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WO2024218311A1 - Compositions à base de décorine pour la réparation et la régéneration de l'épithélium pigmentaire de la rétine - Google Patents

Compositions à base de décorine pour la réparation et la régéneration de l'épithélium pigmentaire de la rétine Download PDF

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Publication number
WO2024218311A1
WO2024218311A1 PCT/EP2024/060741 EP2024060741W WO2024218311A1 WO 2024218311 A1 WO2024218311 A1 WO 2024218311A1 EP 2024060741 W EP2024060741 W EP 2024060741W WO 2024218311 A1 WO2024218311 A1 WO 2024218311A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
protein
nucleic acid
acid sequence
fragment
Prior art date
Application number
PCT/EP2024/060741
Other languages
English (en)
Inventor
Thierry Bordet
Karine Bigot
Laura BENICHOU
Francine Behar-Cohen
Original Assignee
Pulsesight Therapeutics
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Sorbonne Universite
Universite Paris Cite
Assistance Publique - Hopitaux De Paris
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pulsesight Therapeutics, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale, Sorbonne Universite, Universite Paris Cite, Assistance Publique - Hopitaux De Paris filed Critical Pulsesight Therapeutics
Publication of WO2024218311A1 publication Critical patent/WO2024218311A1/fr

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    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Definitions

  • the present invention relates to the field of ophthalmology and in particular to the use of Decorin in the treatment of ocular pathologies characterized by a tear or loss of the retinal pigment epithelium (RPE).
  • Decorin is more particularly described for its ability to repair and restore the RPE and in particular the barrier formed by the RPE, in individuals whose RPE integrity has been affected.
  • the present invention also relates to the use of Decorin to improve retinal reconstruction after RPE transplantation and thus increase the take of retinal grafts as well as the survival of the grafts and the quality of post-operative vision of the patients thus treated.
  • the retinal pigment epithelium is a single-celled structure consisting of a single layer of regular, quiescent hexagonal cells located in the outermost layer of the retina.
  • the outer surface of the RPE is connected to Bruch's membrane and the choroid, while the inner surface is connected to the outer segment of photoreceptor cells.
  • RPE cells play a major role in maintaining visual function and the visual cycle. Indeed, RPE cells have microvilli at the apical pole that extend between the photoreceptor outer segments (POS), which allows them to phagocytose and eliminate exfoliated POS to maintain normal visual cell turnover.
  • the RPE65 (retinal pigment epithelium-specific 65) gene encodes a retinoid isomerohydrolase expressed in RPE cells and is essential for the visual signal transduction cycle by regenerating 11-cis retinal after light exposure.
  • the RPE also contains a significant amount of melanin, which gives it a dark brown coloration. This melanin reduces the damage caused by ultraviolet light to the retina.
  • the RPE also helps reduce the excessive accumulation of reactive oxygen species (ROS) and the resulting oxidative damage.
  • RPE cells form intercellular tight junctions consisting of ZO-1, occludin, and claudins, acting as a barrier between the fenestrated choroidal capillaries and the photosensitive layer of the retina.
  • RPE cells play a key role in the transport of nutrients, water, and electrolytes between the choroid and retinal cells.
  • the structure and function of the RPE are essential for normal vision, and alterations or loss of the RPE impair visual function and can lead to vision loss.
  • geographic atrophy is a form of age-related macular degeneration (AMD) characterized by the atrophy and loss of RPE cells in the macula, leading to the death of overlying photoreceptor cells and blindness.
  • AMD age-related macular degeneration
  • Geographic atrophy is a leading cause of blindness in people over the age of 60 years.
  • Geographic atrophy is estimated to affect approximately 5 million people worldwide, and its prevalence increases exponentially with age (Wong, et al., Lancet Glob Health, 2:el06-l 16, 2014; Rudnicka, et al., Am J Ophthalmol, 160:85-93, 2015).
  • RPE tears vascularized retinal pigment detachment
  • anti-VEGF vascular endothelial growth factor
  • Subretinal fluid in the RPD exerts hydrostatic pressure on the RPE and stretches it. The RPD enlarges as the hydrostatic pressure increases. Contraction of the choroidal neovascular membrane adds tensile forces to the RPE monolayer.
  • RPE tears can complicate various disorders associated with RPD, including central serous chorioretinopathy, toxemia of pregnancy, immunoglobulin A (IgA) nephropathy, and light chain deposition disease.
  • IgA immunoglobulin A
  • RPE tears include suspected ocular histoplasmosis syndrome, proliferative vitreoretinopathy with primary rhematogenous retinal detachment, macular hole, vitreomacular traction, sclerotomy surgery for rhematogenous retinal detachment, familial pulmonary hypertension, traumatic chorioretinopathy, choroidal tumors, glaucoma surgery, Vogt-Koyanagi-Harada disease, acute retinal necrosis, panuveitis, scleritis, shaken baby syndrome, high myopia, laser-induced damage or excessive exposure to light (artificial, solar, eclipses).
  • Transplants can be performed in patients with varying degrees of retinal degeneration using donor material or pluripotent stem cells, and consist of either RPE cell suspensions or retinal sheets.
  • Cell suspension-based strategies involve transplanting purified photoreceptor precursor cells (Bartsch et al., Exp. Eye Res., 86 (2008), pp. 691-700; MacLaren et al., Nature, 444 (2006), pp. 203-207; Pearson et al., Nature, 485 (2012), pp. 99-103), while retinal sheet transplantations allow for the engraftment of retinal organoids containing both photoreceptor cells and inner retinal neurons (Assawachananont et al., Stem Cell Rep., 2 (2014), pp.
  • Retinal pathologies thus represent a major public health issue due to their high prevalence and their social and economic impact.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • the present invention as described below aims to meet these needs.
  • a first object of the present invention therefore relates to a protein, or a fragment thereof, for its use in the treatment of an ocular pathology in an individual in need thereof:
  • the ocular pathology being characterized by a tear or disappearance, partial or total, of the retinal pigment epithelium (RPE) in said individual;
  • the protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • a protein, or a fragment thereof, according to the invention advantageously allows, and against all expectations:
  • RPE retinal pigment epithelium
  • RPE retinal pigment epithelium
  • an ocular pathology treated by a protein implemented according to the invention can be chosen from the group consisting of a tear of the retinal pigment epithelium; geographic atrophy; choroideremia; and hereditary macular dystrophy, in particular chosen from Stargardt's disease, juvenile vitelliform degeneration of the macula or Best's disease, central areolar dystrophy, Sorsby's macular degeneration, North Carolina macular dystrophy, and butterfly wing macular degeneration.
  • the present invention also relates to a protein, or a fragment thereof, for the repair or regeneration of a retinal pigment epithelium (RPE) in an individual in need thereof, the protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • a protein used according to the invention may further comprise a signal peptide, in particular a signal peptide having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6.
  • the present invention also relates to a protein, or fragment thereof, for use in the reconstruction of a retinal pigment epithelium (RPE) in an individual receiving or having received an RPE graft, the protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • a protein, or fragment thereof, implemented according to the invention can be administered to the individual in need thereof by topical application to the eye, for example via eye drops; by intravitreal injection; by subcutaneous injection; conjunctival; by suprachoroidal injection; by subretinal injection; and/or using an intravitreal implant.
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence for use in the treatment of an ocular pathology in an individual in need thereof:
  • the ocular pathology being characterized by a tear or disappearance, partial or total, of the retinal pigment epithelium (RPE);
  • nucleic acid sequence encoding a protein, or a fragment thereof, as previously described i.e. a protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, and optionally in addition a signal peptide, in particular a signal peptide having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6.
  • Said ocular pathology may be selected from the group consisting of a tear of the retinal pigment epithelium; geographic atrophy; choroideremia; and hereditary macular dystrophy, in particular selected from Stargardt's disease, juvenile vitelliform degeneration of the macula or Best's disease, central areolar dystrophy, Sorsby's macular degeneration, North Carolina macular dystrophy, and butterfly wing macular degeneration.
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence for the repair or regeneration of a retinal pigment epithelium (RPE) in an individual in need thereof, the nucleic acid sequence encoding a protein, or a fragment thereof, as previously described, i.e. a protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, and optionally in addition a signal peptide, in particular a signal peptide having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • a nucleic acid sequence used according to the invention may comprise a sequence having at least 70% sequence identity with any one of the nucleotide sequences chosen from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 3, the sequence SEQ ID NO: 4 and the sequence SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid sequence implemented according to the invention may further comprise a nucleotide sequence coding for a signal peptide, in particular a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7.
  • a nucleic acid sequence implemented according to the invention may be included in a vector, the vector being able in particular to be a viral vector, a non-viral vector, a plasmid, a lipid, a liposome or a nanoparticle.
  • a nucleic acid sequence implemented according to the invention may be in the form of a DNA construct intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of the individual in need thereof, said DNA construct being characterized in that it comprises:
  • a therapeutic protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof, and
  • a signal peptide allowing the secretion of this first therapeutic protein, in particular for a signal peptide of sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6; this signal peptide, when present, being contiguous to the sequence of the therapeutic protein, at the N-terminus of said first therapeutic protein,
  • a nucleic acid sequence implemented according to the invention can be administered to the individual in need thereof by injection into a ciliary muscle, optionally followed by an electrotransfer step into the cells of the ciliary muscle.
  • FIG 1 represents, in Figure IA, the mean scores (ordinate) (between 0 and 1: grade 0: no coverage of the lesion by the RPE or coverage with abnormal cells (not hexagonal); grade 0.5: partial coverage of the lesion with hexagonal RPE cells; grade 1: complete coverage of the lesion with hexagonal RPE cells) of repair of a lesion with retinal pigment epithelium cells in a group of control choroidal neovascularization model rats (treated with PBS - left) or in a group of rats model of choroidal neovascularization treated with decorin (DCN - right).
  • Figure 1B represents the distribution of scores of 1, 0.5 or 0 (from top to bottom for each bar) in each group of rats (left control - PBS; right decorin treatment - DCN).
  • the y-axis represents the % impact according to the score of these two groups of rats.
  • FIG 2 represents the percentage of grade 3 lesions (angiographic score) obtained after visualization of retinal and choroidal vascularization at 14 days (D14 - left) and at 28 days (D28 - right) in rats model of persistent choroidal neovascularization induced in the absence of treatment (control).
  • FIG 3 represents the relative percentage of grade 3 lesions (angiographic score) obtained after visualization of the retinal and choroidal vascularization at 14 days (D14 - left) and at 28 days (D28 - right) and compared between 4 groups of rat models of induced persistent choroidal neovascularization: from left to right: control group administered by injection of a control solution of saline buffer followed by an electrotransfer step (Ctrl - Electroporation); group administered by injection of the so-called plasmid A construct followed by an electrotransfer step (Plasmid A - Electroporation); control group administered by intravitreal injection of a control solution of phosphate buffer (Ctrl - IVT Injection); control group administered by intravitreal injection of Aflibercept (15pg) (Aflibercept - IVT Injection).
  • FIG 4 represents, in Figure 4A, the evaluation of the positive immunostaining surface for the RPE65 marker (indicating the presence of RPE cells) reported to the total size of the CNV lesion compared between 4 groups of rats modeling persistent choroidal neovascularization induced: from left to right: control group administered by injection of a control solution of saline buffer followed by an electrotransfer step (Ctrl - Electroporation); group administered by injection of the so-called plasmid A construct followed by an electrotransfer step (Plasmid A - Electroporation); control group administered by intravitreal injection of a control solution of phosphate buffer (Ctrl - IVT Injection); control group administered by intravitreal injection of Aflibercept (15pg) (Aflibercept - IVT Injection).
  • FIG 4B for these same 4 groups represented in the same order from left to right, the distribution of retinal coverage by RPE cells is shown, in percentage. From top to bottom for each column is shown the incidence of lesions as a function of the percentage of RPE coverage (between 80-100%, 60-80% or 0-60% coverage of the CNV lesion for the RPE).
  • FIG 5 represents a DNA construct comprising a nucleic acid sequence implemented according to the invention (Plasmid A).
  • treat and “treatment” designate a reduction or even an interruption of the pathology or disorder considered.
  • patient or “individual” as used herein preferably refers to a mammal, including a non-human mammal, and more particularly a human being.
  • a patient or individual suffering from an ocular pathology, in particular an ocular pathology characterized by a tear or disappearance, partial or total, of the retinal pigment epithelium, more particularly suffering from an ocular pathology selected from the group consisting of a tear of the retinal pigment epithelium, geographic atrophy, choroideremia; and a hereditary macular dystrophy, in particular selected from Stargardt disease, juvenile vitelliform degeneration of the macula or Best disease, central areolar dystrophy, Sorsby macular degeneration, North Carolina macular dystrophy, and butterfly wing macular degeneration.
  • amino acid or nucleic acid sequences of interest reference sequences are described herein.
  • the present disclosure also encompasses amino acid or nucleic acid sequences having specific percentages of amino acid or nucleotide identity with a reference sequence.
  • nucleic acid sequence or a specific amino acid sequence that respects, respectively, the nucleotide or amino acid identity considered must further lead to obtaining a protein that exhibits the desired biological activity.
  • percent identity between two nucleic acid sequences or between two amino acid sequences is determined by comparing the two optimally aligned sequences across a comparison window.
  • This alignment may be performed over the entire length of the sequences being compared.
  • the alignment may also be performed over a shorter length, for example over twenty, fifty, hundred or more nucleic acids/bases or amino acids.
  • the sequence identity is the percentage of identical matches between the two sequences over the stated aligned region.
  • the percentage of sequence identity between two amino acid sequences or between two nucleotide sequences can be determined using the Needleman and Wunsch algorithm for the alignment of two sequences. (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). The algorithm allows for the alignment of both amino acid sequences and nucleotide sequences.
  • the Needleman-Wunsch algorithm has been implemented in the computer program NEEDLE.
  • the NEEDLE program of the EMBOSS software package was used (version 2.8.0 or higher, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. LongdenJ. and Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp276- 277, http://emboss.bioinformatics.nl/).
  • EBLOSUM62 is used for the substitution matrix.
  • EDNAFULL is used for nucleotide sequences.
  • Optional parameters used are a gap opening penalty of 10 and a gap extension penalty of 0.5. No end gap penalty is added.
  • Yes was indicated in response to the question "Brief identity and similarity" and "SRS pairwise” was indicated as the output alignment format.
  • the percent sequence identity between a query sequence and a sequence of the invention is calculated as follows: Number of matching positions in the alignment showing an identical amino acid or nucleotide in both sequences divided by the total length of the alignment after subtracting the total number of gaps in the alignment.
  • the identity defined herein can be obtained from NEEDLE using the NOBRIEF option and is labeled in the program output as "longest identity”.
  • nucleotide and amino acid sequences i.e. the percentage of sequence identity
  • sequence alignments can be determined by sequence alignments using several other known algorithms, preferably with the mathematical algorithm of Karlin and Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877), with hmmalign (HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/) or with the CLUSTAL algorithm (Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res.
  • sequence concordance The degree of sequence identity (sequence concordance) can be calculated using, for example, BLAST, BLAT or BlastZ (or BlastX).
  • BLASTN and BLASTP programs Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410.
  • Gapped BLAST is used as described in Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402.
  • Sequence correspondence analysis can be supplemented by established homology mapping techniques such as Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1: 154-162) or Markov random fields.
  • the percent identity between two sequences is determined using CLUSTAL O (version 1.2.4).
  • Decorin is a secreted glycoprotein of the leucine-rich repeat proteoglycan (SLRP) family.
  • SLRP family members are characterized by N- and C-terminal cysteine-rich regions that flank a central region containing 10–12 tandem leucine-rich repeats (Schaefer, L. and R.V. lozzo, J. Biol. Chem. 283:21305, 2008).
  • the complementary DNA of human decorin encodes a 359 amino acid (AA) precursor that includes a 16 AA signal sequence and a 14 AA propeptide that is cleaved during protein maturation (Krusius, T. and E. Ruoslahti, Proc. Natl. Acad.
  • Mature human decorin contains twelve leucine-rich tandem repeats and shares 80% and 78% AA sequence identity with mouse and rat decorin, respectively. Alternative splicing of human decorin generates five isoforms with deletions of varying length.
  • Decorin is an N-terminally glycosylated protein that also carries a chondroitin/dermatan sulfate hybrid chain of variable size at Ser34 (Scholzen, T. et al., J. Biol. Chem, 269:28270, 1994; Zamfir, A. et al., Glycobiology, 13:733, 2003).
  • the natural proteoglycan of decorin has a molecular mass of approximately 100 kDa, and the deglycosylated core protein of decorin has a mass of approximately 40 kDa (Roughley, P.J and R.J. White, Biochem. J, 262:823, 1989).
  • Decorin is an extracellular matrix (ECM) protein and interacts with ECM proteins including type I and II collagen, fibronectin, and thrombospondin, and contributes to their organization and stability (Scott, JE, Biochemistry, 35:8795, 1996; Scott, JE, et.al., Exp. Cell Res., 243:59-66, 1998).
  • Decorin in particular, plays a critical role in controlling the growth and organization of corneal collagen fibers to make the cornea transparent (Rada, JA, Exp Eye Res, 56;635, 1993).
  • decorin to stabilize the comeal stroma has been suggested in the prior art as an adjunct to orthokeratology for the correction of myopia, hypermetria, astigmatism, and presbyopia (e.g., US2009/0105127).
  • the inventors discovered that decorin can be administered into the fundus of the eye to prevent, delay, or limit the progression of Bruch's membrane extracellular matrix disorganization.
  • Decorin also regulates the biological activity of extracellular matrix-associated growth factors, including fibroblast growth factor 2 (FGF2), myostatin, and transforming growth factor beta (TGFP) (Jârvelâinen, et al., Matrix Biol, 43, 15-26, 2015). It also binds to membrane tyrosine kinase receptors, including epidermal growth factor (EGF) receptor, insulin-like growth factor-7 (IGFl) receptor, and vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor, and regulates their activity.
  • FGF2 fibroblast growth factor 2
  • TGFP transforming growth factor beta
  • EGF epidermal growth factor
  • IGFl insulin-like growth factor-7
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • decorin promotes the inhibition or induction of angiogenesis (Grant, et.al., Oncogene, 21/4765-4777, 2002; Sulochana, et.al., J. Biol. Chem. 280:27935-27948, 2005). Indeed, depending on the microenvironment, decorin can exert pro- or anti-angiogenic effects. Accordingly, the use of decorin to inhibit angiogenesis has been suggested in the prior art for the treatment of exudative AMD (e.g., WO2005116066 and WO201 1069046). In particular, WO2011069046 suggested that intravitreal injection of decorin might be suitable for the treatment of AMD.
  • Decorin is also described for its epithelial-mesenchymal transition (EMT) inhibitory activity.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • decorin inhibits TGFP2-induced EMT of RPE cells in vitro and reduces collagen synthesis, suggesting that decorin may prevent or slow the formation of subretinal fibrosis that occurs in AMD (Begum, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci, 59:4929-4936 2018).
  • Decorin allows also to reduce the progression of fibrosis in a rabbit model of traumatic proliferative vitreoretinopathy (Nassar, et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 249:1649, 2011).
  • Decorin is also described for its cytoprotective properties, particularly against RPE cells subjected to oxidative stress (Xie, et al., Oxidative Medicine and Cellular Longevity, ID 3955748, 2022). Decorin also prevents RPE barrier disruption induced by high glucose intake and hypoxia by suppressing p38 MAPK activation, suggesting that decorin may inhibit the development of diabetic macular edema (Wang, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 56:2971-2979, 2015).
  • the decorin according to the invention comprises a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • At least 85% sequence identity means an amino acid sequence comprising at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100% sequence identity with the amino acid sequence of sequence SEQ ID NO: 1 or with the amino acid sequence of sequence SEQ ID NO: 2.
  • the application also covers the implementation of a fragment of a protein implemented according to the invention, namely the protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2.
  • fragment is meant a “functional fragment”, i.e. a protein sequence or a nucleic acid sequence which, once expressed, exhibits the same activity as a protein of SEQ ID NO: 1 or a protein of SEQ ID NO: 2.
  • it means a protein sequence or a nucleic acid sequence which, once expressed, exhibits the same activity as decorin, in particular as demonstrated in the examples below and as mentioned above.
  • protein means means indifferently designate a protein or a protein fragment.
  • functional fragments of proteins according to the invention may in particular be obtained by proteolytic digestion of native proteins, in particular decorin, by techniques well known in the art. Examples of such methods, as well as functional fragments of decorin, are in particular described in EP0636175 A1.
  • the protein used according to the invention may also comprise a signal peptide, in particular a signal peptide having at least 70% sequence identity with the peptide sequence SEQ ID NO: 6.
  • At least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6 is understood to mean an amino acid sequence comprising at least 70%, at least 71%, at least 72%, at least 73%, at least 74%, at least 75%, at least 76%, at least 77%, at least 78%, at least 79%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or at least 100% identity. of sequence with the sequence SEQ ID NO: 6.
  • a protein used according to the invention may be glycosylated or non-glycosylated, and in particular may be glycosylated, more particularly glycosylated on its N-terminal part.
  • the present invention also relates to the implementation of a nucleic acid sequence encoding decorin.
  • a nucleic acid sequence implemented according to the invention thus encodes a protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof, as defined above, and in particular for a protein comprising the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof.
  • a nucleic acid sequence used according to the invention may in particular have at least 70% sequence identity with any one of the nucleotide sequences chosen from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 3, the sequence SEQ ID NO: 4 and the sequence SEQ ID NO: 5.
  • sequence SEQ ID NO: 3 By at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, the sequence SEQ ID NO: 4 or the sequence SEQ ID NO: 5, it is meant a nucleic acid sequence comprising at least 70%, at least 71%, at least 72%, at least 73%, at least at least 74%, at least 75%, at least 76%, at least 77%, at least 78%, at least 79%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98% at least 99% or at least 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, the sequence SEQ ID NO: 4 or the sequence SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid sequence may have at least 75% sequence identity, in particular at least 80% sequence identity, more particularly 85% sequence identity or even 90% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 3, the sequence SEQ ID NO: 4 or the sequence SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid sequence implemented according to the invention may further comprise a nucleotide sequence coding for a signal peptide, in particular a nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7.
  • At least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7 is understood to mean a nucleic acid sequence comprising at least 70%, at least 71%, at least 72%, at least 73%, at least 74%, at least 75%, at least 76%, at least 77%, at least 78%, at least 79%, at least 80%, at least 81%, at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or at least 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7.
  • a nucleic acid sequence according to the invention may be chosen from a deoxyribonucleic acid (DNA) sequence or a ribonucleic acid (RNA) sequence.
  • a deoxyribonucleic acid sequence may be genomic DNA or cDNA.
  • a ribonucleic acid sequence may be chosen in particular from mRNAs, tRNAs, rRNAs, siRNAs, short hairpin RNAs (shRNAs) or microRNAs (miRNAs).
  • a nucleic acid sequence according to the invention may be an mRNA sequence.
  • Such an mRNA sequence may in particular correspond to the sequence transcribed from a nucleic acid sequence used according to the invention having at least 70% sequence identity with any one of the nucleotide sequences chosen from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 3, the sequence SEQ ID NO: 4 and the sequence SEQ ID NO: 5, and in particular correspond to the sequence transcribed from a nucleic acid sequence implemented according to the invention chosen from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 3, the sequence SEQ ID NO: 4 and the sequence SEQ ID NO: 5.
  • a nucleic acid sequence used according to the invention may in particular be included in a vector.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it has been linked. This term is also intended to refer to any delivery medium, such as a composition associated with a therapeutic or prophylactic nucleic acid in order to increase its cellular delivery.
  • the vector may be a viral vector, a non-viral vector, a plasmid, a lipid, a liposome or a nanoparticle.
  • the nucleic acid sequence may be included in a vector, the vector being in particular a viral vector, a non-viral vector, a plasmid, a lipid, a liposome or a nanoparticle.
  • vectors are those capable of autonomous replication and/or expression of the nucleic acid sequences to which they are linked.
  • Vectors capable of directing the expression of genes to which they are operatively linked are referred to herein as "expression vectors”.
  • a nucleic acid sequence implemented according to the invention can be included in a plasmid.
  • expression vectors useful in recombinant DNA techniques are often in the form of "plasmids" which designate circular double-stranded DNA loops which, in their vector form, are not linked to the chromosome.
  • Vectors can also be episomal DNA, yeast artificial chromosomes, or minichromosomes.
  • Vectors can be of viral origin, and we then speak of viral vectors.
  • a suitable viral vector according to the present invention may be selected from the group consisting of a retrovirus, in particular a lentivirus, an adenovirus, an adeno-associated virus and a virus-like vector.
  • the viral vector is a retroviral vector or an adeno-associated viral (AAV) vector.
  • a suitable viral vector according to the present invention may also be selected from: Herpes simplex virus (HSV) vectors, and in particular among the non-replicating HSV vectors. We thus speak here of HSV vector.
  • HSV vector can in particular be a Herpes simplex virus 1 or 2 (HSV-1 or HSV-2) vector, and in particular an HSV-1 vector.
  • HSV vector means a viral vector derived from the herpes simplex virus, particularly type 1 (HSV1).
  • Retroviral vectors are viral particles that contain a viral genome derived from retroviruses, lack the capacity for self-renewal, and have the ability to introduce a nucleic acid sequence into a cell.
  • a retroviral vector may be an alpha-retroviral vector, a gamma-retroviral vector, a lentiviral vector, or a spuma-retroviral vector, preferably a lentiviral vector.
  • Such vectors have been widely used in gene therapy treatments and other gene delivery applications.
  • the retroviral vector is a lentiviral vector.
  • lentiviral vector refers to a viral vector derived from complex retroviruses such as human immunodeficiency virus (HIV). Lentiviral vectors derived from any strain and subtype may be used.
  • the lentiviral vector may be based on a human or primate lentivirus such as HIV or a non-human lentivirus such as feline immunodeficiency virus, simian immunodeficiency virus, and equine infectious anemia virus (EIAV).
  • the lentiviral vector is an HIV-based vector, and in particular an HIV-1-based vector.
  • AAV vectors are viral particles that contain an AAV-derived genome, lack the capacity for self-renewal, and have the ability to introduce a nucleic acid sequence into a cell.
  • AAV vector is meant a viral vector derived from an adeno-associated virus serotype, including, without limitation, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV6, etc.
  • An AAV vector may have one or more of the wild-type AAV genes deleted in whole or in part, preferably the rep and/or cap genes, but retain functional flanking ITR sequences. Functional ITR sequences are required for the rescue, replication, and packaging of the AAV virion.
  • an AAV vector is defined herein to include at least the sequences required in cis for the replication and packaging (e.g., functional ITRs) of the virus.
  • the ITRs need not be the wild-type nucleotide sequences and may be modified, e.g., by insertion, deletion, or modification. or nucleotide substitution, so long as the sequences allow for functional recovery, replication and packaging.
  • AAV vectors are constructed using known techniques to provide at least as operably linked components in the direction of transcription, control elements comprising a transcription initiation region, the DNA of interest and a transcription termination region. The control elements are selected to be functional in a mammalian cell. The resulting construct containing the operably linked components is linked (5' and Y) with functional AAV ITR sequences.
  • AAV ITR adeno-associated virus inverted terminal repeat
  • AAV ITRs together with the AAV rep coding region, allow for the efficient excision and recovery of, and integration of, a nucleotide sequence interposed between two flanking ITRs into a mammalian cell genome.
  • the nucleotide sequences of AAV ITR regions are known. See, e.g., Kotin, 1994; Berns, K. I. “Parvoviridae and their Replication” in Fundamental Virology, 2nd Edition, (BN Fields and D. M.
  • an “AAV ITR” does not necessarily include the wild-type nucleotide sequence, but may be modified, e.g., by insertion, deletion, or substitution of nucleotides. Additionally, the AAV ITR may be derived from any of several AAV serotypes, including, but not limited to, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV6, etc.
  • 5' and 3' ITRs that flank a selected nucleotide sequence in an AAV vector need not be identical or derived from the same AAV serotype or isolate, so long as they function as intended, ie, to allow excision and rescue of the sequence of interest from a host cell genome or vector, and to allow integration of the heterologous sequence into the recipient cell genome when AAV Rep gene products are present in the cell.
  • the nucleic acid sequence of interest is particularly operably linked to control elements that direct transcription or expression thereof in the subject in vivo.
  • control elements may include control sequences normally associated with the selected gene.
  • heterologous control sequences may be employed.
  • Useful heterologous control sequences generally include those derived from sequences encoding genes of mammalian or viral.
  • Examples include, but are not limited to, the phosphoglycerate kinase (PKG) promoter, the SV40 early promoter, the mouse mammary tumor virus LTR promoter; adenovirus major late promoter (Ad MLP); a herpes simplex virus (HSV) promoter, a cytomegalovirus (CMV) promoter such as the CMV immediate early promoter region (CMVIE), the Roux sarcoma virus (RSV) promoter, a CMV/beta-actin (CAG) hybrid promoter, synthetic promoters, hybrid promoters, etc.
  • PKG phosphoglycerate kinase
  • Ad MLP adenovirus major late promoter
  • HSV herpes simplex virus
  • CMV cytomegalovirus
  • CMVIE CMV immediate early promoter region
  • RSV Roux sarcoma virus
  • CAG CMV/beta-actin
  • a recombinant virus is a virus that comprises a recombinant nucleic acid sequence, i.e. a nucleic acid sequence that comprises parts that do not naturally occur together as part of a single sequence or that have been rearranged relative to a naturally occurring sequence.
  • a “recombinant viral vector” e.g. a “recombinant retroviral vector” or a “recombinant AAV vector” means a viral vector comprising in its genome a recombinant nucleotide sequence (or transgene).
  • the carrier may also be a lipid, including a lipid vesicle such as a liposome, solid lipid nanoparticle (SLN) micelles, or polymeric nanoparticles.
  • lipid vesicle such as a liposome, solid lipid nanoparticle (SLN) micelles, or polymeric nanoparticles.
  • LSN solid lipid nanoparticle
  • Lipid-based compounds that are not liposomes may additionally be used.
  • lipofectins and cytofectins are lipid-based positive ions that bind to a negatively charged nucleic acid and form a complex that can transport the DNA across a cell membrane.
  • a nucleic acid sequence implemented according to the invention may be in the form of a DNA construct, in particular in the form of a DNA construct intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of the patient in need thereof.
  • a nucleic acid sequence implemented according to the invention may also contain one or more additional regions, for example small or large regulatory elements available to those skilled in the art such as a promoter region (constitutive, regulated, inducible, tissue-specific, etc.), for example sequences allowing and/or promoting expression in the targeted tissue (eg in the patient's ocular sphere) or cells (eg RPE or photoreceptors), a transcription termination signal, such as a polyadenylation sequence 3' of the nucleotide sequence, secretion sequences, an origin of replication and/or nuclear localization of signal sequences (nls) which further improve the transfer of polynucleotide to the nucleus. cellular.
  • nls sequences have been described in the prior art, including the SV40 large T antigen sequence.
  • the nucleic acid sequence may be in the form of a DNA construct intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of the patient in need thereof, said DNA construct being characterized in that it comprises:
  • a therapeutic protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof, and
  • a signal peptide allowing the secretion of this first therapeutic protein, in particular for a signal peptide having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6; this signal peptide, when present, being contiguous to the sequence of the therapeutic protein, at the N-terminus of said first therapeutic protein,
  • nucleotide sequence coding
  • a therapeutic protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof, and
  • nucleic acid sequence encoding a therapeutic protein
  • this nucleic acid sequence having at least 70% sequence identity with any of the nucleotide sequences chosen from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 3, the sequence SEQ ID NO: 4 and the sequence SEQ ID NO: 5 and more particularly comprises a sequence selected from the group consisting of the sequence SEQ ID NO: 3, the sequence SEQ ID NO: 4 and the sequence SEQ ID NO: 5; and
  • nucleotide sequence having at least 70% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 7, this signal peptide, when present, being contiguous to the sequence of the therapeutic protein, at the N-terminus of said first therapeutic protein.
  • nucleic acid sequence in the form of a DNA construct may be complexed with any chemical, biochemical or biological agent, may be inserted into a vector, etc., when administered to the patient.
  • the DNA construct is circular in shape.
  • circular or “closed” refers to any nucleic acid molecule that forms a circular molecule.
  • relaxed or closed molecules, which are often supercoiled.
  • the DNA construct is naked DNA.
  • naked DNA refers to any nucleic acid molecule that is not associated with a synthetic, biosynthetic, chemical, biochemical or biological agent that enhances the delivery or transfer of said DNA, or facilitates its entry into the cell. Plasmid is a particular form of naked DNA according to the invention.
  • nucleic acid sequence implemented according to the invention may further comprise selectable markers useful for selecting, measuring and monitoring the results of nucleic acid transfer (transfer to which tissues, duration of expression, etc.).
  • selectable markers useful for selecting, measuring and monitoring the results of nucleic acid transfer (transfer to which tissues, duration of expression, etc.).
  • the types of expression systems and reporter genes that can be used or adapted for use are well known in the art. For example, genes encoding luciferase activity, alkaline phosphatase activity or green fluorescent protein activity are commonly used.
  • the nucleic acid sequence can be prepared and produced according to conventional recombinant DNA techniques, such as amplification, culture in prokaryotic or eukaryotic host cells, enzymatic synthesis, purification, etc.
  • recombinant DNA techniques such as amplification, culture in prokaryotic or eukaryotic host cells, enzymatic synthesis, purification, etc.
  • the techniques of recombinant DNA technology are known to those skilled in the art.
  • a protein or a nucleic acid sequence used according to the invention may be present in a pharmaceutical composition also comprising at least one pharmaceutically acceptable medium.
  • pharmaceutically refers to molecular entities and compositions that do not produce an adverse reaction, allergic or otherwise, when administered to a mammal, particularly a human, as the case may be.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or excipient refers to a non-toxic solid, semi-solid or liquid filler, diluent, encapsulating material or formulation aid of any type.
  • Pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents include diluents and fillers that are pharmaceutically acceptable for the methods of the invention, are sterile and may be selected from neutral to slightly acidic isotonic buffered saline (including phosphates, chloride, etc.), aqueous or oleaginous solutions or suspensions and more preferably from sucrose, trehalose, surfactants, proteins and amino acids.
  • the pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent is preferably formulated using suitable dispersing, wetting, suspending, soothing, isotonic or viscosity increasing agents, stabilizers, preservatives and buffers to form an isotonic solution.
  • the particular pharmaceutically acceptable carrier and the ratio of active compound to carrier are determined by the solubility and chemical properties of the composition, the particular mode of administration and standard pharmaceutical practice. Those skilled in the art will understand how to formulate such vehicles by known techniques.
  • An example of a stabilizer is disodium edetate.
  • isotonic agents are glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, ethylene diamine tetraacetic acid, sodium chloride, potassium chloride, sorbitol and mannitol or the like.
  • buffers are citric acid, sodium hydrogen phosphate, glacial acetic acid and trometamol or the like.
  • pH adjusting agents are hydrochloric acid, citric acid, phosphoric acid, acetic acid, sodium hydroxide, sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate or the like.
  • An example of soothing agents is benzyl alcohol or the like.
  • preservatives are benzalkonium chloride, benzethonium chloride, p-hydroxybenzoate esters, benzoate sodium and chlorobutanol or similar.
  • a viscosity greater than that of simple aqueous solutions may be desirable to increase ocular absorption of the protein or nucleic acid sequence, to decrease variability in formulation distribution, to decrease physical separation of components of a formulation suspension or emulsion, and/or otherwise to improve the ophthalmic formulation.
  • Such viscosity-increasing agents include, for example, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, hydroxyethylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, or other agents known to those skilled in the art. Such agents are typically employed at a level of about 0.01% to about 2% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition.
  • the forms of preparation of the pharmaceutical composition intended to be administered, in particular into the muscle cells of the ocular sphere are preferably liquid preparations.
  • the liquid preparations may be prepared, for example, by dissolving the protein or nucleic acid sequence in BSS (Balanced Salt Solution), glycerin solution, hyaluronic acid solution and the like.
  • BSS Battery Salt Solution
  • a particular composition comprises, for example, BSS (60%) and hyaluronic acid (40%).
  • a stabilizer, an isotonic agent, a buffer, a pH adjuster, a soothing agent, a preservative, electrolytes, such as sodium, potassium, calcium, magnesium and/or chloride or the like may optionally be added in adequate quantity to the liquid.
  • the concentration of decorin in protein form administered may range from about 0.01 mg/mL to about 1000 mg/mL.
  • the concentration may be between 0.05 mg/mL and 750 mg/mL, while in other cases, it may be between 0.1 mg/mL and 500 mg/mL.
  • the concentration ranges from about 0.2 mg/mL to about 250 mg/mL, from about 0.3 mg/mL to about 200 pg/mL, from about 0.5 mg/mL to about 100 mg/mL, from about 0.75 mg/mL to about 50 mg/mL, from about 0.75 mg/mL to about 25 mg/mL, or from about 1.0 mg/mL to about 10 mg/mL.
  • the pharmaceutical composition may comprise one or more additional adjuvant(s).
  • the adjuvant may be selected from any substance, mixture, solute or composition facilitating or increasing the biological activity of the protein or nucleic acid sequence such as any biological, synthetic or biosynthetic agent improving the delivery or transfer of said agent and assimilable to a vector (as delivery carrier) according to the invention.
  • the adjuvant may be packaged and administered separately or sequentially from the composition containing the prophylactic or therapeutic agent and/or at a separate injection site. Treatment with multiple agents and/or adjuvants according to the invention need not be carried out using a mixture of agents and/or adjuvants but may be carried out using separate pharmaceutical preparations.
  • the preparations do not need to be dispensed at exactly the same time, but can be coordinated to be dispensed to a patient during the same treatment period, i.e. a week or a month apart.
  • a pharmaceutical composition as described may comprise one or more therapeutic agents.
  • therapeutic agents include permeabilizing agents such as virus, lipid vesicle, hyaluronic acid, lipid-based positive ions, polycationic emulsions, cationic peptides, polyplexes, etc.; antibiotics and antimicrobial agents such as tetracycline hydrochloride, leukomycin, penicillin, penicillin derivatives, erythromycin, sulfathiazole, and nitrofurazone; local anesthetics such as benzocaine; vasoconstrictors such as phenylephrine hydrochloride, tetrahydrozoline hydrochloride, naphazoline nitrate, oxymetazoline hydrochloride, and tramazoline hydrochloride; cardiotonics such as digitalis and digoxin; vasodilators such as nitroglycerin and papaverine hydrochloride; antiseptics such as chlorhexidine
  • a protein or nucleic acid sequence according to the invention can be administered to the individual in need thereof in combination with one or more biologically active active agents, in particular in a pharmaceutical composition as described above.
  • Biologically active agents are for example selected from VEGF, angiogenin, angiopoietin-1, DeM, acidic or basic fibroblast growth factors (aFGF and bFGF), FGF-2, follistatin, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), hepatocyte growth factor (HGF), scatter factor (SF), leptin, Midkine, placental growth factor (PGF), platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), pleiotrophin (PTN), RdCVF (Rod-derived Cone Viability Factor), Progranulin, Proliferin, TGF-alpha, PEDF, TGF-beta, TNF-alpha, VEGF, VPF, CNTF, BDNF, GDNF, PEDF, NT3, BFGF, F angiopoietin, ephrin, EPO, NGF, IGF,
  • said protein or said nucleic acid sequence is administered to the individual in need thereof in combination with an anti-VEGF protein and/or a sequence coding for an anti-VEGF protein, in particular chosen from the group consisting of S-Fltl, aflibercept, conbercept, bevacizumab, ranibizumab and brolucizumab, more particularly with aflibercept and/or a sequence coding for aflibercept.
  • an anti-VEGF protein and/or a sequence coding for an anti-VEGF protein in particular chosen from the group consisting of S-Fltl, aflibercept, conbercept, bevacizumab, ranibizumab and brolucizumab, more particularly with aflibercept and/or a sequence coding for aflibercept.
  • compositions of the present invention may be tailored to achieve an amount effective to achieve a desired biological activity. It should be understood, however, that the specific dosage level for a particular patient will depend on a variety of factors, including body weight, general health, gender, diet, time, absorption and excretion rates, combination with other drugs, and the severity of the particular disease being treated.
  • a protein, a nucleic acid sequence, in particular in the form of a DNA construct intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of the patient in need thereof, or a pharmaceutical composition implemented according to the invention may be administered to the individual in need thereof according to the administration methods known in the art, of course adapted to the form administered (protein or nucleotide).
  • administration methods suitable according to the present invention are particularly suitable for ocular administration.
  • a protein, a nucleic acid sequence, in particular in the form of a DNA construct intended for the non-viral transfer of nucleic acids into the muscle cells of the ocular sphere of the patient in need thereof, or a pharmaceutical composition implemented according to the invention can thus be administered directly into the eye by injection into the ocular tissue, for example by periocular, conjunctival, sub-tenonal, intracameral, intravitreal, intraocular, subretinal, subconjunctival, retrobulbar, suprachoroidal or intracanalicular injection; by direct application into the eye using a catheter or other placement device such as a retinal pellet, an intraocular insert, a suppository or an implant composed of a porous, non-porous or gelatinous; by topical eye drops or ointments; or by a slow-release device in the cul-de-sac or implanted near the sclera (transscleral) or in the sclera (intrascleral) or
  • Methods of administration include, but are not limited to, methods of injection into the patient's ocular sphere, particularly into the muscle cells of the patient's ocular sphere, particularly into the ciliary muscle cells of the patient.
  • a protein, nucleic acid sequence or pharmaceutical composition may be administered by minimally invasive subconjunctival injection, traditional intravitreal injection, transcleral administration, sub-Tenon injection, suprachoroidal administration or other suitable methods for delivering the protein-containing solution to tissue layers at the back of the eye.
  • the means for injecting a protein, nucleic acid sequence or pharmaceutical composition into the ocular sphere may be an injection needle or preferably a flexible catheter or microcannula. Injection techniques may involve the use of microneedles, such as a 38 gauge microneedle or other microneedles of appropriate gauge.
  • a protein, nucleic acid sequence, or pharmaceutical composition may be administered by injection into the scleral tissue.
  • delivery may be by transcleral delivery using a collagen implant that is impregnated with the protein, nucleic acid sequence, or pharmaceutical composition and then placed into the conjunctiva.
  • a protein, a nucleic acid sequence or a pharmaceutical composition according to the invention can be administered by topical application to the eye, in particular via eye drops; by at least one intravitreal injection, or a subconjunctival injection, or a suprachoroidal injection, or a subretinal injection; and/or using an intravitreal implant.
  • a pharmaceutical composition implemented according to the invention is an eye drop formulation.
  • the eye drop is provided in any generally used formulation, for example, in the form of an aqueous eye drop such as an aqueous eye drop solution, an aqueous eye drop suspension, a viscous eye drop solution, a solubilized eye drop solution and the like, or in the form of a non-aqueous eye drop such as a non-aqueous eye drop solution, a non-aqueous eye drop suspension and the like.
  • an aqueous eye drop such as an aqueous eye drop solution, an aqueous eye drop suspension, a viscous eye drop solution, a solubilized eye drop solution and the like
  • a non-aqueous eye drop such as a non-aqueous eye drop solution, a non-aqueous eye drop suspension and the like.
  • an additive commonly used in an aqueous eye drop. Examples of such an additive include preservatives, isotonic agents, buffering agents, stabilizers, pH regulators or the like.
  • a protein, a nucleic acid sequence or a pharmaceutical composition implemented according to the invention is administered by at least one intravitreal injection.
  • a protein, a nucleic acid sequence or a pharmaceutical composition may be administered to the patient by injection into a ciliary muscle, optionally followed by an electrotransfer step into the cells of the ciliary muscle.
  • Electrotransfer consists of an electroporation step applied after a local injection of a protein or a nucleic acid sequence, in particular a plasmid, and makes it possible to increase the transfection efficiency of the injected molecule.
  • Electroporation is in fact adapted or increases the permeability of a cell membrane and/or at least a portion of a targeted tissue to a biologically active agent such as a protein or nucleic acid sequence.
  • a brief electrical pulse with a given field intensity is used to enable the transport or migration of agents through the tissue or across cell membranes into cells, by an electrophoretic effect.
  • the electroporation technique is well known to those skilled in the art.
  • an electric field consisting of one or more electrical pulse(s) is applied.
  • the field strength may be between about 1 and 600 volts, preferably 1 and 400 volts, even more preferably between about 1 and 200 volts, advantageously between about 10 and 100 volts, or 15 and 70 volts.
  • the total duration of application of the electric field may be between 0.01 millisecond and 1 second, preferably between 0.01 and 500 milliseconds, more preferably between 1 and 500 milliseconds, even more preferably greater than 1 or 10 milliseconds. In a particular embodiment, the total duration of application of the electric field is between 10 milliseconds and 100 milliseconds and is preferably 20 milliseconds.
  • the electrical pulses applied can be between 1 and 100,000, for example. Their frequency can be between 0.1 and 1000 hertz. This is preferably a regular frequency.
  • the electrotransfer is carried out at a rate of 8 unipolar square electrical pulses (200V/cm, 10 ms, 5 Hz) generated by an electroporator similar to that described in Touchard et al. (J Gene Med. 2010 Nov;12(l l):904-19).
  • Electrical pulses can also be delivered irregularly relative to each other, with the function describing the electric field strength as a function of time for a pulse preferably being variable.
  • the electrical pulses may be unipolar or bipolar wave pulses. They may be selected, for example, from square wave pulses, exponentially decaying wave pulses, oscillating unipolar wave pulses of limited duration, oscillating bipolar wave pulses of limited duration, or other waveforms. Preferably, the electrical pulses comprise square wave pulses or oscillating bipolar wave pulses.
  • the electric field is applied using two electrodes, one of said electrodes being introduced into the suprachoroidal space and the other being applied to the surface of the eye on the opposite side where the suprachoroidal injection was performed.
  • the electric field is applied using two electrodes, one of said electrodes being applied to the surface of the sclera adjacent to the region where the suprachoroidal injection was performed and the other being applied to the surface of the eye (e.g. sclera or conjunctiva) on the opposite side where the suprachoroidal injection was performed.
  • the electrodes are preferably selected from a wire type electrode and a contact plate type electrode, each type of electrode optionally being adapted to be reversibly applied to the surface of the eye.
  • the contact plate type electrode is curved.
  • the contact plate electrode is preferably made of a rigid material and of a curved shape adapted to the geometry of the surface of the sclera or the eye (for example the conjunctiva).
  • the electrodes are advantageously made of a non-oxidizing conductive metal chosen for example from iridium or platinum.
  • the electric field is applied with device means as described in Example 2.
  • An electrotransfer method suitable according to the invention is described in Bloquel et al. “Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis” (FASEB J 2006; 20: 389-391) by modifying the injection route by a transscleral approach (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins”, J Gene Med. 2010 Nov;12(l l):904-19). Electroporation methods suitable for administration in the ocular sphere are notably described in EP2266656 B l.
  • the present application also covers a method for treating an ocular pathology in an individual in need thereof, comprising at least one step of administering a protein, or a fragment thereof, as described above, to said individual, in which:
  • the ocular pathology being characterized by a tear or disappearance, partial or total, of the retinal pigment epithelium (RPE) in said individual;
  • the protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof.
  • the application also covers a method for repairing or regenerating a retinal pigment epithelium (RPE) in an individual in need thereof comprising at least one step of administering to said individual a protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof. Furthermore, the application covers a method for treating an ocular pathology in an individual in need thereof, comprising at least one step of administering to said individual a nucleic acid sequence, in which:
  • the ocular pathology being characterized by a tear or disappearance, partial or total, of the retinal pigment epithelium (RPE);
  • the application also relates to a method for repairing or regenerating a retinal pigment epithelium (RPE) in an individual in need thereof, comprising at least one step of administering to said individual a nucleic acid sequence coding for the protein, or a fragment thereof, according to the invention.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • the application also relates to a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof, for its use in the reconstruction of a retinal pigment epithelium (RPE) in an individual receiving or having received an RPE transplant.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • the application also covers a method for improving the reconstruction of a retinal pigment epithelium (RPE) in an individual having received an RPE transplant comprising at least one step of administering to said individual a protein comprising a protein sequence comprising at least 85% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 or with the sequence SEQ ID NO: 2, or a fragment thereof.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • the application relates to a nucleic acid sequence encoding the protein, or a fragment thereof, for use in the reconstruction of a retinal pigment epithelium (RPE) in an individual having received an RPE transplant.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • the application also relates to a method for reconstructing a retinal pigment epithelium (RPE) in an individual having received an RPE transplant comprising at least one step of administering to said individual a nucleic acid sequence coding for the protein, or a fragment thereof, according to the invention.
  • RPE retinal pigment epithelium
  • the inventors first demonstrated the ability of Decorin alone, administered as such, to restore the RPE in a model of laser-induced choroidal neovascularization in rats, an experimental model widely used to study AMD.
  • CNV choroidal neovascularization
  • RPE-choroid complex was flat-mounted and actin filaments in RPE cells were highlighted by immunofluorescence using Phalloidin coupled with the fluorochrome Alexa Fluor 647 (ThermoFisher) for 30 minutes at room temperature and then observed under a confocal microscope (Zeiss LSM710, Le Pecq, France).
  • RPE images were captured using a digital video camera coupled to a computer system. For each laser-induced lesion, RPE reconstitution was qualitatively graded by assessing the structure of RPE cells and the area of RPE coverage of the lesion.
  • Scores were established according to the following criteria: grade 0: no RPE coverage of the lesion or coverage with abnormal cells (not hexagonal); grade 0.5: partial coverage of the lesion with hexagonal RPE cells; grade 1: complete coverage of the lesion with hexagonal RPE cells (normal shape of RPE cells). Test results
  • the mean score of coverage of NVC lesions by RPE cells was compared between the two groups of rats at D14.
  • Figure 1B shows the incidence of different scores assigned per lesion in each group of rats (score of 1, 0.5 or 0 from top to bottom for each group). It thus appears that more than 50% of the lesions were assigned a score of 1 in the group treated with Decorin, compared to only 25% in the control group.
  • the inventors have also demonstrated the ability of Decorin to restore the RPE in a model of persistent choroidal neovascularization induced by double laser impact in rats.
  • mice The double-impact laser-induced choroidal neovascularization model, initially described in mice (Little et al., Transi Vis Sci Technol. 2020 Mar 9;9(4):3) and reproduced here in the Brown Norway rat, mimics chronic human disease in its stability and persistence.
  • a first rupture of Bruch's membrane is performed on D-7 then a second laser impact is performed on D0 on each of the lesions previously induced on D-7.
  • a second laser impact is performed on D0 on each of the lesions previously induced on D-7.
  • four laser impacts were performed around the optic nerve at a distance of approximately 2 diameters from the optic disc with an Argon laser (532 nm) mounted on a slit lamp (200mW, 0.1s and 50pm). The presence of a bubble indicated the rupture of Bruch's membrane and confirmed a successful laser impact.
  • the retinal and choroidal vascularization was visualized at D14 and D28 by fluorescein angiography (FA) and indocyanine green (ICG) according to a standard method well known to those skilled in the art.
  • FFA fluorescein angiography
  • ICG indocyanine green
  • a mixture of fluorescein and indocyanine green was injected into the tail vein of the rats.
  • Early and late phase angiograms were recorded 20 seconds-2 minutes and 5-7 minutes after injection of the fluorescein/indocyanine green mixture, respectively.
  • fluorescein leakage was qualitatively graded by assessing the increase in size/intensity of the dye leakage between the early and late phases.
  • Angiographic scores were established according to the following criteria: grade 0, no hyperfluorescence; grade 1, slight hyperfluorescence without increase in intensity or size; grade 2, hyperfluorescence increasing in intensity but not in size; grade 3, hyperfluorescence increasing in both intensity and size.
  • the percentage of grade 3 lesions measured in rats during this examination is between 55 and 60% at D14 and D28.
  • a DNA construct comprising a nucleic acid sequence according to the invention encoding Decorin was prepared according to conventional methods and is shown in Figure 5.
  • This construct (hereinafter also referred to as plasmid A construct) comprises:
  • sequence SEQ ID NO: 7 encoding the signal peptide of Decorin of sequence SEQ ID NO: 6;
  • sequence SEQ ID NO: 8 encoding the Aflibercept of sequence SEQ ID NO: 9;
  • Rats as previously described are used in accordance with the provisions of the ARVO (Association for Research in Vision and Ophthalmology) protocol.
  • Electrotransfer is performed as described in Bloquel et al. “Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis” (FASEB J 2006; 20: 389-391) by modifying the injection route by a transscleral approach (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins”, J Gene Med. 2010 Nov;12(ll):904-19). Plasmids are injected at a rate of 30 pg in 10 pL of Tris-EDTA NaCl solution, into the ciliary muscle of the animals using a suitable syringe.
  • Electrotransfer is performed using 8 unipolar square electrical pulses (200 V/cm, 10 ms, 5 Hz) generated by an electroporator similar to that described in Touchard et al (J Gene Med. 2010 Nov;12(ll):904-19).
  • the eyes were enucleated, fixed in 4% PFA, embedded in paraffin, and then sectioned into 5 ⁇ m thick sections. Sections made in the central part of the CNV lesions were selected and prepared for immunohistological labeling. Briefly, the sections were deparaffinized using xylene baths and then rehydrated with successive ethanol baths from 100% to 70% ethanol. The sections were immunolabeled using an antibody directed against the RPE65 protein specifically expressed in RPE cells (Sigma Aldrich) and an antibody directed against Collagen 1 (Abeam) to mark the fibrovascular area.
  • RPE65 anti- mouse Alexa fluor 488
  • RPE65 anti-rabbit Alexa fluor 594
  • Collagen 1 DAPI counterstaining was used to localize retinal structures. Sections were mounted with Fluoromount medium (Sigma Aldrich, France) under a coverslip for microscopic examination using a confocal microscope (Spinning disk CSU-W1, Leica). The area of RPE65-positive immunostaining (RPE cells) relative to the total size of the CNV lesion and the percentage of coverage of the CNV lesion by RPE cells (positive for RPE65) were measured using computer-aided image analysis software (ImageJ).
  • ImageJ computer-aided image analysis software
  • the vascular leakage induced by double laser impact was evaluated for each lesion and the relative percentage of grade 3 lesions compared between each of the 4 groups (see Figure 3). It thus appears that the percentage of grade 3 lesions at D14 and D28 is reduced by more than 50% in the group treated with plasmid A compared to the group that received the formulation buffer alone. Conversely, the administration of Aflibercept alone reduces the percentage of grade 3 lesions at D14 and D28 by only 6 to 22%, respectively, compared to the group that received a BSS solution. This thus materializes the capacity of a plasmid coding for Decorin and Aflibercept to very significantly reduce vascular leakage in a retina with choroidal neovascularization.
  • the coverage of the retina by RPE cells was assessed for each lesion and compared between each of the 4 groups (Results presented in Figure 4B). More specifically, the area of positive immunostaining for the RPE65 marker (indicating the presence of RPE cells) relative to the total size of the CNV lesion was also compared between each of the 4 aforementioned groups (see Figure 4A).
  • SEQ ID NO: 1 Peptide sequence of Decorin
  • SEQ ID NO: 2 Peptide sequence of Decorin
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence coding for Decorin ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttc gagccctcctaggcccagtgccccttccgctgtcaatgccatcttcgagtggtccagtgttctgattgggtct ggacaaagtgccaa aggatcttcccctgacacaactctgctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatcaaagatggagactttaagaacctgaagaa ccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagttagtcctggagcatttcttgtca
  • SEQ ID NO: 4 Nucleotide sequence coding for Decorin gatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttcgagccctcctaggcccagtgtgccccttccgctgtcaatg ccatcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaaaggatcttcccctgacacacaactctgctagacctgcaaaac aacaaaataaccgaaatcaaagatggagacttttaagaacctgaagaaccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagtta gtcctggagcattttacaccttggtgaaagttggaaacgactttatc
  • SEQ ID NO: 5 Nucleotide sequence coding for Decorin ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcctctggaatcggacctgaggtgcccgacgacagagactt cgaaccttctgggccctgtgtgccccttcagatgccagtgtcatctgagagtggtgcagtgcgacctgggcc ttgataaggtgc ccaaggacctgcctctgacaccacactgctggacctgcagaacaacaagatcaccgagatcaaggacggcgacttcaagaacctg aagaatctgcacgcctgatctggtcaacaacaaatcaccgagatcaaggacggcgacttcaagaacctg aagaatctgcacg
  • SEQ ID NO: 6 Peptide sequence of the native signal peptide of Decorin MKATIILLLLAQVSWA
  • SEQ ID NO: 7 Nucleotide sequence coding for the native signal peptide of Decorin atgaaggccactatcatcctccttctgcttgcacaagtttcctgggct
  • SEQ ID NO: 8 Nucleotide sequence coding for Aflibercept cagcgacaccggcagacccttcgtggaaatgtacagcgagatccccgagatcatccacatgaccgagggccgcgagctggtgatcc cttgcagagtgaccagccccaacatcaccgtgacactgaagaagttcccctctggacacactgatccccgacggcaagaggatcatctg ggacagcagaaagggcttcatcatcagcaacgccacatacaaagagatcggactgctgacatgcgaggccaccgtgaacggccatc tgtacaagaccaactatctgacccaccgccagaccaacaccatcatcgacgtggtgctgagccccagccacggcatcgagctgag
  • SEQ ID NO: 9 peptide sequence of 1' Aflibercept SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSR

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Abstract

La présente invention concerne à titre principal une protéine, en l'occurrence la décorine, ou un fragment de celle-ci, pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie oculaire chez un individu en ayant besoin (i) la pathologie oculaire étant caractérisée par une déchirure ou une disparition, partielle ou totale, de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez ledit individu; et (ii) la protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d'identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2. Est également concernée la mise en oeuvre dans ce même but d'une séquence d'acides nucléiques codant pour une telle protéine, de même que la mise en oeuvre de cette protéine, ou un fragment de celle-ci, ou de cette séquence d'acides nucléiques pour la réparation ou la régénération d'un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu en ayant besoin.

Description

Description
Titre :
COMPOSITIONS À BASE DE DÉCORINE POUR LA RÉPARATION ET LA RÉGÉNÉRATION DE L'ÉPITHÉLIUM PIGMENTAIRE DE LA RÉTINE
Domaine technique
La présente invention concerne le domaine de l’ophtalmologie et en particulier la mise en œuvre de la Décorine dans le traitement de pathologies oculaires caractérisées par une déchirure ou par une perte de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). La Décorine est plus particulièrement décrite pour sa capacité à réparer et à restaurer l’EPR et en particulier la barrière que forme l’EPR, chez des individus dont l’intégrité de l’EPR a été atteinte. La présente invention concerne également la mise en œuvre de la Décorine pour améliorer la reconstruction rétinienne après transplantation d’un EPR et ainsi augmenter la prise de greffes de rétine ainsi que la survie des greffons et la qualité de la vision post-opératoire des patients ainsi traités.
Technique antérieure
L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une structure monocellulaire formée d'une seule couche de cellules hexagonales régulières et quiescentes, située dans la couche la plus externe de la rétine. La face externe de l'EPR est reliée à la membrane de Bruch et à la choroïde, tandis que la face interne est reliée au segment externe des cellules photoréceptrices.
Les cellules de l'EPR jouent un rôle majeur dans le maintien de la fonction visuelle et dans le cycle visuel. En effet, les cellules de l’EPR présentent des microvillosités au pôle apical qui s'étendent entre les segments externes des photorécepteurs (POS), ce qui leur permet de phagocyter et d'éliminer les POS exfoliés pour maintenir le renouvellement normal des cellules visuelles. De plus, le gène RPE65 (retinal pigment epithelium-specific 65) code une rétinoïde isomérohydrolase exprimée dans les cellules de l’EPR et est indispensable au cycle de la transduction du signal visuel en régénérant le 11-cis rétinal après exposition lumineuse. L'EPR contient aussi une quantité importante de mélanine, ce qui lui donne une coloration brun foncé. Cette mélanine réduit les dommages causés par la lumière ultraviolette à la rétine. L'EPR permet aussi de réduire l'accumulation excessive d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et les dommages oxydatifs qui en résultent. Les cellules de l'EPR forment des jonctions serrées intercellulaires constituées de ZO-1, occludine et de claudines, agissant comme une barrière entre les capillaires choroïdiens fenestrés et la couche photosensible de la rétine. De plus, les cellules de l'EPR jouent un rôle clé dans le transport des nutriments, de l'eau et des électrolytes entre la choroïde et les cellules rétiniennes. En résumé, la structure et la fonction de l'EPR sont essentielles à une vision normale, et les altérations ou la perte de l'EPR altèrent la fonction visuelle et peuvent conduire à la perte de la vision.
Diverses affections oculaires peuvent entraîner une perte des cellules de l'EPR. Par exemple, l’atrophie géographique est une forme de dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) caractérisée par l’atrophie et la disparition des cellules de l’EPR dans la macula entraînant la mort des cellules photoréceptrices sus-jacentes et la cécité. L’atrophie géographique est une cause majeure de cécité chez les personnes âgées de plus de 60 ans. Il est estimé que l'atrophie géographique affecte environ 5 millions de personnes dans le monde, et que sa prévalence augmente de manière exponentielle avec l'âge (Wong, et al., Lancet Glob Health, 2:el06-l 16, 2014 ; Rudnicka, et al., Am J Ophthalmol, 160:85-93, 2015). De plus, la majorité des patients atteint de DMLA humide évolue vers une atrophie géographique (Rofagha, et al., Ophthalmology, 120:2292-2299, 2013). La choroïdérémie mais aussi les dystrophies maculaires, telles que la maladie de Stargardt, la dégénérescence vitelliforme juvénile de la macula ou maladie de Best, la dégénérescence maculaire de Sorsby, la dégénérescence maculaire en aile de papillon, la dystrophie maculaire de la Caroline du Nord, ou la dystrophie aréolaire centrale, sont d’autres exemples d’affections oculaires dans lesquelles la disparition de l’EPR est observée. La maladie de Stargardt, en particulier, est la forme la plus commune de dégénérescence maculaire juvénile héréditaire, avec une prévalence de 1 cas pour 10 000 naissances. Il n’y a pour l’instant pas de traitement pour ces pathologies.
Par ailleurs, diverses affections oculaires provoquent des déchirures dans l'épithélium pigmentaire rétinien. L’une des causes bien connues d'une déchirure de l’EPR est un décollement pigmentaire rétinien vascularisé (DPR) chez les patients atteints de DMLA exsudative. Bien que des déchirures de l’EPR puissent se développer spontanément dans des DPR vascularisés, la plupart des cas récents ont été associés à des injections d'inhibiteurs du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (anti-VEGF). Le liquide sous-rétinien dans le DPR exerce une pression hydrostatique sur l’EPR et l'étire. Le DPR s'agrandit à mesure que la pression hydrostatique augmente. La contraction de la membrane néovasculaire choroïdienne ajoute des forces de traction à la monocouche d’EPR. En particulier dans les DPR plus importants, il est connu que le risque de déchirure de l’EPR augmente après une thérapie anti- VEGF en raison de l'augmentation de la contraction de la membrane néovasculaire choroïdienne (Mehmet Giray Ersoz et al. ; Surv Ophthalmol. 2017 Jul-Aug;62(4):493-505 ; M Sastre-Ibânez et al. ; J Fr Ophtalmol. 2019 Jan;42(l):63-72; Christoph R Clemens and Nicole Eter; Ophthalmologica. 2016 ;235(1): 1-9).
Les déchirures de l’EPR peuvent compliquer divers troubles associés au DPR, notamment la choriorétinopathie séreuse centrale, la toxémie de la grossesse, la néphropathie à immunoglobuline A (IgA) et la maladie de dépôt de chaînes légères.
Parmi d'autres causes de déchirures de l’EPR peuvent également être cités le syndrome présumé d'histoplasmose oculaire, la vitréorétinopathie proliférative avec décollement de la rétine rhématogène primaire, le trou maculaire, la traction vitréomaculaire, la chirurgie de sclérotomie pour décollement de la rétine rhématogène, l'hypertension artérielle pulmonaire familiale, la choriorétinopathie traumatique, les tumeurs choroïdiennes, la chirurgie du glaucome, la maladie de Vogt-Koyanagi-Harada, la nécrose rétinienne aiguë, la panuvéite, la sclérite, le syndrome du bébé secoué, la forte myopie, les lésions induites par des lasers ou par l’exposition excessive à des lumières (artificielles, solaire, éclipses).
Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode éprouvée permettant de prévenir des déchirures de l’EPR.
Il n’existe ainsi à l’heure actuelle que peu de propositions de traitements visant non pas à prévenir la dégradation de l’EPR mais véritablement à permettre sa régénération, sa réparation, en particulier dans le cas de déchirures de l’EPR voire même dans le cas de pathologies ayant conduit à une disparition partielle ou totale de celui-ci. Pour les pathologies de la rétine plus avancées, des approches de greffe, qui consiste en la transplantation de cellules de l’EPR ou de cellules photoréceptrices, sont actuellement en développement (Aghaizu et al Prog. Brain Res., 231 (2017), pp. 191-223; Foik et al., J. Neurosci., 38 (2018), pp. 10709-10724; Santos-Ferreira et al., Front Syst. Neurosci., 10 (2016), p. 105). Des transplantations peuvent être réalisées sur des patients présentant des degrés différents de dégénérescence rétinienne à l'aide de matériaux provenant de donneurs ou de cellules souches pluripotentes, et consister soit en des suspensions de cellules de l’EPR, soit en des feuillets rétiniens. Les stratégies à base de suspension cellulaire consistent à transplanter des cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées (Bartsch et al., Exp. Eye Res., 86 (2008), pp. 691- 700; MacLaren et al., Nature, 444 (2006), pp. 203-207; Pearson et al., Nature, 485 (2012), pp. 99-103), tandis que les transplantations de feuillets rétiniens permettent de greffer des organoïdes rétiniens contenant à la fois des cellules photoréceptrices et des neurones rétiniens internes (Assawachananont et al., Stem Cell Rep., 2 (2014), pp. 662-674; Radtke et al., Am. J. Ophthalmol., 146 (2008), pp. 172-182). Les deux méthodes ont montré une intégration cellulaire, une maturation des cellules photoréceptrices et une certaine récupération de la réponse à la lumière (Barnea-Cramer et al., Sci. Rep., 6 (2016), p. 29784; Iraha et al., Sci. Rep., 6 (2016), p. 29784).
Cependant, ces méthodes sont complexes et comportent comme toute greffe des risques de rejet, ceux-ci étant d’autant plus élevés lorsque la reconstitution rétinienne après transplantation s’avère insuffisante, réduisant les chances de prise de la greffe ainsi que la survie des greffons, ce qui joue un rôle déterminant quant à la qualité de la vision postopératoire chez le patient.
Les pathologies de la rétine représentent ainsi un enjeu majeur de santé publique en raison de leur forte prévalence et de leur impact social et économique.
Il existe par conséquent un besoin important de disposer d’une nouvelle solution permettant la réparation et/ou la régénération de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), en particulier dans des pathologies caractérisées par une déchirure ou par une absence/disparition de l’EPR.
Il existe également un besoin de disposer d’une nouvelle solution permettant de restaurer l’EPR et en particulier la barrière que forme l’EPR, chez des individus dont l’intégrité de l’EPR a été atteinte.
Il existe par ailleurs également un besoin pour améliorer la reconstruction rétinienne après transplantation d’un EPR.
Il existe également un besoin d’augmenter la prise de greffes de rétine ainsi que la survie des greffons.
Il existe de plus un besoin d’améliorer la qualité de la vision post-opératoire des patients ayant bénéficié d’une greffe de rétine telle que décrite précédemment.
La présente invention telle que décrite ci-dessous vise à répondre ces besoins.
Résumé de l’invention
Un premier objet de la présente invention concerne donc une protéine, ou un fragment de celle- ci, pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie oculaire chez un individu en ayant besoin :
(i) la pathologie oculaire étant caractérisée par une déchirure ou une disparition, partielle ou totale, de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez ledit individu ; et
(ii) la protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2. En effet, et contre toute attente, comme démontré in vivo dans deux modèles différents d’animaux dans les exemples, la décorine s’avère être capable de réparer et de régénérer l’EPR chez des individus en ayant besoin.
Par conséquent, une protéine, ou un fragment de celle-ci, selon l’invention permet avantageusement, et contre toute attente :
- de réparer les déchirures, ouvertures et/ou interruption de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) ;
- de régénérer un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) lorsque celui-ci a disparu partiellement ou totalement ;
- et ainsi de restaurer l’EPR et en particulier la barrière que forme l’EPR, chez des individus dont l’intégrité de l’EPR a été atteinte.
Ainsi, une pathologie oculaire traitée par une protéine mise en œuvre selon l’invention peut être choisie dans le groupe constitué d’une déchirure de l'épithélium pigmentaire de la rétine ; d’une atrophie géographique ; d’une choroïdérémie ; et d’une dystrophie maculaire héréditaire, en particulier choisie parmi la maladie de Stargardt, la dégénérescence vitelliforme juvénile de la macula ou maladie de Best, la dystrophie aréolaire centrale, la dégénérescence maculaire de Sorsby, la dystrophie maculaire de la Caroline du Nord, et la dégénérescence maculaire en aile de papillon.
La présente invention a également pour objet une protéine, ou un fragment de celle-ci, pour la réparation ou la régénération d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu en ayant besoin, la protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2. Une protéine mise en œuvre selon l’invention peut en outre comprendre un peptide signal, en particulier un peptide signal ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.
La présente invention a également pour objet une protéine, ou fragment de celle-ci, pour son utilisation dans la reconstruction d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu recevant ou ayant reçu une greffe d’EPR, la protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2.
Une protéine, ou un fragment de celle-ci, mise en œuvre selon l’invention peut être administrée à l’individu en ayant besoin par application topique sur l’œil, par exemple par l’intermédiaire de gouttes pour les yeux ; par injection intravitréenne ; par injection sous- conjonctivale ; par injection supra-choroïdienne ; par injection sous-rétinienne ; et/ou à l’aide d’un implant intravitréen.
La présente invention a également pour objet une séquence d’acides nucléiques pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie oculaire chez un individu en ayant besoin :
(i) la pathologie oculaire étant caractérisée par une déchirure ou une disparition, partielle ou totale, de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) ; et
(ii) la séquence d’acides nucléiques codant pour une protéine, ou un fragment de celle-ci, telle que précédemment décrite, i.e. une protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, et optionnellement en outre un peptide signal, notamment un peptide signal ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.
Ladite pathologie oculaire peut être choisie dans le groupe constitué d’une déchirure de l'épithélium pigmentaire de la rétine ; d’une atrophie géographique ; d’une choroïdérémie ; et d’une dystrophie maculaire héréditaire, en particulier choisie parmi la maladie de Stargardt, la dégénérescence vitelliforme juvénile de la macula ou maladie de Best, la dystrophie aréolaire centrale, la dégénérescence maculaire de Sorsby, la dystrophie maculaire de la Caroline du Nord, et la dégénérescence maculaire en aile de papillon.
La présente invention a également pour objet une séquence d’acide nucléique pour la réparation ou la régénération d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu en ayant besoin, la séquence d’acides nucléiques codant pour une protéine, ou un fragment de celle-ci, telle que précédemment décrite, i.e. une protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, et optionnellement en outre un peptide signal, en particulier un peptide signal ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.
Une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut comprendre une séquence ayant au moins 70% d’identité de séquence avec l’une quelconque des séquences nucléotidiques choisie dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, de la séquence SEQ ID NO : 4 et de la séquence SEQ ID NO : 5.
Une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut en outre comprendre une séquence nucléotidique codant pour un peptide signal, en particulier une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7. Une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut être comprise dans un vecteur, le vecteur pouvant en particulier être un vecteur viral, un vecteur non viral, un plasmide, un lipide, un liposome ou une nanoparticule.
Une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut se présenter sous la forme d’une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire de l’individu en ayant besoin, ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend:
(a) optionnellement une origine de réplication bactérienne ou procaryotique,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ ADN dans la sphère oculaire du patient,
(c) une séquence nucléotidique codant:
- pour une protéine thérapeutique comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment de celle-ci, et
- optionnellement pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier pour un peptide signal de séquence ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6 ; ce peptide signal, lorsqu’il est présent, étant contiguë de la séquence de la protéine thérapeutique, en N-terminal de ladite première protéine thérapeutique,
(d) un promoteur permettant l’expression de cette protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et
(e) optionnellement une séquence de polyadénylation en 3’ de la séquence nucléotidique.
Une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut être administrée à l’individu en ayant besoin par injection dans un muscle ciliaire, optionnellement suivie d’une étape d’électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.
Brève description des dessins
[Fig 1] représente, en Figure IA, les scores moyens (ordonnée) (entre 0 et 1 : grade 0 : pas de couverture de la lésion par l’EPR ou couverture avec des cellules anormales (pas hexagonales) ; grade 0.5 : couverture partielle de la lésion avec des cellules EPR hexagonales ; grade 1 : couverture complète de la lésion avec des cellules EPR hexagonales) de réparation d’une lésion avec des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien dans un groupe de rats modèle de néovascularisation choroïdienne contrôle (traités avec PBS - gauche) ou dans un groupe de rats modèle de néovascularisation choroïdienne traités avec de la décorine (DCN - droite). La Figure IB représente la répartition des scores de 1, 0,5 ou 0 (de haut en bas pour chaque barre) dans chaque groupe de rats (gauche contrôle - PBS ; droite traitement décorine - DCN). L’axe des ordonnées représente le % d’impact en fonction du score de ces deux groupes de rats.
[Fig 2] représente le pourcentage de lésions de grade 3 (score angiographique) obtenue après visualisation de la vascularisation rétinienne et choroïdienne à 14 jours (J14 - gauche) et à 28 jours (J28 - droite) chez des rats modèle de néovascularisation choroïdienne persistante induite en l’absence de traitement (contrôle).
[Fig 3] représente le pourcentage relatif de lésions de grade 3 (score angiographique) obtenue après visualisation de la vascularisation rétinienne et choroïdienne à 14 jours (J14 - gauche) et à 28 jours (J28 - droite) et comparé entre 4 groupes de rats modèles de néovascularisation choroïdienne persistante induite: de gauche à droite : groupe contrôle administré par injection d’une solution contrôle de tampon salin suivi d’une étape d'électrotransfert (Ctrl - Electroporation) ; groupe administré par injection de la construction dite plasmide A suivi d’une étape d’électrotransfert (Plasmide A - Electroporation) ; groupe contrôle administré par injection intravitréenne d’une solution contrôle de tampon phosphate (Ctrl - Injection IVT) ; groupe contrôle administré par injection intravitréenne d’ Aflibercept (15pg) (Aflibercept - Injection IVT).
[Fig 4] représente, en Figure 4A, l’évaluation de la surface d’immunomarquage positive au marqueur RPE65 (indiquant la présence de cellules de l’EPR) rapportée à la taille totale de la lésion NVC comparée entre 4 groupes de rats modèles de néovascularisation choroïdienne persistante induite : de gauche à droite : groupe contrôle administré par injection d’une solution contrôle de tampon salin suivi d’une étape d'électrotransfert (Ctrl - Electroporation) ; groupe administré par injection de la construction dite plasmide A suivi d’une étape d’électrotransfert (Plasmide A - Electroporation) ; groupe contrôle administré par injection intravitréenne d’une solution contrôle de tampon phosphate (Ctrl - Injection IVT) ; groupe contrôle administré par injection intravitréenne d’ Aflibercept (15pg) (Aflibercept - Injection IVT). En Figure 4B, pour ces mêmes 4 groupes représentés dans le même ordre de gauche à droite, est représentée la répartition de la couverture de la rétine par des cellules de l’EPR, en pourcentage. De haut en bas pour chaque colonne est représentée l’incidence des lésions en fonction du pourcentage de couverture de l’EPR (entre 80-100%, 60-80% ou 0-60% de couverture de la lésion NVC pour l’EPR). [Fig 5] représente une construction d’ADN comprenant une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention (Plasmide A).
Description détaillée
Définitions
Dans le contexte du présent texte, les termes « traiter » et « traitement » désignent une diminution, voire une interruption de la pathologie ou du trouble considéré(e).
Le terme « patient » ou « individu » tel qu’utilisé dans le présent texte désigne de préférence un mammifère, y compris un mammifère non-humain, et plus particulièrement un être humain. En particulier, il s’agit d’un patient ou d’un individu souffrant d’une pathologie oculaire, en particulier d’une pathologie oculaire caractérisée par une déchirure ou une disparition, partielle ou totale, de l’épithélium pigmentaire rétinien, plus particulièrement souffrant d’une pathologie oculaire choisie dans le groupe constitué d’une déchirure de l'épithélium pigmentaire de la rétine, d’une atrophie géographique, d’une choroïdérémie ; et d’une dystrophie maculaire héréditaire, en particulier choisie parmi la maladie de Stargardt, la dégénérescence vitelliforme juvénile de la macula ou maladie de Best, la dystrophie aréolaire centrale, la dégénérescence maculaire de Sorsby, la dystrophie maculaire de la Caroline du Nord, et la dégénérescence maculaire en aile de papillon.
Pour chacune des séquences d'acides aminés ou d’acides nucléiques d'intérêt, des séquences de référence sont décrites ici. La présente description englobe également des séquences d'acides aminés ou nucléiques ayant des pourcentages spécifiques d'identité d'acides aminés ou de nucléotides avec une séquence de référence.
Pour des raisons évidentes, dans toute la présente description, une séquence spécifique d'acides nucléiques ou une séquence spécifique d'acides aminés qui respecte, respectivement, l'identité de nucléotide ou d'acide aminé considérée, doit en outre conduire à l'obtention d'une protéine qui présente l’activité biologique recherchée. Tel qu'utilisé ici, le "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides nucléiques ou entre deux séquences d'acides aminés est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence de nucléotides ou d'acides aminés dans la fenêtre de comparaison peut donc comprendre des ajouts ou des suppressions (par exemple des "trous") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces ajouts ou ces suppressions) afin d'obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Les termes "homologie de séquence" ou "identité de séquence" ou "homologie" ou "identité" sont utilisés indifféremment dans le présent document. Aux fins de l'invention, on entend par là que pour déterminer le pourcentage d'homologie de séquence ou d'identité de séquence de deux séquences d'acides aminés ou de deux séquences d'acides nucléiques, les séquences sont alignées à des fins de comparaison optimale. Afin d'optimiser l'alignement entre les deux séquences, des lacunes peuvent être introduites dans n'importe laquelle des deux séquences comparées. Cet alignement peut être effectué sur toute la longueur des séquences comparées. L'alignement peut également être effectué sur une longueur plus courte, par exemple sur une vingtaine, une cinquantaine, une centaine ou plus d'acides nucléiques/bases ou d'acides aminés. L'identité de séquence est le pourcentage de correspondances identiques entre les deux séquences sur la région alignée déclarée.
La comparaison des séquences et la détermination du pourcentage d'identité de séquence entre deux séquences peuvent être effectuées à l'aide d'un algorithme mathématique. L'homme du métier sait que plusieurs programmes informatiques différents sont disponibles pour aligner deux séquences et déterminer l'identité entre deux séquences (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley).
Le pourcentage d'identité de séquence entre deux séquences d'acides aminés ou entre deux séquences de nucléotides peut être déterminé à l'aide de l'algorithme de Needleman et Wunsch pour l'alignement de deux séquences. (Needleman, S. B. et Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). L'algorithme permet d'aligner à la fois des séquences d'acides aminés et des séquences de nucléotides. L'algorithme Needleman-Wunsch a été mis en œuvre dans le programme informatique NEEDLE.
Pour les besoins de l'invention, le programme NEEDLE du progiciel EMBOSS a été utilisé (version 2.8.0 ou supérieure, EMBOSS : The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. LongdenJ. et Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp276- 277, http://emboss.bioinformatics.nl/). Pour les séquences de protéines, EBLOSUM62 est utilisé pour la matrice de substitution. Pour les séquences de nucléotides, EDNAFULL est utilisé. Les paramètres facultatifs utilisés sont une pénalité d'ouverture d'espace de 10 et une pénalité d'extension d'espace de 0,5. Aucune pénalité d'écart de fin n'est ajoutée. Dans la section Output, Yes a été indiqué en réponse à la question "Brief identity and similarity" et "SRS pairwise" a été indiqué comme format d'alignement de sortie. Après l'alignement par le programme NEEDLE décrit ci-dessus, le pourcentage d'identité de séquence entre une séquence d'interrogation et une séquence de l'invention est calculé comme suit : Nombre de positions correspondantes dans l'alignement montrant un acide aminé identique ou un nucléotide identique dans les deux séquences divisé par la longueur totale de l'alignement après soustraction du nombre total de lacunes dans l'alignement. L'identité définie ici peut être obtenue à partir de NEEDLE en utilisant l'option NOBRIEF et est étiquetée dans la sortie du programme comme "identité la plus longue".
La similarité des séquences de nucléotides et d'acides aminés, c'est-à-dire le pourcentage d'identité des séquences, peut être déterminée par des alignements de séquences à l'aide de plusieurs autres algorithmes connus, de préférence avec l'algorithme mathématique de Karlin et Altschul (Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873-5877), avec hmmalign (HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/) ou avec l'algorithme CLUSTAL (Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80) disponible par exemple sur https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ ou le programme GAP (algorithme mathématique de l'Université de l'Iowa) ou l'algorithme mathématique de Myers et Miller (1989 - Cabios 4 : 11-17) ou Clone Manager 9. Les paramètres préférés utilisés sont les paramètres par défaut tels qu'ils sont définis sur https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
Le degré d'identité des séquences (concordance des séquences) peut être calculé à l'aide, par exemple, de BLAST, BLAT ou BlastZ (ou BlastX). Un algorithme similaire est incorporé dans les programmes BLASTN et BLASTP d' Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Les recherches polynucléotidiques BLAST sont effectuées avec le programme BLASTN, score = 100, longueur de mot = 12, afin d'obtenir des séquences polynucléotidiques homologues aux acides nucléiques qui codent la protéine concernée.
Les recherches BLAST sur les protéines sont effectuées avec le programme BLASTP, score = 50, longueur de mot = 3, pour obtenir des séquences d'acides aminés homologues au polypeptide SHC. Pour obtenir des alignements gappés à des fins de comparaison, Gapped BLAST est utilisé comme décrit dans Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. Lors de l'utilisation des programmes BLAST et Gapped BLAST, les paramètres par défaut des programmes respectifs sont utilisés. L'analyse de la correspondance des séquences peut être complétée par des techniques établies de cartographie homologique telles que Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1 : 154-162) ou les champs aléatoires de Markov. Lorsqu'il est fait référence à des pourcentages d'identité de séquence dans la présente demande, ces pourcentages sont calculés par rapport à la longueur totale de la séquence la plus longue, sauf indication contraire.
Dans des modes de réalisation particuliers, le pourcentage d'identité entre deux séquences est déterminé à l'aide de CLUSTAL O (version 1.2.4).
Peptide décorine
La décorine est une glycoprotéine sécrétée de la famille des protéoglycanes à répétition riche en leucine (SLRP). Les membres de la famille SLRP sont caractérisés par des régions riches en cystéine en N- et C terminal qui encadrent une région centrale contenant 10 à 12 répétitions en tandem riches en leucine (Schaefer, L. and R.V. lozzo, J. Biol. Chem. 283:21305, 2008). L'ADN complémentaire de la décorine humaine code pour un précurseur de 359 acides aminés (AA) qui comprend une séquence signal de 16 AA et un propeptide de 14 AA qui est clivé pendant la maturation de la protéine (Krusius, T. and E. Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci, 83:7683, 1986 ; Danielson, et al., Genomics, 15: 146-160, 1993). La décorine humaine mature contient douze répétitions en tandem riches en leucine et partage 80% et 78% d'identité de séquence d'AA avec la décorine de souris et de rat, respectivement. L'épissage alternatif de la décorine humaine génère cinq isoformes avec des délétions de longueur variable. La décorine est une protéine glycosylée en N-terminale qui porte également une chaîne hybride chondroïtine/dermatane sulfate de taille variable au niveau de Ser34 (Scholzen, T. et al., J. Biol. Chem, 269:28270, 1994; Zamfir, A. et al., Glycobiology, 13:733, 2003). Le protéoglycane naturel de la décorine a une masse moléculaire d'environ 100 kDa, et la protéine centrale déglycosylée de la décorine a une masse d'environ 40 kDa (Roughley, P.J and R.J. White, Biochem. J, 262:823, 1989).
La décorine est une protéine de la matrice extracellulaire (MEC) et interagit avec des protéines de la MEC, notamment le collagène de type I et II, la fibronectine, et la thrombospondine, et contribue à leur organisation et à leur stabilité (Scott, JE, Biochemistry, 35 : 8795, 1996 ; Scott, JE, et.al., Exp. Cell Res., 243 : 59-66, 1998). La décorine, en particulier, joue un rôle critique dans le contrôle de la croissance et dans l’organisation des fibres de collagène de la cornée pour la rendre transparente (Rada, JA, Exp Eye Res, 56 ; 635, 1993). En conséquence, l'utilisation de la décorine pour stabiliser le stroma coméen a été suggérée dans l’art antérieur en complément de l’orthokératologie pour la correction de la myopie, de l’hypermétrie, de l’astigmatisme et de la presbytie (par exemple, US2009/0105127). L’utilisation de la décorine pour stabiliser et organiser les fibres de collagène de la MEC dans les tissus rétiniens, en particulier la membrane de Bruch, a aussi été suggérée dans l'art antérieur pour le traitement de la DMLA ou de la rétinopathie diabétique (par exemple, WO2011/069046). Dans ce brevet, les inventeurs ont découvert que la décorine peut être administrée dans le fond de l’œil pour empêcher, retarder ou limiter la progression de la désorganisation de la matrice extracellulaire de la membrane de Bruch.
La décorine régule aussi l’activité biologique des facteurs de croissance associés à la matrice extracellulaire, notamment le fibroblast growth factor 2 (FGF2), la Myostatine, et le transforming growth factor beta (TGFP) (Jârvelâinen, et al., Matrix Biol, 43, 15-26, 2015). Elle se lie également aux récepteurs tyrosine kinase membranaires, notamment le récepteur de l'EGF epidermal growth factor), le récepteur de l’IGFl (insulin-like growth factor- 7) et le récepteur du VEGF (vascular endothelial growth factor), et régule leur activité. In vivo, la décorine favorise l'inhibition ou l'induction de l'angiogenèse (Grant, et.al., Oncogene, 21/ 4765-4777, 2002 ; Sulochana, et.al., J. Biol. Chem. 280:27935-27948, 2005). En effet, selon le microenvironnement, la décorine peut exercer des effets pro ou anti-angiogéniques. En conséquence, l'utilisation de la décorine pour inhiber l'angiogenèse a été suggérée dans l'art antérieur pour le traitement de la DMLA exsudative (par exemple, W02005116066 et WO201 1069046). En particulier, WO2011069046 a suggéré que l'injection intravitréenne de décorine pourrait convenir au traitement de la DMLA. L’injection intravitréenne de décorine réduit en effet la néovascularisation choroïdienne induite par photocoagulation au laser de la choroïde chez le rongeur (Wang, et al, Scientific Reports, 7:9672, 2017 ; Zhao, et al. Nature Communications, 10:369, 2019). En particulier, la décorine est utilisée pour son activité inhibitrice du TGFp, une protéine bien connue pour activer l'angiogenèse et le remodelage vasculaire en modulant la prolifération des cellules endothéliales, l'infiltration des macrophages, ainsi que le dépôt et le remodelage protéolytique de la MEC. Ainsi, l’utilisation de la décorine a été suggérée dans l’art antérieur pour le traitement des formes de néovascularisations choroïdiennes résistantes au traitement anti-VEGF (par exemple, WO2019229116).
La décorine est également décrite pour son activité inhibitrice de la transition épithélio- mésenchymateuse (TEM). En particulier, la décorine inhibe la TEM des cellules de l’EPR induite par TGFP2 in vitro et réduit la synthèse de collagène, suggérant que la décorine pourrait empêcher ou ralentir la formation de fibrose sou s -rétinienne qui survient dans la DMLA (Begum, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci, 59:4929-4936 2018). La décorine permet aussi de réduire la progression de la fibrose dans un modèle de vitréorétinopathie proliférative traumatique chez le lapin (Nassar, et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 249 :1649, 2011). L’injection intravitréenne de la protéine recombinante décorine permet aussi de réduire la fibrose du réseau trabéculaire dans le canal de Schlemm chez le lapin, suggérant que la décorine pourrait réduire la pression intraoculaire pour le traitement du glaucome (Hill, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 56:3743-57, 2015).
La décorine est décrite aussi pour ses propriétés de cytoprotection, notamment vis-à-vis des cellules de l’EPR soumises à un stress oxydatif (Xie, et al., Oxidative Medicine and Cellular Longevity, ID 3955748, 2022). La décorine prévient aussi la rupture de la barrière de l’EPR induite par un apport élevé en glucose et une hypoxie en supprimant l'activation de la MAPK p38, suggérant que la décorine pourrait inhiber le développement des œdèmes maculaires diabétiques (Wang, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 56:2971-2979, 2015).
Il n’avait toutefois jamais été démontré ou même suggéré que la décorine puisse être capable de réparer et de régénérer un EPR. La décorine selon l’invention comprend une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2.
Par au moins 85% d’identité de séquences, on entend désigner une séquence d’acides aminés comprenant au moins 85 %, au moins 86 %, au moins 87 %, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% ou 100% d’identité de séquence avec la séquence d’acides aminés de séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence d’acides aminés de séquence SEQ ID NO : 2.
La demande couvre également la mise en œuvre d’un fragment d’une protéine mise en œuvre selon l’invention, à savoir de la protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2.
Par « fragment », on entend un « fragment fonctionnel », c’est-à-dire une séquence protéique ou une séquence d’acides nucléiques qui, une fois exprimée, présente la même activité qu’une protéine de SEQ ID NO : 1 ou qu’une protéine de SEQ ID NO : 2. En particulier, on entend une séquence protéique ou une séquence d’acides nucléiques qui, une fois exprimée, présente la même activité que la décorine, notamment tel que démontré dans les exemples ci-après et comme mentionné ci-dessus.
Dans la présente demande, sauf indication contraire, lorsque le terme protéine est employé, on entend de manière indifférente désigner une protéine ou un fragment de protéine.
Dans certains cas, des fragments fonctionnels de protéines selon l’invention peuvent notamment être obtenus par digestion protéolytique de protéines natives, notamment de décorine, par des techniques bien connues dans l’art. Des exemples de telles méthodes, ainsi que des fragments fonctionnels de décorine, sont notamment décrits dans EP0636175 Al.
La protéine mise en œuvre selon l’invention peut par ailleurs comprendre un peptide signal, en particulier un peptide signal ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence peptidique SEQ ID NO : 6.
Par au moins 70% d’identité de séquences avec la séquence SEQ ID NO : 6, on entend désigner une séquence d’acides aminés comprenant au moins 70 %, au moins 71 %, au moins 72 %, au moins 73 %, au moins 74 %, au moins 75 %, au moins 76 %, au moins 77 %, au moins 78%, au moins 79 %, au moins 80 %, au moins 81 %, au moins 82 %, au moins 83 %, au moins 84 %, au moins 85 %, au moins 86 %, au moins 87 %, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou au moins 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.
Une protéine mise en œuvre selon l’invention peut être glycosylée ou non glycosylée, et en particulier peut être glycosylée, plus particulièrement glycosylée sur sa partie N-terminale.
La présente invention concerne également la mise en œuvre d’une séquence d’acides nucléiques codant pour la décorine. Une telle séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention code ainsi pour une protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, , ou un fragment de celle-ci, telles que définies ci-dessus, et en particulier pour une protéine comprenant la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment de celle-ci.
Une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut en particulier avoir au moins 70% d’identité de séquence avec l’une quelconque des séquences nucléotidiques choisie dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, de la séquence SEQ ID NO : 4 et de la séquence SEQ ID NO : 5.
Par au moins 70% d’identité de séquences avec la séquence SEQ ID NO : 3, la séquence SEQ ID NO : 4 ou la séquence SEQ ID NO : 5, on entend désigner une séquence d’acides nucléiques comprenant au moins 70 %, au moins 71 %, au moins 72 %, au moins 73 %, au moins 74 %, au moins 75 %, au moins 76 %, au moins 77 %, au moins 78%, au moins 79 %, au moins 80 %, au moins 81 %, au moins 82 %, au moins 83 %, au moins 84 %, au moins 85 %, au moins 86 %, au moins 87 %, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou au moins 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, la séquence SEQ ID NO : 4 ou la séquence SEQ ID NO : 5.
En particulier, une séquence d’acides nucléiques peut avoir au moins 75 % d’identité de séquence, en particulier au moins 80 % d’identité de séquences, plus particulièrement 85 % d’identité de séquence voire 90 % d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 3, la séquence SEQ ID NO : 4 ou la séquence SEQ ID NO : 5.
Une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut par ailleurs en outre comprendre une séquence nucléotidique codant pour un peptide signal, en particulier une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7.
Par au moins 70% d’identité de séquences avec la séquence SEQ ID NO : 7, on entend désigner une séquence d’acides nucléiques comprenant au moins 70 %, au moins 71 %, au moins 72 %, au moins 73 %, au moins 74 %, au moins 75 %, au moins 76 %, au moins 77 %, au moins 78%, au moins 79 %, au moins 80 %, au moins 81 %, au moins 82 %, au moins 83 %, au moins 84 %, au moins 85 %, au moins 86 %, au moins 87 %, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98% au moins 99% ou au moins 100% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7.
Une séquence d’acides nucléiques selon l’invention peut être choisie parmi une séquence d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou une séquence d'acide ribonucléique (ARN). Une séquence d'acide désoxyribonucléique peut être de l'ADN génomique ou de l'ADNc. Une séquence d'acide ribonucléique peut être notamment choisie parmi les ARNm, les ARNt, les ARNr, les siARN, les ARN en épingle à cheveux courts (shARN) ou les microARN (mi ARN). Selon un mode de réalisation particulier, une séquence d’acides nucléiques selon l’invention peut être une séquence d’ ARNm. Une telle séquence d’ARNm peut en particulier correspondre à la séquence transcrite à partir d’une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention ayant au moins 70% d’identité de séquence avec l’une quelconque des séquences nucléotidiques choisie dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, de la séquence SEQ ID NO : 4 et de la séquence SEQ ID NO : 5, et en particulier correspondre à la séquence transcrite à partir d’une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention choisie dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, de la séquence SEQ ID NO : 4 et de la séquence SEQ ID NO : 5.
Une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut en particulier être comprise dans un vecteur.
Tel qu'utilisé ici, le terme « vecteur » fait référence à une molécule d'acide nucléique capable de transporter un autre acide nucléique auquel il a été lié. Ce terme entend par ailleurs également désigner tout support de délivrance, tel qu'une composition associée à un acide nucléique thérapeutique ou prophylactique afin d'augmenter sa délivrance cellulaire.
En particulier, le vecteur peut être un vecteur viral, un vecteur non viral, un plasmide, un lipide, un liposome ou une nanoparticule. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, la séquence d’acides nucléique peut être comprise dans un vecteur, le vecteur étant en particulier un vecteur viral, un vecteur non viral, un plasmide, un lipide, un liposome ou une nanoparticule.
Des vecteurs pouvant particulièrement convenir sont ceux capables de réplication autonome et/ou d'expression des séquences d’acides nucléiques auxquels ils sont liés. Les vecteurs capables de diriger l'expression de gènes auxquels ils sont fonctionnellement liés sont appelés ici "vecteurs d'expression".
Selon un mode de réalisation, une séquence d'acide nucléique mise en œuvre selon l’invention peut être comprise dans un plasmide. En général, les vecteurs d'expression utiles dans les techniques d'ADN recombinant se présentent souvent sous la forme de "plasmides" qui désignent des boucles d'ADN double brin circulaires qui, sous leur forme de vecteur, ne sont pas liées au chromosome.
Les vecteurs peuvent également être de l'ADN épisomique, des chromosomes artificiels de levure, ou des minichromosomes.
Les vecteurs peuvent être d’origine viral, et on parle alors de vecteurs viraux.
Un vecteur viral convenant selon la présente invention peut être choisi dans le groupe consistant en un rétrovirus, en particulier un lentivirus, un adénovirus, un virus adéno-associé et un vecteur de type virus. Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur viral est un vecteur rétroviral ou un vecteur viral adéno-associé (AAV).
Un vecteur viral convenant selon la présente invention peut également être choisi parmi les vecteurs Herpes simplex virus (HSV), et en particulier parmi les vecteurs HSV non- réplicatifs. On parle ainsi ici de vecteur HSV. Un tel vecteur peut en particulier être un vecteur Virus herpes simplex 1 ou 2 (HSV-1 ou HSV-2), et en particulier un vecteur HSV-1.
Par « vecteur HSV », on entend un vecteur viral dérivé du virus de l'herpès simplex, notamment de type 1 (HSV1).
Les vecteurs rétroviraux sont des particules virales qui contiennent un génome viral dérivé de rétrovirus, n'ont pas la capacité d'auto-renouvellement et ont la capacité d'introduire une séquence d’acides nucléiques dans une cellule. Par exemple, un vecteur rétroviral peut être un vecteur alpha-rétroviral, un vecteur gamma-rétroviral, un vecteur lentiviral ou un vecteur spuma-rétroviral, de préférence un vecteur lentiviral. De tels vecteurs ont été largement utilisés dans des traitements de thérapie génique et d'autres applications de délivrance de gènes.
Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur rétroviral est un vecteur lentiviral. Les termes « vecteur lentiviral », tels qu'utilisés ici, désignent un vecteur viral dérivé de rétrovirus complexes tels que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Des vecteurs lentiviraux dérivés de n'importe quelle souche et sous-type peuvent être utilisés. Le vecteur lentiviral peut être basé sur un lentivirus humain ou de primate tel que le VIH ou un lentivirus non humain tel que le virus de l'immunodéficience féline, le virus de l'immunodéficience simienne et le virus de l'anémie infectieuse équine (EIAV). Dans un mode de réalisation particulier, le vecteur lentiviral est un vecteur à base de VIH et notamment un vecteur à base de VIH-1.
Les vecteurs AAV sont des particules virales qui contiennent un génome dérivé d'AAV, n'ont pas la capacité d'auto-renouvellement et ont la capacité d'introduire une séquence d’acides nucléiques dans une cellule.
Par « vecteur AAV », on entend un vecteur viral dérivé d'un sérotype de virus adéno-associé, y compris, sans limitation, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV6, etc. Un vecteur AAV peut avoir un ou plusieurs des gènes de type sauvage d'AAV supprimés en totalité ou en partie, de préférence les gènes rep et/ou cap, mais conservent des séquences ITR flanquantes fonctionnelles. Les séquences ITR fonctionnelles sont nécessaires pour le sauvetage, la réplication et l'encapsidation du virion AAV. Ainsi, un vecteur AAV est défini ici pour inclure au moins les séquences requises en cis pour la réplication et l'encapsidation (par exemple, les ITR fonctionnels) du virus. Les ITR n'ont pas besoin d'être les séquences nucléotidiques de type sauvage et peuvent être modifiées, par ex. g, par l'insertion, la délétion ou la substitution de nucléotides, tant que les séquences permettent une récupération fonctionnelle, une réplication et une encapsidation. Les vecteurs AAV sont construits en utilisant des techniques connues pour fournir au moins comme composants liés de manière opérationnelle dans la direction de la transcription, des éléments de contrôle comprenant une région d’initiation de la transcription, l’ ADN d’intérêt et une région de terminaison de la transcription. Les éléments de contrôle sont sélectionnés pour être fonctionnels dans une cellule de mammifère. La construction résultante qui contient les composants liés de manière opérationnelle est liée (5’ et Y) avec des séquences ITR d’ AAV fonctionnelles. Par « répétition terminale inversée du virus adéno-associé » ou « AAVITR », on entend les régions reconnues dans l’art trouvées à chaque extrémité du génome de l’AAV qui fonctionnent ensemble en cis comme origines de réplication de l’ ADN et comme signaux d’ encapsidation pour le virus. Les ITR d’AAV, conjointement avec la région codante rep d’AAV, permettent l’excision et la récupération efficaces de, et l’intégration d’une séquence nucléotidique interposée entre deux ITR flanquants dans un génome de cellule de mammifère. Les séquences nucléotidiques des régions ITR d’AAV sont connues. Voir, e. g., Kotin, 1994 ; Berns, KI « Parvoviridae and their Replication » in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.) pour la séquence AAV-2. Tel qu’utilisé ici, un « AAV ITR » ne comprend pas nécessairement la séquence nucléotidique de type sauvage, mais peut être modifié, par ex. par exemple, par l’insertion, la délétion ou la substitution de nucléotides. De plus, l’ITR d’AAV peut être dérivé de l’un quelconque de plusieurs sérotypes d’AAV, y compris, sans s’y limiter, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV6, etc. En outre, en 5’ et 3,’ Les ITR qui flanquent une séquence nucléotidique sélectionnée dans un vecteur AAV ne doivent pas nécessairement être identiques ou dérivés du même sérotype ou isolat d’AAV, tant qu’ils fonctionnent comme prévu, i. e., pour permettre l’excision et le sauvetage de la séquence d’intérêt à partir d’un génome ou d’un vecteur de cellule hôte, et pour permettre l’intégration de la séquence hétérologue dans le génome de la cellule receveuse lorsque les produits du gène AAV Rep sont présents dans la cellule.
La séquence d’acides nucléiques d’intérêt est en particulier liée de manière fonctionnelle à des éléments de contrôle qui dirigent la transcription ou l'expression de celle-ci chez le sujet in vivo. De tels éléments de contrôle peuvent comprendre des séquences de contrôle normalement associées au gène sélectionné. En variante, des séquences de contrôle hétérologues peuvent être employées. Des séquences de contrôle hétérologues utiles comprennent généralement celles dérivées de séquences codant pour des gènes de mammifères ou viraux. Des exemples comprennent, mais sans s'y limiter, le promoteur de la phosphoglycérate kinase (PKG), le promoteur précoce SV40, le promoteur LTR du virus de la tumeur mammaire de souris ; promoteur tardif majeur d'adénovirus (Ad MLP) ; un promoteur du virus de l'herpès simplex (HSV), un promoteur du cytomégalovirus (CMV) tel que la région du promoteur précoce immédiat du CMV (CMVIE), le promoteur du virus du sarcome de Roux (RSV), un promoteur hybride CMV/béta-actine (CAG), des promoteurs synthétiques, des promoteurs hybrides, etc.
Un virus recombinant est un virus qui comprend une séquence d’acides nucléiques recombinante, c’est à dire une séquence d’acides nucléiques qui comprend des parties qui n'apparaissent pas naturellement ensemble dans le cadre d'une séquence unique ou qui ont été réarrangées par rapport à une séquence naturelle. Ainsi, un « vecteur viral recombinant » (e.g. un « vecteur rétroviral recombinant » ou un « vecteur AAV recombinant ») désigne un vecteur viral comprenant dans son génome une séquence nucléotidique recombinante (ou transgène).
Le vecteur peut également être un lipide, notamment une vésicule lipidique telle qu'un liposome, des micelles de nanoparticules lipidiques solides (SLN) ou des nanoparticules polymériques. Des composés à base de lipides qui ne sont pas des liposomes peuvent en outre être utilisés. Par exemple, les lipofectines et les cytofectines sont des ions positifs à base de lipides qui se lient à un acide nucléique chargé négativement et forment un complexe qui peut transporter l'ADN à travers une membrane cellulaire.
Selon un mode de réalisation particulier, une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut se présenter sous la forme d’une construction d’ADN, en particulier sous la forme d’une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire du patient en ayant besoin.
Ainsi, une séquence d'acide nucléique mise en œuvre selon l’invention peut également contenir une ou plusieurs régions supplémentaires, par exemple des éléments régulateurs de petite ou grande taille à la disposition de l'homme du métier comme une région promotrice (constitutive, régulée, inductible, tissu-spécifique , etc.), par exemple des séquences permettant et/ou favorisant l'expression dans le tissu ciblé (e.g. dans la sphère oculaire du patient) ou cellules (e.g. EPR ou photorécepteurs), un signal de terminaison de la transcription, telle qu’une séquence de polyadénylation en 3’ de la séquence nucléotidique, des séquences de sécrétion, une origine de réplication et/ou de localisation nucléaire des séquences signal (nls) qui améliorent davantage le transfert de polynucléotide vers le noyau cellulaire. De telles séquences nls ont été décrites dans l'art antérieur, y compris la séquence de l'antigène T large du SV40.
Selon un mode de réalisation particulier, la séquence d’acides nucléiques peut se présenter sous la forme d’une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire du patient en ayant besoin, ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend:
(a) optionnellement une origine de réplication bactérienne ou procaryotique, en particulier bactérienne,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ ADN dans la sphère oculaire du patient,
(c) une séquence nucléotidique codant :
- pour une protéine thérapeutique comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment de celle-ci, et
- optionnellement pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier pour un peptide signal ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6; ce peptide signal, lorsqu’il est présent, étant contiguë de la séquence de la protéine thérapeutique, en N-terminal de ladite première protéine thérapeutique,
(d) un promoteur permettant l’expression de cette protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et
(e) optionnellement une séquence de polyadénylation en 3’ de la séquence nucléotidique.
En particulier, la séquence nucléotidique codant:
- pour une protéine thérapeutique comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment de celle-ci, et
- optionnellement pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier pour un peptide signal ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6; comprend plus particulièrement:
- une séquence d’acides nucléiques codant pour une protéine thérapeutique, cette séquence d’acides nucléiques ayant au moins 70% d’identité de séquence avec l’une quelconque des séquences nucléotidiques choisie dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, de la séquence SEQ ID NO : 4 et de la séquence SEQ ID NO : 5 et plus particulièrement comprend une séquence choisie dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, de la séquence SEQ ID NO : 4 et de la séquence SEQ ID NO : 5 ; et
- optionnellement une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7, ce peptide signal, lorsqu’il est présent, étant contiguë de la séquence de la protéine thérapeutique, en N-terminal de ladite première protéine thérapeutique.
La séquence d'acide nucléique sous forme d’une construction d’ADN, en particulier de forme circulaire ou d’ADN nu, peut être complexée avec tout agent chimique, biochimique ou biologique, peut être inséré dans un vecteur, etc., lorsqu'elle est administrée au patient.
Selon un mode de réalisation particulier, la construction d’ADN est de forme circulaire.
Tel qu'utilisé ici, le terme « de forme circulaire » ou « fermée » fait référence à toute molécule d'acide nucléique formant une molécule circulaire. Dans le cas d'ADN circulaire double -brin, on distingue les molécules ouvertes, dites relâchées, et les molécules fermées qui souvent sont superenroulées.
Selon un mode de réalisation particulier, la construction d’ADN est de l’ADN nu.
Tel qu'utilisé ici, le terme « ADN nu » fait référence à toute molécule d'acide nucléique qui n'est pas associée à un agent synthétique, biosynthétique, chimique, biochimique ou biologique améliorant la délivrance ou le transfert dudit ADN, ou facilitant son entrée dans la cellule. Le plasmide est une forme particulière d'ADN nu selon l'invention.
De plus, la séquence d'acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peut en outre comprendre des marqueurs sélectionnables utiles pour sélectionner, mesurer et surveiller les résultats de transfert d'acide nucléique (transfert vers quels tissus, durée d'expression, etc.). Les types de systèmes d'expression et de gènes rapporteurs qui peuvent être utilisés ou adaptés pour une utilisation sont bien connus dans fart. Par exemple, des gènes codant pour une activité luciférase, une activité phosphatase alcaline ou une activité protéine fluorescente verte sont couramment utilisés.
La séquence d'acide nucléique peut être préparée et produite selon les techniques classiques de l'ADN recombinant, telles que l'amplification, la culture dans des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes, la synthèse enzymatique, la purification, etc. Les techniques de la technologie de l'ADN recombinant sont connues de l'homme du métier. Compositions pharmaceutiques
Une protéine ou une séquence d’acides nucléiques mise en œuvre selon l’invention peuvent être présentes dans une composition pharmaceutique comprenant également au moins un milieu pharmaceutiquement acceptable.
Le terme « pharmaceutiquement » ou « pharmaceutiquement acceptable » désigne des entités moléculaires et des compositions qui ne produisent pas de réaction indésirable, allergique ou autre, lorsqu'elles sont administrées à un mammifère, en particulier un être humain, selon le cas. Un support ou excipient pharmaceutiquement acceptable fait référence à une charge solide, semi-solide ou liquide non toxique, un diluant, un matériau d'encapsulation ou un auxiliaire de formulation de tout type.
Les supports, excipients ou diluants pharmaceutiquement acceptables comprennent les diluants et les charges qui sont pharmaceutiquement acceptables pour les procédés de l'invention, sont stériles et peuvent être choisis parmi une solution saline tamponnée isotonique neutre à légèrement acide (y compris les phosphates, le chlorure, etc. ), des solutions ou suspensions aqueuses ou oléagineuses et plus préférentiellement parmi le saccharose, le tréhalose, les tensioactifs, les protéines et les acides aminés. Le support, excipient ou diluant pharmaceutiquement acceptable est de préférence formulé en utilisant des agents dispersants, mouillants, suspenseurs, apaisants, isotoniques ou augmentant la viscosité, des stabilisants, des conservateurs et des tampons appropriés pour former une solution isotonique. Le support pharmaceutiquement acceptable particulier et le rapport du composé actif au support sont déterminés par la solubilité et les propriétés chimiques de la composition, le mode particulier d'administration et la pratique pharmaceutique standard. L'homme du métier comprendra comment formuler de tels véhicules par des techniques connues.
Un exemple de stabilisant est l'édétate disodique. Des exemples d'agents isotoniques sont la glycérine, le propylèneglycol, le polyéthylèneglycol, l’acide éthylène diamine tétra- acétique, le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, le sorbitol et le mannitol ou similaires. Des exemples de tampons sont l'acide citrique, l'hydrogénophosphate de sodium, l'acide acétique glacial et le trométamol ou similaire. Des exemples d'agents d'ajustement du pH sont l'acide chlorhydrique, l'acide citrique, l'acide phosphorique, l'acide acétique, l'hydroxyde de sodium, le carbonate de sodium et l'hydrogénocarbonate de sodium ou similaire. Un exemple d'agents apaisants est l'alcool benzylique ou similaire. Des exemples de conservateurs sont le chlorure de benzalkonium, le chlorure de benzéthonium, les esters de p-hydroxybenzoate, le benzoate de sodium et le chlorobutanol ou similaire.
Une viscosité supérieure à celle des solutions aqueuses simples peut être souhaitable pour augmenter l'absorption oculaire de la protéine ou de la séquence d’acides nucléiques, pour diminuer la variabilité dans la distribution des formulations, pour diminuer la séparation physique des composants d'une suspension ou d'une émulsion de formulation et/ou autrement pour améliorer la formulation ophtalmique. Ces agents augmentant la viscosité comprennent, par exemple, l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, la méthylcellulose, l'hydroxypropylméthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose ou d'autres agents connus de l'homme du métier. De tels agents sont typiquement employés à un niveau d'environ 0,01 % à environ 2 % en poids par rapport au poids total de la composition pharmaceutique.
Les formes de préparation de la composition pharmaceutique destinées à être administrées, en particulier dans les cellules musculaires de la sphère oculaire, sont de préférence des préparations liquides. Les préparations liquides peuvent être préparées, par exemple, en dissolvant la protéine ou la séquence d’acides nucléiques dans du BSS (Balanced Salt Solution), une solution de glycérine, une solution d'acide hyaluronique et similaire. Une composition particulière comprend par exemple du BBS (60%) et de l'acide hyaluronique (40%). Un stabilisant, un agent isotonique, un tampon, un ajusteur de pH, un agent apaisant, un conservateur, des électrolytes, tels que le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium et/ou le chlorure ou similaire peuvent éventuellement être ajoutés en quantité adéquate au liquide.
A titre illustratif, la concentration de décorine sous forme protéique administrée peut aller d'environ 0,01 mg/mL à environ 1000 mg/mL. Dans certains cas, la concentration peut être comprise entre 0,05 mg/mL et 750 mg/mL, tandis que dans d'autres cas, elle peut être comprise entre 0,1 mg/mL et 500 mg/mL. Dans d'autres modes de réalisation encore, la concentration va d'environ 0,2 mg/mL à environ 250 mg/mL, d'environ 0,3 mg/mL à environ 200 pg/mL, d'environ 0,5 mg/mL à environ 100 mg/mL, d'environ 0,75 mg/mL à environ 50 mg/mL, d'environ 0,75 mg/mL à environ 25 mg/mL, ou d'environ 1,0 mg/mL à environ 10 mg/mL.
La composition pharmaceutique peut comprendre un ou plusieurs adjuvant(s) supplémentaire(s). L'adjuvant peut être choisi parmi toute substance, mélange, soluté ou composition facilitant ou augmentant l'activité biologique de la protéine ou de la séquence d’acides nucléiques tel que tout agent biologique, synthétique ou biosynthétique améliorant la délivrance ou le transfert dudit agent et assimilable à un vecteur (comme transporteur de livraison) selon l'invention. L'adjuvant peut être conditionné et administré séparément ou séquentiellement à partir de la composition contenant l'agent prophylactique ou thérapeutique et/ou à un site d'injection distinct. Le traitement avec de multiples agents et/ou adjuvants selon l'invention n'a pas besoin d'être effectué en utilisant un mélange d'agents et/ou d'adjuvants mais peut être effectué en utilisant des préparations pharmaceutiques séparées.
Les préparations n'ont pas besoin d'être délivrées exactement au même moment, mais peuvent être coordonnées pour être délivrées à un patient pendant la même période de traitement, c'est-à-dire à une semaine ou un mois d'intervalle.
En outre, une composition pharmaceutique telle que décrite peut comprendre un ou plusieurs agent(s) thérapeutique(s). Des exemples non limitatifs d'agents thérapeutiques comprennent des agents perméabilisants tels qu'un virus, une vésicule lipidique, l'acide hyaluronique, des ions positifs à base de lipides, des émulsions polycationiques, des peptides cationiques, des polyplex, etc.; des antibiotiques et des agents antimicrobiens tels que le chlorhydrate de tétracycline, la leucomycine, la pénicilline, les dérivés de la pénicilline, l'érythromycine, le sulfathiazole et la nitrofurazone ; les anesthésiques locaux tels que la benzocaine ; les vasoconstricteurs tels que le chlorhydrate de phényléphrine, le chlorhydrate de tétrahydrozoline, le nitrate de naphazoline, le chlorhydrate d'oxymétazoline et le chlorhydrate de tramazoline ; les cardiotoniques tels que la digitaline et la digoxine ; des vasodilatateurs tels que la nitroglycérine et le chlorhydrate de papavérine ; des antiseptiques tels que le chlorhydrate de chlorhexidine, l'hexylrésorcinol, le chlorure de déqualinium et l'éthacridine ; des enzymes telles que le chlorure de lysozyme et la dextranase ; des hypotenseurs; des sédatifs; es agents antitumoraux; des agents anti-inflammatoires stéroïdiens tels que l'hydrocortisone, la prednisone, la fluticasone, la prednisolone, la triamcinolone, l'acétonide, la dexaméthasone, la bétaméthasone, la béclométhasone et le dipropionate de béclométhasone ; des agents anti-inflammatoires non stéroïdiens tels que l'acétaminophène, l'aspirine, l'aminopyrine, la phénylbutazone, l'acide méfanamique, l'ibuprofène, le diclofénac sodique, l'indométhacine, la colchicine et le probénocide ; les anti-inflammatoires enzymatiques tels que la chymotrypsine et la bromélaïne sératiopeptidase ; des agents anti-histaminiques tels que le chlorhydrate de diphénhydramine, le maléate de chlorophéniramine et la clémastine ; agents anti-allergiques; et des composés analgésiques.
Une protéine ou une séquence d’acides nucléiques selon l’invention peut être administrée à l’individu en ayant besoin en combinaison avec un ou plusieurs actifs biologiquement actifs, en particulier dans une composition pharmaceutique telle que décrite précédemment.
Des agents biologiquement actifs sont par exemple choisis parmi le VEGF, l'angiogénine, l'angiopoïétine- 1, le DeM, les facteurs de croissance des fibroblastes acides ou basiques (aFGF et bFGF), le FGF-2, la follistatine, le facteur de stimulation des colonies de granulocytes (G-CSF), le facteur de croissance des hépatocytes (HGF), le facteur de dispersion (SF), la leptine, la Midkine, le facteur de croissance placentaire (PGF), le facteur de croissance des cellules endothéliales dérivées des plaquettes (PD-ECGF), le facteur de croissance dérivé des plaquettes-BB (PDGF-BB), la pléiotrophine (PTN ), le RdCVF (Rod- derived Cone Viability Factor), la Progranuline, la Proliferine, le TGF-alpha, le PEDF, le TGF-beta, le TNF-alpha, le VEGF, le VPF, le CNTF, le BDNF, le GDNF, le PEDF, le NT3, le BFGF, F angiopoïétine, l’éphrine, l’EPO, le NGF, l’IGF, le GMF, l’aFGF, le NT5, le Gax, une hormone de croissance, l'[alpha]-l-antitrypsine, la calcitonine, la leptine, une apolipoprotéine, une enzyme pour la biosynthèse des vitamines, des hormones ou des neuromédiateurs, des chimiokines, des cytokines telles que IL-1, IL-8, IL-10, IL-12, IL- 13, un récepteur de celui-ci, un anticorps bloquant l'un quelconque desdits récepteurs, TIMP tel que TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, l'angioarrestine, l'endostatine telle que l'endostatine XVIII et l'endostatine XV, l'ATF, l'angiostatine, un la protéine de fusion de l'endostatine et de l'angiostatine, le domaine hémopexine C-terminal de la métalloprotéinase-2 matricielle, le domaine kringle 5 du plasminogène humain, une protéine de fusion de l'endostatine et le domaine kringle 5 du plasminogène humain, l'inhibiteur de la ribonucléase placentaire, l'inhibiteur de l'activateur du plasminogène, le Platelet Factor-4 (PF4), un fragment de prolactine, la Proliferin-Related Protein (PRP), l'antithrombine III anti-angiogénique, le Cartilage-Derived Inhibitor (CDI), un fragment du complément de CD59, , les inhibiteurs C3a et C5a, complexe d'attaque inhibiteurs membranaires, facteur H, l’ICAM, le VCAM, la cavéoline, le PKC zêta, les protéines de jonction, les JAMs, le CD36, la vasculostatine MERTK, la vasostatine (fragment de calréticuline), la thrombospondine, la fibronectine, en particulier fragment de fibronectine gro-bêta, une héparinase, la gonadotrophine chorionique humaine (hCG), l'interféron alpha/bêta/gamma, la protéine inductible par l'interféron (IP- 10), la monokine induite par l'interféron-gamma (Mig), la protéine inductible par l'interféron alpha 10 (IP 10), une protéine de fusion de Mig et IP10, le récepteur soluble Fms-Like Tyrosine kinase 1 (FLT-1), la Kinase insert Domain Receptor (KDR), les régulateurs de l'apoptose tels que Bcl-2, Bad, Bak, Bax, Bik, Bcl-X short isoform et Gax, les fragments ou dérivés celui-ci et autres, ainsi que leurs mélanges. Selon un mode de réalisation particulier, ladite protéine ou ladite séquence d’acides nucléiques est administrée à l’individu en ayant besoin en combinaison avec une protéine de type anti-VEGF et/ou une séquence codant pour une protéine de type anti-VEGF, notamment choisie dans le groupe constitué de S-Fltl, l’aflibercept, le conbercept, le bevacizumab, le ranibizumab et le brolucizumab, plus particulièrement avec de l’aflibercept et/ou une séquence codant pour de l’aflibercept.
Les niveaux de dosage réels d’adjuvants et des d’agents thérapeutiques dans les compositions de la présente invention peuvent être adaptés de manière à obtenir une quantité efficace pour obtenir une activité biologique souhaitée. Il faut comprendre, cependant, que le niveau de dose spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le poids corporel, l'état de santé général, le sexe, le régime alimentaire, le temps, les taux d'absorption et d'excrétion, la combinaison avec d'autres médicaments et la gravité de la maladie particulière traitée.
Mises en œuvre des peptides et/ou séquences d’acides nucléiques de la décorine
Une protéine, une séquence d’acides nucléiques, notamment sous forme d’une construction ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire du patient en ayant besoin, ou une composition pharmaceutique mises en œuvre selon l’invention peuvent être administrées à l’individu en ayant besoin selon les méthodes d’administrations connues dans l’art, bien entendu adaptées à la forme administrée (protéique ou nucléotidique).
En particulier, des méthodes d’administrations convenant selon la présente invention sont particulièrement adaptées à une administration oculaire.
Une protéine, une séquence d’acides nucléiques, notamment sous forme d’une construction ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire du patient en ayant besoin, ou une composition pharmaceutique mises en œuvre selon l’invention peuvent ainsi être administrées directement dans l'œil par injection dans le tissu oculaire, par exemple par injection périoculaire, conjonctivale, sous-ténonale, intracamérale, intravitréenne, intraoculaire, sous-rétinienne, sous-conjonctivale, rétrobulbaire, suprachoroïdienne ou intracanaliculaire ; par application directe dans l'œil à l'aide d'un cathéter ou d'un autre dispositif de placement tel qu'une pastille rétinienne, un insert intraoculaire, un suppositoire ou un implant composé d'un matériau poreux, non poreux ou gélatineux ; par des gouttes ou des pommades oculaires topiques ; ou par un dispositif à libération lente dans le cul-de-sac ou implanté à proximité de la sclérotique (transscléral) ou dans la sclérotique (intrascléral) ou suprachoroïdien ou à l'intérieur de l'œil.
Les méthodes d’administration incluent notamment des méthodes d’injection dans la sphère oculaire du patient, en particulier dans les cellules musculaires de la sphère oculaire du patient, en particulier dans les cellules du muscle ciliaire du patient.
Par exemple, une protéine, une séquence d’acides nucléiques ou une composition pharmaceutique peut être administrée par injection sous-conjonctivale peu invasive, injection intravitréenne traditionnelle, administration transclérale, injection sous-ténonienne, administration suprachoroïdale ou par d'autres procédés appropriés pour administrer la solution contenant la protéine à couches de tissus à l'arrière de l'œil.
Le moyen pour injecter une protéine, une séquence d’acides nucléiques ou une composition pharmaceutique dans la sphère oculaire peut être une aiguille d'injection ou de préférence un cathéter souple ou une microcanule. Les techniques d'injection peuvent impliquer l'utilisation de micro-aiguilles, telles qu'une micro-aiguille de calibre 38 ou d'autres micro-aiguilles de calibre approprié.
Dans d'autres modes de réalisation, une protéine, une séquence d’acides nucléiques ou une composition pharmaceutique peut être administrée par injection dans le tissu scléral. Dans certains modes de réalisation, la délivrance peut se faire par délivrance transclérale à l'aide d'un implant de collagène qui est imprégné de la protéine, la séquence d’acides nucléiques ou la composition pharmaceutique puis placé dans la conjonctive.
Des procédés d'injection dans la sphère oculaire sont bien connus dans l'art comme par exemple dans EP3137497 B 1 ou dans EP1871890 Bl.
Des dispositifs pour injecter une protéine, une séquence d’acides nucléiques ou une composition pharmaceutique dans la sphère oculaire sont également bien connus dans l'art et décrits, notamment, dans EP2997938 Bl ou dans EP3108933 B L
Selon un mode de réalisation particulier, une protéine, une séquence d’acides nucléiques ou une composition pharmaceutique selon l’invention peut être administrée par application topique sur l’œil, notamment par l’intermédiaire de gouttes pour les yeux ; par au moins une injection intravitréenne, ou une injection sous-conjonctivale, ou une injection supra- choroïdienne, ou une injection sous-rétinienne ; et/ou à l’aide d’un implant intravitréen. Dans un mode de réalisation particulier, une composition pharmaceutique mise en œuvre selon l’invention est une formulation de gouttes ophtalmiques. Le collyre est fourni dans toute formulation généralement utilisée, par exemple, sous la forme d'un collyre aqueux tel qu'une solution de collyre aqueuse, une suspension de collyre aqueuse, une solution de collyre visqueuse, une solution de collyre solubilisée et autres, ou sous la forme d'un collyre non aqueux tel qu'une solution de collyre non aqueuse, une suspension de collyre non aqueuse et autres. Lorsque la composition mise en œuvre selon la présente invention est préparée sous forme de collyre aqueux, elle contient de préférence un additif habituellement utilisé dans un collyre aqueux. Les exemples d'un tel additif comprennent les conservateurs, les agents isotoniques, les agents tampons, les stabilisateurs, les régulateurs de pH ou autres.
Selon un mode de réalisation particulier, une protéine, une séquence d’acides nucléiques ou une composition pharmaceutique mise en œuvre selon l’invention est administrée par au moins une injection intravitréenne.
En particulier, une protéine, une séquence d’acides nucléiques ou une composition pharmaceutique peut être administrée au patient par injection dans un muscle ciliaire, optionnellement suivie d’une étape d’électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.
En particulier, l’administration au patient d’une protéine, d’une séquence d’acides nucléiques ou d’une composition pharmaceutique peut être suivie d’une étape d’électrotransfert. L’électrotransfert consiste en une étape d’électrop oration appliquée après une injection locale d’une protéine ou d’une séquence d’acides nucléiques, en particulier d’un plasmide, et permet d’augmenter l’efficacité de transfection de la molécule injectée.
L'exposition de la région où la protéine, la séquence d’acides nucléiques ou la composition pharmaceutique a été délivrée à un champ électrique peut être réalisée par une électroporation extra-oculaire. L'électroporation est en effet adaptée ou augmente la perméabilité d'une membrane cellulaire et/ou d'au moins une partie d'un tissu ciblé à un agent biologiquement actif tel qu'une protéine ou une séquence d’acides nucléiques. De plus, une brève impulsion électrique avec une intensité de champ donnée est utilisée pour permettre le transport ou la migration d'agents à travers le tissu ou à travers les membranes cellulaires dans les cellules, par un effet électrophorétique. La technique d'électroporation est bien connue de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation particulier, un champ électrique constitué d'une ou plusieurs impulsion(s) électrique(s) est appliqué. L’intensité de champ peut être comprise entre environ 1 et 600 volts, de préférence 1 et 400 volts, encore plus préférentiellement entre environ 1 et 200 volts, avantageusement entre environ 10 et 100 volts, ou 15 et 70 volts.
La durée totale d'application du champ électrique peut être comprise entre 0,01 milliseconde et 1 seconde, de préférence entre 0,01 et 500 millisecondes, plus préférentiellement entre 1 et 500 millisecondes, encore plus préférentiellement supérieure à 1 ou 10 millisecondes. Dans un mode de réalisation particulier, la durée totale d'application du champ électrique est comprise entre 10 millisecondes et 100 millisecondes et est de préférence de 20 millisecondes.
Les impulsions électriques appliquées peuvent être comprises par exemple entre 1 et 100 000. Leur fréquence peut être comprise entre 0,1 et 1000 hertz. Il s'agit de préférence d'une fréquence régulière.
Selon un mode de réalisation particulier, l’électrotransfert est réalisé à raison de 8 impulsions électriques carrées unipolaires (200V/cm, 10 ms, 5 Hz) générées par un électroporateur similaire à celui décrit dans Touchard et al. (J Gene Med. 2010 Nov;12(l l):904-19).
Des impulsions électriques peuvent également être délivrées de manière irrégulière les unes par rapport aux autres, la fonction décrivant l'intensité du champ électrique en fonction du temps pour une impulsion étant de préférence variable.
Les impulsions électriques peuvent être des impulsions d'ondes unipolaires ou bipolaires. Elles peuvent être choisies par exemple parmi des impulsions d'ondes carrées, des impulsions d'ondes décroissantes exponentiellement, des impulsions d'ondes unipolaires oscillantes de durée limitée, des impulsions d'ondes bipolaires oscillantes de durée limitée, ou d'autres formes d'ondes. Préférentiellement, les impulsions électriques comprennent des impulsions d'ondes carrées ou des impulsions d'ondes bipolaires oscillantes.
En particulier, lorsque la rétine est ciblée, deux modes de réalisation sont possibles. Dans un premier mode de réalisation, le champ électrique est appliqué à l'aide de deux électrodes, l'une desdites électrodes étant introduite dans l'espace suprachoroïdien et l'autre étant appliquée sur la surface de l'œil du côté opposé où l'injection suprachoroïdienne a été réalisée. Dans un deuxième mode de réalisation, le champ électrique est appliqué à l'aide de deux électrodes, l'une desdites électrodes est appliquée sur la surface de la sclérotique adjacente à la région où l'injection suprachoroïdienne a été effectuée et l'autre est appliquée sur la surface de l'œil ( ex. sclérotique ou conjonctive) du côté opposé où l'injection suprachoroïdienne a été réalisée. Les électrodes sont de préférence choisies parmi une électrode de type fil et une électrode de type plaque-contact, chaque type d'électrode étant éventuellement adapté pour être appliqué de manière réversible sur la surface de l'œil. De préférence, l'électrode du type plaque-contact est incurvée.
Dans un mode de réalisation particulier, l'électrode plaque-contact est de préférence réalisée en un matériau rigide et de forme incurvée adaptée à la géométrie de la surface de la sclérotique ou de l'œil (par exemple la conjonctive). Les électrodes sont avantageusement réalisées en un métal conducteur non oxydant choisi par exemple parmi l'iridium ou le platine
Typiquement, le champ électrique est appliqué avec des moyens de dispositifs tels que décrits dans l'exemple 2. Une méthode d’électrotransfert convenant selon l’invention est décrite dans Bloquel et al. « Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis » (FASEB J 2006; 20: 389-391) en modifiant la voie d’injection par une approche transsclérale (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins”, J Gene Med. 2010 Nov;12(l l):904-19). Des méthodes d’électroporation convenant à une administration dans la sphère oculaire sont notamment décrits dans EP2266656 B l.
La présente demande couvre également une méthode pour traiter d’une pathologie oculaire chez un individu en ayant besoin, comprenant au moins une étape d’administration d’une protéine, ou d’un fragment de celle-ci, telle que décrite précédemment, audit individu, dans laquelle :
(i) la pathologie oculaire étant caractérisée par une déchirure ou une disparition, partielle ou totale, de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez ledit individu ; et
(ii) la protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment de celle-ci.
La demande couvre également une méthode de réparation ou de régénération d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu en ayant besoin comprenant au moins une étape d’administration audit individu d’une protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou d’un fragment de celle-ci. En outre, la demande couvre une méthode pour traiter une pathologie oculaire chez un individu en ayant besoin, comprenant au moins une étape d’administration audit individu d’une séquence d’acides nucléiques, dans laquelle :
(i) la pathologie oculaire étant caractérisée par une déchirure ou une disparition, partielle ou totale, de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) ; et
(ii) la séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine, ou un fragment de celle-ci, selon l’invention.
La demande concerne également une méthode de réparation ou de régénération d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu en ayant besoin comprenant au moins une étape d’administration audit individu d’une séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine, ou un fragment de celle-ci, selon l’invention.
La demande concerne également une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou d’un fragment de celle-ci, pour son utilisation dans la reconstruction d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu recevant ou ayant reçu une greffe d’EPR.
La demande couvre également une méthode pour améliorer la reconstruction d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu ayant reçu une greffe d’EPR comprenant au moins une étape d’administration audit individu d’une protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou d’un fragment de celle-ci.
Par ailleurs, la demande concerne une séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine, ou un fragment de celle-ci, pour son utilisation dans la reconstruction d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu ayant reçu une greffe d’EPR.
La demande concerne également une méthode reconstruction d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu ayant reçu une greffe d’EPR comprenant au moins une étape d’administration audit individu d’une séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine, ou un fragment de celle-ci, selon l’invention.
L’invention est décrite ci-dessous de façon plus détaillée au moyen des exemples suivants qui sont présentés à titre d’illustration uniquement.
Exemple 1
Les inventeurs ont tout d’abord mis en évidence la capacité de la Décorine seule, administrée en tant que telle, à restaurer l’EPR dans un modèle de néovascularisation choroïdienne induite par laser chez le rat, un modèle expérimental largement utilisé pour étudier la DMLA. A. Modèle de néovascularisation choroïdienne chez le rat
L'induction d'une néovascularisation choroïdienne (NVC) chez le rat Long-Evans a été induite à JO en créant une rupture de la membrane de Bruch, une couche qui sépare la choroïde de l’EPR, par photocoagulation au laser. Brièvement, après anesthésie et dilatation des pupilles, six à huit impacts laser ont été réalisées autour du nerf optique à une distance de 2 ou 3 diamètres du disque optique avec un laser Argon (532 nm) monté sur une lampe à fente (175mW, 0,1 s et 50 pm). La présence d'une bulle témoignait de la rupture de la membrane de Bruch et confirmait un impact laser réussi.
B. Tests comparatifs
Nous avons utilisé la protéine Décorine recombinante de souris (référence 1060-DE de chez R&D Systems) qui partage 87% d'identité de séquence amino-acide avec la Décorine de rat. L’injection intravitréenne de Décorine a été réalisée à JO après induction laser et à J7 à une concentration finale de 10 pg/mL dans le vitré de rat (n = 6 rats). Une solution contrôle de tampon phosphate (PBS) ne contenant pas de Décorine a également été injecté dans le vitré d’un groupe de rats contrôle (n = 6 rats).
C. Montages à plat de l'EPR et de la choroïde et quantification de la restauration de l’EPR A J14, les yeux ont été énucléés, fixés dans du PFA à 4 % pendant 15 minutes à température ambiante et sectionnés au niveau du limbe ; la cornée et le cristallin ont été éliminés. La rétine a été séparée du complexe EPR-choroïde. Huit incisions radiales ont été pratiquées sur le complexe EPR-choroïde, qui a ensuite été montée à plat et post- fixée à l'acétone pendant 15 minutes à -20°C. Après lavage au PBS, le complexe EPR-choroïde a été montée à plat et les filaments d’actine dans les cellules de l’EPR ont été mis en évidence par la technique d’immunofluorescence à l’aide de Phalloïdine couplée au fluorochrome Alexa Fluor 647 (ThermoFisher) pendant 30 minutes à température ambiante puis observée au microscope confocal (Zeiss LSM710, Le Pecq, France). Les images de l’EPR ont été capturées à l'aide d'une caméra vidéo numérique couplée à un système informatique. Pour chaque lésion induite par le laser, la reconstitution de l’EPR a été gradée qualitativement en évaluant la structure des cellules de l’EPR et la surface de couverture de la lésion par l’EPR. Les scores ont été établis par selon les critères suivants : grade 0 : pas de couverture de la lésion par l’EPR ou couverture avec des cellules anormales (pas hexagonales) ; grade 0.5 : couverture partielle de la lésion avec des cellules EPR hexagonales ; grade 1 : couverture complète de la lésion avec des cellules EPR hexagonales (forme normale des cellules de l’EPR). Résultats des tests
Le score moyen de couverture des lésions NVC par les cellules de l’EPR a été comparé entre les deux groupes de rats à J 14.
Les résultats obtenus sont présentés en Figures IA et IB.
En Figure 1 A, il peut tout d’abord être observé que le score moyen des rats du groupe contrôle (PB S) est inférieur à 0,5 (environ 0,4). A l’inverse, le score moyen des rats du groupe traité avec de la Décorine est nettement supérieur à 0,5 (environ 0,7) ce qui est statistiquement différent du résultat obtenu avec le groupe contrôle (p = 0.013, test de Wilcoxon-Mann- Whitney).
La Figure IB représente l’incidence des différents scores attribués par lésion dans chacun des groupes de rats (score de 1, 0,5 ou 0 de haut en bas pour chaque groupe). Il apparait ainsi que plus de 50% des lésions se sont vu attribuer un score de 1 dans le groupe traité avec de la Décorine, contre seulement 25% dans le groupe contrôle.
Cela vient ainsi matérialiser la capacité de la Décorine à restaurer un épithélium pigmentaire rétinien au niveau d’une rétine présentant un EPR déchiré voire un EPR ayant disparu.
Exemple 2
Les inventeurs ont par ailleurs également démontré la capacité de la Décorine à restaurer l’EPR dans un modèle de néovascularisation choroïdienne persistante induite par double impact laser chez le rat.
A. Modèle de Néovascularisation choroïdienne persistante chez le rat
Le modèle de néovascularisation choroïdienne induite par double impact laser, initialement décrit chez la souris (Little et al., Transi Vis Sci Technol. 2020 Mar 9;9(4):3) et reproduit ici chez le rat Brown Norway imite la maladie humaine chronique dans sa stabilité et sa persistance.
Une première rupture de la membrane de Bruch est réalisée à J -7 puis un second impact laser est réalisé à J0 sur chacun des lésions précédemment induite à J -7. Brièvement, après anesthésie et dilatation des pupilles, quatre impacts laser ont été réalisées autour du nerf optique à une distance d’environ 2 diamètres du disque optique avec un laser Argon (532 nm) monté sur une lampe à fente (200mW, 0,1 s et 50 pm). La présence d'une bulle témoignait de la rupture de la membrane de Bruch et confirmait un impact laser réussi.
Par la suite, la vascularisation rétinienne et choroïdienne est visualisée à J14 et J28 par angiographie à la fluorescéine (FA) et au vert d’ indocyanine (ICG) selon une méthode habituelle bien connue de l’homme du métier. Après dilatation des pupilles, un mélange de fluorescéine et de vert d’indocyanine a été injectée dans la veine caudale des rats. Les angiogrammes en phase précoce et tardive ont été enregistrés respectivement 20 secondes-2 minutes et 5-7 minutes après l'injection du mélange fluorescéine/vert d’indocyanine. Pour chaque lésion induite par le laser, la fuite de fluorescéine a été gradée qualitativement en évaluant l'augmentation de la taille/intensité de la fuite du colorant entre les phases précoce et tardive. Les scores angiographiques ont été établis par selon les critères suivants : grade 0, pas d'hyperfluorescence ; grade 1, légère hyperfluorescence sans augmentation d'intensité ni de taille ; grade 2, hyperfluorescence augmentant en intensité mais pas en taille ; grade 3, hyperfluorescence augmentant à la fois en intensité et en taille.
Comme illustré en Figure 2, en l’absence de traitement, le pourcentage de lésions de grade 3 mesuré chez les rats lors de cet examen se situe entre 55 et 60% à J14 et J28.
B. Tests comparatifs
Plasmide
Une construction d’ADN comprenant une séquence d’acide nucléique selon l’invention codant pour de la Décorine a été préparée selon les méthodes conventionnelles et est représentée en Figure 5.
Cette construction (également nommée ci-après construction plasmide A) comprend :
- la séquence SEQ ID NO : 5 encodant la Décorine de séquence SEQ ID NO : 1;
- la séquence SEQ ID NO : 7 encodant le peptide signal de la Décorine de séquence SEQ ID NO : 6 ;
- ainsi que la séquence SEQ ID NO : 8 encodant l’Aflibercept de séquence SEQ ID NO : 9 ;
- ces deux séquences étant sous le contrôle de promoteurs ubiquitaires.
L’injection du tampon de formulation (véhicule) uniquement a été utilisée comme comparatif.
Animaux
Des rats tels que précédemment décrits sont utilisés conformément aux dispositions du protocole ARVO (pour Association for Research in Vision and Ophthalmology). Les rats sont anesthésiés par injection intramusculaire d’une dose de kétamine (40 mg/kg) et de xylazine (4 mg/kg) avant injection du plasmide A (30 pg - n=12) ou d’une solution contrôle (véhicule) (30 pg - n=12) et électrotransfert au jour J-3 (i.e. 3 jours avant le second impact laser tel que détaillé précédemment).
En parallèle, deux autres groupes contrôles sont également traités par injection intravitréenne d’Aflibercept (15pg - n=12) ou d’une solution BSS (n=12) à JO (i.e. immédiatement après le second impact laser tel que détaillé précédemment).
Électrotransfert au niveau du muscle ciliaire du rat
L’électrotransfert est réalisé comme décrit dans Bloquel et al. « Plasmid electrotransfer of eye ciliary muscle: principles and therapeutic efficacy using hTNF-alpha soluble receptor in uveitis » (FASEB J 2006; 20: 389-391) en modifiant la voie d’injection par une approche transsclérale (Touchard “The ciliary smooth muscle electrotransfer: basic principles and potetial for sustained intraocular production of therapeutic proteins”, J Gene Med. 2010 Nov;12(ll):904-19). Les plasmides sont injectés à raison de 30 pg dans 10 pL de solution Tris-EDTA NaCl, dans le muscle ciliaire des animaux à l’aide d’une seringue adaptée.
Les impulsions électriques sont administrées à l’aide d’une électrode filaire en iridium/platine de 250 pm de diamètre. Cette électrode interne est introduite dans le tunnel transscléral créé par l’aiguille d’injection des plasmides. L’électrode externe est une feuille d’acier inoxydable courbée pour épouser la forme de l’œil et placée au niveau du limbe face à l’électrode interne. L’électrotransfert est réalisé à raison de 8 impulsions électriques carrées unipolaires (200V/cm, 10 ms, 5 Hz) générées par un électroporateur similaire à celui décrit dans Touchard et al (J Gene Med. 2010 Nov;12(ll):904-19).
C. Histologie et quantification de la restauration de l’EPR
A J30, les yeux ont été énucléés, fixés dans du PFA à 4 %, enrobés dans de la paraffine, puis sectionnés en coupes de 5 pm d’épaisseur. Les coupes réalisées dans la partie centrale des lésions CNV ont été sélectionnées et préparées pour un marquage immunohistologique. Brièvement, les coupes ont été déparaffinées à l'aide de bains de xylène puis réhydratées avec des bains d'éthanol successifs de 100 % à 70 % d'éthanol. Les coupes ont été immunomarquées en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine RPE65 spécifiquement exprimée dans les cellules de l’EPR (Sigma Aldrich) et un anticorps dirigé contre le Collagène 1 (Abeam) pour marquer la zone fibro-vasculaire. Ces anticorps primaires ont ensuite été détectés par des anticorps secondaires (ThermoFisher Scientific, France), anti- souris Alexa fluor 488 (RPE65) et anti-lapin Alexa fluor 594 (Collagène 1). Une contre- coloration au DAPI a été utilisée pour localiser les structures rétiniennes. Les coupes ont été montées avec un milieu Fluoromount (Sigma Aldrich, France) sous une lamelle couvre-objet pour l'examen microscopique à l'aide d'un microscope confocal (Spinning disk CSU-W1, Leica). La surface d’immunomarquage positive au marqueur RPE65 (cellules de l’EPR) rapportée à la taille totale de la lésion NVC et le pourcentage de couverture de la lésion NVC par des cellules de l’EPR (positive pour RPE65) ont été mesurés à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images assistée par ordinateur (ImageJ).
Résultats
A J14 et à J28, la fuite vasculaire induite par double impact laser a été évaluée pour chaque lésion et le pourcentage relatif de lésions de grade 3 comparé entre chacun des 4 groupes (voir Figure 3). Il apparait ainsi que le pourcentage de lésion de grade 3 à J14 et J28 est réduit de plus de 50% dans le groupe traité avec le plasmide A par rapport au groupe ayant reçu le tampon de formulation seul. A l’inverse, l’administration d’Aflibercept seul réduit le pourcentage de lésion de grade 3 à J14 et J28 de seulement, respectivement, 6 à 22% par rapport au groupe ayant reçu une solution BSS. Cela vient ainsi matérialiser la capacité d’un plasmide codant pour la Décorine et Aflibercept à réduire très significativement la fuite vasculaire au niveau d’une rétine présentant une néovascularisation choroïdienne.
A J30, la couverture de la rétine par des cellules de l’EPR a été évaluée pour chaque lésion et comparée entre chacun des 4 groupes (Résultats présentés en Figure 4B). Plus particulièrement, la surface d’immunomarquage positive au marqueur RPE65 (indiquant la présence de cellules de l’EPR) rapportée à la taille totale de la lésion NVC a également été comparées entre chacun des 4 groupes susmentionnés (voir Figure 4A).
Ces expériences matérialisent le fait que la décorine, administrée en tant que telle ou via l’administration d’un plasmide l’encodant, permet une restauration significative de l’épithélium pigmentaire rétinien. A l’inverse, l’administration du tampon de formulation seul, mais également l’administration d’Aflibercept seul ou d’une solution BSS ne permettent pas d’observer une quelconque restauration de cet épithélium endommagé. Listage de séquences
SEQ ID NO : 1: Séquence peptidique de la Décorine
GPFQQRGLFDFMLEDEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLGLD KVPKDLPPDTTLLDLQNNKITEIKDGDFKNLKNLHALILVNNKISKVSPGAFTPLVKL ERLYLSKNQLKELPEKMPKTLQELRAHENEITKVRKVTFNGLNQMIVIELGTNPLKSS GIENGAFQGMKKLSYIRIADTNITSIPQGLPPSLTELHLDGNKISRVDAASLKGLNNLA KLGLSFNSISAVDNGSLANTPHLRELHLDNNKLTRVPGGLAEHKYIQVVYLHNNNIS VVGSSDFCPPGHNTKKASYSGVSLFSNPVQYWEIQPSTFRCVYVRSAIQLGNYK
SEQ ID NO : 2 : Séquence peptidique de la Décorine
DEASGIGPEVPDDRDFEPSLGPVCPFRCQCHLRVVQCSDLGLDKVPKDLPPDTTLLDL QNNKITEIKDGDFKNLKNLHALILVNNKISKVSPGAFTPLVKLERLYLSKNQLKELPE KMPKTLQELRAHENEITKVRKVTFNGLNQMIVIELGTNPLKSSGIENGAFQGMKKLS YIRIADTNITSIPQGLPPSLTELHLDGNKISRVDAASLKGLNNLAKLGLSFNSISAVDNG SLANTPHLRELHLDNNKLTRVPGGLAEHKYIQVVYLHNNNISVVGSSDFCPPGHNTK KASYSGVSLFSNPVQYWEIQPSTFRCVYVRSAIQLGNYK
SEQ ID NO : 3 : Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttc gagccctccctaggcccagtgtgccccttccgctgtcaatgccatcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaa aggatcttccccctgacacaactctgctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatcaaagatggagactttaagaacctgaagaa ccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagttagtcctggagcatttacacctttggtgaagttggaacgactttatctgtcc aagaatcagctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcccatgagaatgagatcaccaaagtgcga aaagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaactgggcaccaatccgctgaagagctcaggaattgaaaatggggctttc cagggaatgaagaagctctcctacatccgcattgctgataccaatatcaccagcattcctcaaggtcttcctccttcccttacggaattaca tcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagcctgaaaggactgaataatttggctaagttgggattgagtttcaacagcatc tctgctgttgacaatggctctctggccaacacgcctcatctgagggagcttcacttggacaacaacaagcttaccagagtacctggtggg ctggcagagcataagtacatccaggttgtctaccttcataacaacaatatctctgtagttggatcaagtgacttctgcccacctggacaca acaccaaaaaggcttcttattcgggtgtgagtcttttcagcaacccggtccagtactgggagatacagccatccaccttcagatgtgtcta cgtgcgctctgccattcaactcggaaactataagtaa
SEQ ID NO : 4 : Séquence nucléotidique codant pour la Décorine gatgaggcttctgggataggcccagaagttcctgatgaccgcgacttcgagccctccctaggcccagtgtgccccttccgctgtcaatg ccatcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaaaggatcttccccctgacacaactctgctagacctgcaaaac aacaaaataaccgaaatcaaagatggagactttaagaacctgaagaaccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagtta gtcctggagcatttacacctttggtgaagttggaacgactttatctgtccaagaatcagctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaa ctcttcaggagctgcgtgcccatgagaatgagatcaccaaagtgcgaaaagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaac tgggcaccaatccgctgaagagctcaggaattgaaaatggggctttccagggaatgaagaagctctcctacatccgcattgctgatacc aatatcaccagcattcctcaaggtcttcctccttcccttacggaattacatcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagcct gaaaggactgaataatttggctaagttgggattgagtttcaacagcatctctgctgttgacaatggctctctggccaacacgcctcatctga gggagcttcacttggacaacaacaagcttaccagagtacctggtgggctggcagagcataagtacatccaggttgtctaccttcataac aacaatatctctgtagttggatcaagtgacttctgcccacctggacacaacaccaaaaaggcttcttattcgggtgtgagtcttttcagcaa cccggtccagtactgggagatacagccatccaccttcagatgtgtctacgtgcgctctgccattcaactcggaaactataagtaa
SEQ ID NO : 5 : Séquence nucléotidique codant pour la Décorine ggaccgtttcaacagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcctctggaatcggacctgaggtgcccgacgacagagactt cgaaccttctctgggccctgtgtgccccttcagatgccagtgtcatctgagagtggtgcagtgcagcgacctgggccttgataaggtgc ccaaggacctgcctcctgacaccacactgctggacctgcagaacaacaagatcaccgagatcaaggacggcgacttcaagaacctg aagaatctgcacgccctgatcctggtcaacaacaaaatcagcaaggtgtcccctggcgccttcacacctctggtcaagctggaaagact gtacctgagcaagaaccagctgaaagaactgcccgagaagatgcccaagacactgcaagagctgcgggcccacgagaacgagatc accaaagtgcggaaagtgaccttcaacggcctgaaccagatgatcgtgatcgagctgggcaccaatcctctgaagtccagcggcattg agaacggcgccttccagggcatgaagaagctgagctacatccggatcgccgacaccaacatcaccagcattcctcagggcctgcctc caagcctgacagagctgcatctggacggcaacaagattagcagagtggacgccgcctctctgaagggcctgaacaatctggccaaa ctgggcctgagcttcaacagcatcagcgccgtggataacggcagcctggccaacacacctcacctgagggaactgcacctggataac aacaagctgaccagagtgcctggcggactggccgagcacaagtacatccaggtggtgtatctccacaacaacaacatctccgtcgtg ggcagcagcgacttctgtcctcctggccacaataccaagaaggccagctactctggcgtgtccctgttcagcaaccccgtgcagtactg ggagatccagcctagcacctttagatgcgtgtacgtgcggagcgccatccagctgggcaactacaaatga
SEQ ID NO : 6: Séquence peptidique du peptide signal natif de la Décorine MKATIILLLLAQVSWA
SEQ ID NO : 7: Séquence nucléotidique codant pour le peptide signal natif de la Décorine atgaaggccactatcatcctccttctgcttgcacaagtttcctgggct
SEQ ID NO : 8 : séquence nucléotidique codant pour l’ Aflibercept cagcgacaccggcagacccttcgtggaaatgtacagcgagatccccgagatcatccacatgaccgagggccgcgagctggtgatcc cttgcagagtgaccagccccaacatcaccgtgacactgaagaagttccctctggacacactgatccccgacggcaagaggatcatctg ggacagcagaaagggcttcatcatcagcaacgccacatacaaagagatcggactgctgacatgcgaggccaccgtgaacggccatc tgtacaagaccaactatctgacccaccgccagaccaacaccatcatcgacgtggtgctgagccccagccacggcatcgagctgagcg tgggcgagaagctggtgctgaactgcaccgccagaaccgagctgaatgtgggcatcgacttcaactgggagtaccccagctccaag caccagcacaagaaactggtgaaccgggatctgaaaacccagagcggcagcgagatgaagaagtttctgagcacactgaccatcga cggcgtgaccagaagcgaccaaggactgtacacatgcgccgccagcagcggactgatgaccaagaagaacagcacattcgtccgg gtgcacgagaaggacaagacccacacatgcccaccatgcccagccccagagctgctgggaggcccctccgtgtttctgttccctcca aagcccaaggacactctgatgatcagcagaacccccgaagtgacatgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggacccagaagtgaa gttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaacagcacatacagagtg gtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaagactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaagtctccaacaaggctctgccagccccc atcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaagtgtacacactgcctccaagccgggacgagctgacca agaatcaagtgtctctgacatgtctggtgaaaggcttctaccccagcgatatcgccgtggaatgggagagcaacggccagcccgaga acaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttctttctgtactccaaactgaccgtggacaagagcagatggca gcaaggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggctctgcacaaccactacacccagaagtctctgtctctgagccccggcaa gtga
SEQ ID NO : 9 : séquence peptidique de 1’ Aflibercept SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSR
KGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKL VLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTR SDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine, ou fragment de celle-ci, pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie oculaire chez un individu en ayant besoin :
(i) la pathologie oculaire étant caractérisée par une déchirure ou une disparition, partielle ou totale, de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez ledit individu ; et
(ii) la protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2.
2. Protéine, ou fragment de celle-ci, pour son utilisation selon la revendication 1, ladite pathologie oculaire étant choisie dans le groupe constitué d’une déchirure de l'épithélium pigmentaire de la rétine ; d’une atrophie géographique ; d’une choroïdérémie ; et d’une dystrophie maculaire héréditaire, en particulier choisie parmi la maladie de Stargardt, la dégénérescence vitelliforme juvénile de la macula ou maladie de Best, la dystrophie aréolaire centrale, la dégénérescence maculaire de Sorsby, la dystrophie maculaire de la Caroline du Nord, et la dégénérescence maculaire en aile de papillon.
3. Protéine, ou fragment de celle-ci, pour la réparation ou la régénération d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu en ayant besoin, la protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2.
4. Protéine, ou fragment de celle-ci, pour son utilisation dans la reconstruction d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu recevant ou ayant reçu une greffe d’EPR, la protéine comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2.
5. Protéine, ou fragment de celle-ci, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, ladite protéine comprenant en outre un peptide signal, en particulier un peptide signal ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6.
6. Protéine, ou fragment de celle-ci, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, la protéine étant administrée audit individu en ayant besoin par application topique sur l’œil, par exemple par l’intermédiaire de gouttes pour les yeux ; par injection intravitréenne ; par injection sous-conjonctivale ; par injection supra-choroïdienne ; par injection sou s -rétinienne ; et/ou à l’aide d’un implant intravitréen.
7. Séquence d’acides nucléiques pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie oculaire chez un individu en ayant besoin :
(i) la pathologie oculaire étant caractérisée par une déchirure ou une disparition, partielle ou totale, de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) ; et (ii) la séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine telle que définie selon l’une quelconque des revendications 1 et 5, ou un fragment de celle-ci.
8. Séquence d’acides nucléiques pour son utilisation selon la revendication 6, ladite pathologie oculaire étant choisie dans le groupe constitué d’une déchirure de l'épithélium pigmentaire de la rétine, d’une atrophie géographique, d’une choroïdérémie ; et d’une dystrophie maculaire héréditaire, en particulier choisie parmi la maladie de Stargardt, la dégénérescence vitelliforme juvénile de la macula ou maladie de Best, la dystrophie aréolaire centrale, la dégénérescence maculaire de Sorsby, la dystrophie maculaire de la Caroline du Nord, et la dégénérescence maculaire en aile de papillon.
9. Séquence d’acide nucléique pour la réparation ou la régénération d’un épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez un individu en ayant besoin, la séquence d’acides nucléiques codant pour la protéine telle que définie selon l’une quelconque des revendications 1 et 5, ou un fragment de celle-ci.
10. Séquence d’acide nucléique pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, ladite séquence d’acides nucléiques comprenant une séquence ayant au moins 70% d’identité de séquence avec l’une quelconque des séquences nucléotidiques choisie dans le groupe constitué de la séquence SEQ ID NO : 3, de la séquence SEQ ID NO : 4 et de la séquence SEQ ID NO : 5.
11. Séquence d’acides nucléiques pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 7 à 10, ladite séquence d’acides nucléiques comprenant en outre une séquence nucléotidique codant pour un peptide signal, en particulier une séquence nucléotidique ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 7.
12. Séquence d’acides nucléiques pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 7 à 11, ladite séquence d’acides nucléique étant comprise dans un vecteur, le vecteur étant en particulier un vecteur viral, un vecteur non viral, un plasmide, un lipide, un liposome ou une nanoparticule.
13. Séquence d’acides nucléiques pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 7 à 12, ladite séquence d’acides nucléique se présentant sous la forme d’une construction d’ADN destinée au transfert non viral d’acides nucléiques dans les cellules musculaires de la sphère oculaire de l’individu en ayant besoin, ladite construction d’ADN étant caractérisée en ce qu’elle comprend :
(a) optionnellement une origine de réplication bactérienne ou procaryotique,
(b) une ou plusieurs séquences favorisant l’expression de l’ ADN dans la sphère oculaire du patient, (c) une séquence nucléotidique codant :
- pour une protéine thérapeutique comprenant une séquence protéique comprenant au moins 85% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 1 ou avec la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment de celle-ci, et
- optionnellement pour un peptide signal permettant la sécrétion de cette première protéine thérapeutique, en particulier pour un peptide signal ayant au moins 70% d’identité de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6 ; ce peptide signal, lorsqu’il est présent, étant contiguë de la séquence de la protéine thérapeutique, en N-terminal de ladite première protéine thérapeutique,
(d) un promoteur permettant l’expression de cette protéine thérapeutique dans la sphère oculaire du patient ; et
(e) optionnellement une séquence de polyadénylation en 3’ de la séquence nucléotidique.
14. Séquence d’acides nucléiques pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 7 à 13, ladite construction d’ADN étant administrée à l’individu en ayant besoin par injection dans un muscle ciliaire, optionnellement suivie d’une étape d’électrotransfert dans les cellules du muscle ciliaire.
15. Séquence d’acides nucléiques pour son utilisation selon la revendication 13 ou 14, dans laquelle la construction d’ADN est de forme circulaire.
16. Séquence d’acides nucléiques pour son utilisation selon la revendication 12 ou 13, dans laquelle la construction d’ADN est de l’ADN nu.
17. Protéine, ou fragment de celle-ci, ou séquence d’acides nucléiques pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 16, ladite protéine, ou un fragment de celle-ci, ou ladite séquence d’acides nucléiques étant présente dans une composition pharmaceutique comprenant également au moins un milieu pharmaceutiquement acceptable.
18. Protéine, ou fragment de celle-ci, pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 et 17 ou séquence d’acides nucléiques pour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 7 à 17, ladite protéine, ou fragment de celle-ci, ou ladite séquence d’acides nucléiques étant administrée à l’individu en ayant besoin en combinaison avec une protéine de type anti-VEGF et/ou une séquence codant pour un protéine de type anti-VEGF, notamment choisie dans le groupe constitué de de S-Fltl, l’aflibercept, le conbercept, le bevacizumab, le ranibizumab et le brolucizumab, plus particulièrement avec de l’aflibercept et/ou une séquence codant pour de l’aflibercept.
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