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WO2024117543A1 - 암 세포 특이적 유전자 발현 시스템 - Google Patents

암 세포 특이적 유전자 발현 시스템 Download PDF

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Publication number
WO2024117543A1
WO2024117543A1 PCT/KR2023/016401 KR2023016401W WO2024117543A1 WO 2024117543 A1 WO2024117543 A1 WO 2024117543A1 KR 2023016401 W KR2023016401 W KR 2023016401W WO 2024117543 A1 WO2024117543 A1 WO 2024117543A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
exon
present
seq
gene
intron
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/016401
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이재형
Original Assignee
주식회사 신렉스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020220162961A external-priority patent/KR20240086750A/ko
Priority claimed from KR1020220162962A external-priority patent/KR102726438B1/ko
Application filed by 주식회사 신렉스 filed Critical 주식회사 신렉스
Publication of WO2024117543A1 publication Critical patent/WO2024117543A1/ko

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue

Definitions

  • the present invention relates to recombinant nucleic acid constructs useful for cancer treatment and gene expression systems comprising the same.
  • Bevacizumab a single antibody that binds to VEGF-A
  • Cetuzimab a single antibody that binds to the EGF receptor
  • cancer immunotherapy using immune checkpoint inhibitors such as Pembrolizumab, Ipilimumab, and Nivolumab, which have recently attracted attention, has very limited effectiveness in patients with cold tumors with extremely low T cell activity. Therefore, there is a need in the medical field for a new concept of treatment that will solve the problems of these treatments.
  • targeted treatments at the gene level have been developed to overcome problems related to target protein mutations found in tumors, and in particular, the correlation between miRNAs and diseases is attracting attention.
  • MicroRNA is a small fragment of RNA approximately 19-25 nucleotides in length. Although it does not contain genetic information itself, it is known to regulate the expression of various genes. MiRNAs regulate the final function of specific genes by participating in various biological processes such as cell cycle, differentiation, proliferation, death, stress resistance, metabolism, and immune response. Gene expression induced by miRNA is a component of the miRNA-induced silencing complex (miRISC). ) binds to the 3'-untranslated regions (UTR) of the target mRNA to control final gene expression by inhibiting mRNA cleavage or translation. In this way, it has been revealed that miRNAs regulate the expression of approximately 30% of human genes, about half of which are involved in causing tumors, and when the expression of miRNAs in tumor cells is reduced, it is believed to contribute to the development of tumors. .
  • miRISC miRNA-induced silencing complex
  • One object of the present invention is to provide a recombinant nucleic acid construct that can be used to treat cancer by post-transcriptional modification.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant nucleic acid construct comprising a polynucleotide encoding a plurality of miRNAs targeting cancer cells.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector containing the above-described recombinant nucleic acid construct.
  • Another object of the present invention is to provide host cells transformed with the above expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving or treating cancer containing the above host cells.
  • the first exon of the granzyme B (GZMB) gene from 5' to 3', the first exon of the granzyme B (GZMB) gene; first intron; second intron; And a recombinant nucleic acid comprising a second exon of the granzyme B (GZMB) gene, and comprising a nucleotide encoding at least one interfering RNA (RNAi) between the first intron and the second intron.
  • RNAi interfering RNA
  • nucleic acid construct refers to any polynucleotide designed to transcribe RNA.
  • GZMB granzyme B
  • NK cells natural killer cells
  • CMA1 mast cell chymase gene
  • the GZMB gene is approximately 3.2 kb in length and consists of 5 exons and 4 introns.
  • the leader (signal) sequence of the GrB preproprotein is encoded by exon 1, and the amino acid residues forming the catalytic triad, namely His57, Asp102 and Ser195, are encoded within exons 2, 3 and 5, respectively.
  • the “exon” refers to nucleic acid sequence(s) encoding one or more amino acids of a transcript expressed from a nucleic acid (e.g., a protein of interest), e.g., within an open reading frame. Exon sequences can be transcribed from DNA to RNA (i.e., present in pre-mRNA), and can also be translated into a polypeptidoma (i.e., a processed form of RNA (e.g., after splicing)). can exist in
  • the “intron” refers to nucleic acid sequence(s) that non-codifies one or more amino acids of a polypeptide transcript (e.g., a protein of interest) expressed from a nucleic acid, e.g., within an open reading frame.
  • Intronic sequences can be transcribed from DNA to RNA (i.e., present in pre-mRNA), but can also be removed before protein expression from mature mRNA, for example through splicing.
  • the granzyme B gene may be of human origin and, for example, may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, preferably consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. , but is not limited to this.
  • the granzyme B gene may be of human origin and, for example, may encode the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • exon 1 of the granzyme B gene may include the coding sequence represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • exon 1 of the granzyme B gene may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and preferably may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto. .
  • exon 1 of the granzyme B gene may encode the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, but is not limited thereto.
  • exon 2 of the granzyme B gene may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, preferably may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto. .
  • exon 2 of the granzyme B gene may encode the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
  • exon 3 of the granzyme B gene may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, and preferably may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6, but is not limited thereto. .
  • exon 3 of the granzyme B gene may encode the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, but is not limited thereto.
  • exon 4 of the granzyme B gene may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and preferably may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, but is not limited thereto. .
  • exon 4 of the granzyme B gene may encode the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, but is not limited thereto.
  • exon 5 of the granzyme B gene may include the coding sequence represented by SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • exon 5 of the granzyme B gene may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, and preferably may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto. .
  • exon 5 of the granzyme B gene may encode the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, but is not limited thereto.
  • the first exon of the granzyme B gene is at least one selected from five exons or fragments thereof included in the granzyme B gene, that is, exon 1, exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, or It may be at least one selected from among these fragments.
  • the second exon of the granzyme B gene is at least one selected from five exons or fragments thereof included in the granzyme B gene, that is, exon 1, exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, or It may be at least one selected from among these fragments.
  • the first exon and the second exon may be the same or different from each other.
  • the first exon and the second exon may be different from each other.
  • the first exon is at least one selected from exon 1, exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, or fragments thereof included in the granzyme B gene
  • the second exon is the remaining exon. Or it may be at least one selected from among the fragments.
  • the first exon may include exon 1 of the granzyme B gene (GZMB) or a fragment thereof
  • the second exon may include exon 5 of the granzyme B gene (GZMB) or a fragment thereof.
  • GZMB granzyme B gene
  • the first exon includes exon 1 of the granzyme B gene (GZMB) or a fragment thereof
  • the second exon includes exon 2, exon 3, and exon 4 of the granzyme B gene (GZMB).
  • GZMB granzyme B gene
  • the second exon includes exon 2, exon 3, and exon 4 of the granzyme B gene (GZMB).
  • exon 5 or a fragment thereof but is not limited thereto.
  • the first exon includes exon 1 or a fragment thereof and exon 2 of the granzyme B gene (GZMB), and the second exon includes exon 3 and exon 2 of the granzyme B gene (GZMB) It may include, but is not limited to, exon 4 and exon 5 or a fragment thereof.
  • the first exon includes exon 1 or a fragment thereof, and exons 2 and 3 of the granzyme B gene (GZMB), and the second exon includes exon 4 of the granzyme B gene (GZMB). and exon 5 or a fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the first exon includes exon 1 or a fragment thereof, exon 2, exon 3, and exon 4 of the granzyme B gene (GZMB), and the second exon includes the granzyme B gene (GZMB) ) may include exon 5 or a fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the first exon may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the first exon may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the second exon may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 (sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8 sequentially linked in the 5'->3' direction), but is limited thereto. It doesn't work.
  • the second exon may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 (sequences of SEQ ID NOs: 5 to 7 and 9 sequentially linked in the 5'->3' direction), It is not limited to this.
  • the first intron and the second intron may include a splice site.
  • splice site refers to a specific nucleic acid sequence that is recognized by the splice machinery of a eukaryotic cell suitable for cleavage and/or can be linked to a corresponding splice site.
  • the splice site allows excision of introns present in the pre-mRNA transcript.
  • the 5' portion of the splice site is referred to as the splice donor site, and the 3' corresponding splice site is referred to as the splice acceptor site.
  • splice site refers to, for example, a natural splice site, an engineered splice site, such as a synthetic splice site, a standard or consensus splice site, and/or a non-canonical splice site, such as a potential ( cryptic) splice site.
  • the first intron or a fragment thereof may include a splice donor site.
  • the second intron or a fragment thereof may include a splice acceptance site.
  • the intron that can be used in the present invention may be an intron isolated from a gene derived from an animal, such as a mammal (e.g., a human), and if it can be removed by splicing after transcription of the corresponding region, the type may be selected. There are no particular restrictions.
  • the intron may include a splicing donor site and an acceptance site, a triploid guanine motif, and/or a branch point sequence.
  • the first intron may include a splice donor site of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, but is limited thereto. That is not the case.
  • the second intron may include a splice acceptance site of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, but is limited thereto. That is not the case.
  • the recombinant nucleic acid construct of the present invention contains a polynucleotide encoding interfering RNAs (RNAi) having specific inhibitory activity against a tumor antigen, such as an immune checkpoint, between the first intron and the second intron. It can be included.
  • RNAi interfering RNAs
  • the “immune checkpoint” is a protein that suppresses excessive immune responses in the immune system, and is a surface protein of immune cells that cancer cells use to avoid attack by the immune system.
  • the immune checkpoint proteins in the present invention include PD-1, PD-L1, PD-L2, IDO, 2B4 (CD244), 4-1BB, A2Ar, B7.1, B7.2, B7-H2, B7-H3.
  • B7-H4, B7-H6, BTLA, butyrophilin CD160, CD48, CTLA4, GITR, gp49B, HHLA2, HVEM, ICOS, ILT-2, ILT-4, KIR family receptor, LAG-3, OX-40 , PIR-B, SIRPalpha (CD47), TFM-4, TIGIT, TIM-1, TIM-3, TIM-4, or VISTA, but are not limited thereto.
  • the “interfering RNAs (RNAi)” may be shRNA, siRNA, or microRNA with a sequence homologous to the target gene, preferably microRNA, but is not limited thereto.
  • miRNA is a small non-coding RNA consisting of 18-25 nucleotides (nt), which is located in the 3'-untranslated region (UTR) of the target gene. ) to regulate gene expression (Bartel DP, et al., Cell 116: 281-297, 2004; Lewis BP, et al., Cell 120: 15-20, 2005), introns, and exons ( exon) or intergenic region (Rodriguez A, et al., Genome Res14: 1902-1910, 2004).
  • miRNAs are transcribed by RNA polymerase into pri-miRNA (miRNA) molecules containing thousands of nucleotides.
  • the pri-miRNA is then microprocessed (DroshaRNase endonuclease and DiGeorge syndrome region gene 8 protein (DGCR8)) to form an approximately 70 nt stem-loop intermediate known as the miRNA precursor. ] (Lee Y, et al., EMBO J21: 4663-4670, 2000; Zeng Y, et al., Proc Natl Acad Sci U S A100: 9779-9784, 2003). Then, the pre-miRNA is transported from the nucleus to the cytoplasm via Exportin-5 (EXP5) and the cofactor Ran-GTP, where the pre-miRNA is cleaved by the Rnase endonuclease Dicer.
  • EXP5 Exportin-5
  • Ran-GTP cofactor Ran-GTP
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the polynucleotide encoding the miRNA may be not only a polynucleotide encoding the mature form of these miRNAs, but also a polynucleotide encoding the miRNA mimic.
  • the miRNA mimic may include a miRNA precursor, a pri-miRNA, or a plasmid-type miRNA precursor.
  • the miRNA may be included without limitation as long as it has cancer prevention, improvement or treatment activity, for example, human PD-L1 (Programmed Cell Death-Ligand-1) or It may be a miRNA that has an inhibitory activity on the gene encoding human IDO (indoleamine dioxygenase), but is not limited thereto.
  • human PD-L1 Programmed Cell Death-Ligand-1
  • IDO indoleamine dioxygenase
  • the miRNA may be miR-138, but is not limited thereto.
  • the miRNA may be miR-153, but is not limited thereto.
  • the miRNA may be miR-138 and miR-153, but is not limited thereto.
  • the mature sequence of the miR-138 is hsa-miR-138 derived from humans (homo sapiens), and may be hsa-miR-138-5p, which consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19, but is limited thereto. no.
  • the sequence encoding the mature sequence of miR-138 may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, and preferably may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, but is not limited thereto. .
  • the sequence encoding the precursor (pre-miRNA) of miR-138 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, but It is not limited.
  • the sequence encoding the initial transcript (pri-miRNA) of miR-138 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22. , but is not limited to this.
  • the mature sequence of the miR-153 is hsa-miR-153 derived from humans (homo sapiens), and may be hsa-miR-153-5p, which consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23, but is limited thereto. no.
  • the sequence encoding the mature sequence of miR-153 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24, but is not limited thereto. .
  • the sequence encoding the precursor (pre-miRNA) of miR-153 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25, but It is not limited.
  • the sequence encoding the initial transcript (pri-miRNA) of miR-153 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26. , but is not limited to this.
  • a polynucleotide encoding miR-138 and a polynucleotide encoding miR-153 are included between the first intron and the second intron, their binding order is not particularly limited, It can be connected in the order of 5' to 3', the sequence coding for miR-138 (or a mimic thereof) - the sequence coding for miR-153 (or a mimic thereof), or the sequence coding for miR-153 (or a mimic thereof).
  • the coding sequence can be linked in the order of the coding sequence-miR-138 (or mimic thereof).
  • it may include a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 20 and a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 between the first intron and the second intron, It is not limited to this.
  • it may include a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 and a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 between the first intron and the second intron, It is not limited to this.
  • it may include a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 and a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 between the first intron and the second intron, It is not limited to this.
  • the first intron to the second intron region is removed through a splicing process, and the mRNA of the first exon and the second exon are combined with each other and subsequently translated.
  • the polypeptide obtained through can exhibit cancer cell killing activity.
  • the miRNA or its mimic e.g., pri-miRNA or pre-miRNA isolated during the splicing process targets cancer cells after undergoing additional processing as needed to inhibit the growth of cancer cells or inhibit cancer cells. It can exert therapeutic activity by inducing cell death.
  • it relates to a recombinant nucleic acid construct comprising polynucleotides encoding each of miR-138 and miR-153.
  • the polynucleotide encoding the miR-138 or miR-153 may be not only a polynucleotide encoding the mature form of these miRNAs, but also a polynucleotide encoding the miRNA mimic.
  • the miRNA mimic may include a miRNA precursor, a pri-miRNA, or a plasmid-type miRNA precursor.
  • the mature sequence of the miR-138 is hsa-miR-138 derived from humans (homo sapiens), and may be hsa-miR-138-5p, which consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19, but is limited thereto. no.
  • the sequence encoding the mature sequence of miR-138 may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, and preferably may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, but is not limited thereto. .
  • the sequence encoding the precursor (pre-miRNA) of miR-138 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, but It is not limited.
  • the sequence encoding the initial transcript (pri-miRNA) of miR-138 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22. , but is not limited to this.
  • the mature sequence of the miR-153 is hsa-miR-153 derived from humans (homo sapiens), and may be hsa-miR-153-5p, which consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23, but is limited thereto. no.
  • the sequence encoding the mature sequence of miR-153 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24, but is not limited thereto. .
  • the sequence encoding the precursor (pre-miRNA) of miR-153 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25, but It is not limited.
  • the sequence encoding the initial transcript (pri-miRNA) of miR-153 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26. , but is not limited to this.
  • the recombinant nucleic acid construct of the present invention may simultaneously contain a sequence encoding miR-138 or a mimic thereof and a sequence encoding miR-153 or a mimic thereof in one construct. It is also included within the scope of the present invention to separately include a polynucleotide containing a sequence encoding a homologous protein and a polynucleotide containing a sequence encoding a homologous protein (miR-153) or a mimic thereof.
  • the linking order of the two genes is not particularly limited, and the 5' In the 3' order, it can be connected in the order of the miR-138 (or its mimic) coding sequence-miR-153 (or its mimic) coding sequence, or the miR-153 (or its mimic) coding sequence-miR. -138 (or its mimic) can be linked in the order of the coding sequence.
  • the present invention relates to an expression vector containing the recombinant nucleic acid construct of the present invention.
  • the construct in order to introduce the recombinant nucleic acid construct into an appropriate host cell, the construct may be inserted into a vector for cloning.
  • the “vector” refers to a recombinant vector that can be introduced into a suitable host cell to express a protein of interest, and refers to a gene expression system that includes essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • a number of expression systems such as chromosomes, episomes, and derived viruses can be used as vectors for inserting the recombinant nucleic acid construct.
  • recombinant expression vectors that can be used include bacterial plasmids, transfections, yeast episomes, insertion factors, yeast chromosomal factors, viruses such as baculovirus, papillomavirus such as SV40, vaccinia virus, adenovirus, and adeno-virus.
  • viruses such as baculovirus, papillomavirus such as SV40, vaccinia virus, adenovirus, and adeno-virus.
  • Those derived from accessory viruses, retroviruses, fowlpox viruses, and pseudorabies viruses may be used, but are not limited to these.
  • These recombinant expression vectors may also be cosmid or phagemid derivatives.
  • one type of vector is a “plasmid,” which refers to a circular double-stranded DNA loop within which additional DNA segments can be ligated.
  • Another type of vector is a phage vector.
  • Another type of vector is a viral vector in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors are capable of autonomous replication within the host cell into which they are introduced (e.g., bacterial vectors with a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors). Other vectors (e.g., non-episomal mammalian vectors) can integrate into the genome of a host cell upon introduction into the host cell, thereby replicating with the host genome. Additionally, a particular vector can direct the expression of a gene to which the vector is operably linked. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply, “recombinant vectors”).
  • the "operably linked” refers to a nucleic acid that is different from the expression control region (e.g., promoter, signal sequence, ribosome binding site, transcription termination sequence, transcription regulator binding site, etc.) of the desired nucleic acid molecule. refers to a functional bond between sequences, whereby the regulatory sequence regulates the transcription and/or translation of the other nucleic acid sequence.
  • the expression control region e.g., promoter, signal sequence, ribosome binding site, transcription termination sequence, transcription regulator binding site, etc.
  • the vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), This document is incorporated herein by reference.
  • vectors that can be used in the present invention include plasmids (e.g., Psc101, ColE1, Pbr322, Puc8/9, Phc79, Puc19, Pet, etc.), phages (e.g., ⁇ gt4 ⁇ b, ⁇ -Charon, ⁇ z1, ⁇ gem.TM.-11, and M13, etc.) or viruses (e.g., SV40, etc.).
  • plasmids e.g., Psc101, ColE1, Pbr322, Puc8/9, Phc79, Puc19, Pet, etc.
  • phages e.g., ⁇ gt4 ⁇ b, ⁇ -Charon, ⁇ z1, ⁇ gem.TM.-11, and M13, etc.
  • viruses e.g., SV40, etc.
  • the recombinant nucleic acid construct can be inserted into a host cell using a viral expression system (vaccinia or other pox virus, retrovirus or adenovirus).
  • viral vectors include retroviral vectors derived from HIV, SIV, murine retroviruses, gibbon ape leukemia virus, adeno-associate viruses (AAVs), and adenoviruses.
  • AAVs adeno-associate viruses
  • it is not limited thereto (Miller et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10:4239; J. Kolberg 1992, NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2 :215).
  • the recombinant nucleic acid construct is DNA
  • the so-called 'naked DNA' method can be used, or a plasmid vector or viral vector can be used, and the nucleic acid is expressed as a vector targeting prokaryotic cells or eukaryotic cells. It can be included in any possible form.
  • the expression vector of the present invention may include a functional sequence for expressing the recombinant nucleic acid construct in addition to the nucleic acid sequence as the expression target sequence.
  • the functional sequence may include one or more promoters that can proceed with transcription, one or more introns, one or more transcription termination regions, one or more start codons, and one or more stop or stop codons.
  • the vector may include a ribosome binding site (RBC) and/or transcription/translation termination sequence to initiate translation into a peptide.
  • RBC ribosome binding site
  • the expression vector of the present invention may include a nucleic acid sequence encoding a protease or peptidase cleavage site, and may include one or more leader sequences. where each leader sequence encodes a signal peptide. Additionally, the expression vector of the present invention may contain one or more linker or tag sequences. Here, the tag sequence may encode a hemagglutinin (HA) tag.
  • HA hemagglutinin
  • a structural promoter or an inducible promoter may be used in the present invention according to the needs of a specific situation that can be confirmed by a person skilled in the art.
  • a large number of promoters recognized by a variety of possible host cells are well known.
  • the selected promoter can be operably linked to the cistron DNA encoding the peptides described herein by removing the promoter from the source DNA via restriction enzyme recognition sequences and inserting the isolated promoter sequence into a selection vector.
  • Both native promoter sequences and multiple heterologous promoters can be used to direct amplification and/or expression of target genes.
  • heterologous promoters can generally achieve transcription and expression efficiency of the expressed target gene compared to the native target polypeptide promoter.
  • a strong promoter capable of advancing transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, and T7 promoter, etc.
  • a ribosome binding site for initiation of translation e.g., amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter, and T7 promoter, etc.
  • E. coli E. coli is used as the host cell, the promoter and operator regions of the E.
  • coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J.Bacteriol., 158:1018-1024 (1984)) and the left-handed promoter of phage ⁇ (pL ⁇ ) Promoters, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann Rev. Genet., 14:399-445 (1980), can be used as control sites.
  • plasmid vectors plasmids commonly used in the art, such as pSC101, pBR322, pUC19, pET-22, etc., can be used.
  • a promoter derived from mammalian cells can be used as host cells.
  • attenuated viruses such as vaccinia or flowpox, as well as adenovirus vectors, adeno-related vectors, are used to express the recombinant nucleic acid construct.
  • Adeno-associated virus vectors, retrovirus vectors, herpes simplex virus, non-toxic anthrax toxin vectors, etc. can be used.
  • the promoters include, for example, CMV (cytomegalo virus) promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, HSV tk promoter, and RSV promoter.
  • cancer cell-specific promoters e.g., TERT promoter, PSA promoter, PSMA promoter, CEA promoter, E2F promoter and AFP promoter
  • tissue-specific promoters e.g., albumin promoter
  • bacteriophage T7 A promoter may be used, but is not limited thereto.
  • the expression vector of the present invention may further include an enhancer sequence to increase transcriptional activity.
  • Enhancer sequences are nucleic acid base sequences that are located at various sites in a promoter and increase transcriptional activity compared to the transcriptional activity caused by the promoter in the absence of the enhancer sequence.
  • the enhancer may be, but is not limited to, human actin, human myosin, human hemoglobin, human muscle creatine enhancer, and viral enhancers such as those derived from CMV, SV40, RSV, and EBV.
  • the expression vector may include a sequence encoding one or more signal peptides/secretion signal peptides to promote and/or increase expression or post-translational secretion of the recombinant nucleic acid construct.
  • the signal sequence or peptide is a secretion signal, also known as a leader sequence or peptide, or a localization signal or sequence, and is a short peptide at the N-terminus of the newly synthesized protein to be secreted.
  • Signal peptides generally promote cells to translocate proteins to the cell membrane. The efficiency of protein secretion is strongly determined by signal peptides.
  • the immunostimulatory bacteria herein contain plasmids that may include a signal peptide/secretion signal peptide to promote and/or increase expression or secretion of the encoded therapeutic agent(s).
  • the signal sequence includes Hly signal sequence, ActA signal sequence, PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, ⁇ -amylase signal sequence, LLO signal sequence, subtilisin signal sequence, MF- ⁇ signal sequence, SUC2 signal sequence, and insulin.
  • a signal sequence, a-interferon signal sequence, an antibody molecule signal sequence, etc. may be used, but it may be any other known signal sequence.
  • the expression vector of the present invention may further include a transcription termination sequence to increase the stability of the transcript or facilitate cytoplasmic transport.
  • the transcription termination sequence may include, but is not limited to, a polyadenylation sequence (e.g., bovine growth hormone terminator and SV40-derived polyadenylation sequence).
  • the expression vector of the present invention when it is a replicable expression vector, it may include a replication origin, which is a specific nucleic acid sequence where replication is initiated.
  • the expression vector of the present invention may contain a DNA nuclear targeting sequence (DTS).
  • DTS DNA nuclear targeting sequences
  • DTS DNA nuclear targeting sequences
  • SV40 DTS mediate translocation of DNA sequences through the nuclear pore complex.
  • the mechanism of this transport is reported to depend on the binding of a DNA-binding protein containing a nuclear localization sequence.
  • Incorporation of expression vectors to increase nuclear transport and expression has been demonstrated (see, e.g., Dean, D.A. et al. (1999) Exp. Cell Res. 253(2):713-722), and S. It has been used to increase gene expression from plasmids transmitted by Typhimurium (see, e.g., Kong et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419).
  • the DNA nuclear targeting sequence may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 27, but is not limited thereto.
  • the expression vector of the present invention may further include a selection marker to facilitate purification of the expressed peptide.
  • a selection marker is used to select cells transformed with a vector, and may be a marker that confers a selectable phenotype such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of a surface protein.
  • markers include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), and 6 x His (hexahistidine; Quiagen, USA). It is not limited to this.
  • RNA polymerase chain reaction PCR
  • LCR ligase chain reaction
  • Q ⁇ -replicase amplification Q ⁇ -replicase amplification
  • bacterial strains can be used as host cells, and bacterial strains transformed with the expression vector of the present invention can be used to prevent, improve, or treat cancer.
  • the expression vector of the present invention may further include a polynucleotide encoding a toxin protein that has the function of directly or indirectly inducing the death of cancer cells.
  • the toxin proteins include Ricin, Saporin, Gelonin, Momordin, Debouganin, Diphtheria toxin, Pseudomonas toxin, and Hemolysin.
  • HlyA FAS ligand
  • FASL FAS ligand
  • TNF-alpha tumor necrosis factor-alpha
  • TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand
  • SLO streptolysin O
  • PLO pneumolysin
  • LLO listeriolysin
  • ClyA cytolysin A
  • the expression vector may further include a polynucleotide encoding listerolysin O (LLO), a toxin protein.
  • LLO listerolysin O
  • Listeriolysin O is a hemolysin produced by the bacterium Listeria monocytogenes, a pathogen that causes listeriosis. Listeriolysin O (LLO) dissolves and destroys phagosomes, allowing bacteria to escape into the cytoplasm and grow inside the cell. After escaping from the phagosome, the toxin has little activity in the cytoplasm.
  • the listeriolysin O (LLO) is encoded by the Hly gene, which is part of a pathogenicity island called LIPI-1.
  • the listerolysin O may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, and the Hly gene may include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29. It is not limited to this.
  • the expression vector of the present invention further includes a polynucleotide encoding a toxin protein, not only when both the recombinant nucleic acid construct and the polynucleotide encoding the toxin protein are inserted into one vector, the recombinant nucleic acid construct
  • a vector containing two types of vectors that is, a vector containing a vector containing a polynucleotide encoding the toxin protein, is also included.
  • the recombinant nucleic acid construct and the polynucleotide encoding the toxin protein when simultaneously included in one vector, they can be operably linked by one promoter, or each can be operated by two or more promoters. can be connected.
  • Figure 1 is a cleavage map of a plasmid system comprising a recombinant nucleic acid construct consisting of polynucleotides (SEQ ID NOs: 22 and 26) encoding the early transcript of miR-138 and the early transcript of miR-153 in one embodiment of the present invention. It is shown.
  • Figure 2 shows a cleavage map of the plasmid system comprising the recombinant nucleic acid construct and the Hly gene sequence (SEQ ID NO: 29) encoding listeolysin O (LLO) in one embodiment of the present invention.
  • DTS (SEQ ID NO: 9) may be cloned in addition to the vector shown in Figure 1 or 2, but is not limited thereto.
  • Figures 3 and 4 show cleavage maps of a plasmid system containing the recombinant nucleic acid construct and a polynucleotide encoding the toxin protein in one embodiment of the present invention, but are not limited thereto.
  • the expression vector includes exon 1 of the granzyme B gene (SEQ ID NO: 3); Intron 1 (SEQ ID NO: 17); miR-138 early transcript coding sequence (SEQ ID NO: 22); miR-153 early transcript coding sequence (SEQ ID NO: 26); Intron 2 (SEQ ID NO: 18); Exons 2 to 5 (SEQ ID NO: 10) of the granzyme B gene may be cloned, but are not limited thereto.
  • the expression vector includes DTS (SEQ ID NO: 27); Exon 1 of the granzyme B gene (SEQ ID NO: 3); Intron 1 (SEQ ID NO: 17); miR-138 early transcript coding sequence (SEQ ID NO: 22); miR-153 early transcript coding sequence (SEQ ID NO: 26); Intron 2 (SEQ ID NO: 18); Exons 2 to 5 (SEQ ID NO: 10) of the granzyme B gene may be cloned, but are not limited thereto.
  • the expression vector includes DTS (SEQ ID NO: 27); Exon 1 of the granzyme B gene (SEQ ID NO: 3); Intron 1 (SEQ ID NO: 17); miR-138 early transcript coding sequence (SEQ ID NO: 22); miR-153 early transcript coding sequence (SEQ ID NO: 26); Intron 2 (SEQ ID NO: 18); Exons 2 to 5 (SEQ ID NO: 10) of the granzyme B gene may be operably linked, and the Hly gene (SEQ ID NO: 29) may be additionally cloned, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a host cell transformed with an expression vector according to the present invention.
  • the host cell includes granzyme B or a fragment thereof; and tumor antigens, such as immune checkpoint proteins, may be genetically engineered to express interfering RNA (RNAi) with specific inhibitory activity.
  • RNAi interfering RNA
  • the granzyme B may be encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the granzyme B may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the fragment of granzyme B includes a polypeptide encoded by at least two selected from exon 1, exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, or fragments thereof of granzyme B. can do.
  • the polypeptide encoded by exon 1 of the granzyme B gene may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, but is not limited thereto.
  • the polypeptide encoded by exon 2 of the granzyme B gene may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, but is not limited thereto.
  • the polypeptide encoded by exon 3 of the granzyme B gene may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, but is not limited thereto.
  • the polypeptide encoded by exon 4 of the granzyme B gene may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, but is not limited thereto.
  • the polypeptide encoded by exon 5 of the granzyme B gene may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, but is not limited thereto.
  • the interfering RNA (RNAi) with specific inhibitory activity against the immune checkpoint encodes human PD-L1 (Programmed Cell Death-Ligand-1) or human IDO (indoleamine dioxygenase).
  • the miRNA has gene repression activity, and may preferably be at least one of miR-138 and miR-153, but is not limited thereto.
  • the host cells may be genetically engineered to express miR-138 and miR-153.
  • the mature sequence of miR-138 may be composed of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19, but is not limited thereto.
  • the mature sequence of miR-153 may be composed of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23, but is not limited thereto.
  • the host cell may be genetically engineered to additionally express listeolysin O (LLO).
  • LLO listeolysin O
  • the listeolysin O may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 28, but is not limited thereto.
  • the host cell may be transformed with the expression vector provided by the present invention.
  • the “host cell” is a cell used to receive, maintain, reproduce and/or amplify the vector. Host cells can also be used to express the polypeptide encoded by the vector. The nucleic acid contained in the vector is replicated when the host cell divides, amplifying the nucleic acid.
  • the host cell is preferably an immunostimulatory bacterial strain.
  • immunostimulatory bacteria means that when introduced into a subject, they accumulate in immunoprivileged tissues and cells, such as tumors, tumor microenvironments, and tumor-residing immune cells, and replicate and/or express products that are immunostimulatory or elicit immunostimulation. It is a therapeutic bacteria.
  • the immunostimulatory bacteria in the present invention may be any suitable species.
  • Salmonella, Listeria, Rickettsia, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas , Francisella, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Coplasma It may include strains of Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Vibrio, Bacillus, or Erysipelothrix. It is not limited to this.
  • Salmonella typhimurium Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Salmonella infantis, Salmonella paratyphi, and Salmonella typhi.
  • Listeria Monocytogenes Ricketsia Ricketsiae Chi), Ricketsia Mooseri, Ricketsia Sibirica ), Bordetella bronchiseptica, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Aeromonas eucrenophila, Aeromonas salmoni Aeromonas salmonicida, Francisella tularensis, Corynebacterium pseudotuberculosis, Citrobacter freundii, Chlamydia pneumoniae, Haemophilus somnus, Brucella abortus, Mycobacterium intracellulare, Legionella pneumophila, Rhodococcus equi, Pseudomonas aerugi P
  • the bacterial strain may preferably be a Salmonella strain, and more preferably, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, or Salmonella Enteritidis. It may be derived from at least one selected from the group consisting of Salmonella enteritidis, Salmonella infantis, Salmonella paratyphi, or Salmonella typhi.
  • Salmonella genus strains are Gram-negative facultative anaerobic bacilli. It is distinguished from E. coli as it does not have the ability to break down lactose, does not form indole, and does not produce hydrogen sulfide.
  • the strains of the Salmonella genus have main hairs and may be motile.
  • Salmonella typhimurium is a bacteria causing typhoid fever in the Salmonella genus.
  • the Salmonella Typhimurium is a rod-shaped bacillus that has flagella and is Gram-negative.
  • the Salmonella Typhimurium is weak to heat and dies in 20 minutes at 60°C. It is primary contaminated by livestock, wild animals, carriers, etc., milk, eggs, etc., and salads, which are susceptible to secondary infection from contaminated raw meat, are also the cause of food poisoning. It can cause a type of salmonellosis.
  • Exemplary Salmonella typhimurium strains herein include Salmonella derived from attenuated and wild-type strains, e.g., strains designated AST-100, VNP20009, YS1646 (ATCC #202165), RE88, SL7207, x8429, x8431, x8468. It may be, but is not limited to, a Typhimurium strain, or a wild-type strain with ATCC accession number 14028.
  • the VNP20009 strain is an attenuated genetically modified strain of Salmonella typhimurium with deletions at the msbB and purI sites, and is described by Luo et al., Oncol Res. 12(11-12):501-8, 2001.
  • “Salmonella choleraesuis” is a well-known porcine cholera bacterium of the Salmonella genus and is a bacterium that infects both humans and animals.
  • the Salmonella cholerasuis is the main cause of acute sepsis caused by Salmonella.
  • This bacterium is a Gram-negative, facultative anaerobic bacillus that has main hairs and is motile. It is distinguished from E. coli as it does not have the ability to break down lactose, does not form indole, and does not produce hydrogen sulfide.
  • the optimal temperature for growth is 35-37°C and the temperature range for proliferation is 10-43°C. It is killed by heating at 60°C for 20 minutes.
  • the optimal pH is 7.2 ⁇ 7.4, and the size is 0.5 ⁇ 0.8 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ m.
  • Salmonella enteritidis is a bacterial infection-type food poisoning bacterium of the Salmonella genus and is also called enteritis bacteria.
  • the Salmonella Enteritidis is a representative Salmonella bacterium and can cause infection in all animals and has very high host adaptability. It is a Gram-negative facultative anaerobic bacillus that has main hairs and is motile. It is distinguished from E. coli as it does not have the ability to break down lactose, does not form indole, and does not produce hydrogen sulfide.
  • the optimal temperature for growth is 35-37°C and the temperature range at which growth is possible is 10-43°C. It is killed by heating at 60°C for 20 minutes.
  • the optimal pH is 7.2 ⁇ 7.4, and the size is 0.5 ⁇ 0.8 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ m.
  • Salmonella infantis is a strain that is infected by eggs or poultry meat
  • Salmonella paratyphi and Salmonella typhi are the causative strains of typhoid fever.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating cancer comprising a genetically engineered host cell, preferably a bacterial strain, as an active ingredient.
  • the “cancer” refers to a disease characterized by rapid and uncontrolled growth of mutant cells, such as melanoma, fallopian tube cancer, brain cancer, small intestine cancer, esophageal cancer, lymph node cancer, gallbladder cancer, blood cancer, thyroid cancer, endocrine cancer, Oral cancer, liver cancer, biliary tract cancer, colon cancer, rectal cancer, cervical cancer, ovarian cancer, kidney cancer, stomach cancer, duodenal cancer, prostate cancer, breast cancer, brain tumor, lung cancer, undifferentiated thyroid cancer, uterine cancer, colon cancer, bladder cancer, ureter cancer, pancreatic cancer, A group consisting of bone/soft tissue sarcoma, skin cancer, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, multiple myeloma, leukemia, myelodysplastic syndrome, acute lymphoblastic leukemia, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic mye
  • mutant cells
  • prevention refers to all actions that inhibit cancer or delay its progression by administering the composition of the present invention.
  • treatment and “improvement” refer to any action in which cancer symptoms are improved or beneficially changed by administration of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated to include one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredients described above.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and a mixture of one or more of these ingredients, and if necessary, antioxidants.
  • other common additives such as buffer solutions and bacteriostatic agents can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants can be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions, as well as pills, capsules, granules, or tablets, and can act specifically on target organs.
  • Target organ-specific antibodies or other ligands can be used in combination with the carrier.
  • it can be preferably formulated according to each disease or ingredient using an appropriate method in the art or a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (recent edition), Mack Publishing Company, Easton PA). there is.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be a solution, suspension, dispersion, emulsion, gel, injectable solution, or sustained-release preparation of the active compound, and is preferably an injection.
  • the pH is adjusted using a buffer solution such as an aqueous acid solution or phosphate that can be used as an injection to ensure product stability according to the distribution of the injection prescription, making the injection very physically and chemically stable. It can be manufactured with
  • the injection can be prepared by dissolving it in water for injection along with a stabilizer or solubilizing agent and then sterilizing it, especially by high-temperature reduced-pressure sterilization or aseptic filtration.
  • the water for injection may be distilled water for injection or a buffer solution for injection, for example, a phosphate buffer solution with a pH in the range of 3.5 to 7.5 or a sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)-citric acid buffer solution.
  • the phosphate salt used may be in the form of sodium salt or potassium salt, anhydrous or hydrated, and may be citric acid or in anhydrous or hydrated form.
  • the stabilizer used in the present invention includes sodium pyrosulfite, sodium bisulfite (NaHSO 3 ), sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 3 ), or ethylenediaminetetraacetic acid
  • Solubilizing agents include bases such as sodium hydroxide (NaOH), sodium bicarbonate (NaHCO 3 ), sodium carbonate (NaCO 3 ) or potassium hydroxide (KOH), or acids such as hydrochloric acid (HCl) or acetic acid (CH 3 COOH).
  • the injectable agent according to the present invention can be formulated to be bioabsorbable, biodegradable, and biocompatible.
  • bioabsorbable we mean that the injectable agent can disappear from the body upon initial application without decomposition or decomposition of the dispersed injectable agent.
  • Biodegradability means that the injectable agent can be broken down or decomposed in the body by hydrolysis or enzymatic degradation.
  • Biosynthesis means that all ingredients are non-toxic to the body.
  • the injection according to the present invention can be prepared using conventional fillers, weighting agents, binders, wetting agents, diluents such as surfactants, or excipients.
  • composition or active ingredient of the present invention may be administered by intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, transdermal, intranasal, subcutaneous, intrathecal, inhalational, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal route depending on the purpose. It can be administered in a conventional manner, and preferably intravenously.
  • the composition or active ingredient of the present invention may be administered by injection or catheter.
  • the dosage of said bacteria to a subject following administration of a composition of the present invention will depend on the subject's species, size, body surface area, age, sex, immunocompetence, and general health to be administered, as known in the medical arts. It can depend on many factors, including the specific bacteria, the duration and route of administration, the type and stage of the disease, such as tumor size, and other compounds such as drugs being administered concomitantly. In addition to the above factors, these levels can be influenced by the infectivity of the bacteria and the characteristics of the bacteria, as can be determined by those skilled in the art. In the present method, the appropriate minimum dose level of bacteria may be a level sufficient for the bacteria to survive, grow and replicate in the tumor or metastasis.
  • Exemplary minimum levels for administration of bacteria to a 65 kg human are at least about 5 ⁇ 10 6 colony forming units (CFU), at least about 1 ⁇ 10 7 CFU, at least about 5 ⁇ 10 7 CFU, at least about 1 ⁇ 10 8 CFU, or at least about 1 ⁇ 10 9 CFU. may include.
  • an appropriate maximum dose level of bacteria is a level that is not toxic to the host, does not cause more than 3x splenomegaly, and produces colonies or colonies in normal tissues or organs after about 1 day, or after about 3 days, or after about 7 days. It may be at a level that does not create plaque.
  • Exemplary maximum levels for administration of bacteria to a 65 kg human may include up to about 5 ⁇ 10 11 CFU, up to about 1 ⁇ 10 11 CFU, up to about 5 ⁇ 10 10 CFU, up to about 1 ⁇ 10 10 CFU, or up to about 1 ⁇ 10 9 CFU. .
  • the active ingredient may be contained in an amount of 0.001 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
  • the content is not limited to this.
  • composition of the present invention may further include one or more anticancer agents.
  • the anticancer agents include nitrogen mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, erlotinib, neratinib, lapatinib, gefitinib, vandetanib, nirotinib, semasanib, bosutinib, axitinib, Cediranib, lestaurtinib, trastuzumab, gefitinib, bortezomib, sunitinib, carboplatin, bevacizumab, cisplatin, cetuximab, Viscum album, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide , dasatinib, estramustine, gemtuzumab ozogamycin, ibritumab tusetan, heptaplatin, methylaminolevulinic acid, amsacrine, alemtuzumab, procarbazin
  • tezolomide busulfan, ifosphamide, cyclophosphamide, melphalan, altretmin, dacarbazine, thiotepa, nimustine, chlorambucil, mitolactol, leucovorin, tretonin, exemestane. , aminoglutethimide, anagrelide, navelvin, fadrazole, taciphen, toremifene, testolactone, anastrozole, letrozole, borozole, bicalutamide, lomustine and carmustine.
  • One or more types selected from the group may be used, but are not limited thereto.
  • combination therapy with other anti-tumor treatments and/or treatments may be performed.
  • cell therapy such as administration of modified immune cells; CAR-T therapy; CRISPR therapy; Immunotherapy, such as immune checkpoint inhibitors, such as antibodies and antibody fragments; Chemotherapy and chemotherapeutic compounds such as nucleoside analogs; surgery; oncolytic virus therapy; and radiotherapy.
  • the present invention relates to a method for preventing, improving, or treating cancer, including the step of administering the pharmaceutical composition provided by the present invention to a subject.
  • the subject may include mammals, birds, reptiles, farmed fish, etc., including rats, livestock, humans, etc. that develop or are at risk of developing cancer, without limitation.
  • the first intron to the second intron region of the mRNA obtained after transcription is removed through a splicing process, and the mRNA of the first exon and the second exon are combined with each other for subsequent translation.
  • the polypeptide obtained through can exhibit cancer cell killing activity.
  • the recombinant nucleic acid construct of the present invention uses an inhibitor targeting an antigen present in cancer cells between the first intron and the second intron, such as interfering RNA (RNAi) targeting an immune checkpoint or other tumor antigen. It may further include a coding polynucleotide, in which case a synergistic improvement in anticancer activity can be expected due to the interfering RNA separated during the splicing process. At this time, excellent anticancer activity can be shown through synergistic action by inserting miR-138 and miR-153, which specifically target cancer cells.
  • RNAi interfering RNA
  • Figure 1 is a cleavage map of the pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO vector produced in Example 1 of the present invention.
  • Figure 2 is a cleavage map of the pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector produced in Example 2 of the present invention.
  • Figure 3 is a cleavage map of the pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector produced in Example 4 of the present invention.
  • Figure 4 is a cleavage map of the pcDNA3-DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector produced in Example 5 of the present invention.
  • Figure 5 shows the results of electrophoresis of the fragment obtained after treating the pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO vector produced in Example 1 of the present invention with restriction enzymes.
  • Figure 6 shows the results of electrophoresis of the fragment obtained after treating the pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector produced in Example 2 of the present invention with restriction enzymes.
  • Figure 7 shows the results of Western blot confirmation of the LLO expression level in cell lysates of Salmonella strains transformed with the pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector produced in Example 2 of the present invention.
  • Figure 8 shows the results of electrophoresis of the fragment obtained after treating the pcDNA3-GrB vector produced in Example 4 of the present invention with restriction enzymes.
  • Figure 9 shows the results of electrophoresis of the fragment obtained after treating the pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector produced in Example 4 of the present invention with restriction enzymes.
  • Figure 10 shows the results of electrophoresis of the fragment obtained after treating the pcDNA3-DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector produced in Example 5 of the present invention with restriction enzymes.
  • Figure 11 shows the results of confirming the expression levels of PD-L1 and IDO in the cell lysate by Western blot after infection of colon cancer SW480 cells with the Salmonella strain transformed with the vector in Example 7 of the present invention.
  • Figure 12 shows the results of confirming the expression levels of PD-L1 and IDO in the cell lysate by Western blot after infection of colon cancer HT29 cells with the Salmonella strain transformed with the vector in Example 7 of the present invention.
  • Figure 13 shows the results of confirming the expression levels of PD-L1 and IDO in the cell lysate by Western blot after infection of liver cancer Huh7 cells with the Salmonella strain transformed with the vector in Example 7 of the present invention.
  • Figure 14 shows the results of confirming the expression levels of PD-L1 and IDO in the cell lysate by Western blot after infecting breast cancer MDA-MB-231 cells with the Salmonella strain transformed with the vector in Example 7 of the present invention. will be.
  • Figure 15 shows the results of confirming the expression levels of PD-L1 and IDO in the cell lysate by Western blot after infection of pancreatic cancer Panc1 cells with the Salmonella strain transformed with the vector in Example 7 of the present invention.
  • Figure 16 shows the expression levels of PD-L1 (target A) and IDO (target B) in the cell lysate after infection of colon cancer cells with the vector-transformed Salmonella strain in Example 8 of the present invention by Western blot. After confirmation, the ratio of changes in the expression levels of PD-L1 and IDO in colon cancer cells treated with the Salmonella strain compared to untreated colon cancer cells is graphed.
  • Figure 17 shows the expression levels of PD-L1 (target A) and IDO (target B) in the cell lysate after infection of liver cancer cells with the vector-transformed Salmonella strain in Example 8 of the present invention by Western blot. Afterwards, the ratio of changes in the expression levels of PD-L1 and IDO in liver cancer cells treated with the Salmonella strain compared to untreated liver cancer cells is graphed.
  • Figure 18 shows the expression levels of PD-L1 (target A) and IDO (target B) in the cell lysate after infection of breast cancer cells with the vector-transformed Salmonella strain in Example 8 of the present invention by Western blot. Afterwards, the ratio of changes in the expression levels of PD-L1 and IDO in breast cancer cells treated with the Salmonella strain compared to untreated breast cancer cells is shown graphically.
  • Figure 19 shows the expression levels of PD-L1 (target A) and IDO (target B) in the cell lysate after infection of pancreatic cancer cells with the vector-transformed Salmonella strain in Example 8 of the present invention by Western blot. Afterwards, the ratio of changes in the expression levels of PD-L1 and IDO in pancreatic cancer cells treated with the Salmonella strain compared to untreated pancreatic cancer cells is shown graphically.
  • Figure 20 shows a photograph showing the expression level of granzyme B protein in the cells after infection with the vector-transformed Salmonella strain in colon cancer SW480 cells in Example 9 of the present invention using a fluorescence microscope.
  • “no Hly” is the result of processing a Salmonella strain transformed with a pcDNA3 mock vector in which the Hly gene was not cloned
  • “Neg. Hly” is the result of processing a Salmonella strain transformed with a pcDNA3 vector in which only the Hly gene was cloned
  • “P/I” or “PI” is the result of treating the Salmonella strain transformed with the pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector of Example 2
  • “Int. GP/I” is the result of treating the pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector of Example 4.
  • GPI is the result of processing a Salmonella strain transformed with a vector in which the CDS of GrB, hsa-mir-138, and hsa-mir-153 were sequentially cloned into the pcDNA3 vector, and the Hly gene was additionally cloned.
  • Gzm is “DGzm” is the result of treating a Salmonella strain transformed with a vector that cloned only the CDS of GrB into the pcDNA3 vector
  • DGzm is the result of treating a Salmonella strain transformed with a vector that cloned the CDS of DTS and GrB into the pcDNA3 vector.
  • the first exon of the granzyme B (GZMB) gene from 5' to 3', the first exon of the granzyme B (GZMB) gene; first intron; second intron; And a recombinant nucleic acid comprising a second exon of the granzyme B (GZMB) gene, and comprising a nucleotide encoding at least one interfering RNA (RNAi) between the first intron and the second intron.
  • RNAi interfering RNA
  • the first exon of the granzyme B gene is at least one selected from five exons or fragments thereof included in the granzyme B gene, that is, exon 1, exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, or It may be at least one selected from among these fragments.
  • the second exon of the granzyme B gene is at least one selected from five exons or fragments thereof included in the granzyme B gene, that is, exon 1, exon 2, exon 3, exon 4, exon 5, or It may be at least one selected from among these fragments.
  • the first exon may include exon 1 of the granzyme B gene (GZMB) or a fragment thereof
  • the second exon may include exon 5 of the granzyme B gene (GZMB) or a fragment thereof.
  • GZMB granzyme B gene
  • the first exon includes exon 1 of the granzyme B gene (GZMB) or a fragment thereof
  • the second exon includes exon 2, exon 3, and exon 4 of the granzyme B gene (GZMB).
  • GZMB granzyme B gene
  • the second exon includes exon 2, exon 3, and exon 4 of the granzyme B gene (GZMB).
  • exon 5 or a fragment thereof but is not limited thereto.
  • the first exon includes exon 1 or a fragment thereof and exon 2 of the granzyme B gene (GZMB), and the second exon includes exon 3 and exon 2 of the granzyme B gene (GZMB) It may include, but is not limited to, exon 4 and exon 5 or a fragment thereof.
  • the first exon includes exon 1 or a fragment thereof, and exons 2 and 3 of the granzyme B gene (GZMB), and the second exon includes exon 4 of the granzyme B gene (GZMB). and exon 5 or a fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the first exon includes exon 1 or a fragment thereof, exon 2, exon 3, and exon 4 of the granzyme B gene (GZMB), and the second exon includes the granzyme B gene (GZMB) ) may include exon 5 or a fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the first exon may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the first exon may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the second exon may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 (sequences of SEQ ID NOs: 5 to 8 sequentially linked in the 5'->3' direction), but is limited thereto. It doesn't work.
  • the second exon may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 (sequences of SEQ ID NOs: 5 to 7 and 9 sequentially linked in the 5'->3' direction), It is not limited to this.
  • the first intron or a fragment thereof may include a splice donor site.
  • the second intron or fragment thereof may include a splice acceptance site.
  • the first intron may include a splice donor site of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17, but is limited thereto. That is not the case.
  • the second intron may include a splice acceptance site of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18, but is limited thereto. That is not the case.
  • the recombinant nucleic acid construct of the present invention contains a polynucleotide encoding interfering RNAs (RNAi) having specific inhibitory activity against a tumor antigen, such as an immune checkpoint, between the first intron and the second intron. It can be included.
  • RNAi interfering RNAs
  • the interfering RNA may be miR-138, but is not limited thereto.
  • the interfering RNA may be miR-153, but is not limited thereto.
  • the interfering RNA may be miR-138 and miR-153, but is not limited thereto.
  • the mature sequence of the miR-138 is hsa-miR-138 derived from humans (homo sapiens), and may be hsa-miR-138-5p, which consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19, but is limited thereto. no.
  • the sequence encoding the mature sequence of miR-138 may include the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, and preferably may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, but is not limited thereto. .
  • the sequence encoding the precursor (pre-miRNA) of miR-138 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, but It is not limited.
  • the sequence encoding the initial transcript (pri-miRNA) of miR-138 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22. , but is not limited to this.
  • the mature sequence of the miR-153 is hsa-miR-153 derived from humans (homo sapiens), and may be hsa-miR-153-5p, which consists of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23, but is limited thereto. no.
  • the sequence encoding the mature sequence of miR-153 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24, but is not limited thereto. .
  • the sequence encoding the precursor (pre-miRNA) of miR-153 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25, but It is not limited.
  • the sequence encoding the initial transcript (pri-miRNA) of miR-153 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26, preferably consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26. , but is not limited to this.
  • it may include a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 21 and a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 between the first intron and the second intron, It is not limited to this.
  • it may include a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 and a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 between the first intron and the second intron, It is not limited to this.
  • it relates to a recombinant nucleic acid construct comprising polynucleotides encoding each of miR-138 and miR-153.
  • the present invention relates to an expression vector containing the recombinant nucleic acid construct of the present invention.
  • the expression vector of the present invention may contain a DNA nuclear targeting sequence (DTS).
  • DTS DNA nuclear targeting sequence
  • the DNA nuclear targeting sequence may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 27, but is not limited thereto.
  • the expression vector of the present invention may further include a polynucleotide encoding a toxin protein that has the function of directly or indirectly inducing death of cancer cells.
  • the toxin proteins include Ricin, Saporin, Gelonin, Momordin, Debouganin, Diphtheria toxin, Pseudomonas toxin, and Hemolysin.
  • HlyA FAS ligand
  • FASL FAS ligand
  • TNF-alpha tumor necrosis factor-alpha
  • TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand
  • SLO streptolysin O
  • PLO pneumolysin
  • LLO listeriolysin
  • ClyA cytolysin A
  • the expression vector may further include a polynucleotide encoding listerolysin O (LLO), a toxin protein.
  • LLO listerolysin O
  • the listerolysin O may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, and the Hly gene may include the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 29. It is not limited to this.
  • it relates to a host cell transformed with the above-described expression vector.
  • the host cell includes granzyme B or a fragment thereof; and tumor antigens, such as immune checkpoint proteins, may be genetically engineered to express interfering RNA (RNAi) with specific inhibitory activity.
  • RNAi interfering RNA
  • the host cells may be genetically engineered to express miR-138 and miR-153.
  • the host cell may be genetically engineered to additionally express listeolysin O (LLO).
  • LLO listeolysin O
  • the host cell is preferably an immunostimulatory bacterial strain.
  • the immunostimulatory bacteria in the present invention may be any suitable species.
  • Salmonella, Listeria, Rickettsia, Klebsiella, Bordetella, Neisseria, Aeromonas , Francisella, Corynebacterium, Citrobacter, Chlamydia, Haemophilus, Brucella, Mycobacterium, Coplasma It may include strains of Mycoplasma, Legionella, Rhodococcus, Pseudomonas, Helicobacter, Vibrio, Bacillus, or Erysipelothrix. It is not limited to this.
  • Salmonella typhimurium Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Salmonella infantis, Salmonella paratyphi, and Salmonella typhi.
  • Listeria Monocytogenes Ricketsia Ricketsiae Chi), Ricketsia Mooseri, Ricketsia Sibirica ), Bordetella bronchiseptica, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Aeromonas eucrenophila, Aeromonas salmoni Aeromonas salmonicida, Francisella tularensis, Corynebacterium pseudotuberculosis, Citrobacter freundii, Chlamydia pneumoniae, Haemophilus somnus, Brucella abortus, Mycobacterium intracellulare, Legionella pneumophila, Rhodococcus equi, Pseudomonas aerugi P
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing, improving or treating cancer comprising a genetically engineered host cell, preferably a bacterial strain, as an active ingredient.
  • the present invention relates to a method for preventing, improving, or treating cancer, including the step of administering the pharmaceutical composition provided by the present invention to a subject.
  • hsa-mir138 which suppresses the expression of PD-L1
  • hsa-mir153 which regulates the expression of IDO
  • Oligonucleic acids were synthesized so that they were positioned sequentially.
  • the oligonucleotide was inserted between the EcoRI and .
  • the obtained plasmid was cut with HindIII/ Through this, it was confirmed that hsa-mir138 and hsa-mir153 were successfully cloned into the vector and a recombinant plasmid was obtained.
  • Hly gene SEQ ID NO: 29
  • Antisense primer 5'-TTCGAAGCTTATATTATATGGATAAACAGTC-3' with a recognition site was purchased from IDT.
  • the bacterial plasmid Pt7RNAi-Hly-Inv(TRIP) was used as a genetic template for amplification of the Hly gene (Xiang, S., Fruehauf, J., & Li, C. J. (2006). Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals.
  • the plasmid and the amplified Hly gene were treated with restriction enzymes XmaI and BstBI.
  • the pcDNA3-miR-PDL1-IDO-Hly plasmid was created by ligation of each gene segment (see cleavage map in Figure 2).
  • the plasmid thus obtained was digested with XmaI/BstBI restriction enzymes, and the obtained fragment was subjected to electrophoresis on a 0.9% agarose gel. As a result, as shown in Figure 6, a band corresponding to 2016bp, the size of the Hly gene, was obtained. Confirmed. Through this, it was confirmed that the Hly gene was successfully inserted and cloned into the vector.
  • the vector was designed and constructed using the method below.
  • a human Granzyme B cDNA ORF clone sold by Sinbiological was purchased and used.
  • the GZMB gene amplified through PCR was inserted into the KpnI and BamHI restriction enzyme sites of pcDNA3.
  • the plasmid thus obtained was digested with KpnI/BstBI restriction enzymes, and the obtained fragment was subjected to electrophoresis on a 0.9% agarose gel.
  • the size of the GZMB gene containing the Flag tag was 798bp. A band corresponding to was confirmed. Through this, it was confirmed that the GZMB gene was successfully cloned into the vector.
  • hsa-mir138 and hsa-mir153 containing introns into the constructed pcDNA3-GrB vector gene amplification was performed using the pcDNA-miR-Pdl1-IDO-Hly vector constructed in Example 2 as a template.
  • the sense primers to be used at this time include the 3' end of the first exon of GZMB (CDS of exon 1; SEQ ID NO: 3), the intron 1 gene base sequence (SEQ ID NO: 17), and 5 of hsc-miRNA-138.
  • 'It is 5'-GTAAGAGTCGATCGCTTCCCGGTTCTCACTTCTG-3' containing part, and the antisense primer is a part of the 3' end of hsc-miRNA-153 and the second exon of GZMB consecutively to the intron 2 gene base sequence (SEQ ID NO: 18).
  • PCR reaction conditions were 30 seconds at 98°C, followed by 35 cycles of 5 seconds at 98°C, 10 seconds at 68°C, and 8 seconds at 72°C, followed by extension reaction at 72°C for 5 minutes.
  • the assembly-intron-miRNA gene was amplified using primers for gene assembly. PCR reaction conditions were 98°C for 30 seconds, followed by 35 cycles of 98°C for 5 seconds, 71°C for 30 seconds, and 72°C for 8 seconds, followed by extension reaction at 72°C for 5 minutes. .
  • the sense primer used at this time was 5'-GGGAGATCATCGGGGGGACATG-3', which is the 5' end of GZMB exon 5, and the antisense primer had the base sequence of 5'-CTGCATCTGCCCTGGGCAGCA-3', which is the base sequence of the 3' end of GZMB exon 1.
  • 0.2 ng of Pcmv-GZMB as a template, 0.2 pmole of sense and antisense primers, and Phusion DNA polymerase (Invitrogen, USA) were mixed and amplified using the method recommended by the manufacturer. PCR reaction conditions were 98°C for 30 seconds, followed by 35 cycles of 98°C for 5 seconds, 63°C for 30 seconds, and 72°C for 118 seconds, followed by extension reaction at 72°C for 5 minutes. .
  • the method developed by Daniel G Gibson was used to construct the amplified assembly-intron-miRNA and assembly-GZMB vector into one vector (Cgibson, D. G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods 6, 343-345 (2009). Approximately 100 ng of the 7918bp assembly-GZMB vector and 15 ng of assembly-intron-miRNA were used in one reaction, and the NEBuilder HiFi DNA Assembly kit provided by New England BioLabs was produced according to the method recommended by the manufacturer. The two gene fragments were reacted at 50°C for 30 minutes.
  • DTS DNA nuclear targeting sequence
  • SEQ ID NO: 27 The sense primer used in PCR was 5'-AGGCGTTTTGCGCTGCTTCG-3', the antisense primer was 5'-TATATCTGGCCCGTACATCGGGAAAGTC-3', and PCR was performed using Phusion DNA polymerase (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's method. PCR reaction conditions were 30 seconds at 98°C, followed by 35 cycles of 5 seconds at 98°C, 10 seconds at 68°C, and 2 seconds at 72°C, followed by extension reaction at 72°C for 5 minutes. .
  • the vector constructed in Examples 2 and 4 was treated with NruI restriction enzyme at 37°C for 30 minutes to obtain a linear vector.
  • the amplified DTS gene fragment and linear vector were produced using the NEBuilder HiFi DNA Assembly kit provided by New England BioLabs according to the method recommended by the manufacturer. The two gene fragments were reacted at 50°C for 30 minutes.
  • the VNP20009 strain cultured on agar medium was washed with 1 ml of cold 10mM HEPES, It was centrifuged at a speed of 3000 rpm. After removing the supernatant, the centrifuged bacterial cells were washed again with 1ml of 10mM HEPES and placed on ice for 10 minutes. The washing process was performed a total of three times, and the remaining centrifuged bacterial cells were mixed with 100ng of the vector to be transformed (the vector of Examples 1, 2, 3, 4, or 5) in 40 ⁇ l of cold 10% glycerol. It was then placed on ice for 15 minutes.
  • DMEM Dulbeccos Modified Eagles Media
  • Panc1 pancreatic cancer cells were infected with the recombinant Salmonella strain of Example 6 transformed with each vector. Specifically, tumor cells cultured in a 12-well culture plate were infected with 1 ml of DMEM adjusted to the desired cell:recombinant Salmonella ratio for 2 hours, and then infiltrated into the tumor cells with DMEM containing 200 ⁇ l/ml of gentamicin. Salmonella strains that could not be removed were removed for 1 hour.
  • Tumor cells infected with recombinant Salmonella were cultured in fresh DMEM medium for 48 hours, then lysed with RIPA hemolysis buffer on ice for 30 minutes, centrifuged, and only the supernatant was collected and mixed with an equal volume of 2X SDS sample. 20ug of protein was quantified using the SDS-PAGE method described above, and the proteins were separated on an SDS-PAGE gel at 100 V for 1 hour according to their molecular weight, and then transferred to a nitrocellulose membrane at 100 V for 50 minutes.
  • the primary antibody to confirm the expression of PD-L1 protein was the PD-L1 rabbit monoclonal antibody (R&D systems), and the primary antibody to confirm the expression of the IDO protein was the IDO rabbit monoclonal antibody (Cell Signaling).
  • a GAPDH mouse monoclonal antibody (Abcam) was used as a control.
  • HRP-conjugated mouse anti-rabbit polyclonal antibody and rabbit anti-mouse polyclonal antibody were used as secondary antibodies.
  • PD-L1 in each tumor cell infected by the Salmonella strain transformed with the pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector (Example 4) of the present invention. It was confirmed that the expression level of IDO was significantly reduced compared to the control group.
  • the DNA nuclear targeting sequence (DTS) was cloned into the vector (pcDNA3- of Example 5) along with the sequences encoding GZMB (first exon and second exon) and hsc-miRNA-138 and hsc-miRNA-138. It was confirmed that the expression levels of PD-L1 and IDO were further reduced in tumor cells infected with Salmonella strains transformed with (DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector).
  • colon cancer cells, liver cancer cells, breast cancer cells, and pancreatic cancer cells were all transformed with the pcDNA3-DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector (Example 5) of the present invention.
  • the expression levels of PD-L1 and IDO were significantly reduced compared to the untreated negative control or wild-type Salmonella strain.
  • Salmonella strains transformed with each vector prepared in Example 6 were treated with colon cancer cells SW480 cultured on poly-L-lysine coverslips, and 48 hours later, the cells were treated by immunocytochemistry. Specifically, SW480 cells were fixed with 4% paraformaldehyde, and lipids from the cell membrane were removed with 0.5% Triton X-100 and 0.5% saponin. Cells were blocked with 5% normal donkey serum and incubated with rabbit anti-FLAG antibody (Proteintech) at 4°C for 1 day. Afterwards, the donkey anti-rabbit Alexa 488 antibody (Invitrogen) was used to detect FLAG antibody.
  • the cells were treated with mouse anti-alpha-tubulin monoclonal antibody and donkey anti-mouse Alexa 594 (Invitrogen) as a secondary antibody.
  • mouse anti-alpha-tubulin monoclonal antibody and donkey anti-mouse Alexa 594 Invitrogen
  • the coverslip and slide were adhered to prevent air from entering using a mounting solution containing 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Images of fluorescently stained cells were acquired using a Zeiss Axioimager M1 epifluorescence microscope, and are shown in Figure 20.
  • hsa-mir-138 and hsa-mir-153 along with the intron were not inserted between the two exon fragments of GZMB, but rather the CDS of GZMB (sequential sequences of SEQ ID NOs: 3 and 10) into the pcDNA3 vector.
  • a pcDNA3-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector in which hsa-mir-138 (SEQ ID NO: 22) and hsa-mir-153 (SEQ ID NO: 26) were sequentially cloned was constructed and the experiment was performed in the same manner.
  • granzyme B was present at the highest level in colon cancer cells infected with the Salmonella strain transformed with the pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector (Example 4) of the present invention. Expression was confirmed, and pcDNA3-GrB_FLAG-, in which the CDS of GZMB and hsa-mir-138 and hsa-mir-153 were linked sequentially, allowed the expression of granzyme B, miR-138, and miR-153 without splicing. It was confirmed that the expression level of granzyme B was higher than when the Salmonella strain transformed with the miRNA-Pdl1-IDO-Hly vector was treated (GPI).
  • the present invention relates to a recombinant nucleic acid construct useful for cancer treatment, a gene expression system comprising the same, and a bacterial strain transformed with the expression system.

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Abstract

본 발명은 암 치료에 유용한 재조합 핵산 작제물과 이를 포함하는 유전자 발현 시스템에 관한 것이다.

Description

암 세포 특이적 유전자 발현 시스템
본 발명은 암 치료에 유용한 재조합 핵산 작제물과 이를 포함하는 유전자 발현 시스템에 관한 것이다.
여러가지 질병 중에서 국내외에서 가장 높은 사망률을 보이는 암을 치료하기 위해서 지금까지 다양한 치료법이 개발되어 왔다. 하지만 전통적인 저분자 항암제를 사용한 치료는 암 세포와 정상 세포를 구분하지 않고 약효를 나타내는 비 특이성과 항암 치료에 대한 내성이 증대된 암 세포의 출현을 야기하거나 지나친 세포 독성에 따른 심각한 부작용 등을 유발한다.
하지만, 항암제 개발 기술의 진보로 인해 과거에 비해서 종양에 대한 특이성이 크게 증대되어 그 치료 효과가 높아졌다. 그럼에도 불구하고 여전히 개선된 항암 치료제는 문제점이 나타나고 있는데, 예를 들어 VEGF-A에 결합하는 단일 항체인 Bevacizumab와 EGF receptor에 결합하는 단일 항체인 Cetuzimab는 대장암, 폐암, 뇌종양 등의 치료에 사용됐으나, 표적 단백질의 잦은 변이에 의해 그 특이성이 떨어지는 문제가 있다. 또한, 최근 들어 주목받는 Pembrolizumab, Ipilimumab, Nivolumab 같은 면역 관문 저해제를 이용하는 면역 항암치료는 T 세포의 활성이 극히 낮은 cold tumor 환자에게는 그 효과가 매우 제한적이다. 따라서, 이들 치료제의 문제점을 해결할 새로운 개념의 치료제에 대한 필요성이 의료현장에서 요구되고 있다. 최근 들어 종양에서 발견되는 표적 단백질 변이에 관련한 문제를 극복하기 위해서 유전자 수준의 표적치료가 개발되고 있으며, 특히 miRNA와 질병의 상관관계가 주목받고 있다.
마이크로RNA (miRNA)는 대략 19-25 뉴클레오타이드 길이의 작은 단편의 RNA로써, 자체적으로 유전적인 정보를 보유하지는 않지만, 다양한 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려졌다. miRNA는 세포 주기, 분화, 증식, 사멸, 스트레스 저항성, 대사, 면역반응 등 다양한 생물학적 과정에 관여함으로써 특정 유전자의 최종적인 기능을 조절하는데, miRNA에 의해 유도되는 유전자 발현은 miRNA-induced silencing complex (miRISC)가 표적 mRNA의 3'-untranslated regions (UTR)에 결합해서 mRNA 절단(cleavage) 또는 번역(translation)을 저해하는 방법으로 최종적인 유전자 발현을 조절하게 된다. 이러한 방법으로 miRNA는 인간 유전자의 대략 30%의 발현을 조절하는 것으로 밝혀졌는데, 이중 절반 가량이 종양을 유발하는데 관여가 되며, 종양 세포 내에서 miRNA의 발현이 축소되면 종양으로 발전하는데 기여하는 것으로 여겨진다.
한편, 살모넬라, 리스테리아를 비롯한 몇몇 병원성 미생물에 감염되면 질병을 유발하지만, 다수의 연구에 의하면 약독화된 이들 미생물들은 실험용 쥐에 투여할 경우에 종양을 공격해 그 성장을 저해하고 종양이 있는 실험용 쥐의 생존 기간이 늘어나는 것이 관찰되었다. 특히 전임상 실험을 통해 살모넬라를 이용하는 종양에 대한 치료의 가능성이 제시된 이래로 살모넬라를 이용하는 종양 치료에 대한 연구가 활발하게 이루어졌다. 살모넬라는 종양 조직에 군집을 형성해 직접적으로 종양 세포를 죽이거나, 또는 종양 주변의 면역 미세환경을 변화시켜 환자의 면역세포가 종양을 인식하고, 나아가 종양 세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려졌다. 그럼에도 불구하고 임상시험에서는 살모넬라에 의한 항암 효과에 대해서 논란이 있었는데, 이러한 이유로 인해서 살모넬라 단독으로 종양을 치료하는 방식에서 치료 약물을 탑재해 전달하는 것으로 접근법이 발전하게 되었다.
본 발명의 일 목적은 전사 후 변형에 의해 암 치료에 사용될 수 있는 재조합 핵산 작제물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 암 세포를 표적으로 하는 복수 개의 miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 작제물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 재조합 핵산 작제물을 포함하는 발현 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 숙주 세포를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 5'에서 3'으로, 그랜자임 B(granzyme B; GZMB) 유전자의 제1 엑손; 제1 인트론; 제2 인트론; 및 그랜자임 B(granzyme B; GZMB) 유전자의 제2 엑손을 포함하고, 상기 제1 인트론과 상기 제2 인트론 사이에 적어도 하나의 간섭 RNA(interfering RNAs, RNAi)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 핵산 작제물(construct)에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "핵산 작제물"은 RNA를 전사하도록 설계된 임의의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에서 상기 "그랜자임 B(granzyme B; GZMB)"는 자연살해세포(NK 세포) 및 세포독성 T 세포의 과립에서 가장 흔히 발견되는 세린 프로테아제 그랜자임 중 하나로, 표적 세포에서 세포 사멸을 매개하기 위해 기공 형성 단백질 퍼포린과 함께 이들 세포에 의해 분비된다. 인간 GrB 유전자(GZMB)는 염색체 14q11.2의 '키마제 유전자좌'에 매핑되었다. 상기 유전자좌에는 그랜자임 H 유전자(GZMH), 카텝신 G 유전자(CTSG), 비만 세포 키마제 유전자(CMA1)의 세 가지 기능적 유전자가 포함되어 있다. GZMB 유전자는 클러스터의 5' 말단에 위치하며 GZMH, CTSG 및 CMA1 유전자가 뒤따른다. GZMB 유전자는 길이가 약 3.2kb이고 5개의 엑손과 4개의 인트론으로 구성된다. GrB 프리프로단백질의 리더(신호) 서열은 엑손 1에 의해 암호화되고, 촉매 트라이어드, 즉 His57, Asp102 및 Ser195를 형성하는 아미노산 잔기는 각각 엑손 2, 3 및 5 내에 암호화된다.
본 발명에서 상기 "엑손(exon)"은 핵산으로부터 발현된 전사체(예를 들어, 관심 단백질)의 하나 이상의 아미노산을 암호화하는 핵산 서열(들), 예를 들어 오픈 리딩 프레임 내에 있는 것을 지칭한다. 엑손 서열은 DNA에서 RNA로 전사될 수 있고(즉, pre-mRNA에 존재할 수 있음), 또한 폴리펩티도로 번역되는 성숙한 mRNA(즉, (예를 들어, 스플라이싱 후) RNA의 처리된 형태)에 존재할 수 있다.
본 발명에서 상기 "인트론"은 핵산으로부터 발현된 폴리펩티드 전사체(예를 들어, 관심 단백질)의 하나 이상의 아미노산을 비암호화하는 핵산 서열(들), 예를 들어 오픈 리딩 프레임 내에 있는 것을 지칭한다. 인트론 서열은 DNA에서 RNA로 전사될 수 있지만(즉, pre-mRNA에 존재할 수 있음), 예를 들어 스플라이싱을 통해 성숙 mRNA로부터 단백질이 발현되기 전에 제거될 수 있다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)는 인간 유래의 것일 수 있고, 예컨대 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)는 인간 유래의 것일 수 있고, 예컨대 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1은 서열번호 3으로 표시되는 코딩 서열(conding sequence)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1은 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1은 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 2는 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 2는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 3은 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 3은 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 4는 서열번호 7로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 4는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 5는 서열번호 8로 표시되는 코딩 서열(coding sequence)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 5는 서열번호 9로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 9로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 5는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자의 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자에 포함되는 5개의 엑손 또는 그 단편들 중에서 선택되는 적어도 하나, 즉, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5 또는 이들의 단편 중에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자의 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자에 포함되는 5개의 엑손 또는 그 단편들 중에서 선택되는 적어도 하나, 즉, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5 또는 이들의 단편 중에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명에서 상기 제1 엑손 및 상기 제2 엑손은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는 상기 제1 엑손과 상기 제2 엑손은 서로 상이한 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자에 포함되는 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5 또는 이들의 단편 중에서 선택된 적어도 하나이고, 상기 제2 엑손은 나머지 엑손 또는 그 단편 중에서 선택된 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편을 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편을 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4와, 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편과, 엑손 2를 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 3 및 엑손 4와, 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편과, 엑손 2 및 3을 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 4와 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편과, 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4를 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제2 엑손은 서열번호 10으로 표시되는 염기 서열(서열번호 5 내지 8의 서열이 5'->3' 방향으로 순차 연결된 것)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제2 엑손은 서열번호 11로 표시되는 염기 서열(서열번호 5 내지 7 및 9의 서열이 5'->3' 방향으로 순차 연결된 것)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 제1 인트론 및 제2 인트론은 스플라이스 부위를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 "스플라이스 부위"란, 절단되기에 적합한 진핵생물 세포의 스플라이스 기구에 의해 인식되고/되거나 상응하는 스플라이스 부위에 연결될 수 있는 특정한 핵산 서열을 지칭한다. 스플라이스 부위는 pre-mRNA 전사물 중에 존재하는 인트론의 절제를 허용한다. 전형적으로 상기 스플라이스 부위의 5' 부분은 스플라이스 공여 부위라 지칭되고, 3' 상응하는 스플라이스 부위는 스플라이스 수용 부위라 지칭된다. 스플라이스 부위란 용어는 예를 들어 천연 스플라이스 부위, 조작된 스플라이스 부위, 예를 들어 합성 스플라이스 부위, 표준 또는 컨센서스 스플라이스 부위, 및/또는 비-표준 스플라이스 부위, 예를 들어 잠재(cryptic) 스플라이스 부위를 포함한다.
본 발명에서 상기 제1 인트론 또는 그 단편은 스플라이스 공여 부위를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 제2 인트론 또는 그 단편은 스플라이스 수용 부위를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 인트론은 동물, 예컨대 포유 동물 (예컨대, 인간)으로부터 유래하는 유전자에서 분리된 인트론일 수 있고, 해당 영역의 전사 후 스플라이싱(splicing)에 의해 제거될 수 있다면, 그 종류를 특별히 제한하지 않는다.
본 발명에서 상기 인트론은 스플라이싱 공여 부위와 수용 부위, 3배수 구아닌 모티프, 및/또는 분기점 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 인트론은 서열번호 17로 표시되는 염기 서열의 스플라이스 공여 부위를 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 17로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제2 인트론은 서열번호 18로 표시되는 염기 서열의 스플라이스 수용 부위를 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 핵산 작제물은 상기 제1 인트론과 상기 제2 인트론 사이에 종양 항원, 예컨대 면역관문 단백질(immune checkpoint) 특이적 억제 활성을 갖는 간섭 RNA(interfering RNAs, RNAi)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "면역관문 단백질(immune checkpoint)"은 면역계에는 과도한 면역반응을 억제시키는 단백질로, 암 세포가 면역체계의 공격을 피하는데 이용하는 면역 세포의 표면 단백질이다. 본 발명에서 상기 면역관문 단백질의 예로는 PD-1, PD-L1, PD-L2, IDO, 2B4 (CD244), 4-1BB, A2Ar, B7.1, B7.2, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, BTLA, 부티로필린, CD160, CD48, CTLA4, GITR, gp49B, HHLA2, HVEM, ICOS, ILT-2, ILT-4, KIR 패밀리 수용체, LAG-3, OX-40, PIR-B, SIRPalpha (CD47), TFM-4, TIGIT, TIM-1, TIM-3, TIM-4 또는 VISTA 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "간섭 RNA(interfering RNAs, RNAi)"는 표적 유전자와 상동성인 서열을 가진 shRNA, siRNA, 또는 마이크로RNA일 수 있고, 바람직하게는 마이크로RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "miR" 또는"마이크로RNA(microRNA; miRNA)"는 18-25 뉴클레오티드(nucleotide, nt)로 구성된 작은 비-암호화 RNA로서, 표적 유전자의 3'-비번역 부위(untranslated region, UTR)에 결합하여 유전자 발현을 조절하고(Bartel DP, et al., Cell 116: 281-297, 2004; Lewis BP, et al., Cell 120: 15-20, 2005), 인트론(intron), 엑손(exon) 또는 유전자 간 부위(intergenic region)로부터 공정된다(Rodriguez A, et al., Genome Res14: 1902-1910, 2004). 첫째로, miRNA는 수천 개의 뉴클레오티드를 포함하는 초기 miRNA(pri-miRNA) 분자 내로 RNA 폴리머라아제에 의해 전사된다. 그런 다음, pri-miRNA는 miRNA 전구체로 알려진 대략 70 nt 줄기 고리 중간체를 형성하기 위해 마이크로프로세서[DroshaRNase 엔도뉴클레아제 및 디조지증후군 부위 유전자 8 단백질(DroshaRNase endonuclease and DiGeorge syndrome region gene 8 protein, DGCR8)]에 의해 연속적으로 공정된다(Lee Y, et al., EMBO J21: 4663-4670, 2000; Zeng Y, et al., Proc Natl Acad Sci U S A100: 9779-9784, 2003). 그런 다음, pre-miRNA는 엑소폴틴-5(Exportin-5, EXP5)와 공동인자 Ran-GTP를 통해 핵으로부터 세포질로 이동되고, 여기서 pre-miRNA는 Rnase 엔도뉴클레아제 다이서에 의해 18-25 nt 성숙 miRNA 듀플렉스(duplexe)로 공정된다(Lee Y, et al., EMBO J23: 4051-4060, 2004; Shenouda SK, et al., Cancer Metastasis Rev28: 369-378, 2009). 성숙 miRNA 듀플렉스는 RNA-유도 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC) 내로 아르고노트(Argonaute) 단백질과 단일 가닥 RNA로서 통합되고, 이는 표적 Mrna의 절단 또는 번역 억제 중 어느 하나를 유도한다(Diederichs S, et al., Cell131: 1097-1108, 2007; Hammond SM, et al., Nature404: 293-296, 2000; Martinez et al., Cell 110: 563-574, 2002).
본 발명에서 상기 miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 성숙한 형태의 이들 miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 상기 miRNA 모방체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다. 여기서, 상기 miRNA 모방체는 miRNA 전구체(miRNA precursor), 초기 전사체 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 miRNA는 암의 예방, 개선 또는 치료 활성을 갖는 miRNA라면 제한없이 포함될 수 있으나, 예를 들면, 면역관문 단백질(immune checkpoint) 중 인간 PD-L1(Programed Cell Death-Ligand-1) 또는 인간 IDO(indoleamine dioxygenase)을 암호화하는 유전자의 억제 활성이 있는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 miRNA는 miR-138일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 miRNA는 miR-153일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 miRNA는 miR-138 및 miR-153일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 성숙한 서열은 인간(homo sapiens) 유래의 hsa-miR-138로, 서열번호 19로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 hsa-miR-138-5p일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 성숙한 서열을 암호화하는 서열은 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 전구체(pre-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 21로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 21로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 초기 전사체(pri-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 22로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 성숙한 서열은 인간(homo sapiens) 유래의 hsa-miR-153로, 서열번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 hsa-miR-153-5p일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 성숙한 서열을 암호화하는 서열은 서열번호 24로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 24로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 전구체(pre-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 25로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 25로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 초기 전사체(pri-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 제1 인트론과 제2 인트론 사이에 2개 이상의 간섭 RNA가 포함되는 경우 이들의 결합 순서는 특별히 제한하지 않는다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 인트론과 제2 인트론 사이에 miR-138을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 miR-153을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 경우, 이들의 결합 순서는 특별히 제한하지 않으며, 5'에서 3'의 순으로 miR-138(또는 이의 모방체) 암호화하는 서열-miR-153(또는 이의 모방체) 암호화하는 서열의 순으로 연결될 수 있고, 혹은 miR-153(또는 이의 모방체) 암호화하는 서열-miR-138(또는 이의 모방체) 암호화하는 서열의 순으로 연결될 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 인트론과 제2 인트론 사이에 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 24로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 인트론과 제2 인트론 사이에 서열번호 21로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 25로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 인트론과 제2 인트론 사이에 서열번호 22로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 재조합 핵산 작제물의 전사 후 얻어진 mRNA는 스플라이싱(splicing) 과정에 의해 제1 인트론 내지 제2 인트론 부위가 제거되고 제1 엑손 및 제2 엑손의 mRNA가 서로 결합하여 이후 번역을 통해 얻어지는 폴리펩타이드는 암 세포 사멸 활성을 낼 수 있다. 또한, 상기 스플라이싱 과정에서 분리된 miRNA 혹은 이의 모방체(예, pri-miRNA 또는 pre-miRNA)는 필요에 따라 추가적인 공정을 거친 뒤 암 세포를 표적으로 하여 암 세포의 성장을 억제하거나, 암 세포의 사멸을 유도하는 등으로 치료 활성을 낼 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, miR-138 및 miR-153 각각을 암호화는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 작제물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 miR-138 또는 miR-153을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 성숙한 형태의 이들 miRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 상기 miRNA 모방체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수도 있다. 여기서, 상기 miRNA 모방체는 miRNA 전구체(miRNA precursor), 초기 전사체 miRNA (pri-miRNA) 또는 플라스미드 (plasmid) 형태의 miRNA 전구체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 miR-138의 성숙한 서열은 인간(homo sapiens) 유래의 hsa-miR-138로, 서열번호 19로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 hsa-miR-138-5p일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 성숙한 서열을 암호화하는 서열은 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 전구체(pre-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 21로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 21로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 초기 전사체(pri-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 22로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 성숙한 서열은 인간(homo sapiens) 유래의 hsa-miR-153로, 서열번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 hsa-miR-153-5p일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 성숙한 서열을 암호화하는 서열은 서열번호 24로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 24로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 전구체(pre-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 25로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 25로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 초기 전사체(pri-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 핵산 작제물은 하나의 작제물에 miR-138 또는 이의 모방체를 암호화하는 서열과 miR-153 또는 이의 모방체를 암호화하는 서열을 동시에 포함하는 것일 수 있으나, miR-138 또는 이의 모방체를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 miR-153 또는 이의 모방체를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 별개로 포함하는 것 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 하나의 작제물에 miR-138 또는 이의 모방체를 암호화하는 서열과 miR-153 또는 이의 모방체를 암호화하는 서열이 동시에 포함되는 경우, 두 유전자의 연결 순서는 특별히 제한하지 않으며, 5'에서 3'의 순으로 miR-138(또는 이의 모방체) 암호화 서열-miR-153(또는 이의 모방체) 암호화 서열의 순으로 연결될 수 있고, 혹은 miR-153(또는 이의 모방체) 암호화 서열-miR-138(또는 이의 모방체) 암호화 서열의 순으로 연결될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 재조합 핵산 작제물을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 재조합 핵산 작제물을 적절한 숙주 세포 내로 도입하기 위하여 상기한 작제물이 벡터 내에 클로닝(cloning)될 수 있도록 삽입될 수 있다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 적당한 숙주 세포에 도입되어 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 발현 시스템을 말한다.
본 발명에서 상기 재조합 핵산 작제물을 삽입하기 위한 벡터로는 염색체, 에피솜 및 유도된 바이러스와 같은 수많은 발현 시스템이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 사용할 수 있는 재조합 발현 벡터로는 세균성 플라스미드, 트랜스포숀, 효모 에피솜, 삽입 인자, 효모 염색체 인자, 바큘로바이러스와 같은 바이러스, SV40과 같은 유두종바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 레트로바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 로부터 유래한 것이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 재조합 발현 벡터는 또한 코스미드 또는 파지미드 유도체일 수 있다.
예시적인 측면에서, 벡터의 한 유형은 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 그 내부에 라이게이션(ligation) 될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션 될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터가 본 명세에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단히, "재조합 벡터")로서 지칭된다.
본 발명에서 상기 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 목적하는 핵산 분자의 발현 조절 부위(예: 프로모터, 시그널 서열, 라이보좀 결합부위, 전사 종결서열, 전사조절인자 결합 위치 등)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절한다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 편입된다.
본 발명의 일 예시로, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: Psc101, ColE1, Pbr322, Puc8/9, Phc79, Puc19, Pet 등), 파지 (예: λgt4Λb, λ-Charon, λ△z1, Λgem.TM.-11 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 재조합 핵산 작제물은 바이러스 발현 시스템(백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로 바이러스 또는 아데노바이러스)을 이용하여 숙주 세포로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터에는 HIV, SIV, 설치류 레트로 바이러스(murine retroviruses), 기본 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus), AAVs(adeno-associate viruses) 및 아데노바이러스(adenoviruses) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(Miller et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10:4239; J. Kolberg 1992, NIH Res. 4:43; Cornetta et al., 1991, Hum. Gene Ther. 2:215). 설치류 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MuLV), 기본 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus, GaLV), 에코트로픽 레트로바이러스(ecotropic retroviruses), SIV(simian immunodeficiency virus), HIV(human immunodeficiency virus) 등에서 유래된 레트로 바이러스 벡터들이 널리 사용되고 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 재조합 핵산 작제물이 DNA인 경우에는 이른바 'naked DNA' 방법을 활용하거나 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터를 활용할 수 있으며, 원핵세포 또는 진핵세포를 대상으로 하는 벡터로서 핵산이 발현 가능한 형태로 포함될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 발현 표적 서열로서 상기 재조합 핵산 작제물의 핵산 서열 이외에, 이를 발현하기 위한 기능적 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 기능적 서열로는 전사를 진행할 수 있는 하나 이상의 프로모터(promoter), 하나 이상의 인트론, 하나 이상의 전사 종결 영역, 하나 이상의 개시 코돈, 하나 이상의 종결 또는 정지 코돈이 포함될 수 있다. 본 발명에서 숙주 세포로 원핵 세포를 사용하는 경우라면, 벡터는 펩타이드로의 번역을 개시하기 위하여 리보솜 결합 부위(RBC) 및/또는 전사/번역 종결 서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 프로테아제 또는 펩티다아제 절단 부위를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 하나 이상의 리더 서열을 포함할 수도 있다. 여기서 각각의 리더 서열은 신호 펩타이드를 암호화한다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 하나 이상의 링커 또는 태그 서열이 포함할 수 있다. 여기서 상기 태그 서열은 헤마글루티닌(HA) 태그를 암호화할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로모터로 구조 프로모터 또는 유도 프로모터는 통상의 기술자에 의해 확인될 수 있는 특정한 상황의 필요에 따라 본 발명에 사용될 수 있다. 다양한 가능한 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선택된 프로모터는 제한 효소 인식 서열을 통해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 단리된 프로모터 서열을 선택 벡터 내로 삽입함으로써 본 명세서에 기재된 펩타이드를 암호화하는 시스트론 DNA에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 천연 프로모터 서열 및 다수의 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 그러나, 이종 프로모터는 일반적으로 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터와 비교하여 발현된 표적 유전자의 전사 및 발현 효율을 구현할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 숙주 세포로 원핵 세포를 사용하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등)와, 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J.Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. . 이와 같은 플라스미드 벡터로서는 당업계에서 일반적으로 사용되는 플라스미드, 예를 들어 pSC101, pBR322, pUC19, pET-22 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 숙주 세포로 진핵 세포를 사용하는 경우라면 포유동물 세포에서 유래된 프로모터(메탈로티아닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스에서 유래된 프로모터를 사용할 수 있다. 다시 말하면, 본 발명의 벡터로서 바이러스를 사용하고자 하는 경우, 재조합 핵산 작제물을 발현시키기 위해서 백시니아(vaccinia) 또는 플로폭스(flowpox)와 같이 약독화된 바이러스는 물론이고 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 무독성 탄저병 독소 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 프로모터는 앞서 기술한 종류 외에도, 예를 들어 CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터와 같은 포유동물 바이러스 유래의 프로모터, EF1 알파프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터), 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터) 및 /또는 bacteriophage T7 프로모터가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발현 벡터는 전사 활성을 증가시키기 위하여 인핸서 서열을 더 포함할 수 있다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다. 이때 상기 인핸서로는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴의 인핸서, CMV, SV40, RSV 및 EBV로부터 유래하는 것 등의 바이러스 인핸서일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 발현 벡터에는 상기 재조합 핵산 작제물의 발현 또는 번역 후 분비를 촉진 및/또는 증가시키기 위해 하나 이상의 신호 펩타이드/분비 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 신호 서열 또는 펩타이드는 리더 서열 또는 펩타이드, 또는 국소화 신호 또는 서열로도 알려진 분비 신호로, 분비될 새로 합성된 단백질의 N-말단에 있는 짧은 펩타이드이다. 신호 펩타이드는 일반적으로 세포막으로 단백질을 전위하도록 세포를 촉진한다. 단백질 분비의 효율성은 신호 펩타이드에 의해 강하게 결정된다. 따라서, 본원의 면역자극성 박테리아는 인코딩된 치료제(들)의 발현 또는 분비를 촉진 및/또는 증가시키기 위해 신호 펩타이드/분비 신호 펩타이드를 포함할 수 있는 플라스미드를 함유한다. 본 발명에서 상기 신호 서열에는 Hly 신호서열, ActA 신호 서열, PhoA 신호서열, OmpA 신호서열, α-아밀라아제 신호서열, LLO 신호 서열, 서브틸리신 신호서열, MF-α 신호서열, SUC2 신호서열, 인슐린 신호서열, a-인터페론 신호서열, 항체 분자 신호서열 등을 이용할 수 있으나, 임의의 다른 공지된 신호 서열일 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 하기 위하여, 전사 종결 서열을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 전사 종결 서열로는 폴리아데닐화 서열(예: 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 발현 벡터가 복제 가능한 발현 벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 DNA 핵 표적화 서열(nuclear targeting sequence, DTS)을 포함할 수 있다. SV40 DTS와 같은 DNA 핵 표적화 서열(DTS)은 핵공 복합체를 통한 DNA 서열의 전위를 매개한다. 이 수송의 기전은 핵 국소화 서열을 포함하는 DNA 결합 단백질의 결합에 의존하는 것으로 보고된다. 핵 수송 및 발현을 증가시키기 위해 발현 벡터를 포함시키는 것이 입증되었으며(예를 들어, Dean, D.A. 등 (1999) Exp. Cell Res. 253(2):713-722 참조), 에스. 티피무리움에 의해 전달된 플라스미드로부터 유전자 발현을 증가시키기 위해 사용되었다(예를 들어, Kong 등 (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109(47):19414-19419 참조).
본 발명의 일 예시로, 상기 DNA 핵 표적화 서열은 서열번호 27로 표시되는 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 발현되는 펩타이드의 정제를 용이하기 위해서 선별 마커(selection marker)를 더 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커가 사용될 수 있다. 상기 마커로는 예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6 x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발현 벡터에 클로닝된 서열을 증폭시키는 여러 가지 시험관내 증폭 기법들(in vitro amplification techniques)이 알려져 있다. 이러한 기법에는 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction), Qβ-복제효소 증폭(replicase amplification) 및 다른 RNA 중합효소를 이용한 기법들이 있다.
본 발명에서는 숙주 세포로 박테리아 균주를 사용할 수 있고, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 박테리아 균주를 암의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 발현 벡터는 암 세포의 사멸을 직간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 독소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 독소 단백질은 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-alpha(Tumour necrosis factor-alpha; TNF-alpha), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL), 스트렙토리신O(streptolysin O; SLO), 폐렴구균용혈소(pneumolysin; PLO), 리스테리오리신(listeriolysin; LLO) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 발현 벡터는 독소 단백질인 리스테로리신 O(LLO)를 암호화는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "리스테리오라이신 O(listeriolysin O, LLO)" 리스테리아증을 일으키는 병원균인 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)라는 세균에 의해 생성되는 용혈소이다. 리스테리오라이신 O(LLO)는 파고솜을 용해하고 파괴한 후 세균은 세포질로 빠져나가 세포 안에서 성장할 수 있다. 파고솜에서 탈출한 이후 독소는 세포질에서는 거의 활성을 가지지 않는다. 상기 리스테리오라이신 O(LLO)는 LIPI-1이라는 병원성 섬의 일부인 Hly 유전자에 의해 암호화된다.
본 발명의 일 예시로, 상기 리스테로리신 O(LLO)는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 Hly 유전자는 서열번호 29로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발현 벡터가 독소 단백질을 암호화는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 경우, 하나의 벡터에 상기 재조합 핵산 작제물과 상기 독소 단백질을 암호화는 폴리뉴클레오티드가 모두 삽입된 경우뿐만 아니라, 상기 재조합 핵산 작제물을 포함하는 벡터와 상기 독소 단백질을 암호화는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 즉 2종의 벡터를 포함하는 경우도 본 발명의 목적 상 포함된다.
본 발명에서 하나의 벡터에 상기 재조합 핵산 작제물과 상기 독소 단백질을 암호화는 폴리뉴클레오티드가 동시에 포함되는 경우, 이들은 하나의 프로모터에 의해 작동 가능하게 연결될 수 있지만, 혹은 2개 이상의 프로모터에 의해 각각 작동 가능하게 연결될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에서 miR-138 초기 전사체 및 miR-153 초기 전사체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 22 및 26)로 이루어진 재조합 핵산 작제물을 포함하는 플라스미드 시스템의 개열 지도를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시형태에서 상기 재조합 핵산 작제물과 리스테오라이신 O(LLO)를 암호화하는 Hly 유전자 서열(서열번호 29)을 포함하는 플라스미드 시스템의 개열 지도를 도시한 것이다.
본 발명의 일 예시로, 상기 도 1 또는 2에 표시되는 벡터에 추가로 DTS(서열번호 9)가 클로닝될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 3 및 4는 본 발명의 일 실시형태에서 상기 재조합 핵산 작제물과 상기 독소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 시스템의 개열 지도를 도시한 것으로, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 발현 벡터에는 그랜자임 B 유전자의 엑손 1(서열번호 3); 인트론 1(서열번호 17); miR-138 초기 전사체 암호화 서열(서열번호 22); miR-153 초기 전사체 암호화 서열(서열번호 26); 인트론 2(서열번호 18); 그랜자임 B 유전자의 엑손 2 내지 5(서열번호 10)가 클로닝된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 발현 벡터에는 DTS(서열번호 27); 그랜자임 B 유전자의 엑손 1(서열번호 3); 인트론 1(서열번호 17); miR-138 초기 전사체 암호화 서열(서열번호 22); miR-153 초기 전사체 암호화 서열(서열번호 26); 인트론 2(서열번호 18); 그랜자임 B 유전자의 엑손 2 내지 5(서열번호 10)가 클로닝된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 발현 벡터에는 DTS(서열번호 27); 그랜자임 B 유전자의 엑손 1(서열번호 3); 인트론 1(서열번호 17); miR-138 초기 전사체 암호화 서열(서열번호 22); miR-153 초기 전사체 암호화 서열(서열번호 26); 인트론 2(서열번호 18); 그랜자임 B 유전자의 엑손 2 내지 5(서열번호 10)가 작동 가능하게 연결되고, Hly 유전자(서열번호 29)가 추가로 클로닝된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 그랜자임 B(granzyme B) 또는 그 단편; 및 종양 항원, 예컨대 면역관문 단백질(immune checkpoint) 특이적 억제 활성을 갖는 간섭 RNA(RNAi)를 발현하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 그랜자임 B의 단편은 그랜자임 B의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5 또는 이들의 단편 중에서 선택되는 적어도 두 개에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1에 의해 암호화되는 폴리펩타이드는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 2에 의해 암호화되는 폴리펩타이드는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 3에 의해 암호화되는 폴리펩타이드는 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 4에 의해 암호화되는 폴리펩타이드는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 5에 의해 암호화되는 폴리펩타이드는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 면역관문 단백질(immune checkpoint) 특이적 억제 활성을 갖는 간섭 RNA(RNAi)는 인간 PD-L1(Programed Cell Death-Ligand-1) 또는 인간 IDO(indoleamine dioxygenase)을 암호화하는 유전자의 억제 활성이 있는 miRNA로, 바람직하게는 miR-138 및 miR-153 중 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 miR-138 및 miR-153을 발현하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 miR-138의 성숙한 서열은 서열번호 19로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 성숙한 서열은 서열번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 숙주 세포는 리스테오라이신 O(LLO)가 추가로 발현되도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 리스테오라이신 O(LLO)는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 본 발명에서 제공하는 발현 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"는 상기 벡터를 수용, 유지, 재생산 및/또는 증폭하는 데 사용되는 세포이다. 숙주 세포는 또한 벡터에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드를 발현하는데 사용될 수 있다. 벡터에 함유된 핵산은 숙주 세포가 분열할 때 복제되어 핵산을 증폭시킨다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 면역자극성 박테리아 균주인 것이 바람직하다. 여기서 "면역자극성 박테리아"란, 대상체에게 도입될 때 면역특혜 조직 및 세포, 예컨대 종양, 종양 미세환경 및 종양-체류 면역 세포에 축적되고, 면역자극성이거나 면역 자극을 이끌어내는 생성물을 복제 및/또는 발현하는 치료 박테리아이다.
본 발명에서 상기 면역자극성 박테리아는 임의의 적합한 종일 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 살모넬라(Sallmonella), 리스테리아(Listeria), 리케치아(Rickettsia), 클레브시엘라(Klebsiella), 보르데텔라(Bordetella), 네이쎄리아(Neisseria), 애로모나스(Aeromonas), 프란치셀라(Francisella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 시트로박터(Citrobacter), 클라미디아(Chlamydia), 해모필루스(Haemophilus), 브루셀라(Brucella), 미코박테리움(Mycobacterium), 코플라즈마(Mycoplasma), 레지오넬라(Legionella), 로도콕커스(Rhodococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 헬리코박터(Helicobacter), 비브리오(Vibrio), 바실러스(Bacillus) 또는 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix)의 균주를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 인판티스(Salmonella infantis), 파라티푸스 균(Salmonella paratyphi), 장티푸스 균(Salmonella typhi), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 리케치아 리케치애(Rickettsia rickettsiae), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 쯔쯔가무시(Rickettsia tsutsugamuchi), 리케치아 무세리(Rickettsia mooseri), 리케치아 시비리카(Rickettsia sibirica), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 네이쎄리아 고노로애(Neisseria gonorrhoeae), 애로모나스 유크레노필라(Aeromonas eucrenophila), 애로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 프란치셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis), 시트로박터 프룬디이(Citrobacter freundii), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 해모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 미코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 로도콕커스 에퀴(Rhodococcus equi), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 헬리코박터 무스텔래(Helicobacter mustelae), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에리시펠로트릭스 루시오파시애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 로칼리마애 퀸타나(Rochalimaea quintana), 또는 애그로박테리움 투메르파시움(Agrobacterium tumerfacium)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 일 예시로, 상기 박테리아 균주는 바람직하게는 살모넬라(Salmonella) 균주일 수 있고, 보다 바람직하게는, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 인판티스(Salmonella infantis), 파라티푸스 균(Salmonella paratyphi) 또는 장티푸스 균(Salmonella typhi)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나로부터 유래된 것일 수 있다. 나열된 살모넬라(Salmonella) 속 균주들은 그람 음성의 통성 혐기성 간균이다. 유당 분해력이 없고, 인돌을 형성하지 않으며, 황화수소를 생성하지 않아 대장균과는 구별된다. 상기 살모넬라(Salmonella) 속 균주들은 주모(周毛)를 가지고 있어 운동성이 있는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 "살모넬라 티피무리움(살모넬라 티피뮤륨, Salmonella typhimurium)"은 살모넬라(Salmonella) 속의 장티푸스를 일으키는 원인균이다. 상기 살모넬라 티피무륨은 막대기 모양의 간균으로 편모가 있고 그람 음성이다. 상기 살모넬라 티피무륨은 열에 약하여 60℃에서 20분만에 사멸하며, 가축, 야생 동물, 보균자 등이나 우유, 계란 등에 의해 1차 오염되고 오염된 생육 등에서 2차 감염을 받기 쉬운 샐러드 등도 원인이 되어 식중독의 일종인 살모넬라증(Salmonellosis)을 유발할 수 있다. 본 발명에서 예시적인 살모넬라 타이피뮤리움 균주로는 약화되고 야생형 균주, 예를 들어, AST-100, VNP20009, YS1646(ATCC #202165), RE88, SL7207, χ8429, χ8431, χ8468로 지정된 균주로부터 유래된 살모넬라 타이피뮤리움 균주, 또는 ATCC 수탁 번호 14028를 갖는 야생형 균주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서, 상기 VNP20009 균주는 msbB 및 purI 자리에서 결실을 갖는 약독화된 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 유전적 변형 균주로, Luo et al., Oncol Res. 12(11-12):501-8, 2001에 자세히 설명되어 있다.
본 발명에서 상기 "살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis)"는 살모넬라(Salmonella)속의 돼지 콜레라균으로 잘 알려져 있는 균으로 사람과 동물 모두에게 감염되는 균이다. 상기 살모넬라 콜레라수이스는 살모넬라에 의한 급성패혈증의 주된 원인균이다. 이 균은 주모(周毛)를 가지고 있어 운동성이 있는 그람 음성의 통성 혐기성 간균이다. 유당 분해력이 없고, 인돌을 형성하지 않으며, 황화수소를 생성하지 않아 대장균과는 구별된다. 발육최적온도 35~37℃이고 증식가능 온도범위는 10~43℃이며, 60℃에서 20분간 가열로 사멸한다. 최적 pH는 7.2~7.4이고, 크기는 0.5~0.8Х3~4μm이다.
본 발명에서 상기 "살모넬라 엔테리티디스(살모넬라 엔테라이티디스, Salmonella enteritidis)"는 살모넬라(Salmonella) 속의 세균성 감염형 식중독의 원인균으로 장염균이라고도 한다. 상기 살모넬라 엔테리티디스는 살모넬라의 대표적인 균으로 모든 동물에서 감염을 일으킬 수 있고 숙주 적응력이 매우 높다. 주모(周毛)를 가지고 있어 운동성이 있는 그람 음성의 통성 혐기성 간균이다. 유당 분해력이 없고, 인돌을 형성하지 않으며, 황화수소를 생성하지 않아 대장균과는 구별된다. 발육 최적 온도는 35~37℃이고 증식이 가능한 온도 범위는 10~43℃이며, 60℃에서 20분간 가열로 사멸한다. 최적 pH는 7.2~7.4이고, 크기는 0.5~0.8Х3~4μm이다.
본 발명에서 상기 "살모넬라 인판티스(Salmonella infantis)"는 계란 또는 가금육류에 의해 감염되는 균주이고, 파라티푸스 균(Salmonella paratyphi) 및 장티푸스 균(Salmonella typhi)은 장티푸스의 원인균주이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 유전적으로 조작된 숙주 세포, 바람직하게는 박테리아 균주를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "암"은 변종 세포의 신속하고 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 질병으로서, 흑색종, 나팔관암, 뇌암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 혈액암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종, 피부암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 암을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 “치료” 및 “개선”은 본 발명의 조성물의 투여로 암의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 제제화할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 액제, 현탁제, 분산액, 유제, 겔제, 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 주사제가 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 주사제로 제제화하는 경우, 주사제 처방의 유통에 따른 제품 안정성을 확보하기 위하여 주사제로 사용 가능한 산수용액 또는 인산염 등의 완충용액을 사용하여 pH를 조절함으로써 물리적으로나 화학적으로 매우 안정한 주사제로 제조될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 주사제는 안정화제 또는 용해 보조제와 함께 주사용수에 용해시킨 후, 멸균처리, 특히 고온감압멸균법 또는 무균여과법에 의해 멸균처리하여 제조될 수 있다. 상기 주사용수로는 주사용 증류수 또는 주사용 완충용액, 예를 들어 pH 3.5 내지 7.5 범위의 인산염 완충용액 또는 인산이수소나트륨(NaH2PO4)-구연산 완충용액을 사용할 수 있다. 사용되는 인산염은 나트륨염 또는 칼륨염 형태이거나 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하고, 구연산 또는 무수물 또는 수화물 형태이어도 무방하다.
또한, 본 발명에서 사용되는 안정화제는 나트륨 피로설파이트(sodium pyrosulfite), 중아황산나트륨(NaHSO3), 메타중아황산나트륨(Na2S2O3) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)을 포함하고, 용해 보조제는 수산화나트륨(NaOH), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 탄산나트륨(NaCO3) 또는 수산화칼륨(KOH)과 같은 염기, 또는 염산(HCl) 또는 아세트산(CH3COOH)과 같은 산을 포함한다.
본 발명에 따른 주사제는 생체흡수성, 생체 분해성, 생체적합성으로 제형화될 수 있다. 생체흡수성이라 함은 주사제가 체내에서, 분산된 주사제의 분해 또는 분해 없이, 초기 적용에서 사라질 수 있음을 의미하는 것이다. 생체 분해성은 가수분해 또는 효소 분해에 의해 주사제가 체내에서 파쇄 또는 분해될 수 있음을 의미한다. 생체적 합성은 성분 모두가 체내에서 무독성임을 의미한다.
본 발명에 따른 주사제는 통상의 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제 등의 희석제, 또는 부형제 등을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 유효성분은 목적에 따라 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 피하, 자궁내 경막, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로 등을 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 정맥내로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물 또는 유효성분은 주사 또는 카테터로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여에 따른 대상체에의 상기 박테리아의 투여량은 의료 분야에 알려진 바와 같이, 대상체의 투여량 대상체의 종, 크기, 체표면적, 연령, 성별, 면역적격, 및 일반적인 건강, 투여될 특정 박테리아, 지속기간 및 투여 경로, 질환의 종류 및 단계, 예를 들어, 종양 크기, 및 다른 화합물 예컨대 동반하여 투여되고 있는 약물을 포함하는 많은 인자에 의존할 수 있다. 상기 인자에 추가하여, 이러한 수준은 당업자에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 박테리아의 감염성 및 박테리아의 특성에 의해 영향을 받을 수 있다. 본 방법에서, 박테리아의 적절한 최소 투여량 수준은 수준은 박테리아가 종양 또는 전이에서 생존, 성장 및 복제하기에 충분한 수준일 수 있다. 박테리아를 65 kg의 인간에게 투여하기 위한 예시적인 최소 수준은 적어도 약 5Х106 콜로니 형성 단위(CFU), 적어도 약 1Х107 CFU, 적어도 약 5Х107 CFU, 적어도 약 1Х108 CFU, 또는 적어도 약 1Х109 CFU를 포함할 수 있다. 본 방법에서, 박테리아의 적절한 최대 투여량 수준은 숙주에게 독성이 없는 수준, 3x 이상의 비장비대증을 유발하지 않는 수준, 약 1일 후 또는 약 3일 후 또는 약 7일 후 정상 조직 또는 기관에서 콜로니 또는 플라크를 생성하지 않는 수준일 수 있다. 박테리아를 65 kg의 인간에게 투여하기 위한 예시적인 최대 수준은 약 5Х1011 CFU 이하, 약 1Х1011 CFU이하, 약 5Х1010 CFU이하, 약 1Х1010 CFU이하, 또는 약 1Х109 CFU 이하를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서 유효성분은, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 함유될 수 있다. 그러나 함량은 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 1종 이상의 항암제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 암의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 본 발명의 조성물을 투여하는 것 외에, 다른 항종양 치료제 및/또는 치료와의 병용 요법을 수행할 수 있다. 예컨대, 세포 요법, 예컨대 변형된 면역 세포의 투여; CAR-T 요법; CRISPR 요법; 면역요법, 예컨대 면역 체크포인트 억제제, 예컨대 항체 및 항체 단편; 화학요법 및 화학치료 화합물, 예컨대 뉴클레오사이드 유사체; 수술; 종양용해 바이러스 요법; 및 방사선요법을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 개체에게 본 발명에서 제공하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 개체는 암이 발병되거나 발병할 위험이 있는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류, 파충류, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암, 약학 조성물 및 그 투여에 관한 내용은 앞서 기재된 바와 중복되어 이하 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 제공하는 재조합 핵산 작제물은 전사 후 얻어진 mRNA는 스플라이싱(splicing) 과정에 의해 제1 인트론 내지 제2 인트론 부위가 제거되고 제1 엑손 및 제2 엑손의 mRNA가 서로 결합하여 이후 번역을 통해 얻어지는 폴리펩타이드는 암 세포 사멸 활성을 낼 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 핵산 작제물에서는 상기 제1 인트론과 제2 인트론 사이에 암 세포에 존재하는 항원을 표적으로 하는 억제제로, 예컨대 면역체크포인트나 기타 종양 항원을 표적하는 간섭 RNA(RNAi)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있고, 그 경우 상기 스플라이싱 과정에서 분리된 간섭 RNA로 인하여 항암 활성의 시너지적 향상 효과를 기대할 수 있다. 이때에 특히 암 세포를 표적으로 하는 miR-138 및 miR-153를 삽입함으로써 시너지 작용에 의해 우수한 항암 활성을 보일 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명에서는 상기 재조합 핵산 작제물을 발현하는 벡터를 면역자극성 박테리아 균주를 통해 전달함으로써 박테리아 균주 자체에 의한 추가적인 항암 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제작된 pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO 벡터의 개열 지도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 제작된 pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터의 개열 지도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 4에서 제작된 pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터의 개열 지도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 5에서 제작된 pcDNA3-DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터의 개열 지도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 제작된 pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO 벡터를 제한효소로 처리한 뒤 얻어진 절편을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에서 제작된 pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터를 제한효소로 처리한 뒤 얻어진 절편을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 2에서 제작된 pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주의 세포 용해물에서 LLO 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 4에서 제작된 pcDNA3-GrB 벡터를 제한효소로 처리한 뒤 얻어진 절편을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 4에서 제작된 pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터를 제한효소로 처리한 뒤 얻어진 절편을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 5에서 제작된 pcDNA3-DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터를 제한효소로 처리한 뒤 얻어진 절편을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 7에서 대장암 SW480 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포 용해물에서 PD-L1 및 IDO의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 7에서 대장암 HT29 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포 용해물에서 PD-L1 및 IDO의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예 7에서 간암 Huh7 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포 용해물에서 PD-L1 및 IDO의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예 7에서 유방암 MDA-MB-231 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포 용해물에서 PD-L1 및 IDO의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 실시예 7에서 췌장암 Panc1 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포 용해물에서 PD-L1 및 IDO의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 실시예 8에서 대장암 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포 용해물에서 PD-L1(target A) 및 IDO(target B)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 후, 무처리 대장암 세포 대비 상기 살모넬라 균주 처리된 대장암 세포에서의 PD-L1 및 IDO의 발현 수준의 변화의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 실시예 8에서 간암 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포 용해물에서 PD-L1(target A) 및 IDO(target B)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 후, 무처리 간암 세포 대비 상기 살모넬라 균주 처리된 간암 세포에서의 PD-L1 및 IDO의 발현 수준의 변화의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 실시예 8에서 유방암 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포 용해물에서 PD-L1(target A) 및 IDO(target B)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 후, 무처리 유방암 세포 대비 상기 살모넬라 균주 처리된 유방암 세포에서의 PD-L1 및 IDO의 발현 수준의 변화의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 실시예 8에서 췌장암 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포 용해물에서 PD-L1(target A) 및 IDO(target B)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 후, 무처리 췌장암 세포 대비 상기 살모넬라 균주 처리된 췌장암 세포에서의 PD-L1 및 IDO의 발현 수준의 변화의 비율을 그래프로 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 실시예 9에서 대장암 SW480 세포를 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주로 감염시킨 뒤 상기 세포에서 그랜자임 B 단백질의 발현 수준을 형광 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
각 도면에서, “Neg” 또는 “Neg. no Hly”는 Hly 유전자가 클로닝되지 않은 pcDNA3 mock 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과이고, "Neg. Hly"는 Hly 유전자만 클로닝된 pcDNA3 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과이며, "P/I" 또는 "PI"는 실시예 2의 pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과이고, "Int. GP/I"는 실시예 4의 pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과이다. "DP/I" 또는 "DPI"는 실시예 2의 벡터에 DTS를 추가로 클로닝한 벡터로, pcDNA3-DTS-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과이고, "DGP/I" 또는 "DGPI"는 실시예 5의 pcDNA3-DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과이다. "GPI"는 pcDNA3 벡터에 GrB의 CDS와, hsa-mir-138 및 hsa-mir-153이 순차로 클로닝되고, 추가로 Hly 유전자가 클로닝된 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과이다. "Gzm"은 pcDNA3 벡터에 GrB의 CDS만 클로닝한 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과이고, "DGzm"은 pcDNA3 벡터에 DTS 및 GrB의 CDS를 클로닝한 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 5'에서 3'으로, 그랜자임 B(granzyme B; GZMB) 유전자의 제1 엑손; 제1 인트론; 제2 인트론; 및 그랜자임 B(granzyme B; GZMB) 유전자의 제2 엑손을 포함하고, 상기 제1 인트론과 상기 제2 인트론 사이에 적어도 하나의 간섭 RNA(interfering RNAs, RNAi)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 핵산 작제물(construct)에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자의 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자에 포함되는 5개의 엑손 또는 그 단편들 중에서 선택되는 적어도 하나, 즉, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5 또는 이들의 단편 중에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명에서 상기 그랜자임 B 유전자의 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자에 포함되는 5개의 엑손 또는 그 단편들 중에서 선택되는 적어도 하나, 즉, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5 또는 이들의 단편 중에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편을 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편을 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4와, 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편과, 엑손 2를 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 3 및 엑손 4와, 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편과, 엑손 2 및 3을 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 4와 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 1 또는 그 단편과, 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4를 포함하고, 상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자(GZMB)의 엑손 5 또는 그 단편을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 엑손은 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제2 엑손은 서열번호 10으로 표시되는 염기 서열(서열번호 5 내지 8의 서열이 5'->3' 방향으로 순차 연결된 것)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제2 엑손은 서열번호 11로 표시되는 염기 서열(서열번호 5 내지 7 및 9의 서열이 5'->3' 방향으로 순차 연결된 것)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 제1 인트론 또는 그 단편은 스플라이스 공여 부위를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 제2 인트론 또는 그 단편은 스플라이스 수용 부위를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 인트론은 서열번호 17로 표시되는 염기 서열의 스플라이스 공여 부위를 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 17로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제2 인트론은 서열번호 18로 표시되는 염기 서열의 스플라이스 수용 부위를 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 18로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 핵산 작제물은 상기 제1 인트론과 상기 제2 인트론 사이에 종양 항원, 예컨대 면역관문 단백질(immune checkpoint) 특이적 억제 활성을 갖는 간섭 RNA(interfering RNAs, RNAi)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 간섭 RNA는 miR-138일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 간섭 RNA는 miR-153일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 간섭 RNA는 miR-138 및 miR-153일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 성숙한 서열은 인간(homo sapiens) 유래의 hsa-miR-138로, 서열번호 19로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 hsa-miR-138-5p일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 성숙한 서열을 암호화하는 서열은 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 20으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 전구체(pre-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 21로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 21로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-138의 초기 전사체(pri-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 22로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 22로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 성숙한 서열은 인간(homo sapiens) 유래의 hsa-miR-153로, 서열번호 23으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 hsa-miR-153-5p일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 성숙한 서열을 암호화하는 서열은 서열번호 24로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 24로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 전구체(pre-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 25로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 25로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 miR-153의 초기 전사체(pri-miRNA)를 암호화하는 서열은 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것, 바람직하게는 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 인트론과 제2 인트론 사이에 서열번호 21로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 25로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 제1 인트론과 제2 인트론 사이에 서열번호 22로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 26으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, miR-138 및 miR-153 각각을 암호화는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 핵산 작제물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 재조합 핵산 작제물을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 발현 벡터는 DNA 핵 표적화 서열(nuclear targeting sequence, DTS)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 DNA 핵 표적화 서열은 서열번호 27로 표시되는 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발현 벡터는 암 세포의 사멸을 직간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 독소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 독소 단백질은 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-alpha(Tumour necrosis factor-alpha; TNF-alpha), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL), 스트렙토리신O(streptolysin O; SLO), 폐렴구균용혈소(pneumolysin; PLO), 리스테리오리신(listeriolysin; LLO) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 발현 벡터는 독소 단백질인 리스테로리신 O(LLO)를 암호화는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예시로, 상기 리스테로리신 O(LLO)는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 Hly 유전자는 서열번호 29로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기한 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 그랜자임 B(granzyme B) 또는 그 단편; 및 종양 항원, 예컨대 면역관문 단백질(immune checkpoint) 특이적 억제 활성을 갖는 간섭 RNA(RNAi)를 발현하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 miR-138 및 miR-153을 발현하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 리스테오라이신 O(LLO)가 추가로 발현되도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 숙주 세포는 면역자극성 박테리아 균주인 것이 바람직하다. 본 발명에서 상기 면역자극성 박테리아는 임의의 적합한 종일 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 살모넬라(Sallmonella), 리스테리아(Listeria), 리케치아(Rickettsia), 클레브시엘라(Klebsiella), 보르데텔라(Bordetella), 네이쎄리아(Neisseria), 애로모나스(Aeromonas), 프란치셀라(Francisella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 시트로박터(Citrobacter), 클라미디아(Chlamydia), 해모필루스(Haemophilus), 브루셀라(Brucella), 미코박테리움(Mycobacterium), 코플라즈마(Mycoplasma), 레지오넬라(Legionella), 로도콕커스(Rhodococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 헬리코박터(Helicobacter), 비브리오(Vibrio), 바실러스(Bacillus) 또는 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix)의 균주를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 인판티스(Salmonella infantis), 파라티푸스 균(Salmonella paratyphi), 장티푸스 균(Salmonella typhi), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 리케치아 리케치애(Rickettsia rickettsiae), 리케치아 프로와제키이(Rickettsia prowazekii), 리케치아 쯔쯔가무시(Rickettsia tsutsugamuchi), 리케치아 무세리(Rickettsia mooseri), 리케치아 시비리카(Rickettsia sibirica), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 네이쎄리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 네이쎄리아 고노로애(Neisseria gonorrhoeae), 애로모나스 유크레노필라(Aeromonas eucrenophila), 애로모나스 살모니시다(Aeromonas salmonicida), 프란치셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis), 시트로박터 프룬디이(Citrobacter freundii), 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 해모필루스 솜누스(Haemophilus somnus), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 미코박테리움 인트라셀룰라레(Mycobacterium intracellulare), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 로도콕커스 에퀴(Rhodococcus equi), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 헬리코박터 무스텔래(Helicobacter mustelae), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에리시펠로트릭스 루시오파시애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 로칼리마애 퀸타나(Rochalimaea quintana), 또는 애그로박테리움 투메르파시움(Agrobacterium tumerfacium)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 유전적으로 조작된 숙주 세포, 바람직하게는 박테리아 균주를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 개체에게 본 발명에서 제공하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO 벡터의 제작
pcDNA3의 플라스미드에 PD-L1의 발현을 억제하는 hsa-mir138과 IDO의 발현을 조절하는 hsa-mir153을 클로닝하기 위하여, hsa-mir138(서열번호 22)과 hsa-mir153(서열번호 26)의 순서로 연속되게 위치하도록 하며 올리고 핵산을 합성하였다. 상기 pcDNA3에 존재하는 T7 프로모터의 하류에 hsa-mir138과 hsa-mir153 유전자가 클로닝되도록, 상기 pcDNA3의 제한효소 부위인 EcoRI와 XhoI 제한효소 부위 사이에 상기 올리고 핵산을 삽입하였다(도 1 개열 지도 참조).
이후, 얻어진 플라스미드를 HindIII/XhoI 제한효소로 절단하고, 얻어진 절편을 0.9% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행한 결과, 도 5에 보는 바와 같이 585bp에 해당하는 밴드가 확인되었다. 이를 통해, hsa-mir138과 hsa-mir153가 벡터 내에 성공적으로 클로닝되어 재조합 플라스미드가 얻어졌음을 알 수 있었다.
[실시예 2] pcDNA3-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터의 제작
실시예 1에서 제작된 플라스미드에 Hly 유전자(서열번호 29)를 추가로 삽입하기 위하여, 5' 말단에 제한효소 XmaI 인식부위가 있는 센스 프라이머 5'-CCCGGGCCCTCCTTTGATTAG-3'와 3' 말단에 제한효소 BstBI 인식부위가 있는 안티센스 프라이머 5'-TTCGAAGCTTATATTATATGGATAAACAGTC-3'을 IDT로 부터 구입하였다. Hly 유전자의 증폭을 위해 사용된 유전자 주형으로는 박테리아 플라스미드 Pt7RNAi-Hly-Inv(TRIP)를 이용하였다(Xiang, S., Fruehauf, J., & Li, C. J. (2006). Short hairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals. Nature Biotechnology, 24(6), 697-702. Doi:10.1038/nbt1211). Hly 유전자 증폭을 위하여, TRIP 0.5ng과 2 pmole의 센스, 안티센스 프라이머와 Phusion DNA 폴리머라제(Invitrogen, USA)를 혼합한 뒤 제조사의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은 98℃에서 30초 반응 후, 98℃에서 5초, 55℃에서 10초, 72℃에서 30초의 조건에서 35 회(cycle) 실시 후, 72℃에서 5분 동안 연장 반응을 실시하였다. PCR 실시 후 증폭된 Hly 유전자는 DNA 전기영동으로 정확한 크기가 확인된 후에 Qiagen의 Extraction kit를 사용해서 추출하였다.
이후 실시예 1에서 제작된 플라스미드에 Hly 유전자를 삽입하기 위하여, 상기 플라스미드와 증폭된 Hly 유전자에 제한효소인 XmaI과 BstBI를 처리하였다. 각각의 유전자 분절을 연결(ligation)하여 pcDNA3-miR-PDL1-IDO-Hly 플라스미드를 제작하였다(도 2 개열 지도 참조).
이렇게 얻어진 플라스미드를 XmaI/BstBI 제한효소로 절단하고, 얻어진 절편을 0.9% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행한 결과, 도 6에 보는 바와 같이 Hly 유전자의 크기인 2016bp에 해당하는 밴드가 확인되었다. 이를 통해, Hly 유전자가 벡터 내에 성공적으로 삽입 클로닝되었음을 알 수 있었다.
[실시예 3] pcDNA3-miR-PDL1-IDO-Hly로 형질전환된 살모넬라 균주의 제작 및 LLO 생산 검증
살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) VNP20009 균주에 상기 실시예 1에서 제작한 벡터를 전기천공법(Electroporation)을 이용하여 형질전환 한 뒤, 100㎍/ml의 엠피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지를 이용하여 상기 형질전환된 균주를 밤새 배양하였다. 단 대조군으로는 Pcmv-Negative으로 형질전환시켰다. 그 뒤, 상기 50ug/ml 농도의 엠피실린이 포함된 새로운 LB 배지에서 24 시간 동안 배양한 뒤 전체 세포 용해물을 수득하였다. 전체 세포 용해물에 2X SDS-PAGE 샘플용액을 동일 볼륨으로 첨가하고 5분간 끓인 후 10 ㎕을 4-20% gradient SDS-PAGE 젤에서 단백질 사이즈 마커와 함께 120 볼트에서 약 1시간 동안 전기영동을 실시하고 100V에서 약 50분 동안 니트로셀룰로오스 막에 이동시켰다. 그 후에 항-Hly 토끼 단일클론항체 (Abcam)로 1차 반응하고, HRP가 결합된 항-토끼 마우스 다클론항체 (Sigma)를 이용하여 단백질 수준에서 LLO의 발현을 확인한 결과를 도 7에 나타내었다. 동일한 시료에 대해서 로딩 컨트롤(loading control)은 anti-DnaK 마우스 단일클론항체 (Abcam)와 HRP가 결합된 항-토끼 마우스 다클론항체 (Sigma)로 확인하였다.
도 7에서 보는 바와 같이, pcDNA3-miR-PDL1-IDO-Hly 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주에서 LLO가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터의 제작
Granzyme B와 hsa-miR-138 및 hsa-miR-153이 동시에 발현되도록 하는 벡터를 제작하기 위하여 아래의 방법으로 벡터를 설계 및 제작하였다.
1. pcDNA3-GrB 벡터의 제작
GZMB의 CDS 유전자(서열번호 3 및 5 내지 8의 연속 서열)를 pcDNA3 벡터에 클로닝하기 위하여 Sinbiological에서 판매하는 인간 Granzyme B cDNA ORF 클론을 구매하여 사용하였다. GZMB 유전자의 증폭을 위하여 5' 말단에 제한효소 KpnI 서열이 포함된 센스 프라이머 5`-GGTACCGAGATGGTGCAAC-3'와 FLAG 태크가 삽입된 BamHI 제한효소 인식부위가 있는 안티센스 프라이머 5`-GGATCCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCACTTCCGCCACCGTAGCGTTTCATGGT-3'를 IDT에서 구매하였다. PCR을 통해 증폭된 GZMB 유전자는 pcDNA3의 KpnI과 BamHI 제한효소 부위에 삽입하였다.
이렇게 얻어진 플라스미드를 KpnI/BstBI 제한효소로 절단하고, 얻어진 절편을 0.9% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행한 결과, 도 8에 보는 바와 같이 Flag 태그가 포함된 GZMB 유전자의 크기인 798bp에 해당하는 밴드가 확인되었다. 이를 통해, GZMB 유전자가 벡터 내에 성공적으로 클로닝되었음을 알 수 있었다.
2. pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터(도 3 개열 지도 참조)의 제작
제작된 pcDNA3-GrB 벡터에 intron이 포함된 hsa-mir138과 hsa-mir153을 클로닝 하기 위하여, 상기 실시예 2에서 제작된 pcDNA-miR-Pdl1-IDO-Hly 벡터를 주형으로 사용해 유전자 증폭을 하였다. 이때 사용하기 위한 센스 프라이머는 GZMB의 제1 엑손(엑손 1의 CDS; 서열번호 3)의 3' 말단과 더불어 인트론 1(intron 1) 유전자 염기 서열(서열번호 17)과 hsc-miRNA-138의 5' 일부를 포함하는 5'-GTAAGAGTCGATCGCTTCCCGGTTCTCACTTCTG-3'이고, 안티센스 프라이머는 hsc-miRNA-153의 3' 말단 일부와 인트론 2(intron 2) 유전자 염기 서열(서열번호 18)에 연속적으로 GZMB의 제2 엑손(엑손 2~4, 엑손 5의 CDS; 서열번호 10)의 5'의 일부가 포함되는 5'-CTGCAGGATATCAAAAAAAAAAGAAGAGGTACCAGTTAGTAACGCGTCGGGCGAGAG-3'을 IDT로부터 구매해 사용했다. Intron-miRNA 유전자를 증폭하기 위하여 실시예 2에서 제작된 pcDNA-miR-Pdl1-IDO-Hly 발현벡터 0.2ng, 2 pmole의 센스, 안티센스 프라이머, 그리고 Phusion DNA polymerase (Invitrogen, USA)을 혼합한 뒤 제조사의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은 98℃에서 30초 반응 후, 98℃에서 5초, 68℃에서 10초, 72℃에서 8초의 조건에서 35 회(cycle) 실시 후, 72℃에서 5분 동안 연장 반응을 실시하였다. 이렇게 증폭된 유전자를 어셈블리(assembly)에 사용하기 위하여, 유전자 어셈블리용 프라이머를 이용해 어셈블리-인트론-miRNA 유전자를 증폭했다. PCR 반응조건은 98℃에서 30초 반응 후, 98℃에서 5초, 71℃에서 30초, 72℃에서 8초의 조건에서 35 회(cycle) 실시 후, 72℃에서 5분 동안 연장 반응을 실시하였다.
이어서 증폭된 어셈블리-인트론-miRNA 유전자와 어셈블리 하기 위한 어셈블리-GZMB 벡터 유전자를 얻기 위하여 유전자 증폭을 실시했다. 이때 사용된 센스 프라이머는 GZMB 엑손 5의 5' 말단인 5'-GGGAGATCATCGGGGGACATG-3'이고, 안티센스 프라이머는 GZMB 엑손 1의 3' 말단 부분의 염기서열인 5'-CTGCATCTGCCCTGGGCAGCA-3'의 염기서열을 갖도록 IDT를 통해 구입하였다. PCR은 주형으로 Pcmv-GZMB 0.2ng과, 0.2 pmole의 센스와 안티센스 프라이머, 그리고 Phusion DNA 폴리머라제(Invitrogen, USA)를 혼합한 뒤 제조사가 권장하는 방법으로 증폭하였다. PCR 반응조건은 98℃에서 30초 반응 후, 98℃에서 5초, 63℃에서 30초, 72℃에서 118초의 조건에서 35 회(cycle) 실시 후, 72℃에서 5분 동안 연장 반응을 실시하였다.
증폭된 어셈블리-인트론-miRNA와 어셈블리-GZMB 벡터를 하나의 벡터로 제작하기 위해서 Daniel G Gibson에 의해 개발된 방법을 사용하였다(Cgibson, D. G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods 6, 343-345 (2009).). 7918bp인 어셈블리-GZMB 벡터 약 100ng과 어셈블리-인트론-miRNA 15ng을 하나의 반응에 사용했으며, New England BioLabs에서 제공하는 NEBuilder HiFi DNA Assembly kit를 제조사가 권장하는 방법에 따라 제작했다. 두 유전자 절편을 50℃에서 30분간 반응시켰다.
GZMB(서열번호 3 및 10)와 hsa-mir-138(서열번호 22) 및 hsa-mir-153(서열번호 26)의 유전자가 하나의 벡터 내에 클로닝되었는지 확인하기 위하여 얻어진 벡터를 KpnI과 BamHI 제한효소로 절단하고, 얻어진 절편을 0.9% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이 예상된 686bp의 밴드가 관찰되었다. 이를 통해, GZMB와 hsa-miR-138 및 hsa-miR-153 유전자가 벡터 내에 성공적으로 삽입 클로닝되었음을 알 수 있었다.
[실시예 5] pcDNA3-DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터의 제작
실시예 2 및 4에서 제작된 벡터에 DNA 핵 표적화 서열(DTS)을 클로닝 하고자, DTS 주형(서열번호 27)을 IDT로 구입해 PCR 주형으로 사용하였다. PCR에 사용된 센스 프라이머는 5'-AGGCGTTTTGCGCTGCTTCG-3', 안티센스 프라이머는 5'-TATATCTGGCCCGTACATCGGGAAAGTC-3'를 사용하고, Phusion DNA polymerase (Invitrogen, USA)를 이용해 제조사의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은 98℃에서 30초 반응 후, 98℃에서 5초, 68℃에서 10초, 72℃에서 2초의 조건에서 35 회(cycle) 실시 후, 72℃에서 5분 동안 연장 반응을 실시하였다.
증폭된 DTS 유전자 어셈블리를 제작하기 위하여, 상기 실시예 2 및 4에서 제작한 벡터에 NruI 제한 효소를 37℃에서 30분 동안 처리하여 선형의 벡터를 확보하였다. 이어서 증폭된 DTS 유전자 절편과 선형의 벡터를 New England BioLabs에서 제공하는 NEBuilder HiFi DNA Assembly kit를 제조사가 권장하는 방법에 따라 제작하였다. 두 유전자 절편은 50℃에서 30분간 반응시켰다.
이후 두 유전자가 하나의 벡터로 결합되었음을 확인하기 위하여, 상기 반응 후 BglII와 NdeI을 처리한 뒤 얻어진 절편을 0.9% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행한 결과, 도 10에서 보는 바와 같이 예상된 541bp의 밴드가 관찰되었다.
[실시예 6] 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주의 제작
살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) VNP20009 균주를 상기 실시예 1, 2, 3, 4 및 5에서 제작한 벡터로 형질전환시키기 위하여, 한천배지에서 배양된 VNP20009 균주를 1ml의 차가운 10mM HEPES로 세척하고, 3000rpm의 속도로 원심분리 하였다. 상등액을 제거한 후에 다시 1ml의 10mM HEPES로 원침한 세균체를 세척하고 10분간 얼음에 두었다. 세척 과정을 총 3회에 걸쳐 실시하고 남은 원침한 세균체를 차가운 40 ㎕의 10% 글리세롤(glycerol)에 형질전환 할 벡터(실시예 1, 2, 3, 4 또는 5의 벡터) 100ng과 섞어준 후에 얼음에 15분 동안 두었다. 이후 전기천공용 1mm 큐벳(cuvette)에 옮겨 Eppendorf Eporator를 사용해 1700V로 상기 균주에 벡터를 전달하였다. 이후 250 ㎕의 SOC 배양액으로 37℃에서, 200rpm 쉐이킹(shaking) 인큐베이터에서 1시간 동안 회수하였고, 이를 암피실린(Ampicillin)이 함유된 한천배지에서 24시간 이상 37℃에서 배양하였다. 한천배지에서 배양된 재조합 살모넬라 콜로니를 선별하여 암피실린이 함유된 10ml의 BHI 배지로 옮길 후에 다시 37℃에서 배양하였다. BHI 배지에서 배양된 재조합 살모넬라는 3000rpm으로 10분 동안 원심분리 후에 생성된 세균체를 혈청이 없는 Dulbeccos Modified Eagles Media (DMEM) 5ml로 세척하는 과정을 총 3회 실시하였다.
[실시예 7] 형질전환된 살모넬라 균주가 처리된 암 세포에서의 PD-L1 및 IDO 단백질의 발현 저해 검증(1)
종양 세포에서 상기 실시예들에서 제작된 벡터에 의한 PD-L1과 IDO 단백질의 발현 저해 효과를 확인하기 위하여, SW480 대장암 세포, HT29 대장암 세포, Huh7 간암 세포, MBA-MB-231 유방암 세포, Panc1 췌장암 세포를 각각의 벡터로 형질전환 된 실시예 6의 재조합 살모넬라 균주로 감염시켰다. 구체적으로는, 12 웰 배양 플레이트에 배양 중인 종양 세포에, 세포: 재조합 살모넬라가 원하는 비율로 조정된 DMEM 1ml을 2시간 동안 감염시킨 후, 젠타마이신 200 ㎕/ml이 포함된 DMEM으로 종양 세포 내로 침투하지 못한 살모넬라 균주를 1시간 동안 제거하였다. 재조합 살모넬라가 감염된 종양 세포는 새로운 DMEM 배지에서 48 시간 동안 배양하였고, 이후 RIPA 용혈 버퍼로 얼음에서 30분 동안 용해한 뒤 원심분리하여 상등액만 취하고 동일 볼륨의 2X SDS 시료와 섞어주었다. 20ug의 단백질을 정량하여 상기에 서술된 SDS-PAGE 방법으로 단백질을 SDS-PAGE 젤로 분자량에 따라 100 V에서 1 시간 분리 후에 니트로셀룰로오스 막에 100 V로 50분 동안 이동시켰다. PD-L1 단백질의 발현을 확인하기 위한 1차 항체는 PD-L1 토끼 단일클론항체 (R&D systems)를 사용하였고, IDO 단백질 발현을 확인하기 위한 1차 항체는 IDO 토끼 단일클론항체 (Cell Signaling)를 사용하였으며, 대조군으로는 GAPDH 마우스 단일클론항체 (Abcam)를 사용하였다. 2차 항체로는 HRP가 결합된 마우스 항-토끼 다클론항체와 토끼 항-마우스 다클론항체를 사용하였다.
그 결과, 도 11 내지 15에서 보는 바와 같이, 본 발명의 pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터(실시예 4)로 형질전환된 살모넬라 균주에 의해 감염된 각 종양 세포에서 PD-L1 및 IDO의 발현 수준이 대조군 대비 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 GZMB(제1 엑손 및 제2 엑손)와 hsc-miRNA-138 및 hsc-miRNA-138를 암호화하는 서열과 함께, DNA 핵 표적화 서열(DTS)이 클로닝된 벡터(실시예 5의 pcDNA3-DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터)로 형질전환된 살모넬라 균주에 의해 감염된 종양 세포에서 PD-L1 및 IDO의 발현 수준이 더욱 감소된 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 8] 형질전환된 살모넬라 균주가 처리된 암 세포에서의 PD-L1 및 IDO 단백질의 발현 저해 검증(2)
종양 세포에서 상기 실시예들에서 제작된 벡터에 의한 PD-L1과 IDO 단백질의 발현 저해 효과를 정량적 수준 하에서 확인하기 위하여, 상기 실시예 7과 동일한 방법으로 대장암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포를 각각의 벡터로 형질전환 된 실시예 6의 재조합 살모넬라 균주로 감염시켰다. 이후, 상기 종양 세포들에서 발현되는 PD-L1(target A) 및 IDO(target B)의 발현 수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 뒤, 무처리 음성 대조군에서의 발현 수준 대비 각 균주 처리에 따른 발현 수준의 변화의 비율을 측정하여 그 결과를 도 16 내지 19에 나타내었다.
도 16 내지 19에서 보는 바와 같이, 대장암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 모두에 있어서 본 발명의 pcDNA3-DTS-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터(실시예 5)로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 결과, PD-L1 및 IDO의 발현 수준이 무처리 음성 대조군이나 야생형 살모넬라 균주를 처리한 경우와 비교하여 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 9] 형질전환된 살모넬라 균주가 처리된 암 세포에서 그랜자임 B 단백질의 발현 검증
상기 실시예 6에서 준비된 각 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 폴리-L-라이신 커버슬립(coverslip)에서 배양된 대장암 세포 SW480에 처리하고 48시간 후에 세포를 면역세포화학 방법으로 처리했다. 구체적으로는 SW480 세포를 4%의 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하고, 0.5%의 Triton X-100과 0.5%의 사포닌(saponin)으로 세포막의 지질을 제거하였다. 5%의 정상 당나귀 혈청(donkey normal serum)으로 세포를 블라킹하고, 토끼 항-FLAG 항체 (Proteintech)를 4℃에서 하루동안 결합시켰다. 이 후에 당나귀 항-토끼 Alexa 488 항체 (Invitrogen)로 FLAG 항체를 검출하는데 사용하였다. 그리고 알파-튜뷸린(alpha-tubulin)을 확인하기 위하여 마우스 항-알파-튜뷸린 단일클론항체를 처리하고 2차 항체로 당나귀 항-마우스 Alexa 594 (Invitrogen)를 처리하였다. 연속해서 DNA를 형광염색 하기 위해서 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)이 포함된 마운팅 용액(mounting solution)으로 커버슬립과 슬라이드를 공기가 들어가지 않도록 접착시켰다. Zeiss Axioimager M1 표면형광 현미경을 이용해 형광 염색된 세포의 이미지를 획득하였으며, 이는 도 20에 나타내었다. 본 실험에서는 추가로, GZMB의 두 엑손 단편 사이에 인트론과 함께 hsa-mir-138, hsa-mir-153이 삽입된 것이 아니라, pcDNA3 벡터에 GZMB의 CDS(서열번호 3 및 10의 순차 서열), hsa-mir-138(서열번호 22), hsa-mir-153(서열번호 26)이 순차로 클로닝된 pcDNA3-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터를 제작하여 동일한 방법으로 실험을 수행하였고, 그 외에도 pcDNA3 벡터에 GrB의 CDS(서열번호 3 및 10의 순차 서열)만 클로닝한 벡터 또는 pcDNA3 벡터에 DTS(서열번호 27) 및 GZMB의 CDS(서열번호 3 및 10의 순차 서열)를 클로닝한 벡터를 제작하여 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
도 20에서 보는 바와 같이, 본 발명의 pcDNA3-intron-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터(실시예 4)로 형질전환된 살모넬라 균주에 의해 감염된 대장암 세포에서 그랜자임 B가 가장 높은 수준으로 발현하는 것을 확인할 수 있었고, 스플라이싱 없이 그랜자임 B와 miR-138 및 miR-153이 발현될 수 있도록 GZMB의 CDS와 hsa-mir-138 및 hsa-mir-153이 순차로 연결된 pcDNA3-GrB_FLAG-miRNA-Pdl1-IDO-Hly 벡터로 형질전환된 살모넬라 균주를 처리한 경우(GPI) 보다도 그랜자임 B의 발현 수준이 높은 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 암 치료에 유용한 재조합 핵산 작제물과 이를 포함하는 유전자 발현 시스템 및 상기 발현 시스템으로 형질 전환된 박테리아 균주에 관한 것이다.

Claims (24)

  1. 그랜자임 B(granzyme B; GZMB) 유전자의 제1 엑손; 제1 인트론; 제2 인트론; 및 그랜자임 B(granzyme B; GZMB) 유전자의 제2 엑손을 포함하고,
    상기 제1 인트론과 상기 제2 인트론 사이에 적어도 하나의 간섭 RNA(interfering RNAs, RNAi)를 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 핵산 작제물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 엑손 또는 제2 엑손은 그랜자임 B의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4 및 엑손 5 중에서 선택되는 적어도 하나인, 재조합 핵산 작제물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 엑손 및 제2 엑손은 서로 동일하거나 상이한, 재조합 핵산 작제물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 엑손은 그랜자임 B 유전자의 엑손 1 또는 그 단편을 포함하고,
    상기 제2 엑손은 그랜자임 B 유전자의 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4와, 엑손 5 또는 그 단편을 포함하는 것인, 재조합 핵산 작제물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 엑손은 서열번호 3 또는 4로 표시되는 염기 서열을 포함하고,
    상기 제2 엑손은 서열번호 10 또는 11로 표시되는 염기 서열을 포함하는, 재조합 핵산 작제물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제1 인트론은 스플라이스 공여 부위를 포함하고,
    상기 제2 인트론은 스플라이스 수용 부위를 포함하는 것인, 재조합 핵산 작제물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 인트론은 서열번호 17로 표시되는 염기 서열을 포함하고,
    상기 제2 인트론은 서열번호 18로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것인, 재조합 핵산 작제물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제1 인트론 및 제2 인트론은 서로 동일하거나 상이한, 재조합 핵산 작제물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 간섭 RNA(interfering RNAs, RNAi)는 면역관문 단백질(immune checkpoint) 억제 활성을 갖는 shRNA, siRNA, 또는 마이크로RNA(microRNA; miRNA)인, 재조합 핵산 작제물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 면역관문 단백질은 PD-L1(Programed Cell Death-Ligand-1) 또는 IDO(indoleamine dioxygenase)인, 재조합 핵산 작제물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 간섭 RNA(interfering RNAs, RNAi)는 miR-138 및 miR-153 중 적어도 하나인, 재조합 핵산 작제물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 작제물을 포함하는 발현 벡터.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 하나 이상의 프로모터(promoter), 하나 이상의 인트론, 하나 이상의 전사 종결 영역, 하나 이상의 개시 코돈, 하나 이상의 종결 또는 정지 코돈을 포함하는, 발현 벡터.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 독소 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 더 포함하는, 발현 벡터.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 독소 단백질은 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-alpha(Tumour necrosis factor-alpha; TNF-alpha), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL), 스트렙토리신O(streptolysin O; SLO), 폐렴구균용혈소(pneumolysin; PLO), 리스테리오리신(listeriolysin; LLO) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 리스테리오라이신 O(listeriolysin O, LLO)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, 발현 벡터.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 DNA 핵 표적화 서열(nuclear targeting sequence, DTS)을 더 포함하는, 발현 벡터.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 DNA 핵 표적화 서열(DTS)은 서열번호 27로 표시되는 염기 서열을 포함하는, 발현 벡터.
  19. 제12항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  20. 그랜자임 B(granzyme B) 또는 그 단편; 및 miR-138 및 miR-153 중 적어도 하나를 발현하도록 유전적으로 조작된 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 추가로 리스테리오라이신 O(LLO)를 발현하도록 유전적으로 조작된 것인, 숙주 세포.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 살모넬라(Sallmonella), 리스테리아(Listeria), 리케치아(Rickettsia), 클레브시엘라(Klebsiella), 보르데텔라(Bordetella), 네이쎄리아(Neisseria), 애로모나스(Aeromonas), 프란치셀라(Francisella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 시트로박터(Citrobacter), 클라미디아(Chlamydia), 해모필루스(Haemophilus), 브루셀라(Brucella), 미코박테리움(Mycobacterium), 코플라즈마(Mycoplasma), 레지오넬라(Legionella), 로도콕커스(Rhodococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 헬리코박터(Helicobacter), 비브리오(Vibrio), 바실러스(Bacillus) 및 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 박테리아 균주인, 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 작제물을 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  24. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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