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WO2024010119A1 - 돌연변이 egfr 및 epha2를 동시 타겟하는 키메라 항원 수용체 - Google Patents

돌연변이 egfr 및 epha2를 동시 타겟하는 키메라 항원 수용체 Download PDF

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WO2024010119A1
WO2024010119A1 PCT/KR2022/009890 KR2022009890W WO2024010119A1 WO 2024010119 A1 WO2024010119 A1 WO 2024010119A1 KR 2022009890 W KR2022009890 W KR 2022009890W WO 2024010119 A1 WO2024010119 A1 WO 2024010119A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
light chain
heavy chain
chain variable
scfv
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/009890
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
권병세
유미진
김나래
Original Assignee
주식회사 유틸렉스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 유틸렉스 filed Critical 주식회사 유틸렉스
Priority to PCT/KR2022/009890 priority Critical patent/WO2024010119A1/ko
Publication of WO2024010119A1 publication Critical patent/WO2024010119A1/ko

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a chimeric antigen receptor that simultaneously targets mutant EGFR and EphA2 expressed in various cancers.
  • Cancer has a high mortality rate worldwide and is the most common cause of death in Western society after cardiovascular disease.
  • brain cancer, colon cancer, breast cancer, and prostate cancer are continuously increasing due to various causes such as the aging of the population, rapid increase in environmental pollutants, and increased intake of high-fat diets.
  • brain cancer has a very poor prognosis, with an average survival period of 14 months after diagnosis.
  • the average survival time has only been extended by 6 months.
  • the standard treatment for brain cancer is surgery, radiation therapy, and chemical treatment, but the probability of cure with these treatments is very low, and they also have the problem of causing serious side effects.
  • CAR-T T cells expressing chimeric antigen receptors (CAR) have been approved as a treatment for blood cancer by showing high anti-cancer efficacy, but the efficacy of CAR-T is reported to be insufficient for solid cancer.
  • CAR-T cell therapy for solid cancer is difficult in selecting target antigens due to the absence of cancer cell-specific antigens.
  • CAR-T cell therapy is being developed targeting antigens overexpressed on solid cancer cells, but many target antigens are also expressed on normal cells present in healthy tissues, so CAR-T cells attack antigens present on normal cells. There is a problem that causes toxicity.
  • solid cancers have high antigenic heterogeneity, and heterogeneity in antigen expression exists between tumor cells even within the tumor tissue of the same patient.
  • the characteristics are very diverse compared to other cancers, so ‘targeted treatment’ targeting a single cancer antigen is almost impossible.
  • a phase 1 clinical trial using EGFRvIII CAR-T targeting EGFRvIII, a mutation of EGFR has been conducted.
  • the present inventors discovered solid tumor-specific cancer antigens, created CAR-T that can simultaneously target two cancer antigens, and developed a CAR-T that is specific for target cells expressing its target antigens.
  • the present invention was completed by confirming its killing activity and excellent therapeutic effect in cancer-inducing animal models.
  • the object of the present invention is to provide a polynucleotide containing a nucleic acid sequence encoding a mutant epidermal growth factor receptor (EGFR)-specific chimeric antigen receptor (CAR) and EphA2 T cell engager. It is done.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • CAR chimeric antigen receptor
  • Another object of the present invention is to provide a vector containing the polynucleotide according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing CAR-T that secretes EphA2 T cell engager and targets EGFR mutations.
  • Another object of the present invention is to provide transformed T cells expressing the polynucleotide according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating cancer.
  • the present invention includes a nucleic acid sequence encoding a mutant epidermal growth factor receptor (EGFR)-specific chimeric antigen receptor (CAR) and an EphA2 T cell engager.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • CAR chimeric antigen receptor
  • EphA2 T cell engager EphA2 T cell engager
  • the nucleic acid sequence encoding the EphA2 T cell engager is an scFv that binds to EphA2 (ephrin type-A receptor 2) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 87; and a nucleic acid sequence encoding a scFv that binds to CD3 and includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88,
  • the nucleic acid sequence encoding the mutant EGFR-specific chimeric antigen receptor provides a polynucleotide characterized in that it comprises a nucleic acid sequence encoding a single chain variable fragment (scFv) selected from the following group:
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 1, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 2, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 3, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 4, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 5.
  • a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 6;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 11, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 12, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 14, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 15.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 16;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 21, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 22, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 23, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 24, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 25.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 26;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 31, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 32, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 33, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 34, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 35.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 36;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 41, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 42, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 43, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 44, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 45.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 46;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 51, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 52, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 53, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 54, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 55.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 56.
  • the present invention provides a vector containing the polynucleotide according to the present invention.
  • the present invention secretes an EphA2 T cell engager, which includes the step of infecting a host cell with a vector containing the polynucleotide according to the present invention and EGFR mutation.
  • the present invention provides transformed T cells expressing the polynucleotide according to the present invention.
  • the present invention provides a polynucleotide according to the present invention.
  • it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising transformed T cells according to the present invention.
  • the present invention provides a) a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 1, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 2, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 3, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: A single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region including the heavy chain CDR2 represented by 5 and the heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 6;
  • scFv single chain variable fragment
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 11, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 12, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 14, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 15.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 16;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 21, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 22, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 23, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 24, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 25.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 26;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 31, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 32, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 33, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 34, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 35.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 36;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 41, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 42, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 43, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 44, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 45.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 46;
  • receptor transformed T cells expressing a specific chimeric antigen receptor (CAR); and
  • EphA2 ephrin type-A receptor 2
  • CD3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, including an EphA2 T cell engager.
  • the present invention provides a polynucleotide according to the present invention; or administering the transformed T cells according to the present invention to an individual.
  • the present invention provides a) a light chain variable region comprising a light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 1, a light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 2, and a light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: A single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region including the heavy chain CDR1 represented by 4, the heavy chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 5, and the heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 6;
  • scFv single chain variable fragment
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 11, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 12, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 14, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 15.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 16;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 21, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 22, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 23, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 24, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 25.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 26;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 31, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 32, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 33, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 34, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 35.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 36;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 41, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 42, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 43, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 44, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 45.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 46;
  • receptor transformed T cells expressing a specific chimeric antigen receptor (CAR); and
  • EphA2 Ephrin type-A receptor 2
  • EphA2 T cell engager comprising an scFv binding to CD3 and containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88.
  • CAR-T cells that secrete the EphA2 T cell engager according to the present invention and target EGFRvIII show specific killing activity against target cells expressing EGFRvIII and/or EphA2, and the effect is similar to CAR-T cells that target only EGFRvIII. Not only was it confirmed to be superior to cells, but it was also confirmed to have a significantly superior therapeutic effect in an animal model causing brain cancer, which could be used to prevent, improve, or treat various solid cancers, including brain cancer, that express EGFRvIII and/or EphA2. It can be useful for this purpose.
  • Figure 1 shows the production and expression of a T cell engager containing an scFv capable of binding to the EphA2 antigen or a T cell engager containing an scFv capable of binding to the CD19 antigen (A) and confirmation of the production and expression of the T cell engager containing an scFv capable of binding to the EphA2 antigen. This is the result of confirming the function of the T cell engager (B and C).
  • Figure 2 shows the results of confirming CAR expression of CAR-T containing an scFv targeting EGFRvIII.
  • Figure 3 shows the results confirming the synergistic effect of EphA2 T cell engager and EGFRvIII CAR-T, showing the killing ability (A) of CAR-T cells and T cell engager at 6 hours or 24 hours and IFN at 6 hours or 24 hours. This is the result of confirming - ⁇ secretion (B).
  • Figure 4 is a schematic diagram showing the structure of the CAR structure for the production of CAR-T targeting EGFRvIII and secreting the EphA2 T cell engager.
  • This is a schematic diagram showing the structure (B) of the EGFRvIII CAR structure.
  • Figure 5 shows the results of confirming the specific killing ability on target cells of CAR-T cell culture media that secretes EphA2 T cell engager and targets EGFRvIII.
  • Figure 6 shows the results of confirming the target-specific activation and killing ability of EGFRvIII CAR-T secreting EphA2 T cell engager on cells expressing EGFRvIII, showing T cell proliferation (A), IFN- ⁇ secretion (B) and target This is the result of confirming cell killing ability (C).
  • Figure 7 shows the results of confirming the target-specific activation and killing ability of EGFRvIII CAR-T secreting EphA2 T cell engager on cells expressing EphA2, showing T cell proliferation (A), IFN- ⁇ secretion (B), and target This is the result of confirming cell killing ability (C).
  • Figure 8 shows the results for the production of an animal model inducing glioblastoma, confirming the expression of EphA2 in cells for inducing glioblastoma (A), and confirming the expression of the EGFRvIII gene after introducing it into the cells (B) ), This is the result of confirming the expression of luciferase (C) after introducing the EGFRvIII gene into the above cells.
  • Figure 9 shows the results of confirming cancer progression and survival up to 98 days in each animal model after injecting EGFRvIII CAR-T, which secretes EphA2 T cell engager, into an animal model causing glioblastoma.
  • Figure 10 shows the results of confirming the size of the cancer by checking the photon value of each animal model after injecting EGFRvIII CAR-T secreting EphA2 T cell engager into an animal model causing glioblastoma.
  • Figure 11 shows the survival rate (A) and body weight (B) of each experimental group after injection of EGFRvIII CAR-T secreting EphA2 T cell engager into an animal model causing glioblastoma. This is one result.
  • Figure 12 shows the results of confirming the difference in CAR expression according to the linker length between scFvs targeting EGFRvII in EGFRvIII CAR-T secreting EphA2 T cell engager, the expression level of CAR in each experimental group (A), and CAR expression This is the result of confirming the MFI (Mean Fluorescence Intensity) value (B) of these cells after isolating only those cells.
  • Figure 13 shows the results of confirming the growth of CAR-T cells and the concentration of secreted EphA2 T cell engager in the culture medium according to the linker length between scFvs targeting EGFRvII in EGFRvIII CAR-T secreting EphA2 T cell engager.
  • Figures 14 and 15 show cells transduced with EGFRvIII CAR lentivirus containing six types of scFv (430, L1A, H2C, L2, L3A, or L3B scFv) targeting EGFRvIII, which secrete EphA2 T cell engager. This is the result of confirming the degree of activation by cell lines expressing each target antigen.
  • scFv 430, L1A, H2C, L2, L3A, or L3B scFv
  • Figure 16 shows the K562-EGFRvIII cell line (B), in which the EGFRvIII gene was introduced into the K562 cell line (A), which does not express EGFRvIII and EphA2, and the antigen introduced in the K562-EGFRvIII/EphA2 cell line (C), in which the EphA2 gene was introduced.
  • the expression of was confirmed through FACS staining, and is a result for the production of target cells used in the analysis of FIGS. 14 and 15 above.
  • Figure 17 shows the results of confirming CAR expression of EGFRvIII CAR-T cells containing various scFvs targeting EGFRvIII and EGFRvIII CAR-T cells containing the same scFv and secreting the EphA2 T cell engager.
  • Figures 18 to 20 show the results of monitoring the target cell killing activity of EGFRvIII CAR-T cells containing various scFvs targeting EGFRvIII and EGFRvIII CAR-T cells containing the same scFv and secreting EphA2 T cell engager for 46 hours. am.
  • Figure 21 shows the injection of EGFRvIII CAR-T cells containing 430 SL (short linker) scFv or L1A SL scFv and EGFRvIII CAR-T cells containing L1A SL scFv secreting EphA2 T cell engager into a glioblastoma animal model. , This is the result of confirming the degree of cancer progression over time.
  • Figure 22 shows the results confirming the anticancer effect of EGFRvIII CAR-T cells containing 430 SL scFv or L1A SL scFv and EGFRvIII CAR-T cells containing L1A SL scFv secreting EphA2 T cell engager in a glioblastoma animal model. , This is the result of comparing the size of the cancer by measuring the photon value of each experimental group.
  • Figure 23 shows the body weight of the glioblastoma animal model after injecting EGFRvIII CAR-T cells containing 430 SL scFv or L1A SL scFv and EGFRvIII CAR-T cells containing L1A SL scFv secreting the EphA2 T cell engager. This is the result of confirming the impact.
  • the present invention is a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence encoding a mutant epidermal growth factor receptor (EGFR)-specific chimeric antigen receptor (CAR) and EphA2 T cell engager,
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • CAR chimeric antigen receptor
  • the nucleic acid sequence encoding the EphA2 T cell engager is an scFv that binds to EphA2 (ephrin type-A receptor 2) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 87; and a nucleic acid sequence encoding a scFv that binds to CD3 and includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88,
  • the nucleic acid sequence encoding the mutant EGFR-specific chimeric antigen receptor provides a polynucleotide characterized in that it comprises a nucleic acid sequence encoding a single chain variable fragment (scFv) selected from the following group:
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 1, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 2, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 3, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 4, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 5.
  • a single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 6;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 11, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 12, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 14, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 15.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 16;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 21, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 22, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 23, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 24, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 25.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 26;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 31, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 32, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 33, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 34, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 35.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 36;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 41, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 42, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 43, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 44, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 45.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 46;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 51, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 52, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 53, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 54, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 55.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 56.
  • the present invention specifically targets EGFRvIII, a mutant EGFR, a cancer antigen specifically expressed in solid tumors, and the EGFRvIII has accession number: NM_001346941.1.
  • CAR-T expressing the polynucleotide of the present invention can specifically target EGFRvIII and EphA2 (EPH receptor A2) at the same time.
  • EphA2 is characterized by accession number: NM_001329090.2.
  • the T cell engager is a double antibody in which two scFvs are connected by a linker.
  • One scFv recognizes a cancer antigen (EphA2 antigen in the present invention), and the other scFv recognizes CD3 of T cells. This allows the T cells to kill cancer cells by connecting the two cells in a close distance.
  • the polynucleotide of the present invention includes a nucleic acid sequence encoding an EphA2 T cell engager, and the EphA2 T cell engager may include a target cell targeting site and a T cell activation site. More specifically, the EphA2 T cell engager of the present invention includes an scFv that binds to EphA2 (ephrin type-A receptor 2) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 87; and an scFv binding to CD3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88, and can be secreted extracellularly or administered in combination to enhance the activity of CAR-T cells targeting EGFRvIII.
  • EphA2 T cell engager of the present invention includes an scFv that binds to EphA2 (ephrin type-A receptor 2) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 87; and an scFv binding to CD3 containing the amino acid sequence shown in SEQ
  • CAR-T expressing the polynucleotide of the present invention secretes EphA2 T cell engager, and CAR-T targeting EGFRvIII (EGFRvIII CAR-T secreting EphA2 T cell engager, EphA2 T cell engager secreting EGFRvIII CAR- T) means.
  • the a) single chain variable fragment (scFv) is characterized by comprising a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 7 and a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 8.
  • the light chain variable region of a) single chain variable fragment (scFv) may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • the heavy chain variable region may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the b) single chain variable fragment (scFv) is characterized by comprising a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 17 and a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 18.
  • the light chain variable region of the b) single chain variable fragment (scFv) may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19
  • the heavy chain variable region may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20.
  • the c) single chain variable fragment (scFv) is characterized by comprising a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 27 and a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 28.
  • the light chain variable region of the c) single chain variable fragment (scFv) may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29, and the heavy chain variable region may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 30.
  • the d) single chain variable fragment (scFv) is characterized by comprising a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 37 and a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 38.
  • the light chain variable region of the d) single chain variable fragment (scFv) may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39
  • the heavy chain variable region may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 40.
  • the e) single chain variable fragment (scFv) is characterized by comprising a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 47 and a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 48.
  • the light chain variable region of the e) single chain variable fragment (scFv) may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 49
  • the heavy chain variable region may be encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50.
  • the f) single chain variable fragment (scFv) is characterized by comprising a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 57 and a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 58.
  • the light chain variable region of f) single chain variable fragment (scFv) may be encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 59
  • the heavy chain variable region may be encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 60.
  • the light chain variable region and the heavy chain variable region of the single chain variable fragment (scFv) may be connected by a (GGGGS)m linker, where m is 1 to 10.
  • m may be 1 to 5, and more preferably, m of the linker may be 1 or 3, and may include an amino acid sequence represented by any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 62. .
  • the mutant EGFR-specific chimeric antigen receptor is a light chain variable region and a heavy chain variable region amino acids linked by a linker comprising an amino acid sequence represented by any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 62.
  • amino acid represented by any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, and SEQ ID NO: 85 The sequence was synthesized by mutating some of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 63 or SEQ ID NO: 65.
  • the amino acid sequence of the scFv binding to the mutant EGFR containing the LL (long linker) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 61 is as follows: SEQ ID NO: 67 (mutation positions: p.E181K and p.T221I, L1A LL ), SEQ ID NO: 71 (mutation position: p.V97L and p.E181V, designated L2 LL), SEQ ID NO: 75 (mutation position: p.L225P, designated L3A LL), SEQ ID NO: 79 (mutation position: p .D94E, p.V97I and p.E181K, designated L3B LL) or SEQ ID NO: 83 (mutation location: p.E181K and p.S187L, designated H2C LL).
  • amino acid sequence of scFv that binds to mutant EGFR containing SL (short linker) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62 is as follows: SEQ ID NO: 69 (mutation positions: p.E171K and p.T211I, L1A SL), SEQ ID NO: 73 (mutation position: p.V97L and p.E171V, designated L2 SL), SEQ ID NO: 77 (mutation position: p.L215P, designated L3A SL), SEQ ID NO: 81 (mutation position: p.D94E, p.V97I and p.E171K, designated L3B SL) or SEQ ID NO: 85 (mutation location: p.E171K and p.S177L, designated H2C SL).
  • the single-chain variable fragment (scFv) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 63 is encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 64;
  • the single chain variable fragment (scFv) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 65 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 66;
  • the single chain variable fragment (scFv) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 67 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 68;
  • the single chain variable fragment (scFv) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 69 is encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 70;
  • the single chain variable fragment (scFv) containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71 is encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 72;
  • the single chain variable fragment (scFv) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 73 is encoded by the base
  • the scFv binding to EphA2 (ephrin type-A receptor 2) containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 87 and the scFv binding to CD3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88 are characterized in that they are connected by a linker. do.
  • the linker may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 62.
  • the nucleic acid sequence encoding the chimeric antigen receptor specific for the mutant EGFR, the nucleic acid sequence encoding the scFv binding to EphA2, and the scFv binding to CD3 are sequentially linked.
  • SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: No. 58, SEQ ID No. 63, Seq. it is clear to those skilled in the art that any one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 87 and SEQ ID NO: 88 will be limited to including mutations in the amino acid sequence that exhibit equivalent biological activity.
  • amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc.
  • Analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substitutions shows that arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
  • the hydrophobic index of the amino acid may be considered.
  • Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); Cysteine/Cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in imparting interactive biological functions to proteins or peptides. It is a known fact that similar biological activity can be maintained only when substituted with an amino acid having a similar hydrophobic index.
  • substitution is made between amino acids showing a difference in the hydrophobicity index, preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); Asphaltate (+3.0 ⁇ 1); glutamate (+3.0 ⁇ 1); serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); threonine (-0.4); Proline (-0.5 ⁇ 1); Alanine (-0.5); histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).
  • substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophilicity value, preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • Amino acid exchanges in proteins or peptides that do not overall alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most common exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly.
  • SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 47 of the present invention
  • SEQ ID NO: 48 SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO:
  • Any one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, and SEQ ID NO: 88 are interpreted to also include sequences showing substantial identity with the sequences listed in the sequence list.
  • amino acid sequence represented by any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 62 may also include mutations in the amino acid sequence that exhibit equivalent biological activity for the same reason as above.
  • the present invention relates to SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 and SEQ ID NO: 86 It may contain one or more base sequences and functional equivalents.
  • the “functional equivalent” refers to SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, Any one or more base sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, and SEQ ID NO: 86, and at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, Even more preferably, those having a sequence homology of 95% or more include SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 50 refers to a polynucleotide that exhibits substantially the same physiological activity as the polynucleotide represented by one or more base sequences selected from the group consisting of No. 84 and SEQ ID No. 86.
  • the “% sequence homology” for a polynucleotide is determined by comparing a comparison region with two optimally aligned sequences, where a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (additions or deletions) for the optimal alignment of the two sequences. may contain additions or deletions (i.e. gaps) compared to those that do not contain .
  • nucleic acid sequence encoding the mutant EGFR-specific chimeric antigen receptor of the present invention may further include a nucleic acid sequence encoding one or more types selected from the group consisting of a signal peptide, a stem domain, a transmembrane domain, and an intracellular signaling domain. there is.
  • polynucleotide may further include a self-cleavage domain.
  • the nucleic acid sequence encoding the mutant EGFR-specific chimeric antigen receptor, the nucleic acid sequence encoding the self-cleavage domain, and the nucleic acid sequence encoding the EphA2 T cell engager may be sequentially linked.
  • the signal peptide serves to send the nascent protein to the endoplasmic reticulum
  • any polypeptide known to have the same or similar function as the above can be used without limitation regardless of whether it is from a natural or synthetic source. It is not limited thereto, but may be one or more selected from the group consisting of CD8, CD28, GM-CSF, CD4, and CD137. In the present invention, a signal peptide derived from CD8 was used.
  • the term “stem domain” refers to any polypeptide that functions to link the transmembrane domain to the scFv of the present invention. If the polypeptide is known to have the same or similar function as the above, it may be from a natural or synthetic source. It can be used without limitation regardless of origin. It is not limited thereto, but may be one selected from the group consisting of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28, and CD8 hinge. One embodiment of the present invention In the example, the CD8 hinge domain was used.
  • transmembrane domain refers to any polypeptide that allows the CAR according to the present invention to be expressed on the surface membrane of a cell.
  • Suitable transmembrane domains for CARs disclosed herein include (a) the ability to be expressed on the surface of cells, such as immune cells, such as, but not limited to, lymphoid cells or natural killer (NK) cells, and (b) has the ability to interact with the scFv and intracellular signaling domains according to the invention to direct the cellular response of immune cells against predefined target cells.
  • the transmembrane domain can also be used without limitation, regardless of whether it is from a natural or synthetic source, as long as it is a polypeptide known to have the same or similar function as the above.
  • Fc ⁇ R Fc ⁇ R
  • ICOS CD278
  • 4-1BB CD137
  • OX40 CD134
  • CD27, CD28, IL-2R ⁇ , CD40, DAP10 MHC class I molecule, TNF receptor protein, Immunoglobulin-like protein , cytokine receptor, integrin, SLAM protein, activated NK cell receptor, BTLA, Toll ligand receptor, CD2, CD7, CD30, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a , LFA-1, ITGAM, CD103,
  • intracellular signaling domain refers to the portion of a protein that transmits effector signal function signals and instructs cells to perform specialized functions. This means that after the scFv according to the present invention binds to the target, It is responsible for intracellular signaling and causes T cell activation.Intracellular signaling domain.
  • any polypeptide known to have the same or similar function as the above can be used without limitation, regardless of whether it is from a natural or synthetic source.
  • the intracellular transduction domains include CD3 ⁇ , Fc ⁇ R, ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD27, CD28, IL-2R ⁇ , IL-15R- ⁇ , MyD88, DAP10 , DAP12, MHC class I molecule, TNF receptor protein, Immunoglobulin-like protein, cytokine receptor, integrin, SLAM protein, activated NK cell receptor, BTLA, Toll ligand receptor, CD2, CD7, CD30, CD40, CDS, ICAM-1 , B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , IL2R ⁇ , IL7R ⁇ , ITGA4, VLA1, CD49a, IA4 , CD49D, ITGA6,
  • the term “self-cleavage domain” refers to a cleavage site for producing multiple proteins from the same transcript.
  • the self-cleavage domain includes EGFRvIII CAR (signal peptide, scFv binding to EGFRvIII, stem domain, transmembrane domain, intracellular signaling domain) and EphA2 T cell engager (scFv binding to EphA2, linker, CD3 scFv that binds to) to express each protein.
  • the self-cleavage domain is characterized in that it is a 2A peptide, and the 2A peptide is Thoseaasigna virus 2A (T2A), porcine teschovirus-1 2A (P2A), and equine rhinitis A virus (rhinitis A). virus) 2A (E2A) and foot-and-mouth disease virus (F2A), but is not limited thereto.
  • T2A was used.
  • the polynucleotide of the present invention may further include a tag peptide for confirming or purifying the expression of the scFv targeting EGFRvIII, the scFv binding to EphA2, and the scFv binding to CD3 according to the present invention.
  • a tag peptide for confirming or purifying the expression of the scFv targeting EGFRvIII, the scFv binding to EphA2, and the scFv binding to CD3 according to the present invention.
  • Any known tag peptide can be used without limitation, and in one embodiment of the present invention, Flag peptide (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 89), HIS peptide (HHHHHH) (SEQ ID NO: 90), Myc peptide (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 91) and HiBiT peptide (VSGWRLFKKIS) (SEQ ID NO: 92) were used.
  • the present invention provides a vector containing the polynucleotide according to the present invention.
  • the present invention provides a method for producing a CAR-T that secretes an EphA2 T cell engager and targets an EGFR mutation, comprising the step of infecting a host cell with a vector containing the polynucleotide according to the present invention. provides.
  • the "vector” refers to a gene construct containing the nucleotide sequence of a gene operably linked to a suitable regulatory sequence to enable expression of the target gene in a suitable host, wherein the regulatory sequence initiates transcription. It may include a promoter, an optional operator sequence to control such transcription, and sequences to control termination of transcription and translation.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate within cells, and any vector known in the art can be used, for example, plasmid, cosmid, phage particle, or viral vector.
  • the "recombinant vector” is used as an expression vector for a target protein that can express the target protein with high efficiency in an appropriate host cell when the gene encoding the target protein to be expressed is operably linked.
  • the recombinant vector may be capable of expression in host cells.
  • the host cell may preferably be a eukaryotic cell, and expression control sequences such as promoters, terminators, enhancers, etc., sequences for membrane targeting or secretion, etc. are appropriately selected depending on the type of host cell. and can be combined in various ways depending on the purpose.
  • the “infection” may mean “transformation.”
  • transformation means introducing DNA into a host so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or through completion of chromosomal integration.
  • Host cells of the invention may be prokaryotic or eukaryotic cells. Additionally, hosts with high efficiency of introducing DNA and high expression efficiency of introduced DNA are usually used. Known eukaryotic and prokaryotic hosts such as Escherichia coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi and yeast, insect cells such as Spodoptera frugiperda (SF9), animal cells such as CHO and mouse cells, COS 1, COS 7, African green monkey cells such as BSC 1, BSC 40 and BMT 10, and tissue cultured human cells are examples of host cells that can be used. In one embodiment of the present invention, 293T cells were used as host cells. Of course, it should be understood that not all vectors and expression control sequences are equally functional in expressing the DNA sequence of the present invention. Likewise, not all hosts perform equally well for the same expression system.
  • those skilled in the art can make an appropriate selection among various vectors, expression control sequences, and hosts without excessive experimental burden and without departing from the scope of the present invention.
  • the host when choosing a vector, the host must be considered, because the vector must replicate within it.
  • the copy number of the vector, the ability to control copy number and the expression of other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, should also be considered.
  • various factors must be considered. For example, the relative strength of the sequences, their controllability and their compatibility with the DNA sequences of the invention should be considered, especially in relation to possible secondary structures.
  • the single cell host must be prepared by the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the present invention, the secretion characteristics, the ability to correctly fold the protein, the culture and fermentation requirements, and the product encoded by the DNA sequence of the present invention from the host. It must be selected taking into account factors such as ease of purification. Within these parameters, one skilled in the art can select various vector/expression control sequence/host combinations capable of expressing the DNA sequence of the present invention in fermentation or large-scale animal culture.
  • the present invention provides transformed T cells expressing the polynucleotide according to the present invention.
  • the T cells are characterized by secreting EphA2 T cell engager and targeting EGFR mutations.
  • the T cells may be alpha beta T cells, gamma delta T cells, or NKT cells.
  • the T cells may be allogeneic T cells, autologous T cells, engineered autologous T cells (eACT), or tumor-infiltrating lymphocytes (TIL).
  • EGFRvIII CAR-T cells secreting the EphA2 T cell engager of the present invention have excellent killing ability by specifically reacting to EphA2 and EGFRvIII, respectively.
  • its effect was significantly superior to that of CAR-T cells targeting only EGFRvIII, and it also showed a significantly better therapeutic effect in animal models that caused brain cancer.
  • the present invention provides a polynucleotide according to the present invention; Alternatively, it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising transformed T cells according to the present invention.
  • the present invention provides a) a light chain variable region comprising the light chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 1, the light chain CDR2 represented by SEQ ID NO: 2, and the light chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 3, the heavy chain CDR1 represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: A single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region including the heavy chain CDR2 represented by 5 and the heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 6;
  • scFv single chain variable fragment
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 11, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 12, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 14, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 15.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 16;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 21, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 22, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 23, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 24, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 25.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 26;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 31, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 32, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 33, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 34, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 35.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 36;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 41, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 42, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 43, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 44, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 45.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 46;
  • receptor transformed T cells expressing a specific chimeric antigen receptor (CAR); and
  • EphA2 ephrin type-A receptor 2
  • CD3 containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, including an EphA2 T cell engager.
  • the cancer is characterized as a solid cancer, and the solid cancer is an abnormal tissue mass that does not contain a cyst or fluid area and may be malignant or benign. Preferably, it is a solid tumor expressing EGFRvIII and/or EphA2. More preferably, the cancer may be one or more types selected from the group consisting of brain cancer, breast cancer, lung cancer, squamous cell cancer, stomach cancer, colon cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, ovarian cancer, bladder cancer, and anal cancer, but is limited thereto. That is not the case.
  • carcinomas expressing EGFRvIII and/or EphA2 may become more diverse than currently known in the future.
  • carcinomas that do not express EGFRvIII and/or EphA2 they are engineered to express EGFRvIII and/or EphA2 using known technologies (Ex, viral transporters) that enable the expression of EGFRvIII and/or EphA2, and then treated with the polypeptide according to the present invention.
  • Nucleotides, transformed T cells according to the present invention or transformed T cells expressing a mutant EGFR-specific CAR and EphA2 T cell engager can be applied.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of a capsule, tablet, granule, injection, ointment, powder, or beverage, and the pharmaceutical composition may be intended for human subjects.
  • the pharmaceutical composition is not limited to these, but can be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, and aqueous suspensions, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods.
  • the composition of the present invention may preferably be formulated for intravenous administration.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, colorants, flavorings, etc. for oral administration.
  • buffers, preservatives, and analgesics can be used.
  • Topics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, etc. can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives, etc. can be used.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared in various ways by mixing it with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration it can be manufactured in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be manufactured in the form of unit dosage ampoules or multiple dosage forms. there is.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil may be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives, etc. may be additionally included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited to these, but is oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, and topical. , sublingual or rectal.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intra-articular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can also be administered in the form of a suppository for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is influenced by various factors, including the activity of the specific active ingredient used, age, body weight, general health, gender, diet, administration time, administration route, excretion rate, drug formulation, and the severity of the specific disease to be prevented or treated.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, body weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but may be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the exact amount of the composition of the present invention to be administered can be determined by the doctor, and the doctor may determine the age of the patient (subject). , taking into account individual differences in body weight, tumor size, extent of infection or metastasis, and disability.
  • the pharmaceutical composition comprising the transformed T cells of the present invention is administered at a dose of 10 4 to 10 9 cells/kg of body weight, preferably 10 5 to 10 6 cells/kg of body weight (within this range). inclusive of all integer values).
  • the pharmaceutical composition comprising the transformed T cells of the present invention can be administered multiple times in such doses and can be administered using injection techniques well known in immunotherapy.
  • the optimal dosage and treatment regimen for a particular patient can be readily determined by those skilled in the medical arts through monitoring the patient's disease signs and adjusting the therapy accordingly.
  • Administering the composition to a subject can be performed in any convenient manner, including nebulization, injection, swallowing, infusion, implantation, or implantation.
  • the compositions described herein can be administered to a patient by subcutaneous, intradermal, intratumoral, intranodal, intraspinal, intramuscular, intravenous (i.v.) injection or intraperitoneally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient by intradermal or subcutaneous injection, preferably i.v. It can be administered by injection.
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be injected directly into a tumor, lymph node or site of infection.
  • the present invention provides a polynucleotide according to the present invention; or administering the transformed T cells according to the present invention to an individual.
  • the present invention provides a) a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 1, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 2, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 3, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: A single chain variable fragment (scFv) comprising a heavy chain variable region including the heavy chain CDR2 represented by 5 and the heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 6;
  • scFv single chain variable fragment
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 11, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 12, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 13, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 14, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 15.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 16;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 21, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 22, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 23, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 24, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 25.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 26;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 31, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 32, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 33, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 34, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 35.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 36;
  • a light chain variable region comprising the light chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 41, the light chain CDR2 shown in SEQ ID NO: 42, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 43, the heavy chain CDR1 shown in SEQ ID NO: 44, and the light chain CDR3 shown in SEQ ID NO: 45.
  • An scFv comprising a heavy chain variable region including heavy chain CDR2 and heavy chain CDR3 represented by SEQ ID NO: 46;
  • receptor transformed T cells expressing a specific chimeric antigen receptor (CAR); and
  • EphA2 Ephrin type-A receptor 2
  • EphA2 T cell engager comprising an scFv binding to CD3 and containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 88.
  • the subject is preferably a mammal, including a human, and includes patients in need of cancer treatment, patients who are being treated, patients who have received treatment, and patients in need of treatment, and who have undergone surgical surgery for cancer treatment. Patients who underwent surgery may also be included.
  • the cancer is characterized as a solid cancer, and the solid cancer is an abnormal tissue mass that does not contain a cyst or fluid area and may be malignant or benign. Preferably, it is a solid tumor expressing EGFRvIII and/or EphA2. More preferably, the cancer may be one or more types selected from the group consisting of brain cancer, breast cancer, lung cancer, squamous cell cancer, stomach cancer, colon cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, ovarian cancer, bladder cancer, and anal cancer, but is limited thereto. That is not the case.
  • the cells activated and expanded using the methods described herein or other methods known in the art to expand the transformed T cells of the invention to therapeutic levels are administered to a patient using any of the following methods: It may be administered in combination (e.g., simultaneously or subsequently) with a related treatment form.
  • the polynucleotide according to the present invention, the transformed T cell according to the present invention, the transformed T cell expressing a mutant EGFR-specific CAR, and the EphA2 T cell engager or the pharmaceutical composition of the present invention are used as chemotherapy, radiation, and anticancer agents. It can be used in combination with treatment methods for treating solid tumors, such as immunotherapy.
  • a gene sequence was first synthesized in which an scFv capable of binding to the EphA2 antigen and an scFv capable of binding to the CD3 antigen were connected by a linker. This was cloned into the pcDNA3.3 vector and used as an expression vector.
  • a gene sequence was synthesized in which an scFv that can bind to the CD19 antigen instead of the EphA2 antigen and an scFv that can bind to the CD3 antigen were connected by a linker. As described above, it was cloned into the pcDNA3.3 vector.
  • HIS peptide HHHHHH
  • Myc peptide EQKLISEEDL
  • SEQ ID NO: 91 HIS peptide
  • His peptide and HiBiT peptide SEQ ID NO: 92
  • GSSGGSSG SEQ ID NO: 93
  • the two expression vectors for producing the EphA2 T cell engager and CD19 T cell engager prepared in Example 1 were transfected into Expi293F cells by a method known in the art. After 5-7 days, the culture medium was collected and purified using a Ni-NTA affinity column. Afterwards, the specific expression of these proteins was confirmed by performing western blot according to a method known in the art using an anti-His antibody (purchased from Biolegend), as shown in A in Figure 1. .
  • NFAT Nuclear factor of activated T-cells reporter
  • luc Proliferative cascade
  • BPS Bioscience NFAT reporter
  • luciferase activity increases when the NFAT transcription factor is activated by an external stimulus. Therefore, it can be quantified by measuring luminescence (RLU) after adding the luciferase substrate.
  • NFAT reporter (luc)-Jurkat cells effector cells, 2 ⁇ 10 4 cells
  • U-87MG ATCC, target cells, 2 ⁇ 10 4 cells
  • EphA2 T cell engager quantified using His tag ELISA (Genescript) was added at various concentrations and cultured for 4 hours.
  • luciferase substrate Promega was added and the luciferase activity of NFAT reporter (luc)-Jurkat cells was measured.
  • T cells effector cells, 1 ⁇ 10 4 cells
  • 293 cells 293 cells overexpressing the EphA2 antigen
  • various concentrations of EphA2 T cell engager were mixed and cultured for 24 hours.
  • the T cell killing ability mediated by the EphA2 T cell engager was investigated by measuring the luciferase activity of the target cells.
  • 293 cells overexpressing the EphA2 antigen were established as follows.
  • the EphA2 gene expression vector purchased from Sino Biological was introduced into 293 cells purchased from ATCC using the SF cell line Afterwards, the cells were subcultured using medium supplemented with 300 ⁇ g/mL of hygromycin, and only cells that highly expressed the EphA2 antigen were selected using FACS.
  • the 293-EphA2 cell line established in this way was transduced with a lentivirus containing a luciferase gene to express luciferase and used for experiments.
  • the specific target cell killing ability by the EphA2 T cell engager was calculated according to Equation 1 below.
  • Target cell killing ability ⁇ (RLU (relatively light unit) value when co-culturing Target cells + T cells) - (RLU value when co-culturing Target cells + T cells + Engager) ⁇ /(RLU when co-culturing Target cells + T cells value)
  • the EphA2 T cell engager was able to kill target cells in proportion to its concentration.
  • CD19 T cell engager a negative control, it was unable to kill target cells regardless of concentration.
  • GGGGS is composed of GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 61) repeated three times
  • SL short linker
  • an scFv with some amino acid sequences mutated was also produced based on the wild type scFv sequence (SEQ ID NO: 63 (named 430 LL) and SEQ ID NO: 65 (named 430 SL)).
  • SEQ ID NO: 67 mutant positions: p.E181K and p.T221I, named L1A LL
  • SEQ ID NO: 71 mutant positions: p.V97L and p.E181V, (named L2 LL)
  • SEQ ID NO: 75 mutant position: p.L225P, designated L3A LL
  • SEQ ID NO: 79 mutant position: p.D94E, p.V97I and p.E181K, designated L3B LL
  • SEQ ID NO: 83 mutantation positions: p.E181K and p.S187L, designated H2C LL.
  • SEQ ID NO: 69 mutant positions: p.E171K and p.T211I, named L1A SL
  • SEQ ID NO: 73 mutant positions: p.V97L and p.E171V, L2
  • SEQ ID NO. 77 mutant position: p.L215P, designated L3A SL
  • SEQ ID NO. 81 mutant position: p.D94E, p.V97I and p.E171K, designated L3B SL
  • SEQ ID NO. 85 Mutation locations: p.E171K and p.S177L, designated H2C SL.
  • a CAR structure was produced to produce CAR-T that can kill cancer cells by targeting EGFRvIII.
  • CD8 signal sequence signal sequence, signal seg
  • hinge hinge
  • transmembrane domain TM
  • TM transmembrane domain
  • the lentivector prepared in Example 3 was transfected into Lenti- It was produced by transfection.
  • the produced lentivirus was concentrated, the titer was measured, and then stored at -80°C until use.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • cells (293-EGFRvIII/EphA2) overexpressing the EphA2 gene were established in 293 cells (293-EGFRvIII, purchased from Cether) overexpressing the EGFRvIII antigen, and luciferase was introduced into these cells to kill target cells. It was possible to measure by luminescence.
  • the EphA2 gene expression vector for overexpressing the EphA2 gene in 293-EGFRvIII cells was purchased from Sino Biological, and this plasmid was introduced into 293-EGFRvIII cells with a Lonza 4D Nucleofector device using the SF cell line Cells expressing EphA2 were selected by subculturing them in medium supplemented with 300 ⁇ g/mL of hygromycin.
  • the 293-EGFRvIII/EphA2 cell line established in this way was transduced with a lentivirus containing a luciferase gene to express luciferase and used for experiments.
  • EGFRvIII CAR-T cells effector cells, 2 ⁇ 10 4 cells
  • target cells luciferase expression, 293/EGFRvIII/ EphA2, 2 ⁇ 10 4 cells
  • target cells luciferase expression, 293/EGFRvIII/ EphA2, 2 ⁇ 10 4 cells
  • the killing activity of CAR-T cells and T cell engagers was confirmed by measuring the luciferase activity of the target cells, and is shown in A in Figure 3.
  • the co-culture medium was collected and the concentration of interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) secreted when T cells were activated was measured using an ELISA kit (Biolegend), and the results are shown in B in Figure 3.
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • Example 5 it was confirmed that a synergistic effect occurred in T cell activation or target cell killing when EphA2 T cell engager and EGFRvIII CAR-T were treated together at a suboptimum concentration, so the EphA2 T cell engager was secreted. EGFRvIII CAR-T was produced.
  • T2A EGRGSLL TCGDVEENPGP
  • EphA2 T of Example 1 are added to the C-terminus (C-terminus of CD3 ⁇ ) of the EGFRvIII CAR construct in A in FIG. 4.
  • a gene fused to the cell engager sequence was designed and synthesized. Lentivirus was produced using the gene in the same manner as in Example 3.
  • EphA2 T cell engager secreting EGFRvIII CAR-T cells were produced in the same manner as in Example 4.
  • EGFRvIII CAR-T cells secreting CD19 T cell engager were produced using the same method as CD19 T cell engager.
  • EGFRvIII CAR-T cells secreting the EphA2 T cell engager according to the present invention are activated by specifically reacting to each target when they encounter the target cells of the T cell engager and the target cells of CAR-T.
  • EGFRvIII CAR-T cells secreting EphA2 T cell engager were stained with anti-Flag-PE or anti-Flag-APC (L5, Biolegend) to confirm the level of CAR expressed on the surface, and then Tag-it violet cell proliferation. and labeled with Violet cell proliferation and tracking dye (Biolegend).
  • CAR-T In the case of CAR-T, it is quickly activated by target cells and kills the target cells, whereas in the case of T cell engager, it was judged that it takes time to reach a certain concentration to be secreted and effective. Therefore, it was inferred that the ability to kill target cells was delayed compared to CAR-T. Therefore, although there is a difference in the time required for CAR-T and T cell engager to act, EGFRvIII CAR-T cells secreting the EphA2 T cell engager according to the present invention can be activated by reacting specifically with EphA2 and EGFRvIII. It was confirmed that target cells can be killed.
  • CAR-T cells targeting EGFRvIII according to the present invention which had confirmed target cell killing ability in vitro, was confirmed in vivo.
  • an orthotopic animal model was first established using a glioblastoma cell line.
  • a glioblastoma cell line U-87MG cells, a cell line widely used in glioblastoma research, were used.
  • U-87MG cells were stained with anti-EphA2 antibody (371805, R&D Systems) and secondary antibody, anti-mouse IgG-APC (poly 4053, biolegend), and expressed on the surface.
  • the level of antigen was confirmed by FACS.
  • U-87MG-Luc2 cell line in which firefly luciferase was introduced, was obtained from ATCC, and the EGFRvIII gene was introduced into this cell line to establish a stable cell line (hereinafter referred to as U87-EGFRvIII).
  • the A19002A antibody was able to well detect two proteins of different sizes, EGFR and EGFRvIII, and the L8A4 antibody showed that it specifically recognized only the EGFRvIII protein.
  • the U87-EGFRvIII cell line was detected at the expected size by both antibodies, confirming that EGFRvIII was expressed (A in Figure 9, lane 3).
  • the cell line was cultured and proliferated, collected, 0.2 It was injected intracranially (IC). After several days, 150 mg/kg of D-Luciferin (PerkinElmer), a luciferase substrate, was injected into the mouse abdominal cavity, and the animal was photographed using an IVIS (In vivo optical imaging system) device. The growth of cancer was monitored by measuring the degree of luminescence.
  • IC intracranially
  • the size of the cancer present in each animal model was quantified by photon value using an IVIS device. According to the quantified photon values, animal models were randomly assigned, 5 animals per group. CAR-T cells in culture were counted and stained with anti-Flag-PE (L5, Biolegend) to confirm the level of CAR expression. Depending on the CAR expression rate, CAR + cells were collected at 0.1 ⁇ 10 6 or 0.5 ⁇ 10 6 cells per animal. After washing, it was suspended in 100 ⁇ L of 5% HSA and injected into animals by IV.
  • EGFRvIII CAR-T cells secreting CD19 T cell engager were injected as a control group. Afterwards, changes in cancer size were monitored by measuring the photon value of each animal model using an IVIS device every week. Additionally, the animal's body weight was measured weekly.
  • Engager-secreting CAR-T cells (LL & SL) that secrete the same EphA2 T cell engager but have different linker lengths of the scFv that recognizes EGFRvIII, differences in efficacy according to linker length were confirmed.
  • HiBiT was tagged instead of the existing myc so that even a very small amount of engager could be detected.
  • Flag positive cells were isolated using MojoSort Human anti-APC nanobeads (Biolegend). As a result, as shown in B in FIG. 12, CAR+ cells after separation were more than 97%. In addition, as a result of checking the MFI of the above cells, it was confirmed that 430SL CAR-T cells secreting EphA2 T cell engager were higher than 430LL CAR-T cells secreting EphA2 T cell engager (1307 vs. 960).
  • scFv containing SL was used.
  • lentivirus was produced in the same manner as described in Example 4 above, and NFAT reporter (luc)-Jurkat cells were infected using this to induce CAR expression.
  • NFAT reporter (luc)-Jurkat cells in which CAR expression was confirmed by staining with anti-Flag-APC (L5, Biolegend), were used as effector cells (2 ⁇ 10 4 cells), and various ratios of target cells (K562 ( Chronic myeloid leukemia cell lines), K562-EGFRvIII, K562-EGFRvIII/EphA2) were mixed and co-cultured for 4 hours.
  • the luciferase substrate Promega was added to measure the luciferase activity of the effector cells to confirm the activity of CAR and T cell engager for each antigen.
  • NFAT reporter (luc)-Jurkat cells which did not express CAR, were used as effector cells and reacted with target cells expressing the target antigen, luciferase activity was not confirmed. In general, it was confirmed that NFAT reporter (luc)-Jurkat cells with high CAR expression had high luciferase activity.
  • K562 cells used as target cells were purchased from ATCC.
  • K562 cells were transduced using a lentivirus simultaneously expressing EGFRvIII antigen and GFP, and only cells expressing GFP were selected by FACS.
  • the K562-EGFRvIII cell line was established by subculturing the cells in medium supplemented with 2 ⁇ g/mL of blasticidin to select cells expressing EGFRvIII.
  • EphA2 gene expression vector (purchased from Sino Biological) was introduced into the K562-EGFRvIII cell line established above using the SF cell line It was established by subculturing using the added medium and selecting cells expressing EphA2.
  • anti-EGFRvIII L8A4, Absolute Antibody
  • anti-EphA2 371805, R & D Systems
  • anti-mouse IgG-APC poly 4053, After staining with Biolegend, expression was confirmed by FACS.
  • Example 12 Monitoring target cell killing activity between EGFRvIII CAR-T cells containing various mutant scFvs and EGFRvIII CAR-T cells containing the same scFv and secreting EphA2 T cell engager
  • EGFRvIII CAR-T cells that secrete EphA2 T cell engager and contain various mutant scFvs have better cancer cell killing ability than EGFRvIII CAR-T cells that contain mutant scFv and do not secrete EphA2 T cell engager.
  • CAR expression in these cells was confirmed by staining with anti-Flag-PE (L5, Biolegend) (see Figure 17).
  • CAR-T cells whose expression was confirmed were used as effector cells, and target cells (U87-EGFRvIII, DKMG-EGFRvIII, or 293-EGFRvIII/EphA2) that express antigens EGFRvIII and EphA2 and simultaneously express GFP were used in various ratios. Mixed.
  • target cells U87-EGFRvIII, DKMG-EGFRvIII, or 293-EGFRvIII/EphA2
  • target cells U87-EGFRvIII, DKMG-EGFRvIII, or 293-EGFRvIII/EphA2 that express antigens EGFRvIII and EphA2 and simultaneously express GFP were used in various ratios.
  • target cells U87-EGFRvIII, DKMG-EGFRvIII, or 293-EGFRvIII/EphA2 that express antigens EGFR
  • U87-EGFRvIII, DKMG-EGFRvIII, and 293-EGFRvIII/EphA2 used as target cells U87-EGFRvIII and 293-EGFRvIII/EphA2 were produced in the same manner as described in Examples 5 and 9 above.
  • DKMG-EGFRvIII a DKMG cell line that overexpressed EGFRvIII, was purchased from Cether and used. These target cells were transduced with a lentivirus containing the GFP gene, expressed GFP, and used for experiments.
  • Example 13 Comparison of the effects of EGFRvIII CAR-T cells containing 430 SL scFv or L1A SL scFv and secreting EphA2 T cell engager and EGFRvIII CAR-T cells containing L1A SL scFv in a glioblastoma animal model
  • EGFRvIII CAR-T cells containing 430 LL scFv and EGFRvIII CAR-T cells containing 430 LL scFv and secreting EphA2 T cell engager were used to produce EGFRvIII CAR-T compared to EGFRvIII CAR-T. It was confirmed that the in vivo efficacy of T cells was superior. In particular, in Example 10, it was confirmed that the length of the scFv linker affects the growth of CAR-T cells and also affects the amount of T cell engager secreted by CAR-T. EphA2 T cells containing an scFv with SL The in vivo efficacy of EGFRvIII CAR-T cells secreting engager was confirmed.
  • EGFRvIII CAR-T cells secreting EphA2 T cell engager containing L1A SL scFv were used, which are representative of various EGFRvIII CAR-T cells secreting EphA2 T cell engager.
  • EGFRvIII CAR-T cells containing 430 SL scFv and secreting EphA2 T cell engager and EGFRvIII CAR-T cells containing L1A SL scFv that do not secrete EphA2 T cell engager were used.
  • the size of the cancer present in each animal was quantified by photon value using an IVIS device, and the animal models were randomly assigned to 5 animals per experimental group according to the photon value.
  • CAR-T cells in culture were counted and stained with anti-Flag-PE (L5, Biolegend) to confirm the level of CAR expression.
  • CAR + cells were collected and washed at 0.1 ⁇ 10 6 or 0.05 ⁇ 10 6 cells per animal, then suspended in 100 ⁇ L of 5% HSA and injected into the animal by IV. Afterwards, changes in cancer size were monitored by measuring the photon value of each animal model using an IVIS device every week. Additionally, the body weight of the animal model was measured weekly.
  • the present invention manufactures EGFRvIII CAR-T cells secreting EphA2 T cell engager and then confirms its activity.
  • EGFRvIII CAR-T cells secreting EphA2 T cell engager according to the present invention are EGFRvIII and/or EphA2 cells. Not only did it show specific killing activity against target cells expressing and confirm that its effect was superior to CAR-T cells targeting only EGFRvIII, but it was also confirmed that it showed a significantly superior therapeutic effect in an animal model causing brain cancer. did.

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Abstract

본 발명은 EphA2 T cell engager를 분비하며, 돌연변이 EGFR인 EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T세포에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포는 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 살상 활성을 보이고, 그 효과가 EGFRvIII만 타겟하는 CAR-T세포보다 우수함을 확인하였을 뿐만 아니라, 뇌암을 유발한 동물모델에서의 유의미하게 우수한 치료 효과를 보임을 확인한 바, 이를 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하는, 뇌암을 비롯한 다양한 고형암의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Description

돌연변이 EGFR 및 EPHA2를 동시 타겟하는 키메라 항원 수용체
본 발명은 다양한 암에서 발현되는 돌연변이 EGFR 및 EphA2를 동시 타겟하는 키메라 항원 수용체에 대한 것이다.
암은 세계적으로 높은 사망률을 보이고 있으며, 서구 사회에서는 심혈관 질환 다음으로 가장 일반적인 사망원인이다. 특히, 인구의 고령화와 더불어 환경오염 물질의 급격한 증가, 고지방 식이 섭취의 증가 등 다양한 원인으로 인해 뇌암, 대장암, 유방암, 전립선암 등이 지속적으로 증가 추세에 있다.
특히 고형암 중 뇌암은 예후가 아주 나쁜 암으로 진단 후 생존기간이 평균 14개월이다. 뇌암을 정복하기 위해 지난 30년간 수많은 연구가 진행되었지만 평균 생존기간을 겨우 6개월 연장시켰을 뿐이다. 현재 뇌암의 표준 치료는 수술, 방사선 치료, 화학적 치료지만, 이들 치료법으로 치유될 확률이 매우 낮으며, 심각한 부작용을 야기하는 문제점도 있다.
한편, CAR(Chimeric antigen receptors)를 발현하는 T세포(CAR-T)는 혈액암에서는 높은 항암 효능을 보임으로써 치료제로서 승인을 받았으나, 고형암의 경우 CAR-T의 효능이 미비한 것으로 보고되고 있다. 더욱이 고형암에서의 CAR-T세포 치료제 개발은 암세포 특이적 항원의 부재로 인하여 타겟 항원 선정에 어려움이 있다. 대부분의 경우 고형암세포에 과발현하는 항원을 표적으로 CAR-T세포 치료제가 개발되고 있으나 많은 타겟 항원들이 건강한 조직에 존재하는 정상세포에도 발현하고 있어 CAR-T세포가 정상세포에 존재하는 항원을 공격함으로써 독성을 유발하는 문제점이 존재한다.
또한 고형암의 경우 혈액암과 달리 항원 이질성이 높아 동일 환자의 종양 조직 내에서도 종양 세포간에 항원의 발현 이질성이 존재한다. 특히 교모세포종의 경우 다른 암에 비해 성질이 매우 다양하여 하나의 암항원을 타겟으로 하는 ‘표적 치료’가 거의 불가능하다. 교모세포종의 경우 EGFR의 돌연변이인 EGFRvIII를 타겟하는 EGFRvIII CAR-T를 이용한 임상 1상이 실시된 바 있다. 그 결과 EGFRvIII CAR-T세포의 안전성은 확인하였으나 다른 고형암을 타겟하는 CAR-T와 유사하게 효능에서는 거의 효과를 보이지 못하였을 뿐만 아니라 환자의 암조직을 관찰한 결과 EGFRvIII-음성 이탈 변이를 가진 것이 확인되었다. 따라서 교모세포종에서 CAR-T세포의 높은 치료효과를 기대하기 위해서는 이탈 변이를 방지하고 종양 세포 이질성을 극복하는 것이 무엇보다 중요하다. 따라서 하나 이상의 항원을 동시에 타겟하여 초기에 암을 효과적으로 제거할 수 있는 CAR-T의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 고형암 특이적 암 항원을 발굴하고, 2개의 암 항원을 동시 타겟할 수 있는 CAR-T를 제작하였으며, 이의 타겟 항원을 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 살상 활성 및 암을 유발한 동물 모델에서의 우수한 치료 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 및 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 분비하며 EGFR 돌연변이를 타겟하는 CAR-T의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 형질전환된 T세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 및 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고,
상기 돌연변이 EGFR 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 하기 군에서 선택된 1 종의 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다:
a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 분비하며 EGFR 돌연변이를 타겟하는 CAR-T의 생산 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 형질전환된 T세포를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드; 또는 본 발명에 따른 형질전환된 T세포를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
더불어 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 항원 결합 도메인(scFv)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하는 형질전환된 T세포; 및
서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 포함하는 EphA2 T 세포 인게이저를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드; 또는 본 발명에 따른 형질전환된 T세포를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 항원 결합 도메인(scFv)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하는 형질전환된 T세포; 및
서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 포함하는 EphA2 T 세포 인게이저를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 EphA2 T cell engager를 분비하며, EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T세포는 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 살상 활성을 보이고, 그 효과가 EGFRvIII만 타겟하는 CAR-T세포보다 우수함을 확인하였을 뿐만 아니라, 뇌암을 유발한 동물모델에서의 유의미하게 우수한 치료 효과를 보임을 확인한 바, 이를 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하는, 뇌암을 비롯한 다양한 고형암의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 EphA2 항원에 결합할 수 있는 scFv를 포함하는 T세포 인게이저(T cell engager) 또는 CD19 항원에 결합할 수 있는 scFv를 포함하는 T cell engager의 생산 및 발현 확인(A) 및 EphA2 항원에 대한 T cell engager의 기능을 확인(B 및 C)한 결과이다.
도 2는 EGFRvIII를 타겟하는 scFv를 포함하는 CAR-T의 CAR 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 EphA2 T cell engager와 EGFRvIII CAR-T의 시너지 효과를 확인한 결과로, 6시간 또는 24시간에서의 CAR-T 세포 및 T cell engager의 살상능(A) 및 6시간 또는 24시간에서의 IFN-γ 분비(B)를 확인한 결과이다.
도 4는 EphA2 T cell engager를 분비하며 EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T의 생산을 위한 CAR 구조체의 구조를 나타낸 모식도로, EGFRvIII 타겟 CAR 구조체의 구조(A)와 이를 기반으로 한 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR 구조체의 구조(B)를 나타낸 모식도이다.
도 5는 EphA2 T cell engager를 분비하며 EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T 세포 배양액의 타겟세포에 대한 특이적인 살상능을 확인한 결과이다.
도 6은 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T의 EGFRvIII를 발현하는 세포에 대한 타겟 특이적 활성화 및 살상능을 확인한 결과로, T 세포 증식(A), IFN-γ 분비(B) 및 타겟 세포 살상능을 확인(C)한 결과이다.
도 7은 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T의 EphA2를 발현하는 세포에 대한 타겟 특이적 활성화 및 살상능을 확인한 결과로, T 세포 증식(A), IFN-γ 분비(B) 및 타겟 세포 살상능을 확인(C)한 결과이다.
도 8은 교모세포종을 유발한 동물모델의 제조를 위한 결과로, 교모세포종 유발을 위한 세포의 EphA2 발현 여부를 확인(A), 상기 세포에 EGFRvIII 유전자를 도입한 후, 이의 발현 여부를 확인(B), 상기 세포에 EGFRvIII 유전자를 도입한 후, 이의 루시퍼라아제(Luciferase) 발현을 확인(C)한 결과이다.
도 9는 교모세포종을 유발한 동물모델에 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T를 주사한 후, 각 동물모델의 98일째까지의 암의 진행 및 생존 여부를 확인한 결과이다.
도 10은 교모세포종을 유발한 동물모델에 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T를 주사한 후, 각 동물모델의 광자(photon) 값을 확인하여, 암의 크기를 확인한 결과이다.
도 11은 교모세포종을 유발한 동물모델에 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T를 주사한 후, 각 실험군의 생존율(survival rate) 확인(A) 및 체중(Body weight)을 확인(B)한 결과이다.
도 12는 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T에 있어서, EGFRvII를 타겟하는 scFv 사이의 링커 길이에 따른 CAR 발현 차이를 확인한 결과로, 각 실험군의 CAR의 발현 정도(A), CAR를 발현하는 세포만을 분리한 후 이들 세포의 MFI(Mean Fluorescence Intensity) 값(B)을 확인한 결과이다.
도 13은 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T에 있어서, EGFRvII를 타겟하는 scFv 사이의 링커 길이에 따른 CAR-T세포의 성장 및 배양액내 분비된 EphA2 T cell engager의 농도를 확인한 결과이다.
도 14 및 도 15은 EphA2 T cell engager를 분비하는, EGFRvIII를 타겟하는 6종의 scFv (430, L1A, H2C, L2, L3A, 또는 L3B scFv)를 포함하는 EGFRvIII CAR 렌티바이러스를 형질도입한 세포가 각각의 타겟 항원을 발현하는 세포주에 의해 활성화되는 정도를 확인한 결과이다.
도 16은 EGFRvIII 와 EphA2를 발현하지 않는 K562세포주 (A)에 EGFRvIII 유전자를 도입한 K562-EGFRvIII 세포주(B), 상기 세포에 EphA2 유전자를 도입한 K562-EGFRvIII/EphA2 세포주(C)에서 도입한 항원의 발현을 FACS 염색을 통하여 확인한 결과로, 상기 도 14 및 도 15의 분석에 이용된 타겟세포의 제조를 위한 결과이다.
도 17은 EGFRvIII를 타겟하는 다양한 scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T세포와 동일 scFv를 포함하며 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포의 CAR 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 18 내지 도 20은 EGFRvIII를 타겟하는 다양한 scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T세포와 동일 scFv를 포함하며 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포의 타겟 세포 살상 활성을 46시간 동안 모니터링한 결과이다.
도 21은 교모세포종 동물 모델에 EphA2 T cell engager를 분비하는 430 SL(short linker) scFv 혹은 L1A SL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T 세포와 L1A SL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T 세포를 주입한 후, 이의 시간 경과에 따른 암의 진행 정도를 확인한 결과이다.
도 22는 교모세포종 동물 모델에서의 EphA2 T cell engager를 분비하는 430 SL scFv 혹은 L1A SL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T 세포와 L1A SL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T 세포의 항암 효과를 확인한 결과로, 각 실험군의 광자 값을 측정하여 암의 크기를 비교한 결과이다.
도 23은 교모세포종 동물 모델에 EphA2 T cell engager를 분비하는 430 SL scFv 혹은 L1A SL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T 세포와 L1A SL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T 세포를 주입한 후, 이의 체중에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 및 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고,
상기 돌연변이 EGFR 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 하기 군에서 선택된 1 종의 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다:
a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv.
본 발명은 고형암에서 특이적으로 발현하는 암 항원, 돌연변이 EGFR인 EGFRvIII를 특이적으로 타겟하며, 상기 EGFRvIII은 accession number: NM_001346941.1인 것을 특징으로 한다.
더불어 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 CAR-T는 상기 EGFRvIII와 EphA2(EPH receptor A2)를 동시에 특이적으로 타겟할 수 있다. 상기 EphA2는 accession number: NM_001329090.2인 것을 특징으로 한다.
한편, T cell engager는 이중항체로 두개의 scFv가 linker로 연결되어 있는 형태이다. 하나의 scFv는 암 항원(본 발명에서는 EphA2 항원)을 인식하고, 다른 scFv는 T세포의 CD3를 인식한다. 이를 통해 두 세포를 거리적으로 가깝게 연결함으로써 T세포가 암세포를 살상하도록 한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 EphA2 T세포 인게이저는 타겟 세포를 표적화하는 부위 및 T 세포 활성화 부위를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 EphA2 T세포 인게이저는 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 포함할 수 있으며, 세포 외로 분비되거나 병용투여되어 EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T세포의 활성을 증진시킬 수 있다.
즉, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 CAR-T는 EphA2 T cell engager를 분비하며, EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T(EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T, EphA2 T cell engager secreting EGFRvIII CAR-T)를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 7로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 a) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 9로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 18로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 b) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 19로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 20으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 27로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 28로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 c) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 29로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 30으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 d) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 37로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 38로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 d) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 39로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 40으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 e) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 47로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 48로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 e) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 49로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 50으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 f) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 57로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 58로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더불어 상기 f) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 59로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 60으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있다.
또한, 상기 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 (GGGGS)m 링커로 연결될 수 있으며, 상기 m은 1 내지 10인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 m은 1 내지 5일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 링커의 m은 1 또는 3으로, 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예로서, 상기 돌연변이 EGFR 특이적 키메라 항원 수용체는 경쇄 가변영역과 중쇄 가변영역이 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 링커로 연결된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 즉, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열은 서열번호 63 또는 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열의 일부 아미노산 서열에 변이를 주어 합성하였다.
서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 LL(long linker)를 포함하는 돌연변이 EGFR에 결합하는 scFv의 아미노산 서열은 다음과 같다: 서열번호 67(변이 위치: p.E181K 및 p.T221I, L1A LL로 명칭), 서열번호 71(변이 위치: p.V97L 및 p.E181V, L2 LL로 명칭), 서열번호 75(변이 위치: p.L225P, L3A LL로 명칭), 서열번호 79(변이 위치: p.D94E, p.V97I 및 p.E181K, L3B LL로 명칭) 또는 서열번호 83(변이 위치: p.E181K 및 p.S187L, H2C LL로 명칭).
더불어 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 SL(short linker)를 포함하는 돌연변이 EGFR에 결합하는 scFv의 아미노산 서열은 다음과 같다: 서열번호 69(변이 위치: p.E171K 및 p.T211I, L1A SL로 명칭), 서열번호 73(변이 위치: p.V97L 및 p.E171V, L2 SL로 명칭), 서열번호 77(변이 위치: p.L215P, L3A SL로 명칭), 서열번호 81(변이 위치: p.D94E, p.V97I 및 p.E171K, L3B SL로 명칭) 또는 서열번호 85(변이 위치: p.E171K 및 p.S177L, H2C SL로 명칭).
이에 있어, 상기 서열번호 63으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 64로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 66으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 68로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 70으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 72로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 74로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 75로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 76으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 78로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 80으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 82로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 84로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 86으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화;되는 것을 특징으로 한다.
더불어 상기 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv과 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv는 링커로 연결된 것을 특징으로 한다.
상기 링커는 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
더불어 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 상기 돌연변이 EGFR에 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열, EphA2에 결합하는 scFv를 암호화하는 핵산 서열 및 CD3에 결합하는 scFv는 순차적으로 연결된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 87 및 서열번호 88로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열은 이와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질 또는 펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 87 및 서열번호 88로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 47, 서열번호 48, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83, 서열번호 85, 서열번호 87 및 서열번호 88로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.
더불어 상기 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열 또한 상기와 동일한 이유로 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84 및 서열번호 86으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열과 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물”이란 염기의 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)의 결과로, 상기 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84 및 서열번호 86으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열과 적어도 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 더 더욱 바람직하게는 95 % 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 64, 서열번호 66, 서열번호 70, 서열번호 72, 서열번호 74, 서열번호 76, 서열번호 78, 서열번호 80, 서열번호 82, 서열번호 84 및 서열번호 86으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
더불어 본 발명의 돌연변이 EGFR 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩티드, 줄기 도메인, 막 관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 암호화하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
더불어 상기 폴리뉴클레오타이드는 자가 절단 도메인을 더 포함할 수 있다.
바람직하게는 상기 돌연변이 EGFR 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열, 자가 절단 도메인을 암호화하는 핵산 서열 및 EphA2 T 세포 인게이저를 암호화하는 핵산 서열이 순차적으로 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호 펩티드(signal sequence)는 초기 단백질을 소포체로 보내는 역할을 하며, 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, CD8, CD28, GM-CSF, CD4 및 CD137로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명에서는 CD8 유래 신호 펩티드를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 용어 “줄기 도메인"은 막 관통 도메인을 본 발명의 scFv에 연결하는 기능을 하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28 및 CD8 힌지로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 CD8 힌지 도메인을 사용하였다.
본 발명에 있어서, 용어 “막 관통 도메인”은 본 발명에 따른 CAR가 세포의 표면 막 상에서 발현되도록 하는 임의의 폴리펩타이드를 의미한다. 본 발명에 개시된 CAR에 적합한 막 관통 도메인은 (a) 세포, 예를 들어, 면역 세포, 예컨대, 예를 들어, 비제한적으로, 림프구 세포 또는 자연 킬러(NK) 세포의 표면에서 발현되는 능력, 및 (b) 미리 규정된 타겟 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 지시하기 위해서 본 발명에 따른 scFv 및 세포내 신호전달 도메인과 상호작용하는 능력을 갖는다. 막 관통 도메인 또한 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, CD40, DAP10, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1, TNFSF14, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD154, T 세포 수용체의 알파 쇄, T 세포 수용체의 베타 쇄 및 T 세포 수용체의 제타 쇄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 CD8α 막 관통 도메인을 사용하였다.
본 발명에 있어서, 용어 “세포내 신호전달 도메인"은 효과기 신호 기능 신호를 전송하고 세포가 특화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 이는 본 발명에 따른 scFv가 표적에 결합된 후, 세포내 신호전달을 담당하여 T세포 활성화를 야기한다. 세포내 신호전달 도메인 또한, 상기와 동일 또는 유사한 기능을 하는 것으로 알려진 폴리펩타이드라면 자연 또는 합성 공급원 유래 상관없이 제한없이 사용가능하다.
이에 제한되는 것은 아니나, 상기 세포내 전달 도메인은 CD3ζ, FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, IL-15R-α, MyD88, DAP10, DAP12, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1 및 TNFSF14로 이루어진 군에서 선택된 어느 1종 이상일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 4-1BB(CD137) 및 CD3ζ를 사용하였다.
본 발명에 있어서, 용어 “자가 절단 도메인”은 동일 전사(transcript)에서 여러 단백질을 생성시키기 위한 절단 부위를 지칭한다. 본 발명에 있어서, 상기 자가 절단 도메인은 EGFRvIII CAR(신호 펩티드, EGFRvIII에 결합하는 scFv, 줄기 도메인, 막 관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인)과 EphA2 T cell engager(EphA2에 결합하는 scFv, 링커, CD3에 결합하는 scFv) 사이에 위치하여 각 단백질을 발현시킨다.
상기 자가 절단 도메인은 2A 펩타이드인 것을 특징으로 하며, 상기 2A 펩타이드는 토세아시그나 바이러스(Thoseaasigna virus) 2A (T2A), 돼지 테스코바이러스(teschovirus)-1 2A (P2A), 말 비염 A 바이러스(rhinitis A virus) 2A (E2A) 및 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 2A (F2A)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 T2A를 사용하였다.
또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 발명에 따른 EGFRvIII을 타겟하는 scFv, EphA2에 결합하는 scFv 및 CD3에 결합하는 scFv의 발현 확인 또는 정제를 위한 태그 펩타이드를 더 포함할 수 있다. 이는 공지된 태그 펩타이드라면 제한없이 사용가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 플래그 펩타이드(Flag peptide)(DYKDDDDK)(서열번호 89), HIS 펩타이드(HHHHHH)(서열번호 90), Myc 펩타이드(EQKLISEEDL)(서열번호 91) 및 HiBiT 펩타이드(VSGWRLFKKIS)(서열번호 92)를 사용하였다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 분비하며 EGFR 돌연변이를 타겟하는 CAR-T의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 단백질이 암호화된 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 단백질을 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 단백질의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 생산 방법에 있어서, 상기 “감염”은 “형질전환”을 의미하는 것일 수 있다. 상기 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 본 발명의 일실시예에서는 293T 세포를 숙주세포로 사용하였다. 물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는 데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다.
그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 형질전환된 T세포를 제공한다.
상기 T 세포는 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 분비하고, EGFR 돌연변이를 타겟하는 것을 특징으로 한다.
상기 T 세포는 알파 베타 T세포, 감마 델타 T세포 또는 NKT세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 T세포는 동종 T세포, 자가 T세포, 조작된 자가 T세포 (eACT), 또는 종양-침윤 림프구 (TIL)일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포는 EphA2 및 EGFRvIII에 각각 특이적으로 반응하여 우수한 살상능을 가짐을 확인하였다. 더불어 그 효과가 EGFRvIII만 타겟하는 CAR-T세포 보다 유의미하게 우수하였으며, 뇌암을 유발한 동물모델에서도 현저히 우수한 치료 효과를 보였다.
따라서 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드; 또는 본 발명에 따른 형질전환된 T세포를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 EphA2 T cell engager와 EGFRvIII CAR-T 세포를 각각 동시에 처리하였을 때 T세포 활성화 또는 타겟세포 살상에 있어서, 시너지 효과를 발생함을 확인하였다.
따라서 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 항원 결합 도메인(scFv)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하는 형질전환된 T세포; 및
서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 포함하는 EphA2 T 세포 인게이저를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하며, 상기 고형암은 낭종 또는 체액 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리로, 악성 또는 양성일 수 있다. 바람직하게는 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하는 고형암인 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 상기 암은 뇌암, 유방암, 폐암, 편평세포암, 위암, 대장암, 두경부암, 췌장암, 자궁암, 난소암, 방광암 및 항문암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더불어 현재 현저히 발달한 시퀀싱 기술을 통해 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하는 암종의 종류는 앞으로 현재 공지된 것보다 더 다양해질 수 있다. 또한 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하지 않는 암종이라 할지라도, 이를 발현할 수 있게 하는 공지의 기술(Ex, 바이러스 전달체)을 이용하여 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하도록 조작한 후, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 형질전환된 T세포 또는 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포 및 EphA2 T 세포 인게이저를 적용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여용으로 제형될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로도 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
"면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 "치료량"을 언급할 때, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 의사에 의해 결정될 수 있고, 의사는 환자 (대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 장애에서의 개별적인 차이를 고려한다. 일반적으로, 본 발명의 형질전환된 T 세포를 포함하는 약학적 조성물이 104 내지 109 개의 세포/체중 kg의 용량, 바람직하게는 105 내지 106 개의 세포/체중 kg의 용량 (이러한 범위 내의 모든 정수 값을 포함함)으로 투여될 수 있는 것으로 언급될 수 있다. 또한 본 발명의 형질전환된 T 세포를 포함하는 약학적 조성물은 이러한 용량으로 여러 번 투여될 수 있으며, 면역요법에서 널리 공지된 주사 기술을 사용하여 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 최적의 투여량 및 치료 요법은 환자의 질환 징후를 모니터링하고 이에 따라 요법을 조정하는 것을 통해 의료 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
조성물을 대상체에게 투여하는 것은 분무, 주사, 연하, 주입, 착상 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 결절내, 척수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사에 의해 또는 복막내로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 환자에게 피내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 i.v. 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로 직접적으로 주사될 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드; 또는 본 발명에 따른 형질전환된 T세포를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 항원 결합 도메인(scFv)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하는 형질전환된 T세포; 및
서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 포함하는 EphA2 T 세포 인게이저를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 인간을 포함한 포유류인 것이 바람직하며, 암 치료를 필요로 하는 환자로 치료 중인 환자, 치료를 받은 적이 있는 환자, 치료를 받을 필요가 있는 환자를 모두 포함하며, 암 치료를 위하여 외과적 수술을 시행한 환자 또한 포함될 수 있다.
상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하며, 상기 고형암은 낭종 또는 체액 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리로, 악성 또는 양성일 수 있다. 바람직하게는 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하는 고형암인 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 상기 암은 뇌암, 유방암, 폐암, 편평세포암, 위암, 대장암, 두경부암, 췌장암, 자궁암, 난소암, 방광암 및 항문암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 형질전환된 T 세포를 치료 수준으로 확장시키기 위해 본원에 기술된 방법 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 활성화 및 확장된 세포가 환자에게 임의의 관련된 치료 형태와 조합되어(예를 들어, 이전에 동시에 또는 후속적으로) 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 형질전환된 T세포, 돌연변이 EGFR 특이적 CAR를 발현하는 형질전환된 T세포 및 EphA2 T 세포 인게이저 또는 본 발명의 약학적 조성물은 화학요법, 방사선, 항암제, 면역치료제 등의 고형암 치료를 위한 치료 방법과 조합되어 사용될 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. EphA2를 타겟하는 T세포 인게이저(T cell engager) 발현 벡터 제작
EphA2를 타겟으로 하는 T cell engager 단백질을 생산하기 위하여, 먼저 EphA2 항원에 결합할 수 있는 scFv와 CD3 항원에 결합할 수 있는 scFv를 링커로 연결한 유전자 서열을 합성하였다. 이를 pcDNA3.3 벡터에 클로닝하여 발현벡터로 이용하였다.
EphA2를 타겟하는 T cell engager의 특이성을 확인하기 위하여, 음성대조군(negative control)으로 EphA2 항원 대신 CD19 항원에 결합할 수 있는 scFv와 CD3 항원에 결합할 수 있는 scFv를 링커로 연결한 유전자 서열을 합성하여 상기와 같이, pcDNA3.3 벡터에 클로닝하였다.
이때 T cell engager의 발현 확인과 정제를 위하여 T cell engager 유전자 C-말단(C-term) 부분(CD3을 타겟하는 scFv의 C-말단)에 HIS 펩타이드(HHHHHH)(서열번호 90)와 Myc 펩타이드(EQKLISEEDL)(서열번호 91)를 태깅(tagging)하였다. 더불어 기능이 확인된 EphA2를 타겟하는 T cell engager의 경우, 소량의 단백질도 검출하기 위하여, C-말단(CD3을 타겟하는 scFv의 C-말단)에 His 펩타이드와 HiBiT 펩타이드(VSGWRLFKKIS)(서열번호 92)를 링커(GSSGGSSG)(서열번호 93)로 연결한 후 태깅하였다. 이때 리더(시그날 서열(signal sequence), MEFGLSWVFLVALFRGVQC)(서열번호 94))는 임의로 결정하였다.
실시예 2. EphA2를 타겟하는 T cell engager의 생산 및 활성 확인
상기 실시예 1에서 제작한 EphA2 T cell engager와 CD19 T cell engager 생산을 위한 두 발현 벡터를 Expi293F 세포에 당분야에 공지된 방법으로 트랜스펙션(transfection)시켰다. 5-7일 뒤 배양액을 수거하여 Ni-NTA 어피니티 컬럼(affinity column)을 이용하여 정제하였다. 이후 이들 단백질의 특이적인 발현을 안티-His 항체(anti-His antibody, Biolegend에서 구입)를 이용하여 당분야에 공지된 방법에 따라 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하여 도 1 중 A와 같이 확인하였다.
더불어 생산한 EphA2 T cell engager가 활성을 가지고 있는지를 확인하기 위하여 NFAT(Nuclear factor of activated T-cells) reporter (luc)- Jurkat 세포(BPS Bioscience)를 이용한 분석을 수행하였다. NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포는 외부 자극에 의해 NFAT 전사인자가 활성화되면 루시퍼라아제(luciferase) 활성이 증가한다. 따라서 루시퍼라아제 기질을 첨가한 후 발광(luminescence, RLU)을 측정함으로써 정량할 수 있다.
먼저, NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포(effector 세포, 2×104 cells)를 EphA2 항원을 발현하는 U-87MG (ATCC, Target 세포, 2×104 cells)와 혼합하였다. 이에 His tag ELISA(Genescript)를 이용하여 정량한 EphA2 T cell engager를 다양한 농도로 첨가한 후 4시간 동안 배양하였다. 이후 루시퍼라아제 기질(Promega)을 첨가하고 NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포의 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.
그 결과 도 1 중 B에 나타낸 바와 같이, EphA2 T cell engager의 경우 농도에 비례하여 NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포의 루시퍼라아제 활성을 증가시킴을 확인하였다. 반면, 음성대조군인 CD19 T cell engager의 경우 동일 농도에서 NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포의 루시퍼라아제 활성을 증가시킬 수 없음을 확인하였다.
또한 EphA2 T cell engager가 타겟 항원을 인식하여 T세포가 매개하는 타겟 세포 살상능을 가지는지를 확인하기 위하여 T세포(이펙터(effector) 세포, 1×104 cells), EphA2 항원을 과발현시킨 293세포(luciferase 발현, 타겟(Target)세포, 2×104 cells), 다양한 농도의 EphA2 T cell engager를 혼합하고 24시간 동안 배양하였다. 이 후 타겟 세포의 루시퍼라아제 활성을 측정함으로써 EphA2 T cell engager가 매개하는 T세포 살상능을 조사하였다.
EphA2 항원을 과발현시킨 293세포는 다음과 같이 확립하였다. ATCC에서 구매한 293세포에 Sino Biological에서 구입한 EphA2 유전자 발현벡터를 SF cell line X kit을 이용하여 Lonza 4D Nucleofector기기로 도입하였다. 그 후 하이그로마이신(hygromycin) 300 μg/mL을 첨가한 배지를 이용해 계대 배양하고 EphA2 항원을 높게 발현하는 세포만을 FACS를 이용하여 선별하였다. 이렇게 확립된 293-EphA2 세포주는 루시퍼라아제 유전자를 가진 렌티바이러스로 형질도입(transduction)시켜 루시퍼라아제를 발현시켜 실험에 이용하였다.
EphA2 T cell engager에 의한 특이적인 타겟 세포 살상능은 하기 수학식 1에 따라 산출하였다.
[수학식 1]
타겟 세포 살상능={(Target세포+T세포 공배양시 RLU(Relatively Light Unit) 값)-(Target세포 +T세포+ Engager 공배양시 RLU값)}/(Target세포+T세포 공배양시 RLU값)
그 결과 도 1 중 C와 같이, 상기 도 1 중 B에서 확인한 바와 동일하게 EphA2 T cell engager는 농도에 비례하여 타겟 세포를 살상할 수 있었다. 반면, 음성대조군인 CD19 T cell engager의 경우 농도에 관계없이 타겟 세포를 살상할 수 없었다.
실시예 3. EGFRvIII를 타겟하는 CAR 구조체 제작
또한 EGFRvIII를 타겟하여 암세포를 사멸시킬 수 있는 CAR-T를 생산하기 위하여, 먼저 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 scFv를 제작하였다.
scFv는 항체의 경쇄 (light chain)과 중쇄 (heavy chain)의 가변성 부분(variable region)을 연결하는 링커의 길이에 차이를 두어 두 종류로 디자인하였다. LL(long linker)의 경우 GGGGS가 세번 반복된 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 61)으로 이루어져 있고, SL(short linker)의 경우 GGGGS(서열번호 62)로 이루어져 있다.
더불어 scFv의 야생형(wild type) 서열(서열번호 63(430 LL로 명칭) 및 서열번호 65(430 SL로 명칭))을 기반으로 일부 아미노산 서열에 변이를 준 서열의 scFv도 제작하였다. 그 결과 다음과 같은 LL을 포함하는 scFv를 제작하였다: 서열번호 67(변이 위치: p.E181K 및 p.T221I, L1A LL로 명칭), 서열번호 71(변이 위치: p.V97L 및 p.E181V, L2 LL로 명칭), 서열번호 75(변이 위치: p.L225P, L3A LL로 명칭), 서열번호 79(변이 위치: p.D94E, p.V97I 및 p.E181K, L3B LL로 명칭) 또는 서열번호 83(변이 위치: p.E181K 및 p.S187L, H2C LL로 명칭).
더불어 다음과 같은 SL을 포함하는 scFv를 제작하였다: 서열번호 69(변이 위치: p.E171K 및 p.T211I, L1A SL로 명칭), 서열번호 73(변이 위치: p.V97L 및 p.E171V, L2 SL로 명칭), 서열번호 77(변이 위치: p.L215P, L3A SL로 명칭), 서열번호 81(변이 위치: p.D94E, p.V97I 및 p.E171K, L3B SL로 명칭) 또는 서열번호 85(변이 위치: p.E171K 및 p.S177L, H2C SL로 명칭).
상기와 같이 제작한 scFv를 기반으로 EGFRvIII를 타겟하여 암세포를 사멸시킬 수 있는 CAR-T를 생산하기 위한 CAR 구조체를 제작하였다. 도 4 중 A에 나타낸 바와 같이, EGFRvIII에 결합할 수 있는 scFv를 T세포 표면에 발현시키기 위하여 CD8 신호 서열(signal sequence, signal seg), 힌지(hinge), 막관통 도메인(transmembrane domain, TM)이랑 융합하였고, T세포가 EGFRvIII에 결합한 후 시그널을 받아 증식하기 위한 세포내 신호전달 도메인으로 41BB와 CD3ζ를 융합시킨 구조를 디자인하였다. 또한 scFv의 발현 확인을 위하여, scFv N-말단(N-term)에 플래그 펩타이드(Flag peptide (DYKDDDDK)(서열번호 89))를 태깅하였다. 이들 유전자의 서열은 하기 표 1에 나타내었으며, 각 유전자를 합성하여 공지된 방법으로 렌티벡터(Lenti vector, pELPS3)에 삽입한 후 렌티바이러스를 생산하였다.
염기 서열 서열번호
CD8 신호 서열 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG 95
CD8 힌지-막 관통 도메인 ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCTAGCCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCCGT 96
41BB TTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG 97
CD3ζ AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC 98
실시예 4. EGFRvIII를 타겟하는 CAR 렌티바이러스 생산 및 이를 이용한 CAR-T 생산
상기 실시예 3에서 제작한 렌티벡터를 렌티바이러스(Lentivirus) 생산에 필요한 악세서리 유전자를 가진 플라스미스(pRSV_rev, pMD2.5G, pMD_RRE)와 함께 Lenti-X™ 293T 세포(Clonetech사에서 구입)에 형질주입(transfection)시켜 생산하였다. 생산한 렌티바이러스는 농축하여 역가를 측정한 후 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.
CAR-T 세포를 생산하기 위하여, 건강한 자원자로부터 혈액을 제공받아 피콜(Ficoll) 밀도구배 방법을 이용하여 공지된 절차에 따라 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리하였다. PBMC를 TransAct(Miltenyi)를 포함한 배지에서 2일동안 배양하여 T세포를 활성화시켰고, 이에 상기 렌티바이러스를 첨가한 후 회전접종(spinoculation) 방법을 이용하여 공지된 절차에 따라 형질도입을 수행하였다. 이후 IL-2(Interleukin-2)가 포함된 배양배지를 2-3일 간격으로 첨가해주며 CAR-T세포를 증식시켰다. 배양된 세포를 anti-Flag-PE 혹은 anti-Flag-APC (L5, Biolegend)로 염색한 후 FACS 기기를 이용하여 세포 표면의 CAR 발현 여부를 확인하여 도 2에 나타내었다. 이때 렌티바이러스로 형질도입하지 않은 세포 (UTD)를 음성 대조군으로 비교하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, CAR-T세포가 430 LL scFv을 포함하는 CAR를 발현함을 확인하였다.
실시예 5. EphA2 T cell engager와 EGFRvIII CAR-T의 시너지 효과 확인
상기 실시예 4에서 CAR(scFv 430 포함)의 발현이 확인된 CAR-T세포 및 상기 실시예 2에서 효능이 확인된 EphA2 T cell engager를 동시 처리시 시너지(synergy) 효과가 발생하는지 확인하였다.
이를 위하여, EGFRvIII 항원을 과발현하는 293세포(293-EGFRvIII, Cether사에서 구입)에 EphA2 유전자를 과발현시킨 세포(293-EGFRvIII/EphA2)를 확립하였으며 이 세포에 루시퍼라아제를 도입함으로써 타겟세포의 살상을 루미네선스(luminescence)로 측정할 수 있게 하였다. 293-EGFRvIII 세포에 EphA2 유전자를 과발현시키기 위한 EphA2 유전자 발현벡터는 Sino Biological에서 구입하였으며 이 플라스미드를 SF cell line X kit을 이용하여 Lonza 4D Nucleofector기기로 293-EGFRvIII 세포에 도입하였다. 이를 하이그로마이신 300 μg/mL을 첨가한 배지에서 계대 배양함으로써 EphA2를 발현하는 세포를 선별하였다. 이렇게 확립된 293-EGFRvIII/EphA2 세포주는 루시퍼라아제 유전자를 가진 렌티바이러스로 형질도입시켜 루시퍼라아제를 발현시켜 실험에 이용하였다.
EGFRvIII CAR-T세포(effector 세포, 2×104 cells)를 전날 96 웰 플레이트에 씨드(seed)한 타겟 세포(루시퍼라아제 발현, 293/ EGFRvIII/ EphA2, 2×104 cells)에 다양한 농도의 T cell engager와 함께 첨가하고 6시간, 24시간 동안 공동배양하였다. 이후 타겟 세포의 루시퍼라아제 활성을 측정함으로써 CAR-T 세포 및 T cell engager의 살상능(killing activity)을 확인하여 도 3 중 A에 나타내었다. 또한 공동배양액을 수거하여 T세포가 활성화되었을 때 분비하는 IFN-γ(Interferon-gamm)의 농도를 ELISA 키트(Biolegend)을 이용하여 측정하고 그 결과를 도 3 중 B에 나타내었다.
도 3 중 A 및 B에 나타낸 바와 같이, CAR-T 세포 및 T cell engager의 살상능의 경우 6시간에는 나타나지 않았으나 24시간이 되면서 뚜렷한 효과가 나타났다. 반면 T세포의 활성화 지표인 IFN-γ 분비의 경우 24시간에 비해 그 레벨(level)은 낮았으나 6시간부터 EphA2 T cell engager 농도에 비례하여 증가함을 확인하였다. 특히 EphA2 T cell engager 단독으로 처리하였을 경우 0.2 fmol 이상일 때에만 효과가 있는 것으로 나타났으나 EGFRvIII CAR-T세포와 함께 처리하였을 때에는 0.04 fmol에서 EGFRvIII CAR-T세포의 효과를 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 하지만 EphA2 T cell engager의 농도가 높은 경우(5 fmol)에는 EGFRvIII CAR-T세포와의 시너지가 확인되지 않았다.
실시예 6. EphA2 T cell engager를 분비하며 EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T 세포 생산
상기 실시예 5에서 EphA2 T cell engager와 EGFRvIII CAR-T를 서브옵티멈(suboptimum) 농도에서 함께 처리하였을 때 T세포 활성화나 타겟세포 살상에 있어서, 시너지 효과를 발생함을 확인하였으므로 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T를 생산하였다.
보다 구체적으로 도 4 중 B에 나타낸 바와 같이, 도 4 중 A의 EGFRvIII CAR 구조체의 C-말단(CD3ζ의 C-말단)에 T2A(EGRGSLL TCGDVEENPGP)(서열번호 99)와 상기 실시예 1의 EphA2 T cell engager 서열을 융합시킨 유전자를 디자인하고 합성하였다. 상기 유전자를 이용하여 상기 실시예 3와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 더불어 실시예 4와 동일한 방법으로 EphA2 T cell engager 분비(secreting) EGFRvIII CAR-T세포를 생산하였다. 이때 대조군으로서 동일한 방법으로 CD19 T cell engager를 이용한 CD19 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 생산하였다.
실시예 7. EphA2 T cell engager를 분비하며 EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T 세포 배양액의 특이적 효과 확인
EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포 또는 CD19 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 anti-Flag-PE 또는 anti-Flag-APC (L5, Biolegend)로 염색하여 세포 표면의 CAR 발현 정도를 확인하였다. 또한 이들 CAR-T세포가 기능이 있는 T cell engager를 분비하는지를 확인하기 위해 각 CAR-T세포의 배양 배지를 수거하고, 이를 다양한 비율로 배양중인 상기 실시예 2에서 제작한 293-EphA2 세포에 첨가하여 하룻밤 배양한 후 타겟 세포의 살상 정도를 현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포의 배양 배지는 첨가한 비율에 비례하여 타겟 세포의 살상이 관찰되었다. 반면 CD19 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포의 배양 배지의 경우 UTD 세포의 배양 배지와 유사하게 타겟 세포를 살상할 수 없음을 확인하였다. 따라서 이를 통해 본 발명에 따른 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포는 기능성이 있는 T cell engager를 분비함을 확인하였다.
실시예 8. EphA2 T cell engager를 분비하며 EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T 세포의 타겟 특이적 활성화 및 살상능 확인
본 발명에 따른 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포가 T cell engager의 타겟 세포와 CAR-T의 타겟 세포를 만났을 때 각각의 타겟에 특이적으로 반응하여 활성화되는지 확인하였다. 이를 위하여 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 anti-Flag-PE 혹은 anti-Flag-APC(L5, Biolegend)로 염색하여 표면에 발현하는 CAR의 정도를 확인한 후 Tag-it 바이올렛 세포 증식 및 추적 염색제(Violet cell proliferation and tracking dye (Biolegend))로 라벨링하였다. 다음날 이들 세포를 루시퍼라아제를 발현하는 293-EphA2 세포 혹은 293-EGFRvIII 세포와 다양한 비율로 반응시킨 후 6, 24, 48 시간에 세포 배양액을 수거하여 IFN-γ 분비능을 확인하고 타겟세포의 살상능도 확인하였다. 더불어 72시간에 세포를 수거하여 세포의 증식 정도를 확인하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포와 293-EGFRvIII 세포를 반응시켰을 때, 타겟 세포의 양이 증가할수록 CAR-T 세포의 MFI(Mean Fluorescence Intensity) 값이 감소한 바, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포는 타겟 세포 수에 비례하여 증식이 증가하였고, IFN-γ 생산이 증가함을 확인하였다. 특히 IFN-γ의 경우 24시간부터 눈에 띄게 증가하여 48시간까지 계속적으로 증가함을 보였다. 타겟 세포 살상도 IFN-g와 유사한 패턴을 보였다.
더불어 도 7과 같이, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 293-EphA2 세포와 반응시켰을 때, 타겟 세포의 양이 증가할수록 CAR-T 세포의 MFI 값이 감소한 바, 293-EGFRvIII 세포와 반응시켰을 때와 유사하게 타겟 세포 수에 비례하여 증식이 증가하였고, IFN-γ 생산이 증가하였음을 확인하였다. IFN-γ와 타겟 세포 살상은 48시간에 유의하게 증가하였다.
CAR-T의 경우 빠른 시간에 타겟 세포에 의해 활성화되어 타겟 세포를 살상하는 반면 T cell engager의 경우 분비가 되어 효력이 나타나는 일정 농도에 이르는 데 시간이 필요한 것으로 판단되었다. 따라서 CAR-T보다는 타겟 세포를 살상 능력이 지연되어 나타나는 것으로 추론되었다. 그러므로, CAR-T 및 T cell engager는 작용하는데 필요한 시간적인 차이는 있으나, 본 발명에 따른 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포는 EphA2, 그리고 EGFRvIII와 특이적으로 반응하여 활성화될 수 있고 타겟세포를 살상할 수 있음을 확인하였다.
실시예 9. 동물모델에서의 효능 확인
9-1. 교모세포종 유발 동물 모델 준비
생체 외(In vitro)에서 타겟 세포 살상능이 확인된, 본 발명에 따른 EGFRvIII를 타겟하는 CAR-T세포들의 생체 내(in vivo)에서의 효능을 확인하였다. 이를 위하여 먼저 교모세포종(glioblastoma) 세포주를 이용하여 동소(orthotopic) 동물 모델을 확립하였다. 상기 교모세포종 세포주로는 교모세포종 연구에 널리 이용되는 세포주인 U-87MG 세포를 활용하였다.
먼저 상기 세포의 EphA2 내재적 발현 여부를 확인하기 위하여, U-87MG 세포를 anti-EphA2 항체 (371805, R&D Systems)와 이차항체인 anti-mouse IgG-APC (poly 4053, biolegend)로 염색하여 표면에 발현하는 항원의 정도를 FACS로 확인하였다. 그 결과 도 8 중 A에 나타낸 바와 같이, U-87MG 세포는 EphA2 내재적 발현을 보임을 확인하였다. 상기 세포주에 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase)를 도입한 U-87MG-Luc2 세포주를 ATCC로부터 확보하고 이 세포주에 EGFRvIII 유전자를 도입하여 안정적인(stable) 세포주를 확립하였다(이하 U87-EGFRvIII로 명칭). 상기 U87-EGFRvIII 세포주가 EGFRvIII를 발현한다는 것을 확인하기 위하여, EGFR을 인식하는 항체(A19002A, Biolegend에서 구입), 그리고 EGFRvIII만을 특이적으로 인식하는 항체(L8A4, Absolute Antibody에서 구입)를 이용하여 공지된 방법에 따라 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하였다. EGFR과 EGFRvIII에 대한 양성 대조군(positive control)으로는 293 (도 8 중 B, 레인(lane) 1)과 293-EGFRvIII (도 8 중 B, 레인 2)을 이용하였다.
그 결과 도 8 중 B와 같이, A19002A 항체는 EGFR과 EGFRvIII 사이즈가 다른 두 단백질을 잘 검출(detection)할 수 있었고, L8A4 항체는 EGFRvIII 단백질만을 특이적으로 인식함을 보여주었다. U87-EGFRvIII 세포주는 두 항체 모두에 의해 기대되는 사이즈에서 검출됨으로써 EGFRvIII가 발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 9 중 A, 레인 3).
또한 도 8 중 C에 나타낸 바와 같이, U87-EGFRvIII 세포주는 세포수에 비례하여 루시퍼라아제 발현이 증가함을 생체외에서 확인하였다.
이 후 세포주를 배양하여 증식시킨 후 수거하여 0.2×106세포를 3μL의 PBS에 현탁하고, 면역결핍(Immunocompromiced) 마우스(NOG, NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull, CIEA에서 구입)의 뇌에 I.C.(intracranial)로 주사하였다. 수일이 지난 후, 루시퍼라아제의 기질인 D-루시페린(D-Luciferin (PerkinElmer)) 150mg/kg을 마우스 복강으로 주사하고 동물을 IVIS(In vivo optical imaging system) 기기를 이용하여 광자(photon)을 확인하여 발광정도를 측정함으로써 암의 성장을 모니터링(monitoring)하였다.
9-2. EGFRvIII CAR-T와 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T 세포의 생체외(in vivo) 효능 비교
EGFRvIII CAR-T 또는 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 동물모델에 주사하기 전에 각 동물모델에 존재하는 암의 크기를 IVIS 기기를 이용하여 광자값으로 수치화하였다. 수치화된 광자 값에 따라 동물모델을 그룹당 5마리씩 무작위(random)로 배치하였다. 배양중인 CAR-T 세포를 계수하고 anti-Flag-PE (L5, Biolegend)로 염색하여 CAR의 발현 정도를 확인하였다. CAR 발현율에 따라 CAR+세포를 동물 당 0.1×106 혹은 0.5×106 세포가 되도록 수거하였다. 이를 세척한 후 100μL의 5% HSA에 현탁하여 I.V.로 동물에 주사하였다. 이때 대조군으로 CD19 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 주사하였다. 이후 매 1주마다 IVIS기기를 이용하여 각 동물모델의 광자 값을 측정함으로써 암크기의 변화를 모니터링하였다. 또한 동물의 몸무게도 매주 측정하였다.
그 결과 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, CD19 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포 0.1×106(0.1M)를 주사한 실험군의 경우 모의(mock)로 이용한 CD19 CAR-T세포 0.1×106(0.1M)를 주사한 그룹과 유사하게 암을 저해하지 못하였다. 반면, 본 발명에 따른 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포 0.1×106(0.1M)를 주사한 실험군의 경우 98일째까지 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD)로 사망한 1마리의 동물모델(*로 표시)을 제외한 4마리의 동물모델 중 2마리는 생존해 있었다. 이들 중 한 개체는 암이 완전히 제거된 상태였고 나머지 한 개체는 암이 재발한 상태였다.
더불어 본 발명에 따른 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포 0.5×106(0.5M)를 주사한 실험군의 동물모델은 1-2주째부터 암이 사라져서 98일째까지 암이 재발하지 않은 상태로 유지되었다. 따라서 도 11 중 A에 나타낸 바와 같이, 실험기간 100일 동안 본 발명에 따른 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 주사한 실험군의 경우 CD19 CAR-T 및 CD19 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 주사한 실험군보다 우수한 생존율을 보여주었다. 더불어 도 11 중 B에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 주사한 실험군의 경우 체중의 감소를 보이지 않았다.
실시예 10. 링커 길이에 따른 CAR의 발현 및 EphA2 T cell engager 분비량 확인
동일한 EphA2 T cell engager를 분비하나 EGFRvIII를 인식하는 scFv의 링커의 길이가 다른 (LL & SL) Engager 분비 CAR-T 세포, 두 종류를 생산한 후 링커 길이에 따른 효능 차이를 확인하였다. EphA2 T cell engager의 경우 아주 적은 양의 engager도 검출할 수 있도록 기존의 myc대신 HiBiT을 태깅하였다. EphA2 T cell engager를 분비하는 430LL CAR-T 세포 또는 EphA2 T cell engager를 분비하는 430SL CAR-T 세포를 anti-Flag-PE 혹은 anti-Flag-APC(L5, Biolegend)로 염색하여 표면에 발현하는 CAR의 정도를 확인하였다.
그 결과 도 12 중 A에 나타낸 바와 같이, 동일한 MOI로 감염시켜 생산한 EphA2 T cell engager를 분비하는 430SL CAR-T 세포의 경우 EphA2 T cell engager를 분비하는 430 LL CAR-T 세포보다 더 높은 CAR의 발현을 보임을 확인하였다.
CAR의 발현 정도가 engager의 생산에도 영향을 주는지를 알아보기 위해 Flag 양성(positive) 세포를 MojoSort 인간 안티-APC 나노비드(MojoSort Human anti-APC nanobeads (Biolegend))를 이용하여 분리하였다. 그 결과 도 12 중 B와 같이, 분리 후 CAR+ 세포는 97%이상이었다. 더불어 상기 세포들의 MFI를 확인한 결과, EphA2 T cell engager를 분비하는 430SL CAR-T 세포의 경우 EphA2 T cell engager를 분비하는 430 LL CAR-T 세포보다 높음을 확인하였다(1307 vs. 960).
분리한 세포를 2×105 cells/mL으로 24웰 플레이트에 씨드(seed)한 후 1- 4일까지 매일 수거하여 세포를 계수함과 동시에 배양액에 존재하는 engager를 Nano-Glo HiBiT 세포외 검출 시스템(Nano-Glo HiBiT Extracellular detection system (Promega))을 이용하여 정량하였다. 그 결과 도 13에 나타낸 바와 같이, CAR-T의 경우 UTD 세포에 비하여 세포의 성장이 빠르게 일어났으며 EphA2 T cell engager를 분비하는 430LL CAR-T 세포에 비해 EphA2 T cell engager를 분비하는 430SL CAR-T 세포가 더 빠르게 자라는 경향을 보였다. 배양액 속에 존재하는 EphA2 T cell engager의 경우 1, 2일에는 미미하였으나 3일부터 세포수의 증가에 비례하여 크게 증가하기 시작하였다.
실시예 11. EphA2 T cell engager를 분비하는 다양한 EGFRvIII CAR의 타겟 항원에 의한 활성화 확인
430 scFv 포함 EGFRvIII를 타겟하는 6종의 scFv (430, L1A, H2C, L2, L3A, 또는 L3B scFv)를 포함하는 EGFRvIII CAR 구조체에 EphA2 T cell engager를 분비하는 기능을 첨가한 렌티바이러스를 형질도입한 리포터 (reporter) 세포를 이펙트 세포로 이용하여 이들 이펙터 세포가 각각의 항원을 발현하는 세포에 의해 활성화되는 정도를 확인하였다.
이때 상기 EGFRvIII scFv의 경우 모두 SL를 포함하는 scFv를 이용하였다. CAR의 발현을 위하여 상기 실시예 4에 기술된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였고, 이를 이용하여 NFAT reporter(luc)- Jurkat 세포를 감염시켜 CAR의 발현을 유도하였다. 그 후 anti-Flag-APC(L5, Biolegend)로 염색하여 CAR의 발현을 확인한 NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포를 이펙터 세포(2×104 cells)로 이용하였으며, 다양한 비율의 타겟세포(K562(만성 골수성 백혈병 세포주), K562-EGFRvIII, K562-EGFRvIII/EphA2)와 혼합하여 4시간동안 공동 배양하였다. 배양이 끝난 후 루시퍼라아제 기질(Promega)을 첨가하여 이펙터 세포의 루시퍼라아제 활성을 측정함으로써 각각의 항원에 대한 CAR 및 T cell engager의 활성을 확인하였다.
그 결과 도 14와 같이, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR(L1A SL, L2 SL, L3A SL 또는 L3B SL scFv를 포함)를 발현하는 세포들은 K562-EGFRvIII를 타겟 세포로 이용하였을 때보다 K562-EGFRvIII/EphA2를 타겟 세포로 이용하였을 때 높은 루시퍼라아제 활성을 보였다. 이를 통해 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR를 발현하는 세포들은 EGFRvIII CAR를 발현할 뿐만 아니라 EphA2 T cell engager를 생산하므로, CAR에 대한 항원과 T cell engager에 대한 항원에 동시에 반응함으로써 이펙터 세포를 더 잘 활성화시킴을 확인하였다. 또한 이펙터 세포의 루시퍼라아제 활성은 타겟 세포의 수에 비례하여 증가하였다. 반면, CAR 혹은 T cell engager에 대한 항원을 발현하지 않는 K562세포를 타겟 세포로 이용하였을 때에는 모든 실험군의 이펙터 세포들에서 루시퍼라아제 활성이 관찰되지 않았다. 또한 CAR를 발현시키지 않은 NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포 (UTD 세포)를 이펙터 세포로 이용하여 타겟 항원이 발현된 타겟 세포와 반응시켰을 때에도 루시퍼라아제 활성은 확인되지 않았다. 대체적으로 CAR의 발현이 높은 NFAT reporter (luc)- Jurkat 세포들의 루시퍼라아제 활성이 높은 것을 확인하였다.
EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR (430 SL, L1A SL, 또는 H2C SL scFv를 포함)를 발현하는 세포들을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 타겟 항원에 의한 활성화를 확인한 결과, 도 14와 유사한 경향의 결과를 확인하였다(도 15 참고).
타겟세포로 이용한 K562 세포는 ATCC에서 구매하였다. K562-EGFRvIII 세포주의 경우 K562세포를 EGFRvIII 항원과 GFP를 동시에 발현하는 렌티바이러스를 이용하여 형질도입시키고 GFP를 발현하는 세포만을 FACS 선별하였다. 이를 블라스티시딘(blasticidin) 2μg/mL을 첨가한 배지에서 계대 배양하여 EGFRvIII를 발현하는 세포를 선별함으로써 K562-EGFRvIII 세포주를 확립하였다.
K562-EGFRvIII/EphA2의 경우 상기에서 확립한 K562-EGFRvIII 세포주에 SF cell line X kit을 이용하여 Lonza 4D Nucleofector 기기로 EphA2 유전자 발현벡터(Sino Biological에서 구매)를 도입한 후 하이그로마이신 300μg/mL을 첨가한 배지를 이용해 계대 배양하여 EphA2를 발현하는 세포를 선별함으로써 확립하였다.
각각의 타겟 세포가 항원을 발현하는지를 확인하기 위하여 일차 항체로 anti-EGFRvIII(L8A4, Absolute Antibody), anti-EphA2(371805, R & D Systems) 그리고 이차항체로 anti-mouse IgG-APC (poly 4053, Biolegend)로 염색한 후 발현을 FACS로 확인하였다.
그 결과 도 16에 나타낸 바와 같이, K562 세포는 EGFRvIII과 EphA2 어느 것도 발현하지 않았고, K562-EGFRvIII 세포주는 EGFRvIII만을 발현하였고, K562-EGFRvIII/EphA2 세포주는 EGFRvIII과 EphA2 모두를 발현하고 있음을 확인하였다.
실시예 12. 다양한 변이 scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T세포와 동일 scFv를 포함하며 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포와의 타겟 세포 살상 활성 모니터링
EphA2 T cell engager를 분비하며, 다양한 변이 scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T세포가 변이 scFv를 포함하며 EphA2 T cell engager를 분비하지 않는 EGFRvIII CAR-T세포보다 더 우수한 암세포 살상능을 보유하는지 확인하였다. 이를 위하여 상기 실시예 4에 기재된 방법과 동일한 방법으로 EGFRvIII를 타겟하는 4종의 scFv (L1A SL, L2 SL, L3B SL, 또는 H2C scFv)를 포함하면서 EphA2 T cell engager를 분비하거나 혹은 분비하지 않는 EGFRvIII CAR 구조체를 이용하여 렌티바이러스 및 CAR-T 세포를 생산하였다. 이들 세포의 CAR 발현을 anti-Flag-PE (L5, Biolegend)로 염색하여 확인하였다(도 17 참고). 발현이 확인된 CAR-T세포를 이펙터세포로 이용하였으며, 이와 항원 EGFRvIII와 EphA2를 발현하면서 동시에 GFP를 발현하는 타겟세포(U87-EGFRvIII, DKMG-EGFRvIII, 혹은 293-EGFRvIII/EphA2)를 다양한 비율로 혼합하였다. 이펙터 세포의 경우 CAR+세포만을 이펙터 세포로 생각하고 E:T 비율을 결정하였으며 이들 세포의 공동배양 시작부터 완료되는 시점인 46시간 동안 타겟 세포 살상 활성을 확인하였다. 이를 위하여 인큐사이트(Incucyte (Sartorius))를 이용하여 타겟 세포의 GFP 발현의 변화를 2시간 마다 측정하였다.
그 결과 도 18에 나타낸 바와 같이, DKMG-EGFRvIII 세포를 타겟 세포로 이용하고 0.2:1의 E:T 비율일 때 EphA2 T cell engager를 분비하거나 혹은 분비하지 않는 EGFRvIII CAR-T세포 모두 타겟세포를 빠르게 살상함을 확인하였다. 특히 T cell engager를 분비하는 경우 살상효과가 더 강력하게 나타났다. 이펙터 세포를 5배 적게 넣어 준, E:T 비율이 0.04:1일 때에는 EphA2 T cell engager를 분비하지 않는 EGFRvIII CAR-T세포의 경우 타겟세포를 살상할 수 없음을 확인하였다. 반면 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포의 경우에는 살상 효과가 있었으나 느리게 나타났다. 더불어 U87-EGFRvIII 세포와 293-EGFRvIII/EphA2를 타겟 세포로 이용하였을 때의 결과를 각각 도 19와 도 20에 나타내었다. DKMG-EGFRvIII 세포를 타겟 세포로 이용하였을 때와 마찬가지로 E:T 비율이 0.2:1일 때 EphA2 T cell engager를 분비하거나 혹은 분비하지 않는 EGFRvIII CAR-T세포 모두에서 타겟세포를 잘 살상할 수 있었으며 EphA2 T cell engager를 분비하는 경우 살상효과가 더 강력하게 나타났다.
이에 있어, 타겟세포로 이용한 U87-EGFRvIII, DKMG-EGFRvIII, 그리고 293-EGFRvIII/EphA2 중 U87-EGFRvIII와 293-EGFRvIII/EphA2은 상기 실시예 5와 실시예 9에 기재한 방법과 동일한 방법으로 제작하였다. 더불어 EGFRvIII을 과발현 시킨 DKMG세포주인 DKMG-EGFRvIII의 경우 Cether사에서 구입하여 사용하였다. 이들 타겟 세포들은 GFP 유전자를 가진 렌티바이러스로 형질도입시켜 GFP를 발현시켜 실험에 이용하였다.
실시예 13. 교모세포종 동물 모델에서의 430 SL scFv 혹은 L1A SL scFv를 포함하며, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포와 L1A SL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T세포의 효과 비교
앞선 실시예를 통해 430 LL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T 세포와 430 LL scFv를 포함하며 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T 세포를 이용하여 EGFRvIII CAR-T 대비 EphA2 T cell engager EGFRvIII CAR-T 세포의 생체 내 (in vivo) 효능이 월등이 좋은 것을 확인하였다. 특히 상기 실시예 10에서 scFv링커의 길이가 CAR-T 세포의 성장에 영향을 미쳐 CAR-T가 분비하는 T cell engager의 양에도 영향을 주는 것을 확인한 바, SL를 보유한 scFv를 포함하는 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T 세포의 생체 내에서의 효능을 확인하였다.
이를 위하여 EphA2 T cell engager를 분비하는 다양한 EGFRvIII CAR-T 중 대표적으로 L1A SL scFv를 포함하는 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T 세포를 이용하였다. 더불어 비교군으로 430 SL scFv를 포함하며, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포와 EphA2 T cell engager를 분비하지 않는 L1A SL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T 세포를 이용하였다. 각 CAR-T 세포를 동물모델에 주사하기 전에 각 동물에 존재하는 암의 크기를 IVIS 기기를 이용하여 광자 값으로 수치화하고 광자 값에 따라 동물모델을 실험군당 5마리씩 무작위로 배치하였다. 배양중인 CAR-T 세포는 계수한 후 anti-Flag-PE (L5, Biolegend)로 염색하여 CAR의 발현 정도를 확인하였다. CAR 발현율에 따라 CAR+세포를 동물 당 0.1×106 혹은 0.05×106 세포가 되도록 수거하여 세척한 후 이를 100μL의 5% HSA에 현탁하여 I.V.로 동물에 주사하였다. 이후 매 1주마다 IVIS기기를 이용하여 각 동물모델의 광자 값을 측정함으로써 암 크기의 변화를 모니터링하였다. 또한 동물모델의 몸무게도 매주 측정하였다.
그 결과 도 21 및 도 22에 나타낸 바와 같이, L1A SL scFv를 포함하며, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T 세포 0.1×106(0.1M)을 주사한 실험군의 경우 7일째부터 5마리중 3마리에서는 암이 모두 제거되었으며 14일째에는 모든 개체에서 암이 제거되어 84일까지 암이 재발하지 않았다. 더불어 L1A SL scFv를 포함하며, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T 세포 0.05×106(0.5M)을 주사한 경우에는 7일째에는 암이 거의 줄지 않았으나, 14일에 암이 모두 제거되었고 84일까지 암이 재발하지 않았다. 반면 EphA2 T cell engager를 분비하지 않으며, L1A SL scFv를 포함하는 EGFRvIII CAR-T 세포 0.1×106을 주사한 실험군의 경우 14일에 암의 크기가 줄어드는 듯 하였으나, 이후 계속적으로 암이 커져 84일째에는 5개체 중 2개체만 생존했다. 이를 통해 UTD 대비 암을 억제하는 효과가 있으나 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T 세포에 대비해서는 낮은 항암 효과를 가짐을 확인하였다. 또한 430 SL scFv를 포함하며, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포 0.1×106(0.1M)를 주사한 실험군의 경우, 14일에 암이 제거되었으나, 그 이후 84일까지 암이 서서히 증가하였다. 이를 통해 UTD 대비 우수한 암을 억제하는 효과를 가지고 있으나, L1A SL scFv를 포함하며, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T 세포에 대비해서는 암 재발을 억제하는 능력이 다소 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
더불어 모든 실험군의 체중(body weight)를 확인한 결과 도 23에 나타낸 바와 같이, EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포와 EGFRvIII CAR-T세포의 주입은 동물모델의 체중에 영향을 미치지 않았다.
종합적으로, 본 발명은 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포를 제조한 후 이의 활성을 확인한 것으로, 본 발명에 따른 EphA2 T cell engager를 분비하는 EGFRvIII CAR-T세포는 EGFRvIII 및/또는 EphA2를 발현하는 타겟 세포에 대한 특이적 살상 활성을 보이고, 그 효과가 EGFRvIII만 타겟하는 CAR-T세포보다 우수함을 확인하였을 뿐만 아니라, 뇌암을 유발한 동물모델에서의 유의미하게 우수한 치료 효과를 보임을 확인하였다.

Claims (44)

  1. 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR) 및 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서,
    상기 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 암호화하는 핵산 서열을 포함하고,
    상기 돌연변이 EGFR 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 하기 군에서 선택된 1 종의 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드:
    a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
    b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
    c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
    d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
    e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
    f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 돌연변이 EGFR은 EGFRvIII인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 a) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 7로 표시되는 경쇄 가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 a) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 9로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 b) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 17로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 18로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 b) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 19로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 20으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 c) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 27로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 28로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 c) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 29로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 30으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 d) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 37로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 38로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 d) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 39로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 40으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 e) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 47로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 48로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 e) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 49로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 50으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 f) 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 57로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 58로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 f) 단일 쇄 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 영역은 서열번호 59로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며, 중쇄 가변 영역은 서열번호 60으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 돌연변이 EGFR에 결합하는 scFv의 경쇄 가변영역 및 중쇄 가변영역은 (GGGGS)m 링커로 연결되며, 상기 m은 1 내지 10인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 링커는 서열번호 61 및 서열번호 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 돌연변이 EGFR 특이적 키메라 항원 수용체는 서열번호 63, 서열번호 65, 서열번호 67, 서열번호 69, 서열번호 71, 서열번호 73, 서열번호 75, 서열번호 77, 서열번호 79, 서열번호 81, 서열번호 83 및 서열번호 85로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 scFv를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 서열번호 63으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 64로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 66으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 67로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 68로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 69로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 70으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 71로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 72로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 73으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 74로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 75로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 76으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 77로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 78로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 79로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 80으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 81로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 82로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되고; 상기 서열번호 83으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 84로 표시되는 염기서열에 의해 암호화되며; 상기 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv)은 서열번호 86으로 표시되는 염기서열에 의해 암호화;되는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv과 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;는 링커로 연결된 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 링커는 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제 1항에 있어서,
    상기 돌연변이 EGFR에 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열, EphA2에 결합하는 scFv를 암호화하는 핵산 서열 및 CD3에 결합하는 scFv는 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  22. 제 1항에 있어서,
    상기 돌연변이 EGFR 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩티드, 줄기 도메인, 막 관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제 1항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 자가 절단 도메인을 더 포함하며,
    상기 돌연변이 EGFR 특이적 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산 서열, 자가 절단 도메인을 암호화하는 핵산 서열 및 EphA2 T 세포 인게이저를 암호화하는 핵산 서열이 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제 22항에 있어서,
    상기 줄기 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgE, IgM, CD28 및 CD8 힌지로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  25. 제 22항에 있어서,
    상기 막 관통 도메인은 FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, CD40, DAP10, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1, TNFSF14, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD154, T 세포 수용체의 알파 쇄, T 세포 수용체의 베타 쇄 및 T 세포 수용체의 제타 쇄로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  26. 제 22항에 있어서,
    상기 세포내 전달 도메인은 CD3ζ, FcγR, ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), OX40(CD134), CD27, CD28, IL-2Rβ, IL-15R-α, MyD88, DAP10, DAP12, MHC class I 분자, TNF 수용체 단백질, Immunoglobulin-유사 단백질, 사이토카인 수용체, 인테그린, SLAM 단백질, 활성화 NK 세포 수용체, BTLA, Toll 리간드 수용체, CD2, CD7, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, B7-H3, GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8α, CD8β, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA4, VLA1, CD49a, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD83 특이적 리간드, CD247, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD8, Ig alpha(CD79a), IL-2Rγ, IL-7Rα, PD-1 및 TNFSF14로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  27. 제 23항에 있어서,
    상기 자가 절단 도메인은 2A 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  28. 제 27항에 있어서,
    상기 2A 펩타이드는 토세아시그나 바이러스(Thoseaasigna virus) 2A (T2A), 돼지 테스코바이러스(teschovirus)-1 2A (P2A), 말 비염 A 바이러스(rhinitis A virus) 2A (E2A) 및 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 2A (F2A)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오타이드.
  29. 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  30. 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 감염시키는 단계를 포함하는, EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 분비하며 EGFR 돌연변이를 타겟하는 CAR-T의 생산 방법.
  31. 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 형질전환된 T세포.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 T 세포는 EphA2 T세포 인게이저(EphA2 T cell engager)를 분비하고, EGFR 돌연변이를 타겟하는 것을 특징으로 하는, 형질전환된 T세포.
  33. 제 31항에 있어서,
    상기 T세포는 알파 베타 T세포, 감마 델타 T세포 또는 NKT세포인, 형질전환된 T세포.
  34. 제 31항에 있어서,
    상기 T세포는 동종 T세포, 자가 T세포, 조작된 자가 T세포 (eACT), 또는 종양-침윤 림프구 (TIL)인, 형질전환된 T세포.
  35. 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드; 또는 제 31항의 형질전환된 T세포를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  36. 제 35항에 있어서,
    상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  37. 제 35항에 있어서,
    상기 암은 뇌암, 유방암, 폐암, 편평세포암, 위암, 대장암, 두경부암, 췌장암, 자궁암, 난소암, 방광암 및 항문암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  38. a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
    b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
    c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
    d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
    e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
    f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 항원 결합 도메인(scFv)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하는 형질전환된 T세포; 및
    서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 포함하는 EphA2 T 세포 인게이저를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  39. 제 38항에 있어서,
    상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  40. 제 38항에 있어서,
    상기 암은 뇌암, 유방암, 폐암, 편평세포암, 위암, 대장암, 두경부암, 췌장암, 자궁암, 난소암, 방광암 및 항문암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  41. 제 1항에 따른 폴리뉴클레오타이드; 또는 제 31항의 형질전환된 T세포를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암을 치료하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서.,
    상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는, 암을 치료하는 방법.
  43. a) 서열번호 1로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 4로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 단일 쇄 가변 단편(scFv);
    b) 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 12로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 13으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 14로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 16으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
    c) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 22로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 23으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 24로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 25로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 26으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
    d) 서열번호 31로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 32로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 33으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 34로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 35로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 36으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;
    e) 서열번호 41로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 42로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 43으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 44로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 45로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 46으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv; 및
    f) 서열번호 51로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 52로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 서열번호 54로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 55로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 scFv;로 이루어진 군에서 선택된 1 종의 항원 결합 도메인(scFv)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 EGFR(epidermal growth factor receptor) 특이적 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 발현하는 형질전환된 T세포; 및
    서열번호 87로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 EphA2(ephrin type-A receptor 2)에 결합하는 scFv; 및 서열번호 88로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CD3에 결합하는 scFv;를 포함하는 EphA2 T 세포 인게이저를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 암을 치료하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서,
    상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는, 암을 치료하는 방법.
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