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WO2023167336A1 - 線維化疾患の治療又は予防のための医薬組成物 - Google Patents

線維化疾患の治療又は予防のための医薬組成物 Download PDF

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WO2023167336A1
WO2023167336A1 PCT/JP2023/008195 JP2023008195W WO2023167336A1 WO 2023167336 A1 WO2023167336 A1 WO 2023167336A1 JP 2023008195 W JP2023008195 W JP 2023008195W WO 2023167336 A1 WO2023167336 A1 WO 2023167336A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
p4ha3
gene
mrna expression
mrna
expression level
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/008195
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
道雄 仲矢
Original Assignee
国立大学法人九州大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人九州大学 filed Critical 国立大学法人九州大学
Priority to JP2024504455A priority Critical patent/JPWO2023167336A1/ja
Publication of WO2023167336A1 publication Critical patent/WO2023167336A1/ja

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a nucleic acid that inhibits the expression of mRNA encoding the alpha 3 subunit of prolyl 4-hydroxylase (P4HA3), specifically for lungs and other organs comprising said nucleic acid.
  • P4HA3 prolyl 4-hydroxylase
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing at least one fibrotic disease selected from the group consisting of fibrosis, liver cirrhosis, renal failure, myocardial infarction and cancer.
  • Fibrosis is a state in which fibrous proteins such as collagen are excessively accumulated in organs.
  • fibrotic diseases are referred to herein as all diseases characterized by physical hardening of the organ caused by overproduction of fibrous proteins.
  • fibrous proteins that are excessively accumulated in organs are called fibrosis-associated factors.
  • Fibrotic diseases are common in that myofibroblasts are the main body that overproduces fibrosis-related factors, even if the organs are different. Fibrotic diseases are responsible for approximately 45% of all deaths in developed countries (Non-Patent Document 1).
  • TGF ⁇ tumor necrosis factor
  • Non-Patent Document 2 nucleic acid drugs targeting growth factors
  • HSP47 collagen-specific molecular chaperones
  • HSP47 collagen-specific molecular chaperones
  • HSP47 Patent Document 1
  • HSP47 collagen-specific molecular chaperones
  • HSP47 Patent Document 1
  • HSP47 collagen-specific molecular chaperones
  • Attempts to treat fibrotic diseases are known.
  • the target genes of these conventional therapeutic drug candidates for fibrotic diseases do not have a high expression specificity for myofibroblasts, and the effect of suppressing the expression of fibrosis-related factors is limited.
  • An object of the present invention is to provide a novel fibrotic disease therapeutic or preventive drug that has a higher expression specificity for target genes in myofibroblasts and a higher inhibitory effect on the expression of fibrosis-related factors than conventional therapeutic drug candidates for fibrotic diseases. It is to provide a pharmaceutical composition. To that end, it is necessary to identify genes that are specifically expressed only in myofibroblasts and are directly involved in the overproduction of fibrosis-associated factors. There is a great demand to provide a pharmaceutical composition that can be expected to have a higher therapeutic or preventive effect in more fibrotic diseases.
  • the present inventors searched for genes that are specifically expressed in myofibroblasts, and identified prolyl 4-hydroxylase as a molecular target capable of preventing overproduction of extracellular matrix proteins by myofibroblasts.
  • a specific isoform of the alpha subunit, alpha 3 subunit (P4HA3) is specifically expressed in myofibroblasts, and inhibition of the gene expression suppresses the production of collagen and other fibrosis-related proteins,
  • the present inventors have discovered that it can ameliorate inflammatory diseases, and have completed the present invention.
  • the present invention provides pharmaceutical compositions for treating or preventing fibrotic diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a nucleic acid that inhibits the expression of mRNA encoding the alpha 3 subunit of prolyl 4-hydroxylase (hereinafter referred to as "P4HA3").
  • the fibrotic disease may be at least one disease selected from the group consisting of fibrosis in lungs, skin and other organs, liver cirrhosis, renal failure, myocardial infarction and cancer.
  • the nucleic acid may have a nucleotide sequence complementary to at least part of the mRNA encoding P4HA3.
  • the nucleic acid may be siRNA or antisense nucleic acid.
  • the siRNA comprises an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous sequences of any one of SEQ ID NOs: 9 to 11 and at least 15 contiguous sequences of the oligonucleotide. It may also be a siRNA consisting of an oligonucleotide containing a complementary sequence.
  • the siRNA is a pair of an oligonucleotide containing the sequence of SEQ ID NO:5 and an oligonucleotide containing the sequence of SEQ ID NO:6, or an oligonucleotide containing the sequence of SEQ ID NO:7 and the oligonucleotide of SEQ ID NO:8. It may be paired with an oligonucleotide containing the sequence.
  • the siRNA is a pair of an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 1 and an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 2, or an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 3 and an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 4. It may be paired with an oligonucleotide consisting of the sequence.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a nucleic acid delivery carrier.
  • the nucleic acid delivery carrier may be liposomes or lipid nanoparticles.
  • the liposome may be a liposome that specifically adsorbs to myofibroblasts and encapsulates the nucleic acid.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain a drug P other than the nucleic acid that inhibits the expression of mRNA encoding P4HA3.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a fibrotic disease, comprising administering an effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention to a subject suffering from or at risk of suffering from a fibrotic disease.
  • the fibrotic disease may be at least one disease selected from the group consisting of fibrosis, liver cirrhosis, renal failure, myocardial infarction and cancer.
  • myofibroblasts are almost absent, and diseases other than fibrotic diseases Patients and healthy subjects have no side effects, while in patients with fibrotic diseases, the production of fibrosis-related proteins can be suppressed more strongly than conventional therapeutic agents for fibrotic diseases.
  • Graphs showing temporal changes in relative mRNA expression levels of P4HA3 (A), ⁇ -SMA (B) and periostin (C) in the heart after myocardial infarction ⁇ represents the infarcted area, ⁇ represents the non-infarcted area, and ⁇ represents the mRNA expression level of each gene measured by real-time RT-PCR method in the sham treated group.
  • Error bars represent the standard deviation of the infarct region expression levels of mRNA for each gene 7 days after treatment.
  • the vertical axis is the relative value of the mRNA expression level of each gene, where the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the heart sample on day 0 of the sham treatment group with the GAPDH gene mRNA expression level is 1, and the horizontal axis is myocardial infarction.
  • the sample numbers for the infarcted area, non-infarcted area and sham-treated group were 5-6, 3 and 3-4, respectively.
  • P-values were calculated by unpaired two-tailed Student's t-test. ### in the graph represents the significance of p ⁇ 0.001 for infarct area vs.
  • B, C and D are enlarged views of the area enclosed by the dashed line in A.
  • B Fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with a periostin probe.
  • C Fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with the P4HA3 probe.
  • D Fluorescence microscopy image merged from B and C fluorescence microscopy images. Scale represents 10 ⁇ m.
  • a t-SNE plot diagram showing the results of single-cell analysis of each cell type in mouse heart before and after treatment with a myocardial infarction model created using data from Parkhi N. et al, (2019).
  • A Dimensional reduction plot of cell populations expressing mRNAs specific to each cell type.
  • B Dimensional reduction plot visualization of cell populations expressing the ⁇ SMA (Acta2) gene.
  • C A dimensionality reduction plot diagram visualizing a cell population expressing the periostin (Postn) gene.
  • D A dimensionality reduction plot visualizing a cell population expressing the P4HA3 gene. Mac represents clusters of macrophages, Endo endothelial cells, Mural smooth muscle cells and pericytes, Fibro fibroblasts, and ActFib activated fibroblasts. Bar graph showing the effect of P4HA3 knockdown on P4HA3 (A), periostin (B), 1 ⁇ type 1 collagen (C), 3 ⁇ type 1 collagen (D) gene expression in myofibroblasts isolated from the infarct region.
  • si P4HA3 and si Ctrl each represent the relative value of the mRNA expression level of each gene measured by real-time RT-PCR method in myofibroblasts to which siRNA against P4HA3 gene and control gene was administered.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level. The number of samples is 5 each. P-values were calculated by two-tailed unpaired t-test. Error bars represent standard deviation.
  • Graph A shows the relative values of P4HA3 mRNA expression levels in the lung tissue of the bleomycin-treated group (Bleomycin) or sham-treated group (Saline), and graph B shows the ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet group (NASH) or normal diet.
  • NASH ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet group
  • Graph C represents the relative value of P4HA3 mRNA expression level in the liver tissue of the fed group (Ctrl), and the relative value of the P4HA3 mRNA expression level in the renal tissue of the UUO-treated group (UUO) or the sham-treated group.
  • the vertical axis of each bar graph represents the relative value of the P4HA3 mRNA expression level, with the value corrected by the GAPDH mRNA expression level being 1.
  • P-values were calculated by two-tailed unpaired t-test. The number of samples was 5 for the lung (A) and liver (B) fibrosis induction experiments, and 3 for the sham-treated group and 8 for the UUO-treated group for the kidney (C) fibrosis induction experiment.
  • Hepatic injury liver fibrosis model mice due to carbon tetrachloride administration were collected 4 weeks after the start of solvent administration (Vehicle), 4 weeks after the start of carbon tetrachloride administration (CCl 4 ), and 4 weeks after discontinuation of carbon tetrachloride administration (Withdraw). Bar graphs showing temporal changes in the relative values of mRNA expression measured by real-time RT-PCR for P4HA3 (A), ⁇ -SMA (B), and 1 ⁇ 1 type collagen (C) in liver tissues treated with the same method.
  • each bar graph represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene with the GAPDH mRNA expression level in the vehicle group 4 weeks after the start of solvent administration.
  • the number of samples is 5. ** indicates P ⁇ 0.01, *** indicates P ⁇ 0.001.
  • P-values were calculated by two-tailed unpaired t-test. Error bars represent standard deviation.
  • Each bar graph (0W, 3W, 6W, 9W and 12W) shows mice before, 3 weeks, 6 weeks, 9 weeks and 12 weeks after ultra-high fat choline-deficient methionine diet, respectively.
  • Fig. 2 shows time-dependent changes in the relative value of mRNA expression levels of P4HA3 measured by real-time RT-PCR in liver tissues collected from .
  • the vertical axis of each bar graph represents the relative value of the P4HA3 mRNA expression level at each time point, where the value obtained by correcting the P4HA3 mRNA expression level before feeding with the GAPDH mRNA expression level is 1. Results of 6 experiments under the same conditions (5 times only 3 weeks after feeding).
  • Each bar graph shows the liver tissue (NASH) of NASH-developing mice that were fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet for 5 weeks and collected 5 weeks after stopping the diet, and control mice that were fed a normal diet.
  • P4HA3 mRNA expression level (A), ⁇ -smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) mRNA expression level (B), and 1 ⁇ 1 type collagen mRNA expression level (C) in liver tissue (Ctrl) were compared. represent.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the Ctrl group with the GAPDH gene mRNA expression level. P-values were calculated by two-tailed unpaired t-test. The number of samples is 5. Cyp7a1 (A), Cd68 (B), ⁇ -SMA (C) and P4HA3 (D) genes were measured by real-time RT-PCR method for each cell type fraction of the liver collected 4 weeks after the start of carbon tetrachloride administration. Bar graph showing relative values of mRNA expression levels.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the hepatocyte fraction with the GAPDH mRNA expression level. P-values were calculated by two-tailed unpaired t-test. The number of samples is 1. Error bars represent standard deviation. P4HA3 knockdown on expression of P4HA3 (A), 1 ⁇ type collagen (B), 1 ⁇ 2 type collagen (C), 3 ⁇ 1 type collagen (D) and elastin (E) genes in liver-derived myofibroblasts of hepatic fibrosis model mice A bar chart showing the impact of .
  • each bar graph is the siRNA of the control gene (si Ctrl), the center is the first siRNA of the P4HA3 gene (si P4HA3 #1), and the right is the second siRNA of the P4HA3 gene (si P4HA3 #2).
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH gene mRNA expression level.
  • the vertical axis of each graph represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, with the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the Saline group by the GAPDH mRNA expression level being 1.
  • P-values were calculated by two-tailed unpaired t-test. The number of samples is 5.
  • P4HA3 (A), 1 ⁇ 1 type collagen (B), 3 ⁇ 1 type collagen (C) and 14 ⁇ 1 type collagen (D ) Bar graph showing the effect of P4HA3 knockdown on gene expression.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level.
  • i-vi indicate the locations of kidney tissue sections. Fluorescence microscopy showing in situ hybridization results with P4HA3 and 1 ⁇ type 1 collagen probes and fluorescence histochemistry results with anti- ⁇ -SMA antibody of sham treated renal tissue sham corresponding to region i in Fig. 12-1. Images (all 2Ox).
  • the center of the upper row is a fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with the P4HA3 probe.
  • the upper right is a fluorescence microscope image showing the results of fluorescence histochemistry with an anti- ⁇ -SMA antibody.
  • the upper left is a fluorescence microscope image obtained by merging the fluorescence microscope images in the upper center and upper right with the DAPI-stained fluorescence microscope image.
  • the lower left is a fluorescent microscope image showing the results of in situ hybridization with a 1 ⁇ 1 type collagen probe.
  • the center of the lower row is a fluorescence microscopy image obtained by merging the middle and right fluorescence microscopy images of the upper row.
  • the lower right is a fluorescence microscopy image obtained by merging the upper middle and lower left fluorescence microscopy images.
  • the center of the upper row is a fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with the P4HA3 probe.
  • the upper right is a fluorescence microscope image showing the results of fluorescence histochemistry with an anti- ⁇ -SMA antibody.
  • the upper left is a fluorescence microscope image obtained by merging the fluorescence microscope images in the upper center and upper right with the DAPI-stained fluorescence microscope image.
  • the lower left is a fluorescent microscope image showing the results of in situ hybridization with a 1 ⁇ 1 type collagen probe.
  • the center of the lower row is a fluorescence microscopy image obtained by merging the middle and right fluorescence microscopy images of the upper row.
  • the lower right is a fluorescence microscopy image obtained by merging the upper middle and lower left fluorescence microscopy images.
  • Results of in situ hybridization using P4HA3 and 1 ⁇ 1 type collagen probes of renal tissue sections of UUO-2 region (see region ii in FIG. 12-1) on the side treated for unilateral ureteral obstruction, and fluorescence histochemistry results using anti- ⁇ -SMA antibody Fluorescence microscope images showing (all 20x).
  • the center of the upper row is a fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with the P4HA3 probe.
  • the upper right is a fluorescence microscope image showing the results of fluorescence histochemistry with an anti- ⁇ -SMA antibody.
  • the upper left is a fluorescence microscope image obtained by merging the fluorescence microscope images in the upper center and upper right with the DAPI-stained fluorescence microscope image.
  • the lower left is a fluorescent microscope image showing the results of in situ hybridization with a 1 ⁇ 1 type collagen probe.
  • the center of the lower row is a fluorescence microscopy image obtained by merging the middle and right fluorescence microscopy images of the upper row.
  • the lower right is a fluorescence microscopy image obtained by merging the upper middle and lower left fluorescence microscopy images. Results of in situ hybridization with P4HA3 and 1 ⁇ 1 type collagen probes of renal tissue section of UUO-3 region (see region iii in FIG.
  • the center of the upper row is a fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with the P4HA3 probe.
  • the upper right is a fluorescence microscope image showing the results of fluorescence histochemistry with an anti- ⁇ -SMA antibody.
  • the upper left is a fluorescence microscope image obtained by merging the fluorescence microscope images in the upper center and upper right with the DAPI-stained fluorescence microscope image.
  • the lower left is a fluorescent microscope image showing the results of in situ hybridization with a 1 ⁇ 1 type collagen probe.
  • the center of the lower row is a fluorescence microscopy image obtained by merging the middle and right fluorescence microscopy images of the upper row.
  • the lower right is a fluorescence microscopy image obtained by merging the upper middle and lower left fluorescence microscopy images.
  • the center of the upper row is a fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with the P4HA3 probe.
  • the upper right is a fluorescence microscope image showing the results of fluorescence histochemistry with an anti- ⁇ -SMA antibody.
  • the upper left is a fluorescence microscope image obtained by merging the fluorescence microscope images in the upper center and upper right with the DAPI-stained fluorescence microscope image.
  • the lower left is a fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with a 1 ⁇ 1 type collagen probe.
  • the center of the lower row is a fluorescence microscopy image obtained by merging the central and right fluorescence microscopy images of the upper row.
  • the lower right is a fluorescence microscopy image obtained by merging the upper middle and lower left fluorescence microscopy images.
  • FIG. 1 Schematic diagram showing the relationship between changes in the expression levels of the P4HA3 gene and fibrosis-related genes (1 ⁇ 1 type collagen and ⁇ -SMA) during the progression of fibrosis.
  • Western blotting diagram showing expression of P4HA3 protein in P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO) and wild-type mice (WT).
  • the upper panel shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis separation of total protein from liver myofibroblasts detected with an antibody against the P4HA3 protein, and the lower panel shows the results of detection of the separation with an antibody against the GAPDH protein.
  • FIG. 1 is a line graph showing changes over time in body weight change rates when P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO) and wild-type mice (WT) were fed with an ultra-high-fat choline-deficient methionine diet.
  • the top line graph is a normal chow-fed wild-type mouse (WT Ctrl), below that is a normal chow-fed P4HA3 gene-deficient mouse (P4HA3-KO Ctrl), then ultra-high-fat choline-deficient Wild-type mice (WT NASH) fed a methionine-reduced diet, and the line graph at the bottom represents P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO NASH) fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • Fig. 10 is a bar graph showing the relative values of percentage of liver weight to body weight after 10 weeks of feeding with ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet or normal diet.
  • the bar graph shows, from the far left, wild-type mice fed a normal diet (WT Ctrl), wild-type mice fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (WT NASH), and P4HA3 gene-deficient mice fed a normal diet ( P4HA3-KO Ctrl), and the far right represents the percentage of liver weight relative to the body weight of P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO NASH) fed with an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • WT Ctrl normal diet
  • WT NASH ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet
  • P4HA3-KO Ctrl P4HA3 gene-deficient
  • the vertical axis represents the relative liver weight/body weight of each mouse group when the liver weight/body weight of wild-type mice fed with a normal diet is taken as 100%. Each group of mice has 8-10 individuals. *** represents P ⁇ 0.001. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation 1 ⁇ 1 type collagen (A), 1 ⁇ 2 type collagen (B), 3 ⁇ 1 type collagen (C), and elastin (C) in P4HA3 gene-deficient mice and wild-type mice after feeding a high-fat choline-deficient methionine-reduced diet or a normal diet for 10 weeks A bar graph comparing the relative values of the expression levels of D).
  • Each bar graph shows, from the left, wild-type mice fed a normal diet (WT Ctrl), wild-type mice fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (WT NASH), and P4HA3 gene-deficient mice fed a normal diet (P4HA3 -KO Ctrl), and the far right shows the mRNA expression level of each gene in P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO NASH) fed with an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene of WT Ctrl with the mRNA expression level of GAPDH is 1.
  • Each group of mice has 8-10 individuals. *** represents P ⁇ 0.001. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • the left figure is a Picrosirius Red-stained optical microscope image of a liver section of a P4HA3 gene-deficient mouse (P4HA3-KO) or a wild-type mouse (WT) fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (NASH) or a normal diet (Ctrl). is.
  • the scale represents 1 mm.
  • the figure on the right shows the results of evaluation by histopathological analysis of these microscopic images.
  • Each bar graph shows, from the left, wild-type mice fed a normal diet (WT Ctrl), wild-type mice fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (WT NASH), and P4HA3 gene-deficient mice fed a normal diet (P4HA3 -KO Ctrl), and the far right represents the percentage of collagen accumulation area in the liver of P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO NASH) fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • the vertical axis of the graph represents the percentage of collagen accumulation area.
  • Each group of mice has 6 individuals.
  • Liver function markers AST left panel
  • ALT in the serum of P4HA3 gene-deficient mice P4HA3-KO
  • WT wild-type mice
  • NASH ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet
  • Ctrl normal diet
  • Each bar graph shows, from the left, wild-type mice fed a normal diet (WT Ctrl), wild-type mice fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (WT NASH), and P4HA3 gene-deficient mice fed a normal diet (P4HA3 -KO Ctrl), and the far right represents the enzyme activity of AST or ALT in P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO NASH) fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • the vertical axis of the graph represents the enzymatic activity of AST or ALT (unit: IU/L).
  • Each group of mice has 5-6 individuals.
  • the vertical axis represents the enzymatic activity of AST or ALT. * indicates P ⁇ 0.05, ** indicates P ⁇ 0.01. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level in each cell fraction, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the hepatocyte fraction with the GAPDH mRNA expression level.
  • Graph A is a bar graph showing the relative values of the expression levels of the Hsp47 gene in myofibroblasts derived from fibrosis liver by administration of carbon tetrachloride to which siHsp47 or siCtrl was administered.
  • Graph B is a bar graph showing the relative values of the expression levels of the P4HA3 gene in myofibroblasts to which siP4HA3 or siCtrl was administered.
  • Graphs C to F show 1 ⁇ 1 type collagen (C), 3 ⁇ 1 type collagen (D), 8 ⁇ 1 type collagen (E), and 14 ⁇ 1 type collagen ( F) A bar graph showing relative values of gene expression levels.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level.
  • the number of samples for each is four. ** indicates P ⁇ 0.01, *** indicates P ⁇ 0.001, n.p. s indicates no significant difference. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • Graphs A to D show Hsp47 (A), P4HA3 (B), 1 ⁇ type collagen (C), or 1 ⁇ 2 in myofibroblasts derived from hepatopathic fibrotic livers administered with si Hsp47 and/or si P4HA3, respectively.
  • 2 is a bar graph showing relative values of mRNA expression levels of type collagen (D).
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level. The number of samples for each is four. *** represents P ⁇ 0.001, n.p. s indicates no significant difference. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • Graphs A to D show, respectively, 3 ⁇ 1 type collagen (A), 8 ⁇ 1 type collagen (B), 14 ⁇ 1 type collagen (C ) or a bar graph showing the relative expression levels of the elastin (D) gene.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level.
  • Each sample number is 5. * indicates P ⁇ 0.05, ** indicates P ⁇ 0.01, *** indicates P ⁇ 0.001, n. s indicates no significant difference.
  • P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation. Kaplan-Meier curves showing the relationship between the level of P4HA3 gene expression and the prognosis of bladder cancer (A), head and neck squamous cell carcinoma (B), cervical squamous cell carcinoma (C) and liver hepatocellular carcinoma (D). be.
  • Cases with high expression of the P4HA3 gene are shown in black, and cases with low expression of the P4HA3 gene are shown in gray. Both were created with a Kaplan-Meier Plotter.
  • 2 is a Kaplan-Meier curve showing the relationship between the level of P4HA3 gene expression and the prognosis of pancreatic ductal carcinoma (E), breast cancer (F), gastric adenocarcinoma (G) and lung squamous cell carcinoma (H). Cases with high expression of the P4HA3 gene are shown in black, and cases with low expression of the P4HA3 gene are shown in gray. Both were created with a Kaplan-Meier Plotter.
  • the upper graph is a graph showing the time course of relative expression levels of different isoforms P4HA3, P4HA1 and P4HA2 of P4HA3 mRNA in the heart after myocardial infarction.
  • ⁇ indicates the infarcted area
  • ⁇ indicates the non-infarcted area
  • ⁇ indicates the mRNA expression level of each gene measured by real-time RT-PCR method in the sham-treated group.
  • the vertical axis is the relative value of the mRNA expression level of each gene, where the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene with the GAPDH mRNA expression level on the day of myocardial infarction treatment (0) is 1, and the horizontal axis is the relative value of the mRNA expression level of each gene after myocardial infarction treatment.
  • the bottom row is a t-SNE plot created using the data of Parkhi N.
  • FIG. 1 is a dimensionality reduction plot diagram; FIG. The upper row shows the type 1 ⁇ 1 collagen gene (Col1 ⁇ 1) in heart tissue at the site of myocardial infarction induced by transverse aortic coarctation (TAC) or in heart tissue from sham-treated control mice (Sham). , P4HA3 mRNA relative isoforms P4HA3, P4HA1 and P4HA2.
  • TAC transverse aortic coarctation
  • Sham sham-treated control mice
  • FIG. 4 is a bar graph showing relative values of mRNA expression levels for different isoforms P4HA3, P4HA1 and P4HA2.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the Sham or Saline group with the GAPDH mRNA expression level. * indicates P ⁇ 0.05, *** indicates P ⁇ 0.001, n.p. s indicates no significant difference.
  • FIG. 4 is a bar graph showing relative values of mRNA expression levels of different isoforms of P4HA P4HA3, P4HA1 and P4HA2.
  • FIG. 10 is a bar graph showing relative values of mRNA expression levels with Forms P4HA3, P4HA1 and P4HA2.
  • FIG. The vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the Ctrl or Sham group with the GAPDH mRNA expression level. *** represents P ⁇ 0.001. P-values were calculated by Student's t-test. Error bars represent standard deviation.
  • Fig. 3 is a bar graph showing the effect of siCtrl, siP4HA1, siP4HA2 and siP4HA3 on gene expression of 3 ⁇ 1 type collagen (Col3 ⁇ 1) and elastin (Eln)).
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level. The number of samples for each is four.
  • FIG. 26a is a bar graph showing the mRNA expression levels of P4HA3 or type 1 ⁇ 1 collagen (Col1 ⁇ 1) in LX-2 treated with PBS or PBS supplemented with TGF ⁇ (5 ng/mL) for 12 hours.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the Ctrl group with the GAPDH mRNA expression level. The number of samples for each is three.
  • FIG. 26b shows P4HA3, 1 ⁇ type collagen (Col1 ⁇ 1 ), 1 ⁇ 2 type collagen (Col1 ⁇ 2), and 3 ⁇ 1 type collagen (Col3 ⁇ 1).
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level. Each sample number is 5. Comparisons between groups were calculated by Tukey's range test after one-way analysis of variance.
  • Fig. 26c shows SMAD3, P4HA3, 1 ⁇ type 1 collagen in myofibroblasts isolated from liver tissue of liver fibrosis model mice with hepatic injury due to carbon tetrachloride administration and transfected with siRNA against SMAD3 (siSmad3) or siCtrl.
  • 1 is a bar graph showing the mRNA expression levels of (Col1 ⁇ 1), 1 ⁇ 2 type collagen (Col1 ⁇ 2), and 3 ⁇ 1 type collagen (Col3 ⁇ 1).
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level. Each sample number is 5. Comparisons between groups were calculated by Tukey's range test after one-way analysis of variance. * indicates P ⁇ 0.05, ** indicates P ⁇ 0.01, *** indicates P ⁇ 0.001, n. s indicates no significant difference.
  • fibrotic diseases refer to all diseases characterized by physical hardening of organs caused by overproduction of fibrous proteins. Fibrotic diseases include, but are not limited to, myocardial infarction, liver cirrhosis, as well as renal failure, fibrosis of the lungs and other organs, and some cancers.
  • the modulus of elasticity of normal liver is about 5 kPa, whereas the modulus of elasticity of lesions of fatty liver or cirrhosis increases to about 8-75 kPa.
  • the modulus of elasticity of a normal heart is about 10 kPa, whereas the modulus of elasticity of a lesioned portion of myocardial infarction increases to about 35-70 kPa.
  • any fibrotic disease physical stiffening of organs leads to functional deterioration of each organ.
  • Physical hardening of organs is caused by excessive accumulation of fibrous proteins, which are extracellular matrix components such as collagen and elastin, in organs. Therefore, the fibrous protein is called a fibrosis-associated factor.
  • myofibroblasts also called activated astrocytes in the liver.
  • Myofibroblasts are differentiated from fibroblasts, pericytes, endothelial cells, epithelial cells, and bone marrow-derived cells that are always present in normal tissues, triggered by inflammatory reactions, ischemic reactions, mechanical stimuli, and the like.
  • Myofibroblasts have contractility, and ⁇ -smooth muscle actin (hereinafter also referred to as ⁇ SMA or ACTA2) is a marker specific to myofibroblasts.
  • ⁇ SMA or ACTA2 ⁇ -smooth muscle actin
  • cancer lesions are known to be physically hardened compared to the surrounding normal tissue. Physically consolidated cancer lesions also involve the overproduction of fibrosis-associated factors by myofibroblasts.
  • fibrotic diseases were classified differently, such as liver cirrhosis, myocardial infarction, and pulmonary fibrosis, according to the causes of physical consolidation, such as inflammation, ischemia, and malignant neoplasms.
  • Fibrotic diseases are defined as all diseases characterized by physical hardening of the organ caused by overproduction of fibrotic proteins. Fibrotic diseases include, but are not limited to, myocardial infarction, liver cirrhosis and renal failure, fibrosis of the lungs, skin and other organs, and cancer with focal physical consolidation.
  • Each gel bead is immobilized with a reverse transcription primer having a unique DNA barcode, ie, a unique molecular identifier (UMI).
  • UMI unique molecular identifier
  • cDNA synthesis reactions, cDNA library construction, and cDNA sequencing on each droplet or well yield cDNA sequence data that include UMI-derived sequences at the 3' ends of mRNAs from individual cells.
  • the obtained cDNA sequence data are subjected to computer analysis.
  • a single cell gene expression analysis system sold by 10x Genomics, etc. and a next-generation sequencer sold by Illumina, etc. are often used, but reagents, kits, equipment and/or software other than these are used. can be used.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of fibrotic diseases.
  • the pharmaceutical composition comprises a nucleic acid that inhibits the expression of mRNA encoding the ⁇ 3 subunit of prolyl 4-hydroxylase (P4HA3).
  • the mRNA encoding the ⁇ 3 subunit of prolyl 4-hydroxylase (P4HA3) whose expression is inhibited by the nucleic acid contained in the pharmaceutical composition of the present invention includes humans and other primates, and mice and other rodents. , but not limited to.
  • knockdown refers to inhibition of mRNA expression of a gene by a nucleic acid that inhibits the expression of mRNA encoding that gene. Inhibition of expression is referred to as P4HA3 knockdown.
  • Prolyl 4-hydroxylase is an enzyme that catalyzes the post-translational hydroxylation of proline residues in collagen and elastin to convert them to hydroxyproline. Hydroxyproline stabilizes the three-stranded helical structure of collagen.
  • Prolyl 4-hydroxylase is a tetrameric protein consisting of two ⁇ subunits and two ⁇ subunits. There are three isoforms, the ⁇ 3 subunit (P4HA3). The ⁇ subunit is a multifunctional protein known to function as a monomeric protein disulfide isomerase.
  • P4HA3 was upregulated in the treated group over the sham-treated group, whereas P4HA1 and P4HA2 were upregulated in both the sham-treated and treated groups. There was no significant difference in expression in , or even if there was a significant difference, the difference in expression between the sham-treated group and the treated group was not as large as that of P4HA3.
  • the pharmaceutical composition of the present invention suppresses mRNA expression of fibrosis-related factors by suppressing P4HA3 mRNA expression produced by myofibroblasts. Therefore, not only patients with symptomatic findings of fibrotic disease, but also subjects with myocardial infarction and inflammatory diseases of the liver, lungs, kidneys, or other causes of fibrotic disease who still have fibrotic disease.
  • myofibroblasts can suppress mRNA expression of fibrosis-related factors to prevent fibrotic diseases.
  • nucleotide sequences of DNA encoding human P4HA3 mRNA are registered in the NCBI Reference Sequence as, for example, NM_182904.4, NM_182904.5, NM_001288748.1, NM_001288748.2, XR_001747836.1 and XR_001747837.1.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding mouse P4HA3 mRNA is registered in NCBI Reference Sequence as, for example, NM_177161.4.
  • Specific embodiments of the nucleic acids contained in the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to (a) to (d) below.
  • siRNA that inhibits the expression of mRNA encoding P4HA3 or its precursor
  • an oligo RNA complementary to the mRNA encoding P4HA3 and A double-stranded RNA consisting of its complementary strand that is, siRNA can be mentioned.
  • siRNA can be designed based on the cDNA sequence information of the target gene, for example, according to the rules proposed by Elbashir et al. (Genes Dev., 15, 188-200 (2001)).
  • any linker sequence capable of forming a loop structure is appropriately selected to separate the sense strand and antisense strand of siRNA. It can be designed by connecting via the linker sequence.
  • a candidate siRNA that inhibits the expression of human P4HA3 mRNA is a nucleotide sequence corresponding to human P4HA3 mRNA (variant 1: NM_001288748, SEQ ID NO: 9, full length nucleotide 2255, or variant 2: NM_001288748, SEQ ID NO: 10, full length nucleotide 2248 ), including a nucleotide sequence complementary to a sequence consisting of at least 15 contiguous nucleotides of the full-length sequence.
  • a candidate siRNA that inhibits the expression of mouse P4HA3 mRNA should be selected from at least 15 contiguous nucleotides of the full length sequence of the nucleotide sequence corresponding to mouse P4HA3 mRNA (NM_177161.4, SEQ ID NO: 11, full length 2361 nucleotides). contains a nucleotide sequence that is complementary to a sequence that is
  • the siRNA of the present invention that inhibits expression of P4HA3 mRNA comprises a double-stranded RNA comprising a nucleotide sequence complementary to a sequence consisting of at least 15 contiguous nucleotides of the DNA sequence listed in SEQ ID NO: 9 or 10. .
  • the siRNA of the present invention is a double-stranded RNA containing the RNA sequences listed in SEQ ID NOS: 5 and 6, or a double-stranded RNA containing the RNA sequences listed in SEQ ID NOS: 7 and 8, or SEQ ID NOS: 1 and 2.
  • RNA sequences listed Including, but not limited to, double-stranded RNA consisting of the RNA sequences listed or double-stranded RNA consisting of the RNA sequences listed in SEQ ID NOS:3 and 4.
  • the two RNAs that constitute the siRNA of the present invention may consist of nucleotide sequences that are completely complementary to each other. It may contain one or several nucleotides.
  • SEQ ID NO: 1 sense strand of siRNA #1 (si P4HA3#1) against mouse P4HA3 SEQ ID NO: 2 antisense strand of mouse si P4HA3#1
  • SEQ ID NO: 3 sense strand of siRNA #2 (si P4HA3#2) against mouse P4HA3 4 mouse si P4HA3#2 antisense strand
  • SEQ ID NO: 5 fully complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NO: 7 that is fully complementary to the nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 8 that is fully complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 3 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 9 sense strand of siRNA #1
  • a nucleotide molecule that constitutes siRNA and/or shRNA may contain only natural ribonucleotides, but may also contain deoxyribonucleotides and natural or non-natural modified nucleotides. In order to reduce off-target effects, or to improve stability (chemically and/or against enzymes) or specific activity (affinity with RNA), various chemical modifications known per se can be included.
  • siRNA against mRNA encoding human P4HA3 for example, siRNA targeting the 1st and 2nd exons, the 2nd exon, or the 9th exon of the human P4HA3 gene is commercially available from Thermo Fisher Scientific. Available.
  • siRNA against mRNA encoding mouse P4HA3 includes, for example, exons 1 and 2, exons 2, exons 3, exons 4, exons 4 and 5, and exons 4 and 5 of mouse P4HA3 gene.
  • siRNAs targeting exon 6, exon 7, exon 8 and 9, or exon 13 are commercially available from Thermo Fisher Scientific, Inc. It is also possible to obtain designed or newly designed siRNA against mRNA encoding human P4HA3 from BIONEER CORPORATION (Daejeon, South Korea) represented by Cosmo Bio Co., Ltd. and others.
  • siRNA is prepared by synthesizing the sense strand and antisense strand of the target sequence on mRNA with an automatic DNA/RNA synthesizer, and denaturing them in an appropriate annealing buffer at about 90 to about 95°C for about 1 minute. It can be prepared by annealing at about 30 to about 70° C. for about 1 to about 8 hours. It can also be prepared by synthesizing shRNA, which is a precursor of siRNA, and cleaving it with dicer.
  • nucleic acids designed to be capable of producing siRNA and/or shRNA that inhibit the expression of mRNA encoding P4HA3 in vivo are also included in the nucleic acids that inhibit the expression of said mRNA.
  • nucleic acids include expression vectors constructed to express the shRNA or siRNA described above.
  • a promoter eg, CMV immediate early promoter
  • a pol III promoter is generally used for accurate transcription of short RNA.
  • Pol III promoters include mouse and human U6-snRNA promoters, human H1-RNase P RNA promoters, human valine-tRNA promoters, and the like.
  • a sequence in which 4 or more Ts are consecutive is used as a transcription termination signal.
  • Antisense nucleic acid against mRNA encoding P4HA3 is a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the mRNA or a portion thereof, and is specific to the target mRNA. It also has the function of suppressing protein synthesis by forming and binding to a stable double chain.
  • Antisense nucleic acids can be DNA or RNA, or can be DNA/RNA chimeras. When the antisense nucleic acid is DNA, an RNA:DNA hybrid formed by the target RNA and the antisense DNA can be recognized by endogenous RNase H to cause selective degradation of the target RNA.
  • the target region of the antisense nucleic acid is not particularly limited in length as long as the hybridization of the antisense nucleic acid results in inhibition of protein translation, and the entire sequence of the mRNA encoding the protein. or a partial sequence, the short one being about 10 bases, and the long one being the whole sequence of mRNA or initial transcription product.
  • antisense nucleic acids not only hybridize with target mRNAs and initial transcription products to inhibit translation into proteins, but also bind to these genes, which are double-stranded DNA, to form triplexes. However, it may be one (antigene) that can inhibit transcription into RNA.
  • the nucleotide molecule that constitutes the antisense nucleic acid may also be modified in the same manner as in the above siRNA and the like in order to improve stability, specific activity, and the like.
  • the target sequence of mRNA or initial transcription product is determined based on the cDNA sequence or genomic DNA sequence of the target gene, and a complementary sequence is synthesized using a commercially available automatic DNA/RNA synthesizer. It can be prepared by
  • a nucleic acid designed to be capable of producing an antisense RNA against mRNA encoding P4HA3 in vivo is also defined as being included in the antisense nucleic acid against said mRNA.
  • nucleic acids include expression vectors constructed to express the antisense RNA described above.
  • a polII-based promoter or a polIII-based promoter can be appropriately selected and used according to the length of the antisense RNA to be transcribed.
  • Ribozyme nucleic acid against mRNA encoding P4HA3 A ribozyme nucleic acid capable of specifically cleaving the mRNA encoding P4HA3 within the coding region can also be used as a nucleic acid that suppresses the expression of the mRNA encoding P4HA3.
  • the term "ribozyme” is narrowly defined as an RNA having an enzymatic activity that cleaves nucleic acids, but is used herein as a concept that includes DNA as long as it has a sequence-specific nucleic acid-cleaving activity.
  • ribozyme nucleic acids are self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as viroids and virusoids, and hammerhead and hairpin types are known.
  • a ribozyme when used in the form of an expression vector containing the DNA that encodes it, it can be a hybrid ribozyme in which a tRNA-modified sequence is further ligated in order to promote translocation of the transcript into the cytoplasm. .
  • miRNAs miRNA against mRNA encoding P4HA3
  • MicroRNAs miRNAs that target the P4HA3-encoding mRNA also either complementarily bind to the P4HA3-encoding mRNA to repress translation of the mRNA, or degrade the mRNA, resulting in post-transcriptional expression of P4HA3.
  • the sequences of miRNAs targeting mRNAs encoding P4HA3 can be searched using search software provided free of charge on various websites. Examples of such sites include, but are not limited to, TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_80/) published by the Whitehead Institute of the United States.
  • miRNAs that target the mRNA encoding P4HA3 include, for example, hsa-miR-335-5p (MIRT018485), hsa-miR-124-3p (MIRT022868), mmu-miR-466i-5p (MIRT586397), mmu- Included are miR-466k (MIRT586399) and mmu-miR-466d-5p (MIRT586400).
  • the nucleic acid that inhibits the expression of mRNA encoding P4HA3, contained in the pharmaceutical composition of the present invention may contain at least one type of nucleic acid of the above (a) to (d). may contain two or more types of nucleic acids of different molecular species, or may contain two or more different types of nucleic acids.
  • a nucleic acid delivery carrier contained in the pharmaceutical composition of the present invention A nucleic acid delivery carrier contained in the pharmaceutical composition of the present invention, capable of carrying the nucleic acid contained in the pharmaceutical composition of the present invention, and carrying the nucleic acid into cells. There are no particular restrictions on the structure, constituent molecules, and carrier form of the nucleic acid, as long as they can be delivered to the cell.
  • a representative nucleic acid drug delivery system (DDS) is a complex formed based on electrostatic interaction between a positively charged cationic liposome, cationic polymer, or the like and a nucleic acid as a carrier. is mentioned. After binding to the negatively charged cell membrane, the complex is internalized by adsorptive endocytosis.
  • nucleic acid delivery carriers used in the present invention include, for example, liposomes (e.g., cationic liposomes, PEG-modified liposomes, etc.), lipid nanoparticles (LNP), cationic polymers (e.g., polyethyleneimine, polylysine , polyornithine, chitosan, atelocollagen, protamine, etc.), liposomes encapsulating cationic polymers, and the like, but are not limited thereto.
  • exosomes which are biologically derived components, can also be used. Liposomes or lipid nanoparticles are preferred, and liposomes are more preferred.
  • liposome refers to a microscopic closed vesicle having an internal phase surrounded by one or more lipid bilayers, usually a water-soluble substance in the internal phase and a fat-soluble substance in the lipid bilayer. can hold.
  • the nucleic acids of the present invention may be retained within the liposome internal phase or within the lipid bilayer.
  • the liposomes used in the present invention may be single-layered or multi-layered, and the particle size can be appropriately selected within the range of, for example, 10 to 1000 nm, preferably 50 to 300 nm. Considering delivery to corneal tissue, the particle size can be, for example, 200 nm or less, preferably 100 nm or less.
  • components of the liposome used in the present invention include natural phospholipids such as lecithin, semisynthetic phospholipids such as dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), and dioleylphosphatidylethanol.
  • DMPC dimyristoylphosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitoylphosphatidylcholine
  • DSPC distearoylphosphatidylcholine
  • dioleylphosphatidylethanol dioleylphosphatidylethanol.
  • Amines DOPE
  • DLPC dilauroylphosphatidylcholine
  • N-( ⁇ -trimethylammonioacetyl)-didodecyl-D-glutamate chloride TMAG
  • N,N',N'',N''-tetramethyl-N,N',N'',N '''-tetrapalmitylspermine TMAG
  • TMG N,N',N'',N''-tetramethyl-N,N',N'',N '''-tetrapalmitylspermine
  • DOSPA 2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate
  • DOSPA 2,3-dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate
  • DOSPA N -[1-(2,3-dioleyloxy)propyl
  • the nucleic acid delivery carrier of the present invention more efficiently delivers the nucleic acid of the present invention to myofibroblasts. Therefore, it is desirable to include a compound that specifically binds to myofibroblasts.
  • myofibroblasts are known to readily take up vitamin A. Therefore, the nucleic acid delivery carrier of the present invention, for example, a liposome, preferably has a membrane surface modified with a retinoid derivative and/or a vitamin A analog having high binding affinity to vitamin A binding protein.
  • the binding or inclusion of the retinoid derivative and/or vitamin A analogue to the nucleic acid delivery carrier of the present invention involves chemically and/or physically binding the retinoid derivative and/or vitamin A analogue to other components of the nucleic acid delivery carrier. It is also possible by combining or including. Alternatively, the binding or inclusion of a retinoid derivative and/or vitamin A analogue to the nucleic acid delivery carrier of the present invention can be achieved by combining the retinoid derivative and/or vitamin A analogue with a forming affinity with the basic nucleic acid delivery carrier components during the preparation of the nucleic acid delivery carrier. Alternatively, it is also possible by incorporating a vitamin A analogue into the component of the nucleic acid delivery carrier.
  • the amount of the retinoid derivative and/or vitamin A analog to be bound or included in the nucleic acid delivery carrier of the present invention is 0.01% to 100%, preferably 0.2% to 100% by weight of the components of the nucleic acid delivery carrier. It can be 20%, more preferably 1-5%.
  • Nucleic acid delivery carriers comprising retinoid derivatives and/or vitamin A analogues and lipids are well known to those skilled in the art, such as the composition disclosed in Japanese Patent No. 6590888, for example.
  • Methods for encapsulating water-soluble compounds such as nucleic acids in liposomes include lipid film method (vortex method), reverse phase evaporation method, surfactant removal method, freeze-thaw method, remote loading method and the like. It is not limited, and any known method can be selected as appropriate.
  • lipid nanoparticles refers to a large pore structure (e.g., liposome) or small pore structure (e.g., means particles with an average diameter of less than 1 ⁇ m without mesoporous materials).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain an agent P other than the nucleic acid that inhibits the expression of mRNA encoding P4HA3.
  • the drug P may be any drug on the condition that it does not substantially affect the efficacy of the nucleic acid that inhibits the expression of the mRNA encoding P4HA3.
  • drug P may be an active ingredient of any existing medicament for fibrotic diseases.
  • Existing drugs for any of the fibrotic diseases may be, for example, nucleic acid drugs such as nucleic acids that inhibit the expression of mRNA encoding Hsp47, or non-nucleic acid drugs such as pirfenidone. good.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be a drug for reducing side effects of a nucleic acid that inhibits the expression of mRNA encoding P4HA3.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention exhibited a synergistic effect when used in combination with nucleic acids that inhibit the expression of mRNA encoding Hsp47. Similar to P4HA3, Hsp47 and P4HA3 have in common that they suppress the mRNA expression of fibrosis-related factors. It is thought that the synergistic effect is exhibited because inhibition differs from the mechanism of action that suppresses mRNA expression of fibrosis-related factors.
  • pirfenidone do not suppress the mRNA expression of fibrosis-associated factors and thus have a different mechanism of action. Therefore, it can be easily expected that the pharmaceutical composition of the present invention will exhibit a synergistic effect when used in combination with a non-nucleic acid drug such as pirfenidone.
  • the pharmaceutical composition of the present invention consists of subcutaneous, intravenous, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intracranial and intrathecal administration. It can be delivered by parenteral administration of at least one selected from the group. Said administration may be continuous or chronic, short term or intermittent.
  • Therapeutic agents of the invention are administered for at least 30 days, at least 35 days, at least 40 days, at least 45 days, at least 50 days, at least 55 days, at least 60 days, at least 65 days, at least 70 days, at least 75 days, Down of mRNA encoding P4HA3 for at least 80 days, at least 85 days, at least 90 days, at least 95 days, at least 100 days, at least 105 days, at least 110 days, at least 115 days, at least 120 days, or at least 1 year regulation and/or 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 100% of the intracellular levels of the diseased tissue of fibrosis-associated factors resulting in a reduction of
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention may be oral administration such as tablets, capsules, granules, powders or syrups.
  • These formulations contain excipients such as sugar derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as maize starch, potato starch, alpha starch, dextrin; cellulose derivatives such as crystalline cellulose; gum arabic; dextran; organic excipients such as pullulan; and silicate derivatives such as light silicic anhydride, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, and magnesium aluminometasilicate; phosphates such as calcium hydrogen phosphate; carbonates such as calcium; inorganic excipients such as sulfates such as calcium sulfate), lubricants (e.g.
  • metal stearates such as stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate salts; talc; colloidal silica; waxes such as Veegum, Gey wax; boric acid; adipic acid; sulfates such as sodium sulfate; lauryl sulfate such as magnesium lauryl sulfate; silicic anhydride, silicic acid such as silicic acid hydrate; pyrrolidone, macrogol, and compounds similar to the above excipients), disintegrants (e.g., low-substituted hydroxypropylcellulose, carboxyl group methylcellulose, carboxyl group methylcellulose calcium, internally crosslinked carboxyl group methylcellulose sodium cellulose derivatives such as; carboxyl group methyl starch, carboxyl group methyl starch sodium, chemically modified starch celluloses such as crosslinked polyvinylpyrrolidone can be mentioned.), stabilizers (methylparaben, propylparab
  • the active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention is a nucleic acid that inhibits the expression of the mRNA encoding P4HA3 (when the nucleic acid delivery carrier binds or associates with the nucleic acid, the nucleic acid delivery carrier binds or associates with the nucleic acid). the nucleic acid).
  • the ratio of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately set within the range in which the desired effect can be exhibited, but it is usually 0.01 to 100% by weight, preferably 0.1%. ⁇ 99.9% by weight, more preferably 0.5 to 99.5% by weight.
  • the dosage for administering the pharmaceutical composition of the present invention must be carefully adjusted taking into account the age, weight and condition of the individual to be treated, the route of administration, dosage form and method of administration, and the exact dosage must be determined by a physician.
  • the actual dosage is within the discretion of the physician and may vary by titrating the particular situation of the invention to obtain the desired therapeutic effect.
  • the dose of the pharmaceutical composition of the present invention is not generally defined according to the type of the active ingredient, the body weight and age of the subject to be administered, symptoms, etc.
  • the lower limit is 0.001 mg/kg body weight (preferably 0.01 mg/kg body weight), and the upper limit is 100 mg/kg body weight (preferably 10 mg/kg body weight).
  • the lower limit is 0.01 mg/kg body weight (preferably 0.1 mg/kg body weight), and the upper limit is 1000 mg/kg body weight (preferably 100 mg/kg body weight), once or several times per day for symptoms. It is desirable to administer as needed.
  • Desirable therapeutic effects used in determining the selection of the active ingredient, carrier, dosage and method of administration of the pharmaceutical composition of the present invention include inhibition of progression of clinical symptoms of fibrotic disease (physical hardening of affected tissue) and/or Mitigation is paramount. However, as a surrogate endpoint prior to clinical symptoms, the reduction and/or disappearance of fibrosis-related factors accumulated in the diseased tissue is also used to determine the selection of the active ingredient, carrier, dosage and method of administration of the pharmaceutical composition of the present invention. be able to.
  • One embodiment of the present invention is a method for preventing or treating a fibrotic disease, which comprises administering an effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention to a subject suffering from or at risk of suffering from a fibrotic disease.
  • administering to a subject who is likely to suffer from a fibrotic disease means a subject with myocardial infarction and an inflammatory disease of the liver, lungs, kidneys, or other cause of the fibrotic disease, who still has fibrotic disease. It means administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject who has not yet developed a disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention suppresses mRNA expression of fibrosis-associated factors by suppressing mRNA expression of P4HA3 produced by myofibroblasts.
  • a fibrotic disease can be prevented by administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject at a stage that does not lead to the disease.
  • the adnominal "about” that modifies a numerical value means a numerical range of 90% or more and 110% or less of the numerical value.
  • “about 40%” refers to a percentage within a numerical range of 36% to 44%.
  • Example 1 Search for genes specifically expressed in myofibroblasts In addition, we searched for proteins whose expression levels were significantly increased in the heart, and further narrowed down the molecules whose expression levels varied depending on the surrounding stiffness (mechanical stimulation) in myofibroblasts.
  • mice used in the examples of this specification were C57BL/6J pure-bred mice purchased from Japan SLC Co., Ltd. Male mice were 8 to 10 weeks old and female mice were 6 to 8 weeks old.
  • NASH model mice were prepared by feeding wild-type mice with an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet and mice fed with a normal diet. After that, RNA was collected from each mouse liver, RNA-seq was performed, and mRNA expression levels of genes were compared. An attempt was made to identify genes that are not normally expressed at all in the liver but whose expression level is increased in the NASH liver.
  • mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of Somnopentyl injection (50 mg/kg sodium pentobarbital) and a cannula was inserted into the trachea.
  • Somnopentyl injection 50 mg/kg sodium pentobarbital
  • the thoracotomy was performed through a left intercostal incision, the heart was aspirated out of the thoracic cavity and the left anterior descending coronary artery was ligated with a 6 mm silk braid suture.
  • the sham group thoracotomy and prolapse of the heart from the thoracic cavity were performed, but no ligation was performed.
  • the heart was returned to the thoracic cavity and closed.
  • the expression level of mRNA such as P4HA3 in the examples of this specification was quantified as follows.
  • the concentration of the purified RNA was determined with a microvolume spectrophotometer DS-11 (DeNovix), and reverse transcription reaction to cDNA was performed using High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Quantification of mRNA was performed according to the protocol of Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) by activating DNA synthetase at 95°C for 60 seconds, denaturing cDNA at 95°C for 15 seconds, and elongation reaction at 60°C for 30 seconds. was performed for 45 cycles. Analysis was performed by the ⁇ Ct method using GAPDH as an internal standard.
  • Mouse Cyp7a1 probe was purchased from Applied Biosystems.
  • Fig. 1 shows a graph showing the time course of the relative expression levels of P4HA3 (A), ⁇ -SMA (B) and periostin (C) in the heart after myocardial infarction.
  • ⁇ SMA is a myofibroblast-specific marker
  • periostin is also an extracellular matrix protein known to be specifically expressed in myofibroblasts.
  • ⁇ represents the infarcted area
  • ⁇ represents the non-infarcted area
  • ⁇ represents the mRNA expression level of each gene measured by real-time RT-PCR method in the sham treated group.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the heart sample on day 0 of the sham treatment group with the GAPDH gene mRNA expression level is 1,
  • the horizontal axis represents the number of days (unit: day) after myocardial infarction treatment.
  • the sample numbers for the infarcted area, non-infarcted area and sham-treated group were 5-6, 3 and 3-4, respectively.
  • P-values were calculated by unpaired two-tailed Student's t-test. ### in the graph represents the significance of p ⁇ 0.001 for infarct area vs.
  • RNAscopeTM reagent kit Advanced Cell Diagnostics, Cosmo Bio Inc.
  • In situ hybridization was performed using RNAscope from Advanced Cell Diagnostics according to the protocol.
  • the prepared frozen tissue sections were first washed with PBS, dropped with a protease solution, and reacted at 40° C. for 30 minutes in a HybEZTM oven (Advanced Cell Diagnostics). After that, a probe for P4HA3 was added dropwise to the tissue section, reacted in a HybEZTM oven at 40° C. for 2 hours, and then subjected to signal amplification reaction with Amp solution.
  • FIG. 2 is a panel of fluorescence microscope images showing the results of in situ hybridization of heart sections 7 days after myocardial infarction.
  • A is a fluorescence microscope image obtained by merging a fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with periostin and P4HA3 probes and a DAPI-stained fluorescence microscope image.
  • B, C and D are all enlarged views of the area enclosed by the dashed line in A.
  • B is a fluorescence microscopy image showing the results of in situ hybridization with a periostin probe
  • C is a fluorescence microscopy image showing the results of in situ hybridization with a P4HA3 probe
  • D is a fluorescence microscopy image in which the fluorescence microscopy images of B and C are merged.
  • P4HA3 mRNA is specifically expressed in myofibroblasts, like periostin mRNA. It is scattered in clusters in part of the cytoplasm of fibroblasts.
  • FIG. 3 is a t-SNE plot diagram created using the data of Parkhi N. et al, (2019) supra, showing the results of single-cell analysis of each cell type in the mouse heart before and after myocardial infarction model treatment.
  • A is a dimension reduction plot of cell populations expressing mRNAs specific to each cell type
  • B is a dimension reduction plot visualizing cell populations expressing ⁇ SMA (Acta2) gene
  • C is periostin (Postn) gene expression.
  • D is a dimensionality reduction plot diagram visualizing a cell population expressing the P4HA3 gene.
  • Mac macrophages, End, endothelial cells, Cycling, proliferating endothelial cells, Mural, smooth muscle cells and pericytes, Fibro, fibroblasts, and ActFibro, activated fibroblasts.
  • Example 3 Effect of P4HA3 Knockdown on Expression of Each Gene in Myofibroblasts Derived from Site of Myocardial Infarction
  • the culture of myofibroblasts from the infarcted region of a disease model mouse of myocardial infarction is described by Nakaya, M., supra. et al. (2017). Briefly, three days after the coronary artery ligation procedure, the ventricles of mice in the treatment group were excised with PBS containing 0.1% collagenase A (Roche Diagnostics) and 0.1% trypsin (Sigma-Aldrich). and digested with agitation at 37°C.
  • P1 (passage 1) myofibroblasts were used as myofibroblasts.
  • Myofibroblasts were transfected with siRNA using Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
  • the si P4HA3 used was ThermoFisher Scientific Catalog No. 4390771 (Assay ID: s115723) added to the myofibroblast cultures at a final concentration of 3.125 nM.
  • si Ctrl used as a control siRNA was ThermoFisher Scientific catalog number 4390843 added to the myofibroblast cultures at a final concentration of 3.125 nM. Quantification of mRNA expression levels of P4HA3 and the like in myofibroblasts after siRNA treatment was performed in the same manner as in Example 2.
  • FIG. 4 shows the effect of siRNA against the P4HA3 gene on the expression of the P4HA3 (A), periostin (B), 1 ⁇ 1 type collagen (C), and 3 ⁇ 1 type collagen (D) genes in myofibroblasts isolated from the infarct region.
  • si P4HA3 and si Ctrl represent relative values of mRNA expression levels of each gene measured by real-time RT-PCR method in myofibroblasts administered with siRNA against P4HA3 gene and siRNA against control gene, respectively.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH gene mRNA expression level.
  • the number of samples is 5.
  • P-values were calculated by two-tailed unpaired t-test. Error bars represent standard deviation.
  • myofibroblasts treated with siP4HA3 (the same siRNA as siP4HA3#1 in Example 7) expressed not only P4HA3 mRNA, but also mRNA expression of periostin, 1 ⁇ 1 type collagen and 3 ⁇ 1 type collagen. was also strongly inhibited.
  • the above P4HA3 knockdown experiments suggested that P4HA3 functions as an essential regulatory factor for the transcription of periostin, 1 ⁇ 1-type collagen and 3 ⁇ 1-type collagen in myofibroblasts differentiated after myocardial infarction.
  • Example 4 Involvement of P4HA3 in Fibrosis in Other Organs
  • disease model mice of pulmonary fibrosis, fatty liver and chronic renal failure were used.
  • quantification of mRNA expression levels of P4HA3 and the like was performed in the same manner as in Example 2.
  • Pulmonary fibrosis disease model mice were created by anesthetizing 6- to 8-week-old female mice with isoflurane inhalation and intrabronchial administration of physiological saline containing bleomycin.
  • the dose was 1 mg/kg for lung tissue mRNA extraction samples, and the dose was 1.5 mg/kg for preparation of other tissue sections, isolation of myofibroblasts, and measurement of viability.
  • saline alone was injected.
  • Lung RNA was collected 14 days after administration of bleomycin or saline alone.
  • Liver fibrosis model mice were prepared by administration of carbon tetrachloride or feeding of ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diets.
  • carbon tetrachloride 0.4 mL per 1 kg body weight
  • corn oil as a solvent
  • intraperitoneally administered twice a week for 4 weeks liver fibrosis is observed.
  • the administration of carbon tetrachloride was discontinued and the rats were reared for another 4 weeks, the liver fibrosis findings disappeared.
  • mice by carbon tetrachloride after administration of carbon tetrachloride for 4 weeks (CCl 4 group), after administration of corn oil alone as a control experiment for 4 weeks (Vehicle group), or administration of carbon tetrachloride was discontinued. Then, liver RNA was collected after further feeding for 4 weeks (Withdraw group). Vehicle group and CCl4 group were anesthetized with somnopentyl 24 hours after the final administration, and withdraw group 4 weeks after the final administration. After confirmation, the liver was excised. Then, according to the protocols of Isogen (Nippon Gene) and RNeasyPlus Mini Kit (Qiagen), total RNA was collected.
  • NASH model mice with diets were fed with ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (60 kcal% fat content, lard use, choline deficiency, methionine-reduced (0.1%), CDAHFD (ResearchDiets)) for 5 weeks, and then fed normally. Liver RNA was collected after returning to diet (SD (Research Diets)) and feeding for an additional 5 weeks.
  • SD Research Diets
  • UUO unilateral ureteral obstruction
  • Eight- to ten-week-old female mice were anesthetized by inhalation of 1.5% isoflurane, and the mice were fixed on an operating table in the supine position while maintaining inhalation anesthesia. It was performed by making a midline abdominal incision, exposing the right ureter, and ligating the ureter with a 6-0 silk braid suture under surgical microscopy. After that, 30 ⁇ L of procaine penicillin G solution was dropped into the abdominal cavity, and the incision was sutured with a suture thread.
  • Fig. 5 is a bar graph showing the expression level of mRNA measured by real-time RT-PCR of the P4HA3 gene in experimental fibrosis models of lung (A), liver (B) and kidney (C).
  • Graph A represents the relative value of P4HA3 mRNA expression levels in lung tissues of the bleomycin-treated group (Bleomycin) or sham-treated group (Saline), and graph B represents the ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet group (NASH) or normal diet.
  • NASH ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet group
  • bar graph C represents the relative value of the P4HA3 mRNA expression level in the renal tissue of the UUO-treated group (UUO) or the sham-treated group.
  • the vertical axis of each bar graph represents the relative value of the P4HA3 mRNA expression level, with the value corrected by the GAPDH gene mRNA expression level being 1. P-values were calculated by two-tailed unpaired t-test.
  • Example 5 Time course of mRNA expression of P4HA3 and fibrosis-related factors in transient fibrosis liver
  • Figure 6-1 shows transient liver fibrosis model mice by carbon tetrachloride administration, 4 weeks after the start of solvent administration (Vehicle), 4 weeks after the start of carbon tetrachloride administration (CCl 4 ), and 4 after cessation of carbon tetrachloride administration.
  • a bar graph showing changes over time in relative values of mRNA expression levels measured by real-time RT-PCR for P4HA3 (A), periostin (B), and 1 ⁇ 1 type collagen (C) in liver tissue collected after a week (Withdraw).
  • each bar graph represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene with the GAPDH mRNA expression level in the vehicle group 4 weeks after the start of solvent administration.
  • Fig. 6-2 is a bar graph showing changes over time in the expression level of P4HA3 mRNA in the liver of NASH model mice due to diet.
  • Each bar graph (0W, 3W, 6W, 9W and 12W) shows mice before, 3 weeks, 6 weeks, 9 weeks and 12 weeks after ultra-high fat choline-deficient methionine diet, respectively.
  • 1 is a bar graph showing changes over time in relative values of mRNA expression levels measured by real-time RT-PCR method of P4HA3 in liver tissue collected from mice.
  • the vertical axis of each bar graph represents the relative value of the P4HA3 mRNA expression level at each time point, where the value obtained by correcting the P4HA3 mRNA expression level before feeding with the GAPDH mRNA expression level is 1. This is the result of 6 experiments under the same conditions (5 times only after 3 weeks of feeding).
  • Fig. 7 is a bar graph showing the mRNA expression level of each gene measured by real-time RT-PCR method in NASH model mice fed with food.
  • Each bar graph shows the liver tissue (NASH) of NASH-induced mice that were fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet for 5 weeks and collected 5 weeks after stopping the diet, and the liver of control mice that were fed a normal diet.
  • NASH liver tissue
  • ⁇ -SMA ⁇ -smooth muscle actin
  • B 1 ⁇ 1 type collagen mRNA expression level
  • C 1 ⁇ 1 type collagen mRNA expression level
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the Ctrl group with the GAPDH gene mRNA expression level. P-values were calculated by two-tailed unpaired t-test.
  • ⁇ -SMA is a marker for myofibroblasts
  • 1 ⁇ 1 type collagen is one of the fibrosis-related factors produced by myofibroblasts. Therefore, from FIGS. 6-1, 6-2 and 7, myofibroblasts appear in liver fibrosis, as in myocardial infarction, and produce fibrosis-related factors. It was suggested that P4HA3 functions as an essential regulatory factor for transcription.
  • Example 6 Gene Expression in Fractions of Liver with Transient Fibrosis Using transient liver fibrosis model mice induced by carbon tetrachloride administration, it was determined whether P4HA3 is expressed only in myofibroblasts. Examined.
  • liver fibrosis model mice due to carbon tetrachloride administration the liver was removed 4 weeks after the start of carbon tetrachloride administration.
  • the liver was treated with collagenase A at 37° C. for 30 minutes, the cell suspension was centrifuged at 50 G for 1 minute, and the precipitated cells were isolated as the hepatocyte fraction.
  • the supernatant was seeded on a plastic plate and cultured overnight in DMEM supplemented with 10% FBS, then the cells adhered to the plate were collected using accutase, and a CD45 positive fraction was obtained using CD45 antibody-added magnetic beads. A fraction was separated as a hematopoietic cell fraction.
  • the CD45-negative fraction was used as the myofibroblast fraction.
  • the hepatocyte marker Cyp7a1, blood cell marker Cd68, myofibroblast marker ⁇ -SMA, and P4HA3 mRNA expression levels were quantified in the same manner as in Example 2.
  • FIG. 8 shows real-time RT-PCR of Cyp7a1 (A), Cd68 (B), ⁇ -SMA (C) and P4HA3 (D) genes in liver cell type fractions collected 4 weeks after the start of carbon tetrachloride administration.
  • 1 is a bar graph showing relative values of mRNA expression levels measured by the method. The vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the hepatocyte fraction with the GAPDH mRNA expression level.
  • Cyp7a1 mRNA expression was detected only in the hepatocyte fraction, Cd68 mRNA expression was detected almost exclusively in the blood cell fraction, and ⁇ -SMA and P4HA3 mRNA expression was detected almost exclusively in myofibroblasts. Detected in fractions only. Therefore, it was shown that P4HA3 is specifically expressed in myofibroblasts even in fibrotic liver.
  • Example 7 Effect of P4HA3 Knockdown on Expression of Fibrosis-Related Factors in Myofibroblasts Derived from Transient Fibrosis Liver Culture isolated from liver 4 weeks after the start of carbon tetrachloride administration in the same manner as in Example 3
  • the effect of P4HA3 mRNA expression suppression on the mRNA expression of other fibrosis-related factors was investigated. Livers were excised from carbon tetrachloride (CCl 4 )-induced liver fibrosis model mice and finely divided.
  • CCl 4 carbon tetrachloride
  • washing was performed using Washing buffer [25 mM HEPES/500 nM EDTA/HBSS (-)], and the liver pieces were treated in Digestion buffer [0.1% Collagenase A/15 mM HEPES/HBSS (-)] at 37°C for 30 minutes.
  • a cell solution containing myofibroblasts was collected by shaking the tube three times. After that, blood cell components were removed with Red Blood Cell Lysis Buffer, the cells were suspended in 10% FBS/1% Penicillin-Streptomycin/DMEM, and then seeded on a culture plate. After 6 hours, the medium was exchanged to remove non-adherent cells and debris.
  • si P4HA3#1 and si P4HA3#2 were obtained from ThermoFisher Scientific Cat. Nos. 4390771 and 4390771 (Assay IDs: s115723 and s115721), respectively, in cultures of the myofibroblasts at 3.125 nM using Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). was added at a final concentration of In experiments where si P4HA3#2 was not used as in Example 3, si P4HA3#1 was used as "si P4HA3". Silencer Select Negative Control no. 1 siRNA (ThermoFisher Scientific, catalog number: 4390843) was used as si Ctrl in the siRNA control experiment.
  • nucleotide sequences of the sense and antisense strands of si P4HA3#1 are listed as SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively, in the Sequence Listing attached hereto.
  • nucleotide sequences of the sense and antisense strands of si P4HA3#2 are listed as SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively, in the Sequence Listing attached hereto.
  • Figure 9 shows the P4HA3 gene (A), 1 ⁇ type collagen (B), 1 ⁇ 2 type collagen (C), 3 ⁇ 1 type collagen (D) and elastin (E) in myofibroblasts isolated from the liver of liver fibrosis model mice.
  • ) is a bar graph showing the effect of P4HA3 knockdown on gene expression.
  • the left of each bar graph represents the relative expression level of each gene in myofibroblasts administered with si Ctrl, the right with si P4HA3#1, and the center with si P4HA3#2.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH gene mRNA expression level.
  • siP4HA3#1 and siP4HA3#2 inhibited the mRNA expression of P4HA3 and 1 ⁇ 1 type collagen and other fibrosis-related factors in transient fibrotic liver-derived myofibroblasts.
  • the inhibitory effect was weaker than the inhibition of mRNA expression of fibrosis-related factors in myofibroblasts derived from the myocardial infarction site shown in FIG. 4 of Example 3.
  • siP4HA3#1 had a stronger inhibitory activity than siP4HA3#2 for any mRNA expression.
  • the difference in the mRNA expression inhibitory effect between siP4HA3#1 and #2 was greater for 1 ⁇ 1-type collagen and 1 ⁇ 2-type collagen than for P4HA3.
  • Example 8 mRNA Expression of P4HA3 and Fibrosis-Related Factors in Fibrotic Lung
  • mRNA expression of P4HA3 and other multiple fibrosis-related factors examined. Quantification of mRNA expression levels of P4HA3 and the like was performed in the same manner as in Example 2.
  • Figure 10 shows P4HA3 (A), ⁇ - 1 is a bar graph showing relative values of mRNA expression levels measured by real-time RT-PCR for SMA (B), 1 ⁇ 1 type collagen (C) and 3 ⁇ 1 type collagen (D) genes.
  • the vertical axis of each graph represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, with the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the Saline group by the GAPDH mRNA expression level being 1.
  • the mRNA expression levels of P4HA3, ⁇ -SMA, 1 ⁇ 1-type collagen and 3 ⁇ 1-type collagen increased in the treatment group compared to the sham treatment group.
  • the mRNA expression of P4HA3 and 1 ⁇ 1 type collagen increased in lungs of pulmonary fibrosis model mice as well as in livers of NASH model mice in FIG.
  • ⁇ -SMA was slightly increased in lungs of pulmonary fibrosis model mice compared to livers of NASH model mice. This is because, in the NASH model mouse shown in FIG.
  • mRNA expression in the liver collected 10 weeks after the start of feeding of the ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet was examined, whereas in the pulmonary fibrosis model by bleomycin administration shown in FIG.
  • the expression of mRNA in the lung collected 7 days after intrabronchial administration of bleomycin was examined, and the time from the initiation of fibrosis induction was short, and many myofibroblasts were not differentiated, so it is a marker of myofibroblasts. It was suggested that there was little increase in the expression level of ⁇ -SMA mRNA.
  • Example 9 Gene expression in each fraction of lung fibrosis caused by administration of bleomycin Using bleomycin-induced pulmonary fibrosis model mice, it was examined whether P4HA3 was expressed only in myofibroblasts.
  • Example 2 In the lung fibrosis model mouse by bleomycin administration created in the same manner as in Example 4, the lungs were excised 7 days after bleomycin administration. The liver was treated with collagenase A at 37° C. for 30 minutes, and the cell suspension was separated by FACSAria. did. . Quantitation of mRNA expression levels of Cd68, a hematopoietic cell marker, 1 ⁇ 1-type collagen, a fibrosis-related factor, and P4HA3 was performed in the same manner as in Example 2.
  • FIG. 11-1 shows Cd68 (A) in blood cell fractions and myofibroblast fractions isolated as CD45-positive fractions and PDGFR ⁇ -positive fractions by FACSAria from the lungs of bleomycin-administered pulmonary fibrosis model mice, respectively.
  • 1 is a bar graph showing relative values of mRNA expression levels measured by real-time RT-PCR method for genes of 1 ⁇ 1 type collagen (B) and P4HA3 (C).
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the hepatocyte fraction with the GAPDH mRNA expression level.
  • the blood cell fraction isolated as the CD45-positive fraction very strongly expresses the blood cell marker Cd68, but was isolated as the PDGFR ⁇ -positive fraction.
  • the myofibroblast fraction expressed little Cd68.
  • the myofibroblast fraction very strongly expressed 1 ⁇ 1-type collagen, which is a profibrotic factor, but the hematopoietic cell fraction hardly expressed 1 ⁇ 1-type collagen.
  • P4HA3 was very strongly expressed in the myofibroblast fraction, P4HA3 was hardly expressed in the blood cell fraction.
  • Example 10 Effect of P4HA3 knockdown on the expression of fibrosis-related factors in myofibroblasts derived from fibrotic lung investigated the effect of P4HA3 knockdown on the mRNA expression of fibrosis-associated factors.
  • Figure 11-2 shows P4HA3 (A), 1 ⁇ 1 type collagen (B), and 3 ⁇ 1 type collagen (C) in myofibroblasts isolated from the lungs of bleomycin-administered pulmonary fibrosis model mice and administered with siCtrl or siP4HA3.
  • 14 ⁇ type 1 collagen (D) gene expression are bar graphs showing the effect of siRNA administration. The left of each bar graph represents the relative value of the mRNA expression level of each gene in myofibroblasts to which si Ctrl was administered, and the right to which si P4HA3 was administered.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level.
  • FIG. 12-1 is a schematic coronal section including the long axis of a kidney with fibrosis due to unilateral ureteral obstruction (UUO). Physical pressure from the ureteral ligation results in thinner parenchyma in the combined cortex and medulla compared to sham kidneys.
  • ⁇ -SMA expression is strongest in the ureteral-proximal region of the renal medulla, and collagen expression is weaker than in the cortex-adjacent region of the renal cortex.
  • cortical-proximal regions of the renal cortex have the strongest expression of collagen and weaker expression of ⁇ -SMA compared to the proximal ureteral regions of the renal medulla. i-vi indicate the locations of kidney tissue sections.
  • FIG. 12-2 shows the results of in situ hybridization with P4HA3 and 1 ⁇ 1 type collagen probes of a sham treated kidney tissue section (sham) corresponding to region i in FIG. 12-1, and fluorescent tissue with anti- ⁇ -SMA antibody Fluorescence microscopy images showing chemical results (all 2Ox).
  • the upper center is a fluorescence microscopy image showing the results of in situ hybridization with the P4HA3 probe
  • the upper right is a fluorescence microscopy image showing the results of fluorescence histochemistry with an anti- ⁇ -SMA antibody
  • the upper left is a fluorescence microscopy image of the upper center and upper right. and a DAPI-stained fluorescence microscope image.
  • the lower left is a fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with a 1 ⁇ 1 type collagen probe
  • the lower center is a fluorescence microscope image that merges the upper center and upper right fluorescence microscope images
  • the lower right is the upper center and lower left fluorescence. It is a fluorescence microscopy image in which the microscopy images were merged.
  • Figure 12-3 is a fluorescence microscope image showing the results of in situ hybridization with P4HA3 and 1 ⁇ 1 type collagen probes of a renal tissue section of the UUO-1 region (see region i in Figure 12-1) on the side treated for unilateral ureteral obstruction. , Fluorescence microscope images showing fluorescence histochemistry results with anti- ⁇ -SMA antibody (all 20 ⁇ ). The description of each image is the same as in FIG. 12-2.
  • the UUO-1 region is the region with the strongest expression of ⁇ -SMA, which means that fibrosis has progressed to a high degree.
  • FIG. 12-4 shows the results of in situ hybridization with P4HA3 and 1 ⁇ 1 type collagen probes of renal tissue sections in the UUO-2 region (see region ii in FIG. 12-1) on the side treated for unilateral ureteral obstruction, and anti- ⁇ -SMA. It is a fluorescence microscopy image which shows the fluorescence histochemistry result by an antibody. (all 20x). The description of each image is the same as in FIG. 12-2.
  • the UUO-2 region is also the region where the expression of ⁇ -SMA is strongest, which means that fibrosis has progressed to a high degree.
  • FIG. 12-5 shows the results of in situ hybridization with P4HA3 and 1 ⁇ 1 type collagen probes of renal tissue sections of the UUO-3 region (see region iii in FIG. 12-1) on the side treated for unilateral ureteral obstruction, and anti- ⁇ -SMA. Fluorescent microscopy images showing fluorescence immunohistochemistry results with antibodies (all 2Ox). The description of each image is the same as in FIG. 12-2.
  • the UUO-3 region is a region in which ⁇ -SMA expression is weak to moderate, indicating that fibrosis is just progressing.
  • FIG. 12-6 shows the results of in situ hybridization with P4HA3 and 1 ⁇ 1 type collagen probes of renal tissue sections in the UUO-5 region (see region v in FIG. 12-1) on the side treated for unilateral ureteral obstruction, and anti- ⁇ -SMA. Fluorescence microscopy images showing antibody fluorescence histochemistry results (all 2Ox). The description of each image is the same as in FIG. 12-2.
  • the UUO-5 region is also a region in which ⁇ -SMA expression is weak to moderate, indicating that fibrosis is just progressing.
  • Fig. 13 is a schematic diagram summarizing the results obtained in Figs. 12-2 to 12-6.
  • ⁇ -SMA a myofibroblast marker
  • 1 ⁇ 1 type collagen and P4HA3 which reflect the fibrotic potential of myofibroblasts, are the strongest in the middle stage of fibrosis, and the expression is lower in the late stage of fibrosis than in the middle stage. It was clarified that the expression was higher than the initial stage, that is, the expression was moderate.
  • P4HA3 knockout mice hepatic fibrosis in mice homozygous for the P4HA3-deficient gene
  • the P4HA3 knockout mice used in the examples of the present specification construct a genome editing construct such that normal P4HA3 mRNA is not transcribed using the CRISPR / Cas9 system, and the construct is mated with a C57BL / 6N male mouse.
  • GONAD Gene-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery
  • Fig. 14 is a Western blotting diagram showing the expression of P4HA3 protein in P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO) and wild-type mice (WT).
  • the top panel shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis separation of total protein from liver myofibroblasts detected with an antibody against P4HA3 protein, and the bottom panel shows the results of detection of the isolate with an antibody against GAPDH protein.
  • the 35 Kd band of the anti-GAPDH antibody has approximately the same intensity in wild-type and P4HA3 knockout mice, whereas the 61 Kd P4HA3 protein was detected only in wild-type mice. Therefore, it was confirmed that the P4HA3 knockout mouse of this example does not express the P4HA3 protein.
  • a NASH disease model was prepared by feeding an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet in the same manner as in Example 4.
  • Fig. 15-1 is a line graph showing changes over time in body weight change rate when P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO) and wild-type mice (WT) were fed with an ultra-high-fat choline-deficient methionine diet. From the top, the top line graph shows wild-type mice (WT Ctrl) fed a normal diet, P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO Ctrl) fed a normal diet, and ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diets.
  • FIG. 15-2 is a bar graph showing percentage of liver weight to body weight after 10 weeks of feeding with ultra high fat choline deficient methionine reduced diet or normal diet.
  • the bar graph shows, from the far left, wild-type mice fed a normal diet (WT Ctrl), wild-type mice fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (WT NASH), and P4HA3 gene-deficient mice fed a normal diet ( P4HA3-KO Ctrl), and the far right represents the percentage of liver weight to body weight of P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO NASH) fed with an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • the vertical axis represents the relative liver weight/body weight of each mouse group when the liver weight/body weight of wild-type mice fed with a normal diet is taken as 100%. Each group of mice has 8-10 individuals. *** represents P ⁇ 0.001. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • FIG. 16 shows 1 ⁇ 1 type collagen (A), 1 ⁇ 2 type collagen (B), 3 ⁇ 1 type collagen (C) in P4HA3 gene-deficient mice and wild-type mice after 10 weeks of high-fat choline-deficient methionine-deficient diet or normal diet. and a bar graph comparing the relative expression levels of elastin (D).
  • Each bar graph shows, from the left, wild-type mice fed a normal diet (WT Ctrl), wild-type mice fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (WT NASH), and P4HA3 gene-deficient mice fed a normal diet (P4HA3 -KO Ctrl), and the far right represents the relative value of the mRNA expression level of each gene in P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO NASH) fed with an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, with the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene of WT Ctrl by the mRNA expression level of GAPDH as 1.
  • Each group of mice has 8-10 individuals. *** represents P ⁇ 0.001. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • liver tissue fibrosis in P4HA3 knockout mice that developed NASH due to feeding an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • Mouse livers were immediately immersed in 10% neutral buffered formalin, fixed at room temperature for 16-32 hours, and paraffin-embedded thin sections were incubated in picric acid-saturated 0.1% Direct Red 80 solution for 60 minutes. , Picrosirius Red staining was performed. Then, it was washed with 0.01N HCl, dehydrated with ethanol and cleared with xylene, and mounted with MOUNT QUICK.
  • the stained liver tissue section was imaged with a microscope (KEYENCE, BZ-X700), and analyzed and quantified by KEYENCE Analysis Software.
  • the left figure in FIG. 17 shows Picrosirius Red staining of liver sections of P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO) or wild-type mice (WT) fed with ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (NASH) or normal diet (Ctrl). It is an optical microscope image. The scale represents 1 mm.
  • the right figure in FIG. 17 shows the evaluation results by pathological tissue analysis of these microscopic images.
  • Each bar graph shows, from the left, wild-type mice fed a normal diet (WT Ctrl), wild-type mice fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (WT NASH), and P4HA3 gene-deficient mice fed a normal diet (P4HA3 -KO Ctrl), and the far right represents the percentage of collagen accumulation area in the liver of P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO NASH) fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • the vertical axis of the graph represents the percentage of collagen accumulation area.
  • Each group of mice has 6 individuals. *** represents P ⁇ 0.001. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • liver tissue fibrosis in P4HA3 knockout mice that developed NASH due to feeding an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • Mice were anesthetized with somnopentyl and exsanguinated from the abdominal aorta using a syringe with a 25G needle. After that, centrifugation (1,200 ⁇ G, 5 minutes, 4° C.) was carried out to fractionate the plasma in the serum. Plasma AST and ALT levels were measured by Unitech, and blood biochemical tests were performed.
  • Figure 18 shows liver function marker AST (left ) or ALT (right) is a bar graph showing the analysis results.
  • Each bar graph shows, from the left, wild-type mice fed a normal diet (WT Ctrl), wild-type mice fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet (WT NASH), and P4HA3 gene-deficient mice fed a normal diet (P4HA3 -KO Ctrl), and the far right represents the enzyme activity of AST or ALT in P4HA3 gene-deficient mice (P4HA3-KO NASH) fed an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet.
  • the vertical axis of the graph represents the enzymatic activity of AST or ALT (unit: IU/L). Each group of mice has 5-6 individuals. The vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, with the GAPDH gene mRNA expression level being 1. * indicates P ⁇ 0.05, ** indicates P ⁇ 0.01. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • liver function markers AST and ALT were significantly lower in NASH-developed P4HA3 knockout mice than in NASH-developed wild-type mice. Therefore, it was also confirmed by blood biochemical evaluation that NASH-induced fibrotic conditions were ameliorated in P4HA3 knockout mice.
  • siHsp47 and siP4HA3#1 of Example 7 were used as Hsp47 and P4HA3 knockdown reagents, respectively.
  • siHsp47 ThermoFisher Scientific catalog number 4390771 (Assay ID: s232335) was used. Separation of liver cell type fractions collected 4 weeks after the start of carbon tetrachloride administration was performed in the same manner as in Example 6. Quantification of mRNA expression levels of P4HA3 and fibrosis-related factors was performed in the same manner as in Example 2. Administration of siHsp47 and siP4HA3#1 to cultured cells was carried out in the same manner as in Examples 3 and 7.
  • FIG. 19 is a bar graph showing the mRNA expression level of each gene measured by real-time RT-PCR method for each cell type fraction of the liver of transient liver fibrosis model mice due to carbon tetrachloride administration.
  • Bar graph A represents the mRNA expression level of P4HA3
  • bar graph B represents the mRNA expression level of Hsp47.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level in each cell fraction, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the hepatocyte fraction with the GAPDH mRNA expression level.
  • the left side of each bar graph represents the gene expression level in the hepatocyte fraction, the center in the blood cell fraction, and the left in the myofibroblast fraction.
  • P4HA3 was expressed almost exclusively in the myofibroblast fraction, but Hsp47 was highly expressed in the myofibroblast fraction, but was over 25% of the expression level in the myofibroblast fraction. was also expressed in the hepatocyte fraction at an expression level of Therefore, it was revealed that P4HA3 has higher expression specificity in myofibroblasts than Hsp47.
  • A is a bar graph showing the relative value of the expression level of the Hsp47 gene expressed in carbon tetrachloride-administered fibrotic liver-derived myofibroblasts to which si P4HA3 or si Ctrl was administered.
  • B is a bar graph showing the relative expression level of the P4HA3 gene in myofibroblasts to which siP4HA3 or siCtrl was administered.
  • C to F show 1 ⁇ 1 type collagen (C), 3 ⁇ 1 type collagen (D), 8 ⁇ 1 type collagen (E), and 14 ⁇ 1 type collagen ( F) A bar graph showing relative values of gene expression levels.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level.
  • Each group of mice has 4 individuals. ** indicates P ⁇ 0.01, *** indicates P ⁇ 0.001, n.p. s indicates no significant difference. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • siHsp47 used in this example had a higher mRNA expression-suppressing effect on each target gene in myofibroblasts than siP4HA3.
  • siP4HA3 had a higher inhibitory effect on mRNA expression of fibrosis-related factors. Therefore, the results of FIG. 20 indicate the possibility that P4HA3 has a more significant fibrosis-suppressing effect than the Hsp47-targeting nucleic acid drug currently under development.
  • Graphs A to D in FIG. 21-1 show, respectively, Hsp47 (A), P4HA3 (B), 1 ⁇ 1 type collagen (C ) or 1 ⁇ 2 type collagen (D).
  • Bar graphs A to D in FIG. 21-2 show, respectively, 3 ⁇ 1 type collagen (A), 8 ⁇ 1 type collagen (B), 14 is a bar graph showing the expression levels of 14 ⁇ type 1 collagen (C) or elastin (D) genes.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene with the GAPDH mRNA expression level as 1.
  • FIG. These are the results of four experiments under the same conditions. * indicates P ⁇ 0.05, ** indicates P ⁇ 0.01, *** indicates P ⁇ 0.001, n. s indicates no significant difference. P-values were calculated by Tukey test. Error bars represent standard deviation.
  • Hsp47 siRNA did not suppress P4HA3 mRNA expression at all, but P4HA3 siRNA also slightly suppressed Hsp47 mRNA expression. Then, as shown in C and D in FIGS. 21-1 and A to D in FIG. It was revealed that the effect of suppressing mRNA expression of fibrosis-related factors is higher than that of either siRNA alone.
  • the P4HA3 gene is expressed only during fibrosis in the liver and other organs, and is not expressed in normal conditions. Expression of P4HA3 was demonstrated to exacerbate fibrotic conditions by promoting the expression of fibrosis-associated factors.
  • Example 14 P4HA3 as a Poor Prognostic Factor in Cancer Fibrotic diseases include not only fibrotic diseases of organs such as myocardial infarction, liver cirrhosis and pulmonary fibrosis, but also cancers accompanied by physical consolidation of foci. Therefore, the possibility that the expression of the P4HA3 gene is a factor of poor prognosis of cancer was examined.
  • Figures 22-1 to 22-3 show bladder cancer (A), head and neck squamous cell carcinoma (B), cervical squamous cell carcinoma (C), liver hepatocellular carcinoma (D), pancreatic ductal carcinoma (E), and breast cancer.
  • Example 15 Isoforms of P4HA3 Alpha subunits of prolyl 4-hydroxylase include P4HA3, alpha1 subunit (P4HA1) and alpha2 subunit (P4HA2). Therefore, we investigated whether there are differences in gene expression variation and expression cells among these isoforms.
  • Table 1 shows sham-operated hearts (Sham ), 1 cell derived from tissues collected from the infarcted region site (Inf) in the treated heart, the boundary site of the infarcted region in the treated heart (Border), and the site distant from the infarcted region in the treated heart (Rem) TPM (transcripts per million) values of P4HA3, P4HA1 and P4HA2 in the RNA library.
  • TPM numbers of P4HA3 were significantly higher in the infarct area 7 days after myocardial infarction (Inf 7d), whereas variations in TPM numbers of P4HA1 and P4HA2 did not increase in the infarct area and were associated with myocardial infarction treatment. I didn't. This result suggested that the expression of only P4HA3 among isoforms of the alpha subunit of prolyl 4-hydroxylase was specifically enhanced in myocardial infarction.
  • the upper part of FIG. 23 is a graph showing temporal changes in the expression levels of P4HA3, P4HA1 and P4HA2 in the heart after myocardial infarction.
  • ⁇ indicates the infarcted area
  • ⁇ indicates the non-infarcted area
  • ⁇ indicates the mRNA expression level of each gene measured by the real-time RT-PCR method in the sham-treated group.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene with the GAPDH mRNA expression level as 1, and the horizontal axis represents the number of days (unit: day) after myocardial infarction treatment.
  • the lower part of FIG. 23 is a t-SNE plot chart created using the data of Parkhi N. et al, (2019) mentioned above, and is a dimension reduction plot chart visualizing cell populations expressing P4HA3, P4HA1 and P4HA2. be.
  • P4HA3 mRNA was expressed almost exclusively in myofibroblasts, whereas P4HA1 mRNA was expressed not only in myofibroblasts but also in fibroblasts, macrophages and endothelial cells. mRNA was expressed not only in myofibroblasts, but also in fibroblasts and endothelial cells.
  • FIG. 24-1 top panel, collagen type 1 ⁇ 1 in heart tissue at the site of myocardial infarction induced by transverse aortic coarctation (TAC) or in heart tissue from sham control mice (Sham).
  • Fig. 3 is a bar graph showing mRNA expression levels of the gene (Col1 ⁇ 1) and different isoforms P4HA3, P4HA1 and P4HA2 of P4HA3 mRNA.
  • the lower part of FIG. 24-1 shows type 1 ⁇ 1 collagen mRNA (Col1 ⁇ 1 ) and the mRNA expression levels of P4HA3, P4HA1 and P4HA2.
  • FIG. 24-2 shows the 1 ⁇ 1 type collagen gene in the liver tissue (NASH) of NASH-induced mice fed with an ultra-high-fat choline-deficient methionine-reduced diet, or in the liver tissue (Ctrl) of control mice fed with a normal diet.
  • Fig. 3 is a bar graph showing the mRNA expression levels of (Col1 ⁇ 1) and different isoforms of P4HA P4HA3, P4HA1 and P4HA2.
  • FIG. 242 shows 1 ⁇ 1 type collagen mRNA (Col1 ⁇ 1) and 1 ⁇ 1 type collagen mRNA (Col1 ⁇ 1) in renal fibrosis model mouse renal lesions due to unilateral ureteral obstruction (UUO) or kidney tissue (Sham) of sham-treated control mice.
  • UUO unilateral ureteral obstruction
  • Sham kidney tissue
  • FIGS. 24-1 and 24-2 the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, with the GAPDH mRNA expression level being 1.
  • FIG. * indicates P ⁇ 0.05, *** indicates P ⁇ 0.001, n.p. s indicates no significant difference.
  • P-values were calculated by Student's t-test. Error bars represent standard deviation.
  • the expression level of P4HA3 mRNA in the treated group was 4 to 40 times stronger than that in the sham treated group.
  • the mRNA expression levels of P4HA1 and P4HA2 in the treated group were only 0.8- to 4.5-fold higher than those in the sham-treated group. Therefore, even among the same P4HA alpha subunit isoforms, only P4HA3 was confirmed to be differentially expressed in response to fibrosis-associated factor mRNA expression in the treated groups.
  • FIG. 25 shows fibrosis-related factors (P4HA1, P4HA2, P4HA3, 1 ⁇ 1 type collagen (Col1 ⁇ 1), 1 ⁇ 2 type collagen) in myofibroblasts isolated from the liver tissue of liver fibrosis model mice with liver damage caused by carbon tetrachloride administration.
  • Col1 ⁇ 2), 3 ⁇ 1 type collagen (Col3 ⁇ 1) and elastin (Eln) are bar graphs showing the effects of siCtrl, siP4HA1, siP4HA2 and siP4HA3 on gene expression.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level.
  • si P4HA1, si P4HA2 and si P4HA3 almost completely suppressed the expression of the P4HA1, P4HA2 and P4HA3 genes, respectively.
  • TGF ⁇ /SMAD3 pathway involved in liver fibrosis It is known that hepatic stellate cells involved in liver fibrosis are activated by TGF ⁇ (Fabregat, I. et al., FEBS J. 283: 2219-2232 (2016)). Therefore, the effects of TGF ⁇ , its specific inhibitor SIS3, and an inhibitor of SMAD3 (si SMAD3) involved in signal transduction of the TGF ⁇ pathway on the mRNA expression of fibrosis-related factors in NASH model mice were investigated.
  • SIS3 (CAS number: 1009104-85-1) used catalog number 15945 from Cayman Chemical Company. SIS3 was added to the culture medium at a final concentration of 3 ⁇ M and administered.
  • si SMAD3 was used as a SMAD3 knockdown reagent.
  • si SMAD3 used Catalog No. 4390771 (Assay ID: s69495) from ThermoFisher Scientific.
  • Administration of si-SMAD3 to cultured cells was carried out in the same manner as in Examples 3, 7 and 13.
  • LX-2 which is a cultured hepatic stellate cell, was cultured in DMEM supplemented with 2% FBS.
  • FIG. 26a is a bar graph showing the mRNA expression level of P4HA3 or type 1 ⁇ 1 collagen (Col1 ⁇ 1) in LX-2 treated with DMSO or TGF ⁇ (5 ng/mL) for 12 hours.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the Ctrl group with the GAPDH mRNA expression level.
  • the number of samples for each is three. Comparisons between groups were calculated by Tukey's range test after one-way analysis of variance.
  • P4HA3, 1 ⁇ 1 type collagen (Col1 ⁇ 1), 1 ⁇ 2 type in myofibroblasts isolated from liver tissue of liver fibrosis model mouse by administration of carbon tetrachloride and treated with SIS3, an inhibitor of TGF ⁇ /SMAD pathway 1 is a bar graph showing mRNA expression levels of collagen (Col1 ⁇ 2) and type 3 ⁇ 1 collagen (Col3 ⁇ 1).
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level. Each sample number is 5. Comparisons between groups were calculated by Tukey's range test after one-way analysis of variance. * indicates P ⁇ 0.05, ** indicates P ⁇ 0.01, *** indicates P ⁇ 0.001, n. s indicates no significant difference. As shown in Figure 26b, SIS3 suppressed mRNA expression of fibrosis-associated factors, including P4HA3.
  • Fig. 26c shows SMAD3, P4HA3, 1 ⁇ type 1 collagen in myofibroblasts isolated from liver tissue of liver fibrosis model mice with hepatic injury due to carbon tetrachloride administration and transfected with siRNA against SMAD3 (siSmad3) or siCtrl.
  • 1 is a bar graph showing the mRNA expression levels of (Col1 ⁇ 1), 1 ⁇ 2 type collagen (Col1 ⁇ 2), and 3 ⁇ 1 type collagen (Col3 ⁇ 1).
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA expression level of each gene, where 1 is the value obtained by correcting the mRNA expression level of each gene in the siCtrl group with the GAPDH mRNA expression level.
  • Each sample number is 5.
  • siSmad3 which inhibits SMAD3 mRNA expression, also suppressed mRNA expression of fibrosis-associated factors, including P4HA3.
  • the P4HA3 according to the present invention is regulated by the TGF ⁇ /SMAD3 pathway like other fibrosis-related factors.
  • the present invention makes it possible to improve fibrotic diseases through suppression of mRNA expression of fibrosis-related factors.

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Abstract

本発明の線維化疾患の治療又は予防のための医薬組成物は、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸を含む。前記線維化疾患は、線維症、肝硬変、腎不全、心筋梗塞及び癌からなる群から選択される少なくとも１つの疾患であってもよい。本発明は、線維化疾患を罹患しているか、罹患するおそれのある被験者に本発明の医薬組成物の有効量を投与することを含む、線維化疾患の予防又は治療方法を提供する。

Description

線維化疾患の治療又は予防のための医薬組成物
　本発明は、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファ３サブユニット（Ｐ４ＨＡ３）をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸を含む、医薬組成物に関し、具体的には、前記核酸を含む、肺その他の臓器の線維症、肝硬変、腎不全、心筋梗塞及び癌からなる群から選択される少なくとも１つの線維化疾患の治療又は予防のための医薬組成物に関する。
　線維化とは、コラーゲンなどの線維状タンパク質が過剰に臓器に蓄積された状態をいう。本明細書の詳細な説明で詳しく説明するとおり、本明細書では、線維状タンパク質の過剰産生によって引き起こされる臓器の物理的硬化を特徴とする全ての疾患を線維化疾患という。線維化疾患において、臓器に過剰蓄積される線維状タンパク質を線維化関連因子という。線維化疾患は、臓器が異なっても、線維化関連因子を過剰産生する主体が筋線維芽細胞である点で共通する。線維化疾患は先進国の全死亡原因の約４５％に関与する（非特許文献１）。従来から、筋線維芽細胞の分化に関与する増殖因子（ＴＧＦβ、非特許文献２）や、コラーゲン特異的分子シャペロン（ＨＳＰ４７、特許文献１、非特許文献３及び４）を標的とする核酸医薬によって線維化疾患を治療する試みが知られている。しかし、これら従来の線維化疾患の治療薬候補の標的遺伝子は筋線維芽細胞に対する発現特異性があまり高くなく、線維化関連因子の発現抑制効果も限定的であった。
特許第６４３３０７９号公報
Pellicoro, A., et al. (2014) Nat. Rev. Immunol., 14(3):181-94. D’Alessandro-Gabazza1、C.N., et al. (2012） Am J Respir Cell Mol Biol Vol 46, Iss. 3, pp 397-406. Ishiwatari, H., et al. (2013) Gut, 62(9), 1328-1339. Liu, Y., et al. (2021) ERJ Open Res , 7: 00733-2020.
　本発明の課題は、従来の線維化疾患の治療薬候補よりも、標的遺伝子の筋線維芽細胞に対する発現特異性が高く、線維化関連因子の発現抑制効果も高い新規線維化疾患治療又は予防用医薬組成物を提供することである。そのためには、筋線維芽細胞だけで特異的に発現して、線維化関連因子の過剰産生に直接関与する遺伝子を特定する必要がある。より多くの線維化疾患において、より高い治療又は予防効果が期待できる医薬組成物を提供することには大きな需要がある。
　本発明者は、鋭意努力の結果、筋線維芽細胞で特異的に発現する遺伝子を探索し、筋線維芽細胞による細胞外マトリックスタンパク質の過剰産生を阻止できる分子標的として、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファサブユニットの特定のアイソフォームである、アルファ３サブユニット（Ｐ４ＨＡ３）が筋線維芽細胞に特異的に発現し、当該遺伝子の発現阻害がコラーゲンその他の線維化関連タンパク質の産生を抑制し、線維化疾患の改善をもたらすことを発見し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、線維化疾患の治療又は予防のための医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファ３サブユニット（以下、「Ｐ４ＨＡ３」と称する。）をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸を含む。
　本発明の医薬組成物において、前記線維化疾患は、肺、皮膚その他の臓器における線維症、肝硬変、腎不全、心筋梗塞及び癌からなる群から選択される少なくとも１つの疾患であってもよい。
　本発明の医薬組成物において、前記核酸は、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補性を有するヌクレオチド配列を有してもよい。
　本発明の医薬組成物において、前記核酸はｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸であってもよい。
　本発明の医薬組成物において、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号９～１１のいずれか１つの配列のうち少なくとも１５個の連続する配列を含むオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとからなるｓｉＲＮＡであってもよい。
　本発明の医薬組成物において、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号５の配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号６の配列を含むオリゴヌクレオチドとの対か、配列番号７の配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号８の配列を含むオリゴヌクレオチドとの対かであってもよい。
　本発明の医薬組成物において、前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１の配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の配列からなるオリゴヌクレオチドとの対か、配列番号３の配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４の配列からなるオリゴヌクレオチドとの対かであってもよい。
　本発明の医薬組成物は、核酸送達担体を含んでもよい。
　本発明の医薬組成物において、前記核酸送達担体はリポソーム又は脂質ナノ粒子であってもよい。
　本発明の医薬組成物において、前記リポソームは、筋線維芽細胞に特異的に吸着し、前記核酸を内包するリポソームであってもよい。
　本発明の医薬組成物は、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸以外の薬剤Ｐをさらに含んでもよい。
　本発明は、線維化疾患を罹患しているか、罹患するおそれのある被験者に本発明の医薬組成物の有効量を投与することを含む、線維化疾患の予防又は治療方法を提供する。
　本発明の予防又は治療方法において、前記線維化疾患は、線維症、肝硬変、腎不全、心筋梗塞及び癌からなる群から選択される少なくとも１つの疾患であってもよい。
　本発明によれば、線維化疾患で出現する筋線維芽細胞に特異的に発現するＰ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害するため、筋線維芽細胞がほとんど存在しない、線維化疾患以外の疾患の患者及び健常者には副作用がない一方、線維化疾患の患者においては線維化関連タンパク質の産生を従来の線維化疾患の治療薬より強力に抑制することが可能となる。
心筋梗塞後の心臓におけるＰ４ＨＡ３（Ａ）、α－ＳＭＡ（Ｂ）及びペリオスチン（Ｃ）のｍＲＮＡ発現量の相対値の経時変化を示すグラフ。■は梗塞領域、▲は非梗塞領域、そして、●は偽処置群（ｓｈａｍ）における各遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量を表す。同一条件の実験を３～６回行った結果である。各遺伝子のｍＲＮＡの梗塞領域の発現量の処置後７日の誤差棒は標準偏差を表す。縦軸は、偽処置群の０日目の心臓サンプルにおける各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値、横軸は心筋梗塞処置後の日数（単位：日）を表す。梗塞領域、非梗塞領域及び偽処置群のサンプル数は、それぞれ、５～６、３及び３～４であった。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定（unpaired two-tailed Student’s t-test）により計算された。グラフの###は同じ梗塞処置後日数の梗塞領域対偽処置群（inf vs. sham）の有意性がｐ＜０．００１であることを表し、グラフの***は同じ梗塞処置後日数の梗塞領域対非梗塞領域（inf vs. rem）の有意性がｐ＜０．００１であることを表す。 心筋梗塞後７日目の心臓切片のin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像のパネル。Ａ：ペリオスチン及びＰ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像と、ＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡画像とをマージした蛍光顕微鏡画像。スケールは２０μｍを表す。Ｂ、Ｃ及びＤはＡの破線で囲まれた領域の拡大図。Ｂ：ペリオスチンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。Ｃ：Ｐ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。Ｄ：Ｂ及びＣの蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。スケールは１０μｍを表す。 Farbehi N. et al, (2019)のデータを用いて作成した心筋梗塞モデル処置前後のマウス心臓の各細胞タイプの１細胞解析結果を示すｔ－ＳＮＥプロット図。Ａ：各細胞タイプ特異的なｍＲＮＡを発現する細胞集団の次元削減プロット図。Ｂ：αＳＭＡ（Ａｃｔａ２）遺伝子を発現する細胞集団を可視化した次元削減プロット図。Ｃ：ペリオスチン（Ｐｏｓｔｎ）遺伝子を発現する細胞集団を可視化した次元削減プロット図。Ｄ：Ｐ４ＨＡ３遺伝子を発現する細胞集団を可視化した次元削減プロット図。Ｍａｃはマクロファージ、Ｅｎｄｏは内皮細胞、Ｍｕｒａｌは平滑筋細胞及びペリサイト、Ｆｉｂｒｏは線維芽細胞、ＡｃｔＦｉｂは活性化線維芽細胞の各細胞のクラスターを表す。 梗塞領域から単離された筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３（Ａ）、ペリオスチン（Ｂ）、１α１型コラーゲン（Ｃ）、３α１型コラーゲン（Ｄ）遺伝子の発現に対するＰ４ＨＡ３ノックダウンの影響を示す棒グラフ。ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３及びｓｉ　Ｃｔｒｌは、それぞれ、Ｐ４ＨＡ３遺伝子及び対照遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した筋線維芽細胞における各遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。サンプル数はそれぞれ５である。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 肺（Ａ）、肝臓（Ｂ）及び腎臓（Ｃ）の実験的線維症モデルにおけるＰ４ＨＡ３遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量を示す棒グラフ。グラフＡはブレオマイシン処置群（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）又は偽処置群（Ｓａｌｉｎｅ）の肺組織におけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の相対値を表し、グラフＢは超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料給餌群（ＮＡＳＨ）又は通常飼料給餌群（Ｃｔｒｌ）の肝組織におけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の相対値を表し、グラフＣはＵＵＯ処置群（ＵＵＯ）又は偽処置群の腎組織におけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。各棒グラフの縦軸は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とするＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。サンプル数は、肺（Ａ）、肝臓（Ｂ）の線維化誘導実験はそれぞれ５、腎臓（Ｃ）の線維化誘導実験は、偽処置群は３，UUO処置群は８である。誤差棒は標準偏差を表す。 四塩化炭素投与による肝障害肝臓線維化モデルマウスについて、溶媒投与開始４週間後（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、四塩化炭素投与開始４週間後（ＣＣｌ４）及び四塩化炭素投与中止４週間後（Ｗｉｔｈｄｒａｗ）に回収した肝臓組織でのＰ４ＨＡ３（Ａ）、α－ＳＭＡ（Ｂ）及び１α１型コラーゲン（Ｃ）のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値の経時変化を示す棒グラフ。各棒グラフの縦軸は、溶媒投与開始４週間後（Ｖｅｈｉｃｌｅ）群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。サンプル数は５である。**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 飼料によるＮＡＳＨモデルマウスの肝臓におけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示す棒グラフ。各棒グラフ（0W、3W、6W、9W及び12W）は、それぞれ、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌前、給餌３週間後、給餌６週間後、給餌９週間後及び給餌１２週間後のマウスから回収した肝臓組織でのＰ４ＨＡ３のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値の経時変化を示す。各棒グラフの縦軸は、給餌前のＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各時点でのＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。同一条件の実験を６回（給餌３週間後のみ５回）行った結果。 飼料によるＮＡＳＨモデルマウスにおける、各遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量を示す棒グラフ。各棒グラフは、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を５週間給餌し、該飼料の給餌を止めて５週間後に回収したＮＡＳＨ発症マウスの肝組織（ＮＡＳＨ）、及び、通常飼料を給餌した対照マウスの肝組織（Ｃｔｒｌ）でのＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量（Ａ）、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）のｍＲＮＡ発現量（Ｂ）、及び、１α１型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量の相対値（Ｃ）を表す。縦軸は、Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。サンプル数は５である。 四塩化炭素投与開始４週間後に回収された肝臓の細胞タイプ画分ごとのＣｙｐ７ａ１（Ａ）、Ｃｄ６８（Ｂ）、α－ＳＭＡ（Ｃ）及びＰ４ＨＡ３（Ｄ）遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値を示す棒グラフ。縦軸は、肝細胞画分における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。サンプル数は１である。誤差棒は標準偏差を表す。 肝線維化モデルマウスの肝臓由来筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３（Ａ）、１α１型コラーゲン（Ｂ）、１α２型コラーゲン（Ｃ）、３α１型コラーゲン（Ｄ）及びエラスチン（Ｅ）遺伝子の発現に対するＰ４ＨＡ３ノックダウンの影響を示す棒グラフ。各棒グラフの左は対照遺伝子のｓｉＲＮＡ（ｓｉ　Ｃｔｒｌ）、中央はＰ４ＨＡ３遺伝子の第１のｓｉＲＮＡ（ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３　＃１）、右はＰ４ＨＡ３遺伝子の第２のｓｉＲＮＡ（ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３　＃２）を投与した筋線維芽細胞における各遺伝子の発現量の相対値を表す。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。同一条件の実験を４回行った結果である。*はＰ＜０．０５、***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 ブレオマイシンの気管支内投与の７日後に回収した肺線維症発症マウスの肺組織（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）及び生理食塩水を投与した対照マウスの肺組織（Ｓａｌｉｎｅ）における、Ｐ４ＨＡ３（Ａ）、α－ＳＭＡ（Ｂ）、１α１型コラーゲン（Ｃ）及び３α１型コラーゲン（Ｄ）遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値を示す棒グラフ。各グラフの縦軸は、Ｓａｌｉｎｅ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。サンプル数は５である。誤差棒は標準偏差を表す。 ブレオマイシン投与肺線維症モデルマウスの肺から単離した血球系細胞画分及び筋線維芽細胞画分におけるＣｄ６８（Ａ）、１α１型コラーゲン（Ｂ）及びＰ４ＨＡ３（Ｃ）の遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値を示す棒グラフ。縦軸は、肝細胞画分における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。 ブレオマイシン投与肺線維症モデルマウスの肺から単離し、ｓｉ　Ｃｔｒｌ又はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３（Ａ）、１α１型コラーゲン（Ｂ）、３α１型コラーゲン（Ｃ）及び１４α１型コラーゲン（Ｄ）遺伝子の発現に対するＰ４ＨＡ３ノックダウンの影響を示す棒グラフ。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。同一条件の実験を５回行った結果である。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 片側尿管閉塞（ＵＵＯ）による腎線維症モデルマウス腎病変の各領域の特徴を示す冠状断模式図。i～viは腎臓組織切片の位置を示す。 図１２－１の領域iに対応する偽処置を施した腎組織切片（ｓｈａｍ）のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像（全て２０倍）。上段中央はＰ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段右は抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段左は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像と、ＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡画像とをマージした蛍光顕微鏡画像。下段左は１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。下段中央は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。下段右は上段中央及び下段左の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。 片側尿管閉塞処置側のＵＵＯ－１領域（図１２－１の領域i参照）の腎組織切片のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像（全て２０倍）。上段中央はＰ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段右は抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段左は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像と、ＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡画像とをマージした蛍光顕微鏡画像。下段左は１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。下段中央は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。下段右は上段中央及び下段左の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。 片側尿管閉塞処置側のＵＵＯ－２領域（図１２－１の領域ii参照）の腎組織切片のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像（全て２０倍）。上段中央はＰ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段右は抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段左は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像と、ＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡画像とをマージした蛍光顕微鏡画像。下段左は１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。下段中央は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。下段右は上段中央及び下段左の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。 片側尿管閉塞処置側のＵＵＯ－３領域（図１２－１の領域iii参照）の腎組織切片のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光免疫組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像（全て２０倍）。上段中央はＰ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段右は抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段左は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像と、ＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡画像とをマージした蛍光顕微鏡画像。下段左は１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。下段中央は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。下段右は上段中央及び下段左の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。 片側尿管閉塞処置側のＵＵＯ－５領域（図１２－１の領域v参照）の腎組織切片のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像（全て２０倍）。上段中央はＰ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段右は抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像。上段左は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像と、ＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡画像とをマージした蛍光顕微鏡画像。下段左は１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像。下段中央は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。下段右は上段中央及び下段左の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像。 線維化の進行過程におけるＰ４ＨＡ３遺伝子及び線維化関連遺伝子（１α１型コラーゲン及びα－ＳＭＡ）の発現量の変化の関係を示す模式図。 Ｐ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ）及び野生型マウス（ＷＴ）におけるＰ４ＨＡ３タンパク質の発現を示すウェスタンブロッティング図。上図は肝臓筋線維芽細胞の全タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動分離物をＰ４ＨＡ３タンパク質に対する抗体で検出した結果であり、下図は前記分離物をＧＡＰＤＨタンパク質に対する抗体で検出した結果である。 Ｐ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ）及び野生型マウス（ＷＴ）に超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した場合の体重変化率の経時変化を示す折れ線グラフである。上から、一番上の折れ線グラフは、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、その下が通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、次に超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、そして一番下の折れ線グラフは、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）を表す。 超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料又は通常飼料を１０週間給餌後の体重に対する肝重量の百分率の相対値を示す棒グラフである。棒グラフは、一番左から、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、そして一番右が超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）の体重に対する肝重量の百分率を表す。縦軸は、通常飼料を給餌した野生型マウスの肝重量/体重を１００％とした時の各マウス群の肝重量/体重の相対値を表す。それぞれのマウス群の個体数は８～１０である。***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す 高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料又は通常飼料を１０週間給餌後のＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス及び野生型マウスにおける１α１型コラーゲン（Ａ）、１α２型コラーゲン（Ｂ）、３α１型コラーゲン（Ｃ）、及び、エラスチン（Ｄ）の発現量の相対値を比較した棒グラフ。各棒グラフは、左から、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、そして一番右は超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を表す。縦軸は、ＷＴ　Ｃｔｒｌのそれぞれの遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのマウス群の個体数は８～１０である。***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 左図は、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（ＮＡＳＨ）又は通常飼料（Ｃｔｒｌ）を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ）又は野生型マウス（ＷＴ）の肝臓切片のＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ　Ｒｅｄ染色光学顕微鏡画像である。スケールは１ｍｍを表す。右図はこれらの顕微鏡画像の病理組織解析による評価結果である。各棒グラフは、左から、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、そして一番右は超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）の肝臓におけるコラーゲン蓄積領域の百分率を表す。グラフの縦軸はコラーゲン蓄積領域の百分率を表す。それぞれのマウス群の個体数は６である。***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（ＮＡＳＨ）又は通常飼料（Ｃｔｒｌ）を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ）又は野生型マウス（ＷＴ）の血清中の肝機能マーカーＡＳＴ（左図）又はＡＬＴ（右図）の分析結果を示す棒グラフである。各棒グラフは、左から、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、そして一番右は超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）のＡＳＴ又はＡＬＴの酵素活性を表す。グラフの縦軸はＡＳＴ又はＡＬＴの酵素活性（単位：ＩＵ／Ｌ）を表す。それぞれのマウス群の個体数は５～６である。縦軸は、ＡＳＴ又はＡＬＴの酵素活性を表す。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 四塩化炭素投与による肝障害肝臓線維化モデルマウスの肝臓の肝細胞画分、血球系細胞画分及び筋線維芽細胞画分でのＰ４ＨＡ３（Ａ）及びＨｓｐ４７（Ｂ）遺伝子のリアルタイムＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値を示す棒グラフ。縦軸は、肝細胞画分における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各細胞画分におけるｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。 グラフＡはｓｉ　Ｈｓｐ４７又はｓｉ　Ｃｔｒｌを投与した四塩化炭素投与による線維化肝臓由来の筋線維芽細胞におけるＨｓｐ４７遺伝子の発現量の相対値を表す棒グラフである。グラフＢはｓｉ　Ｐ４ＨＡ３又はｓｉ　Ｃｔｒｌを投与した筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３遺伝子の発現量の相対値を表す棒グラフである。グラフＣ～Ｆは、それぞれｓｉ　Ｃｔｒｌ、ｓｉ　Ｈｓｐ４７及びｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した筋線維芽細胞における１α１型コラーゲン（Ｃ）、３α１型コラーゲン（Ｄ）、８α１型コラーゲン（Ｅ）、及び、１４α１型コラーゲン（Ｆ）遺伝子の発現量の相対値を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は４である。**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 グラフＡ～Ｄは、それぞれ、ｓｉ　Ｈｓｐ４７及び／又はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した肝障害線維化肝臓由来の筋線維芽細胞におけるＨｓｐ４７（Ａ）、Ｐ４ＨＡ３（Ｂ）、１α１型コラーゲン（Ｃ）、又は、１α２型コラーゲン（Ｄ）のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１としたとする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は４である。***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 グラフＡ～Ｄは、それぞれ、ｓｉ　Ｈｓｐ４７及び／又はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した肝障害線維化肝臓由来の筋線維芽細胞における、３α１型コラーゲン（Ａ）、８α１型コラーゲン（Ｂ）、１４α１型コラーゲン（Ｃ）、又は、エラスチン（Ｄ）遺伝子の発現量の相対値を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は５である。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。 Ｐ４ＨＡ３遺伝子の発現の高低と膀胱癌（Ａ）、頭頚部扁平上皮癌（Ｂ）、子宮頚部扁平上皮癌（Ｃ）及び肝臓肝細胞癌（Ｄ）の予後との関係を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。Ｐ４ＨＡ３遺伝子を高発現する症例を黒色で、Ｐ４ＨＡ３遺伝子を低発現する症例を灰色で表示した。いずれも、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ　Ｐｌｏｔｔｅｒで作成した。 Ｐ４ＨＡ３遺伝子の発現の高低と膵管癌（Ｅ）、乳がん（Ｆ）、胃腺癌（Ｇ）及び肺扁平上皮癌（Ｈ）の予後との関係を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。Ｐ４ＨＡ３遺伝子を高発現する症例を黒色で、Ｐ４ＨＡ３遺伝子を低発現する症例を灰色で表示した。いずれも、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ　Ｐｌｏｔｔｅｒで作成した。 Ｐ４ＨＡ３遺伝子の発現の高低と直腸腺癌（Ｉ）及び卵巣癌（Ｊ）の予後との関係を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。Ｐ４ＨＡ３遺伝子を高発現する症例を黒色で、Ｐ４ＨＡ３遺伝子を低発現する症例を灰色で表示した。いずれも、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ　Ｐｌｏｔｔｅｒで作成した。 上段は、心筋梗塞後の心臓におけるＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡの異なるアイソフォームＰ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２の発現量の相対値の経時変化を示すグラフ。■は梗塞領域、▲は非梗塞領域、そして、●は偽処置群における各遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量を表す。縦軸は、心筋梗塞処置日（０）における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値、横軸は心筋梗塞処置後の日数（単位：日）を表す。下段は、前出のFarbehi N. et al, (2019)のデータを用いて作成したｔ－ＳＮＥプロット図で、Ｐ４ＨＡ３と、Ｐ４ＨＡ３とは異なるアイソフォームであるＰ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２を発現する細胞集団を可視化した次元削減プロット図である。 上段は、横行大動脈縮窄横行大動脈縮窄により誘発された心筋梗塞部位の心臓組織（ＴＡＣ）、又は、偽処置を施した対照マウスの心臓組織（Ｓｈａｍ）における、１α１型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１α１）と、Ｐ４ＨＡ３ｍＲＮＡの異なるアイソフォームＰ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２とのｍＲＮＡ発現量の相対値を表す棒グラフである。下段は、ブレオマイシンを投与した肺線維症モデルマウスの肺病変部組織（ＢＬＭ）、又は、生理食塩水を投与した対照マウスの肺組織（Ｓａｌｉｎｅ）における、１α１型コラーゲンｍＲＮＡ（Ｃｏｌ１α１）と、Ｐ４ＨＡの異なるアイソフォームＰ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２とのｍＲＮＡ発現量の相対値を表す棒グラフである。縦軸は、Ｓｈａｍ又はＳａｌｉｎｅ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。*はＰ＜０．０５、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。それぞれのマウス群の個体数は５である。 上段は、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌によるＮＡＳＨ発症マウスの肝組織（ＮＡＳＨ）、又は、通常飼料を給餌した対照マウスの肝組織（Ｃｔｒｌ）における、１α１型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１α１）と、Ｐ４ＨＡの異なるアイソフォームＰ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２とのｍＲＮＡ発現量の相対値を表す棒グラフである。下段は、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）による腎線維症モデルマウス腎病変部、又は、偽処置を施した対照マウスの腎臓組織（Ｓｈａｍ）における、１α１型コラーゲンｍＲＮＡ（Ｃｏｌ１α１）と、Ｐ４ＨＡの異なるアイソフォームＰ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２とのｍＲＮＡ発現量の相対値を表す棒グラフである。縦軸は、Ｃｔｒｌ又はＳｈａｍ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。それぞれのマウス群の個体数は５である。 四塩化炭素投与による肝障害肝臓線維化モデルマウスの肝組織から単離された筋線維芽細胞における線維化関連因子（Ｐ４ＨＡ１、Ｐ４ＨＡ２、Ｐ４ＨＡ３、１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）、１α２型コラーゲン（Ｃｏｌ１α２）、３α１型コラーゲン（Ｃｏｌ３α１）及びエラスチン（Ｅｌｎ））の遺伝子発現に対するｓｉ　Ｃｔｒｌ、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ１、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ２及びｓｉ　Ｐ４ＨＡ３の効果を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は４である。群間の比較は、一元配置分散分析の後、Ｔｕｋｅｙの範囲検定により計算された。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。誤差棒は標準偏差を表す。 図２６ａは、ＰＢＳ又はＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したＰＢＳで１２時間処理されたＬＸ－２におけるＰ４ＨＡ３又は１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）のｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。縦軸は、Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は３である。群間の比較は、一元配置分散分析の後、Ｔｕｋｅｙの範囲検定により計算された。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。誤差棒は標準偏差を表す。図２６ｂは、四塩化炭素投与による肝障害肝臓線維化モデルマウスの肝組織から単離され、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ経路の阻害剤であるＳＩＳ３で処理された筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３、１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）、１α２型コラーゲン（Ｃｏｌ１α２）、３α１型コラーゲン（Ｃｏｌ３α１）のｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は５である。群間の比較は、一元配置分散分析の後、Ｔｕｋｅｙの範囲検定により計算された。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。図２６ｃは、四塩化炭素投与による肝障害肝臓線維化モデルマウスの肝組織から単離され、ＳＭＡＤ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｍａｄ３）又はｓｉ　Ｃｔｒｌをトランスフェクションした筋線維芽細胞ににおけるＳＭＡＤ３、Ｐ４ＨＡ３、１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）、１α２型コラーゲン（Ｃｏｌ１α２）、３α１型コラーゲン（Ｃｏｌ３α１）のｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は５である。群間の比較は、一元配置分散分析の後、Ｔｕｋｅｙの範囲検定により計算された。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。
　１．定義
　本発明において線維化疾患とは、線維状タンパク質の過剰産生によって引き起こされる臓器の物理的硬化を特徴とする全ての疾患をいう。線維化疾患には、筋梗塞、肝硬変の他、腎不全、肺その他の臓器の線維症と、一部の癌とを含むが、これらに限られない。正常な肝臓の弾性係数は約５ｋＰａであるが、脂肪肝又は肝硬変の病変部分の弾性係数は約８～７５ｋＰａに増大する。また、正常な心臓の弾性係数は約１０ｋＰａであるが、心筋梗塞の病変部分の弾性係数は約３５～７０ｋＰａに増大する。いずれの線維化疾患においても、臓器の物理的硬化が各臓器の機能低下をもたらす。臓器が物理的に硬化する原因は、コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリクス成分の線維状タンパク質が過剰に臓器に蓄積されるためである。そこで、前記線維状タンパク質を線維化関連因子いう。
　近年、心筋梗塞、肝硬変及び腎不全と、肺、皮膚その他の臓器の線維症とにおいて、前記線維化関連因子が、筋線維芽細胞（肝臓では活性型星細胞ともいう。）という特定の細胞タイプの細胞によって過剰に産生されることが明らかになった。筋線維芽細胞は正常臓器ではほとんど存在しない。筋線維芽細胞は、炎症反応、虚血反応、機械的刺激等がトリガーとなって、正常組織に常に存在する線維芽細胞、周皮細胞、内皮細胞、上皮細胞、骨髄由来細胞から分化する。筋線維芽細胞は収縮能を有し、α平滑筋アクチン（以下、αＳＭＡ又はＡＣＴＡ２ともいう。）が筋線維芽細胞に特異的なマーカーである。また、癌の病巣も周辺の正常組織と比べて物理的に硬化する場合が知られている。物理的に硬化した癌の病巣でも筋線維芽細胞による線維化関連因子の過剰産生が関与する。従来、線維化疾患は、肝硬変、心筋梗塞、肺線維症のように、炎症、虚血、悪性新生物等の物理的硬化の原因によって別々に分類されていた。臓器や物理的硬化の原因が異なっても、筋線維芽細胞による線維化関連因子の過剰産生による物理的硬化を伴うという病態を共有することが近年明らかになったので、本明細書では、線維状タンパク質の過剰産生によって引き起こされる臓器の物理的硬化を特徴とする全ての疾患を線維化疾患という。線維化疾患は、心筋梗塞、肝硬変及び腎不全と、肺、皮膚その他の臓器の線維症と、病巣の物理的硬化を伴う癌とを含むが、これらに限定されない。
　２．筋線維芽細胞で特異的に発現する遺伝子の探索
　本発明において、筋線維芽細胞で特異的に発現する遺伝子の探索は、当業者に周知のＤＮＡマイクロアレイ解析と、１細胞解析（single-cell expression profiling）とにより行った（Luecken, M.D. & Theis, F.J. (2019) Molecular Systems Biology 15: e8746、Farbehi N. et al, (2019) eLife 2019;8:e43882.を参照せよ）。本発明の線維化疾患に係る１細胞解析では、臓器又は組織の細胞又は細胞核を解離し、個々の単離細胞を、例えば１個のドロップレットへの封入、マイクロウェルプレートの１個のウェルへの分取等により物理的に隔離する。個々のドロップレット又はウェルごとにはゲルビーズ１個を予め入れておく。各ゲルビーズは１個ずつそれぞれ異なるＤＮＡバーコード、すなわち、分子識別子（unique molecular identifiers:　ＵＭＩ）を有する逆転写プライマーが固定化されている。各ドロップレット又はウェルでｃＤＮＡ合成反応、ｃＤＮＡライブラリ作成及びｃＤＮＡ配列決定を行うと、個々の細胞由来のｍＲＮＡの３’末端にＵＭＩ由来の配列を含むｃＤＮＡ配列データが得られる。得られたｃＤＮＡ配列データを計算機解析に供する。１細胞解析には、10x Genomics社が販売するシングルセル遺伝子発現解析システム等と、Illumina社その他が販売する次世代シーケンサーとを用いることが多いが、これら以外の試薬、キット、機器及び／又はソフトウェアを用いてもかまわない。
　１細胞解析のためのｃＤＮＡ配列データの計算機解析では、まず、無傷の細胞由来のデータと細胞膜が損傷してｍＲＮＡの一部が流出した細胞由来のデータを区別する等の品質管理と、ノーマライゼーションを行う。その後、t分布型確率的近傍埋込み（t-distributed Stochastic Neighbor Embedding, tSNE）などの手法を用いる次元圧縮により、細胞の持つ遺伝子発現状態の類似度を直観的に表示する（Kobak, D. & Berens, P. (2019) Nat Commun., 10(1):5416を参照せよ）。
　３．本発明の医薬組成物に含まれる核酸
　本発明の１つの実施態様は、線維化疾患の治療又は予防のための医薬組成物である。該医薬組成物は、プロリル４－ヒドロキシラーゼのα３サブユニット（Ｐ４ＨＡ３）をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸を含む。本発明の医薬組成物に含まれる核酸が発現を阻害するプロリル４－ヒドロキシラーゼのα３サブユニット（Ｐ４ＨＡ３）をコードするｍＲＮＡは、ヒトその他の霊長類と、マウスその他のげっ歯類とを含むが、これらに限定されない。本明細書では、ある遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸により当該遺伝子のｍＲＮＡ発現を阻害することをノックダウンといい、例えば、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸によりＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現を阻害することをＰ４ＨＡ３ノックダウンという。
　プロリル４－ヒドロキシラーゼは、コラーゲンやエラスチンのプロリン残基を翻訳後に水酸化修飾してヒドロキシプロリンに変換する反応を触媒する酵素である。ヒドロキシプロリンは、コラーゲンの３本鎖らせん構造を安定化する。プロリル４－ヒドロキシラーゼはαサブユニット２個及びβサブユニット２個からなる４量体タンパク質で、プロリル４－ヒドロキシラーゼのαサブユニットにはα１サブユニット（Ｐ４ＨＡ１）、α２サブユニット（Ｐ４ＨＡ２）及びα３サブユニット（Ｐ４ＨＡ３）という３種類のアイソフォームが存在する。βサブユニットは、単量体でタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとして機能することが知られている多機能タンパク質である。以下の実施例で実証するとおり、心臓、肺、肝臓及び腎臓の線維化疾患モデルにおいて、Ｐ４ＨＡ３は偽処置群より処置群で発現が亢進したが、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２は、偽処置群と処置群とで発現に有意差がないか、有意差があってもＰ４ＨＡ３ほど偽処置群と処置群との発現の差が大きくなかった。
　本明細書の実施例に説明するとおり、本発明の医薬組成物は、筋線維芽細胞が産生するＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現を抑制することで線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を抑制する。したがって、線維化疾患の徴候所見が認められた患者だけでなく、線維化疾患の原因となる、心筋梗塞と、肝臓、肺、腎臓その他の炎症疾患との被験者であって、まだ線維化疾患に至らない段階の被験者に本発明の医薬組成物を投与することで、筋線維芽細胞が線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を抑制して線維化疾患を予防することもできる。
　ヒトＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は、例えば、NM_182904.4、NM_182904.5、NM_001288748.1、NM_001288748.2、XR_001747836.1及びXR_001747837.1としてNCBI Reference Sequenceに登録されている。またマウスＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は、例えば、NM_177161.4としてNCBI Reference Sequenceに登録されている。本発明の医薬組成物に含まれる核酸の具体的態様は、以下の（ａ）～（ｄ）を含むが、これらに限られない。
（ａ）　Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡもしくはその前駆体
　本発明のＰ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸の実施態様としては、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに相補的なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、即ちｓｉＲＮＡが挙げられる。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら（Genes Dev., 15, 188-200 (2001)）の提唱する規則に従って設計することができる。また、ｓｉＲＮＡの前駆体であるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、５－２５塩基程度）を適宜選択し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖とを前記リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。
　ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡの配列は、種々のｗｅｂサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Dharmaconが提供するsiDESIGN Center（http://dharmacon.horizondiscovery.com/jp/design-center/?rdr=true&LangType=1041&pageid=17179928204）、GenScriptが提供するsiRNA Target Finder（https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　例えば、ヒトＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡの候補は、ヒトＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡに対応するヌクレオチド配列（variant 1：NM_001288748、配列番号９、全長ヌクレオチド２２５５個、又は、variant 2：NM_001288748、配列番号１０、全長ヌクレオチド２２４８個）の全長配列のうち少なくとも１５個の連続するヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。同様に、マウスＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡの候補は、マウスＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡに対応するヌクレオチド配列（NM_177161.4、配列番号１１、全長ヌクレオチド２３６１個）の全長配列のうちの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。
　Ｐ４ＨＡ３ｍＲＮＡの発現を阻害する本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号９又は１０に列挙するＤＮＡ配列のうちの全長少なくとも１５個の連続するヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む２本鎖ＲＮＡを含む。本発明のｓｉＲＮＡは、配列番号５及び６に列挙するＲＮＡ配列を含む２本鎖ＲＮＡ、若しくは、配列番号７及び８に列挙するＲＮＡ配列を含む２本鎖ＲＮＡ、又は、配列番号１及び２に列挙するＲＮＡ配列からなる２本鎖ＲＮＡ、若しくは、配列番号３及び４に列挙するＲＮＡ配列からなる２本鎖ＲＮＡを含むが、これらに限定されない。本発明のｓｉＲＮＡを構成する２本のＲＮＡは互いに完全に相補的なヌクレオチド配列からなることもあるが、完全に相補的なヌクレオチド配列の５’末端及び／又は３’末端に相補性のない１個又は数個のヌクレオチドを含んでもかまわない。
　本明細書に添付する配列表に列挙する配列は以下のとおりである。
配列番号１　マウスＰ４ＨＡ３に対するｓｉＲＮＡ＃１（ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１）のセンス鎖
配列番号２　マウスｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１のアンチセンス鎖
配列番号３　マウスＰ４ＨＡ３に対するｓｉＲＮＡ＃２（ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃２）のセンス鎖
配列番号４　マウスｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃２のアンチセンス鎖
配列番号５　配列番号１のヌクレオチド配列のうち配列番号２のヌクレオチド配列と完全に相補性のある配列
配列番号６　配列番号２のヌクレオチド配列のうち配列番号１のヌクレオチド配列と完全に相補性のある配列
配列番号７　配列番号３のヌクレオチド配列のうち配列番号４のヌクレオチド配列と完全に相補性のある配列
配列番号８　配列番号４のヌクレオチド配列のうち配列番号３のヌクレオチド配列と完全に相補性のある配列
配列番号９　ヒトＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡに対応するヌクレオチド配列 variant 1（NM_182904.5、全長ヌクレオチド２２５５個）
配列番号１０　ヒトＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡに対応するヌクレオチド配列variant 2 （NM_001288748、全長ヌクレオチド２２４８個）
配列番号１１　マウスＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡに対応するヌクレオチド配列（NM_177161.4、全長ヌクレオチド２３６１個）
配列番号１２　マウスＨｓｐ４７に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ　Ｈｓｐ４７）のセンス鎖
配列番号１３　マウスＨｓｐ４７に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ　Ｈｓｐ４７）のアンチセンス鎖 
配列番号１４　マウスＳＭＡＤ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ　ＳＭＡＤ３）のセンス鎖
配列番号１５　マウスＳＭＡＤ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ　ＳＭＡＤ３）のアンチセンス鎖
　ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを構成するヌクレオチド分子は、天然型のリボヌクレオチドのみを含んでもよいが、デオキシリボヌクレオチドや天然又は非天然の修飾ヌクレオチドを含んでもかまわない。オフターゲット効果を低減させるため、あるいは、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（ＲＮＡとの親和性）を向上させるために、自体公知の種々の化学修飾を含むことができる。
　ヒトＰ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡとしては、例えば、ヒトＰ４ＨＡ３遺伝子の第１及び２エクソンか、第２エクソンか、第９エクソンかを標的とするｓｉＲＮＡがサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社から商業的に入手可能である。同様に、マウスＰ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡとしては、例えば、マウスＰ４ＨＡ３遺伝子の第１及び２エクソンか、第２エクソンか、第３エクソンか、第４エクソンか、第４及び５エクソンか、第６エクソンか、第７エクソンか、第８及び９エクソンか、第１３エクソンか、を標的とするｓｉＲＮＡがサーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社から商業的に入手可能である。コスモバイオ株式会社が代理するBIONEER CORPORATION（韓国、大田）その他から、設計済み、又は、新規設計のヒトＰ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを入手することもできる。
　ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０～約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０～約７０℃で約１～約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、sｉＲＮＡの前駆体となるｓｈＲＮＡを合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
　本明細書においては、生体内でＰ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、該ｍＲＮＡの発現を阻害する核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。プロモーターとしては、ｐｏｌＩＩ系プロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いＲＮＡの転写を正確に行わせるために、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用するのが一般的である。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、マウス及びヒトのＵ６－ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトＨ１－ＲＮａｓｅ　Ｐ　ＲＮＡプロモーター、ヒトバリン－ｔＲＮＡプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。
（ｂ）　Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸
　Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸は、該ｍＲＮＡのヌクレチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその一部を含む核酸であって、標的ｍＲＮＡと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。アンチセンス核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸がＤＮＡの場合、標的ＲＮＡとアンチセンスＤＮＡとによって形成されるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、内在性ＲＮａｓｅ　Ｈに認識されて標的ＲＮＡの選択的な分解を引き起こすことができる。アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてタンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、タンパク質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。また、アンチセンス核酸は、標的ｍＲＮＡや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
　アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のｓｉＲＮＡ等の場合と同様の修飾を受けていてもよい。
　アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のｃＤＮＡ配列もしくはゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。
　本明細書においては、生体内でＰ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、該ｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したアンチセンスＲＮＡを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。プロモーターとしては、転写されるアンチセンスＲＮＡの長さに応じて、ｐｏｌＩＩ系プロモーターかｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを適宜選択して用いることができる。
（ｃ）　Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに対するリボザイム核酸
　Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイム核酸もまた、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を抑制する核酸として使用することができる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる。
（ｄ）　Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ
　Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡを標的とするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）もまた、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡに相補的に結合してｍＲＮＡの翻訳を抑制するか、あるいはｍＲＮＡを分解することにより、転写後にＰ４ＨＡ３の発現を抑制する核酸として使用することができる。Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡの配列は、種々のｗｅｂサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、米国ホワイトヘッド研究所が公開しているTargetScan（http://www.targetscan.org/vert_80/）等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡには、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－３３５－５ｐ（ＭＩＲＴ０１８４８５）、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２４－３ｐ（ＭＩＲＴ０２２８６８）、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｉ－５ｐ（ＭＩＲＴ５８６３９７）、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｋ（ＭＩＲＴ５８６３９９）、及び、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４６６ｄ－５ｐ（ＭＩＲＴ５８６４００）が含まれる。
　本発明の医薬組成物に含まれる、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸は、上記（ａ）～（ｄ）の少なくともいずれか１つのタイプの核酸を含んでおればよく、同一のタイプの異なる分子種の核酸を２種類以上含んでもよく、異なる２つ以上のタイプの核酸を含んでもよい。
　４．本発明の医薬組成物に含まれる核酸送達担体
　本発明の医薬組成物に含まれる核酸送達担体であり、本発明の医薬組成物に含まれる核酸を担持することができ、かつ該核酸を細胞内に送達し得るものである限り、その構造、構成分子、核酸の担持形態に特に制限はない。代表的な核酸のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としては、正電荷を持つカチオン性リポソームやカチオン性ポリマー等を担体として利用し、それらと核酸との静電的相互作用に基づいて形成された複合体が挙げられる。該複合体は負に荷電した細胞膜に結合した後、吸着性エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。
　より具体的には、本発明で用いられる核酸送達担体としては、例えば、リポソーム（例、カチオン性リポソーム、PEG修飾リポソーム等）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、カチオン性ポリマー（例、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリオルニチン、キトサン、アテロコラーゲン、プロタミン等）、カチオン性ポリマーをリポソームに封入したもの等が挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、生体由来成分であるエキソソームを用いることもできる。好ましくは、リポソーム又は脂質ナノ粒子であり、より好ましくはリポソームである。
　本明細書において「リポソーム」とは、１以上の脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞であり、通常は水溶性物質を内相に、脂溶性物質を脂質二重層内に保持することができる。本明細書において「封入」という場合には、本発明の核酸はリポソーム内相に保持されてもよいし、脂質二重層内に保持されてもよい。本発明に用いられるリポソームは単層膜であっても多層膜であってもよく、また、粒子径は、例えば10～1000nm、好ましくは50～300nmの範囲で適宜選択できる。角膜組織への送達性を考慮すると、粒子径は、例えば200nm以下、好ましくは100nm以下であり得る。
　本発明に用いるリポソームの成分としては、例えば、レシチンなどの天然リン脂質、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）などの半合成リン脂質、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、コレステロールなどが好ましい。その他、Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）－ジドデシル－Ｄ－グルタメートクロリド（ＴＭＡＧ）、Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラメチル－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラパルミチルスペルミン（ＴＭＴＰＳ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、１，２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｏ，Ｏ’－ジテトラデカノイル－Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ－６－１４）などのカチオン性脂質も好ましい。
　本発明の医薬組成物に含まれる核酸は、筋線維芽細胞に送達されて作用効果を奏するので、本発明の核酸送達担体は、より効率的に筋線維芽細胞に本発明の核酸を送達するために、筋線維芽細胞に特異的に結合する化合物を含むことが望ましい。例えば、筋線維芽細胞はビタミンＡを取り込みやすいことが知られている。そこで、本発明の核酸送達担体、例えば、リポソームは、ビタミンＡ結合タンパク質との結合親和性の高いレチノイド誘導体及び／又はビタミンＡアナログで膜表面が修飾されることが好ましい。本発明の核酸送達担体へのレチノイド誘導体及び／又はビタミンＡアナログの結合又は包含は、化学的及び／又は物理的な方法によってレチノイド誘導体及び／又はビタミンＡアナログを核酸送達担体の他の構成成分に結合させるか又は包含させることによっても可能となる。又は、本発明の核酸送達担体へのレチノイド誘導体及び／又はビタミンＡアナログの結合又は包含は、該核酸送達担体の作製時に、基本的な核酸送達担体構成成分とともに形成親和性のあるレチノイド誘導体及び／又はビタミンＡアナログを核酸送達担体の構成成分中に混入させることによっても可能となる。本発明の核酸送達担体に結合させるか又は包含させるレチノイド誘導体及び／又はビタミンＡアナログの量は、核酸送達担体構成成分中の重量比で０．０１％～１００％、好ましくは０．２％～２０％、さらに好ましくは１～５％とすることが可能である。レチノイド誘導体及び／又はビタミンＡアナログ並びに脂質を構成成分とする核酸送達担体は、例えば特許第6590888号公報に開示の組成物のように、当業者に周知である。
　核酸のような水溶性化合物のリポソームへの封入法としては、リピドフィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、リモートローディング法等が挙げられるが、これらに限定されず、任意の公知の方法を適宜選択することができる。
　本明細書において「脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）」とは、カチオン性脂質及び非カチオン性脂質を含む脂質集合体の外殻の内部に、大孔構造（例、リポソーム）や小孔構造（例、メソポーラス材料）を有しない、平均径1μm未満の粒子を意味する。
　本発明の医薬組成物の１つの実施態様では、本発明の医薬組成物は、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸以外の薬剤Ｐをさらに含んでもよい。ここで薬剤Ｐは、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸の薬効に実質的に影響を及ぼさないことを条件として、いかなる薬剤でもかまわない。例えば、薬剤Ｐは線維化疾患のいずれかの既存の医薬の有効成分であってもかまわない。前記線維化疾患のいずれかの既存の医薬としては、例えば、Ｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸のような核酸医薬であってもよいし、ピルフェニドンのような非核酸医薬であってもよい。さらに、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸の副作用を軽減するための医薬であってもよい。以下の実施例に示すとおり、本発明の医薬組成物は、Ｈｓｐ４７をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸と併用すると相乗効果を発揮した。Ｈｓｐ４７はＰ４ＨＡ３と同様に線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を抑制する点は共通するが、おそらくＨｓｐ４７のｍＲＮＡ発現阻害が線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を抑制する作用機序が、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現阻害が線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を抑制する作用機序とは異なるために相乗効果を奏するものと考えられる。線維症疾患の既存の他の医薬、例えば、ピルフェニドンは線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を抑制するわけではないので作用機序が異なる。そので本発明の医薬組成物は、ピルフェニドンのような非核酸医薬と併用すると相乗効果を発揮することが容易に予想できる。
　本発明の医薬組成物の１つの実施態様では、本発明の医薬組成物は、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、頭蓋内投与及び髄腔内投与からなる群より選択される少なくとも１つの非経口的投与によって送達されることができる。前記投与は、持続的又は長期的であってもよく、短期的又は断続的であってもよい。本発明の治療剤は、投与後、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、少なくとも６５日、少なくとも７０日、少なくとも７５日、少なくとも８０日、少なくとも８５日、少なくとも９０日、少なくとも９５日、少なくとも１００日、少なくとも１０５日、少なくとも１１０日、少なくとも１１５日、少なくとも１２０日、若しくは、少なくとも１年にわたって、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡのダウンレギュレーション、及び／又は、線維化関連因子の罹患組織の細胞内レベルの５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の低減をもたらす。
　本発明の医薬組成物の投与形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等による経口投与であってもよい。これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトールのような糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリンのような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランのような有機系賦形剤：及び、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カルシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシウムのような燐酸塩；炭酸カルシウムのような炭酸塩；硫酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬロイシン；脂肪酸ナトリウム塩；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；及び、上記澱粉誘導体を挙げることができる。）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、及び、前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシ基メチルセルロース、カルボキシ基メチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシ基メチルセルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシ基メチルスターチ、カルボキシ基メチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及び、ソルビン酸を挙げることができる。）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。）等の添加剤を用いて周知の方法で製造される。
　本発明の医薬組成物に含まれる有効成分は、前記Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸（該核酸に核酸送達担体が結合又は会合する場合には、前記核酸送達担体が結合又は会合した前記核酸）である。本発明の医薬組成物に含まれる有効成分の割合は、所望の効果を奏することができる範囲で適宜設定することができるが、通常、０．０１～１００重量％であり、好ましくは０．１～９９．９重量％、より好ましくは０．５～９９．５重量％である。
　本発明の医薬組成物を投与する用量は、治療される個人の年齢、体重及び状態と、投与経路、投与形態及び投与方法とを考慮して注意深く調整されなければならず、そして正確な投与量は医師によって決定されなければならない。実際の投与量は医師の裁量の範囲内であり、望ましい治療効果を得るために本発明の特別な状況に対して用量を設定することにより変動することがある。しかし本発明の医薬組成物の投与量としては、前記有効成分の種類、投与対象の体重や年齢、症状などにより一概に規定されるものではないが、例えば、非経口的投与の場合には、１回当り、下限として、０．００１ｍｇ／ｋｇ　体重（好ましくは、０．０１ｍｇ／ｋｇ　体重）、上限として、１００ｍｇ／ｋｇ　体重（好ましくは、１０ｍｇ／ｋｇ　体重）を経口投与の場合には、１回当り、下限として、０．０１ｍｇ／ｋｇ　体重（好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ　体重）、上限として、１０００ｍｇ／ｋｇ　体重（好ましくは、１００ｍｇ／ｋｇ　体重）を、１日当り１乃至数回症状に応じて投与することが望ましい。
　本発明の医薬組成物の有効成分、担体、投与する用量及び用法の選択の判断に用いる望ましい治療効果としては、線維化疾患の臨床症状（罹患組織の物理的硬化）の進行の抑制及び／又は軽減が最も重要である。しかし臨床症状に先立つサロゲート・エンドポイントとして、罹患組織に蓄積した線維化関連因子の減少及び／又は消失も本発明の医薬組成物の有効成分、担体、投与する用量及び用法の選択の判断に用いることができる。
　本発明の１つの実施態様は、本発明の医薬組成物の有効量を線維化疾患を罹患しているか、罹患するおそれのある被験者に投与することを含む、線維化疾患の予防又は治療方法である。ここで、線維化疾患を罹患するおそれのある被験者に投与することとは、線維化疾患の原因となる、心筋梗塞と、肝臓、肺、腎臓その他の炎症疾患との被験者であって、まだ線維化疾患に至らない段階の被験者に本発明の医薬組成物を投与することをいう。本明細書の実施例に説明するとおり、本発明の医薬組成物は、筋線維芽細胞が産生するＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現を抑制することで線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を抑制するから、前記線維化疾患に至らない段階の被検者に本発明の医薬組成物を投与することで線維化疾患を予防することができる。
　本明細書において数値について修飾する連体詞「約」は、当該数値の９０％以上、かつ、１１０％以内の数値範囲であることを意味する。例えば、「約４０％」とは、３６％以上４４％以内の数値範囲の百分率を指す。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
　実施例１　筋線維芽細胞で特異的に発現する遺伝子の探索
　本発明の発明者らは、まず、心筋梗塞の実験的発症のモデル動物を用いて、偽処置群と比較して心筋梗塞処置群の心臓において発現量が顕著に増加するタンパク質を探索し、さらに、筋線維芽細胞において周囲の硬さ（機械的刺激）依存的に発現量が変動する分子を絞り込んだ。
　本明細書の実施例で使用したマウスは日本エスエルシー株式会社より購入したＣ５７ＢＬ／６Ｊ純系マウスで、雄性マウスは８～１０週齢、雌性マウスは６～８週齢の個体を用いた。野生型のマウスに超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＮＡＳＨモデルマウス及び通常飼料を給餌したマウスを作成した。その後、それぞれのマウス肝臓からＲＮＡを回収し、ＲＮＡ－ｓｅｑを行い、遺伝子のｍＲＮＡ発現量を比較した。通常肝臓で全く発現せず、ＮＡＳＨ肝臓で発現量が増加する遺伝子を同定しようと考えた。そこでまず、通常飼料を給餌したマウスでのＴＰＭ（transcripts per million）値が０かつ、ＮＡＳＨモデルマウス群の肝臓でのＴＰＭ値が０．１より大きいという基準を満たす遺伝子として１５０１種類の遺伝子を選別した。次に肝臓の筋線維芽細胞に多く発現する遺伝子を同定しようと考えた。そこで、線維化マウス肝臓から筋線維芽細胞を単離してＲＮＡ－ｓｅｑを行い、ＴＰＭ値が５０よりも大きいものを選別した。その結果、１９種類の遺伝子が選別できた。このうち、筋線維芽細胞に特異的に発現しそうなものを選別した。文献検索などを行った結果、Ｐ４ＨＡ３が筋線維芽細胞に特異的に発現することを見出した。
　実施例２　心筋梗塞の疾患モデルマウスにおけるＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡの特異的発現
　心筋梗塞の疾患モデルマウスはNakaya, M. et al.（J Clin Invest. 2017;127(1):383-401.）に記載のとおり行った。簡潔には、マウスにおいて急性心筋梗塞を発症させるために、マウスをソムノペンチル注射液（５０ｍｇ／ｋｇ　ペントバルビタールナトリウム）の腹腔内注射で麻酔し、カニューレを気管に挿入した。左側肋間の切開により開胸し、心臓を吸引して胸腔内から脱出させて、左冠状動脈前下行枝を６ｍｍ絹ブレード縫合糸で結紮した。偽処置群（ｓｈａｍ）では、開胸及び心臓の胸腔内からの脱出は行うが、結紮は行わなかった。処置群、偽処置群ともに、心臓を胸腔に戻して、閉胸した。
　本明細書の実施例におけるＰ４ＨＡ３等のｍＲＮＡ発現量は、以下のとおり定量した。精製したＲＮＡを微量分光光度計DS-11 (DeNovix)により濃度を決定し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems）を用いてｃＤＮＡへの逆転写反応を行った。ｍＲＮＡの定量は、Luna Universal qPCR Master Mix（New England BioLabs）のプロトコルに従い、９５℃でＤＮＡ合成酵素の活性化を６０秒行い、９５℃　１５秒によるｃＤＮＡの変性と６０℃、３０秒の伸長反応を４５サイクル行った。内部標準としてＧＡＰＤＨを用いて、ΔΔＣｔ法により解析を行なった。マウスCyp7a1プローブはApplied Biosystemsから購入した。マウスα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）、ＣＤ６８、１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）、１α２型コラーゲン（Ｃｏｌ１α２）、１α３型コラーゲン（Ｃｏｌ１α３）、６α１型コラーゲン（Ｃｏｌ６α１）、８α１型コラーゲン（Ｃｏ８１α１）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド -3- リン酸脱水素酵素）、熱ショックタンパク質４７（Ｈｓｐ４７）、プロリル４－ヒドロキシラーゼ　アルファ１サブユニット（Ｐ４ＨＡ１）、プロリル４－ヒドロキシラーゼ　アルファ２サブユニット（Ｐ４ＨＡ２）及びプロリル４－ヒドロキシラーゼ　アルファ３サブユニット（Ｐ４ＨＡ３）のプライマー及びプローブはSigma-Aldrichから購入した。
　図１に、心筋梗塞後の心臓におけるＰ４ＨＡ３（Ａ）、α－ＳＭＡ（Ｂ）及びペリオスチン（Ｃ）のｍＲＮＡ発現量の相対値の経時変化を示すグラフを示す。αＳＭＡは筋線維芽細胞の特異的マーカーであり、ペリオスチンも筋線維芽細胞に特異的に発現することが知られている細胞外マトリクスタンパク質である。■は梗塞領域、▲は非梗塞領域、そして、●は偽処置群（ｓｈａｍ）における各遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量を表す。同一条件の実験を３～６回行った結果である。各遺伝子のｍＲＮＡの梗塞領域の発現量の処置後７日の誤差棒は標準偏差を表す。図１のグラフでは、縦軸は偽処置群の０日目の心臓サンプルにおける各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値、横軸は心筋梗塞処置後の日数（単位：日）を表す。梗塞領域、非梗塞領域及び偽処置群のサンプル数は、それぞれ、５～６、３及び３～４であった。Ｐ値は、対応のない両側ｔ検定（unpaired two-tailed Student’s t-test）により計算された。グラフの###は同じ梗塞処置後日数の梗塞領域対偽処置群（inf vs. sham）の有意性がｐ＜０．００１であることを表し、グラフの***は同じ梗塞処置後日数の梗塞領域対非梗塞領域（inf vs. rem）の有意性がｐ＜０．００１であることを表す。Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡは、αＳＭＡ及びペリオスチンと比べて処置群の梗塞領域での発現量が有意に高く、処置群の非梗塞領域と、偽処置群での発現量が有意に低い。したがってＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡは、αＳＭＡ及びペリオスチンと比較して、心筋梗塞部位での発現特異性が高いという結果が得られた。
　心筋梗塞時にＰ４ＨＡ３を発現する細胞を同定するために、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）試薬キット（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、コスモバイオ株式会社）を用いて、心筋梗塞後７日目の心臓切片のin situハイブリダイゼーションを行った。in situハイブリダイゼーションは、Advanced Cell Diagnostics社のRNA scopeを用い、プロトコルに従って操作を行った。作製した凍結組織切片は、まずＰＢＳで洗浄を行なった後、プロテアーゼ溶液を滴下し、HybEZTMオーブン(Advanced Cell Diagnostics)内にて４０℃で３０分間反応させた。その後、Ｐ４ＨＡ３に対するプローブを組織切片に滴下し、HybEZTMオーブンにおいて４０℃で２時間反応させ、その後、Ａｍｐ溶液によるシグナル増幅反応を行った。その後、蛍光標識Tyramideで反応させてＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡのシグナルを検出した。シグナル検出反応の後、抗体を用いた共染色を行った。５％　ＢＳＡ／ＰＢＳを滴下し、室温で１時間反応(ブロッキング)させ、Anit-Desmin抗体（abcam, #ab15200）を4℃で一晩反応させた。翌日、蛍光標識されたAlexa Fluor 488(R)-conjugated goat anti-rabbit IgG（Invitrogen, # A-11008）を室温で１時間反応させ、ＤＡＰＩによる核の染色を行った後に、FluorSaveTM Reagentを用いて切片を封入した。撮像は共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００，　Ｚｅｉｓｓ）により行った。
　図２は、心筋梗塞後７日目の心臓切片のin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像のパネルである。Ａはペリオスチン及びＰ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像と、ＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡画像とをマージした蛍光顕微鏡画像である。Ｂ、Ｃ及びＤは、いずれもＡの破線で囲まれた領域の拡大図である。Ｂはペリオスチンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像で、ＣはＰ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像で、ＤはＢ及びＣの蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像である。図２から、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡはペリオスチンのｍＲＮＡと同じく筋線維芽細胞に特異的に発現するが、ペリオスチンのｍＲＮＡが筋線維芽細胞の細胞質にほぼ均一に分布するのに対し、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡは筋線維芽細胞の細胞質の一部に集塊状に点在する。
　Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡが筋線維芽細胞に特異的に発現することは、公知の心筋梗塞モデル処置前後のマウス心臓の各細胞タイプの１細胞解析結果でも確認された。図３は、前出のFarbehi N. et al, (2019)のデータを用いて作成したｔ－ＳＮＥプロット図で、心筋梗塞モデル処置前後のマウス心臓の各細胞タイプの１細胞解析結果を示す。Ａは、各細胞タイプ特異的なｍＲＮＡを発現する細胞集団の次元削減プロット図、ＢはαＳＭＡ（Ａｃｔａ２）遺伝子を発現する細胞集団を可視化した次元削減プロット図、Ｃはペリオスチン（Ｐｏｓｔｎ）遺伝子を発現する細胞集団を可視化した次元削減プロット図、ＤはＰ４ＨＡ３遺伝子を発現する細胞集団を可視化した次元削減プロット図である。Ｍａｃはマクロファージ、Ｅｎｄは内皮細胞、Ｃｙｃｌｉｎｇは増殖中の内皮細胞、Ｍｕｒａｌは平滑筋細胞及びペリサイト、Ｆｉｂｒｏは線維芽細胞、ＡｃｔＦｉｂｒｏは活性化線維芽細胞の各細胞のクラスターを表す。
　実施例３　心筋梗塞部位由来筋線維芽細胞における各遺伝子の発現に対するＰ４ＨＡ３ノックダウンの影響
　つぎに、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現抑制が他の線維化関連因子のｍＲＮＡ発現に与える影響を調べた。心筋梗塞の疾患モデルマウスの梗塞領域からの筋線維芽細胞の培養は前出のＮａｋａｙａ，　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（２０１７）のとおり行った。簡潔には、冠状動脈結紮処置後３日目に、処置群マウスの心室を、０．１％コラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）と０．１％トリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）とを含むＰＢＳを用いて、３７℃で攪拌しながら消化した。細胞を１０％　ＦＢＳ／ＤＭＥＭを含むプレートに一晩置き、その後、培養液を交換して付着していない細胞を除去した。付着した細胞は６日以上培養し、以下の実験で筋線維芽細胞として使用した。筋線維芽細胞は、Ｐ１（ｐａｓｓａｇｅ　１）の筋線維芽細胞を使用した。筋線維芽細胞には，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。用いたｓｉ　Ｐ４ＨＡ３は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号４３９０７７１（Ａｓｓａｙ　ＩＤ：ｓ１１５７２３）を前記筋線維芽細胞の培養に３．１２５ｎＭの最終濃度で添加した。対照ｓｉＲＮＡとして用いたｓｉ　Ｃｔｒｌは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号４３９０８４３を前記筋線維芽細胞の培養に３．１２５ｎＭの最終濃度で添加した。ｓｉＲＮＡ処理後の筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３等のｍＲＮＡ発現量の定量は実施例２と同様に行った。
　図４は、梗塞領域から単離された筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３（Ａ）、ペリオスチン（Ｂ）、１α１型コラーゲン（Ｃ）、３α１型コラーゲン（Ｄ）遺伝子の発現に対するＰ４ＨＡ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡの影響を示す棒グラフである。ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３及びｓｉ　Ｃｔｒｌは、それぞれ、Ｐ４ＨＡ３遺伝子に対するｓｉＲＮＡ及び対照遺伝子に対するｓｉＲＮＡを投与した筋線維芽細胞における各遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。サンプル数は５である。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。
　図４に示すとおり、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３（実施例７のｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１と同じｓｉＲＮＡ）で処理した筋線維芽細胞は、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現だけでなく、ペリオスチン、１α１型コラーゲン及び３α１型コラーゲンのｍＲＮＡ発現も強力に阻害した。上記Ｐ４ＨＡ３ノックダウン実験から、Ｐ４ＨＡ３は、心筋梗塞後に分化した筋線維芽細胞におけるペリオスチン、１α１型コラーゲン及び３α１型コラーゲンの転写に不可欠な調節因子として機能することが示唆された。
　実施例４　他の臓器での線維症におけるＰ４ＨＡ３の関与
　Ｐ４ＨＡ３の線維症への関与が心筋梗塞に限られないことを確認するため、肺線維症、脂肪肝及び慢性腎不全の疾患モデルマウスを用いて以下の実験を行った。なお、Ｐ４ＨＡ３等のｍＲＮＡ発現量の定量は実施例２と同様に行った。
　肺線維症の疾患モデルマウスは、６～８週齢の雌性マウスをイソフルラン吸入で麻酔し、ブレオマイシンを含む生理食塩水を気管支内に投与して作成した。肺組織のｍＲＮＡを抽出したサンプルにおいては１ｍｇ／ｋｇ投与し、それ以外の組織切片の作製・筋線維芽細胞の単離・生存率の計測においては１．５ｍｇ／ｋｇ投与した。偽処置群では、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）のみを注入した。ブレオマイシン又は生理食塩水のみの投与の１４日後に肺ＲＮＡを回収した。
　肝線維化モデルマウスは、四塩化炭素の投与又は超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌により作成した。四塩化炭素（体重１ｋｇあたり０．４ｍＬ）を溶媒のコーンオイルで５倍希釈して週２回ずつ４週間腹腔内投与すると肝臓の線維化所見が認められる。しかし四塩化炭素の投与を中止してさらに４週間飼育すると肝臓の線維化所見は消失する。四塩化炭素によるＮＡＳＨモデルマウスでは、四塩化炭素の４週間投与後（CCl4群）、対照実験として溶媒のコーンオイルのみを４週間投与後（Vehicle群）、又は、四塩化炭素の投与を中止してさらに４週間飼育後（Withdraw群）に肝ＲＮＡを回収した。Vehicle群及びCCl4群は最終投与から24時間後に、Withdraw群は最終投与から4週間後に、ソムノペンチルで麻酔させ、開腹・開胸し、心臓穿刺によりPBSを灌流させ、肝臓から血液が抜けたことを確認した後、肝臓を摘出した。その後、Isogen（ニッポンジーン）及びRNeasyPlus Mini Kit（Qiagen）のプロトコルに従い、全ＲＮＡを回収した。飼料によるＮＡＳＨモデルマウスでは、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（６０ｋｃａｌ％　脂肪含有量、ラード使用、コリン欠乏、メチオニン減量（０．１％）、ＣＤＡＨＦＤ（ResearchDiets））を５週間給餌し、その後通常飼料（ＳＤ（Research Diets））に戻してさらに５週間給餌した後、肝ＲＮＡを回収した。
　慢性腎不全モデルマウスは、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）をChevalier, R.L. et al.（Kidney International (2009) 75, 1145-1152）に従って作成した。８～１０週齢の雌性マウスに１．５％イソフルランを吸入させ麻酔にかかったマウスを、吸入麻酔維持下で仰臥位にて手術台に固定した。手術用顕微鏡観察下で腹部の正中を切開し、右尿管を露出させ、尿管を６－０絹ブレード縫合糸で結紮することにより行った。その後、腹腔にプロカインペニシリンG溶液を３０μＬ滴下し、縫合糸で切開箇所を縫合した。ＵＵＯ施術１０日後にソムノペンチルで麻酔させ、開腹し腹部大動脈を切断し脱血を行った。その後、腎臓を摘出して全ＲＮＡを回収した。ＵＵＯ施術を行わなかった反対側の腎を偽処置群とした。
　図５は、肺（Ａ）、肝臓（Ｂ）及び腎臓（Ｃ）の実験的線維症モデルにおけるＰ４ＨＡ３遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量発現量を示す棒グラフである。グラフＡはブレオマイシン処置群（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）又は偽処置群（Ｓａｌｉｎｅ）の肺組織におけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の相対値を表し、グラフＢは超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料群（ＮＡＳＨ）又は通常飼料給餌群（Ｃｔｒｌ）の肝組織におけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の相対値を表し、棒グラフＣはＵＵＯ処置群（ＵＵＯ）又は偽処置群の腎組織におけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。各棒グラフの縦軸は、ＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とするＰ４ＨＡ３ｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。
　図５に示すとおり、いずれの臓器の線維症モデルマウスでも、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡの発現が処置群では偽処置群の数倍ないし数十倍増加した。そこで、Ｐ４ＨＡ３は、心臓だけでなく、肺、肝臓及び腎臓でも線維化病態時に発現が増加することが明らかになった。
　実施例５　一過性の線維化を起こした肝臓におけるＰ４ＨＡ３及び線維化関連因子のｍＲＮＡ発現の経時変化
　次に、四塩化炭素投与による一過性肝臓線維化モデルマウスと、飼料によるＮＡＳＨモデルマウスとを用いて、Ｐ４ＨＡ３及び線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を調べた。
　図６－１は、四塩化炭素投与による一過性肝臓線維化モデルマウスについて、溶媒投与開始４週間後（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、四塩化炭素投与開始４週間後（ＣＣｌ４）及び四塩化炭素投与中止４週間後（Ｗｉｔｈｄｒａｗ）に回収した肝臓組織でのＰ４ＨＡ３（Ａ）、ペリオスチン（Ｂ）及び１α１型コラーゲン（Ｃ）のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値の経時変化を示す棒グラフである。各棒グラフの縦軸は、溶媒投与開始４週間後（Ｖｅｈｉｃｌｅ）群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。同一条件の実験を５回行った結果である。
　図６－１に示すとおり、四塩化炭素投与により一過性の肝臓線維化が起こっている状態の肝臓では、Ｐ４ＨＡ３、α－ＳＭＡ及び１α１型コラーゲンのいずれのｍＲＮＡもＶｅｈｉｃｌｅ群より発現が増大したが、四塩化炭素の投与を中止すると、ほぼＶｅｈｉｃｌｅ群と同レベルまで発現が減少した。
　図６－２は、飼料によるＮＡＳＨモデルマウスの肝臓におけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡの発現量の経時的変化を示す棒グラフである。各棒グラフ（0W、3W、6W、9W及び12W）は、それぞれ、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌前、給餌３週間後、給餌６週間後、給餌９週間後及び給餌１２週間後のマウスから回収した肝臓組織でのＰ４ＨＡ３のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値の経時変化を示す棒グラフである。各棒グラフの縦軸は、給餌前のＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各時点でのＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。同一条件の実験を６回（給餌３週間後のみ５回）行った結果である。
　図６－２に示すとおり、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料により肝臓線維化が起こっている状態の肝臓では、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡの発現は給餌期間が長いほど高くなる傾向があり、特に給餌期間が３週間と６週間とでは差が大きかった。
　図７は、飼料によるＮＡＳＨモデルマウスにおける、各遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量を示す棒グラフである。各棒グラフは、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を５週間給餌し、該飼料の給餌を止めて５週間後に回収したＮＡＳＨ発症マウスの肝組織（ＮＡＳＨ）と、通常飼料を給餌した対照マウスの肝組織（Ｃｔｒｌ）とにおけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量（Ａ）、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）のｍＲＮＡ発現量（Ｂ）、及び、１α１型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量（Ｃ）を表す。縦軸は、Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定により計算された。
　図７に示すとおり、飼料によるＮＡＳＨモデルマウスでも、Ｐ４ＨＡ３、α－ＳＭＡ及び１α１型コラーゲンのいずれのｍＲＮＡもＣｔｒｌ群より発現が増大した。
　ここでα－ＳＭＡは筋線維芽細胞のマーカーであり、１α１型コラーゲンは筋線維芽細胞が産生する線維化関連因子の１つである。そこで図６－１、６－２及び７から、肝臓の線維化でも、心筋梗塞の場合と同様に、筋線維芽細胞が出現して、線維化関連因子を産生し、該線維化関連因子の転写に不可欠な調節因子としてＰ４ＨＡ３が機能する可能性が示唆された。
　実施例６　一過性の線維化を起こした肝臓の画分ごとの遺伝子発現
　四塩化炭素投与による一過性肝臓線維化モデルマウスを用いて、Ｐ４ＨＡ３が筋線維芽細胞でだけ発現するかどうかを調べた。
　四塩化炭素投与による一過性肝臓線維化モデルマウスにおいて、四塩化炭素投与開始４週間後に肝臓を摘出した。肝臓をコラゲナーゼＡで３７℃、３０分間処置し、細胞懸濁液を５０Ｇで１分間遠心分離し、沈殿した細胞を肝細胞画分として単離した。一方で、上清をプラスチックプレートに播種し、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭで一晩培養したのち、プレートに接着した細胞をアキュターゼを用いて回収し、ＣＤ４５抗体付加磁気ビーズを用いてＣＤ４５陽性画分を血球系細胞画分として分離した。また同時にＣＤ４５陰性画分を筋線維芽細胞画分とした。肝細胞のマーカーであるＣｙｐ７ａ１、血球系細胞のマーカーであるＣｄ６８、筋線維芽細胞のマーカーであるα－ＳＭＡ、及び、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の定量は実施例２と同様に行った。
　図８は、四塩化炭素投与開始４週間後に回収された肝臓の細胞タイプ画分ごとのＣｙｐ７ａ１（Ａ）、Ｃｄ６８（Ｂ）、α－ＳＭＡ（Ｃ）及びＰ４ＨＡ３（Ｄ）遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値を示す棒グラフである。縦軸は、肝細胞画分における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。
　図８に示すとおり、Ｃｙｐ７ａ１のｍＲＮＡ発現は肝細胞画分のみで検出され、Ｃｄ６８のｍＲＮＡ発現はほとんど血球系細胞画分のみで検出され、α－ＳＭＡ及びＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現はほとんど筋線維芽細胞画分のみで検出された。したがって、線維化した肝臓においても、Ｐ４ＨＡ３は筋線維芽細胞に特異的に発現していることが示された。
　実施例７　一過性線維化肝臓由来の筋線維芽細胞における線維化関連因子の発現に対するＰ４ＨＡ３ノックダウンの影響
　実施例３と同様に、四塩化炭素投与開始４週間後の肝臓から単離した培養筋線維芽細胞において、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現抑制が他の線維化関連因子のｍＲＮＡ発現に与える影響を調べた。四塩化炭素（ＣＣｌ４）誘導性肝臓線維化モデルマウスから肝臓を摘出し、肝臓を細かく分割した。その後、Ｗａｓｈｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ［２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／５００ｎＭ　ＥＤＴＡ／ＨＢＳＳ（－）］を用いて洗浄し、肝臓片をＤｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ［０．１％　Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ａ／１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／ＨＢＳＳ（－）］中で３７℃、３０分間の振盪を３回行うことにより、筋線維芽細胞を含む細胞液を回収した。その後、Ｒｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒによって血球成分を除去し、１０％　ＦＢＳ／１％　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ＤＭＥＭで細胞を懸濁した後に、培養プレートに細胞を播種した。６時間後に培地交換を行い、非接着系の細胞やデブリスの除去を行なった。その後一晩、ＣＯ２インキュベータで培養させた後に、再度、非接着系の細胞をＰＢＳ洗浄によって取り除き、Ａｃｃｕｔａｓｅにより接着した細胞を回収した。磁気ビーズ標識されたＣＤ４５抗体で２０分間反応させ、ＬＳカラムを用いたＭＡＣＳ（磁気細胞分離法）により、ＣＤ４５陽性の血球系細胞を除去し、ＣＤ４５陰性の細胞を筋線維芽細胞として回収した。その後、ＦＡＣＳ　ｖｅｒｓｅを用いて単離した筋線維芽細胞の純度を測定したところ、ＭＡＣＳ後のＣＤ４５陰性細胞のほとんど全てが、筋線維芽細胞マーカーであるα－ＳＭＡ陽性であり、血球系細胞の混入はほとんど認められなかった。ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１及びｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃２は、それぞれ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号４３９０７７１及び４３９０７７１（Ａｓｓａｙ　ＩＤ：ｓ１１５７２３及びｓ１１５７２１）を前記筋線維芽細胞の培養にLipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）を用いて３．１２５ｎＭの最終濃度で添加した。実施例３のようにｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃２を使わない実験では、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１を「ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３」として用いた。ｓｉＲＮＡの対照実験には、Silencer Select Negative Control no. 1 siRNA （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号：4390843）をｓｉ　Ｃｔｒｌとして用いた。ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１のセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は本明細書に添付する配列表に、それぞれ、配列番号１及び２として列挙する。ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃２のセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は本明細書に添付する配列表に、それぞれ、配列番号３及び４として列挙する。
　図９は、肝線維化モデルマウスの肝臓から単離した筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３遺伝子（Ａ）、１α１型コラーゲン（Ｂ）、１α２型コラーゲン（Ｃ）、３α１型コラーゲン（Ｄ）及びエラスチン（Ｅ）遺伝子の発現に対するＰ４ＨＡ３ノックダウンの影響を示す棒グラフである。各棒グラフの左はｓｉ　Ｃｔｒｌ、右はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１、中央はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃２を投与した筋線維芽細胞における各遺伝子の発現量の相対値を表す。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。同一条件の実験を４回行った結果である。*はＰ＜０．０５、***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。
　図９に示すとおり、一過性線維化肝臓由来の筋線維芽細胞において、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１及びｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃２は、Ｐ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンその他の線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を阻害した。しかしその阻害効果は、実施例３の図４に示した心筋梗塞部位由来の筋線維芽細胞における線維化関連因子のｍＲＮＡ発現阻害と比べると弱かった。またいずれのｍＲＮＡ発現についても、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１のほうがｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃２より阻害活性は強かった。ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１及び＃２によるｍＲＮＡ発現阻害効果の差は、Ｐ４ＨＡ３よりも、１α１型コラーゲン及び１α２型コラーゲンのほうが大きかった。これに対し、３α１型コラーゲン及びエラスチンでは、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１によるｍＲＮＡ発現阻害効果と、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃２によるｍＲＮＡ発現阻害効果とで大きな差が生じなかった。このことから、筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３ノックダウンが他の線維化関連因子のｍＲＮＡ発現に与える影響は一様ではなく、Ｐ４ＨＡ３ノックダウンが線維化関連因子のｍＲＮＡ発現阻害を起こす作用機序は複数存在し、線維化関連因子（又はそのサブグループ）ごとに異なる可能性が示唆された。
　実施例８　線維化を起こした肺におけるＰ４ＨＡ３及び線維化関連因子のｍＲＮＡ発現
　実施例４と同様に行って作成したブレオマイシン投与肺線維症モデルマウスにおいて、Ｐ４ＨＡ３の他複数の線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を調べた。Ｐ４ＨＡ３等のｍＲＮＡ発現量の定量は実施例２と同様に行った。
　図１０は、ブレオマイシンの気管支内投与の７日後に回収した肺線維症発症マウスの肺組織（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）及び生理食塩水を投与した対照マウスの肺組織（Ｓａｌｉｎｅ）における、Ｐ４ＨＡ３（Ａ）、α－ＳＭＡ（Ｂ）、１α１型コラーゲン（Ｃ）及び３α１型コラーゲン（Ｄ）遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値を示す棒グラフである。各グラフの縦軸は、Ｓａｌｉｎｅ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。
　図１０に示すとおり、ブレオマイシン投与による肺線維症モデルでも、Ｐ４ＨＡ３、α－ＳＭＡ、１α１型コラーゲン及び３α１型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量は処置群において偽処置群より増大した。図７と比較すると、Ｐ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンのｍＲＮＡ発現は、肺線維症モデルマウスの肺でも図７のＮＡＳＨモデルマウスの肝臓と同様に増大した。しかし、α－ＳＭＡは肺線維症モデルマウスの肺ではＮＡＳＨモデルマウスの肝臓に比べて少ししか増大しなかった。これは、図７のＮＡＳＨモデルマウスでは超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌開始から１０週間後に回収した肝でのｍＲＮＡ発現を調べたのに対し、図１０のブレオマイシン投与による肺線維症モデルではブレオマイシンの気管支内投与の７日後に回収した肺でのｍＲＮＡ発現を調べたため、線維化誘発開始からの時間が短く、筋線維芽細胞がたくさん分化していないので、筋線維芽細胞のマーカーであるα－ＳＭＡのｍＲＮＡ発現量の増大が少なかった可能性が示唆された。
　実施例９　ブレオマイシン投与により線維化を起こした肺の画分ごとの遺伝子発現
　ブレオマイシンによる肺線維化モデルマウスを用いて、Ｐ４ＨＡ３が筋線維芽細胞でだけ発現するかどうかを調べた。
　実施例４と同様に作成したブレオマイシン投与による肺線維化モデルマウスにおいて、ブレオマイシン投与７日後に肺を摘出した。肝臓をコラゲナーゼＡで３７℃、３０分間処置し、細胞懸濁液をＦＡＣＳＡｒｉａにより分離し、得られたＣＤ４５陽性画分を血球系細胞画分とし、ＰＤＧＦＲα陽性画分を筋線維芽細胞画分とした。。血球系細胞のマーカーであるＣｄ６８、線維化関連因子である１α１型コラーゲン、及び、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量の定量は実施例２と同様に行った。
　図１１－１は、ブレオマイシン投与肺線維症モデルマウスの肺からＦＡＣＳＡｒｉａによりＣＤ４５陽性画分及びＰＤＧＦＲα陽性画分として単離したそれぞれ血球系細胞画分及び筋線維芽細胞画分におけるＣｄ６８（Ａ）、１α１型コラーゲン（Ｂ）及びＰ４ＨＡ３（Ｃ）の遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量の相対値を示す棒グラフである。縦軸は、肝細胞画分における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。
　図１１－１（Ａ）から、ＣＤ４５陽性画分として単離された血球系細胞画分は、血球系細胞のマーカーであるＣｄ６８を非常に強く発現するが、ＰＤＧＦＲα陽性画分として単離された筋線維芽細胞画分はほとんどＣｄ６８を発現しなかった。逆に、筋線維芽細胞画分は、線維化促進因子である１α１型コラーゲンを非常に強く発現するが、血球系細胞画分は１α１型コラーゲンはほとんど１α１型コラーゲンを発現しなかった。そして、Ｐ４ＨＡ３は筋線維芽細胞画分では非常に強く発現するが、血球系細胞画分ではＰ４ＨＡ３はほとんど発現しなかった。これらの結果から、Ｐ４ＨＡ３は線維化した肺においても筋線維芽細胞で発現することが実証された。
　実施例１０　線維化肺由来の筋線維芽細胞における線維化関連因子の発現に対するＰ４ＨＡ３ノックダウンの影響
　ブレオマイシン投与肺線維症モデルマウスから分画された筋線維芽細胞を用いて、実施例３と同様に線維化関連因子のｍＲＮＡ発現へのＰ４ＨＡ３ノックダウンの効果を調べた。
　図１１－２は、ブレオマイシン投与肺線維症モデルマウスの肺から単離し、ｓｉ　Ｃｔｒｌ又はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３（Ａ）、１α１型コラーゲン（Ｂ）、３α１型コラーゲン（Ｃ）及び１４α１型コラーゲン（Ｄ）遺伝子の発現に対するｓｉＲＮＡ投与の影響を示す棒グラフである。各棒グラフの左はｓｉ　Ｃｔｒｌ、右はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した筋線維芽細胞における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。同一条件の実験を５回行った結果である。誤差棒は標準偏差を表す。
　図１１－２に示すとおり、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した筋線維芽細胞ではＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現が非常に強く阻害された。ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した筋線維芽細胞での１α１型コラーゲン、３α１型コラーゲン及び１４α１型コラーゲンのｍＲＮＡ発現量は数分の１に低下した。心筋梗塞モデルマウス由来の筋線維芽細胞を用いた実施例３、及び、肝線維化モデルマウス由来の筋線維芽細胞を用いた実施例７と比較すると、肺線維症モデルマウス由来の筋線維芽細胞では、Ｐ４ＨＡ３遺伝子のｓｉＲＮＡによりＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量は５％未満まで低下したにもかかわらず、線維化関連因子のｍＲＮＡ発現量は２５％ないし５０％に低下したが、Ｐ４ＨＡ３ほどはｍＲＮＡ発現量が低下しなかった。この結果から、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現阻害が線維化関連因子のｍＲＮＡ発現阻害を起こす作用機序は、筋線維芽細胞がどの臓器由来かによって異なる可能性が示唆された。
　実施例１１　線維化腎臓におけるＰ４ＨＡ３及び線維化関連因子の発現
　片側尿管閉塞（ＵＵＯ）により線維化したマウス腎臓におけるＰ４ＨＡ３及び線維化関連因子の発現をin situハイブリダイゼーション法及び蛍光免疫組織化学法により調べた。図１２－１は、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）により線維化を起こした腎の長軸を含む冠状断模式図である。尿管結紮による物理的な圧力により、偽処置群（ｓｈａｍ）の腎と比較して皮質及び髄質を合わせた実質が薄くなっている。また、腎髄質の尿管近縁領域はα－ＳＭＡの発現が最も強く、腎皮質の皮質隣接領域に比べてコラーゲンの発現は弱い。逆に、腎皮質の皮質隣接領域はコラーゲンの発現が最も強く、腎髄質の尿管近縁領域に比べてα－ＳＭＡの発現は弱い。i～viは腎臓組織切片の位置を示す。
　図１２－２は、図１２－１の領域iに対応する偽処置を施した腎組織切片（ｓｈａｍ）のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像である（全て２０倍）。上段中央はＰ４ＨＡ３プローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像で、上段右は抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像で、上段左は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像と、ＤＡＰＩ染色蛍光顕微鏡画像とをマージした蛍光顕微鏡画像である。下段左は１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像で、下段中央は上段中央及び上段右の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像で、下段右は上段中央及び下段左の蛍光顕微鏡画像をマージした蛍光顕微鏡画像である。
　図１２－３は、片側尿管閉塞処置側のＵＵＯ－１領域（図１２－１の領域i参照）の腎組織切片のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果を示す蛍光顕微鏡画像と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像である（全て２０倍）。各画像の説明は図１２－２と同じである。ＵＵＯ－１領域は、最もα－ＳＭＡの発現が強い領域で、線維化が高度に進行していることを意味する。
　図１２－４は、片側尿管閉塞処置側のＵＵＯ－２領域（図１２－１の領域ii参照）の腎組織切片のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像である。（全て２０倍）。各画像の説明は図１２－２と同じである。ＵＵＯ－２領域も、最もα－ＳＭＡの発現が強い領域で、線維化が高度に進行していることを意味する。
　図１２－５は、片側尿管閉塞処置側のＵＵＯ－３領域（図１２－１の領域iii参照）の腎組織切片のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光免疫組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像である（全て２０倍）。各画像の説明は図１２－２と同じである。ＵＵＯ－３領域は、α－ＳＭＡの発現が弱～中程度の領域で、線維化がまさに進行中であることを意味する。
　図１２－６は、片側尿管閉塞処置側のＵＵＯ－５領域（図１２－１の領域v参照）の腎組織切片のＰ４ＨＡ３及び１α１型コラーゲンプローブによるin situハイブリダイゼーション結果と、抗α－ＳＭＡ抗体による蛍光組織化学結果を示す蛍光顕微鏡画像である（全て２０倍）。各画像の説明は図１２－２と同じである。ＵＵＯ－５領域も、α－ＳＭＡの発現が弱～中程度の領域で、線維化がまさに進行中であることを意味する。
　図１３は、図１２－２～１２－６で得られた結果をまとめた模式図である。線維化の程度が初期から後期へと進行するに伴って、筋線維芽細胞のマーカーであるα－ＳＭＡの発現の程度は弱から中を経て強に増大した。しかし、筋線維芽細胞の線維化能を反映する１α１型コラーゲンと、Ｐ４ＨＡ３とは、線維化の程度の中期に最も強くなり、線維化の後期になると中期よりも発現が低下するが、線維化初期よりは発現が高い、すなわち、中程度の発現となることが明らかになった。
　実施例１２　Ｐ４ＨＡ３の遺伝子欠損マウスにおける肝の線維化
　次にＰ４ＨＡ３欠損遺伝子のホモ個体のマウス（以下、「Ｐ４ＨＡ３ノックアウトマウス」という。）における肝の線維化について調べた。
　本明細書の実施例で使用したＰ４ＨＡ３ノックアウトマウスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用して正常なＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡが転写されないようなゲノム編集コンストラクトを構築し、該コンストラクトをＣ５７ＢＬ／６Ｎの雄性マウスと交尾させた翌日のＣ５７ＢＬ／６Ｎの雌性マウス卵管内に注入後、卵管全体に対してエレクトロポレーションを行うＧＯＮＡＤ（Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery）法（Ohtsuka, M. et al., Genome Biol. 19, 25 (2018)）により発明者らの研究室で作成した。
　図１４は、Ｐ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ）及び野生型マウス（ＷＴ）におけるＰ４ＨＡ３タンパク質の発現を示すウェスタンブロッティング図である。上図は肝臓筋線維芽細胞の全タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動分離物をＰ４ＨＡ３タンパク質に対する抗体で検出した結果であり、下図は前記分離物をＧＡＰＤＨタンパク質に対する抗体で検出した結果である。抗ＧＡＰＤＨ抗体の３５Ｋｄのバンドは、野生型マウス及びＰ４ＨＡ３ノックアウトマウスでほぼ同じ濃さであるのに対し、６１ＫｄのＰ４ＨＡ３タンパク質は野生型マウスのみで検出された。そこで、本実施例のＰ４ＨＡ３のノックアウトマウスはＰ４ＨＡ３タンパク質を発現しないことが確かめられた。超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌によるＮＡＳＨ疾患モデルの作成は、実施例４と同様に行った。
　図１５－１は、Ｐ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ）及び野生型マウス（ＷＴ）に超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した場合の体重変化率の経時変化を示す折れ線グラフである。上から、一番上の折れ線グラフは、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、そして一番下の折れ線グラフは、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）を表す。図１５－２は、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料又は通常飼料を１０週間給餌後の体重に対する肝重量の百分率を示す棒グラフである。棒グラフは、一番左から、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、そして一番右が超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）の体重に対する肝重量の百分率を表す。縦軸は、通常飼料を給餌した野生型マウスの肝重量/体重を１００％とした時の各マウス群の肝重量/体重の相対値を表す。それぞれのマウス群の個体数は８～１０である。***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。
　図１５に示すとおり、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌によるＮＡＳＨを発症すると、Ｐ４ＨＡ３ノックアウトマウスでも、野生型マウスでも、体重増加が起こらず１０週間経過してもほぼ実験開始時と体重が変わらなかった。しかし、体重で正規化した肝重量の相対値は、ＮＡＳＨを発症した野生型マウスよりＮＡＳＨを発症したＰ４ＨＡ３ノックアウトマウスのほうが有意に低下した。そこで、Ｐ４ＨＡ３ノックアウトマウスではＮＡＳＨを発症しても野生型マウスより肝肥大が抑制されることが示された。
　さらに、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌によるＮＡＳＨを発症したＰ４ＨＡ３ノックアウトマウスにおける線維化関連因子の発現を調べた。線維化関連因子のｍＲＮＡ発現量の定量は実施例２と同様に行った。
　図１６は、高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料又は通常飼料を１０週間給餌後のＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス及び野生型マウスにおける１α１型コラーゲン（Ａ）、１α２型コラーゲン（Ｂ）、３α１型コラーゲン（Ｃ）、及び、エラスチン（Ｄ）の発現量の相対値を比較した棒グラフである。各棒グラフは、左から、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、そして一番右は超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）の各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。縦軸は、ＷＴ　Ｃｔｒｌのそれぞれの遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのマウス群の個体数は８～１０である。***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。
　図１６に示すとおり、いずれの線維化関連因子も、ＮＡＳＨを発症した野生型マウスよりＮＡＳＨを発症したＰ４ＨＡ３ノックアウトマウスのほうが有意に低下した。そこで、Ｐ４ＨＡ３ノックアウトマウスではＮＡＳＨを発症しても野生型マウスより肝肥大が抑制されることが示された。そこで、Ｐ４ＨＡ３は生体内でも線維化関連因子の発現促進に関与することが証明された。
　さらに、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌によるＮＡＳＨを発症したＰ４ＨＡ３ノックアウトマウスにおける肝組織の線維化を組織学的に調べた。マウスの肝臓を速やかに１０％中性緩衝ホルマリンに浸し、室温で１６～３２時間固定し、パラフィン包埋した薄切切片をピクリン酸飽和０．１％　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｒｅｄ　８０　溶液中で６０分間インキュベートして、Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ　Ｒｅｄ染色を行った。その後、０．０１Ｎ　ＨＣＩにより洗浄し、エタノールによる脱水処理およびキシレンによる透徹処理を行い、ＭＯＵＮＴ　ＱＵＩＣＫにより封入した。染色した肝臓組織切片を顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ，ＢＺ－Ｘ７００）により撮像を行い、ＫＥＹＥＮＣＥ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅによって解析と定量を行なった。
　図１７の左図は、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（ＮＡＳＨ）又は通常飼料（Ｃｔｒｌ）を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ）又は野生型マウス（ＷＴ）の肝臓切片のＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ　Ｒｅｄ染色光学顕微鏡画像である。スケールは１ｍｍを表す。図１７の右図はこれらの顕微鏡画像の病理組織解析による評価結果である。各棒グラフは、左から、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、そして一番右は超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）の肝臓におけるコラーゲン蓄積領域の百分率を表す。グラフの縦軸はコラーゲン蓄積領域の百分率を表す。それぞれのマウス群の個体数は６である。***はＰ＜０．００１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。
　図１７の右の棒グラフに示すとおり、コラーゲン蓄積領域はＮＡＳＨを発症した野生型マウスよりＮＡＳＨを発症したＰ４ＨＡ３ノックアウトマウスのほうが有意に低下した。したがって、Ｐ４ＨＡ３のノックアウトマウスでは、ＮＡＳＨでの線維化病態が改善することが組織学的な評価によっても確認された。
　最後に、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌によるＮＡＳＨを発症したＰ４ＨＡ３ノックアウトマウスにおける肝組織の線維化を血液生化学的に調べた。マウスをソムノペンチルで麻酔し、腹大動脈から25G注射針付きシリンジを用いて全採血した。その後、遠心分離（１，２００×Ｇ、５分間、４℃）し、血清中の血漿を分取した。血漿ＡＳＴ、ＡＬＴレベルの測定をユニーテックに依頼し、血液生化学検査を行なった。
　図１８は、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料（ＮＡＳＨ）又は通常飼料（Ｃｔｒｌ）を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ）又は野生型マウス（ＷＴ）の血清中の肝機能マーカーＡＳＴ（左図）又はＡＬＴ（右図）の分析結果を示す棒グラフである。各棒グラフは、左から、通常飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　Ｃｔｒｌ）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌した野生型マウス（ＷＴ　ＮＡＳＨ）、通常飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　Ｃｔｒｌ）、そして一番右は超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料を給餌したＰ４ＨＡ３遺伝子欠損マウス（Ｐ４ＨＡ３－ＫＯ　ＮＡＳＨ）のＡＳＴ又はＡＬＴの酵素活性を表す。グラフの縦軸はＡＳＴ又はＡＬＴの酵素活性（単位：ＩＵ／Ｌ）を表す。それぞれのマウス群の個体数は５～６である。縦軸は、ＧＡＰＤＨ遺伝子ｍＲＮＡ発現量を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１を表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。
　図１８に示すとおり、肝機能マーカーＡＳＴ及びＡＬＴの測定値はＮＡＳＨを発症した野生型マウスよりＮＡＳＨを発症したＰ４ＨＡ３ノックアウトマウスのほうが有意に低下した。したがって、Ｐ４ＨＡ３のノックアウトマウスでは、ＮＡＳＨでの線維化病態が改善することが血液生化学的な評価によっても確認された。
　実施例１３　Ｐ４ＨＡ３及びＨｓｐ４７ノックダウンの線維化関連因子のｍＲＮＡ発現抑制効果の比較
　本実施例では、Ｐ４ＨＡ３のノックダウン治療の薬効を、既に臨床治験第ＩＩ相に入っている肝線維化症及び肝硬変の治療薬候補のＨｓｐ４７のノックダウン治療の薬効と比較した。
　Ｈｓｐ４７及びＰ４ＨＡ３のノックダウン試薬として、それぞれ、ｓｉ　Ｈｓｐ４７及び実施例７のｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１を用いた。ｓｉ　Ｈｓｐ４７は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号４３９０７７１（Ａｓｓａｙ　ＩＤ：ｓ２３２３３５）を用いた。四塩化炭素投与開始４週間後に回収された肝臓の細胞タイプ画分の分離は実施例６と同様に行った。Ｐ４ＨＡ３及び線維化関連因子のｍＲＮＡ発現量の定量は実施例２と同様に行った。ｓｉ　Ｈｓｐ４７及びｓｉ　Ｐ４ＨＡ３＃１の培養細胞への投与は実施例３及び７と同様に行った。
　図１９は、四塩化炭素投与による一過性肝臓線維化モデルマウスの肝臓の細胞タイプ画分ごとの各遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量を示す棒グラフである。棒グラフＡはＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量を表し、棒グラフＢはＨｓｐ４７のｍＲＮＡ発現量を表す。縦軸は、肝細胞画分における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各細胞画分におけるｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。各棒グラフの左は肝細胞画分、中央は血球系細胞画分、左は筋線維芽細胞画分での遺伝子発現量を表す。
　図１９に示すとおり、Ｐ４ＨＡ３はほぼ筋線維芽細胞画分でのみ発現するが、Ｈｓｐ４７は、筋線維芽細胞画分で多く発現したが、筋線維芽細胞画分での発現量の２５％強の発現量で肝細胞画分でも発現した。したがって、Ｐ４ＨＡ３のほうが筋線維芽細胞での発現特異性がＨｓｐ４７よりも高いことが明らかになった。
　図２０で、Ａは四塩化炭素投与線維化肝臓由来の筋線維芽細胞についてｓｉ　Ｐ４ＨＡ３又はｓｉ　Ｃｔｒｌを投与した筋線維芽細胞で発現したＨｓｐ４７遺伝子の発現量の相対値を表す棒グラフである。Ｂはｓｉ　Ｐ４ＨＡ３又はｓｉ　Ｃｔｒｌを投与した筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３遺伝子の発現量の相対値を表す棒グラフである。Ｃ～Ｆは、それぞれ、ｓｉ　Ｃｔｒｌ、ｓｉ　Ｈｓｐ４７又はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した筋線維芽細胞における１α１型コラーゲン（Ｃ）、３α１型コラーゲン（Ｄ）、８α１型コラーゲン（Ｅ）、及び、１４α１型コラーゲン（Ｆ）遺伝子の発現量の相対値を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのマウス群の個体数は４である。**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。
　図２０のＡ及びＢに示すとおり、本実施例で用いたｓｉ　Ｈｓｐ４７は、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３よりも筋線維芽細胞でのそれぞれの標的遺伝子に対するｍＲＮＡ発現抑制効果が高かった。しかし、図２０のグラフＣ～Ｆに示すとおり、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ３のほうが線維化関連因子のｍＲＮＡ発現抑制効果は高かった。そこで図２０の結果から、現在開発中のＨｓｐ４７を標的とする核酸医薬よりもＰ４ＨＡ３のほうが線維化抑制効果において有意性を持つ可能性が示された。
　さらに、筋線維芽細胞において、Ｐ４ＨＡ３及びＨｓｐ４７のｓｉＲＮＡの併用により線維化抑制に対する相乗的な効果が得られるか検討した。
　図２１－１のグラフＡ～Ｄは、それぞれ、ｓｉ　Ｈｓｐ４７及び／又はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した肝障害線維化肝臓由来の筋線維芽細胞におけるＨｓｐ４７（Ａ）、Ｐ４ＨＡ３（Ｂ）、１α１型コラーゲン（Ｃ）、又は、１α２型コラーゲン（Ｄ）のｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。図２１－２の棒グラフＡ～Ｄは、それぞれ、ｓｉ　Ｈｓｐ４７及び／又はｓｉ　Ｐ４ＨＡ３を投与した肝障害線維化肝臓由来の筋線維芽細胞における、３α１型コラーゲン（Ａ）、８α１型コラーゲン（Ｂ）、１４α１型コラーゲン（Ｃ）、又は、エラスチン（Ｄ）遺伝子の発現量を表す棒グラフである。図２１－１及び図２１－２において、縦軸は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。同一条件の実験を４回行った結果である。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。Ｐ値はＴｕｋｅｙ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。
　図２１－１のＡ及びＢに示すとおり、Ｈｓｐ４７のｓｉＲＮＡは、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現を全く抑制しなかったが、Ｐ４ＨＡ３のｓｉＲＮＡはＨｓｐ４７のｍＲＮＡ発現も若干抑制した。そして、図２１－１のＣ及びＤと、図２１－２のＡ～Ｄに示すとおり、Ｐ４ＨＡ３のｓｉＲＮＡのほうがＨｓｐ４７のｓｉＲＮＡより線維化関連因子のｍＲＮＡ発現抑制効果が高く、Ｐ４ＨＡ３のｓｉＲＮＡとＨｓｐ４７のｓｉＲＮＡとを併用すると、いずれかのｓｉＲＮＡ単独よりも線維化関連因子のｍＲＮＡ発現抑制効果がさらに高いことが明らかになった。
　以上の実施例から、Ｐ４ＨＡ３遺伝子は肝臓その他の臓器において線維化時にのみ発現し、正常時には発現しないこと、Ｐ４ＨＡ３遺伝子は肝臓その他の臓器の線維化の実行細胞である筋線維芽細胞に特異的に発現すること、及び、Ｐ４ＨＡ３の発現は、線維化関連因子の発現を促進することで、線維化病態を悪化させることが実証された。
　実施例１４　癌の予後不良因子としてのＰ４ＨＡ３
　線維化疾患には、心筋梗塞、肝硬変、肺線維症等の臓器の線維化疾患だけでなく、癌のうち病巣の物理的硬化を伴うものも含まれる。そこで、Ｐ４ＨＡ３遺伝子の発現が癌の予後不良因子となる可能性を検討した。
　インターネット上（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=pancancer_rnaseq）で公開されているＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ　Ｐｌｏｔｔｅｒ（Gyoerffy,B., Computational and Structural Biotechnology Journal, 2021;19:4101-4109）は、５４０００種類の遺伝子（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、タンパク質）の発現の高低と、２１種類の癌の予後情報（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線）のデータを含む。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ　ＰｌｏｔｔｅｒでＰ４ＨＡ３遺伝子の発現の高低が予後に関係する癌を検索した。
　図２２－１～図２２－３は、膀胱癌（Ａ）、頭頚部扁平上皮癌（Ｂ）、子宮頚部扁平上皮癌（Ｃ）、肝臓肝細胞癌（Ｄ）、膵管癌（Ｅ）、乳がん（Ｆ）、胃腺癌（Ｇ）、肺扁平上皮癌（Ｈ）、直腸腺癌（Ｉ）及び卵巣癌（Ｊ）の予後と、Ｐ４ＨＡ３遺伝子の発現の高低との関係を示すＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線である。Ｐ４ＨＡ３遺伝子を高発現する症例を黒色で、Ｐ４ＨＡ３遺伝子を低発現する症例を灰色で表示した。いずれも、Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ　Ｐｌｏｔｔｅｒで作成した。
　図２２－１～図２２－３に示すとおり、いずれの癌でもＰ４ＨＡ３遺伝子の発現が高い症例のほうが該遺伝子の発現が低い症例より予後が悪かった。Liu, M. et al.（Scientific Reports volume 10, Article number: 12949 (2020)）は検査した１５症例の腎明細胞癌の全てにおいてＰ４ＨＡ３遺伝子の発現が対応する正常腎組織より高かったと報告している。筋線維芽細胞においてＰ４ＨＡ３のｓｉＲＮＡがＰ４ＨＡ３遺伝子だけでなく他の線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を強力に抑制したことから、癌細胞においてもＰ４ＨＡ３のｓｉＲＮＡは薬効を示す可能性が高いと予測できる。
　実施例１５　Ｐ４ＨＡ３のアイソフォームについて
　プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファサブユニットには、Ｐ４ＨＡ３の他にアルファ１サブユニット（Ｐ４ＨＡ１）及びアルファ２サブユニット（Ｐ４ＨＡ２）が存在する。そこで、これらのアイソフォームの間で遺伝子発現の変動及び発現細胞に違いがあるかどうかを調べた。
　表１は、前出のFarbehi N. et al, (2019)のデータにもとづく心筋梗塞処置又は偽処置の３日後（3d）、７日後（7d）及び１４日後（14d）の偽処置心臓（Sham）、処置群心臓における梗塞領域部位（Inf）、処置群心臓における梗塞領域の境界部位（Border）、及び、処置群心臓における梗塞領域から離れた部位（Rem）から回収された組織由来の１細胞ＲＮＡライブラリにおけるＰ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２のＴＰＭ（transcripts per million）値である。
　表１に示すとおり、Ｐ４ＨＡ３のＴＰＭ数は心筋梗塞７日後の梗塞領域（Inf 7d）で著しく多いが、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２のＴＰＭ数の変動は、梗塞領域でも増大せず、心筋梗塞処置と関連しなかった。この結果から、プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファサブユニットのアイソフォームのうちＰ４ＨＡ３のみが心筋梗塞に特異的に発現が亢進することが示唆された。
　図２３の上段は、心筋梗塞後の心臓におけるＰ４ＨＡ３と、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２との発現量の経時変化を示すグラフである。■は梗塞領域、▲は非梗塞領域、そして、●は偽処置群における各遺伝子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法で計測したｍＲＮＡ発現量を表す。縦軸は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値、横軸は心筋梗塞処置後の日数（単位：日）を表す。図２３の下段は、前出のFarbehi N. et al, (2019)のデータを用いて作成したｔ－ＳＮＥプロット図で、Ｐ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２を発現する細胞集団を可視化した次元削減プロット図である。
　図２３の上段に示すとおり、Ｐ４ＨＡ３の梗塞領域でのｍＲＮＡ発現は心筋梗塞発症直後から増大するが、７日後には極大に達し、２８日後にはほぼ消失した。しかしＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡは、非梗塞領域及び偽処置群では全く検出されなかった。これに対し、Ｐ４ＨＡ１のｍＲＮＡは、処置群でも偽処置群でも、心筋梗塞発症と関係なくほぼ一定して発現していた。Ｐ４ＨＡ２のｍＲＮＡは、梗塞領域では心筋梗塞発症直後から増大し、７日後には極大に達するが、２８日後でもかなり強く発現していた。非梗塞領域及び偽処置群では心筋梗塞発症時と同レベルでぼ一定して発現していた。
　図２３の下段に示すとおり、Ｐ４ＨＡ３のｍＲＮＡはほとんど筋線維芽細胞にだけで発現したが、Ｐ４ＨＡ１のｍＲＮＡは、筋線維芽細胞だけでなく線維芽細胞、マクロファージ及び内皮細胞でも発現し、Ｐ４ＨＡ２のｍＲＮＡは、筋線維芽細胞だけでなく線維芽細胞及び内皮細胞でも発現した。
　図２４－１の上段は、横行大動脈縮窄横行大動脈縮窄により誘発された心筋梗塞部位の心臓組織（ＴＡＣ）、又は、偽処置を施した対照マウスの心臓組織（Ｓｈａｍ）における、１α１型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１α１）と、Ｐ４ＨＡ３ｍＲＮＡの異なるアイソフォームＰ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２とのｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。図２４－１の下段は、ブレオマイシンを投与した肺線維症モデルマウスの肺病変部組織（ＢＬＭ）、又は、生理食塩水を投与した対照マウスの肺組織（Ｓａｌｉｎｅ）における、１α１型コラーゲンｍＲＮＡ（Ｃｏｌ１α１）と、Ｐ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２のｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。
　図２４－２の上段は、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量飼料の給餌によるＮＡＳＨ発症マウスの肝組織（ＮＡＳＨ）、又は、通常飼料を給餌した対照マウスの肝組織（Ｃｔｒｌ）における、１α１型コラーゲン遺伝子（Ｃｏｌ１α１）と、Ｐ４ＨＡの異なるアイソフォームＰ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２とのｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。図２４－２の下段は、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）による腎線維症モデルマウス腎病変部、又は、偽処置を施した対照マウスの腎臓組織（Ｓｈａｍ）における、１α１型コラーゲンｍＲＮＡ（Ｃｏｌ１α１）と、Ｐ４ＨＡの異なるアイソフォームＰ４ＨＡ３、Ｐ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２とのｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。図２４－１及び図２４－２において、縦軸は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。*はＰ＜０．０５、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定により計算された。誤差棒は標準偏差を表す。
　図２４－１及び図２４－２に示すとおり、処置群におけるＰ４ＨＡ３のｍＲＮＡ発現量は偽処置群の４倍～４０倍も強く発現した。しかし処置群におけるＰ４ＨＡ１及びＰ４ＨＡ２のｍＲＮＡ発現量は、偽処置群の０．８倍～４．５倍に過ぎなかった。したがって、同じＰ４ＨＡアルファサブユニットのアイソフォームであっても、Ｐ４ＨＡ３だけが処置群において線維化関連因子のｍＲＮＡ発現に対応して特異的に発現することが確認された。
　図２５は、四塩化炭素投与による肝障害肝臓線維化モデルマウスの肝組織から単離された筋線維芽細胞における線維化関連因子（Ｐ４ＨＡ１、Ｐ４ＨＡ２、Ｐ４ＨＡ３、１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）、１α２型コラーゲン（Ｃｏｌ１α２）、３α１型コラーゲン（Ｃｏｌ３α１）及びエラスチン（Ｅｌｎ））の遺伝子発現に対するｓｉ　Ｃｔｒｌ、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ１、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ２及びｓｉ　Ｐ４ＨＡ３の効果を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は４である。群間の比較は、一元配置分散分析の後、Ｔｕｋｅｙの範囲検定により計算された。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。誤差棒は標準偏差を表す。 
　図２５から、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ１、ｓｉ　Ｐ４ＨＡ２及びｓｉ　Ｐ４ＨＡ３は、それぞれ、Ｐ４ＨＡ１、Ｐ４ＨＡ２及びＰ４ＨＡ３遺伝子の発現をほとんど完全に抑制した。
　実施例１６　肝臓線維化に関与するＴＧＦβ／ＳＭＡＤ３経路とＰ４ＨＡ３の関連
　肝臓の線維化に関与する肝星細胞はＴＧＦβによって活性化されることが知られている（Fabregat, I.ら、FEBS J.、283: 2219-2232 (2016)）。そこで、ＴＧＦβ及びその特異的阻害剤であるＳＩＳ３、並びにＴＧＦβ経路のシグナル伝達に関与するＳＭＡＤ３の阻害剤（ｓｉ　ＳＭＡＤ３）のＮＡＳＨモデルマウスにおける線維化関連因子のｍＲＮＡ発現に与える影響を調べた。ＳＩＳ３（ＣＡＳ番号：１００９１０４－８５－１）は、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ社のカタログ番号１５９４５を用いた。ＳＩＳ３は最終濃度３μＭで培養液に添加して投与した。ＳＭＡＤ３のノックダウン試薬として、ｓｉ　ＳＭＡＤ３を用いた。ｓｉ　ＳＭＡＤ３は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号４３９０７７１（Ａｓｓａｙ　ＩＤ：ｓ６９４９５）を用いた。ｓｉ　ＳＭＡＤ３の培養細胞への投与は実施例３、７及び１３と同様に行った。肝星細胞の培養細胞であるＬＸ－２は２％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭで培養した。
　まず、培養細胞ＬＸ－２におけるＰ４ＨＡ３又は１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）のｍＲＮＡ発現に対するＴＧＦβの効果を調べた。図２６ａは、ＤＭＳＯ 又はＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍＬ）で１２時間処理されたＬＸ－２におけるＰ４ＨＡ３又は１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）のｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。縦軸は、Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は３である。群間の比較は、一元配置分散分析の後、Ｔｕｋｅｙの範囲検定により計算された。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。誤差棒は標準偏差を表す。図２６ａに示すとおり、Ｐ４ＨＡ３又は１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）のｍＲＮＡ発現はＴＧＦβの添加により亢進する。
　四塩化炭素投与による肝障害肝臓線維化モデルマウスの肝組織から単離され、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ経路の阻害剤であるＳＩＳ３で処理された筋線維芽細胞におけるＰ４ＨＡ３、１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）、１α２型コラーゲン（Ｃｏｌ１α２）、３α１型コラーゲン（Ｃｏｌ３α１）のｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は５である。群間の比較は、一元配置分散分析の後、Ｔｕｋｅｙの範囲検定により計算された。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。図２６ｂに示すとおり、ＳＩＳ３はＰ４ＨＡ３を含む線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を抑制した。
　図２６ｃは、四塩化炭素投与による肝障害肝臓線維化モデルマウスの肝組織から単離され、ＳＭＡＤ３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｍａｄ３）又はｓｉ　Ｃｔｒｌをトランスフェクションした筋線維芽細胞ににおけるＳＭＡＤ３、Ｐ４ＨＡ３、１α１型コラーゲン（Ｃｏｌ１α１）、１α２型コラーゲン（Ｃｏｌ１α２）、３α１型コラーゲン（Ｃｏｌ３α１）のｍＲＮＡ発現量を表す棒グラフである。縦軸は、ｓｉ　Ｃｔｒｌ群における各遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で補正した値を１とする各遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対値を表す。それぞれのサンプル数は５である。群間の比較は、一元配置分散分析の後、Ｔｕｋｅｙの範囲検定により計算された。*はＰ＜０．０５、**はＰ＜０．０１、***はＰ＜０．００１を表し、ｎ．ｓは有意差がないことを表す。図２６ｃに示すとおり、ＳＭＡＤ３のｍＲＮＡ発現を阻害するｓｉＳｍａｄ３もＰ４ＨＡ３を含む線維化関連因子のｍＲＮＡ発現を抑制した。
　したがって、本発明に係るＰ４ＨＡ３は他の線維化関連因子と同様にＴＧＦβ／ＳＭＡＤ３経路によって調節されていることが明らかになった。
　本出願は、２０２２年３月３日付けで日本国に出願された特願２０２２－０３２９１５を基礎としており、ここで言及することにより、その内容の全てが本明細書に組み込まれるものである。
　本発明により、線維化関連因子のｍＲＮＡ発現の抑制を通じて線維化疾患を改善することが可能となる。またＨｓｐ４７のような開発済みの線維化疾患の治療薬との併用により、線維化疾患をより改善することが可能となる。

Claims (8)

  1. 　プロリル４－ヒドロキシラーゼのアルファ３サブユニット（Ｐ４ＨＡ３）をコードするｍＲＮＡの発現を阻害する核酸を含む、線維化疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  2. 　前記線維化疾患は、線維症、肝硬変、腎不全、心筋梗塞及び癌からなる群から選択される少なくとも１つの疾患である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記核酸は、Ｐ４ＨＡ３をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と相補性を有するヌクレオチド配列を有する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
  4. 　前記核酸はｓｉＲＮＡ又はアンチセンス核酸である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 　前記ｓｉＲＮＡは、配列番号９～１１のいずれか１つの配列のうち少なくとも１５個の連続する配列を含むオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１５個の連続する配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドとからなるｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の医薬組成物。
  6. 　前記ｓｉＲＮＡは、配列番号５の配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号６の配列を含むオリゴヌクレオチドとの対か、配列番号７の配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号８の配列を含むオリゴヌクレオチドとの対かである、請求項４に記載の医薬組成物。
  7. 　前記ｓｉＲＮＡは、配列番号１の配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２の配列からなるオリゴヌクレオチドとの対か、配列番号３の配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４の配列からなるオリゴヌクレオチドとの対かである、請求項５に記載の医薬組成物。
  8. 　筋線維芽細胞に特異的に吸着するリポソームを含み、該リポソームは前記核酸を内包する、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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