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WO2023025187A1 - 特异性结合cd47的抗体、其重组溶瘤病毒及其用途 - Google Patents

特异性结合cd47的抗体、其重组溶瘤病毒及其用途 Download PDF

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WO2023025187A1
WO2023025187A1 PCT/CN2022/114475 CN2022114475W WO2023025187A1 WO 2023025187 A1 WO2023025187 A1 WO 2023025187A1 CN 2022114475 W CN2022114475 W CN 2022114475W WO 2023025187 A1 WO2023025187 A1 WO 2023025187A1
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WO
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virus
antibody
seq
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alie
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PCT/CN2022/114475
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徐建青
张晓燕
丁相卿
廖启彬
张丹
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上海鑫湾生物科技有限公司
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    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • CD47 blocking antibody is considered to be the most promising tumor treatment option.
  • the effectiveness of human CD47-blocking mAbs has been demonstrated in a variety of preclinical models, such as lymphoma, bladder cancer, colon cancer, glioblastoma, breast cancer, acute lymphoblastic leukemia and acute myeloid leukemia, etc. .
  • CD47 antibodies are prone to cause side effects such as obvious anemia, hyperbilirubinemia, and thrombocytopenia, which made many researches hit a wall and stopped related research trials. This is because CD47 is also widely expressed on the surface of red blood cells.
  • the combination of CD47 antibody drug or SIRP ⁇ -Fc fusion protein with red blood cells causes red blood cell agglutination and then red blood cell rupture; at the same time, the cytotoxicity mediated by its Fc segment further triggers the lysis of red blood cells. eventually lead to the occurrence of anemia.
  • CD47 antibodies still have insufficient antibody affinity, immunogenicity, and anti-tumor effects. Therefore, the development of candidate antibodies for this target with better effects is urgently needed.
  • the oncolytic virus (GL-ONC1, also known as GLV-1h68) developed by Genelux in the United States is based on vaccinia virus (Lister strain), and its genes F14.5L, TK (encoding thymidine kinase) and HA (encoding hemagglutination) have been deleted.
  • F14.5L vaccinia virus
  • TK encoding thymidine kinase
  • HA encoding hemagglutination
  • VH CDR2 which consists of the following sequence: SEQ ID NO: 18, or a sequence having one or several amino acid substitutions, deletions or additions thereto, and
  • substitutions described in (ii) or (v) are conservative substitutions
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof further comprises:
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof wherein the antigen-binding fragment is selected from Fab, Fab', (Fab') 2 , Fv, disulfide bond-linked Fv, scFv, diabody and single domain antibody and/or, the antibody is a murine antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a bispecific antibody or a multispecific antibody; more preferably, the antibody is a fully human antibody.
  • the present invention also provides an isolated nucleic acid molecule, which encodes the antibody or antigen-binding fragment thereof capable of specifically binding to CD47 described in the present invention, or its heavy chain variable region and/or light chain variable region;
  • said bispecific or multispecific molecule further comprises at least one molecule having a second binding specificity for a second target (eg a second antibody);
  • the therapeutic agent is selected from alkylating agents, mitosis inhibitors, antitumor antibiotics, antimetabolites, topoisomerase inhibitors, tyrosine kinase inhibitors, radionuclide agents, and any combination thereof;
  • the present invention provides a pharmaceutical composition, which contains the antibody or antigen-binding fragment thereof, bispecific or multispecific molecule or immunoconjugate of the present invention, and a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipients;
  • the present invention provides a kit comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the kit further includes a second antibody that specifically recognizes the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention
  • said antigen binding domain is a scFv
  • said antigen binding receptor is expressed by immune effector cells (eg T cells).
  • immune effector cells eg T cells.
  • the host cell is a chimeric antigen receptor T cell (CAR-T).
  • CAR-T chimeric antigen receptor T cell
  • the present invention also provides a method for preventing and/or treating tumors in a subject (such as a human), the method comprising administering an effective amount of the antibody or antibody described in the present invention to a subject in need thereof.
  • a subject such as a human
  • the recombinant oncolytic virus also includes gene coding sequences of proteins related to apoptosis and pyroptosis, and the proteins related to apoptosis and pyroptosis include but are not limited to apoptosis-related factor 1 (Apaf-1 ), interleukin-1 ⁇ -converting enzyme (ICE), Bcl-2 protein, Fas/APO-1, p53, myc, ataxia telangiectasia mutated gene (ATM), gasdermin D (gasdermin D), dermatin E (gasdermin E), etc.; or
  • the antibodies Hu004-65 and Hu004-101 provided by the present invention have different recognition epitopes from the control antibody, can effectively recognize and bind human and mouse CD47, and have good broad-spectrum anti-tumor efficacy in vitro, and can be prepared Antineoplastic drugs such as CART for targeting CD47 high-expression diseases or conjugated drugs with cytotoxic drugs, radioisotopes, and drug-metabolizing enzymes have very good prospects.
  • the recombinant oncolytic virus provided by the present invention combines tumor gene therapy with oncolytic effect.
  • the present invention provides a vaccinia virus Tiantan strain oncolytic virus capable of highly expressing ⁇ CD47-Fc (ALIE) gene or SIRP ⁇ -Fc (ALIE) gene.
  • oncolytic virus When oncolytic virus is administered to tumor lesions, it expresses CD47 antibody while lysing tumor cells to exert an oncolytic effect, and then blocks the combination of CD47 and SIRP ⁇ , relieves the inhibitory effect of tumor cells on macrophages, and enhances the ability of macrophages to Phagocytosis of tumor cells.
  • the ADCC effect mediated by CD47 antibody is used to enhance the anti-tumor effect.
  • the recombinant vaccinia virus Tiantan strain provided by the present invention is innovatively equipped with a CD47 antibody gene with strong ADCC effect.
  • Use CD47 molecule to precisely target tumor cells, and superimpose the anti-tumor biological effect of CD47 antibody.
  • the oncolytic virus exerts oncolytic effect and lyses tumor cells, it also kills local tumor cells through massive expression of ⁇ CD47-Fc (ALIE), exerting multiple anti-tumor effects.
  • ALOE ⁇ CD47-Fc
  • Detection of CD47 antibody affinity The purified protein was incubated with A549 cells (1 ⁇ 10 6 ) at room temperature for 15 minutes at a concentration of 40 ⁇ g/mL, and a sample without ⁇ CD47-Fc (ALIE) protein was used as a blank control. Wash twice with 1 mL of PBS (FPBS) containing 2% FBS; add 1 ⁇ L of PE-labeled anti-human IgG Fc antibody (BioLegend, Cat. No. 409304) to each sample, and incubate at room temperature for 15 minutes; wash twice with 1 mL of FPBS , resuspended the cells with 200 ⁇ L of FBS, and tested on the machine.
  • FPBS PBS
  • PE-labeled anti-human IgG Fc antibody BioLegend, Cat. No. 409304
  • HepG2 cell preparation HepG2 is a stable transfected cell line overexpressing Luciferase (Shanghai Xinwan Biotechnology Co., Ltd.); spread HepG2 cells in a 96-well plate, about 1 ⁇ 10 4 cells per well , the cell density should reach 100% of the bottom area of the 96-well plate when used.
  • Example 10 Anti-lung cancer effect of recombinant vaccinia virus of ⁇ CD47-Fc (ALIE) in vitro
  • recombinant vaccinia virus rTV- ⁇ CD47-Fc as an oncolytic virus, can significantly inhibit the growth of various solid tumor cells such as human liver cancer and lung cancer, and has very high application value for the treatment of tumors.
  • the oncolytic virus is simple to prepare, and is convenient for mass production and popularization.
  • the Hu004-65-Fc (ALIE) antibody of the present invention (sequence shown in SEQ ID NO: 5 and 9) is loaded into a poxvirus vector, and it is effective against SK-OV3 ovarian cancer and NCI-H292 lung cancer tumor cell lines in vitro Mediated killing experiments.
  • SK-OV3 and NCI-H292 cell lines were cultured in DMEM medium (10% FBS, 1% antibiotics) at 37°C and 5% CO 2 , both of which were Luciferase expressing cell lines.
  • the tumor cells were plated in a 96-well plate at a density of 1E4/well, and cultured overnight at 37°C until they adhered to the wall.

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Abstract

提供了一种能够特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段。还提供了一种重组溶瘤病毒，其可操作地插入或包含抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列，其中抗CD47抗体包含具有A330L/I332E突变的Fc突变体(ALIE抗体)，即抗CD47抗体为αCD47-Fc(ALIE)。还提供了重组溶瘤病毒的制备方法，重组溶瘤病毒用于制备抗肿瘤药物的用途，以及可高效表达αCD47-Fc(ALIE)基因的痘苗病毒天坛株。

Description

特异性结合CD47的抗体、其重组溶瘤病毒及其用途 技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种能够特异性结合CD47的抗体或抗原结合片段。本发明还涉及一种重组溶瘤病毒，本发明还提供了所述抗体或抗原结合片段和所述溶瘤病毒的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。
背景技术
CD47最初在20世纪80年代作为卵巢癌的肿瘤抗原被发现，此后，CD47被发现在多种人类肿瘤上表达，包括急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、膀胱癌和其它实体肿瘤。CD47也称整联素关联蛋白(IAP)，是在人体中由CD47基因编码的跨膜蛋白。它属于免疫球蛋白超家族，可以与整联蛋白、血小板反应素(TSP-1)以及信号调节蛋白α(SIRPα)相互作用。CD47作为一种可防止巨噬细胞吞噬的信号分子，在人体细胞中广泛表达，并且在多种不同的癌细胞中是过表达的，具有作为某些癌症的治疗靶点的潜力。
SIRPα(信号调节蛋白α)也是一种跨膜蛋白，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和神经细胞表面。肿瘤细胞表面高表达的CD47通过与巨噬细胞表面SIRPα结合，释放“不要吃我”的信号，导致肿瘤组织浸润区的巨噬细胞不但同肿瘤细胞和谐相处，而且还会通过促进肿瘤内血管增殖，抑制效应T细胞发挥作用，促进肿瘤细胞扩增和生长。因此通过阻断肿瘤细胞表面CD47与SIRPα结合所传递的抑制性信号通路，恢复或者加强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能，能促进巨噬细胞介导的细胞免疫反应，从而为肿瘤免疫治疗提供新的理论和方法。
近年来，针对CD47/SIRPα信号通路的各种治疗方式进行了大量研究，例如抗CD47抗体、抗SIRPα抗体、重组SIRPα蛋白、双特异性抗体。其中，CD47阻断性抗体被认为是最有希望的肿瘤治疗方案。人CD47阻断型单抗的有效性已经在多种临床前模型中证实，比如淋巴瘤、膀胱癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌、急性淋巴细胞性白血病和急性骨髓性白血病等。相关研究也已证实，利用抗CD47单克隆抗体，在体内特异性结合肿瘤细胞表面高表达的CD47蛋白，能够有效解除肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，重新 恢复机体免疫细胞功能，达到抑制肿瘤生长的效果。
自发现CD47可以作为新一代肿瘤免疫治疗的靶点以来，针对于该靶点的药物研发从未停止过。但在开发CD47靶点药物的途中，CD47抗体易引发明显的贫血、高胆红素血症和血小板减少等副作用，使得不少研究因此碰壁，停止了相关研究试验。这是由于CD47在红细胞表面也广泛表达，CD47抗体药物或SIRPα-Fc融合蛋白与红细胞结合后引起红细胞凝集继而引发红细胞的破裂；同时，其Fc段介导的细胞毒作用进一步引发红细胞的裂解，最终导致贫血的发生。除了明显的贫血等副作用外，CD47抗体仍存在抗体亲和力，免疫原性，抗肿瘤作用等方面不足的问题，因此，亟待效果更佳的该靶点候选抗体的开发。
近年来，溶瘤病毒治疗肿瘤的研究获得领域极大关注。因为溶瘤病毒自身或经过基因修饰对肿瘤具有很好的靶向性，能够在肿瘤局部感染并裂解肿瘤细胞。另外溶瘤病毒可作用于多个细胞通路，以此减少肿瘤的抗性，还可以诱导不同形式的细胞死亡。同时打破肿瘤微环境的免疫耐受进而诱导长效肿瘤特异性免疫应答。借助溶瘤病毒将CD47的抗体蛋白转运到肿瘤组织，发挥CD47抗体的抗肿瘤生物效应，既可有效地避免CD47抗体与外周血红细胞结合而引发贫血的风险，增加了肿瘤免疫治疗的安全性。又可联合溶瘤病毒发挥多重的抗肿瘤作用，从而显著提升了肿瘤免疫治疗的效果。
溶瘤病毒治疗肿瘤的研究获得领域极大关注，其优势在于：溶瘤病毒可通过多种机制联合杀伤肿瘤细胞以减少肿瘤的抗性；可发挥免疫调节作用打破肿瘤微环境的免疫耐受进而诱导长效肿瘤特异性免疫应答；能够转运治疗性蛋白进入肿瘤组织并随病毒复制而在恶性肿瘤细胞提升表达水平。
溶瘤病毒临床研究和治疗在20世纪50年代和70年代出现过短暂的热潮，初期所采用的溶瘤病毒为野生型，临床试验中虽然显示出一定的抗肿瘤效果，但同时也诱导了过强的免疫反应与并发症，以致领域一度几乎中断了溶瘤病毒的研发。20世纪90年代基因工程技术的发展，加速了溶瘤病毒基因改造与优化，极大提高了溶瘤病毒治疗肿瘤的特异性、有效性和安全性，该疗法再次获得了研究者的广泛关注。目前溶瘤病毒的类型主要有：腺病毒、单纯疱疹病毒-1、新城疫病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒、痘苗病毒等，其中以腺病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒临床应用最为广泛。
2006年，溶瘤腺病毒产品(oncorine)已在中国用于临床治疗鼻咽癌等。该溶瘤病毒删除了人5型腺病毒的E1B-55kD基因，可在p53基因突变的癌细胞中复制增殖并杀伤宿主细胞，产生溶瘤治疗作用；同时删除E3区，使 肿瘤抗原信息能通过树突细胞的传递而激活T细胞的免疫。但临床数据显示，相较于放射治疗，溶瘤病毒oncorine联合化疗对鼻咽癌患者的治疗效果较弱。
2015年，安进公司的溶瘤单纯疱疹病毒(talimogene laherparepvec，T-VEC)获得美国FDA批准用于治疗黑色素瘤，同年12月又获得欧盟批准用于首次手术后复发的黑色素瘤患者不可切除的皮肤、皮下和淋巴结病灶的局部治疗。T-VEC临床研究结果极大地推动了溶瘤病毒在肿瘤治疗领域的研发进程。但是通过瘤内给药方式限制了治疗类型，只能应用在离体表近的便于手术的肿瘤类型中，对很多非浅表的实体瘤及转移瘤的治疗存在给药困难和治疗不彻底的问题，若能证实通过静脉给药仍具有较好的肿瘤治疗效果，将极大地提高其临床应用价值；由于疱疹病毒自身溶瘤作用的限制性，对体积大和/或转移的肿瘤清除不完全，所以还需要联合其他治疗手段来增强抗肿瘤作用。
痘苗病毒(Vaccinia virus，VV)的生物学性状和致病机制相对明晰，在消除天花的过程中起到了关键作用，它在人体的安全性也得到了充分证明。根据致病性，宿主范围等特点，痘苗病毒可分为WR(Western reserve)株、Wyeth株、Copenhagen株、Lister株、Tian Tan株等。因其具有宿主范围广，保守性高，安全性好及外源基因容量大等特点，痘苗病毒被用于流感病毒、人类免疫缺陷病毒等多个重组疫苗的载体。作为溶瘤病毒的研发，目前大多数处于临床前研究阶段，只有少数进入临床研究阶段。
利用痘苗病毒作为溶瘤病毒治疗肿瘤的研究，目前进展最快的是美国Jennerex公司研发的Pexa-Vec(JX-594)。JX-594基于Wyeth株病毒，在TK区插入hGM-CSF和LacZ基因，由于缺失胸腺激酶基因，JX-594可在高水平表达胸腺激酶的癌细胞中表达复制，但不会对正常细胞产生影响。同时JX-594因插入了GM-CSF基因，可在肿瘤细胞中表达GM-CSF，激活机体的抗肿瘤免疫反应。JX-594多种肿瘤类型的临床试验结果证明，经瘤内给药或静脉滴注给药均具有良好的耐受性，Pexa-Vec联合sorafenib效果好于单独用药组。中期分析结果表明其延长患者生存期的可能性不高。原本计划2020上市的Pexa-Vec，临床III期试验提前终止。
美国Genelux公司研发的溶瘤病毒(GL-ONC1，又称为GLV-1h68)，是基于痘苗病毒(Lister株)，删除其基因F14.5L、TK(编码胸苷激酶)和HA(编码血凝素)以加强靶向肿瘤，并分别插入luciferase-GFP融合蛋白、β-半乳糖苷转移酶和β-葡萄糖醛酸酶进行痘病毒的筛选与生产制备。GL-ONC1 已经完成的静脉注射给药I期临床试验显示出良好的安全性和疗效，未出现剂量限制毒性，未到达最大耐受剂量，所有患者均出现针对GL-ONC1的中和反应；GL-ONC1目前正在进行静脉注射给药的扩大性实验。
临床试验证据显示，痘苗病毒在肿瘤治疗方面已经初步显示了一定的优势。现有的大多数利用痘苗病毒作为溶瘤病毒设计安全性较高，临床有效性待进一步观察，但是在免疫调节与精准肿瘤靶向性上还需要进一步优化。如何利用溶瘤病毒重构肿瘤微环境，增强免疫应答，提升对肿瘤细胞的杀伤力，实现溶瘤病毒单独用药，仍然是溶瘤病毒研发中的亟待解决的问题。如何最大化利用CD47靶点在杀伤肿瘤细胞上优势，同时减少对红细胞的损伤，一直是开发针对CD47药物面临的关键。现有策略包括筛选只与肿瘤细胞表面CD47结合的SIRPα分子，如Fc融合蛋白药物IMM01，由宜明昂科筛选得到的完全不与人红细胞结合的IgG1型抗体，已于2019年5月在中国获批开展治疗血液肿瘤的临床试验，目前正在进行中。
另外一个策略是替换IgG1Fc段为IgG4Fc段，如抗体药物Hu5F9-G4，采用小剂量诱导+有效剂量维持并联合利妥昔单抗(rituximab)的策略，减轻了贫血的副作用并在侵袭性和惰性淋巴瘤患者的临床研究中显示出了良好疗效。但是在外周血中红细胞表面CD47与CD47抗体结合而引发贫血的风险依然存在，而且Hu5F9-G4单独使用效果甚微。
如通过病毒载体将CD47抗体直接输送到肿瘤细胞则有可能避免贫血的发生。有研究通过构建重组痘病毒表达CD47抗体的轻重链偶联的单链抗体(scFv)去识别肿瘤细胞的CD47抗原，从而更加精准发挥溶瘤效应。同时，利用CD47的阻断效应提升巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用。临床研究结果显示，重组溶瘤痘苗病毒(OVVscFvCD47)发挥了较好的抗淋巴瘤的效果。由于靶向CD47的抗体药物发挥高效抗肿瘤作用的前提是充分激活巨噬细胞，必须满足两个基本条件：1)通过CD47抗体或SIRPα-Fc来阻断CD47-SIRPa之间的相互作用从而解除抑制信号；2)抗体IgG1的Fc端与巨噬细胞膜表面的Fcγ受体结合导致巨噬细胞膜骨架变构以增加吞噬活性。否则，巨噬细胞只能被部分激活。同时，因其缺失Fc段而无ADCC作用，单一用药不可能有良好的治疗效果，必须与其它抗体药物联合应用。特别是scFv体内半衰期短极大地削弱了它的抗肿瘤效果。
基于以上，现有技术中不存在特别适用于重组溶瘤病毒的CD47抗体，当前对具有更好的肿瘤细胞杀伤力的CD47抗体和能够实现溶瘤病毒单独用药的溶瘤病毒存在需求。
发明内容
因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够特异性结合CD47的抗体，本发明提供的抗CD47抗体的特异性强、亲和力高、免疫原性低、稳定性好，能够用于预防或治疗癌症，有着广阔的应用前景。本发明还提供了一种新的重组溶瘤病毒，本发明提供的溶瘤病毒包含抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列，能够在肿瘤细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞。具体地，本发明提供的重组溶瘤病毒包含抗CD47抗体的基因编码序列，本发明的抗CD47抗体的基因序列包含突变的Fc段，具有高杀伤活性，利用抗体介导的强ADCC作用，能够显著增强抗肿瘤效果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一方面，本发明提供了能够特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含下述3个互补决定区的重链可变区：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
和/或
(b)包含下述3个互补决定区的轻链可变区：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22中任一项所示，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23中任一项所示，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:24中任一项所示，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:17所 示的VH CDR1、如SEQ ID NO:18所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VH CDR3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:12所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:13所示的VL CDR3或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:14所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:16所示的VL CDR3或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:22所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:23所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:24所示的VL CDR3。
本发明提供了能够特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含SEQ ID NO:9所示的重链可变区中含有的3个CDR；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5、7或25所示的轻链可变区中含有的3个CDR；
优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:9所示的序列；
(ii)与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(iii)与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或，
(b)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
(iv)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:25的任一项所示的序列；
(v)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:25的任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
(vi)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:25的任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、 或100％的序列同一性的序列；
优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:9所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:5、7或25中任一项所示的序列的VL。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
(a)人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；和
(b)人免疫球蛋白的轻链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换；
优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，更优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，进一步优选地，其是人IgG1或人IgG4重链恒定区；
优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’) 2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体和单域抗体；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体；更优选地，所述抗体为完全人抗体。
另一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段中的重链可变区和轻链可变区为串联组合或并联组合。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的能够特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区；
优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO:6、8、10或26中任一项所示的核酸序列。
本发明还提供了一种载体，其包含本发明所述的分离的核酸分子；
优选地，所述载体为克隆载体或表达载体；
更优选地，所述载体为病毒；
进一步优选地，所述载体为克隆载体AbVec-hIgKappa或者克隆载体AbVec-hIgG1。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含本发明所述分离的核酸分子或所述的载体；
优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的；更优选地，所述宿主细胞选 自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或抗原结合片段、多特异性抗体的其它细胞；进一步优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞；更进一步优选地，所述宿主细胞为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞；最优选地，所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。
再一方面，本发明提供了制备本发明所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许本发明所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
再一方面，本发明提供了双特异性或多特异性分子，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述双特异性或多特异性分子特异性结合CD47，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的分子(例如第二抗体)；
优选地，所述双特异性或多特异性分子还包含其他特异性结合CD47表位的抗体或抗原结合片段。
再一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的治疗剂；
优选地，所述治疗剂选自细胞毒剂；
优选地，所述治疗剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂，及其任意组合；
优选地，所述免疫缀合物是抗体-药物偶联物(ADC)。
再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有本发明所述的抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或者免疫缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，药物组合物还包含另外的药学活性剂；
优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段、双特异性或多特异性分子或免疫缀合物与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分 提供。
再一方面，本发明提供了一种试剂盒，其含有本发明所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素；
优选地，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明所述的抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
再一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段的抗原结合结构域；
优选地，所述抗原结合结构域包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区；
优选地，所述抗原结合结构域是scFv；
优选地，所述抗原结合受体包含本发明所述的抗体的抗原结合片段；
优选地，所述抗原结合受体由免疫效应细胞(例如T细胞)所表达。
再一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其编码所述的嵌合抗原受体。
再一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码所述的嵌合抗原受体的分离的核酸分子；优选地，其用于制备嵌合抗原受体T细胞。
再一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含编码所述的嵌合抗原受体的分离的核酸分子或载体；
优选地，所述宿主细胞是免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)；
优选地，所述宿主细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。
本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞生长和/或杀伤所述肿瘤细胞的方法，其包括将所述肿瘤细胞与有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或双特异性或多特异性分子，或免疫缀合物，或药物组合物，或嵌合抗原受体，或宿主细胞接触。
本发明还提供了一种用于在受试者(例如人)中预防和/或治疗肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或双特异性或多特异性分子，或免疫缀合物，或药物组合物，或嵌合抗原受体，或宿主细胞；
优选地，所述肿瘤选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤如高级别胶质瘤、母细胞瘤如神经母细胞瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、AIDS相关淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人；
优选地，所述方法还包括施用另外的具有抗肿瘤活性的药物，例如烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒；
优选地，所述方法还包括施用另外的抗肿瘤疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗。
本发明还提供了本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或双特异性或多特异性分子，或免疫缀合物，或药物组合物，或嵌合抗原受体，或宿主细胞，在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者(例如人)中预防和/治疗肿瘤；
优选地，药物还包含另外的药学活性剂；
优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物，例如烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、分子靶向药物、免疫检查点抑制剂或溶瘤病毒；
优选地，所述肿瘤选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤如高级别胶质瘤、母细胞瘤如神经母细胞瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、AIDS相关淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人。
另一方面，本发明提供了一种重组溶瘤病毒，所述溶瘤病毒可操作地插入或包含抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列。
优选地，所述基因编码序列位于所述重组溶瘤病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)区。
优选地，所述抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列可单独表达、也可与其他基因或片段融合表达；更优选地，用于融合表达的其他基因或片段包括但不限于Fc片段，趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCL20或CX3CL1，或霍乱毒素CTA或CTB等的一种或多种。
优选地，所述重组溶瘤病毒还包含其他免疫调节因子的基因编码序列，更优选地，所述其他免疫调节因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-33、IL-35、IL-37、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗Lag-3抗体、抗TIGIT抗体或抗Tim-3抗体；或
所述重组溶瘤病毒还包含与细胞凋亡和细胞焦亡相关的蛋白的基因编码序列，所述与细胞凋亡和细胞焦亡相关的蛋白包括但不限于凋亡相关因子1(Apaf-1)、白介素-1β转换酶(ICE)、Bcl-2蛋白、Fas/APO-1、p53、myc、共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)、消皮素D(gasdermin D)、消皮素E(gasdermin E)等；或
所述重组溶瘤病毒还包含免疫调节基因、凋亡与焦亡基因的小RNA。
根据本发明所述的重组溶瘤病毒，其中，所述抗CD47抗体包含上述抗体或其抗原结合片段；优选地，所述抗CD47抗体包含具有A330L/I332E突变的Fc突变体(ALIE抗体)，即所述抗CD47抗体为αCD47-Fc(ALIE)。
根据本发明所述的重组溶瘤病毒，其中，所述抗CD47抗体与SEQ ID NO:2所述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
优选地，所述抗CD47抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
根据本发明所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒包含与SEQ ID NO:1所述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的基因编码序列。
优选地，所述溶瘤病毒包含如SEQ ID NO:1所示的基因编码序列；
根据本发明所述的重组溶瘤病毒，其中所述CD47配体为SIRPα胞外结构域，其功能片段或变体；
优选地，所述抗CD47配体与SEQ ID NO:4所述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
优选地，所述抗CD47配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
根据本发明所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒包含与SEQ ID NO:3所述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的基因编码序列。
优选地，所述溶瘤病毒包含如SEQ ID NO:3所示的基因编码序列。
根据本发明所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒的病毒骨架来源于经修饰或经改造的痘苗病毒天坛株、痘苗病毒纽约株、痘苗病毒哥本哈根株、痘苗病毒金丝雀株、痘苗病毒安卡拉株、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)、呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)、生里基森林病毒(Semliki forest virus，SFV)、EB病毒、巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、天花病毒、痘苗病毒、传染性软疣病毒、羊口疮病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒、肠道病毒、塞内卡病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、口蹄疫病毒、披膜病毒、甲病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、辛德毕斯病毒、风疹病毒、冠状病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒、拉沙热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、皮钦德病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、副粘病毒、人副流感病毒、腮腺炎病毒、猴病毒5、麻疹病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、正粘病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型肝炎病毒、猴免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1型和人免疫缺陷病毒2型、劳氏肉瘤病毒、嗜人T细胞白血病病毒1型、猴泡沫病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或多瘤病毒。
优选地，所述溶瘤病毒骨架为细胞内成熟病毒、细胞内包装病毒、细胞相关包装病毒或细胞外包装病毒。
[根据细则91更正 26.10.2022]　
根据本发明所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒为包含如SEQ ID NO:1所示的基因编码序列的重组痘苗病毒天坛株，命名为rTV-αCD47-Fc(ALIE)，其保藏编号为：CCTCC NO:V202080，保藏日期为2021年1月8日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学。
再一方面，本发明提供了所述重组溶瘤病毒的制备方法，包括以下步骤：
1)合成包含抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列；
2)将步骤1)得到的编码序列克隆至溶瘤病毒的穿梭质粒中，构建重组质粒载体；
3)将步骤2)得到的重组质粒载体转染至溶瘤病毒中，经筛选获得重组 溶瘤病毒。
任选地，培养获得的重组溶瘤病毒。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种重组痘苗病毒天坛株的制备方法，包括以下步骤：
1)合成人基因αCD47-Fc(ALIE)，其序列如SEQ ID NO：1所示；
或其中包含SEQ ID NO:6、8、10或26中任一项所示的核酸序列；
或合成人基因SIRPα-Fc(ALIE)，其序列如SEQ ID NO：3所示；
2)将合成的αCD47-Fc(ALIE)基因或SIRPα-Fc(ALIE)基因亚克隆至痘苗病毒穿梭质粒(pSC65)的TK区中，构建重组质粒pSC65-αCD47-Fc(ALIE)或pSC65-SIRPα-Fc(ALIE)；
3)采用基因同源重组的方式，将pSC65-αCD47-Fc(ALIE)质粒或pSC65-SIRPα-Fc(ALIE)质粒转染到已经被感染了野生型痘苗病毒的TK143 -细胞中，使两者同源重组，产生重组痘苗病毒rTV-αCD47-Fc(ALIE)或rTV-SIRPα-Fc(ALIE)；经筛选获得所述TK区包含SEQ ID NO：1所示的pSC65-αCD47-Fc(ALIE)的编码序列的重组溶瘤痘苗病毒或所述TK区包含SEQ ID NO:3所示的pSC65-SIRPα-Fc(ALIE)的编码序列的重组溶瘤痘苗病毒。
其中，αCD47-Fc(ALIE)基因或SIRPα-Fc(ALIE)基因由痘苗病毒的早/晚期启动子p7.5控制。
优选地，利用VERO细胞扩增重组痘苗病毒的具体步骤包括：培养VERO细胞至密度接近100％时，更换低浓度胎牛血清维持培养基，加入溶瘤痘苗病毒(接种量约为0.02MOI)，放入37℃孵箱培养扩增48小时，收集病毒液并反复冻融2次后，用36％的蔗糖溶液进行密度梯度离心纯化，并冻存于-80℃。
再一方面，本发明还提供了所述重组溶瘤病毒用于制备抗肿瘤药物的用途；其中，所述肿瘤选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤如高级别胶质瘤、母细胞瘤如神经母细胞瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、AIDS相关淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病。
另一方面，本发明提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括给与有需 要的受试者治疗有效量的重组溶瘤病毒。根据本发明所述的方法，其中所述方法还包括给予有需要的受试者另外的化疗药物、放疗技术、手术治疗、免疫细胞药物(包括但不限于CAR-T、NK、NKT、iNKT、CAR-NK、CAR-NKT、CAR-iNKT等)、其他溶瘤病毒；优选地，所述方法为静脉注射或瘤内注射。
本发明的发明构思如下，本发明的发明人通过对天然噬菌体抗体库进行筛选获得25株新型的靶向CD47抗体；进一步纯化表达了其中的示例抗体Hu004-65、Hu004-66、Hu004-67、Hu004-68、Hu004-69、Hu004-73，Hu004-74、Hu004-91、Hu004-100和Hu004-101的表达纯化；并进行了这些抗体的体外生物学功能的鉴定。发明人意外的发现，其中Hu004-65与Hu001-101具有良好的生物学效应，能够识别人CD47蛋白，且亲和力为1.46×10 -7M与3.20×10 -7M。进一步地，发明人发现抗体Hu004-65和Hu004-101与对照抗体具有不同的识别表位，能有效识别结合人源和鼠源CD47，且具有良好的体外广谱介导抗肿瘤疗效，可以制备用于靶向CD47高表达疾病的CART或者与细胞毒药物、放射性同位素、药物代谢酶形成偶联药物等抗肿瘤药物，有非常良好的前景。
进一步地，本发明的发明人将肿瘤的基因治疗与溶瘤效应相结合，制备了一种可高效表达αCD47-Fc(ALIE)基因或SIRPα-Fc(ALIE)基因的痘苗病毒天坛株溶瘤病毒。在将溶瘤病毒投药至肿瘤病灶时，它在裂解肿瘤细胞发挥溶瘤效应的同时表达CD47抗体，继而阻断CD47与SIRPα结合，解除肿瘤细胞对巨噬细胞的抑制作用，提升巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能。同时利用CD47抗体介导的ADCC作用，增强抗肿瘤效果。相对于单纯的抗体疗法或者病毒疗法，所述溶瘤病毒显著增强对恶性肿瘤的抑制能力，从而显著提升了肿瘤免疫治疗的效果。同时，有效地避免CD47抗体与外周血红细胞结合而引发贫血的风险，增加了肿瘤免疫治疗的安全性。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供的抗体Hu004-65和Hu004-101与对照抗体具有不同的识别表位，能有效识别结合人源和鼠源CD47，且具有良好的体外广谱介导抗肿瘤疗效，可以制备用于靶向CD47高表达疾病的CART或者与细胞毒药物、放射性同位素、药物代谢酶形成偶联药物等抗肿瘤药物，有非常良好的前景。
2.本发明提供的重组溶瘤病毒将肿瘤的基因治疗与溶瘤效应相结合。具体地，本发明提供了一种可高效表达αCD47-Fc(ALIE)基因或SIRPα-Fc(ALIE)基因的痘苗病毒天坛株溶瘤病毒。在将溶瘤病毒投药至肿瘤病灶时，它在裂 解肿瘤细胞发挥溶瘤效应的同时表达CD47抗体，继而阻断CD47与SIRPα结合，解除肿瘤细胞对巨噬细胞的抑制作用，提升巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能。同时利用CD47抗体介导的ADCC作用，增强抗肿瘤效果。相对于单纯的抗体疗法或者病毒疗法，所述溶瘤病毒显著增强对恶性肿瘤的抑制能力，从而显著提升了肿瘤免疫治疗的效果。同时，有效地避免CD47抗体与外周血红细胞结合而引发贫血的风险，增加了肿瘤免疫治疗的安全性。
3.本发明已经完成痘苗病毒天坛株溶瘤病毒治疗肝癌与恶性肺癌等的体外实验研究，实现了对肿瘤的良好靶向性及抗肿瘤效果，并且有较为完备的病毒扩增及质量控制体系，为进一步的产业化奠定基础，本发明具有良好的应用前景。
4.本发明提供的重组痘苗病毒天坛株，创新性的搭载具有强ADCC作用的CD47抗体基因。利用CD47分子精准靶向肿瘤细胞，并叠加CD47抗体的抗肿瘤生物效应。在溶瘤病毒发挥溶瘤效应，裂解肿瘤细胞的同时，通过大量表达αCD47-Fc(ALIE)杀伤局部肿瘤细胞，发挥多重的抗肿瘤效果。相对于单纯的基因疗法或者病毒疗法，增强了其对恶性肿瘤的杀伤能力。从而显著提升了肿瘤免疫治疗的效果。同时，有效地避免CD47抗体与外周血红细胞结合而引发贫血的风险，增加了肿瘤免疫治疗的安全性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出为根据本发明的实施例1，通过ELISA筛选克隆上清与抗原hCD47-ECD结合的柱状图，结果显示其中有25株候选抗体克隆可与hCD47-ECD特异性结合，其中根据本发明的Hu004-65和Hu004-101的单克隆抗体具有较高的特异性；
图2表示用于本发明的抗体的表达载体图谱；其中，图2A为Cloning vector AbVec-hIgKappa，图2B为Cloning vector AbVec-hIgG1；
图3示出为根据表面等离子共振法(SPR)测定本发明的抗体的亲和力，结果显示，其中10株抗体均有较强的亲和力；
图4示出为本发明的单克隆抗体Hu004-65与Hu004-101与对照抗体B6H12(US 9017675B2)具有不同的识别表位；
图5示出为本发明的单克隆抗体Hu004-73号抗体能够同时结合人的CD47与小鼠的CD47；
图6示出为本发明的单克隆抗体Hu004-65与Hu004-101在体外可介导 广谱的抗肿瘤活性；其中，图6A为本发明的候选抗体Hu004-65和Hu004-101对NCI-H292肿瘤细胞系的杀伤活性，从图中可以得知，与其他的候选抗体相比，抗体Hu004-65和Hu004-101在体外较强介导杀伤活性，与阳性对照抗体B6H12相当，图6B为本发明的候选抗体Hu004-65和Hu004-101对SK-OV3肿瘤细胞系的杀伤活性，从图中可以得知，候选抗体Hu004-65和Hu004-101在体外对SK-OV3肿瘤细胞系的介导杀伤活性高于阳性对照抗体B6H12，均达到两倍于B6H12抗体的杀伤率。说明候选抗体Hu004-65和Hu004-101在体外有介导广谱抗肿瘤活性；
图7示出为抗体可变区的排布方式；
图8显示了根据本发明的一个具体的实施例中，痘苗病毒天坛株穿梭质粒载体αCD47-Fc(ALIE)的构建；其中，图8A为整合有αCD47-Fc(ALIE)基因的痘苗病毒穿梭质粒pSC65表达图谱；图8B为所述重组痘苗病毒rTV-αCD47-Fc(ALIE)中插入片段αCD47-Fc(ALIE)的PCR鉴定结果；
图9显示了根据本发明的实施例中，不同的痘苗病毒天坛株感染VERO细胞后，培养上清中αCD47-Fc(ALIE)蛋白表达的验证；
图10显示了重组痘苗病毒rTV-αCD47-Fc(ALIE)的的体外抗肝癌的作用；其中，图10A为野生型痘苗病毒天坛株(TTV)治疗组、hrCD16 T细胞组、αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒组(rTV-αCD47-Fc(ALIE))以及rTV-αCD47-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞联合治疗组对HepG2细胞的体外杀伤作用；图10B为野生型痘苗病毒天坛株(TTV)治疗组、NK细胞组、αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒组(rTV-αCD47-Fc(ALIE))以及rTV-αCD47-Fc(ALIE)与NK细胞联合治疗组对HepG2细胞的体外杀伤作用。从图中可知，重组痘苗病毒rTV-αCD47-Fc(ALIE)对HepG2细胞的杀伤作用更明显，且随着病毒滴度增加，杀伤作用增强；
图11显示了重组痘苗病毒rTV-αCD47-Fc(ALIE)的体外抗恶性肺癌作用；其中，图11A为野生型痘苗病毒天坛株(TTV)治疗组、hrCD16 T细胞组、αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒组以及rTV-αCD47-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞联合治疗组对NCI-H292肿瘤细胞系的体外杀伤作用；图11B为野生型痘苗病毒天坛株(TTV)治疗组、NK细胞组、αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒组以及rTV-αCD47-Fc(ALIE)与NK细胞联合治疗组对NCI-H292肿瘤细胞系的体外杀伤作用。从图中可知，重组痘苗病毒rTV-αCD47-Fc(ALIE)对NCI-H292肿瘤细胞系的杀伤作用更明显，且随着病毒滴度增加，杀伤作用增强；
图12显示了本发明的SIRPα-Fc(ALIE)的体外抗肿瘤活性；其中，图12A为单独B6H12-Fc(ALIE)抗体治疗组、单独SIRPα-Fc(ALIE)治疗组、hrCD16 T细胞组、B6H12-Fc(ALIE)抗体与hrCD16 T细胞联合治疗组以及SIRPα-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞联合治疗组对NCI-H292肺癌细胞的体外杀伤作用；图12B为单独B6H12-Fc(ALIE)抗体治疗组、单独SIRPα-Fc(ALIE)治疗组、hrCD16 T细胞组、B6H12-Fc(ALIE)抗体与hrCD16 T细胞联合治疗组以及SIRPα-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞联合治疗组对SK-OV3卵巢癌细胞的体外杀伤作用。从图中可知，SIRPα-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞联合治疗组对SK-OV3细胞的杀伤作用更明显，杀伤作用增强；
图13显示了本发明的65号克隆制备的rTV-Hu004-65-Fc(ALIE)痘病毒在体外有高效的抗肿瘤活性。其中，图13A为hrCD16 T细胞组、野生型痘苗病毒天坛株(TTV)与hrCD16 T细胞联合治疗组、B6H12-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒与hrCD16 T细胞联合治疗组以及rTV-Hu004-65-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞联合治疗组对NCI-H292肺癌细胞的体外杀伤作用；图13B为hrCD16 T细胞组、野生型痘苗病毒天坛株(TTV)与hrCD16 T细胞联合治疗组、B6H12-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒与hrCD16 T细胞联合治疗组以及rTV-Hu004-65-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞联合治疗组对SK-OV3卵巢癌细胞的体外杀伤作用。从图中可知，重组痘苗病毒rTV-Hu004-65-Fc(ALIE)痘病毒对NCI-H292肺癌细胞以及SK-OV3卵巢癌细胞均有强效的杀伤作用，其中对卵巢癌细胞SK-OV3的杀伤作用要显著高于B6H12-Fc(ALIE)组。
保藏信息
[根据细则91更正 26.10.2022]　
痘苗病毒天坛株，命名为rTV-αCD47-Fc(ALIE)，其保藏编号为：CCTCC NO:V202080，保藏日期为2021年1月8日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学。
具体实施方式
实施例1：天然的人抗体噬菌体展示文库的构建和筛选
人CD47胞外结构域(hCD47-ECD)抗原制备：人重组CD47蛋白，由Met1-Pro139组成，共123个氨基酸残基。购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号：12283-H08H。
CD47全人源抗体筛选由泷搌(上海)生物科技有限公司委托完成。在共四轮筛选后，选择第三轮所得的克隆进行ELISA的阳性克隆ELISA筛选。 最终，在共筛选出25个能够与hCD47-ECD蛋白结合的阳性克隆，经测序分析、ELISA结合后，最终选取了10个克隆的序列构建全长抗体以进行进一步的实验。具体实施方法如下：
1.1阳性克隆测序与分析
在完成初筛工作后，对25个能够与hCD47-ECD蛋白结合的阳性克隆进行编号，吸取2μL菌液到2mL的2×YT培养基(Sigma Aldrich公司，货号Y1003-500ML)中，37℃，220rpm培养过夜，提取质粒进行二代测序。测序结果通过SeqMan将原始的AB1文件整合、比对、去掉非抗体基因序列，生成抗体基因整合版的fasta文件。随后将DNA序列通过MEGA6翻译为氨基酸序列，并通过氨基酸序列找出含有终止子、非常规序列等，导出氨基酸序列的fasta文件。
1.2 ELISA筛选克隆上清与抗原hCD47-ECD结合的亲和力
首先挑取第三轮筛选的克隆于含有300μL 2-YT培养基的96孔深孔板中，37℃培养过夜，上清即含有表达的Fab，取上清，梯度稀释后加入到包被2μg/mL hCD47-ECD的ELISA板中，然后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人Fab作为第二抗体(ThermoFisher公司，货号31482)1:6000稀释进行检测，信号值越高，表明亲和力越强，结果如图1所示，结果表明，在ELISA测定法中，10个抗体(分别命名为Hu004-65抗体、Hu004-66抗体、Hu004-67抗体、Hu004-68抗体、Hu004-69抗体、Hu004-73抗体、Hu004-74抗体、Hu004-91抗体、Hu004-100抗体、Hu004-101抗体)的Fab均表现出了较好的亲和活性，其中所述阳性对照为B6H12克隆号抗体(US 9017675B2)，阴性对照为人IgG蛋白。
实施例2：全长抗体的构建、表达和纯化
在本实施例中，将实施例1中获得的10个对结合hCD47-ECD活性较好的Fab抗体构建成人IgG1亚型，其中轻链均为κ型，抗体类型为全人抗体。
其中抗体可变区的排布方式如图7所示；
2.1质粒构建
从筛选获得的含有抗体的菌株中，PCR扩增获取抗体轻、重链可变区片段，通过同源重组方法，分别构建至含有轻、重链恒定区片段的真核表达载体质粒Cloning vector AbVec-hIgKappa(GenBank:FJ475056.1)或者Cloning vector AbVec-hIgG1(GenBank:FJ475055.1)(图2)，组成完整的抗体轻重链全长基因。
其中，对应的抗体CDR序列如下表1所示。
表1 Hu004-65、Hu004-73和Hu004-101的序列
Figure PCTCN2022114475-appb-000001
Figure PCTCN2022114475-appb-000002
2.2质粒准备
将构建好的含抗体轻重链全长基因的载体分别转化到大肠杆菌TOP10(唯地公司，货号DL1010S)中，37℃过夜培养，利用无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA公司，货号D6950-01)进行质粒提取，得到无内毒素的抗体轻重链质粒以供真核表达使用。
2.3抗体的表达纯化
候选抗体Hu004-65、Hu004-66、Hu004-67、Hu004-68、Hu004-69、Hu004-73、Hu004-74、Hu004-91、Hu004-100、Hu004-101以及对照抗体B6H12(US 9017675B2)是通过Expi293瞬转表达系统(Thermo Fisher公司，货号A1435101)表达的，具体方法如下：
转染当天，确认细胞密度为7×10 6至1×10 7个活细胞/mL左右，细胞存活率>98％，此时，用37℃预温的新鲜Expi293表达培养基将细胞调整到终浓度为6×10 6个细胞/mL。用4℃预冷的Expi293 TM Expression Medium稀释目的质粒(向1mL所述培养基中加入10μg质粒)，同时，用Expi293 TM Expression Medium稀释FectoPro(Polyplus公司，货号PT-116-001)转染试剂，再将两者等体积混合并轻轻吹打混匀制备成Expi293 TM Expression Medium/质粒DNA混合液，室温孵育15分钟，缓慢加入到准备好的细胞悬液中，并同时轻轻摇晃，最后置于细胞培养摇床中，在37℃，5％CO 2条件下培养。在转染18-22小时后，向培养液中添加FectoPRO booster为0.6 μL/mL，摇瓶放置于37℃摇床和5％CO 2条件下继续培养，在转染后的第5天，添加相同体积的Expi293 TM Expression Medium，缓慢加入的同时轻轻混匀细胞混悬液，在转染7-15天后，将表达有目的蛋白的细胞培养上清于4000g高速离心10分钟，所得上清用Protein G琼脂糖柱子(GE公司，货号28903134)进行亲和纯化，纯化后的抗体用PBS缓冲液溶解，然后用100mM乙酸钠(pH3.0)洗脱目的蛋白，接着用1M Tris-HCl中和，最后通过超滤浓缩管(Millipore公司，货号UFC901096)将所得蛋白置换至PBS缓冲液中。
2.4抗体的浓度测定
用SDS-PAGE检测10个候选抗体Hu004-65、Hu004-66、Hu004-67、Hu004-68、Hu004-69、Hu004-73、Hu004-74、Hu004-91、Hu004-100、Hu004-101以及对照抗体B6H12的相对分子量和纯度。将经纯化的抗体蛋白用经验证过的超微量分光光度计(Thermo Fisher公司，NanoDrop One C)进行浓度测定，将经测定的A280数值除以抗体理论消光系数后的数值作为后续研究的抗体浓度值，质检合格后，分装并保存于-80℃。
实施例3：抗体亲和系数的SPR方法测定
委托北京义翘神州科技股份有限公司通过表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)进行亲和力测定，结果显示在图3中，结果表明10个候选抗体亲和力都在10的-7次方级别以上，均有较强的亲和力。
实施例4：候选抗体Hu004-65和Hu004-101与B6H12克隆具有不同 识别表位
以DMEM培养基(10％FBS，1％抗生素)，在37℃，5％CO 2条件下培养人非小细胞肺癌A549细胞系。用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞。测定细胞浓度并将细胞在800g条件下离心3分钟，弃去上清；用1mL 2％FBS washing buffer重悬，800g离心3分钟，弃去上清；用100μL 2％FBS washing buffer重悬细胞。用候选抗体Hu004-65，Hu004-101，以及对照抗体B6H12作为一抗对细胞进行染色。室温下，孵育15分钟；用1mL 2％FBS washing buffer重悬，800g离心3分钟，弃上清；加入二抗IgG-Fc-PE和IgG-Fc-APC(BioLegend公司，货号409304和409306)，室温下，避光孵育15分钟；用1mL 2％FBS washing buffer重悬，800g离心3分钟，弃上清；用200μL培养基重悬，上机检测(Beckman Coulter，CytoFLEX Flow Cytometer)。流式结果如图4。由图4可知，阳性对照B6H12和Hu004-65双通道染色组， 阳性对照B6H12和Hu004-101双通道染色组以及Hu004-101和Hu004-65双通道染色组的细胞群均为双阳性，由此证明候选抗体Hu004-65和Hu004-101与B6H12具有不同识别表位，候选抗体Hu004-65和Hu004-101之间也有不同识别表位，互不竞争。
实施例5：候选抗体Hu004-73与人源和鼠源CD47特异性结合测试以DMEM培养基(10％FBS，1％抗生素)，在37℃，5％CO 2条件下培养人肺粘液上皮样癌NCI-H292细胞系。以RPMI1640培养基(10％FBS，1％抗生素)，在37℃，5％CO 2条件下培养B16黑色素瘤细胞(鼠源)。0.25％胰蛋白酶消化收集细胞。测定细胞浓度，准备1E5个细胞；细胞于800g条件下离心3分钟，弃上清；用1mL 2％FBS washing buffer重悬，800g离心3分钟，弃上清；用100μL 2％FBS washing buffer重悬，分别加入一抗(Hu004-73)，室温下，孵育15分钟；用1mL 2％FBS washing buffer重悬，800g离心3分钟，弃上清；加入二抗IgG-Fc-PE(BioLegend公司，货号409304)，室温下，避光孵育15分钟；用1mL 2％FBS washing buffer重悬，800g离心3分钟，弃上清；用200μL培养基重悬，上机检测(Beckman Coulter公司，CytoFLEX Flow Cytometer)。结果如图5所示。由图5可知，Hu004-73抗体对小鼠黑色素瘤细胞B16有96.5％的特异性结合，Hu004-73对人肺粘液上皮样癌细胞NCI-H292也有40.2％特异性结合。此实验可证明候选抗体Hu004-73能够结合人源CD47与鼠源CD47。
实施例6：候选抗体Hu004-65和Hu004-101抗体体外介导广谱抗肿 瘤活性测试
候选抗体在体外对SK-OV3卵巢癌和NCI-H292肺癌肿瘤细胞系的介导杀伤实验。以DMEM培养基(10％FBS，1％抗生素)，在37℃，5％CO 2条件下培养SK-OV3和NCI-H292细胞系，此二者细胞系均为Luciferase表达细胞系。将肿瘤细胞以1E4/孔的密度铺于96孔板中，37℃培养过夜待其贴壁。24小时后除去培养基，设空白对照组加入200μL培养基，阳性对照组加入B6H12抗体，实验组(编号1-10)分别加入候选抗体(Hu004-65、Hu004-66、Hu004-67、Hu004-68、Hu004-69、Hu004-73、Hu004-74、Hu004-91、Hu004-100和Hu004-101)。阳性对照组和实验组分别以2E4/孔的密度加入CD16CAR-T细胞，加入培养基使得抗体终浓度为10μg/mL。24小时后除去上清，每孔加入50μL 1x细胞裂解液(Promega公司，货号E1531)，室 温震荡孵育30分钟，每孔加入30μL荧光素酶底物(Promega公司，货号E151A)。上机检测(
Figure PCTCN2022114475-appb-000003
Navigator Microplate Luminometer，Promega，Steady-Glo protocol)。测得结果如图6可知，候选抗体Hu004-65和Hu004-101对NCI-H292肿瘤细胞系在体外较强介导杀伤活性，与阳性对照抗体相当。由图6可知，候选抗体Hu004-65和Hu004-101在体外对SK-OV3肿瘤细胞系的介导杀伤活性高于阳性对照抗体B6H12，均达到两倍于B6H12抗体的杀伤率。此实验说明候选抗体Hu004-65和Hu004-101在体外有介导广谱抗肿瘤活性。
实施例7：αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒的构建以及表达验证
7.1带αCD47-Fc(ALIE)目的基因的pSC65载体构建
人工合成αCD47-Fc(ALIE)的DNA序列，合成的序列如SEQ ID NO:1所示，以合成的DNA序列为模版采用如下引物进行PCR扩增。
扩增的引物为：
上游：SEQ ID NO:20
Figure PCTCN2022114475-appb-000004
下游：SEQ ID NO:21
Figure PCTCN2022114475-appb-000005
PCR反应程序：94℃预变性5分钟；98℃变性10秒，58℃；退火30秒，72℃延伸1分钟，反应30个循环；72℃再充分延伸10分钟，终止于25℃。
PCR产物的回收与克隆构建：扩增结束后，在2％的琼脂糖凝胶中分离目的基因，同时将pSC65载体用Sal I酶切(Thermo Scientific公司，货号ER0642)线性化载体并进行切胶回收，采用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(Promega公司，货号A9282)回收PCR片断段与载体酶切片段。基因回收产物与酶切线性化载体用同源重组的方法连接(诺唯赞公司，货号c112-02)。将连接产物转化至大肠杆菌E.coli TOP10，在含氨苄霉素的培养板上过夜生长。第2天，随机挑取单菌落进行测序，突变位点校正，验证全部序列正确后，成功克隆出αCD47-Fc(ALIE)基因的pSC65穿梭质粒，质粒构建图谱如图8A所示。
7.2 αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒的重组和筛选
1.细胞准备：将143TK -细胞铺在6孔板中，每孔约1×10 6个。培养24小时左右，当细胞贴壁并且铺满整个底面时，进行下一步操作。
2.痘苗病毒孵育：用0.0125/3PFU(PFU：空斑形成单位，病毒液滴度) 的野生型痘苗病毒天坛株感染细胞，37℃孵箱孵育1小时后取出，吸掉上清，并用1mL PBS冲洗一遍再加入1mL完全培养基。
3.质粒转染：将带有αCD47-Fc(ALIE)的pSC65穿梭质粒转染143TK -细胞。37℃孵箱培养48小时左右，具体时间根据细胞病变情况而定。
4.铺斑：准备病毒铺斑用的2×DMEM维持培养基(含2％PS和4％FBS)，加入2％预热的低熔点琼脂糖再加X-gal(终浓度为200μg/mL)。
5.吸掉6孔板中的上清，将6mL铺斑用的混合物加入6孔板中，每孔1mL。然后小心放入4℃冰箱促进凝固，待低熔点琼脂糖凝固后再转入37℃孵箱中倒置培养直至出现清晰的蓝斑。
6.挑取重组的病毒蓝斑，加入到500μL的完全培养基。在-80℃反复冻融三次以上，使病毒尽量多的释放。
7.将143TK -细胞铺在6孔板中，每孔约1×10 6个。培养24小时左右，直至细胞贴壁并且铺满整个底面。
8.反复吹打EP管中的蓝斑，使其完全散开。
9.将完全培养基换成维持培养基然后将含有蓝斑的病毒液加入，37℃孵箱孵育3-4小时。
10.加入筛选压力：加入BrdU(50μg/mL)，放入37℃孵箱中孵育48小时左右，根据病毒斑形成情况进行铺斑。该纯化过程至少需要进行5次。
11.小样扩增重组痘苗病毒：铺143TK -细胞于六孔板，每孔1×10 6个细胞，使用时细胞约为孔板底面积的100％。
12.种毒前将孔中的培养基换成2mL维持培养基。将纯化得到的含有蓝斑的病毒液反复吹打至蓝斑散开。每孔加入100μL左右病毒液。37℃孵箱孵育48小时左右，根据病毒斑形成情况收样。
13.收样：将孔里的培养基上清小心吸出1mL。用剩下的1mL培养基将细胞充分吹下，收于EP管中，可以用于后续PCR的鉴定以及作为毒种进行扩增。
鉴定结果如图8B所示，重组痘苗病毒rTV-αCD47-Fc(ALIE)成功插入了αCD47-Fc(ALIE)基因。
7.3 αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒的表达验证
1.细胞准备：取10cm培养皿，接种5×10 6个VERO细胞/皿，保证第二天接种痘苗病毒时使细胞密度达100％为宜。
2.病毒接种：将完全培养基换成8mL维持培养基(DMEM培养基+2％FBS+1％PS)；然后加入病毒，获得四株痘苗病毒候选株，分别为7号克 隆、8号克隆、9号克隆和10号克隆，分别感染细胞，接种量约为0.02MOI(MOI＝病毒PFU/细胞数)。在37℃5％CO 2的孵箱中培养48小时。
3.蛋白纯化：根据病毒斑形成情况收取细胞上清，用Protein G琼脂糖柱子(GE公司，货号28-9031-34)富集抗体，并用PBS缓冲液溶解。
4.CD47抗体亲和力检测：将纯化的蛋白按照40μg/mL浓度与A549细胞(1×10 6个)室温共孵育15分钟，同时以不加αCD47-Fc(ALIE)蛋白样品做为空白对照。用1mL含2％FBS的PBS(FPBS)洗涤2遍；每个样品加1μL PE标记的anti-human IgG Fc抗体(BioLegend公司，货号409304)，室温共孵育15分钟；用1mL FPBS洗涤2遍后，用200μL的FBS重悬细胞，上机检测。
[根据细则91更正 26.10.2022]　
结果如图9所示，与空白对照相比，在四株痘苗病毒组中，9号克隆表达分泌的αCD47-Fc(ALIE)与A549细胞的结合率为95％左右。说明该重组痘苗病毒上携带的CD47抗体基因不仅成功表达出CD47抗体，而且与A549细胞上CD47蛋白有更好的结合力。将9号克隆进行保藏，命名为rTV-αCD47-Fc(ALIE)，其保藏编号为：CCTCC NO:V202080，保藏日期为2021年1月8日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学。
实施例8：αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒扩增和滴度测定
8.1 αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒的扩增与纯化
1.VERO细胞铺板：每个10cm皿接种5×10 6个细胞，保证第二天接种痘苗病毒时使细胞密度达100％为宜。
2.病毒接种前，将完全培养基换成8mL维持培养基(DMEM培养基+2％FBS+1％PS)，接种病毒(0.02MOI)后继续在37℃5％CO 2的孵箱中培养48小时左右，根据病毒斑形成情况收样。
3.收痘苗病毒：弃掉皿内培养基，取用2mL维持培养基将剩余的细胞吹下，收于15mL离心管中。
4.冻存24小时后，再将收得病毒液反复冻融2次，用36％的蔗糖溶液进行密度梯度离心，16000g条件下4℃离心90分钟，小心倒掉上清，用PBS缓冲液溶解离心管内的病毒沉淀，分装保存于-80℃，待测定病毒滴度。8.2αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒的滴度测定
1. 143TK -细胞的准备：将143TK -细胞铺在24孔板中，每孔2×10 5个细胞，使用时细胞密度要达到24孔板底面积的100％。
2.稀释病毒，用维持培养基稀释痘苗病毒病毒液，从1:100开始，10 倍比稀释，终体积为1100μL。
3.弃掉24孔板中的完全培养基，加入500μL稀释好的病毒液，每个样本设置复孔。37℃5％CO 2的孵箱中孵育48小时左右，根据病毒嗜斑形成情况决定铺斑时间。
4.铺斑凝胶配制：准备8mL含有2×DMEM培养基+4％FBS+2％PS的铺斑培养基和8mL沸水浴融化后也置于37℃水浴锅中的低熔点琼脂糖，将二者混合，再将X-gal加入混合物中(200μg/mL)，待用。
5.吸掉24孔板中的上清。将(4)中的铺斑混合物立刻加入24孔板中，每孔500μL。然后小心放入4℃冰箱促进凝固，待低熔点琼脂糖凝固后再转入37℃孵箱中倒置培养直至出现清晰的蓝斑。
6.病毒斑计数：首先观察病毒嗜斑的数目是否呈十倍比的趋势递减，随后统计种毒的两个复孔中仅有个位数蓝斑的数量，得到的两个孔中蓝斑数值之和，乘以该孔所对应稀释度的倒数值即为1mL中病毒的滴度。
实施例9：αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒体外杀伤肝癌细胞的效果
1.实验分组如下：
A：野生型痘苗病毒天坛株(TTV)治疗组、hrCD16 T细胞组、αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒组(rTV-αCD47-Fc(ALIE))以及rTV-αCD47-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞联合治疗组。
B：野生型痘苗病毒天坛株(TTV)治疗组、NK细胞组、αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒组(rTV-αCD47-Fc(ALIE))以及rTV-αCD47-Fc(ALIE)与NK细胞联合治疗组。
其中，hrCD16 T细胞为变型hrCD16嵌合受体修饰的原代T细胞，能够与CD47抗体的Fc(经突变修饰)高效结合，从而介导T细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤，NK细胞由人PBMC中扩增并分选而来。
2.HepG2细胞准备：HepG2是过表达荧光素酶(Luciferase)的稳转细胞株(上海鑫湾生物科技有限公司)；将HepG2细胞铺在96孔板中，每孔约1×10 4个细胞，使用时细胞密度要达到96孔板底面积的100％。
3.接种病毒：在重组痘苗病毒组和联合治疗组中，采用重组痘苗病毒(rTV-αCD47-Fc(ALIE))感染HepG2细胞12小时。所感染病毒从3.125×10 2PFU至2×10 4PFU之间，呈2倍递增共7个剂量。同时，以野生型痘苗病毒(TTV)感染的HepG2细胞为对照。
4.感染12小时后在hrCD16 T细胞组和联合治疗组加入1×10 4个hrCD16 T细胞继续培养12小时；或者感染12小时后在NK细胞组和联合治疗组加入1×10 4个NK细胞继续培养12小时。
5.弃掉细胞上清，采用Luciferase Assay System(Promega公司，货号E1501)进行荧光素酶检测。具体方法是：弃掉上清，每孔加50μL 1×cell lysis buffer，放入摇床室温孵育30分钟；加入30μL底物上机检测(注意避光)。
结果如图10所示，rTV-αCD47-Fc(ALIE)组以及与联合治疗组测得的荧光值随着病毒滴度的增加而降低，说明对HepG2细胞的杀伤作用随着病毒滴度的增加而增强。相较于单独加病毒或加hrCD16T细胞或NK细胞组，rTV-αCD47-Fc(ALIE)联合hrCD16T或NK细胞组在体外能够显著提高对HepG2细胞的杀伤。
实施例10：αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒体外抗肺癌效果
1.实验分组如下：
A：野生型痘苗病毒天坛株(TTV)治疗组、hrCD16 T细胞组、αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒组以及rTV-αCD47-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞联合治疗组。
B：野生型痘苗病毒天坛株(TTV)治疗组、NK细胞组、αCD47-Fc(ALIE)的重组痘苗病毒组以及rTV-αCD47-Fc(ALIE)与NK细胞联合治疗组。
2.NCI-H292肿瘤细胞系准备：NCI-H292肿瘤细胞系是过表达荧光素酶(Luciferase)的稳转细胞株(上海鑫湾生物科技有限公司)；将NCI-H292细胞铺在96孔板中，每孔约为1×10 4个细胞，使用时细胞密度要达到96孔板底面积的100％。
3.接种病毒：在重组痘苗病毒组和联合治疗组中，采用重组痘苗病毒(rTV-αCD47-Fc(ALIE))感染NCI-H292细胞12小时。所感染病毒从3.125×10 2PFU至2×10 4PFU之间，呈2倍递增共7个剂量。同时，以野生型痘苗病毒(TTV)感染的NCI-H292细胞为对照。
4.感染12小时后在hrCD16 T细胞组和联合治疗组加入1×10 4个hrCD16T细胞，继续培养12小时；或者感染12小时后在NK细胞组和联合治疗组加入1×10 4个NK细胞继续培养12小时；
5.弃掉细胞上清，采用Luciferase Assay System(Promega公司，货号E1501)进行荧光素酶检测。具体方法是：弃掉上清，每孔加50μL 1×cell lysis buffer，放入摇床室温孵育30分钟；加入30μL底物上机检测(注意避光)。
6.结果如图11所示，随着病毒滴度的增加，野生型痘苗病毒天坛株 (TTV)组、rTV-αCD47-Fc(ALIE)组和rTV-αCD47-Fc(ALIE)与hrCD16 T细胞或NK细胞联合治疗组的荧光值降低，说明对NCI-H292肿瘤细胞系的杀伤作用增强。相较于单独加病毒或加hrCD16T细胞或NK细胞，rTV-αCD47-Fc(ALIE)联合hrCD16T或NK细胞能够显著提高对NCI-H292肿瘤细胞系的杀伤。
7.综上所述，重组痘苗病毒rTV-αCD47-Fc(ALIE)作为溶瘤病毒，能够显著抑制人肝癌以及肺癌等多种实体肿瘤细胞生长，对于肿瘤的治疗有非常高的应用价值。该溶瘤病毒制备简单，便于大量制备以及推广使用。
实施例11：SIRPα-Fc(ALIE)蛋白体外介导广谱抗肿瘤活性测试
将本发明的SIRPα-Fc(ALIE)抗体(序列如SEQ ID NO：3或4所示)在体外对SK-OV3卵巢癌和NCI-H292肺癌肿瘤细胞系的介导杀伤实验。以DMEM培养基(10％FBS，1％抗生素)，在37℃，5％CO 2条件下培养SK-OV3和NCI-H292细胞系，此二者细胞系均为Luciferase表达细胞系。将肿瘤细胞以1E4/孔的密度铺于96孔板中，37℃培养过夜待其贴壁。24小时后除去培养基，设空白对照组加入200μL培养基，阳性对照组加入B6H12抗体，实验组分别加入蛋白SIRPα-Fc(WT)和SIRPα-Fc(ALIE)。阳性对照组和实验组分别以2E4/孔的密度加入CD16CAR-T细胞，加入培养基使得抗体终浓度为10μg/mL。24小时后除去上清，每孔加入50μL 1x细胞裂解液(Promega公司，货号E1531)，室温震荡孵育30分钟，每孔加入30μL荧光素酶底物(Promega公司，货号E151A)。上机检测(
Figure PCTCN2022114475-appb-000006
Navigator Microplate Luminometer，Promega，Steady-Glo protocol)。测得结果如图12所示可知，SIRPα-Fc(ALIE)抗体对NCI-H292肿瘤细胞系在体外较强介导杀伤活性，与阳性对照抗体相当。由图12可知，SIRPα-Fc(ALIE)抗体在体外对SK-OV3肿瘤细胞系的介导杀伤活性高于阳性对照抗体B6H12，达到1.2倍于B6H12抗体的杀伤率。此实验说明SIRPα-Fc(ALIE)抗体在体外同样具有介导广谱抗肿瘤活性的能力。
实施例12：rTV-Hu004-65-Fc(ALIE)痘病毒体外介导广谱抗肿瘤活性测 试
将本发明的Hu004-65-Fc(ALIE)抗体(序列如SEQ ID NO：5和9所示)装载到痘病毒载体中，在体外对SK-OV3卵巢癌和NCI-H292肺癌肿瘤细胞系的介导杀伤实验。以DMEM培养基(10％FBS，1％抗生素)，在37℃， 5％CO 2条件下培养SK-OV3和NCI-H292细胞系，此二者细胞系均为Luciferase表达细胞系。将肿瘤细胞以1E4/孔的密度铺于96孔板中，37℃培养过夜待其贴壁。24小时后除去培养基，设空白对照组加入200μL培养基，病毒对照组加入野生型病毒感染上清，阳性对照组加入rTV-B6H12-Fc(ALIE)感染细胞后的培养上清，实验组加入rTV-Hu004-65-Fc(ALIE)痘病毒感染上清。病毒对照组、阳性对照组和实验组分别以2E4/孔的密度加入CD16CAR-T细胞。24小时后除去上清，每孔加入50μL 1x细胞裂解液(Promega公司，货号E1531)，室温震荡孵育30分钟，每孔加入30μL荧光素酶底物(Promega公司，货号E151A)。上机检测(
Figure PCTCN2022114475-appb-000007
Navigator Microplate Luminometer，Promega，Steady-Glo protocol)。测得结果如图13所示可知，rTV-Hu004-65-Fc(ALIE)对NCI-H292肿瘤细胞系在体外较强介导杀伤活性，与阳性对照抗体相当。由图13可知，rTV-Hu004-65-Fc(ALIE)在体外对SK-OV3肿瘤细胞系的介导杀伤活性高于阳性对照rTV-B6H12-Fc(ALIE)，达到1.6倍于rTV-B6H12-Fc(ALIE)的杀伤率。此实验说明候选抗体Hu004-65-Fc(ALIE)制备成的痘病毒rTV-Hu004-65-Fc(ALIE)在体外同样具有介导广谱抗肿瘤活性的能力。
上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (18)

  1. 能够特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
    (a)包含下述3个互补决定区的重链可变区：
    (i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
    (ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
    (iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
    和/或
    (b)包含下述3个互补决定区的轻链可变区：
    (iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:22中任一项所示，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，
    (v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:23中任一项所示，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，和
    (vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:24中任一项所示，或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
    优选地，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换；
    优选地，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:17所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:18所示的VH CDR2和如SEQ ID NO:19所示的VH CDR3；
    并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:11所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:12所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:13所示的VL CDR3；
    或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:14所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:15所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:16所示的VL CDR3；
    或所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:22所示的VL  CDR1、如SEQ ID NO:23所示的VL CDR2和如SEQ ID NO:24所示的VL CDR3。
  2. 能够特异性结合CD47的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，
    所述重链可变区包含SEQ ID NO:9所示的重链可变区中含有的3个CDR；并且，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:5、7或25所示的轻链可变区中含有的3个CDR；
    优选地，所述重链可变区中含有的3个CDR，和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR，由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义。
  3. 权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
    (a)重链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
    (i)SEQ ID NO:9所示的序列；
    (ii)与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
    (iii)与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
    和/或，
    (b)轻链可变区，其包含选自下列的氨基酸序列：
    (iv)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:25的任一项所示的序列；
    (v)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:25的任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；或
    (vi)与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:25的任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
    优选地，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换；
    优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含：具有如SEQ ID NO:9所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:5、7或25中任一项所示的序列的VL。
  4. 权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
    (a)人免疫球蛋白的重链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加；和
    (b)人免疫球蛋白的轻链恒定区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸的保守置换；
    优选地，所述重链恒定区是IgG重链恒定区，更优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区，进一步优选地，其是人IgG1或人IgG4重链恒定区；
    优选地，所述轻链恒定区是κ轻链恒定区。
  5. 权利要求1-4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’) 2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体和单域抗体；和/或，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体；更优选地，所述抗体为完全人抗体。
  6. 一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区；
    优选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO:6、8、10或26中任一项所示的核酸序列。
  7. 一种载体，其包含权利要求6所述的分离的核酸分子；
    优选地，所述载体为克隆载体或表达载体；
    更优选地，所述载体为病毒；
    进一步优选地，所述载体为克隆载体AbVec-hIgKappa或者克隆载体AbVec-hIgG1。
  8. 宿主细胞，其包含权利要求6所述的分离的核酸分子或权利要求7所述的载体；
    优选地，所述宿主细胞是原核的或真核的；更优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或抗原结合片段、多特异性抗体的其它细胞；进一步优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞；更进一步优选地，所述宿主细胞为人、鼠、羊、马、狗或猫的细胞；最优选地，所述宿主细胞是293细胞或CHO细胞。
  9. 制备权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在允许权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求8所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
  10. 一种重组溶瘤病毒，所述溶瘤病毒可操作地插入或包含抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列；
    优选地，所述基因编码序列位于所述重组溶瘤病毒的胸腺嘧啶核苷激酶区。
  11. 根据权利要求10所述的重组溶瘤病毒，其中，所述抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列可单独表达、也可与其他基因或片段融合表达；
    优选地，用于融合表达的其他基因或片段选自Fc片段，趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CCL20或CX3CL1，或霍乱毒素CTA或CTB的一种或多种；
    优选地，所述重组溶瘤病毒还包含其他免疫调节因子的基因编码序列；更优选地，所述其他免疫调节因子选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-33、IL-35、IL-37、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、抗PD-1/PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗Lag-3抗体、抗TIGIT抗体或抗Tim-3抗体的一种或多种；
    优选地，所述重组溶瘤病毒还包含与细胞凋亡和细胞焦亡相关的蛋白的基因编码序列；更优选地，所述与细胞凋亡和细胞焦亡相关的蛋白选自凋亡相关因子1、白介素-1β转换酶、Bcl-2蛋白、Fas/APO-1、p53、myc、共济失调毛细血管扩张突变基因、消皮素D或消皮素E中的一种或多种；或
    优选地，所述重组溶瘤病毒还包含免疫调节基因、凋亡与焦亡基因的小RNA。
  12. 根据权利要求10或11所述的重组溶瘤病毒，其中，所述抗CD47抗体包含权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；优选地，所述抗CD47抗体还包含具有A330L/I332E突变的Fc突变体；
    优选地，所述抗CD47抗体与SEQ ID NO:2所述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；更优选地，所述抗CD47抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
    优选地，所述CD47配体为SIRPα的胞外结构域，其功能片段或变体；更优选地，所述抗CD47配体与SEQ ID NO:4所述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性；进一步优选地，所述抗CD47配体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
  13. 根据权利要求10或11所述的重组溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒包含与SEQ ID NO:1或3所述的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的基因编码序列；
    优选地，所述溶瘤病毒包含如SEQ ID NO:1或3所示的基因编码序列。
  14. 根据权利要求10至13中任一项所述的重组溶瘤病毒，其中，所述 溶瘤病毒的病毒骨架来源于经修饰或经改造的痘苗病毒天坛株、痘苗病毒纽约株、痘苗病毒哥本哈根株、痘苗病毒金丝雀株、痘苗病毒安卡拉株、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、生里基森林病毒、EB病毒、巨细胞病毒、人疱疹病毒6型、天花病毒、痘苗病毒、传染性软疣病毒、羊口疮病毒、呼肠孤病毒、轮状病毒、肠道病毒、塞内卡病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、口蹄疫病毒、披膜病毒、甲病毒、塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒、辛德毕斯病毒、风疹病毒、冠状病毒、黄病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷热病毒、黄热病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、沙粒病毒、拉沙热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、皮钦德病毒、胡宁病毒、马丘波病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、副粘病毒、人副流感病毒、腮腺炎病毒、猴病毒5、麻疹病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病病毒、正粘病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型肝炎病毒、猴免疫缺陷病毒、人免疫缺陷病毒1型和人免疫缺陷病毒2型、劳氏肉瘤病毒、嗜人T细胞白血病病毒1型、猴泡沫病毒、乙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或多瘤病毒；
    优选地，所述溶瘤病毒骨架为细胞内成熟病毒、细胞内包装病毒、细胞相关包装病毒或细胞外包装病毒。
  15. 一种重组痘苗病毒天坛株，命名为rTV-αCD47-Fc(ALIE)，其保藏编号为：CCTCC NO:V202080。
  16. 如权利要求10-15中任一项所述的重组溶瘤病毒的制备方法，包括以下步骤：
    1)合成包含抗CD47抗体或CD47配体的基因编码序列；
    2)将步骤1)得到的编码序列克隆至溶瘤病毒的穿梭质粒中，构建重组质粒载体；
    3)将步骤2)得到的重组质粒载体转染至溶瘤病毒中，经筛选获得重组溶瘤病毒；
    任选地，培养获得的重组溶瘤病毒。
  17. 如权利要求16所述的方法，包括以下步骤：
    1)合成人基因αCD47-Fc(ALIE)，其序列如SEQ ID NO:1所示；
    或其中包含SEQ ID NO:6、8、10或26中任一项所示的核酸序列；
    或合成人基因SIRPα-Fc(ALIE)，其序列如SEQ ID NO：3所示；
    2)将合成的αCD47-Fc(ALIE)基因或SIRPα-Fc(ALIE)基因亚克隆至痘苗 病毒穿梭质粒pSC65的TK区中，构建重组质粒pSC65-αCD47-Fc(ALIE)或pSC65-SIRPα-Fc(ALIE)；
    3)采用基因同源重组的方式，将pSC65-αCD47-Fc(ALIE)质粒或pSC65-SIRPα-Fc(ALIE)质粒转染到已经被感染了野生型痘苗病毒的TK143 -细胞中，使两者同源重组，产生重组痘苗病毒rTV-αCD47-Fc(ALIE)或rTV-SIRPα-Fc(ALIE)；经筛选获得所述TK区包含SEQ ID NO:1所示的pSC65-αCD47-Fc(ALIE)的编码序列的重组溶瘤痘苗病毒或所述TK区包含SEQ ID NO:3所示的pSC65-SIRPα-Fc(ALIE)的编码序列的重组溶瘤痘苗病毒；
    优选地，αCD47-Fc(ALIE)基因或SIRPα-Fc(ALIE)基因由痘苗病毒的早/晚期启动子p7.5控制。
  18. 如权利要求10-17中任一项所述的重组溶瘤病毒用于制备抗肿瘤药物的用途；
    优选地，所述肿瘤选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、胶质瘤优选高级别胶质瘤、母细胞瘤优选神经母细胞瘤、骨肉瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、大肠癌、造血系统癌、睾丸癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、鳞状细胞癌、腺癌、AIDS相关淋巴瘤、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或血液致瘤疾病的一种或多种。
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