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WO2022265130A1 - 신규 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

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Publication number
WO2022265130A1
WO2022265130A1 PCT/KR2021/007511 KR2021007511W WO2022265130A1 WO 2022265130 A1 WO2022265130 A1 WO 2022265130A1 KR 2021007511 W KR2021007511 W KR 2021007511W WO 2022265130 A1 WO2022265130 A1 WO 2022265130A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polynucleotide
seq
present application
nucleotide
promoter
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/007511
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
권나라
이한형
김혜미
박소정
김병수
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Priority to PCT/KR2021/007511 priority Critical patent/WO2022265130A1/ko
Publication of WO2022265130A1 publication Critical patent/WO2022265130A1/ko

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • the present application relates to a novel promoter and a method for producing a target substance using the same, and more particularly, to a novel polynucleotide having promoter activity, a gene expression cassette and host cell containing the same, and a method for producing a target substance using the microorganism It is about.
  • L-amino acid is a basic structural unit of protein and is used as an important raw material for pharmaceutical raw materials, food additives, animal feeds, nutrients, insecticides, and bactericides.
  • L-lysine is an essential amino acid that is not biosynthesized at all in vivo, and is known to be necessary for growth promotion, calcium metabolism, gastric juice secretion promotion, and increased resistance to disease.
  • the L-lysine is used in various ways such as feed, medicine, food, etc.
  • L-tryptophan is also one of the essential amino acids, and is used as a feed additive, infusion solution, pharmaceutical raw material, and health food material.
  • Common methods for producing the amino acid include Brevibacterium or Corynebacterium ( Corynebacterium; Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center: 195-215, 1986), other Escherichia coli , Bacillus subtilis ( Bacillus ), actinomyces ( Streptomyces ), Penicillium ( Penicillum ), Klebsiella ( Klebsiella ), Erwinia ( Erwinia ), Pantoea ( Pantoea )
  • There is a fermentation method using microorganisms such as 3,220,929, 6,682,912), and also industrially produced through synthetic methods such as monochloroacetic acid method and Strecker method.
  • the present inventors have developed a polynucleotide having a novel promoter activity capable of producing a target substance with high productivity in a microorganism of the genus Corynebacterium, and introducing it into a microorganism can increase the productivity of the target substance.
  • This application was completed by confirming that it exists.
  • the present inventors completed the present application by developing a polynucleotide having a novel promoter activity, a host cell containing the polynucleotide, and a method for producing a target substance using the host cell.
  • One object of the present application is to provide a host cell comprising one or more polynucleotides of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a host cell comprising one or more gene expression cassettes of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing a target substance, including culturing the host cells in a medium and recovering the target substance from the medium.
  • Another object of the present application is to provide use as a promoter of one or more polynucleotides of the present application.
  • novel promoter of the present application can be introduced into a microorganism that produces amino acids to increase the amount of amino acids produced by the microorganism.
  • L-lysine which has been previously produced synthetically, can be produced by fermentation, so it can be usefully used for amino acid production.
  • a host cell comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of (a) and (b) below is provided.
  • One or more in the present application may be one or more or two or more, but is not limited thereto.
  • the host cell of the present application may contain one or more polynucleotides selected from the group consisting of (a) and (b), but is not limited thereto.
  • the host cell of the present application includes (a) a polynucleotide having promoter activity; and (b) a host cell containing a polynucleotide having promoter activity, but is not limited thereto.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 may mean a part of the promoter sequence of the NCgl0859 gene.
  • NCgl0859 gene refers to a gene inherently present in microorganisms of the genus Corynebacterium, or a gene encoding a hypothetical protein whose function is unknown.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 may mean a part of the promoter sequence of the NCgl1416 gene.
  • NCgl1416 gene refers to a gene inherently present in a microorganism of the genus Corynebacterium, or a gene encoding a hypothetical protein whose function is unknown.
  • sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 may be derived from Corynebacterium sp., specifically, may be a sequence from Corynebacterium glutamicum , but the polynucleotide Sequences having activity equal to or higher than may be included without limitation in the promoter of the present application.
  • polynucleotide is a DNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain shape by covalent bonds.
  • promoter refers to a non-translated nucleotide sequence upstream of a coding region that includes a binding site for polymerase and has an activity to initiate transcription of a promoter target gene into mRNA, that is, a polymerase A region of DNA that binds and initiates transcription of a gene.
  • the promoter may be located at the 5' site of the mRNA transcription initiation site.
  • polynucleotide having promoter activity refers to a gene operably linked thereto, that is, near a transcription site of a target gene including a site to which RNA polymerase or an enhancer binds for the expression of the target gene. refers to a region of DNA that is present.
  • the polynucleotide can be used as a universal promoter, and the polynucleotide can be compared with an existing promoter or a cell endogenous promoter in a cell, expression of a target gene operably linked thereto,
  • the production and/or activity of a protein encoded by a gene may be regulated (eg, increased or decreased), and the target product involved in the production of the protein (as a biologically active substance, for example, amino acids, nucleic acids, vitamins, It may be to regulate (eg, increase or decrease) production and/or activity of at least one selected from the group consisting of protein, fatty acid, and organic acid, but is not limited thereto.
  • polynucleotide of the present application may be included without limitation as long as it is a polynucleotide sequence having promoter activity.
  • the polynucleotide having promoter activity of the present application may include a polynucleotide having promoter activity in which one or more nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 are substituted with other nucleotides.
  • it may be composed of a polynucleotide having promoter activity in which one or more nucleotides of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 are substituted with other nucleotides.
  • the polynucleotide having the promoter activity may be used interchangeably with "mutant promoter" herein, and all of the above-described terms may be used herein.
  • the polynucleotide having promoter activity may have promoter activity weakened or enhanced by substituting a nucleotide at a specific position in an existing polynucleotide sequence having promoter activity.
  • the mutant promoter may be one in which the 178th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with another nucleotide or the 268th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is replaced with another nucleotide. there is.
  • the "other nucleotide” is not limited as long as it is different from the nucleotide before substitution.
  • the nucleotide at position 178 in SEQ ID NO: 1 is substituted with another nucleotide
  • nucleotide 268 in SEQ ID NO: 3 it means that thymine (T), cytosine (C), and guanine (G) are substituted except for adenine (A) do.
  • a nucleotide is described as "substituted” in this application, it means that it is substituted with a nucleotide different from the nucleotide before substitution.
  • nucleotide at the position corresponding to nucleotide 178 of SEQ ID NO: 1 or nucleotide 268 of SEQ ID NO: 3 of the present application in any polynucleotide sequence through sequence alignment known in the art Even if it is not separately described in the present application, if "a nucleotide at a specific position in a specific sequence number" is described, it is clear that it means including "a nucleotide at a corresponding position" in any polynucleotide sequence.
  • any polynucleotide sequence having promoter activity selected from the group consisting of the nucleotide at position corresponding to position 178 of the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the nucleotide at position corresponding to position 268 of the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 3
  • Polynucleotide sequences in which any one or more nucleotides are substituted with other nucleotides are also included in the scope of the present application.
  • the polynucleotide is a mutation in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, that is, the promoter sequence of the NCgl0859 gene, specifically, the mutation is a polynucleotide in which the 178th nucleotide of the sequence is substituted with another nucleotide, More specifically, a polynucleotide in which the 178th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with C; And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, that is, the promoter sequence of the NCgl1416 gene is mutated, specifically, the mutation is a polynucleotide in which the 268th nucleotide of the sequence is substituted with another nucleotide, more specifically, SEQ ID NO: 3 It may be any one or more selected from the group consisting of polynucleotides in which the 268th nucleotide of the displayed
  • the polynucleotide may have a promoter activity that is mutated (increased or decreased) compared to a polynucleotide that does not contain the mutation. Accordingly, the expression of a target gene operably linked to the polynucleotide and the activity of a protein encoded by the target gene may be regulated (increased or decreased), and furthermore, the expression of other genes other than the target gene may be regulated.
  • a promoter having a weakened or enhanced activity than that of the unsubstituted (unmodified) promoter sequence can be provided.
  • a promoter having a weakened or enhanced activity than the unsubstituted (unmodified) promoter sequence can be provided.
  • polynucleotide may be a polynucleotide involved in increasing the production or production of a target substance, specifically, L-amino acid, more specifically, L-lysine.
  • the present inventors first identified the effect of increasing the amount of L-amino acid, more specifically, L-lysine, by the promoter mutation of the NCgl0859 gene or the NCgl1416 gene as described above.
  • L-lysine is one of the basic ⁇ -amino acids and is an essential amino acid that is not synthesized in the body.
  • the L- lysine is not limited thereto, but may be applied to various products such as feed or feed additives, or foods, food additives, and pharmaceuticals.
  • the polynucleotide having promoter activity in the present application may include at least one or at least two of the polynucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4.
  • the polynucleotide may consist essentially of, or consist of, one or more of the polynucleotide sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • nucleotide sequence of the present application may be modified by conventionally known mutagenesis methods, such as directed evolution and site-directed mutagenesis.
  • mutation means a genetic or non-genetically stable phenotypic change, and may be named interchangeably with “variation” or “mutation” in the present specification.
  • a polynucleotide having promoter activity is SEQ ID NO: 1, to SEQ ID NO: 4, or at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 , polynucleotide sequences having 97%, 98%, or 99% or more homology or identity.
  • a nucleotide sequence having homology or identity may be a sequence having less than 100% identity or excluding sequences having 100% identity among the above categories.
  • a meaningless sequence is added to the inside or end of the nucleotide sequence of the corresponding sequence number, or a polynucleotide in which some sequence inside or at the end of the nucleotide sequence of the corresponding sequence number is deleted It is obvious that also falls within the scope of the present application.
  • Homology and identity mean the extent to which two given base sequences are related and can be expressed as a percentage.
  • Sequence homology or identity of conserved polynucleotides is determined by standard alignment algorithms, together with default gap penalties established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally under moderate or high stringency conditions along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire or full-length sequence. It can hybridize under stringent conditions. Hybridization is also contemplated for polynucleotides that contain degenerate codons in lieu of codons in the polynucleotide.
  • Whether any two polynucleotide sequences have homology, similarity or identity can be determined, for example, by Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: can be determined using known computer algorithms such as the “FASTA” program using default parameters as in 2444. or, as performed in the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later), It can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
  • GAP program defines the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (i.e., nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp.
  • a probe that can be prepared from a known gene sequence for example, a polynucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence to all or part of the above-described polynucleotide sequence and has the same activity, may be included without limitation.
  • the "stringent condition” means a condition that allows specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in the literature (e.g., J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • genes with high homology or identity 40% or more, specifically 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, more specifically 95% or more, More specifically, genes having homology or identity of 97% or more, particularly specifically, 99% or more hybridize, and genes having lower homology or identity than that do not hybridize, or normal Southern hybridization (southern hybridization) hybridization) washing conditions of 60 ° C, 1XSSC, 0.1% SDS, specifically 60 ° C, 0.1XSSC, 0.1% SDS, more specifically 68 ° C, 0.1XSSC, 0.1% SDS At a salt concentration and temperature corresponding to, Conditions for washing once, specifically two to three times, can be enumerated.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases are possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include isolated nucleic acid fragments complementary to substantially similar nucleic acid sequences as well as the entire sequence.
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C or 65 ° C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • Appropriate stringency for hybridizing polynucleotides depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, parameters well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • Polynucleotides having promoter activity of the present application can be isolated or prepared using standard molecular biology techniques. For example, it may be prepared using standard synthesis techniques using an automated DNA synthesizer, but is not limited thereto.
  • a polynucleotide having promoter activity of the present application can be used as a promoter.
  • the promoter may be located at the 5' site of the initiation site of transcription into mRNA.
  • the promoter may have increased or decreased promoter activity compared to conventional promoters. That is, it is possible to increase or decrease the expression and/or activity of a protein encoded by the gene of interest as well as the expression of the gene of interest in the host cell.
  • the gene of interest for enhancing or attenuating expression may be changed depending on the product to be produced, and the promoter may be used as a universal promoter for enhancing or attenuating the gene of interest.
  • Another aspect of the present application provides a host cell comprising one or more gene expression cassettes selected from the group consisting of the following (a') and (b').
  • a gene expression cassette comprising a polynucleotide having promoter activity in which the 178th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with C and a first target gene;
  • a gene expression cassette comprising a polynucleotide having promoter activity in which the 268th nucleotide of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 is substituted with G, and a second target gene.
  • the polynucleotide and the like are as described above.
  • One or more in the present application may be one or more or two or more, but is not limited thereto.
  • the host cell of the present application may include one or more gene expression cassettes selected from the group consisting of (a') and (b'), but is not limited thereto.
  • the host cells of the present application may also include host cells containing the gene expression cassettes of (a') and (b'), but are not limited thereto.
  • the term "gene expression cassette” means a unit cassette capable of expressing a target gene operably linked to a downstream side of a promoter, including a promoter and a target gene. Various factors that can help the efficient expression of the target gene may be included inside or outside such a gene expression cassette.
  • the gene expression cassette may include, but is not limited to, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal in addition to a promoter operably linked to the gene of interest.
  • target gene for the purpose of the present application, means a gene whose expression is to be controlled by the promoter sequence of the present application.
  • a protein encoded by the target gene may be referred to as “target protein”, and a gene encoding the "target protein” may be referred to as “target gene”.
  • a polynucleotide encoding a protein of interest can be varied in the coding region within a range that does not change the polypeptide sequence due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in organisms in which the polynucleotide is to be expressed. Transformations can be made. Description of the polynucleotide sequence is as described above.
  • the expression consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 above refers to the number of nucleotides that may occur during the process of linking to the target gene, such as using a restriction enzyme, when using the polynucleotide linked to the target gene as a promoter. Additions, and/or deletions, and/or mutations are not excluded.
  • a polynucleotide having promoter activity consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 is hybridized with a complementary sequence to all or part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 under stringent conditions, Any nucleotide sequence having promoter activity of the present application may be included without limitation.
  • vector is an artificial DNA molecule having genetic material so as to express a target gene in a suitable host, specifically, a DNA comprising a nucleotide sequence of a gene encoding a target protein operably linked thereto. means product.
  • operably linked means that a polynucleotide having promoter activity of the present application is functionally linked to the gene sequence to initiate and mediate transcription of a target gene.
  • Operable linkages can be prepared using genetic recombination techniques known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage can be prepared using cutting and linking enzymes in the art, but are not limited thereto.
  • Vectors used in the present application are not particularly limited as long as they can be expressed in host cells, and host cells can be transformed using any vector known in the art. Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors , pBluescriptII-based, pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors, etc. may be used, but are not limited thereto.
  • insertion of the polynucleotide into a chromosome is not known in the art. This can be done by any known method, for example homologous recombination.
  • a selection marker may be additionally included to determine whether the vector is inserted into the chromosome.
  • Selectable markers are used to select cells transformed with a vector, that is, to determine whether a polynucleotide is inserted, and to impart selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of surface proteins. Markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” means introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide can be expressed in the host cell, it may be inserted into and located in the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide includes DNA and RNA encoding a target protein, and may be introduced in any form as long as it can be introduced into a host cell and expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all elements required for self-expression, or a vector containing the polynucleotide.
  • the transformation method includes all methods of introducing a gene encoding the target protein into a cell, and can be performed by selecting an appropriate standard technique as known in the art according to the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Lithium acetate-DMSO method, etc., but is not limited thereto.
  • the host cell of the present application may include one or more polynucleotides of the present application, one or more gene expression cassettes including the polynucleotide and the target gene, or a combination thereof.
  • the host cell may be a microorganism of the genus Corynebacterium, but is not limited thereto.
  • microorganism includes both wild-type microorganisms and microorganisms in which genetic modification has occurred naturally or artificially, and specific mechanisms are weakened due to causes such as insertion of external genes or enhancement or weakening of the activity of endogenous genes. It is a concept that includes all microorganisms that have been enhanced or enhanced.
  • the microorganism may be included without limitation as long as it is a microorganism into which the polynucleotide of the present application is introduced or included.
  • the microorganism may include the polynucleotide, may specifically include the polynucleotide and/or a vector containing the polynucleotide, and more specifically, a vector containing a gene encoding a target protein. It may include, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide and vector may be introduced into the microorganism by transformation, but is not limited thereto.
  • the microorganism is, for example, a cell or microorganism that is transformed with a vector containing the polynucleotide of the present application and a gene encoding a target protein, and expresses the target protein, and for the purpose of the present application, the host cell or microorganism is the above Any microorganism capable of producing a target product including a target protein is possible.
  • microorganism producing a target protein or target product includes both wild-type microorganisms and microorganisms in which genetic modification has occurred naturally or artificially, and in which foreign genes are inserted or the activity of endogenous genes is enhanced or inactivated. It may be a microorganism whose specific mechanism is weakened or enhanced due to causes such as, etc., and which includes genetic modification (modification) for the production of a desired protein or product.
  • the microorganism producing the target protein or the target product may be a microorganism characterized by an increased ability to produce the target protein or the target product, including the polynucleotide of the present application.
  • a microorganism producing a target protein or a target product, or a microorganism capable of producing a target protein or a target product has a part of a gene in the target protein or target product biosynthesis pathway that is enhanced or weakened, or a target protein or target product. It may be a microorganism in which some of the genes in the degradation pathway are enhanced or weakened.
  • the microorganism containing the polynucleotide may be one with increased production of L-amino acids, specifically, L-lysine.
  • the microorganism may be included without limitation as long as it is a microorganism capable of operating as a promoter by introducing a polynucleotide having a promoter activity of the present application.
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Corynebacterium, more specifically Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ) or Corynebacterium flavum ( Corynebacterium flavum ) It may be, most specifically Corynebacterium It may be Nebacterium glutamicum, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a method for producing a target substance, including culturing the host cells in a medium and recovering the target substance from the medium.
  • the polynucleotide, gene expression cassette, host cell, target substance, etc. are as described above.
  • the target substance may be an amino acid.
  • the amino acids may be L-type amino acids, unless otherwise specified, and include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, threonine, serine, cysteine, glutamine, methionine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, and lysine.
  • arginine, histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, proline and may be selected from the group consisting of combinations thereof, but is not limited thereto.
  • amino acid may be L-lysine, but is not limited thereto.
  • the term "cultivation” means to grow microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the method for producing a target substance using a microorganism containing the polynucleotide may be performed using a method widely known in the art. Specifically, the culture may be cultured continuously in a batch process, injection batch or repeated injection batch process (fed batch or repeated fed batch process), but is not limited thereto. The medium used for culture must meet the requirements of the particular strain in an appropriate manner. Culture media for Corynebacterium strains are known (eg, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981).
  • Sugar sources that can be used in the medium include sugars and carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, and cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, and coconut oil, palmitic acid, and stearic acid. , fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These materials may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. Nitrogen sources may also be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • Persons that may be used may include salts containing potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium.
  • the culture medium may contain metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins may be used in addition to the above substances.
  • precursors suitable for the culture medium may be used. The above raw materials may be added in a batchwise or continuous manner by a method suitable for the culture during the cultivation process.
  • the pH of the culture may be adjusted by using a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, or ammonia or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid in an appropriate manner.
  • a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, or ammonia or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid in an appropriate manner.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters may be used to suppress foam formation.
  • Oxygen or an oxygen-containing gas eg, air
  • air oxygen-containing gas
  • the temperature of the culture may be usually 20 ° C to 45 ° C, specifically 25 ° C to 40 ° C.
  • the culturing time may be continued until a desired production amount of the target substance is obtained, but may be specifically 10 to 160 hours.
  • Recovery of the target substance from the culture (medium) can be separated and recovered by a conventional method known in the art. Methods such as centrifugation, filtration, chromatography and crystallization may be used for such a separation method.
  • the culture may be centrifuged at low speed to remove biomass, and the obtained supernatant may be separated through ion exchange chromatography, but is not limited thereto.
  • the recovery step may further include a purification process.
  • Another aspect of the present application provides the use of one or more polynucleotides of the present application as promoters.
  • the polynucleotide is as described above.
  • Example 1 Evaluation of L-lysine production ability of microorganisms containing novel promoter sequences
  • Example 1-1 Construction of a recombinant vector containing a novel promoter sequence
  • a base sequence (SEQ ID NO: 1) including the promoter region of NCgl0859 of wild type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was obtained based on the NIH GenBank of the US National Institutes of Health.
  • Vector for constructing an expression strain to confirm the effect of a promoter variant (PNCgl0859 (t178c); SEQ ID NO: 2) in which the nucleotide corresponding to position 178 of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1 is substituted from T to C on L-lysine production was constructed using plasmid pDCM2 (Korean Publication No. 10-2020-0136813) for insertion and replacement of genes in the Corynebacterium chromosome.
  • PCR was performed using the gDNA (genomic DNA) of wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template and the primer pairs of SEQ ID NOs: 5 and 6 and the primer pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8, respectively. .
  • gDNA genomic DNA
  • overlapping PCR was performed again to obtain fragments.
  • PCR was denatured at 94°C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute 30 seconds, followed by 72°C for 5 minutes.
  • the pDCM2 plasmid was treated with SmaI, and the PCR product obtained above was subjected to fusion cloning.
  • In-Fusion® HD cloning kit (Clontech) was used.
  • the resulting vector was named pDCM2-PNCgl0859 (t178c). Primer sequence information used for constructing the vector is shown in Table 1 below.
  • sequence number primer name 5' sequence 3' 5 PNCgl0859_1F TGAATTCGAGCTCGGTACCCCCACCGCCTTCACACCG 6 PNCgl0859_2R GATCGAAAAGAATCAGgGCTTGTGACGATTATC 7 PNCgl0859_3F GATAATCGTCACAAGCcCTGATTCTTTTCGATC 8 PNCgl0859_4R GTCGACTCTAGAGGATCCCCCGCAGTACATAGATCGGGG
  • Example 1-2 Evaluation of L-lysine production ability of microorganisms containing novel promoter sequences
  • Example 1-1 The gene replacement vector prepared in Example 1-1 was introduced into the Corynebacterium glutamicum CJ3P (US 9556463 B2) strain to produce L-lysine producing strain "CJ3P_PNCgl0859 (t178c)" into which the mutation was introduced. .
  • the L-lysine production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of the strain prepared in Example 1-2-1 and the parent strain of the control group.
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium, and cultured at 30° C. for 20 hours with shaking at 200 rpm.
  • a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of production medium was inoculated with 1 ml of the seed culture and incubated at 30° C. for 72 hours with shaking at 200 rpm.
  • the composition of the seed medium and production medium is as follows.
  • the concentration of L-lysine produced by the mutant-introduced Corynebacterium glutamicum CJ3P_PNCgl0859 (t178c) strain was higher than that produced by the non-mutated Corynebacterium glutamicum CJ3P strain. It was confirmed that the L- lysine concentration increased by 22.5%.
  • Example 2 Evaluation of L-lysine production ability of microorganisms containing novel promoter sequences
  • Example 2-1 Construction of a recombinant vector containing a novel promoter sequence
  • a base sequence (SEQ ID NO: 3) including the promoter region of NCgl1416 of wild type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was obtained based on the NIH GenBank of the US National Institutes of Health.
  • SEQ ID NO: 4 the promoter variant in which the nucleotide corresponding to position 268 of the polynucleotide of SEQ ID NO: 3 is substituted from A to G (PNCgl1416 (a268g); SEQ ID NO: 4) on L-lysine production, for the construction of an expression strain
  • the vector was constructed using the plasmid pDCM2 (Korean Publication No. 10-2020-0136813) for insertion and replacement of genes in the Corynebacterium chromosome.
  • PCR was performed using the gDNA (genomic DNA) of wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template and the primer pairs of SEQ ID NOs: 11 and 12 and the primer pairs of SEQ ID NOs: 13 and 14, respectively. .
  • gDNA genomic DNA
  • overlapping PCR was performed again to obtain fragments.
  • PCR was denatured at 94°C for 5 minutes, followed by 30 cycles of 94°C for 30 seconds, 55°C for 30 seconds, and 72°C for 1 minute 30 seconds, followed by 72°C for 5 minutes.
  • the pDCM2 plasmid was treated with SmaI, and the PCR product obtained above was subjected to fusion cloning.
  • In-Fusion® HD cloning kit (Clontech) was used.
  • the resulting vector was named pDCM2-PNCgl1416(a268g). Primer sequence information used for constructing the vector is shown in Table 4 below.
  • Example 2-2 Evaluation of L-lysine production ability of microorganisms containing novel promoter sequences
  • Example 2-1 The gene replacement vector prepared in Example 2-1 was introduced into the Corynebacterium glutamicum CJ3P (US 9556463 B2) strain to produce L-lysine producing strain "CJ3P_PNCgl1416 (a268g)" into which the mutation was introduced. .
  • the L-lysine production ability was analyzed by evaluating the flask fermentation titer of the strain prepared in Example 2-2-1 and the parent strain of the control group.
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of seed medium, and cultured at 30° C. for 20 hours with shaking at 200 rpm.
  • a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of production medium was inoculated with 1 ml of the seed culture and incubated at 30° C. for 72 hours with shaking at 200 rpm.
  • the composition of the seed medium and production medium is as follows.
  • the concentration of L-lysine produced by the mutated Corynebacterium glutamicum CJ3P_PNCgl1416 (a268g) strain was higher than that produced by the non-mutated Corynebacterium glutamicum CJ3P strain. It was confirmed that the L- lysine concentration increased by 19.8%. That is, it was confirmed that the mutation remarkably increases the ability of the microorganism to produce L-lysine.

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Abstract

본 출원은 신규한 프로모터 및 이를 이용한 목적 물질 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프로모터 활성을 가지는 신규 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 유전자 발현 카세트 및 숙주세포, 및 상기 미생물을 이용한 목적 물질의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

신규 프로모터 및 이의 용도
본 출원은 신규한 프로모터 및 이를 이용한 목적 물질의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 프로모터 활성을 가지는 신규 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 유전자 발현 카세트 및 숙주세포, 및 상기 미생물을 이용한 목적 물질의 생산 방법에 관한 것이다.
L-아미노산은 단백질의 기본 구성단위로서, 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등의 중요 소재로 사용된다. 그 중에서도, L-라이신은 생체 내에서 전혀 생합성되지 않는 필수 아미노산이며, 성장촉진, 칼슘 대사, 위액분비촉진, 병에 대한 저항력 증가에 필요하다고 알려져 있다. 상기 L-라이신은 사료, 의약품, 식품 등에 다양하게 쓰이고 있다. 또한, L-트립토판도 필수 아미노산 중 하나이며, 사료 첨가제, 수액제, 약품 원료 및 건강식품 소재 등으로 사용되고 있다.　
상기 아미노산을 생산하는 통상적인 방법으로는 주로 브레비박테리움(Brevibacterium)이나 코리네박테리움(Corynebacterium; Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center: 195-215, 1986), 그 외에도 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus), 방선균(Streptomyces), 페니실리움(Penicillum) 속, 크렙시엘라(Klebsiella), 어위니아(Erwinia), 판토에아(Pantoea) 속 등의 미생물을 이용한 발효 방법이 있고(미국 특허 제3,220,929호, 제6,682,912호), 또한 모노클로로초산법, 스트렉커(Strecker)법 등의 합성법을 통한 공업적인 방법으로도 생산된다.
또한, 아미노산을 효율적으로 생산하기 위한 다양한 연구, 예를 들어, 아미노산 고효율 생산 미생물이나 발효공정 기술을 개발하기 위한 노력이 이루어지고 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에서 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 아미노산 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적인 접근 방법이 개발되었고(한국 등록특허공보 제10-0924065호, 제1208480호), 이러한 방법 이외에 아미노산 생산에 관여하지 않는 유전자를 제거하는 방법, 아미노산 생산에 있어 구체적으로 기능이 알려지지 않은 유전자를 제거하는 방법 또한 활용되고 있다. 그러나, 여전히 효율적으로 고수율로 L-아미노산을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 코리네박테리움 속 미생물에서 높은 생산성으로 목적물질을 제조할 수 있는 신규한 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 개발하였고, 이를 미생물에 도입하면 목적하는 물질의 생산성을 증가시킬 수 있음을 확인하여 본 출원을 완성하였다.
본 발명자들은 신규한 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 목적 물질의 생산 방법을 개발하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 본 출원의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 하나 이상의 유전자 발현 카세트를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 숙주세포를 배지에서 배양하는 단계 및 상기의 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 프로모터로서의 용도를 제공한다.
본 출원의 신규 프로모터는 아미노산을 생산하는 미생물에 도입되어 미생물의 아미노산 생성량을 증가시킬 수 있다. 특히, 상기 신규 프로모터를 이용하여 아미노산을 제조하는 경우, 기존에 합성법으로 제조되던 L-라이신을 발효법으로 생산할 수 있으므로 아미노산 생산에 유용하게 활용될 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 출원의 하나의 양태는
하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주세포를 제공한다.
(a) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 178번째 뉴클레오티드가 C로 치환된 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 268번째 뉴클레오티드가 G로 치환된 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드.
본 출원에서 하나 이상은 1 이상 또는 2 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 숙주세포는 상기 (a) 및 (b)로 구성되는 군에서 선택되는 1 이상 또는 2 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 출원의 숙주세포는 상기 (a) 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포도 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열"은 NCgl0859 유전자의 프로모터 서열의 일부를 의미할 수 있다.
이때, 상기 용어 "NCgl0859 유전자"는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 유전자이나, 기능이 알려지지 않은 추정상의 단백질(hypothetical protein)을 코딩하는 유전자를 의미한다.
본 출원에서 용어 "서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열"은 NCgl1416 유전자의 프로모터 서열의 일부를 의미할 수 있다.
이때, 상기 용어 "NCgl1416 유전자"는 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 유전자이나, 기능이 알려지지 않은 추정상의 단백질(hypothetical protein)을 코딩하는 유전자를 의미한다.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 3에 상응하는 서열은 코리네박테리움(Corynebacterium sp.) 유래일 수 있고, 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 서열일 수 있으나, 상기 폴리뉴클레오티드와 동등 또는 그 이상의 활성을 갖는 서열은 본 출원의 프로모터에 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 가닥이다.
본 출원에서 용어 "프로모터"는 폴리머라제(polymerase)에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 목적 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비 해독된 뉴클레오티드 서열, 즉 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 의미한다. 상기 프로모터는 mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다.
본 출원에서 용어, "프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드"는 뒤에 작동가능하게 연결시키는 유전자, 즉 목적 유전자의 발현을 위해 RNA 폴리머라제 또는 인핸서 등이 결합하는 부위를 포함하는 목적 유전자의 전사시키는 부위 근처에 존재하는 DNA 영역을 의미한다. 본 출원의 목적상 상기 폴리뉴클레오티드는 범용적 프로모터로 이용될 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드는, 세포 내에서, 기존의 프로모터 또는 세포 내재 프로모터와 비교하여, 이와 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 발현, 상기 목적 유전자에 의하여 암호화되는 단백질의 생산 및/또는 활성이 조절(예컨대, 증가 또는 감소)되는 것일 수 있으며, 상기 단백질이 생산에 관여하는 목적 산물(생물학적 활성 물질로서 예를 들어, 아미노산, 핵산, 비타민, 단백질, 지방산 및 유기산 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상)의 생산 및/또는 활성을 조절(예컨대, 증가 또는 감소)시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
일 구현예로, 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된, 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있다. 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 본원에서 "변이형 프로모터"와 혼용 될 수 있으며, 본 명세서에서는 상기 기술된 용어가 모두 사용될 수 있다.
일 예로, 상기 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 기존의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에서, 특이적 위치의 뉴클레오티드가 치환되어 프로모터 활성이 약화 또는 강화된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변이형 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 178번째 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 것 또는 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 268번째 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 것일 수 있다.
상기 "다른 뉴클레오티드"는 치환 전의 뉴클레오티드와 다른 것이면, 제한되지 않는다. 일 예로, "서열번호 1에서 178번 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되었다" 고 기재하는 경우, 티민(T)을 제외한 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G)으로 치환되는 것을 의미한다. 또 다른 일 예로, "서열번호 3에서 268번 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환되었다" 고 기재하는 경우, 아데닌(A)을 제외한 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G)으로 치환되는 것을 의미한다. 또한 달리 표시하지 않더라도 본 출원에서 어떤 뉴클레오티드가 "치환되었다"고 기재하는 경우, 치환 전의 뉴클레오티드와 다른 뉴클레오티드로 치환되는 것을 의미한다.
한편, 당업자라면 당업계에 알려진 서열 얼라인먼트를 통해 임의의 폴리뉴클레오티드 서열에서 본 출원의 서열번호 1의 178번 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 뉴클레오티드 또는 서열번호 3의 268번 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 뉴클레오티드를 파악할 수 있으며, 본 출원에서 별도로 기재하지 않더라도 "특정 서열번호에서 특이적 위치의 뉴클레오티드"를 기재하는 경우, 임의의 폴리뉴클레오티드 서열에서 그와 "상응하는 위치의 뉴클레오티드"까지 포함하는 의미임은 자명하다. 따라서 프로모터 활성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열 내에서 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열의 178번에 상응하는 위치의 뉴클레오티드 및 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열의 268번에 상응하는 위치의 뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 폴리뉴클레오티드 서열 역시 본 출원의 범위에 포함된다.
본 출원의 목적상 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열, 즉 NCgl0859 유전자의 프로모터 서열이 변이된 것이며, 구체적으로 상기 변이는 상기 서열의 178번째 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 폴리뉴클레오티드, 보다 구체적으로, 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 178번째 뉴클레오티드가 C로 치환된 폴리뉴클레오티드; 및 상기 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열, 즉 NCgl1416 유전자의 프로모터 서열이 변이된 것이며, 구체적으로 상기 변이는 상기 서열의 268번째 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 폴리뉴클레오티드, 보다 구체적으로, 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 268번째 뉴클레오티드가 G로 치환된 폴리뉴클레오티드로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오티드는 변이를 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드에 비해 변이된(증가 또는 감소된) 프로모터 활성을 가질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 연결된 목적 유전자의 발현 및 상기 목적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 조절(증가 또는 감소)할 수 있으며, 나아가 목적 유전자 이외의 다른 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
일 예로, 상기 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 178번째 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 치환할 경우, 비치환된(비변형된) 프로모터 서열보다 약화 또는 강화된 활성을 갖는 프로모터를 제공할 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 268번째 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 치환할 경우, 비치환된(비변형된) 프로모터 서열보다 약화 또는 강화된 활성을 갖는 프로모터를 제공할 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 물질, 구체적으로, L-아미노산, 더욱 구체적으로, L-라이신의 생산, 또는 생산량을 증가시키는 데 관여하는 폴리뉴클레오티드 일 수 있다.
상기와 같은 NCgl0859 유전자 또는 NCgl1416 유전자의 프로모터 변이에 의한 L-아미노산, 더욱 구체적으로, L-라이신 생성량 증가 효과는 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.
이때, 상기 용어, "L-라이신(L-lysine)"은 염기성 α-아미노산의 하나로 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산이다. 상기 L-라이신은 이에 제한되지는 않으나, 사료 또는 사료 첨가제, 또는 식품, 식품 첨가제, 의약품 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.
일 구현예로, 본 출원에서 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열 중 1 이상 또는 2 이상을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 2 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열 중 1 이상 또는 2 이상으로 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한 전술한 구현예에 제한되지 않고, 프로모터 활성을 크게 감소시키지 않는 범위에서 폴리뉴클레오티드 서열에 다양한 변형도 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 뉴클레오티드 서열은 종래 알려진 돌연변이 유발법, 예를 들어 방향성 진화법(direct evolution) 및 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)등에 의하여 변형될 수 있다.
이때, 상기 용어 "변이"는 유전적 또는 비유전적으로 안정적인 표현형적 변화를 의미하며, 본 명세서에서 "변형" 또는 "돌연변이"와 혼용되어 명명될 수 있다.
따라서, 본 출원에서 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 1, 내지 서열번호 4, 또는 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4와 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상동성 또는 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 상기 범주 중 100% 동일성을 갖는 서열은 제외되거나, 100% 미만의 동일성을 갖는 서열일 수 있다.
한편 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드', '특정 서열번호로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드' 라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다.
예를 들어, 상기 폴리뉴클레오티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열 내부나 말단에 무의미한 서열이 부가되거나 혹은 해당 서열번호의 뉴클레오티드 서열 내부나 말단의 일부 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
상동성(homology) 및 동일성(identity)은 두 개의 주어진 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다.(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들어 전술한 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하고 동일한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 프로모터로서 이용될 수 있다.
상기 프로모터는 mRNA로의 전사 개시부위의 5' 부위에 위치할 수 있다.
상기 프로모터는 종래의 프로모터에 비하여 증가 또는 감소된 프로모터 활성을 가질 수 있다. 즉, 숙주 세포에서 목적 유전자의 발현뿐만 아니라 목적 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 및/또는 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 본 출원의 목적상, 생산하고자 하는 산물에 따라 발현 강화 또는 약화를 위한 목적 유전자가 변경될 수 있고, 상기 프로모터는 목적 유전자의 강화 또는 약화를 위한 범용적 프로모터로서 사용될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 하기 (a') 및 (b')로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현 카세트를 포함하는, 숙주세포를 제공한다.
(a') 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 178번째 뉴클레오티드가 C로 치환된 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드 및 제 1 목적 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트;
(b') 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 268번째 뉴클레오티드가 G로 치환된 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드 및 제 2 목적 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트.
상기 폴리뉴클레오티드 등은 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 하나 이상은 1 이상 또는 2 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 숙주세포는 상기 (a') 및 (b')로 구성되는 군에서 선택되는 1 이상 또는 2 이상의 유전자 발현 카세트를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 출원의 숙주세포는 상기 (a') 및 (b')의 유전자 발현 카세트를 포함하는 숙주세포도 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "유전자 발현 카세트"란, 프로모터와 목적 유전자를 포함하고 있어서, 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 이와 같은 유전자 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 상기 목적 유전자의 효율적인 발현을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다. 상기 유전자 발현 카세트는 통상 상기 목적 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter) 외에 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 "목적 유전자"는, 본 출원의 목적상 본 출원의 프로모터 서열에 의해 발현을 조절하고자 하는 유전자를 의미한다. 상기 목적 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 "목적 단백질"로 표현할 수 있고, 상기 "목적 단백질"을 코딩하는 유전자는 "목적 유전자"로 표현할 수 있다.
또한, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
특히, 상기에서 서열번호 2 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진다는 표현은 해당 폴리뉴클레오티드를 프로모터로서 목적 유전자에 연결하여 사용할 때, 제한효소 사용과 같이 목적 유전자에 연결하는 과정 중에 발생할 수 있는 뉴클레오티드의 추가, 및/또는 삭제, 및/또는 변이 등의 경우를 배제하지 않는다.
또한, 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화되어 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 유전 물질을 보유하는 인위적 DNA 분자로서, 구체적으로, 이에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 제조물을 의미한다.
본 출원에서 용어 "작동 가능하게 연결된"(operatively linked)은 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 목적 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록 상기 유전자 서열과 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 발현 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.
예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.또한, 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
본 출원의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태 또는 이를 포함하는 벡터의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다.
상기 형질전환하는 방법은 상기 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 세포 내로 도입하는 모든 방법을 포함하며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 숙주세포는 본 출원의 1 이상 또는 2 이상의 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 및 목적 유전자를 포함하는 1 이상 또는 2 이상의 유전자 발현 카세트 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 숙주세포는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어 "미생물"은 야생형 미생물이나, 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물을 모두 포함하는 개념이다. 본 출원에서 미생물은 상기 본 출원의 폴리뉴클레오티드가 도입되거나 포함되는 미생물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원에서, 상기 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 구체적으로 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 형질전환에 의해 상기 미생물에 도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물은, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 예를 들어 목적 단백질을 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 목적 단백질을 포함하여 목적산물을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다.
본 출원에서 용어, "목적 단백질 또는 목적산물을 생산하는 미생물"은 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 목적상 상기 목적 단백질 또는 목적산물을 생산하는 미생물은 상기 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 목적 단백질 또는 목적 산물 생산능이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 목적 단백질 또는 목적산물을 생산하는 미생물, 또는 목적 단백질 또는 목적산물 생산능을 갖는 미생물은, 목적 단백질 또는 목적산물 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, 목적 단백질 또는 목적산물 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물 일 수 있다.
본 출원의 목적상, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물은 L-아미노산, 구체적으로, L-라이신의 생성량이 증가된 것일 수 있다.
본 출원에서 상기 미생물은 본 출원의 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 도입되어 프로모터로 작동할 수 있는 미생물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 또는 코리네박테리움 플라붐(Corynebacterium flavum)일 수 있고, 가장 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 상기 숙주세포를 배지에서 배양하는 단계 및 상기의 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드, 유전자 발현 카세트, 숙주세포, 목적 물질 등은 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원에서, 상기 목적 물질은 아미노산일 수 있다. 구체적으로, 상기 아미노산은 다른 언급이 없는 한 L-형태의 아미노산일 수 있으며, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 트레오닌, 세린, 시스테인, 글루타민, 메치오닌, 아스파라트산, 아스파라긴, 글루탐산, 라이신, 알지닌, 히스티딘, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 프롤린, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더욱 구체적으로, 상기 아미노산은 L-라이신 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 이용하여 목적 물질을 생산하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981).
배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
상기 미생물의 배양 중 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다.
배양물(배지)의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 시간은 원하는 목적 물질의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 구체적으로는 10 내지 160시간일 수 있다.
배양물(배지)로부터의 목적 물질의 회수는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리되어 회수될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 프로모터로서의 용도를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드에 대해서는 전술한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1: 신규 프로모터 서열을 포함하는 미생물의 L-라이신 생산능 평가
실시예 1-1: 신규 프로모터 서열을 포함하는 재조합 벡터 제작
먼저, 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 야생형(wild type) 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 NCgl0859의 프로모터 부위를 포함하는 염기서열(서열번호 1)을 확보하였다. 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 178번에 상응하는 뉴클레오티드가 T에서 C로 치환된 프로모터 변이체(PNCgl0859(t178c); 서열번호 2)가 L-라이신 생산에 미치는 영향을 확인하고자 이의 발현 균주 제작을 위한 벡터를 코리네박테리움 염색체 내 유전자의 삽입 및 교체를 위한 플라스미드 pDCM2(대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)를 이용하여 제작하였다.
구체적으로, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 gDNA(genomic DNA)를 주형으로 서열번호 5 및 6의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 7 및 8의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 상기에서 얻어진 두 단편의 혼합물을 주형으로 서열번호 5 및 서열번호 8의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 다시 오버랩핑(overlapping) PCR을 수행하여 단편을 수득하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃ 에서 1분 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다. pDCM2 플라스미드는 SmaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 벡터를 pDCM2-PNCgl0859(t178c)라 명명하였다. 상기의 벡터 제작을 위해 사용된 프라이머 서열 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 프라이머 명 5' 서열 3'
5 PNCgl0859_1F TGAATTCGAGCTCGGTACCCCCACCGCCTTCACACCG
6 PNCgl0859_2R GATCGAAAAGAATCAGgGCTTGTGACGATTATC
7 PNCgl0859_3F GATAATCGTCACAAGCcCTGATTCTTTTCGATC
8 PNCgl0859_4R GTCGACTCTAGAGGATCCCCGCAGTACATAGATCGGGG
실시예 1-2: 신규 프로모터 서열을 포함하는 미생물의 L-라이신 생산능 평가
1-2-1: PNCgl0859 변이체 발현 균주 제작
상기 실시예 1-1을 통해 제작한 유전자 치환 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(US 9556463 B2) 균주에 도입하여, 변이가 도입된 L-라이신 생산 균주 " CJ3P_PNCgl0859(t178c)"를 제작하였다.
구체적으로, 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol., 1999, 52: 541-545)으로 형질 전환 한 후, 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주를 카나마이신(kanamycin) 25 mg/L를 함유한 한천 영양배지에서 선별하였다. 선별한 1차 균주를 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 타겟 변이가 도입된 균주를 선별하였다. 최종 형질전환된 균주의 변이(치환) 여부는 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후 시퀀싱을 통해 확인하였다. 상기의 PNCgl0859 변이체 발현 균주 제작을 위해 사용된 프라이머 서열 정보는 하기 표 2에 나타내었다.
서열번호 프라이머 명 5' 서열 3'
9 PNCgl0859_5F CCGGCTTGAGCAGTTCG
10 PNCgl0859_6R GCGACGAAGGATCCTGG
1-2-2: PNCgl0859 변이체 발현 균주의 L-라이신 생산능 비교
상기 실시예 1-2-1에서 제작된 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-라이신 생산능을 분석하였다.
먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주를 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 이때, 종배지와 생산배지 조성은 다음과 같다.
종배지 (pH 7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g, 바이오틴 0.1 mg, 티아민 HCl 1 mg, 칼슘-판토텐산 2 mg, 니코틴아미드 2 mg (증류수 1 리터 기준)
생산배지 (pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
배양 종료 후, HPLC를 이용한 방법을 통해 L-라이신의 생산능을 측정하였으며, 각 균주에 대한 배양액 중의 라이신 농도 및 농도 증가율은 하기 표 3에 나타내었다.
균주명 L-라이신 농도 (g/L) 라이신 농도 증가율 (%)
CJ3P 8.03 -
CJ3P_PNCgl0859(t178c) 9.84 22.5
표 3에 나타낸 바와 같이, 변이가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P_PNCgl0859(t178c) 균주가 생산한 L-라이신의 농도는, 변이가 도입되지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P 균주가 생산한 L-라이신 농도 대비 22.5% 증가함을 확인하였다.
즉, 상기 변이는 미생물의 L-라이신 생성능을 현저하게 증가시킨다는 것을 확인하였다.
실시예 2: 신규 프로모터 서열을 포함하는 미생물의 L-라이신 생산능 평가
실시예 2-1: 신규 프로모터 서열을 포함하는 재조합 벡터 제작
먼저, 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 야생형(wild type) 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 NCgl1416의 프로모터 부위를 포함하는 염기서열(서열번호 3)을 확보하였다. 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드의 268번에 상응하는 뉴클레오티드가 A에서 G로 치환된 프로모터 변이체가 (PNCgl1416(a268g); 서열번호 4)가 L-라이신 생산에 미치는 영향을 확인하고자 이의 발현 균주 제작을 위한 벡터를 코리네박테리움 염색체 내 유전자의 삽입 및 교체를 위한 플라스미드 pDCM2(대한민국 공개번호 제 10-2020-0136813호)를 이용하여 제작하였다.
구체적으로, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 gDNA(genomic DNA)를 주형으로 서열번호 11 및 12의 서열의 프라이머 쌍과 서열번호 13 및 14의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. 상기에서 얻어진 두 단편의 혼합물을 주형으로 서열번호 11 및 서열번호 14의 서열의 프라이머 쌍을 이용하여 다시 오버랩핑(overlapping) PCR을 수행하여 단편을 수득하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃ 에서 1분 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 수행하였다. pDCM2 플라스미드는 SmaI을 처리하고 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다. 결과로 얻은 벡터를 pDCM2-PNCgl1416(a268g)라 명명하였다. 상기의 벡터 제작을 위해 사용된 프라이머 서열 정보는 하기 표 4에 나타내었다.
서열번호 프라이머 명 5' 서열 3'
11 PNCgl1416_1F TGAATTCGAGCTCGGTACCCCCAGTTGCCAAGGTTGGC
12 PNCgl1416_2R CACCTTGTCCGCCGCTcGAGAATTTTCCTCCGG
13 PNCgl1416_3F CCGGAGGAAAATTCTCgAGCGGCGGACAAGGTG
14 PNCgl1416_4R GTCGACTCTAGAGGATCCCCGTTGAGAGCCCAGCCGG
실시예 2-2: 신규 프로모터 서열을 포함하는 미생물의 L-라이신 생산능 평가
2-2-1: PNCgl1416 변이체 발현 균주 제작
상기 실시예 2-1을 통해 제작한 유전자 치환 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(US 9556463 B2) 균주에 도입하여, 변이가 도입된 L-라이신 생산 균주 " CJ3P_PNCgl1416(a268g)"를 제작하였다.
구체적으로, 전기천공법(Appl. Microbiol.Biotechnol., 1999, 52: 541-545)으로 형질 전환 한 후, 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주를 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 한천 영양배지에서 선별하였다. 선별한 1차 균주를 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 타겟 변이가 도입된 균주를 선별하였다. 최종 형질전환된 균주의 변이(치환) 여부는 서열번호 15 및 16의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후 시퀀싱을 통해 확인하였다. 상기의 PNCgl1416 변이체 발현 균주 제작을 위해 사용된 프라이머 서열 정보는 하기 표 5에 나타내었다.
서열번호 프라이머 명 5' 서열 3'
15 PNCgl1416_5F CAGGATGGGGAAGTTGTC
16 PNCgl1416_6R GACCACTGTACGCGAGG
2-2-2: PNCgl1416 변이체 발현 균주의 L-라이신 생산능 비교
상기 실시예 2-2-1에서 제작된 균주 및 대조군 모균주의 플라스크 발효역가 평가를 통해 L-라이신 생산능을 분석하였다.
먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주를 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 이때, 종배지와 생산배지 조성은 다음과 같다.
종배지 (pH 7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g, 바이오틴 0.1 mg, 티아민 HCl 1 mg, 칼슘-판토텐산 2 mg, 니코틴아미드 2 mg (증류수 1 리터 기준)
생산배지 (pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
배양 종료 후, HPLC를 이용한 방법을 통해 L-라이신의 생산능을 측정하였으며, 각 균주에 대한 배양액 중의 라이신 농도 및 농도 증가율은 하기 표 6에 나타내었다.
균주명 L-라이신 농도 (g/L) 라이신 농도 증가율 (%)
CJ3P 7.87 -
CJ3P_PNCgl1416(a268g) 9.43 19.8
표 6에 나타낸 바와 같이, 변이가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P_PNCgl1416(a268g) 균주가 생산한 L-라이신의 농도는, 변이가 도입되지 않은 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P 균주가 생산한 L-라이신 농도 대비 19.8% 증가함을 확인하였다. 즉, 상기 변이는 미생물의 L-라이신 생성능을 현저하게 증가시킨다는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주세포:
    (a) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 178번째 뉴클레오티드가 C로 치환된 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 268번째 뉴클레오티드가 G로 치환된 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 상기 (a) 및 (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 코리네박테리움 속 미생물인, 숙주세포.
  4. 하기 (a') 및 (b')로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 발현 카세트를 포함하는, 숙주세포:
    (a') 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 178번째 뉴클레오티드가 C로 치환된 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드 및 제 1 목적 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트;
    (b') 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 268번째 뉴클레오티드가 G로 치환된 프로모터 활성을 가지는 폴리뉴클레오티드 및 제 2 목적 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 숙주세포는 상기 (a') 및 (b')의 유전자 발현 카세트를 포함하는, 숙주세포.
  6. 제4항에 있어서, 상기 숙주세포는 코리네박테리움 속 미생물인, 숙주세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 숙주세포를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기의 배지에서 목적 물질을 회수하는 단계;를 포함하는, 목적 물질을 생산하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 목적 물질은 아미노산인, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 목적 물질은 L-라이신인, 방법.
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