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WO2022255774A1 - 아실카르니틴 대사체를 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물 - Google Patents

아실카르니틴 대사체를 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물 Download PDF

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Publication number
WO2022255774A1
WO2022255774A1 PCT/KR2022/007731 KR2022007731W WO2022255774A1 WO 2022255774 A1 WO2022255774 A1 WO 2022255774A1 KR 2022007731 W KR2022007731 W KR 2022007731W WO 2022255774 A1 WO2022255774 A1 WO 2022255774A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oral cancer
metabolite
metabolites
acyl carnitine
level
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/007731
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김미경
최성원
황금숙
정영애
Original Assignee
국립암센터
한국기초과학지원연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 국립암센터, 한국기초과학지원연구원 filed Critical 국립암센터
Priority to US18/566,404 priority Critical patent/US20240255512A1/en
Priority to JP2023574490A priority patent/JP2024521217A/ja
Priority to EP22816433.1A priority patent/EP4339616A1/en
Publication of WO2022255774A1 publication Critical patent/WO2022255774A1/ko

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials

Definitions

  • the present disclosure relates to a biomarker for diagnosing oral cancer using metabolome profiling, and more particularly, to a biomarker composition containing an acyl carnitine metabolite whose amount changes when oral cancer occurs, and a method for diagnosing oral cancer using the same. it's about
  • Oral cancer is one of the most common malignancies worldwide. According to World Health Organization GLOBOCAN data, 378,000 patients with oral cancer occurred worldwide in 2020, and it is predicted to be 553,000 in 2040. predicted to be More than 90% of the most common type of oral cancer is oral squamous cell carcinoma (OSCC). The overall 5-year survival rate is about 56% for oral cancer, which is a carcinoma with a low survival rate.
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • Metabolomics which is the latest technological field following genomics, transcriptomics, and proteomics, is one of the fields of biology that comprehensively analyzes and studies metabolites and metabolic circuits in cells. It is an important field of research to identify markers and elucidate metabolic mechanisms. Metabolomics involves the identification, profiling, and quantification of metabolites, which are end products of biological processes that play a key role in linking genotype and phenotype. In particular, in the field of cancer research, it is expected to find cancer metabolomes that change during carcinogenesis, identify how changes in metabolomes contribute to specific genes or mechanisms, and furthermore, be used as an important strategy for cancer treatment using metabolites.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • MS mass spectrometry
  • the present inventors performed UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS-based target-off-target metabolome profiling from oral cancer patients and controls, and found that acyl carnitine metabolites were useful as metabolic signals to identify oral cancer. confirmed that it can be used.
  • An object of the present disclosure is to include a biomarker composition for oral cancer diagnosis comprising an acyl carnitine metabolite as an active ingredient, and an agent capable of measuring the level of the acyl carnitine metabolite as an active ingredient.
  • a kit for diagnosing oral cancer including the composition for diagnosing oral cancer, and a method for providing information for diagnosing oral cancer.
  • the present disclosure provides a biomarker composition for diagnosing oral cancer comprising an acyl carnitine metabolite as an active ingredient.
  • the acyl carnitine metabolite may be at least one selected from the group consisting of decanoylcarnitine, octanoylcarnitine and hexanoylcarnitine.
  • the biomarker composition for diagnosing oral cancer further contains at least one metabolite selected from the group consisting of glycerophosphorylcholine, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and triglyceride can include
  • compositions for diagnosing oral cancer comprising, as an active ingredient, an agent capable of measuring the level of an acyl carnitine metabolite.
  • kits for diagnosing oral cancer including the composition for diagnosing oral cancer.
  • the present disclosure includes the steps of (a) measuring the level of an acyl carnitine metabolite from a sample isolated from an oral cancer patient; (b) comparing the level of the acyl carnitine metabolite with that of a control sample; and (c) determining that oral cancer is present when the level of an acyl carnitine metabolite from a sample isolated from an oral cancer patient is lower than that of a control sample.
  • Level of at least one metabolite selected from the group consisting of glycerophosphorylcholine, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and triglyceride in the step (a) (level) can be further measured.
  • the separated sample may be at least one selected from the liquid biopsy group consisting of saliva, whole blood, serum and plasma.
  • the present disclosure provides a (marker) composition for detecting and/or diagnosing oral cancer and a method for preparing the same; kits for detecting and/or diagnosing oral cancer and methods for manufacturing the same; devices for detecting and/or diagnosing oral cancer and methods for manufacturing the same; And in an information providing method for detecting and/or diagnosing oral cancer, use of the acyl carnitine metabolite(s) is provided.
  • the present disclosure enables early diagnosis of oral cancer, which was difficult to diagnose due to conventional tissue biopsy, and can reduce pain and risk of patients by using a liquid biopsy method in which blood is collected and analyzed.
  • Figure 1 shows the results of pathway analysis in The Cancer Genome Atlas (TCGA) using RNAseq data for the oral cancer patient group and control group.
  • Figure 2 shows a heat map and hierarchical clusters with Wald distance analysis for 10 metabolites for a targeted metabolome profiling approach.
  • Figure 3 shows the results of random forest using 5-fold cross validation in target metabolome profiling.
  • a is the confusion matrix of the random forest for the training set
  • b is the grid search result to find the optimal parameters in the random forest
  • the highest accuracy point is the number of variables available for splitting at each tree node (mtry): 4
  • c is the confusion matrix of the random forest for the test set
  • d is the top 4 metabolites using the random forest in the test set.
  • 4A to 4O are four metabolites (a-d), two metabolites (e-j), three metabolites (k-n), and four metabolites (o) respectively identified in the validation data set for the metabolite panel. Sensitivity and specificity and AUC values are shown.
  • Figure 5a shows a PCA score plot obtained from the UHPLC ESI Q TOF MS/MS spectrum of plasma lipids in positive mode and Figure 5b in negative mode.
  • Figure 6 shows the random forest results using 5-fold cross-validation in lipid metabolite profiling: a is the confusion matrix of the random forest for the training set; b is the grid search result for finding the optimal parameters in the Random Forest, the highest accuracy point is the number of variables available for splitting at each tree node (mtry): 4, the number of trees to grow (ntree): 240 ; c is the confusion matrix of the Random Forest for the test set; d is the top 3 metabolites using Random Forest in the test set.
  • the present disclosure performs UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS-based target-off-target metabolomic profiling from oral cancer patients and controls, and acyl carnitine metabolites can be considered as metabolic signals to identify oral cancer. confirmed that it can.
  • metabolite in the present invention refers to a metabolite obtained from a biological sample
  • the biological sample from which the metabolite can be obtained may be saliva, whole blood, plasma, serum, or platelets, preferably plasma.
  • the metabolites may include substances produced by metabolism and metabolic processes or substances generated by chemical metabolism by biological enzymes and molecules.
  • diagnosis in the present invention refers to determining the susceptibility of a subject to a specific disease or disorder, determining whether an object currently has a specific disease or disorder, or suffering from a specific disease or disorder determining the prognosis of a subject, or monitoring the condition of a subject to provide information about therametrics, eg, treatment efficacy.
  • the present disclosure provides a biomarker composition for diagnosing oral cancer comprising an acyl carnitine metabolite as an active ingredient.
  • the present disclosure in one embodiment, (a) UHPLC-ESI-Q-TOF-MS / MS-based data extraction step of samples of oral cancer patient group and samples of the control group; (b) converting the UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS analysis results into numerical values that can be processed; and (c) statistically verifying the difference between the two samples using the converted values, thereby diagnosing oral cancer.
  • step (b) Divide the total analysis time by unit time intervals in step (b), set the largest value among the areas or heights of chromatogram peaks appearing during unit time as the representative value, and compare metabolite profiling differences in step (c) For this purpose, machine learning analysis was performed, and through 5-fold cross-validation, metabolites showing significant differences between the two samples were selected as biomarkers, analyzed and verified.
  • cross-validation is a method of evaluating models in statistics, in which the data is partitioned such that the entire data is used as a test set at least once, and the best parameters are found for each parameter to determine accuracy and accuracy. Find performance values with increased reliability.
  • the performance value in the present disclosure is AUC (Area Under the Curve), and the higher the AUC value, the higher the ability to distinguish between positive and negative oral cancer.
  • metabolites with an AUC value of 0.8 or more were classified as biomarkers for oral cancer diagnosis, specifically including acyl carnitine metabolites, preferably decanoylcarnitine and octanoyl. It includes at least one metabolite selected from the group consisting of octanoylcarnitine and hexanoylcarnitine.
  • the acyl carnitine plays a role in transporting fatty acids into mitochondria in fatty acid beta-oxidation, and two fatty acids analyzed in lipid metabolism profiling, that is, polyunsaturated fatty acids (PUFAs) arachidonic acid and eico Sapentaenoic acid (eicosapentaenoic acid) was verified as a reliable biomarker as a result of showing a reduced amount in the oral cancer patient group.
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • eico Sapentaenoic acid eicosapentaenoic acid
  • biomarker composition further reduces one or more metabolites selected from the group consisting of glycerophosphorylcholine, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and triglyceride.
  • metabolites selected from the group consisting of glycerophosphorylcholine, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid and triglyceride.
  • the present disclosure provides a composition for diagnosing oral cancer comprising, as an active ingredient, an agent capable of measuring the level of an acyl carnitine metabolite.
  • the term "level” is used interchangeably to refer to a measurement made using any analytical method for detecting a biomarker in a biological sample, and the level corresponding to the biomarker in the biological sample. It indicates the presence, absence, absolute amount or concentration, relative amount or concentration, titer, level, expression level, ratio of measured levels, etc., and the precise characteristics of the level are used to detect biomarkers. is dependent on the particular design and components of the particular analytical method used.
  • the term "agent” refers to an agent for quantitatively detecting a metabolite from a biological sample, and the agent is not particularly limited.
  • the agent may be a primer, probe, aptamer, small molecule compound, protein, ligand or antibody capable of complementary binding that interacts with the metabolite to generate a signal.
  • the present disclosure provides a kit for diagnosing oral cancer including the composition for diagnosing oral cancer.
  • the kit essentially includes a composition for diagnosing oral cancer including an agent capable of measuring the level of an acyl carnitine metabolite as an active ingredient, and capable of quantifying the agent. It may further include a factor or metering device.
  • a kit according to the present disclosure may be a simple diagnostic kit or a PCR-based diagnostic kit.
  • Components capable of quantifying the agent may include, but are not limited to, probes, fluorophores, chromophores, radionuclides, etc. commonly used in the field of diagnostic kits.
  • the quantitative device is for measuring the level of each metabolite and may be at least one selected from the group consisting of nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), chromatography, and mass spectrometry.
  • NMR nuclear magnetic resonance spectroscopy
  • chromatography chromatography
  • mass spectrometry mass spectrometry
  • the present disclosure provides (a) measuring the level of an acyl carnitine metabolite from a sample isolated from an oral cancer patient; (b) comparing the level of the acyl carnitine metabolite with that of a control sample; and (c) determining that oral cancer is present when the level of an acyl carnitine metabolite from a sample isolated from an oral cancer patient is lower than that of a control sample.
  • the separated sample may be selected from a liquid biopsy group such as saliva, whole blood, serum, and plasma, and in step (a), glycerophosphorylcholine, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid (The level of one or more metabolites selected from the group consisting of eicosapentaenoic acid and triglyceride may be further measured.
  • a liquid biopsy group such as saliva, whole blood, serum, and plasma
  • step (a) glycerophosphorylcholine, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid
  • the level of one or more metabolites selected from the group consisting of eicosapentaenoic acid and triglyceride may be further measured.
  • the discovery data set consisted of 182 oral cancer patients who had visited the National Cancer Center screening center and outpatient clinic since 2018, and 364 healthy people who were diagnosed as cancer-free at the time of enrollment by matching sex and age.
  • the oral cancer patient group was those who had histologically diagnosed oral cancer in one of the tongue, submandibular gland, upper gum, lower gum, maxillary sinus, buccal mucosa, posterior deltoid muscle, hard palate, soft palate, floor of the mouth, and lower lip. Healthy control group All children under the age of 19 were excluded.
  • the validation data set included 52 oral cancer patients who had visited Seoul National University Hospital and 52 healthy controls during the same period at the National Cancer Center, which constituted the discovery data set by matching their sexes.
  • Blood samples which are samples, were stored frozen immediately after collection, and plasma was separated for 20 minutes using 3000 rpm centrifugation at 4 ° C and stored at -80 ° C for further analysis.
  • Plasma specimens (50 ⁇ L) to be used for semi-target profiling were extracted with 500 ⁇ L chloroform:methanol (2:1, v/v) solution and 100 ⁇ L water, dried in a vacuum, and then stirred at 3000 rpm for 20 minutes. It was centrifuged and used by injecting 1 ⁇ L each.
  • Plasma samples (20 ⁇ L) to be used for target profiling were extracted with 30 ⁇ L of water and 150 ⁇ L of acetonitrile, followed by protein precipitation for 1 hour and centrifugation at 4500 g for 10 minutes at 4°C. The aqueous supernatant was transferred to a new 1.5 ml tube and each metabolite internal standard was added by dilution factor to 75% ACN.
  • Plasma samples (20 ⁇ L) to be used for lipid profiling were extracted using 30 ⁇ L of water, 250 ⁇ L of AVANTISSLASH LIPIDOMIX and isopropyl alcohol (1:49, v/v) solution, mixed for 10 minutes, and complete protein It was left for 2 hours for precipitation and then centrifuged at 4500g for 10 minutes at 4°C.
  • Anti-target and target profiling performed using an ACQUITY UPC coupled with a Xevo TQ XS system (Waters, Milford, Mass.) equipped with electrospray (ESI). Polar metabolites were separated with a Shuherzo SM-C18 column (2 mm x 100 mm, 3 ⁇ m; Imtakt, Kyoto, Japan) at 0.2 mL/min for 20 minutes.
  • Mobile phase A consisted of 0.1% formic acid in water and mobile phase B consisted of 0.1% formic acid in methanol.
  • the retention time of the compound, internal standard concentration, etc. were quantified by multi-component simultaneous analysis monitoring (dMRM), and QC samples were analyzed every 5 samples before sample acquisition to monitor the stability and reproducibility of the analysis system. .
  • dMRM multi-component simultaneous analysis monitoring
  • Table 2 shows retention times and multiple response monitoring transitions for selected metabolites in semi-target profiling. Considering the ionic transition value and retention time reproducibility, the selected reactions of decanoylcarnitine, hexanoylcarnitine and octanoylcarnitine can be confirmed.
  • Multivariate statistical analysis was performed using SIMCA-P+ version 12.0 (Umetrics, Ume, Sweden). PCA was applied for lipid profiling, and the UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS data set was expanded to unit variance before performing PCA.
  • Model validity was evaluated in model parameters that provide information on the interpretability and predictability of the model, respectively. Differences between groups were compared using the Kruskal-Wallis test for continuous variables and the chi-square test for categorical variables.
  • Metabolites obtained from global profiling were derived by machine learning analysis including minimum absolute contraction and selection operator (LASSO) and random forest (RF) methods.
  • LASSO minimum absolute contraction and selection operator
  • RF random forest
  • the discovery data set was divided into a training set (146 oral cancer cases and 292 control groups) and a test set (36 oral cancer cases and 72 control groups).
  • the training set was used to build an optimistic model for metabolite selection, and the test set was used to validate the model. Results generated from both algorithms were combined to select metabolites for further analysis.
  • the area under the curve (AUC) of the receiver operating characteristic (ROC) curve was calculated to test the predictive ability of selected metabolites. All statistical tests were two-tailed, and significance was set at p > 0.05. All other statistical analyzes and visualizations were performed using the R platform's ggplot2 package.
  • a total of 82 metabolites were detected in plasma samples using UHPLC-ESIQ-TOF-MS/MS, and to identify names, all metabolites were identified in terms of exact mass values of electrons and fragment ions and retention times in the online database. Compared to the standard reference. As a result, 48 metabolites were selected for the additional selection process, and a training set and a test set were constructed to select the best variable for distinguishing the oral cancer patient group from the control group. As a result of product and random forest (RF), 5 metabolites were derived. The training set and test set accuracies for these results were 98.81%, 94.30%, 94.44%, and 93.52%, respectively.
  • the predictive performance for oral cancer was tested by calculating the area under the curve (AUC) in the receiver operating characteristic (ROC) curve for the eight metabolites that combined the results of LASSO and RF.
  • AUC area under the curve
  • ROC receiver operating characteristic
  • Figure 3A is the confusion matrix of the random forest for the training set
  • Figure 3B is the grid search result for finding the optimal parameters in the random forest.
  • the highest accuracy point is that the number of variables available for splitting at each tree node (mtry) is 4, and the number of trees to grow (ntree) is 360. In the test set, the top 4 metabolites using Random Forest can be identified.
  • the AUC values of the top 4 metabolites in the validation data set were greater than 0.8, and as shown in Fig. 4o, the 4 metabolite panel had a sensitivity of 0.9744 and a specificity of 0.8478. It can be confirmed that it shows a high oral cancer identification index with an AUC of 0.9666.
  • FIG. 5 a PCA (principal component analysis) plot in which a pattern between the oral cancer patient group and the control group is clearly distinguished can be seen.
  • Lipidomics Fold change (Case/Control) adjusted P-value train AUC test AUC Conditional logistic regression OR P-value FDR FFA 20:4 0.9011 0.0000 0.8547 0.8990 0.1630 0.0000 0.0000 FFA 20:5 0.8800 0.0000 0.7946 0.7351 0.2150 0.0000 0.0000 TG 60:13 0.9578 0.0000 0.7697 0.7270 0.3060 0.0000 0.0000 FFA 18:2 0.9773 0.0000 0.6772 0.7633 0.4950 0.0000 0.0000 LysoPC 18:0 0.9846 0.0000 0.7036 0.6214 0.3690 0.0000 0.0000 PC 40:7 0.9723 0.0000 0.6587 0.5602 0.4050 0.0000 0.0000 LysoPC 16:1 0.9929 0.0000 0.6804 0.5884 0.4330 0.0000 0.0000 TG 44:2 1.0092 0.0000 0.6492 0.6663 2.0520 0.0000 0.0000 FFA 20:2 0.9557 0.0000
  • Figure 6 shows the random forest results using 5-fold cross-validation
  • Figure 6a is the confusion matrix of the random forest for the training set
  • Figure 6b is the grid search results for finding the optimal parameters in the random forest.
  • the highest accuracy point is that the number of variables available for splitting at each tree node (mtry) is 14 and the number of trees to grow (ntree) is 240.
  • the top 3 lipid metabolites using Random Forest can be identified.
  • the acylcarnitine metabolite according to the present disclosure has usefulness as a cancer diagnostic marker with excellent ability to discriminate oral cancer patients, and can be regarded as a metabolic signal in oral cancer, as well as being non-invasive in oral cancer. Since its potential as an early diagnostic marker using a sample has been demonstrated, it has useful value as a composition for diagnosing oral cancer, a diagnostic kit, and a method for providing detection/diagnosis information related to oral cancer.

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Abstract

본 개시는 대사체 프로파일링을 이용한 구강암 진단용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구강암 발생 시 그 양이 변화하는 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 포함하는 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 구강암 진단방법에 관한 것이다. 본 개시는 종래 조직생검이 불가능하여 진단이 용이하지 않았던 구강암의 조기진단을 가능하게 하며, 혈액을 수집하여 분석하는 액체생검 방법을 이용하기 때문에 환자의 고통과 위험부담을 감소시킬 수 있다.

Description

아실카르니틴 대사체를 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 6월 1일에 출원된 한국 특허출원 제2021-0070830호에 대한 우선권 이익을 주장하며, 상기 특허출원의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.
본 개시는 대사체 프로파일링을 이용한 구강암 진단용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구강암 발생 시 그 양이 변화하는 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 포함하는 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 구강암 진단방법에 관한 것이다.
구강암은 전 세계적으로 가장 흔한 악성 종양 중 하나다. 세계보건기구 GLOBOCAN 자료에 의하면, 전 세계적으로 2020년에 37.8만명의 구강암 환자가 발생하였고, 2040년에는 55.3만명으로 예측되며, 구강암 사망자는 2020년에 17.8만명이었고, 2040년에는 26.3만명으로 증가할 것으로 예측된다. 가장 흔한 구강암 유형은 90% 이상이 구강 편평세포암(oral sqamous cell carcinoma, OSCC)이다. 전체 5년 생존율은 구강암의 경우 약 56%로 낮은 생존율의 암종에 속한다. 치료 및 재건 방법에 연구자마다 다양한 결과를 발표하고 있으며, 지금까지 진단과 치료의 방법에 많은 발전이 있었음에도 불구하고 수십 년간 구강 및 구인두암의 생존율이 여전히 향상되지 못하고 있다.
구강암 초기 단계에서는 종종 무증상이고 특이적인 진단방법이 거의 없기 때문에 초기에 구강암을 발견하는 것은 상당히 어렵다. 대부분의 구강암이 많이 진행된 단계에서 진단됨으로 인해 생존율이 낮아지고 예후가 좋지 않게 된다. 따라서 구강암을 가능한 초기단계에서 진단할 수 있는 비침습적이고 매우 민감한 바이오마커를 찾아 진단에 활용하는 것은 매우 중요하다.
최근 유전체학, 전사체학, 단백질체학에 이은 최신 기술분야인 대사체학은 세포내의 대사물질과 대사회로를 총체적으로 분석 연구하는 생물학의 분야 가운데 하나로 생체내 대사과정을 연구하고, 대사적 특징과 관련된 중요한 생체 표지자를 동정하며, 대사적 메커니즘을 밝히는 중요한 연구 분야이다. 대사체학은 유전자형과 표현형을 연결하는 데 중요한 역할을 하는 생물학적 과정의 최종 산물인 대사산물의 식별, 프로파일링 및 정량화를 포함한다. 특히 암연구 분야에서는 발암 과정에서 변화되는 암 대사체를 찾아내고 대사체의 변화가 특정　유전자나 기전에 어떻게 기여하는지를 규명하고 나아가 대사항암제를 이용한 암치료의 전략에도 중요하게 사용될 것으로 기대된다.
생체 시스템에서 대사산물을 포괄적으로 분석하고 정량화하는데 사용되는 가장 일반적인 대사체 분석 플랫폼은 크로마토그래피와 결합된 핵자기공명 (NMR) 분광법 또는 질량분석법 (MS)이다. 이러한 플랫폼을 기반으로 한 대사체학 분석기법은 유방암, 결장 직장암, 폐암, 전립선암, 간세포암종과 같은 다양한 암의 진단 및 병인 검사를 위한 바이오마커 식별에 효과적이고 광범위하게 활용되고 있다.
구강암과 관련하여 여러 연구 보고가 있기는 하지만, 신뢰도가 높고 임상적으로 검증된 연구는 드물다. 이러한 이유로 대사산물이 구강암의 스크리닝 또는 검출을 위한 임상 마커로 아직 많이 사용되지 않았다. 또한, 실제 임상과 검진에 적용할 수 있는 비침습적 또는 액체 생검을 이용한 바이오마커를 찾는 연구가 필요한 실정이다.
본 발명자들은 구강암 환자군과 대조군으로부터 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 기반의 표적-비표적 대사체 프로파일링을 수행하여 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체가 구강암을 식별해내는 대사 신호로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
1. 대한민국 등록특허 제10- 2091483호
[비특허문헌]
1. Martin-Blαzquez A, et al. Untargeted LC-HRMS-based metabolomics to identify novel biomarkers of metastatic colorectal cancer. Scientific reports 9, 20198 (2019)
2. Xie GX, et al. Urine metabolite profiling offers potential early diagnosis of oral cancer. Metabolomics 8, 220-231 (2012)
3. Chen X, Yu D. 구강암의 대사체학 연구.　Metabolomics　15, 22 (2019)
본 개시의 목적은 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물, 상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 조성물, 상기 구강암 진단용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트 및 구강암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 개시는 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체는 데카노일 카르니틴(decanoylcarnitine), 옥타노일 카르니틴(octanoylcarnitine) 및 헥사노일 카르니틴(hexanoylcarnitine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 구강암 진단용 바이오마커 조성물은 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 개시는 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 개시는 상기 구강암 진단용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 개시는 (a) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 측정하는 단계; (b) 상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 대조군 시료의 수준(level)과 비교하는 단계; 및 (c) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)이 대조군 시료의 수준(level)보다 낮을 경우 구강암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 구강암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
상기 (a)의 단계에서 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체의 수준(level)을 더 측정할 수 있다.
상기 분리된 시료는 타액, 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 액체생검 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 개시는 구강암 검출 및/또는 진단용 (마커) 조성물 및 이의 제조방법; 구강암 검출 및/또는 진단용 키트 및 이의 제조방법; 구강암 검출 및/또는 진단용 장치 및 이의 제조방법; 그리고 구강암 검출 및/또는 진단을 위한 정보제공 방법에 있어서, 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체(들)의 용도를 제공한다.
본 개시는 종래 조직생검이 어려워 진단이 용이하지 않았던 구강암의 조기진단을 가능하게 하며, 혈액을 수집하여 분석하는 액체생검 방법을 이용하기 때문에 환자의 고통과 위험부담을 감소시킬 수 있다.
도 1은 구강암 환자군과 대조군에 대한 RNAseq 데이터를 이용하여 TCGA(The Cancer Genome Atlas)에서 pathway 분석을 한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 표적 대사체 프로파일링 접근을 위한 10개의 대사 산물에 대한 Wald 거리 분석이 포함된 히트 맵 및 계층적 클러스터를 나타낸 것이다.
도 3은 표적 대사체 프로파일링에서 5-fold 교차 검증을 사용한 랜덤 forest의 결과를 나타낸 것이다. a는 훈련 세트에 대한 Random Forest의 혼동 행렬, b는 Random Forest에서 최적의 매개 변수를 찾기 위한 grid 검색 결과, 가장 높은 정확도 포인트는 각 트리 노드 (mtry)에서 분할에 사용할 수 있는 변수 수: 4개, 성장할 트리 수(ntree): 360개, c는 테스트 세트에 대한 Random Forest의 혼동 행렬, d는테스트 세트에서 Random Forest를 사용하는 상위 4개의 대사 산물을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4o는 검증 데이터 세트에서 확인한 각 4개의 대사 산물(a-d)과 2개의 대사산물(e-j), 3개의 대사산물(k-n), 및 4개의 대사산물(o)의 대사산물 패널에 대한 민감도와 특이성 및 AUC 값을 나타낸 것이다.
도 5a는 양성 모드, 도 5b는 음성 모드에서 혈장 지질의 UHPLC ESI Q TOF MS/MS 스펙트럼에서 얻은 PCA score plot을 나타낸 것이다.
도 6은 지질 대사체 프로파일링에서 5-fold 교차 검증을 사용한 Random Forest 결과를 나타낸 것이다: a는 훈련 세트에 대한 Random Forest의 혼동 행렬; b는 Random Forest에서 최적의 매개 변수를 찾기 위한 grid 검색 결과, 가장 높은 정확도 포인트는 각 트리 노드(mtry)에서 분할에 사용할 수 있는 변수의 수: 4개, 성장할 트리의 수(ntree): 240개; c는 테스트 세트에 대한 Random Forest의 혼동 행렬; d는 테스트 세트에서 Random Forest를 사용하는 상위 3개의 대사 산물.
본 개시는 구강암 환자군과 대조군으로부터 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 기반의 표적-비표적 대사체 프로파일링을 수행하여 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체가 구강암을 식별해내는 대사 신호로 간주될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서의 용어 "대사체"는 생물학적 시료로부터 수득한 대사물질을 의미하며, 상기 대사체를 수득할 수 있는 생물학적 시료는 타액, 전혈, 혈장, 혈청, 혈소판일 수 있고, 바람직하게는 혈장일 수 있다. 또한, 상기 대사체는 대사 및 대사 과정에 의해 생산된 물질 또는 생물학적 효소 및 분자에 의한 화학적 대사작용으로 발생한 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics), 예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것을 포함한다.
본 개시는 일 관점에서, 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 개시는 일 실시예에서 (a) 구강암 환자군의 시료와 대조군의 시료를 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 기반의 데이터 추출 단계; (b) UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및 (c) 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 두 시료의 차별성을 검증하는 단계를 통해 구강암을 진단하였다.
상기 단계 (b)에서 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위 시간동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 대표값으로 정하고, 상기 단계(c)에서 대사체 프로파일링 차이를 비교하기 위해 기계학습(machine learning) 분석을 수행하여 5-fold 교차 검증을 통해 두 시료간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체를 바이오마커로 선정하고 분석, 검증하였다.
본 명세서에 사용된 용어 "교차 검증"은 통계학에서 모델을 평가하는 한 가지 방법으로, 전체 데이터가 최소 한 번은 테스트 세트로 이용되도록 데이터를 분할하고 각각의 매개변수에 대해 최고의 매개변수를 찾아 정확도와 신뢰성을 높인 성능값을 찾아준다.
본 개시에서의 성능값은 AUC(Area Under the Curve)이며, 상기 AUC값이 높을수록 구강암의 양성 및 음성여부를 구분할 수 있는 능력이 높음을 의미한다.
상기 5-fold 교차 검증을 통하여 AUC 값이 0.8이상인 대사체를 구강암 진단용 바이오마커로 분류하였으며, 구체적으로 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 포함하며, 바람직하게는 데카노일 카르니틴(decanoylcarnitine), 옥타노일 카르니틴(octanoylcarnitine) 및 헥사노일 카르니틴(hexanoylcarnitine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 대사체를 포함한다.
상기 아실카르니틴(acyl carnitine)은 지방산 베타산화에서 지방산을 미토콘드리아 내부로 운반하는 역할을 하며, 지질 대사 프로파일링에서 분석된 2개의 지방산 즉, 폴리불포화지방산(PUFA)인 아라키돈산(arachidonic acid)과 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid)이 구강암 환자군에서 감소된 양을 나타낸 결과로 신뢰할 수 있는 바이오마커로 검증되었다. 이는 Mika, A., et al. 연구의 대장암 환자군 혈청에서 PUFA 수준이 건강한 대조군에 비해 낮게 나타난 결과와 일치하며 도 1에서 나타난 바와 같이, 유전체 프로젝트인 TCGA(The Cancer Genome Atlas)에서 구강암 환자군과 대조군에 대한 RNAseq 데이터를 이용하여 pathway 분석을 수행한 결과 본 개시의 연구 결과와 일치하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 바이오마커 조성물은 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체를 더 포함할 수 있다.
본 개시는 다른 관점에서, 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 용어 "수준(level)"은 생물학적 시료에서 바이오마커를 검출하기 위한 임의의 분석 방법을 사용하여 만들어진 측정값을 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용되며, 생물학적 시료에서 바이오마커에 대응하는 것에 대한 존재, 부재, 절대적인 양 또는 농도, 상대적인 양 또는 농도, 역가(titer), 수치, 발현 수치, 측정된 수치의 비율 등을 나타내는 것으로, 수준(level)의 정확한 특성은 바이오마커를 검출하는데 사용된 특정 분석 방법의 특정 설계 및 성분에 의존하는 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 "제제(agent)"는 생물학적 시료로부터 대사체를 정량적으로 검출하기 위한 제제를 의미하며, 상기 제제는 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 제제는 대사체와 상호 작용하여 신호를 발생시키는 상보적 결합이 가능한 프라이머, 프로브, 압타머, 소분자 화합물, 단백질, 리간드 또는 항체일 수 있다.
본 개시는 또 다른 관점에서, 상기 구강암 진단용 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트를 제공한다.
본 개시에 있어서, 상기 키트는 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 조성물을 필수적으로 포함하고, 상기 제제를 정량할 수 있는 구성요소 또는 정량장치를 더 포함할 수 있다.
본 개시에 따른 키트는 간이 진단용 또는 PCR-기반 진단용 키트일 수 있다.
각 용도에 적합한 키트를 설계하고, 구성품에 대한 적절한 수정 또는 변경을 거쳐 구현하는 것은 통상의 기술자에게 있어 자명할 것이다.
상기 제제를 정량할 수 있는 구성요소는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 진단 키트 관련 분야에서 일반적으로 사용되는 프로브, 형광단, 발색단, 방사성 핵종 등을 포함할 수 있다.
상기 정량장치는 각 대사체의 수준(level)을 측정하기 위한 것으로 핵자기공명분광분석기(NMR), 크로마토그래피, 및 질량분석기(mass spectrometry)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 개시는 또 다른 관점에서, (a) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 측정하는 단계; (b) 상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 대조군 시료의 수준(level)과 비교하는 단계; 및 (c) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)이 대조군 시료의 수준(level)보다 낮을 경우 구강암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 구강암 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
상기 분리된 시료는 타액, 전혈, 혈청 및 혈장 등의 액체생검 군에서 선택할 수 있으며, 상기 (a) 단계에서 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체 수준(level)을 더 측정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 개시의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 개시의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실험재료 및 방법>
1. 표본 수집
본 개시의 연구는 국립암센터 윤리위원회(IRB No. NCC2016-0147)의 승인을 받고, 연구 참여자 전원 서면 동의를 받아 수행되었다.
본 개시는 디스커버리 데이터 세트(Discovery Data Set)와 검증 데이터 세트(Validation Data Set)로 구성된다. 디스커버리 데이터 세트는 2018년부터 국립암센터 검진센터와 외래진료소를 방문한 182명의 구강암 환자와 성-연령을 매칭하여 등록 당시 암이 없다는 진단을 받은 건강한 사람 364명으로 구성하였다. 구강암 환자군은 혀, 턱밑 샘, 윗 잇몸, 아랫 잇몸, 상악 부비동, 볼 점막, 후 구치 삼각근, 경구개, 연구개, 입바닥 및 아랫입술 중 하나에서 조직학적으로 구강암을 진단받은 사람이며, 건강한 대조군은 19세 미만은 모두 제외하였다. 검증 데이터 세트는 서울대병원을 방문한 경험이 있는 구강암 환자 52명과 성을 매칭하여 상기 디스커버리 데이터 세트를 구성한 국립암센터의 같은 기간의 건강한 대조군에서 52명을 포함하였다.
시료인 혈액샘플은 채취 직후 냉동보관하였고, 혈장은 4℃에서 3000 rpm 원심분리를 이용해 20분간 분리하고, 추가 분석을 위해 -80℃에서 보존하였다.
본 개시와 관련한 연구의 참가자들의 일반적인 특성은 표 1에 나타나 있다.
Figure PCTKR2022007731-appb-T000001
디스커버리 데이터 세트에서 364명의 대조군이 182명의 암환자와 연령별, 성별별로 일치했기 때문에 이러한 변수에 대한 그룹 간에는 차이가 없었다. 결과는 중앙값(25%, 75%), 숫자(%)로 표시하고 P-값은 연속 변수에서 Kruskal-Wallis 검정, 범주형 데이터에서 카이-제곱 검정으로 계산되었다. 환자군과 대조군 간 음주 상태(P = 0.03)에서 유의한 차이가 있었지만, 흡연 상태에서는 유의적인 차이가 존재하지 않았다(P = 0.09). 검증 데이터 집합에서는 연령과 흡연 상태에 유의한 차이가 관찰되었지만 성별과 음주 상태에는 차이가 없었다.
디스커버리 데이터 세트와 검증 데이터 세트를 대상으로 대사 산물을 분리하기 위하여 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS; Agilent 1290 Infinity LC와 6490 Triple Fourthpole MS 시스템(Agilent Technologies; Palto, CA, 미국)을 사용하였다. 대사 산물 분석에는 MassHunter Workstation (Ver B.06.00, Agilent Technologies) 소프트웨어를 사용하였다.
2. LC-MS 분석 방법
2-1. 시료 준비
(1) 반표적 프로파일링에 사용할 혈장표본(50 μL)을 500 μL 클로로포름:메탄올(2:1, v/v) 용액과 100 μL 물로 추출하여 진공 상태에서 건조시킨 후, 20분 동안 3000 rpm으로 원심분리하여 1 μL씩 주입하여 사용하였다.
(2) 표적 프로파일링에 사용할 혈장표본(20 μL)을 물 30 μL, 아세토니트릴 150 μL로 추출한 후, 1시간 동안 단백질을 침전시키고 4℃에서 10분 동안 4500g에서 원심분리하였다. 수용성 상등액을 1.5 ml 새 튜브로 옮겨 각 희석 계수를 75% ACN으로 희석하여 각 대사산물 내부 표준을 추가하였다.
(3) 지질 프로파일링에 사용할 혈장표본(20μL)을 물 30 μL, 250 μL의 AVANTISSLASH LIPIDOMIX 및 이소프로필 알코올(1:49, v/v) 용액을 사용하여 추출하여 10분 동안 혼합하고, 완전한 단백질 침전을 위해 2시간 동안 두었다가 4℃에서 10분 동안 4500g에서 원심분리하였다.
2-2. UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 분석
(1) 반표적 및 표적 프로파일링: 전기분사(ESI)를 장착한 Xevo TQ XS 시스템(Waters, Milford, MA, MA)이 결합된 ACQUITY UPC을 사용하여 수행하였다. 슈헤르조 SM-C18 칼럼(2 mm x 100 mm, 3 μm; Imtakt, Kyoto, 일본)으로 0.2 mL/min에서 20분간 극성 대사 산물을 분리하였다. 이동상 A는 수중 0.1% 포름산, 이동상 B는 메탄올 내 0.1% 포름산으로 구성되었다.
(2) 지질 프로파일링: 크로마토그래피 분리를 ACQUITY UPLC CSH C18 (2.1mm x 100mm, 1.7μm, Waters)에서 20분 동안 수행하였고, 컬럼 온도 및 유속은 55℃ 및 0.4 ml/min으로 유지하였다. Q-TOF Micro mass detector (Waters, Milford, MA, 미국)를 사용해 포지티브 모드의 이동상 A는 물:아세토니트릴(40:60 v/v) 중 0.1 % 포름산, 이동상 B는 이소프로필 알코올:아세토니트릴(90:10 v/v) 중 0.1 % 포름산으로 구성되었고, 네거티브 모드의 이동상 A는 물:아세토니트릴(60:40 v/v) 중 0.1 % 포름산, 이동상 B는 이소프로필 알코올:아세토니트릴(90:10 v/v) 중 0.1 % 포름산으로 구성되었다. 정확한 질량 획득을 위해 5μL/min의 lock-spray 조건에서 Lucine-enkphalin([M + H]+: m/z 556.2771 및 [M-H]-: m/z 554.2615)을 사용하였다.
2-3. 다성분 동시분석 모니터링(dMRM)
고품질의 데이터를 획득하기 위하여 다성분 동시분석 모니터링(dMRM)으로 화합물의 머무름 시간, 내부 표준 농도 등을 정량화하였고, QC 검체는 검체 획득 전 5개 검체마다 분석되어 분석 시스템의 안정성과 재현성을 모니터링하였다.
표 2는 반표적 프로파일링에서 선별한 대사산물에 대한 머무름 시간 및 다중반응 모니터링 전이를 나타낸 것이다. 이온 전이값과 머무름 시간 재현성을 고려할 때 데카노일 카르니틴, 헥사노일 카르니틴 및 옥타노일 카르니틴의 선택된 반응을 확인할 수 있다.
Metabolite Retention time (min) Ionization mode Precursor ion
(m/z)		 MRM ion transitions
(m/z)		 Collision energy (eV) IS concentration
(nM)
Acetyl-carnitine 1.08 + 203.8 84.5 15 25
Decanoyl carnitine 4.86 + 316.2 84.8 18 5
Glutamine 1.18 + 148 84 16 100
Hexanoyl carnitine 4.41 + 260.2 84.5 15 5
Hypoxanthine 1.52 + 137.2 110 20 1000
Isovaleryl carnitine 4.17 + 246.1 85 14 30
Octanoyl carnitine 4.67 + 288.2 84.98 18 2.5
Proline 1.16 + 116 70 16 25
Pyridoxamine 0.88 + 169 151.8 10 100
sn-glycerol 3-phosphocholine 1.13 + 258 104 10 Proline
Taurine 1.14 + 126 108 8 30
3. 통계 분석
다변량 통계 분석은 SIMCA-P+ 버전 12.0(Umetrics, Ume, 스웨덴)을 사용하여 수행되었다. 지질 프로파일링에 있어서 PCA가 적용되고, UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 데이터 세트는 PCA를 수행하기 전에 단위 분산으로 확장되었다.
모델 유효성은 모델의 해석성과 예측성에 대한 정보를 각각 제공하는 모델 매개 변수에서 평가되었다. 그룹 간의 차이는 연속형 변수에 대한 Kruskal-Wallis 검정과 범주형 변수에 대한 카이-제곱 검정을 사용하여 비교되었다.
글로벌 프로파일링에서 얻은 대사산물은 최소 절대 수축 및 선택 연산자(LASSO) 및 랜덤 포레스트(RF) 방법을 포함하는 기계 학습 분석으로 도출하였다. LASSO와 RF의 과적합 편향을 피하기 위해, 디스커버리 데이터 세트를 훈련세트(구강암 146건 및 대조군 292건)와 테스트세트(구강암 36건 및 대조군 72건)로 나누었다. 훈련세트는 대사산물 선택에 대한 낙관적 모델을 구축하기 위해 사용되었고, 모델 검증에는 테스트세트가 사용되었다. 두 알고리즘에서 생성된 결과를 결합하여 추가 분석을 위해 대사산물을 선택하였다.
이후, 추가 대사산물은 fold 변화 및 다변량 조정 조건부 로지스틱 회귀 분석 및 AUC 값을 기반으로 선택하였다. 본페로니 방법을 사용한 사후 다중 비교는 대사산물의 그룹 간 유의한 차이를 식별하기 위해 적용되었다.
디스커버리 데이터 세트에서의 음주 및 흡연 상태에 대해 OR(odds ratio) 및 해당 CI(95% 신뢰구간)를 추정하기 위해 조정된 조건부 로지스틱 회귀 분석을 수행하였다.
수신기 작동 특성(ROC) 곡선의 곡선 아래 영역(AUC)은 선택된 대사물의 예측 능력을 테스트하기 위해 계산되었다. 모든 통계 시험은 양측검사로 유의성이 p > 0.05로 설정되었다. 다른 모든 통계 분석과 시각화는 R 플랫폼의 ggplot2 패키지를 사용하여 수행되었다.
<실험결과>
실시예 1: 극성 대사체 프로파일링 분석 결과
UHPLC-ESIQ-TOF-MS/MS를 사용한 혈장 검체에서 총 82개의 대사산물이 검출되었으며, 이름을 식별하기 위해 모든 대사산물은 전자의 정확한 질량값과 파편 이온 및 보존 시간의 측면에서 온라인 데이터베이스의 실제 표준참조와 비교하였다. 그 결과, 추가 선택 과정을 위해 48개의 대사산물을 선발하였으며 구강암 환자군과 대조군을 구분 짓는 최고의 변수 선택을 위해 훈련세트와 테스트세트를 구성하여 5-fold 교차 검증으로 LASSO를 사용한 로지스틱 회귀 결과 16개의 대사산물 및 랜덤 forest(RF) 결과 5개의 대사산물을 도출하였다. 이들 결과에 대한 훈련세트와 테스트세트 정확도는 각각 98.81%, 94.30% 및 94.44%, 93.52%로 나타났다.
구강암 환자군에서 상기 LASSO와 RF의 결과를 결합한 18개의 대사산물 중 6개의 대사산물(프롤린, 타우린, 피리독사민, 프로-카르니틴, 시트룰린 및 하이포크산틴)은 증가하였고, 12개의 대사산물(아세틸콜린, 크레아티닌, 트립토판, 아스파테이트, 옥타노일 카르니틴, 아세틸 카르니틴, 이소 카르니틴, 글리세롤포스포콜린, 페닐알라닌, 글루타메이트, 데카노일 카르니틴, 헥사노일 카르니틴)은 감소한 양을 보였다
Metabolites Fold change (Case/Control) adjusted P-value Conditional logistic regression OR adjusted
P-value 		Train AUC Test AUC
Oct-carnitine 0.3106 2.80E-57 0 .0640 1.26E-13 0.914969 0.949899
Deca-carnitine 0.2782 1.06E-50 0 .0368 2.37E-11 0.894206 0.886869
Sn_glycerol_3_ phosphocholine 0.4995 2.08E-35 0.2358 6.24E-16 0.818114 0.852929
Glutamate 0.6612 3.44E-37 0 .2342 2.07E-16 0.828862 0.840000
Pyridoxamine 1.3416 2.19E-31 4.5381 7.57E-16 0.805277 0.831919
Hex-carnitine 0.5252 1.65E-41 0 .1455 5.96E-17 0.855908 0.821818
Proline 1.2718 6.01E-24 3.6447 1.57E-14 0.766853 0.762424
Creatinine 0.9208 2.32E-04 0.5624 1.81E-05 0.568521 0.726869
Acetyl-carnitine 0.6367 1.88E-27 0.3329 4.87E-14 0.796593 0.72404
Hypoxanthine 1.7927 1.76E-19 3.7789 1.04E-14 0.749081 0.707071
Iso-carnitine 0.6999 2.65E-16 0.4452 6.67E-10 0.715565 0.700202
Aspartate 0.7918 4.09E-15 0 .3378 8.24E-12 0.705121 0.686061
Taurine 1.3407 9.44E-25 4.7644 1.16E-15 0.798678 0.668283
Acetylcholine 0.9534 1.27.E-02 0 .7510 1.31E-02 0.547615 0.661414
Pro-carnitine 1.2793 1.58E-10 2 .0899 9.75E-09 0.674469 0.600808
Citrulline 1.1605 8.44E-08 1.6324 2.02E-05 0.655886 0.594343
Phenylalanine 0.9095 6.72E-09 0.3930 4.04E-09 0.675406 0.550707
Tryptophan 0.8981 7.41E-05 0 .6160 1.09.E-04 0.615467 0.525253
18개의 대사산물에 대하여 리시버 작동 특성(ROC) 곡선에서 곡선 아래 영역 (AUC)을 계산하여 구강암에 대한 예측성능을 테스트한 결과를 나타내는 것이며, 이를 통해 AUC값이 0.7이상인 10개의 대사산물을 선정하였다(표 3).
또한, 도 2를 참조하면, 10 개의 대사산물에 대한 Wald 거리 분석이 포함된 히트맵 및 계층적 클러스터에서 구강암에 대한 옥타노일 카르니틴, 데카노일 카르니틴, 헥사노일 카르니틴, 글리세롤포스포콜린, 하이포크산틴 및 이소-카르니틴의 유의미한 변화를 확인할 수 있다.
상기 10개의 대사산물에 대한 바이오마커 값을 확인하기 위해 표적 프로파일링을 수행한 결과, LASSO 로지스틱 회귀 결과로 6개의 대사산물 및 Random Forest 결과로 상위 4개의 대사산물을 도출하였다. 이들 결과에 대한 훈련세트와 테스트세트 정확도는 각각 93.25%, 93.64% 및 93.14%, 89.81%로 나타났다.
Metabolites Fold Change (case/control) P-value Conditional logistic regresion (OR) P-value Train AUC Test AUC
Deca-carnitine 0.515185 3.46E-65 0.073 2.87E-14 0.947129 0.940808
Oct-carnitine 0.489523 2.95E-63 0.0876 2.17E-15 0.940524 0.939192
sn_glycerol_3_glycerophosphocholine 0.838444 3.15E-44 0.197 3.85E-17 0.85592 0.913131
Hex-carnitine 0.570878 7.77E-54 0.1109 2.24E-16 0.910444 0.884646
Hypoxanthine 1.094322 7.46E-13 2.7042 8.68E-12 0.695483 0.689697
Iso-carnitine 0.82226 5.97E-13 0.465 1.16E-09 0.682114 0.686061
Acetyl-carnitine 0.904537 5.48E-12 0.3138 3.18E-12 0.680409 0.650303
Proline 1.005017 0.391368 1.085 0.5103048 0.488911 0.531394
LASSO와 RF의 결과를 결합한 8개의 대사산물에 대하여 리시버 작동 특성(ROC) 곡선에서 곡선 아래 영역 (AUC)을 계산하여 구강암에 대한 예측성능을 테스트한 결과로 AUC값이 0.8 이상인 4개의 대사산물 즉, 데카노일 카르니틴, 옥트타노일 카르니틴, 글리세롤포스포콜린 및 헥사노일 카르니틴을 선정하였으며, 특히 옥타노일 카르니틴과 데카노일 카르니틴의 AUC값은 0.9 이상을 나타내었다(표 4).
도 3을 참조하면, 5-fold 교차 검증을 사용한 Random Forest의 결과로, 도3A는 훈련 세트에 대한 Random Forest의 혼동 행렬이고, 도 3B는 Random Forest에서 최적의 매개 변수를 찾기 위한 grid 검색 결과이다. 가장 높은 정확도 포인트는 각 트리 노드(mtry)에서 분할에 사용할 수 있는 변수 수는 4개, 성장할 트리 수(ntree)는 360개이며, 도 3C는 테스트세트에 대한 Random Forest의 혼동 행렬, 도 3D에서 테스트세트에서 Random Forest를 사용한 상위 4 개의 대사산물을 확인할 수 있다.
또한, 도 4a 내지 4d에 나타난 바와 같이, 검증 데이터 세트에서 상기 상위 4개 대사산물의 AUC값이 0.8보다 크고, 도 4o에 나타난 바와 같이, 4개 대사산물 패널은 0.9744의 민감도와 0.8478의 특이성을 보이며 AUC 0.9666으로 높은 구강암 식별 지수를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 2: 지질 대사체 프로파일링 분석 결과
UHPLC-ESIQ-TOF-MS/MS를 사용한 혈장 검체에서 검출된 135개의 지질 대사산물 중 구강암 환자군과 대조군간의 유의미한 차이를 보인 86개의 지질 대사산물을 분류하여 기계학습으로 최적의 변수값을 도출하였다.
도 5에서 구강암 환자군과 대조군간의 패턴이 명확히 구별되는 PCA(principal component analysis) 플롯을 확인할 수 있다.
LASSO 로지스틱 회귀 결과로 26개의 대사산물 및 Random Forest 결과로 상위 3개의 대사산물을 선정하였다. 이들 결과에 대한 훈련세트와 테스트세트 정확도는 각각 87.33%, 79.86% 및 93.49%, 88.19%로 나타났다.
Lipidomics Fold change (Case/Control) adjusted P-value train AUC test AUC Conditional logistic regression OR P-value FDR
FFA 20:4 0.9011 0.0000 0.8547 0.8990 0.1630 0.0000 0.0000
FFA 20:5 0.8800 0.0000 0.7946 0.7351 0.2150 0.0000 0.0000
TG 60:13 0.9578 0.0000 0.7697 0.7270 0.3060 0.0000 0.0000
FFA 18:2 0.9773 0.0000 0.6772 0.7633 0.4950 0.0000 0.0000
LysoPC 18:0 0.9846 0.0000 0.7036 0.6214 0.3690 0.0000 0.0000
PC 40:7 0.9723 0.0000 0.6587 0.5602 0.4050 0.0000 0.0000
LysoPC 16:1 0.9929 0.0000 0.6804 0.5884 0.4330 0.0000 0.0000
TG 44:2 1.0092 0.0000 0.6492 0.6663 2.0520 0.0000 0.0000
FFA 20:2 0.9557 0.0000 0.6215 0.5944 0.6560 0.0013 0.0026
TG 48:3 1.0245 0.0003 0.6007 0.6855 1.7790 0.0001 0.0002
TG 56:7-isomer2 0.9861 0.0004 0.5922 0.5969 0.7500 0.0448 0.0448
TG 56:9 0.9934 0.0007 0.5850 0.5795 0.6930 0.0102 0.0197
Cer d42:1-isomer2 0.9850 0.0009 0.5756 0.6145 0.6230 0.0054 0.0107
DG 36:4-isomer1 0.9962 0.0018 0.5982 0.6050 0.6920 0.0107 0.0214
TG 54:2 1.0053 0.0131 0.5996 0.5891 1.4160 0.0140 0.0140
PC 38:4 0.9964 0.0252 0.5687 0.5658 0.6080 0.0033 0.0066
PC 38:3 0.9842 0.0253 0.5648 0.5400 0.6440 0.0110 0.0221
DG 34:0 1.0017 0.0744 0.5733 0.5673 1.3480 0.1274 0.1274
SMd 42:3 1.0006 0.2022 0.5567 0.5725 0.7880 0.1944 0.1940
SMd 34:1 0.9990 0.2458 0.5520 0.5823 0.7670 0.0957 0.0957
TG 52:3 0.9953 0.3768 0.5471 0.5575 0.9090 0.4995 0.4995
PC 36:2 0.9884 0.4560 0.5631 0.5455 0.7240 - -
TG 58:8-isomer1 0.9974 0.5290 0.5363 0.5492 0.9270 0.5771 0.5771
PC 32:2 1.0021 0.6130 0.5525 0.4638 1.0830 0.5772 0.5772
TG 58:7-isomer2 0.9981 0.6774 0.5522 0.548 1.0360 0.7957 0.7957
TG 52:2 0.9965 0.6956 0.5301 0.5448 0.9160 0.5399 0.5399
도 6은 5-fold 교차 검증을 사용한 Random Forest 결과를 보여주며, 도 6a는 훈련 세트에 대한 Random Forest의 혼동 행렬이고, 도 6b는 Random Forest에서 최적의 매개변수를 찾기 위한 grid 검색 결과이다. 가장 높은 정확도 포인트는 각 트리 노드(mtry)에서 분할에 사용할 수 있는 변수 수는 14개, 성장할 트리 수(ntree)는 240개이며, 도 6c는 테스트 세트에 대한 Random Forest의 혼동 행렬, 도 6d에서는 테스트 세트에서 Random Forest를 사용하는 상위 3개의 지질대사 산물을 확인할 수 있다.
결과적으로, 구강암 환자에서 선택된 26가지 지질의 변화를 대조군과 비교하였을 때, 회귀, 배수 변화에서 17개의 지질이 구강암에서 유의미한 차이가 있었으며, 표 5에 나타나 있는 바와 같이 그룹(P 값 <0.05)의 17 가지 지질의 fold 변화 및 조건부 로지스틱 회귀 모델 분석에서 AUC 값이 0.7 이상인 3개의 지질(FFA 20:4, FFA 20:5, TG 60:13), 즉 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid), 및 트리글리세라이드(triglyceride)를 구강암 진단을 위한 유의한 지표로 선정하였다.
본 개시에 따른 아실카르니틴 대사체는 구강암 환자를 구별해 내는 능력이 뛰어난 암 진단 마커로서 유용성을 구비하고 있고, 또 구강암에서 대사 신호로 간주될 수 있음을 객관적으로 입증하였으며, 뿐만 아니라 구강암에서 비침습적 샘플을 이용한 조기진단 마커로서 잠재력을 입증하였으므로, 구강암 진단용 조성물, 진단 키트, 구강암 관련 검출/진단 정보 제공방법으로서 유용한 가치가 있다.

Claims (8)

  1. 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체는 데카노일 카르니틴(decanoylcarnitine), 옥타노일 카르니틴(octanoylcarnitine) 및 헥사노일 카르니틴(hexanoylcarnitine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
  4. 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체의 수준(level)을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 구강암 진단용 조성물.
  5. 제 4항의 조성물을 포함하는 구강암 진단용 키트.
  6. (a) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 측정하는 단계;
    (b) 상기 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)을 대조군 시료의 수준(level)과 비교하는 단계; 및
    (c) 구강암 환자에서 분리된 시료로부터 아실카르니틴(acyl carnitine) 대사체 수준(level)이 대조군 시료의 수준(level)보다 낮을 경우 구강암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 구강암 진단을 위한 정보제공 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서, 글리세로포스포릴콜린(glycerophosphorylcholine), 아라키돈산(arachidonic acid), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid) 및 트리글리세라이드(triglyceride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 대사체의 수준(level)을 더 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 분리된 시료는 타액, 전혈, 혈청 및 혈장으로 이루어진 액체생검 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 정보제공 방법.
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