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WO2022124511A1 - 변이형 atp-의존적 프로테아제 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산 방법 - Google Patents

변이형 atp-의존적 프로테아제 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산 방법 Download PDF

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Publication number
WO2022124511A1
WO2022124511A1 PCT/KR2021/008881 KR2021008881W WO2022124511A1 WO 2022124511 A1 WO2022124511 A1 WO 2022124511A1 KR 2021008881 W KR2021008881 W KR 2021008881W WO 2022124511 A1 WO2022124511 A1 WO 2022124511A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
microorganism
present application
atp
clpc
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/008881
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
윤병훈
김선혜
배지연
최선형
김경림
김형준
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
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Priority to JP2023532433A priority patent/JP7550315B2/ja
Priority to MX2023006460A priority patent/MX2023006460A/es
Priority to CA3199126A priority patent/CA3199126A1/en
Priority to EP21903560.7A priority patent/EP4242315A4/en
Priority to US18/038,422 priority patent/US20240002827A1/en
Publication of WO2022124511A1 publication Critical patent/WO2022124511A1/ko

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21092—Endopeptidase Clp (3.4.21.92)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • the present application relates to a mutant ATP-dependent protease and a method for producing L-amino acids using the same.
  • L-amino acid is a basic structural unit of protein and is used as an important material for pharmaceutical raw materials, food additives, animal feeds, nutrients, pesticides, and disinfectants.
  • branched chain amino acids BCAA are essential amino acids L-valine, L-leucine, and L-isoleucine.
  • the branched chain amino acids have an antioxidant effect and directly promote protein synthesis in muscle cells. It is known to be effective.
  • the present inventors developed a method for producing branched chain amino acids at high concentrations using a mutant ATP-dependent protease and completed the present application.
  • One object of the present application is to provide a microorganism of the genus Corynebacterium having an ATP-dependent protease activity weakened compared to an unmodified microorganism, preferably having a branched chain amino acid production ability.
  • Another object of the present application is to provide a ClpC variant in which the amino acid sequence corresponding to positions 431 to 433 is deleted based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding the ClpC variant of the present application.
  • Corynebacterium genus comprising any one or more of a microorganism of the genus Corynebacterium of the present application, or a ClpC variant of the present application, or a polynucleotide of the present application, or a vector comprising the same It is to provide a method for producing branched chain amino acids, comprising the step of culturing a microorganism in a medium.
  • the microorganism according to the present application can produce branched chain amino acids with high efficiency.
  • the prepared branched chain amino acid can be applied to various products such as pharmaceutical raw materials, food additives, animal feed, nutrients, pesticides, and disinfectants.
  • the present application provides a microorganism of the genus Corynebacterium in which ATP-dependent protease activity is weakened compared to the unmodified microorganism in one embodiment.
  • ATP-dependent protease (EC 3.4.21.92) refers to an enzyme that hydrolyzes proteins into small peptides in the presence of ATP and Mg 2+ .
  • the ATP-dependent protease of the present application may be used interchangeably with endopeptidase Clp, ATP-dependent Clp protease, ClpP, Clp protease.
  • the ATP-dependent protease attenuation of the present application may be the attenuation of the activity of the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit.
  • the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit may be used in combination with AAA family ATPase or ClpC.
  • the sequence of the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit can be obtained from GenBank of NCBI, a known database.
  • the subunit may be a polypeptide having an ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit activity encoded by clpC , but is not limited thereto.
  • the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit of the present application may be from the genus Corynebacterium.
  • the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit of the present application may be derived from Corynebacterium glutamicum .
  • the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit of the present application may include a polypeptide described in SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having 90% or more identity thereto.
  • the amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 of the present application is at least 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 of the present application % or more, 96% or more, 96.26% or more, 97% or more, 97.5% or more, 97.7% or more, 97.8% or more, 98% or more, 98.5% or more, 98.7% or more, 98.8% or more, 99% or more, 99.5% or more , 99.7% or more, 99.8% or more or more, and less than 100% homology or identity.
  • the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit of the present application has, or consists of, or consists essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having at least 90% identity therewith ( can consist essentially of).
  • the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit of the present application adds meaningless sequences before and after SEQ ID NO: 5 or an amino acid sequence having at least 90% identity (i.e., amino acid sequence N-terminus and/or C-terminus of the protein function (addition of a sequence that does not change the
  • conservative substitution means substituting an amino acid for another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such amino acid substitutions may generally occur based on similarity in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. Typically, conservative substitutions may have little or no effect on the activity of the protein or polypeptide.
  • the microorganism of the present application is a polypeptide in which amino acids corresponding to positions 431 to 433 are deleted based on the SEQ ID NO of the sequence shown in SEQ ID NO: 5, or 1,291 to 1,291 based on the SEQ ID NO of the sequence shown in SEQ ID NO: 6 It may include a polynucleotide in which the nucleotide corresponding to position 1299 is deleted.
  • corresponding to means an amino acid residue or nucleotide residue at a listed position in a polypeptide or polynucleotide, or an amino acid residue similar, identical to, or homologous to a residue listed in a polypeptide or polynucleotide, or refers to nucleotide residues. Identifying an amino acid or nucleotide at a corresponding position may be determining a particular amino acid or nucleotide of a sequence that refers to a particular sequence.
  • corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related or reference protein.
  • any amino acid sequence is aligned with SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6, and based on this, each amino acid residue of the amino acid sequence is an amino acid residue corresponding to an amino acid residue of SEQ ID NO: 6 or a nucleotide of SEQ ID NO: 6 Residues can be numbered with reference to the numerical position of the corresponding nucleotide residue.
  • a sequence alignment algorithm such as that described in this application can identify the position of an amino acid, or a position at which modifications, such as substitutions, insertions, or deletions, occur compared to a query sequence (also referred to as a "reference sequence").
  • Such alignments include, for example, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000), Trends Genet. 16: 276-277), but is not limited thereto, and a sequence alignment program, pairwise sequence comparison algorithm, etc. known in the art may be appropriately used.
  • the term “attenuation” of polypeptide activity is a concept that includes both reduced or no activity compared to intrinsic activity.
  • the attenuation may be used interchangeably with terms such as inactivation, deficiency, down-regulation, decrease, reduce, attenuation, and the like.
  • the attenuation is when the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide possessed by the original microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the polypeptide, etc., inhibiting the expression of the gene encoding the polynucleotide or translation into a polypeptide
  • the overall polypeptide activity level and/or concentration (expression amount) in the cell is lower than that of the native strain due to (translation) inhibition, etc., when the expression of the polynucleotide is not made at all, and/or when the expression of the polynucleotide is Even if there is no activity of the polypeptide, it may also be included.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain, wild-type or unmodified microorganism before transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activity before modification”. "Inactivation, deficiency, reduction, downregulation, reduction, attenuation” of the activity of a polypeptide compared to the intrinsic activity means that the activity of the specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation is lowered.
  • Attenuation of the activity of the polypeptide may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by application of various methods well known in the art (eg, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • the attenuation of the polypeptide activity of the present application is
  • an antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • an antisense oligonucleotide that complementarily binds to the transcript of said gene encoding the polypeptide
  • deletion of a part or all of the gene encoding the polypeptide may be the removal of the entire polynucleotide encoding the endogenous target polypeptide in the chromosome, replacement with a polynucleotide in which some nucleotides are deleted, or replacement with a marker gene.
  • the above 2) modification of the expression control region is deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution or a combination thereof, resulting in mutation in the expression control region (or expression control sequence), or weaker replacement with an active sequence.
  • the expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 3) and 4) above is a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to weaken the activity of the polypeptide. Or a combination thereof may result in sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have weaker activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have no activity, but is not limited thereto.
  • the expression of a gene may be inhibited or attenuated, but is not limited thereto.
  • the base sequence modification encoding the start codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a base encoding another start codon having a lower polypeptide expression rate than the intrinsic start codon It may be substituted with a sequence, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • antisense RNA an antisense oligonucleotide that complementarily binds to the transcript of the gene encoding the polypeptide
  • Weintraub, H. et al. Antisense-RNA as a molecular tool. for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
  • RTE reverse transcription engineering
  • the microorganism of the present application may have the ability to produce branched chain amino acids.
  • the branched chain amino acid of the present application may be L-valine or L-isoleucine.
  • microorganism or strain
  • microorganism includes both wild-type microorganisms or microorganisms in which genetic modification has occurred naturally or artificially. Due to this, as a microorganism with a weakened or enhanced specific mechanism, it may be a microorganism containing genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein or product.
  • the strain of the present application is an ATP-dependent protease naturally present in a microorganism having a branched-chain amino acid production ability or a microorganism having a branched-chain amino acid production ability to a parent strain without branched-chain amino acid production ability.
  • An ATP-dependent protease or a polynucleotide encoding the same (or a vector comprising the polynucleotide) may be introduced or modified with the attenuated ATP-dependent protease of the present application, but is not limited thereto.
  • the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit variant is expressed and the microorganism producing branched chain amino acids includes the polynucleotide of the present application, the ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit variant is It may be a microorganism characterized in that the branched chain amino acid production capacity is increased.
  • a microorganism in which an ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit variant is expressed and produces branched-chain amino acids or an ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit variant having an expression ability and branched-chain amino acid production ability
  • ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit activity is attenuated and a part of a gene in the branched-chain amino acid biosynthesis pathway is enhanced or attenuated, or ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit activity is attenuated and branched-chain amino acid degradation pathway
  • the microorganism of the genus Corynebacterium of the present application additionally has enhanced acetolactate synthase isozyme 1 small subunit activity, enhanced aspartokinase activity, and enhanced homoserine dehydrogenase (homoserine) activity.
  • dehydrogenase) activity may be weakened and/or L-threonine dehydratase biosynthetic IlvA (L-threonine dehydratase biosynthetic IlvA) activity may be enhanced.
  • the term “enhancement” of a polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased compared to the intrinsic activity.
  • the reinforcement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
  • activation, enhancement, upregulation, overexpression, and increase may include all of those exhibiting an activity that was not originally possessed, or exhibiting an improved activity compared to intrinsic activity or activity before modification.
  • intrinsic activity refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors.
  • the enrichment can be achieved by introducing an exogenous polypeptide, or by enhancing the activity and/or concentration (expression amount) of an endogenous polypeptide. Whether or not the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed from the increase in the level of activity, expression level, or the amount of product excreted from the polypeptide.
  • the enhancement of the activity of the polypeptide can be applied by various methods well known in the art, and is not limited as long as it can enhance the activity of the target polypeptide compared to the microorganism before modification. Specifically, it may be one using genetic engineering and/or protein engineering well known to those skilled in the art, which is a routine method of molecular biology, but is not limited thereto (eg, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell). Biology 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the polypeptide activity eg, modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode a polypeptide modified to enhance the activity of the polypeptide
  • Such enhancement of polypeptide activity is to increase the activity or concentration of the corresponding polypeptide relative to the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild-type or pre-modified microbial strain, or increase the amount of product produced from the polypeptide.
  • the present invention is not limited thereto.
  • Modification of part or all of the polynucleotide in the microorganism of the present application is (a) homologous recombination using a vector for chromosome insertion in the microorganism or genome editing using engineered nuclease (e.g., CRISPR-Cas9) and/or (b) It may be induced by light and/or chemical treatments such as, but not limited to, ultraviolet and radiation.
  • the method for modifying part or all of the gene may include a method by DNA recombination technology.
  • a part or all of the gene may be deleted.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include a dominant selection marker, but is not limited thereto.
  • Corynebacterium genus microorganisms of the present application are Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium crudilactis ( Corynebacterium crudilactis ), Corynebacterium deserti ( Corynebacterium deserti ), Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium efficiens , Corynebacterium callunae , Corynebacterium stationis , Corynebacterium singulare , Corynebacterium halotolelans ( Corynebacterium halotolerans , Corynebacterium striatum , Corynebacterium ammoniagenes , Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans, Corynebacterium imitans It may be Corynebacterium testudinoris or Corynebacterium flavescens .
  • the present application provides a ClpC variant in which the amino acid sequence corresponding to positions 431 to 433 is deleted based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the ClpC variant may be an ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit variant.
  • ClpC or "ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit" is as described above.
  • the ClpC variant of the present application may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polypeptide described as an amino acid sequence having 90% or more identity thereto.
  • the ClpC variant of the present application has a polypeptide described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 90% or more identity therewith, or consists of, or essentially consists of. .
  • the ClpC variant of the present application has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or It may comprise an amino acid sequence having at least 99.9% homology or identity.
  • variant means that one or more amino acids are conservatively substituted and/or modified so that they differ from the amino acid sequence before the mutation of the variant, but have functions or properties refers to a polypeptide that is maintained.
  • variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide and evaluating the properties of the modified polypeptide. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the polypeptide before the mutation.
  • some variants may include variants in which one or more portions, such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain, have been removed.
  • variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • variant may be used interchangeably with terms such as mutant, modified, mutant polypeptide, mutated protein, mutant and mutant (in English, modified, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent, etc.) and, as long as it is a term used in a mutated sense, it is not limited thereto.
  • variants may contain deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide.
  • a signal (or leader) sequence involved in protein translocation may be conjugated to the N-terminus of the mutant, either co-translationally or post-translationally.
  • the variants may also be conjugated with other sequences or linkers for identification, purification, or synthesis.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or nucleotide sequences and may be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity can often be used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing with all or part of a sequence under moderate or high stringent conditions. It is apparent that hybridization also includes hybridization with a polynucleotide containing a common codon in a polynucleotide or a codon in consideration of codon degeneracy.
  • a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • the variant of the present application may have ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit activity.
  • the variants of the present application may have an activity such that branched chain amino acid production is increased compared to a wild-type polypeptide having an ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit activity.
  • the present application provides a polynucleotide encoding the ClpC variant of the present application.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are linked in a long chain by covalent bonds, and more specifically, encoding the variant. polynucleotide fragments.
  • the polynucleotide encoding the ClpC variant of the present application may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a nucleotide sequence encoding a polypeptide described with an amino acid sequence having 90% or more identity thereto.
  • the polynucleotide of the present application may have or include a polynucleotide described as SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence having 90% or more identity thereto.
  • the polynucleotide of the present application may consist of, or consist essentially of, the polynucleotide described in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the polynucleotides of the present application are various in the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the variants of the present application. Variations can be made.
  • the polynucleotide of the present application may be a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a sequence complementary to all or part of the polynucleotide sequence of the present application, without limitation. may be included.
  • the "stringent condition” means a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • polynucleotides with high homology or identity 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or a condition in which polynucleotides having 99% or more homology or identity hybridize with each other and polynucleotides with lower homology or identity do not hybridize, or 60 ° C., which is a washing condition of conventional Southern hybridization; 1XSSC, 0.1% SDS, specifically 60°C, 0.1XSSC, 0.1% SDS, more specifically 68°C, 0.1XSSC, 0.1% SDS at a salt concentration and temperature equivalent to one wash, specifically two to three washes conditions can be enumerated.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other.
  • adenine is complementary to thymine
  • cytosine is complementary to guanine.
  • the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the overall sequence.
  • a polynucleotide having homology or identity with the polynucleotide of the present application can be detected using the hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art depending on the purpose.
  • the appropriate stringency for hybridizing the polynucleotides depends on the length of the polynucleotides and the degree of complementarity, and the parameters are well known in the art (eg, J. Sambrook et al., supra).
  • the present application provides a vector comprising the polynucleotide of the present application.
  • the vector may be an expression vector for expressing the polynucleotide in a host cell, but is not limited thereto.
  • the vector of the present application refers to a DNA preparation containing a target polynucleotide sequence operably linked to a suitable regulatory sequence so that a target gene can be introduced in a suitable host.
  • the regulatory sequences may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • a target polynucleotide in a chromosome may be replaced with a mutated polynucleotide through a vector for intracellular chromosome insertion. Insertion of the polynucleotide into a chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used in the present application is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors may be used.
  • pBluescript II-based, pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based and the like can be used.
  • pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide may be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosome insertion.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • It may further include a selection marker (selection marker) for confirming whether the chromosome is inserted.
  • the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule is inserted, and selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface polypeptide expression. Markers to be given can be used. In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
  • the term “transformation” refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide may include all of them regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located extrachromosomally, as long as they can be expressed in the host cell.
  • the polynucleotide includes DNA and RNA encoding a target protein. The polynucleotide may be introduced into a host cell and expressed in any form, as long as it can be expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • the method for transforming the vector of the present application includes any method of introducing a nucleic acid into a cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Lithium acetate-DMSO method and the like, but is not limited thereto.
  • operably linked in the present application means that the gene sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a target protein of the present application.
  • the present application provides a Corynebacterium sp. strain comprising any one or more of the variant of the present application, or the polynucleotide of the present application, or the vector of the present application in another aspect.
  • the strain of the present application includes a strain comprising any one or more of the variant of the present application, the polynucleotide of the present application, and a vector including the polynucleotide of the present application; a strain modified to express a variant of the present application or a polynucleotide of the present application; a strain of the present application, or a strain expressing the polynucleotide of the present application (eg, a recombinant strain); Or it may be a strain having the mutant activity of the present application (eg, a recombinant strain), but is not limited thereto.
  • the strain of the present application is a cell or microorganism that is transformed with a vector containing the polynucleotide of the present application or a polynucleotide encoding the ClpC variant of the present application, and expresses the ClpC variant of the present application, for the purpose of the present application
  • the strain of the present application may include all microorganisms capable of producing branched chain amino acids, including the ClpC variant of the present application.
  • the strain of the present application may be a recombinant strain in which the ClpC variant is expressed by introducing a polynucleotide encoding the ClpC variant of the present application into a microorganism producing branched chain amino acids, thereby increasing branched chain amino acid production capacity.
  • the recombinant strain with increased branched chain amino acid production capacity is a natural wild-type microorganism or ClpC unmodified microorganism (ie, a microorganism expressing wild-type aldehyde dehydrogenase (SEQ ID NO: 5) or a mutant (SEQ ID NO: 1) protein expression) It may be a microorganism having increased branched chain amino acid production capacity compared to microorganisms that do not), but is not limited thereto.
  • ClpC unmodified microorganism is CA08-0072 strain (KCCM11201P, US 8465962 B2) or KCJI-38 (KCCM11248P, Korean Patent No. 10-1335789 ), but is not limited thereto.
  • the term "unmodified microorganism” does not exclude strains containing mutations that can occur naturally in microorganisms, and is either a wild-type strain or a natural-type strain itself, or a genetic mutation caused by natural or artificial factors. It may mean the strain before being changed.
  • the unmodified microorganism may refer to a strain in which the ClpC variant described herein has not been introduced or has been introduced.
  • the "unmodified microorganism” may be used interchangeably with "strain before modification", “microbe before modification”, “unmodified strain”, “unmodified strain”, "unmodified microorganism” or "reference microorganism".
  • the present application relates to a microorganism of the genus Corynebacterium in which the ATP-dependent protease activity of the present application is weakened compared to an unmodified microorganism, or a ClpC variant of the present application, or a polynucleotide encoding a ClpC variant of the present application Or, it provides a method for producing branched chain amino acids, comprising the step of culturing a microorganism of the genus Corynebacterium comprising the vector of the present application in a medium.
  • the term "cultivation” means growing the microorganisms of the genus Corynebacterium of the present application in appropriately controlled environmental conditions.
  • the culture process of the present application may be made according to a suitable medium and culture conditions known in the art. Such a culturing process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the culture may be a batch, continuous, and/or fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material in which nutrients required for culturing the microorganism of the genus Corynebacterium of the present application are mixed as a main component, and includes water essential for survival and development, as well as nutrients and development supplies, etc.
  • any medium and other culture conditions used for culturing the microorganisms of the genus Corynebacterium of the present application may be used without particular limitation as long as they are media used for culturing conventional microorganisms, but the genus Corynebacterium of the present application
  • the microorganism may be cultured in a conventional medium containing an appropriate carbon source, nitrogen source, phosphorus, inorganic compound, amino acid and/or vitamin, etc. under aerobic conditions while controlling temperature, pH, and the like.
  • the culture medium for the Corynebacterium sp. strain can be found in the literature ["Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)].
  • carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugar cane offal and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e., converted to reducing sugar). molasses) may be used, and other suitable carbon sources may be variously used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or degradation products thereof, defatted soybean cake or degradation products thereof, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract
  • the phosphorus may include potassium first potassium phosphate, second potassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • potassium first potassium phosphate potassium phosphate
  • second potassium phosphate or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and in addition, amino acids, vitamins and/or suitable precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, the present invention is not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. may be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester may be used to suppress bubble formation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without injection of gas or without gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions. it is not
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45° C., specifically, 25 to 40° C., and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the branched chain amino acids produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or remain in the cells.
  • the branched chain amino acid production method of the present application includes the steps of preparing the microorganism of the genus Corynebacterium of the present application, preparing a medium for culturing the microorganism, or a combination thereof (regardless of the order), for example, , before the culturing step, may be further included.
  • the method for producing branched-chain amino acids of the present application may further include recovering branched-chain amino acids from the culture medium (the culture medium) or the microorganism of the genus Corynebacterium of the present application.
  • the recovering step may be further included after the culturing step.
  • the recovery may be to collect the desired branched chain amino acids using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method, etc. .
  • a suitable method known in the art for example, centrifugation, filtration, treatment with a crystallized protein precipitant (salting out method), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity
  • chromatography such as island chromatography, HPLC, or a combination thereof may be used, and a desired branched-chain amino acid may be recovered from a medium or a microorganism using a suitable method known in the art.
  • the method for producing branched chain amino acids of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification may be performed using a suitable method known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed concurrently (or sequentially) regardless of the order, or simultaneously or in one step may be integrated and performed, but is not limited thereto.
  • variants, polynucleotides, vectors, microorganisms, branched chain amino acids, and the like are as described in the other aspects above.
  • the present application provides a variant of the present application in another embodiment, a polynucleotide encoding the variant, a vector comprising the polynucleotide, or a microorganism of the present application; Medium in which the microorganisms of the present application are cultured; Or it provides a composition for producing branched chain amino acids comprising a combination of two or more of them.
  • composition of the present application may further include any suitable excipients commonly used in compositions for the production of branched chain amino acids, and these excipients include, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffering agents, stabilizing agents or isotonic agents. and the like, but is not limited thereto.
  • composition of the present application variants, polynucleotides, vectors, strains, media and branched chain amino acids are the same as those described in the other aspects above.
  • the present application provides a use for producing branched-chain amino acids in a microorganism of the genus Corynebacterium, in which ATP-dependent protease activity is weakened compared to an unmodified microorganism.
  • the present application relates to a ClpC variant in which the amino acid sequence corresponding to positions 431 to 433 is deleted based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or a branched chain amino acid of a polynucleotide encoding the ClpC variant It provides production use.
  • L- valine-producing NTG strain Corynebacterium glutamicum CA08-0072 (KCCM11201P, US 8465962 B2) was plated on a nutrient medium containing agar at 30°C. Incubated for 36 hours.
  • composition of the nutrient medium is as follows.
  • Glucose 10g broth 5g, polypeptone 10g, sodium chloride 2.5g, yeast extract 5g, agar 20g, urea 2g (based on 1 liter of distilled water)
  • each colony was subcultured in a nutrient medium, and then each strain was inoculated in a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the production medium, and cultured with shaking at 30° C. for 72 hours at 200 rpm.
  • the composition of the nutrient medium and the production medium is as follows, respectively.
  • Glucose 10 g broth 5 g, polypeptone 10 g, sodium chloride 2.5 g, yeast extract 5 g, agar 20 g, urea 2 g (based on 1 liter of distilled water)
  • strain name L-valine (g/L) control CA08-0072 2.7 experimental group M1 3.0 M2 2.8 M3 2.5 M4 4.8 M5 3.5 M6 3.3 M7 2.9 M8 3.9 M9 3.5 M10 2.1 M11 1.1 M12 2.9 M13 2.5 M14 3.1 M15 4.7 M16 3.2
  • the M4 strain with the highest L-valine production was selected compared to the control strain CA08-0072.
  • Example 1 the major genes of the M4 strain with increased L-valine production ability were sequenced and compared with CA08-0072 strain and Corynebacterium glutamicum wild-type strain ATCC14067.
  • the M4 strain contains a mutation at a specific position in the ORF (Open Reading Frame) of clpC, which is one of the hexameric ATPase-active chaperon subunits constituting the ATP-dependent protease. It was confirmed that Specifically, it was confirmed that the M4 strain has a deletion of 1,291 to 1,299 nucleotides (SEQ ID NO: 4) in the sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • the sequence represented by SEQ ID NO: 6 is a sequence commonly included in the ORF of clpC of wild-type Corynebacterium glutamicum (ATCC14067, ATCC13032 and ATCC13869).
  • SEQ ID NO: 2 the 1,291 to 1,299 nucleotides (SEQ ID NO: 4) in the sequence represented by SEQ ID NO: 6 are deleted into L-valine-producing NTG strain Corynebacterium glutamicum CA08-0072 produced.
  • the genomic DNA of the ATCC14067 strain which is a wild-type Corynebacterium glutamicum, was extracted using a G-spin total DNA extraction mini kit (Intron, Cat. No 17045) according to the protocol provided in the kit.
  • Overlapping PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 10 using the two fragments as templates to obtain a PCR product of 1,040 bp (hereinafter, referred to as a "mutant introduction fragment").
  • PCR was performed after denaturation at 94°C for 5 minutes; After 25 repetitions of denaturation at 94° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 60 seconds; Polymerization was performed at 72° C. for 7 minutes.
  • the obtained mutated fragments were treated with restriction enzyme XbaI (New England Biolabs, Beverly, Mass.), and then replicated in Corynebacterium glutamicum treated with the same restriction enzyme.
  • Impossible pDZ vector US Patent No. 9109242 and International Patent Publication No. 2008-033001
  • T4 ligase New England Biolabs, Beverly, MA
  • the prepared recombinant plasmid pDZ-clpC_M4 was transformed into L-valine-producing strain, Corynebacterium glutamicum CA08-0072, by homologous recombination on the chromosome (van der Rest et al., Appl Microbiol). Biotechnol 52:541-545, 1999).
  • the strain into which the vector was inserted into the chromosome by recombination of the homologous sequence was selected in a medium containing 25 mg/L of kanamycin.
  • Fermentation potency evaluation was performed to compare the L-valine producing ability of the prepared L-valine producing strains, Corynebacterium glutamicum CA08-0072 and CA08-0072-clpC_M4.
  • each strain was inoculated in a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the production medium, and cultured with shaking at 30° C. for 72 hours at 200 rpm.
  • the composition of the nutrient medium and the production medium is as follows, respectively.
  • Glucose 10 g broth 5 g, polypeptone 10 g, sodium chloride 2.5 g, yeast extract 5 g, agar 20 g, urea 2 g (based on 1 liter of distilled water)
  • CA08-0072-clpC_M4 was named CA08-1542, and was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee institution under the Budapest Treaty on July 2, 2020, and was given an accession number KCCM12755P.
  • the genomic DNA of the ATCC14067 strain which is a wild type of Corynebacterium glutamicum, was extracted using a G-spin total 1 DNA extraction mini kit.
  • genomic DNA was extracted using a G-spin total 1 DNA extraction mini kit.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 11 and 12 and the primers of SEQ ID NOs: 13 and 14 to construct a vector introducing A42V mutation into the ilvN gene to generate gene fragments (A, B) were obtained respectively.
  • the primer sequences used herein are shown in Table 4 below.
  • Overlapping PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 11 and 14 using the two fragments as templates to obtain a 1044 bp PCR product (hereinafter, referred to as a "mutant introduction fragment").
  • PCR was performed after denaturation at 94°C for 5 minutes; After 25 repetitions of denaturation at 94° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 60 seconds; Polymerization was performed at 72° C. for 7 minutes. As a result, polynucleotides of 537 bp were obtained for both fragments A and B.
  • the obtained mutated fragment was treated with a restriction enzyme XbaI, and then ligated with a pDZ vector treated with the same restriction enzyme using T4 ligase.
  • a restriction enzyme XbaI ligated with a pDZ vector treated with the same restriction enzyme using T4 ligase.
  • T4 ligase T4 ligase
  • the vector for the purpose of introducing the A42V mutation of the ilvN gene was named pDZ-ilvN (A42V).
  • the recombinant plasmid pDZ-ilvN (A42V) constructed above was transformed into a wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC14067 by homologous recombination on the chromosome.
  • the strain into which the vector was inserted into the chromosome by recombination of the homologous sequence was selected in a medium containing 25 mg/L of kanamycin. Thereafter, the gene fragment was amplified through PCR using the primers of SEQ ID NOs: 11 and 14 for the Corynebacterium glutamicum transformant on which the secondary recombination was completed, and the mutant introduced strain was identified through gene sequence analysis. .
  • the recombinant strain into which the mutation was introduced was named Corynebacterium glutamicum CJ7V.
  • CJ7V-clpC_M4 was transformed in the same manner as in Example 3-1 to prepare a strain in which the mutation was introduced into the ORF of clpC, and this was named CJ7V-clpC_M4.
  • the L-valine concentrations were analyzed by culturing in the same manner as in Example 3-1, and the analyzed L-valine concentrations are shown in Table 5 below.
  • the recombinant vector pDZ-clpC_M4 prepared in Example 3-1 was transformed into CJ8V.
  • the strain into which the vector was inserted into the chromosome by recombination of the homologous sequence was selected in a medium containing 25 mg/L of kanamycin. Thereafter, the strain into which the clpC mutation was introduced was identified using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 10 for the Corynebacterium glutamicum transformant on which the secondary recombination was completed.
  • the identified recombinant strain was named Corynebacterium glutamicum CJ8V-clpC_M4.
  • the L-valine concentrations were analyzed by culturing in the same manner as in Example 3-1, and the analyzed L-valine concentrations are shown in Table 6 below.
  • Example 3 the recombinant plasmid pDZ-clpC_M4 prepared in Example 3-1 was transferred to Corynebacterium glutamicum KCJI-38 (KCCM11248P, US Patent US 9885093), which is an L-isoleucine-producing strain, on the chromosome.
  • Corynebacterium glutamicum KCJI-38 (KCCM11248P, US Patent US 9885093), which is an L-isoleucine-producing strain, on the chromosome.
  • a strain introduced by homologous recombination of was prepared and named KCJI-38-clpC_M4.
  • the produced strain was cultured in the following manner to compare isoleucine-producing ability.
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of a seed medium, and cultured with shaking at 30° C. for 20 hours at 200 rpm. Then, 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the production medium and cultured with shaking at 30° C. for 48 hours at 200 rpm.
  • the composition of the species medium and the production medium is as follows, respectively.
  • Glucose 50 g (NH 4 ) 2 SO 4 12.5 g, Soy Protein 2.5 g, Corn Steep Solids 5 g, Urea 3 g, KH 2 PO 4 1 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, Biotin 100 ⁇ g, thiamine hydrochloride 1000 ⁇ g, calcium-pantothenic acid 2000 ⁇ g, nicotinamide 3000 ⁇ g, CaCO 3 30 g (based on 1 liter of distilled water)
  • the KCJI-38-clpC_M4 was named CA10-3123, and it was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center, a trustee institution under the Budapest Treaty, on December 1, 2020, and was given an accession number KCCM12858P.
  • the known aspartokinase mutant (lysC(L377K)) based on the Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (hereinafter WT) strain (lysC(L377K)) (US 10662450 B2), homoserine dehydrogenase variant (hom(R407H)) ( Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612-620 (1996) ) and L-threonine dehydratase variant (ilvA) (V323A)) (Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p.4345-4351) was prepared and the L-isoleucine-producing ability was compared.
  • WT Corynebacterium glutamicum ATCC13032
  • ilvA L-threonine dehydratase variant
  • V323A L-threonine dehydratase variant
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 15 and 16 or SEQ ID NOs: 17 and 18 using the WT chromosome as a template.
  • the primer sequences used herein are shown in Table 8 below.
  • PCR was performed at 95°C for 5 minutes, followed by denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a 509 bp DNA fragment at the 5' upper end and a 520 bp DNA fragment at the 3' lower end were obtained centering on the mutation of the lysC gene.
  • SEQ ID NOs: 15 and PCR was performed with 18 primers. After denaturation at 95° C. for 5 minutes, denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C.
  • a 1011 bp DNA fragment containing a mutation (L377K) of the lysC gene encoding an aspartokinase variant in which the leucine at position 377 was substituted with a lysine was amplified.
  • the pDZ vector and the amplified 1011 bp DNA fragments were treated with restriction enzyme XbaI, ligated using a DNA conjugation enzyme, and then cloned to obtain a plasmid, which was named pDZ-lysC (L377K).
  • the pDZ-lysC (L377K) vector obtained above was introduced into the WT strain by an electric pulse method (Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999, 52:541-545)), and then transformed in a selective medium containing 25 mg/L of kanamycin. strains were obtained.
  • a strain, WT::lysC (L377K) in which a nucleotide mutation was introduced into the lysC gene by the DNA fragment inserted on the chromosome, was obtained.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 19 and 20 and SEQ ID NOs: 21 and 22 using WT genomic DNA as a template.
  • the primer sequences used herein are shown in Table 9 below.
  • PCR was performed at 95°C for 5 minutes, followed by denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a 220 bp DNA fragment at the 5' upper end and a 220 bp DNA fragment at the 3' lower end were obtained centering on the mutation of the hom gene.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 19 and 22 using the obtained two PCR products as templates. After denaturation at 95° C. for 5 minutes, denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C.
  • the obtained pDZ-hom(R407H) vector was introduced into the WT::lysC(L377K) strain by an electric pulse method, and then the transformed strain was obtained in a selective medium containing 25 mg/L of kanamycin.
  • a strain, WT::lysC(L377K)-hom(R407H) in which a nucleotide mutation was introduced into the hom gene by the DNA fragment inserted on the chromosome, was obtained.
  • the recombinant plasmid pDZ-clpC_M4 prepared in Example 3-1 was introduced into the WT::lysC(L377K)-hom(R407H) strain by homologous recombination on the chromosome in the same manner as in the above example, and WT: :lysC(L377K)-hom(R407H)-clpC_M4 was named.
  • primers of SEQ ID NOs: 23 and 26 a BamHI restriction enzyme site (indicated by an underline) was inserted at each end, and the primers of SEQ ID NOs: 24 and 25 were designed to cross each other so that a nucleotide substitution mutation (indicated by an underline) was located. did The primer sequences designed here are shown in Table 10 below.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 using the WT chromosome as a template. PCR was performed at 95°C for 5 minutes, followed by denaturation at 95°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 30 seconds repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes. As a result, a 627 bp DNA fragment at the 5' upper end and a 608 bp DNA fragment at the 3' lower end were obtained centering on the mutation of the ilvA gene.
  • SEQ ID NO: 23 and the sequence PCR was performed with the primer number 26. After denaturation at 95° C. for 5 minutes, denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 60 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes.
  • pECCG117 Republic of Korea Patent No.
  • ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC/pECCG117-ilvA(V323A) strain introduced with pECCG117-ilvA(V323A) vector into ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC_M4 of the above example was produced.
  • a strain in which only ilvA(V323A) mutation was introduced into ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K) as its control was also prepared.
  • the prepared strains were cultured in the same manner as in the flask culture method shown in Example 4-1, and the L-isoleucine concentration in the culture medium was analyzed.
  • the concentrations of L-isoleucine in the culture medium for each strain tested are shown in Table 11 below.
  • ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K) introduced only ilvA(V323A) mutation
  • ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC_M4/pECCG117-ilvA(V323A) into which the clpC_M4 mutation was additionally introduced it was confirmed that the concentration of L-isoleucine increased by about 42%.

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Abstract

본 출원은 변이형 ATP-의존적 프로테아제(ATP-dependent protease) 활성이 비변형 미생물에 비해 약화된 코리네박테리움 속 미생물 또는 ClpC 변이체를 이용한 L-분지쇄 아미노산 생산 방법에 관한 것으로, 분지쇄 아미노산을 높은 효율로 생산할 수 있으며, 제조된 L-분지쇄 아미노산은 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.

Description

변이형 ATP-의존적 프로테아제 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산 방법
본 출원은 변이형 ATP-의존적 프로테아제(ATP-dependent protease) 및 이를 이용한 L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
L-아미노산은 단백질의 기본 구성단위로서, 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등의 중요 소재로 사용된다. 특히 분지쇄 아미노산(Brached Chain Amino Acids, BCAA)는 필수 아미노산인 L-발린, L-루이신, L-이소류신을 총칭하는 것으로, 상기 분지쇄 아미노산는 항산화 효과 및 근육세포의 단백질 합성작용을 직접적으로 촉진시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 미생물을 이용한 분지쇄 아미노산의 생산은, 주로 에스케리키아속 미생물 또는 코리네박테리움 속 미생물을 통해 이루어지며, 피루브산으로부터 여러 단계를 거쳐 케토이소카프로산(2-ketoisocaproate)을 전구체로 생합성된다고 알려져 있다(미국등록특허 US 9885093, 미국등록특허 US 10351859, 미국등록특허 US 8465962). 그러나, 상기 미생물을 통한 분지쇄 아미노산의 생산은 공업적으로 대량 제조가 쉽지 않은 문제점이 있었다.
다만, 분지쇄 아미노산의 수요 증가에 따라 효과적인 분지쇄 아미노산의 생산능 증가를 위한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 발명자들은 분지쇄 아미노산의 생산능 증가를 위해 예의 노력한 결과, 변이형 ATP-의존적 프로테아제를 이용하여 분지쇄 아미노산을 고농도로 생산하는 방법을 개발하여 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 ATP-의존적 프로테아제(ATP-dependent protease) 활성이 비변형 미생물에 비해 약화된, 바람직하게는 분지쇄 아미노산 생산능을 가진 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 431번째 내지 433번째 위치에 상응하는 아미노산 서열이 결손된, ClpC 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물, 또는 본 출원의 ClpC 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드, 또는 이를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 분지쇄 아미노산 생산방법을 제공하는 것이다.
본 출원에 따른 미생물은 분지쇄 아미노산을 높은 효율로 생산할 수 있다. 또한, 제조된 분지쇄 아미노산은 약품 원료와 식품첨가제, 동물 사료, 영양제, 살충제, 살균제 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원은 하나의 양태로 ATP-의존적 프로테아제(ATP-dependent protease) 활성이 비변형 미생물에 비해 약화된, 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어, "ATP-의존적 프로테아제(ATP-dependent protease) (EC 3.4.21.92)"는 ATP 및 Mg2+의 존재 하에서 단백질을 작은 펩티드로 가수 분해하는 효소를 의미한다. 본 출원의 ATP-의존적 프로테아제는 엔도펩티다제 Clp, ATP-의존적 Clp 프로테아제, ClpP, Clp 프로테아제와 혼용될 수 있다.
본 출원의 ATP-의존적 프로테아제 약화는 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛(ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit)의 활성 약화일 수 있다.
상기 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛은 AAA 패밀리 ATPase(AAA family ATPase) 또는 ClpC와 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 상기 서브유닛은 clpC에 의해 코딩되는 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛은 코리네박테리움 속 유래일 수 있다. 일 예로, 본 출원의 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다.
본 출원의 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛은 서열번호 5 또는 이와 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일 예로, 본 출원의 서열번호 5의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열은 본 출원의 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 96.26% 이상, 97% 이상, 97.5% 이상, 97.7% 이상, 97.8% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 98.7% 이상, 98.8% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 그 이상, 및 100% 미만의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛에 동일 또는 상응하는 활성을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결손, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 약화 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원의 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛은 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드를 가지거나, 또는 상기 폴리펩티드로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질(consisting essentially of) 수 있다. 본 출원의 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛은 서열번호 5 또는 이와 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가(즉, 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가) 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우도 포함될 수 있다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 출원의 미생물은 서열번호 5로 표시되는 서열의 서열번호를 기준으로 431번째 내지 433번째 위치에 상응하는 아미노산이 결손된 폴리펩티드, 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열의 서열번호를 기준으로 1,291번 내지 1,299번째 위치에 상응하는 뉴클레오티드가 결손된 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기이거나, 또는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산 또는 뉴클레오티드를 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 5 또는 서열번호 6과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 6의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기 또는 서열번호 6의 뉴클레오티드 잔기와 상응하는 뉴클레오티드 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형(예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
또한, 상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원의 미생물은 분지쇄 아미노산 생산능을 가질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 분지쇄 아미노산은 L-발린 또는 L-이소류신일 수 있다.
본 출원에서 용어, "미생물(또는, 균주)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 균주는 분지쇄 아미노산 생산능이 없는 모균주에 분지쇄 아미노산 생산능이 부여된 미생물 또는 분지쇄 아미노산 생산능을 가지고 있는 미생물에서 자연적으로 존재하는 ATP-의존적 프로테아제 대신 본 출원의 약화된 ATP-의존적 프로테아제 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 본 출원의 약화된 ATP-의존적 프로테아제로 변형될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에 있어서, 상기 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 변이체가 발현되고 분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물은 상기 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하여, ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 변이체가 발현되어 분지쇄 아미노산 생산능이 증가된 것을 특징으로 하는 미생물일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 변이체가 발현되고 분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물, 또는 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 변이체 발현능 및 분지쇄 아미노산 생산능을 갖는 미생물은, ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 활성이 약화되고 분지쇄 아미노산 생합성 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화되거나, ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 활성이 약화되고 분지쇄 아미노산 분해 경로 내 유전자 일부가 강화 또는 약화된 미생물일 수 있다.
본 출원의 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 아세토락테이트 신타아제 아이소자임 1 서브유닛(Acetolactate synthase isozyme 1 small subunit) 활성이 강화, 아스파르토키나아제(aspartokinase) 활성이 강화, 호모세린 탈수소효소(homoserine dehydrogenase) 활성이 약화 및/또는 L-쓰레오닌 탈수효소 생합성 IlvA(L-threonine dehydratase biosynthetic IlvA) 활성이 강화된 미생물일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드 활성의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형(예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위(engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있다.
본 출원은 다른 하나의 양태로 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 431번째 내지 433번째 위치에 상응하는 아미노산 서열이 결손된, ClpC 변이체를 제공한다.
상기 ClpC 변이체는 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 변이체일 수 있다. "ClpC"또는 "ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛"은 앞서 설명한 바와 같다.
일 예로, 본 출원의 ClpC 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 출원의 ClpC 변이체는 상기 설명한 바와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드를 가지거나, 또는 상기 폴리펩티드로 이루어지거나, 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 ClpC 변이체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 ClpC 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al.(1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 활성을 가질 수 있다. 또한, 본 출원의 변이체는 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 활성을 갖는 야생형 폴리펩티드에 비해 분지쇄 아미노산 생산이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로 본 출원의 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 "ClpC 변이체"및 "ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛 변이체"는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산염기 서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 이와 90% 이상의 동일성을 가지는 핵산염기 서열로 기재된 폴리뉴클레오티드를 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 핵산염기 서열로 기재된 폴리뉴클레오티드로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원은 또 다른 하나의 양태로 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 도입할 수 있도록, 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 목적 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 출원의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 출원의 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, 코리네박테리움 속 균주를 제공한다.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 균주; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주 (예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 균주 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 ClpC 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 균주는 본 출원의 ClpC 변이체를 포함하여 분지쇄 아미노산을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 분지쇄 아미노산을 생산하는 미생물에 본 출원의 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 ClpC 변이체가 발현되어, 분지쇄 아미노산 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 분지쇄 아미노산 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 ClpC 비변형 미생물 (즉, 야생형 알데하이드 디하이드로게나제(서열번호 5)를 발현하는 미생물 또는 변이형 (서열번호 1) 단백질을 발현하지 않는 미생물)에 비하여 분지쇄 아미노산 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로, 상기 분지쇄 아미노산 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, ClpC 비변형 미생물은 CA08-0072 균주(KCCM11201P, US 8465962 B2) 또는 KCJI-38(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제 10-1335789호)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 ClpC 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로 본 출원의 ATP-의존적 프로테아제 활성이 비변형 미생물에 비해 약화된 코리네박테리움 속 미생물, 또는 본 출원의 ClpC 변이체, 또는 본 출원의 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 분지쇄 아미노산 생산방법을 제공한다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 분지쇄 아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 분지쇄 아미노산 생산방법은, 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 분지쇄 아미노산 생산방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 본 출원의 코리네박테리움 속 미생물로부터 분지쇄 아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 분지쇄 아미노산을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 분지쇄 아미노산을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 분지쇄 아미노산 생산방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 분지쇄 아미노산 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 이시적(또는 연속적)으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 미생물 및 분지쇄 아미노산 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 본 출원의 미생물; 본 출원의 미생물을 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 분지쇄 아미노산 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원의 조성물은 분지쇄 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 균주, 배지 및 분지쇄 아미노산 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로 ATP-의존적 프로테아제 활성이 비변형 미생물에 비해 약화된, 코리네박테리움 속 미생물의 분지쇄 아미노산 생산 용도를 제공한다.
본 출원은 또 다른 하나의 양태로 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 431번째 내지 433번째 위치에 상응하는 아미노산 서열이 결손된 ClpC 변이체, 또는 상기 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 분지쇄 아미노산 생산 용도를 제공한다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1. 인공변이법을 통한 L-발린 생산능 증가 변이주 선별
1-1. UV조사를 통한 인공 돌연변이 유발
L-발린 생산능이 증가된 변이주를 선별하기 위하여, L-발린 생산 NTG 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CA08-0072(KCCM11201P, US 8465962 B2)를 한천을 포함하는 영양배지에 도말하여 30℃에서 36시간 동안 배양하였다.
이를 통해 획득한 수백 개의 콜로니를 실온에서 UV를 조사하여 균주 내 게놈상에 무작위 돌연변이를 유발시켰다.
상기 영양배지의 조성은 하기와 같다.
<영양배지 (pH 7.2)>
포도당 10g, 육즙 5g, 폴리펩톤 10g, 염화나트륨 2.5g, 효모엑기스 5g, 한천 20g, 유레아 2g (증류수 1리터 기준)
1-2. 돌연변이 유발 균주 발효역가 실험 및 균주 선별
실시예 1-1에서 모균주로 사용된 코리네박테리움 글루타미쿰 CA08-0072 대비 L-발린의 생산능이 증가된 변이주를 선별하고자 무작위 돌연변이가 유발된 균주들을 대상으로 발효 역가 실험을 실시하였다.
구체적으로, 각각의 콜로니는 영양배지에서 계대 배양된 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 영양배지와 생산배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<영양배지 (pH 7.2)>
포도당 10 g, 육즙 5 g, 폴리펩톤 10 g, 염화나트륨 2.5 g, 효모엑기스 5 g, 한천 20 g, 유레아 2 g (증류수 1리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 1에 나타내었다.
균주명 L-발린(g/L)
대조군 CA08-0072 2.7
실험군 M1 3.0
M2 2.8
M3 2.5
M4 4.8
M5 3.5
M6 3.3
M7 2.9
M8 3.9
M9 3.5
M10 2.1
M11 1.1
M12 2.9
M13 2.5
M14 3.1
M15 4.7
M16 3.2
상기 표 1을 참고하여, 대조군인 CA08-0072 균주에 비하여 L-발린 생산량이 가장 많이 증가한 M4 균주를 선별하였다.
실시예 2. 유전자 시퀀싱을 통한 변이 확인
상기 실시예 1에서 L-발린 생산능이 증가된 M4 균주의 주요 유전자들을 시퀀싱하여 CA08-0072 균주 및 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형 균주 ATCC14067와 비교하였다. 그 결과, 상기 M4 균주가 ATP 의존성 프로테아제(ATP-dependent protease)를 구성하는 헥사머 ATPase 활성 샤페론(hexameric ATPase-active chaperon) 서브유닛 중 하나인 clpC의 ORF(Open Reading Frame) 특정 위치에 변이를 포함하고 있음을 확인하였다. 구체적으로, M4 균주는 서열번호 6으로 표시되는 서열 내 1,291~1,299번째 뉴클레오티드(서열번호 4)가 결손되어 있음을 확인하였다. 상기 서열번호 6으로 표시되는 서열은 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC14067, ATCC13032 및 ATCC13869)의 clpC의 ORF에 공통적으로 포함된 서열이다.
이하 실시예에서는, 상기 변이가 코리네박테리움 속 미생물의 아미노산의 생산량에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
실시예 3. 변이가 도입된 균주 제작 및 L-발린 생산능 확인
3-1. 코리네박테리움 글루타미쿰 CA08-0072에 변이가 도입된 균주 제작 및 L-발린 생산능 평가
서열번호 6으로 표시되는 서열 내 1,291~1,299번째 뉴클레오티드(서열번호 4)가 결손된 뉴클레오티드(서열번호 2)를 L-발린 생산 NTG 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CA08-0072에 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 G-스핀 총 DNA 추출 미니 키트(Intron사, Cat. No 17045)를 이용하여 키트에 제공된 프로토콜에 따라 추출하였다. 상기 각 게노믹 DNA들을 주형으로 하고 서열번호 7, 8의 프라이머 및 서열번호 9, 10의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 DNA 단편(A, B)을 각각 얻었다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.
서열번호 서열명 서열
7 P1 ctat tctaga tccagagaccctcaaggacaagcag
8 P2 ggacggtgcggtcatgcgcatgcgggcgcc
9 P3 ggcgcccgcatgcgcatgaccgcaccgtcc
10 P4 ctat tctaga tcgatttggatgagggaatcatcg
상기 두 단편을 주형으로 서열번호 7, 10의 프라이머를 이용하여 오버래핑(Overlapping) PCR을 실시하여 1,040bp의 PCR 결과물(이하, "변이 도입 단편"이라 명명함)을 얻었다. PCR은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.수득한 변이 도입 단편들을 제한효소 XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(미국등록특허 US 9109242 및 국제 공개특허 제2008-033001호)와 T4 리가아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질 전환시킨 후, 이를 25 ㎎/L 카나마이신(kanamycin) 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-스핀 플라스미드 DNA 정제 키트(Intron 사)로 DNA를 획득하여 재조합 플라스미드 pDZ-clpC_M4를 제조하였다.
상기 제작한 재조합 플라스미드 pDZ-clpC_M4를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 L-발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CA08-0072에 형질 전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999). 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 25 ㎎/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합(cross-over)이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 7, 10의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 염색체상에서 clpC의 ORF에 변이가 도입된 균주를 제조하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA08-0072-clpC_M4라 명명하였다.
제작한 L-발린 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CA08-0072와 CA08-0072-clpC_M4의 L-발린 생성능을 비교하기 위하여 발효 역가 평가를 수행하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 영양배지에서 계대 배양한 후, 생산 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 영양배지와 생산배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<영양배지 (pH 7.2)>
포도당 10 g, 육즙 5 g, 폴리펩톤 10 g, 염화나트륨 2.5 g, 효모엑기스 5 g, 한천 20 g, 유레아 2 g (증류수 1리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, 황산암모늄 40 g, 대두단백질 2.5 g, 옥수수침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, 제2인산칼륨 1 g, 황산마그네슘7수염 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민-HCl 1 ㎎, 판토텐산칼슘 2 ㎎, 니코틴아마이드 3 ㎎, 탄산칼슘 30 g (증류수 1리터 기준)
이후, HPLC를 이용하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 3에 나타내었다.
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 CA08-0072 2.8 2.6 2.7 2.7
실험군 CA08-0072-clpC_M4 3.2 3.1 3.0 3.1
상기 표 3의 결과와 같이, CA08-0072-clpC_M4 균주의 L-발린 생산능은 대조군 대비 14% 증가함을 확인하였다. 결과적으로, clpC의 ORF 변이를 통해서 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
상기 CA08-0072-clpC_M4는 CA08-1542로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 7월 2일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12755P를 부여받았다.
3-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V에 변이가 도입된 균주의 제작 및 L-발린 생산능 평가
L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 1종의 변이[ilvN(A42V); Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467]를 도입하여 L-발린 생산능이 향상된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형인 ATCC14067 균주의 게노믹 DNA를 G-스핀 총l DNA 추출 미니 키트를 이용하여 추출하였다. 상기 게노믹 DNA를 주형으로 하고 ilvN 유전자에 A42V 변이를 도입하는 벡터를 제작하기 위해 서열번호 11, 12의 프라이머 및 서열번호 13, 14의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 유전자 단편(A, B)을 각각 얻었다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 4와 같다.
서열번호 서열명 서열
11 P5 aatttctagaggcagaccctattctatgaagg
12 P6 agtgtttcggtctttacagacacgagggac
13 P7 gtccctcgtgtctgtaaagaccgaaacact
14 P8 aatttctagacgtgggagtgtcactcgcttgg
상기 두 단편을 주형으로 서열번호 11, 14의 프라이머를 이용하여 Overlapping PCR을 실시하여 1044bp의 PCR 결과물 (이하, "변이 도입 단편"이라 명명함)을 얻었다. PCR은 94℃에서 5분간 변성한 후; 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 어닐링, 및 72℃ 60초 중합을 25회 반복한 후; 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 단편 A, B 모두 537bp의 폴리뉴클레오티드를 획득할 수 있었다. 수득한 변이 도입 단편을 제한효소 XbaI로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pDZ 벡터와 T4 리가아제를 이용하여 라이게이션하였다. 상기 제작한 유전자를 대장균 DH5α에 형질전환시킨 후, 이를 카나마이신 25㎎/L 함유 LB배지에서 선별하고, DNA-스핀 플라스미드 DNA 정제 키트로 DNA를 획득하였다. 상기 ilvN 유전자의 A42V 변이 도입을 목적으로 하는 벡터를 pDZ-ilvN(A42V)라 명명하였다.
이후, 상기에서 제작된 재조합 플라스미드 pDZ-ilvN(A42V)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 야생형인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14067에 형질 전환시켰다. 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 25㎎/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 11, 14의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 유전자 단편을 증폭한 뒤, 유전자 서열 분석을 통하여 변이 도입 균주를 확인하였다. 상기 변이가 도입된 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V라 명명하였다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ7V를 대상으로 실시예 3-1와 같은 방법으로 pDZ-clpC_M4가 형질 전환되어 clpC의 ORF에 변이가 도입된 균주를 제작하고 이를 CJ7V-clpC_M4로 명명하였다.
제작된 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 5에 나타내었다.
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 CJ7V 2.1 2.2 2.2 2.2
실험군 CJ7V-clpC_M4 2.6 2.4 2.5 2.5
상기 표 5의 결과와 같이, CJ7V-clpC_M4 균주의 L-발린 생산능은 대조군 대비 14% 증가함을 확인하였다. 즉, 코리네박테리움 속 미생물에서 clpC 유전자의 ORF 변이를 통해서 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 다시 한번 확인하였다.
3-3. 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V에 변이가 도입된 균주의 제작 및 L-발린 생산능 평가
L-발린을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주들에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 실시예 3-2와 같은 방법으로 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869에 1종의 변이[ilvN(A42V)]를 도입하여 L-발린 생산능을 갖는 변이주를 제작하고, 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V라 명명하였다.
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V를 대상으로 clpC 변이가 도입된 균주를 제작하기 위해, 실시예 3-1에서 제작한 재조합 벡터 pDZ-clpC_M4를 CJ8V에 형질 전환시켰다. 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 25㎎/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 이후 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환주를 대상으로 서열번호 7, 10의 프라이머를 이용하여 clpC 변이가 도입된 균주를 확인하였다. 상기 확인된 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ8V-clpC_M4으로 명명하였다.
제작한 균주의 L-발린 생산능을 비교하고자 실시예 3-1과 동일한 방법으로 배양하여 L-발린의 농도를 분석하였고, 분석한 L-발린의 농도를 하기 표 6에 나타내었다.
균주 L-발린 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 CJ8V 1.8 1.9 1.9 1.9
실험군 CJ8V-clpC_M4-14067 2.2 2.1 2.1 2.13
상기 표 6의 결과와 같이, CJ8V-clpC_M4 균주의 L-발린 생산능은 대조군 대비 12% 증가함을 확인하였다. 즉, 코리네박테리움 속 미생물에서 clpC 유전자의 ORF 변이를 통해서 L-발린의 생산능을 향상시킬 수 있음을 다시 한번 확인하였다.
실시예 4. 이소류신 생산 균주 제작 및 생산능 평가
4-1. L-이소류신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P 균주에서 clpC ORF 변이가 도입된 균주의 제작 및 평가
상기 실시예 3와 동일한 방법으로 L-이소류신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCJI-38(KCCM11248P, 미국등록특허 US 9885093)에 실시예 3-1에서 제작한 재조합 플라스미드 pDZ-clpC_M4를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 도입한 균주를 제작하고 KCJI-38-clpC_M4라 명명하였다. 제작된 균주를 아래와 같은 방법으로 배양하여 이소류신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종 배지(pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 50 g, (NH4)2SO4 12.5 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO47H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
배양종료 후 HPLC로 L-이소류신의 생산능을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도는 하기 표 7과 같다.
균주 L-이소류신 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCJI-38 1.4 1.5 1.3 1.4
실험군 KCJI-38-clpC_M4 2.1 2.4 2.0 2.17
상기 표 7에서 나타난 바와 같이 L-이소류신 생산 균주 KCJI-38에 비하여 clpC 변이가 도입된 KCJI-38-clpC_M4에서는 L-이소류신의 농도가 약 55% 증가함을 확인하였다. 이를 통해 clpC 유전자의 변이를 통해서 L-이소류신의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.상기의 결과는 코리네박테리움 속 L-이소류신 생산 균주에서 clpC ORF 변이의 도입이 L-이소류신 생산에 효과적임을 나타내었다.
상기 KCJI-38-clpC_M4는 CA10-3123으로 명명하였으며, 부다페스트조약 하의 수탁기관인 한국미생물보존센터에 2020년 12월 1일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12858P를 부여받았다.
4-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주 ATCC13032에서의 clpC ORF 변이가 도입된 L-이소류신 균주의 제작 및 L-이소류신 생산능 평가
clpC-M4 변이 도입에 의한 L-이소류신 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(이하 WT) 균주 기반으로 기 공지된 아스파토키나제(aspartokinase) 변이체(lysC(L377K)) (US 10662450 B2), 호모세린 탈수소효소(homoserine dehydrogenase) 변이체(hom(R407H)) (Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612-620 (1996)) 및 트레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase) 변이체(ilvA(V323A)) (Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p.4345-4351)를 도입한 균주를 제작하여 L-이소류신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 15 및 16 혹은 서열번호 17 및 18 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 8과 같다.
서열번호 서열명 염기서열
15 P9 tcctctagaGCTGCGCAGTGTTGAATACG
16 P10 TGGAAATCttTTCGATGTTCACGTTGACAT
17 P11 ACATCGAAaaGATTTCCACCTCTGAGATTC
18 P12 gactctagaGTTCACCTCAGAGACGATTA
PCR은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 509 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 520 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 15 및 18의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루신이 라이신으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 암호화하는 lysC 유전자의 변이(L377K)를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. pDZ 벡터와 증폭된 1011 bp의 DNA 단편들을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-lysC(L377K)라 명명하였다.
위에서 획득한 pDZ-lysC(L377K) 벡터를 WT 균주에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999, 52:541-545))으로 도입한 후 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합 과정으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 lysC 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::lysC(L377K)를 획득하였다.
또한, hom(R407H)를 도입하는 벡터를 제작하기 위하여 WT 게노믹 DNA를 주형으로 서열번호 19와 20, 서열번호 21과 22의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 9와 같다.
서열번호 서열명 서열
19 P13 tcctctagaCTGGTCGCCTGATGTTCTAC
20 P14 CACGATCAGATGTGCATCATCAT
21 P15 ATGATGATGCACATCTGATCGTG
22 P16 gactctagaTTAGTCCCTTTCGAGGCGGA
PCR은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 220 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 220 bp의 DNA 단편을 수득하였다. 수득한 2 개의 PCR 산물을 주형으로 서열번호 19와 22의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, hom 유전자의 변이를 포함하는 440 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. 앞서 사용된 pDZ 벡터와 증폭된 440 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-hom(R407H)라 명명하였다.
획득한 pDZ-hom(R407H) 벡터를 WT::lysC(L377K) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합 과정으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 hom 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::lysC(L377K)-hom(R407H)를 획득하였다.
상기 실시예와 동일한 방법으로 WT::lysC(L377K)-hom(R407H) 균주에 실시예 3-1에서 제작한 재조합 플라스미드 pDZ-clpC_M4를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 도입된 균주를 제작하고 WT::lysC(L377K)-hom(R407H)-clpC_M4라 명명하였다.
한편, ilvA 유전자를 대상으로 기 공지된 ilvA(V323A) 변이(S. Morbach et al., Appl. Enviro. Microbiol., 62(12): 4345-4351, 1996)가 도입된 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 23 및 24)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 25 및 26)을 고안하였다. 서열번호 23 및 26의 프라이머는 각 말단에 BamHI 제한효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 24 및 25의 프라이머는 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다. 여기에서 고안된 프라이머 서열은 하기 표 10과 같다.
서열번호 서열명 서열
23 P17 ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG
24 P18 ACACCACGgCAGAACCAGGTGCAAAGGACA
25 P19 CTGGTTCTGcCGTGGTGTGCATCATCTCTG
26 P20 ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 627 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 608 bp의 DNA 단편을 수득하였다.증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 23 및 서열번호 26의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 323번째 L-발린이 알라닌으로 치환된 IlvA 변이체를 암호화하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1217 bp의 DNA 단편이 증폭되었다. pECCG117 (대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 1217 bp의 DNA 단편을 제한효소 BamHI으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117-ilvA(V323A) 라 명명하였다.
pECCG117-ilvA(V323A) 벡터를 위 실시예의 ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC_M4에 도입한 ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC/pECCG117-ilvA(V323A) 균주를 제작하였다. 또한 이의 대조군으로 ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)에 ilvA(V323A) 변이만 도입된 균주도 제작하였다.
상기 제작된 균주들을 실시예 4-1에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-이소류신 농도를 분석하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도는 하기 표 11과 같다.
균주 L-이소류신 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V323A) 4.1 4.0 4.3 4.13
실험군 ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC/pECCG117-ilvA(V323A) 6.3 5.7 5.6 5.87
상기 표 11에서 나타난 바와 같이 ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)에 ilvA(V323A) 변이만 도입된 ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V323A)에 비하여 clpC_M4 변이가 추가로 도입된 ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-clpC_M4/pECCG117-ilvA(V323A)에서는 L-이소류신의 농도가 약 42% 증가함을 확인하였다. 상기의 결과는 코리네박테리움 속 L-이소류신 생산 균주에서 clpC 변이의 도입이 L-이소류신 생산에 효과적임을 나타내었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2021008881-appb-img-000001
Figure PCTKR2021008881-appb-img-000002

Claims (15)

  1. ATP-의존적 프로테아제 활성이 비변형 미생물에 비해 약화된, 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 분지쇄 아미노산 생산능을 가진 것인, 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분지쇄 아미노산은 L-발린 또는 L-이소류신인, 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약화는 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛의 활성 약화인, 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛은 코리네박테리움 속 유래인, 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 ATP-의존적 Clp 프로테아제 ATP-바인딩 서브유닛은 서열번호 5 또는 이와 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 서열번호 5로 표시되는 서열의 서열번호를 기준으로 431번째 내지 433번째 위치에 상응하는 아미노산이 결손된 폴리펩티드, 또는 서열번호 6으로 표시되는 서열의 서열번호를 기준으로 1,291번 내지 1,299번째 위치에 상응하는 뉴클레오티드가 결손된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 속 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것인, 미생물.
  9. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 431번째 내지 433번째 위치에 상응하는 아미노산 서열이 결손된, ClpC 변이체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드를 포함하는 것인, ClpC 변이체.
  11. 제9항의 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  12. ATP-의존적 프로테아제 활성이 비변형 미생물에 비해 약화된 코리네박테리움 속 미생물, 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 431번째 내지 433번째 위치에 상응하는 아미노산 서열이 결손된 ClpC 변이체, 또는 상기 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 분지쇄 아미노산 생산방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 배양하는 단계 이후 배지 또는 미생물로부터 분지쇄 아미노산을 회수하는 단계를 추가적으로 포함하는, 분지쇄 아미노산 생산방법.
  14. ATP-의존적 프로테아제 활성이 비변형 미생물에 비해 약화된, 코리네박테리움 속 미생물의 분지쇄 아미노산 생산 용도.
  15. 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 431번째 내지 433번째 위치에 상응하는 아미노산 서열이 결손된 ClpC 변이체, 또는 상기 ClpC 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 분지쇄 아미노산 생산 용도.
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