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WO2022091375A1 - 周産期心筋症治療剤 - Google Patents

周産期心筋症治療剤 Download PDF

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WO2022091375A1
WO2022091375A1 PCT/JP2020/040927 JP2020040927W WO2022091375A1 WO 2022091375 A1 WO2022091375 A1 WO 2022091375A1 JP 2020040927 W JP2020040927 W JP 2020040927W WO 2022091375 A1 WO2022091375 A1 WO 2022091375A1
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WO
WIPO (PCT)
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antibody
npr1
mice
receptor
cardiomyopathy
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/040927
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English (en)
French (fr)
Inventor
健太郎 大谷
健 ▲徳▼留
千津子 神谷
Original Assignee
国立研究開発法人国立循環器病研究センター
中外製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US18/034,429 priority patent/US20230382990A1/en
Priority to PCT/JP2020/040927 priority patent/WO2022091375A1/ja
Priority to JP2022558777A priority patent/JPWO2022091375A1/ja
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing perinatal cardiomyopathy, and a method for treating or preventing perinatal cardiomyopathy.
  • Dilated cardiomyopathy is a group of "idiopathic" cardiomyopathy characterized by (1) myocardial contractile insufficiency and (2) dilation of the left ventricular cavity, and is characterized by chronic heart failure symptoms and a prognosis of repeated acute exacerbations. It is a poor / progressive disease and may cause sudden death due to fatal arrhythmia or thromboembolism of arteries. Similar to dilated cardiomyopathy, there are similar diseases that cause "left ventricular enlargement” and "left ventricular contractility disorder", and specific cardiomyopathy whose cause is clear is idiopathic (primary) as secondary cardiomyopathy. ) Is diagnosed separately from dilated cardiomyopathy (Non-Patent Document 1).
  • Peripartum cardiomyopathy PPCM, puerperal cardiomyopathy
  • secondary cardiomyopathy is a pregnancy in women who have no history of heart failure and no other cause for developing heart failure. It is characterized by developing heart failure during the puerperium and exhibiting a dilated cardiomyopathy-like pathology. More than half of peripartum cardiomyopathy patients normalize, but about 40% have residual cardiac dysfunction, and severe cases are fatal. Pregnancy and delivery are considered to be involved in the onset and progression of this disease (Non-Patent Document 1). There are reports on treatment methods and pathological studies for perinatal cardiomyopathy (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • Interleukin 6 is a cytokine also called B cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon ⁇ 2.
  • BSF2 B cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphoid cells (Non-Patent Document 4), and was subsequently revealed to be a multifunctional cytokine that affects the functions of various cells. (Non-Patent Document 5). IL-6 has been reported to induce the maturation of T lymphocytes (Non-Patent Document 6).
  • IL-6 transmits its biological activity on cells via two proteins.
  • One is the IL-6 receptor, which is a ligand-binding protein having a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Non-Patent Documents 7 and 8).
  • the IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly composed of its extracellular region, in addition to the membrane-bound type that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane.
  • gp130 a membrane protein with a molecular weight of about 130 kD, which is involved in non-ligand-binding signal transduction.
  • IL-6 and IL-6 receptors form the IL-6 / IL-6 receptor complex, which then binds to gp130 to transfer the biological activity of IL-6 intracellularly (non-).
  • Patent Document 9 ).
  • Non-Patent Documents 10 to 12 and Patent Documents 1 to 3 the relationship between IL-6 and various diseases.
  • the relationship between IL-6 and cardiac hypertrophy and the application of IL-6 inhibitors to the treatment of heart disease have been reported (Non-Patent Documents 10 to 12 and Patent Documents 1 to 3).
  • Atrial natriuretic peptide is a type of peptide consisting of 28 amino acids with physiological activity. It is mainly biosynthesized and stored in the atrium and secreted into the blood as needed. To. ANP has vasodilatory and diuretic effects, and regulates circulatory homeostasis via NPR1 (Natriuretic Peptide Receptor 1), a common receptor with brain natriuretic peptide (BNP). ANP and BNP have already been widely clinically applied as diagnostic and therapeutic agents for heart failure.
  • NPR1 Nonatriuretic Peptide Receptor 1
  • BNP brain natriuretic peptide
  • Npr1 knockout mice Both the maternal circulatory system and hormonal balance change dynamically during pregnancy, parturition, and postpartum.
  • NPR1 common receptor 1
  • the Npr1 knockout mouse may be referred to as Npr1 -/- mouse, and the wild-type mouse may be referred to as Npr1 +/+ mouse.
  • the present inventors expressed IL-6 mRNA (hereinafter, the mRNA corresponding to IL-6 may be referred to as Il6) in the heart of Npr1 -/- mouse during or after the lactation period.
  • Il6 IL-6 mRNA
  • [1-1] A pharmaceutical composition containing an IL-6 inhibitor as an active ingredient for use in the treatment or prevention of perinatal cardiomyopathy.
  • [1-2] The pharmaceutical composition according to [1-1] for use in a postpartum or lactating subject.
  • [1-3] The pharmaceutical composition according to [1-1] or [1-2], wherein the IL-6 inhibitor is an antibody that recognizes IL-6.
  • [1-4] The pharmaceutical composition according to [1-1] or [1-2], wherein the IL-6 inhibitor is an antibody that recognizes an IL-6 receptor.
  • [1-5] The pharmaceutical composition according to [1-3] or [1-4], wherein the antibody is a monoclonal antibody.
  • [2-6] The pharmaceutical composition according to any one of [2-3] to [2-5], wherein the antibody is an antibody against human IL-6 or an antibody against a human IL-6 receptor.
  • [2-7] The pharmaceutical composition according to any one of [2-3] to [2-6], wherein the antibody is a recombinant antibody.
  • [2-8] The pharmaceutical composition according to any one of [2-3] to [2-7], wherein the antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • [2-9] The pharmaceutical composition according to any one of [2-3] to [2-8], wherein the antibody is tocilizumab, satralizumab or sarilumab.
  • [2-10] The pharmaceutical composition according to any one of [2-1] to [2-9] for use in the treatment or prevention of perinatal cardiomyopathy.
  • [4-1] A method for treating or preventing perinatal cardiomyopathy, which comprises administering an IL-6 inhibitor to a subject in need of the treatment or prevention.
  • [4-2] The method according to [4-1], which treats or prevents perinatal cardiomyopathy that develops after delivery or during lactation.
  • [4-3] A method for suppressing or ameliorating cardiac remodeling associated with perinatal cardiomyopathy, which comprises administering an IL-6 inhibitor to a subject in need of the suppression or improvement.
  • [4-4] The method according to [4-3], which suppresses or improves cardiac remodeling that occurs after delivery or during lactation.
  • [4-5] A method of inhibiting the IL-6 signaling pathway in the perinatal maternal heart via a neuromineralocorticoid receptor, in which an IL-6 inhibitor is administered to a subject in need of the inhibition.
  • the above-mentioned method including the above.
  • [4-6] The method according to [4-5], which inhibits the IL-6 signaling pathway in a postpartum or lactating subject.
  • [4-7] The method according to any one of [4-1] to [4-6], wherein the IL-6 inhibitor is an antibody that recognizes IL-6.
  • [4-8] The method according to any one of [4-1] to [4-6], wherein the IL-6 inhibitor is an antibody that recognizes the IL-6 receptor.
  • [4-9] The method according to any one of [4-7] or [4-8], wherein the antibody is a monoclonal antibody.
  • [4-10] The method according to any one of [4-7] to [4-9], wherein the antibody is an antibody against human IL-6 or an antibody against a human IL-6 receptor.
  • [4-11] The method according to any one of [4-7] to [4-10], wherein the antibody is a recombinant antibody.
  • [4-12] The method according to any one of [4-7] to [4-11], wherein the antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • [4-13] The method according to any one of [4-7] to [4-12], wherein the antibody is tocilizumab, satralizumab or sarilumab.
  • [5-1] Use of IL-6 inhibitors in the manufacture of pharmaceuticals for use in the treatment or prevention of perinatal cardiomyopathy.
  • [5-2] Use of IL-6 inhibitors in the manufacture of pharmaceuticals for use in suppressing or ameliorating cardiac remodeling associated with perinatal cardiomyopathy.
  • [5-3] Use of IL-6 inhibitors in the manufacture of drugs for use in the inhibition of the IL-6 signaling pathway in the perinatal maternal heart via neuromineralocorticoid receptors.
  • [5-4] The use according to any one of [5-1] to [5-3], which is used by a drug for a perinatal period subject.
  • [5-5] The use according to any one of [5-1] to [5-4], wherein the IL-6 inhibitor is an antibody that recognizes IL-6.
  • [5-6] The use according to any one of [5-1] to [5-4], wherein the IL-6 inhibitor is an antibody that recognizes the IL-6 receptor.
  • [5-7] The use according to any one of [5-1] to [5-6], wherein the antibody is a monoclonal antibody.
  • [5-8] The use according to any one of [5-1] to [5-7], wherein the antibody is an antibody against human IL-6 or an antibody against a human IL-6 receptor.
  • [5-9] The use according to any one of [5-1] to [5-8], wherein the antibody is a recombinant antibody.
  • [5-10] The use according to any one of [5-1] to [5-9], wherein the antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • [5-11] The use according to any one of [5-1] to [5-10], wherein the antibody is tocilizumab, satralizumab or sarilumab.
  • the present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for perinatal cardiomyopathy, particularly a therapeutic or prophylactic agent for perinatal cardiomyopathy during the postpartum or lactation period.
  • FIG. 1 is a diagram showing a possible mechanism of lactation-induced postpartum cardiomyopathy-like cardiac remodeling in Npr1 -/- mice.
  • FIG. 2A shows an experimental protocol that examines the effect of the number of pregnancy-lactation cycles on the maternal heart.
  • 1PP-5PP as shown in this figure, mean the time of completion (weaning) of the 4-week lactation period in the first-fifth pregnancy-lactation cycle, respectively.
  • 1PP mouse to 5PP mouse means a mouse at the time of 1PP to 5PP, respectively.
  • FIG. 2B is a graph showing the effect of repeated pregnancy-lactation cycles on maternal survival. The P value was determined by the log-rank test.
  • 2C shows representative photographs of the hearts of Npr1 + /+ and Npr1-/ - mouse after 5PP and the ratio of heart weight to tibial length in Npr1 +/+ and Npr1 -/- mouse at 5PP (HW / TL). ) Is shown in the graph. The graph on the left shows the Npr1 +/+ mouse, and the graph on the right shows the Npr1 -/- mouse. Statistical analysis was performed by independent t-test. *: Indicates P ⁇ 0.05 vs. 5PP Npr1 +/+ mice.
  • FIG. 2D is a photograph showing representative examples of the results of staining the hearts of heifers (non-pregnant) and 5PP mice with Sirius Red. The scale bar indicates 1 mm.
  • FIG. 2E is a photograph showing representative examples of the results of hematoxylin and eosin staining of the heart in heifers, 1PP mice and 2PP mice. The scale bar indicates 1 mm.
  • FIG. 2F is a graph showing the ratio of heart weight to tibial length (HW / TL) in heifers, 1PP mice, 2PP mice, and 1PP or 2PP mice 8 weeks after calving.
  • FIG. 2G is a graph showing the ratio of lung weight to tibial length (LuW / TL) in heifers, 1PP mice, 2PP mice and mice after 8 weeks of 1PP or 2PP.
  • FIG. 2H is a photograph showing representative examples of cardiac tissue images after Sirius red staining in heifer and 2PP Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice. The scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • 2I is a graph showing quantification of fibrotic regions in the heart of heifers, 1PP, and 2PP Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice.
  • the graph on the left shows the Npr1 +/+ mouse, and the graph on the right shows the Npr1 -/- mouse.
  • Statistical analysis was performed by two-way ANOVA with Tukey-Kramer post-test. ⁇ : P ⁇ 0.05 vs. heifer Npr1 -/- indicates mice. NS indicates that it is not significant.
  • FIG. 2J is a photograph showing representative examples of cardiac tissue images after staining with fluorescently labeled wheat germ agglutinin in heifer and 2PP Npr1 +/+ mice and Npr1 -/- mice.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • FIG. 2K is a graph showing the quantification of myocardial cross-section in heifers, 1PP, and 2PP Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice. The graph on the left shows the Npr1 +/+ mouse, and the graph on the right shows the Npr1 -/- mouse.
  • Statistical analysis was performed by two-way ANOVA with Tukey-Kramer post-test. *: P ⁇ 0.05, ⁇ : P ⁇ 0.05 vs.
  • FIG. 3A shows an experimental protocol for investigating the effects of breastfeeding on the maternal heart.
  • FIG. 3B is a graph showing continuous changes in systolic blood pressure (SBP) in Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice during pregnancy. The shades in the graph indicate the gestation period.
  • SBP systolic blood pressure
  • 3C shows the body weight (BW) and plasma natriuretic natriuretic of Npr1 +/+ mice (10-20 subjects in each group) and Npr1 -/- mice (5-13 subjects in each group) during pregnancy and postpartum. It is a graph which shows the time change of a peptide (ANP) concentration. The shades in the graph indicate the gestation period.
  • Statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Tukey-Kramer post-test. *: P ⁇ 0.05, ⁇ : P ⁇ 0.05 vs. heifers.
  • 3D shows the ratio of cardiac weight to tibial length (HW / TL) in Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice in parous, late pregnancy (E18.5), and immediately after delivery (within 3 days). It is a graph which shows. The graph on the left shows the Npr1 +/+ mouse, and the graph on the right shows the Npr1 -/- mouse. Statistical analysis was performed by two-way ANOVA with Tukey-Kramer post-test. ⁇ P ⁇ 0.05 vs. corresponding Npr1 +/+ groups are shown. NS indicates that it is not significant. FIG.
  • Statistical analysis was performed by two-way ANOVA with Tukey-Kramer post-test. ⁇ : P ⁇ 0.05 vs. heifers, ⁇ P ⁇ 0.05 vs. corresponding Npr1 +/+ groups.
  • FIG. 4A shows an experimental protocol for investigating the involvement of aldosterone, IL-6, sympathetic or parasympathetic nerve activity, and oxidative stress in breastfeeding-induced cardiac hypertrophy in Npr1 -/- mice. This experiment showed that IL-6-induced inflammation is involved in lactation-induced cardiac hypertrophy in Npr1 -/- mice.
  • FIG. 4B is a graph showing relative gene expression levels of IL-6 and IL-1 ⁇ in the hearts of Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice after heifer (non-pregnancy) or 2 weeks after lactation.
  • Statistical analysis was performed by two-way ANOVA with Tukey-Kramer post-test. *: Indicates P ⁇ 0.05. NS indicates that it is not significant.
  • FIG. 4C is a diagram showing the effect of lactation on the phosphorylation of the signal transducing transcription factor 3 (STAT3) protein in the hearts of Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice.
  • FIG. 4D shows IL-6 and IL-1 ⁇ in the hearts of Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice 2 weeks after breastfeeding given a control diet or a diet containing the mineralocorticoid receptor (MR) antagonist eplerenone. It is a graph which shows the level of relative gene expression of. Statistical analysis was performed by two-way ANOVA with Tukey-Kramer post-test. NS indicates that it is not significant.
  • FIG. 4D shows IL-6 and IL-1 ⁇ in the hearts of Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice 2 weeks after breastfeeding given a control diet or a diet containing the mineralocorticoid receptor (MR) antagonist eplerenone. It is a graph which shows the level of relative gene
  • FIG. 4E shows the ratio of heart weight to tibial length in Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice 2 weeks after breastfeeding with control immunoglobulin G (IgG) or MR16-1 (anti-IL-6 receptor antibody). It is a graph which shows (HW / TL). Statistical analysis was performed by two-way ANOVA with Tukey-Kramer post-test. NS indicates that it is not significant.
  • FIG. 4F shows a comparison of HW / TL in Npr1 -/- mice 2 weeks after breastfeeding with and without metoprolol ( ⁇ 1 receptor antagonist), nicotine (parasympathomimetic), or tempol (radical scavenger). It is a graph.
  • FIG. 4G shows tissue-specific deletion mice (nestin, neurons; ⁇ MHC, cardiomyocytes; Tie2, endothelial cells; AQP2, aggregates) of Npr1 after heifer (white squares) and 2 weeks after breastfeeding (filled squares). It is a graph showing a comparison of HW / TL in tubes; CLC-KB, distal tubules) and Npr1 -/- mice.
  • Statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Dunnett post-test and independent t-test. *: Indicates P ⁇ 0.05. NS indicates that it is not significant.
  • the present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for perinatal cardiomyopathy, which contains an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • the "IL-6 inhibitor” is a substance that blocks signal transduction by IL-6 and inhibits the biological activity of IL-6.
  • the IL-6 inhibitor is preferably a substance having an inhibitory effect on the binding of any of IL-6, IL-6 receptor and gp130.
  • Examples of the IL-6 inhibitor of the present invention include anti-IL-6 antibody, anti-IL-6 receptor antibody, anti-gp130 antibody, IL-6 variant, soluble IL-6 receptor variant, or IL-6 or IL.
  • -6 Receptor partial peptides and low molecular weight substances showing similar activity are included, but are not particularly limited.
  • the IL-6 inhibitor of the present invention preferably includes an antibody that recognizes the IL-6 receptor.
  • the origin of the antibody in the present invention is not particularly limited, but an antibody derived from a mammal is preferable, and an antibody derived from a human is more preferable.
  • the anti-IL-6 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody by using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. By binding to IL-6, this antibody blocks the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocks the intracellular transmission of IL-6 biological activity.
  • Such antibodies include MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) and SK2 antibody (Sato, K. et al., 21st Japan Society for Immunology). General meetings, academic records (1991) 21, 166), etc.
  • the anti-IL-6 antibody-producing hybridoma can be produced as follows, basically using known techniques. That is, IL-6 is used as a sensitizing antigen, immunized according to a normal immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal screening method. It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • human IL-6 used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541, or Agr. Biol. Obtained by using the IL-6 gene / amino acid sequence disclosed in Chem. (1990) 54, 2685-2688.
  • the desired IL-6 protein is purified from the host cell or the culture supernatant by a known method. Then, this purified IL-6 protein may be used as a sensitizing antigen. Further, a fusion protein of IL-6 protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody by using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. By binding to the IL-6 receptor, this antibody blocks the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocks the intracellular transmission of IL-6 biological activity.
  • Such antibodies include MR16-1 antibody (Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928) and PM-1 antibody (Hirata, Y. et al.). , J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody (international patent application publication number WO 92-19759).
  • PM-1 antibody is exemplified as a preferable monoclonal antibody against human IL-6 receptor
  • MR16-1 antibody is mentioned as a preferable monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor.
  • the anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hybridoma can be produced basically by using a known technique as follows. That is, the IL-6 receptor is used as a sensitizing antigen, immunized according to a normal immunization method, and the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and a normal screening method is used. Can be produced by screening for monoclonal antibody-producing cells.
  • the following should be used to produce an anti-IL-6 receptor antibody.
  • the human IL-6 receptor used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is disclosed in European Patent Application Publication No. EP 325474
  • the mouse IL-6 receptor is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. 3-155795. Obtained by using the IL-6 receptor gene / amino acid sequence.
  • IL-6 receptor proteins are those expressed on the cell membrane and those released from the cell membrane (soluble IL-6 receptor) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, There are two types, 673-676). Soluble IL-6 receptors are composed substantially of the extracellular region of the IL-6 receptor that binds to the cell membrane, and the membrane is lacking in the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region. It differs from the bound IL-6 receptor. As the IL-6 receptor protein, any IL-6 receptor may be used as long as it can be used as a sensitizing antigen for the production of the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention.
  • the target IL-6 receptor protein After inserting the gene sequence of the IL-6 receptor into a known expression vector system to transform an appropriate host cell, the target IL-6 receptor protein is known from the host cell or the culture supernatant.
  • the purified IL-6 receptor protein may be used as a sensitizing antigen.
  • a cell expressing the IL-6 receptor or a fusion protein of the IL-6 receptor protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the anti-gp130 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody by using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced in hybridomas and those produced in hosts transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. By binding to gp130, this antibody blocks the binding of the IL-6 / IL-6 receptor complex to gp130 and blocks the intracellular transmission of IL-6 biological activity. Examples of such an antibody include AM64 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 3-219894), 4B11 antibody and 2H4 antibody (US5571513), B-S12 antibody and B-P8 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 8-291199).
  • the anti-gp130 monoclonal antibody-producing hybridoma can be produced as follows, basically using known techniques. That is, gp130 is used as a sensitizing antigen, immunized according to a normal immunization method, the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and a monoclonal antibody is obtained by a normal screening method. It can be produced by screening the producing cells.
  • gp130 used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is obtained by using the gp130 gene / amino acid sequence disclosed in European Patent Application Publication No. EP 411946.
  • the desired gp130 protein is purified from the host cell or the culture supernatant by a known method, and this purification is performed.
  • the gp130 protein may be used as a sensitizing antigen.
  • a cell expressing gp130 or a fusion protein of the gp130 protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion, and is generally of rodents. Animals such as mice, rats, hamsters and the like are used.
  • the sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitized antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, etc., and suspended in an appropriate amount, and if desired, a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, is mixed in an appropriate amount, and after emulsification.
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • physiological saline physiological saline
  • a normal adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • immune cells are taken out from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells attached to cell fusion include splenocytes in particular.
  • Mammalian myeloma cells as the other parental cell fused to the immune cells are already known from various cell lines such as P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979). ) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976)) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion of immune cells and myeloma cells is basically carried out by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). It can be done according to the same procedure.
  • the cell fusion is carried out, for example, in the presence of a cell fusion promoter in a normal nutrient culture medium.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if desired, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used in order to increase the fusion efficiency.
  • the ratio of immune cells to myeloma cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells, for example.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other ordinary culture mediums used for this type of cell culture can be used, and further.
  • Serum supplement such as cow fetal serum (FCS) can also be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are well mixed in the culture solution, and a PEG solution preheated to about 37 ° C., for example, a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is usually used.
  • a PEG solution preheated to about 37 ° C.
  • a PEG solution having an average molecular weight of about 1000 to 6000 is usually used.
  • the hybridoma is selected by culturing in a normal selective culture medium, for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture medium is continued for a sufficient time, usually for several days to several weeks, for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die. The usual limiting dilution method is then performed to screen and clone hybridomas that produce the antibody of interest.
  • a normal selective culture medium for example, a HAT culture medium (a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing in the HAT culture medium is continued for a sufficient time, usually for several days to several weeks, for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • the usual limiting dilution method is then performed to screen and clone hybridomas that produce the antibody of interest.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen protein or antigen-expressing cells, and sensitized B lymphocytes are sensitized to human myeloma cells, such as U266. It is also possible to obtain a desired human antibody having a desired antigen or binding activity to an antigen-expressing cell (see Special Fair 1-59878). Furthermore, antigens or antigen-expressing cells may be administered to transgenic animals having a repertoire of human antibody genes to obtain the desired human antibodies according to the method described above (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92 /.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture medium and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method and obtained as a culture supernatant thereof, or the hybridoma is administered to a mammal compatible with the hybridoma and propagated, and the ascites thereof is obtained.
  • the method of obtaining as is adopted.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibody, while the latter method is suitable for mass production of antibody.
  • an anti-IL-6 receptor antibody-producing hybridoma can be produced by the method disclosed in JP-A-3-39293.
  • a method of injecting a PM-1 antibody-producing hybridoma into the abdominal cavity of BALB / c mice to obtain ascites and purifying the PM-1 antibody from the ascites, or using this hybridoma in an appropriate medium for example, 10% fetal bovine serum, Cultivate in RPMI1640 medium containing 5% BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim), hybridoma SFM medium (GIBCO-BRL), PFHM-II medium (GIBCO-BRL), etc., and PM-1 antibody from the culture supernatant. It can be done by the purification method.
  • a recombinant antibody obtained by cloning an antibody gene from a hybridoma, incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique can be used.
  • a recombinant antibody obtained by cloning an antibody gene from a hybridoma incorporating it into an appropriate vector, introducing it into a host, and producing it using a gene recombination technique.
  • the mRNA encoding the variable (V) region of the antibody is isolated from the cell producing the target antibody, for example, a hybridoma.
  • the isolation of mRNA is performed by known methods such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal).
  • guanidine ultracentrifugation Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299
  • AGPC method Vorczynski, P. et al., Anal
  • Prepare total RNA using Biochem. (1987) 162, 156-159), etc. and prepare mRNA using mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia), etc.
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia).
  • cDNA synthesis can be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit or the like.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit manufactured by Clontech
  • 5'-RACE method using PCR are used to synthesize and amplify cDNA. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) can be used.
  • the desired DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with the vector DNA. Further, a recombinant vector is prepared from this, introduced into Escherichia coli or the like, and colonies are selected to prepare a desired recombinant vector.
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method, for example, the deoxy method.
  • a DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, this is ligated with the DNA encoding the desired antibody constant region (C region), and this is incorporated into an expression vector.
  • the DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing the DNA of the antibody C region.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or a promoter, as described later.
  • the host cell can then be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose of reducing heterologous antigenicity to humans for example, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody is used.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • the chimeric antibody is obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating this into an expression vector, introducing it into a host, and producing it (Europe). See patent application publication number EP 125023, international patent application publication number WO 92-19759). Using this known method, a chimeric antibody useful for the present invention can be obtained.
  • Humanized antibodies also referred to as reshaped human antibodies or humanized antibodies, are non-human mammals, such as the complementarity determining regions (CDRs) of mouse antibodies transplanted into the complementarity determining regions of human antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the general gene recombination method is also known (see European patent application publication number EP 125023, international patent application publication number WO 92-19759).
  • oligos prepared so as to have an overlapping portion at the end of a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR; framework region) of a human antibody. It is synthesized from nucleotides by the PCR method. It is obtained by ligating the obtained DNA with the DNA encoding the human antibody C region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication No. EP 239400, International Patent Application Publication No. See WO 92-19759).
  • the FR of the human antibody linked via the CDR is selected so that the complementarity determining region forms a good antigen binding site.
  • the amino acids in the framework regions of the variable region of the antibody may be replaced so that the complementarity determining regions of the reconstituted human antibody form the appropriate antigen binding site (Sato, K. et al., Cancer). Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for the chimeric antibody and the humanized antibody.
  • Examples of the human antibody C region include C ⁇ , and for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3 or C ⁇ 4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • the chimeric antibody consists of a variable region of a non-human mammalian-derived antibody and a C region derived from a human antibody
  • a humanized antibody consists of a complementarity determining region of a non-human mammalian-derived antibody, a framework region derived from a human antibody, and C. It consists of regions, which are useful as antibodies used in the present invention because of their reduced antigenicity in the human body.
  • Preferred specific examples of the humanized antibody used in the present invention include humanized PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • a method for obtaining a human antibody in addition to the method described above, a technique for obtaining a human antibody by panning using a human antibody library is also known.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method.
  • scFv single-chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method.
  • mammalian cells When mammalian cells are used, they can be expressed by a useful promoter commonly used, an antibody gene to be expressed, a DNA functionally bound to a poly A signal downstream thereof, or a vector containing the same.
  • the promoter / enhancer include human cytomegalovirus immediate promoter / enhancer.
  • virus promoters / enhancers such as retrovirus, polyomavirus, adenovirus, and Simianvirus 40 (SV40) and human elongation factor 1 ⁇ (HEF1 ⁇ )
  • SV40 Simianvirus 40
  • HEF1 ⁇ human elongation factor 1 ⁇
  • a useful promoter commonly used a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally bound and expressed.
  • examples of the promoter include the lacZ promoter and the araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Ward, E.S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E.S. et al. -2427),
  • the araB promoter the method of Better et al. (Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be followed.
  • the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used when it is produced in the periplasm of Escherichia coli. After separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (see, for example, WO96 / 30394).
  • the expression vector can be used as a selectable marker for increasing the number of gene copies in the host cell system.
  • Aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthing annin phosphoribosyl transferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • Examples of the in vitro production system include a production system using eukaryotic cells and a production system using prokaryotic cells.
  • Animal cells include (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), HeLa, Vero, etc., (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or (3) insects. Cells such as sf9, sf21, Tn5, etc. are known.
  • a plant cell a cell derived from Nicotiana tabacum is known, and this cell may be cultured in callus.
  • yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger.
  • filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger.
  • prokaryotic cells there are production systems that use bacterial cells.
  • Escherichia coli (E. coli) and Bacillus subtilis are known as bacterial cells.
  • Antibodies can be obtained by introducing the target antibody gene into these cells by transformation and culturing the transformed cells in vitro. Culturing is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as the culture medium, and serum replacement fluid such as fetal bovine serum (FCS) can also be used in combination.
  • FCS fetal bovine serum
  • an antibody may be produced in vivo by transferring the cells into which the antibody gene has been introduced to the abdominal cavity of an animal or the like.
  • examples of the in vivo production system include a production system using animals and a production system using plants.
  • animals there are mammals, production systems using insects, and the like.
  • mammals goats, pigs, sheep, mice, cows and the like can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • Insects can be silk moths.
  • plants for example, tobacco can be used.
  • the antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibody is produced and recovered in the body of the animal or plant.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein uniquely produced in milk such as goat ⁇ casein to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene with the antibody gene inserted is injected into a goat embryo and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that received the embryo or its offspring.
  • the hormone may be used in the transgenic goat as appropriate (Ebert, K.M. et al., Bio / Technology (1994) 12, 699- 702).
  • the silk moth When using silk moth, the silk moth is infected with baculovirus into which the target antibody gene is inserted, and the desired antibody is obtained from the body fluid of this silk moth (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594. ). Furthermore, when tobacco is used, the antibody gene of interest is inserted into a plant expression vector, such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens. Infect tobacco, for example Nicotiana tabacum, with this bacterium to obtain the desired antibody from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). ..
  • DNA encoding an antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) is separately incorporated into an expression vector to simultaneously transform the host. It may be transformed, or the DNA encoding the H and L chains may be integrated into a single expression vector to transform the host (see International Patent Application Publication No. WO 94-11523).
  • the antibody used in the present invention may be a full-length antibody, a fragment of the antibody or a modification thereof, as long as it can be suitably used in the present invention.
  • “Full-length antibody” refers to an antibody consisting of two “full-length antibody heavy chains” and two “full-length antibody light chains”.
  • the "full-length antibody heavy chain” includes an antibody heavy chain variable domain (VH), an antibody heavy chain constant domain 1 (CH1), an antibody hinge region (HR), and an antibody heavy chain constant domain 2 in the direction from the N-terminal to the C-terminal. (CH2) and antibody heavy chain constant domain 3 (CH3) (abbreviated as VH-CH1-HR-CH2-CH3).
  • a “full-length antibody light chain” is a polypeptide (abbreviated as VL-CL) consisting of an antibody light chain variable domain (VL) and an antibody light chain constant domain (CL) in the direction from the N-terminal to the C-terminal. ..
  • the antibody light chain constant domain (CL) can be ⁇ (kappa) or ⁇ (lambda).
  • the two full-length antibody chains are linked together between the CL domain and the CH1 domain and between the hinge regions of the full-length antibody heavy chain via interpeptide disulfide bonds.
  • typical full-length antibodies are natural antibodies such as IgG (eg IgG1 and IgG2), IgM, IgA, IgD and IgE.
  • Examples of antibody fragments include Fab, F (ab') 2 , Fv or single chain Fv (scFv) in which H chain and L chain Fv are linked with an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate an antibody fragment, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host cell is used.
  • an enzyme such as papain or pepsin
  • a gene encoding these antibody fragments is constructed and introduced into an expression vector, and then an appropriate host cell is used.
  • ScFv is obtained by linking the H chain V region and the L chain V region of the antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988). 85, 5879-5883).
  • the H-chain V region and the L-chain V region in scFv may be derived from any of the antibodies described above.
  • the peptide linker linking the V region for example, any single-stranded peptide consisting of amino acid 12-19 residues is used.
  • the DNA encoding scFv uses the DNA encoding the H chain or the H chain V region of the antibody and the DNA encoding the L chain or the L chain V region as templates, and a desired amino acid sequence among those sequences.
  • the DNA portion encoding the peptide linker moiety is amplified by the PCR method using a primer pair defining both ends thereof, and then the DNA encoding the peptide linker moiety and both ends thereof are specified to be linked to the H chain and the L chain, respectively. It is obtained by combining and amplifying a pair of primers.
  • an expression vector containing them and a host transformed by the expression vector can be obtained according to a conventional method, and the host can be used according to a conventional method.
  • ScFv can be obtained. Fragments of these antibodies can be obtained, expressed and produced by the host in the same manner as described above.
  • the "antibody” in the present invention also includes fragments of these antibodies.
  • an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the "antibody” in the present invention also includes these antibody modifications.
  • Such an antibody modification can be obtained by chemically modifying the obtained antibody.
  • the antibody produced and expressed as described above can be separated from the inside and outside of the cell and the host and purified uniformly.
  • the antibody used in the present invention can be separated and purified by affinity chromatography.
  • Examples of the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • Examples of the carrier used for the protein A column include HyperD, POROS, Sepharose F.F. and the like.
  • the separation and purification methods used for ordinary proteins may be used, and the method is not limited.
  • the antibody used in the present invention can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. other than the above affinity chromatography.
  • the chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration and the like. These chromatographies can be applied to HPLC (High performance liquid chromatography). Further, reverse phase HPLC may be used.
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring the absorbance or ELISA. That is, in the case of measuring the absorbance, after appropriately diluting with PBS (-), the absorbance at 280 nm is measured, and 1 mg / ml is calculated as 1.35 OD.
  • ELISA it can be measured as follows. That is, 100 ⁇ l of goat anti-human IgG (manufactured by TAG) diluted to 1 ⁇ g / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was added to a 96-well plate (manufactured by Nunc), and the antibody was incubated overnight at 4 ° C. Immobilize. After blocking, an appropriately diluted antibody or sample containing the antibody used in the present invention, or 100 ⁇ l of human IgG (manufactured by CAPPEL) as a standard is added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • the IL-6 variant used in the present invention is a substance that has binding activity to the IL-6 receptor and does not transmit the biological activity of IL-6. That is, the IL-6 variant binds to the IL-6 receptor competitively with IL-6, but does not transmit the biological activity of IL-6, thus blocking signal transduction by IL-6.
  • the IL-6 variant is prepared by introducing a mutation by substituting the amino acid residue of the amino acid sequence of IL-6.
  • the origin of IL-6 which is the source of the IL-6 variant, is not limited, but human IL-6 is preferable in consideration of antigenicity and the like.
  • the amino acid sequence of IL-6 is predicted by using a known molecular modeling program, for example, WHATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56). It is done by further assessing the effect on the whole of the amino acid residues to be substituted.
  • IL- is introduced by introducing a mutation so that the amino acid is substituted by a usual PCR method using a vector containing a base sequence encoding the human IL-6 gene as a template. 6
  • the gene encoding the variant is obtained. This can be incorporated into an appropriate expression vector as needed to obtain an IL-6 variant according to the above-mentioned recombinant antibody expression, production and purification methods.
  • IL-6 variants include Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, and Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO96. -18648, disclosed in WO 96-17869.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide used in the present invention has binding activity to IL-6 receptor or IL-6, respectively, and transmits the biological activity of IL-6. It is a substance that does not.
  • the IL-6 partial peptide or the IL-6 receptor partial peptide binds to the IL-6 receptor or IL-6, and by capturing these, the binding of IL-6 to the IL-6 receptor is specific. Inhibits. As a result, it does not transmit the biological activity of IL-6, thus blocking signal transduction by IL-6.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide is an amino acid in part or all of the region involved in the binding of IL-6 to the IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor. It is a peptide consisting of a sequence. Such peptides usually consist of 10-80, preferably 20-50, more preferably 20-40 amino acid residues.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide identifies and identifies a region involved in the binding of IL-6 to the IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor. It can be prepared by a method usually known based on the amino acid sequence of a part or all of the region, for example, a genetic engineering method or a peptide synthesis method.
  • an IL-6 partial peptide or an IL-6 receptor partial peptide by a genetic engineering method, a method for expressing, producing and purifying the recombinant antibody by incorporating a DNA sequence encoding a desired peptide into an expression vector. Can be obtained according to.
  • a method usually used in peptide synthesis for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method can be used.
  • an amino acid corresponding to the C-terminal of the peptide to be synthesized is bound to a support that is insoluble in an organic solvent, and the ⁇ -amino group and the side chain functional group are protected with an appropriate protective group.
  • the peptide chain is formed by alternately repeating the reaction of condensing amino acids one amino acid at a time in the order from the C-terminal to the N-terminal and the reaction of removing the protective group of the ⁇ -amino group of the amino acid or peptide bonded on the resin.
  • a method of stretching is used.
  • the solid phase peptide synthesis method is roughly classified into the Boc method and the Fmoc method depending on the type of protecting group used.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction from the support of the peptide chain are carried out.
  • hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid can be usually used in the Boc method
  • TFA can be usually used in the Fmoc method.
  • the protective peptide resin is treated in hydrogen fluoride in the presence of anisole. The peptide is then recovered by elimination of the protecting group and cleavage from the support. By freeze-drying this, a crude peptide can be obtained.
  • the deprotection reaction and the cleavage reaction from the support of the peptide chain can be carried out in TFA by the same operation as described above.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by applying it to HPLC.
  • the elution may be carried out under optimum conditions using a water-acetonitrile solvent usually used for protein purification.
  • the fraction corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile is fractionated and lyophilized.
  • the peptide fraction thus purified is identified by molecular weight analysis by mass spectrum analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like.
  • Specific examples of the IL-6 partial peptide and the IL-6 receptor partial peptide are disclosed in JP-A 2-188600, JP-A-7-324097, JP-A-8-311098 and US Patent Publication No. US5210075.
  • the antibody used in the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, and toxins.
  • PEG polyethylene glycol
  • Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. A method for modifying an antibody has already been established in this field.
  • the "antibody” in the present invention also includes these conjugated antibodies.
  • the therapeutic or prophylactic agent for perinatal cardiomyopathy and the inhibitor of cardiac remodeling associated with perinatal cardiomyopathy of the present invention can be used in the treatment of cardiomyopathy.
  • Periodum cardiomyopathy means heart failure that develops in pregnancy and puerperium in women who have no history of heart disease, and shows a pathological condition similar to dilated cardiomyopathy. What is dilated cardiomyopathy? Differentiated as different diseases. In the WHO definition and classification of cardiomyopathy, pericardial cardiomyopathy is classified as secondary cardiomyopathy.
  • Perinatal cardiomyopathy (postpartum cardiomyopathy) is defined by the American Heart Association (AHA) as acquired of primary cardiomyopathy (main lesions in the myocardium).
  • AHA American Heart Association
  • Heart failure In heart failure, as the stage progresses, left ventricular enlargement, decreased contractile force, and myocardial fibrosis occur, and this change is called “cardiac remodeling.”
  • Heart failure is a condition in which palpitation, shortness of breath, malaise, edema of the legs, etc. are gradually observed due to insufficient functioning of the heart, and if left untreated, it becomes stuffy and unable to lie down. The degree and speed of progression varies from person to person, but generally it becomes more severe and intractable over time. Sudden onset and sudden changes are not uncommon, and it is a dangerous condition that eventually leads to death due to lack of oxygen, arrhythmia and other illnesses.
  • treatment or prevention of perinatal cardiomyopathy means treatment or prevention of cardiac dysfunction caused by perinatal cardiomyopathy, and acute heart failure symptoms (dyspnea, cough, cough,) of perinatal cardiomyopathy. It means the treatment or prevention of edema, general malaise, palpitation, shock, palpitations, etc.) and chronic heart failure symptoms (shortness of breath on exertion, palpitations, palpitation, etc.).
  • compression or improvement of cardiac remodeling means to stop the progression of left ventricular enlargement, contractile force decrease, myocardial fibrosis associated with the progression of the stage of heart failure, or to stop the progression of myocardial fibrosis. It means improving the condition.
  • Mineralocorticoid receptor is a receptor with equivalent affinity for mineralocorticoid (aldosterone) and glucocorticoid (cortisol), kidney, colon, heart, central nervous system (hip horse), brown. It is expressed in many tissues such as adipose tissue and sweat glands.
  • the "IL-6 signaling pathway in the perinatal maternal heart via the neuromineralocorticoid receptor” refers to the increase in cardiac plasma aldosterone concentration in the perinatal maternal heart and the central nervous system. Activation of MR increases IL-6 levels in cardiac tissue, resulting in a pathway that causes myocardial damage.
  • Perinatal cardiomyopathy is, for example, as a new symptom of heart failure that appears within 5 months of postpartum from late pregnancy in women who have no history of heart failure and no other cause for developing heart failure. Be diagnosed. Symptoms include, for example, a decrease in left ventricular ejection fraction (EF), a dilated cardiomyopathy-like condition such as less than 45%, and an increase in blood levels of brain natriuretic peptide (BNP). Perinatal cardiomyopathy can be diagnosed, for example, based on BNP measurements, chest Xp / CT, echocardiography, and electrocardiography. Furthermore, diagnosis can be made based on the results of cardiac CT, cardiac MRI, coronary angiography, myocardial biopsy, etc. for excluding other cardiomyopathy.
  • EF left ventricular ejection fraction
  • BNP brain natriuretic peptide
  • Delivery may be spontaneous delivery or may be accompanied by cesarean section surgery.
  • Spontaneous delivery is roughly divided into three stages: labor pain occurs in the first stage, the uterine ostium gradually opens and the fetus moves to the vagina, the fetus is delivered in the second stage, and the placenta is delivered in the third stage. ..
  • "Postpartum” means the time when the third stage of labor is completed, and "postpartum” means the time when the fetus is delivered by "postpartum” or cesarean section surgery.
  • examples of the treatment target include women from the latter half of pregnancy (after 22 weeks of gestation) to within 5 months after delivery. In one embodiment of the invention, a postnatal lactating woman is targeted.
  • the "perinatal period” refers to the period from “22 weeks gestation to less than 7 days after birth", and the “postpartum period” is the period from birth to the recovery of the mother, usually 6 to 8 weeks after delivery. be.
  • the "lactation period” is the period from birth to weaning when the baby is fed, and is about one year after birth.
  • lactating women are mentioned, where lactating women, whether or not they are actually breastfeeding, include, for example, women who discontinue lactation during treatment. Is done. Further, in one aspect of the present invention, a woman within 5 months after delivery is mentioned as a treatment target in the present invention.
  • the inventors have found that hypertrophic changes occur in the maternal heart after delivery, especially during the lactation period.
  • by targeting the above-mentioned lactating women it is possible to suppress the onset or exacerbation of perinatal cardiomyopathy during the lactation period.
  • treatment for chronic symptoms of perinatal cardiomyopathy can be continued even after 5 months after delivery.
  • Another aspect of the present invention can be suitably used, especially when breastfeeding is continued even after 5 months after delivery.
  • NPR1 a receptor for ANP / BNP
  • ANP / BNP a receptor for ANP / BNP
  • the expected mechanism of action for cardiac hypertrophy in Npr1 -/- mice is shown in FIG.
  • the ANP / BNP-NPR1 system is normal, the maternal heart develops reversible hypertrophy, which is accompanied by increased phosphorylation of the ERK1 / 2 (extracellular signaling regulatory kinase) protein.
  • Nppa, Nppb, and Acta1 mRNA expression is significantly increased during lactation.
  • the treatment by administration of the IL-6 inhibitor can be carried out in combination with other treatments.
  • Other treatments include, for example, drug therapy (administration of ACE inhibitors, angiotensin receptor blockers, ⁇ -blockers, diuretics, bromocryptin, etc.), especially in acute cases, artificial respiration management, intra-aortic balloon pumping. (Intra-Aortic Balloon. Pumping: IABP), cardiopulmonary support devices (PCPS, V-A. Bypass, ECMO) and the like.
  • IL-6 inhibitor administration can be used for the treatment of a subject diagnosed with perinatal cardiomyopathy. Further, in the present invention, administration of an IL-6 inhibitor can be used for prevention of aggravation of the heart failure state of a subject diagnosed with perinatal cardiomyopathy. In one embodiment of the invention, IL-6 inhibitor administration can be performed as a prophylactic treatment during the next pregnancy of a woman diagnosed with perinatal cardiomyopathy during the previous pregnancy.
  • the target of preventive treatment includes, but is not limited to, women whose cardiac function has been normalized by the next pregnancy.
  • the IL-6 signal transduction inhibitory activity of the IL-6 inhibitor used in the present invention can be evaluated by a commonly used method. Specifically, IL-6-dependent human myeloma strain (S6B45, KPMM2), human Rennert T lymphoma cell line KT3, or IL-6-dependent cell MH60.BSF2 was cultured, and IL-6 was added to this. At the same time, the uptake of 3H -thymidine in IL-6-dependent cells may be measured by coexisting with an IL-6 inhibitor.
  • U266 which is an IL-6 receptor-expressing cell
  • 125 I-labeled IL-6 was added
  • an IL-6 inhibitor was added to bind to the IL-6 receptor-expressing cell 125 I-labeled.
  • a negative control group not containing the IL-6 inhibitor is set, and the results obtained by both are compared. The activity can be evaluated.
  • the drug such as the pharmaceutical composition, therapeutic agent, and prophylactic agent of the present invention can be administered in the form of a pharmaceutical preparation, and can be administered orally or parenterally systemically or topically.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solvent, etc. can be selected, and the administration method should be appropriately selected according to the patient's age and symptoms. Can be done.
  • the effective dose is selected from 0.01 mg to 100 mg / kg body weight, preferably 1 mg to 2 mg / kg body weight, preferably 8 mg / kg body weight, and 12 mg / kg body weight at a time.
  • a dose of 1 to 1000 mg, preferably 100 to 200 mg, preferably 120 mg, 150 mg, or 200 mg per patient can be selected.
  • the preferred dose and method of administration are, for example, in the case of an anti-IL-6 receptor antibody, an effective dose is such that a free antibody is present in the blood, and a specific example is per 1 kg of body weight.
  • the administration schedule is such as twice / week or once / week to once / two weeks, once / three weeks, once / four weeks while observing the condition after transplantation and the trend of blood test values. It is also possible to make adjustments such as extending the dosing interval.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a preservative or a stabilizer may be added to a drug such as a pharmaceutical composition, a therapeutic agent, or a preventive agent of the present invention.
  • the pharmaceutically acceptable carrier itself may be a material having a therapeutic or preventive effect on symptoms in peripartum cardiomyopathy and an inhibitory effect on cardiac remodeling associated with perinatal cardiomyopathy. It may be a material that does not have the inhibitory effect, and means a material that can be administered together with the above-mentioned drug. Further, a material having no pharmacological effect and having a synergistic or additive stabilizing effect when used in combination with an IL-6 inhibitor may be used. Examples of the material acceptable for the preparation include sterile water, physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders, and the like. ..
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants, for example, sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate, and sorbitan monooleate; glycerin monocaprylate.
  • surfactant examples include anionic surfactants, for example, alkyl sulfates having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate, and sodium oleyl sulfate; polyoxyethylene.
  • alkyl sulfates having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate, and sodium oleyl sulfate
  • polyoxyethylene Polyoxyethylene alkyl ether sulfates such as sodium lauryl sulfate having an average added molar number of 2 to 4 and an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms; carbon atoms of an alkyl group such as sodium lauryl sulfosuccinate.
  • Typical examples are alkyl sulfosuccinic acid ester salts having a number of 8 to 18; natural surfactants such as lecithin and glycerophospholipids; fingering lipids such as sphingomyelin; sucrose fatty acid esters of fatty acids having 12 to 18 carbon atoms. Can be mentioned as.
  • Preferred surfactants used in the formulations of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysorbate 20 and 80 being particularly preferred. Further, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol represented by poloxamer (Pluronic F-68 (registered trademark), etc.) is also preferable.
  • the amount of the surfactant added varies depending on the type of the surfactant used, but in the case of polysorbate 20 or polysorbate 80, it is generally 0.001 to 100 mg / mL, preferably 0.003 to 50 mg / mL, and more preferably 0.003 to 50 mg / mL. It is 0.005 to 2 mg / mL.
  • the buffering agent includes phosphoric acid, citric acid, acetic acid, malic acid, tartrate acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, gluconic acid, capric acid, deoxycholic acid, salicylic acid, triethanolamine, fumaric acid and the like.
  • the solution formulation may be prepared by dissolving it in an aqueous buffer solution known in the field of solution formulation.
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, more preferably 10 to 20 mM.
  • agent of the present invention may contain other low molecular weight polypeptides, serum albumin, proteins such as gelatin and immunoglobulin, amino acids, saccharides such as polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols.
  • amino acids in the present invention include basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine, or inorganic salts of these amino acids (preferably hydrochlorides, phosphate forms, ie phosphate amino acids).
  • suitable physiologically acceptable buffering agents such as hydrochloric acid, in particular hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or salts thereof.
  • phosphate is particularly advantageous in that a particularly stable lyophilized product is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, citric acid, succinic acid, fumaric acid and the like, or corresponding anions (malic acid ion, tartaric acid ion, citric acid ion, succinate ion, fumal). It is especially advantageous in the absence of acid ions, etc.).
  • Preferred amino acids are arginine, lysine, histidine, or ornithine.
  • acidic amino acids such as glutamate and aspartic acid, and their salt forms (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine, or alanine, or aromatics.
  • Amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyltryptophan can also be used.
  • examples of saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, glucose, fructose, lactose, xylose, mannose, maltose, sucrose, trehalose, raffinose and the like.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol and the like.
  • the agent of the present invention when used as an aqueous solution for injection, it may be mixed with an isotonic solution containing, for example, physiological saline, glucose or other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • the aqueous solution can be mixed, and the aqueous solution is an appropriate solubilizing agent (for example, alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50, etc.), etc.). May be used in combination with.
  • a diluent, a solubilizing agent, a pH adjuster, a pain-relieving agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like may be further contained.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetylcysteine, N-acetylhomocysteine, thioctic acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and its salts, and thiosulfate.
  • examples thereof include those having a sulfur hydryl group such as sodium, glutathione, and thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • antioxidant in the present invention for example, erythorbic acid, dibutyl hydroxytoluene, butyl hydroxyanisole, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and its salt, L-ascorbic acid palmitate, L-ascorbic acid steer.
  • chelating agents such as rate, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, triamyl ascorbic acid, propyl ascorbic acid or disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, sodium metaphosphate and the like.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]
  • colloidal drug delivery systems liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, nanocapsules, etc.
  • a method of making a drug a sustained release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105; US Pat. No.
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used is appropriately selected from the above or in combination depending on the dosage form, but is not limited thereto.
  • the subject of the treatment in the present invention is not particularly limited, but includes animals (for example, humans, livestock animal species, wild animals).
  • administering includes oral or parenteral administration.
  • oral administration include administration in the form of oral preparations, and as oral preparations, a dosage form such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions, or suspensions is selected. be able to.
  • parenteral administration examples include administration in the form of an injection, and examples of the injection include subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection and the like.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene containing an oligonucleotide to be administered into a living body by using a method of gene therapy.
  • the agent of the present invention can be locally administered to the region to be treated. It can also be administered, for example, by local injection during surgery, the use of a catheter, or delivery of a targeted gene for the DNA encoding the peptide of the invention.
  • the agent of the present invention may be administered simultaneously with prescriptions at the onset of cardiomyopathy, such as catheter surgery (PTCA, PCI), thrombolytic therapy (PTCR), coronary artery bypass grafting (CABG), and the like.
  • mice All animal experiments were approved by the National Cardiovascular Research Center Animal Experiment Ethics Committee and conducted in accordance with the guidelines of the Physiological Society of Japan. Npr1 -/- Mice were produced at the Howard Hughes Medical Institute (Dallas, University of Texas Southwestern Medical Center) (Nature. (1995) 378, 65-68. Doi: 10.1038 / 378065a0). All mice used in this study were of C57BL / 6 background. Mice were group-reared at 25 ° C. for 12:12 hours in a light: dark cycle with unlimited access to food and water. Female mice (8 weeks old) were used in the experiment.
  • Mating was performed with multiple females for one male, and female mice found to be pregnant were individually bred in separate cages. After delivery, the animals were bred in the same gauge as the pups until the end of the lactation period, and the number of pups was not adjusted.
  • mice were randomly assigned to the experimental group. Survival between mice was compared using Kaplan-Meier analysis followed by a logrank test. Pairwise comparisons were performed using the unpaired Student's t-test on both sides. Differences between 3 or more groups were analyzed using one-way or two-way ANOVA with Tukey-Kramer post-test. For comparisons between tissue-specific knockout mice, one-way ANOVA followed by Dunnett post-test was applied. In microarray analysis, t-test was used to determine differential gene expression. The multiple test was adjusted according to the Benjamini-Hochberg method, and the false discovery rate was set to 0.05. For all comparisons, a P-value of less than 0.05 indicates statistical significance.
  • Npr1 -/- mice and wild-type mice were bred according to the experimental protocol shown in FIG. 2A.
  • the survival rate after 5 pregnancy-lactation cycles is shown in FIG. 2B.
  • the Npr1 -/- mouse heart is significantly larger than the Npr1 +/+ mouse heart, genes associated with increased lung weight, interstitial fibrosis, and cardiac hypertrophy.
  • the ratio of heart weight to tibial length (HW / TL) in the hematological state was slightly but significantly higher in Npr1 -/- mice than in Npr1 +/+ mice (FIGS. 2E and 2F).
  • HW / TL after the first pregnancy-lactation cycle was significantly increased in postpartum Npr1 -/- mice (FIGS.
  • Npr1 -/- Mice did not show that phenotype (Fig. 3B). Maternal body weight was highest in late pregnancy in both Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice during the first pregnancy-lactation cycle (Fig. 3C). Plasma ANP peaked bimodally in Npr1 +/+ mice immediately after parturition and 2 weeks after lactation, whereas it peaked in Npr1 -/- mice 2 weeks after parturition (Fig. 3C). In contrast, HW / TL did not increase in late pregnancy or within 3 days after first delivery in either Npr1 +/+ or Npr1 -/- mice (Fig. 3D).
  • HW / TL was significantly increased within 2 weeks of lactation in postnatal Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice (Fig. 3E).
  • the mRNA expression levels of the genes associated with cardiac hypertrophy (Nppa, Nppb, and Acta1) were significantly increased during lactation in both postnatal Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice (Fig. 3F).
  • mRNA expression of genes associated with fibrosis (Col3a1, Fn1, and Tgfb1) was significantly increased only in lactating Npr1 -/- mice (Fig. 3F).
  • systolic blood pressure 2 weeks after lactation was not different in either Npr1 +/+ or Npr1 -/- mice from immediately after delivery (data not shown).
  • Non-Patent Document 10 Non-Patent Document 10
  • breastfeeding Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice after heifer and primipara The expression levels of IL-6 and IL-1 ⁇ mRNA in the heart of the heart were investigated.
  • the experimental protocol is shown in FIG. 4A. Compared with heifers, lactating Npr1 +/+ mice tended to have increased cardiac Il6 mRNA expression, but lactating Npr1 -/- mice showed a significant increase (figure). 4B).
  • the mRNA level of Il1 ⁇ tended to increase during lactation in both Npr1 +/+ and Npr1 -/- mice after the first birth (Fig. 4B).
  • STAT3 signal transduction transcription factor 3
  • control IgG or MR16-1 was intraperitoneally administered to 0.5 mg / mouse on the day of delivery (immediately after delivery) and one week after the start of lactation.
  • the dose was standardized to 0.1 mL.
  • Metoprolol ⁇ 1 adrenergic receptor antagonist
  • nicotine ⁇ 7-nicotinic acetylcholine receptor agonist
  • tempor radical scavenger
  • the present invention provides a therapeutic or prophylactic agent for perinatal cardiomyopathy, particularly a therapeutic or prophylactic agent for perinatal cardiomyopathy during the postpartum or lactation period.

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Abstract

本発明により、IL-6阻害剤を有効成分として含有する、周産期心筋症の治療または予防において使用するための医薬組成物が提供される。

Description

周産期心筋症治療剤
　本発明は、周産期心筋症を治療または予防するための医薬組成物、および周産期心筋症の治療方法および予防方法に関する。
　拡張型心筋症は、「特発性」心筋症のなかで（1）心筋収縮不全と（2）左室内腔の拡張を特徴とする疾患群であり、慢性心不全症状を特徴とし急性増悪を繰り返す予後不良・進行性の疾患であり、致死性不整脈による突然死や動脈の血栓塞栓症を生じることもある。拡張型心筋症と同様に「左室拡大」と「左室収縮能障害」をきたす類似の疾患が存在し、原因が明らかである特定心筋症は二次性心筋症として、特発性（原発性）の拡張型心筋症とは区別して診断される（非特許文献１）。
　二次性心筋症として知られている周産期心筋症（Peripartum Cariomyopathy: PPCM、産褥性心筋症）は、心疾患の既往がなく、心不全を発症する原因が他にみあたらない女性が、妊娠・産褥期に心不全を発症し、拡張型心筋症様の病態を呈することを特徴する。周産期心筋症患者は半数以上が正常化するが、約４割に心機能低下が残存し、重症例は致死的である。妊娠・分娩が本疾患の発症と進展に関与していると考えられる（非特許文献１）。周産期心筋症の処置方法や病理学的研究についての報告がされている（非特許文献２および３）。
　インターロイキン６（IL-6）はB細胞刺激因子2（BSF2）あるいはインターフェロンβ2とも呼称されたサイトカインである。IL-6は、Bリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（非特許文献４）、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイトカインであることが明らかになった（非特許文献５）。IL-6は、Tリンパ球系細胞の成熟化を誘導することが報告されている（非特許文献６）。
　IL-6は、細胞上で二種のタンパク質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、IL-6が結合する分子量約80kDのリガンド結合性タンパク質のIL-6受容体である（非特許文献７および８）。IL-6受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に、主にその細胞外領域からなる可溶性IL-6受容体としても存在する。
　もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約130kDの膜タンパク質gp130である。IL-6とIL-6受容体はIL-6／IL-6受容体複合体を形成し、次いでgp130と結合することにより、IL-6の生物学的活性が細胞内に伝達される（非特許文献９）。
　IL-6と種々の疾患との関連性について研究がされている。例えば、IL-6と心肥大との関連や、IL-6阻害剤の心疾患治療への適用について報告がされている（非特許文献１０～１２、および特許文献１～３）
　心房性ナトリウム利尿ペプチド（Atrial Natriuretic Peptide: ANP）は、生理活性を持つアミノ酸２８個からなるペプチドの１種であり、主に心房で生合成して貯蔵され、必要に応じて血液中に分泌される。ANPは血管拡張作用や利尿作用を有し、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Brain Natriuretic Peptide: BNP）との共通受容体、NPR1（Natriuretic Peptide Receptor 1）を介して循環恒常性を制御する。ANPおよびBNPはすでに心不全の診断薬および治療薬として広く臨床応用されている。
WO2010/065072 A1 WO2005/028514 A1 WO2007/046489 A1
日本循環器学会/日本心不全学会発行、心筋症診療ガイドライン（2018年改訂版）； Bhattacharyya, A., Tex Heart Inst J. 2012; 39(1): 8-16. Kurdi, M., Front Immunol. 2018; 9: 3029 Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76 Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78 Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258 Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828 Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581 Shimizu I., J Mol Cell Cardiol. 2016; 97: 245-262 Chou, C.H. et al., Cardiovascular Research (2018) 114, 690-702 Kang, Y.M. et al., Circ Res. 2006, 99758-766.
　母体の循環系とホルモンバランスは、いずれも妊娠、分娩、分娩後の時期に動的に変化する。心臓で産生されるANPおよびBNPは、それらの共通受容体、NPR1を介して循環恒常性を制御する。周産期における内因性ANP/BNP-NPR1系の生理学的および病態生理学的役割を明らかにするために、周産期におけるNpr1ノックアウトマウスの表現型を、特に母体の心臓重量、血圧、および心機能に焦点を当てて検討した。その結果、Npr1ノックアウトマウスが、周産期心筋症様の線維化を伴う重度の心肥大を示し、Npr1ノックアウトマウスが妊娠誘発性高血圧を伴わないPPCMのモデルとして役立つことを発見した。なお、以後Npr1ノックアウトマウスをNpr1-/-マウスと、野生型マウスをNpr1+/+マウスとする場合がある。
　さらに検討したところ、本発明者らは、授乳期中または授乳期後のNpr1-/-マウスの心臓では、IL-6 mRNA（以後、IL-6に対応するmRNAをIl6とする場合がある）発現の増加が確認し、抗IL-6受容体抗体投与は授乳期Npr1-/-マウスの心肥大を減少させることを見いだし、本発明を完成させた。本発明により、以下の組成物、薬剤、方法、および使用が提供される。
　［１－１］IL-6阻害剤を有効成分として含有する、周産期心筋症の治療または予防において使用するための医薬組成物。
　［１－２］分娩後または授乳期の対象において使用するための、［１－１］に記載の医薬組成物。
　［１－３］IL-6阻害剤がIL-6を認識する抗体である、［１－１］または［１－２］に記載の医薬組成物。
　［１－４］IL-6阻害剤がIL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする［１－１］または［１－２］に記載の医薬組成物。
　［１－５］抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする［１－３］または［１－４］に記載の医薬組成物。
　［１－６］抗体がヒトIL-6に対する抗体またはヒトIL-6受容体に対する抗体である、［１－３］～［１－５］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［１－７］抗体が組換え型抗体である、［１－３］～［１－６］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［１－８］抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、［１－３］～［１－７］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［１－９］抗体がトシリズマブ、サトラリズマブまたはサリルマブである、［１－３］～［１－８］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［２－１］IL-6阻害剤を有効成分として含有する、周産期心筋症に伴う心臓リモデリングの抑制または改善において使用するための医薬組成物。
　［２－２］分娩後または授乳期の対象における心臓リモデリングに対して使用するための、［２－１］に記載の医薬組成物。
　［２－３］IL-6阻害剤がIL-6を認識する抗体であることを特徴とする［２－１］または［２－２］に記載の医薬組成物。
　［２－４］IL-6阻害剤がIL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする［２－１］または［２－２］に記載の医薬組成物。
　［２－５］抗体がモノクローナル抗体である、［２－３］または［２－４］に記載の医薬組成物。
　［２－６］抗体がヒトIL-6に対する抗体またはヒトIL-6受容体に対する抗体である、［２－３］～［２－５］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［２－７］抗体が組換え型抗体である、［２－３］～［２－６］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［２－８］抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、［２－３］～［２－７］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［２－９］抗体がトシリズマブ、サトラリズマブまたはサリルマブである、［２－３］～［２－８］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［２－１０］周産期心筋症の治療または予防において使用するための、［２－１］～［２－９］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［３－１］IL-6阻害剤を有効成分として含有する、神経ミネラロコルチコイドレセプターを介した、周産期の母体の心臓におけるIL-6シグナル経路阻害剤。
　［３－２］分娩後または授乳期の対象において使用するための、［３－１］に記載の阻害剤。
　［３－３］IL-6阻害剤がIL-6を認識する抗体である、［３－１］または［３－２］に記載の阻害剤。
　［３－４］IL-6阻害剤がIL-6受容体を認識する抗体である、［３－１］または［３－２］に記載の阻害剤。
　［３－５］抗体がモノクローナル抗体である、［３－３］または［３－４］に記載の阻害剤。
　［３－６］抗体がヒトIL-6に対する抗体またはヒトIL-6受容体に対する抗体である、［３－３］～［３－５］のいずれかに記載の阻害剤。
　［３－７］抗体が組換え型抗体である、［３－３］～［３－６］のいずれかに記載の阻害剤。
　［３－８］抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、［３－３］～［３－７］のいずれかに記載の阻害剤。
　［３－９］抗体がトシリズマブ、サトラリズマブまたはサリルマブである、［３－３］～［３－８］のいずれかに記載の医薬組成物。
　［３－１０］分娩後または授乳期の周産期心筋症の治療に用いられる、［３－３］～［３－９］のいずれかに記載の阻害剤。
　［４－１］周産期心筋症を治療または予防する方法であって、IL-6阻害剤を前記治療または予防を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
　［４－２］分娩後または授乳期に発症した周産期心筋症を治療または予防する、［４－１］に記載の方法。
　［４－３］周産期心筋症に伴う心臓リモデリングを抑制または改善する方法であって、IL-6阻害剤を前記抑制または改善を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
　［４－４］分娩後または授乳期に生じた心臓リモデリングを抑制または改善する、［４－３］に記載の方法。
　［４－５］神経ミネラロコルチコイドレセプターを介した周産期の母体の心臓におけるIL-6シグナル経路を阻害する方法であって、前記阻害を必要とする対象にIL-6阻害剤を投与することを含む、前記方法。
　［４－６］分娩後または授乳期の対象においてIL-6シグナル経路を阻害する、［４－５］に記載の方法。
　［４－７］IL-6阻害剤がIL-6を認識する抗体である、［４－１］～［４－６］のいずれかに記載の方法。
　［４－８］IL-6阻害剤がIL-6受容体を認識する抗体である、［４－１］～［４－６］のいずれかに記載の方法。
　［４－９］抗体がモノクローナル抗体である、［４－７］または［４－８］のいずれかに記載の方法。
　［４－１０］抗体がヒトIL-6に対する抗体またはヒトIL-6受容体に対する抗体である、［４－７］～［４－９］のいずれかに記載の方法。
　［４－１１］抗体が組換え型抗体である、［４－７］～［４－１０］のいずれかに記載の方法。
　［４－１２］抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、［４－７］～［４－１１］のいずれかに記載の方法。
　［４－１３］抗体がトシリズマブ、サトラリズマブまたはサリルマブである、［４－７］～［４－１２］のいずれかに記載の方法。
　［５－１］周産期心筋症の治療または予防に用いるための医薬の製造における、IL-6阻害剤の使用。
　［５－２］周産期心筋症に伴う心臓リモデリングの抑制または改善に用いるための医薬の製造における、IL-6阻害剤の使用。
　［５－３］神経ミネラロコルチコイドレセプターを介した周産期の母体の心臓におけるIL-6シグナル経路の抑制に用いるための医薬の製造における、IL-6阻害剤の使用。
　［５－４］医薬が周産期の対象に用いる、［５－１］～［５－３］のいずれかに記載の使用。
　［５－５］IL-6阻害剤がIL-6を認識する抗体である、［５－１］～［５－４］のいずれかに記載の使用。
　［５－６］IL-6阻害剤がIL-6受容体を認識する抗体である、［５－１］～［５－４］のいずれかに記載の使用。
　［５－７］抗体がモノクローナル抗体である、［５－１］～［５－６］のいずれかに記載の使用。
　［５－８］抗体がヒトIL-6に対する抗体またはヒトIL-6受容体に対する抗体である、［５－１］～［５－７］のいずれかに記載の使用。
　［５－９］抗体が組換え型抗体である、［５－１］～［５－８］のいずれかに記載の使用。
　［５－１０］抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、［５－１］～［５－９］のいずれかに記載の使用。
　［５－１１］抗体がトシリズマブ、サトラリズマブまたはサリルマブである、［５－１］～［５－１０］のいずれかに記載の使用。
　本発明により、周産期心筋症の治療剤または予防剤、特に分娩後または授乳期における周産期心筋症の治療剤および予防剤が提供される。
図１はNpr1-/-マウスにおける授乳誘発分娩後心筋症様心リモデリングの想定される機序を示す図である。 図２Ａは、妊娠－授乳サイクル数が母体心臓に及ぼす影響を検討する実験プロトコールを示す。本明細書においては、本図に示されるように1PP～5PPは、それぞれ第１～第５の妊娠－授乳サイクルにおける４週間の授乳期間完了（断乳）時を意味する。また1PPマウス～5PPマウスはそれぞれ1PP～5PPの時点にあるマウスを意味する。 図２Ｂは、反復する妊娠－授乳サイクルが母体生存率に及ぼす影響を示すグラフである。P値はlog-rank検定により求めた。 図２Ｃは、5PP後のNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスの心臓の代表写真と、5PPにおけるNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスにおける脛骨長に対する心臓重量の比（HW/TL）のグラフを示す。それぞれ左側のグラフがNpr1+/+マウス、右側のグラフがNpr1-/-マウスを表す。統計解析は独立ｔ検定により行った。*：P<0.05対5PP Npr1+/+マウスを示す。 図２Ｄは、未経産（非妊娠）および5PPマウスの心臓をシリウスレッドにより染色した結果の代表例を示す写真である。スケールバーは1mmを示す。 図２Ｅは、未経産マウス、1PPマウスおよび2PPマウスにおける心臓をヘマトキシリンおよびエオシン染色した結果の代表例を示す写真である。スケールバーは1mmを示す。 図２Ｆは、未経産マウス、1PPマウス、2PPマウス、および分娩8週間後の1PPまたは2PPマウスにおける脛骨長に対する心臓重量の比（HW/TL）を示すグラフである。それぞれ左側のグラフがNpr1+/+マウス、右側のグラフがNpr1-/-マウスを表す。統計解析は、Tukey-Kramer 事後検定による二元配置分散分析により行った。*：P<0.05、†：P<0.05 対未経産Npr1+/+マウス、‡：P<0.05対未経産Npr1-/-マウスを示す。 図２Ｇは、未経産マウス、1PPマウス、2PPマウスおよび1PPまたは2PPの8週間後のマウスにおける脛骨長に対する肺重量の比（LuW/TL）を示すグラフである。それぞれ左側のグラフがNpr1+/+マウス、右側のグラフがNpr1-/-マウスを表す。統計解析は、Tukey-Kramer 事後検定による二元配置分散分析により行った。*：P<0.05、‡：P<0.05対未経産Npr1-/-マウスを示す。NSは有意ではないことを示す。 図２Ｈは、未経産および2PPのNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスにおけるシリウスレッド染色後の心臓組織像の代表例を示す写真である。スケールバーは50μmを示す。 図２Ｉは、未経産、1PP、および2PPのNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスの心臓における線維化領域の定量化を示すグラフである。それぞれ左側のグラフがNpr1+/+マウス、右側のグラフがNpr1-/-マウスを表す。統計解析は、Tukey-Kramer 事後検定による二元配置分散分析により行った。‡：P<0.05対未経産Npr1-/-マウスを示す。NSは有意ではないことを示す。 図２Ｊは、未経産および2PPのNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスにおける蛍光標識コムギ胚芽凝集素による染色後の心臓組織像の代表例を示す写真である。スケールバーは50μmを示す。 図２Ｋは、未経産マウス、1PP、および2PPのNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスにおける心筋断面積の定量化を示すグラフである。それぞれ左側のグラフがNpr1+/+マウス、右側のグラフがNpr1-/-マウスを表す。統計解析は、Tukey-Kramer 事後検定による二元配置分散分析により行った。*：P<0.05、†：P<0.05対未経産Npr1-/-マウス、‡：P<0.05対未経産Npr1-/-マウスを示す。 図３Ａは、授乳が母体の心臓に及ぼす影響を調べるための実験プロトコールを示す図である。 図３Ｂは、妊娠期間中のNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスにおける収縮期血圧（SBP）の連続的変化を示すグラフである。グラフ中の陰影は妊娠期間を示す。統計解析は、2元配置反復測定分散分析により行った。*：P<0.05を示す。 図３Ｃは、妊娠期間及び分娩後期間におけるNpr1+/+マウス（各群10～20例）及びNpr1-/-マウス（各群5～13例）の体重（BW）及び血漿中心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）濃度の時間的変化を示すグラフである。グラフ中の陰影は妊娠期間を示す。統計解析は、Tukey-Kramer 事後検定による一元配置分散分析により行った。*：P<0.05、†：P<0.05対未経産マウスを示す。 図３Ｄは、Npr1+/+およびNpr1-/-マウスにおける未経産状態、妊娠後期（E18.5）、および分娩直後（3日以内）の脛骨長に対する心臓重量の比（HW/TL）を示すグラフである。それぞれ左側のグラフがNpr1+/+マウス、右側のグラフがNpr1-/-マウスを表す。統計解析は、Tukey-Kramer 事後検定による二元配置分散分析により行った。‡P<0.05対対応するNpr1+/+群を示す。NSは有意ではないことを示す。 図３Ｅは、Npr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスにおける授乳中のHW/TL値の経時的分析、および授乳を回避した場合の分娩後2週のHW/TL値を示すグラフである（Npr1+/+群でn=8～21、Npr1-/-群でn=7～13）。統計解析は、Tukey-Kramer 事後検定による二元配置分散分析により行った。†：P<0.05 対未経産マウス、‡P<0.05対対応するNpr1+/+群を示す。 図３Ｆは、２週間授乳中のNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスの心臓における心肥大および心臓線維化に関与する遺伝子の相対的発現量を示すグラフである（各群n=8マウス）。それぞれ左から、未経産のNpr1+/+マウス、未経産のNpr1-/-マウス、２週間授乳中のNpr1+/+マウス、２週間授乳中のNpr1-/-マウスのグラフを表す。統計解析は、Tukey-Kramer事後検定による二元配置分散分析により行った。*：P<0.05を示す。 図４Ａは、Npr1-/-マウスの授乳誘発心肥大におけるアルドステロン、IL-6、交感神経または副交感神経活性、酸化ストレスの関与を調べるための実験プロトコールを示す。本実験により、IL-6誘導性炎症は、Npr1-/-マウスにおける授乳誘発性心肥大に関与することが示された。 図４Ｂは、未経産（非妊娠）または授乳2週間後のNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスの心臓におけるIL-6およびIL-1βの相対的遺伝子発現レベルを示すグラフである。統計解析は、Tukey-Kramer事後検定による二元配置分散分析により行った。*：P<0.05を示す。NSは有意ではないことを示す。 図４Ｃは、Npr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスの心臓におけるシグナル伝達性転写因子3（STAT3）タンパク質のリン酸化に対する授乳の影響を示す図である。 図４Ｄは、対照食餌またはミネラロコルチコイド受容体（MR）アンタゴニストであるエプレレノンを含む食餌を投与した授乳2週間後の Npr1+/+およびNpr1-/-マウスの心臓におけるIL-6およびIL-1βの相対的遺伝子発現のレベルを示すグラフである。統計解析は、Tukey-Kramer事後検定による二元配置分散分析により行った。NSは有意ではないことを示す。 図４Ｅは、対照免疫グロブリンG（IgG）またはMR16-1（抗IL‐6受容体抗体）の投与による授乳2週間後のNpr1+/+およびNpr1-/-マウスにおける脛骨長に対する心臓重量の比（HW/TL）を示すグラフである。統計解析は、Tukey-Kramer事後検定による二元配置分散分析により行った。NSは有意ではないことを示す。 図４Ｆは、メトプロロール（β1受容体拮抗薬）、ニコチン（副交感神経刺激薬）、またはテンポール（ラジカルスカベンジャー）の投与の有無による授乳2週間後のNpr1-/-マウスにおけるHW/TLの比較を示すグラフである。統計解析は、Tukey-Kramer事後検定による一元配置分散分析により行った。NSは有意ではないことを示す。 図４Ｇは、未経産（白抜きの四角）および授乳2週間後（塗りつぶしの四角）のNpr1の組織特異的欠失マウス（ネスチン、ニューロン; αMHC、心筋細胞; Tie2、内皮細胞; AQP2、集合管; CLC-KB、遠位尿細管）およびNpr1-/-マウスにおけるHW/TLの比較を示すグラフである。統計解析は、Dunnett事後検定および独立ｔ試験による一元配置分散分析により行った。*：P<0.05を示す。NSは有意ではないことを示す。
　本発明は、IL-6阻害剤を有効成分として含有する、周産期心筋症の治療剤または予防剤に関する。
　本発明において「IL-6阻害剤」とは、IL-6によるシグナル伝達を遮断し、IL-6の生物学的活性を阻害する物質である。IL-6阻害剤は、好ましくはIL-6、IL-6受容体及びgp130のいずれかの結合に対する阻害作用を有する物質である。
　本発明のIL-6阻害剤としては、例えば抗IL-6抗体、抗IL-6受容体抗体、抗gp130抗体、IL-6改変体、可溶性IL-6受容体改変体あるいはIL-6又はIL-6受容体の部分ペプチドおよび、これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のIL-6阻害剤としては、好ましくはIL-6受容体を認識する抗体を挙げることができる。
　本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることができる。
　本発明で使用される抗IL-6抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗IL-6抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はIL-6と結合することにより、IL-6のIL-6受容体への結合を阻害してIL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
　このような抗体としては、MH166（Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956）やSK2抗体（Sato, K. et al., 第21回 日本免疫学会総会、学術記録 (1991) 21, 166）等が挙げられる。
　抗IL-6抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、IL-6を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、抗IL-6抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトIL-6は、Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550、J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541、あるいはAgr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688に開示されたIL-6遺伝子／ アミノ酸配列を用いることによって得られる。
　IL-6の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のIL-6タンパク質を公知の方法で精製し、この精製IL-6タンパク質を感作抗原として用いればよい。また、IL-6タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質を感作抗原として用いてもよい。
　本発明で使用される抗IL-6受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗IL-6受容体抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はIL-6受容体と結合することにより、IL-6のIL-6受容体への結合を阻害してIL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
　このような抗体としては、MR16-1抗体（Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928）、PM-1抗体 （Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906）、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体あるいはAUK146-15抗体（国際特許出願公開番号WO 92-19759）などが挙げられる。これらのうちで、ヒトIL-6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体としてはPM-1抗体が例示され、またマウスIL-6受容体に対する好ましいモノクローナル抗体としてはMR16-1抗体が挙げられる。
　抗IL-6受容体モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、IL-6受容体を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、抗IL-6受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトIL-6受容体は、欧州特許出願公開番号EP 325474に、マウスIL-6受容体は日本特許出願公開番号特開平3-155795に開示されたIL-6受容体遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
　IL-6受容体タンパク質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱しているもの（可溶性IL-6受容体）（Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676）との二種類がある。可溶性IL-6受容体は細胞膜に結合しているIL-6受容体の実質的に細胞外領域から構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領域が欠損している点で膜結合型IL-6受容体と異なっている。IL-6受容体タンパク質は、本発明で用いられる抗IL-6受容体抗体の作製の感作抗原として使用されうる限り、いずれのIL-6受容体を使用してもよい。
　IL-6受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のIL-6受容体タンパク質を公知の方法で精製し、この精製IL-6受容体タンパク質を感作抗原として用いればよい。また、IL-6受容体を発現している細胞やIL-6受容体タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質を感作抗原として用いてもよい。
　本発明で使用される抗gp130抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗gp130抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はgp130と結合することにより、IL-6／IL-6受容体複合体のgp130への結合を阻害してIL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
　このような抗体としては、AM64抗体（特開平3-219894）、4B11抗体および2H4抗体（US5571513）、B-S12抗体およびB-P8抗体（特開平8-291199）などが挙げられる。
　抗gp130モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、gp130を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
　具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるgp130は、欧州特許出願公開番号EP 411946に開示されたgp130遺伝子／ アミノ酸配列を用いることによって得られる。
　gp130の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的のgp130タンパク質を公知の方法で精製し、この精製gp130タンパク質を感作抗原として用いればよい。また、gp130を発現している細胞やgp130タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質を感作抗原として用いてもよい。
　感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
　感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4-21日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
　このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
　前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、P3X63Ag8.653（Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550）、P3X63Ag8U.1 （Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7)、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415）、SP2/0（Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133）等が適宜使用される。
　前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）等に準じて行うことができる。
　より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1～ 10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、37℃程度に加温したPEG溶液、例えば、平均分子量1000～ 6000程度のPEG溶液を通常、30～60％（w/v）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
　当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日～ 数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原タンパク質又は抗原発現細胞で感作し、感作Bリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO96/34096、WO96/33735参照）。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
　当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
　例えば、抗IL-6受容体抗体産生ハイブリドーマの作製は、特開平3-139293に開示された方法により行うことができる。PM-1抗体産生ハイブリドーマをBALB/cマウスの腹腔内に注入して腹水を得、この腹水からPM-1抗体を精製する方法や、本ハイブリドーマを適当な培地、例えば、10％ ウシ胎児血清、5％BM-Condimed H1（Boehringer Mannheim製）含有RPMI1640培地、ハイブリドーマSFM培地（GIBCO-BRL製）、PFHM-II培地（GIBCO-BRL製）等で培養し、その培養上清からPM-1抗体を精製する方法で行うことができる。
　本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
　具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（V）領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159）等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit（Pharmacia製）等を使用してmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharmacia製）を用いることによりmRNAを直接調製することができる。
　得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMVReverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用いて行うことができる。また、cDNAの合成および増幅を行うには5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002；Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932）を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
　目的とする抗体のV領域をコードするDNAが得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
　本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
　本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体、ヒト（human）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
　キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
　具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework region）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
　CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
　キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体C領域が使用される。ヒト抗体C領域としては、Cγ が挙げられ、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。
　キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のC領域からなり、またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域からなり、これらはヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
　本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化PM-1抗体が挙げられる（国際特許出願公開番号WO 92-19759参照）。
　また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
　前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させることができる。哺乳類細胞を用いた場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
　また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／ エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
　例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Mulliganらの方法（Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114）、また、HEF1α ロモーター／ エンハンサーを使用する場合、Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）に従えば容易に実施することができる。
　大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、lacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合、Wardらの方法（Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546； Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーターを使用する場合、Betterらの方法（Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043）に従えばよい。
　抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（refold）して使用する（例えば、WO96/30394を参照）。
　複製起源としては、SV40、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、in vitroおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
　真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、(1)哺乳類細胞、例えば、CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Veroなど、(2)両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3)昆虫細胞、例えば、sf9、sf21、Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Aspergillus）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
　原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E.coli）、枯草菌が知られている。
　これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、in vivoにて抗体を産生してもよい。
　一方、in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
　哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
　これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
　また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばpMON530に挿入し、このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばNicotiana tabacumに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。
　上述のようにin vitro又はin vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号WO 94-11523参照）。
　本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、完全長抗体であってよく、抗体の断片やその修飾物であってよい。「完全長抗体」とは、２つの「完全長抗体重鎖」および２つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を示す。「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）（ＶＨ－ＣＨ１－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３と略称される）からなるポリペプチドである。「完全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチド（ＶＬ－ＣＬと略称される）である。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）はκ（カッパ）またはλ（ラムダ）であり得る。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間、および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間がポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒に連結されている。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような天然抗体である。抗体の断片としては、例えば、Fab、F（ab'）2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げられる。
　具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152,2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496、Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515、Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66、Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137参照）。
　scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域を連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883）。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
　scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖又は、H鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖又は、L鎖V領域をコードするDNAを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNAおよびその両端を各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
　また、一旦scFvをコードするDNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、scFvを得ることができる。
　これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
　前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。プロテインAカラムに用いる担体として、例えば、HyperD、POROS、SepharoseF.F.等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
　例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはHPLC（High performance liquid chromatography）に適用し得る。また、逆相HPLC（reverse phase HPLC）を用いてもよい。
　上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はELISA等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、PBS(-)で適当に希釈した後、280nmの吸光度を測定し、1mg/mlを1.35ODとして算出する。また、ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6）で1μg/mlに希釈したヤギ抗ヒトIgG（TAG製）100μlを96穴プレート（Nunc製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトIgG（CAPPEL製）100μlを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
　洗浄後、5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG（BIO SOURCE製）100μlを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、MICROPLATE READER Model 3550（Bio-Rad製）を用いて405nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
　本発明で使用されるIL-6改変体は、IL-6受容体との結合活性を有し、且つIL-6の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、IL-6改変体はIL-6受容体に対しIL-6と競合的に結合するが、IL-6の生物学的活性を伝達しないため、IL-6によるシグナル伝達を遮断する。
　IL-6改変体は、IL-6のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入して作製される。IL-6改変体のもととなるIL-6はその由来を問わないが、抗原性等を考慮すれば、好ましくはヒトIL-6である。
　具体的には、IL-6のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、WHATIF（Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56）を用いてその二次構造を予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行われる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒトIL-6遺伝子をコードする塩基配列を含むベクターを鋳型として、通常行われるPCR法によりアミノ酸が置換されるように変異を導入することにより、IL-6改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じてIL-6改変体を得ることができる。
　IL-6改変体の具体例としては、Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93、及びSavino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367、WO96-18648、WO96-17869に開示されている。
　本発明で使用されるIL-6部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペプチドは、各々IL-6受容体あるいはIL-6との結合活性を有し、且つIL-6の生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、IL-6部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペプチドはIL-6受容体又はIL-6に結合し、これらを捕捉することによりIL-6のIL-6受容体への結合を特異的に阻害する。その結果、IL-6の生物学的活性を伝達しないため、IL-6によるシグナル伝達を遮断する。
　IL-6部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペプチドは、IL-6又はIL-6受容体のアミノ酸配列においてIL-6とIL-6受容体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常１０～８０、好ましくは２０～５０、より好ましくは２０～４０個のアミノ酸残基からなる。
　IL-6部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペプチドは、IL-6又はIL-6受容体のアミノ酸配列において、IL-6とIL-6受容体との結合に係わる領域を特定し、その特定した領域の一部又は全部のアミノ酸配列に基づいて通常知られる方法、例えば遺伝子工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。
　IL-6部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製するには、所望のペプチドをコードするDNA配列を発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
　IL-6部分ペプチド又はIL-6受容体部分ペプチドをペプチド合成法により作製するには、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相合成法を用いることができる。
　具体的には、続医薬品の開発第１４巻ペプチド合成　監修矢島治明廣川書店1991年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶性である支持体に合成しようとするペプチドのC末端に対応するアミノ酸を結合させ、α－アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸をC末端からN末端方向の順番に１アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はペプチドのα－アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種類によりBoc法とFmoc法に大別される。
　このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応をする。ペプチド鎖との切断反応には、Boc法ではフッ化水素又はトリフルオロメタンスルホン酸を、又Fmoc法ではTFAを通常用いることができる。Boc法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をアニソール存在下で処理する。次いで、保護基の脱離と支持体から切断によりペプチドを回収する。これを凍結乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、Fmoc法では、例えばTFA中で上記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行うことができる。
　得られた粗ペプチドは、HPLCに適用することにより分離、精製することができる。その溶出にあたり、タンパク質の精製に通常用いられる水-アセトニトリル系溶媒を使用して最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分について、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解析等により同定する。
　IL-6部分ペプチド及びIL-6受容体部分ペプチドの具体例は、特開平2-188600、特開平7-324097、特開平8-311098及び米国特許公報US5210075に開示されている。
　本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
　本発明においてIL-6阻害剤は好ましくは抗IL-6受容体抗体であり、具体例として、トシリズマブ、サリルマブ、サトラリズマブなどが挙げられる。
　本発明の周産期心筋症の治療剤または予防剤および周産期心筋症に伴う心臓リモデリングの抑制剤は、心筋症の治療において使用することができる。「周産期心筋症」とは、心疾患の既往のなかった女性が、妊娠・産褥期に発症する心不全を意味し、拡張型心筋症に類似した病態を示すが、拡張型心筋症とは異なる疾患として鑑別される。WHOの心筋症の定義と分類では、心周産期心筋症とは二次性心筋症に分類されている。米国心臓協会（AHA）の定義では、周産期心筋症（産褥性心筋症）は一次性心筋症（心筋に主な病変があるもの）のうち後天性のものとされている。心不全において，病期が進行するとともに左室の拡大，収縮力の低下，心筋の線維化が起こり，この変化を「心臓リモデリング」とよぶ。「心不全」とは、心臓の働きが十分でないことが原因で、次第に動悸や息切れ、倦怠感や足の浮腫などを認めるようになり、放置するとやがて息苦しくて横になれなくなる状態をいう。進行の程度や速さは人それぞれだが、一般的に時間とともに重症化し、難治性となる。突然の発症や急変することも稀ではなく、やがて酸素不足のためや不整脈その他の病気を併発して死に至る危険な状態である。
　本発明において「周産期心筋症の治療または予防」とは、周産期心筋症により生じる心機能低下を治療または予防すること、ならびに周産期心筋症の急性心不全症状（呼吸困難、咳、浮腫、全身倦怠感、動悸、ショック、意識障害など）、および慢性心不全症状（労作時息切れ、浮腫、動悸など）の治療または予防することを意味する。
　本発明において「心臓リモデリングの抑制又は改善」とは、心不全の病期進行に伴う、左室拡大、収縮力低下、心筋線維化の進行を止める、あるいは、薬剤投与前と比較してそれらの状態を改善することを意味する。
　ミネラロコルチコイド受容体（MR）は、ミネラロコルチコイド（アルドステロン）とグルココルチコイド（コルチゾール）に対して同等の親和性を持つ受容体であり、腎臓、結腸、心臓、中枢神経系（海馬）、褐色脂肪組織、汗腺などの多くの組織で発現している。本発明において、「神経ミネラロコルチコイドレセプターを介した周産期の母体の心臓におけるIL-6シグナル経路」とは、周産期の母体の心臓において心臓血漿アルドステロン濃度が上昇して、中枢神経系MRの活性化により心臓組織におけるIL-6濃度が上昇し、その結果、心筋障害が引き起こされる経路を意味する。
　本明細書において周産期心筋症は、例えば、心疾患の既往がなく、心不全を発症する原因が他に見当たらない女性において、妊娠後期から分娩後５か月以内に新たに出現した心不全症状として診断される。その症状としては、例えば、左室駆出率（EF）の低下、例えば４５％未満などの拡張型心筋症様の病態、脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）の血中濃度の上昇などが挙げられる。周産期心筋症は、例えば、BNPの測定、胸部Ｘｐ／ＣＴ、心エコー、心電図検査に基づいて診断することができる。さらに、他の心筋症を除外するための心臓ＣＴ、心臓ＭＲＩ、冠動脈造影、心筋生検などの結果に基づいて診断することができる。
　分娩は自然分娩の場合もあり、帝王切開手術を伴う場合もある。自然分娩は大きく３つの時期に分かれ、第１期は陣痛が生じ、子宮口が徐々に開いて胎児が腟に移動し、第２期で胎児が娩出され、第３期で胎盤が娩出される。「分娩後」とは、分娩第３期まで終了した時期をいい、「出産後」とは、「分娩後」又は帝王切開手術により胎児を娩出した時期をいう。本発明において処置対象として、例えば、妊娠後期（妊娠22週以降）から出産後５か月以内の女性が挙げられる。本発明の１つの態様において、出産後授乳期の女性が対象として挙げられる。「周産期」とは「妊娠22週から生後7日未満」までの期間を指し、「産褥期」とは出産後、母体が回復するまでの期間で、通常、出産後6～8週間である。「授乳期」とは、出産後から離乳までの、乳児に乳を飲ませる期間であり、生後約一年間をいう。本発明の１つの態様において、授乳期の女性が対象として挙げられ、ここで授乳期の女性は、実際に授乳を行っているか否かを問わず、例えば処置にあたり、授乳を中止した女性も含まれる。また本発明の１つの態様において、分娩後５ヵ月以内の女性が本発明において処置対象として挙げられる。
　後述するように発明者らは、分娩後、特に授乳期において母体の心臓に肥大性の変化が生じることを見出した。本発明の１つの態様においては、上記授乳期の女性を対象とすることで、授乳期における周産期心筋症の発症又は増悪を抑制することが可能である。本発明の別の態様において、周産期心筋症の慢性症状に対して、分娩後５ヵ月以降も処置を継続することもできる。本発明の別の態様は、特に、分娩後５ヵ月以降も授乳を継続する場合に好適に用いることができる。
　本明細書の実施例において言及するように、ANP/BNPの受容体であるNPR1は、妊娠、分娩、分娩後の時期の心臓の動的変化に関与すると考えられており、Npr1-/-マウスは周産期心筋症のモデル動物として使用することができる。Npr1-/-マウスにおける心肥大について予想される作用機序を図１に示す。ANP/BNP‐NPR1系が正常な場合、母体の心臓は可逆的肥大を発症し、それに伴ってERK1/2（細胞外シグナル伝達調節キナーゼ）タンパク質のリン酸化が亢進する。Nppa、Nppb、Acta1のmRNA発現は授乳期に有意に増加する。母体の心臓におけるこれらの肥大性変化は、血漿アルドステロンレベルおよび心臓におけるIL-6産生の増加に起因すると考えられる。しかし、ANP/BNP-NPR1系が欠損すると、周産期心筋症様の過剰な心肥大を来し、線維化、顕著な心機能障害、分娩後期の心臓におけるカルシニューリン・転写因子（Nuclear factor of activated T-cells: NFAT）経路の活性化を伴う。母体の心臓におけるこれらの変化は、血漿アルドステロンの有意な増加および心臓におけるIL-6依存性経路の顕著な活性化によって引き起こされる可能性が高い。これらの結果は、ANP/BNP－NPR1系が授乳誘発性の心臓リモデリングから母体心臓を保護することを意味する。なお、図１中でMRはミネラロコルチコイド受容体を示す。
　本発明において、IL-6阻害剤投与による処置は、その他の処置と併用して実施することができる。その他の処置としては、例えば、薬物療法（ACE阻害剤、アンジオテンシン受容体ブロッカー、βブロッカー、利尿薬、ブロモクリプチンなどの投与）が挙げられ、特に急性の場合には、人工呼吸管理、大動脈内バルーンパンピング（Intra-Aortic Balloon. Pumping：IABP）、心肺補助装置（PCPS、V-A. bypass、ECMO）などが挙げられる。
　本発明において、IL-6阻害剤投与は周産期心筋症との診断を受けた対象の治療のために用いることができる。また、本発明において、IL-6阻害剤投与は周産期心筋症との診断を受けた対象の心不全状態の重症化予防のために用いることができる。本発明の一つの態様において、前回の妊娠時に周産期心筋症の診断を受けた女性の次回妊娠時にIL-6阻害剤投与を予防的処置として行うことができる。ここで、予防的処置の対象には、次回の妊娠までに心機能が正常化している女性が含まれるがこれに限られない。
　本発明で使用されるIL-6阻害剤のIL-6シグナル伝達阻害活性は、通常用いられる方法により評価することができる。具体的には、IL-6依存性ヒト骨髄腫株（S6B45,KPMM2）、ヒトレンネルトTリンパ腫細胞株KT3、あるいはIL-6依存性細胞MH60.BSF2を培養し、これにIL-6を添加し、同時にIL-6阻害剤を共存させることによりIL-6依存性細胞の3H-チミジン取込みを測定すればよい。また、IL-6受容体発現細胞であるU266を培養し、125I標識IL-6を添加し、同時にIL-6阻害剤を加えることにより、IL-6受容体発現細胞に結合した125I標識IL-6を測定する。上記アッセイ系において、IL-6阻害剤を存在させる群に加えIL-6阻害剤を含まない陰性コントロール群をおき、両者で得られた結果を比較すればIL-6阻害剤のIL-6阻害活性を評価することができる。
　本発明の医薬組成物、治療剤、予防剤などの薬剤は、医薬製剤の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.01mgから100mgの範囲で、好ましくは体重1kgあたり1mgから2mgの範囲で、好ましくは体重1kgあたり8mg、体重1kgあたり12mgから選ばれる。あるいは、患者あたり1～1000mg、好ましくは100～200mg、好ましくは120mg、150mg、200mgの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗IL-6受容体抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重1kgあたり１ヶ月（４週間）に0.5mgから40mg、好ましくは1mgから20mgを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、移植後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
　本発明の医薬組成物、治療剤、予防剤などの薬剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる担体が添加されていてもよい。製剤上許容しうる担体とは、それ自体は周産期心筋症における症状の治療効果または予防効果、および周産期心筋症に伴う心臓リモデリングの抑制効果を有する材料であってもよいし、当該抑制効果を有さない材料であってもよく、上記の薬剤とともに投与可能な材料を意味する。また、薬理効果を有さない材料であって、IL-6阻害剤と併用することによって相乗的もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。
　製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤（EDTA等）、結合剤等を挙げることができる。
　本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノオレアート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のHLB 6～18を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
　また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０～１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２～４でアルキル基の炭素原子数が１０～１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８～１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２～１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
　本発明の薬剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０，４０，６０又は８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０及び８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックF-68（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
　界面活性剤の添加量は使用する界面活性剤の種類により異なるが、ポリソルベート20又はポリソルベート80の場合では、一般には0.001～100ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは0.003～50ｍｇ／ｍＬであり、さらに好ましくは0.005～2ｍｇ／ｍＬである。
　本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等他の有機酸等、あるいは、リン酸緩衝液（リン酸水素ナトリウム水和物、リン酸二水素ナトリウム水和物）、クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液（L-ヒスチジン、L-ヒスチジン塩酸塩水和物）、イミダゾール緩衝液等を挙げることができる。
　また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には1～500ｍＭであり、好ましくは5～100ｍＭであり、さらに好ましくは10～20ｍＭである。
　また、本発明の薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等のタンパク質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
　本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩（好ましくは、塩酸塩、リン酸塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場合、好ましいpH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添加により調整される。この場合、リン酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有しない場合あるいは対応する陰イオン（リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クエン酸イオン、コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましいアミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオルニチンである。さらに、酸性アミノ酸、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸、及びその塩の形（好ましくはナトリウム塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン、バリン、メチオニン、システイン、またはアラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体のN-アセチルトリプトファンを使用することもできる。
　本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース，トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
　本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
　本発明の薬剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液と混合することができる、また該水溶液は、適当な溶解補助剤（例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、PEG等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80、HCO-50）等）と併用してもよい。所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
　本発明において、含硫還元剤としては、例えば、Ｎ－アセチルシステイン、Ｎ－アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１～７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等を挙げることができる。
　また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸及びその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミテート、Ｌ－アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
　また、必要に応じ、マイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る（Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105; 米国特許第3,773,919号; 欧州特許出願公開（EP）第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP第133,988号）。
　使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
　本発明における処置の対象は、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物）を含む。
　本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含まれる。経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。
　非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤としては、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を挙げることができる。また、投与すべきオリゴヌクレオチドを含む遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することができる。また、本発明の薬剤を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または本発明のペプチドをコードするDNAの標的化遺伝子送達により投与することも可能である。心筋症発症時の処方、例えば、カテーテル手術法（PTCA、PCI）、血栓溶解療法（PTCR）、冠動脈バイパス増設法（CABG）等、と同時平行的に本発明の薬剤が投与されてもよい。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　１．マウスの作製
　動物実験はすべて国立循環器病研究センター動物実験倫理委員会の承認を受け、日本生理学会のガイドラインに準拠して実施された。Npr1-/-マウスは、Howard Hughes Medical Institute （テキサス大学サウスウェスタン医療センター、ダラス）で作製された（Nature. (1995) 378, 65-68. doi:10.1038/378065a0）。本研究で用いたマウスはいずれもC57BL/6バックグラウンドのものであった。マウスを25℃で12:12時間の明:暗サイクル下で群飼育し、食物および水へのアクセスは無制限とした。実験には雌マウス（8週齢）を用いた。交配は雄1に対して雌複数で行い、妊娠が判明した雌マウスは別ケージにて個別に飼育した。分娩後は授乳期間終了まで仔と同じゲージで飼育し、仔の数の調整は行わなかった。
　２．統計解析
　すべてのデータは平均値の平均値±標準誤差で示す。動物を無作為に実験群に割り付けた。Kaplan‐Meier分析、続いてログランク検定を用いて、マウス間の生存を比較した。ペアワイズ比較は、両側の対応のないスチューデントt検定を用いて行った。3群以上の差は、Tukey-Kramer事後検定による1元配置または2元配置分散分析を用いて解析した。組織特異的ノックアウトマウス間の比較には、1元配置分散分析に続いてDunnett事後検定を適用した。マイクロアレイ解析では、t検定を用いて示差的遺伝子発現を決定した。多重検定の調整はBenjamini-Hochberg法に準じて行い、偽発見率を0.05と設定した。すべての比較について、P値が0.05未満であれば統計的有意性を示す。
　３．分娩後Npr1ノックアウトマウスにおけるPPCM様心臓リモデリングの確認
　図２Ａに示す実験プロトコールにしたがって、Npr1-/-マウスおよび野生型マウス（Npr1+/+マウス）を飼育した。５回の妊娠－授乳サイクル後の生存率を図２Ｂに示す。Npr1-/-マウスの生存率は、連続した妊娠-授乳サイクルにわたってNpr1+/+マウスよりも有意に低かった（図２Ｂ; P = 0.0008, 対Npr1+/+マウス）。驚くべきことに、連続した妊娠－授乳サイクル中に死亡したNpr1-/-母動物のうち、75%が授乳期間中に死亡した。5回目の連続した妊娠－授乳サイクル後、Npr1-/-マウスの心臓はNpr1+/+マウスの心臓よりも顕著に大きく、肺重量の増加、間質の線維化、および心肥大に関連する遺伝子のmRNA発現の増加を伴っていた（図２Ｃおよび２Ｄ）。未経産状態における脛骨長に対する心臓重量の比（HW/TL）は、Npr1+/+マウスよりもNpr1-/-マウスでわずかではあるが有意に高かった（図２Ｅおよび２Ｆ）。しかし、最初の妊娠－授乳サイクル後のHW/TLは、分娩後Npr1-/-マウスで有意に増加し（図２Ｅおよび２Ｆ）、２回目の連続した妊娠－授乳サイクル後のHW/TL（2PP）は、分娩後Npr1-/-マウスだけでなく、Npr1+/+マウスでも有意に増加した（図２Ｅおよび２Ｆ）。なお、HW/TLが増加しているということは、心肥大が生じていることを意味する。
　分娩後Npr1+/+マウスにおいては、1PPおよび2PPの心肥大はその後8週までに未経産レベルに完全に回復した（図２Ｆ）。対照的に、2PPのNpr1-/-マウスにおける心肥大は、その後8週までに完全には消失しなかった（図２Ｆ）。心不全に起因する肺のうっ血を示す、肺重量の脛骨長に対する比（LuW/TL）は未経産Npr1+/+マウスとNpr1-/-マウスの間でほぼ同じであり、Npr1+/+マウスでは妊娠－授乳サイクルを通してほぼ変化しなかったが、1PPおよび2PPのNpr1-/-マウスでは有意に増加した（図２Ｇ）。さらに、離乳後8週までのLuW/TLの回復が、2PP Npr1-/-マウスででは妨げられる傾向が確認された（P = 0.064, 対未経産Npr1-/-マウス;図２Ｇ）。分娩後Npr1+/+マウスでは、心臓における線維化領域は増加しなかったが（図２Ｈおよび２Ｉ）、心筋細胞は有意に肥大した（図２Ｊおよび２Ｋ）。線維化領域（図２Ｈおよび２Ｉ）および心筋細胞サイズ（図２Ｊおよび２Ｋ）はいずれも、Npr1-/-マウスでは1PPおよび2PPの何れにおいても有意に増加した。
　４．授乳によるマウス心肥大誘発の確認
　Npr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスにおいて、どの過程（すなわち、妊娠、分娩、または授乳）が心肥大の原因であるかを明らかにするために、3つの過程すべての間の母体の表現型を調べた。実験プロトコールを図３Ａに示す。22匹のNpr1-/-マウスは、Npr1+/+マウスよりも未経産状態で高い血圧を示した（図３Ｂ）。proANP転換酵素を欠損したマウスが妊娠誘発性高血圧を発症することが報告されているが（Chan, J.C., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2005) 102, 785-790. doi: 10.1073/pnas.0407234102）、Npr1-/-マウスはその表現型を示さなかった（図３Ｂ）。最初の妊娠－授乳サイクルにおけるNpr1+/+マウスとNpr1-/-マウスの両方で、母体体重は妊娠後期に最も高かった（図３Ｃ）。血漿ANPはNpr1+/+マウスでは分娩直後と授乳2週間後に二峰性にピークに達したが、Npr1-/-マウスでは分娩2週間後にピークに達した（図３Ｃ）。対照的に、Npr1+/+マウスまたはNpr1-/-マウスのいずれにおいても、HW/TLは妊娠後期または初産後3日以内に増加しなかった（図３Ｄ）。さらに、Npr1+/+マウスまたはNpr1-/-マウスのいずれにおいても、RCAN1の発現およびERK1/2のリン酸化は妊娠後期（E18.5）には増加しなかった（データ不掲載）。これらの所見は、周産期マウスにおける心肥大が妊娠に関連する体液量過負荷によって誘発されないことを意味する。
　対照的に、HW/TLは、初産後のNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスにおいて授乳2週間以内に有意に増加した（図３Ｅ）。心肥大に関連する遺伝子（Nppa、Nppb、およびActa1）のmRNA発現量は、初産後のNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスの両方で授乳中に有意に増加した（図３Ｆ）。比較すると、線維化に関連する遺伝子（Col3a1、Fn1、およびTgfb1）のmRNA発現は、授乳期Npr1-/-マウスのみで有意に増加した（図３Ｆ）。しかし、授乳2週間後の収縮期血圧は、Npr1+/+マウスまたはNpr1-/-マウスのいずれにおいても、分娩直後と差はなかった（データ不掲載）。
　最初の妊娠－授乳サイクル後にNpr1+/+マウスまたはNpr1-/-マウスで発生した心肥大は、出生直後に仔を除去して授乳を行わない場合には認められなかった（図３Ｅ；授乳を行わない２週間）。仔を除去して授乳を行わないことにより、肥大した心筋細胞と心肥大に関連するmRNA発現の増加の両方が、初産後のNpr1-/-マウスで減少した（データ不掲載）。しかし、授乳を妨げることは、初産後のNpr1+/+マウスまたはNpr1-/-マウスのいずれにおいても心機能に影響を及ぼさなかった（データ不掲載）。これらの結果は、妊娠ではなく授乳がマウスにおいて心肥大を誘発することを示す。すなわち、これらの結果は、授乳中の肥大性心リモデリングを潜在的に抑制するANP/BNP－NPR1系の重要性を示す。
　５．授乳によるマウス心肥大に対するIL-6阻害剤の効果
　アルドステロンによる脳MRの活性化は、心血管炎症、酸化ストレス、交感神経活動を調節することが知られている。そこで次に、初産後の未経産および2週間授乳Npr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウス由来の心臓組織由来RNAおよびcDNAを用いてマイクロアレイ解析を行った。Npr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスの心臓において、それぞれ3246および2336のプローブで2倍以上の発現レベルの変化が生じた。その解析結果を以下の表に示す。なお、解析にはt検定を用い、P値計算は、漸近;多重比較補正、およびBenjamini-Hochberg法により行った。調整P値カットオフは0.05とし、倍率変化カットオフは2.0とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　さらに、授乳期Npr1+/+マウスと比較して授乳期Npr1-/-マウスの心臓では27のプローブで遺伝子発現の有意な（>1.5倍）変化が生じた（データ不掲載）。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）によるパスウェイ解析を行い、上流の調節因子の評価を行った。サイトカインに関する評価結果を表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　Npr1-/-マウスにおいて、心臓炎症性サイトカインが授乳誘発性心肥大に寄与する可能性があることが明らかになった。また、IL-6およびIL-1βは心肥大の発症に重要な役割を果たすとの報告があり（非特許文献１０）、未経産および初産後の授乳Npr1+/+およびNpr1-/-マウスの心臓におけるIL-6およびIL-1βのmRNAの発現量を調べた。実験プロトコールを図４Ａに示す。未経産マウスと比較して、授乳中のNpr1+/+マウスでは心臓のIl6 mRNA発現量が増加する傾向にあったが、授乳中のNpr1-/-マウスでは有意に増加していた（図４Ｂ）。Il1βのmRNAレベルは、初産後のNpr1+/+マウス、Npr1-/-マウスとも授乳中に上昇する傾向がみられた（図４Ｂ）。また、IL-6の下流標的であるシグナル伝達性転写因子3（STAT3）のタンパク質発現とリン酸化の程度をウエスタンブロット法により検討した。使用した１次抗体および２次抗体を表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　授乳は、Npr1-/-マウスの心臓においてリン酸化STAT3（p-STAT3α）を顕著に増加させたが、Npr1+/+マウスでは増加させなかった（図４Ｃ）。授乳はNpr1+/+マウスまたはNpr1-/-マウスのいずれにおいてもIL-6の血漿中濃度に影響を及ぼさなかったが、授乳中のNpr1-/-マウスでは授乳中のNpr1+/+マウスと比較して心臓のCD68陽性細胞数が多かった（データ不掲載）。エプレレノン投与により、初産後のNpr1-/-マウスの心臓におけるIl6発現が低下することが確認された（図４Ｄ）。
　さらに、抗IL-6受容体抗体（MR16-1）のNpr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスにおける効果を確認するために、以下の手順で試験を行った。Npr1+/+マウスおよびNpr1-/-マウスを対照IgG投与群（Npr1+/+マウス：n = 7；Npr1-/-マウス：n = 11）およびMR16-1投与群（Npr1+/+マウス：n = 8；Npr1-/-マウス：n = 8）に分けた。いずれのマウスにおいても、出産日（出産直後）および授乳開始から１週間後に対照IgGあるいはMR16-1を0.5 mg/マウス となるように腹腔内に投与した。投与量は0.1 mLに統一した。授乳開始から２週間後に心臓重量および脛骨長を測定し、心重量脛骨比（HW/TL）を算出した。抗IL-6受容体抗体（MR16-1）の週1回腹腔内注射は、初産後のNpr1-/-マウスでは授乳誘発心肥大を抑制する傾向が確認され、Npr1+/+マウスでは抑制しなかった（図４Ｅ）。
　同様の手法により授乳期間中のメトプロロール（β1アドレナリン受容体拮抗薬）、ニコチン（α7－ニコチン性アセチルコリン受容体作動薬）およびテンポール（ラジカルスカベンジャー）の投与試験も行った。いずれかの投与を介した交感神経または副交感神経活性の薬理学的修飾は、Npr1-/-マウスの心肥大を抑制しなかった（図４Ｆ）。さらに、授乳中のNpr1-/-マウスにテンポール（ラジカルスカベンジャー）を2週間投与しても、授乳依存性の心肥大は抑制されなかった（図４Ｆ）。
　本発明により、周産期心筋症の治療剤または予防剤、特に分娩後または授乳期における周産期心筋症の治療剤および予防剤が提供される。
 

Claims (9)

  1. 　IL-6阻害剤を有効成分として含有する、周産期心筋症の治療または予防において使用するための医薬組成物。
  2. 　授乳期の対象において使用するための、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　IL-6阻害剤がIL-6を認識する抗体である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
  4. 　IL-6阻害剤がIL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
  5. 　抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３または４に記載の医薬組成物。
  6. 　抗体がヒトIL-6に対する抗体またはヒトIL-6受容体に対する抗体である、請求項３～５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 　抗体が組換え型抗体である、請求項３～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  8. 　抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項３～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  9. 　抗体がトシリズマブ、サトラリズマブまたはサリルマブである、請求項３～８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
     
     
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