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WO2022064147A1 - Procede d'analyse d'un echantillon biologique avec determination de la repartition spatiale de biomasse le long de l'axe optique - Google Patents

Procede d'analyse d'un echantillon biologique avec determination de la repartition spatiale de biomasse le long de l'axe optique Download PDF

Info

Publication number
WO2022064147A1
WO2022064147A1 PCT/FR2021/051635 FR2021051635W WO2022064147A1 WO 2022064147 A1 WO2022064147 A1 WO 2022064147A1 FR 2021051635 W FR2021051635 W FR 2021051635W WO 2022064147 A1 WO2022064147 A1 WO 2022064147A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
analysis
biomass
distribution
optical axis
holographic
Prior art date
Application number
PCT/FR2021/051635
Other languages
English (en)
Inventor
Dominique Decaux
Emilie BISCEGLIA
Original Assignee
Biomerieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux filed Critical Biomerieux
Priority to EP21798063.0A priority Critical patent/EP4217713A1/fr
Priority to CN202180065424.4A priority patent/CN116324386A/zh
Priority to JP2023519055A priority patent/JP2023543228A/ja
Priority to US18/025,814 priority patent/US20240019365A1/en
Publication of WO2022064147A1 publication Critical patent/WO2022064147A1/fr

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    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/41—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length
    • G01N21/45—Refractivity; Phase-affecting properties, e.g. optical path length using interferometric methods; using Schlieren methods
    • G01N21/453—Holographic interferometry
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01N2015/1486—Counting the particles

Definitions

  • the present invention relates to the field of the analysis of biological samples by imaging, and more particularly relates to the monitoring over time of the spatial distribution of biomass along the optical axis.
  • a biological sample consists of a suspension of biological agents.
  • Biological agents are, for example, microorganisms (bacteria, yeasts, molds, etc.).
  • the analysis of a biological sample is an in vitro analysis of the biological sample.
  • the analysis of a biological agent in the biological sample can comprise the identification of said biological agent or the determination of a characteristic of this biological agent, such as for example the minimum inhibitory concentration of an antibiotic which would be effective at against said biological agent or else the ability to form a biofilm.
  • the biological sample called inoculum in its initial state, is placed in a receptacle, or well, at least partially transparent through which the analysis instrument can carry out measurements of optical properties of the biological sample.
  • the well contains a nutrient medium and also one or more reagents, such as an enzymatic substrate or antibiotics, intended to interact with biological agents present in the biological sample.
  • reagents such as an enzymatic substrate or antibiotics
  • a plurality of wells are provided to each receive the inoculum, each of the wells being provided with different reagents or with the same reagent at different concentrations. Depending on the nature of the biological agents present in the inoculum, these react with certain reagents, and not with other reagents, or at certain concentrations and not at others.
  • the reagents consist of different antibiotics at different concentrations, and the biological agents will multiply in the wells containing the antibiotics to which they are not sensitive or in which the concentration of antibiotics is insufficient, or on the contrary will see their development more or less hampered in the wells containing the antibiotics to which they are sensitive in sufficient concentrations.
  • the biomass i.e. the quantity of biological material present in each well, directly influences the optical properties of the biological sample present in each well, since the biological agents themselves present different optical properties from the solution. in which they are suspended.
  • the transmittance of the biological sample is affected by the evolution of the concentration of biological agents.
  • methods for the analysis of biological samples had been developed based on the determination of the evolution over time, during an incubation phase, of the overall transmittance (or absorbance, which is equivalent) of a well filled with the biological sample, in order to determine a turbidity measurement, typically expressed in McFarland (McF).
  • McFarland McFarland
  • This turbidity measurement is directly representative of the biomass of biological agents in the biological sample.
  • an emitting diode illuminates the sample with a light beam of known intensity, and a point photodiode arranged opposite the emitting diode with respect to the sample makes it possible to determine the light intensity received after the light beam has passed through the biological sample.
  • Such a transmittance measurement has a fairly low sensitivity, such that it is not possible to measure a turbidity of less than 0.05 McF, or even less than 0.1 McF.
  • the biomass does not always make it possible to determine the concentration of biological agents: in the event of an increase in the volume of the biological agents, for example by elongation for bacteria, the biomass increases for the same number of biological agents.
  • the spatial distribution of the growth of the biomass of biological agents is then affected at least temporarily by the spatial heterogeneity of the reactants, but an overall measurement does not make it possible to account for this.
  • heterogeneity can indicate that a biological agent is likely to form a biofilm, in which case measures Special measures can be taken, for example by adapting a medical treatment to the presence of a biofilm.
  • the invention therefore aims to make it possible, during the analysis of a biological sample, to have available for the latter the evolution over time of the spatial distribution of the biomass of biological agents along an optical axis. , for example in order to highlight characteristics of biological agents such as the ability to form a biofilm.
  • the invention proposes a method for analyzing a biological sample by means of an analysis instrument, the biological sample comprising biological agents and being placed in an analysis receptacle in a field of view of a holographic imaging system, said holographic imaging system defining an optical axis and an acquisition focal plane, the method comprising, for each measurement instant of a plurality of measurement instants of a duration of measure :
  • the method comprising the construction of a distribution indicator based on values of the biomass parameter of a measurement instant for several positions of the acquisition focal plane, said distribution indicator being representative of the spatial distribution of the quantity of biological agents in the receptacle of analysis along the optical axis at said instant of measurement, and the provision, among the analysis results, of a representation of the distribution of the biomass of biological agents derived from at least one indicator of distribution at an instant of measurement.
  • the distribution indicator is obtained by spatially organizing biomass parameter values according to the respective positions of the acquisition focal plane or the distribution indicator is obtained by a calculation relating to biomass parameter values at different positions the acquisition focal plane;
  • the representation of the distribution of the biomass of biological agents is a representation of the temporal evolution of the distribution of the biomass of biological agents which is derived several distribution indicators at a plurality of measurement instants;
  • the method comprises the construction of the representation of the temporal evolution of the distribution of the biomass of biological agents by spatially organizing distribution indicators according to their respective measurement instants;
  • the biomass parameter of a holographic image is derived from a statistic relating to the gray levels of the pixels of said holographic image
  • the biomass parameter is an average of the absolute values of the gray levels of each pixel of the holographic image
  • the determination of the biomass parameter of a holographic image includes a prior normalization of the holographic image, comprising:
  • the different respective positions on the optical axis of the acquisition focal planes are at least 10 in number in the analysis receptacle, and preferably at least 20;
  • the analysis receptacle comprises two opposite transparent faces located at different positions on the optical axis, and the different respective positions on the optical axis of the acquisition focal planes extend from one transparent face to the other face transparent;
  • At least one position of an acquisition focal plane on the optical axis is not located between the two transparent faces, and/or one position of an acquisition focal plane on the optical axis corresponds to the position of a transparent face;
  • the holographic imaging system defines a depth of field of at least 100 ⁇ m in the direction of the optical axis around each acquisition focal plane;
  • the holographic image is a hologram or an image reconstructed from a hologram.
  • the invention also relates to an analysis instrument comprising a holographic system with a field of view configured to acquire a holographic image and data processing means, the analysis instrument being configured to receive a biological sample in a receptacle of analysis in the field of view of the holographic system and to implement the steps of the method according to the invention.
  • FIG. 1 shows an example of an analysis card comprising a plurality of receptacles in the form of wells that can be used for the placement of a biological sample to be analyzed, according to a possible embodiment of the invention
  • FIG. 2 schematically shows an example of a holographic imaging system that can be used in an analysis instrument according to a possible embodiment of the invention
  • FIG. 3 is a diagram illustrating steps of the analysis method according to a possible embodiment of the invention.
  • FIG. 4 is a schematic view of a section of an analysis receptacle along a plane containing the optical axis
  • FIG. 5 is an example of a graphical representation of the evolution over time of the spatial distribution of biomass of biological agents along an optical axis.
  • the method of analyzing a biological sample is carried out using an analysis instrument comprising a holographic imaging system with a field of view, the analysis instrument being configured to receive a biological sample in a receptacle analysis in the field of view of the holographic imaging system.
  • Figure 1 shows an example of an analysis card 1 comprising a plurality of analysis receptacles 2 in the form of wells that can be used for placing a biological sample to be analyzed.
  • the analysis receptacles 2 are here organized according to a two-dimensional network on a plane, each receptacle 2 being associated with different analysis conditions, typically by means of different reagents present in the analysis receptacles 2.
  • the reagents are made up of different antibiotics at different concentrations.
  • the use of an analysis card 1 is not required, but such an analysis card 1 makes it possible to proceed during the same analysis period to a plurality of tests in a standardized way.
  • Each analysis receptacle 2 is at least partially transparent to at least one wavelength of light, visible or not, and preferably is at least partially transparent to the visible spectrum. This transparency allows the analysis of the sample biological material contained therein by optical means such as the holographic imaging system.
  • an analysis receptacle 2 has at least two opposite transparent faces 2a, 2b, so as to have a transparent axis for the propagation of light. These two opposite transparent faces 2a, 2b are for example less than 10 mm apart, and preferably less than 5 mm.
  • the opposite transparent faces 2a, 2b are separated, along the optical axis 16, by more than 0.1 mm, and preferably by more than 0.5 mm, and more preferably by more than 1 mm.
  • the opposite transparent faces 2a, 2b are transparent films defining the analysis receptacle 2. It is common for the reagents to be attached to at least one of the transparent faces. The reagents can thus be introduced into the analysis receptacle 2 by placing them on the film intended to form a transparent face 2a, 2b, before the latter is applied to the analysis card 1.
  • such an analysis card 1 may for example comprise a conduit 5 intended to be immersed in a volume 3 of inoculum 3 prepared in a tube 4.
  • the inoculum is prepared by an operator who introduces biological agents, for example taken from a culture in a Petri dish by means of a rod or a swab, suspended in a saline solution, with a dilution corresponding to a determined range of turbidity, for example between 0.5 and 0.63 McF for bacteria as biological agents or else between 1.8 and 2.2 McF for yeasts as biological agents, the range depending on the type of analysis carried out and the measuring instrument.
  • This preliminary suspension is then further diluted, for example with a factor of 20, or even 100, to analyze Gram- bacteria or with a factor of 10, or even 100, to analyze Gram+ bacteria.
  • This subsequent dilution can in particular be automated, and therefore be carried out by the measuring instrument after the tube 4 has been placed in the analysis instrument.
  • Other determined ranges of turbidity can be used, depending on the protocols used.
  • the desired dilution can be obtained all at once, or as in the example above, in several times.
  • conduit 5 is then immersed in the volume 3 of inoculum resulting from the preparation in tube 4, and the assembly is introduced into the analysis instrument. Of course, all or part of these preparation steps can be automated.
  • the inoculum travels through the conduit 5, then by a fluidic circulation circuit provided in the analysis card 1, is distributed between the analysis receptacles 5. This movement of the inoculum in the conduit 5 and the card d analysis 1 can be caused by capillarity and/or by depressurization of the air present at the open end of the tube 4.
  • the air present in the analysis card 1 which is at atmospheric pressure, leaves the analysis card 1 by the tube 5 through the inoculum 3 and gives way to the inoculum 3 which thus goes up by the tube 5 in the analysis card 1.
  • the biological sample constituted by the inoculum is then in place in an analysis receptacle 2.
  • the analysis instrument includes a holographic imaging system with a field of view configured to acquire a holographic image of that field of view.
  • the acquisition of a holographic image allows a significant depth of field, and therefore a very good detection sensitivity of biological agents.
  • the holographic imaging system is placed facing an analysis receptacle 2.
  • FIG. 2 schematically represents a holographic imaging system 10 in line arranged so that the field of view 11 of said holographic imaging system 10 is contained in the volume of biological sample contained in an analysis receptacle 2.
  • the analysis card 1, and therefore the analysis receptacles 2 that it comprises, is placed in an object plane of the holographic imaging system 10.
  • the holographic imaging system 10 defines an imaging axis 16, simplified here by a straight line corresponding to the optical axis but which can consist of a set of successive lines defining the light path, depending on the configuration of the optical components of the holographic imaging system 10.
  • a light source 4 configured to illuminate the analysis receptacle 2 in the field of view (or "field-of-view") of the holographic imaging system 10 by means of an illumination beam of sufficiently coherent light.
  • the light source 14 can produce the illumination light, or simply be the termination of an optical fiber conveying this illumination light, optionally provided with a diaphragm or iris.
  • the illumination beam has the conventional characteristics for holographic imaging, without particular additional constraints.
  • the illumination beam can thus be monochromatic (for example with a wavelength around 640-670 nm) or possibly be composed of several wavelengths, for example used one after the other.
  • an image sensor 12 On the other side of the analysis receptacle 2, here on the optical axis 16, is an image sensor 12, which is a digital sensor such as for example a CMOS or CCD sensor.
  • the image sensor 12 is placed on an image plane of the holographic imaging system 10, and is configured to acquire a hologram, that is to say a spatial distribution of intensity of interference caused by interactions between the inoculum placed in the field of view 11 and the illumination beam.
  • the holographic imaging system 10 is here provided with a set of optical components 18 arranged between the analysis receptacle 2 and the digital image sensor 12 such as for example a microscope objective 18a and a tube lens 18b in the example shown.
  • An optical component such as the microscope objective 18a is however optional, the invention not being limited to holographic microscopy with lens.
  • the arrangement described here is of course a non-limiting example. Any holographic imaging system 10 can be used, with different optical elements (with or without a microscope objective, etc.). Thus, when a holographic imaging system 10 can acquire an image in which the interference patterns generated by the biological sample appear, this holographic imaging system is suitable for implementing the method.
  • the holographic imaging system 10 is configured to define a depth of field of at least 100 ⁇ m in depth in the direction of the optical axis 16 around each acquisition focal plane 20, and preferably at least 150 ⁇ m, and more preferably at least 250 ⁇ m.
  • the analysis receptacle 2 comprises two opposite transparent faces 2a, 2b organized along the optical axis 16, and the depth of field extends over at least 100 ⁇ m between the two opposite transparent faces of the analysis receptacle. , and preferably over at least 150 ⁇ m, and more preferably over at least 250 ⁇ m, or even at least 300 ⁇ m.
  • the field of view 11 is understood as being the space in which the presence of biological agents can be determined from a hologram imaging said field of view 11.
  • the measuring instrument also includes components for processing data, such as a processor, memory, communication buses, etc. Insofar as these other components are specific only by the process that they implement and by the instructions that they contain, they will not be detailed below.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the steps of the analysis method, which follow a prior placement (step S1) of the biological sample in an analysis receptacle 2 in the field of view 11 of a system holographic imaging 10, detailed above.
  • the method comprises a plurality of cycles (steps S02) consisting of steps implemented repeatedly for a plurality of measurement instants of a measurement duration:
  • These cycles are typically repeated over a period ranging from one minute to 30 minutes, depending on the speed of the analysis instrument, the number of biological samples processed in parallel, and for example depending on the number of receptacles of analysis 2 in an analysis map 1.
  • the measurement duration extends over several hours, and typically more than 10 hours, resulting in several tens or even several hundreds of measurement instants.
  • the acquisition of a plurality of holographic images of the biological sample at different respective positions on the optical axis 16 of the acquisition focal plane involves a displacement of the acquisition focal plane (step S02c) prior to each acquisition of a holographic image by the image sensor 12 (step S02a).
  • These different positions of the acquisition focal plane can be obtained for example by moving the assembly formed by the image sensor 12 and the optical elements 18a, 18b, for example via a motorized rail or a motorized stage. It is also possible to obtain these different positions of the acquisition focal plane 20 by modifying an optical component of the holographic imaging system 10 moving the acquisition focal plane, by modifying a focusing of light rays incident on the sensor image 12 so as to move the acquisition focal plane of the image sensor 12.
  • the various respective positions on the optical axis 16 of the acquisition focal planes are at least 2 in number in the analysis receptacle, preferably at least 5, and more preferably at least 15, although only six between them are illustrated in Figure 4, for the purpose of simplification.
  • a greater number of acquisition planes makes it possible to refine the analysis of the heterogeneity of the spatial distribution of biological agents along the optical axis 16.
  • the focal acquisition planes extend preferably substantially perpendicular to the optical axis 16, so that the different respective positions on the optical axis 16 correspond to as many different depths in the analysis receptacle 2.
  • the analysis receptacle 2 typically comprises two opposite transparent faces 2a, 2b located at different positions on the optical axis 16, and different respective positions 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f on the optical axis 16 of the acquisition focal planes 20 extend from one transparent face 2a, 2b to the other transparent face 2a, 2b.
  • different respective positions 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f are regularly spaced along the optical axis 16 between the two transparent faces 2a, 2b opposites.
  • the various respective positions 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f of the acquisition focal plane are spaced apart so that each image acquired reveals different biological agents.
  • the different respective positions 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f of the acquisition focal plane on the optical axis 16 extend over a depth, along the optical axis 16, greater than 0.1 mm, and preferably greater than or equal to 0.5 mm, and preferably greater than or equal to 0.8 mm.
  • consecutive positions 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f of the acquisition focal plane on the optical axis 16 are spaced apart by at least 50 ⁇ m, preferably by at least 100 ⁇ m, and preferably still at least 150 iim.
  • the zones close to the two transparent faces 2a, 2b constitute privileged zones for analyzing the spatial distribution of the biological agents.
  • these faces also constitute mechanical supports on which the biological agents can develop a biofilm, a particularly interesting characteristic to detect.
  • a position of an acquisition focal plane on the optical axis 16 corresponds to the position of a transparent face 2a, 2b.
  • the holographic imager 10 acquires a hologram, which has the advantage of offering a great depth of field, and therefore a great sensitivity for detecting biological agents in the biological sample.
  • the holographic imaging system acquires a hologram.
  • the light source 14 emits a reference illumination beam, which can be translated into a reference plane wave propagating in the Z direction along the imaging axis 16.
  • the biological agents present in the field of view 11 inside the analysis receptacle 2 by their diffraction properties, scatter the incident reference light.
  • the wave scattered by the biological agents and the reference background interfere on the image sensor 12 to form the hologram.
  • the hologram corresponds to the spatial intensity distribution of the total field corresponding to the addition of scattered background and reference background. , which is translated into a gray level value for each pixel.
  • the holographic image used may be the hologram or may be an image reconstructed by backpropagation calculation from the hologram, using an algorithm of propagation for example based on Rayleigh Sommerfeld's diffraction theory.
  • Using the hologram without reconstruction makes it possible to benefit from a high detection sensitivity, because each biological agent appears in the hologram surrounded by rings corresponding to the interference figures caused by the presence of said biological agents, thus facilitating detection. the presence of these biological agents.
  • the non-reconstruction saves time and computational resources.
  • using a reconstructed image has other advantages, such as making it possible to precisely locate, possibly in three dimensions, the biological agents appearing in the reconstructed image.
  • a reconstructed image can be defined by gray levels for each pixel.
  • the biomass parameter of a holographic image is derived from a statistic relating to the gray levels of the pixels of said holographic image, and more preferably, the biomass parameter is an average of the absolute values of the gray levels of each pixel of the holographic image.
  • Other biomass parameters can however be used, such as for example a count of biological agents appearing in the holographic image, or even the proportion of the holographic image in which biological agents appear or not.
  • the determination of the biomass parameter of a holographic image comprises a prior normalization of the holographic image, comprising:
  • a smoothing filter preferably a Gaussian filter
  • the smoothing filter parameters for example the standard deviation for a Gaussian filter, are chosen to create a low-pass filter with a cutoff frequency low enough that the filtered image is representative only of the background. plane of the holographic image, hence the name background image, without for example the biological agents being discernible in this filtered image.
  • the normalization of the image may further comprise a subtraction of a constant operated on the gray levels of the holographic image resulting from the division. It is then possible to obtain a normalized holographic image with negative gray level values. It is therefore then the absolute values of the gray levels which are taken into account to determine the values of the biomass parameter.
  • a distribution indicator is constructed (step S03) from values of the biomass parameter of the same measurement instant for several positions of the acquisition focal plane.
  • the distribution indicator is representative of the spatial distribution of the quantity of biological agents along the optical axis at this instant of measurement.
  • the distribution indicator can be obtained by spatially organizing the biomass parameters according to the respective positions of their acquisition focal planes.
  • the distribution indicator takes the form of a concatenation of the values of the biomass parameter, and preferably takes the form of a spatial concatenation, in which the values of the biomass parameter are spatially concatenated.
  • the distribution indicator can therefore be interpreted as a vector whose components account for the quantity of biological agents at different positions.
  • the different values of the biomass parameter are organized according to the same spatial organization as the respective positions of the acquisition focal planes of the holographic images from which they come.
  • the distribution indicator can correspond to a single value, which accounts for the homogeneity or heterogeneity of the spatial distribution of the quantity of biological agents along the optical axis at a time of measure.
  • the distribution indicator can thus be obtained by a calculation relating to values of biomass parameters at different acquisition focal planes, and in particular by differences between these values.
  • a distribution indicator can correspond to a difference between at least one value of the biomass parameter with an acquisition focal plane close to the middle of the well (on the optical axis), and at least one value of the biomass parameter with an acquisition focal plane close to a transparent face 2a, 2b.
  • Other calculations are possible, such as for example a standard deviation, a variance, or other.
  • a first holographic image is acquired with an acquisition focal plane 20 at a first position 20a
  • a second holographic image is acquired with an acquisition focal plane 20 at a second position 20b
  • a third holographic image is acquired with an acquisition focal plane 20 at a third position 20c, etc., until a holographic image has been acquired for each position 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f of the acquisition focal plane 20 along the optical axis.
  • a value of the biomass parameter is determined for each holographic image, and therefore is associated with each position 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f: a first value for the first position 20a, a second value for the second position 20b, a third value for the third position 20c, etc.
  • the first value is therefore placed adjacent to the second value, itself placed adjacent to the third value, itself placed adjacent to the fourth value, etc.
  • the second value is therefore between the first value and the third value, just as the second position 20b is between the first position 20a and the third position 20c.
  • the spatial organization of the respective positions of the acquisition focal planes is therefore repeated.
  • Each measurement cycle therefore makes it possible to obtain a distribution indicator representative of the spatial distribution of the quantity of biological agents along the optical axis 16 at the measurement instant in which the cycle takes place.
  • the measurement cycles are typically repeated over a period ranging from one minute to 30 minutes, depending on the speed of the analysis instrument, the number of biological samples processed in parallel, and for example depending on the number of analysis receptacles 2 in an analysis card 1, but also depending on the speed of the interactions between the biological agents and the reagents.
  • the analysis time typically extends over several hours, and the method thus typically comprises more than 10 cycles, and preferably more than 20 measurement cycles during this measurement time.
  • the method then preferably comprises the construction (S04) of a representation of the distribution of the biomass of biological agents, which is derived from at least one distribution indicator at a measurement instant.
  • the representation of the distribution of the biomass of biological agents is a representation of the temporal evolution of the distribution of the biomass of biological agents which is derived from several distribution indicators at a plurality of measurement instants.
  • This representation of the distribution of the biomass of biological agents can be constructed by spatially organizing distribution indicators according to their respective measurement instants. Indeed, each distribution indicator corresponds to a particular measurement instant.
  • the combination of the distribution indicators therefore makes it possible to follow the temporal evolution of the spatial distribution of the biomass of biological agents along the optical axis 16.
  • it is a concatenation of distribution indicators , organized chronologically.
  • Figure 5 shows an example of representation of this temporal evolution.
  • the biological sample imaged is a saline suspension of Pseudomonas aeruginosa as biological agents.
  • 27 holographic images were acquired at 27 acquisition focal plane positions along the optical axis, corresponding to 27 different depths.
  • the measurement times are spaced 15 minutes apart.
  • the ordinate axis is that of the positions in Z along the optical axis, corresponding to the depth
  • the abscissa axis is that of the time, in minutes.
  • the bottom of the figure therefore corresponds to a transparent face 2a, 2b of the analysis receptacle 2, and the top of the figure corresponds to the other transparent face 2a, 2b, while the left of the figure corresponds to the start of the duration of measurement and the right of the figure corresponds to the end of the measurement duration.
  • This figure corresponds to a representation of the distribution of the biomass of biological agents in graphical form, derived from the distribution indicators at several measurement instants, which was obtained by translating the values of the biomass parameter by different shades of gray.
  • the Pseudomonas aeruginosa bacteria develop in the form of structured aggregates called biofilms, which first extend over the surfaces of the analysis receptacle 2.
  • the spatial distribution of the biological agents in the analysis receptacle is important information, which can for example constitute an additional indicator for identifying the biological agents of the sample, or for evaluating the interactions with reagents arranged on one face of the analysis receptacle 2, or even to reveal the ability of the biological agent to form a biofilm.
  • the method comprises the supply, among the analysis results (step S05), of the representation of the distribution of the biomass of biological agents derived from at least one distribution indicator at a measurement instant, for example to provide information on the spatial distribution of biological agents at a measurement instant.
  • This representation of the distribution of the biomass of biological agents can for example be provided in graphical form, such as an image or a curve or a table. It can be provided in the form of numerical values, for example corresponding to one or more distribution indicators. It is also possible that the representation of the distribution of the biomass of biological agents is simply one of the distribution indicators, in which case no construction step may be necessary, except for example if it is desired to provide this graphically. representation of the distribution of the biomass of biological agents. Thus, even with a single distribution indicator consisting of values of the biomass parameter, it is possible to construct a curve showing the distribution of the biomass of biological agents along the optical axis.
  • a representation of the temporal evolution of the distribution of the biomass of biological agents can for example be obtained by spatially organizing indicators of distribution according to their respective measurement instants.
  • the image in Figure 5 is an example of such a representation in graphical form.
  • this representation of the distribution of the biomass of biological agents can take another form, such as for example a curve or a table or even a numerical value, as mentioned previously.
  • the representation can be a table or a list chronologically organizing said numerical values of the distribution indicators, or representing it in the form of curves.
  • the representation of the distribution of the biomass of biological agents can also result from calculation relating to values of distribution indicators, such as for example differences between these values.
  • the representation of the distribution of the biomass of biological agents is understood here as allowing its communication to an operator, and its interpretation by the latter.
  • the representation of the distribution of the biomass of biological agents can for example be displayed by a display screen, put in a format allowing its display, or can be transmitted to a printer to be printed.

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Abstract

Un procédé d'analyse d'un échantillon biologique comprenant des agents biologiques et disposé dans un réceptacle d'analyse dans un champ de vue d'un système d'imagerie holographique définissant un plan focal d'acquisition, avec pour chacun d'une pluralité d'instants de mesure : l'acquisition (S02a) d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives du plan focal d'acquisition, et la détermination (S02b) à partir de chaque image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de biomasse représentatif de la quantité d'agents biologiques à la position du plan focal d'acquisition, le procédé comprenant la construction (S03) d'un indicateur de répartition à partir de valeurs du paramètre de biomasse d'un même instant de mesure pour plusieurs positions du plan focal d'acquisition,, et la fourniture, parmi les résultats d'analyse (S05), d'une représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques dérivée d'au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure.

Description

Procédé d'analyse d'un échantillon biologique avec détermination de la répartition spatiale de biomasse le long de l'axe optique
Domaine technique
La présente invention se rapporte au domaine de l'analyse d'échantillons biologiques par imagerie, et plus particulièrement concerne le suivi au cours du temps de la répartition spatiale de biomasse le long de l’axe optique.
Arrière-plan technologique
L'analyse d'échantillons biologiques par imagerie fait appel à un instrument d'analyse optique dans lequel sont introduits les échantillons biologiques à analyser. Un échantillon biologique est constitué par une suspension d’agents biologiques. Les agents biologiques sont par exemple des micro-organismes (bactéries, levures, moisissures, etc.). L’analyse d’un échantillon biologique est une analyse in vitro portant sur l'échantillon biologique. L'analyse d’un agent biologique dans l’échantillon biologique peut comprendre l’identification dudit agent biologique ou la détermination d’une caractéristique de cet agent biologique, comme par exemple la concentration minimale inhibitrice d'un antibiotique qui serait efficace à l'encontre dudit agent biologique ou encore la capacité à former un biofïlm.
L’échantillon biologique, appelé inoculum dans son état initial est disposé dans un réceptacle, ou puits, au moins partiellement transparent à travers lequel l'instrument d'analyse peut procéder à des mesures de propriétés optiques de l’échantillon biologique. Le puits contient un milieu nutritif et également un ou plusieurs réactifs, tels qu’un substrat enzymatique ou des antibiotiques, destinés à interagir avec des agents biologiques présents dans l’échantillon biologique. Généralement, une pluralité de puits sont prévus pour recevoir chacun de l’inoculum, chacun des puits étant muni de réactifs différents ou d'un même réactif à des concentrations différentes. En fonction de la nature des agents biologiques présents dans l’inoculum, ceux-ci réagissent avec certains réactifs, et pas avec d'autres réactifs, ou à certaines concentrations et pas à d'autres. Par exemple, dans le cadre d'un antibiogramme pour tester les sensibilités aux antibiotiques, les réactifs sont constitués de différents antibiotiques à différentes concentrations, et les agents biologiques vont se multiplier dans les puits contenant les antibiotiques auxquels ils ne sont pas sensibles ou dans lesquels la concentration en antibiotiques est insuffisante, ou verront au contraire leur développement plus ou moins entravés dans les puits contenant les antibiotiques auxquels ils sont sensibles à des concentrations suffisantes. Ces différences d'interactions entre les agents biologiques et les réactifs se traduisent donc par des évolutions différentes de la biomasse dans les puits. La biomasse, c'est-à-dire la quantité de matière biologique présente dans chaque puits, influe directement les propriétés optiques de l'échantillon biologique présent dans chaque puits, puisque les agents biologiques présentent eux-mêmes des propriétés optiques différentes de la solution dans laquelle ils sont en suspension.
En particulier, la transmittance de l’échantillon biologique est affectée par l’évolution de la concentration en agents biologiques. Pour cette raison, il avait été développé des procédés d'analyse d'échantillons biologiques basé sur la détermination de l'évolution au cours du temps, lors d'une phase d'incubation, de la transmittance globale (ou absorbance, ce qui est équivalent) d'un puits rempli de l'échantillon biologique, afin d'en déterminer une mesure de turbidité, exprimée typiquement en McFarland (McF). Cette mesure de turbidité est directement représentative de la biomasse en agents biologiques dans l'échantillon biologique. Pour ce faire, une diode émettrice éclaire l’échantillon avec un faisceau lumineux d’intensité connue, et une photodiode ponctuelle disposée à l'opposé de la diode émettrice par rapport à l'échantillon permet de déterminer l’intensité lumineuse reçue après que le faisceau lumineux ait traversé l’échantillon biologique. Toutefois, une telle mesure en transmittance présente une sensibilité assez faible, de sorte qu'il n'est pas possible de mesurer une turbidité inférieure à 0,05 McF, voire inférieure à 0,1 McF. De plus, la biomasse ne permet pas toujours de déterminer la concentration d'agents biologiques : en cas d'augmentation du volume des agents biologiques, par exemple par élongation pour des bactéries, la biomasse augmente pour un même nombre d'agents biologiques.
En outre, il s'agit d'une mesure globale, qui ne tient pas compte de la répartition spatiale des agents biologiques à l'intérieur du réceptacle d'analyse, et en particulier le long de l'axe optique (couramment désigné par la coordonnée z). Or, cette répartition peut être fortement hétérogène. Par exemple, certains agents biologiques se développent préférentiellement dans certaines zones du réceptacle, et la mise en évidence de cette hétérogénéité peut alors aider à identifier les agents biologiques et/ou à déterminer certaines de leurs propriétés lors de l'analyse de l'échantillon biologique. De plus, il est courant que les réactifs soient disposés sur une paroi du réceptacle d’analyse. Fa répartition spatiale de la croissance de la biomasse d’agents biologiques est alors affectée au moins transitoirement par l’hétérogénéité spatiale des réactifs, mais une mesure globale ne permet pas d'en rendre compte. Surtout, hétérogénéité peut indiquer qu'un agent biologique est susceptible de former un biofilm, auquel cas des mesures particulières peuvent être prises, par exemple en adaptant un traitement médical à la présence d'un biofilm.
Présentation de l'invention
L'invention vise donc à permettre, lors de l'analyse d'un échantillon biologique, de disposer pour celle-ci de l’évolution au cours du temps de la répartition spatiale de biomasse d’agents biologiques le long d’un axe optique, par exemple afin de mettre en évidence des caractéristiques des agents biologiques comme la capacité de former un biofilm.
A cet effet, l’invention propose un procédé d’analyse d’un échantillon biologique au moyen d’un instrument d’analyse, l’échantillon biologique comprenant des agents biologiques et étant disposé dans un réceptacle d’analyse dans un champ de vue d’un système d’imagerie holographique, ledit système d’imagerie holographique définissant un axe optique et un plan focal d’acquisition, le procédé comprenant, pour chaque instant de mesure d’une pluralité d’instants de mesure d’une durée de mesure :
- l’acquisition d’une pluralité d’images holographiques de l’échantillon biologique à différentes positions respectives sur l’axe optique du plan focal d’acquisition,
- la détermination à partir de chaque image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de biomasse représentatif de la quantité d’agents biologiques à la position du plan focal d’acquisition de ladite image holographique, le procédé comprenant la construction d'un indicateur de répartition à partir de valeurs du paramètre de biomasse d’un instant de mesure pour plusieurs positions du plan focal d'acquisition, ledit indicateur de répartition étant représentatif de la répartition spatiale de la quantité d’agents biologiques dans le réceptacle d’analyse le long de l’axe optique audit instant de mesure, et la fourniture, parmi les résultats d'analyse, d'une représentation de la répartition de la biomasse d’agents biologiques dérivée d’au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure.
L'invention est avantageusement complétée par les différentes caractéristiques suivantes prises seules ou selon leurs différentes combinaisons possibles :
- l'indicateur de répartition est obtenu en organisant spatialement des valeurs du paramètres de biomasse en fonction des positions respectives du plan focal d’acquisition ou l’indicateur de répartition est obtenu par un calcul portant sur des valeurs de paramètres de biomasse à différentes positions du plan focal d’acquisition ;
- la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques est une représentation de l’évolution temporelle de la répartition de la biomasse d’agents biologiques qui est dérivée de plusieurs indicateurs de répartition à une pluralité d'instants de mesure ;
- le procédé comprend la construction de la représentation de l’évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques en organisant spatialement des indicateurs de répartition en fonction de leurs instants de mesure respectifs ;
- le paramètre de biomasse d'une image holographique est dérivé d'une statistique portant sur les niveaux de gris des pixels de ladite image holographique ;
- le paramètre de biomasse est une moyenne des valeurs absolues des niveaux de gris de chaque pixel de l'image holographique ;
- la détermination du paramètre de biomasse d’une image holographique comprend une normalisation préalable de l’image holographique, comprenant :
- la détermination d’une image de fond par application d’un filtre de lissage sur l’image holographique acquise,
- la division pixel à pixel des niveaux de gris de l'image holographique acquise par les niveaux de gris de l'image de fond ;
- les différentes positions respectives sur l'axe optique des plans focaux d'acquisition sont au moins au nombre de 10 dans le réceptacle d’analyse, et de préférence au moins 20 ;
- le réceptacle d'analyse comprend deux faces transparentes opposées situées à différentes positions sur l'axe optique, et les différentes positions respectives sur l'axe optique des plans focaux d’acquisition s'étendent d'une face transparente à l'autre face transparente ;
- au moins une position d’un plan focal d’acquisition sur l’axe optique n’est pas située entre les deux faces transparentes, et/ou une position d’un plan focal d’acquisition sur l’axe optique correspond à la position d’une face transparente ;
- le système d’imagerie holographique définit une profondeur de champ d’au moins 100 iim de profondeur dans la direction de l’axe optique autour de chaque plan focal d’acquisition ;
- l'image holographique est un hologramme ou une image reconstruite à partir d'un hologramme.
L'invention concerne également un instrument d'analyse comprenant un système holographique avec un champ de vue configuré pour acquérir une image holographique et des moyens de traitement de données, l'instrument d'analyse étant configuré pour recevoir un échantillon biologique dans un réceptacle d’analyse dans le champ de vue du système holographique et pour mettre en œuvre les étapes du procédé selon l’invention. Présentation des figures
D'autres caractéristiques, buts et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit, qui est purement illustrative et non limitative, et qui doit être lue en regard des dessins annexés sur lesquels :
- la figure 1 montre un exemple de carte d’analyse comportant une pluralité de réceptacles sous forme de puits pouvant être utilisée pour la mise en place d'un échantillon biologique à analyser, selon un mode de réalisation possible de l'invention ;
- la figure 2 montre schématiquement un exemple de système d’imagerie holographique pouvant être utilisé dans un instrument d'analyse selon un mode de réalisation possible de l’invention ;
- la figure 3 est un diagramme illustrant des étapes du procédé d'analyse selon un mode de réalisation possible de l'invention ;
- la figure 4 est une vue schématique d'une coupe d'un réceptacle d'analyse selon un plan contenant l’axe optique ;
- la figure 5 est un exemple d'une représentation graphique de l'évolution au cours du temps de la répartition spatiale de biomasse d'agents biologiques le long d'un axe optique.
Description détaillée
Le procédé d’analyse d’un échantillon biologique est mené au moyen d’un instrument d’analyse comprenant un système d’imagerie holographique avec un champ de vue, l’instrument d’analyse étant configuré pour recevoir un échantillon biologique dans un réceptacle d’analyse dans le champ de vue du système d'imagerie holographique.
La figure 1 montre un exemple de carte d’analyse 1 comportant une pluralité de réceptacles d'analyse 2 sous forme de puits pouvant être utilisée pour la mise en place d'un échantillon biologique à analyser. Les réceptacles d'analyse 2 sont ici organisés selon un réseau bidimensionnel sur un plan, chaque réceptacle 2 étant associé à des conditions d’analyse différentes, typiquement au moyen de réactifs différents présents dans les réceptacles d'analyse 2. Par exemple, dans le cadre d’un antibiogramme pour tester les sensibilités aux antibiotiques, les réactifs sont constitués de différents antibiotiques à différentes concentrations. L’utilisation d'une carte d'analyse 1 n'est pas requise, mais une telle carte d'analyse 1 permet de procéder pendant une même durée d'analyse à une pluralité de test de façon standardisée.
Chaque réceptacle d’analyse 2 est au moins partiellement transparent à au moins une longueur d'onde de lumière, visible ou non, et de préférence est au moins partiellement transparent pour le spectre visible. Cette transparence permet l’analyse de l’échantillon biologique qui y est contenu par des moyens optiques tels que le système d'imagerie holographique. De préférence, et comme visible sur la figure 4, un réceptacle d’analyse 2 présente au moins deux faces transparentes 2a, 2b opposées, de sorte à présenter un axe transparent pour la propagation de la lumière. Ces deux faces transparentes opposées 2a, 2b sont par exemple distantes de moins de 10 mm, et de préférence de moins de 5 mm. Typiquement, les faces transparentes opposées 2a, 2b sont distantes, le long de l'axe optique 16, de plus de 0,1 mm, et de préférence de plus de 0,5 mm, et de préférence encore de plus de 1 mm. Typiquement, les faces transparentes opposées 2a, 2b sont des films transparents définissant le réceptacle d'analyse 2. Il est courant que les réactifs soient fixés sur au moins une des faces transparentes. Les réactifs peuvent ainsi être introduits dans le réceptacle d'analyse 2 en les disposant sur le film destiné à former une face transparente 2a, 2b, avant que celui-ci soit appliqué sur la carte d'analyse 1.
Afin de permettre le remplissage des réceptacles d’analyse 2, une telle carte d’analyse 1 peut par exemple comporter un conduit 5 destiné à être plongé dans un volume 3 d'inoculum 3 préparé dans un tube 4. L'inoculum est préparé par un opérateur qui introduit des agents biologiques, par exemple prélevés d'une culture dans une boîte de Petri au moyen d'une tige ou d'un écouvillon, en suspension dans une solution saline, avec une dilution correspondant à une plage déterminée de turbidité, par exemple entre 0,5 et 0,63 McF pour des bactéries en tant qu' agents biologiques ou encore entre 1,8 et 2,2 McF pour des levures en tant qu' agents biologiques, la plage dépendant du type d'analyse effectuée et de l'instrument de mesure. Cette suspension préalable est ensuite diluée encore, par exemple avec un facteur 20, voire 100, pour analyser des bactéries Gram- ou avec un facteur 10, voire 100, pour analyser des bactéries Gram+. Cette dilution ultérieure peut notamment être automatisée, et donc être effectuée par l’instrument de mesure après la mise en place du tube 4 dans l’instrument d’analyse. Bien entendu d'autres plages déterminées de turbidité peuvent être utilisées, en fonction des protocoles utilisés. La dilution désirée peut être obtenue en une fois, ou comme dans l'exemple ci-dessus, en plusieurs fois.
Une extrémité du conduit 5 est alors plongée dans le volume 3 d'inoculum résultant de la préparation dans le tube 4, et l’ensemble est introduit dans l’instrument d’analyse. Bien entendu, tout ou partie de ces étapes de préparation peuvent être automatisées. L'inoculum voyage à travers le conduit 5, puis par un circuit de circulation fluidique ménagé dans la carte d'analyse 1, se répartit entre les réceptacles d'analyse 5. Ce déplacement de l'inoculum dans le conduit 5 et la carte d'analyse 1 peut être causé par capillarité et/ou par une dépressurisation de l’air présent à l’extrémité ouverte du tube 4. Par exemple avec la dépressurisation, l’air présent dans la carte d'analyse 1 , qui est à pression atmosphérique, sort de la carte d'analyse 1 par le tube 5 à travers l'inoculum 3 et laisse sa place à l'inoculum 3 qui remonte ainsi par le tube 5 dans la carte d’analyse 1. A l’inverse, il est possible de procéder à une application d’une pression d'air s'exerçant sur l'inoculum par l'intermédiaire de l'extrémité ouverte du tube 4 pour provoquer la remontée du tube 5 par l’inoculum 3. L’échantillon biologique constitué par l'inoculum est alors en place dans un réceptacle d'analyse 2.
L'instrument d'analyse comprend un système d'imagerie holographique avec un champ de vue configuré pour acquérir une image holographique de ce champ de vue. L’acquisition d'une image holographique permet une profondeur de champ importante, et donc une très bonne sensibilité de détection des agents biologiques. Lors de l’acquisition d’une image holographique, le système d'imagerie holographique est placé face à un réceptacle d'analyse 2. A titre d'exemple non limitatif, la figure 2 représente schématiquement un système d'imagerie holographique 10 en ligne disposé de sorte que le champ de vue 11 dudit système d’imagerie holographique 10 se trouve contenu dans le volume d’échantillon biologique contenu dans un réceptacle d’analyse 2. La carte d’analyse 1 , et donc les réceptacles d’analyse 2 qu’elle comprend, est placée dans un plan objet du système d’imagerie holographique 10. Le système d’imagerie holographique 10 définit un axe d'imagerie 16, simplifié ici par une droite correspondant à l'axe optique mais qui peut consister en un ensemble de droites successives définissant le trajet lumineux, en fonction de la configuration des composants optiques du système d’imagerie holographique 10.
D’un côté du réceptacle d’analyse 2, ici sur l’axe optique 16, se trouve une source lumineuse 4 configurée pour illuminer le réceptacle d’analyse 2 dans le champ de vue (ou « fïeld-of-view ») du système d’imagerie holographique 10 au moyen d’un faisceau d'illumination de lumière suffisamment cohérente. La source lumineuse 14 peut produire la lumière d'illumination, ou être simplement la terminaison d'une fibre optique acheminant cette lumière d'illumination, éventuellement pourvue d'un diaphragme ou iris. Le faisceau d'illumination présente les caractéristiques conventionnelles pour l'imagerie holographique, sans contraintes additionnelle particulière. Le faisceau d'illumination peut ainsi être monochromatique (par exemple avec une longueur d’onde autour de 640-670 nm) ou possiblement être composé de plusieurs longueurs d’onde, par exemple utilisées l’une après l'autre.
De l’autre côté du réceptacle d’analyse 2, ici sur l’axe optique 16, se trouve un capteur d’image 12, qui est un capteur numérique comme par exemple un capteur CMOS ou CCD. Le capteur d’image 12 est placé sur un plan image du système d’imagerie holographique 10, et est configuré pour acquérir un hologramme, c'est-à-dire une distribution spatiale d'intensité des interférences causées par des interactions entre l'inoculum placé dans le champ de vue 11 le faisceau d'illumination.
Le système d’imagerie holographique 10 est ici muni d’un ensemble d’organes optiques 18 disposés entre le réceptacle d'analyse 2 et le capteur d’image numérique 12 comme par exemple un objectif de microscope 18a et une lentille de tube 18b dans l’exemple illustré. Un organe optique tel que l'objectif de microscope 18a est cependant optionnel, l'invention n'étant pas limitée à la microscopie holographique avec lentille. L'arrangement décrit ici est bien entendu un exemple non limitatif. Tout système d'imagerie holographique 10 peut être utilisé, avec différents organes optiques (avec ou sans objectif de microscope, etc.). Ainsi, dès lors qu’un système d’imagerie holographique 10 peut acquérir une image dans laquelle apparaissent les motifs d’interférence générées par l'échantillon biologique, ce système d'imagerie holographique convient à la mise en œuvre du procédé. De préférence toutefois, le système d’imagerie holographique 10 est configuré pour définir une profondeur de champ d’au moins 100 um de profondeur dans la direction de l’axe optique 16 autour de chaque plan focal d’acquisition 20, et de préférence au moins 150 um, et de préférence encore au moins 250 um. Typiquement, le réceptacle d’analyse 2 comprend deux faces transparentes 2a, 2b opposées organisées le long de l’axe optique 16, et la profondeur de champ s'étend sur au moins 100 um entre les deux faces transparentes opposées du réceptacle d'analyse, et de préférence sur au moins 150 um, et de préférence encore sur au moins 250 um, voire au moins 300 um. Le champ de vue 11 s'entend comme étant l'espace dans lequel la présence d'agents biologiques peut être déterminée à partir d’un hologramme imageant ledit champ de vue 11.
L’instrument de mesure comprend également des composants permettant de traiter des données, tel qu'un processeur, une mémoire, des bus de communication, etc. Dans la mesure où ces autres composants ne sont spécifiques que par le procédé qu'ils mettent en œuvre et par les instructions qu'ils contiennent, ils ne seront pas détaillés dans la suite.
La figure 3 est un diagramme illustrant des étapes du procédé d'analyse, qui font suite à une mise en place (étape SI) préalable de l’échantillon biologique dans un réceptacle d’analyse 2 dans le champ de vue 11 d'un système d'imagerie holographique 10, détaillée plus haut. Le procédé comprend une pluralité de cycles (étapes S02) constitués d'étapes mises en œuvre de manière répétée pour une pluralité d'instants de mesure d'une durée de mesure :
- l'acquisition d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives sur l'axe optique 16 du plan focal d'acquisition, - la détermination à partir de chaque image holographique acquise, d'une valeur d'un paramètre de biomasse représentatif de la quantité d’agents biologiques à ladite position du plan focal d’acquisition.
Ces cycles sont typiquement répétés selon une période allant de une minute à 30 minutes, en fonction de la rapidité de l'instrument d'analyse, du nombre d'échantillons biologiques traités en parallèle, et par exemple en fonction du nombre de réceptacles d'analyse 2 dans une carte d’analyse 1. La durée de mesure s'étend sur plusieurs heures, et typiquement plus de 10 heures, résultants en plusieurs dizaines voire plusieurs centaines d'instants de mesure.
Bien entendu, l'acquisition d'une pluralité d'images holographiques de l'échantillon biologique à différentes positions respectives sur l'axe optique 16 du plan focal d'acquisition implique un déplacement du plan focal d'acquisition (étape S02c) préalablement à chaque acquisition d'une image holographique par le capteur d'image 12 (étape S02a). Ces différentes positions du plan focal d'acquisition peuvent être obtenues par exemple en déplaçant l'ensemble formé par le capteur d’image 12 et les organes optiques 18a, 18b, par exemple via un rail motorisé ou une platine motorisée. Il est également possible d'obtenir ces différentes positions du plan focal d'acquisition 20 par la modification d'un organe optique du système d'imagerie holographique 10 déplaçant le plan focal d’acquisition, en modifiant une focalisation de rayons lumineux incident au capteur d’image 12 de manière à déplacer le plan focal d’acquisition du capteur d'image 12.
Les différentes positions respectives sur l'axe optique 16 des plans focaux d'acquisition sont au moins au nombre de 2 dans le réceptacle d'analyse, de préférence au moins 5, et de préférence encore au moins 15, bien que seulement six d'entre elles soient illustrées sur la figure 4, à des fins de simplification. Un plus grand nombre de plans d’acquisition permet d’affiner l'analyse de l'hétérogénéité de la répartition spatiale des agents biologiques le long de l'axe optique 16. Il est à noter que les plans focaux d'acquisition s'étendent de préférence de façon sensiblement perpendiculaire à l'axe optique 16, de sorte que les différentes positions respectives sur l'axe optique 16 correspondent à autant de profondeurs différentes dans le réceptacle d’analyse 2.
Comme précédemment mentionné, le réceptacle d’analyse 2 comprend typiquement deux faces transparentes 2a, 2b opposées situées à différentes positions sur l'axe optique 16, et différentes positions respectives 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f sur l'axe optique 16 des plans focaux d’acquisition 20 s'étendent d'une face transparente 2a, 2b à l'autre face transparente 2a, 2b. De préférence, différentes positions respectives 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f sont régulièrement espacées le long de l’axe optique 16 entre les deux faces transparentes 2a, 2b opposées. De préférence, les différentes positions respectives 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f du plan focal d'acquisition sont espacées de sorte à ce que chaque image acquise fasse apparaître des agents biologiques différents. Typiquement, les différentes positions respectives 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f du plan focal d'acquisition sur l'axe optique 16 s'étendent sur une profondeur, le long de l'axe optique 16, supérieure à 0,1 mm, et de préférence supérieure ou égale à 0,5 mm, et de préférence supérieure ou égale à 0,8 mm. De préférence, des positions 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f consécutives du plan focal d'acquisition sur l'axe optique 16 sont espacées d'au moins 50 iim, de préférence d'au moins 100 iim, et de préférence encore d'au moins 150 iim.
Les zones à proximité des deux faces transparentes 2a, 2b constituent des zones privilégiées d'analyse de la répartition spatiale des agents biologiques. Outre le fait que les réactifs peuvent être présents sur au moins une de ces faces transparentes 2a, 2b, ces faces constituent également des supports mécaniques sur lesquels les agents biologiques peuvent développer un biofilm, caractéristique particulièrement intéressante à détecter. Afin de s'assurer qu'une zone à proximité immédiate d'une des deux faces transparentes 2a, 2b soit correctement imagée, il est possible de prévoir qu’au moins une position d’un plan focal d’acquisition sur l’axe optique 16 ne soit pas située entre les deux faces transparentes 2a, 2b, et plus précisément qu’au moins deux positions de plans focaux d’acquisition sur l’axe optique 16 soient de part et d’autre d'une face transparente 2a, 2b. Idéalement, une position d'un plan focal d'acquisition sur l'axe optique 16 correspond à la position d'une face transparente 2a, 2b.
Lors de l’acquisition d’une image holographique, l’imageur holographique 10 acquiert un hologramme, ce qui présente l'avantage d'offrir une grande profondeur de champ, et donc une grande sensibilité de détection des agents biologiques dans l’échantillon biologique. Lors de l’acquisition d’une image holographique, le système d’imagerie holographique acquiert un hologramme. Lors de l'acquisition d'un hologramme, la source lumineuse 14 émet un faisceau d'illumination de référence, qui peut être traduite par une onde plane de référence se propageant dans la direction Z le long de l’axe d’imagerie 16. Les agents biologiques présents dans le champ de vue 11 à l’intérieur du réceptacle d’analyse 2, par leurs propriétés de diffraction, diffusent la lumière de référence incidente. L’onde diffusée par les agents biologiques et fonde de référence interfèrent sur le capteur d'image 12 pour former l'hologramme. Puisqu'un capteur d'image 12 numérique n'est sensible qu'à l'intensité du champ électromagnétique, l'hologramme correspond à la distribution spatiale d'intensité du champ total correspondant à l'addition de fonde diffusée et de fonde de référence, qui est traduite par une valeur de niveau de gris pour chaque pixel. L'image holographique exploitée peut être l'hologramme ou peut être une image reconstruite par calcul de rétropropagation à partir de l'hologramme, en utilisant un algorithme de propagation par exemple basé sur la théorie de la diffraction de Rayleigh Sommerfeld. Utiliser l'hologramme sans reconstruction permet de bénéficier d'une grande sensibilité de détection, car chaque agent biologique apparaît dans l'hologramme entouré d'anneaux correspondant aux figures d’interférences causées par la présence desdits agents biologiques, facilitant d’autant la détection de la présence de ces agents biologiques. En outre, la non-reconstruction permet un gain de temps et de ressource de calcul. Toutefois, utiliser une image reconstruite présente d'autres avantages, comme celui de permettre de localiser précisément, possiblement en trois dimensions, les agents biologiques apparaissant dans l’image reconstruite. De même que l’hologramme, une telle image reconstruite peut être définie par des niveaux de gris pour chaque pixel.
De préférence, le paramètre de biomasse d’une image holographique est dérivé d’une statistique portant sur les niveaux de gris des pixels de ladite image holographique, et de préférence encore, le paramètre de biomasse est une moyenne des valeurs absolues des niveaux de gris de chaque pixel de l’image holographique. D’autres paramètres de biomasse peuvent cependant être utilisés, comme par exemple un comptage des agents biologiques apparaissant dans l'image holographique, ou bien encore la proportion de l'image holographique dans laquelle apparaissent ou non des agents biologiques.
De préférence, la détermination du paramètre de biomasse d'une image holographique comprend une normalisation préalable de l'image holographique, comprenant :
- la détermination d'une image de fond par application d'un filtre de lissage, de préférence un filtre gaussien, sur l’image holographique acquise,
- la division pixel à pixel des niveaux de gris de l’image holographique acquise par les niveaux de gris de l’image de fond.
Les paramètre du filtre de lissage, par exemple l’écart-type pour un filtre gaussien, sont choisies pour créer un filtre passe-bas avec une fréquence de coupure suffisamment basse pour que l'image filtrée ne soit représentative que de l'arrière-plan de l'image holographique, d'où la dénomination image de fond, sans par exemple que ne soient discernables les agents biologiques dans cette image filtrée. La normalisation de l'image peut en outre comprendre une soustraction d’une constante opérée sur les niveaux de gris de l’image holographique résultant de la division. On peut alors obtenir une image holographique normalisée avec des valeurs de niveaux de gris négatifs. Ce sont donc alors les valeurs absolues des niveaux de gris qui sont prises en compte pour déterminer les valeurs du paramètre de biomasse.
A la suite d’un cycle de mesure, qui permet d’obtenir une pluralité de valeurs du paramètre de biomasse à un même instant de mesure pour différentes positions du plan focal d'acquisition, un indicateur de répartition est construit (étape S03) à partir de valeurs du paramètre de biomasse d'un même instant de mesure pour plusieurs positions du plan focal d’acquisition. L’indicateur de répartition est représentatif de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique à cet instant de mesure. Par exemple, l'indicateur de répartition peut être étant obtenu en organisant spatialement les paramètres de biomasse en fonction des positions respectives de leurs plans focaux d'acquisition. Typiquement, l'indicateur de répartition prend la forme d’une concaténation des valeurs du paramètre de biomasse, et de préférence prend la forme d’une concaténation spatiale, dans laquelle les valeurs du paramètre de biomasse sont spatialement concaténées. L’indicateur de répartition peut donc être interprété comme un vecteur dont les composantes rendent compte de la quantité d'agents biologiques à différentes positions. Typiquement, les différentes valeurs du paramètre de biomasse sont organisées selon la même organisation spatiale que les positions respectives des plans focaux d'acquisition des images holographiques dont ils proviennent. Il est également possible que l'indicateur de répartition corresponde à une seule valeur, qui rend compte de l'homogénéité ou de l'hétérogénéité de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique à un instant de mesure. L’indicateur de répartition peut ainsi être obtenu par un calcul portant sur des valeurs de paramètres de biomasse à différents plans focaux d'acquisition, et en particulier par des différences entre ces valeurs. Par exemple, un indicateur de répartition peut correspondre à une différence entre au moins une valeur du paramètre de biomasse avec un plan focal d'acquisition proche du milieu du puits (sur l'axe optique), et au moins une valeur du paramètre de biomasse avec un plan focal d’acquisition proche d’une face transparente 2a, 2b. D’autres calculs sont possibles, comme par exemple un écart-type, une variance, ou autre.
Ainsi, en reprenant l’exemple de la figure 4, une première image holographique est acquise avec un plan focal d'acquisition 20 à une première position 20a, puis une deuxième image holographique est acquise avec un plan focal d'acquisition 20 à une deuxième position 20b, puis une troisième image holographique est acquise avec un plan focal d'acquisition 20 à une troisième position 20c, etc., jusqu'à ce qu'une image holographique ait été acquise pour chaque position 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f du plan focal d'acquisition 20 le long de l'axe optique. Une valeur du paramètre de biomasse est déterminée pour chaque image holographique, et donc est associée à chaque position 20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f : une première valeur pour la première position 20a, une deuxième valeur pour la deuxième position 20b, une troisième valeur pour la troisième position 20c, etc. Pour construire l’indicateur de répartition, la première valeur est donc placée adjacente à la deuxième valeur, elle-même placée adjacente à la troisième valeur, elle-même placée adjacente à la quatrième valeur etc. La deuxième valeur se trouve donc entre la première valeur et la troisième valeur, tout comme la deuxième position 20b est entre la première position 20a et la troisième position 20c. L'organisation spatiale des positions respectives des plans focaux d’acquisition est donc reprise.
Chaque cycle de mesure permet donc d'obtenir un indicateur de répartition représentatif de la répartition spatiale de la quantité d’agents biologiques le long de l’axe optique 16 à l’instant de mesure dans lequel s'inscrit le cycle. Les cycles de mesure sont typiquement répétés selon une période allant d'une minute à 30 minutes, en fonction de la rapidité de l'instrument d'analyse, du nombre d'échantillon biologiques traités en parallèle, et par exemple en fonction du nombre de réceptacles d'analyse 2 dans une carte d'analyse 1 , mais également en fonction de la vitesse des interactions entre les agents biologiques et les réactifs. La durée d’analyse s'étend typiquement sur plusieurs heures, et le procédé comprend ainsi typiquement plus de 10 cycles, et de préférence plus de 20 cycles de mesure au cours de cette durée de mesure.
A la suite de ces cycles de mesure, correspondant à une pluralité d'instants de mesure, on dispose donc une pluralité d’indicateurs de répartition représentatifs de la répartition spatiale de la quantité d'agents biologiques le long de l'axe optique 16 à une pluralité d'instants de mesure. Le procédé comprend ensuite de préférence la construction (S04) d'une représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques, qui est dérivée d'au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure. De préférence, la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques est une représentation de l'évolution temporelle de la répartition de la biomasse d'agents biologiques qui est dérivée de plusieurs indicateurs de répartition à une pluralité d’instants de mesure. Cette représentation de la répartition de la biomasse d’agents biologiques peut être construite en organisant spatialement des indicateurs de répartition en fonction de leurs instants de mesure respectifs. En effet, chaque indicateur de répartition correspond à un instant de mesure particulier. La combinaison des indicateurs de répartition permet donc de suivre l’évolution temporelle de la répartition spatiale de la biomasse d’agents biologiques le long de l'axe optique 16. De préférence, il s'agit d'une concaténation d'indicateurs de répartition, organisés chronologiquement.
La figure 5 montre un exemple de représentation de cette évolution temporelle. L'échantillon biologique imagé est une suspension dans une solution saline de Pseudomonas aeruginosa en tant qu'agents biologiques. A chaque instant de mesure, 27 images holographiques ont été acquises à 27 positions de plans focaux d'acquisition le long de l'axe optique, correspond à 27 profondeurs différentes. Les instants de mesure sont espacés de 15 minutes. Ainsi, sur la figure 5, l'axe des ordonnées est celui des positions en Z le long de l'axe optique, correspondant à la profondeur, et l'axe des abscisses est celui du temps, en minutes. Le bas de la figure correspond donc à une face transparente 2a, 2b du réceptacle d'analyse 2, et le haut de la figure correspond à l'autre face transparente 2a, 2b, tandis que la gauche de la figure correspond au début de la durée de mesure et la droite de la figure correspond à la fin de la durée de mesure.
Cette figure correspond à une représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques sous forme graphique, dérivée des indicateurs de répartition à plusieurs instants de mesure, qui a été obtenue en traduisant les valeurs du paramètre de biomasse par différentes nuances de gris. On constate une augmentation de la biomasse de bactéries avec le temps (de gauche à droite), mais également que la répartition en profondeur de la biomasse n'est pas uniforme, et évolue avec le temps : la croissance des bactéries intervient d'abord dans une zone 21 proche d’une face, puis se diffuse dans le centre 22 du réceptacle d’analyse 2. De fait, les bactéries Pseudomonas aeruginosa se développent sous forme d’agrégats structurés appelés biofïlms, qui s'étendent d'abord sur les surfaces du réceptacle d'analyse 2. Ainsi, la répartition spatiale des agents biologiques dans le réceptacle d’analyse est une information importante, pouvant par exemple constituer un indicateur supplémentaire pour identifier les agents biologiques de l'échantillon, ou pour évaluer les interactions avec des réactifs disposés sur une face du réceptacle d'analyse 2, ou bien encore pour révéler la capacité de l'agent biologique à former un biofïlm.
Par conséquent, le procédé comprend la fourniture, parmi les résultats d’analyse (étape S05), de la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques dérivée d'au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure, par exemple pour informer sur la répartition spatiale des agents biologiques à un instant de mesure. Cette représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques peut par exemple être fournie sous forme graphique, comme une image ou une courbe ou un tableau. Elle peut être fournie sous la forme de valeurs numériques, par exemple correspondant à un ou plusieurs indicateurs de répartition. Il est d'ailleurs possible que la représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques soit simplement un des indicateurs de répartition, auquel cas aucune étape de construction peut n’être nécessaire, sauf par exemple s’il est souhaité fournir graphiquement cette représentation de la répartition de la biomasse d’agents biologiques. Ainsi, même avec un seul indicateur de répartition constitué de valeurs du paramètre de biomasse, il est possible de construire une courbe montrant la répartition de la biomasse d'agents biologiques le long de l'axe optique.
Une représentation de l’évolution temporelle de la répartition de la biomasse d’agents biologiques peut par exemple être obtenue en organisant spatialement des indicateurs de répartition en fonction de leurs instants de mesure respectifs. L'image de la figure 5 est un exemple d’une telle représentation sous forme graphique. Toutefois, cette représentation de la répartition de la biomasse d'agents biologiques peut prendre d'autre forme, comme par exemple une courbe ou un tableau ou même une valeur numérique, comme évoqué précédemment. A titre d’exemple, lorsque les indicateurs de répartition sont des valeurs numériques, la représentation peut être un tableau ou une liste organisant chronologiquement lesdites valeurs numériques des indicateurs de répartitions, ou le représentant sous forme de courbes. La représentation de la répartition de la biomasse d’agents biologiques peut également résulter de calcul portant sur des valeurs d’indicateurs de répartition, comme par exemple des différences entre ces valeurs.
La représentation de la répartition de la biomasse d’agents biologiques est ici entendue comme permettant sa communication à un opérateur, et son interprétation par celui-ci. La représentation de la répartition de la biomasse d’agents biologiques peut par exemple être affichée par un écran d'affichage, mise sous un format permettant son affichage, ou peut être transmise à une imprimante pour être imprimée.
L'invention n'est pas limitée au mode de réalisation décrit et représenté aux figures annexées. Des modifications restent possibles, notamment du point de vue de la constitution des divers caractéristiques techniques ou par substitution d’équivalents techniques, sans sortir pour autant du domaine de protection de l'invention.

Claims

Revendications
1. Procédé d'analyse d'un échantillon biologique au moyen d'un instrument d'analyse, l’échantillon biologique comprenant des agents biologiques et étant disposé dans un réceptacle d’analyse (2) dans un champ de vue (11) d’un système d’imagerie holographique (10), ledit système d’imagerie holographique (10) définissant un axe optique (16) et un plan focal d’acquisition (20), le procédé comprenant, pour chaque instant de mesure d’une pluralité d’instants de mesure d’une durée de mesure :
- l’acquisition (S02a) d’une pluralité d’images holographiques de l’échantillon biologique à différentes positions respectives (20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f) sur l’axe optique (16) du plan focal d’acquisition (20),
- la détermination (S02b) à partir de chaque image holographique acquise, d’une valeur d’un paramètre de biomasse représentatif de la quantité d’agents biologiques à la position du plan focal d’acquisition de ladite image holographique, le procédé comprenant la construction (S03) d’un indicateur de répartition à partir de valeurs du paramètre de biomasse d’un même instant de mesure pour plusieurs positions du plan focal d'acquisition, ledit indicateur de répartition étant représentatif de la répartition spatiale de la quantité d’agents biologiques dans le réceptacle d’analyse le long de l’axe optique à un instant de mesure, et la fourniture, parmi les résultats d’analyse (S05), d’une représentation de la répartition de la biomasse d’agents biologiques dérivée d’au moins un indicateur de répartition à un instant de mesure.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'indicateur de répartition est obtenu en organisant spatialement des valeurs du paramètres de biomasse en fonction des positions respectives du plan focal d’acquisition ou l’indicateur de répartition est obtenu par un calcul portant sur des valeurs de paramètres de biomasse à différentes positions du plan focal d’acquisition.
3. Procédé d’analyse selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la représentation de la répartition de la biomasse d’agents biologiques est une représentation de l’évolution temporelle de la répartition de la biomasse d’agents biologiques qui est dérivée de plusieurs indicateurs de répartition à une pluralité d’instants de mesure.
4. Procédé d'analyse selon la revendication 3, comprenant la construction (S04) de la représentation de l’évolution temporelle de la répartition de la biomasse d’agents biologiques en organisant spatialement des indicateurs de répartition en fonction de leurs instants de mesure respectifs.
5. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le paramètre de biomasse d'une image holographique est dérivé d'une statistique portant sur les niveaux de gris des pixels de ladite image holographique et/ou le paramètre de biomasse est une moyenne des valeurs absolues des niveaux de gris de chaque pixel de l'image holographique.
6. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la détermination du paramètre de biomasse d’une image holographique comprend une normalisation préalable de l’image holographique, comprenant :
- la détermination d’une image de fond par application d’un filtre de lissage sur l’image holographique acquise,
- la division pixel à pixel des niveaux de gris de l'image holographique acquise par les niveaux de gris de l'image de fond.
7. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les différentes positions respectives sur l'axe optique (16) des plans focaux d'acquisition sont au moins au nombre de 10 dans le réceptacle d’analyse, et de préférence au moins 20.
8. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le réceptacle d'analyse comprend deux faces transparentes (2a, 2b) opposées situées à différentes positions sur l'axe optique (16), et les différentes positions respectives (20a, 20b, 20c, 20d, 20e, 20f) sur l'axe optique (16) des plans focaux d'acquisition (20) s'étendent d'une face transparente à l’autre face transparente.
9. Procédé d'analyse selon la revendication précédente, dans lequel au moins une position d'un plan focal d'acquisition sur l'axe optique (16) n'est pas située entre les deux faces transparentes (2a, 2b), et/ou une position d'un plan focal d'acquisition sur l'axe optique (16) correspond à la position d’une face transparente (2a, 2b). 18
10. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le système d'imagerie holographique définit une profondeur de champ d'au moins 100 iim de profondeur dans la direction de l'axe optique (16) autour de chaque plan focal d'acquisition.
11. Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’image holographique est un hologramme ou une image reconstruite à partir d’un hologramme.
12. Instrument d’analyse comprenant un système holographique (10) avec un champ de vue (11) configuré pour acquérir une image holographique et des moyens de traitement de données, l’instrument d’analyse étant configuré pour recevoir un échantillon biologique dans un réceptacle d'analyse (2) dans le champ de vue (11) du système holographique (10) et pour mettre en œuvre les étapes du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
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