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WO2021133030A1 - 사이토크롬 c 활성이 강화된 l-아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산방법 - Google Patents

사이토크롬 c 활성이 강화된 l-아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산방법 Download PDF

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WO2021133030A1
WO2021133030A1 PCT/KR2020/018896 KR2020018896W WO2021133030A1 WO 2021133030 A1 WO2021133030 A1 WO 2021133030A1 KR 2020018896 W KR2020018896 W KR 2020018896W WO 2021133030 A1 WO2021133030 A1 WO 2021133030A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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amino acid
cytochrome
microorganism
producing
gene
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/018896
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이한형
박상민
배현원
변효정
신용욱
임보람
장재원
정무영
최윤정
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Definitions

  • L-amino acid-producing microorganisms with enhanced cytochrome C activity, and methods for producing L-amino acids using the microorganisms.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium is a gram-positive microorganism that is widely used for the production of L-amino acids.
  • L-amino acids particularly L-lysine, are used in animal feed, human pharmaceuticals, and cosmetics industries, and are mainly produced by fermentation using a Corynebacterium strain.
  • L- amino acids for example, the production capacity of L- lysine is improved and the development of a continuously sustainable strain is required.
  • One example provides an L-amino acid producing microorganism with enhanced cytochrome C (Cytochrome C) activity.
  • the enhancement of the cytochrome C activity may be by introduction of a gene encoding cytochrome C.
  • the gene encoding the cytochrome C may be a foreign gene.
  • Another example provides a method for producing L-amino acids, including the step of culturing the L-amino acid producing microorganism.
  • compositions for enhancing L-amino acid production or L-amino acid production in a microorganism including a cytochrome C coding gene, a recombinant vector including the gene, or both.
  • the effect on lysine production by amplifying a gene for the purpose of increasing the lysine production capacity of the microorganism of the genus Corynebacterium is confirmed, and based on this, a strain improvement technology for amino acid production is proposed.
  • a method for increasing the production capacity of amino acids such as lysine there may be mentioned methods of improving the yield of amino acids such as lysine of the strain, or increasing the production (productivity) of amino acids such as lysine per hour.
  • the productivity of amino acids such as lysine may be affected by various factors such as components of the fermentation medium, osmotic pressure of the fermentation medium, temperature, agitation rate, and oxygen supply rate.
  • One example provides an L-amino acid producing microorganism with enhanced cytochrome C (Cytochrome C) activity.
  • L-amino acid-producing microorganism refers to a case in which a microorganism having L-amino acid-producing ability has increased L-amino acid-producing ability by enhancing cytochrome C activity and/or does not have L-amino acid-producing ability. It can be used to mean a case in which microorganisms have L-amino acid production ability by enhancing cytochrome C activity.
  • microorganism encompasses single-celled bacteria, and may be used interchangeably with “cell”.
  • the L-amino acid may be L-lysine.
  • the cytochrome C activity is A microorganism before the chromium C activity is enhanced can be expressed as a host microorganism.
  • the host microorganism may be selected from all microorganisms having the ability to produce L-amino acids (eg, L-lysine).
  • the host microorganism may be a microorganism having L-lysine-producing ability naturally or a microorganism having L-lysine-producing ability by introducing a mutation into a parent strain having no or significantly less L-lysine-producing ability.
  • the host microorganism is any gram-positive bacteria having L-lysine-producing ability by introducing a mutation into a microorganism having naturally L-lysine-producing ability or a parent strain having no or significantly less L-lysine-producing ability, such as Corynebacter
  • the genus Corynebacterium may be at least one selected from the group consisting of microorganisms and the genus Escherichia microorganisms.
  • the Corynebacterium genus microorganism is Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ), Corynebacterium ammoniagenes ( Corynebacterium ammoniagenes ), Brevibacterium lactofermentum ( Brevibacterium lactofermentum ), Brevibacterium flabum ( Brevibacterium flavum ), Corynebacterium thermoaminogenes ( Corynebacterium thermoaminogenes ), Corynebacterium efficiens ( Corynebacterium efficiens ) and the like may include, but are not necessarily limited thereto.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum.
  • cytochrome C is derived from bacteria and has an average molecular weight of 15 kDa or less, for example, about 8 kDa to about 15 kDa and/or 90 to 150, 100 to 150, 120 to 150, 90 to 125, It is 100 to 125, or 120 to 125 amino acids in length, and refers to cytochrome C of a monomer having membrane-bound properties.
  • the cytochrome C may be derived from a microorganism of the genus Bacillus, and the wavelength range in which the absorption band (absorbance) of the lowest energy level in the reduced state appears is 550 to 555 nm or 550 to 551 nm, selected from cytochrome C There may be more than one type.
  • the cytochrome C is at least one selected from the group consisting of cytochrome c-551 (absorbance about 551 nm), cytochrome c-550 (absorbance about 550 nm), etc., derived from microorganisms of the genus Bacillus, such as one, It may be 2 types, or 3 types (the numerical value listed after cytochrome c means absorbance).
  • the microorganism of the genus Bacillus may be at least one selected from the group consisting of Bacillus pseudofirmus , Bacillus subtilis, and the like.
  • the cytochrome C for example, one or more selected from c-551 and cytochrome c-550 may each independently include an amino acid sequence encoded by cccA or cccB.
  • the cytochrome C is one selected from the group consisting of Bacillus pseudofirmus (eg, Bacillus pseudofirmus OF4, etc.) and/or Bacillus subtilis- derived cytochrome c-551, Bacillus subtilis- derived cytochrome c-550, etc. may be more than
  • the cytochrome C (eg, cytochrome c-551 from Bacillus subtilis ) is a poly containing an amino acid sequence (eg, SEQ ID NO: 16) encoded by cccA (eg, BpOF4_13740 from Bacillus pseudofirmus OF4) It may include a peptide, a polypeptide including an amino acid sequence (eg, SEQ ID NO: 27) encoded by cccB (eg, BpOF4_05495 derived from Bacillus pseudofirmus OF4), or both.
  • cccA eg, BpOF4_13740 from Bacillus pseudofirmus OF4
  • cccB eg, BpOF4_05495 derived from Bacillus pseudofirmus OF4
  • cytochrome C described herein is 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 55% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 27 described as an example, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 82% or more, 85% or more, 87% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or greater, 95% or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater (eg, 60% to 99.5%, 70% to 99.5%, 80% to 99.5%, 85% to 99.5%, 90 % to 99.5%, 91% to 99.5%, 92% to 99.5%, 93% to 99.5%, 94% to 99.5%, 95% to 99.5%, 96% to 99.5%, 97% to 99.5%, 98% to 99.5%, or 99% to 99.5%) can be interpreted as
  • the protein having the sequence homology that can be included in the cytochrome C category described herein is (1) the above-described cytochrome C characteristics, such as (a) bacterial origin, (b) an average molecular weight of 15 kDa or less, such as, about 8 kDa to about 15 kDa, and/or 90 to 150, 100 to 150, 120 to 150, 90 to 125, 100 to 125, or 120 to 125 amino acids in length, (c) membrane binding properties, and (d) monomeric properties.
  • cytochrome C characteristics such as (a) bacterial origin, (b) an average molecular weight of 15 kDa or less, such as, about 8 kDa to about 15 kDa, and/or 90 to 150, 100 to 150, 120 to 150, 90 to 125, 100 to 125, or 120 to 125 amino acids in length, (c) membrane binding properties, and (d) monomeric properties.
  • the effect of increasing the rate of sugar consumption may be at a level equivalent to that of the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 27 exemplified above.
  • the L-amino acid producing microorganism with enhanced cytochrome C activity may have an increased L-amino acid producing ability, compared to the same unmodified microorganism having no enhanced cytochrome C activity.
  • the term "enhancement of cytochrome C activity” refers to any manipulation in which cytochrome C activity is introduced into a microorganism, or cytochrome C activity can be improved compared to the intrinsic or pre-modification activity of the microorganism. have.
  • the "introduction” means that the activity of cytochrome C, which the microorganism did not originally have, appears naturally or artificially.
  • the “unmodified microorganism” may refer to a host microorganism in which cytochrome C has not been enriched or has not been enriched.
  • the "intrinsic activity” may refer to the activity of cytochrome C originally possessed by the host microorganism before or without cytochrome C enrichment.
  • "unmodified” may be used interchangeably with a form having intrinsic activity in which genetic mutation does not occur.
  • the enhancement of cytochrome C activity may include both introducing and enhancing exogenous cytochrome C or enhancing endogenous cytochrome C activity.
  • the enhancement of cytochrome C activity may be enhanced by introducing exogenous cytochrome C.
  • the enhancement of cytochrome C activity in the microorganism is improved compared to the unmodified microorganism in which the sugar consumption rate of the microorganism is not enhanced.
  • the cytochrome C activity-enhanced microorganism exemplified in one embodiment is similar to the unmodified microorganism and the strain growth (OD value) and / or L-amino acid, for example, L-lysine production yield within a specific section, and the sugar consumption rate may be improved, which suggests that the cytochrome C activity-enhanced microorganism produces more L-amino acids in a shorter time than the unmodified microorganisms, thereby improving L-amino acid productivity.
  • the enhancement of the cytochrome C activity may be due to an increase in the expression level and/or an increase in the activity as cytochrome C at the gene (mRNA) level and/or protein level of cytochrome C, but is limited thereto no.
  • the enhancement of the cytochrome C activity may be by introduction of a gene encoding cytochrome C.
  • a gene encoding cytochrome C By introducing such a gene encoding cytochrome C, the L-amino acid producing ability of the microorganism having the L-amino acid producing ability is increased, or the L-amino acid producing ability can be imparted to the microorganism having the L-amino acid producing ability.
  • the cytochrome C or a gene encoding the same may be derived from (intrinsic) a host microorganism or derived from another microorganism (exogenous).
  • the enhancement of cytochrome C activity may be performed by introducing a polynucleotide encoding exogenous cytochrome C into a host microorganism.
  • the cytochrome C is as described above, and for example, may be cytochrome C (cytochrome c-551) derived from Bacillus pseudofirmus OF4, for example, SEQ ID NO: 16 (eg, encoded by cccA (BpOF4_13740)) Or it may be one represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 (eg, encoded by cccB (BpOF4_05495)).
  • the gene encoding the cytochrome C or the L-amino acid producing microorganism into which the gene is introduced may include a polynucleotide encoding SEQ ID NO: 16, a polynucleotide encoding SEQ ID NO: 27, or both.
  • the L-amino acid producing microorganism is a microorganism of the genus Corynebacterium comprising a polynucleotide encoding SEQ ID NO: 16, a polynucleotide encoding SEQ ID NO: 27, or both, such as Corynebacterium glue Tamicum ( Corynebacterium glutamicum ) may be.
  • the L-amino acid-producing microorganism may be one with accession number KCCM12640P.
  • a polynucleotide which may be used interchangeably with “gene” or a polypeptide (which may be used interchangeably with “protein”) is "comprises a specific nucleic acid sequence or amino acid sequence, consists of a specific nucleic acid sequence or amino acid sequence, Or it is expressed as a specific nucleic acid sequence or amino acid sequence” is an equivalent meaning and interchangeable expressions, and may mean that the polynucleotide or polypeptide essentially includes the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence, and the polynucleotide or polypeptide necessarily includes the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence.
  • nucleic acid sequences or amino acid sequences provided herein can be prepared by conventional mutagenesis methods such as direct evolution and/or site-specification to the extent that they retain their original or desired functions. It may include those modified by site-directed mutagenesis or the like.
  • reference to a polynucleotide or polypeptide “comprising a specific nucleic acid sequence or amino acid sequence” means that the polynucleotide or polypeptide (i) consists of or consists essentially of the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence; or (ii) at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, 95% of the specific nucleic acid sequence or amino acid sequence.
  • the original function may be a cytochrome C function (in the case of an amino acid sequence), or a function encoding a protein having the cytochrome C function (in the case of a nucleic acid sequence), and the desired function is a microorganism It may mean a function of increasing or imparting L-amino acid (eg, L-lysine) production capacity of
  • nucleic acid sequence described herein is the amino acid sequence and / or function of the protein expressed from the coding region, considering the codon preferred in the microorganism to express the protein (cytochrome C) due to the degeneracy of the codon.
  • Various modifications may be made to the coding region within a range that does not change .
  • the term "homology” refers to the degree of correspondence with a given nucleic acid sequence or amino acid sequence, and may be expressed as a percentage (%).
  • the algorithm BLAST according to the literature (Karlin and Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993) or FASTA by Pearson (see Methods Enzymol) ., 183, 63, 1990) can be used.
  • BLAST a program called BLASTN or BLASTX has been developed (refer to http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • a polynucleotide comprising a specific nucleic acid sequence comprises a polynucleotide fragment comprising a nucleic acid sequence complementary to the specific nucleic acid sequence or a nucleic acid sequence substantially equivalent thereto, as well as the specific nucleic acid sequence.
  • the polynucleotide having the complementarity can be hybridized at a Tm value that can be appropriately adjusted by a person skilled in the art depending on the purpose, for example, a Tm value of 55 °C, 60 °C, 63 °C or 65 °C, and analyzed under the conditions described below. : These conditions are specifically described in known literature.
  • Hybridization requires that two nucleotides have complementary sequences, or mismatches between bases may be allowed depending on the stringency of hybridization.
  • the term “complementary” may be used to describe a relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other. For example, in the case of DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the appropriate stringency for hybridizing polynucleotides depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, which is well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • the increase in the copy number of the polynucleotide is not particularly limited thereto, but the polynucleotide may be introduced into a host microorganism through a vector or may be performed by being inserted into the chromosome of the host microorganism.
  • the copy number increase may be performed by introducing a polynucleotide encoding an exogenous cytochrome C or a codon-optimized mutant polynucleotide of the polynucleotide into a host microorganism.
  • the foreign polynucleotide may be used without limitation in its origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as that of cytochrome C it encodes.
  • the introduction can be carried out by appropriately selecting and/or modifying known transformation methods by those skilled in the art. By the introduction, the introduced polynucleotide is expressed in the host microorganism, thereby making it possible to generate exogenous cytochrome C.
  • Modification of the expression control sequence so as to increase the expression of the polynucleotide is applicable to both foreign polynucleotides and endogenous polynucleotides, and is not particularly limited thereto. Deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or mutagenesis of a combination thereof, or replacement with an expression control sequence having stronger activity.
  • the expression control sequence is not particularly limited thereto, but may be one or more selected from the group consisting of a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence controlling the termination of transcription and/or translation, and the like.
  • a strong heterologous promoter can be operably linked to the top of the polynucleotide expression unit instead of the native promoter.
  • the strong promoter include CJ7 promoter, lysCP1 promoter, EF-Tu promoter, groEL promoter, aceA or aceB promoter. More specifically, the strong promoter may be the lysCP1 promoter (WO2009/096689) or the CJ7 promoter (WO2006/065095), which is a promoter derived from the genus Corynebacterium, but is not limited thereto.
  • the gene introduction described herein is performed by introducing a foreign gene (derived from a heterologous and/or homologous to the host microorganism) into a host cell i) in a form operably linked to a recombinant vector, or ii) the host. It can be done by insertion (eg, random insertion) into the chromosome (genome) of the cell.
  • the insertion site when inserted into the chromosome (genome) of the host cell, is a location that does not affect the growth of the host cell (eg, non-transcriptional spacer (NTS), etc.) and / or random insertion efficiency It may be a position that can be raised (eg, retrotransposon, etc.), but is not limited thereto.
  • NTS non-transcriptional spacer
  • the gene or vector introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by those skilled in the art.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target protein (cytochrome C) into a host microorganism so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell. it means.
  • the transformed polynucleotide may include all of these, whether inserted into or extrachromosomally located in the chromosome of the host microorganism, as long as it can be expressed in the host microorganism.
  • the polynucleotide includes DNA and RNA encoding a target protein.
  • the form in which it is introduced is not limited.
  • the polynucleotide may be introduced into a host microorganism in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may include expression control elements such as a promoter, a transcription termination signal, a ribosome binding site and/or a translation termination signal, which are operably linked to the polynucleotide in general.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • operably linked means an expression control element (eg, a promoter) and an expression control element (eg, a promoter) so that the expression control element can perform transcriptional control (eg, transcription initiation) of a polynucleotide encoding a target protein (cytochrome C) It may mean that the polynucleotides are functionally linked. Operable ligation may be performed using genetic recombination techniques known in the art, such as, but not limited to, by conventional site-specific DNA cleavage and ligation.
  • the method of transforming the polynucleotide into a host microorganism can be performed by any method of introducing a nucleic acid into a cell (microorganism), and can be performed by appropriately selecting a transformation technique known in the art according to the host microorganism.
  • the known transformation methods include electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol-mediated uptake. ), DEAE-dextran method, cationic liposome method, lipofection, lithium acetate-DMSO method and the like may be exemplified, but is not limited thereto.
  • Insertion of the gene into the host cell genome can be performed by appropriately selecting a known method by those skilled in the art, for example, an RNA-guided endonuclease system (RNA-guided endonuclease system; for example, (a) RNA- A guide endonuclease (eg, Cas9 protein, etc.), its coding gene, or a vector comprising the gene; and (b) a guide RNA (eg, single guide RNA (sgRNA), etc.), its coding DNA, or the DNA A mixture (eg, a mixture of RNA-guided endonuclease protein and guide RNA, etc.), a complex (eg, ribonucleic acid fusion protein (RNP)), a recombinant vector (eg, RNA-guided endonuclease) comprising a vector comprising It may be carried out using one or more selected from the group consisting of a vector including the first encoding gene and the guide
  • cytochrome C encoding gene a recombinant vector comprising the gene, and/or an increase in L-amino acid production capacity and/or L-amino acid production ability in a microorganism of a cell comprising the gene or the recombinant vector A use for is provided.
  • compositions for producing L-amino acids comprising a gene encoding cytochrome C, a recombinant vector containing the gene, or a cell containing the gene or the recombinant vector.
  • Another example may be a cytochrome C-encoding gene, a recombinant vector containing the gene, or a composition for producing L-amino acids, including both.
  • the composition for producing L-amino acid may be for L-amino acid production in microorganisms, increase in L-amino acid production capacity, and/or to impart L-amino acid production capability.
  • Another example is a method for increasing the L-amino acid production capacity of the microorganism, or a method for increasing the L-amino acid production capacity of the microorganism, comprising introducing (transformation) a cytochrome C encoding gene or a recombinant vector containing the gene into the microorganism provide a way
  • the cytochrome C, the gene encoding it, and the microorganism are as described above.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable regulatory sequence so that the target protein can be expressed in a suitable host.
  • the regulatory sequence may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and/or a sequence regulating the termination of transcription and/or translation. have.
  • the vector After transformation into a suitable host microorganism, the vector may be expressed independently of the genome (genome) of the host microorganism, or may be integrated into the genome of the host microorganism.
  • the vector usable in the present specification is not particularly limited as long as it is capable of replication in a host cell, and may be selected from all commonly used vectors.
  • commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages, and the like.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as a phage vector or a cosmid vector, and pBR-based, pUC as a plasmid vector.
  • pDZ pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like may be exemplified, but is not limited thereto.
  • the vector usable herein may be a known expression vector and/or a vector for inserting a polynucleotide into a host cell chromosome. Insertion of the polynucleotide into the host cell chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector may further include a selection marker for confirming whether or not it is inserted into the chromosome.
  • the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to determine whether the polynucleotide is inserted, and selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophicity, resistance to cytotoxic agents or expression of surface proteins It can be selected from among genes that confer In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
  • Another example provides a method for producing L-amino acids, comprising the step of culturing the above-described L-amino acid-producing microorganisms in a medium.
  • the method after the step of culturing, may further include the step of recovering L-amino acids from the cultured microorganism, the medium, or both.
  • the step of culturing the microorganism is not particularly limited thereto, but may be performed by a known batch culture method, a continuous culture method, a fed-batch culture method, and the like.
  • the culture conditions are not particularly limited thereto, but use a basic compound (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg, phosphoric acid or sulfuric acid) to an appropriate pH (eg, pH 5 to 9, specifically can control pH 6 to 8, most specifically pH 6.8) and maintain aerobic conditions by introducing oxygen or an oxygen-containing gas mixture into the culture.
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45°C, or 25 to 40°C, and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • L-amino acids (eg, L-lysine) produced by the above culture may be secreted into the medium or remain in the cells.
  • the medium usable for the culture includes sugars and carbohydrates (eg, glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), oils and fats (eg, soybean oil, sunflower oil, Peanut oil and coconut oil), fatty acids (eg palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (eg glycerol and ethanol), organic acids (eg acetic acid), etc. are individually used or Or two or more types may be mixed and used, but the present invention is not limited thereto.
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (e.g. peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soy flour and urea), inorganic compounds (e.g.
  • ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and nitric acid) ammonium), etc. may be used individually or in a mixture of two or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • a phosphorus source at least one selected from the group consisting of potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, and a corresponding sodium-containing salt may be used individually or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • the medium may contain essential growth-promoting substances such as other metal salts (eg, magnesium sulfate or iron sulfate), amino acids, and/or vitamins.
  • the step of recovering the L-amino acid may be collecting the desired amino acid from the medium, the culture medium, or the microorganism using a suitable method known in the art according to the culture method.
  • the recovering may be performed by one or more methods selected from centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, HPLC, and the like.
  • the method for recovering the L-amino acid may further include a purification step before, simultaneously, or after that.
  • the lysine-producing activity of the lysine-producing strain is enhanced and maintained until the latter half of culture, it is possible to improve the lysine-producing ability.
  • 1 is a schematic diagram showing a nucleic acid sequence analysis result of a library vector obtained in Example.
  • a genomic DNA library derived from extremophile bacteria that adapts and lives in various extreme environments was prepared.
  • extreme microorganisms 4 representative microorganisms that can grow under extreme conditions of high osmotic pressure, high temperature, low oxygen, and various hydrogen ion concentrations, namely, Bacillus atrophaeus (ATCC 49337), Bacillus licheniformis (KCTC 1030), Lactobacillus fermentum (KCTC 3112), and Bacillus pseudofirmus OF4 (ATCC BAA2126) was used.
  • genomic DNA was obtained from the four strains using the QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN).
  • the obtained genomic DNA is treated with restriction enzyme Sau3A1 (NEB), reacted at 37°C for 10 minutes, and reacted at 65°C for 30 minutes to make an incomplete gene fragment, which is electrophoresed on a 1% agarose gel to produce a 5 to 7kb gene fragment. only acquired.
  • the gene fragment for insertion was obtained using the GeneAll Expin GEL SV kit (seoul, KOREA).
  • the thus-obtained gene fragment is linked to the pECCG117 vector (Korea Patent No. 0057684) obtained after a 1 hour reaction with restriction enzyme BamHI-HF (NEB) at 37° C. and 30 minutes treatment with CIP (NEB) enzyme at 37° C., E. coli DH5 ⁇ was transformed and plated on LB solid medium containing kanamycin (25 mg/l). Transformed colonies were subjected to PCR using the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2 of Table 1 below.
  • PCR conditions were denatured at 95°C for 10 minutes, followed by denaturation at 95°C for 1 minute, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 4 minutes were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 10 minutes.
  • the four library vectors (p117-Lib.Bat, p117-Lib.Bli, p117-Lib.Lfe, and p117-Lib.Bps) prepared in Example 1 were used to produce lysine, Corynebacterium glutamicum KCCM11016P.
  • kanamycin 25 mg/l was It was smeared on the included complex plate medium.
  • LYS_Lib.Bat As a control of the library strains, the KCCM11016P strain was transformed with the pECCG117 vector into which the gDNA-derived gene fragment was not inserted, and was named LYS_117 control.
  • composition of the complex plate medium used was as follows:
  • Glucose 10 g Peptone 10 g, Beef extract 5 g, Yeast extract 5 g, Brain Heart Infusion 18.5 g, NaCl 2.5 g, Urea 2 g, Sorbitiol 91 g, Agar 20 g (based on 1 liter of distilled water)
  • the four KCCM11016P-based library strains obtained above were inoculated using a colony-picker (SINGER, PIXL) on a 96-Deep Well Plate-Dome (Bioneer) containing 400ul screening medium, respectively, and in a plate shaking incubator (TAITEC). Incubated for 15 hrs at 32 °C, 12000rpm conditions.
  • composition of the seed medium used was as follows:
  • Example 2 In order to confirm the sequence of the gene inserted into the three colonies selected in Example 2 LYS_Lib.Bps #257, #881, and #4213, the primers of SEQ ID NOs 1 and 2 described in Table 1 of Example 1 were used. Thus, the gDNA library gene fragment possessed by the colony was amplified by PCR. PCR conditions were the same as in Example 1, and the amplified DNA fragment was obtained using the GeneAll Expin GEL SV kit (seoul, KOREA) and nucleotide sequence analysis was performed. The analysis result confirmed the genetic information through BLAST (NCBI reference sequence NC_013791.2).
  • the obtained analysis result is shown in FIG. 1 .
  • the LYS_Lib.Bps colony #257 contained the gene fragments of 4794bp
  • the colony #881 was 3985bp
  • the colony #4213 contained the gene fragments of 4483bp.
  • the complete gene ORFs commonly included in the three colonies were identified as BpOF4_13735 and BpOF4_13740, and then, additional experiments were performed on the influence of the two genes.
  • a vector for genome insertion was prepared.
  • a pDZ_ ⁇ 2284 vector was prepared targeting the Ncgl2284 gene, one of the transposases, to prepare a base vector for gene insertion.
  • ATCC13032 gDNA was used as a DNA template for PCR, and primers were prepared with reference to the NCBI base sequence (NC_003450.3). After denaturation at 95°C for 10 minutes with the primers of SEQ ID NOs: 3 and 4, denaturation at 95°C for 1 minute, annealing at 55°C for 1 minute, and polymerization at 72°C for 1 minute were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 10 minutes. PCR was performed to obtain a 5' DNA fragment of about 900 bp. Similarly, PCR was performed under the same conditions as above using primers SEQ ID NOs: 5 and 6, and the 3' DNA fragment was amplified.
  • the two amplified DNA fragments were purified using the GeneAll Expin GEL SV kit (seoul, KOREA), treated with restriction enzyme XbaI (NEB), and then heat-treated at 65° C. for 20 minutes (Korea Patent No. 2009-0094433) vector and E. coli DH5 ⁇ after ligation using the Infusion Cloning Kit.
  • the strain was plated on LB solid medium containing kanamycin (25 mg/l), and the nucleotide sequence of the gene inserted into the pDZ vector was confirmed to finally prepare a pDZ_ ⁇ 2284 vector.
  • the vector for further enhancement (expression) of individual genes is obtained by treating the base vector pDZ_ ⁇ 2284 with restriction enzymes NdeI and CIP (NEB) and heat-treating it at 65° C. for 20 minutes for purification. Then, the obtained vector, promoter, and each gene DNA fragment are linked with the Infusion Cloning Kit. was produced.
  • the promoter for the additional expression of the gene used the gapA gene promoter of SEQ ID NO: 13, and to obtain it, PCR amplification was performed using ATCC13032 gDNA (NC_003450.3) as a template and primers SEQ ID NOs: 7 and 8.
  • PCR was performed using pfu polymerase, denaturing at 95°C for 10 minutes, denaturing at 95°C for 1 minute, annealing at 55°C for 1 minute, and repeating polymerization at 72°C for 1 minute 30 times, followed by polymerization at 72°C for 10 minutes. proceeded.
  • the two gene BpOF4_13735 and BPOF4_13740 DNA fragments were processed in the same manner as the promoter PCR.
  • BpOF4_13735 For the BpOF4_13735 gene (SEQ ID NO: 14), the primers of SEQ ID NOs: 9 and 10 were used, and for BpOF4_13740 (SEQ ID NO: 15), SEQ ID NO: 11 and The gene was amplified from Bacillus pseudofirmus OF4 gDNA using the primers of 12. The DNA fragments thus obtained were purified using the GeneAll Expin GEL SV kit (seoul, KOREA) and ligated with the pDZ_ ⁇ 2284 vector to prepare two types of vectors. Finally, pDZ_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_13735 vector and pDZ_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_13740 vector were constructed.
  • the two types of vectors prepared above were transformed by an electric pulse method into a Corynebacterium glutamicum KCCM11016P strain (Korean Patent No. 10-0159812) producing lysine, and each gene was passed through a secondary DNA-crossover.
  • a strain fortified was prepared.
  • the two strains thus prepared were named KCCM11016P_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_13735 and KCCM11016P_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_13740.
  • Example 5 of individual gene insertion strains lysine productivity analysis
  • the two strains prepared in Example 4 were cultured in the following manner to measure OD, lysine production yield, and sugar consumption rate (g/hr).
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of a seed medium, and cultured with shaking at 30° C. for 20 hours at 150 rpm.
  • a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the production medium was inoculated with 1 ml of the seed culture and cultured with shaking at 32° C. for 40 hours at 150 rpm.
  • the composition of the species medium and the production medium is as follows, respectively, and the culture results are shown in Table 4.
  • the strain overexpressing BpOF4_13735 did not show significant improvement in lysine yield and sugar consumption rate compared to the parent strain KCCM11016P_ ⁇ 2284.
  • the final fermentation OD and yield are similar, but the rate of sugar consumption per hour in the middle section of the culture (17 to 24 hours) increased by 31.5% compared to the parent strain KCCM11016P_ ⁇ 2284.
  • Example 2 the effect of the colony LYS_Lib.Bps #257, #881, and #4213 strains confirmed in Example 2 was the effect of strengthening BpOF4_13740.
  • Example 6 Improvement of lysine production ability of the BpOF4_13740 gene-enhanced strain
  • the BpOF4_13740 gene was analyzed after gene enhancement with another promoter.
  • the effect was also confirmed on the BpOF4_05495 gene, which was additionally confirmed by NCBI BLAST analysis.
  • a gene expression vector was additionally prepared.
  • a vector was prepared in the same manner as the vector prepared in Example 3 above:
  • the sigB promoter was amplified by PCR using the primers of SEQ ID NOs: 17 and 18 using ATCC13032 gDNA as a template, and BpOF4_13740 gene was PCR amplified using the primers of SEQ ID NOs: 19 and 12 using Bacillus pseudofirmus OF4 gDNA as a template. These two gene fragments were ligated with the pDZ_ ⁇ 2284 vector to further construct a pDZ_ ⁇ 2284::PsigB BpOF4_13740 vector.
  • BpOF4_05495 gene enhancement was performed in the same manner to construct pDZ_ ⁇ 2284::PsigB BpOF4_05495 and pDZ_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_05495 vectors.
  • the BpOF4_05495 gene fragment was obtained using SEQ ID NOs: 20 and 21 and SEQ ID NOs: 22 and 21.
  • SEQ ID NOs: 23 and 24 primers inserted with ribosome attachment sequences were added, and pDZ_ ⁇ 2284::PsigB BpOF4_13740_05495 and pDZ_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_13740_05495 vectors were also constructed.
  • KCCM11016P_ ⁇ 2284::PsigB BpOF4_13740 KCCM11016P_ ⁇ 2284::PsigB BpOF4_05495, KCCM11016P_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_05495, KCCM11016P_ ⁇ 2284::Psig_05495, KCCM11016P_ ⁇ 2284::Psig
  • the highest rate of sugar consumption was confirmed when the co-expression of the genes BpOF4_13740 and BpOF4_05495 was enhanced.
  • the hourly glucose consumption rate of the KCCM11016P_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_13740_05495 strain showed a 45.9% improvement compared to the control KCCM11016P_ ⁇ 2284.
  • Example 7 Analysis of lysine production capacity of the BpOF4_13740_05495 enhanced strain
  • Example 6 The genes selected in Example 6 were enhanced in Corynebacterium glutamicum KCCM10770P (Korean Patent No. 10-0924065) and KCCM11347P (Korean Patent No. 10-0073610) that produce L-lysine, respectively.
  • additional genes were introduced in the same manner as in Example 6, and finally, three vectors, pDZ_ ⁇ 2284, pDZ_ ⁇ 2284::PsigB BpOF4_13740_05495, and pDZ_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_13740_05495, were electropulsed with Corynebacter.
  • the prepared gene-enhanced strains were cultured in the same manner as in Example 5, and the OD, lysine production yield, and relative glucose consumption rate per hour (based on 100% of the rate of glucose consumption per hour of KCCM10770P_ ⁇ 2284 and KCCM11347P_ ⁇ 2284, respectively) were measured, and the results are as follows. Table 7 shows.
  • Example 8 BpOF4_13740_05495 introduced CJ3P strain production and lysine production capacity analysis
  • the produced strains were named CJ3_ ⁇ 2284, CJ3_ ⁇ 2284::PsigB BpOF4_13740_05495, and CJ3_ ⁇ 2284::PgapA BpOF4_13740_05495, respectively.
  • the control CJ3P strain (BpOF4_13740_05495 enhancement was not performed) and three production strains were cultured in the same manner as in Example 5 above, and OD, lysine production yield, and relative glucose consumption rate per hour (the rate of consumption per hour of KCCM10770P_ ⁇ 2284 and KCCM11347P_ ⁇ 2284, respectively) 100% basis) was measured, and the results are shown in Table 8 below:

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Abstract

사이토크롬 C (Cytochrome C) 활성이 강화된, L-아미노산 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-아미노산의 생산 방법이 제공된다.

Description

사이토크롬 C 활성이 강화된 L-아미노산 생산 미생물 및 이를 이용한 L-아미노산 생산방법
관련 출원들과의 상호 인용
본 출원은 2019년 12월 23일자 대한민국 특허출원 제10-2019-0173087호 및 2019년 12월 23일자 대한민국 특허출원 10-2019-0173088호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
사이토크롬 C (Cytochrome C) 활성이 강화된, L-아미노산 생산 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-아미노산의 생산 방법이 제공된다.
코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며, 주로 코리네박테리움 균주를 이용한 발효에 의해 생성되고 있다.
코리네박테리움 속 균주를 이용한 L-아미노산의 제조방법을 개선하기 위하여 많은 시도가 행해지고 있다. 그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 특정 유전자를 파괴시키거나 감쇠 발현시킴으로써 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있다. 또한, 각각의 L-아미노산 생합성에 관련된 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하기 위한 연구가 진행되어 왔다.
한편, 발효를 통한 라이신 생산 산업에 있어서, 고농도의 라이신 생산 및 미생물의 라이신 생산능 증가는 중요한 요소이다. 따라서 미생물의 라이신 생산능 향상 및 이를 발효배양 동안 지속적으로 유지하기 위한 노력이 지속되어 왔다. 하지만 미생물의 활성을 저해 시키는 다양한 내부 또는 외부 요소들로 인해 배양후반까지 라이신 생산능을 유지하기 어려운 문제가 있다.
따라서, L-아미노산, 예를 들어, L-라이신의 생산능이 향상되고 지속적으로 유지 가능한 균주의 개발이 요구되고 있다.
일 예는 사이토크롬 C (Cytochrome C) 활성이 강화된 L-아미노산 생산 미생물을 제공한다. 예컨대, 상기 사이토크롬 C 활성의 강화는 사이토크롬 C를 암호화하는 유전자 도입에 의한 것일 수 있다. 예컨대, 상기 사이토크롬 C를 암호화하는 유전자는 외래 유전자일 수 있다.
다른 예는 상기 L-아미노산 생산 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산 방법을 제공한다.
다른 예는 사이토크롬 C 암호화 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 이들 모두를 포함하는, 미생물에서의 L-아미노산 생산용 또는 L-아미노산 생산 증진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 제공되는 일 실시예에서 코리네박테리움 속 미생물의 라이신 생산능 증가를 목적으로 유전자를 증폭하여 라이신 생산에 미치는 영향을 확인하고, 이를 근거로 아미노산 생산을 위한 균주 개량 기술을 제안한다. 일반적으로 라이신 등의 아미노산의 생산능 증가를 위한 방법으로 균주가 가지는 라이신 등의 아미노산 생산 수율을 향상시키거나, 시간당 라이신 등의 아미노산 생산량 (생산성)을 증가시키는 방법 등을 들 수 있다. 특히 라이신 등의 아미노산 생산성은 발효 배지의 성분, 발효 배지의 삼투압, 온도, 교반 속도, 산소 공급 속도 등 다양한 인자에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 발효액 내에 존재하는 다양한 물질 및 대사체에 의한 스트레스, 미생물 균체 증가에 따른 산소 공급 저하, 온도 및 교반 속도와 같은 물리조건 등의 문제로 인해 미생물의 라이신 생산능 및 미생물의 세포 활성은 지속적으로 감소한다. 본 명세서의 일 예에서는 이와 같은 다양한 인자에 의한 스트레스를 극복하고 미생물의 목적 산물 생산 활성을 발효 후반까지 유지할 수 있도록 하는 균주의 개량 기술이 제공된다.
이하, 보다 상세히 설명한다.
일 예는 사이토크롬 C (Cytochrome C) 활성이 강화된, L-아미노산 생산 미생물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "L-아미노산 생산 미생물"은 L-아미노산 생산능을 갖는 미생물이 사이토크롬 C 활성이 강화됨으로써 증가된 L-아미노산 생산능을 갖는 경우 및/또는 L-아미노산 생산능을 갖지 않는 미생물이 사이토크롬 C 활성이 강화됨으로써 L-아미노산 생산능을 갖게 되는 경우를 의미하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 "미생물"은 단세포 박테리아를 포괄하는 것으로, "세포"와 혼용될 수 있다.
상기 L-아미노산은 L-라이신일 수 있다.
본 명세서에서, 사이토크롬 C 활성이 강화되기 전의 미생물을 상기 사이토크롬 C 활성이 강화되어 L-아미노산 생산능이 증가되거나 L-아미노산 생산능이 부여된 "L-아미노산 생산 미생물"과 구별하기 위하여, 상기 사이토크롬 C 활성이 강화되기 전의 미생물을 숙주 미생물로 표현할 수 있다.
일 예에서, 상기 숙주 미생물은 L-아미노산 (예컨대, L-라이신) 생산능을 갖는 모든 미생물에서 선택된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 숙주 미생물은 자연적으로 L-라이신 생산능을 가지는 미생물 또는 L-라이신 생산능이 없거나 현저히 적은 모균주에 변이가 도입되어 L-라이신 생산능을 가지는 미생물일 수 있다.
일 예에서, 상기 숙주 미생물은 자연적으로 L-라이신 생산능을 가지는 미생물 또는 L-라이신 생산능이 없거나 현저히 적은 모균주에 변이가 도입되어 L-라이신 생산능을 가지는 모든 그람양성 세균, 예컨대 코리네박테리움 속 (the genus　Corynebacterium) 미생물 및 에스케리키아 속 (the genus Escherichia) 미생물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium　glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium　thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium　efficiens) 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium　glutamicum)일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "사이토크롬 C"는 박테리아 유래이고 평균분자량 15kDa 이하, 예컨대, 약 8kDa 내지 약 15kDa 정도 및/또는 90 내지 150개, 100 내지 150개, 120 내지 150개, 90 내지 125개, 100 내지 125개, 또는 120 내지 125개 아미노산 길이이고, 막결합 특성을 가지는 단량체의 사이토크롬 C을 의미한다. 일 구체예에서, 상기 사이토크롬 C는 바실러스 속 미생물 유래의 것일 수 있으며, 환원 상태에서 가장 낮은 준위 에너지의 흡수 밴드(흡광도)가 나타나는 파장 구간이 550 내지 555nm 또는 550 내지 551nm인 사이토크롬 C 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 사이토크롬 C는 바실러스 속 미생물 유래의 사이토크롬 c-551 (흡광도 약 551nm), 사이토크롬 c-550 (흡광도 약 550nm) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 예컨대, 1종, 2종, 또는 3종일 수 있다 (상기 사이토크롬 c 뒤에 기재된 수치는 흡광도를 의미한다). 상기 바실러스 속 미생물은 Bacillus pseudofirmus, Bacillus subtilis 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 예에서, 상기 사이토크롬 C, 예컨대, c-551 및 사이토크롬 c-550 중에서 선택된 1종 이상은 각각 독립적으로 cccA 또는 cccB에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 사이토크롬 C는 Bacillus pseudofirmus (예컨대, Bacillus pseudofirmus OF4 등) 및/또는 Bacillus subtilis 유래의 사이토크롬 c-551, Bacillus subtilis 유래의 사이토크롬 c-550 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 사이토크롬 C (예컨대, Bacillus subtilis 유래의 사이토크롬 c-551)는 cccA (예컨대, Bacillus pseudofirmus OF4 유래의 BpOF4_13740)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열(예컨대, 서열번호 16)을 포함하는 폴리펩타이드, cccB (예컨대, Bacillus pseudofirmus OF4 유래의 BpOF4_05495)에 의하여 암호화되는 아미노산 서열 (예컨대, 서열번호 27)을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이들 모두를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 사이토크롬 C는 일 예로 기재된 서열번호 16 또는 서열번호 27의 아미노산 서열과 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 82% 이상, 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 (예컨대, 60% 내지 99.5%, 70% 내지 99.5%, 80% 내지 99.5%, 85% 내지 99.5%, 90% 내지 99.5%, 91% 내지 99.5%, 92% 내지 99.5%, 93% 내지 99.5%, 94% 내지 99.5%, 95% 내지 99.5%, 96% 내지 99.5%, 97% 내지 99.5%, 98% 내지 99.5%, 또는 99% 내지 99.5%)의 서열 상동성을 갖는 단백질을 포함하는 의미로 해석될 수 있다. 이와 같이 본 명세서에 기재된 사이토크롬 C 범주에 포함 가능한 상기 서열 상동성을 갖는 단백질은 (1) 앞서 설명한 사이토크롬 C의 특징, 예컨대, (a) 박테리아 유래, (b) 평균분자량 15kDa 이하, 예컨대, 약 8kDa 내지 약 15kDa 정도, 및/또는 90 내지 150, 100 내지 150, 120 내지 150, 90 내지 125, 100 내지 125, 또는 120 내지 125 아미노산 길이, (c) 막결합 특성, 및 (d) 단량체 특성 중 하나 이상을 갖거나, 및/또는 (2) 미생물 내 활성 강화에 의한 효과, 예컨대, 비변형 미생물 대비, (e) L-아미노산 (예컨대, L-라이신) 생산능 증가 및/또는 (f) 당 소모 속도 증가 효과가 상기 예시된 서열번호 16 또는 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동등 정도의 수준인 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 사이토크롬 C 활성이 강화된 L-아미노산 생산 미생물은, 사이토크롬 C 활성이 강화되지 않은 동종의 비변형 미생물과 비교하여, L-아미노산 생산능이 증가된 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "사이토크롬 C 활성의 강화"는 미생물에 사이토크롬 C 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 사이토크롬 C 활성이 향상될 수 있는 모든 조작을 의미할 수 있다. 상기 "도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 사이토크롬 C의 활성이 자연적 혹은 인위적으로 나타나게 되는 것을 의미한다. 상기 "비변형 미생물"은 사이토크롬 C가 강화되지 않은 또는 강화되기 전의 숙주 미생물을 의미할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 사이토크롬 C가 강화되지 않은 또는 강화되기 전의 숙주 미생물이 본래 가지고 있던 사이토크롬 C의 활성을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 "비변형"은 유전적 변이가 일어나지 않은 내재적 활성을 갖는 형태와 혼용되어 사용될 수 있다.
예를 들어, 사이토크롬 C 활성의 강화는 외래의 사이토크롬 C를 도입하여 강화하는 것, 또는 내재적 사이토크롬 C 활성을 강화하는 것을 모두 포함할 수 있다. 일 예에서, 사이토크롬 C 활성의 강화는 외래의 사이토크롬 C를 도입하여 강화하는 것일 수 있다.
일 예에서, 미생물에서의 사이토크롬 C 활성의 강화는 상기 미생물의 당 소모속도 등이 사이토크롬 C 활성의 강화되지 않은 비변형 미생물과 비교하여 향상된 것으로 확인할 수 있다. 특히, 일 구체예에서 예시되는 사이토크롬 C 활성 강화된 미생물은 비변형 미생물과 특정 구간 내 균주 생장(OD 값) 및/또는 L-아미노산, 예를 들어 L-라이신 생산 수율이 유사하고 당 소모 속도가 향상된 것일 수 있으며, 이는 상기 사이토크롬 C 활성 강화된 미생물이, 비변형 미생물 대비, 보다 짧은 시간 내 더욱 많은 L-아미노산을 생산하여, L-아미노산 생산성이 개선된 것을 특징을 가짐을 제안한다.
일 예에서, 상기 사이토크롬 C 활성의 강화는 사이토크롬 C의 유전자 (mRNA) 수준 및/또는 단백질 수준에서의 발현량 증가 및/또는 사이토크롬 C로서의 활성 증가에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 사이토크롬 C 활성의 강화는 사이토크롬 C를 암호화하는 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 이와 같은 사이토크롬 C를 암호화하는 유전자 도입에 의하여, L-아미노산 생산능을 갖는 미생물의 L-아미노산 생산능이 증가되거나 L-아미노산 생산능을 갖지 않는 미생물에 L-아미노산 생산능이 부여될 수 있다.
일 예에서, 상기 사이토크롬 C 또는 이를 암호화하는 유전자는 숙주 미생물 유래(내재)의 것 또는 이와 다른 미생물 유래(외래)의 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 사이토크롬 C 활성의 강화는 숙주 미생물에 외래의 사이토크롬 C를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 사이토크롬 C는 앞서 설명한 바와 같으며, 예를 들어, Bacillus pseudofirmus OF4 유래의 사이토크롬 C (사이토크롬 c-551)일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 16 (예컨대, cccA (BpOF4_13740)에 의하여 암호화) 또는 서열번호 27 (예컨대, cccB (BpOF4_05495)에 의하여 암호화)의 아미노산 서열로 표현되는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 사이토크롬 C를 암호화하는 유전자 또는 상기 유전자가 도입된 L-아미노산 생산 미생물은 서열번호 16을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 27을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들 모두를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 L-아미노산 생산 미생물은 서열번호 16을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 27을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들 모두를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물, 예컨대, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium　glutamicum)일 수 있다. 예컨대, 상기 L-아미노산 생산 미생물은 기탁번호 KCCM12640P인 것일 수 있다.
본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드("유전자 "와 혼용될 수 있음) 또는 폴리펩타이드("단백질"과 혼용될 수 있음)가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다, 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어진다, 또는 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 표현된다" 함은 등가적 의미로 상호 혼용 가능한 표현으로, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열에 변이(결실, 치환, 변형, 및/또는 부가)가 가해진 "실질적으로 동등한 서열"을 포함하는 것(또는 상기 변이가 도입된 것을 배제하지 않는 것)으로 해석될 수 있다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 이들의 본래의 기능 또는 목적하는 기능을 유지하는 범위에서 통상적인 돌연변이 유발법, 예를 들면 방향성 진화법(direct evolution) 및/또는 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis) 등에 의하여 변형된 것을 포함할 수 있다. 일 예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 "특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열을 포함한다" 함은 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 (i) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이를 필수적으로 포함하거나, 또는 (ii) 상기 특정 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상 (예컨대, 60% 내지 99.5%, 70% 내지 99.5%, 80% 내지 99.5%, 85% 내지 99.5%, 90% 내지 99.5%, 91% 내지 99.5%, 92% 내지 99.5%, 93% 내지 99.5%, 94% 내지 99.5%, 95% 내지 99.5%, 96% 내지 99.5%, 97% 내지 99.5%, 98% 내지 99.5%, 또는 99% 내지 99.5%)의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 필수적으로 포함하고 본래의 기능 및/또는 목적하는 기능을 유지하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 상기 본래의 기능은, 사이토크롬 C 기능 (아미노산 서열의 경우), 또는 상기 사이토크롬 C 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 기능 (핵산 서열의 경우)일 수 있고, 상기 목적하는 기능은 미생물의 L-아미노산 (예컨대, L-라이신) 생산능을 증가시키거나 부여하는 기능을 의미할 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질(사이토크롬 C)을 발현시키고자 하는 미생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열 및/또는 기능을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "상동성"은 주어진 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율(%)로 표시될 수 있다. 핵산 서열에 대한 상동성의 경우, 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST(참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993)나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
일 예에서, 본 명세서에 제공되는 특정 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 특정 핵산 서열 또는 이와 실질적으로 동등한 핵산 서열뿐만 아니라, 상기 특정 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 구체적으로, 상기 상보성을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절 가능한 Tm 값, 예컨대, 55℃, 60℃, 63℃ 또는 65℃의 Tm 값에서 혼성화하고, 후술하는 조건에서 분석할 수 있다: 이러한 조건은 공지의 문헌에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 98% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 높은 상보성을 갖는 유전자끼리 혼성화하고, 그보다 낮은 상보성을 갖는 유전자끼리는 혼성화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1x SSC(saline-sodium citrate buffer), 및 0.1%(w/v) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate); 60℃, 0.1x SSC, 및 0.1% SDS; 또는 68℃, 0.1x SSC, 및 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세척하는 조건을 등을 열거할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 혼성화에는 두 개의 뉴클레오타이드가 상보적 서열을 가질 것을 요구되거나, 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 허용될 수 있다. 상기 용어 "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오타이드 염기 간의 관계를 기술하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, DNA의 경우, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고, 이는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
상기 사이토크롬 C 활성의 강화 중 사이토크롬 C의 유전자 (mRNA) 수준에서의 강화를 위한 방법을 보다 상세히 설명하면,
1) 상기 사이토크롬 C를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 또는
3) 상기 1) 및 2) 의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법
등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오타이드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오타이드가 벡터를 통하여 숙주 미생물에 도입되거나, 숙주 미생물의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 카피수 증가는, 외래의 사이토크롬 C를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오타이드를 숙주 미생물 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오타이드는 이것이 암호화하는 사이토크롬 C와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택 및/또는 변형하여 수행될 수 있다. 상기 도입에 의하여 숙주 미생물 내에서 도입된 폴리뉴클레오타이드가 발현됨으로써 외래 사이토크롬 C가 생성되도록 할 수 있다.
상기 2) 폴리뉴클레오타이드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 외래 폴리뉴클레오타이드 및 내재 폴리뉴클레오타이드 모두에 적용 가능하며, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열을 발현조절 활성이 더욱 강화되도록 뉴클레오타이드의 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환, 또는 이들의 조합으로 변이시키거나, 더욱 강한 활성을 가지는 발현조절 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 발현 증가를 위하여, 폴리뉴클레오타이드 발현 단위의 상부에 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 강력한 프로모터로서 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 또는 aceB 프로모터 등을 예시할 있다. 더욱 구체적으로, 상기 강력한 프로모터는 코리네박테리움 속 유래 프로모터인 lysCP1 프로모터 (WO2009/096689) 또는 CJ7 프로모터(WO2006/065095)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 상기 설명한 사이토크롬 C를 암호화하는 유전자가 벡터를 통하여 숙주 미생물에 도입되거나, 숙주 미생물의 염색체 내로 삽입되는 경우를 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재된 유전자 도입은, 외래(숙주 미생물과 이종 유래 및/또는 동종의 다른 개체 유래)의 유전자가, i) 재조합 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 숙주 세포에 도입되어 수행되거나, ii) 숙주 세포의 염색체(유전체) 내로 삽입(예컨대, 무작위 삽입)됨으로써 수행될 수 있다. 상기 ii) 숙주 세포의 염색체(유전체) 내로 삽입되는 경우, 삽입 위치는 숙주 세포의 성장에 영향이 없는 위치 (예컨대, 비전사 영역(non-transcriptional spacer; NTS) 등) 및/또는 무작위 삽입 효율을 높일 수 있는 위치 (예컨대, 레트로트랜스포존 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자 또는 벡터 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "형질전환"은 표적 단백질(사이토크롬 C)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주 미생물의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 그 도입되는 형태는 제한이 없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및/또는 번역 종결신호 등의 발현 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다. 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 발현조절 요소가 목적 단백질(사이토크롬 C)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전사 조절 (예, 전사 개시)를 수행할 수 있도록 발현조절 요소 (예, 프로모터)와 폴리뉴클레오타이드가 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행할 수 있으며, 예컨대, 통상적인 부위-특이적 DNA 절단 및 연결에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오타이드를 숙주 미생물에 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포(미생물) 내로 도입하는 어떠한 방법으로도 수행 가능하며, 숙주 미생물에 따라 당 분야에서 공지된 형질전환 기술을 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 상기 공지된 형질전환 방법으로 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전법, 염화칼슘 (CaCl2) 침전법, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 리포펙션(lipofection), 초산 리튬-DMSO법 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자의 숙주 세포 유전체 (염색체) 내 삽입은 공지된 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 시스템 (RNA-guided endonuclease system; 예컨대, (a) RNA-가이드 엔도뉴클레아제(예, Cas9 단백질 등), 이의 암호화 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터; 및 (b) 가이드 RNA (예, single guide RNA (sgRNA) 등), 이의 암호화 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 벡터를 포함하는 혼합물(예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA의 혼합물 등), 복합체 (예컨대, 리보핵산 융합단백질 (RNP), 재조합 벡터 (예컨대, RNA-가이드 엔도뉴클레아제 암호화 유전자 및 가이드 RNA 암호화 DNA를 포함하는 함께 포함하는 벡터 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상)을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 사이토크롬 C 암호화 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 및/또는 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 세포의 미생물에서의 L-아미노산 생산능 증가 및/또는 L-아미노산 생산능 부여를 위한 용도가 제공된다.
일 예는 사이토크롬 C를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 L-아미노산 생산용 조성물을 제공한다.
다른 예는 사이토크롬 C 암호화 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 이들 모두를 포함하는, L-아미노산 생산용 조성물일 수 있다. 상기 L-아미노산 생산용 조성물은 미생물에서의 L-아미노산 생산, L-아미노산 생산능 증가 및/또는 L-아미노산 생산능 부여를 위한 것일 수 있다.
다른 예는 사이토크롬 C 암호화 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 도입(형질전환)시키는 단계를 포함하는, 상기 미생물의 L-아미노산 생산능 증가 방법 또는 상기 미생물에 L-아미노산 생산능 부여 방법을 제공한다.
상기 사이토크롬 C, 이를 암호화하는 유전자, 및 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및/또는 전사 및/또는 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주 미생물 내로 형질전환된 후, 숙주 미생물의 게놈(유전체)과 무관하게 발현되거나, 숙주 미생물의 게놈 내에 통합될 수 있다.
본 명세서에서 사용가능한 벡터는 숙주 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 통상 사용되는 모든 벡터들 중에서 선택될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 등을 들 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터로서, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는　pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용 가능한 벡터는 공지된 발현 벡터 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입용 벡터일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 염색체 내 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 벡터는 상기 염색체 내 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 상기 폴리뉴클레오타이드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들 중에서 선택되어 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
다른 예는 상기한 L-아미노산 생산 미생물 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
　상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-아미노산 (예, L-라이신)은　배지　중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
상기 배양에 사용 가능한 배지는 탄소 공급원으로 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올), 유기산 (예: 아세트산) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 개별적으로 사용하거나 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한,　상기 배지는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산, 및/또는 비타민 등과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
상기 L-아미노산(예, L-라이신)을 회수하는 단계는 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지, 배양액, 또는 미생물로부터 목적하는 아미노산을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 회수하는 단계는 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화, HPLC 등에서 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있다. 상기 L-아미노산 (예, L-라이신)을 회수하는 방법은, 그 이전, 동시, 또는 그 이후에, 정제단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
외래 유전자의 도입을 통하여 라이신 생산 균주의 라이신 생산 활성이 증진되고 배양 후반까지 유지됨으로써, 라이신 생산능을 향상시킬 수 있다.
도 1은 일 실시예에서 얻어진 라이브러리 벡터의 핵산 서열 분석 결과를 보여주는 모식도이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: 유전자 도입용 벡터 라이브러리 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)의 라이신 생산능 향상에 유효한 유전자를 탐색하기 위하여, 다양한 극한 환경에서 적응하고 살아가는 극한미생물 (extremophile bacteria) 유래 genomic DNA library를 제작 하였다. 극한미생물로는 고삼투압, 고온, 저산소, 다양한 수소이온 농도의 극한 조건에서 생장가능한 대표 미생물 4종, 즉, Bacillus atrophaeus (ATCC 49337), Bacillus licheniformis (KCTC 1030), Lactobacillus fermentum (KCTC 3112), 및 Bacillus pseudofirmus OF4 (ATCC BAA2126)을 사용하였다.
먼저 QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN)를 이용하여 상기 균주 4종 으로부터 genomic DNA를 확보 하였다. 확보된 genomic DNA는 제한효소 Sau3A1 (NEB)을 처리하고 37℃에서 10분간 반응 후 65℃에서 30분간 반응하여 불완전한 유전자 단편을 만들고, 이를 1% 아가로스겔에 전기영동하여 5 내지 7kb의 유전자 단편만 취득하였다. 취득한 유전자 단편은 GeneAll Expin GEL SV kit (seoul, KOREA)를 이용하여 삽입용 유전자 단편을 확보하였다.
이와 같이 확보된 유전자 단편은 제한효소 BamHI-HF (NEB)를 37℃에서 1시간 반응, 37℃에서 CIP (NEB) 효소 30분 처리 후 취득한 pECCG117 vector(대한민국 등록특허 제0057684호)와 연결하고, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신 (25 mg/l)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니는 아래의 표 1의 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 조건은 95℃ 에서 10분간 변성 후, 95℃ 1분 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 4분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응으로 진행하였다.
Description 서열 (5' -> 3') 서열번호
F primer TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 1
R primer CAA TTA ACC CTC ACT AAA 2
상기 PCR 증폭된 유전자 단편을 통해 3 내지 5kb의 극한미생물 (extremophile bacteria) 유래 genomic DNA 단편이 삽입된 것을 확인하였으며, pECCG117 벡터 내 유전자 삽입율은 99% 이상이었다. 이렇게 형질전환된 콜로니를 균주 당 10000개 확보하고 plasmid prep kit (QIAGEN)를 이용하여 플라스미드를 추출하였으며, 이들 각각의 라이브러리 벡터를 p117-Lib.Bat (Bacillus atrophaeus 유래), p117-Lib.Bli (Bacillus licheniformis 유래), p117-Lib.Lfe (Lactobacillus fermentum 유래), 및 p117-Lib.Bps (Bacillus pseudofirmus OF4 유래)로 각각 명명하였다.
실시예 2: 벡터 라이브러리 도입 균주 제작 및 스크리닝
상기 실시예 1에서 제작된 라이브러리 벡터 4종 (p117-Lib.Bat, p117-Lib.Bli, p117-Lib.Lfe, 및 p117-Lib.Bps)을 라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주(대한민국 등록특허 제10-0159812호)에 전기펄스법 (Van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotecnol. 52:541-545, 1999)으로 형질전환하여, 카나마이신 (25 mg/l)이 포함된 복합평판배지에 도말하였다. 최종적으로 각 라이브러리 벡터 별로 약 5000 개의 콜로니를 확보하고, 이를 각각 LYS_Lib.Bat, LYS_Lib.Bli, LYS_Lib.Lfe, 및 LYS_Lib.Bps 라이브러리로 명명하였다. 상기 라이브러리 균주들의 대조군으로는 KCCM11016P 균주에 gDNA유래 유전자단편이 삽입되지 않은 pECCG117 벡터를 형질전환하여 사용하였으며, LYS_117 control 으로 명명하였다.
상기 사용된 복합평판배지 조성은 다음과 같다:
<복합평판배지 (pH 7.0)>
포도당 10 g, 펩톤 10 g, Beef extract 5 g, 효모추출물 5 g, Brain Heart Infusion 18.5 g, NaCl 2.5 g, 요소 2 g, Sorbitiol 91 g, 한천 20 g (증류수 1 리터 기준)
상기 확보된 4종의 KCCM11016P기반 라이브러리 균주들은 각각 400ul 스크리닝 배지가 포함된 96-Deep Well Plate-Dome (Bioneer)에 colony-picker (SINGER, PIXL)를 사용하여 접종하고, plate shaking incubator (TAITEC)에서 32℃, 12000rpm 조건으로 15hr 동안 배양하였다.
상기 사용된 종배지 조성은 다음과 같다:
<스크리닝 배지 (pH 7.0)>
포도당 45 g, 사탕무 유래 당밀 10 g, 대두 침지액 10 g, (NH4)2SO4 24 g, MgSO47H2O 0.6 g, KH2PO4 0.55 g, 요소 5.5 g, 바이오틴 0.9 mg, 티아민 HCl 4.5 mg, 칼슘-판토텐산 4.5 mg, 니코틴아미드 30 mg, MnSO4ㆍ5H2O 9 mg, ZnSO4ㆍ5H2O 0.45 mg, CuSO4ㆍ5H2O 0.45 mg, FeSO4ㆍ5H2O 9 mg, 카나마이신 25 mg (증류수 1 리터 기준)
배양 중 세포 성장은 마이크로플레이트-리더 (microplate-reader, BioTek)를 이용하여 모니터링 하였으며, 배양액 내 존재하는 포도당 농도 및 생성된 라이신의 농도는 각각 당분석기 (YSI) 및 HPLC (Shimadzu) 분석기기를 이용하여 측정하였다.
상기 실험을 통하여 최종적으로 대조군 대비 세포 성장이 우수하고, 포도당 소모속도가 빠른 균주 3종을 선별하였다 (표 2). 선별된 균주 3종은 LYS_Lib.Bps 라이브러리 벡터가 삽입된 균주였으며, 대조군 균주인 LYS_117 control 대비 수율 및 OD값은 유사하지만, 샘플링 포인트 구간의 시간당 당소모 속도(g/hr)가 LYS_117 control 100% 대비 118% 수준으로 증가하여 생산성이 우수한 것을 확인하였다.
균주 OD 600 상대 당소모 속도 36hr 라이신 수율
12hr 36hr (%) (%)
LYS_117 control 17.1 62.7 100 15.8
LYS_Lib.Bps #257 17.4 63.5 117.4 15.9
LYS_Lib.Bps #881 16.8 64.1 111.1 15.6
LYS_Lib.Bps #4213 18.1 63.8 118.0 15.8
실시예 3: gDNA 라이브러리 염기서열 분석
상기 실시예 2에서 선별된 콜로니 3종 LYS_Lib.Bps #257, #881, 및 #4213에 삽입된 유전자의 서열을 확인하기 위하여, 실시예 1의 표 1에 기재된 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용하여 상기 콜로니가 가지고 있는 gDNA 라이브러리 유전자 단편을 PCR 증폭하였다. PCR 조건은 실시예 1과 동일하게 진행하였으며, 증폭된 DNA 단편을 GeneAll Expin GEL SV kit (seoul, KOREA)를 이용하여 획득하고 염기서열 분석을 진행하였다. 분석결과는 BLAST를 통해 유전자정보를 확인하였다 (NCBI reference sequence NC_013791.2).
상기 얻어진 분석 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 유전자 염기서열 분석 결과, LYS_Lib.Bps #257 콜로니에는 4794bp, #881 콜로니에는 3985bp, 그리고 #4213 콜로니에는 4483bp 의 유전자 단편이 포함되어 있었다. 상기 3개의 콜로니에 공통적으로 포함된 완전한 유전자 ORF는 BpOF4_13735 와 BpOF4_13740으로 확인되어, 이후, 상기 두 유전자의 영향성에 대한 추가 실험을 진행하였다.
실시예 4: 개별 유전자 도입 벡터 제작 및 균주 제작
상기 실시예 3에서 확인된 유전자 2개에 대한 개별 유전자 영향성을 확인하기 위하여 게놈 삽입용 벡터를 제작하였다. 먼저 유전자 삽입을 위한 기반 벡터를 제작하기 위하여 transposase 중 하나인 Ncgl2284 유전자를 타겟으로 pDZ_Δ2284 벡터를 제작하였다.
구체적으로, PCR을 진행하기 위한 DNA 주형으로 ATCC13032 gDNA를 이용하였으며, NCBI 염기서열(NC_003450.3)을 참고하여 프라이머를 제작하였다. 서열번호 3과 4의 프라이머로 95℃ 에서 10분간 변성 후, 95℃ 1분 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응하는 조건으로 PCR을 진행하여 약 900bp의 5' DNA 단편을 얻었다. 마찬가지로 프라이머 서열번호 5와 6을 이용하여 위와 동일한 조건으로 PCR을 진행하고 3' DNA 단편을 증폭하였다. 증폭된 두 DNA 단편은 GeneAll Expin GEL SV kit (seoul, KOREA)를 이용하여 정제하고, 제한효소 XbaI (NEB)로 처리한 후 65℃에서 20분간 열처리한 pDZ (대한민국 특허 제2009-0094433호) 벡터와 Infusion Cloning Kit를 사용하여 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 상기 균주를 카나마이신 (25 mg/l)이 포합된 LB 고체배지에 도말하고 pDZ 벡터에 삽입된 유전자의 염기서열을 확인하여 최종적으로 pDZ_Δ2284 벡터를 준비하였다.
개별 유전자의 추가 강화(발현) 벡터는 상기 기반벡터 pDZ_Δ2284을 제한효소 NdeI 및 CIP (NEB)처리하고 65℃에서 20분간 열처리하여 정제 후 취득한 벡터와 프로모터, 각각의 유전자 DNA단편을 Infusion Cloning Kit로 연결하여 제작하였다. 상기 유전자 추가 발현을 위한 프로모터는 서열번호 13의 gapA 유전자 프로모터를 사용하였고, 이를 취득하기 위해 ATCC13032 gDNA(NC_003450.3)를 주형으로 프라이머 서열번호 7과 8을 이용하여 PCR 증폭을 진행하였다. PCR은 pfu polymerase를 이용하였으며, 95℃ 에서 10분간 변성 후, 95℃ 1분 변성, 55℃ 1분 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분간 중합반응하는 조건으로 진행하였다. 2개 유전자 BpOF4_13735 와 BPOF4_13740 DNA단편은 프로모터 PCR과 동일한 방법으로 진행하였으며, BpOF4_13735 유전자 (서열번호 14)를 위해서는 서열번호 9와 10의 프라이머를 사용하고, BpOF4_13740 (서열번호 15)를 위해서는 서열번호 11과 12의 프라이머를 사용하여 Bacillus pseudofirmus OF4 gDNA로부터 유전자를 증폭하였다. 이렇게 취득한 DNA 단편들은 GeneAll Expin GEL SV kit (seoul, KOREA)를 이용하여 정제하여 pDZ_Δ2284 벡터와 연결하여 2종의 벡터를 제작하였다. 최종적으로 pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13735 벡터, 및 pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13740 벡터를 제작하였다.
상기 제작된 2종의 벡터는 라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주 (대한민국 등록특허 제10-0159812호)에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 DNA-crossover를 거쳐 각각의 유전자가 강화된 균주를 제작하였다. 이와 같이 제작된 균주 2종은 KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13735, KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740 로 명명하였다.
상기 사용된 프라이머, 프로모터, BpOF4 유전자의 핵산 서열, 및 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 아래의 표 3에 정리하였다:
Description 서열 (5' → 3' or N→C) 서열번호
F primer for ATCC13032 gDNA GTACCCGGGGATCCTCTAGAATCGCAATGATAGCCCATTC 3
R primer for ATCC13032 gDNA TTGGTCAAACCTCCCCTcatatgCAGAAATCCACATCAAT 4
F primer for ATCC13032 gDNA ATTGATGTGGATTTCTGcatatgAGGGGAGGTTTGACCAA 5
R primer for ATCC13032 gDNA GCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGCATCTCTGGATGATGTG 6
F primer for gapA promoter ATTGATGTGGATTTCTGcatAAGCCTAAAAACGACCGAGC 7
R primer for gapA promoter GTTGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAG 8
F primer for BpOF4_13735 ATCTTTAGAGGAGACACAACATGGATGAAAAAAGAAAAGC 9
R primer for BpOF4_13735 TTGGTCAAACCTCCCCTcatTTAACGCCCCAGCCAAAAAATTCC 10
F primer for BpOF4_13740 ATCTTTAGAGGAGACACAACATGAAAGGAAGACCACTTTT 11
R primer for BpOF4_13740 TTGGTCAAACCTCCCCTcatTTATTCTGAAATAGATAGTA 12
gapA promoter AAGCCTAAAAACGACCGAGCCTATTGGGATTACCATTGAAGCCAGTGTGAGTTGCATCACATTGGCTTCAAATCTGAGACTTTAATTTGTGGATTCACGGGGGTGTAATGTAGTTCATAATTAACCCCATTCGGGGGAGCAGATCGTAGTGCGAACGATTTCAGGTTCGTTCCCTGCAAAAACTATTTAGCGCAAGTGTTGGAAATGCCCCCGTTTGGGGTCAATGTCCATTTTTGAATGTGTCTGTATGATTTTGCATCTGCTGCGAAATCTTTGTTTCCCCGCTAAAGTTGAGGACAGGTTGACACGGAGTTGACTCGACGAATTATCCAATGTGAGTAGGTTTGGTGCGTGAGTTGGAAAAATTCGCCATACTCGCCCTTGGGTTCTGTCAGCTCAAGAATTCTTGAGTGACCGATGCTCTGATTGACCTAACTGCTTGACACATTGCATTTCCTACAATCTTTAGAGGAGACACAAC 13
BpOF4_13735 핵산서열 ATGGATGAAAAAAGAAAAGCGATTATTATAAATGAAATTAAGTACTGGCGCGAATCAAAGCTGCTTCCCTCCCAGTATTGTGATTTCTTATTAACGCTTTATTCAGAAGGAGAGGACCTAGAGACAGCCGACTCAGGAAAGCGCTTCCGAAACATTCGGACAATCTATTCGTTTATTATTGTTCAGCTTTCATTTGTCTTTACTGCTCTTGTCATTTATTTTACTGATTTTTCAAATGGATTGCAAATGCTTATTGGTTTGACTTTTTCGATTATTGTGTTAATTATAGCAAAACGGACTAGGGCAGATGCCTTTTTTCTTAAACAATTTTACTATTTTATAGGGGCTCTGATCCTCTTTTTACTAACGATTGAATGGGTTGTTCACTACAAAAGTACTAATAACCTTTTATTATCAGCAACAATCATTTTACATTGCGTTTTTTGGCTCTTTGCAGGGCTGAAATGGAAAATGCGATTTTTTACGATATCTGCTATACTAGGACTAGTAGTGTTAGGAATTTTTTGGCTGGGGCGTTAA 14
BpOF4_13740 핵산서열 ATGAAAGGAAGACCACTTTTACCATTTGCGATCATAGCAATTGTCGGGATTGTTGTTATGATTTCGCTTTCATTTATTGGGTTAAACCAGCGTGAAGCGATGCAGGCAGATGAAGAAGGAGAAGAAGAAGTAACTGAAATTGAAGATCCGGTAGCAGCTGGAGAAGAATTAGTGCAAACTTCTTGTATCGGTTGTCACGGTGGCGATTTAAGCGGTGGTGCAGGTCCTGCCCTAACGTCTCTTGAAGGTCAATACACTCAAGAAGAAATTACAGATATTGTTGTTAATGGGATTGGATCAATGCCGTCAGTTAACGATAACGAAGTAGAAGCAGACGCAATTGCACAGTATTTACTATCTATTTCAGAATAA 15
BpOF4_13740 아미노산 서열 MKGRPLLPFAIIAIVGIVVMISLSFIGLNQREAMQADEEGEEEVTEIEDPVAAGEELVQTSCIGCHGGDLSGGAGPALTSLEGQYTQEEITDIVVNGIGSMPSVNDNEVEADAIAQYLLSISE* 16
실시예 5: 개별 유전자 삽입 균주의 라이신 생산능 분석
상기 실시예 4에서 제작된 균주 2종을 아래와 같은 방법으로 배양하여 OD, 라이신 생산 수율, 및 당소모 속도(g/hr)를 측정하였다. 먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 40 시간 동안, 150 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같으며, 배양 결과는 표 4에 나타내었다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO47H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 배지 (pH 7.0)>
포도당 45 g, 사탕무 유래 당밀 10 g, 대두 침지액 10 g, (NH4)2SO4 24 g, MgSO47H2O 0.6 g, KH2PO4 0.55 g, 요소 5.5 g, CaCO3 30 g, 바이오틴 0.9 mg, 티아민 HCl 4.5 mg, 칼슘-판토텐산 4.5 mg, 니코틴아미드 30 mg, MnSO4ㆍ5H2O 9 mg, ZnSO4ㆍ5H2O 0.45 mg, CuSO4ㆍ5H2O 0.45 mg, FeSO4ㆍ5H2O 9 mg, 카나마이신 25 mg (증류수 1 리터 기준)
개별유전자 강화 균주 OD, 라이신 생산능, 당 소모속도 측정
균주 OD 상대
당소모 속도		 FN (최종시점) 라이신 수율
FN (%) (%)
KCCM11016P 68.5 99.5 18.9
KCCM11016P_Δ2284 67.8 100 18.7
KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13735 68.3 103 18.8
KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740 69.1 131.5 18.6
gDNA 라이브러리를 통해 확보된 2개의 유전자 중 BpOF4_13735를 과발현 시킨 균주는 모균주 KCCM11016P_Δ2284 대비 라이신 수율 및 당소모 속도에서 유의미하게 향상된 효과가 나타나지 않았다. 하지만 KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740 균주는 모균주 대비 발효 최종 OD 및 수율은 유사하지만, 배양 중간 구간 (17 내지 24시간)에의 시간당 당소모 속도가 모균주 KCCM11016P_Δ2284 대비 31.5% 증가하는 결과를 확인하였다.
최종적으로 실시예 2에서 확인된 콜로니 LYS_Lib.Bps #257, #881, #4213 균주의 효과는 BpOF4_13740 강화에 의한 효과임을 확인하였다.
실시예 6: BpOF4_13740 유전자 강화 균주의 라이신 생산능 향상
상기 실시예 5에서 확인된 BpOF4_13740 유전자의 효과를 2차 검증하기 위하여, 다른 프로모터로 유전자 강화를 실시한 후 BpOF4_13740 유전자를 분석하였다. 또한, NCBI BLAST 분석으로 추가 확인된 BpOF4_05495 유전자에 대해서도 효과 확인을 진행하였다.
이를 위하여 유전자 발현 벡터를 추가로 제작하였다. 상기 실시예 3에서 제작한 벡터와 동일한 과정으로 벡터를 제작하였다:
ATCC13032 gDNA를 주형으로 서열번호 17과 18의 프라이머를 사용하여 PCR을 진행하여 sigB 프로모터를 증폭하고, Bacillus pseudofirmus OF4 gDNA를 주형으로 서열번호 19과 12의 프라이머를 사용하여 BpOF4_13740 유전자를 PCR 증폭하였다. 이 두 유전자 단편을 pDZ_Δ2284 벡터와 연결하여 pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_13740 벡터를 추가 제작하였다.
BpOF4_05495 유전자 강화도 동일한 방법으로 실시하여 pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_05495 및 pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_05495 벡터를 제작하였다. 프라이머는 서열번호 20과 21, 서열번호 22와 21을 사용하여 BpOF4_05495 유전자 단편을 확보하였다. 한편 이 두 유전자의 동시강화 효과도 확인하기 위하여, 라이보솜 부착서열 (RBS)을 삽입한 서열번호 23, 24 프라이머를 추가하여, pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495 및 pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 벡터도 제작하였다.
상기 제작된 추가 5종의 벡터 (pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_13740 벡터, pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_05495 벡터, pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_05495 벡터, pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495 벡터, 및 pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 벡터)를 라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주 (대한민국 등록특허 제10-0159812호)에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 DNA-crossover를 거쳐 각각의 유전자가 강화된 균주를 제작하였다.
이와 같이 추가 제작된 균주 5종은 KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740, KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_05495, KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_05495, KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495, 및 KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 로 각각 명명하였다.
상기 사용된 프라이머, 프로모터, BpOF4_05495 유전자의 핵산 서열 및 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 아래의 표 5에 정리하였다:
Description 서열 (5' → 3' or N→C) 서열번호
F primer for sigB promoter ATTGATGTGGATTTCTGcatTGCAGCACCTGGTGAGGTGG 17
R primer for sigB promoter AACTGGCCTCCTAAATTCGCGGTTC 18
F primer for BPOF4_13740 GCGAATTTAGGAGGCCAGTTATGAAAGGAAGACCACTTTT 19
F primer for BpOF4_05495 GCGAATTTAGGAGGCCAGTTATGAAAAAGTTTTTATTAGC 20
R primer for BpOF4_05495 TTGGTCAAACCTCCCCTcatTTATTGAGCTTCAAGCCATG 21
F primer for BpOF4_05495 ATCTTTAGAGGAGACACAACATGAAAAAGTTTTTATTAGC 22
R primer for RBS insertion CTGTGTTTCCTCCTTTCTCCTGTTATTCTGAAATAGATAGTA 23
F primer for RBS insertion CAGGAGAAAGGAGGAAACACAGATGAAAAAGTTTTTATTAGC 24
sigB promoter TGCAGCACCTGGTGAGGTGGCTGAGCCGGTGATTGAAAAGATTGCACAAGGTTTACGTGAGCGCGGAATCACCGTGGAACAAGGACGATTCGGCGCAATGATGAAGGTCACATCGGTTAACGAAGGCCCCTTCACCGTTTTGGTCGAGTGCTAGCCAGTCAATCCTAAGAGCTTGAAACGCCCCAATGTGGGGGTGTTAAGAACTCCATAAAAGCGCTTGGGAACTTTTTGTGGAAGCAGTCCGTTGAACCTCTTGAACCGCGAATTTAGGAGGCCAGTT 25
BPOF4_05495 핵산서열 ATGAAAAAGTTTTTATTAGCTCTTGGCGCAGTTGTTGCTCTTACAGCATGTGGCGGCGGAGACGAAGCTGCTCCACCGGTTGATGAGGAGTCTCCAGCAGTAGATGAAGCTCCAGCAGATGAGCCTGCAGATGATGCAACAGCTGGTGATTACGATGCAGAATCAGCTCGTGCTACATATGAGCAAAGCTGTATCGCATGTCATGGCGGCGATCTTCAAGGGGCATCAGGTCCAGCTCTAGTAGGAACTGGCCTGTCAGCTGCTGAAATTCAAGACATCATCCAAAACGGACAAGGTTCAATGCCTGCTCAAAATTTAGATGATGACGAAGCTGCTAACCTAGCTGCATGGCTTGAAGCTCAATAA 26
BPOF4_05495 아미노산 서열 MKKFLLALGAVVALTACGGGDEAAPPVDEESPAVDEAPADEPADDATAGDYDAESARATYEQSCIACHGGDLQGASGPALVGTGLSAAEIQDIIQNGQGSMPAQNLDDDEAANLAAWLEAQ 27
상기 제작된 5종의 균주, KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740, KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_05495, KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_05495, KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495, 및 KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495에 대하여 실시예 5와 동일한 조건으로 플라스크 평가를 진행하여, 그 결과를 표 6에나타내었다.
개별 및 조합 유전자 강화 균주 OD, 라이신 생산능, 당 소모속도 측정
균주 OD FN 라이신 농도 FN 라이신 수율 상대
당소모 속도
FN (g/L) % (%)
KCCM11016P 68.4 9.0 18.4 101.6
KCCM11016P_Δ2284 68.1 8.7 18.7 100
KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740 67.5 8.4 18.1 107.1
KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740 68.8 9.2 18.4 142.1
KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_05495 68.8 8.7 18.2 120.2
KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_05495 68.9 8.9 17.8 136.6
KCCM11016P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495 68.4 9.3 19.3 114.8
KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 69 9.5 19.0 145.9
BpOF4_13740 유전자를 sigB 프로모터 및 gapA 프로모터로 발현하였을 때, 대조군 KCCM11016P_Δ2284 대비 각각 7.1% 및 42.1% 의 시간당 당소모 속도 증가의 결과를 확인하였다. 또한, 유사 단백질인 BpOF4_05495 유전자를 sigB 및 gapA 프로모터로 추가 도입하였을 때도 각각 20.2%, 36.6% 의 당소모 속도 증가를 보였다. 상기 두 결과를 통해 프로모터 세기에 따른 유전자 강화 정도에 따라 당소모 속도(g/hr)가 증가함을 확인할 수 있었다. 추가적으로 상기 유전자 BpOF4_13740 및 BpOF4_05495 를 동시 발현 강화하였을 때 가장 높은 당소모 속도를 확인 하였다. 구체적으로 KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 균주의 시간당 당소모 속도는 대조군 KCCM11016P_Δ2284 대비 45.9% 향상된 효과를 보였다.
본 실시예에서 라이신 생산능 증가를 보인 KCCM11016P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 균주(Corynebacterium glutamicum CM03-885로 명명)는 2019년 12월 13일자로 대한민국 서울특별시 서대문구 홍제동에 소재하는 한국미생물보존센터에 기탁하여 KCCM12640P 의 기탁번호를 부여 받았다.
실시예 7: BpOF4_13740_05495 강화 균주의 라이신 생산능 분석
L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(대한민국등록특허 제10-0924065호) 및 KCCM11347P (대한민국 등록특허 제10-0073610호)에 각각 실시예 6에서 선별된 유전자를 강화하였다. 강화 방법으로는 실시예 6에서 실시한 방법과 동일하게 유전자 추가 도입을 진행하였으며, 최종적으로, 3종의 벡터, pDZ_Δ2284, pDZ_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495, 및 pDZ_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495을 전기펄스법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P 및 KCCM11347P 균주 2종에 각각 도입하여, KCCM10770P_Δ2284, KCCM10770P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495, KCCM10770P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495, KCCM11347P_Δ2284, KCCM11347P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495, 및 KCCM11347P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495의 6종의 균주를 제작하였다.
상기 제작된 유전자 강화 균주들은 실시예 5와 같은 방법으로 배양하여, OD, 라이신 생산 수율 및 시간당 상대 당소모 속도(각각 KCCM10770P_Δ2284 및 KCCM11347P_Δ2284의 시간당 당소모 속도 100% 기준)를 측정하고, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
유전자 강화주 OD, 라이신 생산능, 상대 당 소모속도 측정
균주 OD FN 라이신 농도 FN 라이신 수율 당소모 상대 속도
FN (g/L) (%) (%)
KCCM10770P 95.5 6.7 13.3 99.4
KCCM10770P_Δ2284 95.3 6.5 13.0 100
KCCM10770P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495 95.0 6.5 13.0 102.5
KCCM10770P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 95.9 6.3 12.7 105.6
KCCM11347P 65.0 15.1 30.2 99.4
KCCM11347P_Δ2284 64.7 15.3 30.6 100
KCCM11347P_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495 65.5 15.1 30.2 103.5
KCCM11347P_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 65.2 15.5 31.0 108.2
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 본 실시예에서 제작된 유전자 강화 균주에서 OD, FN 라이신 농도 및 라이신 생산수율 수준이 유사함에도 당소모 속도향상으로 인한 발효시간 단축의 효과를 확인하였다.
실시예 8: BpOF4_13740_05495가 도입된 CJ3P 균주 제작 및 라이신 생산능 분석
L-라이신을 생산하는 다른 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주에서도 상기와 동일한 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주에 3종의 변이[pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)]를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게 된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)를 대상으로, 실시예 7과 같은 방법으로 BpOF4_13740_05495가 강화된 균주를 제작하였다. 상기 제작된 균주는 CJ3_Δ2284, CJ3_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495, CJ3_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 으로 각각 명명하였다. 대조군인 CJ3P 균주(BpOF4_13740_05495 강화가 수행되지 않음)와 제작 균주 3종은 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 배양하여, OD, 라이신 생산 수율 및 시간당 상대 당소모 속도(각각 KCCM10770P_Δ2284 및 KCCM11347P_Δ2284의 시간당 당소모 속도 100% 기준)를 측정하고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다:
유전자 강화주 OD, 라이신 생산능, 상대 당 소모속도 측정
균주 OD FN 라이신 농도 FN 라이신 수율 상대 당소모 속도
FN (g/L) (%) (%)
CJ3 70.5 4.5 9.0 100.4
CJ3_Δ2284 71.4 4.2 8.4 100
CJ3_Δ2284::PsigB BpOF4_13740_05495 70.9 4.4 8.8 102.9
CJ3_Δ2284::PgapA BpOF4_13740_05495 71.6 4.6 9.2 160.9
표 8에 나타난 바와 같이, BpOF4_13740_05495가 강화된 균주에서 OD 값, FN 라이신 농도 및 라이신 생산수율 수준이 유사함에도 시간당 당소모 속도가 60% 이상 향상된 효과를 확인하였다.
이상, 본 명세서에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 다양한 요소들의 가능한 모든 조합이 본 명세서에서 제안되는 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 명세서의 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없으며, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 본 명세서에 기재된 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있는 한, 이러한 등가물은 본 명세서에서 제안되는 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
[규칙 제91조에 의한 정정 04.01.2021]　
Figure WO-DOC-FIGURE-139

Claims (20)

  1. 바실러스(Bacillus) 속 미생물 유래의 90 내지 150개 아미노산 길이의 사이토크롬 C의 활성이 강화된, L-아미노산 생산 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사이토크롬 C는 흡광도가 550 내지 555nm인, L-아미노산 생산 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 사이토크롬 C는 사이토크롬 c-551 및 사이토크롬 c-550로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, L-아미노산 생산 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 사이토크롬 C는 바실러스 수도피르무스 OF4 (Bacillus pseudofirmus OF4) 유래의 사이토크롬 c-551인, L-아미노산 생산 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 바실러스 수도피르무스 OF4 유래의 사이토크롬 c-551은,
    cccA에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드,
    cccB에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는
    이들 모두
    를 포함하는 것인, L-아미노산 생산 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 cccA는 서열번호 16 또는 이와 80% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 것인, L-아미노산 생산 미생물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 cccB는 서열번호 27 또는 이와 80% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 것인, L-아미노산 생산 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 사이토크롬 C 활성이 강화되지 않은 동종의 비변형 미생물과 비교하여 당 소모 속도가 증가된, L-아미노산 생산 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물인, L-아미노산 생산 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토크롬 C 활성이 강화되지 않은 동종의 비변형 미생물과 비교하여, L-아미노산 생산능이 증가된, L-아미노산 생산 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신인, L-아미노산 생산 미생물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 L-아미노산 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및
    상기 배양된 미생물, 배지, 또는 이들 모두로부터 L-아미노산을 회수하는 단계
    를 포함하는, L-아미노산의 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신인, L-아미노산의 생산 방법.
  14. 바실러스 속 미생물 유래의 사이토크롬 c-551 및 사이토크롬 c-550로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 사이토크롬 C를 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 세포를 포함하는, L-아미노산 생산용 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 사이토크롬 C는 바실러스 수도피르무스 OF4 유래의 사이토크롬 c-551인, L-아미노산 생산용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 바실러스 수도피르무스 OF4 유래의 사이토크롬 c-551은,
    cccA에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드,
    cccB에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 또는
    이들 모두
    를 포함하는 것인, L-아미노산 생산용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 cccA는 서열번호 16 또는 이와 80% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 것인, L-아미노산 생산용 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 cccA는 서열번호 27 또는 이와 80% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 암호화하는 것인, L-아미노산 생산용 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 코리네박테리움 속 또는 에스케리키아 속 미생물에서 L-아미노산을 생산하는 것인, L-아미노산 생산용 조성물.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L-아미노산은 L-라이신인, L-아미노산 생산용 조성물.
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US17/605,671 US20220275412A1 (en) 2019-12-23 2020-12-22 Microorganism for producing l-amino acid having increased cytochrome c activity, and l-amino acid production method using same
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BR112021025900A BR112021025900A2 (pt) 2019-12-23 2020-12-22 Microrganismo para produção de l-aminoácido tendo atividade do citocromo c aumentada, e método de produção de l-aminoácido usando o mesmo
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AU2020414201A AU2020414201B2 (en) 2019-12-23 2020-12-22 Microorganism for producing L-amino acid having increased cytochrome C activity, and L-amino acid production method using same
MX2022003709A MX2022003709A (es) 2019-12-23 2020-12-22 Microorganismo productor de l-aminoacidos que tiene actividad de citocromo c potenciada y metodo para producir l-aminoacidos utilizando el mismo.
JP2022506836A JP7362895B2 (ja) 2019-12-23 2020-12-22 シトクロムｃの活性が強化されたｌ－アミノ酸生産微生物およびこれを用いたｌ－アミノ酸の生産方法
ZA2021/08637A ZA202108637B (en) 2019-12-23 2021-11-04 Microorganism for producing l-amino acid having increased cytochrome c activity, and l-amino acid production method using same

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Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
US20020048795A1 (en) * 2000-09-14 2002-04-25 Mike Farwick Nucleotide sequences coding for the ccsB gene
US20040014180A1 (en) * 2000-09-14 2004-01-22 Michael Bott Method for the microbial production of metabolic products, polynucleotides from coryneform bacteria and use thereof
WO2006065095A1 (en) 2004-12-16 2006-06-22 Cj Corporation Novel promoter nucleic acid derived from corynebacterium genus bacteria, expression cassette comprising the promoter and vector comprising the cassette, host cell comprising the vector and method for expressing a gene using the cell
EP2067864A1 (en) * 2000-07-05 2009-06-10 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine utilizing microorganism
WO2009096689A2 (ko) 2008-01-28 2009-08-06 Cj Cheiljedang Corporation 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR20090094433A (ko) 2006-11-10 2009-09-07 쇼와 덴코 가부시키가이샤 가공성이 우수한 내마모성 알루미늄 합금재 및 그 제조 방법
KR100924065B1 (ko) 2006-09-15 2009-10-27 씨제이제일제당 (주) Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 ｌ－라이신 생산 방법
KR102134375B1 (ko) * 2019-12-23 2020-07-15 씨제이제일제당 (주) 사이토크롬 c 활성이 강화된 l-라이신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0869175B1 (en) * 1997-04-04 2011-03-09 DSM IP Assets B.V. Cytochrome C and its gene
KR20130082124A (ko) * 2012-01-10 2013-07-18 씨제이제일제당 (주) 자일로즈 이용능이 부여된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산방법
KR101594156B1 (ko) 2013-06-25 2016-02-15 씨제이제일제당 주식회사 Ｌ-라이신 생산능이 향상된 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법
KR101863456B1 (ko) 2016-11-15 2018-06-01 씨제이제일제당 (주) L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 생산방법
KR20210080975A (ko) * 2019-12-23 2021-07-01 씨제이제일제당 (주) 사이토크롬 c 활성이 강화된 l-라이신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
EP2067864A1 (en) * 2000-07-05 2009-06-10 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing L-lysine utilizing microorganism
US20020048795A1 (en) * 2000-09-14 2002-04-25 Mike Farwick Nucleotide sequences coding for the ccsB gene
US20040014180A1 (en) * 2000-09-14 2004-01-22 Michael Bott Method for the microbial production of metabolic products, polynucleotides from coryneform bacteria and use thereof
WO2006065095A1 (en) 2004-12-16 2006-06-22 Cj Corporation Novel promoter nucleic acid derived from corynebacterium genus bacteria, expression cassette comprising the promoter and vector comprising the cassette, host cell comprising the vector and method for expressing a gene using the cell
KR100924065B1 (ko) 2006-09-15 2009-10-27 씨제이제일제당 (주) Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 ｌ－라이신 생산 방법
KR20090094433A (ko) 2006-11-10 2009-09-07 쇼와 덴코 가부시키가이샤 가공성이 우수한 내마모성 알루미늄 합금재 및 그 제조 방법
WO2009096689A2 (ko) 2008-01-28 2009-08-06 Cj Cheiljedang Corporation 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR102134375B1 (ko) * 2019-12-23 2020-07-15 씨제이제일제당 (주) 사이토크롬 c 활성이 강화된 l-라이신 생산 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"NCBI", Database accession no. NC_003450.3
BINDER ET AL., GENOME BIOLOGY, vol. 13, 2012, pages R40
DATABASE PROTEIN 30 January 2014 (2014-01-30), ANONYMOUS: "cytochrome c551 [Bacillus pseudofirmus OF4]", XP055824756, retrieved from GENBANK Database accession no. ADC49161 *
DATABASE PROTEIN 30-01-2014, ANONYMOUS: "cytochrome c551 [Bacillus pseudofirmus OF4]", XP055824751, retrieved from GENBANK Database accession no. ADC50799 *
KABUS ARMIN, NIEBISCH AXEL, BOTT MICHAEL: "ABSTRACT", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 73, no. 3, 1 February 2007 (2007-02-01), US, pages 861 - 868, XP055824759, ISSN: 0099-2240, DOI: 10.1128/AEM.01818-06 *
KARLINALTSCHUL, PRO. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 5873
PEARSON, METHODS ENZYMOL., vol. 183, 1990, pages 63
See also references of EP4083064A4
VAN DER REST ET AL., APPL. MICROBIOL. BIOTECNOL., vol. 52, 1999, pages 541 - 545

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