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WO2021112597A1 - 솔루블 vegfr-1 변이체 cdna를 함유하는 raav를 포함하는 당뇨망막병증 치료용 조성물 - Google Patents

솔루블 vegfr-1 변이체 cdna를 함유하는 raav를 포함하는 당뇨망막병증 치료용 조성물 Download PDF

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WO2021112597A1
WO2021112597A1 PCT/KR2020/017570 KR2020017570W WO2021112597A1 WO 2021112597 A1 WO2021112597 A1 WO 2021112597A1 KR 2020017570 W KR2020017570 W KR 2020017570W WO 2021112597 A1 WO2021112597 A1 WO 2021112597A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
diabetic retinopathy
svegfrv
raav2
vector
present
Prior art date
Application number
PCT/KR2020/017570
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이현승
박기랑
이영일
Original Assignee
주식회사 씨드모젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 씨드모젠 filed Critical 주식회사 씨드모젠
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Priority to US17/781,960 priority patent/US20230024569A1/en
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    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
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    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of diabetic retinopathy, and more particularly, to a pharmaceutical composition for the treatment of diabetic retinopathy comprising a recombinant vector containing a soluble VEGF receptor mutant cDNA.
  • Diabetic retinopathy is one of the three major diseases of the retina along with glaucoma and macular degeneration.
  • Diabetic retinopathy is a retinal disease caused by high blood sugar, in which retinal blood vessel degeneration is induced, retinal edema, exudate deposition and bleeding due to vascular leakage, and retinal nerve cell degeneration occur.
  • Diabetic retinopathy is divided into proliferative diabetic retinopathy and non-proliferative diabetic retinopathy, and there is Diabetic macular edema.
  • retinopathy mainly used to treat retinal edema and proliferative retinopathy.
  • Retinal edema is treated by injection of anti-VEGF, and when there is blood vessel proliferation and bleeding, photocoagulation using laser is performed.
  • gene therapy is a method of treating diseases by gene delivery and expression, and unlike drug therapy, it is a treatment to correct a genetic defect by targeting a specific gene with a disorder.
  • the ultimate goal of gene therapy is to genetically modify living cells to obtain beneficial therapeutic effects.
  • the treatment has the advantages of accurate delivery of genetic factors to the diseased site, complete degradation in vivo, absence of toxicity and immune antigenicity, and long-term stable expression of genetic factors, so it is the best method for treating diseases. It is gaining popularity as a treatment.
  • Gene therapy includes a method of introducing a gene having a therapeutic effect on a specific disease, enhancing the resistance function of normal cells to exhibit resistance to anticancer drugs, etc., or replacing a modified or lost gene in patients with various hereditary diseases.
  • in vivo gene therapy is to directly inject a therapeutic gene into the body
  • ex vivo gene therapy primarily involves culturing target cells in vitro, introducing the gene into these cells, and then reintroducing the genetically modified cells. to be injected into the body.
  • ex vivo gene therapy is more used than in vivo gene therapy.
  • Gene transfer technology is largely a method using a virus as a transporter (viral vector-based transfer method), a non-viral delivery method using synthetic phospholipids or synthetic cationic polymers, and a temporary electrical stimulation to the cell membrane. It can be classified by a physical method such as electroporation, which introduces a gene by adding it.
  • viruses used as viral carriers or viral vectors include RNA viral vectors (retroviral vectors, lentiviral vectors, etc.) and DNA viral vectors (adenovirus vectors, adeno-associated viral vectors, etc.),
  • RNA viral vectors retroviral vectors, lentiviral vectors, etc.
  • DNA viral vectors adenovirus vectors, adeno-associated viral vectors, etc.
  • herpes simplex viral vectors vaccinia virus vectors, alpha viral vectors, and the like.
  • adenovirus as a cloning vector (cloning vector) has several advantages, it can be replicated in the cell nucleus with a medium size, is clinically non-toxic, stable even when inserting foreign genes , it can transform eukaryotes without rearrangement or loss of genes, and is stable and expressed at a high level even when integrated into host cell chromosomes.
  • Good host cells for adenoviruses are those responsible for human hematopoietic, lymphoid, and myeloma.
  • it since it is linear DNA, it is difficult to multiply, it is not easy to recover an infected virus, and the infection rate of the virus is low.
  • the expression of the transferred gene is greatest after 1 to 2 weeks, and in some cells, the expression is maintained for only 3 to 4 weeks. Also problematic is that it has high immunogenicity.
  • Adeno-associated virus has recently been favored because it has many advantages as a gene therapy agent while being able to overcome the above problems.
  • AAV is a single-stranded provirus, which requires an auxiliary virus to replicate, and the AAV genome is 4,680 bp, which can be inserted into a specific site on chromosome 19 of an infected cell.
  • the trans-gene is inserted into plasmid DNA linked by two inverted terminal repeat (ITR) sequence portions of 145 bp each and a signal sequence portion.
  • ITR inverted terminal repeat
  • adenovirus which is absolutely necessary for AAV amplification, is directly added as a helper virus, It is added in the form of a separate plasmid containing adenovirus genes (E1, E4, VA RNA genes) that play an important function in amplification.
  • AAV has the advantage of having a wide range of host cells to deliver genes, few immune side effects upon repeated administration, and maintaining the gene expression period for several years. Moreover, the AAV genome is safe to integrate into the host cell's chromosomes and does not alter or rearrange the host's gene expression.
  • vascular endothelial growth factor acts by binding to a pair of fms-like tyrosine kinase receptors Flt-1 and KDR/Flk-1, and interaction with the latter is an angiogenic process.
  • Soluble Flt-1 sFLT-1
  • sFLT-1 Soluble Flt-1
  • sFlt-1 directly binds to VEGF with high affinity, preventing VEGF from interacting with KDR/Flk-1, thereby exhibiting anti-VEGF activity (anti-angiogenic activity)
  • sFlt-1 also binds with KDR/Flk-1 itself to form an inactive heterodimer. Since this anti-VEGF activity functions as an anti-angiogenic activity, an antibody and a fusion protein using anti-VEGF activity are currently used as a treatment for retinal degeneration (Sim ⁇ et al., Diabetes Care , 37:893). , 2014), Lucentis (Ranibizumab, Lucentis) developed by Genentech and sold by Novartis, Eylea (Aflibercept, Eylea) developed by Regeneron Pharmaceuticals, and Avastin (Bevacizumab, Avastin). However, these protein therapeutics need to be injected into the eye once every 1-2 months, and the side effects are serious.
  • the present inventors made diligent efforts to develop a therapeutic agent that can treat diabetic retinopathy with only a single administration.
  • the present inventors developed a solvable VEGF receptor variant including a new region rather than the naturally occurring solvable VEGF receptor studied so far, adeno-attached
  • AAV adeno-associated viral vector
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating or preventing diabetic retinopathy, comprising administering a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA).
  • Another object of the present invention is to provide the use of a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA) for the treatment or prevention of diabetic retinopathy.
  • sVEGFRv-1 cDNA soluble VEGF receptor mutant cDNA
  • Another object of the present invention is to provide the use of a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA) for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of diabetic retinopathy.
  • sVEGF receptor mutant cDNA sVEGFRv-1 cDNA
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing diabetic retinopathy comprising a recombinant vector containing a solvable VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA).
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing diabetic retinopathy comprising a recombinant vector containing a solvable VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA).
  • the present invention also provides a method for treating or preventing diabetic retinopathy comprising administering a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA).
  • the present invention also provides the use of a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA) for the treatment or prevention of diabetic retinopathy.
  • sVEGFRv-1 cDNA soluble VEGF receptor mutant cDNA
  • the present invention also provides the use of a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA) for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of diabetic retinopathy.
  • a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA sVEGFRv-1 cDNA
  • FIG. 1 shows the composition of the soluble VEGF receptor mutant inserted into rAAV2-sVEGFRv-1 used in the present invention in comparison with sFlt-1, which is a naturally occurring solvable VEGF receptor.
  • FIG. 2 is a photograph confirming the expression of the solvable VEGF receptor variant in the eye after rAAV2-sVEGFRv-1 used in the present invention was injected into the eye (A) and a graph measuring the amount of the soluble VEGF receptor variant secreted into the vitreous (B) is shown.
  • Figure 3 shows a photograph (A) and an analysis graph (B) of observing retinal vascular leakage using Dextran-FITC in a diabetic retinopathy mouse model, a control group, a positive control group, and a group administered with rAAV2-sVEGFRv-1. Retinal photographs indicate that vascular leakage was inhibited by administration of rAAV2-sVEGFRv-1.
  • Figure 4 shows the TUNEL staining photograph (A) and the analysis graph (B) for observing retinal nerve cell degeneration in diabetic retinopathy mouse model, as a photograph of the retina of the control group, the positive control group and the group administered with rAAV2-sVEGFRv-1. It shows that the degeneration of retinal neurons was inhibited compared to the control by administration of rAAV2-sVEGFRv-1.
  • Figure 5 shows the Neu N staining photograph (A) and analysis graph (B) for observing retinal ganglion cells in a diabetic retinopathy mouse model, and a photograph of the retina of the negative control group, positive control group and rAAV2-sVEGFRv-1 administered group. This indicates that the degeneration of retinal ganglion cells was inhibited compared to the control group by administration of rAAV2-sVEGFRv-1.
  • FIG. 6 is a GFAP staining photograph (A) and analysis graph (B) for observing glial cell activity in a diabetic retinopathy mouse model, as a photograph of the retina of a control group, a positive control group and a group administered with rAAV2-sVEGFRv-1.
  • the administration of rAAV-sVEGFRv-1 showed a decrease in GFAP staining compared to the control group, and the effect of inhibiting glial cell activity by administration of a therapeutic vector.
  • FIG. 7 shows a photograph of retinal blood vessels separated for observation of retinal blood vessel degeneration in a mouse model of diabetic retinopathy (A) and an analysis graph (B), and a photograph of the retina of a control group, a positive control group, and a group administered with rAAV2-sVEGFRv-1
  • A diabetic retinopathy
  • B analysis graph
  • FIG. 8 is a photograph (A) and an analysis graph (B) showing the degeneration and protective effect of retinal tissue after staining the retinal tissue in a diabetic retinopathy mouse model, a control group, a positive control group and rAAV2-sVEGFRv-1 administered
  • the retinal photograph of the group indicates that the thickness of the retinal tissue is thicker than that of the control group by administration of rAAV2-sVEGFRv-1, and the protective effect on retinal nerves by administration of rAAV2-sVEGFRv-1 can be confirmed.
  • VEGF vascular leakage, degeneration of nerve cells, and new blood vessels are induced by the action of VEGF induced by hyperglycemia.
  • a therapeutic gene was loaded into recombinant adeno-associated virus (AAV), and a therapeutic agent was developed to deliver the therapeutic gene to the retina, and it was confirmed using an animal model.
  • AAV adeno-associated virus
  • a solvable VEGFR-1 mutant therapeutic gene is mounted on a recombinant adeno-associated virus (AAV) to block the activity of VEGF in the retina.
  • AAV adeno-associated virus
  • rAAV2-Soluble VEGFRv-1 rAAV2-sVEGFRv-1
  • rAAV2-sVEGFRv-1 a gene therapy candidate
  • the rAAV2-Soluble VEGFRv-1 gene therapy had excellent efficacy compared to the therapeutic efficacy of the existing antibody-based drugs, Avastin and Bevacizumab.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of diabetic reticulopathy comprising a recombinant vector containing a soluble VEGF receptor mutant cDNA.
  • Soluble VEGF receptor mutant cDNA used in the present invention is a fragment of spanning nucleotide positions 282-2253 in the human vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)1 gene (XM_017020485.1, NCBI reference sequence, NIH), with a total size of 1,972bp ( SEQ ID NO: 1), and the amino acid is expressed from the 5th base of SEQ ID NO: 1, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the solvable VEGF receptor variant is a variant having 6 immunoglobulin-like domains having a binding site for VEGF and PIGF and 31 N-terminus identical to FLT-1, a naturally occurring variant of FLT-1.
  • sFLT-1 which has 6 immunoglobulin-like domains and a tail composed of 37 amino acids different from FLT-1, has a different composition of variants (Kendall, RL and Thomas, KA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705-10709, 1993).
  • the recombinant vector may be characterized as an adeno-associated virus, preferably rAAV2 or other serotype rAAV.
  • pAAV-F containing a CMV promoter, SV40 polyadenylation signal and two ITRs to construct rAAV2-sVEGFRv-1, a recombinant vector containing a solvable VEGF receptor mutant (sVEGFRv-1) cDNA.
  • IX cis plasmid US Patent No.
  • HEK293 cells were collected and sonicated, and the recombinant AAV (rAAV) particles were subjected to CsCl density gradient centrifugation twice repeatedly, so that the RI (Refractive Index) was 1.37 to 1.42 in the first phase. g/mL, and in the second, 1.35 to 1.43 g/mL was collected and purified to obtain a rAAV2-sVEGFRv-1 vector.
  • rAAV Refractive Index
  • the composition for the treatment of diabetic retinopathy of the present invention has side effects such as pain and injection-induced eye damage and infection, which is a problem with the existing anti-VEGF (anti-VEGF) treatment agents, which are repeated monthly intraocular injections, It is an AAV-based gene therapy that can overcome high treatment costs.
  • anti-VEGF anti-VEGF
  • rAAV2-sVEGFRv-1 vascular leakage inhibitory effect of rAAV2-sVEGFRv-1, inhibition of retinal nerve cell degeneration, glial cell activity inhibition, and retinal vascular regression were inhibited, so that rAAV2-sVEGFRv-1 of the present invention is known as a therapeutic agent for diabetic retinopathy. It was confirmed that the treatment effect was similar to that of bevacizumab.
  • the rAAV2-sVEGFRv-1 of the present invention does not need to be directly injected into the eye every month, such as bevacizumab (Avastin), ranibizumab (Ranibizumab, Lucentis), etc., and continuous treatment for 2-3 years with a single injection There are advantages to being effective.
  • composition of the present invention may be characterized in administration once / 2 to 3 years.
  • the composition for treating diabetic retinopathy may be prepared as an injection formulation, and in the case of the injection formulation, Ethyl oleate, Polyvinylpyrrolidone (PVP10), Ganglioside Sodium L-lactate, Zinc chloride and Sucrose are selected from the group consisting of It may be characterized in that it additionally contains a stabilizer that is used, and in a preferred embodiment, Ethyl oleate 10mg/ml, PVP10 1mg/ml, GM1 0.1mg/ml, Sodium L-lactate 1mg in HEPES buffer (20mM, pH 7.4) /ml, Zinc chloride 0.1mg/ml, Sucrose 10mg/ml can be used.
  • Ethyl oleate, Polyvinylpyrrolidone (PVP10), Ganglioside Sodium L-lactate, Zinc chloride and Sucrose are selected from the group consisting of It may be characterized in that it additionally contains a stabilize
  • the rAAV2-sVEGFRv-1 vector may be administered at 1x10 5 ⁇ 1x10 10 vg/eye, preferably, at 1x10 8 ⁇ 1x10 10 vg/eye, more preferably 1x10 8 It can be administered at ⁇ 1x10 9 vg/eye.
  • the present invention also relates to a method for treating or preventing diabetic retinopathy, comprising administering a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA).
  • the present invention relates to the use of a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA) for the treatment or prevention of diabetic retinopathy.
  • sVEGFRv-1 cDNA soluble VEGF receptor mutant cDNA
  • the present invention relates to the use of a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA) for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of diabetic retinopathy.
  • a recombinant vector containing the soluble VEGF receptor mutant cDNA sVEGFRv-1 cDNA
  • the carrier used in the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant and vehicle, and is collectively referred to as a “pharmaceutically acceptable carrier”.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, ion exchange, alumina, aluminum stearate, lecithin, serum proteins (eg, human serum albumin), buffer substances (eg, Several phosphates, glycine, sorbic acid, potassium sorbate, partial glyceride mixtures of saturated vegetable fatty acids), water, salts or electrolytes (e.g.
  • protamine sulfate disodium hydrogen phosphate, potassium hydrogen phosphate, sodium chloride and zinc salts
  • colloidal silica magnesium trisilicate
  • polyvinyl pyrrolidone polyvinyl pyrrolidone
  • cellulose-based substrates polyethylene glycol, sodium carboxymethylcellulose, polyarylate, waxes, polyethylene-polyoxypropylene-barrier polymers, polyethylene glycol and wool paper and the like.
  • the therapeutic composition of the present invention is preferably administered parenterally.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of a sterile injectable preparation as a sterile injectable aqueous or oleaginous suspension.
  • suspensions may be formulated according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents (eg, Tween 80) and suspending agents.
  • the sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension (eg, a solution in 1,3-butanediol) in a non-toxic parenterally acceptable diluent or solvent.
  • Vehicles and solvents that can be used permissibly include mannitol, water, Ringel's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • sterile, non-volatile oils may conventionally be employed as the solvent or suspending medium.
  • any non-volatile, less irritating oil may be used, including synthetic mono or diglycerides.
  • Fatty acids, such as oleic acid and its glyceride derivatives, can be used in injectable formulations as well as pharmaceutically acceptable natural oils (eg olive oil or castor oil), especially their polyoxyethylated ones.
  • composition of the present invention may be mixed with conventional anti-inflammatory agents or mixed with matrix metalloprotease inhibitors, lipoxygenase inhibitors and inhibitors of cytokines other than IL-1 ⁇ .
  • the compositions of the present invention may also contain immunomodulatory agents (eg, bropyrimine, anti-human alpha interferon antibody, IL-2, GM-CSF, methionine enkephalin, interferon) to prevent or combat IL-1 mediated disease symptoms such as inflammation. alpha, diethyldithiocarbamate, tumor necrosis factor, naltrexone and rEPO) or prostaglandins.
  • the compositions of the present invention are administered in combination with other therapeutic agents, they may be administered to the patient sequentially or simultaneously.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be made by mixing the composition of formula (1) with the other therapeutic or prophylactic agents described above.
  • the amount of antibody that may be combined with the carrier materials to form a single dosage form will vary depending upon the host treated and the particular mode of administration.
  • a particular effective amount for a particular patient may vary depending on the activity of the particular compound used, age, weight, general health, sex, diet, administration time, route of administration, excretion rate, drug formulation, and the severity of the particular disease to be prevented or treated. It will be appreciated that this may vary depending on factors.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, and suspensions.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared as an aqueous solution.
  • a physically suitable buffer solution such as Hank's solution, Ringer's solution or physically buffered saline may be used.
  • Aqueous injection suspensions may contain a substrate capable of increasing the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol or dextran.
  • suspensions of the active ingredient may be prepared as suitable oily injection suspensions.
  • Suitable lipophilic solvents or carriers include fatty acids such as sesame oil or synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate, triglycerides or liposomes. Polycationic non-lipid amino polymers can also be used as carriers.
  • the suspension may use suitable stabilizers or agents to increase the solubility of the compound and to prepare solutions of high concentration.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of the above diseases are improved or cured by administration of a pharmaceutical composition containing a recombinant vector containing a soluble VEGF receptor mutant cDNA (sVEGFRv-1 cDNA). .
  • vector means a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to suitable regulatory sequences capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • a vector may be a plasmid, a phage particle, or simply a potential genomic insert. Upon transformation into an appropriate host, the vector may replicate and function independently of the host genome, or in some cases may be integrated into the genome itself. Since a plasmid is currently the most commonly used form of vector, “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use a plasmid vector.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) an initiation point of replication that allows efficient replication to include hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) a selection of host cells transformed with the plasmid vector. It has a structure including an antibiotic resistance gene and (c) a restriction enzyme cleavage site into which a foreign DNA fragment can be inserted. Even if an appropriate restriction enzyme cleavage site does not exist, the vector and foreign DNA can be easily ligated by using a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to a conventional method.
  • the vector should be transformed into an appropriate host cell.
  • the preferred host cell is a prokaryotic cell.
  • Suitable prokaryotic host cells include E. coli DH5 ⁇ , E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue (Stratagene), E. coli B, E. coli B21, etc. includes However, E. coli strains such as FMB101, NM522, NM538 and NM539 and other prokaryotic species and genera may also be used. In addition to the aforementioned E.
  • strains of the genus Agrobacterium such as Agrobacterium A4, bacilli such as Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium or Serratia marcescens) and other Enterobacteriaceae and various Pseudomonas genus strains can be used as host cells.
  • Transformation of prokaryotic cells can be readily accomplished using the calcium chloride method described in section 1.82 of Sambrook et al., supra. Alternatively, electroporation (Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) can also be used to transform these cells.
  • expression control sequence refers to a DNA sequence essential for the expression of an operably linked coding sequence in a specific host organism.
  • regulatory sequences include promoters for effecting transcription, optional operator sequences for regulating such transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosome binding sites, and sequences regulating the termination of transcription and translation.
  • regulatory sequences suitable for prokaryotes include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site.
  • Eukaryotic cells include promoters, polyadenylation signals and enhancers. The factor most affecting the amount of expression of a gene in a plasmid is a promoter.
  • the SR ⁇ promoter As a promoter for high expression, the SR ⁇ promoter, a cytomegalovirus-derived promoter, etc. are preferably used.
  • any of a wide variety of expression control sequences can be used in the vector.
  • Useful expression control sequences include, for example, early and late promoters of SV40 or adenovirus, lac system, trp system, TAC or TRC system, T3 and T7 promoters, major operator and promoter region of phage lambda, fd coding protein Regulatory region of, promoters for 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, promoters of said phosphatase, such as Pho5, promoters of yeast alpha-crossing systems and gene expression in prokaryotic or eukaryotic cells or viruses Other sequences known to modulate and various combinations thereof are included.
  • the T7 promoter can be usefully used to express the protein of the present invention in E. coli.
  • a nucleic acid is "operably linked" when it is placed into a functional relationship with another nucleic acid sequence. It can be a gene and regulatory sequence(s) linked in such a way that a suitable molecule (eg, a transcriptional activation protein) allows gene expression when bound to the regulatory sequence(s).
  • a suitable molecule eg, a transcriptional activation protein
  • DNA for a pre-sequence or secretion leader is operably linked to DNA for a polypeptide when expressed as a preprotein that participates in secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; or the ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it affects transcription of the sequence; or the ribosome binding site is operably linked to a coding sequence when positioned to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the linked DNA sequences are in contact and, in the case of a secretory leader, in contact and in reading frame. However, the enhancer does not need to be in contact. Linking of these sequences is accomplished by ligation (ligation) at convenient restriction enzyme sites. When such a site does not exist, a synthetic oligonucleotide adapter or linker according to a conventional method is used.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not found naturally in a host cell.
  • An expression vector once in the host cell, can replicate independently of the host chromosomal DNA and several copies of the vector and its inserted (heterologous) DNA can be produced.
  • the gene in order to increase the expression level of a transfected gene in a host cell, the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the selected expression host.
  • the expression control sequence and the corresponding gene are included in one expression vector including the bacterial selection marker and the replication origin.
  • a host cell transformed or transfected with the above-described expression vector constitutes another aspect of the present invention.
  • transformation refers to the introduction of DNA into a host such that the DNA becomes capable of replication either as an extrachromosomal factor or by chromosomal integrity.
  • transfection means that an expression vector is accepted by a host cell, whether or not any coding sequence is actually expressed.
  • Soluble VEGF receptor-1 mutant (sVEGFRv-1) was designed using the human vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)1 gene (XM_017020485.1, NCBI reference sequence, NIH).
  • sVEGFRv-1 of the present invention is a variant having 6 immunoglobulin-like domains having a binding site with VEGF and PIGF and 31 N-terminal points identical to those of FLT-1, and the naturally occurring FLT-1
  • the variant FLT-1s has 6 immunoglobulin-like domains and a tail composed of 37 amino acids that is different from FLT-1, and thus the variants are different from each other (Kendall, RL and Thomas, KA. Proc. Natl. Acad). (Sci. USA 90, 10705-10709, 1993).
  • sVEGFRv-1 spanning nucleotide positions 282-2253 (total of pAAV-F.IX cis plasmid (US Pat. No. 6,093,392) containing the CMV promoter, SV40 polyadenylation signal and two ITRs) 1972bp: SEQ ID NO: 1) was inserted.
  • rAAV2-GFP the GFP gene was inserted into the same plasmid.
  • the sVEGFRv-1 insertion fragment was prepared by PCR using the following primer pair.
  • sVEGFRv-1 F1 AAGGTACCGC CACCATGGTCAGCTACTGGGACA (SEQ ID NO: 3)
  • sVEGFRv-1 R3 CGCTCGAGCTA TCTGATTGTAATTTCTTTCTTCTG (SEQ ID NO: 4)
  • AAV rep-cap plasmid DNA pAAV-R2C2 plasmid, Stratagene Co., USA
  • pHelper plasmid adenovirus helper plasmid, Stratagene Co., USA
  • All of the above three types of plasmid DNA were transfected into HEK293 (human embryonic kidney 293; ATCC CRL-1573) cells, and then cultured for 72 hours.
  • rAAV recombinant AAV
  • rAAV2-sVEGFRv-1 After administering rAAV2-sVEGFRv-1 to the eyes of normal mice (C57BL, 6-7 weeks old) by intra-vitreal (IV) injection at 5x10 7 vg/eye, the eyes were removed a week later. And, the retina was made a tissue sample and immunostaining was performed for the human solvable VEGF receptor to confirm the expression of the therapeutic gene, and the antibody used for immunostaining was anti-human VEGF receptor (Anti-Human VEGF-R1/FLT). , purified - monoclonal antibody, Invitrogen) was used.
  • the vitreous body was isolated and confirmed by performing ELISA (Quantikine ELISA Human VEGF R1/Flt-1 Immunoassay, SVR100C, R&D SYSTEMS) for human soluble VEGF receptors.
  • ELISA Quantikine ELISA Human VEGF R1/Flt-1 Immunoassay, SVR100C, R&D SYSTEMS
  • SVR100C Human VEGF R1/Flt-1 Immunoassay
  • R&D SYSTEMS ELISA
  • the results are shown in FIG. 2 .
  • Example 3 Confirmation of vascular leakage inhibitory effect in diabetic retinopathy model using Dextran-FITC
  • Example 1 An animal model of diabetic retinopathy for observing the in vivo therapeutic effect of rAAV2-sVEGFRv-1 prepared in Example 1 was prepared as follows.
  • mice In mice (C57BL, 6-7 weeks of age), streptozotocin was prepared with 0.1 M citrate buffer at a concentration of 150 mg/kg and injected once by intraperitoneal administration. An animal model evaluated as (300 or more with a blood glucose meter) was used, and 4 weeks after streptozotocin injection, 5x10 7 vg/eye dose of rAAV2-sVEGFRv-1 was administered to both eyes in an intra-vitreal (IV) injection method. The therapeutic effect on diabetic retinopathy in diabetic-induced disease animals was analyzed.
  • retinal vascular leakage was analyzed by fluorescence fundus imaging. Briefly, dextran-FITC was injected intraperitoneally for vascular leakage in the retina, the eyeball was removed, and then the retina was separated and spread on a glass slide and placed on a cover glass. was covered and observed under a fluorescence microscope to compare and analyze the treatment effect in the control group and the treatment vector administration group.
  • Substance and rAAV2-sVEGFRv-1 treatment vector group were administered intraocularly to confirm vascular leakage As shown in Figure 3, 1.94 ⁇ 0.19 in the control group (Sham) compared to the normal (Normal) group, GFP vector administration group (GFP) was observed to be 1.93 ⁇ 0.2, in the rAAV2-sVEGFRv-1 treatment vector group, 1.11 ⁇ 0.12, and in the Avastin (Bevacizumab) treatment group, 1.17 ⁇ 0.09, compared to the control group (Sham, GFP), the rAAV2-sVEGFRv-1 treatment vector It was confirmed that vascular leakage was inhibited by the administration of (p ⁇ 0.01).
  • Example 4 Observation of retinal nerve cell degeneration in hyperglycemic diabetic retinopathy model
  • Example 2 Observation of retinal nerve cell degeneration in the hyperglycemic-induced diabetic retinopathy mouse model by the method of Example 2 was performed after injection of the therapeutic vector rAAV2-sVEGFRv-1 therapeutic vector, and after a certain period of time, such as 1 month, the eyes were removed and then frozen sections were used. produced and observed. For observation of apoptosis, dying cells were stained using TUNEL staining.
  • Example 5 Preservation of retinal ganglion cells and observation of glial cell activity in retinal degeneration caused by hyperglycemia
  • retinal degeneration in the hyperglycemic-induced diabetic retinopathy mouse model In order to confirm retinal degeneration in the hyperglycemic-induced diabetic retinopathy mouse model by the method of Example 2, the survival of retinal ganglion cells and activity of glial cells were observed. Retinal neural sperm cells were identified using Neu N antibody, and glial cells were observed using immunostaining using GFAP antibody. For the staining of Neu N and GFAP, cryosectioned retinal tissue was used, and after immunostaining, it was observed with a fluorescence microscope.
  • Example 6 Separation of retinal blood vessels for observing retinal blood vessel degeneration
  • retinal blood vessels were separated, and retinal blood vessel changes, pericytes, endothelial cells, etc. Degeneration of peripheral cells and non-cellular blood vessels was observed.
  • the retinal blood vessels were separated using the trypsin digestion method, and the separated blood vessels were subjected to H&E staining to observe perivascular cells and blood vessels without cells.
  • the stained retinal tissue slides were observed using a microscope, and changes in retinal tissue were analyzed by observing changes in retinal thickness.
  • the thickness of the retina was analyzed by measuring changes in the thickness of the inner nuclear layer and inner flexiform layer.
  • diabetic retinopathy can be treated by a single administration, and compared to the conventional treatment method that requires monthly intraocular injection, the patient's pain, eye damage and infection can be suppressed, and the treatment cost can be reduced. have.

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Abstract

본 발명은 당뇨망막병증 치료용 의약조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 당뇨망막병증을 단일 투여에 의하여, 치료가능하여, 매월 안구내 주사를 수행해야 하는 종래 치료법에 비하여, 환자의 고통과 안구손상 및 감염을 억제할 수 있고, 치료비용을 경감할 수 있다.

Description

솔루블 VEGFR-1 변이체 CDNA를 함유하는 RAAV를 포함하는 당뇨망막병증 치료용 조성물
본 발명은 당뇨망막병증 치료용 의약조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA를 함유하는 재조합벡터를 포함하는 당뇨망막병증 치료용 의약조성물에 관한 것이다.
당뇨망막병증은 녹내장, 황반변성과 함께 망막 질환 중 주요 3대 질환의 하나이다. 당뇨망막병증은 고혈당으로 인한 망막 질환으로 망막 혈관의 퇴화가 유도되고, 망막 부종, 혈관누수로 인한 삼출물의 퇴적 및 출혈, 망막 신경세포의 퇴화가 일어나는 질병이다. 당뇨망막병증은 증식성 망막병증(proliferative diabetic retinopathy)과 비증식성 당뇨망막병증(non-proliferative diabetic retinopathy)으로 나뉘며, 망막황반부종(Diabetic macular edema)가 있다.
현재 당뇨망막병증의 치료는 망막 부종과 증식성 망막병증을 치료하는 방법이 주로 사용되고 있다. 망막 부종의 치료는 anti-VEGF의 주사로 치료하며, 혈관의 증식 및 출혈이 있을 때는 레이저를 이용한 광응고술을 실시한다.
한편, 유전자 치료법은 유전자 전달 및 발현에 의하여 질병을 치료하는 방법으로서, 약물치료와는 달리 장애가 있는 특정 유전자를 목표로 유전적 결함을 교정하는 치료법이다. 유전자 치료의 궁극적인 목표는 살아있는 세포를 유전적으로 변형하여 유익한 치료 효과를 얻는 것이다. 상기 치료법은 질환부위로 유전인자의 정확한 전달, 생체 내에서의 완전한 분해, 독성 및 면역 항원성 부재(不在) 및 유전인자의 장기간 안정적인 발현이라는 장점을 지니고 있어서, 질병치료에 있어 더할 나위없는 최선의 치료법으로 각광받고 있다.
유전자 치료는 특정 질병에 치료효과를 나타내는 유전자를 도입하거나, 항암제 등에 저항성을 나타내도록 정상세포의 저항기능을 증강시키거나, 각종 유전성 질환자에 있어서 변형되거나 소실된 유전자를 대체하는 방법 등이 있다.
유전자 치료법은 크게 생체내(in vivo)와 생체외(ex vivo) 두 가지로 구분된다. In vivo 유전자 치료법은 치료 유전자를 직접 체내에 주입하는 것이고, ex vivo 유전자 치료법은 일차적으로 목적 세포(target cell)를 시험관내에서 배양하고, 이들 세포에 유전자를 도입시킨 다음, 유전자 변형된 세포를 다시 체내로 주입하는 것이다. 현재 유전자 치료 연구 분야에서는 in vivo 유전자 치료법보다는 ex vivo 유전자 치료법을 많이 사용하고 있다.
유전자 전달기술은 크게 바이러스를 수송체로 사용하는 방법(viral vector-based transfer method), 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법(non-viral delivery method) 및 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기투과법(electroporation) 등의 물리적 방법으로 구분할 수 있다.
상기 유전자 전달기술 중에서, 바이러스 수송체 또는 바이러스 벡터로 사용되는 바이러스로는 RNA 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)와 DNA 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노-부속 바이러스 벡터 등)가 있으며, 이 외에도 단순포진바이러스 벡터(herpes simplex viral vector), 백시니아 바이러스 벡터(vaccinia virus vector), 알파 바이러스 벡터(alpha viral vector) 등이 있다.
한편, 아데노바이러스(adenovirus)는 클로닝 벡터(cloning vector)로 여러 가지 장점을 가지는데, 중간정도의 크기로 세포 핵 속에서 복제될 수 있으며, 임상적으로 무독성이고, 외부 유전자를 삽입하여도 안정적이며, 유전자의 재배열이나 손실이 일어나지 않고, 진핵생물을 형질전환 시킬 수 있으며, 숙주세포 염색체에 통합되어도 안정적이면서도 높은 수준으로 발현된다. 아데노바이러스의 좋은 숙주세포는 인간의 조혈, 림프, 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나, 선상 DNA라서 증식이 어렵고, 감염된 바이러스를 회복시키는 것이 쉽지 않으며, 바이러스의 감염율이 낮다. 또한 전달된 유전자의 발현이 1~2주 후에 가장 많이 되고, 일부 세포에서는 3~4주정도만 발현이 유지된다. 또한, 문제가 되는 것은 높은 면역 항원성을 갖는다는 것이다.
아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV)는 상기와 같은 문제점들을 보완할 수 있으면서, 유전자 치료제로의 많은 장점을 가지고 있어 최근에 선호되고 있다. AAV는 단일가닥의 원바이러스(provirus)로서, 복제하기 위하여 보조바이러스를 필요로 하고, AAV 게놈(genome)은 4,680bp로서 감염세포의 염색체 19번 특정부위에 삽입이 가능하다. 트랜스 유전자(trans-gene)는 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열부분과 시그날 서열(signal sequence)부분에 의해 연결된 플라스미드 DNA(plasmid DNA)에 삽입된다. AAV 기반 유전자 치료제를 생산하기 위해서는 추가적으로 AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 다른 플라스미드 DNA를 함께 트랜스팩션(transfection)시키며 동시에 AAV 증폭에 절대적으로 필요한 아데노바이러스는 보조바이러스(helper virus)로 직접 첨가하거나, 증폭에 중요한 기능을 하는 아데노바이러스 유전자(E1, E4, VA RNA 유전자)를 포함하는 별도의 플라스미드 형태로 첨가한다.
AAV는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고, 반복투여 시 면역 부작용이 적으며, 유전자 발현 기간이 수년간 유지되는 장점을 지니고 있다. 더구나, AAV 게놈이 숙주세포의 염색체에 통합되어도 안전하고, 숙주의 유전자발현을 변형시키거나 재배열시키지 않는다.
혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF)는 fms-유사 티로신키나아제 수용체인 Flt-1 및 KDR/Flk-1의 쌍에 결합하여 작용하며, 후자와의 상호 작용이 혈관신생과정(angiogenic process)을 유도한다. 솔루블 Flt-1 (sFLT-1)은 Flt-1에 존재하는 막확장영역(membrane-spanning domain)이 없는 변형된 수용체(soluble variant)로 선택적 스플라이싱 과정이 의해 자연 발생적으로 생성되는 가용성 변형체이다. sFlt-1은 높은 친화성으로 VEGF에 직접 결합하여, VEGF가 KDR/Flk-1과 상호작용하지 못하게 함으로써, 항-VEGF 활성(anti-VEGF activity, anti-angiogenic activity)을 나타낸다(McLeod et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 43:474, 2002). sFlt-1은 또한 KDR/Flk-1 자체와 결합하여 비활성 헤테로다이머를 형성한다. 이러한 항-VEGF 활성은 항-혈관신생 활성(anti-angiogenic activity)으로 기능하므로 항-VEGF 활성을 이용한 항체 및 융합단백질이 망막변성 치료제로 현재 사용되고 있으며(Simσ et al., Diabetes Care,37:893, 2014), 제넨텍이 개발하여 노바티스가 판매하고 있는 루센티스 (Ranibizumab, Lucentis), 리제네론 제약회사가 개발한 아일리아 (Aflibercept, Eylea), 그리고 아바스틴 (Bevacizumab, Avastin) 등이 이에 해당한다. 그러나 이들 단백질 치료제는 1-2개월에 한 번씩 안구에 주사를 맞아야 하고, 이에 따른 부작용이 심각하므로, 한번 주사로 장기간 치료효능이 있는 근원적인 황반변성 치료제 개발이 매우 필요하다.
이에, 본 발명자들은 단일 투여만으로도 당뇨망막병증을 치료할 수 있는 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 그동안 연구된 자연발생적인 솔루블 VEGF 수용체가 아닌 새로운 영역을 포함한 솔루블 VEGF 수용체 변이체를 개발하여 아데노-부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector, AAV)에 패키징한 유전자치료제를 당뇨망막병증 모델 마우스에 투여하는 경우, 당뇨 망막 병증의 증상인 망막황반부종, 혈관누수와 혈관퇴화가 억제되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 단일 투여 만으로도 당뇨망막병증을 치료할 수 있는 당뇨망막병증 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증의 치료 또는 예방 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 당뇨망막병증의 치료 또는 예방을 위한 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 당뇨망막병증의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터의 사용을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 당뇨망막병증 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 당뇨망막병증의 치료 또는 예방을 위한 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 당뇨망막병증의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터의 사용을 제공한다.
도 1은 본 발명에서 사용한 rAAV2-sVEGFRv-1에 삽입된 솔루블 VEGF 수용체 변이체의 구성을 자연발생적 솔루블 VEGF 수용체인 sFlt-1과 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용한 rAAV2-sVEGFRv-1을 안구에 주사한 후, 눈에서 솔루블 VEGF 수용체 변이체의 발현을 확인한 사진(A)과 초자체로 분비된 솔루블 VEGF 수용체 변이체의 양을 측정한 그래프(B)를 나타낸 것이다.
도 3은 당뇨망막병증 마우스모델에서 Dextran-FITC를 이용하여 망막 혈관 누수를 관찰한 사진(A) 및 분석그래프(B)를 나타낸 것으로, 대조군, 양성대조군 및 rAAV2-sVEGFRv-1이 투여된 군의 망막 사진으로 rAAV2-sVEGFRv-1의 투여에 의하여 혈관 누수가 억제된 것을 나타낸다.
도 4는 당뇨망막병증 마우스모델에서 망막신경세포 퇴화 관찰을 위한 TUNEL염색사진(A)과 분석그래프(B)를 나타낸 것으로, 대조군, 양성대조군 및 rAAV2-sVEGFRv-1이 투여된 군의 망막 사진으로 rAAV2-sVEGFRv-1의 투여에 의하여 대조군 대비 망막 신경세포의 퇴화가 억제된 것을 나타낸다.
도 5는 당뇨망막병증 마우스모델에서 망막신경절 세포 관찰을 위한 Neu N 염색사진(A)과 분석그래프(B)를 나타낸 것으로, 음성대조군, 양성대조군 및 rAAV2-sVEGFRv-1이 투여된 군의 망막 사진으로 rAAV2-sVEGFRv-1의 투여에 의하여 대조군 대비 망막신경절 세포의 퇴화가 억제된 것을 나타낸다.
도 6는 당뇨망막병증 마우스모델에서 glial cell 활성관찰을 위한 GFAP 염색사진(A)과 분석그래프(B)를 나타낸 것이로, 대조군, 양성대조군 및 rAAV2-sVEGFRv-1이 투여된 군의 망막 사진으로 rAAV-sVEGFRv-1의 투여에 의하여 대조군 대비 GFAP의 염색이 줄어든 것, 치료제 벡터 투여에 의해 glial cell의 활성이 억제되는 효과를 나타낸다.
도 7은 당뇨망막병증 마우스모델에서 망막혈관 퇴화 관찰을 위하여 분리된 망막혈관 사진(A)과 분석그래프(B)를 나타낸 것으로, 대조군, 양성대조군 및 rAAV2-sVEGFRv-1이 투여된 군의 망막 사진으로 rAAV2-sVEGFRv-1의 투여에 의하여 대조군 대비 망막 혈관에서 혈관주위세포의 소실과 세포가 없는 혈관의 생성이 억제된 것을 나타낸다.
도 8는 당뇨망막병증 마우스모델에서 망막 조직을 염색한 후 망막 조직의 퇴화 및 보호효과를 사진(A)과 분석그래프(B)로 나타낸 것으로, 대조군, 양성대조군 및 rAAV2-sVEGFRv-1이 투여된 군의 망막사진으로 rAAV2-sVEGFRv-1의 투여에 의하여 대조군 대비 망막 조직의 두께가 두꺼운 것을 나타내며, rAAV2-sVEGFRv-1의 투여에 의한 망막신경 보호효과를 확인할 수 있다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
당뇨망막병증은 고혈당에 의하여 유도된 VEGF의 작용으로 혈관누수, 신경세포의 퇴화 및 신생혈관이 유도된다. 본 발명에서는 발현된 VEGF의 작용을 억제하기 위한 유전자 치료제를 개발하고자 하였으며, 솔루블 VEGF receptor 1을 발현시켜, VEGF의 발현을 억제하고자 하였다.
본 발명에서는 당뇨망막병증을 억제하기 위하여 재조합 아데노부속바이러스(AAV)에 치료 유전자를 탑재하여, 망막에 치료유전자를 전달하는 치료제를 개발하였고, 동물 모델을 이용하여 확인하였다.
본 발명에서는 신생혈관에 의해 발병하는 당뇨망막병증을 억제하기 위하여 재조합 아데노부속바이러스(AAV)에 솔루블 VEGFR-1 변이체 치료 유전자를 탑재하여, 망막에서의 VEGF의 활성을 차단하고자 솔루블 VEGFR-1 유전자 치료제 후보물질인 rAAV2-솔루블 VEGFRv-1 (rAAV2-sVEGFRv-1)을 개발하였고, 당뇨망막병증 유도 동물모델을 이용하여 이의 치료효능을 확인하였다. 또한 기존의 항체 기반 약제인 아바스틴과 베바시주맙의 치료효능과 비교하여 rAAV2-솔루블 VEGFRv-1 유전자 치료제가 우수한 효능을 가지는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 당뇨망박병증 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA는 인간 혈관내피 성장인자 수용체(VEGFR)1 유전자(XM_017020485.1, NCBI reference Sequence, NIH)에서 스패닝 뉴클레오티드 위치 282-2253의 단편으로, 총 1,972bp 크기(서열번호 1)를 가지며, 아미노산은 서열1의 5번째 염기부터 발현되며, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진다.
솔루블 VEGF 수용체 변이체는 도 1A에 나타낸 바와 같이, VEGF 및 PIGF와의 결합 부위를 가지는 6개의 면역글로블린 유사 도메인과 31개의 N-말단이 FLT-1과 동일한 변이체로, FLT-1의 자연발생적인 변이체인 sFLT-1는 6개 면역글로불린 유사 도메인과 FLT-1과는 다른 37개의 아미노산으로 구성된 테일을 가지고 있어, 변이체의 구성이 서로 상이하다(Kendall, R.L. and Thomas, K.A.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705~10709, 1993).
본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 아데노부속 바이러스인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 rAAV2 또는 다른 혈청형 타입 rAAV인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 솔루블 VEGF 수용체 변이체(sVEGFRv-1) cDNA를 포함하는 재조합 벡터인 rAAV2-sVEGFRv-1을 제작하기 위해 CMV 프로모터, SV40 폴리아데닐화 시그널 및 두개의 ITR를 함유하는 pAAV-F.IX cis 플라스미드(미국특허 제6,093,392호)에 sVEGFRv-1 cDNA를 삽입하여, pAAV-sVEGFRv-1를 제작하고, pAAV-sVEGFRv-1, pAAV-R2C2 및 pHelper를 HEK293(ATCC CRL-1573) 세포에 모두 트랜스팩션시킨 다음, 72시간 배양한 후, HEK293 세포를 모아서 초음파 파쇄하고, 재조합 AAV (rAAV) particle을 CsCl 밀도구배 원심분리를 2번 반복하여, RI(Refractive Index)가 1차에서는 1.37~1.42 g/mL, 그리고 2차에서는 1.35~1.43 g/mL 인 부분을 모아 순수하게 분리하여 rAAV2-sVEGFRv-1 벡터를 수득하였다.
따라서, 본 발명의 당뇨망막병증 치료용 조성물은 기존의 항-VEGF (anti-VEGF) 치료제가 가지고 있던 문제점인 반복적으로 매월 안구내 주사를 수행해야 하는 고통과 주사로 인한 안구손상 및 감염 등 부작용, 높은 치료비용 등을 극복할 수 있는 AAV 기반 유전자치료제이다.
본 발명에서는 rAAV2-sVEGFRv-1의 혈관누수 억제효과, 망막신경세포 퇴화 억제, glial cell 활성 억제 및 망막 혈관퇴하가 억제되는 것을 확인하여, 본 발명의 rAAV2-sVEGFRv-1이 당뇨망막병증 치료제로 알려진 베바시주맙과 유사한 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 rAAV2-sVEGFRv-1는 베바시주맙(bevacizumab, Avastin), 라니비주맙(Ranibizumab, Lucentis) 등과 같이 매월 안구에 직접 주사할 필요 없이, 1회 주사로 2~3년간의 지속적인 치료효과를 나타낼 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 조성물은 1회/2~3년으로 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 당뇨망막병증 치료용 조성물은 주사제 제형으로 제조될 수 있으며, 상기 주사제 제형의 경우, Ethyl oleate, Polyvinylpyrrolidone (PVP10), Ganglioside Sodium L-lactate, Zinc chloride 및 Sucrose로 구성된 군에서 선택되는 안정화제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직한 양태로는 HEPES buffer (20mM, pH 7.4)에 Ethyl oleate 10mg/ml, PVP10 1mg/ml, GM1 0.1mg/ml, Sodium L-lactate 1mg/ml, Zinc chloride 0.1mg/ml, Sucrose 10mg/ml으로 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, rAAV2-sVEGFRv-1 벡터는 1x105~1x1010vg/eye 로 투여할 수 있으며, 바람직하게는, 1x108~1x1010vg/eye로 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1x108~1x109vg/eye로 투여할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 또한, 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 당뇨망막병증의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 당뇨망막병증의 치료 또는 예방을 위한 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 당뇨망막병증의 치료 또는 예방용 약제 제조를 위한 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터의 사용에 관한 것이다.
발명의 약제학적 조성물에 사용된 담체는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.
본 발명의 치료용 조성물은 비경구 투여가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화된 것과 마찬가지로 주사 제제에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 항염증제와 혼합하거나 매트릭스 메탈로프로테아제 억제제, 리폭시게나제 억제제 및 IL-1β외의 사이토킨의 억제제와 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 염증과 같은 IL-1 매개된 질환 증세를 예방 또는 퇴치하기 위해 면역조절제(예, 브로피리민, 항-사람 알파 인터페론 항체, IL-2, GM-CSF, 메티오닌 엔케팔린, 인터페론 알파, 디에틸디티오카바메이트, 종양 괴사 인자, 날트렉손 및 rEPO) 또는 프로스타글란딘과 배합하여 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물이 다른 치료 제제와 배합하여 투여될 때 이들은 환자에게 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 다른 방도로서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 일반식(1)의 조성물과 상기된 다른 치료 또는 예방제와 혼합하여 이루어질 수 있다.
단일 용량형을 만들기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 항체의 양은 치료받는 숙주 및 특정 투여방식에 따라 다양할 수 있다.
그러나, 특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 의약 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액 (Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입 (injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀루로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액 (oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA(sVEGFRv-1 cDNA)를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 약학적 조성물의 투여로 상기 질환들의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
본 발명에서 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: rAAV2-sVEGFRv-1의 제작
솔루블 VEGF 수용체-1 변이체(sVEGFRv-1)는 인간혈관내피성장인자수용체(VEGFR)1 유전자(XM_017020485.1, NCBI reference Sequence, NIH)를 이용하여 디자인하였다.
본 발명의 sVEGFRv-1는 도 1에 나타낸 바와 같이, VEGF 및 PIGF와의 결합 부위를 가지는 6개의 면역글로블린 유사 도메인과 31개의 N-말단이 FLT-1과 동일한 변이체이며, FLT-1의 자연발생적인 변이체인 FLT-1s는 6개 면역글로불린 유사 도메인과 FLT-1과는 다른 37개의 아미노산으로 구성된 테일을 가지고 있어, 변이체의 구성이 서로 상이하다(Kendall, R.L. and Thomas, K.A.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10705~10709, 1993).
pAAV2-sVEGFRv-1을 제작하기 위해 CMV 프로모터, SV40 폴리아데닐화 시그널 및 두개의 ITR를 함유하는 pAAV-F.IX cis 플라스미드(미국특허 제6,093,392호)에 sVEGFRv-1 스패닝 뉴클레오티드 위치 282-2253 (총 1972bp: 서열번호 1)를 삽입하였다. rAAV2-GFP의 경우, 동일한 플라스미드에 GFP유전자를 삽입하여 제작하였다.
상기 sVEGFRv-1 삽입 단편은 하기 프라이머쌍을 이용하여 PCR로 제작하였다.
sVEGFRv-1 F1: AAGGTACCGC CACCATGGTCAGCTACTGGGACA(서열번호 3)
sVEGFRv-1 R3: CGCTCGAGCTA TCTGATTGTAATTTCTTTCTTCTG(서열번호 4)
유전자 치료에 이용되는 재조합 rAAV2-sVEGFRv-1 벡터 및 rAAV2-eGFP를 제작하기 위해서는 상기 제작된 pAAV-sVEGFRv-1 이외에 AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 AAV rep-cap 플라스미드 DNA(pAAV-R2C2 플라스미드, Stratagene Co., USA)와 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (pHelper 플라스미드, StratageneCo., USA)가 필요하다. 상기 세 가지 종류의 플라스미드 DNA (pAAV-sVEGFRv-1, pAAV-R2C2 및 pHelper)를 HEK293 (human embryonic kidney 293; ATCC CRL-1573) 세포에 모두 트랜스팩션시킨 다음, 72시간 배양한 후, HEK293 세포를 모아서 초음파 파쇄하고, 재조합 AAV (rAAV) particle을 CsCl 밀도구배 원심분리를 3번 반복하여, RI(Refractive Index)가 1차에서는 1.37~1.42 g/mL, 그리고 2차에서는 1.35~1.43 g/mL 인 부분을 모아 순수하게 분리하여 rAAV2-sVEGFRv-1 벡터를 수득하였으며, 동일한 방법으로 rAAV2-eGFP를 수득하였다.
실시예 2: 망막에서 rAAV2-sVEGFRv-1의 발현 확인
실시예 1에서 제작한 rAAV2-sVEGFRv-1의 in vivo 발현을 확인하기 위하여 다음과 같이 실시를 하였다.
정상의 마우스 (C57BL, 6-7 주령)의 눈에 rAAV2-sVEGFRv-1를 5x107 vg/eye 로 안구내주사(intra-vitreal (IV) injection)로 양안에 투여한 후, 주 후에 안구를 적출하고, 망막은 조직표본을 만들어 사람의 솔루블 VEGF 수용체에 대한 면역염색을 수행하여 치료 유전자의 발현을 확인하였으며, 면역염색에 사용된 항체는 항-사람 VEGF 수용체 (Anti-Human VEGF-R1/FLT, purified - monoclonal Antibody, Invitrogen)를 사용하였다. 초자체는 분리하여 사람의 솔루블 VEGF 수용체에 대한 ELISA (Quantikine ELISA Human VEGF R1/Flt-1 Immunoassay, SVR100C, R&D SYSTEMS))를 수행하여 확인하였다. 측정결과 정상에서는 평균 4.5 ± 6.7 pg이었으며, rAAV2-sVEGFRv-1 (5x107 vg/eye)가 주사된 눈에서는 평균 59.6 ± 41.4 pg로 관찰되었다 (n=6, p<0.01). 결과는 도 2에 나타내었다.
실시예 3: Dextran-FITC를 이용한 당뇨망막병증 모델에서 혈관 누수 억제 효과 확인
실시예 1에서 제작한 rAAV2-sVEGFRv-1의 in vivo 치료 효과를 관찰하기 위한 당뇨망막병증 동물 모델은 다음과 같이 제작하였다.
마우스 (C57BL, 6-7 주령)에서 streptozotocin을 150 mg/kg 농도로 0.1 M citrate buffer로 준비하여 복강 내 투여방법으로 1회 주사하였고, 1주후 8시간 금식, 음수자유급여 후 혈당을 측정해서 고혈당 (혈당측정기로 300 이상)으로 평가되는 동물모델을 사용하였으며, streptozotocin 주사 후 4주 후에 rAAV2-sVEGFRv-1를 5x107 vg/eye 투여량을 intra-vitreal (IV) injection 방식으로 양안에 투여한 후 당뇨가 유도된 질환동물에서 당뇨망막병증에 대한 치료효능을 분석하였다.
치료효과분석을 위하여, 망막 혈관 누수를 형광 안저 촬영방법으로 분석하였으며, 간단히 설명하면 망막에서 혈관 누수는 dextran-FITC를 복강 주사하고 안구를 적출한 다음, 망막을 분리하여 유리슬라이드에 펼쳐 놓고 커버글라스를 덮은 다음 형광 현미경으로 관찰하여 대조군과 치료제벡터 투여군에서의 치료 효과를 비교 분석하였다.
당뇨망막병증 모델에서 2종류 대조물질 (Vehicle 투여군(Sham(DR) 및 rAAV2-eGFP 벡터 5x107 vg/eye 투여군(GFP)), 양성대조군 (Avastin, Bevacizumab 25 mg/mL 농도의 몰질을 1 μL 양안에 투여) 물질 및 rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터 투여군을 안구내 IV 투여하여 혈관 누수를 확인하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 정상(Normal)에 비하여 대조군(Sham)에서는 1.94 ± 0.19, GFP 벡터투여군(GFP)에서는 1.93 ± 0.2, rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터 투여군에서는 1.11 ± 0.12, Avastin(Bevacizumab)투여군에서는 1.17 ± 0.09로 관찰되었고, 대조군(Sham, GFP)과 비교하여 rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터의 투여에 의하여 혈관 누수가 억제된 것을 확인하였다 (p<0.01).
실시예 4: 고혈당 당뇨 망막병증 모델에서 망막 신경세포 퇴화 관찰
실시예 2의 방법으로 고혈당으로 유도된 당뇨망막병증 마우스모델에서 망막 신경세포의 퇴화 관찰은 치료제 벡터인 rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터 주사 후, 1달 등 일정 시간 후에 안구를 적출한 다음 냉동 절편을 제작하여 관찰하였다. 세포 사멸의 관찰은 TUNEL 염색을 이용하여 죽어가는 세포를 염색하였다.
당뇨망막병증 모델에서 2종류 대조물질 (Vehicle 투여군 및 rAAV2-eGFP 벡터 5x107 vg/eye 투여군), 양성대조군 (Avastin, Bevacizumab 25 mg/mL 농도의 몰질을 1 μL 양안에 투여) 물질 및 rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터 투여군을 안구내 IV 투여하여 세포 사멸을 분석하였다,
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터의 투여에 의하여 망막신경세포 퇴화를 억제하는 치료 효과가 있는 것를 확인하였다.
실시예 5: 고혈당으로 인한 망막 변성에서 망막신경절 세포의 보존과 Glial cell 활성 관찰
실시예 2의 방법으로 고혈당으로 유도된 당뇨망막병증 마우스모델에서 망막의 변성을 확인하기 위하여 망막신경절세포의 생존과 Glial cell의 활성을 관찰하였다. 망막신경정세포의 확인은 Neu N 항체를 이용하였으며, Glial cell의 관찰은 GFAP 항체를 이용한 면역염색을 이용하여 관찰하였다. Neu N 및 GFAP의 염색은 냉동 절편된 망막 조직을 이용하였으며, 면역 염색을 진행한 후 형광현미경으로 관찰하였다.
당뇨망막병증 모델에서 2종류 대조물질 (Vehicle 투여군 및 rAAV2-eGFP 벡터 5x107 vg/eye 투여군), 양성대조군 (Avastin, Bevacizumab 25 mg/mL 농도의 몰질을 1 μL 양안에 투여) 물질 및 rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터 투여군을 안구내 IV 투여한 후 비교분석하였다.
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, Neu N에 염색된 세포는 대조군에서 정산의 망막 대비 줄어든 것이 확인되었으며, rAAV2-sVEGFRv-1의 투여에 의하여 NeuN 양성 세포의 보존이 확인되었다. 또한, GFAP의 염색이 대조군 대비 약하였으며, 이것은 glial cell의 활성이 rAAV2-sVEGFRv-1의 투여에 의하여 억제된 것을 의미한다.
실시예 6: 망막혈관 퇴화 관찰을 위한 망막 혈관 분리
실시예 2의 방법으로 고혈당으로 유도된 당뇨망막병증 마우스모델에서 망막혈관의 퇴화를 관찰하기 위하여 망막혈관을 분리하고, 망막혈관 변화, pericytes, endothelial cells 등 혈관주변세포 및 비세포혈관 등의 퇴화현상을 관찰하였다. 망막혈관의 분리는 trypsin digestion방법을 이용하여 분리하였고, 분리된 혈관은 H&E 염색을 수행하여 혈관 주위 세포 및 세포가 없는 혈관을 관찰하였다.
당뇨망막병증 모델에서 2종류 대조물질 (Vehicle 투여군 및 rAAV2-eGFP 벡터 5x107 vg/eye 투여군), 양성대조군 (Avastin, Bevacizumab 25 mg/mL 농도의 몰질을 1 μL 양안에 투여) 물질 및 rAAV-sVEGFRv-1 치료제 벡터 투여군을 안구내 IV 투여한 후 혈관과 혈관주변세포 등의 퇴화를 관찰하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, rAAV-sVEGFRv-1 치료제 벡터의 투여에 의하여 혈관 퇴화가 억제된 것을 확인하였다.
실시예 7: 망막 퇴화 관찰을 위한 망막 조직 염색
실시예 2의 방법으로 고혈당으로 유도된 당뇨망막병증 마우스모델에서 망막혈관의 퇴화를 확인하기 위하여 질환 유도 후, 6개월에 망막 조직의 변화를 관찰하였다. 망막의 염색은 안구를 고정한 다음, 수정체와 각막을 제거하고, 동결 절편을 만든 다음 H&E 염색을 수행하였다.
염색된 망막 조직 슬라이드는 현미경을 이용하여 관찰하였고, 망막 두께의 변화를 관찰하여 망막조직의 변화를 분석하였다. 망막의 두께는 inner nucler layer과 Inner flexiform layer의 두께의 변화를 측정하여 분석하였다.
당뇨망막병증 모델에서 2종류 대조물질 (Vehicle 투여군 및 rAAV2-eGFP 벡터 5x107 vg/eye 투여군), 양성대조군 (Avastin, Bevacizumab 25 mg/mL 농도의 몰질을 1 μL 양안에 투여) 물질 및 rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터가 투여된 망막 조직의 두께를 비교한 결과, rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터가 투여된 군에서 망막 보호효과가 있는 것을 확인하였으며, 도 8에 나타난 바와 같이, rAAV2-sVEGFRv-1 치료제 벡터의 투여에 의하여 망막 신경 조직의 퇴화가 억제된 것을 확인하였다.
본 발명에 따르면 당뇨망막병증을 단일 투여에 의하여, 치료가능하여, 매월 안구내 주사를 수행해야 하는 종래 치료법에 비하여, 환자의 고통과 안구손상 및 감염을 억제할 수 있고, 치료비용을 경감할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (5)

  1. 솔루블 VEGF 수용체 변이체 cDNA를 함유하는 재조합 벡터를 포함하는 당뇨망막병증 치료 또는 예방용 약학조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 솔루블 VEGF 수용체 변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 당뇨망막병증 치료 또는 예방용 약학조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 재조합벡터는 아데노부속 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)인 것을 특징으로 하는 당뇨망막병증 치료 또는 예방용 약학조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 재조합벡터는 rAAV2 또는 다른 혈청형 타입 rAAV인 것을 특징으로 하는 당뇨망막병증 치료 또는 예방용 약학조성물.
  5. 제1항에 있어서, 2~3년에 1회 투여하는 것을 특징으로 하는 당뇨망막병증 치료 또는 예방용 약학조성물.
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