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WO2020130467A2 - Cd8+ 메모리 t 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Cd8+ 메모리 t 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2020130467A2
WO2020130467A2 PCT/KR2019/017416 KR2019017416W WO2020130467A2 WO 2020130467 A2 WO2020130467 A2 WO 2020130467A2 KR 2019017416 W KR2019017416 W KR 2019017416W WO 2020130467 A2 WO2020130467 A2 WO 2020130467A2
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cells
memory
treatment
disease
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신의철
한지원
김종훈
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한국과학기술원
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of CD8 + memory T cell mediated diseases.
  • the HIF-2 ⁇ protein of the present invention is a protein encoded by the EPAS1 gene, and has a transcription factor activity in response to a decrease in oxygen available in a hypoxic state.
  • the HIF-2 ⁇ protein may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the EPAS1 gene may be composed of a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the inhibitor of the present invention may include all that can inhibit the expression or activity of HIF-2 ⁇ protein, for example, at least one selected from the group consisting of oligonucleotides, antibodies, antigen-binding fragments, aptamers and chemicals It may be, but is not limited thereto.
  • the antibody of the present invention is a protein molecule containing an immunoglobulin molecule that is immunologically reactive with a specific antigen, and refers to a protein molecule that acts as an antigen receptor that specifically recognizes and reacts when a specific antigen invades the body. do.
  • the antibody of the present invention also includes special antibodies such as humanized antibodies and human antibodies, and antibodies known in the art may be included in addition to novel antibodies.
  • the antibody includes functional fragments of the antibody molecule, as well as a complete form with the full length of two heavy and two light chains, as long as it has the properties of binding specifically recognizing the HIF-2 ⁇ protein.
  • treatment of the present invention may include, without limitation, any action that improves or ameliorates symptoms caused by CD8 + memory T cell mediated disease using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be characterized in that it is in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, and the pharmaceutical composition may be characterized for humans.
  • the food composition of the present invention can exhibit the effect of preventing or improving CD8 + memory T cell mediated diseases by including the inhibitor of expression or activity of HIF-2 ⁇ protein described in the pharmaceutical composition as an active ingredient. Therefore, content related to HIF-2 ⁇ , an inhibitor of expression or activity, CD8+ memory T cell mediated disease and prevention is omitted to avoid excessive complexity of the specification according to the repeated description.
  • Food composition comprising the inhibitor of the present invention as an active ingredient may be prepared in the form of various foods, for example, beverages, gum, tea, vitamin complexes, powders, granules, tablets, capsules, confectionery, rice cakes, bread, etc. have.
  • the above components of the present invention can be used independently or in combination.
  • the ratio of the additives does not correspond to the essential elements of the present invention, but may be selected from 0.1 to about 50 parts by weight per 100 parts by weight of the food composition of the present invention, but is not limited thereto.
  • the biological sample of the present invention refers to any substance, biological body fluid, tissue or cell obtained from or derived from an individual, for example, whole blood, leukocytes, peripheral blood mononuclear cells ( peripheral blood mononuclear cells, blood, including leukocyte soft coat, plasma and serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, Nasal aspirate, breath, urine, semen, saliva, peritoneal washings, pelvic fluids, cystic fluid , Meningeal fluid, amniotic fluid, glandular fluid, pancreatic fluid, lymph fluid, pleural fluid, nipple aspirate, bronchial aspirate ( bronchial aspirate, synovial fluid, joint aspirate, organ secretions, cells, cell extracts or cerebrospinal fluid It does not work.
  • peripheral blood mononuclear cells peripheral blood mononuclear cells, blood, including leukocyte soft coat, plasma and serum, sputum, tears, mucus, nasal washes, Nasal
  • the step of determining the level of the present HIF-2 ⁇ protein of the present invention is a Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay using an agent measuring the protein level containing the antibody specific for the protein (radioimmunoassay, RIA), radioimmunodiffusion, ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, flow cytometry (FACS) and a protein chip (protein chip), and the like, but is not limited thereto.
  • the antibody of the present invention can be easily produced by a method known to those of ordinary skill in the art with reference to SEQ ID NO: 1, which is the amino acid sequence of HIF-2 ⁇ .
  • the candidate substance when the expression level of the HIF-2 ⁇ protein or the gene encoding it measured after treatment of the candidate substance is reduced compared to before the candidate substance treatment, the candidate substance is judged as a therapeutic agent for CD8 + T cell mediated disease It further comprises the steps.
  • composition for measuring aging of the present invention includes an agent that measures the level of HIF-2 ⁇ protein or a gene encoding it.
  • the contents related to the CD69 + CD103 - CD8 + memory T cells, HIF-2 ⁇ , etc. are omitted to avoid excessive complexity of the specification according to the repeated description.
  • the CD69 + CD103 - - - On the basis of being a CD8 + memory T cell populations (Subpopulation) resident tissue, the CD69 + CD103 - - The compositions according to the present invention CD8 + memory T cells from the CD69 + CD103 existing between the CD8 + memory only T cell-specific By inhibiting the expression level or activity of HIF-2 ⁇ present at a high level, it is possible to induce the apoptosis of CD69 + CD103 - CD8 + memory T cells, or to effectively suppress the function of the cells. Furthermore, through this effect, it can be very usefully applied to the prevention, improvement or treatment of CD8 + memory T cell mediated diseases.
  • FIGS. 7 to 10 show the results of confirming the types of genes specifically expressed in CD69 + CD103 - CD8 + memory T cells according to an embodiment of the present invention.
  • mononuclear cell suspensions were prepared from the tissues using a tumor dissociation kit (Miltenyi Biotec, Germany) and GentleMACS TM dissociator.
  • HLA Human leukocyte antigen
  • T which is an indicator related to terminal differentiation of T cells in the CD103 - cell subset It was confirmed that the frequency of the presence of EMRA cells, CD57 + cells and T-bet low Eomes hi cells was higher.
  • the instrument for sequencing was HiSeq2500 (Illumina, USA), and the sequencing conditions were such that RAW reads were set to conditions aligned to the reference genome (UCSC.hg38) through the HISAT2 package, and the reads sorted using the StringTie package. A copy assembly was generated, and the expression profile of the gene could be presented as a fragment per kilobase of transcript per million mapping leads.
  • CD69 + CD8 + memory T cells sorted from LSMCs of chronic HBV infected patients maintained activity and confirmed cell death
  • CD69 + CD8 + memory T cells in the CD103 LSMCs obtained from a chronic HBV infected-cell subset and CD103 + cells was confirmed TCR (T cell receptor) in a reactive subset.
  • TCR T cell receptor
  • 1 ⁇ g/mL HBVcore overlapping peptide was treated with RPMI culture containing LSMCs and 10% fetal calf serum, and cultured for 1 hour, Brefeldin A (BD Biosciences), monensin (BD Biosciences) and The CD107a antibody (PE- or FITC-conjugated) was further added, followed by further incubation for 5 hours. Then, after washing the cells in which the culture was completed, the antibody to which the fluorescence for a specific surface marker was conjugated was added and cultured.

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Abstract

본 발명은 본 발명은 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 상기 조성물은 간에 존재하는 CD8+ 메모리 T 세포 중에서 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포가 조직 상주 집단(Subpopulation)인 것에 기초하여, 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에만 특이적으로 높은 수준으로 존재하는 HIF-2α의 발현 수준 또는 활성을 억제함으로써 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 사멸을 유도하거나, 그 기능을 효과적으로 억제할 수 있다. 나아가, 이와 같은 효과를 통해 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방, 개선 또는 치료에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

Description

CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
간은 면역 내성이 있는 기관으로서, 조직 적합성 복합체 부적합 간 동종 이식의 경우에도 거부 반응 없이 생존할 수 있으며, HBV(Hepatitis B virus) 및 HCV(Hepatitis C virus)가 만성 감염을 쉽게 일으킬 수 있는 독특한 면역학적 측면을 갖는 기관이다.
한편, 최근 이펙터 메모리 T (Effector memory T; TEM) 세포 또는 CD45RA+ 이펙터 메모리 T (CD45RA+ effector memory; TTEMRA) 세포의 표현형을 나타내는, 재순환하지 않는 조직 상주 기억 T (Non-recirculating tissue-resident memory T; TRM) 세포가 다양한 말초 기관에서 발견되었다. αE 인테그린(αEintegrin, CD103)의 유무에 관계없이 CD69가 발현되고, 스핑고신-1-인산 수용체(Sphingosine-1-phosphate receptor; S1PR1)와 쿠루펠-유사 인자(Kruppel-like factor 2; KLF2)가 적게 존재하는 특징을 가지는 상기 TRM 세포는 동일한 병원체에 신속하게 반응한다. 또한, 상기 TRM 세포는 피부, 폐, 위장관 및 생식기, 뇌, 신장 등 비 림프성 조직에서 흔히 발견되며, 쥐와 사람의 간에서 발견된다.
한편, CD69와 함께 TRM 세포를 확인하기 위한 중요한 표지자 중 하나인 CD103은 간 세포와 같은 상피세포에서 발현되는 E-카드헤린(E-cadherin)을 인식하기 위해 β7 인테그린과 이종 이량체를 형성하는 αE 인테그린으로서, 돌기세포, 선천적인 림프 세포, 비만 세포 및 T 세포를 포함한 다양한 면역 세포에서 발견되며, CD8+ T 세포에서 조직 위치 및 변형 성장 인자-β(transforming growth factor-β; TGF-β)에 대한 노출에 따라 발현이 증가된다. 마우스 간의 TRM 세포는 CD103을 발현하지 않지만, 세포 독성이 감소되어 있는 것으로 알려진 인간 간의 CD69+CD8+ 메모리 T 세포의 약 95%는 CD103- 세포 서브세트이고, 나머지 5%는 CD103+ 세포 서브세트로 구성되어 있다. 상기 CD103+ 세포 서브세트의 경우, TEM 표현형을 나타내고, HBV에 의해 자극되는 경우 인터루킨-2(Interleukin-2; IL-2)와 같은 사이토카인을 생산한다.
이와 같이, CD69+CD8+ 메모리 T 세포의 서브세트 중 CD103+ 의 특징을 가지는 세포의 특징에 대한 연구가 다양하게 진행된 반면, 현재까지 CD103-의 특징을 가지는 세포의 특징과 이와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 대한 연구는 아직까지 미비한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD8+ T 세포 매개성 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD8+ T 세포 노화 측정용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 간에서 HIF-2α(Hypoxia Inducible Factors 2α) 단백질이 높은 수준으로 존재하는 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포가 조직 상주 기억 T 세포인 것에 착안하여, 상기 HIF-2α 단백질의 발현 또는 활성을 특이적으로 억제하는 경우, 간의 CD8+ T 세포 중에서 주로 기능하는 집단인 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 사멸을 유도하거나, 그 기능을 억제시킴으로써 CD8+ 메모리 T 세포 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 나아가, 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포는 텔로미어의 길이가 짧고, 최종 분화되어 있으므로, HIF-2α 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 존재하는 수준을 측정함으로써 CD8+ 메모리 T 세포의 노화를 측정할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 구현 예는 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 HIF-2α(Hypoxia Inducible Factors 2α) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 HIF-2α 단백질은 EPAS1 유전자에 의해 암호화되는 단백질로서, 저산소 상태에서 이용 가능한 산소가 감소하는 현상에 반응하는 전사 인자(Transcriptional factor) 활성을 갖는다. 상기 HIF-2α 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 상기 EPAS1 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 억제제는 CD8+ T 세포의 집단 중에서, CD8+CD103-CD69+ 메모리 T 세포의 선택적인 사멸을 유도하거나, 그 기능을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 CD8+CD103-CD69+ 메모리 T 세포는, CD8+ T 세포 중에서 주로 기능하는 집단으로서, CD8+CD103+CD69+ 메모리 T 세포에 비하여, 세포 내 HIF-2α 단백질이 높은 수준으로 존재한다는 특징을 갖는다. 또한, 상기 세포는 TCR(T cell receptor) 자극에 의한 활성을 유지하며 세포가 잘 사멸되지 않으며, 최종 분화되어 있으며 텔로미어의 길이가 짧은 특징을 갖는다. 따라서, CD8+CD103-CD69+ 메모리 T 세포에 높은 수준으로 존재하는 HIF-2α 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 CD8+ 메모리 T 세포의 선택적인 사멸을 유도하거나, 그 기능을 효과적으로 억제함으로써 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료 효과가 발휘되도록 할 수 있다.
본 발명의 상기 억제제는 HIF-2α 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 것이라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면 올리고뉴클레오티드, 항체, 항원 결합 단편, 앱타머 및 화학 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화학 물질은 하기 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019017416-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2019017416-appb-I000002
[화학식 3]
Figure PCTKR2019017416-appb-I000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2019017416-appb-I000004
[화학식 5]
Figure PCTKR2019017416-appb-I000005
[화학식 6]
Figure PCTKR2019017416-appb-I000006
[화학식 7]
Figure PCTKR2019017416-appb-I000007
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 (S)-3-((2,2-디플루오르-1-하이드록시-7-(메틸설포닐)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)옥시)-5-플루오르벤조니트릴 ((S)-3-((2,2-difluoro-1-hydroxy-7-(methylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile), 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 7-((디플루오르메틸)설포닐)-2,2-디플루오르-4-(3-플루오르-5-이소시아노페녹시)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-올(7-((difluoromethyl)sulfonyl)-2,2-difluoro-4-(3-fluoro-5-isocyanophenoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-ol), 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 7-(에틸설포닐)-2,2-디플루오르-4-(3-플루오르-5-이소시아노페녹시)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-올(7-(ethylsulfonyl)-2,2-difluoro-4-(3-fluoro-5-isocyanophenoxy)-2,3-dihydro-1H-inden-1-ol), 상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 2,2-디플루오르-4-(3-플루오르-5-이소시아노페녹시)-7-(메틸설포닐)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-올(2,2-difluoro-4-(3-fluoro-5-isocyanophenoxy)-7-(methylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-ol), 상기 화학식 5로 표시되는 화합물은 2,2-디플루오르-4-(3-플루오르-5-이소시아노페녹시)-7-(메틸설포닐)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-아민(2,2-difluoro-4-(3-fluoro-5-isocyanophenoxy)-7-(methylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-inden-1-amine), 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물은 3-((2-클로로-2-플루오르-1-하이드록시-7-(메틸설포닐)-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)옥시)-5- 플루오르벤조니트릴(3-((2-chloro-2-fluoro-1-hydroxy-7-(methylsulfonyl)-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile) 및 상기 화학식 7로 표시되는 화합물은 3-((2-클로로-2-플루오르-7-(메틸설포닐)-1-옥소-2,3-디하이드로-1H-인덴-4-일)옥시)-5-플루오르벤조니트릴(3-((2-chloro-2-fluoro-7-(methylsulfonyl)-1-oxo-2,3-dihydro-1H-inden-4-yl)oxy)-5-fluorobenzonitrile) 일 수 있다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 상기 HIF-2α의 mRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), shRNA 및 siRNA 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 수개 내지 수십 개의 염기 서열이 공유결합을 통해 중합되어 형성된 중합체로서, mRNA에 상보적으로 결합되어 mRNA를 분해하거나, mRNA가 단백질로 번역되는 것을 방해하는 기능을 할 수 있는 것일 수 있다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 HIF-2α의 mRNA의 염기 서열인 서열번호 2를 참조하여 당해 기술 분야에서 통상이 지식을 가진 자가 공지되어 있는 방법에 의해 쉽게 제작될 수 있다.
본 발명의 상기 억제제는 HIF-2α 단백질의 활성을 억제할 수 있는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 상기 단백질의 활성을 억제하는 것은, 상기 HIF-2α 단백질이 갖는 전사 인자로서의 기능을 억제할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 항체는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체 및 인간 항체 등도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 HIF-2α 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 항체는 상기 HIF-2α 단백질의 아미노산 서열인 서열번호 1을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상이 지식을 가진 자가 공지되어 있는 방법에 의해 쉽게 제작될 수 있다.
본 발명의 상기 앱타머는 단일 가닥 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대한 높은 친화력을 가질 수 있고, 표적 분자에 결합되어 표적 분자의 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 본 발명의 상기 앱타머는 상기 HIF-2α 단백질의 아미노산 서열인 서열번호 1을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상이 지식을 가진 자가 공지되어 있는 방법에 의해 쉽게 제작될 수 있다.
본 발명의 상기 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환이란, CD8+ 메모리 T 세포가 정상 조직을 공격함으로써 발생될 수 있는 질환으로서, 예를 들면 간에서 비 정상적인 수준으로 존재하거나, 간에 과도하게 축적된 CD8+ 메모리 T 세포에 의해 유발된 간 질환일 수 있고, 바람직하게는 상기 간 질환은 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 자가 면역성 간염(Autoimmune hepatitis), 비 알코올성 지방간 질환(Human Nonalcoholic Fatty Liver Disease), 급성 간염(acute hepatitis) 및 간 섬유화(Hepatic Fibrogenesis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환이 발생될 수 있는 간은 면역 반응과 관련된 매우 독특한 세포 집단을 갖는 기관으로서, 쿠퍼 세포(Kupffer cell), 자연 살해 세포(Natural killer cell) 및 점막 관련 불변 T 세포(mucosal-associated invariant T cell)와 같은 세포들이 축적될 수 있다. 이와 같은 이유로, CD8+ 메모리 T 세포에 의한 항원 제시가 간에서 국소적으로 일어나는 경우 자가 면역 반응이 유도될 수 있다(Nat Rev Dis Primers. 2018 Apr 12;4:18017 참고). 또한, 간에 축적된 CD8+ 메모리 T 세포는 정상인에 비하여 염증성 사이토카인을 매우 높은 수준으로 생성시켜 원발성 담즙성 간경변을 유도할 수 있다(Gastroenterology. 2014 Jul;147(1):221-232 참고). 또한, 정상인에 비하여 원발성 담즙성 간경변, 비 알코올성 지방간과 같은 질환에서 높은 수준으로 CD8+ 메모리 T 세포가 존재한다(Annu Rev Pathol. 2013 Jan 24;8:303-30, Biomed Res Int. 2017, 2017 : 6862439 및 Hepatology. 2014 Apr;59(4):1393-405 참고). 나아가, 쥐에서 CD8+ T 세포의 증가는 쥐의 간 섬유화와 관련이 있다(Gastroenterology. 2004 Sep;127(3):870-82 참고). 상기 약학 조성물은 CD8+ 메모리 T 세포의 집단에서 주로 기능하는 CD8+CD103-CD69+ 메모리 T 세포를 특이적으로 표적하여, 세포의 사멸을 유도하거나 그 기능을 억제할 수 있기 때문에, CD8+ T 세포에 의해 매개된 상기와 같은 질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환으로 인해 발생한 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환으로 인해 발생한 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명의 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예는 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 식품 조성물은, 상기 약학 조성물에 기재된 HIF-2α 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하여 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방 또는 개선 효과를 발휘할 수 있다. 따라서, HIF-2α, 발현 또는 활성 억제제, CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환 및 예방과 관련된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
한편, 본 발명의, "개선"은 본 발명의 식품 조성물을 이용하여 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환으로 인해 발생한 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 억제제를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 억제제가 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 포함하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 구체적으로, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등일 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 성분은 독립적 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 핵심적인 요소에 해당하지 아니하지만, 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 CD8+ T 세포 매개성 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 스크리닝 방법은 우선, CD8+ 메모리 T 세포 또는 그 배양액에 목적하는 후보물질을 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 CD8+ 메모리 T 세포 집단의 표현형은 CD69+CD103-CD8+의 표현형을 나타내는 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포일 수 있고, 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포는 최종 분화되어 있고, 텔로미어의 길이가 짧은 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포는 생물학적 시료로부터 유세포분석기를 통해 선별되어, 시험관 내에서 배양됨으로써 얻어지는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 골반 내 유체액(pelvic fluids), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 후보물질은 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환을 치료하기 위한 활성이 존재하는지 여부에 대해 테스트하기 위한 약제를 의미하며, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함한다. 이러한 후보 물질은 또한 천연 물질뿐만 아니라 합성 물질을 모두 포함한다.
본 발명의 상기 스크리닝 방법은, 상기 후보물질의 처리 후 상기 CD8+ 메모리 T 세포 또는 그 배양액에서 HIF-2α 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 HIF-2α 단백질이 존재하는 수준을 확인하는 단계는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 이용하여, 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역 분석법 (radioimmunoassay, RIA), 방사선 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니(ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역 전기 영동, 면역 침전 분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complement fixation assay), 유세포분석(FACS) 및 단백질 칩 (protein chip)등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 항체는 HIF-2α의 아미노산 서열인 서열번호 1을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상이 지식을 가진 자가 공지되어 있는 방법에 의해 쉽게 제작될 수 있다.
본 발명의 상기 HIF-2α 단백질을 암호화하는 유전자가 존재하는 수준을 확인하는 단계는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍, 프로 (probe), 안티센스(anti-sense) 뉴클레오티드를 이용하여, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction), 형광상관분석법(fluorescence correlation spectroscopy), 마이크로어레이(microarray), 칩어세이(chip-assay) 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 프라이머 쌍, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드는 HIF-2α를 암호화하는 염기서열인 서열번호 2를 참조하여 당해 기술 분야에서 통상이 지식을 가진 자가 공지되어 있는 방법에 의해 쉽게 제작될 수 있다.
본 발명의 상기 스크리닝 방법은, 상기 후보물질의 처리 후 측정된 HIF-2α 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 후보물질 처리 전에 비하여 감소한 경우 상기 후보물질을 CD8+ T 세포 매개성 질환 치료제로 판단하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포, CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환, HIF-2α 등과 관련된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 CD8+ T 세포 노화 측정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 노화 측정용 조성물은 HIF-2α 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자가 존재하는 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
본 발명의 상기 노화 측정용 조성물은, 상기 약학 조성물에 기재된 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에서 높은 수준으로 발현되는 HIF-2α 단백질 또는 그를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 확인하여 텔로미어의 길이가 짧아져 있고, 말단이 분화된 특징을 갖는 노화된 CD8+ 메모리 T 세포를 측정할 수 있다.
본 발명의 상기 노화 측정용 조성물에서, 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포, HIF-2α 등과 관련된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 CD8+ T 세포 노화 측정용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 노화 측정용 키트는, 상기 약학 조성물에 기재된 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에서 높은 수준으로 발현되는 HIF-2α 단백질 또는 그를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 확인하여 텔로미어의 길이가 짧아져 있고, 말단이 분화된 특징을 갖는 노화된 CD8+ 메모리 T 세포를 측정하는 노화 측정용 조성물을 포함한다.
본 발명의 상기 노화 측정용 키트에서, 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포, HIF-2α 등과 관련된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 키트는 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 마이크로어레이 또는 단백질 칩 키트일 수 있고, 상기 노화 측정용 조성물을 사용하여 당업계에서 사용되는 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 상기 노화 측정용 조성물 외에, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 더 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 HIF-2α(Hypoxia Inducible Factors 2α) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 약학적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법에서, 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포, HIF-2α 등과 관련된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 상기 “개체”이란, CD8+ T 세포 매개성 질환의 발병이 의심되는 개체로서, CD8+ T 세포 매개성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명에서 제공하는 HIF-2α(Hypoxia Inducible Factors 2α) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 이용하여 치료 가능한 개체라면 제한없이 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 “투여”는 본 발명에 따른 조성물을 약학적 유효량으로 개체에 투여하는 것으로서, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 상기 유효성분을 포함하는 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 상기 유효성분을 포함하는 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 “병용”은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이라면 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 “약학적 유효량”은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 μg 내지 500 mg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물은 간에 존재하는 CD8+ 메모리 T 세포 중에서 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포가 조직 상주 집단(Subpopulation)인 것에 기초하여, 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에만 특이적으로 높은 수준으로 존재하는 HIF-2α의 발현 수준 또는 활성을 억제함으로써 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 사멸을 유도하거나, 상기 세포의 기능을 효율적으로 억제할 수 있다. 나아가, 이와 같은 효과를 통해 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방, 개선 또는 치료에 매우 유용하게 적용될 수 있다.
도 1a, 도 1b 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 만성 HBV 감염이 있는 이식 환자의 LSMCs에서 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 항원 특이성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3e는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 바이러스 감염이 있는 환자의 LSMCs에서 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 항원 특이성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 비 간염 바이러스 특이성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6c 및 도 7 내지 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 종류를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 일 실시예에 따른 CD69+CD8+ 메모리 T 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 발현을 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 HIF-2α 단백질이 CD69+CD103+CD8+ 메모리 T 세포에 비하여, CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에 특이적으로 높은 수준으로 존재하는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13a 및 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 HIF-2α 억제제(PT-2385) 처리에 의해 만성 HBV 감염 환자의 LSMCs로부터 분리된 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 선택적 사멸과, 그 기능의 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14a 및 14b는 본 발명의 일 실시예에 따른 급성 바이러스 감염에서 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 표현형을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 구체 예는 HIF-2α(Hypoxia Inducible Factors 2α) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체 예는 CD8+ 메모리 T 세포 또는 그 배양액에 목적하는 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질의 처리 후 HIF-2α 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는, CD8+ T 세포 매개성 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구체 예는 HIF-2α 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자가 존재하는 수준을 측정하는 제제를 포함하는 CD8+ T 세포 노화 측정용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구체 예는 HIF-2α(Hypoxia Inducible Factors 2α) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 약학적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
하기 실시예는 세브란스 병원(서울, 한국)의 기관 검토위원회에서 검토 및 승인되었으며, 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행하였으며, 모든 연구 대상자의 동의를 얻었다.
[준비예 1] 간 관류액 및 말초 혈액으로부터 단핵 세포 분리
6명의 만성 HBV 감염이 있는 간 이식 환자로부터 간 관류액 및 말초 혈액을 채취한 뒤에 여과하였다. 그런 다음, 여과된 간 관류액과 말초 혈액을 원심분리하였다. 이후, Ficoll-Paque(GE Healthcare, USA)로 간 시누소이드 단핵 세포(liver sinusoidal mononuclear cell; LSMCs, 이하, 'LSMCs'라 함)와 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells; PBMCs, 이하, 'PBMCs'라함)를 분리하고, 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)을 포함하는 10 % 디메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO) (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여, 상기 분리된 LSMCs 및 PBMCs를 동결시켰다.
[준비예 2] 조직 침윤 림프구 분석을 위한 종양 조직의 준비
4명의 급성 A형 간염 환자는 코어 니들 생검에 의하여 채취하였고, 5명의 만성 HBV 환자는 간 이식을 하는 동안 채취하였다.
면역 형광 염색을 위하여, 상기 조직들을 4 %의 파라포름 알데히드로 2시간 동안 고정시킨 뒤, 20%의 수크로스가 포함된 PBS(phosphate-buffered saline)로 탈수시켰다. 그런 다음, FSC 22 동결 절편 화합물 (Leica)에 박혀있는 상기 조직을 -70 ℃의 냉동고에 보관하였다.
또한, 유세포 분석(Flow cytometry)을 위해, 종양 해리 키트(Miltenyi Biotec, 독일) 및 GentleMACSTM 디소시에이터(Dissociator)를 사용하여, 상기 조직으로부터 단핵 세포 현탁액을 제조하였다.
[준비예 3] T 세포 분리
CD8+ T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, 독일)를 사용하여, LSMCs PBMCs로부터 CD8+ T 세포를 분리하였다. 그리고, CD69+ 마이크로 비드 키트 Ⅱ(Miltenyi Biotec, 독일)를 사용하여, 상기 분리된 CD8+ T 세포로부터 CD69+CD8+ T 세포를 추가로 분리하였다.
[실시예 1] 만성 HBV 감염이 있는 간 이식 환자의 LSMCs에서 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 항원 특이성 확인
인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen; HLA) 클래스 I 펜타머(pentamers)를 사용하여 만성 HBV 감염이 있는 간 이식 환자로부터 분리된 LSMCs의 항원 특이성을 확인하였다.
실온에서 15분 동안 HLA 클래스 I 멀티머를 이용하여, 해동된 LSMCs를 염색하였다. 그런 다음, 형광이 결합되어 있는 측정하고자 하는 항원에 특이적인 항체들을 상기 세포들과 함께 실온에서 10분 동안 반응시켰다.
LSR Ⅱ 다색 유세포분석기(multicolor flow cytometer)(BD Biosciences, USA)를 이용하여 분석을 수행하였으며, 모든 CD8+ T 세포의 게이팅은 TCRγ/δ+γδ T 세포 및 TCRα7.2+CD161+ 점막-관련 불변 T(mucosal-associated invariant T; MAIT) 세포가 제외될 수 있도록 하였다.
이렇게 얻어진 결과 데이터의 분석은 FlowJo 소프트웨어(Treestar)를 이용하였으며, 그 결과를 도 1a, 도 1b 및 2에 나타내었다.
도 1a 및 1b에 도시된 바와 같이, HBV에 특이적인 LSMCs의 CD69+CD8+ T 세포의 집단에서 CD103- 세포 서브세트 및 CD103+ 세포 서브세트 모두가 존재하는 것을 확인하였다.
또한, 도 2에 도시된 바와 같이, HBV에 특이적인 LSMCs의 CD69+CD8+ T 세포의 집단 중에서 CD103+ 세포 서브세트와 비교하여, CD103- 세포 서브세트에서 T 세포의 말단 분화와 관련된 지표인 TEMRA 세포, CD57+ 세포 및 T-betlowEomeshi 세포가 존재하는 빈도가 더욱 높은 것을 확인하였다.
한편, 인플루엔자 A 바이러스(influenza A virus, IAV), 호흡기 세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus, RSV), 거대 세포 바이러스(cytomegalovirus, CMV) 및 엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)와 같은 비 간염 바이러스(non-hepatotropic virus)에 특이적인 LSMCs로부터 분리된 CD69+CD8+ T 세포의 서브세트를 확인한 결과, 도 3a 내지 3e에 도시된 바와 같이, CD103- 세포 서브세트만이 특이적으로 존재하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, CD103- 세포 서브세트는 노화된 T 세포이며, CD103+ 세포 서브세트에 비하여 세포 증식이 적은 반면, 세포 사멸도 잘 일어나지 않음으로써 CD69+CD8+ 메모리 T 세포 서브세트에서 다수로 존재할 수 있고, CD103- 세포 서브세트는 간염 바이러스뿐만 아니라, 비 간염 바이러스 특이성이 있음을 알 수 있다.
[실시예 2] 간 조직에서 분리된 CD69+CD8+ 메모리 T 세포의 항원 특이성 확인
상기 실시예 1에서 확인된 CD103- 세포 서브세트가 가지는 비 간염 바이러스 특이성이 HBV 감염에 특이적인 것인지 확인하기 위하여, 상기 준비예 2에서 조직으로부터 분리된 CD69+CD8+ 메모리 T 세포에서 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 유세포 분석을 수행하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, CD69+CD8+ 메모리 T 세포 중에서 CD103- 세포 서브세트는 지배적인 집단으로서, CXCR6를 발현하는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 CD103- 세포 서브세트에 CCR7-CD45RA+ TEMRA 세포가 응집되어 있는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 간 관류액에서 분리된 세포에서 확인된 결과와 일치하였다.
또한, 도 5에 도시된 바와 같이, CMV에 특이적인 CD69+CD8+ 메모리 T 세포는 모두 CD103- 세포 서브세트인 반면, HBV에 특이적인 CD69+CD8+ 메모리 T 세포는 CD103- 세포 서브세트와 CD103+ 세포 서브세트가 모두 존재하였다.
상기 결과를 통해, CD69+CD8+ 메모리 T 세포 집단 중에서, HBV에는 CD103- 세포 서브세트와 CD103+ 세포 서브세트가 모두가 특이적인 반면, 비 간염 바이러스에는 CD103- 세포 서브세트만이 특이적인 것임을 알 수 있다.
[실시예 3] CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포 내 존재하는 유전자의 종류 확인
CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에 존재하는 유전자의 종류를 확인하기 위하여, RNA 시퀀싱 및 마이크로 어레이를 통한 전사체 분석(transcriptome analysis)을 수행하였다.
RNeasy 키트(Qiagen, German)를 사용하여, LSMCs로부터 분류된 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포 및 CD69-CD103-CD8+ 메모리 T 세포로부터 전체 RNA를 각각 추출하였다. 그런 다음, 상기 각각의 전체 RNA를 정제, 증폭시킨 뒤에 역전사 과정을 통해 cDNA들을 합성하였다. 그런 다음, TruSeq RNA 접근 라이브러리 프렙 키트(Access library prep kit, Illumina, USA)를 사용하여 상기 cDNA들을 시퀀싱을 위한 라이브러리로 제작하였다. RNA 시퀀싱 분석은 Magrogen Inc.(Korea)에서 수행하였으며, 구체적인 조건은 다음과 같다.
시퀀싱을 위한 기기는 HiSeq2500(Illumina, USA)를 사용하였으며, 시퀀싱 조건은 RAW 리드는 HISAT2 패키지를 통해 참조 게놈(UCSC.hg38)에 정렬되는 조건으로 설정되도록 하고, StringTie 패키지를 이용하여 정렬된 리드에서 사본 어셈블리를 생성하였으며, 유전자의 발현 프로파일은 백만 매핑 리드당 전사체의 킬로베이스당 단편으로 제시될 수 있도록 하였다.
또한, LSMC로부터 분류된 HLA-A*0201-CMVpp65495 펜타머+CD8+ T 세포로부터 전체 RNA를 추출하고, 역전사 과정을 통해 cDNA를 합성하였다. 그런 다음, 합성된 cDNA를 Cy3 염료로 표지하고, Agilent Human 4 X 44K 마이크로 어레이에 혼성화시켰다.
DEGseq R 패키지를 사용하여 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포와 CD69+CD103+CD8+ 메모리 T 세포 집단 내에서 발현의 차이가 나는 유전자를 식별하였다. 여기서, DEG로부터 기능적 에노테이션 정보를 얻기 위하여 DAVID 웹 툴을 사용하였다.
또한 GSEA(Gene set enrichment analysis)를 수행함으로써, CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포와 CD69+CD103+CD8+ 메모리 T 세포간의 표지 유전자 세트를 확인하였으며, 이렇게 확인된 유전자를 기 공개된 조직 상주 유전자 세트(tissue-resident gene sets) 및 최종 분화된 T 세포 유전자 세트(terminally differentiated T-cell gene sets)와 비교하였다.
도 6a 내지 6c 및 도 7 내지 도 9에서 보는 바와 같이, CD69-CD103-CD8+ 메모리 T 세포에 비하여, CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포가 조직 거주와 최종 분화를 나타내는 유전적 특성을 더 많이 나타내었다(도 6a 내지 6c). 또한, DEGs 분석을 통해 확인한 결과, CD69-CD103-CD8+ 메모리 T 세포에 비하여, CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에서 190개의 유전자가 현저하게 상승되었고, 751개의 유전자가 감소된 것을 확인하였다(도 7). 또한, 유전자 온톨로지 분석 및 히트맵 분석 결과, CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에서 케모카인의 활성이 증가되었으며, 림프구 활성화의 감소를 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9).
도 10에서 보는 바와 같이, CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 RNA 시퀀싱 분석 결과와, 간 시누소이드 CMV-특이적 T 세포(liver sinusoidal CMV-specific T cell)의 마이크로어레이 분석 결과에서 유의미하게 발현이 증가된 12개의 중첩 유전자 리스트를 도출해내었다. 상기 12개의 중첩 유전자 중에서 HIF-2α단백질을 암호화하는 EPAS1 유전자만이 유일한 전사 인자에 해당함을 확인하였다.
상기 결과를 통해 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에서, 전사 인자인 HIF-2α 단백질과 그를 암호화하는 EPAS1 유전자의 발현이 특이적으로 높게 존재하는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] CD69+CD8+ 메모리 T 세포에 특이적으로 존재하는 유전자의 검증
PBMC의 전체 CD8+ 메모리 T 세포, LSMCS의 CD69+CD8+ 메모리 T 세포 및 LSMCs의 CD69-CD8+ 메모리 T 세포에서, HIF 표적 유전자, NDRG1 및 SLC2A1 유전자가 존재하는 수준을 정량적으로 확인하여, 그 결과를 도 11a 및 11b에 나타내었다. 여기서, 상기 각 세포들에서의 전체 RNA 추출을 위하여 RNeasy 키트(Qiagen, German)를 사용하였으며, 상기 유전자가 존재하는 수준을 정량적으로 확인하기 위해 Master Mix(Legene)를 이용하여 상기 추출된 RNA로부터 cDNA를 합성하였으며, HIF1A 유전자, EPAS1 유전자, NDRG1 유전자 및 SLC2A1 유전자 각각에 대한 프로브(Thermo Scientific, USA)를 이용한 TaqMan 실시간 PCR 어세이를 수행하였다.
도 11a 및 11b에서 보는 바와 같이, PBMC의 전체 CD8+ 메모리 T 세포와 LSMCs의 CD69-CD8+ 메모리 T 세포에 비하여, CD69+CD8+ 메모리 T 세포에 특이적으로 HIF 표적 유전자인 HIF1A 유전자 및 EPAS1 유전자 중에서 EPAS1 유전자와 NDRG1 및 SLC2A1 유전자가 높은 수준으로 존재하는 것을 확인하였다.
[실시예 5] CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에서 HIF-2α의 존재 수준 검증
LSMCs의 CD69+CD8+ 메모리 T 세포의 CD103- 세포 서브세트와 CD103+ 세포 서브세트 중 어떠한 서브세트에 EPAS1 유전자에 의해 암호화되는 HIF-2α 단백질이 더 높은 수준으로 존재하는지 확인하기 위하여 상기 실시예 1에 기재된 방법과 동일한 유세포 분석을 수행하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 보는 바와 같이, CD69+CD103+CD8+ 메모리 T 세포에 비하여 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에서 특이적으로 HIF-2α 단백질이 존재하는 것을 확인하였다.
[실시예 6] 만성 HBV 감염 환자의 LSMCs로부터 분류된 CD69+CD8+ 메모리 T 세포에서 활성 유지 및 세포 사멸 확인
만성 HBV 감염 환자로부터 얻어진 LSMCs의 CD69+CD8+ 메모리 T 세포의 CD103- 세포 서브세트와 CD103+ 세포 서브세트에서 TCR(T cell receptor) 반응성을 확인하였다. 세포를 자극하기 위하여, LSMCs 및 10%의 우태아혈청이 포함된 RPMI 배양액에 1μg/mL의 HBVcore 중첩 펩타이드를 처리하고, 1시간 동안 배양하였으며, Brefeldin A(BD Biosciences), monensin(BD Biosciences) 및 CD107a 항체(PE- 또는 FITC- 접합)를 추가로 첨가한 뒤, 5시간 동안 더 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양이 완료된 세포를 세척한 뒤, 특정 표면 마커에 대한 형광이 접합되어 있는 항체를 넣고 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양된 세포에서 세포 투과성을 수행하고, 세포 내 사이토카인(IFN-γ, IL-2, TNF-α)을 염색한 뒤, 유동세포계측법 분석을 수행하여, 그 결과를 도 13a 및 13b에 나타내었다.
도 13a에서 보는 바와 같이, HIF-2α의 길항제인 PT-2385를 투여하는 경우, HBVcore 중첩 펩타이드로 자극된 CD69+CD8+메모리 T 세포 중에서, CD103+ 세포 서브세트에 비하여 CD103- 세포 서브세트에서 IFN-γ+ TNF+ 또는 IL-2+ 세포의 빈도가 현저하게 낮은 것을 확인하였다.
또한, 도 13b에서 보는 바와 같이, CD103- 세포 서브세트에서 HBVcore 중첩 펩타이드에 의해 유도된 사이토카인의 생성은 PT-2385의 투여에 의해 억제될 수 있으나, CD103+ 세포 서브세트에서는 PT-2385의 투여에도 불구하고 사이토카인의 생성이 억제되지 않았다.
상기 결과를 통해, CD8+ 메모리 T 세포에서 주로 기능을 담당하는 집단인 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 활성 유지와 세포의 생존에 HIF-2α가 필수적인 것임을 알 수 있다.
[실시예 7] 급성 바이러스 감염에서 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 표현형 확인
A형 급성 바이러스 감염 환자로부터 얻어진 LSMCs에서 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 빈도와 표현형을 상기 실시예 1에서와 동일한 방법을 통해 확인하여, 그 결과를 도 14a 및 14b에 나타내었다.
도 14a 및 14b에서 보는 바와 같이, 급성 A형 바이러스에 감염된 환자의 간으로부터 얻어진 CD69+CD8+ 메모리 T 세포의 95% 이상은 CD103- 세포 서브세트인 것을 확인하였다. 또한, CD103+ 세포 서브세트에 비하여, 상기 CD103- 세포 서브세트에서는 TEMRA 세포 및 HIF-2α 단백질이 존재하는 수준이 증가되어 있는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 급성 바이러스 감염 동안 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 특징이 유지되고 있는 것을 알 수 있다. 나아가, HIF-2α 단백질을 암호화하는 유전자를 억제하는 약물에 의한 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 사멸을 유도를 통해 급성 바이러스 감염과 같은 질환을 치료할 수 있음을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 본 발명은 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 상기 조성물은 간에 존재하는 CD8+ 메모리 T 세포 중에서 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포가 조직 상주 집단(Subpopulation)인 것에 기초하여, 상기 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포에만 특이적으로 높은 수준으로 존재하는 HIF-2α의 발현 수준 또는 활성을 억제함으로써 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포의 사멸을 유도하거나, 그 기능을 효과적으로 억제할 수 있다. 나아가, 이와 같은 효과를 통해 CD8+ 메모리 T 세포 매개성 질환의 예방, 개선 또는 치료에 매우 유용하게 적용될 수 있다.
서열번호 1: HIF-2 alpha 아미노산 서열(UniProtKB - Q99814 (EPAS1_HUMAN) 참고)
MTADKEKKRSSSERRKEKSRDAARCRRSKETEVFYELAHELPLPHSVSSHLDKASIMRLA
ISFLRTHKLLSSVCSENESEAEADQQMDNLYLKALEGFIAVVTQDGDMIFLSENISKFMG
LTQVELTGHSIFDFTHPCDHEEIRENLSLKNGSGFGKKSKDMSTERDFFMRMKCTVTNRG
RTVNLKSATWKVLHCTGQVKVYNNCPPHNSLCGYKEPLLSCLIIMCEPIQHPSHMDIPLD
SKTFLSRHSMDMKFTYCDDRITELIGYHPEELLGRSAYEFYHALDSENMTKSHQNLCTKG
QVVSGQYRMLAKHGGYVWLETQGTVIYNPRNLQPQCIMCVNYVLSEIEKNDVVFSMDQTE
SLFKPHLMAMNSIFDSSGKGAVSEKSNFLFTKLKEEPEELAQLAPTPGDAIISLDFGNQN
FEESSAYGKAILPPSQPWATELRSHSTQSEAGSLPAFTVPQAAAPGSTTPSATSSSSSCS
TPNSPEDYYTSLDNDLKIEVIEKLFAMDTEAKDQCSTQTDFNELDLETLAPYIPMDGEDF
QLSPICPEERLLAENPQSTPQHCFSAMTNIFQPLAPVAPHSPFLLDKFQQQLESKKTEPE
HRPMSSIFFDAGSKASLPPCCGQASTPLSSMGGRSNTQWPPDPPLHFGPTKWAVGDQRTE
FLGAAPLGPPVSPPHVSTFKTRSAKGFGARGPDVLSPAMVALSNKLKLKRQLEYEEQAFQ
DLSGGDPPGGSTSHLMWKRMKNLRGGSCPLMPDKPLSANVPNDKFTQNPMRGLGHPLRHL
PLPQPPSAISPGENSKSRFPPQCYATQYQDYSLSSAHKVSGMASRLLGPSFESYLLPELT
RYDCEVNVPVLGSSTLLQGGDLLRALDQAT
서열번호 2: EPAS1 유전자 (NM_001430 참고)
1 acactcgcga gcggaccgcc acacgggtcc ggtgcccgct gcgcttccgc cccagcgctc
61 ctgaggcggc cgtacaatcc tcggcagtgt cctgagactg tatggtcagc tcagcccggc
121 ctccgactcc ttccgactcc cagcattcga gccacttttt tttttctttg aaaactcaga
181 aaagtgactc cttttccagg gaaaaaggaa cttgggttcc cttctctccg tcctcttttc
241 gggtctgaca gcctccaccc actccttccc cggaccccgc ctccgcgcgc aggttcctcc
301 cagtcacctt tctccacccc cgcccccgca cctagcccgc cgcgcgccac cttccacctg
361 actgcgcggg gcgctcggga cctgcgcgca cctcggacct tcaccacccg cccgggccgc
421 ggggagcgga cgagggccac agccccccac ccgccaggga gcccaggtgc tcggcgtctg
481 aacgtctcaa agggccacag cgacaatgac agctgacaag gagaagaaaa ggagtagctc
541 ggagaggagg aaggagaagt cccgggatgc tgcgcggtgc cggcggagca aggagacgga
601 ggtgttctat gagctggccc atgagctgcc tctgccccac agtgtgagct cccatctgga
661 caaggcctcc atcatgcgac tggcaatcag cttcctgcga acacacaagc tcctctcctc
721 agtttgctct gaaaacgagt ccgaagccga agctgaccag cagatggaca acttgtacct
781 gaaagccttg gagggtttca ttgccgtggt gacccaagat ggcgacatga tctttctgtc
841 agaaaacatc agcaagttca tgggacttac acaggtggag ctaacaggac atagtatctt
901 tgacttcact catccctgcg accatgagga gattcgtgag aacctgagtc tcaaaaatgg
961 ctctggtttt gggaaaaaaa gcaaagacat gtccacagag cgggacttct tcatgaggat
1021 gaagtgcacg gtcaccaaca gaggccgtac tgtcaacctc aagtcagcca cctggaaggt
1081 cttgcactgc acgggccagg tgaaagtcta caacaactgc cctcctcaca atagtctgtg
1141 tggctacaag gagcccctgc tgtcctgcct catcatcatg tgtgaaccaa tccagcaccc
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1261 gaagttcacc tactgtgatg acagaatcac agaactgatt ggttaccacc ctgaggagct
1321 gcttggccgc tcagcctatg aattctacca tgcgctagac tccgagaaca tgaccaagag
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1561 ggtgttctcc atggaccaga ctgaatccct gttcaagccc cacctgatgg ccatgaacag
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1681 gctaaaggag gagcccgagg agctggccca gctggctccc accccaggag acgccatcat
1741 ctctctggat ttcgggaatc agaacttcga ggagtcctca gcctatggca aggccatcct
1801 gcccccgagc cagccatggg ccacggagtt gaggagccac agcacccaga gcgaggctgg
1861 gagcctgcct gccttcaccg tgccccaggc agctgccccg ggcagcacca cccccagtgc
1921 caccagcagc agcagcagct gctccacgcc caatagccct gaagactatt acacatcttt
1981 ggataacgac ctgaagattg aagtgattga gaagctcttc gccatggaca cagaggccaa
2041 ggaccaatgc agtacccaga cggatttcaa tgagctggac ttggagacac tggcacccta
2101 tatccccatg gacggggaag acttccagct aagccccatc tgccccgagg agcggctctt
2161 ggcggagaac ccacagtcca ccccccagca ctgcttcagt gccatgacaa acatcttcca
2221 gccactggcc cctgtagccc cgcacagtcc cttcctcctg gacaagtttc agcagcagct
2281 ggagagcaag aagacagagc ccgagcaccg gcccatgtcc tccatcttct ttgatgccgg
2341 aagcaaagca tccctgccac cgtgctgtgg ccaggccagc acccctctct cttccatggg
2401 gggcagatcc aatacccagt ggcccccaga tccaccatta cattttgggc ccacaaagtg
2461 ggccgtcggg gatcagcgca cagagttctt gggagcagcg ccgttggggc cccctgtctc
2521 tccaccccat gtctccacct tcaagacaag gtctgcaaag ggttttgggg ctcgaggccc
2581 agacgtgctg agtccggcca tggtagccct ctccaacaag ctgaagctga agcgacagct
2641 ggagtatgaa gagcaagcct tccaggacct gagcgggggg gacccacctg gtggcagcac
2701 ctcacatttg atgtggaaac ggatgaagaa cctcaggggt gggagctgcc ctttgatgcc
2761 ggacaagcca ctgagcgcaa atgtacccaa tgataagttc acccaaaacc ccatgagggg
2821 cctgggccat cccctgagac atctgccgct gccacagcct ccatctgcca tcagtcccgg
2881 ggagaacagc aagagcaggt tccccccaca gtgctacgcc acccagtacc aggactacag
2941 cctgtcgtca gcccacaagg tgtcaggcat ggcaagccgg ctgctcgggc cctcatttga
3001 gtcctacctg ctgcccgaac tgaccagata tgactgtgag gtgaacgtgc ccgtgctggg
3061 aagctccacg ctcctgcaag gaggggacct cctcagagcc ctggaccagg ccacctgagc
3121 caggccttct acctgggcag cacctctgcc gacgccgtcc caccagcttc actctctccg
3181 tctgtttttg caactaggta tttctaacgc cagcacacta tttacaagat ggacttacct
3241 ggcagacttg cccaggtcac caagcagtgg cctttttctg agatgctcac tttattatcc
3301 ctatttttaa agtacacaat tgttttacct gttctgaaat gttcttaaat tttgtaggat
3361 ttttttcctc cccaccttca atgacttcta atttatatta tccataggtt tctctccctc
3421 cttctccttc tcacacacaa ctgtccatac taacaagttt ggtgcatgtc tgttcttctg
3481 tagggagaag ctttagcttc attttactaa aaagattcct cgttattgtt gttgccaaag
3541 agaaacaaaa atgattttgc tttccaagct tggtttgtgg cgtctccctc gcagagccct
3601 tctcgtttct tttttaaact aatcaccata ttgtaaattt cagggttttt ttttttttgt
3661 ttaagctgac tctttgctct aattttggaa aaaaagaaat gtgaagggtc aactccaacg
3721 tatgtggtta tctgtgaaag ttgcacagcg tggcttttcc taaactggtg tttttccccc
3781 gcatttggtg gattttttat tattattcaa aaacataact gagtttttta aaagaggaga
3841 aaatttatat ctgggttaag tgtttatcat atatatgggt actttgtaat atctaaaaac
3901 ttagaaacgg aaatggaatc ctgctcacaa aatcacttta agatcttttc gaagctgtta
3961 atttttctta gtgttgtgga cactgcagac ttgtccagtg ctcccacggc ctgtacggac
4021 actgtggaag gcctccctct gtcggctttt tgccatctgt gatatgccat aggtgtgaca
4081 atccgagcag tggagtcatt cagcgggagc actgcgcgct atcccctcac attctctatg
4141 tactatgtat gtatgtatta ttattattgc tgccaagagg gtctgatggc acgttgtggg
4201 gtcggggggt ggggcgggga agtgctctaa cttttcttaa ggttttgttg ctagcccttc
4261 aagtgcactg agctatgtga ctcggatggt ctttcacacg gcacatttgg acatttccag
4321 aactaccatg agatggttta gacgggaatt catgcaaatg aggggtcaaa aatggtatag
4381 tgaccccgtc cacgtcctcc aagctcacga ccttggagcc ccgtggagct ggactgagga
4441 ggaggctgca cagcgggaga gcagctggtc cagaccagcc ctgcagcccc cactcagccg
4501 gcagccagat ggccccgcaa ggcctccagg gatggcccct agccacaggc cctggctgag
4561 gtctctgggt cggtcagtga catgtaggta ggaagcactg aaaatagtgt tcccagagca
4621 ctttgcaact ccctgggtaa gagggacgac acctctggtt tttcaatacc aattacatgg
4681 aacttttctg taatgggtac aatgaagaag tttctaaaaa cacacacaaa gcacattggg
4741 ccaactattt agtaagcccg gatagactta ttgccaaaaa caaaaaatag ctttcaaaag
4801 aaatttaagt tctatgagaa attccttagt catggtgttg cgtaaatcat attttagctg
4861 cacggcatta ccccacacag ggtggcagaa cttgaagggt tactgacgtg taaatgctgg
4921 tatttgattt cctgtgtgtg ttgccctggc attaagggca ttttaccctt gcagttttac
4981 taaaacactg aaaaatattc caagcttcat attaacccta cctgtcaacg taacgatttc
5041 atgaacgtta ttatattgtc gaattcctac tgacaacatt ataactgtat gggagcttaa
5101 ctttataagg aaatgtattt tgacactggt atcttattaa agtattctga tccta

Claims (22)

  1. HIF-2α(Hypoxia Inducible Factors 2α) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 억제제는 CD8+ T 세포의 집단 중에서, CD8+CD103-CD69+ 메모리 T 세포의 선택적인 사멸을 유도하거나, 그 기능이 억제되도록 하는 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 억제제는 상기 HIF-2α의 mRNA가 존재하는 수준을 낮출 수 있는 올리고뉴클레오티드인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 억제제는 화학 물질인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 화학 물질은 하기 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019017416-appb-I000008
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019017416-appb-I000009
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2019017416-appb-I000010
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2019017416-appb-I000011
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2019017416-appb-I000012
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2019017416-appb-I000013
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2019017416-appb-I000014
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 CD8+ T 세포 매개성 질환은 CD8+ T 세포에 의해 유발된 간 질환인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 간 질환은 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 자가 면역성 간염, 비 알코올성 지방간 질환, 급성 간염 및 간 섬유화로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. HIF-2α(Hypoxia Inducible Factors 2α) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 CD8+ T 세포 매개성 질환은 CD8+ T 세포에 의해 유발된 간 질환인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 간 질환은 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 자가 면역성 간염, 비 알코올성 지방간 질환, 급성 간염 및 간 섬유화로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  11. CD8+ 메모리 T 세포 또는 그 배양액에 목적하는 후보물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보물질의 처리 후 HIF-2α 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는, CD8+ T 세포 매개성 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 CD8+ 메모리 T 세포는 CD69+CD103-CD8+ 메모리 T 세포인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 후보물질의 처리 후 측정된 HIF-2α 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준이 후보물질 처리 전에 비하여 감소한 경우 상기 후보물질을 CD8+ T 세포 매개성 질환의 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, CD8+ T 세포 매개성 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  14. 제 11항에 있어서,
    상기 CD8+ T 세포 매개성 질환은 CD8+ T 세포에 의해 유발된 간 질환인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 간 질환은 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 자가 면역성 간염, 비 알코올성 지방간 질환, 급성 간염 및 간 섬유화로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  16. HIF-2α 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자가 존재하는 수준을 측정하는 제제를 포함하는 CD8+ T 세포 노화 측정용 조성물.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 단백질이 존재하는 수준을 측정하는 제제는 HIF-2α 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인, CD8+ T 세포 노화 측정용 조성물.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 유전자가 존재하는 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 쌍, 프로 (probe) 또는 안티센스(anti-sense) 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, CD8+ T 세포 노화 측정용 조성물.
  19. 제 16항 내지 제 18항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, CD8+ T 세포 노화 측정용 키트.
  20. HIF-2α(Hypoxia Inducible Factors 2α) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 약학적 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 CD8+ T 세포 매개성 질환은 CD8+ T 세포에 의해 유발된 간 질환인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 간 질환은 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 자가 면역성 간염, 비 알코올성 지방간 질환, 급성 간염 및 간 섬유화로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, CD8+ T 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료 방법.
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