Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

WO2020055293A1 - Pacas9 nuclease - Google Patents

Pacas9 nuclease Download PDF

Info

Publication number
WO2020055293A1
WO2020055293A1 PCT/RU2019/050154 RU2019050154W WO2020055293A1 WO 2020055293 A1 WO2020055293 A1 WO 2020055293A1 RU 2019050154 W RU2019050154 W RU 2019050154W WO 2020055293 A1 WO2020055293 A1 WO 2020055293A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nuclease
pacas9
nucleic acid
sequence
sequences
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/050154
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Дмитрий Александрович МАДЕРА
Александр Владимирович КАРАБЕЛЬСКИЙ
Роман Алексеевич ИВАНОВ
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Константин Викторович СЕВЕРИНОВ
Сергей Анатольевич ШМАКОВ
Дмитрий Александрович СУТОРМИН
Георгий Евгеньевич ПОБЕГАЛОВ
Александра Андреевна ВАСИЛЬЕВА
Полина Анатольевна СЕЛЬКОВА
Анатолий Николаевич АРСЕНИЕВ
Татьяна Игоревна ЗЮБКО
Яна Витальевна ФЕДОРОВА
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CN201980075402.9A priority Critical patent/CN113272425B/en
Priority to MX2021002933A priority patent/MX2021002933A/en
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Биокад" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority to PE2021000323A priority patent/PE20211111A1/en
Priority to EP19858873.3A priority patent/EP3851522A4/en
Priority to US17/276,016 priority patent/US20220064612A1/en
Priority to JP2021513998A priority patent/JP2022500044A/en
Priority to BR112021004746-8A priority patent/BR112021004746A2/en
Priority to KR1020217011069A priority patent/KR20210062040A/en
Priority to MA53045A priority patent/MA53045B1/en
Priority to EA202190676A priority patent/EA202190676A1/en
Priority to CA3113215A priority patent/CA3113215A1/en
Priority to AU2019341014A priority patent/AU2019341014A1/en
Publication of WO2020055293A1 publication Critical patent/WO2020055293A1/en
Priority to ZA2021/01681A priority patent/ZA202101681B/en
Priority to CONC2021/0003285A priority patent/CO2021003285A2/en
Priority to PH12021550563A priority patent/PH12021550563A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/007—Vectors comprising a special translation-regulating system cell or tissue specific

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, molecular biology and medicine, namely to a nuclease enzyme and the use of this nuclease enzyme. More specifically, the present invention relates to the PaCas9 nuclease enzyme.
  • the invention also relates to a nucleic acid encoding a given nuclease, a genetic construct, an expression vector, a delivery vector that include a given nucleic acid, a liposome comprising a given nuclease or nucleic acid encoding a given nuclease, a method for producing a nuclease, delivery methods, and also a host cell that includes a nucleic acid encoding a given nuclease.
  • CRISPR-Cas was first demonstrated that the adaptive immune system in many bacteria and most archaea (Barrangou et al., 2007, Science 315: 17091712, Brouns et al., 2008, Science 321: 960-964). So far, three types of CRISPR-Cas systems have been characterized based on functional and structural criteria, most of which use small RNA molecules as hydro-RNAs to direct DNA targets to complementary sequences (Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol 9 : 467-477, Van der Oost et al., 2014, Nat Rev Microbiol 12: 479-492).
  • Cas9 was used to edit the genomes of a number of eukaryotic cells (e.g., fish, plants, humans) (Charpentier and Doudna, 2013, Nature 495: 50-51).
  • eukaryotic cells e.g., fish, plants, humans
  • Cas9 was used to improve homologous recombination yields in bacteria by selecting targeted recombination events (Jiang et al., 2013, Nature Biotechnol 31: 233–239).
  • a toxic fragment (directing construct) is subjected to joint transfection with a rescue fragment bearing the desired change (editing construct carrying a point mutation or deletion).
  • the guide construct consists of Cas 9 in combination with the constructed CRISPR and antibiotic resistance marker, determining the site of the desired recombination on host chromosome; in the presence of an appropriate antibiotic, the integration of the guide construct into the host chromosome is selected.
  • CRISPR-Cas mediated genome editing has been found to be a useful tool for genetic engineering. It has been established that CRISPR prokaryotic systems serve their hosts as adaptive immune systems (Jinek et al., 20T2, Science 337: 816-821) and can be used for fast and efficient genetic engineering (e.g., Mali et al., 2013, Nat Methods 10: 957-963), requiring only modification of the guide sequence to direct to sequences of interest.
  • the present invention relates to PaCas9 nuclease with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule that encodes PaCas9 nuclease, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention relates to an expression vector comprising a nucleic acid with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the expression vector is the genetic construct shown in FIG. 1, PpCas9-T2A-GFP-sgRNAl-MCS-sgRNA2-MCS.
  • the present invention relates to a vector for delivering a therapeutic agent comprising a nucleic acid of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the vector delivers a therapeutic agent to target cells or target tissues.
  • the present invention relates to a liposome for delivering a therapeutic agent comprising PaCas9 nuclease with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the liposome delivers a therapeutic agent to target cells or target tissues.
  • the present invention relates to a method for delivering a therapeutic agent to a target cell or target tissue using the above vector or the above liposome.
  • the above vector or the above liposome is introduced into the body of a mammal.
  • the present invention relates to a method for producing a host cell for producing PaCas9 nuclease with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which comprises transforming a cell with any of the above vectors.
  • the present invention relates to a method for producing PaCas9 nuclease, comprising culturing the aforementioned host cell in a culture medium under the conditions necessary to obtain said PaCas9 nuclease, optionally, followed by isolation and purification of the obtained PaCas9 nuclease.
  • FIG. 1 The ring diagram of the plasmid PpCas9-T2A-GFP-sgRNAl-MCS-sgRNA2-MCS, designed to generate PpCas9 nuclease in mammalian cells.
  • AmpR - beta-lactamase gene that provides resistance to ampicillin
  • NLS signals for nuclear localization NLS
  • FI ori is the origin of replication, which allows the plasmid to be packaged into phage particles during co-transformation with helper phages,
  • each cassette contains a U6 promoter and an RNA polymerase III transcription terminator.
  • FIG. 2 Amino acid sequence of PaCas9 nuclease with domain distribution.
  • the terms in the singular include the terms in the plural, and the terms in the plural include the terms in the singular.
  • the classification and methods used for cell cultivation, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, analytical chemistry, chemistry of organic synthesis, medical and pharmaceutical chemistry, as well as hybridization and chemistry of protein and nucleic acids described in this document are well known to specialists and widely used in this field. Enzymatic reactions and purification methods are carried out in accordance with the manufacturer's instructions, as is usually done in the art, or as described herein.
  • mammal any animal classified as a mammal, including primates, humans, rodents, canine, feline, cattle, small cattle, horses, pigs, etc. d.
  • Nucleases are a large group of enzymes that hydrolyze a phosphodiester bond between nucleic acid subunits.
  • nucleases There are several types of nucleases depending on their specificity and activity: exonuclease and endonuclease, ribonuclease and deoxyribonuclease, restrictase and some others. Restriction enzymes occupy an important position in applied molecular biology.
  • PaCas9 nuclease is a deoxyribonuclease type.
  • PaCas9 nuclease is capable of cleaving DNA, including the target nucleic acid sequence, by binding to at least one RNA molecule that recognizes the target sequence.
  • PaCas9 nuclease contains two endonuclease domains that introduce single-stranded breaks one at a time and, acting together, a double-stranded break.
  • PaCas9 nuclease is an effector enzyme of type II CRISPR-Cas system (second type nuclease). PaCas9 nuclease is capable of creating a double-stranded DNA gap with a highly specific recognition site (16-20 letters).
  • PaCas9 nuclease DNA is presented in SEQ ID N0: 1.
  • the figure 2 shows the amino acid sequence of PaCas9 nuclease with domain distribution.
  • PaCas9 nuclease is associated with an isolated cluster of regularly arranged groups of short palindromic repeats (CRISPR), as well as other components of the CRISPR-Cas system adjacent to it: crRNA and tracrRNA sequences.
  • CRISPR short palindromic repeats
  • nucleotide sequence encoding tracrRNA is presented in SEQ ID NO: 3.
  • nucleotide sequence encoding a direct repeat of DR presented in SEQ ID NO: 4.
  • crRNA consists of the variable part, depending on the target, and the sequence of direct repeat DR, presented in SEQ ID NO: 4.
  • therapeutic agent in this invention is meant a PaCas9 nuclease with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an isolated nucleic acid molecule that encodes PaCas9 nuclease with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • tracrRNA (trans-activating crRNA) is a small transcoded RNA.
  • CRISPR from the English Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; short palindromic repeats regularly arranged in groups
  • CRISPR are special loci of bacteria and archaea, consisting of direct repeating sequences that are separated by unique sequences (spacers).
  • nucleic acid means a clear sequence of nucleotides, modified or not modified defining a fragment or region of a nucleic acid containing or not containing unnatural nucleotides and being either double-stranded DNA or RNA, or a single-chain stranded DNA or RNA or the transcription product of said DNA.
  • nucleotide sequences in their natural chromosome environment i.e. in a natural state.
  • the sequences of this invention were isolated and / or purified, i.e. were taken directly or indirectly, for example, by copying, while their environment was at least partially modified. So also this should include isolated nucleic acids obtained by genetic recombination, for example, using host cells (host cells), or obtained by chemical synthesis.
  • An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one impurity nucleic acid molecule with which it is usually associated in a natural source of a nuclease nucleic acid.
  • An isolated nucleic acid molecule differs from the form or kit in which it is found in vivo. Thus, the isolated nucleic acid molecule is different from the nucleic acid molecule that exists in cells in vivo.
  • the isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule located in cells in which nuclease expression normally occurs, for example, if the nucleic acid molecule has a localization in the chromosome that is different from its localization in cells in vivo.
  • nucleotide sequence covers its compliment, unless otherwise indicated.
  • a nucleic acid having a specific sequence should be understood as encompassing its complementary chain with its complementary sequence.
  • control sequences refers to DNA sequences necessary for the expression of a functionally linked coding sequence in a particular host organism.
  • Suitable control sequences for prokaryotes are, for example, a promoter, optionally an operator and a ribosome binding site.
  • promoters, polyadenylation signals, and enhancers are present in eukaryotic cells.
  • a nucleic acid is “operably linked” if it is in functional association with another nucleotide sequence.
  • DNA of a presequence or secretory leader sequence is operably linked to the DNA of a polypeptide if it is expressed as a preprotein that is involved in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence, if located so that it can facilitate translation.
  • “operably linked” means that the linked DNA sequences are contiguous, and in the case of a secretory leader sequence, are contiguous and are in the reading phase. However, enhancers do not have to be contiguous.
  • vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • vectors can be integrated into the genome of the host cell when introduced into the host cell, and thus replicate together with the host gene.
  • some vectors are capable of directing the expression of the genes with which they are functionally linked. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply
  • the present invention relates to a vector suitable for expression of any of the nucleotide sequences described herein.
  • the present invention relates to vectors containing nucleic acid molecules that encode RaCaz9 nuclease.
  • the PaCas9 nuclease of the invention is expressed by inserting DNA into expression vectors, such that the genes are operably linked to desired expression control sequences, such as transcriptional and translational control sequences.
  • Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), plant viruses such as cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic viruses, cosmids, YAC, EBV derived episomas and the like.
  • DNA molecules can be ligated into a vector so that sequences that control transcription and translation in the vector fulfill the intended function of regulating the transcription and translation of DNA.
  • the expression vector and expression control sequences may be selected so as to be compatible with the expression host cell used.
  • DNA molecules can be introduced into the expression vector by standard methods (for example, by ligation of complementary restriction sites on a fragment of the PaCas9 nuclease gene and vector or by ligation of blunt ends if there are no restriction sites).
  • recombinant expression of the vectors of this invention may carry regulatory sequences, which control the expression of the PaCas9 nuclease gene in the host cell.
  • regulatory sequences which control the expression of the PaCas9 nuclease gene in the host cell.
  • the design of the expression vector including the choice of regulatory sequences, may depend on factors such as selection of the host cell for transformation, expression level of the desired protein, etc.
  • Preferred regulatory sequences for an expressing mammalian host cell include viral elements providing a high level of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from retroviral LTR, cytomegalovirus (CMV) (e.g.
  • CMV promoter / enhancer monkey virus 40 (SV40) (e.g. SV40 promoter / enhancer), adenovirus, (e.g. Late Adenovirus late promoter (AdMLP)), polyoma virus, as well as strong mammalian promoters such as the native promoter x immunoglobulins or actin promoter.
  • SV40 monkey virus 40
  • AdMLP Late Adenovirus late promoter
  • polyoma virus as well as strong mammalian promoters such as the native promoter x immunoglobulins or actin promoter.
  • the recombinant expression vectors of the invention may carry additional sequences, such as sequences that regulate vector replication in host cells (eg, replication origin) and selectable marker genes.
  • the selectable marker gene facilitates the selection of host cells into which the vector has been introduced (see, for example, US patents 4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017).
  • a selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, to the host cell into which the vector is introduced.
  • breeding marker genes include the dihydrofolate reductase gene (DHFR) (for use in dhfr host cells for the selection / amplification of methotrexate), the neo gene (for G418 selection), and the glutamate synthetase gene.
  • DHFR dihydrofolate reductase gene
  • neo for G418 selection
  • glutamate synthetase gene for use in dhfr host cells for the selection / amplification of methotrexate
  • glutamate synthetase gene glutamate synthetase gene
  • expression control sequence means polynucleotide sequences that are necessary to affect the expression and processing of the coding sequences to which they are ligated.
  • Expression control sequences include corresponding transcription, termination, promoter and enhancer initiation sequences; effective RNA processing signals, such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize the cytoplasmic mRNA; sequences that increase translation efficiency (i.e., Kozak consensus sequence); sequences that enhance protein stability; and, if desired, sequences that enhance protein secretion.
  • control sequences vary depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and transcription termination sequences; in eukaryotes, typically, such control sequences include promoters and transcription termination sequences.
  • control sequences includes at least all components whose presence is important for expression and processing, and may also include additional components whose presence is useful, for example, leading sequences and sequences of fused cells.
  • recombinant host cell means a cell into which a recombinant expression vector has been introduced.
  • the present invention relates to host cells, which may include, for example, a vector in accordance with the present invention described above. It should be understood that “recombinant host cell” and “host cell” mean not only the specific cell claimed, but also the progeny of such a cell. Since modifications can occur in subsequent generations due to mutations or environmental influences, such offspring may not, in fact, be identical to the parent cell, but such cells are still included in the scope of the term “host cell” as used herein.
  • Nucleic acid molecules encoding the PaCas9 nuclease of the invention and vectors containing these nucleic acid molecules can be used to transfect a suitable mammal or its cell, plant or its cell, bacterial or yeast host cell.
  • the conversion can occur by any known method for introducing polynucleotides into a host cell.
  • Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are well known in the art and include dextran-mediated transfection, transfection with a complex of nucleic acid and a positively charged polymer, transfection with nucleic acid and calcium phosphate precipitate, polybrin-mediated transfection, protoplast fusion and lipid transfection direct microinjection of DNA into the nucleus.
  • nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells by viral vectors.
  • Cell transfection methods are well known in the art. See, for example, U.S. Patents 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 and 4,959,455.
  • Methods for transforming plant cells are well known in the art, including, for example, Agrobacterium-mediated transformation, biolistic transformation, direct injection, electroporation and viral transformation.
  • Methods for transforming bacterial and yeast cells are also well known in the art.
  • Mammalian cell lines used as hosts for transformation are well known in the art and include many immoralized available cell lines. These include, for example, Chinese hamster ovary cells (CHO), NS0 cells, SP2 cells, HEK-293T cells, 293 Freestyle cells (Invitrogen), NIH-3T3 cells, HeLa cells, hamster kidney cells (BHK), African kidney cells green monkeys (COS), human hepatocellular carcinoma cells (e.g., Hep G2), A549 cells, and a number of other cell lines. Cell lines are selected by determining which cell lines have high levels of expression and provide the necessary characteristics of the protein produced. Other cell lines that can be used are insect cell lines, such as Sf9 or Sf21 cells.
  • PaCas9 nuclease When recombinant expression vectors encoding PaCas9 nuclease are introduced into mammalian host cells, PaCas9 nuclease is produced by culturing the host cells for a sufficient time to express PaCas9 nuclease in the host cells or, preferably, isolating PaCas9 nuclease into a culture medium in which host cells are grown. PaCas9 nuclease can be isolated from the culture medium using standard protein purification methods. Plant host cells, for example, include Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, corn, wheat, potatoes, etc. Host bacteria cells include Escherichia and Streptomyces species. Yeast host cells include Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris.
  • the level of production of PaCas9 nuclease of the invention from a producing cell line can be enhanced using a number of known methods.
  • the glutamine synthetase gene expression system (GS system) is common enough to enhance expression under certain conditions.
  • the GS system is discussed in whole or in part in connection with patents EP 0216846, 0256055, 0323997 and 0338841.
  • PaCas9 nuclease obtained from different cell lines or transgenic animals, will differ from each other by a glycosylation profile.
  • PaCas9 nuclease encoded by the nucleic acid molecules described herein is part of this invention, regardless of the state of glycosylation and in general, regardless of the presence or absence of post-translational modifications.
  • the present invention relates to liposomes in which PaCas9 nuclease is encapsulated with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or isolated a nucleic acid molecule that encodes a PaCas9 nuclease with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Liposomes are microscopic closed vesicles that have an internal phase surrounded by one or more lipid bilayers and are capable of retaining water-soluble material in the internal phase, and oil-soluble material in a phospholipid bilayer.
  • important tasks are the highly efficient capture of the active compound into the liposome and ensuring stable retention of the active compound by the liposome.
  • a liposome is a particle with a predominant size from several tens of nanometers up to tenths of microns, inside the shell of which are molecules of another substance (s).
  • the liposome membrane is “semi-permeable” to water molecules and ions.
  • Liposomes are characterized by the ability to incorporate and retain substances of various nature.
  • the range of substances included in liposomes is quite wide - from inorganic ions and low molecular weight organic compounds to large proteins and nucleic acids.
  • Liposomes provide a sustained release of a substance enclosed in a carrier.
  • Liposomes can be made from phospholipid, in particular from phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, sphingophospholipid, egg phospholipids or soybeans or mixtures thereof.
  • the desired gene segments were obtained from oligonucleotides created by chemical synthesis. Gene segments from 300 to 4000 kbp in length, which are flanked by unique restriction sites, were collected by annealing and ligation of oligonucleotides, including PCR amplification and subsequent cloning through these restriction sites. The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing.
  • DNA sequences were determined by Sanger sequencing.
  • PaCas9 nuclease For expression of PaCas9 nuclease, variants of expression plasmids intended for expression in prokaryotic cells (E. coli), short-term expression in eukaryotic cells (for example, in CHO cells) were used.
  • the vectors contained: a replication initiation site that replicates the plasmid to E. coli, genes that confer resistance in E. coli to various antibiotics (e.g., ampicillin and / or kanamycin).
  • samples of Homoeodictya palmata sponges were collected from sites of the White Sea, the material was fractionated by centrifugation, after which total DNA was extracted and subsequently sequenced.
  • Bioinformatics methods revealed an open reading frame of the PaCas9 protein in metagenomic sequences, as well as the neighboring components of the CRISPR Cas system: the CRISPR cassette, as well as the crRNA and tracrRNA sequences.
  • PaCas9 nuclease DNA is presented in SEQ ID N0: 1.
  • the amino acid sequence of PaCas9 nuclease is presented in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence encoding tracrRNA is presented in SEQ ID NO: 3.
  • nucleotide sequence encoding a direct repeat of DR presented in SEQ ID NO: 4.
  • the PaCas9 nuclease gene sequence was obtained by bioinformatic search. The sequence was codon-optimized to ensure optimal expression in mammalian cells, and then assembled de novo from chemically synthesized oligonucleotides according to the Gibson method. The synthesized PaCas9 gene was cloned into the genetic construct at the 3 'end of the CMV promoter. Kozak sequences and nuclear localization signals (NLS) were added from the 5 'end of the gene, and the FLAG epitope sequence for protein detection was added from the 3' end. After the sequence of PaCas9 and related elements listed above, T2A elements and an open reading frame of green fluorescent protein (EGFP) are placed in the design in the same reading frame as an expression marker.
  • EGFP green fluorescent protein
  • the polyA sequence of the thymidine kinase signal is placed to increase the stability of the mRNA.
  • the polyA sequence of the thymidine kinase signal is placed to increase the stability of the mRNA.
  • the polyA sequence of the thymidine kinase signal is placed to increase the stability of the mRNA.
  • the construction map is shown in FIG. 1.
  • RaCaz9 protein which is transported to the nucleus due to NLS
  • RNA molecules directing it RNA directing
  • the reaction products are applied to gel electrophoresis. Uncut pieces are extracted from the gel and sequenced on an Illumina platform. Comparison of the PAM sequences contained in the uncut products of the PaCas9 reaction and the control reaction will determine the PAM of the protein under study.
  • an in vitro nuclease activity assessment is performed.
  • the protein in complex with RNA guides is incubated with a DNA fragment carrying the protospacer sequence and detected by RAM.
  • the optimal ratio of RNA-protein complex to cut DNA was determined.
  • Assessment of nuclease activity was determined based on the amount of PaCas9 protein required for 50% cutting of 200 ng of target DNA with a length of about 400 nucleotide pairs containing optimal RAM.
  • PaCas9 nuclease has enzymatic activity and creates a double-stranded gap in DNA.
  • PaCas9 nuclease is capable of creating a double-stranded gap in DNA with a highly specific recognition site (16-20 letters).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

The present invention relates to biotechnology, molecular biology and medicine, and more precisely to a nuclease enzyme and use thereof. More particularly, the present invention relates to a PaCas9 nuclease enzyme. The invention also relates to a nucleic acid encoding said nuclease, a genetic construct, an expression vector, a vector for delivery, which include said nucleic acid, a liposome incorporating said nuclease or nucleic acid encoding said nuclease, a method for producing nuclease, methods of delivery, as well as a host cell which includes a nucleic acid encoding said nuclease.

Description

НУКЛЕАЗА PaCa s 9  NUCLEASE PaCa s 9
Область техники  Technical field
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины, а именно к ферменту нуклеазе и применению данного фермента нуклеазы. Более конкретно, настоящее изобретение относится к ферменту нуклеазе PaCas9. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данную нуклеазу, генетической конструкции, экспрессионному вектору, вектору для доставки, которые включают данную нуклеиновую кислоту, липосоме, включающей данную нуклеазу или нуклеиновую кислоту, кодирующую данную нуклеазу, способу получения нуклеазы, способам доставки, а также к клетке-хозяину, которая включает нуклеиновую кислоту, кодирующую данную нуклеазу.  The present invention relates to the field of biotechnology, molecular biology and medicine, namely to a nuclease enzyme and the use of this nuclease enzyme. More specifically, the present invention relates to the PaCas9 nuclease enzyme. The invention also relates to a nucleic acid encoding a given nuclease, a genetic construct, an expression vector, a delivery vector that include a given nucleic acid, a liposome comprising a given nuclease or nucleic acid encoding a given nuclease, a method for producing a nuclease, delivery methods, and also a host cell that includes a nucleic acid encoding a given nuclease.
Уровень техники State of the art
В 2007 году впервые было продемонстрировано, что CRISPR-Cas представляет собой адаптивную иммунную систему у многих бактерий и большинства археев (Barrangou et al., 2007, Science 315: 17091712, Brouns et al . , 2008, Science 321: 960-964) . До сих пор были охарактеризованы три типа систем CRISPR-Cas на основе функциональных и структурных критериев, большинство из которых использует малые молекулы РНК в качестве гид-РНК для направления на комплементарные последовательности ДНК-мишеней (Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol 9: 467-477, Van der Oost et al. , 2014, Nat Rev Microbiol 12 : 479-492) .  In 2007, CRISPR-Cas was first demonstrated that the adaptive immune system in many bacteria and most archaea (Barrangou et al., 2007, Science 315: 17091712, Brouns et al., 2008, Science 321: 960-964). So far, three types of CRISPR-Cas systems have been characterized based on functional and structural criteria, most of which use small RNA molecules as hydro-RNAs to direct DNA targets to complementary sequences (Makarova et al., 2011, Nat Rev Microbiol 9 : 467-477, Van der Oost et al., 2014, Nat Rev Microbiol 12: 479-492).
В недавнем исследовании лабораторий Doudna/Charpentier была проведена тщательная характеристика эффекторного фермента системы типа II CRISPR-Cas (Cas9), включая демонстрацию того, что введение созданных с помощью CRISPR гид-РНК (со специфическими спейсерными последовательностями) направлено действует на комплементарные последовательности (протоспейсеры) на плазмиде, вызывая разрывы двойной цепи этой плазмиды (Jinek et al. , 2012, Science 337: 816- 821) . Затем Jinek et al, 2012 использовали Cas9 как инструмент для редактирования генома.  A recent study by the Doudna / Charpentier laboratories meticulously characterized the type II CRISPR-Cas (Cas9) type II effector enzyme, including demonstrating that the introduction of CRISPR-guided RNAs (with specific spacer sequences) is directed to complementary sequences (protospacers) on the plasmid, causing double strand breaks of this plasmid (Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821). Then, Jinek et al, 2012 used Cas9 as a tool for editing the genome.
Cas9 использовали для редактирования геномов ряда эукариотических клеток (например, рыб, растений, человека) (Charpentier and Doudna, 2013, Nature 495: 50-51) .  Cas9 was used to edit the genomes of a number of eukaryotic cells (e.g., fish, plants, humans) (Charpentier and Doudna, 2013, Nature 495: 50-51).
Кроме того, Cas9 использовали для улучшения выходов гомологичной рекомбинации у бактерий путем отбора целенаправленных событий рекомбинации (Jiang et al . , 2013, Nature Biotechnol 31: 233- 239) . Для достижения этого токсический фрагмент (направляющий конструкт) подвергают совместной трансфекции со спасающим фрагментом, несущим требуемое изменение (редактирующий конструкт, несущий точечную мутацию или делеции) . Направляющий конструкт состоит из Cas 9 в сочетании со сконструированным CRISPR и маркером устойчивости к антибиотикам, определяя сайт желаемой рекомбинации на хромосоме хозяина; в присутствии соответствующего антибиотика отбирают интеграцию направляющего конструкта в хромосому хозяина. Только тогда, когда происходит дополнительная рекомбинация редактирующего конструкта с целевым сайтом CRISPR в другом месте на хромосоме хозяина, хозяин может избежать проблемы аутоиммунности. Следовательно, в присутствии антибиотика только желаемые (свободные от маркера) мутанты способны выживать и расти. Также представлена сходная стратегия выбора для последующего удаления интегрированного направляющего конструкта из хромосомы, создающая свободный от собственного маркера мутант. In addition, Cas9 was used to improve homologous recombination yields in bacteria by selecting targeted recombination events (Jiang et al., 2013, Nature Biotechnol 31: 233–239). To achieve this, a toxic fragment (directing construct) is subjected to joint transfection with a rescue fragment bearing the desired change (editing construct carrying a point mutation or deletion). The guide construct consists of Cas 9 in combination with the constructed CRISPR and antibiotic resistance marker, determining the site of the desired recombination on host chromosome; in the presence of an appropriate antibiotic, the integration of the guide construct into the host chromosome is selected. Only when additional editing of the editing construct with the CRISPR target site elsewhere on the host chromosome occurs, the host can avoid the autoimmunity problem. Therefore, in the presence of an antibiotic, only the desired (marker free) mutants are able to survive and grow. A similar selection strategy is also presented for the subsequent removal of the integrated guide construct from the chromosome, creating a mutant free of its own marker.
В последние годы было установлено, что редактирование генома, опосредуемое CRISPR-Cas, является полезным инструментом для генной инженерии. Установлено, что прокариотические системы CRISPR служат своим хозяевам как адаптивные иммунные системы (Jinek et al . , 20T2, Science 337: 816-821) и могут быть использованы для быстрой и эффективной генной инженерии (например, Mali et al. , 2013, Nat Methods 10: 957-963), требуя только модификации гид- последовательности для направления на интересующие последовательности .  In recent years, CRISPR-Cas mediated genome editing has been found to be a useful tool for genetic engineering. It has been established that CRISPR prokaryotic systems serve their hosts as adaptive immune systems (Jinek et al., 20T2, Science 337: 816-821) and can be used for fast and efficient genetic engineering (e.g., Mali et al., 2013, Nat Methods 10: 957-963), requiring only modification of the guide sequence to direct to sequences of interest.
Тем не менее, существует постоянная потребность в разработке агентов с улучшенным определением специфической для последовательности нуклеиновой кислоты, ее расщеплением и манипуляциями в различных экспериментальных условиях для применения в области генетических исследований и редактирования генома.  However, there is a continuing need for the development of agents with improved definition of a sequence-specific nucleic acid, its cleavage and manipulation under various experimental conditions for use in the field of genetic research and genome editing.
Краткое описание изобретения SUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение относится к нуклеазе PaCas9 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.  The present invention relates to PaCas9 nuclease with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует нуклеазу PaCas9, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.  In one aspect, the present invention relates to an isolated nucleic acid molecule that encodes PaCas9 nuclease, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему нуклеиновую кислоту с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.  In one aspect, the present invention relates to an expression vector comprising a nucleic acid with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах экспрессионный вектор представляет собой генетическую конструкцию, указанную на фиг. 1, PpCas9-T2A-GFP- sgRNAl-МСS-sgRNA2-MCS .  In some embodiments, the expression vector is the genetic construct shown in FIG. 1, PpCas9-T2A-GFP-sgRNAl-MCS-sgRNA2-MCS.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вектору для доставки терапевтического агента, содержащего нуклеиновую кислоту с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.  In one aspect, the present invention relates to a vector for delivering a therapeutic agent comprising a nucleic acid of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
В одном из вариантов настоящего изобретения вектор доставляет терапевтический агент в клетки-мишени или ткани-мишени.  In one embodiment of the present invention, the vector delivers a therapeutic agent to target cells or target tissues.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к липосоме для доставки терапевтического агента, включающего нуклеазу PaCas9 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или нуклеиновую кислоту с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов настоящего изобретения липосома доставляет терапевтический агент в клетки-мишени или ткани-мишени. In one aspect, the present invention relates to a liposome for delivering a therapeutic agent comprising PaCas9 nuclease with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a nucleic acid with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. In one embodiment of the present invention, the liposome delivers a therapeutic agent to target cells or target tissues.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу доставки в клетки-мишени или ткани-мишени терапевтического агента с помощью вышеуказанного вектора или вышеуказанной липосомы.  In one aspect, the present invention relates to a method for delivering a therapeutic agent to a target cell or target tissue using the above vector or the above liposome.
В одном из вариантов способа доставки в клетки-мишени или ткани- мишени терапевтического агента осуществляется путем введения в организм млекопитающего вышеуказанного вектора или вышеуказанной липосомы.  In one embodiment of a method for delivering a therapeutic agent to a target cell or target tissue, the above vector or the above liposome is introduced into the body of a mammal.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения нуклеазы PaCas9 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, который включает трансформирование клетки любым вышеуказанным вектором.  In one aspect, the present invention relates to a method for producing a host cell for producing PaCas9 nuclease with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which comprises transforming a cell with any of the above vectors.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения нуклеазы PaCas9, заключающемуся в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, необходимых для получения указанной нуклеазы PaCas9, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученной нуклеазы PaCas9.  In one aspect, the present invention relates to a method for producing PaCas9 nuclease, comprising culturing the aforementioned host cell in a culture medium under the conditions necessary to obtain said PaCas9 nuclease, optionally, followed by isolation and purification of the obtained PaCas9 nuclease.
Краткое описание чертежей Brief Description of the Drawings
Фиг. 1. Кольцевая схема плазмиды PpCas9-T2A-GFP-sgRNAl-MCS- sgRNA2-MCS, предназначенной для наработки нуклеазы PpCas9 в клетках млекопитающих .  FIG. 1. The ring diagram of the plasmid PpCas9-T2A-GFP-sgRNAl-MCS-sgRNA2-MCS, designed to generate PpCas9 nuclease in mammalian cells.
AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину,  AmpR - beta-lactamase gene that provides resistance to ampicillin,
CMV promoter - промотор ранних генов цитомегаловируса,  CMV promoter - promoter of early cytomegalovirus genes,
Kozak sequence- последовательность Kozak для повышения эффективности трансляции белка,  Kozak sequence - Kozak sequence to increase the efficiency of protein translation,
START codon - старт-кодон,  START codon - start codon,
NLS -сигналы ядерной локализации (NLS),  NLS signals for nuclear localization (NLS),
PaCas9 - нуклеотидная последовательностью SEQ ID NO: 1, кодирующая нуклеазу PaCas9 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,  PaCas9 - nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 encoding PaCas9 nuclease with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
FLAG- последовательность эпитопа FLAG для детекции белка, FLAG - FLAG epitope sequence for protein detection,
GFP- модифицированный зелёный флуоресцентный белок, GFP-modified green fluorescent protein,
ТК рА - последовательность поли-А сигнала тимидинкиназы для повышения стабильности мРНК  TC pA - sequence of poly-A signal of thymidine kinase to increase the stability of mRNA
FI ori - ориджин репликации, который позволяет плазмиде упаковываться в фаговые частицы при котрансформации с фагами- помощниками,  FI ori is the origin of replication, which allows the plasmid to be packaged into phage particles during co-transformation with helper phages,
polIII term + U6 promotor - кассеты для экспрессии малых молекул РНК, каждая кассета содержит U6 промотор и терминатор транскрипции РНК полимеразы III.  polIII term + U6 promotor - cassettes for the expression of small RNA molecules, each cassette contains a U6 promoter and an RNA polymerase III transcription terminator.
pUC origin- pUC ориджин репликации в бактериях. Фиг. 2. Аминокислотная последовательность нуклеазы PaCas9 с распределением по доменам. pUC origin- pUC origin of replication in bacteria. FIG. 2. Amino acid sequence of PaCas9 nuclease with domain distribution.
Описание изобретения Description of the invention
Определения и общие методы  Definitions and General Methods
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области .  Unless otherwise specified herein, the scientific and technical terms used in connection with the present invention will have meanings that are commonly understood by those skilled in the art.
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.  In addition, unless the context requires otherwise, the terms in the singular include the terms in the plural, and the terms in the plural include the terms in the singular. As a rule, the classification and methods used for cell cultivation, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, analytical chemistry, chemistry of organic synthesis, medical and pharmaceutical chemistry, as well as hybridization and chemistry of protein and nucleic acids described in this document are well known to specialists and widely used in this field. Enzymatic reactions and purification methods are carried out in accordance with the manufacturer's instructions, as is usually done in the art, or as described herein.
Под «млекопитающим» понимается любое животное, классифицируемое как млекопитающее, в том числе приматы, люди, грызуны, собачьи, кошачьи, крупный рогатый скот, мелкий рогатый скот, лошади, свиньи и т . д .  By “mammal” is meant any animal classified as a mammal, including primates, humans, rodents, canine, feline, cattle, small cattle, horses, pigs, etc. d.
Нуклеаза Nuclease
Нуклеазы — большая группа ферментов, гидролизующих фосфодиэфирную связь между субъединицами нуклеиновых кислот.  Nucleases are a large group of enzymes that hydrolyze a phosphodiester bond between nucleic acid subunits.
Различают несколько типов нуклеаз в зависимости от их специфичности и активности: экзонуклеазы и эндонуклеазы, рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, рестриктазы и некоторые другие. Рестриктазы занимают важное положение в прикладной молекулярной биологии .  There are several types of nucleases depending on their specificity and activity: exonuclease and endonuclease, ribonuclease and deoxyribonuclease, restrictase and some others. Restriction enzymes occupy an important position in applied molecular biology.
Нуклеаза PaCas9 относится к типу дезоксирибонуклеаз.  PaCas9 nuclease is a deoxyribonuclease type.
Нуклеаза PaCas9 способна расщеплять ДНК, включающую последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, при связывании, по меньшей мере, с одной молекулой РНК, которая распознает последовательность-мишень .  PaCas9 nuclease is capable of cleaving DNA, including the target nucleic acid sequence, by binding to at least one RNA molecule that recognizes the target sequence.
Нуклеаза PaCas9 содержит два эндонуклеазных домена, которые поодиночке вносят одноцепочечные разрывы, а действуя совместно — двуцепочечный разрыв .  PaCas9 nuclease contains two endonuclease domains that introduce single-stranded breaks one at a time and, acting together, a double-stranded break.
Нуклеаза PaCas9 представляет собой эффекторный фермент системы типа II CRISPR-Cas (нуклеаза второго типа) . Нуклеаза PaCas9 способна создавать двухцепочечный разрыв в ДНК с высокоспецифичным сайтом узнавания (16-20 букв) . PaCas9 nuclease is an effector enzyme of type II CRISPR-Cas system (second type nuclease). PaCas9 nuclease is capable of creating a double-stranded DNA gap with a highly specific recognition site (16-20 letters).
ДНК нуклеазы PaCas9 представлена в SEQ ID N0:1.  PaCas9 nuclease DNA is presented in SEQ ID N0: 1.
Аминокислотная последовательность нуклеазы PaCas9 представлена в SEQ ID NO: 2  The amino acid sequence of PaCas9 nuclease is presented in SEQ ID NO: 2
На фигуре 2 приведена аминокислотная последовательность нуклеазы PaCas9 с распределением по доменам.  The figure 2 shows the amino acid sequence of PaCas9 nuclease with domain distribution.
Нуклеаза PaCas9 связанна с изолированным кластером регулярно расположенных группами коротких палиндромных повторов (CRISPR) , а также находящимися по соседству остальными компонентами CRISPR-Cas системы: последовательностями crRNA и tracrRNA.  PaCas9 nuclease is associated with an isolated cluster of regularly arranged groups of short palindromic repeats (CRISPR), as well as other components of the CRISPR-Cas system adjacent to it: crRNA and tracrRNA sequences.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая tracrRNA, представлена в SEQ ID NO:3.  The nucleotide sequence encoding tracrRNA is presented in SEQ ID NO: 3.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая прямой повтор DR, представлена в SEQ ID NO: 4.  The nucleotide sequence encoding a direct repeat of DR presented in SEQ ID NO: 4.
crRNA состоит из вариабельной части, зависящей от мишени, и последовательности прямого повтора DR, представленной в SEQ ID NO: 4.  crRNA consists of the variable part, depending on the target, and the sequence of direct repeat DR, presented in SEQ ID NO: 4.
Под «терапевтическим агентом» в данном изобретении подразумевается нуклеаза PaCas9 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует нуклеазу PaCas9, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.  By "therapeutic agent" in this invention is meant a PaCas9 nuclease with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an isolated nucleic acid molecule that encodes PaCas9 nuclease with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
tracrRNA ( транс-активирующая crRNA) - это небольшая транс- кодированная РНК.  tracrRNA (trans-activating crRNA) is a small transcoded RNA.
CRISPR (от англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) - это особые локусы бактерий и архей, состоящие из прямых повторяющихся последовательностей, которые разделены уникальными последовательностями (спейсерами) .  CRISPR (from the English Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; short palindromic repeats regularly arranged in groups) are special loci of bacteria and archaea, consisting of direct repeating sequences that are separated by unique sequences (spacers).
Молекулы нуклеиновых кислот Nucleic acid molecules
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.  The terms "nucleic acid", "nucleic acid sequence" or "nucleic acid sequence", "polynucleotide", "oligonucleotide", "polynucleotide sequence" and "nucleotide sequence", which are used interchangeably herein, mean a clear sequence of nucleotides, modified or not modified defining a fragment or region of a nucleic acid containing or not containing unnatural nucleotides and being either double-stranded DNA or RNA, or a single-chain stranded DNA or RNA or the transcription product of said DNA.
Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев) , или полученные путем химического синтеза . It should also be mentioned here that the invention does not apply to nucleotide sequences in their natural chromosome environment, i.e. in a natural state. The sequences of this invention were isolated and / or purified, i.e. were taken directly or indirectly, for example, by copying, while their environment was at least partially modified. So also this should include isolated nucleic acids obtained by genetic recombination, for example, using host cells (host cells), or obtained by chemical synthesis.
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты нуклеазы. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия нуклеазы, например, в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях .  An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one impurity nucleic acid molecule with which it is usually associated in a natural source of a nuclease nucleic acid. An isolated nucleic acid molecule differs from the form or kit in which it is found in vivo. Thus, the isolated nucleic acid molecule is different from the nucleic acid molecule that exists in cells in vivo. However, the isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule located in cells in which nuclease expression normally occurs, for example, if the nucleic acid molecule has a localization in the chromosome that is different from its localization in cells in vivo.
Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью .  The term nucleotide sequence covers its compliment, unless otherwise indicated. Thus, a nucleic acid having a specific sequence should be understood as encompassing its complementary chain with its complementary sequence.
Выражение «контролирующие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме- хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.  The expression "control sequences" refers to DNA sequences necessary for the expression of a functionally linked coding sequence in a particular host organism. Suitable control sequences for prokaryotes are, for example, a promoter, optionally an operator and a ribosome binding site. As is known, promoters, polyadenylation signals, and enhancers are present in eukaryotic cells.
Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связывают с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, «функционально связан» обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными. Вектор A nucleic acid is “operably linked” if it is in functional association with another nucleotide sequence. For example, DNA of a presequence or secretory leader sequence is operably linked to the DNA of a polypeptide if it is expressed as a preprotein that is involved in the secretion of the polypeptide; a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence, if located so that it can facilitate translation. Generally, “operably linked” means that the linked DNA sequences are contiguous, and in the case of a secretory leader sequence, are contiguous and are in the reading phase. However, enhancers do not have to be contiguous. Vector
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих) . В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто The term "vector" as used herein means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is connected. In some embodiments, the vector is a plasmid, i.e. a circular double-stranded portion of DNA into which additional DNA segments can be ligated. In some embodiments, the vector is a viral vector in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome. In some embodiments of the invention, the vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (for example, bacterial vectors having a bacterial replication origin and episomal mammalian vectors). In other embodiments, vectors (eg, non-episomal mammalian vectors) can be integrated into the genome of the host cell when introduced into the host cell, and thus replicate together with the host gene. Moreover, some vectors are capable of directing the expression of the genes with which they are functionally linked. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply
«экспрессирующие векторы») . “Expression vectors”).
В одном аспекте настоящее изобретение настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.  In one aspect, the present invention, the present invention relates to a vector suitable for expression of any of the nucleotide sequences described herein.
Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют нуклеазу РаСаз9.  The present invention relates to vectors containing nucleic acid molecules that encode RaCaz9 nuclease.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, нуклеаза PaCas9 по данному изобретению экспрессируются путем вставки ДНК в экспрессионные вектора, таким образом, что гены функционально соединены с необходимыми последовательностями, контролирующими экспрессию, такими как транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV) , вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена нуклеазы PaCas9 и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют) .  In some embodiments, the PaCas9 nuclease of the invention is expressed by inserting DNA into expression vectors, such that the genes are operably linked to desired expression control sequences, such as transcriptional and translational control sequences. Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), plant viruses such as cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic viruses, cosmids, YAC, EBV derived episomas and the like. DNA molecules can be ligated into a vector so that sequences that control transcription and translation in the vector fulfill the intended function of regulating the transcription and translation of DNA. The expression vector and expression control sequences may be selected so as to be compatible with the expression host cell used. DNA molecules can be introduced into the expression vector by standard methods (for example, by ligation of complementary restriction sites on a fragment of the PaCas9 nuclease gene and vector or by ligation of blunt ends if there are no restriction sites).
Помимо гена нуклеазы PaCas9, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию гена нуклеазы PaCas9 в клетке- хозяине. Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP) ) , вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как промотор нативных иммуноглобулинов или промотор актина. Для дальнейшего описания вирусных регулирующих элементов и их последовательностей см. , например, патенты США 5,168,062, 4,510,245 и 4,968,615. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники . In addition to the PaCas9 nuclease gene, recombinant expression of the vectors of this invention may carry regulatory sequences, which control the expression of the PaCas9 nuclease gene in the host cell. Those skilled in the art will understand that the design of the expression vector, including the choice of regulatory sequences, may depend on factors such as selection of the host cell for transformation, expression level of the desired protein, etc. Preferred regulatory sequences for an expressing mammalian host cell include viral elements providing a high level of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from retroviral LTR, cytomegalovirus (CMV) (e.g. CMV promoter / enhancer), monkey virus 40 (SV40) (e.g. SV40 promoter / enhancer), adenovirus, (e.g. Late Adenovirus late promoter (AdMLP)), polyoma virus, as well as strong mammalian promoters such as the native promoter x immunoglobulins or actin promoter. For further description of viral regulatory elements and their sequences, see, for example, US patents 5,168,062, 4,510,245 and 4,968,615. Methods for expressing polypeptides in bacterial or fungal cells, for example, yeast cells, are also well known in the art.
В дополнение к гену нуклеазы PaCas9 и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках- хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток- хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017) . Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке- хозяину, в которую вектор введен. Например, гены селектируемого маркера включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-клетках-хозяевах при селекции/амплификации метотрексата), ген нео (для селекции G418) и ген синтетазы глутамата.  In addition to the PaCas9 nuclease gene and regulatory sequences, the recombinant expression vectors of the invention may carry additional sequences, such as sequences that regulate vector replication in host cells (eg, replication origin) and selectable marker genes. The selectable marker gene facilitates the selection of host cells into which the vector has been introduced (see, for example, US patents 4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017). For example, usually a selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, to the host cell into which the vector is introduced. For example, breeding marker genes include the dihydrofolate reductase gene (DHFR) (for use in dhfr host cells for the selection / amplification of methotrexate), the neo gene (for G418 selection), and the glutamate synthetase gene.
Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака) ; последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина ; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток. The term “expression control sequence” as used herein means polynucleotide sequences that are necessary to affect the expression and processing of the coding sequences to which they are ligated. Expression control sequences include corresponding transcription, termination, promoter and enhancer initiation sequences; effective RNA processing signals, such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize the cytoplasmic mRNA; sequences that increase translation efficiency (i.e., Kozak consensus sequence); sequences that enhance protein stability; and, if desired, sequences that enhance protein secretion. Nature of such control sequences vary depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and transcription termination sequences; in eukaryotes, typically, such control sequences include promoters and transcription termination sequences. The term "control sequences" includes at least all components whose presence is important for expression and processing, and may also include additional components whose presence is useful, for example, leading sequences and sequences of fused cells.
Клетки-хозяева Host cells
Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка- хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по- прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.  The term “recombinant host cell” (or simply “host cell”) as used herein means a cell into which a recombinant expression vector has been introduced. The present invention relates to host cells, which may include, for example, a vector in accordance with the present invention described above. It should be understood that “recombinant host cell” and “host cell” mean not only the specific cell claimed, but also the progeny of such a cell. Since modifications can occur in subsequent generations due to mutations or environmental influences, such offspring may not, in fact, be identical to the parent cell, but such cells are still included in the scope of the term “host cell” as used herein.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие нуклеазу PaCas9 по изобретению, и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего или его клетки, растения или его клетки, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяина . Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран-опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами. Способы трансфекции клеток хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США, 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 и 4,959,455. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, Agrobacterium-опосредованную трансформацию, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Методы трансформации клеток бактерий и дрожжей также хорошо известны в данной области. Nucleic acid molecules encoding the PaCas9 nuclease of the invention and vectors containing these nucleic acid molecules can be used to transfect a suitable mammal or its cell, plant or its cell, bacterial or yeast host cell. The conversion can occur by any known method for introducing polynucleotides into a host cell. Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells are well known in the art and include dextran-mediated transfection, transfection with a complex of nucleic acid and a positively charged polymer, transfection with nucleic acid and calcium phosphate precipitate, polybrin-mediated transfection, protoplast fusion and lipid transfection direct microinjection of DNA into the nucleus. In addition, nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells by viral vectors. Cell transfection methods are well known in the art. See, for example, U.S. Patents 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 and 4,959,455. Methods for transforming plant cells are well known in the art, including, for example, Agrobacterium-mediated transformation, biolistic transformation, direct injection, electroporation and viral transformation. Methods for transforming bacterial and yeast cells are also well known in the art.
Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммор ализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (СНО) , NS0 клетки, клетки SP2, НЕК-293Т клетки, 293 Фристайл клетки ( Invitrogen) , NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (ВНК) , клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), А549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие нуклеазу PaCas9, вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, нуклеаза PaCas9 продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии нуклеазы PaCas9 в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения нуклеазы PaCas9 в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Нуклеаза PaCas9 может быть выделена из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces . Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.  Mammalian cell lines used as hosts for transformation are well known in the art and include many immoralized available cell lines. These include, for example, Chinese hamster ovary cells (CHO), NS0 cells, SP2 cells, HEK-293T cells, 293 Freestyle cells (Invitrogen), NIH-3T3 cells, HeLa cells, hamster kidney cells (BHK), African kidney cells green monkeys (COS), human hepatocellular carcinoma cells (e.g., Hep G2), A549 cells, and a number of other cell lines. Cell lines are selected by determining which cell lines have high levels of expression and provide the necessary characteristics of the protein produced. Other cell lines that can be used are insect cell lines, such as Sf9 or Sf21 cells. When recombinant expression vectors encoding PaCas9 nuclease are introduced into mammalian host cells, PaCas9 nuclease is produced by culturing the host cells for a sufficient time to express PaCas9 nuclease in the host cells or, preferably, isolating PaCas9 nuclease into a culture medium in which host cells are grown. PaCas9 nuclease can be isolated from the culture medium using standard protein purification methods. Plant host cells, for example, include Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, corn, wheat, potatoes, etc. Host bacteria cells include Escherichia and Streptomyces species. Yeast host cells include Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris.
Кроме того, уровень продукции нуклеазы PaCas9 по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с патентами ЕР 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.  In addition, the level of production of PaCas9 nuclease of the invention from a producing cell line can be enhanced using a number of known methods. For example, the glutamine synthetase gene expression system (GS system) is common enough to enhance expression under certain conditions. The GS system is discussed in whole or in part in connection with patents EP 0216846, 0256055, 0323997 and 0338841.
Вполне вероятно, что нуклеаза PaCas9, полученная из различных клеточных линий или трансгенных животных, будет отличаться друг от друга профилем гликозилирования . Однако нуклеаза PaCas9, кодируемая молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, является частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования и в целом, независимо от наличия или отсутствия пост-трансляционных модификаций .  It is likely that PaCas9 nuclease, obtained from different cell lines or transgenic animals, will differ from each other by a glycosylation profile. However, PaCas9 nuclease encoded by the nucleic acid molecules described herein is part of this invention, regardless of the state of glycosylation and in general, regardless of the presence or absence of post-translational modifications.
Липосома Liposome
В одном аспекте настоящее изобретение настоящее изобретение относится к липосомам, в которые инкапсулирована нуклеаза PaCas9 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует нуклеазу PaCas9, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1. In one aspect, the present invention relates to liposomes in which PaCas9 nuclease is encapsulated with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or isolated a nucleic acid molecule that encodes a PaCas9 nuclease with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
Липосомы - это микроскопические замкнутые везикулы, имеющие внутреннюю фазу, окруженную одним или несколькими липидными бислоями, и способные удерживать водорастворимый материал во внутренней фазе, а маслорастворимый материал - в фосфолипидном бислое. При заключении активного вещества в липосому и доставке его в ткани-мишени, важными задачами являются высокоэффективный захват активного соединения в липосому и обеспечение устойчивого удержания активного соединения липосомой.  Liposomes are microscopic closed vesicles that have an internal phase surrounded by one or more lipid bilayers and are capable of retaining water-soluble material in the internal phase, and oil-soluble material in a phospholipid bilayer. When enclosing an active substance in a liposome and delivering it to the target tissue, important tasks are the highly efficient capture of the active compound into the liposome and ensuring stable retention of the active compound by the liposome.
В целом, считается, что липосома представляет собой частицу с преимущественным размером от нескольких десятков нанометров вплоть до десятых долей микрон, внутри оболочки которой, располагаются молекулы другого вещества (веществ) . Оболочка липосом является «полупроницаемой» для молекул воды и ионов .  In general, it is believed that a liposome is a particle with a predominant size from several tens of nanometers up to tenths of microns, inside the shell of which are molecules of another substance (s). The liposome membrane is “semi-permeable” to water molecules and ions.
Для липосом характерна способность включать в себя и удерживать вещества различной природы. Круг веществ, включаемых в липосомы, достаточно широк - от неорганических ионов и низкомолекулярных органических соединений до крупных белков и нуклеиновых кислот.  Liposomes are characterized by the ability to incorporate and retain substances of various nature. The range of substances included in liposomes is quite wide - from inorganic ions and low molecular weight organic compounds to large proteins and nucleic acids.
Липосомы обеспечивают пролонгированное высвобождение заключенного в носителе вещества.  Liposomes provide a sustained release of a substance enclosed in a carrier.
Липосомы могут быть выполнены из фосфолипида, в частности из фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, фосфатидилглицерина, фосфатидовой кислоты, сфингофосфолипида, фосфолипидов яиц или соевых бобов или их смесей.  Liposomes can be made from phospholipid, in particular from phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, phosphatidic acid, sphingophospholipid, egg phospholipids or soybeans or mixtures thereof.
Примеры Examples
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме . For a better understanding of the invention, the following examples are provided. These examples are for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any form.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.  All publications, patents and patent applications referred to in this specification are incorporated herein by reference. Although the aforementioned invention has been described in some detail by way of illustration and example in order to avoid ambiguous interpretation, it will be readily understood by those skilled in the art that certain changes and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the enclosed embodiments. the implementation of the invention.
Материалы и общие методы Materials and general methods
Методы рекомбинантной ДНК  Recombinant DNA Methods
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др . , Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей. For manipulations with DNA used standard methods described by Sambrook J. et al. , Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Reagents for molecular biology were used according to manufacturers instructions.
Синтез генов Gene synthesis
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 т.п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР- амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.  The desired gene segments were obtained from oligonucleotides created by chemical synthesis. Gene segments from 300 to 4000 kbp in length, which are flanked by unique restriction sites, were collected by annealing and ligation of oligonucleotides, including PCR amplification and subsequent cloning through these restriction sites. The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing.
Определение последовательностей ДНК DNA sequencing
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру .  DNA sequences were determined by Sanger sequencing.
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях DNA and protein sequence analysis and sequence data processing
Применяли пакет программ фирмы Infomax's Vector NT I Advance suite, версия 8.0 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.  We used the Infomax's Vector NT I Advance suite software package, version 8.0, to create, map, analyze, annotate and illustrate sequences.
Экспрессионные векторы Expression vectors
Для экспрессии нуклеазы PaCas9 использовали варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для экспрессии в клетках прокариот (Е. coli), кратковременной экспрессии в клетках эукариот (например, в клетках СНО) . Помимо кассеты экспрессии нуклеазы PaCas9 векторы содержали: сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в Е. coli, гены, придающие устойчивость в E.coli к различным антибиотикам (например, к ампициллину и/или канамицину) .  For expression of PaCas9 nuclease, variants of expression plasmids intended for expression in prokaryotic cells (E. coli), short-term expression in eukaryotic cells (for example, in CHO cells) were used. In addition to the PaCas9 nuclease expression cassette, the vectors contained: a replication initiation site that replicates the plasmid to E. coli, genes that confer resistance in E. coli to various antibiotics (e.g., ampicillin and / or kanamycin).
Пример 1 Example 1
Способ получения нуклеазы PaCas9  The method of obtaining nuclease PaCas9
Для получения метагеномных последовательностей образцы губок Homoeodictya palmata собирали с участков Белого моря, материал фракционировали центрифугированием, после чего производилось выделение тотальной ДНК и ее последующее секвенирование .  To obtain metagenomic sequences, samples of Homoeodictya palmata sponges were collected from sites of the White Sea, the material was fractionated by centrifugation, after which total DNA was extracted and subsequently sequenced.
В метагеномных последовательностях биоинформатическими методами была обнаружена открытая рамка считывания белка PaCas9, а также находящиеся по соседству остальные компоненты CRISPR Cas системы: CRISPR кассета, а также последовательности crRNA и tracrRNA.  Bioinformatics methods revealed an open reading frame of the PaCas9 protein in metagenomic sequences, as well as the neighboring components of the CRISPR Cas system: the CRISPR cassette, as well as the crRNA and tracrRNA sequences.
ДНК нуклеазы PaCas9 представлена в SEQ ID N0:1.  PaCas9 nuclease DNA is presented in SEQ ID N0: 1.
Аминокислотная последовательность нуклеазы PaCas9 представлена в SEQ ID NO: 2. Нуклеотидная последовательность, кодирующая tracrRNA, представлена в SEQ ID NO:3. The amino acid sequence of PaCas9 nuclease is presented in SEQ ID NO: 2. The nucleotide sequence encoding tracrRNA is presented in SEQ ID NO: 3.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая прямой повтор DR, представлена в SEQ ID NO: 4.  The nucleotide sequence encoding a direct repeat of DR presented in SEQ ID NO: 4.
Пример 2 Example 2
Описание клонирования  Cloning Description
Последовательность гена нуклеазы PaCas9 была получена биоинформатическим поиском. Последовательность была кодон- оптимизирована для обеспечения оптимальной экспрессии в клетках млекопитающих, после чего собрана de novo из химически синтезированных олигонуклеотидов по методу Гибсона. Синтезированный ген PaCas9 был заклонирован в генетическую конструкцию с 3' -конца от промотора CMV. С 5' -конца гена были добавлены последовательности Kozak и сигналы ядерной локализации (NLS) , а с 3' -конца - последовательность эпитопа FLAG для детекции белка. После последовательности PaCas9 и относящихся к ней перечисленных выше элементов, в конструкции в той же рамке считывания помещены элементы Т2А и открытая рамка считывания зелёного флуоресцентного белка (EGFP) в качестве маркера экспрессии.  The PaCas9 nuclease gene sequence was obtained by bioinformatic search. The sequence was codon-optimized to ensure optimal expression in mammalian cells, and then assembled de novo from chemically synthesized oligonucleotides according to the Gibson method. The synthesized PaCas9 gene was cloned into the genetic construct at the 3 'end of the CMV promoter. Kozak sequences and nuclear localization signals (NLS) were added from the 5 'end of the gene, and the FLAG epitope sequence for protein detection was added from the 3' end. After the sequence of PaCas9 and related elements listed above, T2A elements and an open reading frame of green fluorescent protein (EGFP) are placed in the design in the same reading frame as an expression marker.
После рамок считывания с 3' -конца помещена последовательность поли-А сигнала тимидинкиназы для повышения стабильности мРНК. В области бактериального кора генетической конструкции находится тандем из двух кассет для экспрессии малых молекул РНК. Каждая кассета содержит U6 промотор и терминатор транскрипции РНК полимеразы III. Данные кассеты необходимы для экспрессии молекул РНК, которые обеспечивают специфичное взаимодействие белка PaCas9 с целевой молекулой ДНК (клеточным геномом) . Карта конструкции приведена на Фиг. 1. Данная конструкция позволяет экспрессировать в клетках эукариот одновременно как белок РаСаз9 (который благодаря NLS транспортируется в ядро), так и направляющие его молекулы РНК (направляющие РНК) , а также детектировать белок по эпитопу FLAG и определять эффективность доставки генетической конструкции по детекции EGFP.  After reading frames from the 3 'end, the polyA sequence of the thymidine kinase signal is placed to increase the stability of the mRNA. In the area of the bacterial cortex of the genetic construct there is a tandem of two cassettes for the expression of small RNA molecules. Each cassette contains a U6 promoter and an RNA polymerase III transcription terminator. These cassettes are necessary for the expression of RNA molecules that provide a specific interaction of the PaCas9 protein with the target DNA molecule (cell genome). The construction map is shown in FIG. 1. This design allows both RaCaz9 protein (which is transported to the nucleus due to NLS) and the RNA molecules directing it (RNA directing) to be expressed in eukaryotic cells, as well as to detect the protein by the FLAG epitope and determine the delivery efficiency of the genetic construct by EGFP detection.
Пример 3 Example 3
Ферментативная активность белка PaCas9  Enzymatic activity of PaCas9 protein
Аминокислоты, участвующие в ферментативном гидролизе ДНК/РНК, были выявлены с помощью сравнения гомологии доменов HNH и RuvC различных белков семейства Cas9 с доменами PaCas9 (распределение по доменам указано на Фиг. 2) . Консервативные аминокислоты, для которых ранее было показано участие в ферментативной активности белков Cas9, были выделены в PaCas9. Таким образом, аналитическими методами было установлено, что необходимыми для ферментативной активности белка PaCas9 являются аминокислотные остатки данного белка (аминокислота - положение) : D 9; Е 527; Н 750; D 753; Н 613; N 636. Пример 4 Amino acids involved in the enzymatic hydrolysis of DNA / RNA were detected by comparing the homology of the HNH and RuvC domains of various Cas9 family proteins with the PaCas9 domains (domain distribution is shown in Fig. 2). Conservative amino acids, for which participation of Cas9 proteins in the enzymatic activity was previously shown, were isolated in PaCas9. Thus, by analytical methods it was found that the amino acid residues of this protein (amino acid position) are necessary for the enzymatic activity of the PaCas9 protein: D 9; E 527; H 750; D 753; H 613; N 636. Example 4
Определение ферментативной активности белка PaCas9  Determination of the enzymatic activity of the PaCas9 protein
Для определения РАМ последовательности ((Protospacer Adjacent Motif) - последовательность, прилегающая к протоспейсеру) проведены in vitro реакции разрезания библиотек ДНК с рекомбинантным белком- нуклеазой (SEQ ID NO: 2), crRNA (состоит из вариабельной части, зависящей от мишени, и последовательности прямого повтора, представленной в SEQ ID NO: 4) и tracrRNA (SEQ ID NO:3) . Библиотека ДНК - ПЦР фрагмент, содержащий семибуквенную рандомизированную последовательность, и узнаваемую последовательность, протоспейсер .  To determine the PAM sequence ((Protospacer Adjacent Motif) - the sequence adjacent to the protospacer), in vitro reactions were performed by cutting DNA libraries with recombinant protein nuclease (SEQ ID NO: 2), crRNA (consists of the variable part depending on the target, and the sequence direct repeat presented in SEQ ID NO: 4) and tracrRNA (SEQ ID NO: 3). DNA library - PCR fragment containing a seven-letter randomized sequence, and a recognizable sequence, protospacer.
После инкубации РаСаз9-РНК-белкового комплекса с библиотекой ДНК продукты реакции наносятся на гель -электрофорез . Не порезанные фрагменты экстрагируются из геля и подвергаются секвенированию на платформе Illumina. Сравнение РАМ последовательностей, содержащихся в не порезанных продуктах реакции PaCas9 и контрольной реакции, позволят определить РАМ исследуемого белка.  After incubation of the RaCaz9-RNA protein complex with a DNA library, the reaction products are applied to gel electrophoresis. Uncut pieces are extracted from the gel and sequenced on an Illumina platform. Comparison of the PAM sequences contained in the uncut products of the PaCas9 reaction and the control reaction will determine the PAM of the protein under study.
После выявления РАМ последовательности, проводиться оценка активности нуклеазы in vitro. Для этого белок в комплексе с направляющими РНК инкубируется с ДНК-фрагментом, несущим последовательность протоспейсера и выявленный РАМ. Определено оптимальное соотношение РНК-белкового комплекса к разрезаемой ДНК. Оценка активности нуклеазы определена исходя из количества белка PaCas9, необходимого для 50% разрезания 200 нг ДНК мишени, длиной около 400 пар нуклеотидов, содержащей оптимальный РАМ.  After detecting the PAM sequence, an in vitro nuclease activity assessment is performed. For this, the protein in complex with RNA guides is incubated with a DNA fragment carrying the protospacer sequence and detected by RAM. The optimal ratio of RNA-protein complex to cut DNA was determined. Assessment of nuclease activity was determined based on the amount of PaCas9 protein required for 50% cutting of 200 ng of target DNA with a length of about 400 nucleotide pairs containing optimal RAM.
Таким образом, подтверждено, что нуклеаза PaCas9 обладает ферментативной активность и создает двуцепочечный разрыв в ДНК.  Thus, it was confirmed that PaCas9 nuclease has enzymatic activity and creates a double-stranded gap in DNA.
Более того, подтверждено что нуклеаза PaCas9 способна создавать двухцепочечный разрыв в ДНК с высокоспецифичным сайтом узнавания (16-20 букв) .  Moreover, it was confirmed that PaCas9 nuclease is capable of creating a double-stranded gap in DNA with a highly specific recognition site (16-20 letters).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕ ТЕНИЯ CLAIM
1. Нуклеаза PaCas9 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. 1. Nuclease PaCas9 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует нуклеазу PaCas9 по п.1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.  2. The selected nucleic acid molecule that encodes the PaCas9 nuclease according to claim 1, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
3. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п .2.  3. The expression vector containing the nucleic acid according to claim 2.
4. Экспрессионный вектор по п.З, который представляет собой генетическую конструкцию, указанную на фиг. 1.  4. The expression vector according to claim 3, which is the genetic construct indicated in FIG. 1.
5. Экспрессионный вектор для доставки терапевтического агента, содержащего нуклеиновую кислоту по п.2.  5. Expression vector for the delivery of a therapeutic agent containing a nucleic acid according to claim 2.
6. Экспрессионный вектор по п.5, где терапевтический агент доставляется в клетки-мишени или ткани-мишени.  6. The expression vector of claim 5, wherein the therapeutic agent is delivered to target cells or target tissues.
7. Способ доставки в клетки-мишени или ткани-мишени терапевтического агента, который включает введение вектора по любому из пп . 3-6 в клетки-мишени или ткани-мишени.  7. A method of delivering to a target cell or target tissue a therapeutic agent, which comprises administering a vector according to any one of claims. 3-6 in the target cell or target tissue.
8. Способ получения клетки-хозяина для получения нуклеазы PaCas9 по п. 1, включающий трансформирование клетки вектором по любому из пп. 3-6.  8. A method of obtaining a host cell to obtain PaCas9 nuclease according to claim 1, comprising transforming the cell with the vector according to any one of claims. 3-6.
9. Клетка-хозяин для получения нуклеазы PaCas9 по п. 1, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 2.  9. A host cell for producing PaCas9 nuclease according to claim 1, comprising a nucleic acid according to claim 2.
10. Способ получения нуклеазы PaCas9 по п. 1, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п. 9 в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанной нуклеазы PaCas9, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученной нуклеазы PaCas9.  10. The method of producing PaCas9 nuclease according to claim 1, comprising culturing the host cell according to claim 9 in a culture medium under conditions sufficient to obtain said PaCas9 nuclease, if necessary, followed by isolation and purification of the obtained PaCas9 nuclease.
PCT/RU2019/050154 2018-09-14 2019-09-13 Pacas9 nuclease WO2020055293A1 (en)

Priority Applications (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MA53045A MA53045B1 (en) 2018-09-14 2019-09-13 Nuclease p?Cas9
KR1020217011069A KR20210062040A (en) 2018-09-14 2019-09-13 PaCas9 nuclease
PE2021000323A PE20211111A1 (en) 2018-09-14 2019-09-13 NUCLEASA PACAS9
MX2021002933A MX2021002933A (en) 2018-09-14 2019-09-13 Pacas9 nuclease.
US17/276,016 US20220064612A1 (en) 2018-09-14 2019-09-13 PaCas9 nuclease
JP2021513998A JP2022500044A (en) 2018-09-14 2019-09-13 PaCas9 nuclease
EA202190676A EA202190676A1 (en) 2018-09-14 2019-09-13 NUCLEASE PaCas9
CN201980075402.9A CN113272425B (en) 2018-09-14 2019-09-13 PaCas9 nuclease
EP19858873.3A EP3851522A4 (en) 2018-09-14 2019-09-13 Pacas9 nuclease
BR112021004746-8A BR112021004746A2 (en) 2018-09-14 2019-09-13 pacas9 nuclease
CA3113215A CA3113215A1 (en) 2018-09-14 2019-09-13 Pacas9 nuclease
AU2019341014A AU2019341014A1 (en) 2018-09-14 2019-09-13 PaCas9 nuclease
ZA2021/01681A ZA202101681B (en) 2018-09-14 2021-03-12 Pacas9 nuclease
CONC2021/0003285A CO2021003285A2 (en) 2018-09-14 2021-03-12 Nuclease pacas9
PH12021550563A PH12021550563A1 (en) 2018-09-14 2021-03-15 Pacas9 nuclease

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018132816A RU2706298C1 (en) 2018-09-14 2018-09-14 PaCas9 NUCLEASE
RU2018132816 2018-09-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020055293A1 true WO2020055293A1 (en) 2020-03-19

Family

ID=68580023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/050154 WO2020055293A1 (en) 2018-09-14 2019-09-13 Pacas9 nuclease

Country Status (20)

Country Link
US (1) US20220064612A1 (en)
EP (1) EP3851522A4 (en)
JP (1) JP2022500044A (en)
KR (1) KR20210062040A (en)
CN (1) CN113272425B (en)
AR (1) AR116403A1 (en)
AU (1) AU2019341014A1 (en)
BR (1) BR112021004746A2 (en)
CA (1) CA3113215A1 (en)
CL (1) CL2021000610A1 (en)
CO (1) CO2021003285A2 (en)
EA (1) EA202190676A1 (en)
MA (1) MA53045B1 (en)
MX (1) MX2021002933A (en)
PE (1) PE20211111A1 (en)
PH (1) PH12021550563A1 (en)
RU (1) RU2706298C1 (en)
TW (1) TWI843749B (en)
WO (1) WO2020055293A1 (en)
ZA (1) ZA202101681B (en)

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
EP0216846A1 (en) 1985-04-01 1987-04-08 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same.
EP0256055A1 (en) 1986-01-23 1988-02-24 Celltech Ltd Recombinant dna sequences, vectors containing them and method for the use thereof.
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
EP0338841A1 (en) 1988-04-18 1989-10-25 Celltech Limited Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
WO2017048969A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 The Regents Of The University Of California Variant cas9 polypeptides comprising internal insertions
RU2634395C1 (en) * 2015-12-01 2017-10-26 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) GENETIC CONSTRUCT BASED ON CRISPR/Cas9 GENOME SYSTEM EDITING, CODING Cas9 NUCLEASE, SPECIFICALLY IMPORTED IN HUMAN CELLS MITOCHONDRIA
RU2650819C2 (en) * 2012-05-07 2018-04-17 Сангамо Терапьютикс, Инк. Methods and compositions for nuclease-mediated targeting of transgenes

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9410134B2 (en) * 2011-06-07 2016-08-09 Helmholtz Zentrum München—Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt Protein having nuclease activity, fusion proteins and uses thereof
ES2636902T3 (en) * 2012-05-25 2017-10-10 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed transcription modulation
WO2014001509A1 (en) * 2012-06-29 2014-01-03 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Functionalized liposomes useful for the delivery of bioactive compounds
EP3481856A1 (en) * 2016-07-06 2019-05-15 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of pain related disorders
KR20190133699A (en) * 2017-03-24 2019-12-03 큐어백 아게 Nucleic acid encoding CRISPR-associated protein and uses thereof

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0216846A1 (en) 1985-04-01 1987-04-08 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same.
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
EP0256055A1 (en) 1986-01-23 1988-02-24 Celltech Ltd Recombinant dna sequences, vectors containing them and method for the use thereof.
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
EP0323997A1 (en) 1987-07-23 1989-07-19 Celltech Limited Recombinant dna expression vectors
EP0338841A1 (en) 1988-04-18 1989-10-25 Celltech Limited Recombinant DNA methods, vectors and host cells
RU2650819C2 (en) * 2012-05-07 2018-04-17 Сангамо Терапьютикс, Инк. Methods and compositions for nuclease-mediated targeting of transgenes
WO2017048969A1 (en) * 2015-09-17 2017-03-23 The Regents Of The University Of California Variant cas9 polypeptides comprising internal insertions
RU2634395C1 (en) * 2015-12-01 2017-10-26 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Балтийский Федеральный Университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) GENETIC CONSTRUCT BASED ON CRISPR/Cas9 GENOME SYSTEM EDITING, CODING Cas9 NUCLEASE, SPECIFICALLY IMPORTED IN HUMAN CELLS MITOCHONDRIA

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARRANGOU ET AL., SCIENCE, vol. 315, 2007, pages 17091712
BROUNS ET AL., SCIENCE, vol. 321, 2008, pages 960 - 964
CHARPENTIERDOUDNA, NATURE, vol. 495, 2013, pages 50 - 51
JIANG ET AL., NATURE BIOTECHNOL, vol. 31, 2013, pages 233 - 239
JINEK ET AL., SCIENCE, vol. 337, 2012, pages 816 - 821
MAKAROVA ET AL., NAT REV MICROBIOL, vol. 9, 2011, pages 467 - 477
MALI ET AL., NAT METHODS, vol. 10, 2013, pages 957 - 963
SAMBROOK, J. ET AL.: "Molecular cloning: A laboratory manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP3851522A4
VAN DER OOST ET AL., NAT REV MICROBIOL, vol. 12, 2014, pages 479 - 492

Also Published As

Publication number Publication date
RU2706298C1 (en) 2019-11-15
AU2019341014A1 (en) 2021-05-13
MA53045B1 (en) 2022-08-31
US20220064612A1 (en) 2022-03-03
PE20211111A1 (en) 2021-06-21
CA3113215A1 (en) 2020-03-19
CN113272425A (en) 2021-08-17
EA202190676A1 (en) 2021-06-08
JP2022500044A (en) 2022-01-04
MX2021002933A (en) 2021-06-15
CO2021003285A2 (en) 2021-06-10
EP3851522A4 (en) 2022-06-01
MA53045A1 (en) 2022-02-28
KR20210062040A (en) 2021-05-28
TWI843749B (en) 2024-06-01
CL2021000610A1 (en) 2021-09-24
BR112021004746A2 (en) 2021-06-08
AR116403A1 (en) 2021-05-05
EP3851522A1 (en) 2021-07-21
CN113272425B (en) 2024-09-13
ZA202101681B (en) 2022-06-29
TW202016130A (en) 2020-05-01
PH12021550563A1 (en) 2022-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3152312B1 (en) Methods and compositions for modifying a targeted locus
CN107109422B (en) Genome editing using split Cas9 expressed from two vectors
EP4025691B1 (en) Novel, non-naturally occurring crispr-cas nucleases for genome editing
WO2019099943A1 (en) Compositions and methods for improving the efficacy of cas9-based knock-in strategies
JP2016523084A (en) Target integration
US20230113805A1 (en) CRISPR-Cas NUCLEASES FROM CPR-ENRICHED METAGENOME
CA3164931A1 (en) Targeted integration in mammalian sequences enhancing gene expression
RU2706298C1 (en) PaCas9 NUCLEASE
JP2024509139A (en) Novel CRISPR-CAS nuclease derived from metagenomics
EA043898B1 (en) NUCLEASE PaCas9
JP2024501892A (en) Novel nucleic acid-guided nuclease
OA20101A (en) Pacas9 nuclease.
CN113795588A (en) Methods for scar-free introduction of targeted modifications in targeting vectors
KR102302827B1 (en) Compositon for inhibiting gene expression using CRISPRi
WO2023177424A1 (en) Integration of large nucleic acids into genomes

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19858873

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3113215

Country of ref document: CA

Ref document number: 2021513998

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: NC2021/0003285

Country of ref document: CO

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3113215

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112021004746

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20217011069

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019858873

Country of ref document: EP

Effective date: 20210414

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019341014

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20190913

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112021004746

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20210312