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WO2019233935A1 - Mikroskop und verfahren zum aufnehmen eines mikroskopischen bildes und verwendung eines plattenförmigen reflektors - Google Patents

Mikroskop und verfahren zum aufnehmen eines mikroskopischen bildes und verwendung eines plattenförmigen reflektors Download PDF

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WO2019233935A1
WO2019233935A1 PCT/EP2019/064311 EP2019064311W WO2019233935A1 WO 2019233935 A1 WO2019233935 A1 WO 2019233935A1 EP 2019064311 W EP2019064311 W EP 2019064311W WO 2019233935 A1 WO2019233935 A1 WO 2019233935A1
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WO
WIPO (PCT)
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sample
reflector
illumination
image
use according
Prior art date
Application number
PCT/EP2019/064311
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Norbert Leclerc
Jürgen Wolf
Original Assignee
Jenoptik Optical Systems Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE102018113182.8A external-priority patent/DE102018113182A1/de
Application filed by Jenoptik Optical Systems Gmbh filed Critical Jenoptik Optical Systems Gmbh
Priority to EP19729679.1A priority Critical patent/EP3803494A1/de
Priority to US16/972,401 priority patent/US20210231939A1/en
Priority to CN201980037953.6A priority patent/CN112424668A/zh
Priority to JP2020567236A priority patent/JP2021527842A/ja
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    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/36—Microscopes arranged for photographic purposes or projection purposes or digital imaging or video purposes including associated control and data processing arrangements
    • G02B21/361—Optical details, e.g. image relay to the camera or image sensor

Definitions

  • the invention relates to a method for illuminating a microscopic object, a microscope and a use of a plate-shaped reflector.
  • Retroreflectors are well known, e.g. https://de.wikipedia.org/wiki/Retroreflektor. In addition to the conventional macroscopically structured retroreflectors, there are those with microstructures as reflection elements.
  • EP0200521 A2 describes retroreflective sheet materials which use small glass beads embedded in a matrix of synthetic resin. Similar retroreflectors are also known from US4957335A, WO9822837A1, WO003070483A1 and WO02006085690A1.
  • W02006136381 A1, DE102009060884A1, DE29701903U1 and DE29707066U1 describe retroreflective sheeting which uses microprism formations which induce backscattering properties. From US3689346A a retroreflective sheeting is known.
  • DE4117911A1 describes a retroreflective sheeting which produces light reflectance in a slightly divergent manner. Further microretroreflectors are known from DE102005063331 A1 and EP0880716A1 and
  • AT508102A1 is a lighting device for a microscope with a ring illumination for dark field illumination from below or bright field transmitted light illumination known.
  • the object of the invention is to enable a transmitted light bright field or dark field recording and / or a phase contrast recording of a sample with a space-saving EPI lighting.
  • the scanning of multiple samples or multiple points of a sample should be possible.
  • the invention enables a compact illumination for a microscope. In this case, advantageously, both the lighting and the observation can be done from below. As a result, an application in cell biology or as a cell microscope is possible.
  • the present invention also provides a simple way of microscopically examining transparent and / or semi-transparent objects in a sample.
  • the object is achieved by a use according to claim 1, a method according to claim 2 and a microscope according to claim 19 or D.
  • the method according to the invention serves to receive at least one microscopic image of a sample.
  • the method can be particularly advantageous if transparent and / or semi-transparent objects are to be examined. These may be present in a liquid, for example water, a nutrient solution, oil or formaldehyde.
  • Investigational objects may be, for example, plant, animal or eukaryotic cells or cell aggregates, cell organelles and their constituents, for example chromosomes, viruses, bacteria, antibodies, pollen, sperm, macromolecules, for example peptides, lipids, DNA, RNA or molecular assemblies.
  • the optical axis may be the optical axis of a microscope objective.
  • the following method of taking a microscopic image is illustrated.
  • the image of at least one region of at least one sample is recorded.
  • the sample is arranged in a sample plane.
  • the sample plane may be perpendicular to the optical axis, which may be indicated in the z direction.
  • the picture is taken from a first page. As a result, the direction of observation can be predetermined.
  • This method comprises generating at least one beam with the aid of at least one light source.
  • the beam may also be referred to as an illumination beam. It can be advantageously provided exactly one light source. However, it is also possible to provide a plurality of light sources.
  • the light source can emit light with a spectral distribution. It may, for example, be infrared, visible or ultraviolet light.
  • the method comprises guiding the beam through the sample plane to a plate-shaped reflector.
  • the plate-shaped reflector can be a plate normal and a define a replacement solder other than the plate standard with respect to the illumination beam.
  • the plate normal can lie in the direction of the optical axis, ie in the z-direction.
  • the plate surface may lie in an xy plane.
  • the plate may have a structure that causes a reflection of an incident light beam around the replacement solder. It can be provided exactly one or more individual reflections. This may mean that the emergent light beam leaves the reflector after exactly one or more individual reflections.
  • a replacement solder can be understood as the direction of an angle bisector between the incident and the outgoing light beam.
  • the replacement solder can also be referred to as the effective incidence solder with respect to an incident light beam.
  • the reference beam for determining the replacement solder the central ray of the incident light beam can be selected.
  • the replacement solder can also be understood as the direction of the difference vector of the normalized failure vector and the normalized incident vector.
  • the normalized incident vector or failure vector can be the direction vector of the incident or outgoing light beam. If, as in the case of a retroreflector, the direction of incidence and exit are exactly opposite, the replacement solder can be defined in the same direction as the direction of the failure vector.
  • the use of the term replacement solder to describe the method or article of the present invention may in this case be redundant.
  • the method comprises guiding the beam through the sample plane to a plate-shaped reflector, wherein the reflector is a retroreflector.
  • the replacement solder can be fixed, i. regardless of the angle of incidence. For deflecting the beam, a simple reflection on a reflection surface may be provided for each beam, i. exactly one single reflection. Then the replacement solder can be equal to the incident slot of the respective beam on the reflection surface.
  • the replacement solder can correspond in this case to the surface normal of the reflection surface.
  • the replacement solder can also be dependent on the direction of the incident light beam. This may be the case in particular if the reflection at the reflector comprises a plurality of individual reflections, for example two.
  • the method comprises deflecting the beam through the reflector.
  • the method comprises illuminating the sample with the deflected beam.
  • the method includes capturing the microscopic image with an image sensor.
  • the microscopic image can be an intensity contrast image.
  • the microscopic image may also be advantageous, but need not be, a phase contrast image. Also advantageous may be a microscopic image, which is a superimposition of a phase contrast image with an intensity contrast image.
  • At least one plate-shaped reflector for deflecting at least one illumination beam.
  • the illumination beam serves to illuminate at least one sample.
  • the indicated use is intended for taking at least a microscopic image of the sample from a first side.
  • the picture is taken with an image sensor.
  • the plate-shaped reflector has a plate normal and a different from the plate normal Excellencelot with respect to the lighting on a second side, which is opposite to the first side with respect to the sample, arranged. The opposite can be more accurately understood with respect to the sample level.
  • the sample can be arranged in a horizontal sample plane, for example in an xy plane.
  • the taking of the microscopic image can advantageously be done from above with respect to gravity.
  • the first side may be the top of the sample.
  • the second side can then be the bottom of the sample. This may make it possible to illuminate the sample in the transmitted light process, even if the illumination and the image recording in the sense of epi-illumination (epi-illumination) from the same side, namely the first page done.
  • An epi-illumination is to be understood as meaning illumination that takes place from the same hemisphere as the observation.
  • This half-space can be defined with respect to the sample level. In the other half-space may advantageously be arranged the reflector.
  • the taking of the microscopic image can be carried out particularly advantageously from below with respect to the gravitational force. Then the first side can be the bottom of the sample. The second side can then be the top of the sample.
  • the image can be captured by a microscope objective.
  • the microscope objective can be provided for this purpose as a first Fourier lens.
  • a camera lens which can be provided as a further, namely a second, Fourier lens, be present.
  • the arrangement of both Fourier lenses can cause an image of the sample on the sensor.
  • the camera lens can also be called a tube lens.
  • a camera lens does not necessarily have to be present.
  • the microscope objective itself can be provided for imaging the sample onto the image sensor. The image on the image sensor can therefore be done without a camera lens, if the microscope objective is designed accordingly.
  • the beam can be guided to illuminate the sample through the microscope objective. But it may also be advantageous to pass the beam of illumination on the microscope objective. In the latter case, the lens can be made smaller because the illumination beam does not need to be passed through the lens.
  • the beam of illumination before being deflected by the reflector through the microscope objective is provided.
  • the illumination of the specimen with the deflected beam can take place in a beam direction at a mean elevation angle ⁇ and a mean azimuth angle y.
  • the beam can be collimated even before the deflection in order to illuminate the sample with parallel light. But there may also be deviations from the parallelism. Then one can specify a mean elevation angle ⁇ and a mean azimuth angle of the radiation beam.
  • the deflected beam may have a central beam.
  • the central ray of the central ray of the beam can be considered.
  • the incident beam may also have a central beam. This may be the beam of the incident beam leaving the reflector as the central beam of the deflected beam.
  • the azimuth angle y and the elevation angle ⁇ one can use a spherical coordinate ordinate system, where the zenith describes the optical axis, which may lie in the direction z.
  • the azimuth angle can be specified with respect to the direction x.
  • the direction x can be set so that the xz half plane with positive x comprises a central ray of the deflected light beam.
  • the elevation angle may be the angle of the central ray of the deflected beam to the xy plane.
  • the elevation angle can be determined as 90 ° minus the angle of the central ray of the deflected beam with the optical axis of the microscope objective.
  • the elevation angle can be between 45 ° and 90 °, particularly advantageously between 70 ° and 85 °.
  • the elevation angle can advantageously be chosen smaller than the right angle. This may correspond to an oblique incidence of the beam on the sample, also called oblique illumination - called oblique illumination. This can improve the contrast in the case of transparent and / or semi-transparent objects in the sample.
  • the central ray of the deflected beam can thus be inclined to the optical axis.
  • the elevation angle can also be selected 90 °. Then the central ray of the deflected beam may be parallel to the optical axis.
  • the light bundles can have the same elevation angle ⁇ . These can be arranged distributed azimuthal evenly.
  • the azimuth angle of the first beam can be 0 ° and that of a second beam can be 180 °.
  • the light source can be advantageously designed as an LED.
  • This can be arranged in a pupil plane (22) or in a plane conjugate to the pupil plane.
  • the pupil plane may be the plane in which a diaphragm is located.
  • the pupil plane may be the focal plane of the microscope objective opposite the sample. A slight deviation of the position of the LED from the pupil plane can be neglected. Therefore, it is possible, for example, to fix the LEDs on the diaphragm ring. Under a conjugate plane one can understand such a plane, which is projected onto the pupil plane by means of a relay optics.
  • the relay optics can be designed as a relay lens (relay lens) or, for example, comprise two Fourier lenses.
  • the light source can be designed as an LED and in each case have a diffuser arranged directly in front of the light-generating surface.
  • the diffuser may be provided to homogenize the directional intensity distribution. Arranging directly in front of the light-generating area may cause directional homogenization without significantly increasing the radiating area.
  • the light sources can have a diameter of the luminous surfaces which is smaller than 30% of the focal length of the microscope objective.
  • the luminous surface of the light source may be, for example, circular, square or rectangular.
  • the light source may be, for example, an LED chip or a packaged SMD LED.
  • the light beam may be linearly polarized in a first direction of polarization.
  • the light beam may be unpolarized.
  • the sample may comprise a liquid sample substance. This can be on a sample carrier. With respect to gravitational force, the sample carrier may be at the bottom and the liquid sample substance at the top. Thereby, a dripping of the sample substance can be prevented. In this case, lighting and observation of the sample from below may be advantageous. For this one can expediently use a transparent sample carrier.
  • the first page can be the bottom.
  • the reflector may in this case be arranged above the sample.
  • the sample may comprise a cover, for example a coverslip.
  • the microscope or the microscope objective can have a field of view.
  • the field of view can be at a given focal plane, an area in the focal plane, which can be detected with the image sensor.
  • the focal plane can be the plane that can be sharply imaged onto the image sensor.
  • the focal plane can be perpendicular to the optical axis. Conveniently, the focal plane can be located in the sample. The focal plane may coincide with the sample plane. Then the microscope can be focused on the sample plane.
  • the beam path can be provided such that the deflected beam completely illuminates the field of view.
  • the beam may have a cut surface with the focal plane before deflecting.
  • the cut surface may contain the field of view. Then the sample can be illuminated from two sides. As a result, simultaneous incident and transmitted light illumination of the sample can be realized. With such combined incident and transmitted light illumination, certain patterns in the sample can be better recognized.
  • the cut surface may be outside the field of view. This may mean that the beam is guided through the sample plane at a point outside a field of view. Then the sample can only be transmitted by transmitted light, i. be illuminated from the back. The back can be the second side.
  • the deflected beam may also have another interface with the focal plane, which may be referred to as a sample surface illuminated by the deflected beam.
  • the sample surface illuminated by the deflected beam may contain the field of view.
  • the deflected beam as a bundle of parallel rays.
  • the beam may already be present as a parallel beam bundle before deflecting the reflector.
  • the vergence of the beam can be preserved during the redirection.
  • the provision of a vergence and / or the diffuser can also cause the reflection of the beam becomes less sensitive to, for example, a tilting of the sample, unevenness of the reflector, etc.
  • the reflector may be formed as a Fresnel prism.
  • a Fresnel prism is made
  • the Fresnel prism may comprise a plurality of reflection surfaces with reflection surface normals.
  • the reflection surface normal may be inclined to the plate normal.
  • the reflection surface normals can each be the incident slot of an incident beam.
  • the incident slot can correspond to the replacement solder of the reflector.
  • the beam deflection at the Fresnel prism can be done by a simple reflection.
  • the Fresnel prism may have a periodic structure. In each period, exactly one reflection surface can be provided.
  • the reflection face normal of the Fresnel prism may be parallel.
  • the reflector may be integrally formed as a plate or a foil.
  • a foil can be considered as a thin plate.
  • the reflector may be formed as a layer on a carrier plate or a carrier foil. This layer or the surface of the plate may have a step structure.
  • the reflector may be designed so that a plurality of beams of the beam, which were deflected at different reflection surfaces of the reflector, contribute to the illumination of the field of view.
  • the reflector may be formed as a periodic relief structure.
  • a periodic structure may be in one direction, for example x. However, it is also possible to use a periodic structure in two directions, for example x and y.
  • the reflector can deflect an incident light beam of the beam by means of at least two successive individual reflections.
  • exactly two reflection surfaces can be provided in each period.
  • the replacement solder may be different from the incident slot of the first single reflection.
  • more than two reflections for example three, may be provided.
  • the reflector can be designed as a microprism array and / or microlens array.
  • the reflector can be designed as a retroreflector with respect to a plurality of beam directions.
  • Such an embodiment can be designed especially as a cat's eye or as a retroreflective retro-reflector with, for example, three-plane angle reflectors. In this case, the deflection of the incident beam can be done by three reflections.
  • the reflector can bring about a deflection of the incident beam which deviates from a retroreflection with respect to a plurality of beam directions.
  • the angular difference between an incident and the corresponding incident beam can be independent of the angle of incidence within a certain angular range. This may mean that a replacement solder in this angular range varies with the angle of incidence.
  • Such a reflector may for example have V-trenches with a roof edge angle. A roof angle of 90 ° can cause a retroreflection, while another, preferably smaller, angle causes a deviating from a retroreflection deflection of the incident beam. In this case, due to multiple individual reflections on both sides of the V-trenches, the angular difference between an incident and the corresponding incident beam within a certain angular range can be independent of the angle of incidence.
  • the incident on the sample beam of illumination can be split in the sample and / or by refraction on a sample back in at least a first beam and at least one second beam.
  • a splitting can be, for example, by refractive index differences in the sample, inner optical interfaces in the sample, a curved sample back and / or the formation of menisci, for example be effected in a liquid sample.
  • the second beam may strike the reflector at a different angle of incidence than the first beam.
  • the use of a retroreflector as a reflector can be particularly advantageous. Namely, by using the retroreflector, the first and second beams can each be reflected back on themselves and thus reflected back to the same location of the sample from which they originated.
  • first and a second beam are for illustrative purposes only.
  • the associated outgoing beam to the incident beam be exactly opposite.
  • the replacement solder in this case can be the direction of the outgoing light beam.
  • the term replacement solder can be redundant in this case. Therefore, if the reflector is designed as a retroreflector, one can dispense with the use of the term replacement solder.
  • the retroreflector can be designed such that it as out
  • a transmitted-light bright-field image and / or a transmitted-light dark-field image can be recorded with oblique illumination.
  • the recording of the image as a superposition of an transmitted light field image with a phase contrast image.
  • the recording of the image can be done as a superposition of a transmitted light dark field image with a phase contrast image.
  • phase contrast image In the case of a phase contrast image, at least one phase plate may additionally be provided. This can be arranged for example in the diaphragm plane. In this case, coaxial illumination through the microscope objective may be advantageous.
  • the phase plate may include a retarder plate and a gray filter.
  • the phase plate may be formed as a phase ring.
  • the phase contrast image with the reflector according to the invention can be recorded, for example, with one of the known methods according to Zernicke, relief phase contrast according to DE102012005911, or luminance contrast according to DE102007029814.
  • Varel contrast image it is also possible to take a Varel contrast image.
  • the Varel contrasting method is used, in which a superposition of oblique bright field illumination with phase contrast is used.
  • a Hoffman modulator can be provided in three parts, with three segments with different optical attenuation. The middle segment can be arranged centrally or off-center with respect to the optical axis.
  • a light source aperture may be provided, preferably in a plane of the illumination beam path conjugate to the pupil plane.
  • the light source aperture can be designed as a slit diaphragm.
  • the slit can preferably be partially covered with a polarizing filter.
  • the slot can be arranged centrally or off-center with respect to the illumination beam path.
  • another polarizing filter in the Illumination beam path be present.
  • beam offset between the incident beam and the associated emergent beam may occur.
  • a beam offset can be up to a few millimeters in a retroreflector with macroscopic reflection elements, such as a conventional retroreflector (cat's eye) from the bicycle shop.
  • a micro-prism array or encapsulated micro glass beads as a retroreflector may be advantageous.
  • retroreflectors are available, for example, as films in the retro reflection classes RA1, RA2, RA2 / B, RA2 / C and RA3 for street signs, for example the film 3M TM Engineer Grade Prismatic Series 3430 according to "Technical Information SG 103 / 10.2017” 3M Anlagennique GmbFI company or Avery Dennison® T T7500B microprismatic retroreflective sheeting.
  • Microcube reflectors which can be constructed as fullcube triple arrays, are even more suitable.
  • the reflector "3M TM Diamond Grade DG 3. Reflective Sheeting" can be used.
  • Pyramidal triple arrays can be more cost effective than fullcube arrays.
  • Fullcube or pyramidal triple arrays can be produced, for example, in a plastic injection molding process or be embossed in a plastic substrate, a glass substrate or in a flexible plastic film.
  • the beam of illumination can be guided through the microscope objective to the sample.
  • Such a beam guidance can be advantageous in particular when using a retroreflector. Such a beam guidance can also be used in particular for phase contrast recordings.
  • the reflector may also cause diffraction and interference of the light.
  • the reflector can in principle also be designed as a reflection grating, preferably as a blazed grating.
  • this can have the disadvantage that large-area blaze grids are currently very expensive.
  • the wavelength-dependent diffraction angle occurring in a grating may be disadvantageous. Therefore, it may be advantageous to minimize diffraction effects.
  • the structural widths of the reflector can be chosen so large that the reflection angle corresponds to at least more than a tenth, preferably more than thirtieth, and more preferably more than one hundredth diffraction order of a blazed grating.
  • the period of the reflector may for example be between 50 micrometers and 5 millimeters, preferably between 0.1 millimeter and 2 millimeters. Then, beams diffracted in different orders of diffraction may be mixed due to the spectral width of the light source and / or the convergence of the beam at the location of the sample. As a result, diffraction and dispersion effects in the beam deflection at the reflector can be avoided. Also advantageously, the period of the reflector between dmhi and IOOmhi amount. Although such fine structures are more difficult to produce, this may be advantageous because of the low beam offset.
  • a front projection screen such as those based on reflection volume holograms, may be known as "daylight-compatible front projection screens based on reflection volume holograms"; von Spiegel, Wolff, Darmstadt (2006), http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000799, be used as a reflector.
  • a retroreflector having both holographic and retortive layers. Such a reflector is described in US5656360.
  • the reflector may be spaced apart along the optical axis, i. can be measured in the z direction, be arranged to the sample plane, which is equal to or greater than half the focal length, particularly advantageously greater than the simple focal length of the microscope objective.
  • this distance can be selected smaller than 10 times, particularly advantageously smaller than 5 times the focal length of the objective. Otherwise, if the distance is too great, angle errors of the prisms could otherwise cause artifacts in the microscopic image.
  • the plate normal of the reflector may be parallel to the optical axis, i. be selected in z-direction.
  • the distance of the reflector to the sample plane can be fixed. Alternatively, this distance can be changed, but this can be more complex.
  • the light source can be chosen such that its coherence length is less than twice the aforementioned distance. Then artefacts due to interference of transmitted and incident illumination can be avoided. Alternatively, the light source may be selected such that its coherence length is greater than twice the aforementioned distance. Then, as a result of interference from transmitted and reflected light illumination, contrasts of certain objects in the sample can be exaggerated.
  • the retroreflector may be configured such that the beam offset between an incident and a emergent beam is at most less than 100mhi.
  • retro reflections from microprismarrays with a period of less than 100 ⁇ m or retroreflectors with microglass spheres of less than 100 ⁇ m in diameter may be suitable.
  • such a retroreflector can be chosen in which the half-width of the backscattered light intensity is less than 5 °, more advantageously less than 3 ° and most preferably less than 1 °. Then an incident beam can be thrown back as accurately as possible in itself. As a result, the highest possible contrast in the microscopic image can be achieved.
  • the half width of the backscattered intensity may be greater than 20 angular minutes. Then small angle errors of the prism angle can be compensated.
  • Particularly advantageous may be a retroreflector of the lighting performance class RA3 (formerly "Type 3"). Such retroreflectors may have or exceed a minimum retroreflective value of 300 cd / lx per m 2 at an illumination angle of 5 ° and a viewing angle of 0.33 °.
  • the deflected beam can cause transmitted-light bright-field illumination or one or a transmitted-light darkfield illumination of the sample.
  • a plurality of microscopic images of a plurality of samples and / or a sample may be taken at several locations.
  • a microscope camera comprising the image sensor can be used.
  • the microscope camera may include a camera lens.
  • the microscope camera can be moved from the taking of an image to the acquisition of a next image respectively with respect to the sample or the sample.
  • the reflector can be arranged fixed with respect to the samples or the sample. That can mean that he is not moved with the camera.
  • the light source may be fixed with respect to the microscope camera. This can mean that the light source is moved with the microscope camera.
  • a beam path comprising at least one illumination beam path and at least one imaging beam path
  • At least one light source for generating at least one beam
  • a plate-shaped reflector for deflecting the beam wherein the deflected beam is provided for illuminating the sample, and wherein the plate-shaped reflector has a plate normal and a different from the plate normal Optimizlot with respect to the illumination beam,
  • At least one microscope objective for the imaging beam path is provided.
  • a microscope for receiving at least one image of at least one sample in at least one field of view comprising
  • a beam path comprising at least one illumination beam path and at least one imaging beam path
  • At least one light source for generating at least one illumination beam
  • At least one microscope objective for the imaging beam path is provided.
  • the microscope objective can be used both for the illumination beam path and for the imaging beam path.
  • both the not yet deflected illumination beam and the deflected illumination beam can be provided simultaneously for illuminating the sample.
  • the light source, the microscope objective and the image sensor in the sense of an epi-illumination on one side of the sample, the reflector in the sense of an epi-illumination on one side of the sample
  • the reflector in the other side of the sample.
  • Geometrically, such an embodiment of the invention can be expressed more precisely in such a way that the light source, the microscope objective and the image sensor are arranged with respect to the sample plane in a common half space, the reflector is arranged in the other half space.
  • the illumination beam path can be provided parallel to the optical axis. As a result, the structure can be inexpensive.
  • the illumination beam path may also advantageously be provided inclined to the optical axis. As a result, the contrast of the recording can be improved.
  • the microscope may include a camera lens.
  • At least one second light source may be present in addition to the first light source.
  • a second illumination beam can be generated.
  • the second light source may be operable independently of the first light source.
  • the plate-shaped reflector may also be provided for deflecting the second beam.
  • the deflected second beam may be provided to illuminate the sample.
  • the second beam can cause a second illumination situation different from a first illumination situation.
  • Such a microscope can also be advantageously used to take a plurality of images for the methods described above. In this case, the microscope may have several, for example two, light sources and illumination beam paths.
  • the illumination of the first recording can be done with the first light source and the illumination of a second recording with a second light source. Then, a sum image and / or a difference image can be calculated from both images, which can have an improved contrast in comparison to the individual images.
  • a focus plane can be present in the microscope, which can be imaged sharply on the image sensor.
  • the field of view can be provided, which can be detected by the image sensor.
  • the illumination beam may have a sectional area with the focal plane in the beam path before deflecting the reflector. This section may contain the field of view. In this way, a combined incident and transmitted illumination of the sample can be achieved. This can be particularly advantageous when the illumination is through the microscope objective.
  • Fig. 1 shows a first embodiment
  • Fig. 2 shows a second embodiment.
  • Fig. 3 shows a third embodiment.
  • Fig. 4 shows a fourth embodiment.
  • Fig. 5 shows a fifth and a sixth embodiment.
  • Fig. 6 shows a seventh embodiment.
  • FIG. 7 shows a first embodiment of the illumination beam path in a sectional plane.
  • FIG 8 shows a second embodiment of the illumination beam path in a sectional plane.
  • Fig. 9 shows a light source
  • Fig. 10 shows an eighth embodiment.
  • Fig. 11 shows a ninth embodiment.
  • Fig. 12 shows a tenth embodiment.
  • Fig. 13 shows a beam deflection on an element of a microprism array.
  • Fig. 14 shows a section of a reflector.
  • Fig. 1 shows a first embodiment. Shown is a device for receiving at least one microscopic image 1, which can also be described as a microscope.
  • the optical axis 2 of the microscope objective lies in the z-direction.
  • a sample 7 with transparent and / or semitransparent objects 9 is located on a sample carrier 10.
  • the microscope comprises a microscope objective 20 with an optical axis 2.
  • the light source 17 is arranged slightly in front of the pupil plane 22.
  • the pupil plane is the xy plane in which the diaphragm 21, which can also be called a pupil, is located. By this arrangement, the light source, a slight divergence of the beam 3 is effected.
  • the plane 16 is the focal plane in which objects are sharply imaged onto the image sensor 25.
  • the focal plane is at the same time the sample plane 8 in which the sample is arranged.
  • the beam 3 is guided through the sample plane 8 to a plate-shaped reflector 11.
  • the plate-shaped reflector 11 has a plate normal 12 and a deviating from the plate normalIALlot 14 with respect to the illumination beam 3.
  • the reflector 11 may be formed as a Fresnel prism.
  • the Fresnel prism comprises a plurality of reflection surfaces 13 with reflection surface normals 14.
  • the reflection surface normals are inclined with respect to the plate standard 12.
  • the reflection surface normals are each the incident slot of an incident beam.
  • the incidence slot corresponds to the replacement slot of the reflector.
  • the reflector has a periodic structure with a period 29 in the x direction. Each period 29 comprises a reflection surface. The steep flanks between the reflection surfaces 13, however, are not intended for reflection.
  • the deflected beam 4 has a central beam 5 on. With the deflected beam 4, the sample is illuminated.
  • a camera 23 which comprises a camera lens 24 and an image sensor 25.
  • An image sensor 25 can be used to take one or more microscopic images of the sample. In order to illustrate the imaging beam path, light beams 6 from the object are shown here.
  • Fig. 1 In the illumination shown in Fig. 1 is a bright field transmitted light illumination.
  • the gravitational direction is here the z-direction.
  • the sample is illuminated from below and observed from below.
  • Fig. 2 shows a second embodiment.
  • the reflector with respect to the beam 3 is executed in contrast to the first embodiment approximately as a retroreflector. Characteristic of this is that the incident light rays are reflected back almost in themselves.
  • the other reference numerals correspond to those of the first embodiment.
  • the illumination shown in FIG. 2 is a combined one Incident and transmitted-light dark-field illumination.
  • Fig. 3 shows a third embodiment.
  • the illumination beam 3 is guided past the objective 20 on the outside.
  • the light source 17 here comprises a separate collimation device (not shown) for generating a parallel beam.
  • the field of view 27 is shown.
  • the cut surface 26 lies outside the field of view 27.
  • the reflector is designed so that in each period with respect to the direction z rising edge 30 and a falling edge 31 are present. Only the longer running rising flanks are used as reflection surfaces 13.
  • the other reference numerals correspond to those of the preceding embodiments.
  • Fig. 4 shows a fourth embodiment. This is a transmitted-light bright field illumination, wherein the illumination beam 3 is passed outside of the lens 20.
  • the other reference numerals correspond to those of the preceding embodiments.
  • Fig. 5 shows a fifth and a sixth embodiment.
  • a first light source 17.a for generating the first beam 3.a is provided.
  • the reflector 11 has V trenches, wherein in each period 29 a with respect to the direction z rising edge 30 and an equally long falling edge 31 are present. Both flanks are used as reflection surfaces 13.
  • the illustrated beams of the beam 3.a are deflected by a first reflection 15.a at a reflection surface and a subsequent second reflection 15.b at another reflection surface.
  • the replacement solder 14 is dependent on the direction of the incident beam.
  • the first replacement solder 14.a here denotes the replacement solder of the central ray of the incident beam 3.a.
  • the interaction of both individual reflections produces the first deflected radiation beam 4.a, with which the sample is illuminated under an oblique incidence of light.
  • the roof edge angle 32 is selected here smaller than 90 °.
  • the other reference numerals correspond to those of the preceding embodiments.
  • three reflections are provided for deflecting the beam.
  • the reflector may be formed as a microprism array, for example as a fullcube or as a pyramidal triple microprism array.
  • a second light source 17.b is additionally provided, which is operable independently of the first light source 17.a.
  • the first light source is switched on, a first image is taken. Thereafter, the first light source is turned off and the second light source is turned on. Since the replacement solder depends on the direction of incidence of the light, the reflector 11 now has a second replacement solder 14.b and second incident beam 3.b is deflected into a second deflected beam 4.b and illuminates the sample from a different direction than the first deflected Beams 4.a. Under this illumination, a second image of the sample is taken. From these two images, one can calculate a difference image in which the contrasts of the observed objects can be improved.
  • Fig. 6 shows a seventh embodiment.
  • a scanner unit 33 which carries a microscope camera 23, the objective 20 and the light source 17.
  • This scanner unit is arranged in an xy plane displaceable under the samples 34.
  • the microscope camera comprises the image sensor 25 and a camera lens 24.
  • the light source 17 is fixed with respect to the microscope camera.
  • a displacement 34 of the scanner unit 33 with respect to the samples 7 is provided in each case.
  • the reflector 11 is fixed with respect to the samples.
  • FIG. 7 shows a first embodiment of the illumination beam path in a sectional plane. Shown here are the cut surface 26 of the incident beam with the focal plane, the field of view 27 and the illuminated by the deflected beam sample surface 28. As can be seen, this is a combined incident and transmitted light illumination , Such lighting is shown in Fig. 2 in the second embodiment.
  • FIG. 8 shows a second embodiment of the illumination beam path in a sectional plane. Shown here are the cut surface 26 of the incident beam with the focal plane, which is outside the field of view, the field of view 27 and illuminated by the deflected beam sample surface 28. As can be seen, this is a transmitted light - Lighting.
  • Fig. 9 shows a light source.
  • the light source is an LED 17.
  • a diffuser 18 In front of the light-emitting surface is a diffuser 18, and light source aperture 19.
  • a homogeneous directional distribution of the illumination light over a limited range can be achieved.
  • Fig. 10 shows an eighth embodiment.
  • the reflector 11 is designed as a retroreflector.
  • the radiation beam 3 of the illumination is split into a plurality of radiation beams. This can be done by refractive index differences in the sample and / or by refraction on a curved sample back 35. Shown are a first 3.a, a second 3.b and a third beam 3.c. These fall in different directions on the retroreflector 11. Each beam is reflected back against the incident direction at the retroreflector, namely the first beam 3.a in the first deflected beam 4.a, the second beam 3.b in the second deflected beam 4.b and the third beam 3.c into the third deflected beam 4.c.
  • the individual bundles of rays can here be assigned substitute solders whose direction corresponds to the respective outgoing beam.
  • the first replacement solder 14.a corresponds to the first deflected beam 4.a
  • the second replacement solder 14.b to the second deflected beam 4.b
  • the third replacement solder 14.c to the third deflected beam 4.c.
  • the description of the beam path by means of the replacement solders is redundant in the case of a retroreflector since the direction of the deflected beam against the incident beam is already clearly described by the function of the retroreflector.
  • the deflection of the beam is effected by a plurality of reflections, by way of example given are a first reflection 15.a and a second reflection 15.b.
  • the reflector as a microprism array
  • three reflections for deflecting each beam are provided.
  • a beam offset between the incident and the failing Beam arise.
  • the size of the prisms or, in the case of embedded glass spheres, their diameter can be considered as structure size.
  • the use of microprism arrays or the smallest possible embedded glass spheres for the retroreflector may be advantageous.
  • the deflected radiation beams 4.a, 4.b, 4.c should namely hit the sample back as close as possible to the radiation beams 3.a, 3.b or 3.c.
  • a transmitted light illumination can be achieved, which is divergent in parallel or in the same way as the incident beam of illumination 3.
  • the illustration is an axis-parallel bright field illumination, ie that the radiation beam of the illumination 3 is parallel to the optical axis 2.
  • oblique bright field illumination can be provided.
  • the beam of the illumination 3 extends at an angle to the optical axis 2.
  • the illumination beam is reflected with a partially transparent mirror 38.
  • the illustration also shows an optional configuration for taking a Hoffman's modulation contrast image.
  • This optional configuration comprises a modulator 37. This comprises three segments of different optical attenuation, which are indicated by dashed lines of different stroke width. This modulator is normally intended for the observation beam path (not shown). The illumination light is also passed through the modulator here.
  • the optional configuration includes a slit (slit) 19.
  • the aforementioned aperture may be fixed or rotatable and / or displaceable. This aperture is partially covered with a polarizer, which is shown in dashed lines.
  • a further polarizer 39 may be provided, which acts on the whole used illumination beam. This can be rotatable.
  • Fig. 11 shows a ninth embodiment.
  • an oblique dark field illumination is provided here.
  • a retroreflector 11 is used.
  • a second light source (not shown) is provided which is operable independently of the first light source 17. Then, one partial image each can be recorded with one light source switched on and the microscopic image can be created as a difference image of both partial images.
  • Fig. 12 shows a tenth embodiment.
  • a phase plate 36 is provided, which is designed as a phase ring.
  • a first illumination beam path 3 which emanates from a first point light source 17.a.
  • further point light source can be specified, for example, a second point light source 17.b in the illustrated sectional image.
  • an annular illumination is provided, which can be considered as a plurality of annularly arranged light sources.
  • the individual light sources 17.a, 17.b can be fed by a single light source 17.
  • the annular illumination can be coherent in order to accomplish a phase contrast recording as a microscopic image.
  • the illumination beam is reflected with a partially transparent mirror 38.
  • the phase plate is omitted and one or recorded several bright field images of the sample with oblique illumination.
  • Fig. 13 shows a beam deflection on an element of a microprism array. Each beam undergoes a beam deflection through a first 15.a, a second 15.b and a third reflection 15.c on each of the surfaces of the microprism 40.
  • Fig. 14 shows a section of a reflector.
  • the reflector is a retroreflector, which in this exemplary embodiment is designed as a fullcube microprism array.
  • the microprism array includes many trihedral microprisms 40. Such retroreflectors may be used in the above embodiments.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine EPI Beleuchtung, die eine Durchlicht-Hellfeld oder Durchlicht-Dunkelfeldaufnahme oder eine Phasenkontrastaufnahme einer mikroskopischen Probe ermöglicht. Dabei wird ein gegenüber der Beobachtungsseite angeordneter plattenförmiger Reflektor verwendet, welcher eine Umlenkung des Beleuchtungsstrahlenbündels bewirkt. Dabei weist der plattenförmig ausgebildete Reflektor eine Plattennormale und ein von der Plattennormale abweichendes Ersatzlot auf oder ist als Retroreflektor ausgebildet.

Description

Mikroskop und Verfahren zum Aufnehmen eines mikroskopischen Bildes und Verwendung eines plattenförmigen Reflektors
Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Beleuchten eines mikroskopischen Objekts, ein Mikroskop und eine Verwendung eines plattenförmigen Reflektors.
Stand der Technik
Aus JP2000019310 und aus JP2000019309 ist ein Fresnel-Prisma bekannt.
Aus JPH11344605 ist ein Fresnel-Prisma zu Beleuchtungszwecken bekannt.
Aus W02014080910 ist ein lichtmodulierendes Element mit einer Fresnel- Struktur bekannt.
Aus JPH10288741 ist ein Durchlichtmikroskop mit prismatischer Beleuchtungsstrahlablenkung bekannt.
Aus„Floffman Modulation Contrast“; Abramowitz, M.; Davidson M. W. in http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techni- ques/hoffman/hoffmanintro.html ist ein Mikroskop nach dem Hoffmanschen Modulationskontrastverfahren bekannt.
Retroreflektoren sind allgemein bekannt, z.B. https://de.wikipedia.org/wiki/Retroreflektor. Neben den herkömmlichen makroskopisch strukturierten Retroreflektoren gibt es solche mit Mikrostrukturen als Reflexionselemente. Aus EP0200521 A2 sind rückstrahlende Flachmaterialien beschrieben, die kleine Glasperlen verwenden, die in einer Matrix aus Kunstharz eingebettet sind. Ähnliche Retroreflektoren sind auch bekannt aus US4957335A, W09822837A1 , W003070483A1 und W02006085690A1. In W02006136381 A1 , DE102009060884A1 , DE29701903U1 und DE29707066U1 sind retroreflektierende Flachmaterialien beschrieben, die Mikroprismenformationen verwenden, welche Rückstrahleigenschaften hervorrufen. Aus US3689346A ist eine retroreflektierende Folie bekannt.
DE4117911A1 beschreibt ein rückstrahlendes Flachmaterial, welches eine Lichtrückstrahlung in leicht divergenter Art erzeugt. Weitere Mikroretroreflektoren sind bekannt aus DE102005063331 A1 und EP0880716A1 und
WO200223232A2.
Aus AT508102A1 ist eine Beleuchtungseinrichtung für ein Mikroskop mit einer Ringbeleuchtung zur Dunkelfeldbeleuchtung von unten bzw. Hellfelddurchlichtbeleuchtung bekannt.
Aus US 5285314 ist ein diffraktiver Spiegel mit einer Vielzahl von diffraktiven Zonen bekannt. Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, mit einer platzsparenden EPI- Beleuchtung eine Durchlicht- Hellfeld- oder Dunkelfeldaufnahme und / oder eine Phasenkontrastaufnahme einer Probe zu ermöglichen. Außerdem soll das Scannen mehrerer Proben oder mehrerer Stellen einer Probe möglich sein.
Vorteile der Erfindung
Die Erfindung ermöglicht eine kompakte Beleuchtung für ein Mikroskop. Dabei kann vorteilhaft sowohl die Beleuchtung als auch die Beobachtung von unten erfolgen. Dadurch ist eine Anwendung auch in der Zellbiologie bzw. als Zellmikroskop möglich. Mit der vorliegenden Erfindung kann man außerdem auf einfache Weise transparente und/oder semitransparente Objekte in einer Probe mikroskopisch untersuchen.
Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst durch eine Verwendung nach Anspruch 1 , ein Verfahren nach Anspruch 2 und ein Mikroskop nach Anspruch 19 oder D.
Beschreibung
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Aufnahme wenigstens eines mikroskopischen Bildes einer Probe. Das Verfahren kann besonders vorteilhaft sein, wenn transparente und/oder semitransparente Objekte untersucht werden sollen. Diese können in einer Flüssigkeit, beispielsweise Wasser, einer Nährlösung, Öl oder Formaldehyd, vorliegen. Untersuchungsobjekte können beispielsweise pflanzliche, tierische oder eukaryotische Zellen oder Zellverbände, Zellorganellen und deren Bestandteile, beispielsweise Chromosomen, Viren, Bakterien, Antikörper, Pollen, Spermien, Makromoleküle, beispielsweise Peptide, Lipide, DNA, RNA, oder Molekülverbände sein.
Man kann eine optische Achse in einer Richtung z einführen. Senkrecht zu z kann man die Richtungen x und y angeben, die ebenfalls senkrecht zueinander sind. Die Richtungen x, y und z können ein rechtwinkliges Koordinatensystem bilden. Die optische Achse kann die optische Achse eines Mikroskopobjektivs sein.
In einer ersten Ausprägung der Erfindung wird das folgende Verfahren zum Aufnehmen eines mikroskopischen Bildes dargestellt. Dabei wird das Abbild wenigstens eines Bereichs wenigstens einer Probe aufgenommen. Die Probe ist in einer Probenebene angeordnet. Die Probenebene kann senkrecht zur optischen Achse sein, welche in z Richtung angegeben sein kann. Die Aufnahme erfolgt von einer ersten Seite. Dadurch kann die Beobachtungsrichtung vorgegeben sein.
Dieses Verfahren umfasst das Erzeugen wenigstens eines Strahlenbündels mit Hilfe wenigstens einer Lichtquelle. Das Strahlenbündel kann auch als Beleuchtungsstrahlenbündel bezeichnet werden. Es kann vorteilhaft genau eine Lichtquelle vorgesehen sein. Es können aber auch mehrere Lichtquellen vorgesehen sein. Die Lichtquelle kann Licht mit einer spektralen Verteilung emittieren. Es kann sich bespielweise um infrarotes, sichtbares oder ultraviolettes Licht handeln.
Außerdem umfasst das Verfahren das Führen des Strahlenbündels durch die Probenebene bis zu einem plattenförmig ausgebildeten Reflektor. Für den plattenförmig ausgebildeten Reflektor kann man eine Plattennormale und ein von der Plattennormale abweichendes Ersatzlot bezüglich des Beleuchtungsstrahlenbündels definieren. Die Plattennormale kann in Richtung der optischen Achse, d.h. in z-Richtung liegen. Dann kann die Plattenoberfläche in einer xy-Ebene liegen. Die Platte kann eine Struktur aufweisen, die eine Reflexion eines einfallenden Lichtstrahls um das Ersatzlot bewirken. Es können genau eine oder auch mehrere Einzelreflexionen vorgesehen sein. Das kann bedeuten, dass der ausfallende Lichtstrahl nach genau einer oder nach mehreren Einzelreflexionen den Reflektor verlässt. Unter einem Ersatzlot kann die Richtung einer Winkelhalbierenden zwischen dem einfallenden und dem ausfallenden Lichtstrahl verstanden werden. Man kann das Ersatzlot auch als das effektive Einfallslot bezüglich eines einfallenden Lichtstrahls bezeichnen. Als Bezugsstrahl zum Bestimmen des Ersatzlots kann der Zentralstrahl des einfallenden Lichtbündels gewählt werden. Das Ersatzlot kann auch als die Richtung des Differenzvektors des normierten Ausfallsvektors und des normierten Einfallsvektors aufgefasst werden. Der normierte Einfallsvektor bzw. Ausfallsvektor kann der Richtungsvektor des einfallenden bzw. ausfallenden Lichtstrahls sein. Sind, wie beispielsweise bei einem Retroreflektor, Einfalls- und Ausfallsrichtung genau entgegengesetzt, kann das Ersatzlot gleich der Richtung des Ausfallsvektors definiert werden. Die Verwendung des Begriffs Ersatzlot zur Beschreibung des Verfahrens oder des Gegenstands der vorliegenden Erfindung kann in diesem Fall redundant sein. Im Falle der Verwendung eines Retroreflektors als Reflektor kann man auf die Definition des Ersatzlotes verzichten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Führen des Strahlenbündels durch die Probenebene bis zu einem plattenförmig ausgebildeten Reflektor, wobei der Reflektor ein Retroreflektor ist.
Das Ersatzlot kann fest, d.h. unabhängig vom Einfallswinkel, sein. Zum Umlenken des Strahlenbündels kann für jeden Strahl eine einfache Reflexion an einer Reflexionsfläche vorgesehen sein, d.h. genau eine Einzelreflexion. Dann kann das Ersatzlot gleich dem Einfallslot des jeweiligen Strahls auf die Reflexionsfläche sein. Das Ersatzlot kann in diesem Falle der Flächennormale der Reflexionsfläche entsprechen.
Das Ersatzlot kann aber auch abhängig von der Richtung des einfallenden Lichtstrahls sein. Das kann insbesondere dann der Fall sein, wenn die Reflexion am Reflektor mehrere Einzelreflexionen, beispielsweise zwei, umfasst.
Außerdem umfasst das Verfahren das Umlenken des Strahlenbündels durch den Reflektor. Außerdem umfasst das Verfahren das Beleuchten der Probe mit dem umgelenkten Strahlenbündel. Außerdem umfasst das Verfahren das Aufnehmen des mikroskopischen Bildes mit einem Bildsensor. Das mikroskopische Bild kann ein Intensitätskontrastbild sein. Das mikroskopische Bild kann ebenfalls vorteilhaft, muss aber nicht, ein Phasenkontrastbild sein. Ebenfalls vorteilhaft kann ein mikroskopisches Bild sein, welches eine Überlagerung eines Phasenkontrastbildes mit einem Intensitätskontrastbild darstellt.
Vorteilhaft ist die Verwendung wenigstens eines plattenförmig ausgebildeten Reflektors zum Umlenken wenigstens eines Beleuchtungsstrahlenbündels. Das Beleuchtungsstrahlenbündel dient zum Beleuchten wenigstens einer Probe. Die angegebene Verwendung ist vorgesehen zum Aufnehmen wenigstens eines mikroskopischen Bildes der Probe von einer ersten Seite. Das Bild wird mit einem Bildsensor aufgenommen. Der plattenförmig ausgebildete Reflektor weist eine Plattennormale und eine von der Plattennormale abweichende Ersatzlot bezüglich des Beleuch- tungsstrahlenbündels auf und ist auf einer zweiten Seite, welche der ersten Seite bezüglich der Probe gegenüberliegt, angeordnet. Das Gegenüberliegen kann genauer ausgedrückt, bezüglich der Probenebene verstanden werden.
Die Probe kann in einer horizontalen Probenebene, beispielsweise in einer xy-Ebene, angeordnet sein. Das Aufnehmen des mikroskopischen Bildes kann vorteilhaft von oben bezüglich der Erdanziehungskraft erfolgen. Dann kann die erste Seite die Oberseite der Probe sein. Die zweite Seite kann dann die Unterseite der Probe sein. Dadurch kann es möglich sein, die Probe im Durchlichtverfahren zu beleuchten, auch wenn die Beleuchtung und die Bildaufnahme im Sinne einer Epi-Beleuchtung (Epi-illumination) von derselben Seite, nämlich der ersten Seite, erfolgen. Unter einer Epi-Beleuchtung ist eine solche Beleuchtung zu verstehen, die aus demselben Halbraum erfolgt, wie die Beobachtung. Dieser Halbraum kann bezüglich der Probenebene definiert werden. Im anderen Halbraum kann vorteilhaft der Reflektor angeordnet sein.
Das Aufnehmen des mikroskopischen Bildes kann besonders vorteilhaft von unten bezüglich der Erdanziehungskraft erfolgen. Dann kann die erste Seite die Unterseite der Probe sein. Die zweite Seite kann dann die Oberseite der Probe sein.
Das Aufnehmen des Bildes kann durch ein Mikroskopobjektiv erfolgen. Das Mikroskopobjektiv kann dazu als eine erste Fourierlinse vorgesehen sein. Außerdem kann ein Kameraobjektiv, das als weitere, nämlich eine zweite, Fourierlinse vorgesehen sein kann, vorhanden sein. Die Anordnung beider Fourierlinsen kann eine Abbildung der Probe auf den Sensor bewirken. Die Kameralinse kann auch als Rohrlinse (tube lens) bezeichnet werden. Ein Kameraobjektiv muß jedoch nicht zwingend vorhanden sein. Das Mikroskopobjektiv selbst kann zur Abbildung der Probe auf den Bildsensor vorgesehen sein. Die Abbildung auf den Bildsensor kann also auch ohne Kameraobjektiv erfolgen, wenn das Mikroskopobjektiv dementsprechend ausgebildet ist. Vorteilhaft kann das Strahlenbündel zum Beleuchten der Probe durch das Mikroskopobjektiv geführt werden. Es kann aber auch vorteilhaft sein, das Strahlenbündel der Beleuchtung am Mikroskopobjektiv vorbeizuführen. Im letzteren Fall kann das Objektiv kleiner ausgeführt werden, weil das Beleuchtungsstrahlenbündel nicht durch das Objektiv geführt werden braucht.
Vorteilhaft kann das Strahlenbündel der Beleuchtung vor dem Umlenken durch den Reflektor durch das Mikroskopobjektiv geführt werden.
Das Beleuchten der Probe mit dem umgelenkten Strahlenbündel kann in einer Strahlrichtung unter einem mittleren Elevationswinkel ß und einem mittleren Azimutwinkel y erfolgen. Vorteilhaft kann das Strahlenbündel bereits vor dem Umlenken kollimiert werden, um die Probe mit parallelem Licht zu beleuchten. Es können aber auch Abweichungen von der Parallelität vorhanden sein. Dann kann man einen mittleren Elevationswinkel ß und einem mittleren Azimutwinkel des Strahlenbündels angeben.
Das umgelenkte Strahlenbündel kann einen Zentralstrahl aufweisen. Als Zentralstrahl kann der mittlere Strahl des Strahlenbündels betrachtet werden. Das einfallende Strahlenbündel kann ebenfalls einen Zentralstrahl aufweisen. Das kann der Strahl des einfallenden Strahlenbündels sein, der den Reflektor als Zentralstrahl des umgelenkten Strahlenbündels verlässt. Zur Angabe der des Azimutwinkels y und des Elevationswinkels ß kann man ein Kugelko- ordinatensystem verwenden, wobei der Zenit die optische Achse beschreibt, die in Richtung z liegen kann. Der Azimutwinkel kann bezüglich der Richtung x angegeben werden. Die Richtung x kann so festgelegt werden, dass die xz Halbebene mit positivem x einen Zentralstrahl des umgelenkten Lichtbündels umfasst. Der Elevationswinkel kann der Winkel des Zentralstrahls des umgelenkten Strahlenbündels zur xy-Ebene sein. Der Elevationswinkel kann als 90° minus dem Winkel des Zentralstrahls des umgelenkten Strahlenbündels mit der optischen Achse des Mikroskopobjektivs bestimmt werden. Beispielsweise kann der Elevationswinkel zwischen 45° und 90° liegen, besonders vorteilhaft zwischen 70° und 85°. Der Elevationswinkel kann vorteilhaft kleiner als der rechte Winkel gewählt werden. Das kann einem schrägen Einfall des Strahlenbündels auf die Probe, auch schräge Beleuchtung - oblique Illumination- genannt, entsprechen. Dadurch kann der Kontrast im Falle transparenter und/oder semitransparenter Objekte in der Probe verbessert werden. Der Zentralstrahl des umgelenkten Strahlenbündels kann also geneigt zur optischen Achse verlaufen.
Der Elevationswinkel kann aber auch 90° gewählt werden. Dann kann der Zentralstrahl des umgelenkten Strahlenbündels parallel zur optischen Achse sein.
Falls mehrere Lichtbündel vorgesehen sind, können die Lichtbündel einen gleichen Elevationswinkel ß aufweisen. Diese können azimutal gleichmäßig verteilt angeordnet sein. Beispielsweise kann der Azimutwinkel des ersten Strahlenbündels 0° betragen und der eines zweiten Strahlenbündels 180°.
Die Lichtquelle kann vorteilhaft als LED ausgebildet sein. Diese kann in einer Pupillenebene (22) oder in einer zur Pupillenebene konjugierten Ebene angeordnet sein. Die Pupillenebene kann die Ebene sein, in der sich eine Blende befindet. Die Pupillenebene kann die der Probe gegenüberliegende Brennebene des Mikroskopobjektivs sein. Eine geringe Abweichung der Position der LED von der Pupillenebene kann vernachlässigt werden. Daher ist es beispielsweise möglich, die LEDs auf dem Blendenring zu befestigen. Unter einer konjugierten Ebene kann man eine solche Ebene zu verstehen, die mittels einer Relaisoptik (relay optics) auf die Pupillenebene projiziert wird. Die Relaisoptik kann als Relay-Linse (Relay lens) ausgebildet sein oder beispielsweise zwei Fourierlinsen umfassen.
Die Lichtquelle kann als LED ausgebildet sein und jeweils einen direkt vor der lichterzeugenden Fläche angeordneten Diffusor aufweisen. Der Diffusor kann dazu vorgesehen sein, die richtungsabhängige Intensitätsverteilung zu homogenisieren. Das Anordnen direkt vor der lichterzeugenden Fläche kann bewirken, dass eine Richtungshomogenisierung erfolgt, ohne dass die abstrahlende Fläche erheblich vergrößert wird.
Vorteilhaft können die Lichtquellen einen Durchmesser der leuchtenden Flächen aufweisen, welcher kleiner ist als 30% der Brennweite des Mikroskopobjektivs. Die leuchtende Fläche der Lichtquelle kann beispielsweise kreisrund, quadratisch oder rechteckig sein. Die Lichtquelle kann beispielsweise ein LED-Chip oder eine gehäuste SMD-LED sein.
Das Lichtbündel kann linear in einer ersten Polarisationsrichtung polarisiert sein. Alternativ kann das Lichtbündel un- polarisiert sein. Die Probe kann eine flüssige Probensubstanz umfassen. Diese kann sich auf einem Probenträger befinden. Bezüglich der Erdanziehungskraft können sich der Probenträger unten und die flüssige Probensubstanz oben befinden. Dadurch kann ein Abtropfen der Probensubstanz verhindert werden. In diesem Falle kann eine Beleuchtung und Beobachtung der Probe von unten vorteilhaft sein. Dazu kann man zweckmäßig einen transparenten Probenträger verwenden. Dabei kann die erste Seite die Unterseite sein. Der Reflektor kann in diesem Fall über der Probe angeordnet sein. Die Probe kann eine Abdeckung, beispielsweise ein Deckgläschen, umfassen.
Das Mikroskop bzw. das Mikroskopobjektiv kann ein Sichtfeld aufweisen. Das Sichtfeld kann bei einer vorgegebenen Fokusebene eine Fläche in der Fokusebene sein, die mit dem Bildsensor erfasst werden kann. Die Fokusebene kann die Ebene sein, die scharf auf den Bildsensor abgebildet werden kann. Die Fokusebene kann senkrecht zur optischen Achse sein. Zweckmäßigerweise kann sich die Fokusebene in der Probe befinden. Die Fokusebene kann mit der Probenebene zusammenfallen. Dann kann das Mikroskop auf die Probenebene scharf eingestellt sein. Der Strahlengang kann derart vorgesehen sein, dass das umgelenkte Strahlenbündel das Sichtfeld vollständig ausleuchtet.
Das Strahlenbündel kann vor dem Umlenken eine Schnittfläche mit der Fokusebene aufweisen. Die Schnittfläche kann das Sichtfeld enthalten. Dann kann die Probe von zwei Seiten beleuchtet werden. Dadurch kann eine gleichzeitige Auflicht- und Durchlichtbeleuchtung der Probe realisiert werden. Mit einer solchen kombinierten Auflicht- und Durchlichtbeleuchtung können bestimmte Muster in der Probe besser erkannt werden.
Ebenfalls vorteilhaft kann die Schnittfläche außerhalb des Sichtfelds liegen. Das kann bedeuten, dass das Strahlenbündel an einer außerhalb eines Sichtfelds liegenden Stelle durch die Probenebene geführt wird. Dann kann die Probe nur im Durchlichtverfahren, d.h. von der Rückseite beleuchtet werden. Die Rückseite kann die zweite Seite sein.
Das umgelenkte Strahlenbündel kann ebenfalls eine weitere Schnittfläche mit der Fokusebene aufweisen, welche als vom umgelenkten Strahlenbündel beleuchtete Probenfläche bezeichnet werden kann. Vorteilhaft kann die vom umgelenkten Strahlenbündel beleuchtete Probenfläche das Sichtfeld enthalten.
Man kann das umgelenkte Strahlenbündel als Bündel von Parallelstrahlen vorsehen. Dazu kann das Strahlenbündel bereits vor dem Umlenken am Reflektor als Parallelstrahlbündel vorliegen. Es kann aber auch vorteilhaft sein, das umgelenkte Strahlenbündel konvergent oder divergent auf die Probe zu richten. Die Vergenz des Strahlenbündels kann beim Umlenken erhalten bleiben. Das Vorsehen einer Vergenz und/oder des Diffusors können zudem bewirken, dass das Reflektieren des Strahlenbündels unempfindlicher wird gegen beispielsweise ein Verkippen der Probe, Unebenheiten des Reflektors etc.
Der Reflektor kann als ein Fresnel- Prisma ausgebildet sein. Ein Fresnel-Prisma ist beispielsweise aus
JP2000019310 und aus JP2000019309 bekannt. Das Fresnel-Prisma kann mehrere Reflexionsflächen mit Reflexionsflächenormalen umfassen. Die Reflexionsflächenormalen können gegenüber der Plattennormale geneigt sein. Die Reflexionsflächennormalen können jeweils das Einfallslot eines einfallenden Strahls sein. Das Einfallslot kann dem Ersatzlot des Reflektors entsprechen. Die Strahlumlenkung am Fresnel Prisma kann durch eine einfache Reflexion erfolgen. Das Fresnel- Prisma kann eine periodische Struktur aufweisen. In jeder Periode kann genau eine Reflexionsfläche vorgesehen sein. Die Reflexionsflächennormalen des Fresnel-Prismas können parallel sein.
Der Reflektor kann einstückig als eine Platte oder eine Folie ausgebildet sein. Eine Folie kann als eine dünne Platte betrachtet werden. Der Reflektor kann als Schicht auf einer Trägerplatte oder einer Trägerfolie ausgebildet sein. Diese Schicht bzw. die Oberfläche der Platte können eine Stufenstruktur aufweisen. Der Reflektor kann so ausgeführt sein, dass mehrere Strahlen des Strahlenbündels, die an unterschiedlichen Reflexionsflächen des Reflektors umgelenkt wurden, zur Beleuchtung des Sichtfelds beitragen.
Der Reflektor kann als eine periodische Relief-Struktur ausgebildet sein. Eine periodische Struktur kann in einer Richtung, beispielsweise x vorliegen. Es ist aber auch möglich eine in zwei Richtungen, beispielsweise x und y periodische Struktur zu verwenden.
Vorteilhaft kann es sein, wenn in jeder Periode wenigstens zwei Reflexionsflächen vorhanden sind. Der Reflektor kann einen einfallenden Lichtstrahl des Strahlenbündels mittels wenigstens zweier aufeinanderfolgender Einzelreflexionen umlenken. Vorteilhaft können genau zwei Reflexionsflächen in jeder Periode vorgesehen sein. In diesem Fall kann das Ersatzlot von dem Einfallslot der ersten Einzelreflexion verschieden sein. Ebenfalls vorteilhaft können mehr als zwei Reflexionen, beispielsweise drei, vorgesehen sein.
Der Reflektor kann als Mikroprismenarray und/oder Mikrolinsenarray ausgeführt sein.
Der Reflektor kann als Retroreflektor bezüglich mehrerer Strahlrichtungen ausgeführt sein. Eine solche Ausführung kann speziell als Katzenauge oder als retroreflektierender Rückstrahler mit beispielsweise dreiflächigen Winkelreflektoren ausgeführt sein. In diesem Fall kann die Umlenkung des einfallenden Strahlbündels durch drei Reflexionen erfolgen.
Der Reflektor kann in einer alternativen Ausführung bezüglich mehrerer Strahlrichtungen eine von einer Retrorefle- xion abweichende Umlenkung des einfallenden Strahlenbündels bewirken. Die Winkeldifferenz zwischen einem einfallenden und dem zugehörigen ausfallenden Strahl kann in einem bestimmten Winkelbereich unabhängig vom Einfallswinkel sein. Das kann bedeuten, dass ein Ersatzlot in diesem Winkelbereich mit dem Einfallswinkel variiert. Ein solcher Reflektor kann beispielsweise V-Gräben mit einem Dachkantwinkel aufweisen. Ein Dachkantwinkel von 90° kann eine Retroreflexion bewirken, während ein anderer, vorzugsweise kleinerer, Winkel eine von einer Retrorefle- xion abweichende Umlenkung des einfallenden Strahlenbündels bewirkt. Dabei kann aufgrund mehrfacher Einzelreflexionen an beiden Seiten der V-Gräben die Winkeldifferenz zwischen einem einfallenden und dem zugehörigen ausfallenden Strahl in einem bestimmten Winkelbereich unabhängig vom Einfallswinkel sein.
Das auf die Probe einfallende Strahlenbündel der Beleuchtung kann in der Probe und/oder durch Brechung an einer Probenrückseite in wenigstens ein erstes Strahlenbündel und wenigstens ein zweites Strahlenbündel aufgespalten werden. Eine solche Aufspaltung kann beispielsweise durch Brechzahlunterschiede in der Probe, innere optische Grenzflächen in der Probe, eine gekrümmte Probenrückseite und/oder die Ausbildung von Menisken beispielsweise bei einer flüssigen Probe bewirkt werden. Das zweite Strahlenbündel kann in einem anderen Einfallswinkel auf den Reflektor treffen, als das erste Strahlenbündel. In diesem Fall kann die Verwendung eines Retroreflektors als Reflektor besonders vorteilhaft sein. Durch die Verwendung des Retroreflektors können nämlich das erste und das zweite Strahlenbündel jeweils in sich selbst zurückreflektiert werden und somit wieder auf die gleiche Stelle der Probe zurückgeworfen werden, von der sie ausgegangen sind. Dadurch kann eine besonders gleichmäßige Ausleuchtung der Probe erreicht werden. Natürlich können bei der Aufspaltung auch eine Vielzahl von einzelnen Strahlenbündeln entstehen. Deren Anzahl ist nicht auf ein erstes und ein zweite Strahlenbündel beschränkt. Die Darstellung eines ersten und eines zweite Strahlenbündels dient lediglich der Veranschaulichung.
Bei der Ausführung des Reflektors als Retroreflektor kann -wenigstens in einem bestimmten Winkelbereich- der zugehörige ausfallende Strahl dem einfallenden Strahl genau entgegen gerichtet sein. Das Ersatzlot kann in diesem Fall die Richtung des ausfallenden Lichtstrahls sein. Der Begriff Ersatzlot kann in diesem Fall redundant sein. Deshalb kann man, wenn der Reflektor als Retroreflektor ausgeführt ist, auf die Verwendung des Begriffs Ersatzlot verzichten. In einer weiteren Ausführungsform kann der Retroreflektor derart ausgeführt sein, dass er wie aus
DE4117911 bekannt, eine Lichtrückstrahlung in leicht divergenter Art bewirkt.
Besonders vorteilhaft können zur Aufnahme eines Durchlicht-Hellfeldbild und/oder Durchlicht-Dunkelfeldbild mit einer schrägen Beleuchtung erfolgen.
Besonders vorteilhaft kann die die Aufnahme des Bildes als eine Überlagerung eines Durchlicht Hellfeldbildes mit einem Phasenkontrastbild erfolgen. Ebenfalls vorteilhaft kann die die Aufnahme des Bildes als eine Überlagerung eines Durchlicht Dunkelfeldbildes mit einem Phasenkontrastbild erfolgen.
Im Falle eines Phasenkontrastbildes kann zusätzlich wenigstens eine Phasenplatte vorgesehen sein. Diese kann beispielsweise in der Blendenebene angeordnet sein. In diesem Fall kann eine koaxiale Beleuchtung durch das Mikroskopobjektiv vorteilhaft sein. Die Phasenplatte kann eine Verzögerungsplatte und ein Graufilter umfassen. Die Phasenplatte kann als ein Phasenring ausgebildet sein. Das Phasenkontrastbild mit dem erfindungsgemäßen Reflektor kann beispielsweise mit einem der bekannten Verfahren nach Zernicke, Relief-Phasenkontrast nach DE102012005911 , oder Luminanz-Kontrast nach DE102007029814 aufgenommen werden.
Auch die Aufnahme eines Varel-Kontrast- Bildes ist möglich. Bei letzterer wird die Varel- Kontrastierungsmethode verwendet, bei welcher eine Überlagerung von schräger Hellfeldbeleuchtung mit Phasenkontrast eingesetzt wird.
Auch die Aufnahme mit dem Hoffmanschen Modulationskontrastverfahren nach US4062619, US4200353 bzw. US4200354 ist möglich. Dabei kann vorzugsweise in der Pupillenebene, ein Hoffmanscher Modulator vorgesehen sein. Der Modulator kann dreiteilig ausgeführt sein, wobei drei Segmente mit verschiedener optischer Abschwächung vorhanden sind. Das mittlere Segment kann mittig oder außermittig bezüglich der optischen Achse angeordnet sein. Außerdem kann, vorzugsweise in einer zur Pupillenebene konjugierten Ebene des Beleuchtungsstrahlengangs eine Lichtquellenblende vorgesehen sein. Die Lichtquellenblende kann als Schlitzblende ausgeführt sein. Die Schlitzblende kann vorzugsweise teilweise mit einem Polarisationsfilter abgedeckt sein. Der Schlitz kann mittig oder außermittig bezüglich des Beleuchtungsstrahlengangs angeordnet sein. Außerdem kann ein weiterer Polarisationsfilter im Beleuchtungsstrahlengang vorhanden sein.
Allerdings kann bei einem Retroreflektor ein Strahlversatz zwischen dem einfallenden Strahl und dem zugehörigen ausfallenden Strahl auftreten. Ein solcher Strahlversatz kann bei einem Retroreflektor mit makroskopischen Reflexionselementen, beispielsweise einem herkömmlichen Rückstrahler (Katzenauge) aus dem Fahrradladen, bis zu einigen Millimetern betragen. Um den Strahlversatz möglichst gering zu halten, kann die Verwendung eines Mikropris- menarrays oder eingekapselter Mikroglasperlen als Retroreflektor vorteilhaft sein. Derartige Retroreflektoren sind beispielsweise als Folien in den Retro-Reflexionsklassen RA1 , RA2, RA 2/B, RA 2/C und RA3 für Straßenschilder erhältlich, beispielsweise die Folie 3M™ Engineer Grade Prismatic Serie 3430 nach„Technische Information SG 103 / 10.2017“ der Firma 3M Deutschland GmbFI oder die Mikroprismatische retroreflektierende Folie Avery Dennison® T T7500B. Noch besser geeignet können Microcube Reflektoren sein, die als Fullcube-Tripel-Arrays aufgebaut sein können. Als Beispiel eines Fullcube Reflektors kann beispielsweise der Reflektor„3M™ Diamond Grade DG 3. Re- flective Sheeting“ verwendet werden. Ebenfalls geeignet können Mikrostrukturen aus Dreieckspiegeln, auch als pyramidale Tripel zu bezeichnen, sein. Pyramidale Tripel Arrays können kostengünstiger sein als Fullcube Arrays. Fullcube- oder pyramidale Tripel Arrays können beispielsweise in einem Kunststoff Spritzgussverfahren hergestellt werden oder in ein Kunststoffsubstrat, ein Glassubstrat oder in eine flexible Kunststofffolie eingeprägt sein.
Vorteilhaft kann das Strahlenbündel der Beleuchtung durch das Mikroskopobjektiv auf die Probe geführt werden.
Eine solche Strahlführung kann insbesondere bei der Verwendung eines Retroreflektors vorteilhaft sein. Eine solche Strahlführung kann insbesondere auch für Phasenkontrastaufnahmen verwendet werden.
Der Reflektor kann außerdem eine Beugung und Interferenz des Lichts bewirken. Der Reflektor kann prinzipiell auch als Reflexionsgitter, vorzugsweise als Blaze-Gitter ausgeführt sein. Allerdings kann das den Nachteil haben, dass großflächige Blaze-Gitter derzeit sehr teuer sind. Außerdem können die bei einem Gitter auftretenden wellenlängenabhängigen Beugungswinkel nachteilig sein. Daher kann es vorteilhaft sein, Beugungseffekte zu minimieren. Beispielsweise können die Strukturbreiten des Reflektors so groß gewählt werden, dass der Reflexionswinkel wenigstens der mehr als zehnten, bevorzugt der mehr als dreißigsten und besonders bevorzugt der mehr als hundertsten Beugungsordnung eines Blaze-Gitters entspricht. Die Periode des Reflektors kann beispielsweise zwischen 50 Mikrometern und 5 Millimetern betragen, bevorzugt zwischen 0,1 Millimetern und 2 Millimetern. Dann können in verschiedenen Beugungsordnungen gebeugte bzw. durch eine Dispersion aufgespaltene Strahlen aufgrund der spektralen Breite der Lichtquelle und/oder der Vergenz des Strahlenbündels am Ort der Probe vermischt werden. Dadurch können Beugungs- und Dispersionseffekte bei der Strahlumlenkung am Reflektor vermieden werden. Ebenfalls vorteilhaft kann die Periode des Reflektors zwischen dmhi und IOOmhi betragen. Obwohl solche feinen Strukturen schwieriger herzustellen sind, kann das wegen des geringen Strahlversatzes vorteilhaft sein.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Aufprojektionsschirm, beispielsweise ein solcher auf Basis von Reflexions-Volumenhologrammen, bekannt aus„Tageslichttaugliche Aufprojektionsschirme auf Basis von Reflexions-Volumenhologrammen“; von Spiegel, Wolff, Darmstadt (2006), http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000799, als Reflektor verwendet werden. In einerweiteren Ausführungsform kann man einen Retroreflektor verwenden, der sowohl holografische als auch ret- roreflektive Schichten aufweist. Ein solcher Reflektor ist in US5656360 beschrieben.
Vorteilhaft kann der Reflektor in einem Abstand, der entlang der optischen Achse, d.h. in z Richtung gemessen werden kann, zur Probenebene angeordnet sein, der gleich oder größer als die halbe Brennweite, besonders vorteilhaft größer als die einfache Brennweite des Mikroskopobjektivs ist. Dadurch können Artefakte durch lokale Fehler des Reflektors, beispielsweise einzelne fehlerhafte oder verschmutzte Mikroprismen, vermieden werden. Vorteilhaft kann dieser Abstand kleiner als das 10 fache, besonders vorteilhaft kleiner als das 5 fache der Brennweite des Objektivs gewählt werden. Bei einem zu großen Abstand könnten ansonsten beispielsweise Winkelfehler der Prismen Artefakte im mikroskopischen Bild verursachen. Vorteilhaft kann die Plattennormale des Reflektors parallel zur optischen Achse, d.h. in z-Richtung gewählt werden. Vorteilhaft kann der Abstand des Reflektors zur Probenebene fest sein. Alternativ kann dieser Abstand veränderbar sein, was aber aufwändiger sein kann. Vorteilhaft kann die Lichtquelle derart gewählt werden, dass deren Kohärenzlänge kleiner ist als das Doppelte des vorgenannten Abstands. Dann können Artefakte infolge einer Interferenz von Durchlicht- und Auflichtbeleuchtung vermieden werden. Alternativ kann die Lichtquelle derart gewählt werden, dass deren Kohärenzlänge größer ist als das Doppelte des vorgenannten Abstands. Dann können infolge einer Interferenz von Durchlicht- und Auflichtbeleuchtung Kontraste bestimmter Objekte in der Probe überhöht werden.
Der Retroreflektor kann derart ausgeführt sein, dass der Strahlversatz zwischen einem einfallenden und einem ausfallenden Strahl höchstens weniger als IOOmhi beträgt. Dazu können Retro refl e kto re n aus Mikroprismenarrays mit einer Periode von weniger als IOOmhi oder Retroreflektoren mit Mikroglaskugeln von weniger als IOOmhi Durchmesser geeignet sein. Vorteilhaft kann ein solcher Retroreflektor gewählt werden, bei dem die Halbwertsbreite der rückgestreuten Lichtintensität weniger als 5°, besonders vorteilhaft weniger als 3° und ganz besonders vorteilhaft weniger als 1 ° beträgt. Dann kann ein einfallendes Strahlenbündel möglichst genau in sich selbst zurückgeworfen werden. Dadurch kann ein möglichst hoher Kontrast im mikroskopischen Bild erreicht werden. Ebenfalls vorteilhaft kann die Halbwertsbreite der rückgestreuten Intensität größer als 20 Winkelminuten sein. Dann können geringe Winkelfehler der Prismenwinkel ausgeglichen werden. Besonders vorteilhaft kann ein Retroreflektor der lichttechnischen Leistungsklasse RA3 (früher„Typ 3“) sein. Derartige Retroreflektoren können unter einem Anleuchtwinkel von 5° und einem Betrachtungswinkel von 0,33° einen Mindestrückstrahlwert von 300cd / Ix pro m2 aufweisen oder überschreiten.
Das umgelenkte Strahlenbündel kann eine Durchlicht- Hellfeldbeleuchtung oder eine oder eine Durchlicht-Dunkel- feldbeleuchtung der Probe bewirken.
In einer vorteilhaften Ausführungsform können mehrere mikroskopische Bilder mehrerer Proben und/oder einer Probe an mehreren Stellen aufgenommen werden. Dazu kann eine Mikroskopkamera, welche den Bildsensor umfasst, verwendet werden. Außerdem kann die Mikroskopkamera ein Kameraobjektiv umfassen. Die Mikroskopkamera kann von der Aufnahme eines Bildes zur Aufnahme eines nächsten Bildes jeweils bezüglich der Proben bzw. der Probe bewegt werden. Der Reflektor kann bezüglich der Proben bzw. der Probe fix angeordnet sein. Das kann bedeuten, dass er nicht mit der Kamera mitbewegt wird. Die Lichtquelle kann bezüglich der Mikroskopkamera fix angeordnet sein. Das kann bedeuten, dass die Lichtquelle jeweils mit der Mikroskopkamera mitbewegt wird.
Vorteilhaft ist ein Mikroskop zur Aufnahme wenigstens eines Durchlicht Hellfeldbildes oder Durchlicht-Dunkelfeldbil- des wenigstens einer Probe in wenigstens einem Sichtfeld, umfassend
• Einen Strahlengang umfassend wenigstens einen Beleuchtungsstrahlengang und wenigstens einen Abbildungsstrahlengang,
• Wenigstens eine Lichtquelle zum Erzeugen wenigstens eines Strahlenbündels,
• Einen plattenförmiger Reflektor zum Umlenken des Strahlenbündels, wobei das umgelenkte Strahlenbündel zum Beleuchten der Probe vorgesehen ist, und wobei der plattenförmig ausgebildete Reflektor eine Plattennormale und ein von der Plattennormale abweichendes Ersatzlot bezüglich des Beleuchtungsstrahlenbündels aufweist,
• Wenigstens ein Mikroskopobjektiv für den Abbildungsstrahlengang,
• Wenigstens einen Bildsensor
Besonders vorteilhaft kann ein Mikroskop zur Aufnahme wenigstens eines Bildes wenigstens einer Probe in wenigstens einem Sichtfeld sein, umfassend
• Einen Strahlengang umfassend wenigstens einen Beleuchtungsstrahlengang und wenigstens einen Abbildungsstrahlengang,
• Wenigstens eine Lichtquelle zum Erzeugen wenigstens eines Beleuchtungsstrahlenbündels,
• Einen plattenförmiger Reflektor zum Umlenken des Beleuchtungsstrahlenbündels, wobei das umgelenkte Beleuchtungsstrahlenbündel zum Beleuchten der Probe vorgesehen ist, und wobei der Reflektor als Retroreflektor ausgebildet ist,
• Wenigstens ein Mikroskopobjektiv für den Abbildungsstrahlengang,
• Wenigstens einen Bildsensor,
wobei das Beleuchtungsstrahlenbündel vor dem Umlenken am Reflektor durch das Mikroskopobjektiv geführt wird. Hier kann also das Mikroskopobjektiv sowohl für den Beleuchtungsstrahlengang als auch für den Abbildungsstrahlengang benutzt werden. Dabei können sowohl das noch nicht umgelenkte Beleuchtungsstrahlenbündel als auch das umgelenkte Beleuchtungsstrahlenbündel gleichzeitig zum Beleuchten der Probe vorgesehen sein.
Dabei können die Lichtquelle, das Mikroskopobjektiv und der Bildsensor im Sinne einer Epi-Beleuchtung auf einer Seite der Probe, der Reflektor hingegen auf der anderen Seite der Probe angeordnet sein. Geometrisch kann man eine solche Ausführung der Erfindung präziser ausgedrückt derart beschreiben, dass die Lichtquelle, das Mikroskopobjektiv und der Bildsensor bezüglich der Probenebene in einem gemeinsamen Halbraum angeordnet sind, der Reflektor im anderen Halbraum angeordnet ist. Der Beleuchtungsstrahlengang kann parallel zur optischen Achse vorgesehen sein. Dadurch kann der Aufbau kostengünstig sein. Der Beleuchtungsstrahlengang kann ebenfalls vorteilhaft geneigt zur optischen Achse vorgesehen sein. Dadurch kann der Kontrast der Aufnahme verbessert sein.
Außerdem kann das Mikroskop ein Kameraobjektiv umfassen.
Vorteilhaft kann, insbesondere wenn der Beleuchtungsstrahlengang bzw. die Beleuchtungsstrahlengänge gegenüber der optischen Achse geneigt sind, zusätzlich zur ersten Lichtquelle wenigstens eine zweite Lichtquelle vorhanden sein. Mit der zweiten Lichtquelle kann ein zweites Beleuchtungsstrahlenbündel erzeugbar sein. Die zweite Lichtquelle kann unabhängig von der ersten Lichtquelle betreibbar sein. Der plattenförmige Reflektor kann außerdem zum Umlenken des zweiten Strahlenbündels vorgesehen sein. Das umgelenkte zweite Strahlenbündel kann zum Beleuchten der Probe vorgesehen sein. Dabei kann das zweite Strahlenbündel eine von einer ersten Beleuchtungssituation verschiedene zweite Beleuchtungssituation bewirken. Ein solches Mikroskop kann auch vorteilhaft zum Aufnehmen mehrerer Bilder für die oben beschriebenen Verfahren verwendet werden. In diesem Fall kann das Mikroskop mehrere, beispielsweise zwei, Lichtquellen und Beleuchtungsstrahlengänge aufweisen. Die Beleuchtung der ersten Aufnahme kann mit der ersten Lichtquelle und die Beleuchtung einer zweiten Aufnahme mit einer zweiten Lichtquelle erfolgen. Dann kann aus beiden Bildern ein Summenbild und/oder ein Differenzbild berechnet werden, welches einen verbesserten Kontrast im Vergleich zu den Einzelbildern aufweisen kann.
Vorteilhaft kann bei dem Mikroskop eine Fokusebene vorhanden sein, die scharf auf den Bildsensor abbildbar ist. In der Fokusebene kann das Sichtfeld vorgesehen sein, das mit dem Bildsensor erfassbar ist. Das Beleuchtungsstrahlenbündel kann im Strahlengang vor dem Umlenken am Reflektor eine Schnittfläche mit der Fokusebene aufweisen. Diese Schnittfläche kann das Sichtfeld enthalten. Auf diese Weise kann eine kombinierte Auflicht- und Durchlichtbeleuchtung der Probe erreicht werden. Das kann besonders vorteilhaft sein, wenn die Beleuchtung durch das Mikroskopobjektiv hindurch erfolgt.
Die Figuren zeigen Folgendes:
Fig. 1 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel.
Fig. 2 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel.
Fig. 3 zeigt ein drittes Ausführungsbeispiel.
Fig. 4 zeigt ein viertes Ausführungsbeispiel.
Fig. 5 zeigt ein fünftes und ein sechstes Ausführungsbeispiel.
Fig. 6 zeigt ein siebentes Ausführungsbeispiel.
Fig. 7 zeigt eine erste Ausführung des Beleuchtungsstrahlengangs in einer Schnittebene.
Fig. 8 zeigt eine zweite Ausführung des Beleuchtungsstrahlengangs in einer Schnittebene.
Fig. 9 zeigt eine Lichtquelle.
Fig. 10 zeigt ein achtes Ausführungsbeispiel.
Fig. 11 zeigt ein neuntes Ausführungsbeispiel.
Fig. 12 zeigt ein zehntes Ausführungsbeispiel. Fig. 13 zeigt eine Strahlumlenkung an einem Element eines Mikroprismenarrays.
Fig. 14 zeigt einen Ausschnitt aus einem Reflektor.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird nachfolgend an Ausführungsbeispielen erläutert.
Fig. 1 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel. Dargestellt ist eine Vorrichtung zur Aufnahme wenigstens eines mikroskopischen Bildes 1 , die man auch als Mikroskop bezeichnen kann. Die optische Achse 2 des Mikroskopobjektivs liegt in z-Richtung. Eine Probe 7 mit transparenten und/oder semitransparenten Objekten 9 befindet sich auf einem Probenträger 10. Das Mikroskop umfasst ein Mikroskopobjektiv 20 mit einer optischen Achse 2. Die Lichtquelle 17 ist etwas vor der Pupillenebene 22 angeordnet. Die Pupillenebene ist die xy- Ebene, in welcher sich die Blende 21 , die man auch als Pupille bezeichnen kann, befindet. Durch diese Anordnung der Lichtquelle wird eine leichte Divergenz des Strahlenbündels 3 bewirkt. Alternativ kann man die Lichtquelle in der Pupillenebene anordnen, um ein paralleles Strahlenbündel (nicht dargestellt) zu erzeugen.
Die Ebene 16 ist die Fokusebene, in welcher Objekte scharf auf den Bildsensor 25 abgebildet werden. Die Fokusebene ist gleichzeitig die Probenebene 8, in der die Probe angeordnet ist.
Das Strahlenbündel 3 wird durch die Probenebene 8 bis zu einem plattenförmig ausgebildeten Reflektor 11 geführt. Der plattenförmig ausgebildete Reflektor 11 weist eine Plattennormale 12 und eine von der Plattennormale abweichende Ersatzlot 14 bezüglich des Beleuchtungsstrahlenbündels 3 auf. Der Reflektor 11 ist als ein Fresnel- Prisma ausgebildet sein. Das Fresnel-Prisma umfasst mehrere Reflexionsflächen 13 mit Reflexionsflächenormalen 14. Die Reflexionsflächenormalen sind gegenüber der Plattennormale 12 geneigt. Die Reflexionsflächennormalen sind jeweils das Einfallslot eines einfallenden Strahls. Das Einfallslot entspricht dem Ersatzlot des Reflektors. Der Reflektor weist eine periodische Struktur mit einer Periode 29 in x-Richtung auf. Jede Periode 29 umfasst eine Reflexionsfläche. Die steilen Flanken zwischen den Reflexionsflächen 13 hingegen sind nicht zur Reflexion vorgesehen.
Dargestellt ist außerdem das Umlenken des Strahlenbündels 3 durch den Reflektor 11. Das umgelenkte Strahlenbündel 4 weist einen Zentralstrahl 5 auf. Mit dem umgelenkten Strahlenbündel 4 wird die Probe beleuchtet.
Außerdem ist eine Kamera 23 dargestellt, die ein Kameraobjektiv 24 und einen Bildsensor 25 umfasst. Mit einem Bildsensor 25 kann man ein oder mehrere mikroskopische Bilder der Probe aufnehmen. Um den Abbildungsstrahlengang zu verdeutlichen, sind hier vom Lichtstrahlen 6 vom Objekt dargestellt.
Bei der in Fig. 1 dargestellten Beleuchtung handelt es sich um eine Hellfeld-Durchlichtbeleuchtung. Die Gravitationsrichtung ist hier die z-Richtung. Die Probe wird also von unten beleuchtet und von unten beobachtet.
Fig. 2 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel. Hier ist der Reflektor bezüglich des Strahlenbündels 3 im Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel annähernd als Retroreflektor ausgeführt. Kennzeichnend dafür ist, dass die einfallenden Lichtstrahlen nahezu in sich selbst zurückreflektiert werden. Die anderen Bezugszeichen entsprechen denen des ersten Ausführungsbeispiels. Bei der in Fig. 2 dargestellten Beleuchtung handelt es sich um eine kombinierte Auflicht- und Durchlicht- Dunkelfeldbeleuchtung.
Fig. 3 zeigt ein drittes Ausführungsbeispiel. Im Unterschied zu den vorstehenden Ausführungsbeispielen wird das Beleuchtungsstrahlenbündel 3 hier außen am Objektiv 20 vorbeigeführt. Die Lichtquelle 17 umfasst hier eine eigene Kollimationsvorrichtung (nicht dargestellt) zum Erzeugen eines parallelen Strahlenbündels. Anhand dieses Ausführungsbeispiels ist außerdem die Schnittfläche 26 des Strahlenbündels 3, d.h. des Strahlenbündels vor der Umlenkung, mit der Fokusebene 16, die auch hier in der Probenebene 8 liegt, dargestellt. Außerdem ist das Sichtfeld 27 dargestellt. Die Schnittfläche 26 liegt hier außerhalb des Sichtfelds 27. Hier handelt es sich um eine Durchlicht- Dunkelfeldbeleuchtung. Der Reflektor ist so ausgeführt, dass in jeder Periode eine bezüglich der Richtung z ansteigende Flanke 30 und eine abfallende Flanke 31 vorhanden sind. Dabei werden nur die länger ausgeführten ansteigenden Flanken als Reflexionsflächen 13 benutzt. Die anderen Bezugszeichen entsprechen denen der vorangegangenen Ausführungsbeispiele.
Fig. 4 zeigt ein viertes Ausführungsbeispiel. Hier handelt es sich um eine Durchlicht- Hellfeldbeleuchtung, wobei das Beleuchtungsstrahlenbündel 3 außen am Objektiv 20 vorbeigeführt wird. Die anderen Bezugszeichen entsprechen denen der vorangegangenen Ausführungsbeispiele.
Fig. 5 zeigt ein fünftes und ein sechstes Ausführungsbeispiel. Im fünften Ausführungsbeispiel ist eine erste Lichtquelle 17.a zum Erzeugen des ersten Strahlenbündels 3.a vorgesehen. Der Reflektor 11 weist V Gräben auf, wobei in jeder Periode 29 eine bezüglich der Richtung z ansteigende Flanke 30 und eine gleich lange abfallende Flanke 31 vorhanden sind. Dabei werden beide Flanken als Reflexionsflächen 13 benutzt. Die dargestellten Strahlen des Strahlenbündels 3.a werden durch eine erste Reflexion 15.a an einer Reflexionsfläche und eine nachfolgende zweite Reflexion 15.b an einer anderen Reflexionsfläche umgelenkt. Dadurch ist das Ersatzlot 14 von der Richtung des einfallenden Strahls abhängig. Das erste Ersatzlot 14.a bezeichnet hier das Ersatzlot des Zentralstrahls des einfallenden Strahlenbündels 3.a. Durch das Zusammenwirken beider Einzelreflexionen entsteht das erste umgelenkte Strahlenbündel 4.a, mit welchem die Probe unter schrägem Lichteinfall beleuchtet wird. Der Dachkantwinkel 32 ist hier kleiner als 90° gewählt. Die anderen Bezugszeichen entsprechen denen der vorangegangenen Ausführungsbeispiele. In einer Abwandlung des sechsten Ausführungsbeispiels sind drei Reflexionen (nicht dargestellt) zur Umlenkung des Strahlenbündels vorgesehen. Dazu kann der Reflektor als Mikroprismenarray, beispielsweise als Fullcube- oder als pyramidale Tripel- Mikroprismen-Array ausgebildet sein.
Im sechsten Ausführungsbeispiel ist zusätzlich eine zweite Lichtquelle 17.b vorgesehen, die unabhängig von der ersten Lichtquelle 17.a betreibbar ist. Mit eingeschalteter erster Lichtquelle wird ein erstes Bild aufgenommen. Danach wird die erste Lichtquelle ausgeschaltet und die zweite Lichtquelle eingeschaltet. Da das Ersatzlot von der Einfallsrichtung des Lichts abhängt hat der Reflektor 11 nun ein zweites Ersatzlot 14. b und zweite einfallende Strahlenbündel 3.b wird in ein zweites umgelenktes Strahlenbündel 4.b umgelenkt und beleuchtet die Probe aus einer anderen Richtung, als das erste umgelenkte Strahlenbündel 4.a. Unter dieser Beleuchtung wird nun ein zweites Bild der Probe aufgenommen. Aus diesen beiden Bildern kann man ein Differenzbild berechnen, in welchem die Kontraste der beobachteten Objekte verbessert sein können. Fig. 6 zeigt ein siebentes Ausführungsbeispiel. Hier werden mehrere mikroskopische Bilder mehrerer Proben 7 a-c aufgenommen. Dazu wird eine Scannereinheit 33 verwendet, die eine Mikroskopkamera 23, das Objektiv 20 und die Lichtquelle 17 trägt. Diese Scannereinheit ist in einer xy Ebene unter den Proben verschiebbar 34 angeordnet. Die Mikroskopkamera umfasst den Bildsensor 25 und ein Kameraobjektiv 24. Die Lichtquelle 17 ist bezüglich der Mikroskopkamera fix angeordnet.
Von der Aufnahme eines Bildes zur Aufnahme eines nächsten Bildes ist jeweils eine Verschiebung 34 der Scannereinheit 33 bezüglich der Proben 7 vorgesehen. Der Reflektor 11 ist bezüglich der Proben fix angeordnet.
Fig. 7 zeigt eine erste Ausführung des Beleuchtungsstrahlengangs in einer Schnittebene. Die Schnittebene ist hier die Fokusebene 16. Dargestellt sind hier die Schnittfläche 26 des einfallenden Strahlenbündels mit der Fokusebene, das Sichtfeld 27 und die vom umgelenkten Strahlenbündel beleuchtete Probenfläche 28. Wie man sieht, handelt es sich hier um eine kombinierte Auflicht- und Durchlicht- Beleuchtung. Eine solche Beleuchtung ist im zweiten Ausführungsbeispiel in Fig. 2 dargestellt.
Fig. 8 zeigt eine zweite Ausführung des Beleuchtungsstrahlengangs in einer Schnittebene. Die Schnittebene ist hier die Fokusebene 16. Dargestellt sind hier die Schnittfläche 26 des einfallenden Strahlenbündels mit der Fokusebene, die außerhalb des Sichtfelds liegt, das Sichtfeld 27 und die vom umgelenkten Strahlenbündel beleuchtete Probenfläche 28. Wie man sieht, handelt es sich hier um eine Durchlicht- Beleuchtung.
Fig. 9 zeigt eine Lichtquelle. Die Lichtquelle ist eine LED 17. Vor der lichtemittierenden Fläche befindet sich ein Diffusor 18, sowie Lichtquellenblenden 19. Damit kann eine homogene Richtungsverteilung des Beleuchtungslichts über einen begrenzten Bereich erreicht werden.
Fig. 10 zeigt ein achtes Ausführungsbeispiel. Hier ist der Reflektor 11 als Retroreflektor ausgeführt. Beim Durchleuchten der Probe 7 wird das Strahlenbündel 3 der Beleuchtung in mehrere Strahlenbündel aufgespalten. Das kann durch Brechzahlunterschiede in der Probe und/oder durch die Brechung an einer gekrümmten Probenrückseite 35 erfolgen. Dargestellt sind ein erstes 3.a, ein zweites 3.b und ein drittes Strahlenbündel 3.c. Diese fallen in unterschiedlichen Richtungen auf den Retroreflektor 11. Jedes Strahlenbündel wird am Retroreflektor entgegen der Einfallsrichtung zurückreflektiert, nämlich das erste Strahlenbündel 3.a in das erste umgelenkte Strahlenbündel 4.a, das zweite Strahlenbündel 3.b in das zweite umgelenkte Strahlenbündel 4.b und das dritte Strahlenbündel 3.c in das dritte umgelenkte Strahlenbündel 4.c. Den einzelnen Strahlenbündeln können hier Ersatzlote zugeordnet werden, deren Richtung dem jeweils ausfallenden Strahl entspricht. Das erste Ersatzlot 14.a entspricht dem ersten umgelenkten Strahlenbündel 4.a, das zweite Ersatzlot 14. b dem zweiten umgelenkten Strahlenbündel 4.bund das dritte Ersatzlot 14. c dem dritten umgelenkten Strahlenbündel 4.c. Die Beschreibung des Strahlengangs mittels der Ersatzlote ist allerdings hier im Falle eines Retroreflektors redundant, da die Richtung des umgelenkten Strahls entgegen dem einfallenden Strahl bereits durch die Funktion des Retroreflektors eindeutig beschrieben ist. Die Umlenkung der Strahlenbündel erfolgt durch mehrere Reflexionen, beispielhaft angegeben sind eine erste Reflexion 15.a und eine zweite Reflexion 15.b. Bei der vorteilhaften Ausführung des Reflektors als Mikroprismenarray sind drei Reflexionen zum Umlenken jedes Strahls vorgesehen. Dabei kann ein Strahlversatz zwischen dem einfallenden und dem ausfallenden Strahl entstehen. Der maximale Strahlversatz ist umso geringer, je kleiner die Periode 29, d.h. die Strukturgröße des Retroreflektors gewählt wird. Als Strukturgröße kann hier im Falle eines Prismenarrays die Ausdehnung der Prismen oder im Falle eingebetteter Glaskugeln deren Durchmesser betrachtet werden. Um vorteilhaft den Strahlversatz zu minimieren, kann die Verwendung von Mikroprismenarrays oder möglichst kleiner eingebetteter Glaskugeln für den Retroreflektor vorteilhaft sein. Die umgelenkte Strahlenbündel 4.a, 4.b, 4.c sollen nämlich möglichst nahe den Strahlenbündeln 3.a, 3.b bzw. 3.c auf die Probenrückseite treffen. Dann können sie in entgegengesetzter Weise gebeugt werden wie letztere. Dadurch kann eine Durchlichtbeleuchtung erreicht werden, die parallel oder in gleicher weise divergent ist wie das einfallende Strahlenbündel der Beleuchtung 3. In der Darstellung handelt es sich um eine achsenparallele Hellfeldbeleuchtung, d.h. dass das Strahlenbündel der Beleuchtung 3 parallel zur optischen Achse 2 verläuft. In einer nicht dargestellten Abwandlung des Ausführungsbeispiels kann schräge Hellfeldbeleuchung vorgesehen sein. Bei Letzterer verläuft das Strahlenbündel der Beleuchtung 3 in einem Winkel zur optischen Achse 2. In diesem Ausführungsbeispiel wird das Beleuchtungsstrahlenbündel mit einem teildurchlässigen Spiegel 38 eingespiegelt.
In der Darstellung ist ebenfalls eine optionale Konfiguration zur Aufnahme eines Hoffmanschen Modulationskontrastbildes zu sehen. Diese optionale Konfiguration umfasst einen Modulator 37. Dieser umfasst drei Segmente unterschiedlicher optischer Abschwächung, die mittels Strichlinien unterschiedlicher Strichbreite angedeutet sind. Dieser Modulator ist normalerweise für den Beobachtungsstrahlengang (nicht dargestellt) vorgesehen. Das Beleuchtungslicht ist hier ebenfalls durch den Modulator geführt. Außerdem umfasst die optionale Konfiguration eine Schlitzblende (Spaltblende) 19. Die genannte Blende kann fest oder drehbar und/oder verschiebbar sein. Diese Blende ist teilweise mit einem Polarisator belegt, der gestrichelt dargestellt ist. Außerdem kann optional ein weiterer Polarisator 39 vorgesehen sein, der auf das gesamte genutzte Beleuchtungsstrahlenbündel wirkt. Dieser kann drehbar sein.
Fig. 11 zeigt ein neuntes Ausführungsbeispiel. Im Unterschied zum vorgenannten Ausführungsbeispiel ist hier eine schräge Dunkelfeldbeleuchtung vorgesehen. Auch in diesem Beispiel wird ein Retroreflektor 11 verwendet. In einer Abwandlung dieses Ausführungsbeispiels ist eine zweite Lichtquelle (nicht dargestellt) vorgesehen, die unabhängig von der ersten Lichtquelle 17 betreibbar ist. Dann kann mit jeweils einer eingeschalteten Lichtquelle je ein Teilbild aufgenommen werden und das mikroskopische Bild kann als Differenzbild beider Teilbilder erstellt werden.
Fig. 12 zeigt ein zehntes Ausführungsbeispiel. Hier ist eine Phasenplatte 36 vorgesehen, welche als Phasenring ausgebildet ist. Dargestellt ist ein erster Beleuchtungsstrahlengang 3, der von einer ersten Punktlichtquelle 17.a ausgeht. Zusätzlich können weitere Punktlichtquelle angegeben werden, beispielsweise eine zweite Punktlichtquelle 17.b im dargestellten Schnittbild. In diesem Ausführungsbeispiel ist eine ringförmige Beleuchtung vorgesehen, die als eine Vielzahl ringförmig angeordneter Lichtquellen betrachtet werden kann. Die einzelnen Lichtquellen 17.a, 17.b können von einer einzigen Lichtquelle 17 gespeist werden. Dadurch kann die ringförmige Beleuchtung kohärent erfolgen, um als mikroskopisches Bild eine Phasenkontrastaufnahme zu bewerkstelligen. In diesem Ausführungsbeispiel wird das Beleuchtungsstrahlenbündel mit einem teildurchlässigen Spiegel 38 eingespiegelt.
In einer alternativen Abwandlung dieses Ausführungsbeispiels wird die Phasenplatte weggelassen und eine oder mehrere Hellfeldaufnahmen der Probe mit schräger Beleuchtung aufgenommen.
Fig. 13 zeigt eine Strahlumlenkung an einem Element eines Mikroprismenarrays. Jeder Strahl erfährt eine Strahlum- lenkung durch eine erste 15.a, eine zweite 15.b und eine dritte Reflexion 15.c an jeweils einer der Flächen des Mikroprismas 40.
Fig. 14 zeigt einen Ausschnitt aus einem Reflektor. Der Reflektor ist ein Retroreflektor, welcher in diesem Ausführungsbeispiel als Fullcube- Mikroprismenarray ausgebildet ist. Das Mikroprismenarray umfasst viele dreiflächige Mikroprismen 40. Derartige Retroreflektoren können in den obenstehenden Ausführungsbeispielen verwendet werden.
Bezugszeichen
1. Vorrichtung zur Aufnahme wenigstens eines mikroskopischen Bildes
2. Optische Achse
3. Strahlenbündel der Beleuchtung
a. Erstes Strahlenbündel
b. Zweites Strahlenbündel
c. Drittes Strahlenbündel
4. Umgelenktes Strahlenbündel
a. Erstes umgelenktes Strahlenbündel
b. Zweites umgelenktes Strahlenbündel
c. Drittes umgelenktes Strahlenbündel
5. Zentralstrahl des umgelenkten Strahlenbündels
6. Lichtstrahl vom Objekt
7. Probe
a. Erste Probe
b. Zweite Probe
c. Dritte Probe
8. Probenebene
9. Transparente und/oder semitransparente Objekte
10. Probenträger
11. Reflektor, Fresnel-Prisma
12. Plattennormale
13. Reflexionsfläche
14. Ersatzlot
a. Erstes Ersatzlot
b. Zweites Ersatzlot
c. Drittes Ersatzlot
15. Reflexion a. Erste Reflexion
b. Zweite Reflexion
c. Dritte Reflexion
sebene
quelle
a. Erste Lichtquelle
b. Zweite Lichtquelle
sor
quellenblende
ktiv, Mikroskopobjektiv
de, Pupille
llenebene
era
eraobjektiv
ensor
ittfläche
tfeld
umgelenkten Strahlenbündel beleuchtete Probenfläche de
eigende Flanke
llende Flanke
hkantwinkel
ner
chiebung
enrückseite
enplatte
ulator
urchlässiger Spiegel
risator
flächiges Mikroprisma

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung wenigstens eines plattenförmig ausgebildeten Reflektors (11) zum Umlenken wenigstens eines Beleuchtungsstrahlenbündels (3) zum Beleuchten wenigstens einer Probe (7) zum Aufnehmen wenigstens eines mikroskopischen Bildes der Probe von einer ersten Seite mit einem Bildsensor (25), wobei der plattenförmig ausgebildete Reflektor (11) eine Plattennormale (12) und ein von der Plattennormale abweichendes Ersatzlot (14) bezüglich des Beleuchtungsstrahlenbündels (3) aufweist und der Reflektor auf einer zweiten Seite, welche der ersten Seite bezüglich der Probe gegenüberliegt, angeordnet ist.
2. Verfahren zum Aufnehmen eines mikroskopischen Bildes wenigstens eines Bereichs wenigstens einer in einer Probenebene (8) angeordneten Probe (7) von einer ersten Seite, umfassend
• Erzeugen wenigstens eines Strahlenbündels (3) mit Hilfe wenigstens einer Lichtquelle (17),
• Führen des Strahlenbündels (3) durch die Probenebene (8) bis zu einem plattenförmig ausgebildeten Reflektor (11), wobei der Reflektor ein Retroreflektor ist,
• Umlenken des Strahlenbündels (3) durch den Reflektor (11),
• Beleuchten der Probe mit dem umgelenkten Strahlenbündel (4),
• Aufnehmen des mikroskopischen Bildes mit einem Bildsensor (25).
3. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (7) in einer horizontalen Probenebene (8) angeordnet ist und/oder dass das Aufnehmen des mikroskopischen Bildes von unten bezüglich der Erdanziehungskraft erfolgt.
4. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Reflektor (11) einstückig als eine Platte oder eine Folie ausgebildet ist und/oder dass der Reflektor (11) als Schicht auf einer Trägerplatte oder einer Trägerfolie ausgebildet ist.
5. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fokusebene (16) vorhanden ist, die scharf auf den Bildsensor (25) abgebildet wird, und in der Fokusebene ein Sichtfeld (27) vorhanden ist, das mit dem Bildsensor (25) erfasst wird und das Beleuchtungsstrahlenbündel (3) vor dem Umlenken eine Schnittfläche (26) mit der Fokusebene (16) aufweist und die Schnittfläche (26) das Sichtfeld (27) enthält.
6. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Strahlenbündel (3) an einer außerhalb eines Sichtfelds (27) liegenden Stelle (18) durch die Probenebene (8) geführt wird.
7. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das umgelenkte Strahlenbündel (4) eine Durchlicht- Hellfeldbeleuchtung oder eine Durchlicht-Dunkelfeldbe- leuchtung bewirkt.
8. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das umgelenkte Strahlenbündel (4) einen Zentralstrahl (5) aufweist, welcher geneigt zu einer optischen Achse (2) verläuft.
9. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (17) eine LED ist.
10. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere mikroskopische Bilder mehrerer Proben (7) und/oder einer Probe an mehreren Stellen aufgenommen werden und dass eine Mikroskopkamera (23), welche den Bildsensor (25) und ein Kameraobjektiv (24) umfasst, von der Aufnahme eines Bildes zur Aufnahme eines nächsten Bildes jeweils bezüglich der Proben (7) bzw. der Probe bewegt wird und der Reflektor (11) bezüglich der Proben bzw. der Probe fix angeordnet ist und die Lichtquelle (17) bezüglich der Mikroskopkamera (23) fix angeordnet ist.
11. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Reflektor (11) als eine periodische Relief-Struktur ausgebildet ist und in jeder Periode (29) wenigstens zwei Reflexionsflächen (13) vorhanden sind.
12. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Reflektor (11) als Mikroprismenarray und/oder Mikrolinsenarray ausgeführt ist.
13. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Reflektor (11) als Retroreflektor ausgeführt ist, welcher als Fullcube- Mikroprismenarray- oder als pyramidale Tripel- Mikroprismen-Array ausgebildet ist oder eingekapselte Mikroglasperlen umfasst.
14. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das auf die Probe einfallende Strahlenbündel (3) der Beleuchtung in der Probe (7) und/oder durch Brechung an einer Probenrückseite (35) in wenigstens ein erstes Strahlenbündel (3.a) und wenigstens ein zweites Strahlenbündel (3.b) aufgespalten wird, wobei das zweite Strahlenbündel (3.b) in einem anderen Einfallswinkel auf den Reflektor (11) trifft, als das erste Strahlenbündel (3.a).
15. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Strahlenbündel (3) der Beleuchtung durch das Mikroskopobjektiv (20) auf die Probe (7) geführt wird.
16. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Reflektor (11) einen einfallenden Lichtstrahl (5) des Strahlenbündels (3) mittels wenigstens zweier aufeinanderfolgender Einzelreflexionen (15.a, 15.b) umlenkt.
17. Verfahren oder Verwendung nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mikroskopische Bild eine Phasenkontrastaufnahme oder eine Überlagerung eines Durchlicht-Hellfeldbildes oder eines Durchlicht-Dunkelfeldbildes mit einem Phasenkontrastbild ist.
18. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Reflektor (11) als ein Fresnel- Prisma ausgebildet ist, wobei das Fresnel-Prisma mehrere Reflexionsflächen (13) mit Reflexionsflächenormalen (14) umfasst und die Reflexionsflächenormalen gegenüber der Plattennormale (12) geneigt sind.
19. Mikroskop (1) zur Aufnahme wenigstens eines Durchlicht Hellfeldbildes oder Durchlicht-Dunkelfeldbildes wenigstens einer Probe (7) in wenigstens einem Sichtfeld (27), umfassend
• Einen Strahlengang umfassend wenigstens einen Beleuchtungsstrahlengang (3, 4) und wenigstens einen Abbildungsstrahlengang (6),
• Wenigstens eine Lichtquelle (17) zum Erzeugen wenigstens eines Strahlenbündels (3),
• Einen plattenförmiger Reflektor (11) zum Umlenken des Strahlenbündels (3), wobei das umgelenkte Strahlenbündel (4) zum Beleuchten der Probe (7) vorgesehen ist, und wobei der plattenförmig ausgebildete Reflektor (11) eine Plattennormale (12) und ein von der Plattennormale abweichendes Ersatzlot (14) bezüglich des Beleuchtungsstrahlenbündels (3) aufweist,
• Wenigstens ein Mikroskopobjektiv (20) für den Abbildungsstrahlengang,
• Wenigstens einen Bildsensor (25).
20. Mikroskop (1) zur Aufnahme wenigstens eines Bildes wenigstens einer Probe (7) in wenigstens einem Sichtfeld (27), umfassend
• Einen Strahlengang umfassend wenigstens einen Beleuchtungsstrahlengang (3, 4) und wenigstens einen Abbildungsstrahlengang (6),
• Wenigstens eine Lichtquelle (17) zum Erzeugen wenigstens eines Beleuchtungsstrahlenbündels
(3),
• Einen plattenförmiger Reflektor (11) zum Umlenken des Beleuchtungsstrahlenbündels (3), wobei das umgelenkte Beleuchtungsstrahlenbündel (4) zum Beleuchten der Probe (7) vorgesehen ist, und wobei der Reflektor (11) als Retroreflektor ausgebildet ist,
• Wenigstens ein Mikroskopobjektiv (20) für den Abbildungsstrahlengang,
• Wenigstens einen Bildsensor (25),
wobei das Beleuchtungsstrahlenbündel (3) vor dem Umlenken am Reflektor (11) durch das Mikroskopobjektiv (20) geführt wird.
21. Mikroskop nach Anspruch 19 oder 20 dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zur ersten Lichtquelle (17.a) wenigstens eine zweite Lichtquelle (17.b) vorhanden ist und mit der zweiten Lichtquelle ein zweites Beleuchtungsstrahlenbündel (3.b) erzeugbar ist und die zweite Lichtquelle unabhängig von der ersten Lichtquelle betreibbar ist, und der plattenförmige Reflektor (11) außerdem zum Umlenken des zweiten Strahlenbündels (3.b) vorgesehen ist, wobei das umgelenkte zweite Strahlenbündel (4.b) zum Beleuchten der Probe (7) vorgesehen ist.
22. Mikroskop nach Anspruch 19 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Fokusebene (16) vorhanden ist, die scharf auf den Bildsensor (25) abbildbar ist, und das Beleuchtungsstrahlenbündel (3) im Strahlengang vor dem Umlenken am Reflektor (11) eine Schnittfläche (26) mit der Fokusebene (16) aufweist und die Schnittfläche (26) das Sichtfeld (27) enthält.
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