Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

WO2019190359A1 - Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с iv и ii субдоменами внеклеточного домена her2 человека - Google Patents

Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с iv и ii субдоменами внеклеточного домена her2 человека Download PDF

Info

Publication number
WO2019190359A1
WO2019190359A1 PCT/RU2019/050037 RU2019050037W WO2019190359A1 WO 2019190359 A1 WO2019190359 A1 WO 2019190359A1 RU 2019050037 W RU2019050037 W RU 2019050037W WO 2019190359 A1 WO2019190359 A1 WO 2019190359A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
antibody
her2
human
antibodies
Prior art date
Application number
PCT/RU2019/050037
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Владимирович ПРОКОФЬЕВ
Нина Грачьяевна ХАРАТЯН
Елена Андреевна КРЕНДЕЛЕВА
Виктория Олеговна ШИТИКОВА
Мария Александровна ЩЕМЕЛЕВА
Арина Витальевна АНИКИНА
Ольга Викторовна НАЗАРЕНКО
Анна Валентиновна ЕВСТРАТЬЕВА
Александра Александровна СОЗОНОВА
Алексей Владимирович ЧЕРКАСОВ
Алексей Константинович МИСОРИН
Яков Юрьевич УСТЮГОВ
Алексей Александрович АЛЕКСАНДРОВ
Павел Андреевич ЯКОВЛЕВ
Мария Игоревна ЛОМОВСКАЯ
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Биокад" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Publication of WO2019190359A1 publication Critical patent/WO2019190359A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology, namely to antibodies, as well as their use. More specifically, the present invention relates to a bispecific antibody that specifically binds to the fourth subdomain of the extracellular domain (ECD4) of HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) and the second subdomain of the extracellular domain (ECD2) of human HER2.
  • ECD4 extracellular domain
  • ECD2 human epidermal growth factor receptor 2
  • ECD2 extracellular domain 2
  • the invention also relates to a nucleic acid encoding a given antibody, an expression vector, a method for producing an antibody, and the use of an antibody for treating diseases or disorders associated with HER2 overexpression.
  • the group of human epidermal factor receptor (HER) receptors also called ErbB receptors, belongs to the family of transmembrane receptor tyrosine kinases. This family includes the epidermal growth factor receptor (EGFR), also called ErbB-1 (or HER1), and the homologous receptors ErbB-2 (HER2), ErbB-3 (HER3) and ErbB-4 (HER4 ) These receptors are expressed on the surface of most normal cells; they are involved in the regulation of the most important cellular processes, controlling proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. Increased expression of HER receptors or their ligands, such as heregulin (HRG) or epidermal growth factor (EGF), is often observed in cancer patients (Wilson, Fridlyand et al. 2012).
  • HRG heregulin
  • EGF epidermal growth factor
  • ERBB receptor The structure of the ERBB receptor (HER) is represented by three domains: extracellular, with 4 subdomains, transmembrane and intracellular, represented by juxtamembrane, tyrosine kinase subdomains and carboxyl end (for autophosphorylation processes).
  • the binding of the ligand to the extracellular domain of tyrosine kinases causes a receptor dimerization process, which can take place between two identical receptors (homodimerization) or between different receptors within the same family (heterodimerization). Dimerization activates the intracellular domains of tyrosine kinases and causes their autophosphorylation. This, in turn, triggers a series of downstream proliferative signaling cascades, including those mediated by mitogen-activated protein kinases, as well as the AKT signaling pathway aimed at cell survival (described in Yarden and Pines, 2012).
  • ligands include, among others, neuregulin (NRG) or heregulin (HRG).
  • Ligand-dependent dimerization is characteristic of HER1 / 3/4; it is mediated by binding of the ligand to the extracellular domain of the receptor (1 ligand molecule is sufficient to maintain stable conformation of the dimer; dissociation of a single ligand molecule with a dimer leads to instantaneous dissociation of the dimer).
  • Ligand-independent dimerization is characteristic when a critical point of the HER2 level is reached, the process of spontaneous dimerization begins, i.e. hyperexpression of HER2 itself leads to a shift in the receptor equilibrium from a monomeric to an aggregated state.
  • All three receptor domains are usually involved in the dimerization process, however, both the extracellular and intracellular domains, individually, are sufficient for the dimerization process and kinase activity (in particular, the constitutive activity of the intracellular domain).
  • the allosteric interactions underlying the dimerization process begin in the region of the extracellular domain.
  • the extracellular receptor domains are responsible both for ligand binding (between I and III subdomains), and for binding of receptors to each other via II subdomains.
  • the “bent” conformation of subdomain II is characteristic of ligand-independent, inactive extracellular domains of EGFR, while the “direct” one is characteristic of ligand-dependent active dimers.
  • EbB2 receptors HER2
  • HER3B3 receptor HER3
  • the most unfavorable prognosis of breast cancer is associated with the presence of a large number of HER2-HER3 heterodimers on the surface of tumor cells, as well as with coexpression of IGFR and c-Met (associated with invasive tumor phenotype, intense metastasis, and resistance to monospecific anti-HEN2 targeted therapy).
  • trastuzumab antibody that blocks the IV subdomain of the extracellular domain of the HER2 receptor (patent EP0590058 (B1), W09222653);
  • Pertuzumab antibody which blocks the second subdomain of the extracellular domain of the HER2 receptor (patent RU2270029, W00100245).
  • the main mechanisms of resistance formation are:
  • the Beodaim drug was developed - a combination of trastuzumab and pertuzumab, used to treat metastatic breast cancer, in the absence of previously conducted anti-HE2 therapy, and also as a drug for neoadjuvant breast cancer therapy (patent RU 2430739, WO 01/00245) .
  • This drug has an inconvenient route of administration, since Beiodime is administered to the patient with two separate continuous intravenous infusions of trastuzumab and pertuzumab.
  • the above problem is solved by developing a bispecific antibody that specifically binds to different subdomains of the human extracellular domain of HER2 and is administered to the patient in a single infusion, thereby reducing the patient’s hospital stay.
  • Bispecific antibodies are known in the art that specifically bind to different subdomains of the extracellular domain of human HER2, for example, the antibodies described in the following patent documents.
  • the bispecific antibody of the invention (BCD-147-02-020) does not exhibit complement dependent cytotoxicity (CDC) at all.
  • WO2015157592 describes a bispecific antibody specifically binding to HER2 comprising a first immunoglobulin antigen binding domain, where (i) the first and second immunoglobulin antigen binding domains specifically bind to different H2 immunoglobulin binding sites binds to the first HER2 antibody binding site that contains an epitope in HER2 domain II, and (iii) the first antibody H binding site ER2 differs from the pertuzumab antibody binding site.
  • This antibody effectively inhibits HER2-mediated cell signaling, which can be used to treat tumors expressing HER2, including cancers that have a low level of HER2 presentation (p. 3 descriptions, penultimate paragraph, WO2015157592).
  • the toxic properties of the antibody are presented in the international application WO2015157592. This assumption is based on the properties of the antibody indicated in the application — enhanced internalization of the HER2 receptor and enhanced ADCC properties against HER2-expressing cells, as well as safety data for other anti-HE2 antibodies.
  • the HER2 receptor is an integral structural component of cardiomyocytes, endothelial cells, and small intestine epithelium.
  • the antibody indicated in WO2015157592 is likely to affect all healthy body cells expressing the HER2 receptor. This is confirmed by safety data obtained during phase 1 CI, where the incidence of diarrhea was 44%, which indirectly indicates toxicity to the intestinal epithelium.
  • BCD-147-02-02020 bispecific anti-HE2 antibody of this invention developed by us on healthy (non-malignant) HER2-expressing cells
  • the antibody activity against this cell line namely, antibody-dependent cell cytotoxicity
  • the antibody activity against this cell line is minimal, which suggests a potentially low toxicity of the BCD-147-02-02 020 preparation and high selectivity for HER2 tumor-expressing cells.
  • This antibody exhibits enhanced effector functions, including complement dependent cytotoxicity (CDC), compared to each corresponding monospecific divalent antigen binding construct (i.e., compared to a monospecific divalent antigen binding construct that binds to ECD2, or a monospecific bivalent antigen binding construct binds to ECD4, and / or in comparison with a combination of two monospecific divalent antigen-binding constructs (paragraph [00147 ], p. 36 of the description of W02015077891).
  • the bispecific antibody of the invention (BCD-147-02-020) does not exhibit complement dependent cytotoxicity (CDC) at all.
  • the BCD-147-02-020 bispecific antibody binds to the 4th and 2nd subdomains of the extracellular domain of HER2, so sterically, this antibody tends to effectively block both ligand-dependent and ligand-independent dimerization.
  • the BCD-147-02-020 bispecific antibody is capable of preventing not only HER2 / HER3 dimerization, but also dimerization of HER2 with EGFR and HER4.
  • the bispecific antibody BCD-147-02-020 exhibits the following properties:
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • the HER2 antibody component becomes highly plastic, especially in the domain I and III domains, and this contributes to its enhanced association with the anti-HEB2 (II) component of the antibody.
  • the present invention relates to a bispecific antibody BCD-147-02-020, which specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of HER2, and provides enhanced blockade of HER2-mediated signaling pathways.
  • Such an antibody can be used to treat a disease or disorder mediated by HER2.
  • the present invention relates to a bispecific antibody that specifically binds to the fourth subdomain of the extracellular domain (ECD4) of HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) and the second subdomain of the extracellular domain (ECD2) of human HER2, and includes:
  • the first antigen-binding part which specifically binds to the IV subdomain of the extracellular domain (ECD4) of HER2, and is a single-chain variable fragment (scFv) trastuzumab with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • the second antigen-binding part which specifically binds to the II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of HER2, and is an antigen binding site (Fab), comprising the variable domain of the heavy chain (VH) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and variable light chain domain (VL) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6;
  • the bispecific antibody is an IgG antibody.
  • the bispecific IgG antibody is of the human IgGl, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype.
  • the bispecific antibody is of the human IgGl isotype.
  • the bispecific antibody comprises a crystallizing immunoglobulin fragment (Fc fragment) that contains two amino acid sequences of the second and third constant domains (CH2-CH3) represented by SEQ ID NOs: 10-11, respectively.
  • Fc fragment crystallizing immunoglobulin fragment
  • the bispecific antibody comprises a second antigen binding portion that specifically binds to the II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of HER2, and is an antigen binding site (Fab), comprising:
  • VH variable domain of the heavy chain
  • CHI first constant domain of the heavy chain
  • VL variable domain of the light chain
  • SC constant domain of the light chain
  • the present invention relates to a bispecific antibody that specifically binds to the fourth subdomain of the extracellular domain (ECD4) of HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) and the second subdomain of the extracellular domain (ECD2) of human HER2, and consists of:
  • the present invention relates to a nucleic acid that encodes the above antibody.
  • the nucleic acid is DNA.
  • the present invention relates to an expression vector comprising the aforementioned nucleic acid.
  • the present invention relates to a method for producing a host cell for producing the aforementioned antibody, which comprises transforming the cell with the aforementioned vector.
  • the present invention relates to a host cell for preparing the aforementioned antibody comprising the aforementioned nucleic acid.
  • the present invention relates to a method for producing the aforementioned antibody, which comprises culturing the aforementioned host cell in a culture medium under conditions sufficient to produce the aforementioned antibody, if necessary, followed by isolation and purification of the obtained antibody.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a disease or disorder mediated by HER2, comprising the aforementioned antibody or antigen binding fragment thereof in a therapeutically effective amount, in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the pharmaceutical composition is intended to treat a disease or disorder mediated by HER2, which is selected from the group: breast cancer (BC), malignant neoplasm of the stomach, non-small cell lung cancer, malignant neoplasm of the head and / or neck, squamous cell carcinoma of the head and neck (PRGS) ), colorectal cancer (CRC), esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine cancer, malignant melanoma, pharyngeal cancer, and oral cancer and skin cancer.
  • BC breast cancer
  • non-small cell lung cancer malignant neoplasm of the head and / or neck
  • PRGS squamous cell carcinoma of the head and neck
  • CRC colorectal cancer
  • esophageal cancer esophageal cancer
  • ovarian cancer pancreatic cancer
  • gastrointestinal cancer kidney cancer
  • cervical cancer endometrial cancer
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating a disease or disorder mediated by HER2, comprising the aforementioned antibody or antigen binding fragment thereof in a therapeutically effective amount and at least one therapeutically active antitumor compound in a therapeutically effective amount.
  • the pharmaceutical composition is intended to treat a disease or disorder mediated by HER2, which selected from the group: breast cancer (BC), malignant neoplasm of the stomach, non-small cell lung cancer, malignant neoplasm of the head and / or neck, squamous cell carcinoma of the head and neck (PRGS), colorectal cancer (CRC), esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer glands, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine cancer, malignant melanoma, pharyngeal cancer, oral cancer or skin cancer.
  • HER2 selected from the group: breast cancer (BC), malignant neoplasm of the stomach, non-small cell lung cancer, malignant neoplasm of the head and / or neck, squamous cell carcinoma of the head and neck (PRGS), colorectal cancer (CRC), esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer glands, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer
  • the pharmaceutical composition comprises a therapeutically active antitumor compound that is selected from a cytotoxic agent, chemotherapeutic agent, antibody, or anti-hormonal agent.
  • the present invention relates to a method for inhibiting the biological activity of HER2 in a subject that needs such inhibition, comprising administering to the subject an effective amount of the above antibody.
  • the present invention relates to a method for treating a disease or disorder mediated by HER2, comprising administering to a subject in need of such treatment the above antibody or the above pharmaceutical composition in a therapeutically effective amount.
  • the disease or disorder is selected from the group: breast cancer (BC), malignant neoplasm of the stomach, non-small cell lung cancer, malignant neoplasm of the head and / or neck, squamous cell carcinoma of the head and neck (PRGS), colorectal cancer (CRC) , esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine cancer, malignant melanoma, pharyngeal cancer, oral cancer or skin cancer.
  • BC breast cancer
  • non-small cell lung cancer malignant neoplasm of the head and / or neck
  • PRGS squamous cell carcinoma of the head and neck
  • CRC colorectal cancer
  • esophageal cancer esophageal cancer
  • ovarian cancer pancreatic cancer
  • gastrointestinal cancer kidney cancer
  • cervical cancer endometrial cancer
  • uterine cancer malignant melanoma
  • pharyngeal cancer
  • the present invention relates to the use of the above antibody or the above pharmaceutical composition for treating in a subject in need of such treatment a disease or disorder mediated by HER2.
  • the disease or disorder is selected from the group: breast cancer (BC), malignant neoplasm of the stomach, non-small cell lung cancer, malignant neoplasm of the head and / or neck, squamous cell carcinoma of the head and neck (PRGS), colorectal cancer (CRC), esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine cancer, malignant melanoma, pharyngeal cancer, oral cancer or skin cancer.
  • FIG. 1 The ring diagram of the plasmid pEE-Fc, designed to produce the extracellular domain of the human Ig2 protein in mammalian cells.
  • AmpR - beta-lactamase gene that provides ampicillin resistance
  • CMV promoter - promoter of early cytomegalovirus genes oriP - origin of replication
  • START - Start codon Leader - Leader mouse IgGk peptide
  • hHer2-Synthetic sequence of human Neg2 antigen Fc - Fc- fragment of human IgGl
  • His - polyhistidine tag His - polyhistidine tag
  • STOP - stop codons The ring diagram of the plasmid pEE-Fc, designed to produce the extracellular domain of the human Ig2 protein in mammalian cells.
  • FIG. 2 The ring diagram of the plasmid pEE-SK, designed to produce the light chain of antibodies in mammalian cells.
  • AmpR - beta-lactamase gene that provides ampicillin resistance
  • CMV promotor - promoter of early cytomegalovirus genes oriP - origin of replication
  • START - Start codon Leader - mouse IgGk leader peptide
  • VL - antibody light chain variable domain sequence SK
  • polyA is the polyadenylation site.
  • FIG. 3 The ring diagram of plasmids pEE-NS, designed to produce the heavy chain of antibodies in mammalian cells.
  • AmpR - beta-lactamase gene that provides ampicillin resistance
  • CMV promotor - promoter of early cytomegalovirus genes oriP - origin of replication
  • START - Start codon Leader - IgGk leader peptide
  • VH - sequence of the antibody heavy chain variable domain VH - sequence of the antibody heavy chain variable domain
  • NS - constant domains CHI, CH2, CHZ
  • STOP is the stop codon
  • polyA is the polyadenylation site.
  • FIG. 4 The ring diagram of plasmids pEE-HChole, designed to generate the heavy chain of antibodies in mammalian cells.
  • AmpR - beta-lactamase gene that provides ampicillin resistance
  • CMV promotor - promoter of early cytomegalovirus genes oriP - origin of replication
  • START - Start codon Leader - IgGk leader peptide
  • VH - sequence of the antibody heavy chain variable domain VH - sequence of the antibody heavy chain variable domain
  • NS - constant domains CHI, CH2, CHZ
  • STOP is the stop codon
  • polyA is the polyadenylation site.
  • FIG. 5 Library design with selection for stability. Design of light chain sequences.
  • FIG. b Design library with stability selection Design of heavy chain sequences.
  • FIG. 7 Library design with affinity selection. Light chain sequence design.
  • FIG. 8. Library design with affinity selection. Design sequences of heavy chains.
  • FIG. 9. The ring diagram of the plasmid pBL, designed for expression of proteins in E. coli cells.
  • AmpR is the beta-lactamase gene that provides resistance to ampicillin
  • pBR322_ori is the origin of replication from plasmid pBR322
  • lad is the lactose operon repressor gene
  • KmR is the aminoglycoside phosphotransferase gene, which provides resistance to kanamycin
  • Leader is the leader peptide that expresses periplase E.
  • VL is the sequence of the variable domain of the light chain of the antibody
  • SC is the constant domain of the light chain of the isotype of human IgGl
  • VH is the sequence of the variable domain of the heavy chain of the antibody
  • CH1 is the constant domain of human IgGl
  • Myc-tag His-tag is AGI.
  • FIG. 10 Results of kinetic analysis for 8 Fab fragments of a synthetic library (association-dissociation curve) that demonstrated binding in an enzyme-linked immunosorbent assay.
  • FIG. 11 Schematic representation of the asymmetric format.
  • a bispecific asymmetric antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2 consists of 1) Fc-knob - scFv-Trastuzumab, 2) HC-hole - aNEB2-candidate 020-VH, 3) Ck - aNEB2-candidate 020 VL.
  • FIG. 12 The ring diagram of the plasmid pEE-scFvTrast-Fc_knob.
  • AmpR is the beta-lactamase gene that provides ampicillin resistance
  • CMV promoter is the promoter of early cytomegalovirus genes
  • oriP is the origin of replication
  • START is the start codon
  • Leader is the IgGk leader peptide
  • scFv-Trastuzumab is the sequence of variable domains of the control antibody in scFv format, S-linker - ASGDKTHT linker, Fcknob - CH2, SNZ human IgGl domains with introduced knob mutations, His-tag - polyhistidine tag, STOP - stop codon, polyA - polyadenylation site.
  • FIG. 13 Electrophoresis of antibody candidates in polyacrylamide gel under non-reducing conditions.
  • FIG. 14 Electrophoresis of antibody candidates in a polyacrylamide gel under non-reducing conditions.
  • FIG. 15 Electrophoresis of polyacrylamide gel antibody candidates under non-reducing conditions.
  • FIG. 16 Electrophoresis of antibody candidates in polyacrylamide gel under non-reducing conditions.
  • FIG. 17 Results of kinetic analysis for full-length antibodies in IgGl format (candidates 001-017) and asymmetries (candidates 019
  • FIG. 18 Curves of association-dissociation of competition of candidates 017 035 with Trastuzumab in the format “Ih-tandem”.
  • the curve labels show the loading sequence of the antigen, control antibody, and sensor candidates. Curves for different candidates overlap.
  • FIG. 19 Curves of association-dissociation of competition of candidates 017 035 with Pertuzumab in the format "Ih-tandem".
  • the curve labels show the loading sequence of the antigen, control antibody, and sensor candidates. Curves for different candidates overlap.
  • FIG. 20 Curves of association-dissociation of competition of candidates 017
  • FIG. 21 The ring diagram of the vectors pSX. p-CMVe / EFlalpha - a synthetic promoter, co-consisting of a CMV enhancer and an EF- promoter la, START - Start codon, Leader - IgGk leader peptide, INSERT - insertion sequence (antibody heavy or light chain), STOP - stop codon, polyA - polyadenylation site, Enhancer SV-40 - monkey virus enhancer SV-40, beta globin MAR - MAR (matrix attachment region) of the human b-globin gene, Rep origin 1 - pUC Origin of replication, AmpR - beta-lactamase gene providing resistance to ampicillin, F1 origin - allows a plasmid with such an origin of replication to be packaged into phage particles upon cotransformation with helper phages VCSM13 and M13K07, SV40 promoter - eukaryotic promoter of the monkey virus SV-40,
  • FIG. 22 The dependence of the fluorescence intensity on the logarithm of the concentration of antibodies in the antiproliferative test on the cell line VT-474.
  • the graph shows 11-fold insertion antibody concentrations.
  • FIG. 23 Dependence of the fluorescence intensity on the logarithm of the concentration of antibodies in the antiproliferative test on the cell line BT-474 with the introduction of hrEGF.
  • the graph shows 11-fold insertion antibody concentrations.
  • FIG. 24 The dependence of the fluorescence intensity on the logarithm of the concentration of antibodies in the antiproliferative test on the cell line BT-474 Clone 5 resistant to trastuzumab.
  • the graph shows 11-fold insertion antibody concentrations.
  • FIG. 25 Analysis of ADCC on the BT-474 cell line using a high affinity FcyRIIIa receptor reporter line.
  • the graph shows 2-fold injected antibody concentrations.
  • FIG. 26 Analysis of ADCC on the BT-474 cell line using a low affinity FcyRIIIa receptor reporter line.
  • the graph shows 2-fold injected antibody concentrations.
  • FIG. 27 CDC analysis on cell lines BT-474 and SK-BR-3. Antibodies are presented at a concentration of 50 ⁇ g / ml (3-fold injected antibody concentration), “0 point” - the point without introduction of antibodies, “PC” - positive control of CDC (rituximab and WIL2-S).
  • FIG. 28 Analysis of ADCC on a HUVEC cell line using a high affinity FcyRIIIa receptor reporter line.
  • the graph shows 4-fold injected antibody concentrations.
  • FIG. 29 Dynamics of the growth index of the tumor (tumor line ZR-75-1).
  • FIG. 30 The value of the indicator of inhibition of tumor growth (TPO) (tumor line ZR-75-1).
  • FIG. 31 The dynamics of the growth index of the tumor (tumor line SKBR3).
  • FIG. 32 The value of the inhibition of tumor growth (TPO) (tumor line SKBR3).
  • FIG. 33 The dynamics of the growth index of the tumor (tumor line BT-474).
  • FIG. 34 The value of the inhibition of tumor growth (SRW) (tumor line VT-474).
  • the terms in the singular include the terms in the plural, and the terms in the plural include the terms in the singular.
  • the classification and methods used for cell cultivation, molecular biology, immunology, microbiology, genetics, analytical chemistry, organic synthesis chemistry, medical and pharmaceutical chemistry, as well as hybridization and protein and nucleic acid chemistry described in this document are well known to specialists and widely used in this field. Enzymatic reactions and purification methods are carried out in accordance with the manufacturer's instructions, as is usually done in the art, or as described herein.
  • HER receptor is a tyrosine protein kinase receptor that belongs to the HER receptor family and includes the EGFR, HER2, HER3 and HER4 receptors and other members of this family that will be identified in the future.
  • the HER receptor may contain an extracellular domain that can bind the HER ligand; lipophilic transmembrane domain; conserved intracellular tyrosine kinase domain; and a signal transduction domain located at the carboxyl end that carries several tyrosine residues that can be phosphorylated.
  • the HER receptor is a human HER receptor with a native sequence.
  • EbB2 and "HER2” are used interchangeably herein and refer to the human HER2 protein described, for example, in Semba et al. PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) and Yamamoto et al. Nature 319: 230-234 (1986) (access number in Genebank X03363).
  • eBB2 refers to a gene encoding human EbB2.
  • Preferred HER2 is human HER2 with a native sequence.
  • the extracellular domain of HER2 contains four domains: domain I (amino acid residues from about 1 to 195), domain II (amino acid residues from about 196 to 319), domain III (amino acid residues from about 320 to 488) and domain IV (amino acid residues from about 489 to 630) (residue numbering without signal peptide).
  • domain I amino acid residues from about 1 to 195
  • domain II amino acid residues from about 196 to 319
  • domain III amino acid residues from about 320 to 488
  • domain IV amino acid residues from about 489 to 630
  • HER ligand is meant a polypeptide that binds and / or activates the HER receptor.
  • binding to human HER2 or “specifically binding to human HER2” or “anti-HEU2 antibody” are used interchangeably and refer to an antibody specifically binding to a human HER2 antigen with binding affinity that matters KD 1 * 10 8 mol / L or lower at 25 ° C, in one embodiment, has a value of KD 1 * 10 9 mol / L or lower at 25 ° C.
  • Binding affinity is determined in a standard binding assay at 25 ° C, such as a surface plasma resonance technique (BIAcore®, GE-Healthcare, Uppsala, Sweden). A method for determining the KD binding affinity value is described in Example 2b).
  • antibody binding to human HER2 refers to an antibody specifically binding to a human HEy2 antigen with binding affinity with a KD value of 1 * 10 8 mol / L or lower (preferably 1 c 10 8 mol / L - 1, 0x10 12 mol / L) at 25 ° ⁇ .
  • Amplification of this gene and / or overexpression of its protein was found in many cancers, including breast cancer, breast cancer, non-small cell lung cancer, malignant neoplasms of the head and / or neck, squamous cell carcinoma of the head and neck (PRGSh ), colorectal cancer (CRC), esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine cancer, malignant melanoma, pharyngeal cancer, oral cancer or skin cancer.
  • binding molecule includes antibodies and immunoglobulins.
  • antibody or “immunoglobulin” (Ig), as used herein, includes whole antibodies and any antigen binding fragment (ie, “antigen binding part”) or its individual chains.
  • antibody refers to a glycoprotein containing at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds, or its antigen-binding part. Each heavy chain contains a variable region of the heavy chain (abbreviated herein as VH) and the constant region of the heavy chain.
  • VH variable region of the heavy chain
  • Five types of mammalian antibody heavy chains are known which are denoted by Greek letters: a, d, e, g and m.
  • the type of heavy chain present determines the class of antibody; these chains are found in antibodies such as IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, respectively.
  • Different heavy chains differ in size and composition; and g contain approximately 450 amino acids, and m and e consist of approximately 550 amino acids.
  • Each heavy chain contains two regions, i.e. constant region and variable region. The constant region is identical in all antibodies of the same isotype, but differs in antibodies of a different isotype.
  • the heavy chains g, and d contain a constant region, which consists of three constant domains CHI, CH2 and CHZ (aligned) and a hinge region, which gives flexibility (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc .89-99); heavy chains m and e contain a constant region, which consists of four constant domains CHI, CH2, CH3 and CH4.
  • heavy chains m and e contain a constant region, which consists of four constant domains CHI, CH2, CH3 and CH4.
  • lambda (l) and kappa (k) In mammals, only two types of light chains are known, which are designated as lambda (l) and kappa (k).
  • Each light chain consists of a variable region of the light chain (abbreviated herein as VL) and a constant region of the light chain.
  • the approximate length of the light chain is 211-217 amino acids.
  • the light chain is a light kappa (k) chain
  • Antibodies can be antibodies of any class (eg, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG) or a subclass (eg, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2, preferably IgGl).
  • class e.g, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG
  • subclass eg, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2, preferably IgGl.
  • VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, called complementarity determining regions (CDRs), scattered between regions that are more conservative, called framework regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • Each VH and VL consists of three CDRs and four FRs located from the amino end to the carboxy end in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with the antigen.
  • the constant regions of antibodies can mediate the binding of immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (eg, effector cells), and the first component (Clq) of the classical complement system.
  • antibody portion of an antibody or “antigen binding fragment” (or simply “antibody portion” or “antibody fragment”), as used herein, refers to one or more antibody fragments that retain the ability to specifically bind to an antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-sized antibody.
  • binding fragments included in the term “antigen binding portion” of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CHI domains; (ii) F (ab f ) 2 fragment, a divalent fragment containing two Fab fragment linked by a disulfide bridge in the hinge region; (iii) an Fd fragment consisting of the VH and CHI domains; (iv) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains in a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), which consists of a VH / VHH domain; and (vi) a designated complementarity determining region (CDR).
  • a Fab fragment a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CHI domains
  • F (ab f ) 2 fragment a divalent fragment containing two Fab fragment linked by a disul
  • two regions of the Fv fragment, VL and VH are encoded by different genes, they can be connected using recombinant methods using a synthetic linker, which makes it possible to obtain them as a single protein chain, in which the VL and VH regions mate to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv); see, for example, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 - 5883). It is contemplated that such single chain molecules are also included in the term “antigen binding portion” of an antibody. Such antibody fragments are prepared using conventional methods known to those skilled in the art, and these fragments are screened in the same manner as intact antibodies.
  • the CDR of the antigen binding site or the entire antigen binding site of the antibodies of the invention is from a mouse, llama, or human donor library, or essentially human, with certain amino acid residues altered, for example, substituted by different amino acid residues, in order to optimize specific properties of the antibody, for example KD , koff, IC50, EC50, ED50.
  • the antibody fragments of the invention are of human origin or essentially human origin (at least 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99% human origin).
  • the antigen binding site of an antibody of the invention may be derived from, but not limited to, other non-human species, including, but not limited to, a mouse, llama, rabbit, rat, or hamster.
  • the antigen binding site may be derived from human species.
  • variable refers to the fact that certain segments of the variable domains vary widely in sequence among antibodies. Domain V mediates antigen binding and determines the specificity of a particular antibody to its specific antigen. However, the variability is not evenly distributed across the 110-amino acid variable domain region. In contrast, V regions are composed of invariant fragments called framework regions (FR) of 15-30 amino acids, separated by shorter regions of extreme variability, called “hypervariable regions” or CDRs.
  • FR framework regions
  • Each variable domain of the native heavy and light chains contains four FRs, mainly taking the configuration of beta sheets connected by three hypervariable regions that form loops that bind, and in some cases are part of the beta-folded structure.
  • the hypervariable regions in each chain are held together in close proximity with FR and with hypervariable regions of the other chain contribute to the formation of the antigen-binding site of antibodies.
  • the constant domains do not directly participate in the binding of the antibody to the antigen, but exhibit various effector functions, such as the participation of the antibody in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC, ADCC).
  • hypervariable region refers to the amino acid residues of an antibody that are responsible for antigen binding.
  • the hypervariable region contains amino acid residues from the "complementarity determining region" or "CDR”, and / or such residues from the "hypervariable loop".
  • affinity maturation it may also be preferable to change one or more amino acid residues of the CDR regions in order to increase the binding affinity of the target epitope.
  • affinity maturation is known as “affinity maturation” and in some cases can be performed in connection with humanization, for example, in situations where humanization of an antibody leads to a decrease in binding specificity or affinity, and it is not possible to sufficiently improve binding specificity or affinity by using only reverse mutations.
  • affinity maturation methods are known in the art, for example, the in vitro scanning saturation mutagenesis method described by Burks et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 94: 412-417 (1997), and a method for incremental in vitro affinity maturation proposed by Wu et al. , Proc Natl Acad Sci USA 95: 6037 6042 (1998).
  • FR Framework regions
  • FR Framework regions
  • FR light chain residues are localized approximately in residual regions 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) and 98-107 (LCFR4)
  • heavy chain FR residues localized approximately in the region of residues 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) and 103-113 (HCFR4) in the heavy chain.
  • FR light chain residues are located at approximately 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) and 97-107 (LCFR4) in the light chain
  • a FR heavy chain residues are localized at about 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) and 102-113 (HCFR4) in the heavy chain residues.
  • the FRs are adjusted accordingly. For example, when CDRH1 includes amino acids H26-H35, heavy chain FR1 residues are at positions 1-25, and FR2 residues are at positions 36-49.
  • a crystallizing fragment of an immunoglobulin (Eng. Fragment crystallizable region, Fc region, Fc) is the end part of an immunoglobulin molecule that interacts with the Fc receptor on the cell surface and with some proteins of the complement system. Given The property allows antibodies to activate the immune system.
  • the Fc region of IgG, IgA and IgD isotypes consists of two identical protein fragments, respectively, of the second and third constant domains of two heavy chains; in the case of IgM and IgE isotypes, Fc contains three constant heavy chain domains (CH 2-4 domains) in each polypeptide chain.
  • An antibody of the invention that “binds” the target antigen is an antibody that binds the antigen with sufficient affinity so that the antibody can be used as a diagnostic and / or therapeutic agent when targeting a protein or cell or tissue expressing the antigen, and slightly cross-reacts with other proteins.
  • analytical methods sorting of fluorescently activated cells (FACS), radioimmunoprecipitation (RIA) or ELISA (ELISA), in such embodiments of the invention, the degree of binding of the antibody to a protein that is not a “target” (with a “non-target protein”) is less than 10 % of the binding of the antibody to a specific target protein.
  • the term “specific binding” or the expression “specifically binds to” or “specific to” a particular polypeptide or epitope on a particular target polypeptide means a binding that is markedly (measurably) different from a non-specific interaction (e.g. in the case of LH1-44 or LH1-81, the non-specific interaction is binding to bovine serum albumin, casein, fetal bovine serum or neutravidin).
  • Specific binding can be quantified, for example, by determining the binding of a molecule compared to the binding of a control molecule. For example, specific binding can be determined by competitive reaction with another molecule similar to the target, for example, with an excess of unlabeled target. In this case, specific binding is indicated if the binding of the labeled target to the probe is competitively inhibited by an excess of unlabeled target.
  • the term “specific binding” or the expressions “specifically binds to” or “specific for” a particular polypeptide or epitope on a specific target polypeptide can be characterized by the example of a molecule having a Kd of at least 200 nM to the target, or at least at least about 150 nM, or at least about 100 nM, or at least about 60 nM, or at least about 50 nM, or at least about 40 nM, or at least about 30 nM, or at least about 20 nM, or at least about 10 n M, or at least about 8 nM, or at least about 6 nM, or at least about 4 nM, or at least about 2 nM, or at least about 1 nM or higher.
  • the term “specific binding” refers to a binding in which a molecule binds to a particular polypeptide or epitope on a particular polypeptide, with little or no binding to any other polypeptide or epitope on the polypeptide.
  • the term "Ka”, as used herein, refers to the rate of association of a particular antibody-antigen interaction.
  • Kd refers to the dissociation rate of a particular antibody-antigen interaction.
  • Binding affinity generally refers to the strength of the cumulative non-covalent interactions between a single binding site of a molecule (eg, an antibody) and its binding partner (eg, antigen). Unless otherwise indicated, “binding affinity” refers to the intrinsic (characteristic, true) binding affinity, which reflects a 1: 1 interaction between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). The affinity of molecule X to its partner Y can usually be represented by constant dissociation (Kd).
  • the Kd value is about 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM or less.
  • Affinity can be measured by conventional methods known in the art, including those described herein. Low affinity antibodies usually bind slowly to the antigen and tend to readily dissociate, whereas high affinity antibodies usually bind to the antigen faster and tend to remain in the bound state for longer. Various methods for measuring binding affinity are known in the art, any of these methods can be used for the purposes of the present invention.
  • the "Kd" or “Kd value” of this invention is measured by surface plasmon resonance methods on a B1 Asoge TM -2000 or BIAcore TM -3000 instrument (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) at 25 ° C using immobilized chips CM5 antigen at ⁇ 10 relative units (response units, RU).
  • CM5 antigen at ⁇ 10 relative units (response units, RU).
  • carboxymethyldextran biosensor chips CM5, BIAcore Inc.
  • EDC -ethyl- '(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the antigen is diluted with a 10 mM sodium acetate solution, pH 4.8, to a concentration of 5 ⁇ g / ml ( ⁇ 0.2 ⁇ M), and then injected at a flow rate of 5 ⁇ l / min until approximately 10 relative units (RU) of the bound protein are reached.
  • a 1 M ethanolamine solution is administered to block unreacted groups.
  • two-fold serial dilutions of Fab e.g., from 0.78 nM to 500 nM
  • PBST Tween 20
  • association rate (cop) and dissociation rate (koff) are calculated using the simple Langmuir model for one-plus-one binding (BIAcore Evaluation Software version 3.2), using the simultaneous acquisition of association and dissociation sensograms.
  • the equilibrium dissociation constant (Kd) is calculated as the koff / kon ratio. See, for example, Chen, Y., et al. , (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881.
  • a spectrometer such as a stopped flow spectrophotometer (Aviv Instruments) or a SLM-Aminco spectrophotometer (ThermoSpectronie) 8000 series with a mixing cuvette.
  • koff refers to the dissociation rate constant of a particular interaction of a binding molecule and antigen.
  • the koff dissociation rate constant can be measured by bi-layer interferometry, for example using the Octet TM system.
  • the “oh-rate” or “cop” of this invention can also be determined by the same surface plasmon resonance method as described above on a B1Acoge TM -2000 or BIAcore TM -3000 instrument (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ ) at 25 ° C using chips with immobilized CM5 antigen at ⁇ 10 relative units (response units, RU).
  • CM5 antigen at ⁇ 10 relative units (response units, RU).
  • carboxymethyldextran biosensor chips CM5, BIAcore Inc.
  • EDC -ethyl- '- (3-dimethylamino-propyl) -carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the antigen is diluted with a 10 mM sodium acetate solution, pH 4.8, to a concentration of 5 ⁇ g / ml ( ⁇ 0.2 ⁇ M), and then injected at a flow rate of 5 ⁇ l / min until approximately 10 relative units (RU) of the bound protein are reached. After administration of the antigen, a 1 M ethanolamine solution is administered to block unreacted groups.
  • biologically active and “biological activity”, and “biological characteristics”, with respect to the polypeptide of this invention, mean having the ability to bind to a biological molecule.
  • biological molecule refers to nucleic acid, protein, carbohydrate, lipid, and combinations thereof. In one embodiment of the invention, the biological molecule exists in nature.
  • Antibody sites such as Fab and F (ab ') 2 fragments, can be obtained from whole antibodies using traditional methods, such as papain or pepsin hydrolysis of whole antibodies. Moreover, antibodies, parts of antibodies and immunoadhesion molecules can be obtained using standard recombinant DNA methods, for example, as described herein.
  • recombinant antibody means an antibody that is expressed in a cell or cell line containing a nucleotide sequence (nucleotide sequences) that encodes an antibody, wherein said nucleotide sequence (nucleotide sequences) is not associated with the cell in nature.
  • variant antibody refers to an antibody having an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence of its "parent” antibody by adding, removing and / or replacing one or more amino acid residues relative to the sequence of the parent antibody.
  • the variant antibody comprises at least one or more (e.g., one to twelve, e.g., two, three, four, five, six, seven, eight or nine, ten, eleven or twelve; and in some embodiments one to about ten) additions, deletions and / or substitutions of amino acids relative to the parent antibody. In some embodiments, additions, deletions, and / or substitutions are made at the CDR regions of a variant antibody.
  • Identity or homology with respect to the sequence of the variant antibody is defined herein as the percentage of amino acid residues in the sequence of the variant antibody that are identical to the residues of the parent antibody, after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to achieve the maximum percentage of sequence identity.
  • a variant antibody retains the ability to bind to the same antigen, and preferably the epitope, to which the parent antibody binds, and in some embodiments, the at least one property or biological activity exceeds that of the parent antibody.
  • a variant antibody may have, for example, a more pronounced binding affinity, a longer half-life, a lower IC50 value or an increased ability to suppress the biological activity of the antigen compared to the parent antibody.
  • a variant antibody showing a biological activity greater than at least 2 times (preferably at least 5 times, 10 times or 20 times) the biological activity of the parent antibody.
  • bispecific antibody means an antibody containing an antigen binding domain or antigen binding domains that are capable of specific binding to two different epitopes on one biological molecule or capable of specific binding to epitopes on two different biological molecules.
  • a bispecific antibody is also referred to herein as having "double specificity” or as being an antibody with "double specificity” or "biparatopic antibody”.
  • chimeric antibody refers in a broad sense to an antibody that contains one or more regions of one antibody, and one or more regions of one or more other antibodies, typically an antibody, partially human or partially non-human, that is, obtained partially from not a human animal, for example, a mouse, rat, or other rodent, or a camelid, such as a llama or alpaca.
  • Chimeric antibodies are preferred over non-human antibodies in order to reduce the risk of an immune response directed against antibodies in humans, for example, a response directed against murine antibodies in humans in the case of a murine antibody.
  • An example of a typical chimeric antibody is one in which the variable region sequences are murine, while the constant region sequences are human.
  • non-human parts can be further modified to humanize the antibody.
  • humanization refers to the fact that when an antibody is wholly or partially non-human, for example, a mouse or llama antibody obtained by immunizing mice or llamas with an antigen of interest, respectively, or is a chimeric antibody based on such a mouse or llama antibody , you can replace some amino acids, for example, in the framework regions and constant domains of the heavy and light chains, in order to avoid or minimize the immune response in humans.
  • the specificity of the interaction of the antibody with the target antigen is inherent mainly in amino acid residues located in six CDR regions of the heavy and light chains. Therefore, the amino acid sequences within the CDR regions are much more variable between individual antibodies, compared with sequences outside the CDR regions.
  • recombinant antibodies can be expressed that mimic the properties of a specific natural antibody, or more generally, any specific antibody with a given amino acid sequence, for example, by constructing expression vectors that express CDR sequences -particles from a specific antibody and frame sequences of another antibody.
  • a non-human antibody can be “humanized” and the binding specificity and affinity of the original antibody can be largely maintained.
  • non-human antibodies are generally more immunogenic than human antibodies.
  • Chimeric antibodies in which foreign (e.g., rodent or camel) constant regions have been replaced by sequences of human origin have shown generally lower immunogenicity than antibodies of completely foreign origin, and there is a tendency to use humanized or fully human antibodies in therapeutic antibodies.
  • Chimeric antibodies or other non-human antibodies can thus be humanized to reduce the risk of an anti-antibody immune response in humans.
  • humanization usually involves modifying the frame regions of the variable region sequences.
  • CDR regions complementarity determining regions
  • Amino acid residues that are part of the complementarity determining regions will most often not change due to humanization, although in some cases it may be desirable to alter individual amino acid residues of the CDR region, for example, to remove a glycosylation region, a deamidation site, an aspartate isomerization site, or an undesired cysteine or methionine residue.
  • N-linked glycosylation occurs by attaching an oligosaccharide chain to an asparagine residue in the tripeptide sequence of Asn-X-Ser or Asn-X-Thr, where X can be any amino acid except Pro.
  • Removal of the N-glycosylation site can be achieved by mutating the Asn or Ser / Thr residue with another residue, preferably by conservative substitution.
  • the deamidation of asparagine and glutamine residues can occur depending on factors such as pH and exposure of the surface.
  • Asparagine residues are particularly susceptible to deamidation, especially if they are present in the Asn-Gly sequence, and to a lesser extent in other dipeptide sequences, such as Asn-Ala. If there is such a deamidated region, for example, Asn-Gly in the sequence of the CDR region, it may be preferable to remove this region, usually by conservative substitution to remove one of the residues involved.
  • CDR site transplantation may be based on Rabat CDR site definitions, although a later publication (Magdelaine-Beuzelin et al., Crit Rev. Oncol Hematol. 64: 210 225 (2007)) suggests that the definition of no IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) can improve the result of humanization (see Lefranc et al., Dev. Comp Immunol. 27: 55-77 (2003)).
  • transplantation of a CDR region can reduce the specificity and affinity of binding, and therefore biological activity, in a CDR transplanted non-human antibody, compared to the parent antibody from which the CDR regions are derived.
  • Reverse mutations (sometimes referred to as “frame repair”) can be applied at selected positions of the CDR of the transplanted antibody, typically in the frame regions, in order to restore the specificity and binding affinity of the parent antibody.
  • the determination of positions for possible reverse mutations can be performed using information available in the literature and in the antibody databases. Amino acid residues that are candidates for reverse mutations are typically located on the surface of an antibody molecule, while residues that are recessed or have a low degree of exposure of the surface usually will not be subject to change.
  • the humanization method an alternative to transplantation of the CDR region and reverse mutation, is a surface change in which residues of non-human origin unexposed on the surface are retained, while residues exposed on the surface are transformed into human residues.
  • naive and immune libraries are constructed using naturally reorganized genes encoding the variable domains of healthy or immune donor immunoglobulins, respectively. For this, mRNA of lymphoid cells producing antibodies is isolated. Most often these are peripheral blood lymphocytes, but in some cases splenocytes are used [Sheets MD, Amersdorfer P, Finnern R, Sargent P, Lindquist E, Schier R, et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens.
  • CDNAs are synthesized based on mRNA, and oligo-dT primers and statistical hexaoligonucleotides can be taken to prime the reaction, which allows one to obtain cDNA copies of all possible variants of genes encoding the variable domains of antibodies [Ulitin AB, Kapralova MV, Daman AG, Shepelyakovskaya AO, Bulgakov EB, Fursova KK, et al. Library of human mini-antibodies in phage display format. Creation and testing. DAN: Publishing House “Science”; 2005.].
  • one or more primers can be used that limit the set of amplifiable genes to one or more gene families of variable domains or antibody isotypes already at the cDNA level [Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222: 581-597].
  • the primers used to amplify genes encoding immunoglobulins are complementary to their most conserved regions.
  • Them sequences are selected from gene collections that are organized into databases, such as the Rabat database or V BASE.
  • the design of the primers also provides for the presence of internal restriction sites in them, allowing cloning PCR products into the corresponding vectors.
  • Phage display is the first and most widely used in vitro antibody search technology.
  • Smith discovered that foreign DNA sequences can be cloned into an M13 filamentous bacteriophage in such a way that cloned gene sequences are expressed on the surface of phage particles as fusion proteins (Smith GP: Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228: 1315-1317.).
  • Smith GP Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228: 1315-1317.
  • the repertoire of phage libraries reflects the repertoire of antibodies of B-lymphocytes of each person or animal whose blood was used to create the library.
  • mice that expressed fully human antibodies, the repertoire of which could be comparable to those obtained by hybridoma technology
  • Hybridoma technology Liunstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al.: Antigen-specific human antibodies from mice containing four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368: 856-859
  • mice express B-cell receptors, which are essentially hybrid mouse and human (human immunoglobulin, mouse Ig, Irb and other signaling molecules), their B cells normally develop and mature.
  • a clonal population may be a clonal population of immortalized cells.
  • immortalized cells in a clonal population are hybrid cells, hybridomas that are usually obtained by fusing individual B lymphocytes from immunized animals with individual cells of a lymphocytic tumor.
  • Hybridomas are a type of engineered cell and are not found in nature.
  • “Native antibodies” are usually heterotetrameric glycoproteins with a molecular weight of approximately 150,000 daltons, consisting of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. Each light chain is linked to the heavy chain by one covalent disulfide bond, while the number of disulfide bonds between the heavy chains varies in different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has evenly spaced intrachain disulfide bridges. Each heavy chain has a variable domain (VH) at one end, followed by several constant domains. Each light chain has a variable domain at one end (VL) and a constant domain at the other end.
  • VH variable domain
  • VL variable domain at one end
  • the constant domain of the light chain is aligned with the first constant domain of the heavy chain, and the variable domain of the light chain is aligned with the variable domain of the heavy chain.
  • Specific amino acid residues are believed to form an interface between the variable domains of the light chain and the heavy chain.
  • isolated used to describe the various antibodies described herein means an antibody identified and isolated and / or regenerated from the cell or cell culture in which it is expressed. Impurities (contaminants) from the natural environment are materials that, as a rule, interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, and may include enzymes, hormones, and other protein or non-protein solutes.
  • the antibody is purified (1) to a degree sufficient to obtain at least 15 residues of the N-terminal or internal amino acid sequence using a rotating glass cup sequencer (Edman sequencer), or (2) until homogeneous by SDS-PAGE in non-reducing or reducing conditions using Coomassie staining with brilliant blue or, preferably, silver.
  • An isolated antibody includes antibodies in situ within recombinant cells, since at least one component of the natural environment of the polypeptide is absent. Typically, an isolated polypeptide is obtained from at least one purification step.
  • An “isolated” nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule that is identified and separated from at least one impurity nucleic acid molecule with which it is usually associated in a natural source of an antibody nucleic acid.
  • An isolated nucleic acid molecule differs from the form or kit in which it is found in vivo. Thus, the isolated nucleic acid molecule is different from a nucleic acid molecule that exists in cells in vivo.
  • the isolated nucleic acid molecule includes a nucleic acid molecule located in cells in which expression of the antibody normally occurs, for example, if the nucleic acid molecule has a localization in the chromosome that is different from its localization in cells in vivo.
  • epitope refers to a part (determinant) of an antigen that specifically binds to a binding molecule (for example, an antibody or a related molecule, such as a bispecific binding molecule).
  • a binding molecule for example, an antibody or a related molecule, such as a bispecific binding molecule.
  • Epitope determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules, such as amino acids or carbohydrates, or sugar side chains, and typically have specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific charge characteristics.
  • the epitope can be "linear” or “conformational. In a linear epitope, all points of interaction between a protein (eg an antigen) and an interacting molecule (such as an antibody) occur linearly along the primary amino acid sequence of the protein.
  • a conformational epitope interaction points occur through amino acid residues on a protein that are separated from each other in the primary amino acid sequence.
  • antibodies to this epitope can be generated using techniques well known in the art.
  • the generation and characterization of antibodies or other binding molecules can shed light on information about the desired epitopes. Based on this information, binding molecules can then be competitively screened for binding to the same or similar epitopes, for example, by conducting competition studies to find binding molecules that compete for binding to antigen.
  • peptide linker in this document means any peptide with the ability to join domains with a length depending on the domains that it binds to each other, containing any amino acid sequence.
  • the peptide linker has a length of more than 5 amino acids and consists of any set of amino acids selected from G, A, S, P, E, T, D, K.
  • in vitro refers to a biological object, biological process or biological reaction outside the body, modeled in artificial conditions.
  • in vitro cell growth should be understood as cell growth in a medium outside the body, for example, in a test tube, culture bottle or microplate.
  • 1C50 50% inhibitory concentration refers to drug concentrations at which measured activity or response, for example, growth or proliferation of cells, such as tumor cells, is inhibited by 50%.
  • the IC50 value can be estimated using the corresponding response curves of the logarithm of the dose, s using special statistical programs for processing curves.
  • GI50 growth inhibition
  • ED50 effective dose / concentration
  • antiproliferative effect means stopping or inhibiting the growth of proliferating cells, such as cancer cells.
  • effector function of an antibody refers to the types of biological activity associated with the Fc region (native sequence of the Fc region or variants of the amino acid sequence of the Fc region) of the antibody, and vary depending on the isotype of the antibody.
  • antibody effector functions are: Clq binding; complement dependent cytotoxicity; Fc receptor binding; antibody dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC); phagocytosis; downregulation of cell surface receptors (e.g., B-cell receptor, BCR); and B-cell activation.
  • a CC antibody-dependent cell cytotoxicity
  • FcR Fc receptors
  • NK natural killer cells
  • monocytes express FcyRI, FcyRII and FcyRIII.
  • the expression of FcR on hematopoietic cells is summarized in table 3 on page 464 of Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991).
  • ADCC assays can be performed to evaluate the activity of the molecule of interest in ADCC, such as the assays described in US Pat. Nos. 5,500,362 or 5,821,337.
  • Applicable effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and natural killer cells (NKs).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • NKs natural killer cells
  • the ADCC activity of the molecule of interest can be evaluated in vivo, for example, in an animal model, such as the model described in Clynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).
  • Human effector cells are white blood cells that express one or more FcRs and perform effector functions. Preferably, the cells express at least FcyRIII and perform an ADCC effector function. Examples of human leukocytes that mediate ADCC include peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), natural killer cells (NKs), monocytes, cytotoxic T cells, and neutrophils; RVMS and NK cells are preferred. Effector cells can be isolated from their natural source, for example, from blood or PBMC, as described in this publication.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • NKs natural killer cells
  • monocytes cytotoxic T cells
  • neutrophils neutrophils
  • Effector cells can be isolated from their natural source, for example, from blood or PBMC, as described in this publication.
  • Fc receptor and “FcR” are used to describe a receptor that binds to the Fc region of an antibody.
  • a preferred FcR is a human FcR with a native sequence.
  • a preferred FcR is FcR, which binds an IgG antibody (gamma receptor), and preferred receptors include receptors of subclasses FcyRI, FcyRII and FcyRIII, including allelic variants and alternatively splicable forms of these receptors.
  • FcyRII receptors include FcyRI IA ("activating receptor") and FcyRI IB ("inhibitory receptor”), which have similar amino acid sequences that differ mainly in their cytoplasmic domains.
  • the activating receptor FcyRI IA contains a tyrosine-based immunoreceptor activation motif (ITAM) in its cytoplasmic domain.
  • ITAM immunoreceptor activation motif
  • the inhibitory receptor FcyRI IB contains in its cytoplasmic domain a tyrosine-based immunoreceptor inhibition motive (IT ⁇ M) (see review in Aegop, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)).
  • IT ⁇ M tyrosine-based immunoreceptor inhibition motive
  • FcR is presented in Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991).
  • Other FcRs, including FcRs, which will be identified in the future, are included in the present description in the term "FcR".
  • the term also includes a neonatal receptor, FcRn, which is responsible for the transfer of maternal IgG to the fetus.
  • complement dependent cytotoxicity and “SBS” refer to the ability of a molecule to lyse a target in the presence of complement.
  • the complement activation pathway is initiated by binding of the first component of the complement system (Clq) to a molecule (e.g., an antibody) in complex with its antigen.
  • a molecule e.g., an antibody
  • an SBS analysis can be performed, for example, as described in Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).
  • identity or “homology” should be interpreted as meaning the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the residues of the corresponding sequence with which it is compared, after sequence comparison and introduction of “gaps” if it is necessary to achieve the maximum percentage of identity for the full sequence and not considering any conservative substitutions as part of sequence identity. Neither the N- or C-terminal extension nor insertion segments should be construed as reducing identity or homology. Methods and computer programs for comparison are well known. Sequence identity can be determined using sequence analysis software (e.g., Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705). This software is suitable for such sequences by determining the degree of homology. for a variety of substitutions, deletions (eliminations) and other modifications.
  • sequence analysis software e.g., Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, WI 53705
  • nucleic acid sequence should be interpreted as a nucleotide sequence exhibiting at least 85%, preferably 90%, more preferably 95% and most preferably 97% sequence identity with respect to the nucleic acid sequence.
  • the proposed modification (s) of the amino acid sequences of the antibodies described in this application may be desirable to improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • Variants of the amino acid sequence of an antibody are obtained by introducing appropriate changes in nucleotides into the nucleic acid of the antibody or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletions and / or insertions and / or substitutions of residues in the amino acid sequences of an antibody. Any combination of deletion, insertion, and substitution is performed to obtain the final construct, provided that the final construct possesses the required characteristics. Changes in amino acids can also change the post-translational processes in the antibody, such as changes in the number or position of glycosylation sites.
  • a variant of the modification of the amino acid sequences of antibodies using amino acid substitutions is the replacement of at least one amino acid residue in the antibody molecule with another residue.
  • Places of greatest interest for mutagenesis by substitutions include hypervariable regions or CDRs, but changes in the FR or Fc regions are also contemplated.
  • Conservative substitutions are shown in Table A under the heading of “preferred substitutions”. If such substitutions result in a change in biological activity, then additional substantial changes can be introduced, called “examples of substitutions" in Table A, or changes additionally described below in the description of the classes of amino acids, and products can be screened.
  • nucleic acid means a clear sequence of nucleotides, modified or not modified defining a fragment or region of a nucleic acid containing or not containing unnatural nucleotides and being either double-stranded DNA or RNA, or a single-chain stranded DNA or RNA or the transcription product of said DNA. It should also be mentioned here that the invention does not apply to nucleotide sequences in their natural chromosome environment, i.e. in a natural state.
  • sequences of this invention have been isolated and / or purified, i.e. were taken directly or indirectly, for example, by copying, while their environment was at least partially modified.
  • isolated nucleic acids obtained by genetic recombination, for example, using host cells (host cells), or obtained by chemical synthesis.
  • nucleotide sequence covers its compliment, unless otherwise indicated.
  • reference to a nucleic acid having a specific sequence should be understood as encompassing its complementary chain with its complementary sequence.
  • control sequences refers to DNA sequences necessary for the expression of a functionally linked coding sequence in a particular host organism.
  • Suitable control sequences for prokaryotes are, for example, a promoter, optionally an operator and a ribosome binding site.
  • promoters, polyadenylation signals and enhancers are present in eukaryotic cells.
  • a nucleic acid is “operably linked” if it is in functional association with another nucleotide sequence.
  • DNA of a presequence or secretory leader sequence is operably linked to the DNA of a polypeptide if it is expressed as a preprotein that is involved in the secretion of the polypeptide;
  • a promoter or enhancer is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence;
  • the ribosome binding site is functionally linked to the coding sequence, if located so that it can facilitate translation.
  • “operably linked” means that the linked DNA sequences are contiguous, and in the case of a secretory leader sequence, are contiguous and are in the reading phase. However, enhancers do not have to be contiguous.
  • vector means a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which it is connected.
  • the vector is a plasmid, i.e. a circular double-stranded portion of DNA into which additional DNA segments can be ligated.
  • the vector is a viral vector in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • the vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (e.g., bacterial vectors having a bacterial initiation site mammalian replication and episomal vectors).
  • vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • vectors can be integrated into the genome of the host cell when introduced into the host cell, and thus replicate together with the host gene.
  • some vectors are capable of directing the expression of the genes with which they are functionally linked. Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” (or simply “expression vectors”).
  • recombinant host cell means a cell into which a recombinant expression vector has been introduced.
  • the present invention relates to host cells, which may include, for example, a vector in accordance with the present invention described above.
  • the present invention also relates to host cells, which include, for example, a nucleotide sequence encoding a heavy chain or its antigen binding parts, a nucleotide sequence encoding a light chain or its antigen binding parts, or both of them, a first binding domain and / or a second binding domain a binding molecule of the invention.
  • host cell and “host cell” mean not only the specific cell claimed, but also the progeny of such a cell. Since modifications can occur in subsequent generations due to mutations or environmental influences, such offspring may not, in fact, be identical to the parent cell, but such cells are still included within the scope of the term “host cell” as used herein.
  • disease or disorder mediated by HER2 means all diseases or disorders that are either directly or indirectly associated with HER2, including the etiology, development, progress, persistence or pathology of the disease or disorder.
  • Treatment refers to a method of alleviating or eliminating a biological disorder and / or at least one of its accompanying symptoms. Used in this document, the term “alleviate” a disease, disease or condition, means a decrease in the severity and / or frequency of symptoms of the disease, disorder or condition.
  • references to “treatment” contained herein include references to therapeutic, palliative, and prophylactic therapy.
  • the subject of treatment or the patient is a mammal, preferably a human subject.
  • the above subject may be male or female of any age.
  • violation means any condition that can be improved as a result of treatment according to the present invention.
  • the definition of this term includes chronic and acute disorders or diseases, including pathological conditions that cause a mammal's predisposition to the occurrence of this violation.
  • diseases to be treated include benign and malignant tumors, for example, cancer of the breast, ovary, stomach, cervix, endometrium, uterus, salivary gland, lung, kidney, colon, colon, thyroid, pancreas, prostate glands, skin, head and / or neck, pharynx, oral cavity or bladder.
  • the preferred disorder to be treated according to the invention is cancer, namely breast cancer (breast cancer), gastric cancer, non-small cell lung cancer, head and / or neck cancer, squamous cell carcinoma of the head and neck (CBC), colorectal cancer (CRC), esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine cancer, malignant melanoma, pharyngeal cancer, oral cancer or skin cancer.
  • breast cancer breast cancer
  • gastric cancer gastric cancer
  • non-small cell lung cancer non-small cell lung cancer
  • head and / or neck cancer squamous cell carcinoma of the head and neck
  • CRC colorectal cancer
  • esophageal cancer ovarian cancer
  • pancreatic cancer gastrointestinal cancer
  • kidney cancer cervical cancer
  • endometrial cancer uterine cancer
  • malignant melanoma malignant melanoma
  • pharyngeal cancer oral cancer or skin
  • cancer refers to a physiological state or describe the physiological state in mammals, which is usually characterized by unregulated (/ th) cell growth / proliferation. This definition covers benign and malignant cancers. Examples of cancers include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia.
  • cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, adenocarcinoma of the lung, squamous cell carcinoma of the lung, peritoneal cancer, hepatic cell carcinoma, gastric cancer, including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial and uterine carcinoma, salivary carcinoma, kidney cancer (renal cell carcinoma), gland cancer (prostate cancer), cancer of the external female genital organs, thyroid cancer, hepatic carcinoma, carcinoma of the anal canal, carcinoma of the penis, melanoma and various types of cancer of the head and neck.
  • gastric cancer including gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, glioma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial and uterine
  • a “therapeutically effective amount” is the amount of a therapeutic agent administered during treatment that will relieve to some extent one or more of the symptoms of the disease being treated.
  • chronic use refers to the continuous (long-term) use of the agent (s) as opposed to the acute (short-term) route of administration, so as to maintain the initial therapeutic effect (activity) for a long period of time.
  • “Intermittent” use refers to a treatment that is not administered sequentially without interruption, but which is rather periodic in nature.
  • the present invention relates to a bispecific antibody that specifically binds to the fourth subdomain of the extracellular domain (ECD4) of HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) and the second subdomain of the extracellular domain (ECD2) of human HER2.
  • ECD4 extracellular domain
  • ECD2 human epidermal growth factor receptor 2
  • the present invention relates to a bispecific antibody that specifically binds to the fourth subdomain of the extracellular domain (ECD4) of HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) and the second subdomain of the extracellular domain (ECD2) of human HER2, and includes:
  • the first antigen-binding part that specifically binds to the IV subdomain of the extracellular domain (ECD4) of HER2, and is a single-chain variable fragment (scFv) of trastuzumab with the amino acid sequence
  • the second antigen-binding part which specifically binds to the II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of HER2, and is an antigen binding site (Fab), including the variable domain of the heavy chain (VH) with the amino acid sequence
  • HCDR1 GFTFTDYTMD (SEQ ID NO: 3);
  • HCDR2 DVNPNSGES IYNQRFKG (SEQ ID NO: 4);
  • HCDR3 NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 5).
  • VL variable domain of the light chain
  • DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPSRFSGSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: b: 3), includes LCD
  • LCDR1 KALQDVSRGVA (SEQ ID NO: 7);
  • LCDR2 SAHYRYT (SEQ ID NO: 8);
  • LCDR3 QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 9).
  • the bispecific antibody is an IgG antibody.
  • the bispecific IgG antibody is of the human IgGl, IgG2, IgG3 or IgG4 isotype.
  • the bispecific antibody is of the human IgGl isotype.
  • the bispecific antibody comprises a crystallizing immunoglobulin fragment (Fc fragment) that contains two amino acid sequences of the second and third constant domains (CH2-CH3) represented by the amino acid sequence
  • the bispecific antibody comprises a second antigen binding portion that specifically binds to the II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of HER2, and is an antigen binding site (Fab), comprising:
  • VH variable domain
  • CHI first constant domain of the heavy chain
  • amino acid sequence EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGESIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNL NHKPSNTKVDKRV (SEQ ID NO: 12);
  • the present invention relates to a bispecific antibody that specifically binds to the IV subdomain of the extracellular domain (ECD4) HER2 (epidermal receptor human growth factor 2) and II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of human HER2, consisting of:
  • an antibody light chain that specifically binds to the II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of HER2, including the variable domain of the light chain (VL) and the constant domain of the light chain (SC), with the amino acid sequence
  • the bispecific antibody is a BCD147-02-020 bispecific antibody that specifically binds to the IV subdomain of the extracellular domain (ECD4) HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) and the second subdomain of the extracellular domain (ECD2) HER2.
  • the BCD147-02-020 bispecific antibody is an asymmetric antibody, that is, it includes 1) a first antigen binding portion that specifically binds to the IV subdomain of the extracellular domain (ECD4) of HER2, and is a single chain variable fragment (scFv) of trastuzumab; and 2) a second antigen binding part that specifically binds to the II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of HER2, and is antigen binding site (Fab).
  • the BCD147-02-020 bispecific antibody is a biparatopic antibody, that is, an antibody that binds to two paratopes, IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2.
  • the bispecific antibody is a bispecific asymmetric antibody BCD147-02-020, which specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2.
  • the BCD147-02-020 bispecific antibody consists of:
  • an antibody light chain that specifically binds to the II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of HER2, including the variable domain of the light chain (VL) and the constant domain of the light chain (SC), with the amino acid sequence
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, which specifically binds to the IV subdomain of the extracellular domain (ECD4) HER2, consists of: 1) the constant domain of CH2 and CHZ, with the amino acid sequence
  • the antibody heavy chain (SEQ ID NO: 15), which specifically binds to the II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of HER2, consists of:
  • VH heavy chain variable domain
  • CHI first constant domain of the heavy chain
  • the antibody light chain (SEQ ID NO: 13), which specifically binds to the II subdomain of the extracellular domain (ECD2) of HER2, consists of:
  • the present invention also relates to nucleic acid molecules, in particular to sequences encoding a bispecific antibody that specifically binds to the IV subdomain of the extracellular domain (ECD4) HER2 (human epidermal growth factor receptor 2) and the second subdomain of the extracellular domain (ECD2) HER2, according to this inventions as described herein, optionally including any sequence of a peptide linker connecting them.
  • ECD4 extracellular domain
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • ECD2 extracellular domain 2
  • nucleotide sequence covers its compliment, unless otherwise indicated. Thus, a reference to a nucleic acid having a specific sequence should be understood as encompassing its complementary chain with its complementary sequence.
  • polynucleotide means a polymeric form of nucleotides of at least 10 bases in length, or ribonucleotides, or deoxynucleotides, or a modified form of any type of nucleotide. The term includes single and double chain forms.
  • the present invention also relates to nucleotide sequences encoding an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-15, or any combination thereof.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1-15.
  • the nucleic acid molecule may also contain any combination of these nucleotide sequences.
  • the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 1, 2, and b. In another embodiment, the nucleic acid molecule comprises nucleotide sequences encoding SEQ ID NO: 1, 2, b, 10-11. In one embodiment, the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 1, 12 and 13. In one embodiment, the nucleic acid molecule comprises a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 1, 10-13.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule that contains nucleotide sequences encoding the amino acid sequences of SEQ ID NO: 13-15.
  • the present invention relates to a nucleic acid molecule comprising any combination of the above nucleic acid sequences.
  • the nucleic acid molecules may be isolated.
  • the nucleic acid molecule of this invention can be isolated from any source that produces a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2.
  • a nucleic acid molecule of the invention may be synthesized rather than isolated.
  • the nucleic acid molecule of the invention may comprise a nucleotide sequence encoding a VH domain of a first or second domain of an antibody of the invention, coupled as read from a nucleotide sequence encoding a constant domain of a heavy chain from any source.
  • a nucleic acid molecule of this invention may comprise a nucleotide sequence encoding a VL domain from a first or second region of an antibody of this invention, combined as a read with a nucleotide sequence encoding a constant domain of a light chain from any source.
  • nucleic acid molecules encoding the variable domain of the heavy (VH) and / or light (VL) chains of the first or second binding domain can be "transformed” along the entire length of the antibody genes.
  • the nucleic acid molecules encoding the VH or VL domains are transformed into antibody genes along the entire length by insertion into an expression vector already encoding the constant domains of the heavy chain (CH) or light chain (CL), respectively, so that the VH segment is functional connected to the CH segment (s) in the vector and / or the VL segment is operatively connected to the CL segment in the vector.
  • nucleic acid molecules encoding the VH and / or VL domains are converted into genes along the entire length of the antibody by connecting, for example, ligation, a nucleic acid molecule encoding the VH and / or VL domains to a nucleic acid molecule encoding the CH and / or CL domains using standard molecular biological methods. Nucleic acid molecules encoding the entire length of the heavy and / or light chains can then be expressed from the cell into which they were introduced.
  • Nucleic acid molecules can be used to express a large amount of a recombinant bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2. Nucleic acid molecules can be used to produce bispecific antibodies, as described herein.
  • Vectors a recombinant bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2. Nucleic acid molecules can be used to produce bispecific antibodies, as described herein.
  • the present invention relates to a vector suitable for expression of any of the nucleotide sequences described herein.
  • the present invention relates to vectors containing nucleic acid molecules that encode any of the amino acid sequences of a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2, or parts thereof (e.g., heavy and / or heavy and / or heavy chain sequences light chain of the second binding domains) as described herein.
  • the present invention further relates to vectors containing nucleic acid molecules encoding a bispecific antibody or parts thereof.
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 of this invention is expressed by inserting DNA encoding partially or fully the sequence of the first and second binding domain (e.g., heavy and light chain sequences, where the binding domain contains heavy and light chain sequences) obtained as described above in expression vectors so that the genes are functionally linked with the necessary expression control sequences, such as transcriptional and translational control sequences.
  • Expression vectors include plasmids, retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV), plant viruses such as cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic viruses, cosmids, YAC, EBV derived episomas and the like.
  • DNA molecules can be ligated into a vector so that sequences that control transcription and translation in the vector fulfill the intended function of regulating the transcription and translation of DNA.
  • the expression vector and expression control sequences can be selected so as to be compatible with the expression host cell used.
  • DNA molecules encoding partially or along the entire length of the sequence of the first and second binding domains e.g., heavy and light chain sequences, where the binding domain contains a heavy and light chain sequence
  • any combination of the above DNA molecules is introduced into the same expression vector.
  • DNA molecules can be introduced into the expression vector by standard methods (for example, by ligation of complementary restriction sites on a fragment of an antibody and vector gene or by ligation of blunt ends if there are no restriction sites).
  • a suitable vector is one that encodes functionally complete sequences of CH or CL of human immunoglobulin with the construction of an appropriate restriction site so that any the VH or VL sequence can be easily incorporated and expressed as described above.
  • NS and LC coding of genes in such vectors may contain intron sequences, which leads to a general increase in the protein products of antibodies by stabilization of the corresponding mRNA.
  • Intron sequences are surrounded by a splice donor and a splice acceptor sites that determine where RNA splicing will occur.
  • the arrangement of intron sequences can be either in the variable or constant regions of the antibody chains, or in both variable and constant regions when several introns are used.
  • Termination of polyadenylation and transcription may occur downstream of the native chromosome site of the encoded regions.
  • the recombinant expression vector can also encode a signal peptide that facilitates the production of an antibody chain by a host cell.
  • the antibody chain gene can be cloned into a vector so that the signal peptide is connected to the reading frame of the amino terminus of the immunoglobulin chain.
  • the signal peptide may be an immunoglobulin signal peptide or a heterologous signal peptide (i.e., a signal peptide of a non-immunoglobulin nature protein).
  • the recombinant expression of the vectors of this invention can carry regulatory sequences that control the expression of antibody chain genes in the host cell.
  • regulatory sequences that control the expression of antibody chain genes in the host cell.
  • the design of the expression vector including the choice of regulatory sequences, may depend on factors such as selection of the host cell for transformation, expression level of the desired protein, etc.
  • Preferred regulatory sequences for an expressing mammalian host cell include viral elements providing a high level of protein expression in mammalian cells, such as promoters and / or enhancers derived from retroviral LTR, cytomegalovirus (CMV) (e.g., CMV promoter / enhancer), monkey virus 40 (SV40) (e.g.
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 monkey virus 40
  • SV40 promoter / enhancer adenovirus, (e.g. Late Adenovirus late promoter (AdMLP)), polyoma virus, as well as strong mammalian promoters such as the native promoter x immunoglobulins or actin promoter.
  • AdMLP Late Adenovirus late promoter
  • strong mammalian promoters such as the native promoter x immunoglobulins or actin promoter.
  • recombinant expression vectors of the invention may carry additional sequences, such as sequences that regulate vector replication in host cells (eg, replication origin) and selectable marker genes.
  • the selectable marker gene facilitates the selection of host cells into which the vector has been introduced (see, for example, US patents 4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017).
  • a selectable marker gene confers resistance to drugs, such as G418, hygromycin or methotrexate, to the host cell into which the vector is introduced.
  • breeding marker genes include the dihydrofolate reductase gene (DHFR) (for use in dhfr host cells for the selection / amplification of methotrexate), the neo gene (for G418 selection), and the glutamate synthetase gene.
  • DHFR dihydrofolate reductase gene
  • neo for G418 selection
  • glutamate synthetase gene for use in dhfr host cells for the selection / amplification of methotrexate
  • glutamate synthetase gene glutamate synthetase gene
  • expression control sequence means polynucleotide sequences that are necessary to affect the expression and processing of the coding sequences to which they are ligated.
  • Expression control sequences include corresponding transcription, termination, promoter and enhancer initiation sequences; effective RNA processing signals, such as splicing and polyadenylation signals; sequences that stabilize the cytoplasmic mRNA; sequences that increase translation efficiency (i.e., Kozak consensus sequence); sequences that enhance protein stability; and, if desired, sequences that enhance protein secretion.
  • control sequences vary depending on the host organism; in prokaryotes, such control sequences typically include a promoter, a ribosome binding site, and transcription termination sequences; in eukaryotes, typically, such control sequences include promoters and transcription termination sequences.
  • control sequences includes at least all components whose presence is important for expression and processing, and may also include additional components whose presence is useful, for example, lead sequences and sequences of fused cells.
  • An additional aspect of the present invention relates to methods for producing a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2, according to this invention.
  • One embodiment of the invention relates to a method for producing a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human HER2 extracellular domain, as defined herein, comprising preparing a recombinant host cell capable of expressing a bispecific antibody that specifically binds to IV and II subdomains human extracellular domain HER2 cultivation the specified host cell under conditions suitable for expression of the production of a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2, and the selection of this antibody.
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 obtained by such expression in such recombinant host cells is referred to herein as a “recombinant bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2".
  • the invention also relates to the progeny of cells of such host cells and a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2, obtained in a similar way.
  • Nucleic acid molecules encoding a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 according to the invention and vectors containing these nucleic acid molecules can be used to transfect a suitable mammal or cell, plant or cell thereof, bacterial or yeast host cell. The conversion can occur by any known method for introducing polynucleotides into a host cell.
  • Methods for introducing heterologous polynucleotides into mammalian cells include dextran-mediated transfection, transfection with a nucleic acid complex and a positively charged polymer, transfection with a nucleic acid and calcium phosphate precipitate, polybrene-mediated transfection, protoplast fusion, and transfection of the nucleotide DNA to the nucleus.
  • nucleic acid molecules can be introduced into mammalian cells by viral vectors.
  • Cell transfection methods are well known in the art. See, for example, U.S. Patents 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 and 4,959,455.
  • Methods for transforming plant cells are well known in the art, including, for example, Agrobacterium-mediated transformation, biolistic transformation, direct injection, electroporation and viral transformation. Methods for transforming bacterial and yeast cells are also well known in the art.
  • Mammalian cell lines used as hosts for transformation are well known in the art and include many immortalized cell lines available. These include, for example, Chinese hamster ovary cells (CHO), NS0 cells, SP2 cells, HEK-293T cells, 293 Freestyle cells (Invitrogen), NIH-3T3 cells, HeLa cells, hamster kidney cells (BHK), African kidney cells green monkeys (COS), human hepatocellular carcinoma cells (e.g., Hep G2), A549 cells, and a number of other cell lines. Cell lines are selected by determining which cell lines have high levels of expression and provide the necessary characteristics of the protein produced. Other cell lines which can be used are insect cell lines, such as Sf9 or Sf21 cells.
  • the antibodies are produced by culturing the host cells for a time sufficient to express the antibodies in the host cells or, more preferably, isolating antibodies into the culture medium in which the host cells are grown.
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 can be isolated from the culture medium using standard protein purification methods.
  • Plant host cells include Nicotiana, Arabidopsis, duckweed, corn, wheat, potatoes, etc.
  • Host bacteria cells include Escherichia and Streptomyces species.
  • Yeast host cells include Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, and Pichia pastoris.
  • the production level of a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 of the present invention from a producing cell line can be enhanced using a number of known methods.
  • the glutamine synthetase gene expression system (GS system) is common enough to enhance expression under certain conditions.
  • the GS system is discussed in whole or in part in connection with the patents EP 0216846, 0256055, 0323997 and 0338841.
  • bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2 obtained from different cell lines or transgenic animals, will differ from each other by a glycosylation profile.
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human HER2 extracellular domain, encoded by the nucleic acid molecules described herein or containing the amino acid sequences provided herein is part of this invention, regardless of the glycosylation state of the binding molecules and Generally, regardless of the presence or absence of post-translational modifications.
  • the invention also relates to methods and processes for the preparation of a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2.
  • Monoclonal antibodies can be created, for example, using the hybridoma-based method, which was first described by Kohler et al. , Nature,
  • lymphocytes can be obtained by in vitro immunization. After immunization, lymphocytes are isolated and then fused to the myeloma cell line using an acceptable binding agent, such as polyethylene glycol, to produce a hybridoma cell.
  • an acceptable binding agent such as polyethylene glycol
  • the hybridoma cells thus obtained are seeded and grown in a suitable culture medium that preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused parent myeloma cells.
  • a suitable culture medium that preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused parent myeloma cells.
  • the hybridoma culture medium should typically include hypoxanthine, aminopterin and thymidine (NAT medium), i.e. substances that inhibit the growth of HGPRT-deficient cells.
  • Myeloma cells used as a component for cell fusion are preferably fusion cells, maintain a stable high level of antibody production by selected antibody producing cells, and are sensitive to the selective medium on which unbound parental cells are selected.
  • Preferred myeloma cell lines are mouse myeloma lines, such as those based on the murine tumor cell lines of the MORS-21 and MPC-11 lines, which can be obtained from the Salk Institite Cell Disrtibution Center, San Diego, pc. California, USA, and the SP-2 or HBZ-Ad8-653 lines, which can be obtained from the American Type Culture Collection, Rockville, pc. Maryland, USA
  • the use of human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for the production of monoclonal antibodies has also been described (Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, p. 3001).
  • the binding specificity of the monoclonal antibodies obtained using hybridoma cells is determined by immunoprecipitation or by an in vitro binding assay, such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • an in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • the binding affinity of a monoclonal antibody can, for example, be determined using the Scatchard analysis described by Munson et al. Anal. Biochem., 107, 1980, p. 220.
  • clones can be subcloned using the method of limiting dilutions and grown by standard methods. Suitable media for this purpose include, for example, DMEM or RPMI-1640.
  • hydriboma cells can grow in vivo as ascites tumors in animals, for example, by intraperitoneal (ip) injection of cells into mice.
  • Monoclonal antibodies secreted by subclones can be separated from the culture medium, ascites fluid or serum using conventional antibody purification methods, for example, affinity chromatography (for example, using protein A - or protein Q-Sepharose), or ion exchange chromatography, chromatography on hydroxylapatites, gel electrophoresis, dialysis, etc.
  • affinity chromatography for example, using protein A - or protein Q-Sepharose
  • ion exchange chromatography chromatography on hydroxylapatites, gel electrophoresis, dialysis, etc.
  • DNA encoding monoclonal antibodies can be easily isolated and sequenced using conventional procedures (for example, using oligonucleotide probes that have the ability to specifically bind to genes encoding the heavy and light chains of murine antibodies).
  • Hybridoma cells serve as a preferred source of such DNA.
  • DNA can be included in expression vectors, which are then transfected with host cells, such as E. coli cells, monkey COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, or myeloma cells that do not produce antibody proteins without transfection, resulting in the synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells.
  • monoclonal antibodies or antibody fragments can be isolated from phage libraries of antibodies generated using methods described by McCafferty et al. , Nature, 348, 1990, ss. 552-554. Clackson et al. , Nature, 352, 1991, ss. 624-628 and Marks et al. , J. Mol. Biol., 222,
  • the DNA encoding the antibody can also be modified, for example, so as to obtain chimeric or fused polypeptides of antibodies, for example, by replacing the sequences of the constant regions of the heavy and light chains (Cn and CL) with homologous mouse sequences (US 4816567 and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, p. 6851) or by covalently linking the immunoglobulin coding sequence to all or part of the coding sequence of a non-immunoglobulin polypeptide (heterologous polypeptide).
  • Cn and CL homologous mouse sequences
  • Non-immunoglobulins polypeptide sequences can be replaced by constant regions of the antibody or replaced by the variable regions of the antigen-binding center of the antibody, creating a chimeric bivalent an antibody that contains one antigen binding center having specificity for an antigen, and another antigen binding center having specificity for another antigen.
  • transgenic animals e.g., mice
  • mice can be obtained which, after immunization, can produce a full range of human antibodies without producing endogenous immunoglobulin.
  • Dn segment the region of the junction of the antibody heavy chain gene
  • transferring the germline set of the human immunoglobulin gene to such a mutant mouse germline results in the production of human antibodies after challenge with the antigen (US 5545806, 5569825, 5591669 (all in the name of GenPharm); 5545807; and WO 97/17852).
  • phage display technology (McCafferty et al., Nature, 348, 1990, pp. 552-553) can be used to obtain human antibodies and in vitro antibody fragments from the spectrum of immunoglobulin variable region (V) gene genes from immunized donor organisms.
  • V immunoglobulin variable region
  • the genes of the V region of the antibody are cloned into the reading frame with either the main or minor gene of the coat protein of a filamentous bacteriophage, such as M13 or fd, and present as functional fragments of the antibody on the surface of the phage particle.
  • the filamentous particle contains a copy of the single-stranded DNA of the phage genome, selection based on the functional properties of the antibody also leads to the selection of a gene encoding an antibody that has the indicated properties.
  • the phage mimics some of the properties of b cells.
  • Phage presentation can be carried out in various formats. For phage presentation, you can use various sources of segments of V-genes. Clackson et al. , Nature, 352, 1991, ss. 624-628 isolated various sets of antibodies to oxazolone from a small random combinatorial library of V genes obtained from the spleen of immunized mice.
  • V genes obtained from the body of immunized human donors can be constructed, and antibodies to a different set of antigens (including autoantigens) can be isolated in general according to the methods described by Marks et al. , J. Mol. Biol., 222, 1991, ss. 581-597.
  • human antibodies can also be produced in vitro by activated B cells (see US 5567610 and 5229275).
  • Bespecifically antibodies are antibodies that have specificity for binding to two different epitopes.
  • a bispecific antibody that specifically binds to two different protein epitopes, namely the IV and II subdomains the extracellular domain of human HER2.
  • Bespecifically antibodies can be obtained in the form of full-sized antibodies or fragments of antibodies (for example, F (ab ') 2 fragments of bespecifically antibodies).
  • bispecific antibodies Methods for creating bispecific antibodies are known in the art.
  • the generally accepted production of full-sized bispecific antibodies is based on the joint expression of two pairs of immunoglobulin heavy and light chains, where both chains have different specificities. Due to the random set of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) can potentially produce a mixture of 10 different antibody molecules, of which only one has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule, which is usually carried out in several stages using affinity chromatography, is quite laborious, and the product yield is low. Similar processes are described in WO 93/08829.
  • variable regions of an antibody with the desired binding specificity are fused to the sequences of the constant region of an immunoglobulin.
  • the fusion is preferably carried out with the constant region of the Ig heavy chain, which includes at least a portion of the hinge CH2 and CH3 regions.
  • at least one of the fusions contains the first constant region of the heavy chain (CH1) containing the site necessary for binding of the light chain.
  • DNAs encoding the fusion of the immunoglobulin heavy chain and, if necessary, the immunoglobulin light chain are inserted into various expression vectors and together they transfect an acceptable host organism.
  • the bispecific antibodies are an immunoglobulin heavy chain hybrid providing the first binding specificity in the first arm, and an immunoglobulin light chain-heavy chain hybrid (which provides the second binding specificity) in the second arm. It has been found that this asymmetric structure facilitates the separation of the desired bispecific molecule from undesired combinations of immunoglobulin chains, since the presence of the immunoglobulin light chain in only one half of the bispecific molecule facilitates separation.
  • This approach is described in WO 94/04690.
  • a preferred contact region includes at least a portion of the CHZ region.
  • one or more small amino acids with side chains from the contact region of the first antibody molecule are replaced with molecules with larger side chains (for example, tyrosine or tryptophan).
  • Balancing “cavities” that are identical or close in size to the large side chain (s) (s) in the contact area of the second antibody molecule are created by replacing amino acids with large side chains with amino acids with smaller side chains (for example, alanine or threonine ) This provides a mechanism to increase the yield of the heterodimer relative to other undesired end products.
  • Bespecific antibodies include crosslinked antibodies or “heteroconjugates”.
  • one of the antibodies in the heteroconjugate may be crosslinked with avidin, and the other with biotin.
  • Such antibodies can be used, for example, for targeted transfer of cells of the immune system to unwanted cells (US 4676980) and for the treatment of HIV infection (WO 91/00360, WO 92/200373 and EP 03089).
  • Heteroconjugate antibodies can be created using any of the conventional cross-linking methods. Acceptable cross-linkers are well known in the art and are described in US 4,676,980 along with various methods for introducing cross-linking.
  • bispecific antibodies can be obtained using chemical binding.
  • Brennan et al. Science, 229, 1985, p. 81 described a technique whereby intact antibodies are proteolytically cleaved to obtain F (ab ′) 2 fragments. These fragments are reduced in the presence of a complexing agent with dithiol, such as sodium arsenite, to stabilize neighboring dithiols and prevent the formation of intermolecular disulfide bonds.
  • the resulting Fab ′ fragments are then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative.
  • TAB thionitrobenzoate
  • bispecific antibodies can be used as agents for the selective immobilization of enzymes.
  • bispecific antibodies were prepared using leucine zippers (Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5), 1992, pp. 1547-1553). Leucine zipper peptides from Fos and Jun proteins were linked to Fab 'fragments of two different antibodies by gene fusion. Antibody homodimers were reduced in the hinge region to produce monomers, and then antibody heterodimers were obtained by reoxidation. This method can also be used to obtain antibody homodimers. Double Antibody Technology Described by Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Fragments contain a VH region linked to the VL region by a linker that is too short to allow pairing of two domains of the same chain. Thus, the VH and VL regions of one fragment must pair with the complementary VL and VH regions of another fragment, thereby forming two antigen-binding centers.
  • Another strategy for producing bispecific antibody fragments is also described, based on the use of single chain (Fv) - (sFv) dimers (see Gruber et al., J. Immunol, 152, 1994, p. 5368).
  • compositions comprising, as an active ingredient (or as a sole active ingredient), a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2.
  • the pharmaceutical composition may include at least one bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2, as described herein, and one or more additional binding molecules (eg, antibodies) that target one or more of the corresponding surface receptors.
  • the compositions are intended to improve, prevent, or treat disorders that may be associated with HER2.
  • “Pharmaceutical composition” means a composition comprising a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2, according to the invention and at least one of the components selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable and pharmacologically compatible excipients, such as excipients, solvents, diluents, carriers, excipients, distributors, delivery vehicles, preservatives, stabilizers, emulsifiers, suspending agents, thickeners, regulators of prolonged delivery, the choice and ratio of which depends on the nature and method of administration and dosage.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention and methods for their manufacture will be undeniably apparent to those skilled in the art.
  • the manufacture of pharmaceutical compositions should preferably comply with GMP (Good Manufacturing Practice) requirements.
  • the composition may include a buffer composition, tonic agents, stabilizers and solubilizers.
  • the prolonged action of the composition can be achieved using agents that slow down the absorption of the active pharmaceutical ingredient, for example, aluminum monostearate and gelatin.
  • suitable carriers, solvents, diluents and delivery vehicles are water, ethanol, polyalcohols, and also mixtures thereof, oils and injectable organic esters.
  • “Medicinal product (preparation)” a substance or mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition in the form of tablets, capsules, powders, lyophilisates, injections, infusions, ointments, etc. ready-made forms, designed to restore, correct or change the physiological functions in humans and animals, as well as for the treatment and prevention of diseases, diagnosis, anesthesia, contraception, cosmetology and other things. Any method of administering peptides, proteins, or antibodies adopted in the art can be suitably used for a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 of this invention.
  • pharmaceutically acceptable means one or more compatible liquid or solid components that are suitable for administration to a mammal, preferably a human.
  • excipient or “excipient” is used herein to describe any component other than previously described in this invention. These are substances of inorganic or organic origin, used in the production process, the manufacture of drugs to give them the necessary physical and chemical properties.
  • buffer By the term “buffer”, “buffer composition”, “buffer agent” is meant a solution capable of maintaining a pH value due to the interaction of the acid and alkaline components included in its composition, which enables the preparation of a bispecific antibody that specifically binds to IV and II subdomains the extracellular domain of human HER2, show resistance to pH changes.
  • pharmaceutical pHs are preferred.
  • compositions from 4.0 to 8.0.
  • buffering agents for example, acetate, phosphate, citrate, histidine, succinate and the like can be used. buffer solutions, but not limited to them.
  • tonic agent refers to an excipient that can apply the osmotic pressure of a liquid antibody preparation.
  • An “isotonic” drug is a drug that has an osmotic pressure equivalent to that of human blood. Isotonic preparations typically have an osmotic pressure of about 250 to 350 mOsm / kg.
  • isotonic agents polyols, mono- and disaccharides, amino acids, metal salts, for example, sodium chloride, and the like, can be used, but not limited to.
  • stabilizer is meant an auxiliary substance or a mixture of two or more auxiliary substances that provide the physical and / or chemical stability of the active agent.
  • amino acids can be used, for example, but not limited to arginine, histidine, glycine, lysine, glutamine, proline; surfactants, for example, polysorbate 20 (trade name Tween 20), polysorbate 80 (trade name Tween 80), polyethylene-polypropylene glycol and its copolymers (trade names Poloxamer, Pluronic), sodium dodecyl sulfate (SDS ), but not limited to them; antioxidants, for example, methionine, acetylcysteine, ascorbic acid, monothioglycerol, salts of seric acids, and the like, but not limited to; chelating agents, for example, ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), sodium citrate, and the like
  • the pharmaceutical composition is “stable” if the active agent retains its physical stability and / or chemical stability and / or biological activity during the stated shelf life at a storage temperature, for example, at 2-8 ° C.
  • the active agent retains both physical and chemical stability as well as biological activity.
  • the storage period is selected based on the results of stability studies during accelerated and natural storage.
  • the pharmaceutical composition of this invention can be manufactured, packaged, or sold widely as a unit dosage unit or as a plurality of unit dosage units in the form of a finished dosage form.
  • unit dosage unit means a discrete amount of a pharmaceutical composition containing a predetermined amount of an active ingredient.
  • the amount of active ingredient is usually equal to the dosage of the active ingredient that will be administered to the subject, or a convenient portion of such a dosage, for example half or a third of such a dosage.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention are suitable for parenteral administration in the form of sterile drugs intended for administration to the human body with a violation of the integrity of the skin or mucous membranes, bypassing the gastrointestinal tract by injection, infusion or implantation.
  • parenteral administration includes, but is not limited to, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, intravenous, intraarterial, intrathecal, intraventricular, intraurethral, intracranial, intraarticular, transdermal injection or infusion; and renal dialysis infusion techniques.
  • Intratumoral delivery for example, intratumoral injection, may also be applicable.
  • Regional perfusion is also provided.
  • Preferred embodiments of the invention include intravenous and subcutaneous routes. Any method of administering peptides or proteins adopted in this field can be suitably used for a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2, according to this invention.
  • Injectable drugs can be manufactured, packaged or sold in unit dosage form, for example, but not limited to ampoules, vials, polymer containers, prefilled syringes, auto-injection devices.
  • Medicines for parenteral administration include, but are not limited to, suspensions, solutions, emulsions in oily or aqueous bases, pastes, and the like.
  • Another embodiment of the invention is a medicament for parenteral administration, wherein the pharmaceutical composition is provided in dry form, that is, a powder or granules for dissolution in a suitable solvent (eg, sterile pyrogen-free water) before administration.
  • a suitable solvent eg, sterile pyrogen-free water
  • Such a drug can be obtained, for example, by lyophilization, i.e. a process known in the art as freeze-drying, which includes freezing the preparation and then removing the solvent from the frozen contents.
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2, according to this invention, can also be administered intranasally or by inhalation, alone, as a mixture with a suitable pharmaceutically acceptable excipient, such as a pressurized aerosol container, pump, spray, nebulizer) or a nebulizer in which a suitable propellant is used or not used, or in the form of nasal drops or a spray.
  • a suitable pharmaceutically acceptable excipient such as a pressurized aerosol container, pump, spray, nebulizer
  • a nebulizer in which a suitable propellant is used or not used, or in the form of nasal drops or a spray.
  • the parenteral drug may be immediate or modified release.
  • Modified release drugs include delayed, slow, pulsating, controlled, targeted and programmed release.
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 of the present invention is used in the treatment of diseases or disorders that are associated with HER2 activity.
  • the subject of treatment or the patient is a mammal, preferably a human subject.
  • the above subject may be male or female and of any age.
  • a therapeutically effective amount of a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 can reduce the number of cancer cells; reduce the initial size of the tumor; inhibit (i.e., to some extent slow down and, preferably, stop) cancer cell infiltration of peripheral organs; inhibit (i.e., to some extent slow down and, preferably, stop) tumor metastasis; inhibit, to some extent, tumor growth; and / or alleviate, to some extent, one or more symptoms associated with the disorder.
  • An antibody or antibody fragment can, to some extent, prevent the growth and / or kill existing cancer cells, it can cause a cytostatic and / or cytotoxic effect.
  • in vivo efficacy can be determined, for example, by assessing life expectancy, time to disease progression (TTR), tumor response rate (RR), response duration and / or quality of life.
  • co-administration refers to a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2, with one or more other therapeutic agents, which are intended to mean are referred to or include:
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 according to this invention can be administered without additional therapeutic treatment, i.e. as an independent therapy.
  • treatment with a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 according to the invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy).
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 can be co-administered or formulated with another cancer treatment / medication.
  • cytotoxic agent refers to a substance that inhibits or prevents the functioning of cells and / or causes destruction of cells.
  • the term is intended to include radioactive isotopes (e.g., At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32 and Lu radioactive isotopes), chemotherapeutic agents and toxins, such as low molecular weight toxins or enzymatically active toxins originating from bacteria, fungi, plants or animals, including fragments and / or variants thereof.
  • a “chemotherapeutic agent” is a chemical compound useful in the treatment of a malignant tumor.
  • chemotherapeutic agents include alkylating agents such as thiotepa and cyclophosphamide (CYTOXAN®); alkyl sulfonates such as busulfan, improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodopa, carboquinone, meturedopa and uredopa; ethyleneimines and methylmelamines, including altretamine, triethylene melamine, triethylene phosphoramide, triethylene thiophosphoramide and trimethyl melamine; acetogenins (e.g., bullatacin and bullatacinone); delta-9-tetrahydrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta lapachone; lapachol; colchicines; betulinic acid; camptothecin (including the synthetic analogue of topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acety
  • cryptophycin 1 and cryptophycin 8 dolastatin; duocarmycin (including synthetic analogues KW-2189 and CB1-TM1); eleutherobin; pankratistatin; sarcodiktiin; spongistatin; nitrogen mustards, such as chlorambucil, chlornaphazine, holophosphamide, estramustine, ifosfamide, mechlorethamine, mechlorethamine oxide hydrochloride, melphalan, novembikhine, phenesterol, prednimustine, trophosphamide, uramustine; nitrosoureas such as carmustine, chlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustine and ranimnustine; antibiotics such as enediin antibiotics (e.g.
  • calicheamicin e.g. calicheamicin gamma II and calicheamicin omega II (see, for example, Agnew, Chem. Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dynamin, including dynemycin A; esperamycin; as well as the neocarcinostatin chromophore and related chromophores of chromoproteins - enediin antibiotics, aclacinomisins, actinomycin, autramycin, azaserin, bleomycin, cactinomycin, carabicin-5, carcininomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycinomycin L-norleucine, doxorubicin (including ADRIAMICIN®, my rfolinodoksorubitsin, tsianomorfolinodoksorubitsin, 2- pyrrolino, doksorubitsin
  • LURTOTECAN® LURTOTECAN®
  • rmRH e.g., ABARELIX®
  • BAY439006 sorafenib; Bayer
  • SU-11248 Pfizer
  • perifosin a COX-2 inhibitor (e.g., celecoxib or etoricoxib), a proteosome inhibitor (e.g., PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (811577); orafenib, ABT510; a Bc1-2 inhibitor such as oblimersen sodium (GENASENSE®); pixantron; EGFR inhibitors (see definition below); tyrosine kinase inhibitors (see definition below); and pharmaceutically acceptable salts, acids or derivatives of any of the above; as well as combinations of two or more of the above, such as CHOP, short name for combination therapy with cyclophosphamide, doxorubicin, vin
  • anti-hormonal drugs that act to regulate or inhibit the action of hormones on tumors, such as antiestrogens with a mixed agonist / antagonist profile, including tamoxifen (NOLVADEX®), 4-hydroxytamoxifen, trioxifene, toremifene (FARESTON®); idoxifene, droloxifene, raloxifene (EVISTA®), trioxifene, keyoxifene and selective estrogen receptor modulators (SERMs) such as SERM3; pure antiestrogens without agonistic properties, such as fulvestrant (FASLODEX®) and EM800 (such drugs can block estrogen receptor dimerization (ER), inhibit DNA binding, increase ER metabolism and / or reduce ER levels); aromatase inhibitors, including steroidal aromatase inhibitors such as formestane and exemestane (AROMAS IN®), and non-steroidal aromatase inhibitors such as anastrazole
  • the bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 will be administered in an amount effective to treat the condition in question, i.e. in doses and for periods of time necessary to achieve the desired result.
  • a therapeutically effective amount may vary depending on factors such as the particular condition being treated, the patient’s age, gender and weight, and whether the administration of a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 is independent treatment or it is performed in combination with one or more additional drugs or treatments.
  • Drug regimens can be adjusted to provide the optimum desired response. For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered during some time, or the dose can be proportionally reduced or increased depending on the severity of the therapeutic situation. Particularly useful is the manufacture of parenteral compositions in unit dosage form for ease of administration and uniformity of dosage.
  • the unit dosage form refers to physically discrete units suitable as unit doses for patients / subjects to be treated; each unit contains a predetermined amount of the active compound, calculated to produce the desired therapeutic effect in combination with the desired pharmaceutical carrier.
  • unit dosage forms of the present invention is generally dictated and directly dependent on (a) the unique characteristics of the chemotherapeutic agent and the particular therapeutic or prophylactic effect to be achieved, and (b) the limitations inherent in the compounding technique of such an active compound for treatment of sensitivity in subjects.
  • the dose and dosage regimen are adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic field.
  • the maximum tolerated dose can be easily set and an effective amount can also be determined that provides a detectable therapeutic effect for the patient, as well as the time requirements for the administration of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient.
  • some dosages and regimen regimens are given as examples herein, these examples do not in any way limit the dosages and regimens that may be necessary for the patient to practice the present invention.
  • dosage values may vary, depending on the type and severity of the condition, which should be alleviated, and may include one or more doses.
  • specific administration schedules should be adjusted after some time according to individual needs and at the discretion of the medical professional who administers or controls the administration of the compositions, and that the concentration ranges given in this description are only given as an example and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions.
  • the dosage regimen with the compositions of this invention can be based on various factors, including the type of disease, age, weight, gender, health status of the patient, severity of the condition, route of administration, and the particular bispecific antibody used that specifically binds to the IV and II subdomains the extracellular domain of human HER2.
  • the dosage regimen can vary widely, but can be determined regularly using standard methods. For example, doses may be adjusted based on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects, such as toxic effects or laboratory values.
  • the present invention encompasses an individual dose increase, which is determined by a qualified specialist. Determination of the required dose and modes are well known in the relevant field of technology and will be clear to a person skilled in the art after familiarization with the ideas disclosed herein.
  • a suitable dose of a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 in the present invention will be in the range of 0.1-200 mg / kg, preferably 0.1-100 mg / kg, including about 0.5-50 mg / kg, for example, about 1-20 mg / kg.
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2 can be administered, for example, at a dose of at least 0.25 mg / kg, for example at least 0.5 mg / kg, including not less than 1 mg / kg, for example at least 1.5 mg / kg, for example, as well as at least 2 mg / kg, for example at least 3 mg / kg, including at least 4 mg / kg, for example at least 5 mg / kg; and for example up to a maximum of 50 mg / kg, including up to a maximum of 30 mg / kg, for example, up to a maximum of 20 mg / kg, including up to a maximum of 15 mg / kg.
  • the administration will usually be repeated at suitable intervals, for example, once a week, once every two weeks, once every three weeks, or once every four weeks, and for as long as it is deemed appropriate by the responsible physician, who may in some cases increase or reduce the dose if necessary.
  • the next embodiment of the invention is a product that contains products used to treat cancer selected from the group: breast cancer (BC), malignant neoplasm of the stomach, non-small cell lung cancer, malignant neoplasm of the head and / or neck, squamous cell carcinoma of the head and neck (PRGS) ), colorectal cancer (CRC), esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine cancer, malignant melanoma, pharyngeal cancer, oral cancer or cancer skin.
  • the product is a container with a label and a leaflet, which can be placed in a blister and / or bundle.
  • Suitable containers are, for example, vials, ampoules, syringes, etc.
  • Containers can be made of various materials, such as glass or polymeric materials.
  • the container contains a composition effective to treat a particular condition and may have a sterile inlet channel).
  • At least one active ingredient in the composition is a bispecific antibody that specifically binds to IV and II subdomains of the extracellular domain of human HER2, proposed in the invention.
  • the label and package insert indicate that the drug is used to treat a specific condition.
  • the label and / or package leaflet must additionally contain instructions for administering the antibody composition to the patient, including information about the indications, use, dose, route of administration, contraindications and / or precautions regarding the use of such therapeutic products.
  • the package insert indicates that the composition is used to treat a disease or disorder mediated by HER2, namely a cancer selected from the group: breast cancer (BC), gastric cancer, non-small cell lung cancer, malignant neoplasm of the head and / or neck, squamous cell carcinoma of the head and neck (CBC), colorectal cancer (CRC), esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer, endometrial cancer, uterine cancer, zl qualitative melanoma, cancer of the pharynx, cancer of the oral cavity or skin cancer.
  • a cancer selected from the group: breast cancer (BC), gastric cancer, non-small cell lung cancer, malignant neoplasm of the head and / or neck, squamous cell carcinoma of the head and neck (CBC), colorectal cancer (CRC), esophageal cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, kidney cancer, cervical cancer, endometrial cancer
  • the product may include other products necessary from a commercial point of view and from the point of view of the consumer, for example, but not limited to solvents, diluents, filters, needles and syringes.
  • a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human extracellular domain of HER2 of the present invention is also used for diagnostic purposes (e.g., in vitro, ex vivo).
  • this bispecific antibody can be used to detect or measure HER2 levels in samples obtained from a patient, for example, a tissue sample or a sample of body fluid, such as inflammatory exudate, blood, blood serum, intestinal fluid, saliva, or urine.
  • Suitable detection and measurement methods include immunological methods such as flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescent analysis, radioimmunoassay and immunohistology.
  • the invention further includes kits, for example, diagnostic kits containing a bispecific antibody that specifically binds to the IV and II subdomains of the human HER2 extracellular domain described herein.
  • the desired gene segments were obtained from oligonucleotides created by chemical synthesis. Gene segments ranging in length from 300 to 4000 kb, which are flanked by unique restriction sites, were collected by annealing and ligation of oligonucleotides, including PCR amplification and subsequent cloning through these restriction sites. The DNA sequences of the subcloned gene fragments were confirmed by DNA sequencing.
  • DNA sequences were determined by Sanger sequencing.
  • variants of expression plasmids were used for expression in prokaryotic (E. coli) cells of short-term expression in eukaryotic cells (for example, in CHO cells).
  • the vectors contained: a replication initiation site for replication of the indicated plasmid in E. coli, genes conferring resistance in E. coli to various antibiotics (e.g., ampicillin and kanamycin).
  • antibodies with the published sequence of Pertuzumab, Trastuzumab were used.
  • the genes of the variable domains of the heavy and light chains of antibodies were synthesized and cloned into the vectors pEE-HC, pEE-CK (Figs. 2, 3, 4), intended for the production of protein in mammalian cells, at the restriction sites Sall / Nhel and Sall / BstWI, respectively .
  • Plasmids were generated in the required quantities in E. coli cells and purified using the Qiagen kit.
  • Antigens and control antibodies were produced in cells of a constant cell line obtained from Chinese hamster ovary cells (CHO-T line). Suspension cultivation was carried out in flasks on an orbital shaker incubator using serum-free media manufactured by HyCell TransFx-C with the addition of 8 mM L-glutamine and 1 g / l pluronic 68. For transient cell expression at a concentration of 2-2.2 * 10 6 cells / ml were transfected using linear polyethyleneimine (PEI "MAX", the company "Polysciences”). The ratio of DNA / PEI was 1: 3/1: 10.
  • the culture fluid was separated from the cells by filtration through a depth filter with a pore size of 0.5 / 0.22 ⁇ m.
  • Target proteins were isolated from the culture fluid by affinity chromatography.
  • Recombinant proteins with Fc from the culture fluid were isolated and purified using a Protein A affinity chromatography column.
  • the clarified culture fluid was passed through a 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF column (GE Healthcare), balanced with phosphate-buffered saline (FSB, pH 7, four) . Then the column was washed with 5 column volumes of FSB to wash the non-specific binding components.
  • the bound antigen was eluted using 0.1 M glycine pH 3 buffer.
  • the main protein elution peak was collected and adjusted to neutrality with 1 M Tris buffer (pH 8). All stages were carried out at a flow rate of 110 cm / h. Next, the protein was transferred to PBS (pH 7.4) using dialysis using SnakeSkin Dialysis Tubing technology, filtered (0.22 ⁇ m), transferred to test tubes and stored at -70 ° C.
  • the purity of the resulting protein solution was evaluated using SDS gel electrophoresis under reducing and non-reducing conditions.
  • the optimal poses were selected by estimating the average binding energy over a 50 nanosecond molecular dynamics interval (Desmond tool, part of the Schrodinger Suite) using the MM-GBSA method (with a force field OPLS_2005) for dynamics frames taken at different simulation intervals.
  • the visualization of the resulting structure was created using Schrodinger's PyMOL tool.
  • the library contained 335 different Fab candidates: 1) 135 candidates in the set with affinity selection (up to 10 substitutions in b CDR); 2) 211 candidates in the set with stability selection (1 mutation in each CDR from the set) combined from 196 different heavy chains and 37 light chains (Figs. 5-8).
  • Antibody Fab genes were synthesized using degenerate oligonucleotides and cloned into the pBL vector, designed to generate Fab fragments in E. coli cells, at the Ncol, Nhel sites (Fig. 9).
  • Fab was produced according to the standard method: E. coli B121Gold bacterial cells were transformed with expression vectors containing Fab genes, and the subsequent addition of an inducer triggered transcription of the 1ac operon, which, when cultured, transformed the expression of Fabs, which were exported to the periplasmic space of the cells. Then, ELISA was performed to check the Fab binding with the substrate immobilized ⁇ réelle2-Fc antigen at a concentration of 0.2 ⁇ g / ml on plates (medium binding from Greiner bio one) in 0.1 M ANCO3, pH 9.0 (the antigen was immobilized overnight at 4 ° ⁇ ) As a positive control, Fab control antibodies Pertuzumab (Roche) were used.
  • Detection of immune complexes was carried out using goat anti-Fab antibodies, peroxidase-conjugated (from Pierce-Thermo Scientific) at a dilution of 1: 7500. Staining of the substrate – chromogenic mixture was carried out by adding a substrate solution ( ⁇ 2 ⁇ 2 - 0.02% and TMB in CHsCOONa pH 5.5) in a volume of 50 ⁇ l for 15 minutes. The reaction was stopped by 25 ⁇ l of H2S04 1%. The color signal was measured at a wavelength of 450 nm using a suitable Tecan-Sunrise plate reader (from Tecan). The degree of antibody binding was proportional to the color signal intensity. Clones in which the color signal intensity exceeded the signal from the control antibody was tested in ELISA for non-specific binding.
  • ELISA was also used to analyze nonspecific binding of the studied Fab fragments to other antigens.
  • the study was carried out as described above, but Angiopoetin2-H6F, Cmet-Fc, GM-CSFl-Fc, INF 2b in 0.1 M INHCO3, pH 9.0 were used as antigens for immobilization (the antigen was immobilized overnight at 4 ° C).
  • Her2-Fc was used as a control for specific binding (the antigen was immobilized overnight at 4 ° C). All subsequent steps were carried out according to the standard ELISA protocol using a high-performance automated platform based on Genetix Qpix2xt robotic systems (from Molecular Device) and Tecan Freedom EVO 200 (from Tecan).
  • variable domains of the positive clones were sequenced according to standard protocols and analyzed.
  • FIG. 11 A schematic representation of the asymmetry format is shown in FIG. 11.
  • the bulge-containing heavy chain (knob) contains the following domains: Trastuzumab in scFv format, flexible linker, Fc-knob (Fig. 12).
  • the heavy chain containing the hole consists of domains: VH optimized candidates, CH1, hinge region IgGl, Fc-hole.
  • a light chain containing VL domains of optimized candidates and a CK domain was also developed.
  • the obtained genetic constructs transformed the CHO-T-NS cell line.
  • Proteins were isolated and purified by standard methods by affinity chromatography on a Protein A bacterial protein as described in Example 1. Electrophoresis was performed under denaturing conditions in 7.5% PAG (Figs. 13, 14, 15, 16). The productivity of candidates BCD147-02-004, -006, -011, -015, -016, -018, -025 turned out to be below the threshold level (50 mg / l), and accordingly they were not taken for isolation and purification.
  • Anti-human Fc sensors (ForteBio, AHC) were immersed in a solution of antibodies at a concentration of 30 ⁇ g / ml for 300 seconds to immobilize them. Sensors loaded with antibody were then immersed in wells with solutions of non-targeted antigens at a concentration of 30 ⁇ g / ml for 150 s. Then, dissociation of the complex was detected for 150 seconds.
  • the panel of non-specific antigens includes: Ang2, IL23, GMCSF Fe, IL6R, IL5R, IL4R, DLL4, PDL1, LAG3, FGF2, Neg3, CD3 ED, CD137, PCSK9, PD1. These antigens do not contain Fc-tag.
  • candidate BCD147-02-020 showed himself best.
  • the obtained plasmids were obtained in E. coli cells and isolated using a BenchPro device in an amount of 600-700 ⁇ g. Plasmids were linearized overnight with Pvul endonuclease, then reprecipitated with ethanol and the final concentration was adjusted to 900-1100 ng / ⁇ l.
  • the CHO-K1-S cell line was cultured in S.3.87 MM (synthetic medium developed in BIOCAD without FBS) + 6 mM Glutamine.
  • Transfection with genetic constructs containing the coding sequences of candidate BCD147-02-020 chains was performed by electroporation on a Nucleofector TM instrument (Lonza) according to the manufacturer's protocol.
  • the cell clone expressing BCD147-02-020 was selected based on the analysis of the level of the target protein and the homogeneity of its structure, taking into account the growth rate, population homogeneity and the absence of morphological changes.
  • trastuzumab Comparison of candidate antibodies against HER2-HER2 BCD147-02-020 and monoclonal antibodies trastuzumab, pertuzumab, as well as a mixture of trastuzumab and pertuzumab in the antiproliferative test on cell culture BT-474
  • a BT-474 breast cancer cell line was used with HER2 receptor overexpression (HER2 +++ line).
  • Cells were cultured in DMEM / F12 medium with 2 mM glutamine, 10% FBS (fetal bovine serum), 10 ⁇ g / ml insulin at 37 ° C, 5% CO2. Cells were removed from the surface of the culture vials using trypsin. Cell viability and cell count were evaluated using trypan blue dye. A cell suspension was prepared in DMEM / F12 medium with 2 mM glutamine, 10% FBS, 10 ⁇ g / ml gentamicin antibiotic with a density of 1 * 10 5 cells / ml. 100 ⁇ l of the obtained cell suspension were added to the wells of a 96-well plate, the plate was incubated for 1 hour at 37 ° C and 5% COg.
  • FBS fetal bovine serum
  • trastuzumab, pertuzumab, a mixture of trastuzumab and pertuzumab and BCD147-02-02 from a concentration of 100 ⁇ g / ml was prepared, introduced into a plate with cells of 10 ⁇ l per well of the tablet.
  • trastuzumab and pertuzumab were mixed in a 1: 1 ratio two-fold solutions of each of the antibodies.
  • the plate was incubated for 5 days at 37 ° C, 5% COg. After incubation time, cell viability analysis was performed using the Alamar Blue stain (alamarBlue®).
  • trastuzumab Comparison of the candidate antibody against HER2-HER2 BCD147-02-020 and monoclonal antibodies trastuzumab, pertuzumab, as well as a mixture of trastuzumab and pertuzumab in the antiproliferative test with the introduction of hrEGF on cell culture BT-474
  • hrEGF human recombinant epidermal growth factor
  • the level of inhibition of proliferation at a maximum concentration of candidate BCD147-02-020 is 1.44 times higher than the mixture of monoclonal antibodies trastuzumab and pertuzumab.
  • candidate BCD147-02-020 the ratio of the maximum level of inhibition of proliferation to point 0 was 1.5 times.
  • candidate BCD147-02-020 unlike the antibodies trastuzumab and a mixture of trastuzumab and pertuzumab, has an antiproliferative effect on the cell line resistant to trastuzumab in proliferative tests.
  • ADCC analysis was performed using Jurkat reporter lines stably expressing the FcyRIIIa (CD16a) receptor and carrying the gene encoding luciferase expressed in response to activation of the NFAT pathway, which in turn occurs after the interaction of the FcyRIIIa receptor with the Fc portion of the antibody, provided that the antibody binds to the antigen on the surface of the target cells.
  • Two Jurkat reporter cell lines stably expressing the FcyRIIIa receptor, variant V158 (with high affinity for Fc - Jurkat Reporter ADCC High) and stably expressing FcyRIIIa receptor, variant F158 (with low affinity for Fc - Jurkat Reporter ADCC Low) were used in the analysis.
  • the supernatant was taken from the wells with BT-474 cells and 40 ⁇ l of the prepared dilutions of BCD147-02-020 antibody series and a mixture of trastuzumab and pertuzumab in RPMI-1640 medium, 2 mM glutamine, 4% FBS ultra-low IgG were added. 40 ⁇ l of a cell suspension of Jurkat Reporter ADCC High or Jurkat Reporter ADCC Low with a concentration of 1.875 * 10 6 cells / ml was added. The plates were incubated at 37 ° C, 5% C0 2 for 5 hours.
  • candidate BCD147-02-020 was 99.2% of the activity of the mixture of antibodies trastuzumab and pertuzumab using the reporter line with the high affinity FcyRIIIa receptor, and 121.2% of the reporter line with the low affinity FcyRIIIa receptor.
  • the analysis was carried out in RPMI-1640 medium, 2 mM glutamine, 0.1% bovine serum albumin, 50 ⁇ g / ml gentamicin.
  • a series of dilutions of the antibodies trastuzumab, a mixture of trastuzumab and pertuzumab, BCD147-02-020 from a concentration of 50 ⁇ g / ml were prepared. Contributed to 96-well plates at 50 ⁇ l per well. 50 ⁇ l of cell suspension BT-474 or SK-BR-3 with a density of 0.4 * 10 6 cells / ml was added.
  • a cell suspension of WIL2-S with a density of 1 * 10 6 cells / ml was added. Prepared a working solution of complement dilution of the liquid preparation of human complement 4 times. A complement solution of 50 ⁇ l / well was added. The plates were incubated for 2 hours at 37 ° C, 5% COg. 15 ⁇ l of Alamar Blue dye was added to the wells of the plate, the plate was incubated at 37 ° C, 5% COg until the development of a gradient color. The fluorescence level was estimated using an Infinite M200Pgo flatbed detector at an excitation / emission wavelength of 544/590 nm.
  • HUVEC cells were used as the target line. HUVEC cells were thawed on the day of analysis, washed from DMSO, a cell suspension was prepared with a concentration of 2 * 10 5 cells / ml in Medium200 medium with lx LSGS (Gibco), 1: 1 mixed with Medium200 medium, 5% Attachment factor (Gibco), 4 ⁇ g / ml gentamicin was added at 50 ⁇ l / well into 96-well plates with white walls. Cell plates were incubated for 1.5-2 hours at 37 ° C, 5% C0 2 .
  • An antibody titer of a mixture of trastuzumab and pertuzumab, BCD147-02-020, and antibodies binding to DLL4 as a positive ADCC control on HUVEC was added at 25 ⁇ l / well.
  • An antibody titer was prepared in steps of 2, at a concentration of 400 ⁇ g / ml.
  • a suspension of Jurkat Reporter ADCC High was added at a concentration of 3.75 * 10 6 cells / ml, 25 ⁇ l / well.
  • the weight of the animals was assessed (before administration, and then twice a week), the volume of the tumor node, the following formula was used:
  • W is the width of the tumor node
  • L is the length of the tumor node
  • the criterion for the effectiveness of the studied drug is the tumor growth inhibition index (SRW) and the tumor growth index (I), which are calculated by the formulas:
  • TPO (%) (Vo-Vk) / Vk * 100,
  • Vk and Vo are the average tumor volume (mm 3 ) in the control experimental groups, respectively.
  • I is the tumor growth index
  • i-day of the experiment Vo is the tumor volume on the day treatment begins.
  • the weight of the animals was assessed (before administration, and then twice a week), the volume of the tumor node, the following formula was used:
  • W is the width of the tumor node
  • L is the length of the tumor node
  • the criterion for the effectiveness of the studied drug is the tumor growth inhibition index (SRW) and the tumor growth index (I), which are calculated by the formulas:
  • TPO (%) (Vo-Vk) / Vk * 100,
  • Vk and Vo are the average tumor volume (mm 3 ) in the control experimental groups, respectively.
  • I is the tumor growth index
  • i-day of the experiment Vo is the tumor volume on the day treatment begins.
  • the weight of the animals was assessed (before administration, and then twice a week), the volume of the tumor node, the following formula was used:
  • W is the width of the tumor node
  • L is the length of the tumor node
  • the criterion for the effectiveness of the studied drug is the tumor growth inhibition index (SRW) and the tumor growth index (I), which are calculated by the formulas:
  • TPO (%) (Vo-Vk) / Vk * 100,
  • Vk and Vo are the average tumor volume (mm 3 ) in the control experimental groups, respectively.
  • I is the tumor growth index
  • i-day of the experiment Vo is the tumor volume on the day treatment begins.
  • - a general blood test according to indicators: the number of red blood cells, the number of leukocytes, the concentration of hemoglobin, the number of lymphocytes, the number of monocytes, the number of neutrophils, the number of eosinophils, the number of basophils;
  • the local irritant effect of the drugs was also evaluated, for which they isolated and performed a histological examination of the soft tissues at the injection site. For all doses tested, the toxic effect of the drug was not shown.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и предлагает биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека. Изобретение также относится к ДНК, кодирующей указанное антитело, соответствующим экспрессионным векторам и способам продукции, а также к способам лечения с использованием указанного антитела.

Description

Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для лечения заболеваний или нарушений, связанных с гиперэкспрессией HER2.
Уровень техники
Группа рецепторов эпидермального фактора роста (human epidermal factor receptor, HER) , также именуемая ErbB-рецепторами, относится к семейству трансмембранных рецепторных тирозинкиназ . Это семейство включает в себя рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR) , также называемый ErbB- 1 (или HER1), и гомологичные рецепторы ErbB-2 (HER2), ErbB-3 (HER3) и ErbB-4 (HER4) . Данные рецепторы экспрессированы на поверхности большинства нормальных клеток, они участвуют в регулировании важнейших клеточных процессов, контролируя пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз. Повышение уровня экспрессии HER рецепторов или их лигандов, таких как херегулин (HRG) или фактор эпидермального роста (EGF) , часто наблюдается у пациентов с онкологическими заболеваниями (Wilson, Fridlyand et al . 2012) .
Структура ERBB-рецептора (HER) представлена тремя доменами: внеклеточным, с 4 субдоменами, трансмембранным и внутриклеточным, представленным юкстамембранным, тирозин-киназным субдоменами и карбоксильным концом (для процессов аутофосфорилирования) .
Связывание лиганда с внеклеточным доменом тирозинкиназ вызывает процесс димеризации рецепторов, который может проходить как между двумя идентичными рецепторами (гомодимеризация) , так и между разными рецепторами внутри одного семейства (гетеродимеризация) . Димеризация активирует внутриклеточные домены тирозинкиназ и вызывает их аутофосфорилирование. Это, в свою очередь, запускает ряд нисходящих пролиферативных сигнальных каскадов, в том числе опосредованных митоген-активируемыми протеинкиназами, а также сигнальный путь АКТ, направленный на выживание клетки (описано в работе Yarden and Pines, 2012) .
Для ErbB-2 (HER2) не удалось обнаружить специфичных эндогенных лигандов, но его внеклеточный домен содержит участок связывания с низкой аффинностью и широкой специфичностью для лигандов других рецепторов, и предполагается, что в норме активация этого рецептора происходит путем гетеродимеризации (Sergina, Rausch et al . 2007), тогда как активация рецептора ErbB-3 может происходить с участием лигандов. К таким лигандам относятся, среди прочих, нейрегулин (NRG) или херегулин (HRG) .
Лиганд-зависимая димеризация характерна для HER1/3/4, опосредована связыванием лиганда с внеклеточным доменом рецептора (1 молекулы лиганда достаточно для поддержания устойчивой конформации димера; диссоциация единственной молекулы лиганда с димером приводит к мгновенной диссоциации димера) .
Лиганд-независимая димеризация характерна при достижении критической точки уровня HER2, начинается процесс спонтанной димеризации, т.е. сама гиперэкспрессия HER2 приводит к смещению равновесия рецептора от мономерного к агрегированному состоянию.
В процессе димеризации обычно участвуют все три домена рецепторов, однако, как внеклеточного, так и внутриклеточного доменов, по-отдельности, достаточно для процесса димеризации и киназной активности (в частности, конститутивной активности внутриклеточного домена) .
Аллостерические взаимодействия, лежащие в основе процесса димеризации, начинаются в области внеклеточного домена. Внеклеточные домены рецепторов отвечают как за связывание лиганда (между I и III субдоменами) , так и за связывание рецепторов друг с другом посредством II субдоменов. При этом «согнутая» конформация II субдомена характерна для лиганд-независимых, неактивных внеклеточных доменов EGFR, «прямая» - для лиганд-зависимых активных димеров.
Нарушение регуляции ErbB-рецепторов приводит к образованию и росту опухолей (Yarden, Sliwkowski et al . 2001) . Известным примером служит амплификация и гиперэкспрессия рецептора ErbB2 (HER2), которая наблюдается в 20-30% случаев рака молочной железы (РМЖ) и рака желудка.
Несмотря на отсутствие высокоаффинных лигандов, ЕгЬВ2 -рецепторы (HER2) успешно участвуют в реализации сигнальных путей, направленных на выживание клеток. Это происходит посредством образования гетеродимеров с другими рецепторами ErbB-семейства, например, с ЕгЬВЗ- рецептором (HER3) .
Наиболее неблагоприятный прогноз течения РМЖ связан с наличием большого количества гетеродимеров HER2-HER3 на поверхности опухолевых клеток, а также с коэкспрессией IGFR и c-Met (ассоциируется с инвазивным фенотипом опухоли, интенсивным метастазированием и устойчивостью к моноспецифической анти-НЕН2 таргетной терапии) .
Высокий уровень HER2-HER2 и HER2-HER3 коррелировал с амплификацией или гиперэкспрессией HER2.
Следует отметить, что существует 2 различных формации гетеродимеров HER2/HER3:
В лиганд-независимых условиях они формируются через 4 субдомены внеклеточного домена (ECD4) HER2. В лиганд-зависимых - через вторые субдомены внеклеточного домена (ECD2 ) HER2.
Лекарственные препараты, направленно действующие на ЕгЬВ2- рецепторы (HER2) (Baselga, Swain et al . 2009), позволили значительно улучшить результаты лечения у многих пациентов с опухолями, характеризующимися повышенной экспрессией ErbB2 (HER2) .
Самыми распространенными препаратами, блокирующими HER2 опосредованные механизмы опухолевого роста являются:
антитело Трастузумаб, которое блокирует IV субдомен внеклеточного домена HER2 рецептора (патент ЕР0590058 (В1 ) , W09222653);
антитело Пертузумаб, которое блокирует II субдомен внеклеточного домена HER2 рецептора (патент RU2270029, W00100245) .
Однако у значительной части пациентов такое лечение оказывается неэффективным, а у тех, кто изначально отвечал на терапию, со временем развивается резистентность (Nahta, Yu et al.2006) .
Основными механизмами формирования резистентности являются:
1. Стерический эффект - мутация р95 в структуре рецептора HER2. Данная мутация заключается в протеолизе внеклеточного домена HER2, образованию усеченной формы р95 с конститутивной киназной активностью, что исключает возможность связывания рецептора с трастузумабом и ингибирования сигнального пути; данный тип мутации не характерен для других рецепторов семейства.
2.Аберрантная активация сигнальных каскадов, регулируемых другими рецепторами семейства EGF/образование HER2-HER3, EGFR-HER3, EGFR-HER2 - гетеродимеров
3. Внутриклеточные изменения в НЕй2-сигналинге, в частности, дефицит/частичная или полная утрата функции PTEN
4. «Маскирование» экстрацеллюлярного доменома HER2 в присутствии мембрано-ассоциированного гликопротеина MUC4.
5. Коэкспрессия IGFR и с-Met
6.Т798М мутация в гене HER2
7.PIK3CA мутации
8.Активация Src
9. Повышенная экспрессия Hsp90 (связываясь с Hsp90 рецептор HER2 избегает присоединения антитела, интернализуется и вскоре возвращается в процессе ресайклинга на поверхность клетки)
10. Ингибирование miR200c
Аберрантная активация сигнальных каскадов, регулируемых другими рецепторами семейства EGF, в частности, образование HER2-HER3, EGFR/HER2 и EGFR/HER3 - гетеродимеров является одним из основных механизмов резистентности к моно-анти HER2 и EGFR антителам.
Для преодоления промблемы с резистентностью был разработан препарат Бейодайм - комбинация трастузумаба и пертузумаба, применяющаяся для лечения метастатического рака молочной железы, при отсутствии ранее проводимой анти-НЕй2 терапии, а также в качестве препарата неоадъювантной терапии РМЖ (патент RU 2430739, WO 01/00245) . Данный препарат обладает неудобным способом введения, так как Бейодайм вводят пациенту двумя раздельными длительными внутривенными инфузиями трастузумаба и пертузумаба.
Вышеуказанная проблема решается с помощью разработки биспецифического антитела, которое специфично связывается с разными субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, и вводится пациенту в одну инфузию, таким образом, сокращается время пребывания пациента в стационаре .
Из уровня техники известны биспецифические антитела, которые специфично связываются с разными субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, например, антитела, описанные в следующих патентных документах .
В международной заявке WO2015091738 (заявка RU2016129517 ) описано биспецифическое антитело, специфически связывающееся с HER2, которое содержит первый антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении внеклеточного домена II HER2, и второй антигенсвязывающий сайт, специфический в отношении внеклеточного домена IV HER2, где биспецифическое антитело является одновалентным в отношении обоих внеклеточных доменов II и IV HER2, при этом указанное антитело индуцирует комплементзависимую цитотоксичность (CDC) в более высокой степени, чем комбинация пертузумаба и трастузумаба.
Биспецифическое антитело по данному изобретению (BCD-147-02-020) вообще не проявляет комплементзависимую цитотоксичность (CDC) .
В международной заявке WO2015157592 описано биспецифическое антитело, специфически связывающееся с HER2, содержащее первый иммуноглобулиновый антигенсвязывающий домен и второй иммуноглобулиновый антигенсвязывающий домен, где (i) первый и второй иммуноглобулиновые антигенсвязывающие домены специфически связываются с различными сайтами связывания антител HER2, (ii) первый иммуноглобулиновый антигенсвязывающий домен связывается с первым сайтом связывания антител HER2, который содержит эпитоп в домене II HER2, и (iii) первый сайт связывания с антителом HER2 отличается от сайта связывания антитела пертузумаба. Данное антитело эффективно ингибирует HER2 опосредованную клеточную сигнализацию, которая может быть использована для лечения опухолей, экспрессирующих HER2, включая раковые образования, обладающие низким уровнем представленности HER2 (с. 3 описания, предпоследний абзац, WO2015157592 ) . В международной заявке WO2015157592 указано, по данным in vitro и in vivo тестов, что антитело обладает высокой активностью в отношении HER2-экспрессирующих клеток, вне зависимости от уровня экспрессии НЕБ2-рецептора, в частности, в отношении клеток тройного негативного (ER-, PR-, HER2 0- 1+) рака молочной железы. Данное свойство препарата заявлено как потенциальное преимущество, т.к. имеющиеся в настоящее время в разработке анти-НЕБ2 антитела направлены на опухоли с гиперэкспрессией HER2 рецептора (HER2 2+ FISH+, 3+) . Однако, помимо данных о противоопухолевой активности препарата, авторами не представлены доклинические исследования токсичности. Учитывая механизм действия препарата, а также механизм развития токсичности анти-НЕй2 антител (блокада HER2 сигналинга и интернализация HER2 рецептора) , следует предположить усиление токсических свойств антитела, представленного в международной заявке WO2015157592. Данное предположение основано на указанных в заявке свойствах антитела - усиленной интернализации HER2 рецептора и усиленных ADCC свойствах в отношении HER2 -экспрессирующих клеток, а также на данных по безопасности других анти-НЕй2 антител. По данным литературы, HER2 рецептор является неотъемлемой структурной составляющей кардиомиоцитов, клеток эндотелия, эпителия тонкой кишки. Таким образом, указанное в заявке WO2015157592 антитело, с большой вероятностью будет воздействовать на все здоровые клетки организма, экспрессирующие HER2 рецептор. Это подтверждается данными по безопасности, полученными в ходе КИ 1 фазы, где частота возникновения диареи составила 44%, что косвенно свидетельствует о токсичности в отношении кишечного эпителия.
Для доказательства отсутствия влияния разработанного нами биспецифического анти-НЕй2 антитела по данному изобретению (BCD-147- 02-020) на здоровые (немалигнизированные) HER2-экспрессирующие клетки был проведен тест на клетках эндотелия сосудов человека HUVEC, экспрессирующих HER2 рецептор (AGHAJANIAN Н. ЕТ AL . , Coronary vasculature patterning requires a novel endothelial ErbB2 holoreceptor, Nat Commun . , 2016, no. 7:12038. doi: 10.1038/ncommsl2038 ) . По результатам данного in vitro теста активность антитела в отношении данной клеточной линии, а именно антителозависимая клеточная цитотоксичность, минимальна, что позволяет сделать вывод о потенциально низкой токсичности препарата BCD-147-02- 020 и высокой селективности в отношении опухолевых HER2- гиперэкспрессирующих клеток.
В международной заявке WO2015077891 (заявка RU2016125551 ) описана антигенсвязывающая конструкция, содержащая первую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая моновалентно и специфически связывает ECD2 (внеклеточный домен 2) антигена HER2, и вторую антигенсвязывающую полипептидную конструкцию, которая моновалентно и специфически связывает ECD4 (внеклеточный домен 4) антигена HER2, причем один или оба из первого или второго антигенсвязывающего полипептида представляют собой scFv. Данное антитело демонстрирует увеличенные эффекторные функции, в том числе комплементзависимую цитотоксичность (CDC) , по сравнению с каждой соответствующей моноспецифической двухвалентной антигенсвязывающей конструкцией (т.е. по сравнению с моноспецифической двухвалентной антигенсвязывающей конструкцией, которая связывается с ECD2, или моноспецифической бивалентной антигенсвязывающей конструкции, которая связывается с ECD4, и/или в сравнение с комбинацией двух моноспецифических двухвалентных антигенсвязывающих конструкций (абзац [00147], с. 36 описания W02015077891 ) . Биспецифическое антитело по данному изобретению (BCD-147-02-020) вообще не проявляет комплементзависимую цитотоксичность (CDC) .
В связи с вышесказанным, актуальным является создание нового нетоксичного биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 у опухолевых HER2- гиперэкспрессирующих клеток, и проявляет антитело-зависимую клеточно- опосредованную цитотоксичность (ADCC) , но не проявляет комплементзависимую цитотоксичность (CDC) .
Биспецифическое антитело BCD-147-02-020 связывается с 4 и 2 субдоменом внеклеточного домена HER2, таким образом, стерически, данному антителу свойственно эффективно блокировать как лиганд- зависимую, так и лиганд-независимую димеризацию.
Биспецифическое антитело BCD-147-02-020 способно предотвращать не только HER2/HER3 димеризацию, но и димеризацию HER2 с EGFR и HER4.
Биспецифическое антитело BCD-147-02-020 проявляет следующие свойства :
1. способствует интернализации и деградации HER2 (посредством убиквитинирования С-СЫ) ;
2. блокирует лиганд-независимую димеризацию HER2 ;
3. предотвращает лиганд-зависимую гетеродимеризацию HER2 с другими рецепторами семейства HER1, HER3, и HER4, так как связывается со II субдоменом внеклеточного домена HER2
4. блокирует PI3K/Akt сигналинг (препятствуя димеризации);
5. проявляет антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) ;
6. не проявляет комплементзависимую цитотоксичность (CDC) ;
7. в присутствии анти-НЕБ2 (IV) компонента антитела HER2 становится высоко пластичным, в особенности в области I и III доменов, и это способствует усиленной ассоциации его с анти-НЕБ2 (II) компонентом антитела.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу BCD- 147-02-020, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2, и обеспечивает усиленную блокаду HER2 опосредованных сигнальных путей.
Такое антитело может быть использовано для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, и включает:
1) первую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, и представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) трастузумаба с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1;
2) вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, и вариабельный домен легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 6;
3) кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина ( Fc-фрагмент ) .
В некоторых вариантах биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело относится к изотипу IgGl человека.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело включает кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (Fc-фрагмент), который содержит две аминокислотные последовательности второго и третьего константных доменов (СН2-СНЗ), представленные SEQ ID NO: 10-11, соответственно .
В некоторых вариантах биспецифическое антитело включает вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий:
а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый константный домен тяжелой цепи (CHI), с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 12;
б) вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 13
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, и состоит из:
1) аминокислотной последовательности, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, включающей константные домены СН2 и СНЗ, и одноцепочечный вариабельного фрагмент (scFv) трастузумаба, с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 14;
2) тяжелой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый, второй и третий константные домены тяжелой цепи (СН1-СН2-СНЗ ) , с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 15; 3) легкой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 13,
где части 1)-3) соединены между собой дисульфидными мостиками.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует вышеуказанное антитело.
В некоторых вариантах нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему вышеуказанную нуклеиновую кислоту .
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения клетки-хозяина для получения вышеуказанного антитела, который включает трансформирование клетки вышеуказанным вектором.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к клетке- хозяину для получения вышеуказанного антитела, содержащей вышеуказанную нуклеиновую кислоту.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения вышеуказанного антитела, который заключается в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела .
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, содержащей вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в терапевтически эффективном количестве, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами .
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, которое выбрано из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, содержащей вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в терапевтически эффективном количестве и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение в терапевтически эффективном количестве.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, которое выбрано из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.
В некоторых вариантах фармацевтическая композиция включает терапевтически активное противоопухолевое соединение, которое выбирают из цитотоксического средства, химиотерапевтического средства, антитела или противогормонального средства.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу ингибирования биологической активности HER2 у субъекта, который нуждается в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества вышеуказанного антитела.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения, опосредованного HER2, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, вышеуказанного антитела или вышеуказанной фармацевтической композиции, в терапевтически эффективном количестве.
В некоторых вариантах способа лечения, заболевание или нарушение выбрают из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного антитела или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого HER2.
В некоторых вариантах применения, заболевание или нарушение выбирают из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи. Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Кольцевая схема плазмиды pEE-Fc, предназначенной для наработки экстраклеточного домена белка Нег2 человека в клетках млекопитающих. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promoter - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - Лидерный пептид IgGk мыши, hHer2 -Синтетическая последовательность антигена Нег2 человека, Fc - Fc-фрагмент IgGl человека, His - полигистидиновый таг, STOP - стоп-кодоны.
Фиг. 2. Кольцевая схема плазмиды рЕЕ-СК, предназначенной для наработки легкой цепи антитела в клетках млекопитающих. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promotor - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk мыши, VL - последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела, СК
- константный домен легкой цепи изотипа к IgGl человека, STOP - стоп- кодон, polyA - сайт полиаденилирования .
Фиг. 3. Кольцевая схема плазмид рЕЕ-НС, предназначенных для наработки тяжелой цепи антитела в клетках млекопитающих. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promotor - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk, VH - последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, НС - константные домены (CHI, СН2, СНЗ) тяжелой цепи IgGl человека, Fchole
- СН2, СНЗ домены IgGl человека с внесенными мутациями hole. STOP - стоп-кодон, polyA - сайт полиаденилирования.
Фиг. 4. Кольцевая схема плазмид pEE-HChole, предназначенных для наработки тяжелой цепи антитела в клетках млекопитающих. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promotor - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk, VH - последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, НС - константные домены (CHI, СН2, СНЗ) тяжелой цепи IgGl человека, Fchole
- СН2, СНЗ домены IgGl человека с внесенными мутациями hole. STOP - стоп-кодон, polyA - сайт полиаденилирования.
Фиг. 5. Дизайн библиотеки с отбором по стабильности Дизайн последовательностей легких цепей.
Фиг. б. Дизайн библиотеки с отбором по стабильности Дизайн последовательностей тяжелых цепей.
Фиг. 7. Дизайн библиотеки с отбором по аффинности . Дизайн последовательностей легких цепей.
Фиг. 8. Дизайн библиотеки с отбором по аффинности . Дизайн последовательностей тяжелых цепей. Фиг. 9. Кольцевая схема плазмиды pBL, предназначенная для экспрессии белков в клетках Е. coli. AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, pBR322_ori - ориджин репликации из плазмиды pBR322, lad - ген репрессора лактозного оперона, KmR - ген аминогликозид фосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к канамицину, Leader - лидерный пептид, обеспечивающий периплазматическую экспрессию в E.coli, VL - последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела, СК - константный домен легкой цепи изотипа к IgGl человека, VH - последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела, СН1 - константный домен IgGl человека, Myc-tag, His-tag - таги.
Фиг. 10. Результаты кинетического анализа для 8 Fab-фрагментов синтетической библиотеки (кривая ассоциации-диссоциации) , продемонстрировавших связывание в иммуноферментном анализе.
Фиг. 11. Схематическое изображение формата асимметрик. Биспецифическое ассиметричное антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, состоит из 1) Fc-knob - scFv-Трастузумаб, 2) HC-hole - аНЕБ2-кандидат 020-VH, 3) Ck - аНЕБ2-кандидат 020 VL .
Фиг. 12. Кольцевая схема плазмиды pEE-scFvTrast-Fc_knob . AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, CMV promoter - промотор ранних генов цитомегаловируса, oriP - ориджин репликации, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk, scFv- Trastuzumab - последовательность вариабельных доменов контрольного антитела в формате scFv, S-linker - линкер ASGDKTHT, Fcknob - СН2, СНЗ домены IgGl человека с внесенными мутациями knob, His-tag - полигистидиновый таг, STOP - стоп-кодон, polyA - сайт полиаденилирования .
Фиг. 13. Электрофорез кандидатов антител в полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях. Кандидаты 001 - 017 в формате IgGl (146 кДа) , кандидаты 019 - 035 - в формате асимметрик (125,5 кДа) .
1- маркер Bio-Rad Protein Standard
2- BCD147-02-001 Юмкг
3- BCD147-02-002 Юмкг
4- BCD147-02-003 Юмкг
5- BCD147-02-005 Юмкг
6- BCD147-02-007 Юмкг
7- BCD147-02-008 Юмкг
8- BCD147-02-009 Юмкг
9- BCD147-02-010 Юмкг
10- BCD147-02-012 Юмкг
Фиг. 14. Электрофорез кандидатов антител в полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях. Кандидаты 001 - 017 в формате IgGl (146 кДа) , кандидаты 019 - 035 - в формате асимметрик (125,5 кДа) .
1- маркер Bio-Rad Protein Standard
2- BCD147-02-013 Юмкг 3- BCD147-02-014 Юмкг
4- BCD147-02-017 Юмкг
5- BCD147-02-019 Юмкг
6- BCD147-02-020 Юмкг
7- BCD147-02-021 Юмкг
8- BCD147-02-022 Юмкг
9- BCD147-02-023 Юмкг
10- BCD147-02-024 Юмкг
Фиг. 15. Электрофорез кандидатов антител в полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях. Кандидаты 001 - 017 в формате IgGl (146 кДа) , кандидаты 019 - 035 - в формате асимметрик (125,5 кДа) .
1- маркер Bio-Rad Protein Standard
2- BCD147-02-026 Юмкг
3- BCD147-02-027 Юмкг
4- BCD147-02-028 Юмкг
5- BCD147-02-029 Юмкг
6- BCD147-02-030 Юмкг
7- BCD147-02-031 Юмкг
8- BCD147-02-032 Юмкг
9- BCD147-02-033 Юмкг
Фиг. 16. Электрофорез кандидатов антител в полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях. Кандидаты 001 - 017 в формате IgGl (146 кДа) , кандидаты 019 - 035 - в формате асимметрик (125,5 кДа) .
1- маркер Bio-Rad Protein Standard
2- BCD147-02-034 Юмкг
3- BCD147-02-035 Юмкг
Фиг. 17. Результаты кинетического анализа для полноразмерных антител в формате IgGl (кандидаты 001-017) и асимметрик (кандидаты 019
- 035) .
Фиг. 18. Кривые ассоциации-диссоциации конкуренции кандидатов 017 035 с Трастузумаб в формате «Ih-tandem». Подписи над кривыми демонстрируют последовательность загрузки антигена, контрольного антитела и кандидатов на сенсор. Кривые для различных кандидатов накладываются друг на друга.
Фиг. 19. Кривые ассоциации-диссоциации конкуренции кандидатов 017 035 с Pertuzumab в формате «Ih-tandem». Подписи над кривыми демонстрируют последовательность загрузки антигена, контрольного антитела и кандидатов на сенсор. Кривые для различных кандидатов накладываются друг на друга.
Фиг. 20. Кривые ассоциации-диссоциации конкуренции кандидатов 017
- 035 с Trastuzumab и Pertuzumab в формате «Sandwich». Подписи над кривыми демонстрируют последовательность загрузки антигена, контрольных антител и кандидатов на сенсор. Кривые для различных кандидатов накладываются друг на друга.
Фиг. 21. Кольцевая схема векторов pSX. p-CMVe/EFlalpha - синтетический промотор, сосотоящий из энхансера CMV и промотора EF- la, START - Старт-кодон, Leader - лидерный пептид IgGk, INSERT - последовательность вставки (тяжелая или легкая цепь антитела) , STOP - стоп-кодон, polyA - сайт полиаденилирования, Enhancer SV-40 - энхансер вируса обезьян SV-40, beta globin MAR - MAR (matrix attachment region) гена b-глобина человека, Rep origin 1 - pUC Ориджин репликации, AmpR - ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, F1 origin - позволяет плазмиде с таким ориджином репликации упаковываться в фаговые частицы при котрансформации с фагами-помощниками VCSM13 и М13К07, SV40 promoter - эукариотический промотор вируса обезьян SV- 40, Antibiotic_R - Ген устойчивости к антибиотику (пуромицин, бластитидин, гигромицин Б) , позволяет вести селекцию трансфецированной клеточной культуры млекопитающих.
Фиг. 22. Зависимость интенсивности флуоресценции от логарифма концентрации антител в антипролиферативном тесте на клеточной линии ВТ-474. На графике представлены 11-кратные вносимые концентрации антител .
Фиг. 23. Зависимость интенсивности флуоресценции от логарифма концентрации антител в антипролиферативном тесте на клеточной линии ВТ-474 с внесением hrEGF. На графике представлены 11-кратные вносимые концентрации антител.
Фиг. 24. Зависимость интенсивности флуоресценции от логарифма концентрации антител в антипролиферативном тесте на клеточной линии ВТ-474 Clone 5, устойчивых к трастузумабу . На графике представлены 11- кратные вносимые концентрации антител.
Фиг. 25. Анализ ADCC на клеточной линии ВТ-474 с использованием репортерной линии с высокоаффинным FcyRIIIa рецептором. На графике представлены 2-кратные вносимые концентрации антител.
Фиг. 26. Анализ ADCC на клеточной линии ВТ-474 с использованием репортерной линии с низкоаффинным FcyRIIIa рецептором. На графике представлены 2-кратные вносимые концентрации антител.
Фиг. 27. Анализ CDC на клеточных линиях ВТ-474 и SK-BR-3. Антитела представлены в концентрации 50 мкг/мл (3-кратная вносимая концентрация антител) , «0 point» - точка без внесения антител, «РС» - положительный контроль CDC (ритуксимаб и WIL2-S) .
Фиг. 28. Анализ ADCC на клеточной линии HUVEC с использованием репортерной линии с высокоаффинным FcyRIIIa рецептором. На графике представлены 4-кратные вносимые концентрации антител.
Фиг. 29. Динамика значения индекса прироста опухоли (опухолевая линия ZR-75-1) .
Фиг. 30. Значение показателя торможения роста опухоли (ТРО) (опухолевая линия ZR-75-1) .
Фиг. 31. Динамика значения индекса прироста опухоли (опухолевая линия SKBR3) .
Фиг. 32. Значение показателя торможения роста опухоли (ТРО) (опухолевая линия SKBR3) . Фиг. 33. Динамика значения индекса прироста опухоли (опухолевая линия ВТ-474 ) .
Фиг. 34. Значение показателя торможения роста опухоли (ТРО) (опухолевая линия ВТ-474) .
Описание изобретения
Определения и общие методы
Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области .
Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.
Определения , связанные с антителом
"HER-рецептор" является рецепторной тирозиновой протеинкиназой, которая относится к семейству HER-рецепторов и включает рецепторы EGFR, HER2, HER3 и HER4 и других представителей такого семейства, которые будут идентифицированы в будущем. HER-рецептор, как правило, может содержать внеклеточный домен, который может связывать лиганд HER; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен; и находящийся на карбоксильном конце домен передачи сигнала, несущий несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы. Предпочтительно HER-рецептор представляет собой HER-рецептор человека с нативной последовательностью.
Выражения «ЕгЬВ2» и «HER2» используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к белку HER2 человека, описанному, например, в Semba et al . , PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) и Yamamoto et al . Nature 319: 230-234 (1986) (номер доступа в Genebank X03363) . Термин «егЬВ2» относится к гену, кодирующему ЕгЬВ2 человека. Предпочтительный HER2 представляет собой HER2 человека с нативной последовательностью . Внеклеточный домен HER2 содержит четыре домена: домен I (аминокислотные остатки примерно от 1 до 195) , домен II (аминокислотные остатки примерно от 196 до 319) , домен III (аминокислотные остатки примерно от 320 до 488) и домен IV (аминокислотные остатки примерно от 489 до 630) (нумерация остатков без сигнального пептида) . См. Garrett et al . Mol. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho et al . Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al . Cancer Cell 5: 317-328 (2004) и Plowman et al . Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 1746-1750 (1993) . Также см. фиг. 1 в данном описании.
Под «лигандом HER» подразумевают полипептид, который связывается и/или активирует рецептор HER.
Используемые в данном документе термины «связывающийся с человеческим HER2», или «специфически связывающийся с человеческим HER2», или «анти-НЕй2-антитело» являются взаимозаменяемыми и относятся к антителу, специфически связывающемуся с человеческим НЕй2-антигеном с аффинностью связывания, которая имеет значение KD 1*10 8 моль/л или ниже при 25 °С, в одном воплощении имеет значение KD 1*10 9 моль /л или ниже при 25 °С. Аффинность связывания определяют в стандартном анализе связывания при 25°С, таком как методика поверхностного плазменного резонанса (BIAcore®, GE-Healthcare, Упсала, Швеция) . Способ определения значения KD аффинности связывания описан в примере 2b) . Таким образом, термин «антитело, связывающееся с человеческим HER2», используемый в данном документе, относится к антителу, специфически связывающемуся с человеческим НЕй2-антигеном с аффинностью связывания со значением KD 1*10 8 моль/л или ниже (предпочтительно 1c10 8 моль/л - 1, 0х10 12моль/л) при 25°С.
Амплификация этого гена и/или сверхэкспрессия его белка были обнаружены при многих раковых заболеваниях, в том числе при раке молочной железы (РМЖ) , злокачественном новообразовании желудка, немелкоклеточном раке лёгкого, злокачественном новообразовании головы и/или шеи, плоскоклеточном раке головы и шеи (ПРГШ) , колоректальном раке (КРР) , эзофагеальном раке, раке яичника, раке поджелудочной железы, раке ЖКТ, раке почек, раке шейки матки, раке эндометрия, раке матки, злокачественной меланоме, раке глотки, раке ротовой полости или раке кожи.
Термин «связывающая молекула» включает в себя антитела и иммуноглобулины .
Термин «антитело» или «иммуноглобулин» (Ig), как использовано в данном описании, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его отдельные цепи. Термин "антитело» относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как VH) и константную область тяжелой цепи. Известно пять типов тяжелых цепей антител млекопитающих, которые обозначают греческими буквами: a, d, e, g и m. Присутствующий тип тяжелой цепи определяет класс антитела; указанные цепи обнаружены в антителах типа IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно. Различные тяжелые цепи отличаются по размеру и составу; и g содержат примерно 450 аминокислот, а m и e состоят примерно из 550 аминокислот. Каждая тяжелая цепь содержит две области, т.е. константную область и вариабельную область . Константная область является идентичной во всех антителах одного и того же изотипа, но отличается в антителах различного изотипа. Тяжелые цепи g, и d содержат константную область, которая состоит из трех константных доменов CHI, СН2 и СНЗ (выстроены в ряд) и шарнирной области, которая придает гибкость (Woof J., Burton D., Nat Rev Immunol 4, 2004, cc.89-99); тяжелые цепи m и e содержат константную область, которая состоит из четырех константных доменов CHI, СН2, СНЗ и СН4. У млекопитающих известно только два типа легких цепей, которые обозначают как лямбда (l) и каппа (к) . Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в данном описании как VL) и константной области легкой цепи. Примерная длина легкой цепи составляет 211-217 аминокислот. Предпочтительно легкая цепь представляет собой легкую каппа (к) -цепь, а константный домен CL предпочтительно представляет собой С-каппа (к) .
«Антитела» согласно изобретению могут представлять собой антитела любого класса (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительно IgG) или подкласса (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2, предпочтительно IgGl) .
Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) , разбросанные между областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR) . Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторными клетками) , и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.
Термин «антигенсвязывающая часть» антитела или «антигенсвязывающий фрагмент» (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») , как использовано в данном описании, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин "антигенсвязывающая часть» антитела включают (i) Fab- фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CHI; (ii) F (abf ) 2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd- фрагмент, состоящий из доменов VH и CHI; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH в едином плече антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al . , (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH/VHH; и (vi) выделенная определяющая комплементарность область (CDR) . Кроме того, две области Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены при помощи рекомбинантных способов с использованием синтетического линкера, который дает возможность получать их в виде единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al . (1988) Science 242:423-426; и Huston et al . (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879- 5883) . Предполагается, что такие одноцепочечные молекулы также включены в термин "антигенсвязывающая часть» антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и эти фрагменты подвергают скринингу таким же образом, как и интактные антитела.
Предпочтительно CDR антигенсвязывающего участка или весь антигенсвязывающий участок антител по изобретению имеет происхождение из мыши, ламы или донорской человеческой библиотеки или по существу человеческое происхождение с определенными аминокислотными остатками, измененными, например, замещенными разными аминокислотными остатками с тем, чтобы оптимизировать конкретные свойства антитела, например KD, koff, IC50, ЕС50, ED50. Предпочтительно каркасные участки антитела по изобретению имеют человеческое происхождение или по существу человеческое происхождение (по крайней мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% человеческое происхождение) .
В других вариантах осуществления антигенсвязывающий участок антитела по изобретению может происходить из других нечеловеческих видов, включая мыши, ламы, кролика, крысу или хомяка, но не ограничиваясь ими. Альтернативно, антигенсвязывающий участок может происходить из человеческих видов.
Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных доменов широко отличаются в последовательности среди антител. Домен V опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела к его конкретному антигену. Однако вариабельность неравномерно распределяется на участке вариабельных доменов из 110 аминокислот. Напротив, V области состоят из инвариантных фрагментов, называемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими участками чрезвычайной вариабельности, называемых «гипервариабельными областями» или CDR. Каждый вариабельный домен нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR, в основном принимающих конфигурацию бета-листов, связанных тремя гипервариабельными областями, которые образуют петли, связывающие, и в некоторых случаях являющиеся частью бета-складчатой структуры. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с помощью FR и с гипервариабельными областями другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител. Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ, ADCC) .
Термин «гипервариабельная область» по данному описанию относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Обычно гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR», и/или такие остатки из «гипервариабельной петли».
В некоторых случаях может также быть предпочтительным изменение одного или более остатков аминокислот CDR-участков с целью повышения аффинности связывания с целевым эпитопом. Это известно, как «созревание аффиности» и в некоторых случаях может выполняться в связи с гуманизацией, например, в ситуациях, когда гуманизация антитела приводит к снижению специфичности или аффинности связывания, и не представляется возможным в достаточной степени улучшить специфичность или аффинность связывания с помощью только обратных мутаций. Различные методы созревания аффинности известны в данной области техники, например, способ in vitro сканирующего насыщающего мутагенеза, описанный Burks et al . , Proc Natl Acad Sci USA, 94:412-417 (1997), и способ пошагового in vitro созревания аффинности, предложенный Wu et al . , Proc Natl Acad Sci USA 95:6037 6042 (1998) .
«Каркасные области» (FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от CDR остатков. Обычно каждый вариабельный домен имеет четыре FR, определяемые как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определяются согласно Rabat, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), а остатки FR тяжелой цепи локализуются, приблизительно, в области остатков 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103- 113 (HCFR4) в тяжелой цепи. Если участки CDR содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, FR остатки легкой цепи локализуются, приблизительно, в остатках 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) в легкой цепи, a FR остатки тяжелой цепи локализуются, примерно, в остатках 1-25 (HCFRI), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи. В некоторых примерах, когда CDR содержит аминокислоты как из CDR по Rabat, так и аминокислоты из гипервариабельной петли, FR соответствующим образом корректируются. Например, когда CDRH1 включает аминокислоты Н26-Н35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся в положениях 1-25, а остатки FR2 находятся в положениях 36-49.
Кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (англ. fragment crystallizable region, Fc region, Fc) — это концевая часть молекулы иммуноглобулина, которая взаимодействует с Fc-рецептором на поверхности клетки и с некоторыми белками системы комплемента. Данное свойство позволяет антителам активировать иммунную систему. Fc-участок IgG, IgA и IgD изотипов состоит из двух одинаковых белковых фрагментов, соответственно, второго и третьего константных доменов двух тяжелых цепей; в случае изотипов IgM и IgE Fc содержит три константных домена тяжелых цепей (домены СН 2-4) в каждой полипептидной цепочке.
Антитело по данному изобретению, «которое связывает» целевой антиген, представляет собой антитело, которое связывает антиген с достаточной аффинностью так, что антитело можно применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на белок или клетку, или ткань, экспрессирующую антиген, и в незначительной степени перекрестно реагирует с другими белками. По данным аналитических методов: сортинга флуоресцентно-активированных клеток (FACS), радиоиммунопреципитации (RIA) или ИФА (ELISA), в таких вариантах изобретения степень связывания антитела с белком, не являющимся «мишенью» (с «нецелевым белком») , составляет менее 10% от связывания антитела с конкретным белком-мишенью. По отношению к связыванию антитела с молекулой-мишенью термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени означает связывание, которое заметно (измеримо) отличается от неспецифического взаимодействия (например, в случае ЬН1- 44 или ЬН1-81 неспецифическое взаимодействие представляет собой связывание с бычьим сывороточным альбумином, казеином, фетальной бычьей сывороткой или нейтравидином) .
Специфическое связывание можно определять количественно, например, определяя связывание молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы. Например, специфическое связывание можно определять конкурентной реакцией с другой молекулой, аналогичной мишени, например, с избытком немеченой мишени. В этом случае специфическое связывание указывается, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. В данном описании термин «специфическое связывание» или выражения «специфически связывается с» или «специфический к» конкретному полипептиду или эпитопу на конкретном полипептиде-мишени можно характеризовать на примере молекулы, имеющей Kd к мишени по меньшей мере около 200 нМ, или же по меньшей мере около 150 нМ, или же по меньшей мере около 100 нМ, или же по меньшей мере около 60 нМ, или же по меньшей мере около 50 нМ, или же по меньшей мере около 40 нМ, или же по меньшей мере около 30 нМ, или же по меньшей мере около 20 нМ, или же по меньшей мере около 10 нМ, или же по меньшей мере около 8 нМ, или же по меньшей мере около 6 нМ, или же по меньшей мере около 4 нМ, или же по меньшей мере около 2 нМ, или же по меньшей мере около 1 нМ или выше . В одном варианте изобретения термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде, практически не связываясь с каким-либо другим полипептидом или эпитопом на полипептиде . Термин «Ка», как использовано в данном описании, относится к скорости ассоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
Термин «Kd», как использовано в данном описании, относится к скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген.
«Аффинность связывания» обычно относится к силе совокупных нековалентных взаимодействий между единичным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном) . Если не указано иначе, «аффинность связывания» относится к внутренней (характерной, истинной) аффинности связывания, которая отражает 1:1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антителом и антигеном) . Аффинность молекулы X к своему партнеру Y обычно можно представить константной диссоциации (Kd) . Желательно, чтобы величина Kd составляла, примерно, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 6 нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее. Аффинность можно измерять обычными методами, известными в уровне техники, включая методы по данному описанию. Низкоаффинные антитела обычно медленно связываются с антигеном и имеют тенденцию легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно быстрее связывают антиген и имеют тенденцию дольше оставаться в связанном состоянии. В уровне техники известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из этих методов можно использовать для целей настоящего изобретения.
В одном варианте изобретения «Kd» или «величину Kd» по данному изобретению измеряют методами поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1Асоге™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU) . Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом -этил- ' - ( 3-диметиламинопропил) - карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) , а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (например, от 0.78 нМ до 500 нМ) вводят в PBS с 0.05% Tween 20 (PBST) при 25 °С при скорости потока, примерно, 25 мкл/мин. Величины скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (koff) рассчитывают, применяя простую модель Ленгмюра для связывания один-плюс-один (BIAcore Evaluation Software версия 3.2), с помощью одновременного получения сенсограммы ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение koff/kon. См., например, Chen, Y., et al . , (1999) J. Mol. Biol. 293: 865-881. Если по данным вышеуказанного метода поверхностного плазмонного резонанса скорость ассоциации превышает 106 М-1 сек-1, тогда ее можно определять методом тушения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентной эмиссии (возбуждение=295 нм; эмиссия (излучение ) =340 нм, полоса 16 нм) при 25°С раствора антитела против антигена (Fab форма) с концентрацией 20 нМ в PBS, pH 7.2, в присутствии увеличивающихся концентраций антигена, измеряемых с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр остановленного потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-Aminco ( ThermoSpectronie ) серии 8000 с кюветой с перемешиванием.
Термин «koff» относится к константе скорости диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы и антигена. Константу скорости диссоциации koff можно измерить посредством биослойной интерферометрии, например, с помощью системы Octet™.
«Скорость ассоциации» («oh-rate») или «коп» по данному изобретению можно также определять тем же самым описанным выше методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе В1Асоге™-2000 или BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C, используя чипы с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~10 относительных единицах (единицах отклика, RU) . Коротко говоря, биосенсорные чипы с карбоксиметилдекстраном (СМ5, BIAcore Inc.) активируют гидрохлоридом -этил- ' - ( 3-диметиламино пропил) -карбодиимида (EDC) и N- гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разводят 10 мМ раствором ацетата натрия, pH 4.8, до концентрации 5 мкг/мл (~0.2 мкМ) , а затем вводят (инжекция) при скорости потока 5 мкл/минута до достижения, примерно, 10 относительных единиц (RU) связанного белка. После введения антигена вводят 1 М раствор этаноламина, чтобы блокировать непрореагировавшие группы .
Если специально не указано иначе, выражения «биологически активный», и «биологическая активность», и «биологические характеристики», по отношению к полипептиду по данному изобретению, означают обладание способностью связываться с биологической молекулой.
Выражение «биологическая молекула» относится к нуклеиновой кислоте, белку, углеводу, липиду и их комбинации. В одном варианте изобретения биологическая молекула существует в природе.
Участки антител, такие как Fab- и F (ab ' ) 2-фрагменты, могут быть получены из целых антител с использованием традиционных методов, таких как папаиновый или пепсиновый гидролиз целых антител. Более того, антитела, части антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК, например, как описано в настоящем документе.
Термин «рекомбинантное антитело» означает антитело, которое экспрессируется в клетке или клеточной линии, содержащей нуклеотидную последовательность (нуклеотидные последовательности) , которая кодирует антитела, при этом указанная нуклеотидная последовательность (нуклеотидные последовательности) не ассоциирована с клеткой в природе . Термин «вариантное» антитело, используемый в данном документе, относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности его «родительского» антитела путем добавления, удаления и/или замены одного или более аминокислотных остатков относительно последовательности родительского антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения вариантное антитело содержит по меньшей мере одно или более (например, от одного до двенадцати, например, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или девять, десять, одиннадцать или двенадцать; и в некоторых вариантах осуществления изобретения от одного до примерно десяти) добавлений, делеций и/или замен аминокислот относительно родительского антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретение добавления, делеции и/или замены осуществляются на CDR-участках вариантного антитела. Идентичность или гомология по отношению к последовательности вариантного антитела определяется в настоящем документе как процент аминокислотных остатков в последовательности вариантного антитела, которые идентичны остаткам родительского антитела, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Вариантное антитело сохраняет способность связываться с тем же антигеном, и предпочтительно эпитопом, с которым связывается родительское антитело, и в некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно свойство или биологическая активность превосходит аналогичные свойства родительского антитела. Например, вариантное антитело может иметь, например, более выраженную аффинность связывания, более длительный период полувыведения, более низкое значение ИК50 или повышенную способность подавлять биологическую активность антигена по сравнению с родительским антителом. Особый интерес в настоящем документе представляет вариантное антитело, показывающее биологическую активность, превышающую по меньшей мере в 2 раза (предпочтительно, по меньшей мере в 5 раз, 10 раз или 20 раз) биологическую активность родительского антитела.
Термин «биспецифическое антитело» означает антитело, содержащее антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающие домены, которые способны к специфическому связыванию с двумя различными эпитопами на одной биологической молекуле или способны к специфическому связыванию с эпитопами на двух различных биологических молекулах. Биспецифичное антитело также упоминается в настоящем документе, как обладающее «двойной специфичностью» или как являющееся антителом с «двойной специфичностью» или «бипаратопное антитело».
Термин «химерное антитело» относится в широком смысле к антителу, которое содержит одну или более областей из одного антитела, и одну или более областей из одного или нескольких других антител, как правило, антитело, частично человеческого происхождения и частично нечеловеческого происхождения, то есть полученное частично из не относящегося к человеку животного, например, мыши, крысы или другого грызуна или верблюдовых, таких как лама или альпака. Химерные антитела являются предпочтительными по сравнению с нечеловеческими антителами для того, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антител у человека, например, ответа, направленного против мышиных антител у человека в случае мышиного антитела. Примером типичного химерного антитела является то, в котором последовательности вариабельного участка являются мышиными, в то время как последовательности константного участка являются человеческими. В случае химерного антитела нечеловеческие части могут быть подвергнуты дальнейшему изменению с целью гуманизации антитела.
Термин «гуманизация» относится к факту, что когда антитело имеет полностью или частично нечеловеческое происхождение, например, антитело мыши или ламы, полученное при иммунизации мышей или лам, соответственно, с представляющим интерес антигеном, или является химерным антителом на основе такого антитела мыши или ламы, можно заменить некоторые аминокислоты, например, в каркасных областях и константных доменах тяжелой и легкой цепей, с тем чтобы избежать или свести к минимуму иммунный ответ у человека. Специфичность взаимодействия антитела с антигеном-мишенью присуща главным образом аминокислотным остаткам, расположенных в шести CDR-участках тяжелой и легкой цепи. Поэтому аминокислотные последовательности внутри CDR- участков, являются гораздо более вариабельными между отдельными антителами, по сравнению с последовательностями вне CDR-участков . Поскольку последовательности CDR участков отвечают за большинство антитело-антиген взаимодействий, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфического природного антитела, или в более общем плане какого-либо специфического антитела с данной аминокислотной последовательностью, например, путем конструирования экспрессионных векторов, которые экспрессируют последовательности CDR-участков из специфического антитела и каркасные последовательности другого антитела. В результате, можно «гуманизировать» нечеловеческое антитело и в значительной степени сохранить специфичность связывания и аффинность исходного антитела. Несмотря на то, что невозможно точно предсказать иммуногенность и тем самым иммунный ответ, направленный против антитела у человека на конкретное антитело, нечеловеческие антитела, как правило, более иммуногенны, чем человеческие антитела. Химерные антитела, у которых инородные (например, грызуна или верблюда) константные участки были заменены последовательностями человеческого происхождения, показали в целом более низкую иммуногенность, чем антитела полностью инородного происхождения, и существует тенденция использовать в терапевтических антителах гуманизированные или полностью человеческие антитела. Химерные антитела или другие антитела нечеловеческого происхождения, таким образом, могут быть гуманизированы, чтобы снизить риск иммунного ответа, направленного против антитела, у человека. Для химерных антител, гуманизация обычно включает в себя модификацию каркасных участков последовательностей вариабельного участка. Аминокислотные остатки, которые являются частью участков, определяющих комплементарность (CDR участков) , чаще всего не будут изменяться в связи с гуманизацией, хотя в некоторых случаях это может быть желательным, чтобы изменить отдельные аминокислотные остатки CDR- участка, например, чтобы удалить участок гликозилирования, участок дезамидирования, участок изомеризации аспартата или нежелательный остаток цистеина или метионина. N-связанное гликозилирование происходит путем присоединения олигосахаридной цепи к остатку аспарагина в трипептидной последовательности Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме Pro. Удаление участка N- гликозилирования может быть достигнуто путем мутирования Asn или Ser/Thr остатка другим остатком, предпочтительно путем консервативной замены. Дезамидирование остатков аспарагина и глутамина может происходить в зависимости от таких факторов, как pH и обнажение поверхности. Остатки аспарагина особенно восприимчивы к дезамидированию, прежде всего, если они присутствуют в последовательности Asn-Gly, и в меньшей степени в других дипептидных последовательностях, таких как Asn-Ala. При наличии такого дезамидированного участка, например, Asn-Gly в последовательности CDR- участка, может быть предпочтительным удалить этот участок, как правило, путем консервативной замены для удаления одного из вовлеченных остатков.
В данной области техники известны многочисленные способы гуманизации последовательности антитела. Одним из наиболее часто используемых методов является трансплантация CDR-участков. Трансплантация CDR участка может быть основана на определениях CDR- участков по Rabat, хотя в более поздней публикации (Magdelaine- Beuzelin et al . , Crit Rev. Oncol Hematol. 64:210 225 (2007)) предполагается, что определение no IMGT® (the international ImMunoGeneTics information system®, www.imgt.org) может улучшить результат гуманизации (см Lefranc et al . , Dev. Comp Immunol. 27:55-77 (2003)) . В некоторых случаях, трансплантация CDR-участкка может уменьшить специфичность и аффинность связывания, и, следовательно, биологическую активность, в CDR трансплантированном нечеловеческом антителе, по сравнению с родительским антителом, из которого получены CDR-участки. Обратные мутации (иногда именуемые «ремонт каркасного участка») , могут применяться в выбранных положениях CDR трансплантированного антитела, как правило, в каркасных участках, для того, чтобы восстановить специфичность и аффинность связывания родительского антитела. Определение позиций для возможных обратных мутаций может быть выполнено с использованием информации, имеющейся в литературе и в базах данных антител. Аминокислотные остатки, которые являются кандидатами для обратных мутаций, как правило, расположены на поверхности молекулы антитела, в то время как остатки, которые углублены или имеют низкую степень обнажения поверхности обычно не будут подвержены изменениям. Метод гуманизации, альтернативный трансплантации CDR-участка и обратной мутации, представляет собой изменение поверхности, при котором неэкспонированные на поверхности остатки нечеловеческого происхождения, сохраняются, в то время как экспонированные на поверхности остатки изменяются в человеческие остатки .
Существует две технологии получения полностью человеческих антител: с использованием in vitro собранных фаговых библиотек или in vivo иммунизацией гуманизированных животных (мышей, крыс и т.д.) .
Конструирование комбинаторных фаговых библиотек антител начинается с выбора источника генного репертуара, в зависимости от которого можно выделить несколько видов библиотек антител: наивные, иммунные или синтетические. Наивные и иммунные библиотеки конструируют, используя естественным образом реорганизованные гены, кодирующие вариабельные домены иммуноглобулинов здоровых или иммунных к какому-либо антигену доноров, соответственно. Для этого выделяют мРНК клеток лимфоидного ряда, продуцирующих антитела. Чаще всего это лимфоциты периферической крови, но в некоторых случаях используют спленоциты [Sheets MD, Amersdorfer Р, Finnern R, Sargent P, Lindquist E, Schier R, et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: the production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 1998,95:6157- 6162 и de Haard HJ, van Neer N, Reurs A, Hufton SE, Roovers RC, Henderikx P, et al . A large non-immunized human Fab fragment phage library that permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodies. J Biol Chem 1999,274:18218-18230.], клетки миндалин или лимфоциты костного мозга [Vaughan TJ, Williams AJ, Pritchard К, Osbourn JK, Pope AR, Earnshaw JC, et al . Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat Biotechnol 1996,14:309-314.]. На основе мРНК синтезируют кДНК, при этом для праймирования реакции могут быть взяты олиго-dT праймеры и статистические гексаолигонуклеотиды, что позволяет получать кДНК копии всех возможных вариантов генов, кодирующих вариабельные домены антител [Улитин АБ, Капралова МВ, Даман АГ, Шепеляковсткая АО, Булгакова ЕВ, Фурсова КК, et al . Библиотека миниантител человека в формате фагового дисплея. Создание и апробация. ДАН: Изд-во «Наука»; 2005.].
Сразу могут использоваться один или несколько праймеров, ограничивающих набор амплифицируемых генов до одного или нескольких семейств генов вариабельных доменов или изотипов антител уже на уровне кДНК [Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, McCafferty J, Griffiths AD, Winter G. Bypassing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol 1991,222:581-597]. Праймеры, используемые для амплификации генов, кодирующих иммуноглобулины, комплементарны их наиболее консервативным участкам. Их последовательности выбирают из коллекций генов, которые организованы в базы данных, такие как база данных Rabat или V BASE. Дизайн праймеров также предусматривает наличие в них внутренних сайтов рестрикции, позволяющих клонировать ПЦР продукты в состав соответствующих векторов .
Конструирование синтетических библиотек основано на замене природных CDR на набор случайных последовательностей, что позволяет создавать огромное разнообразие антигенсвязывающих сайтов.
Фаговый дисплей является первой и самой широко распространенной in vitro технологией для поиска антител. В 1985 году Смит обнаружил, что последовательности чужеродной ДНК могут быть клонированы в нитевидный бактериофаг М13 таким образом, что клонированные последовательности генов экспрессируются на поверхности фаговых частиц как слитые белки (Smith GP : Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 1985, 228:1315-1317.) . Таким образом, можно проводить селекцю интересующих нас слитых белков на основе их способности связывать другие белки. Это открытие было скомбинировано с методами ПЦР- амплификации, что позволило клонировать кДНК репертуар генов иммуноглобулинов для создания разнообразных фаговых библиотек, содержащих вариабельные домены, которые могут быть использованы для быстрого поиска мишень -специфичных моноклональных антител. Репертуар фаговых библиотек отражает репертуар антител В-лимфоцитов каждого человека или животного, кровь которого была использована при создании библиотеки. В 1995 году две статьи сообщили о создании генетически сконструированных мышей, которые экспрессировали полностью человеческие антитела, репертуар которых может быть соспоставим с полученных гибридомной технологией (Lonberg N, Taylor LD, Harding FA, Trounstine M, Higgins KM, Schramm SR, Kuo CC, Mashayekh R, Wymore K, McCabe JG et al . : Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature 1994, 368:856- 859) У этих животных были целенаправленно разрушены гены своих собственных эндогенных тяжелых и к легких цепей иммунноглобулинов и введены трансгены, представляющие собой сегменты генов тяжелых и к легких цепей человека. Оказалось, что репертуар генов человека может быть использован мышиной иммунной системой для создания высокоспецифичных и высокоаффинных антител ко большему разнообразию антигенов. Несмотря на то, что трансгенные мыши экспрессируют В- клеточные рецепторы, которые по существу являются гибридными мышиных и человеческих (человеческий иммуноглобулин, мышиные Ig , Irb и другие сигнальные молекулы), их В-клетки нормально развиваются и созревают.
Термин «моноклональное антитело» или «тАЬ» ОТНОСИТСЯ К антителу, которое синтезировано и выделено отдельной клональной популяцией клеток. Клональная популяция может быть клональной популяцией иммортализованных клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммортализованные клетки в клональной популяции являются гибридными клетками, гибридомами, которые обычно получают путем слияния отдельных В-лимфоцитов от иммунизированных животных с отдельными клетками лимфоцитарной опухоли. Гибридомы представляют собой тип сконструированных клеток и не встречаются в природе.
«Нативные антитела» обычно являются гетеротетрамерными гликопротеидами с молекулярной массой примерно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует в разных изотипах иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет равномерно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH) , за которым следует несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на другом конце. Константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Полагают, что конкретные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи .
Определение «выделенный» («изолированный») , применяемое для описания различных антител по данному описанию, означает антитело, идентифицированное и выделенное и/или регенерированное из клетки или клеточной культуры, в которой оно экспрессируется. Примеси (загрязняющие компоненты) из природной среды представляют собой материалы, которые, как правило, мешают диагностическому или терапевтическому применению полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах изобретения антитело очищают (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N- концевой или внутренней аминокислотной последовательности, при использовании секвенатора с вращающейся стеклянной чашечкой (секвенатора Эдмана) , или (2) до гомогенности методом SDS-PAGE в невосстанавливающих или восстанавливающих условиях с применением окрашивания Кумасси бриллиантовым голубым или, предпочтительно, серебром. Выделенное антитело включает антитела in situ внутри рекомбинантных клеток, так как по меньшей мере один компонент природной среды полипептида отсутствует. Обычно выделенный полипептид получают в результате по меньшей мере одной стадии очистки.
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена от по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты-примеси, с которой она обычно связана в естественном источнике нуклеиновой кислоты антитела. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от той формы или набора, в которых она находится в естественных условиях. Таким образом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты отличается от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в клетках в естественных условиях. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу нуклеиновой кислоты, находящуюся в клетках, в которых в норме происходит экспрессия антитела, например, в случае, если молекула нуклеиновой кислоты имеет локализацию в хромосоме, отличную от ее локализации в клетках в естественных условиях.
Термин «эпитоп» при использовании в данном документе относится к части (детерминанте) антигена, который специфически связывается со связывающей молекулой (например, и антитело или родственная молекула, такие как биспецифичная связывающая молекула) . Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или углеводы, или боковые цепи сахаров, и, как правило, имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов. Эпитоп может быть «линейным» или «конформационным. » В линейном эпитопе, все точки взаимодействия между белком (например, антиген) и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) происходит линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе, точки взаимодействия происходят через аминокислотные остатки на белке, отделенные друг от друга в первичной аминокислотной последовательности. Когда желаемый эпитоп антигена определен, можно генерировать антитела к этому эпитопу с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Кроме того, генерация и характеристика антител или других связывающих молекул могут пролить свет на информацию о желательных эпитопах. Основываясь на этой информации, можно затем конкурентно скринировать связывающие молекулы для связывания с теми же или аналогичными эпитопами, например, путем проведения исследований конкуренции, чтобы найти связывающие молекулы, которые конкурируют за связывание с антигеном.
Термин «пептидный линкер» в настоящем документе означает любой пептид с возможностью соединения доменов с длиной в зависимости от доменов, которые он связывает между собой, содержащий любую аминокислотную последовательность . Предпочтительно пептидный линкер имеет длину более 5 аминокислот и состоит из любого набора аминокислот, выбранного из G, A, S, Р, Е, Т, D, К.
Термин «in vitro» относится к биологическому объекту, биологическому процессу или биологической реакции вне организма, смоделированному в искусственных условиях. Например, рост клеток in vitro должен пониматься как рост клеток в среде вне организма, например, в пробирке, культуральном флаконе или микропланшете.
Термин «1С50» (50% ингибирующая концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемая активность или отклик, например, рост или пролиферация клеток, таких как опухолевые клетки, ингибируется на 50%. Значение IC50 может оцениваться с помощью соответствующих кривых зависимости ответа от логарифма дозы, с использованием специальных статистических программ для обработки кривых .
Термин GI50 (50% ингибирование роста) относится к концентрациям препарата, при которых пролиферация клеток, таких как опухолевые клетки, ингибируется на 50%. Термин ED50 (ЕС50) (50% эффективная доза/концентрация) относится к концентрациям препарата, при которых измеряемый биологический эффект достигается на 50% (может включать цитотоксичность) . Термин «антипролиферативное действие» подразумевает остановку или ингибирование роста пролиферирующих клеток, таких как раковые клетки.
Понятие «эффекторная функция» антитела относится к видам биологической активности, связанным с Fc-областью (нативной последовательностью Fc-области или с вариантами аминокислотной последовательности Fc-области) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются: Clq- связывание; комплементзависимая цитотоксичность; связывание Fc- рецептора; антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) ; фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и В-клеточная активация .
«Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность» или «А СС» относится к опосредованному клетками ответу, при котором неспецифичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы Fc (FcR) (например, природные клетки-киллеры (NK) , нейтрофилы и макрофаги) , узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис или фагоцитоз клетки-мишени. Первичные клетки для опосредования ADCC, NK- клетки, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR на гематопоэтических клетках суммирована в таблице 3 на странице 464 в публикации Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) . Чтобы оценить активность в ADCC представляющей интерес молекулы можно осуществить анализы ADCC in vitro, такие как анализы, описанные в патентах США W 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и природные клетки- киллеры (NK) . Альтернативно или дополнительно ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценить in vivo, например, в животной модели, такой как модель, описанная в Clynes et al . PNAS (USA) 95: 652-656 (1998) .
«Эффекторными клетками человека» являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и осуществляют эффекторные функции. Предпочтительно клетки экспрессируют, по меньшей мере, FcyRIII и осуществляют ADCC-эффекторную функцию. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют ADCC, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) , природные клетки-киллеры (NK) , моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; при этом предпочтительны РВМС и NK-клетки. Эффекторные клетки могут быть выделены из их природного источника, например, из крови или РВМС, как описано в настоящей публикации .
Термины «Fc-рецептор» и «FcR» используют для описания рецептора, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR человека с нативной последовательностью. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает IgG-антитело (гамма-рецептор) , и к предпочтительным рецепторам относятся рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсируемые формы указанных рецепторов. Рецепторы FcyRII включают FcyRI IA («активирующий рецептор») и FcyRI IB («ингибирующий рецептор») , которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом своими цитоплазматическими доменами. Активирующий рецептор FcyRI IA содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив активации иммунорецептора (ITAM) . Ингибирующий рецептор FcyRI IB содержит в своем цитоплазматическом домене основанный на тирозине мотив ингибирования иммунорецептора (ITΊM) (см. обзор в аёгоп, Annu . Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). Обзор, посвященный FcR, представлен в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991) . Другие FcR, включая FcR, которые будут идентифицированы в будущем, включены в настоящем описании в термин «FcR». Термин также включает неонатальный рецептор, FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG в плод.
Термины «Комплемент-зависимая цитотоксичность» и «СБС» относятся к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (Clq) с молекулой (например, антителом) в комплексе со своим антигеном. Чтобы оценить активацию комплемента можно осуществить анализ СБС, например, как описано в Gazzano-Santoro et al . , J. Immunol. Methods 202: 163 (1996) .
Термин «идентичность» или «гомологичность» следует толковать как означающее процентное содержание остатков аминокислот в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам соответствующей последовательности, с которой ее сравнивают, после сравнения последовательностей и введения "брешей", если необходимо достичь максимального процента идентичности для полной последовательности и не учитывая любые консервативные замещения как часть идентичности последовательности. Ни N- или С-концевой удлиняющей, ни инсерционные сегменты не следует толковать как уменьшающие идентичность или гомологичность . Методы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны. Идентичность последовательности можно определить, используя программное обеспечение для анализа последовательности (например, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave . , Madison, WI 53705) . Данное программное обеспечение подходит для подобных последовательностей путем определения степени гомологичности для разнообразных замещений, делеций (элиминирований) и других модификаций .
Фразу «гомологичный», что касается полипептидной последовательности антитела, следует толковать как антитело, проявляющее по крайней мере, 70%-ную, предпочтительно 80%-ную, более предпочтительно 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%-ную идентичность последовательности относительно полипептидной последовательности. Термин в отношении последовательности нуклеиновой кислоты следует толковать как последовательность нуклеотидов, проявляющих, по крайней мере, 85%-ную, предпочтительно 90%-ную, более предпочтительно 95%-ную и наиболее предпочтительно 97%-ную идентичность последовательности относительно последовательности нуклеиновой кислоты.
Предлагается модификация (и) аминокислотных последовательностей антител, описанных в настоящей заявке. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела получают введением соответствующих изменений нуклеотидов в нуклеиновую кислоту антитела или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Осуществляют любое сочетание делеции, инсерции и замены, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками. Изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционные процессы в антителе, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования .
Вариант модификации аминокислотных последовательностей антител с помощью аминокислотных замен. Такой вариант представляет собой замену, по меньшей мере, одного аминокислотного остатка в молекуле антитела на другой остаток. Места, представляющие наибольший интерес для мутагенеза путем замен, включают гипервариабельные области или CDR, но также предполагаются изменения и в области FR или Fc . Консервативные замены показаны в таблице А под заголовком «предпочтительные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то могут быть введены дополнительные существенные изменения, названные «примерами заменам» в таблице А, или изменения, дополнительно описанные ниже при описании классов аминокислот, и может быть проведен скрининг продуктов .
Figure imgf000034_0001
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК. Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев) , или полученные путем химического синтеза.
Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью .
Выражение «контролирующие последовательности» относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в определенном организме- хозяине. Пригодные для прокариот контролирующие последовательности представляют собой, например, промотор, необязательно оператор и сайт связывания рибосомы. Как известно, в эукариотических клетках присутствуют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связывают с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде предпротеина, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; сайт связывания рибосомы функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что может облегчать трансляцию. Как правило, «функционально связан» обозначает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, а в случае секреторной лидерной последовательности являются смежными и находятся в фазе считывания. Однако энхансеры не обязательно должны быть смежными.
Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой плазмиду, т.е. кольцевую двухцепочечную часть ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации и эписомные векторы млекопитающих) . В других вариантах осуществления изобретения векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геном хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально соединены. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные экспрессирующие векторы» (или просто «экспрессирующие векторы») .
Термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка- хозяин») при использовании в данном документе означает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, которые могут включать, например, вектор в соответствии с настоящим изобретением, описанным выше. Настоящее изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые включают, например, нуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь или ее антигенсвязывающие части, нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь или ее антигенсвязывающие части, или обе из них, первого связывающего домена и/или второго связывающего домена связывающей молекулы по данному изобретению. Следует понимать, что «рекомбинантная клетка-хозяин» и «клетка-хозяин» означают не только конкретную заявленную клетку, но также и потомство такой клетки. Поскольку модификации могут проходить в последующих поколениях вследствие мутации или воздействий окружающей среды, такое потомство не может, на самом деле, быть идентичным родительской клетке, но такие клетки по-прежнему включены в объем термина «клетка-хозяин» при использовании в настоящем документе.
Термин «заболевание или нарушение, опосредованное HER2» подразумевает все заболевания или нарушения, которые либо прямо, либо косвенно связаны с HER2, включая этиологию, развитие, прогресс, персистентность или патологию заболевания или нарушения. «Лечить», «лечение» и «терапия» относятся к методу смягчения или устранения биологического расстройства и/или по меньшей мере одного из сопутствующих ему симптомов. Используемый в данном документе, термин «облегчить» болезнь, заболевание или состояние, означает уменьшение тяжести и/или частоты возникновения симптомов заболевания, расстройства или состояния. Кроме того, содержащиеся в данном документе ссылки на «лечение» включает ссылки на лечебную, паллиативную и профилактическую терапию.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.
Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения. Неограничивающие примеры подлежащих лечению заболеваний включают в себя доброкачественные и злокачественные опухоли, например, рак молочной железы, яичника, желудка, шейки матки, эндометрия, матки, слюнной железы, легкого, почки, толстой кишки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы, предстательной железы, кожи, головы и/или шеи, глотки, ротовой полости или мочевого пузыря. Предпочтительным подлежащим лечению нарушением согласно изобретению является рак, а именно, рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.
Термины «рак» или «раковый» относятся к физиологическому состоянию или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое, как правило, характеризуется нерегулируемым ( /-ой) ростом/пролиферацией клеток. Это определение охватывает доброкачественные и злокачественные раковые заболевания. Примеры раковых заболеваний включают, но без ограничения, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких раковых заболеваний включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночноклеточный рак, рак желудка, включая рак ЖКТ, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, цервикальный рак, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия и матки, карциному слюнных желез, рак почки (почечноклеточную карциному) , рак предстательной железы (рак простаты) , рак наружных женских половых органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному, карциному анального канала, карциному пениса, меланому и различные типы рака головы и шеи.
«Терапевтически эффективным количеством» считается количество вводимого в процессе лечения терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.
Понятие «хроническое» применение относится к непрерывному (продолжительному) применению агента (ов) в противоположность острому (кратковременному) пути введения, так чтобы поддерживать первоначальное терапевтическое действие (активность) в течение длительного периода времени.
«Прерывистое» применение обозначает лечение, которое не осуществляют последовательно без перерывов, но которое скорее по своей природе является периодическим.
В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.
Подробное описание изобретения
Антитело
Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, и включает:
1) первую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, и представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) трастузумаба с аминокислотной последовательностью
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADS VKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSG GGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK ( SEQ ID NO: 1);
2) вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGES IYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSS ( SEQ ID NO: 2), и вариабельный домен легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK ( SEQ ID NO: 6) ;
3) кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина ( Fc-фрагмент ) .
Вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGES IYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2), включает HCDR1-3:
HCDR1 : GFTFTDYTMD (SEQ ID NO: 3);
HCDR2 : DVNPNSGES IYNQRFKG (SEQ ID NO: 4);
HCDR3 : NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 5) . Вариабельный домен легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK ( SEQ ID NO: б), включает LCDR1-3 :
LCDR1 : KALQDVSRGVA ( SEQ ID NO: 7);
LCDR2 : SAHYRYT (SEQ ID NO: 8);
LCDR3 : QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 9) .
В некоторых вариантах биспецифическое антитело представляет собой антитело IgG.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело IgG относится к изотипу IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело относится к изотипу IgGl человека.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело включает кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина ( Fc-фрагмент ) , который содержит две аминокислотные последовательности второго и третьего константных доменов (СН2-СНЗ), представленные аминокислотной последовательностью
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 10) и аминокислотной последовательностью PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQV SLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11), соответственно.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело включает вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий:
а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый константный домен тяжелой цепи (CHI), с аминокислотной последовательностью EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGESIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNL NHKPSNTKVDKRV ( SEQ ID NO: 12);
б) вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13) .
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, состоящему из:
1) аминокислотной последовательности, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, включающей константные домены СН2 и СНЗ, и одноцепочечный вариабельного фрагмент (scFv) трастузумаба, с аминокислотной последовательностью
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRF TISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKASGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14);
2) тяжелой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый, второй и третий константные домены тяжелой цепи (СН1-СН2-СНЗ ) , с аминокислотной последовательностью EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGES IYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNL NHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ ID NO: 15) ;
3) легкой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC ( SEQ ID NO: 13),
где части 1)-3) соединены между собой дисульфидными мостиками.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело BCD147-02-020, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2. Биспецифическое антитело BCD147-02-020 представляет собой ассиметричное антитело, то есть включает 1) первую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, и представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) трастузумаба; и 2) вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab) . Биспецифическое антитело BCD147- 02-020 представляет собой бипаратопное антитело, то есть антитело, которое связывается с двумя паратопами, IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека.
В некоторых вариантах биспецифическое антитело представляет собой биспецифическое ассиметричное антитело BCD147-02-020, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека .
Биспецифическое антитело BCD147-02-020 состоит из:
1) аминокислотной последовательности, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, включающей константные домены СН2 и СНЗ, и одноцепочечный вариабельного фрагмент (scFv) трастузумаба, с аминокислотной последовательностью
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRF TISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKASGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14)- «Fc-knob - scFv-Trastuzumab»;
2) тяжелой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый, второй и третий константные домены тяжелой цепи (СН1-СН2-СНЗ ) , с аминокислотной последовательностью EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGES IYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNL NHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ ID NO: 15) - «НС-hole
- аНЕй2-кандидат 020-VH»;
3) легкой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC ( SEQ ID NO: 13)- «Ск - aHER2 -кандидат 020 VL»,
где части 1)-3) соединены между собой дисульфидными мостиками.
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 14, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, состоит из: 1) константного домена СН2 и СНЗ, с аминокислотной последовательностью
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ ID NO: 10);
2) одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) трастузумаба с аминокислотной последовательностью
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRF TISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSD IQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 1);
3) линкера с аминокислотной последовательностью ASGDKTHTCP.
Тяжелая цепь антитела (SEQ ID NO: 15), которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, состоит из :
1) вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и первого константного домена тяжелой цепи (CHI), с аминокислотной последовательностью EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGESIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNL NHKPSNTKVDKRV ( SEQ ID NO: 12), которая состоит из
a) вариабельного домена тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAWGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGESIYNQRFKGRF TLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGLGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2); и b) первого константного домена тяжелой цепи (CHI) с аминокислотной последовательностью
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNLNHKPSNTKVDKRV;
2) второго и третьего константных доменов тяжелой цепи (СН2 и
СНЗ), с аминокислотной последовательностью
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQV SLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11);
3) линкера с аминокислотной последовательностью EPKSCDKTHTCP . Легкая цепь антитела (SEQ ID NO: 13), которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, состоит из :
1) вариабельного домена легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKALQDVSRGVAWYQQKPGKAPKLLIYSAHYRYTGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK ( SEQ ID NO: б) ; и
2) константного домена легкой цепи (СК) с аминокислотной последовательностью RTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Молекулы нуклеиновых кислот
Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновых кислот, а именно к последовательностям, кодирующим биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, по данному изобретению, которые описаны в данном документе, необязательно включающим любую последовательность соединяющего их пептидного линкера .
Ссылка на нуклеотидную последовательность, охватывает его комплимент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать, как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Термин «полинуклеотид», упоминаемый в данном документе, означает полимерную форму нуклеотидов, по меньшей мере 10 оснований в длину, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Термин включает в себя одно- и двухцепочечные формы.
Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-15, или любой их комбинации .
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1-15. Молекула нуклеиновой кислоты может также содержать любую комбинацию указанных нуклеотидных последовательностей.
В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 1, 2 и б. В другом варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO: 1, 2, б, 10-11. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 1, 12 и 13. В одном варианте осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 1, 10-13.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13-15.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей любые комбинации вышеуказанных последовательностей нуклеиновых кислот. В любом из указанных выше вариантах осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот могут быть выделенными.
Молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может быть выделена из любого источника, который продуцирует биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. В определенных вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты данному изобретению может быть синтезирована, а не выделена.
В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VH домен из первого или второго домена антитела по данному изобретению, соединенного в рамках считывания с нуклеотидной последовательности, кодирующей константный домен тяжелой цепи из любого источника. Аналогичным образом, молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую VL домен из первой или второй области антитела по данному изобретению, объединеной в рамках считывания с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи из любого источника.
В еще одном аспекте настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой (VH) и/или легкой (VL) цепей первого или второго связывающего домена, могут «преобразовываться» по всей длине генов антитела. В одном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие домены VH или VL преобразуются в гены антитела по всей длине путем вставки в экспрессионный вектор, уже кодирующей константные домены тяжелой цепи (СН) или легкой цепи (CL) , соответственно, так что VH сегмент функционально соединен с СН сегментом ( -ами) в векторе и/или VL сегмент оперативно соединен с CL сегментом в векторе. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие VH и/или VL домены преобразуются в гены по всей длине антитела путем соединения, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей VH и/или VL домены, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей СН и/или CL домены с использованием стандартных молекулярно-биологических методов. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие по всей длине тяжелую и/или легкую цепи, могут затем экспрессироваться из клетки, в которую они были введены.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для экспрессии большого количества рекомбинантного биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для получения биспецифических антител, как описано в настоящем документе. Вектор
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору, подходящему для экспрессии любой из нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе.
Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из аминокислотных последовательностей биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, или их частей (например, последовательностей тяжелой цепи первого и/или тяжелой и/или легкой цепи второго связывающих доменов) как описано в настоящем документе. Настоящее изобретение далее относится к векторам, содержащим молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих биспецифическое антитело или его части.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению экспрессируются путем вставки ДНК, кодирующей частично или полностью последовательность первого и второго связывающего домена (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательности тяжелой и легкой цепи) , полученный, как описано выше, в экспрессионных векторах таким образом, что гены функционально соединены с необходимыми последовательностями, контролирующими экспрессию, такими как транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV) , вирусы растений, такие как вирус мозаики цветной капусты, вирусы табачной мозаики, космиды, YAC, EBV полученные эписомы и тому подобное. Молекулы ДНК могут быть лигированы в вектор таким образом, что последовательности, контролирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, выполняют предусмотренную функцию регуляции транскрипции и трансляции ДНК. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии могут быть выбраны таким образом, чтобы быть совместимыми с используемой экспрессирующей клеткой-хозяином. Молекулы ДНК, кодирующие частично или по всей длине последовательности первого и второго связывающих доменов (например, последовательности тяжелой и легкой цепи, где связывающий домен содержит последовательность тяжелой и легкой цепи) могут быть введены в отдельные векторы. В одном варианте осуществления изобретения любая комбинация указанных выше молекул ДНК вводится в тот же экспрессионный вектор. Молекулы ДНК могут быть введены в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если сайты рестрикции отсутствуют) .
Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально законченные последовательности СН или CL человеческого иммуноглобулина с конструированием соответствующего места рестрикции так, что любая последовательность VH или VL может быть легко включена и экспрессирована, как описано выше. НС - и LC-кодирование генов в таких векторах может содержать интронные последовательности, что приводит к общему увеличению белковых продуктов антитела путем стабилизации соответствующей мРНК. Интронные последовательности находятся в окружении сплайс-донора и сплайс-акцептора сайтов, которые определяют, где будет происходить сплайсинг РНК. Расположение интронных последовательностей может быть либо в вариабельных или константных участках цепей антитела, или как в вариабельных, так и константных участках, когда используются несколько интронов . Прекращение полиаденилирования и транскрипции может произойти вниз по ходу сайта нативной хромосомы кодируемых участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который облегчает выработку цепочки антитела клеткой-хозяином. Ген цепочки антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид соединен с рамкой считывания аминоконца цепи иммуноглобулина. Сигнальным пептидом может быть сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (то есть, сигнальный пептид белка не иммуноглобулиновой природы) .
Помимо цепочки генов антител, рекомбинантная экспрессия векторов по данному изобретению может нести регулирующие последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антител в клетке-хозяине . Специалистам в этой области будет понятно, что дизайн экспрессионного вектора, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов, как селекция клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Предпочтительные регулирующие последовательности для экспрессирующей клетки-хозяина млекопитающих включают вирусные элементы обеспечивающие высокий уровень экспрессии белков в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусной LTR, цитомегаловируса (CMV) (например, CMV промотора/энхансера), обезьяньего вируса 40 (SV40) (например, SV40 промотора/энхансера), аденовируса, (например, большого позднего промотора аденовируса (AdMLP) ) , вирус полиомы, а также сильных промоторов млекопитающих, таких как промотор нативных иммуноглобулинов или промотор актина. Для дальнейшего описания вирусных регулирующих элементов и их последовательностей см., например, патенты США 5,168,062, 4,510,245 and 4,968,615. Способы экспрессии связывающих молекул, таких как антитела растений, в том числе описание промоторов и векторов, а также трансформация растений, известны в данной области техники. См., например, патент США 6,517,529. Методы экспрессии полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной области техники.
В дополнение к генам цепи антитела и регулирующим последовательностям, рекомбинантные векторы экспрессии изобретения могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках- хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемого маркера. Ген селектируемого маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4,399,216, 4,634,665 и 5,179,017) . Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую вектор введен. Например, гены селектируемого маркера включают ген дигидрофолат редуктазы (DHFR) (для использования в dhfr-клетках-хозяевах при селекции/амплификации метотрексата), ген нео (для селекции G418) и ген синтетазы глутамата.
Термин «последовательность контроля экспрессии», используемый в данном описании, означает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для воздействия на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, к которым они лигированы. Контролирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сплайсинг и сигналы полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака) ; последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при желании, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Характер таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина; в прокариотах такие контролирующие последовательности, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы, а также последовательности терминации транскрипции; в эукариотах, как правило, такие контролирующие последовательности включают промоторы и последовательности терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» включает, как минимум, все компоненты, наличие которых имеет важное значение для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, чье присутствие является полезным, например, лидирующие последовательности и последовательности слившихся клеток.
Клетки-хозяева
Дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способам получения биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению. Один вариант осуществления изобретения относится к способу получения биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, как определено в настоящем документе, содержащему получение рекомбинантной клетки-хозяина, способной экспрессировать биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии продукции биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, и выделение данного антитела. Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, полученное такой экспрессией в таких рекомбинантных клетках-хозяевах упоминается в данном документе как «рекомбинантное биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека». Изобретение также относится к потомству клеток таких клеток-хозяев и биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, полученному аналогично.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по изобретению и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящего млекопитающего или его клетки, растения или его клетки, бактериальной или дрожжевой клетки-хозяина. Преобразование может происходить любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают декстран опосредованную трансфекцию, трансфекцию комплексом нуклеиновой кислоты и позитивно заряженного полимера, трансфекцию преципитатом нуклеиновой кислоты и фосфата кальция, полибрен опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, трансфекцию инкапсулированными в липосомы полинуклеотидами и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. В дополнение, молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в клетки млекопитающих вирусными векторами. Способы трансфекции клеток хорошо известны в данной области техники. См., например, патенты США, 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 и 4,959,455. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, Agrobacterium-опосредованную трансформацию, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Методы трансформации клеток бактерий и дрожжей также хорошо известны в данной области.
Клеточные линии млекопитающих, используемые в качестве хозяев для трансформации, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных доступных клеточных линий. К ним относятся, например, клетки яичников китайского хомячка (СНО) , NS0 клетки, клетки SP2, НЕК-293Т клетки, 293 Фристайл клетки ( Invitrogen) , NIH-3T3 клетки, клетки HeLa, клетки почек хомячка (ВНК) , клетки почек африканских зеленых мартышек (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2 ) , А549 клетки и ряд других клеточных линий. Клеточные линии выбираются путем определения, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и обеспечивают необходимые характеристики продуцируемого белка. Другими клеточными линиями, которые могут быть использованы, являются клеточные линии насекомых, такие как Sf9 или Sf21 клетки. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, вводятся в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение времени, достаточного для экспрессии антител в клетках-хозяевах или, предпочтительнее, выделения антител в питательную среду, в которой выращиваются клетки-хозяева. Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, может быть выделено из питательной среды с использованием стандартных методов очистки белка. Клетки-хозяева растений, например, включают Nicotiana, Arabidopsis, ряску, кукурузу, пшеницу, картофель и т.д. Клетки бактерий хозяина включают виды Escherichia и Streptomyces . Дрожжевые клетки-хозяева включают Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris.
Кроме того, уровень продукции биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению из продуцирующей клеточной линии можно усилить с помощью ряда известных методов. Например, система экспрессии гена глутамин синтетазы (система GS) является достаточно распространенной для усиления экспрессии при определенных условиях. Система GS обсуждается в целом или частично в связи с патентами ЕР 0216846, 0256055, 0323997 и 0338841.
Вполне вероятно, что биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, полученное из различных клеточных линий или трансгенных животных, будет отличаться друг от друга профилем гликозилирования . Однако биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, кодируемое молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данном документе, или содержащее аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе, является частью данного изобретения, независимо от состояния гликозилирования связывающих молекул и в целом, независимо от наличия или отсутствия пост-трансляционных модификаций.
Получение антител
Изобретение относится также к способам и процессам получения биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека.
Моноклональные антитела
Моноклональные антитела можно создавать, например, с помощью метода на основе гибридом, который впервые описан Kohler и др . , Nature,
256, 1975, с. 495, или с помощью методов рекомбинантной ДНК (US
4816567) . При использовании метода на основе гибридом, мышь или другое пригодное животное-хозяин, такое как хомячок, иммунизируют согласно описанной выше методике, для того, чтобы вызывать образование лимфоцитов, которые продуцируют или могут продуцировать антитела, обладающие способностью специфически связываться с белком, применяемым для иммунизации. Согласно другому варианту лимфоциты можно получать в результате иммунизации in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и затем сливают с клеточной линией миеломы с помощью приемлемого связывающего агента, такого как полиэтиленгликоль, с получением клетки гибридомы.
Полученные таким образом клетки гибридомы высевают и выращивают в пригодной культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, ингибирующих рост или выживание неслитых родительских клеток миеломы. Например, если родительские клетки миеломы не содержат фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT) , то культуральная среда для гибридом, как правило, должна включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (НАТ-среда) , т.е. вещества, которые препятствуют росту клеток с дефицитом HGPRT .
Предпочтительными применяемые в качестве компонента для слияния клетками миеломы являются клетки, которые легко поддаются слиянию, поддерживают стабильный высокий уровень производства антител выбранными продуцирующими антитела клетками и чувствительны к избирательной среде, на которой происходит отбор несвязанных родительских клеток. Предпочтительными линиями клеток миелом являются линии мышиной миеломы, такие как созданные на основе мышиных линий опухолевых клеток линии МОРС-21 и МРС-11, которые можно получать из Salk Institite Cell Disrtibution Center, Сан-Диего, шт . Калифорния, США, и линии SP-2 или ХбЗ- Ад8-653, которые можно получать из Американской коллекции типовых культур, Роквилл, шт . Мэриленд, США. Описано также применение линий клеток человеческой миеломы и гетеромиеломы типа «мышь -человек» для производства моноклональных антител (Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, с. 3001) .
Предпочтительно специфичность связывания моноклональных антител, полученных с использованием клеток гибридомы, определяют методом иммунопреципитации или с помощью анализа связывания in vitro, такого как радиоиммунный анализ (РИА) или твердофазный имммуноферментный анализ (ELISA) .
Аффинность связывания моноклонального антитела можно, например, определять с помощью Скэтчард-анализа, описанного у Munson и др . , Anal. Biochem., 107, 1980, с. 220.
После выявления клеток гибридомы, которые продуцируют антитела требуемой специфичности, аффинности и/или активности, клоны можно субклонировать с помощью метода лимитирующих разведений и выращивать стандартными методами. Пригодные для этой цели среды включают, например, среду DMEM или RPMI-1640. Кроме того, клетки гидрибомы можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей в организме животных, например, путем внутрибрюшинной (i.p.) инъекции клеток мышам.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделять от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью обычных методов очистки антител, например, аффинной хроматографией (например, с использованием протеин А- или протеин Q-сефарозы) , или ионообменной хроматографии, хроматографии на гидроксилапатитах, гель- электрофореза, диализа и т.д.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител) . В качестве предпочтительного источника такой ДНК служат клетки гибридомы. После выделения ДНК можно включать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки Е. coli, обезьяньи COS- клетки, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые без трансфекции не продуцируют белок антитела, что приводит к синтезу моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах .
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения моноклональные антитела или фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, созданных с помощью методов, описанных у McCafferty и др . , Nature, 348, 1990, сс. 552-554 . У Clackson и др . , Nature, 352, 1991, сс. 624- 628 и Marks и др . , J. Mol. Biol., 222,
1991, сс. 581-597 описано выделение мышиных и человеческих антител соответственно с помощью фаговых библиотек. В последующих публикациях было описано производство высокоаффинных (нМ-диапазон) человеческих антител с помощью перестановки цепи (Marks и др . , Bio/Technology, 10,
1992, сс. 779-783), а также комбинаторная инфекция и рекомбинация in vivo в качестве стратегии конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse и др . , Nucl . Acids. Res., 21, 1991, сс. 2265- 2266) . Таким образом, эти методы представляют собой реальную альтернативу традиционным методам выделения моноклональных антител на основе гибридом моноклональных антител.
ДНК, кодирующую антитело, можно также модифицировать, например таким образом, чтобы получать химерные или слитые полипептиды антител, например, путем замены последовательностей константных областей тяжелой и легкой цепи (Сн и CL) на гомологичные мышиные последовательности (US 4816567 и Morrison и др . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, 1984, с. 6851) или с помощью ковалентного связывания кодирующей последовательности иммуноглобулина со всей или с частью кодирующей последовательности полипептида, не относящегося к иммуноглобулинам (гетерологичного полипептида) . Не относящиеся к иммуноглобулинам полипептидные последовательности можно заменять на константные области антитела или заменять на вариабельные области антигенсвязывающего центра антитела, создавая химерное бивалентное антитело, которое содержит один антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении антигена, и другой антигенсвязывающий центр, обладающий специфичностью в отношении другого антигена.
Человеческие антитела и методика, основанная на применении фаговой дисплейной библиотеки
В настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей) , которые после иммунизации могут продуцировать полный спектр человеческих антител без производства эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция областей стыка гена тяжелой цепи антитела ( Дн-сегмента) в организме химерных мышей и мышей с мутацией в зародышевой линии приводит к полному ингибированию производства эндогенного антитела. Перенос набора зародышевой линии гена человеческого иммуноглобулина в такую мутантную зародышевую линию мышей приводит к производству человеческих антител после контрольного заражения антигеном (US 5545806, 5569825, 5591669 (все на имя фирмы GenPharm) ; 5545807; и WO 97/17852) .
В альтернативном варианте для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из спектра генов вариабельной области (V) иммуноглобулина из организма иммунизированных доноров можно использовать фаговую дисплейную технологию (McCafferty и др . , Nature, 348, 1990, сс. 552-553) . Согласно этой методике гены V-области антитела клонируют в рамке считывания либо с основным, либо с минорным геном оболочечного белка нитчатого бактериофага, такого как М13 или fd, и презентируют в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности фаговой частицы. Поскольку нитчатая частица содержит копию одноцепочечной ДНК фагового генома, селекции по признаку функциональных свойств антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитело, которое обладает указанными свойствами. Таким образом, фаг имитирует некоторые свойства В-клетки. Фаговую презентацию можно осуществлять в различных форматах. Для фаговой презентации можно использовать различные источники сегментов V-генов. Clackson и др . , Nature, 352, 1991, сс. 624-628 выделили различные наборы антител к оксазолону из небольшой произвольной комбинаторной библиотеки V-генов, полученной из селезенки иммунизированных мышей. Можно конструировать спектр V-генов, полученных из организма иммунизированных людей-доноров, и антитела к различному набору антигенов (включая аутоантигены) можно выделять в целом согласно методам, описанным у Marks и др . , J. Mol. Biol., 222, 1991, сс. 581- 597.
Как описано выше, человеческие антитела могут продуцироваться также in vitro активированными В-клетками (см. US 5567610 и 5229275) .
Биспецифические антитела
Биспецифические антитела представляют собой антитела, которые обладают специфичностью к связыванию с двумя различными эпитопами. Например, биспецифическое антитела, которое специфично связывается с двумя различными эпитопами белка, а именно с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. Биспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F ( ab ') 2-фрагментов биспецифических антител) .
Методы создания биспецифических антител известны в данной области. Общепринятое получение полноразмерных биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, где обе цепи имеют различную специфичность. Из-за случайного набора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, эти гибридомы (квадромы) потенциально могут продуцировать смесь из 10 различных молекул антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка правильной молекулы, которую обычно осуществляют в несколько стадий с помощью аффинной хроматографии, является довольно трудоемкой, а выход продукта - низким. Аналогичные процессы описаны в WO 93/08829.
Согласно другому подходу вариабельные области антитела с требуемой специфичностью связывания ( антигенсвязывающие центры антитела) сливают с последовательностями константной области иммуноглобулина. Слияние предпочтительно осуществляют с константной областью тяжелой цепи Ig, которая включает по меньшей мере часть шарнирных СН2- и СНЗ-областей . Предпочтительно, чтобы по меньшей мере в одном из слияний присутствовала первая константная область тяжелой цепи (СН1), содержащая сайт, необходимый для связывания легкой цепи. ДНК, кодирующие слияния тяжелой цепи иммуноглобулина и при необходимости легкой цепи иммуноглобулина, встраивают в различные экспрессионные векторы и ими совместно трансфектируют приемлемый организм-хозяин. Это обеспечивает большую гибкость в подборе общих пропорций трех полипептидных фрагментов в вариантах, когда в конструкции используют неравные соотношения трех полипептидных цепей с целью оптимизации выходов. Однако можно также встраивать кодирующие последовательности в две или во все три полипептидные цепи в одном экспрессионном векторе, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных пропорциях обеспечивает высокие выходы или когда соотношения не имеют решающего значения.
В предпочтительном варианте осуществления указанного подхода биспецифические антитела представляют собой гибрид тяжелой цепи иммуноглобулина, обеспечивающий первую специфичность связывания в первом плече, и гибрид пары тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина (что обеспечивает вторую специфичность связывания) во втором плече. Было обнаружено, что эта асимметричная структура облегчает отделение требуемой биспецифической молекулы от нежелательных комбинаций цепей иммуноглобулинов, поскольку присутствие легкой цепи иммуноглобулина только в одной половине биспецифической молекулы облегчает разделение. Этот подход описан в WO 94/04690. Дополнительное подробное описание получения биспецифических антител см., например, Suresh и др . , Methods in Enzymology, 121, 1986, с. 210. Согласно следующему подходу, описанному в патенте US 5731168, можно сконструировать область контакта между парой молекул антител с целью повышения до максимального уровня процентного содержания гетеродимеров, которые получают из культуры рекомбинантных клеток. Предпочтительная область контакта включает по меньшей мере часть СНЗ- области. Согласно этому методу одну или несколько небольших аминокислот с боковыми цепями из области контакта первой молекулы антитела заменяют на молекулы с более крупными боковыми цепями (например, на тирозин или триптофан) . Уравновешивающие «полости», идентичные или близкие по размеру большой (им) боковой (ым) цепи (ям) создают в области контакта второй молекулы антитела путем замены аминокислот с крупными боковыми цепями на аминокислоты с более мелкими боковыми цепями (например, на аланин или треонин) . Это обеспечивает механизм, способствующий повышению выхода гетеродимера относительно других нежелательных конечных продуктов.
Биспецифические антитела включают перекрестносшитые антитела или «гетероконъюгаты». Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть сшито с авидином, а другое с биотином. Такие антитела можно использовать, например, для направленного переноса клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (US 4676980) и для лечения ВИЧ-инфекции (WO 91/00360, WO 92/200373 и ЕР 03089) . Антитела-гетероконъюгаты можно создавать с помощью любого из обычных методов введения перекрестных сшивок. Приемлемые кросс-линкеры хорошо известны в данной области и описаны в US 4676980 наряду с различными методами введения перекрестных сшивок .
Методы получения биспецифических антител из фрагментов антител также описаны в литературе. Например, биспецифические антитела можно получать с помощью химического связывания. Brennan и др . , Science, 229, 1985, с. 81 описали методику, согласно которой интактные антитела подвергают протеолитическому расщеплению, получая F (ab ') 2-фрагменты. Эти фрагменты восстанавливают в присутствии агента, образующего комплексы с дитиолом, такого как арсенит натрия, для стабилизации соседних дитиолов и предупреждения образования межмолекулярных дисульфидных связей. Полученные Fab ' -фрагменты затем превращают в тионитробензоатное (TNB) производное. Одно из Fab ' -TNB-производных затем повторно превращают в Fab'-тиол путем восстановления меркаптоэтиламином и смешивают с эквимолярным количеством другого Fab ' -TNB-производного, получая биспецифическое антитело. Полученные биспецифические антитела можно применять в качестве агентов для избирательной иммобилизации ферментов.
Достигнутый в настоящее прогресс позволяет облегчать непосредственное выделение из Е. coli Fab ' -SH-фрагментов, которые можно химически сшивать с образованием биспецифических антител. Shalaby и др . , J. Exp . Med., 175, 1992, сс. 217-225 описали получение F ( ab ') 2-фрагмента молекулы полностью гуманизированного биспецифического антитела. Каждый Fab ' -фрагмент по отдельности секретировался из Е. coli и его подвергали непосредственному химическому связыванию in vitro с получением биспецифического антитела. Полученное таким образом биспецифическое антитело обладало способностью связываться с клетками, для которых характерна сверхэкспрессия рецептора ЕгЬВ2, и с обычными человеческими Т- клетками, а также стимулировать литическую активность человеческих цитотоксических лимфоцитов, мишенью которых является опухоль молочной железы человека.
Описаны также различные методы получения и выделения фрагментов биспецифических антител непосредственно из культуры рекомбинантных клеток. Например, биспецифические антитела получали с помощью лейциновых «застежек-молний» (Kostelny и др . , J. Immunol., 148(5), 1992, сс. 1547-1553) . Пептиды лейциновых «застежек-молний» из белков Fos и Jun связывали с Fab ' -фрагментами двух различных антител путем генного слияния. Гомодимеры антител восстанавливали в шарнирной области с получением мономеров, а затем путем повторного окисления получали гетеродимеры антител. Этот метод можно применять также для получения гомодимеров антител. Технология на основе «двойных антител», описанная Hollinger и др . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, сс. 6444-6448, представляет собой другой механизм получения фрагментов биспецифических антител. Фрагменты содержат VH-область, связанную с VL- областью линкером, который является слишком коротким, для того чтобы позволить произойти спариванию двух доменов одной и той же цепи. Таким образом, VH- и VL-области одного фрагмента должны спариваться с комплементарными VL- и VH-областями другого фрагмента, образуя тем самым два антигенсвязывающих центра. Описана также другая стратегия получения фрагментов биспецифических антител, основанная на применении одноцепочечных (Fv)- (sFv) димеров (см. Gruber и др . , J. Immunol, 152, 1994, с. 5368) .
Фармацевтическая композиция
Другим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента (или в качестве единственного активного ингредиента) биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. Фармацевтическая композиция может включать по меньшей мере одно биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, как описано в данном документе, и одну или более дополнительных связывающих молекул (например, антител) , которые нацелены на один или более соответствующих поверхностных рецепторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиции предназначены для улучшения, профилактики или лечения нарушений, которые могут быть связаны с HER2.
«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, согласно изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики) . Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы. Пролонгированное действие композиции может быть обеспечено с помощью агентов, замедляющих абсорбцию активного фармацевтического ингредиента, например, моностеарат алюминия и желатин. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, масла и инъекционные органические сложные эфиры.
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество или смесь веществ в виде фармацевтической композиции в виде таблеток, капсул, порошков, лиофилизатов, инъекций, инфузий, мазей и др . готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению.
Термин «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку.
Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.
Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение pH, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, проявлять устойчивость к изменениям pH. В общем случае, преимущественными являются значения pH фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Термины «тонический агент», «осмолитик» или «осмотический агент» в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата антитела. «Изотоничный» препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг . В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими.
Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно-активные вещества, например , полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен-полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner) , Плуроник (Pluronic) ) , натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) , диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА) , цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8 °С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению, как правило, пригодны для парентерального введения в виде стерильных лекарственных средств, предназначенных для введения в организм человека с нарушением целостности кожных покровов или слизистых оболочек, минуя желудочно-кишечный тракт путем инъекций, инфузий или имплантации. Например, предполагается, что парентеральное введение включает, помимо прочего, подкожную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутривенную, внутриартериальную, интратекальную, внутрижелудочковую, интрауретральную, внутричерепную, внутрисуставнную, трансдермальную инъекцию или инфузии; и почечные диализные инфузионные методики. Внутриопухолевая доставка, например, внутриопухолевая инъекция, также может быть применима. Также предусмотрена региональная перфузия. Предпочтительные варианты осуществления изобретения включают внутривенный и подкожный пути. Любой способ введения пептидов или белков, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению.
Инъекционные лекарственные средства могут быть изготовлены, упакованы или проданы в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах, флаконах, полимерных контейнерах, преднаполненных шприцах, устройствах для автоинжекции, но, не ограничиваясь ими. Лекарственные средства для парентерального введения включают, помимо прочего, суспензии, растворы, эмульсии в масляных или водных основах, пасты и тому подобное.
Еще одним вариантом осуществления изобретения является лекарственное средство для парентерального введения, где фармацевтическая композиция предоставлена в сухой форме, то есть, порошка или гранул для растворения в подходящем растворителе (например, стерильной апирогенной воде) перед введением. Такое лекарственное средство может быть получено, например, с помощью лиофилизации, т.е. процесса, известного в данной области техники как сушка из замороженного состояния, включающая в себя замораживание препарата и последующее удаление растворителя из замороженного содержимого .
Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению может также вводиться интраназально или ингаляционно, самостоятельно, в виде смеси с подходящим фармацевтически приемлемым наполнителем из ингалятора, такого как аэрозольный контейнер под давлением, помпа, спрей, распылитель) или небулайзер, в котором используется или не используется подходящий пропеллент, или в виде назальных капель или спрея.
Лекарственное средство для парентерального введения может быть немедленного или модифицированного высвобождения. Лекарственные средства с модифицированным высвобождением включают отсроченное, замедленное, пульсирующее , контролируемое , нацеленное и программируемое высвобождение .
Терапевтическое применение биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению
В одном аспекте биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению применяется в лечении заболеваний или нарушений, которые связаны с активностью HER2.
В одном аспекте субъект лечения или пациент является млекопитающим, предпочтительно человеческим субъектом. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола и любого возраста.
В случае опухоли (например, раковой опухоли) терапевтически эффективное количество биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, может уменьшать число раковых клеток; уменьшать начальный размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) инфильтрацию раковыми клетками периферических органов; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлять и, предпочтительно, прекращать) метастазирование опухоли; ингибировать, до некоторой степени, рост опухоли; и/или облегчать, до некоторой степени, один или более симптомов, обусловленных расстройством. Антитело или фрагмент антитела может, до некоторой степени, предупреждать рост и/или убивать имеющиеся раковые клетки, оно может вызывать цитостатический и/или цитотоксический эффект. При терапии рака эффективность in vivo можно определять, например, оценивая продолжительность жизни, время до прогрессирования заболевания (ТТР) , частоту ответа опухоли на лечение (RR) , продолжительность ответа и/или качество жизни.
Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относятся к биспецифическому антителу, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, сслылаются или включают :
1) одновременное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
2) одновременное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
3) последовательное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также
4) последовательное введение такой комбинации биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.
Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению может назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии. Кроме того, лечение биспецифическим антителом, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия) . В некоторых вариантах осуществления изобретения, биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, может вводиться совместно или быть сформулирована с другим медикаментом/препаратом для лечения рака.
Термин «цитотоксическое средство» в используемом в настоящем описании смысле относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает функционирование клеток и/или вызывает разрушение клеток. Подразумевается, что термин включает радиоактивные изотопы (например, At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32 и радиоактивные изотопы Lu) , химиотерапевтические средства и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины, имеющие происхождение из бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты. «Химиотерапевтическим средством» является химическое соединение, применимое для лечения злокачественной опухоли. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®) ; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилмеламин; ацетогенины (например, буллатацин и буллатацинон) ; дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL®) ; бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN®) , СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR®) , ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин) ; бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин) ; подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины (например, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, например, калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem. Inti. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также хромофор неокарциностатина и родственные хромофоры хромопротеинов - энедииновые антибиотики, аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин, доксорубицин (включая ADRIAMICIN®, морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2- пирролинодоксорубицин, доксорубициноНС1 в инъецируемых липосомах (DOXOL®) , липосомный доксорубицин TLC D-99 (MYOCET®) , пегилированный липосомный доксорубицин (CAELYX®) и дезоксидоксорубицин) , эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат, гемцитабин (GEMZAR®) , тегафур (UFTORAL®) , капецитабин (XELODA®) , эпотилон и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат ; аналоги пурина, такие как флударабин, 6- меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; средства, подавляющие функции надпочечников, такие как аминоглю е имид, митотан, трилостан; компенсатор фолиевой кислоты, такой как фолиновая кислота; ацеглатон; гликозид альдофосфамида; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазихон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2- этилгидразид ; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2 , 2 ' , 2»-трихлортриэтиламин; трихотецены (например, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин) ; уретан; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («ага-С») ; тиотепа; таксоид, например паклитаксел (TAXOL®) , препарат паклитаксела на основе сконструированных связанных с альбумином наночастиц (ABRAXANETM) и доцетаксел (TAXOTERE®) ; хлорамбуцил; б-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; средства на основе платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; алкалоиды барвинка, которые предотвращают полимеризацию тубулина из образующихся микротрубочек, включая винбластин (VELBAN®) , винкристин (ONCOVIN®) , виндезин (ELDISINE®, FILDESIN®) и винорелбин (NAVELBINE®) ; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; лейковорин; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO) ; ретиноиды, такие как ретиноевая кислота, включая бексаротен (TARGRETIN®) ; бифосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS® или OSTAC®) , этидронат (DIDROCAL®) , NE-58095, золедроновую кислоту/золедронат (ZOMETA®), алендронат (FOSAMAX®), памидронат (AREDIA®) , тилудронат (SKELID®) или ризендронат (ACTONEL®) ; троксацитабин ( 1 , 3-диоксолановый нуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, например олигонуклеотиды, которые ингибируют экспрессию генов в путях передачи сигналов, вовлеченных в пролиферацию аберрантных клеток, таких как, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R) ; вакцины, такие как вакцина THERATOPE® и вакцины для генной терапии, например вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® и вакцина VAXID®; ингибитор топоизомеразы 1 (например, LURTOTECAN®) ; rmRH (например, ABARELIX®) ; BAY439006 (сорафениб; Bayer) ; SU-11248 (Pfizer) ; перифосин, ингибитор ЦОГ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб) , ингибитор протеосом (например, PS341); бортезомиб (VELCADE®) ; CCI-779; типифарниб (811577); орафениб, АВТ510; ингибитор Вс1-2, такой как облимерсен натрия (GENASENSE®) ; пиксантрон; ингибиторы EGFR (см. определение ниже) ; ингибиторы тирозинкиназ (см. определение ниже) ; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств, такие как CHOP, сокращенное название комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, сокращенное название схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-FU и лейковорином.
Также в указанное определение включены противогормональные средства, которые действуют, регулируя или ингибируя действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены со смешанным профилем агонист/антагонист, включая тамоксифен (NOLVADEX®), 4- гидрокситамоксифен, триоксифен, торемифен (FARESTON®); идоксифен, дролоксифен, ралоксифен (EVISTA®) , триоксифен, кеоксифен и избирательные модуляторы рецепторов эстрогена (SERM) , такие как SERM3; чистые антиэстрогены без агонистических свойств, такие как фулвестрант (FASLODEX®) и ЕМ800 (такие средства могут блокировать димеризацию рецепторов эстрогена (ER) , ингибировать связывание ДНК, усиливать метаболизм ER и/или снижать уровни ER) ; ингибиторы ароматазы, включая стероидные ингибиторы ароматазы, такие как форместан и эксеместан (AROMAS IN®) , и нестероидные ингибиторы ароматазы, такие как анастразол (ARIMIDEX®) , летрозол (FEMARA®) и аминоглутетимид и другие ингибиторы ароматазы, включая ворозол (RIVISOR®) , ацетат мегестрола (MEGASE®) , фадрозол, имидазол; агонисты рилизинг-гормона лютеинизирующего гормона, включая лейпролид (LUPRON® и ELIGARD®) , гозерелин, бузерелин и триптерелин; половые стероиды, включая прогестины, такие как ацетат мегестрола и ацетат медроксипрогестерона, эстрогены, такие как диэтилстилбестрол и премарин и андрогены/ретиноиды, такие как флуоксиместерон, полностью трансретиноевая кислота и фенретинид; онапристон; антипрогестероны; понижающие регуляторы рецепторов эстрогенов (ERD) ; антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид и бикалутамид; тестолактон; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше средств; а также сочетания двух или более указанных выше средств.
Дозы и пути введения
Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению будут вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных препаратов или методов лечения.
Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (Ь) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.
Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, так же как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения .
Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.
Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.
Предполагается, что подходящая доза биспецифического антитела, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1- 200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1-20 мг/кг. Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, может быть введено, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере 5 мг/кг; и например вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.
Изделие (продукты) и наборы
Следующим вариантом осуществления изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения рака, выбранного из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи. Изделие представляет собой контейнер с этикеткой и листовкой-вкладышем, которые могут быть размещены в блистере и/или пачке. Приемлемыми контейнерами являются, например флаконы, ампулы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или полимерные материалы. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения определенного состояния, и может иметь стерильный входной канал) . По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, предлагаемое в изобретении. На этикетке и листовке-вкладыше в упаковке указано, что лекарственное средство применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка и/или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно должны содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту, в том числе информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном из вариантов осуществления изобретения на листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, а именно рака, выбранного из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.
Кроме того, изделие может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, например, растворители, разбавители, фильтры, иглы и шприцы, но не ограничиваясь ими .
Диагностическое использование и композиции
Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, по настоящему изобретению также используются в диагностических целях (например, in vitro, ex vivo) . Например, данное биспецифическое антитело может использоваться для обнаружения или измерения уровня HER2 в образцах, полученных от пациента, например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, сыворотка крови, жидкость кишечника, слюна или моча. Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) , хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы, например, диагностические наборы, содержащие биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II субдоменами внеклеточного домена HER2 человека, описанные в данном документе.
Примеры
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме .
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Материалы и общие методы
Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у: Rabat Е.А. и др . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- oe изд . , изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител пронумерованы согласно нумерации EU (Edelman G.M. и др . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, ее. 78- 85; Rabat Е.А. и др . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) .
Методы рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др . , Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей .
Синтез генов
Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 4000 т.п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.
Определение последовательностей ДНК
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сенгеру .
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях
Применяли пакет программ фирмы Infomax's Vector NT1 Advance suite, версия 8.0 для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей. Экспрессионные векторы
Для экспрессии описанных антител и антигенов применяли варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для экспрессии в клетках прокариот (E.coli) кратковременной экспрессии в клетках эукариот (например, в клетках СНО) . Помимо кассеты экспрессии антитела векторы содержали: сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в E.coli, гены, придающие устойчивость в E.coli к различным антибиотикам (например, к ампициллину и канамицину) .
Слияние генов, содержащих описанные цепи антитела, как указано ниже, осуществляли с помощью ПЦР и/или синтеза и сборки генов с использованием известных методов и процедур рекомбинации путем соединения соответствующих сегментов нуклеиновых кислот, например, с использованием уникальных сайтов рестрикции в соответствующих векторах. Субклонированные нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием ДНК. Для кратковременных трансфекций создавали большие количества плазмид посредством получения плазмид из трансформированных культур Е. coli.
Пример 1
Продукция рекомбинантных антигенов и контрольных антител в суспензионной культуре клеток млекопитающих
Последовательности экстраклеточного домена Нег2 человека и животных Нег2 были синтезированы и клонированы в вектор для наработки белка в клетках млекопитающих с тагом Fc (фиг. 1) по сайтам рестрикции Sall/Notl .
В качестве контроля использовали антитела с опубликованной последовательностью Pertuzumab, Trastuzumab. Гены вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антител были синтезированы и клонированы в вектора рЕЕ-НС, рЕЕ-СК (фиг. 2, 3, 4), предназначенною для наработки белка в клетках млекопитающих, по сайтам рестрикции Sall/Nhel и Sall/BstWI соответственно.
Плазмиды нарабатывали в необходимых количествах в клетках E.coli и очищали при помощи набора Qiagen.
Антигены и контрольные антитела продуцировали в клетках постоянной клеточной линии, полученной из клеток яичника китайского хомячка (линия СНО-Т) . Суспензионное культивирование осуществляли в колбах на орбитальном шейкере-инкубаторе, с использованием бессывороточных сред производства компании HyCell TransFx-C с добавлением 8 мМ L-глутамина и 1 г/л плюроника 68. Для транзиентной экспрессии клетки в концентрации 2-2,2*106 кл/мл трансфецировали с помощью линейного полиэтиленимина (ПЭИ «МАХ», компания «Polysciences») . Соотношение ДНК/ПЭИ составляло 1:3/1:10. Через 9 дней после трансфекции культуральную жидкость отделяли от клеток фильтрацией через глубинный фильтр с размером пор 0,5/0,22 мкм. Целевые белки выделяли из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии . Рекомбинантные белки с Fc из куль уральной жидкости выделяли и очищали, используя колонку для аффинной хроматографии протеин А. Осветленную культуральную жидкость пропускали через колонку HiTrap rProtein A Sepharose FF объемом 5 мл (GE Healthcare) , уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,4) . Затем колонку промывали 5 колоночными объемами ФСБ, чтобы вымыть неспецифически связывающие компоненты. Связанный антиген элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер pH 3. Главный протеиновый пик элюции собирали и доводили его pH до нейтральности с помощью 1 М буфера Tris (pH 8) . Все стадии проводили при скорости потока 110 см/ч. Далее белок переводили в ФСБ (pH 7,4) с помощью диализа, используя технологию SnakeSkin Dialysis Tubing, фильтровали (0,22 мкм) , переносили в пробирки и хранили при -70°С.
Чистоту полученного раствора белка оценивали с помощью SDS-гель- электрофореза в редуцирующих и нередуцирующих условиях.
Пример 2
Создание синтетических оптимизированных комбинаторных библиотек Fab-фрагментов
Для создания мутантных антител, специфичных против Нег2 был проведен структурный анализ отобранных природный байндеров на основе 3D моделирования с использованием программных пакетов Schrodinger Suite компании Schrodinger и пакета YLab компании БИОКАД. В качестве кристаллической структуры мишени была выбрана PDB 1S78, включающая в себя структуру мишени и контрольного антитела pertuzumab, обладающего схожим эпитопом связывания. Гомологичный фолдинг природных байндеров осуществлялся с помощью инструментов BioLuminate (часть пакета Schrodinger Suite компании Schrodinger) и BENDER (часть пакета YLab компании БИОКАД) . Получение модели взаимодействующего комплекса осуществлялся с помощью инструмента белок-белкового докинга HEDGE (часть пакета YLab компании БИОКАД) . Выбор оптимальных поз был проведен с помощью оценки усредненной энергии связывания на 50 наносекундном интервале молекулярной динамики (инструмент Desmond, часть пакета Schrodinger Suite) с помощью метода MM-GBSA (с силовым полем OPLS_2005) для фреймов динамики, взятых на различных интервалах симуляции. Визуализация полученной структуры создана с помощью инструмента PyMOL компании Schrodinger.
С помощью пакета YLab были определены и исправлены потенциальные сайты пост-трансляционных модификаций, а также предложены точки замен, повышающие гуманизацию предложенных последовательностей и потенциально повышающих связывание. Оценка точек проводилась с помощью структурных замен аминокислот в выбранных позициях и оценки изменения энергии связывания с помощью вычисления методом MM-GBSA (с силовым полем OPLS_2005) . Дизайн олигонуклеотидов для синтеза был осуществлен пакетом OligoDesigner (часть пакета YLab компании БИОКАД) .
Библиотека содержала 335 различных Fab-кандидатов: 1) 135 кандидатов в сете с отбором по аффинности (до 10 замен в б CDR) ; 2) 211 кандидатов в сете с отбором по стабильности (по 1 мутации в каждом CDR из набора) , скомбинированных из 196 различных тяжелых цепей и 37 легких цепей (фиг. 5-8) .
Гены Fab антител были синтезированы с использованием вырожденных олигонуклеотидов и клонированы в вектор pBL, предназначенный для наработки Fab-фрагментов в клетках Е. coli, по сайтам Ncol, Nhel (фиг. 9) .
Пример 3
Отбор высокоаффинных клонов из синтетической библиотеки, специфически связывающих Нег2 человека
Наработку Fab проводили по стандартной методике: бактериальные клетки Е. coli B121Gold трансформировали экспрессионными векторами, содержащими гены Fab, а последующее добавление индуктора, запускало транскрипцию 1ас-оперона, что при культивировании полученных трансформантов вызывало экспрессию Fab, которые экспортировались в периплазматическое пространство клеток. Далее проводили ИФА для проверки связывания Fab с иммобилизованным на подложке антигеном Нег2- Fc в концентрации 0,2 мкг/мл на планшетах (medium binding от Greiner bio one) в 0.1 M аНСОз, pH 9.0 (антиген иммобилизовали в течении ночи при 4°С) . В качестве положительного контроля использовали Fab контрольного антитела Pertuzumab (Roche) . Все последующие этапы проводили при комнатной температуре по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan) . После каждого этапа проводили отмывку 300 мкл на лунку 1х ФСБТ в трех повторностях. Проводили блокирования неспецифических участков связывания на планшете 1% обезжиренным молоком в 1х ФСБТ, после отмывки происходило связывание с аналитом, в качестве которого выступали супернатанты клеток Е. coli в обьеме 60 мкл на лунку. Детекция иммунных комплексов осуществлялась при помощи козьих анти-Fab антител, коньтированных с пероксидазой (от Pierce- ThermoScientific) в разведении 1:7500. Окрашивание субстрат- хромогенной смеси проводили добавлением субстратного раствора (Н2О2- 0,02% и ТМБ в CHsCOONa рН5.5) в объёме 50 мкл на 15 минут. Остановку реакции осуществили 25 мкл H2S04 1%. Цветовой сигнал измеряли при длине волны 450 нм, используя подходящий планшет-ридер Tecan-Sunrise (от Tecan) . Степень связывания антитела была пропорциональна интенсивности цветового сигнала. Клоны, у которых интенсивность цветового сигнала превышала сигнал от контрольного антитела, проверяли в ИФА на неспецифическое связывание.
В результате было отобрано 348 клонов для дальнейшего анализа. Пример 4
Анализ неспецифического связывания отобранных Fab с другими антигенами
ИФА использовали также для анализа неспецифического связывания исследуемых Fab-фрагментов с другими антигенами. Исследование проводили, как описано выше, но в качестве антигенов для иммобилизации использовали Angiopoetin2-H6F, Cmet-Fc, GM-CSFl-Fc, INF 2b в 0.1 M ИаНСОЗ, pH 9.0 (антиген иммобилизовали в течении ночи при 4°С) . В качестве контроля специфического связывания использовали Her2-Fc (антиген иммобилизовали в течении ночи при 4°С) . Все последующие этапы проводили по стандартному протоколу ИФА с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы на базе роботизированных систем Genetix Qpix2xt (от Molecular Device) и Tecan Freedom EVO 200 (от Tecan) . Клоны, у которых значение оптической плотности в контрольных лунках (неспецифическое связывание) не превышало значения оптической плотности отрицательного контроля, проверяли в конкурентном ИФА анализе для выявления Fab, блокирующих взаимодействие контрольного антитела Pertuzumab в формате IgG с антигеном Her2-Fc.
Последовательности вариабельных доменов позитивных клонов секвенировали согласно стандартным протоколам и анализировали.
Пример 5
Отбор высокоаффинных Fab фрагментов по скорости диссоциации
Off-rate скрининг проводили с использованием прибора Pall Forte Bio Octet Red 394. Анти FAB2G CHl-биосенсоры в течение 30 минут регидратировали в рабочем буфере, содержащем 10 мМ ФСБ, pH 7.2-7.4, 0.1% Твин-20, 0,1% БСА. В исследуемые образцы супернатантов Е. coli добавляли рабочий буфер до конечной концентрации 10%. Затем анти и FABCHl-биосенсоры погружали в супернатанты Е. coli, содержащие Fab- фрагменты кандидатов антител, на 12 часов при 4°С. Сенсоры с иммобилизованными на поверхности Fab-фрагментами переносили в лунки с рабочим буфером, где прописывали базовую линию (60 с.) . Далее сенсоры переносили в лунки с раствором аналита (Her2-Fc, 30 мкг/мл) для ассоциации комплекса антиген-антитело (300 с.) . Затем сенсоры возвращали в лунки, содержащие рабочий буфер, для последующей стадии диссоциации (600 с.) . После каждого эксперимента использованные сенсоры регенерировали путем трехкратного помещения их в буфер для регенерации (10 мМ Gly-HCl, pH 1,7) после чего использовали в следующем эксперименте. Анализ полученных кривых проводили с помощью программного обеспечения Octet Data Analysis (версия 8.2) согласно стандартной процедуре по модели взаимодействия 1:1 Local. Восемь клонов, показавших взаимодействие с антигеном представлены в приложении (Фиг.10) . Пример 6
Получение полноразмерных антител в формате IgGl и биспецифических антител в формате асимметрии
Для полученных 8 кандидатов (Пример 5) с помощью инструмента OligoDesigner программного пакета YLab (Биокад) была проведена кодон- оптимизация для СНО (по 2 кодон-оптимизации для каждого клона) . Оптимизированные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей были синтезированы de novo и клонированы в вектора рЕЕ- НС, рЕЕ-СК (формат IgGl) или в вектора рЕЕ-HChole, рЕЕ-СК (для формата асимметрии) по сайтам рестрикции Sall/Nhel и Sall/BsiWl соответственно .
Схематическое изображение формата асимметрии изображено на фиг. 11. Данный формат представляет собой антитело, в котором в константных доменах тяжелых цепей внесены мутации (hole=Y352C, T369S, L371A, Y419V; knob=S390C, T402W) , обеспечивающие образование гетеродимера. Тяжелая цепь, содержащая выпуклость (knob) содержит следующие домены: Trastuzumab в формате scFv, гибкий линкер, Fc-knob (Фиг. 12) . Тяжелая цепь, содержащая впадину (hole), состоит из доменов: VH оптимизированных кандидатов, СН1, шарнирная область IgGl, Fc-hole. В пару к тяжелой цепи с hole нарабатывалась также легкая цепь, содержащая домены VL оптимизированных кандидатов, и домен СК.
Полученными генетическими конструкциями трансформировали клеточную линию СНО-Т-НС. Белки выделяли и очищали по стандартной методике путем аффинной хроматографии на бактериальном белке Protein А как описано в примере 1. Электрофорез проводили в денатурирующих условиях в 7,5% ПААГ (Фиг.13, 14, 15, 16) . Продуктивность кандидатов BCD147-02-004 , -006, -011, -015, -016, -018, -025 оказалась ниже порогового уровня (50 мг/л) , и соответственно они не брались на выделение и очистку.
Пример 7
Определение аффинности полноразмерных антител на Forte Bio Octert RED 384
Эксперименты по исследованию аффинности связывания антител к антигену Нег2 человека проводили на приборе Forte Bio Octert RED 384. Her2-Fc человека в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30 °С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором антител в концентрации в 10 раз превышающей предполагаемую константу диссоциации на 600 секунд, где происходит ассоциация комплекса. Затем детектировали диссоциацию комплекса в буферном растворе в течении 600 секунд.
Кривые связывания с вычетом базового сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.2) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1. Анти-Нег2 антитела специфически и с высокой аффинностью связываются с антигеном человека с константами, представленными на Фиг.17.
Пример 8.1
Определение эпитопной специфичности кандидатов
Эксперименты по исследованию эпитопной специфичности антител к антигену Нег2 человека проводили на приборе Forte Bio Octert RED 384 в форматах «Ip-tandem» и «Sandwich».
Формат «Ip-tandem» - конкуренция с Trastuzumab: Her2-Fc человека в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30 °С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором контрольных антител Trastuzumab в концентрации 60 мкг/мл где происходит ассоциация. Затем, после насыщения антигена, погружали в раствор с анализируемыми образцами в концентрации 15 мкг/мл. Все кандидаты показывали связывание с антигеном за эпитоп, отличный от эпитопа Trastuzumab (фиг 18.) .
Формат «Ip-tandem» - конкуренция с Pertuzumab: Her2-Fc человека в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30 °С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором контрольных антител Pertuzumab в концентрации 60 мкг/мл, где происходит ассоциация. Затем, после насыщения антигена, сенсоры погружали в раствор с анализируемыми образцами в концентрации 15 мкг/мл. Все кандидаты показывали связывание с антигеном за эпитоп, отличный от эпитопа Pertuzumab (фиг. 19) .
Формат «Sandwich»: Trastuzumab в концентрации 30 мкг/мл иммобилизовали на поверхности аминореактивных сенсоров второго поколения (ForteBio, AR2G) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя для подготовки и иммобилизации AR2G сенсоров. Анализ проводили при 30°С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин- 20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с Нег2- Fc человека в концентрации 15 мкг/мл. Затем сенсоры погружали в лунки с раствором Pertuzumab в концентрации 30 мкг/мл. Затем сенсоры погружали в лунки с анализируемыми образцами в концентрации 30 мкг/мл. Все кандидаты не показывали связывания с антигеном за эпитопы, отличные от эпитопа Pertuzumab и Trastuzumab (фиг.20) .
Пример 8.2
Анализ неспецифического связывания антител к нецелевым антигенам
Эксперименты по исследованию неспецифического связывания антител к нецелевым антигенам человека проводили на приборе Forte Bio Octert RED 384.
Сенсоры anti-human Fc (ForteBio, AHC) погружали в раствор с антителами в концентрации 30 мкг/мл на 300 секунд для их иммобилизации. Затем сенсоры с загруженным антителом погружали в лунки с растворами нецелевых антигенов в концентрации 30 мкг/мл на 150 с. Затем детектировали диссоциацию комплекса в течении 150 секунд.
Затем другие, незагруженные антителами, АНС сенсоры погружали в лунки с растворами нецелевых антигенов с аналогичными параметрами, как описано ранее, для считывания референсного сигнала. При обработке данных референсный сигнал вычитался из сигнала, полученного с сенсоров с иммобилизованными антителами.
Анализ проводили при 30°С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. В панель неспецифических антигенов входят: Ang2, IL23, GMCSF Fe, IL6R, IL5R, IL4R, DLL4 , PDL1, LAG3 , FGF2 , НегЗ, CD3 ED, CD137, PCSK9 , PD1. Данные антигены не содержат Fc-тага.
Кривые связывания с вычетом референсного сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 8.2) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1. Кандидаты BCD147-02-002 , -007, -008, -009, -012, -013, -014, -017, - 019, -021, -022, -026, -030, -033, -034, -035 продемонстрировали связывание с нецелевыми антигенами, и в дальнейшую работу не брались.
Пример 9
Получение клеточной линии, стабильно продуцирующей биспецифические антитела в формате асиммерик
По результатам всех вышеперечисленных тестов лучше всего показал себя кандидат BCD147-02-020. Последовательности его тяжелой и легкой цепи, а также последовательность Trastuzumab в формате scFv были клонированы в вектора pSX по сайтам Hindlll, Xbal . Полученные плазмиды нарабатывали в клетках Е. coli и выделяли с помощью прибора BenchPro в количестве 600-700 мкг . Плазмиды линеаризовали в течение ночи с помощью эндонуклеазы Pvul, затем переосаждали этанолом и доводили конечную концентрацию до 900-1100 нг/мкл.
Клеточную линию CHO-K1-S культивировали в среде S.3.87 ММ (синтетическая среда, разработанная в «БИОКАД» без содержания FBS) + 6 mM Glutamine. Трансфекцию генетическими конструкциями, содержащими кодирующие последовательности цепей кандидата BCD147-02-020, проводили с помощью электропорации на приборе Nucleofector™ (Lonza) согласно протоколу производителя.
На следующий день после трансфекции в течение 24 дней проводилась селекция трансфецированной культуры добавлением в среду пуромицина (конечная концентрация 7,2 мкг/мл) , гигромицина Б (конечная концентрация 640 мкг/мл) и бластицидина (конечная концентрация 2,62 мкг/мл) . Полученная после селекции популяция клеток была клонирована. Клеточный клон, экспрессирующий BCD147-02-020, был выбран на основе результатов анализа уровня целевого белка и гомогенности его структуры, с учетом скорости роста, гомогенности популяции и отсутствия морфологических изменений.
Пример 10
Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и моноклональных антител трастузумаб, пертузумаб, а также смеси трастузумаб и пертузумаб в антипролиферативном тесте на культуре клеток ВТ-474
Для анализа антипролиферативной активности использовали клеточную линию рака молочной железы ВТ-474 с гиперэкспрессией рецептора HER2 (линия HER2+++) .
Клетки культивировали в среде DMEM/F12 с 2 мМ глутамином, 10% FBS (фетальной бычьей сывороткой), 10 мкг/мл инсулина при 37°С, 5% С02. Клетки снимали с поверхности культуральных флаконов с помощью трипсина. Жизнеспособность и количество клеток оценивали с использованием красителя трипановый синий. Готовили суспензию клеток в среде DMEM/F12 с 2 мМ глутамином, 10% FBS, 10 мкг/мл антибиотика гентамицина с плотностью 1 * 105 клеток/мл. В лунки 96-луночного планшета вносили по 100 мкл полученной клеточной суспензии, инкубировали планшет 1 час при 37 °С и 5% СОг. Готовили серию разведений антител трастузумаб, пертузумаб, смесь трастузумаб и пертузумаб и BCD147-02- 020 от концентрации 100 мкг/мл, вносили в планшет с клетками по 10 мкл на лунку планшета. Для приготовления смеси трастузумаб и пертузумаб смешивали в соотношении 1:1 двукратные растворы каждого из антител. Планшет инкубировали в течение 5 суток при 37 °С, 5% СОг. После окончания времени инкубации проводили анализ жизнеспособности клеток с помощью красителя Аламар синий ( alamarBlue®) . Вносили по 11 мкл красителя в лунки планшета, инкубировали планшет при 37 °С, 5% СОг до развития градиентной окраски. Оценивали уровень флюоресценции с помощью планшетного детектора Infinite М200Рго при длине волны возбуждения/испускания 544/590 нм. Построение кривых зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации белка проводили с помощью программного обеспечения Magellan ver. 7.2, использовали модель 4-х- параметровой кривой с оптимизацией коэффициентов по алгоритму Levenberg-Marquardt . Уровень ингибирования пролиферации при максимальной концентрации кандидата BCD147-02-020 в 1,43 раза превышает смесь моноклональных антител трастузумаб и пертузумаб.
Результаты показаны на фиг. 22.
Пример 11
Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и моноклональных антител трастузумаб, пертузумаб, а также смеси трастузумаб и пертузумаб в антипролиферативном тесте с внесением hrEGF на культуре клеток ВТ-474
Оценку антипролиферативной активности с внесением человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста (hrEGF) проводили как описано в Примере 10, за исключением следующего: суспензию клеток готовили в среде DMEM/F12 с 2 мМ глутамином, 1% FBS, 10 мкг/мл антибиотика гентамицина с плотностью 2*105 клеток/мл. Вносили в лунки планшета по 50 мкл клеточной суспензии. Вносили по 50 мкл раствора hrEGF, получали конечную концентрацию hrEGF 1 нМ. Серию разведений антител готовили от концентрации 500 мкг/мл.
Уровень ингибирования пролиферации при максимальной концентрации кандидата BCD147-02-020 в 1,44 раза превышает смесь моноклональных антител трастузумаб и пертузумаб.
Результаты показаны на фиг. 23.
Пример 12
Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и моноклональных антител трастузумаб и смеси трастузумаб и пертузумаб в антипролиферативном тесте на культуре клеток ВТ-474 Clone 5
Антипролиферативный анализ на клетках ВТ-474 Clone 5, устойчивых к трастузумабу в пролиферативных тестах, проводили как описано в Примере 10.
Для кандидата BCD147-02-020 отношение максимального уровня ингибирования пролиферации к точке 0, составило 1,5 раза. Кандидат BCD147-02-020, в отличие от антител трастузумаб и смеси трастузумаб и пертузумаб, оказывает антипролиферативный эффект на клеточную линию, устойчивую к трастузумабу в пролиферативных тестах.
Результаты показаны на фиг. 24.
Пример 13
Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и смеси моноклональных антител трастузумаб и пертузумаб в анализе антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) на клеточной линии ВТ-474 с использованием репортерных клеточных линий Jurkat ADCC Reporter High и Jurkat ADCC Reporter Low
Анализ ADCC проводили с использованием в качестве клеток- эффекторов репортерных линий Jurkat, стабильно экспрессирующих на своей поверхности FcyRIIIa (CD16a) рецептор и несущих ген, кодирующий люциферазу, экспрессирующийся в ответ на активацию NFAT-пути, которая в свою очередь происходит после взаимодействия FcyRIIIa рецептора с Fc-частью антитела, при условии связывания антитела с антигеном на поверхности клеток-таргетов . В анализе использовали 2 репортерные клеточные линии Jurkat, стабильно экспрессирующие FcyRIIIa рецептор, вариант V158 (с высокой афинностью к Fc - Jurkat Reporter ADCC High) и стабильно экспрессирующие FcyRIIIa рецептор, вариант F158 (с низкой афинностью к Fc - Jurkat Reporter ADCC Low) .
Суспензию клеточной линии ВТ-474 в среде flMEM/F12, 2 мМ глутамином, 10% FBS с концентрацией 5*104 клеток/мл, вносили в 96- луночные планшеты с белыми стенками по 100 мкл на лунку. Планшеты с клетками инкубировали ночь при 37 °С, 5% СОг. Клеточные линии Jurkat Reporter ADCC High и Jurkat Reporter ADCC Low переводили в среду RPMI- 1640, 2 мМ глутамином, 10% FBS, с плотностью клеточной суспензии 1 * 106 клеток/мл. Селективные антибиотики не добавляли. Также, инкубировали ночь при 37 °С, 5% СОг.
По окончании времени инкубации из лунок с клетками ВТ-474 отбирали супернатант и вносили по 40 мкл приготовленных серий разведений антител BCD147-02-020 и смеси трастузумаб и пертузумаб в среде RPMI-1640, 2 мМ глутамином, 4% FBS ultra-low IgG. Вносили по 40 мкл клеточной суспензии Jurkat Reporter ADCC High или Jurkat Reporter ADCC Low c концентрацией 1,875*106 клеток/мл. Планшеты инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 5 часов. Вносили по 80 мкл субстрата для люциферазы Bio- Glo (Promega) , проводили измерение люминесценции с использованием Infinite М200Рго при времени инкубации 8 мин, считывании люминесценции при времени интеграции 100 ms. Построение кривых зависимости интенсивности люминесценции от концентрации белка проводили с помощью программного обеспечения Magellan ver. 7.2, использовали модель 4-х- параметровой кривой с оптимизацией коэффициентов по алгоритму Levenberg-Marquardt .
Активность кандидата BCD147-02-020 составила 99,2% от активности смеси антител трастузумаб и пертузумаб с использованием репортерной линии с высокоаффинным FcyRIIIa рецептором, и 121,2% - с использованием репортерной линии с низкоаффинным FcyRIIIa рецептором.
Результаты показаны на фиг. 25 и фиг. 26.
Пример 14
Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и моноклональных антител трастузумаб, и смеси трастузумаб и пертузумаб в анализе комплементзависимой цитотоксичности (CDC) на клеточных линиях ВТ-474 и SK-BR-3
Для анализа комплементзависимой цитотоксичности использовали 2 клеточные линии рака молочной железы - ВТ-474 и SK-BR-3, с повышенной экспрессией рецептора HER2. В качестве положительного контроля комплементзависимой цитоксичности использовали моноклональное антитело ритуксимаб в концентрации 50 мкг/мл и клеточную линию WIL2-
S .
Анализ проводили в среде RPMI-1640, 2мМ глутамином, 0,1% бычьим сывороточным альбумином, 50 мкг/мл гентамицина. Готовили серию разведений антител трастузумаб, смеси трастузумаб и пертузумаб, BCD147-02-020 от концентрации 50 мкг/мл. Вносили в 96-луночные планшеты по 50 мкл на лунку. Вносили 50 мкл клеточной суспензии ВТ- 474 или SK-BR-3 с плотностью 0,4*106 клеток/мл. Для положительного контроля комплементзависимой цитоксичности вносили клеточную суспензию WIL2-S с плотностью 1 * 106 клеток/мл. Готовили рабочий раствор комплемента разведением жидкого препарата комплемента человека в 4 раза. Вносили рабочий раствор комплемента по 50 мкл/лунку. Планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37 °С, 5% СОг. Вносили по 15 мкл красителя Аламар синий в лунки планшета, инкубировали планшет при 37° С, 5% СОг до развития градиентной окраски. Оценивали уровень флюоресценции с помощью планшетного детектора Infinite М200Рго при длине волны возбуждения/испускания 544/590 нм.
Кандидат BCD147-02-020, также как трастузумаб и смесь трастузумаба и пертузумаба не оказывают комплементзависимой цитотоксичности на клеточные линии ВТ-474 и SK-BR-3.
Результаты показаны на фиг. 27.
Пример 15
Сравнение кандидата антитела против HER2-HER2 BCD147-02-020 и смеси моноклональных антител трастузумаб и пертузумаб в анализе антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) на клеточной линии HUVEC с использованием репортерной клеточной линии Jurkat ADCC Reporter High
Анализ ADCC проводили аналогично описанному в примере 13, за исключением следующего: в качестве таргетной линии использовали клетки HUVEC. Клетки HUVEC размораживали в день анализа, отмывали от DMSO, готовили клеточную суспензию с концентрацией 2*105 клеток/мл в среде Medium200 с lx LSGS (Gibco) , смешанной 1:1 со средой Medium200, 5% Attachment factor (Gibco) , 4 мкг/мл гентамицин, вносили по 50 мкл/лунку в 96-луночные планшеты с белыми стенками. Инкубировали планшеты с клетками в течение 1,5-2х часов при 37 °С, 5% С02. Вносили титр антител смеси трастузумаб и пертузумаб, BCD147-02-020, и антител, связывающихся с DLL4 в качестве положительного контроля ADCC на HUVEC, по 25 мкл/лунку. Титр антител готовили с шагом 2, от концентрации 400 мкг/мл. Вносили суспензию Jurkat Reporter ADCC High, с концентрацией 3,75*106 клеток/мл, по 25 мкл/лунку. Инкубировали в течение 5 часов при 37°С, 5% С02 · Добавляли 100 мкл реагента Bio-Glo (Promega) , проводили измерение люминесценции с использованием Infinite М200Рго при времени инкубации 8 мин, считывании люминесценции при времени интеграции 100 ms. Для смеси трастузумаб и пертузумаб показана незначительная активность в данном тесте, кандидат BCD147-02-020 не показал активности в данном тесте.
Результаты показаны на фиг. 28.
Пример 1 б
Оценка эффективности препарата BCD-147-02-20 на модели подкожных ксенографтов
Для оценки эффективности использовали иммунодефицитных Nude- мышей, которым подкожно прививали опухолевую линию ZR-75-1. Каждое животное в группе получало 2, 5х106/мышь опухолевых клеток. Перед введением клетки смешивали с Matrigel® в соотношении 1:1. Полученную смесь вводили подкожно. Оценку эффективности проводили с использованием 4 доз препарата BCD-147-02-20, препарата сравнения смесь препаратов Трастузумаба и Пертузумаба (положительный контроль) и плацебо (отрицательный контроль) .
Таблица 1. Распределение животных по группам в эксперименте по определению эффективности препарата BCD-147-02-20
Figure imgf000079_0002
В ходе эксперимента оценивали вес животных (до введения, и далее два раза в неделю) , объем опухолевого узла, использовали следующую формулу :
Figure imgf000079_0001
где W - ширина опухолевого узла, L - длинна опухолевого узла.
Критерием эффективности исследуемого препарата служат показатель торможения роста опухоли (ТРО) и индекс прироста опухоли (I), которые вычисляют по формулам:
ТРО (%)= (Vo-Vk) /Vk *100,
где Vk и Vo - средний объем опухоли (мм3) в контрольной опытных группах, соответственно.
Ii = Vi/Vo,
Где I - индекс прироста опухоли, i-сутки эксперимента, Vo - объем опухоли в день начала лечения.
Результаты показаны на фигурах 29 и 30. Пример 17
Оценка эффективности препарата BCD-147-02-20 на модели подкожных ксенографтов
Для оценки эффективности использовали иммунодефицитных Nude- мышей, которым подкожно прививали опухолевую линию SKBR3. Каждое животное в группе получало 5, 0х106/мышь опухолевых клеток. Перед введением клетки смешивали с Matrigel® в соотношении 1:1. Полученную смесь вводили подкожно. Оценку эффективности проводили с использованием 4 доз препарата BCD-147-02-20, препарата сравнения смесь препаратов Трастузумаба и Пертузумаба (положительный контроль) и плацебо (отрицательный контроль) .
Таблица 2. Распределение животных по группам в эксперименте по определению эффективности препарата BCD-147-02-20
Figure imgf000080_0002
В ходе эксперимента оценивали вес животных (до введения, и далее два раза в неделю) , объем опухолевого узла, использовали следующую формулу :
Figure imgf000080_0001
где W - ширина опухолевого узла, L - длинна опухолевого узла.
Критерием эффективности исследуемого препарата служат показатель торможения роста опухоли (ТРО) и индекс прироста опухоли (I), которые вычисляют по формулам:
ТРО (%)= (Vo-Vk) /Vk *100,
где Vk и Vo - средний объем опухоли (мм3) в контрольной опытных группах, соответственно.
Ii =Vi/Vo,
Где I - индекс прироста опухоли, i-сутки эксперимента, Vo - объем опухоли в день начала лечения.
Результаты показаны на фигурах 31 и 32. Пример 18
Оценка эффективности препарата BCD-147-02-20 на модели подкожных ксенографтов
Для оценки эффективности использовали иммунодефицитных Nude- мышей, которым подкожно прививали опухолевую линию ВТ-474. Каждое животное в группе получало 5, 0х106/мышь опухолевых клеток. Перед введением клетки смешивали с Matrigel® в соотношении 1:1. Полученную смесь вводили подкожно. Оценку эффективности проводили с использованием 4 доз препарата BCD-147-02-20, препарата сравнения смесь препаратов Трастузумаба и Пертузумаба (положительный контроль) и плацебо (отрицательный контроль) .
Таблица 3. Распределение животных по группам в эксперименте по определению эффективности препарата BCD-147-02-20
Figure imgf000081_0002
В ходе эксперимента оценивали вес животных (до введения, и далее два раза в неделю) , объем опухолевого узла, использовали следующую формулу :
Figure imgf000081_0001
где W - ширина опухолевого узла, L - длинна опухолевого узла.
Критерием эффективности исследуемого препарата служат показатель торможения роста опухоли (ТРО) и индекс прироста опухоли (I), которые вычисляют по формулам:
ТРО (%)= (Vo-Vk) /Vk *100,
где Vk и Vo - средний объем опухоли (мм3) в контрольной опытных группах, соответственно.
Ii =Vi/Vo,
Где I - индекс прироста опухоли, i-сутки эксперимента, Vo - объем опухоли в день начала лечения.
Результаты показаны на фигурах 33 и 34.
Пример 19
Результаты оценки токсикокинетических свойств препарата BCD-147- 02-20 при однократном внутривенном введении яванским макакам (Масаса fascicularis ) Исследование проведено на 12 самцах яванских макак (Масаса fascicularis ) . Животные были распределены на 4 группы. Наименование групп приведено в таблице 4.
Таблица 4. Распределение животных по группам в эксперименте по токсикокинетике
Figure imgf000082_0001
В рамках исследования клинический осмотр проводился ежедневно, кроме того оценивали:
- вес животных;
- температуру тела;
- общий анализ мочи;
- общий анализ крови по показателям: количество эритроцитов, количество лейкоцитов, концентрация гемоглобина;
биохимический анализ сыворотки крови по показателям: лактатдегидрогеназа, билирубин общий, общий белок, глюкоза, аспартатаминотрансфераза, аланин-аминотрансфераза;
- исследование концентрации препарата в сыворотке крови.
Не было показано влияния препарата на интегральные показатели токсичности, а также на функциональное состояние органов и систем органов по оцениваемым параметрам (в случае отсутствия, в противном случае указать) .
Пример 20
Оценка токсичности при многократном внутривенном введении яванским макакам в течение 13 недель с последующим периодом свободным от введения в течение 30 дней
Исследование токсичности при многократном внутривенном введении в течение 13 недель с последующим периодом восстановления в течение 30 дней проводили на релевантном виде животных - яванских макаках. В эксперименте использовали 3 уровня доз. Схема экспериментальных групп представлена в таблице 5. Таблица 5. Распределение животных по группам в эксперименте по оценке токсичности при многократном введении
Figure imgf000083_0001
В ходе проведения исследования оценивали следующие параметры:
- результаты клинического осмотра;
- вес животных (до введения далее еженедельно) ;
- температуру тела (до введения далее еженедельно до окончания эксперимента) ;
- влияние на сердечно-сосудистую систему, для чего оценивали биоэлектрическую активность сердца с использованием кардиографа «Поли- Спектр;
- общий анализ мочи;
- общий анализ крови по показателям: количество эритроцитов, количество лейкоцитов, концентрация гемоглобина, количество лимфоцитов, количество моноцитов, количество нейтрофилов, количество эозинофилов, количество базофилов;
- оценка влияния на свертывающую систему крови по показателям: активированное частичное тромбопластиновое время, концентрация фибриногена, протромбиновое время;
- биохимический анализ сыворотки крови по показателям: натрий, калий, креатинин, мочевина, щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа, билирубин общий, общий белок, глюкоза, триглицериды, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза холестерин общий;
- на момент окончания периода введения проводили эвтаназию и последующее патоморфологическое исследование животных основной группы максимальной дозы, на момент окончания исследования животных сателлитной группы максимальной дозы и контрольной группы;
- в рамках проведения исследования токсичности оценивали также местно-раздражающее действие препаратов для чего выделяли и проводили гистологическое исследование мягких тканей в месте введения препарата. Для всех испытанных доз не было показано токсического действия препарата .

Claims

Формула изобретения
1. Биспецифическое антитело, которое специфично
связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4)
HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, включающее :
1) первую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, и представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) трастузумаба с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1;
2) вторую антигенсвязывающую часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, и представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, и вариабельный домен легкой цепи (VL) с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 6;
3) кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (Fc- фрагмент) .
2. Биспецифическое антитело по п. 1, где антитело представляет собой антитело IgG.
3. Биспецифическое антитело по п. 2, где антитело IgG относится к изотипу gGl, IgG2, IgG3 или IgG4 человека.
4. Биспецифическое антитело по п. 3 где антитело IgG относится к изотипу IgGl человека.
5. Биспецифическое антитело по п. 1, где кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина ( Fc-фрагмент ) включает две аминокислотные последовательности второго и третьего константных доменов (СН2-СНЗ), представленные SEQ ID NO: 10- 11, соответственно.
6. Биспецифическое антитело по п. 1, где вторая антигенсвязывающая часть, которая специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, представляет собой участок связывания антигена (Fab), включающий:
а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый константный домен тяжелой цепи (CHI), с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 12;
б) вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 13;
7. Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2 (рецептор эпидермального фактора роста 2) человека и II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2 человека, состоящее из:
82
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 1) аминокислотной последовательности, которая специфично связывается с IV субдоменом внеклеточного домена (ECD4) HER2, включающей константные домены СН2 и СНЗ, и одноцепочечный вариабельного фрагмент (scFv) трастузумаба, с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO : 14;
2) тяжелой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и первый, второй и третий константные домены тяжелой цепи (СН1-СН2- СНЗ), с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 15;
3) легкой цепи антитела, которое специфично связывается с II субдоменом внеклеточного домена (ECD2) HER2, включающей вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (СК) , с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 13,
при этом части 1)-3) соединены между собой дисульфидными мостиками .
8 Нуклеиновая кислота, которая кодирует антитело по любому из пп . 1-7.
9. Нуклеиновая кислота по п. 8, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.
10. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 8-9.
11. Способ получения клетки-хозяина для получения антитела по любому из пп. 1-7, включающий трансформирование клетки вектором по п. 10.
12. Клетка-хозяин для получения антитела по любому из пп. 1-7, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 8-9.
13. Способ получения антитела по любому из пп. 1-7, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п. 12 в культуральной среде в условиях, достаточных для получения указанного антитела, при необходимости, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.
14. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7 в терапевтически эффективном количестве, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
15. Фармацевтическая композиция по п. 14, предназначенная для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, выбранного из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный
83
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.
16. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, содержащая антитело по любому из пп. 1-7 в терапевтически эффективном количестве и по меньшей мере одно терапевтически активное противоопухолевое соединение в терапевтически эффективном количестве.
17. Фармацевтическая композиция по п. 16, предназначенная для лечения заболевания или нарушения, опосредуемого HER2, выбранного из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.
18. Фармацевтическая композиция по пп. 16-17, где терапевтически активное противоопухолевое соединение выбирают из цитотоксического средства, химиотерапевтического средства, антитела или противогормонального средства.
19. Способ ингибирования биологической активности HER2 у субъекта, нуждающемуся в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества антитела по любому из пп . 1-7.
20. Способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного HER2, включающий введение субъекту антитела по любому из пп. 1-7 или фармацевтической композиции по п. 14, нуждающемуся в таком лечении, в терапевтически эффективном количестве.
21. Способ лечения заболевания или нарушения по п.20, где заболевание или нарушение выбрано из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.
22. Применение антитела по любому из пп. 1-7 или фармацевтической композиции по п. 14 для лечения у субъекта,
84
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого HER2.
23. Применение по п. 20, где заболевание или нарушение выбрано из группы: рак молочной железы (РМЖ) , злокачественное новообразование желудка, немелкоклеточный рак лёгкого, злокачественное новообразование головы и/или шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) , колоректальный рак (КРР) , эзофагеальный рак, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак ЖКТ, рак почек, рак шейки матки, рак эндометрия, рак матки, злокачественная меланома, рак глотки, рак ротовой полости или рак кожи.
85
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2019/050037 2018-03-29 2019-03-28 Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с iv и ii субдоменами внеклеточного домена her2 человека WO2019190359A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018111298A RU2018111298A (ru) 2018-03-29 2018-03-29 Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II cубдоменами внеклеточного домена HER2 человека
RU2018111298 2018-03-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019190359A1 true WO2019190359A1 (ru) 2019-10-03

Family

ID=68058434

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/050037 WO2019190359A1 (ru) 2018-03-29 2019-03-28 Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с iv и ii субдоменами внеклеточного домена her2 человека

Country Status (5)

Country Link
AR (1) AR115311A1 (ru)
RU (1) RU2018111298A (ru)
TW (1) TW202003038A (ru)
UY (1) UY38168A (ru)
WO (1) WO2019190359A1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015077891A1 (en) * 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
RU2627185C1 (ru) * 2012-03-16 2017-08-03 Коваген Аг Новые связывающие молекулы с противоопухолевой активностью

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2627185C1 (ru) * 2012-03-16 2017-08-03 Коваген Аг Новые связывающие молекулы с противоопухолевой активностью
WO2015077891A1 (en) * 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAIL D. LEWIS PHILLIPS ET AL.: "Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DMl, an Antibody-Cytotoxic Drug Conjugate", CANCER RES 2008, vol. 68, no. 22, 15 November 2008 (2008-11-15), pages 9280 - 9290, XP055013498, doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-1776 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202003038A (zh) 2020-01-16
AR115311A1 (es) 2020-12-23
RU2018111298A (ru) 2019-10-01
UY38168A (es) 2019-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11840567B2 (en) Bispecific antibodies with specific binding to CD47 and PD-L1
RU2665790C1 (ru) Моноклональное антитело к pd-l1
RU2734432C1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с GITR
JP7065935B2 (ja) 抗ｌｙ６ｇ６ｄ抗体及び使用方法
RU2724469C2 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с cd20
WO2019190359A1 (ru) Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с iv и ii субдоменами внеклеточного домена her2 человека
RU2698048C2 (ru) МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К IL-5Rα
RU2779652C2 (ru) АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD47 и PD-L1
EA044786B1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с gitr
RU2653443C2 (ru) Биспецифичные анти-her2/анти-her3 антитела
EA044757B1 (ru) Моноклональное антитело, которое специфически связывается с cd20
EA041915B1 (ru) Моноклональное антитело к pd-l1

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19777315

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19777315

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1