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WO2019190157A2 - 박쥐나방 동충하초에서 분리한 아데노신 고생산능 패실로마이세스 헤피알리 cs4 균주 - Google Patents

박쥐나방 동충하초에서 분리한 아데노신 고생산능 패실로마이세스 헤피알리 cs4 균주 Download PDF

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WO2019190157A2
WO2019190157A2 PCT/KR2019/003485 KR2019003485W WO2019190157A2 WO 2019190157 A2 WO2019190157 A2 WO 2019190157A2 KR 2019003485 W KR2019003485 W KR 2019003485W WO 2019190157 A2 WO2019190157 A2 WO 2019190157A2
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WO
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cordyceps
strain
adenosine
hepiali
cordyceps sinensis
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PCT/KR2019/003485
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이원재
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이원재
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Publication date
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Priority to CN201980022381.4A priority patent/CN112272696A/zh
Priority to EP19778326.9A priority patent/EP3778863A4/en
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Publication of WO2019190157A3 publication Critical patent/WO2019190157A3/ko
Publication of WO2019190157A9 publication Critical patent/WO2019190157A9/ko

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    • C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to adenosine high-productivity Paecilomyces hepiali CS4 strain isolated from bat moth cordyceps, more specifically isolated from wild bat moth cordyceps collected from China, and significantly improved adenosine. It relates to the Paecilomyces hepiali CS4 strain having a (Adenosine) production capacity.
  • fungus of the asymptomatic fungus grows in an insect as a host, and, under certain conditions, penetrates the insect to make an fruiting body, commonly called Cordyceps, and is a type of insect that is a host.
  • Cordyceps Various Cordyceps sinensis are found depending on the type of parasitic fungi.
  • Cordyceps fungi are caterpillar cordyceps (Red cordyceps, Cordyceps millitaris), Paecilomyces japonica, Cordyceps scarabaeicola, and stink bugs according to the type of insects and host species.
  • Hundreds of species are known, including Cordyceps mutans, Cordyceps sobolifera, and Bat moth cordyceps sinensis.
  • Cordyceps sinensis which is based on bat moth larvae, is the most effective. It is widely known to be outstanding.
  • the above-mentioned bat moth cordyceps is harvested from the alpine areas of Cambodia, Qinghai and Nepal in China, and is a medicinal herb that is regarded as one of the three traditional medicines in China.
  • the cord moth cordyceps sinensis (Cordyceps sinensis) is a sexually asexual spore or mycelia infected with bat moth larvae, mycelium nutrients grow in the body of the bat moth larvae in winter, the larvae die, summer bat moth cordyceps (Cordyceps sinensis) bacteria develop, the fruiting body grows in the head of the host, breaks out through the host, and takes the form of a baseball stick.
  • the bat moth cordyceps is about 10 cm in total length, about 0.5 cm in diameter, round, initially light green, and dark brown.
  • the head of the fruiting body is slightly bulging and is cylindrical and elliptical. Is fulfilling.
  • fungi such as opiocordyceps sinensis, Paecilomyces hepiali, and Lecanicillium are known.
  • Cordyceps sinensis contains various low-molecular substances such as polysaccharides, cordycepin, adenosine, lovastatin, ergosterol, and various unsaturated fatty acids, depending on the type.
  • various low-molecular substances such as polysaccharides, cordycepin, adenosine, lovastatin, ergosterol, and various unsaturated fatty acids, depending on the type.
  • cordyceps such as pupa cordyceps militaris and Paecilomyces japonica
  • pupa cordyceps militaris and Paecilomyces japonica have already been successfully cultivated and entered the mass production stage, only the cord moth cordyceps sinensis, which is known to be the most effective, To this day, artificial cultivation has not been successful, and the situation is dependent only on natural products.
  • Korean Patent No. 10-0415893 discloses a method for separating cordyceps sinensis
  • Korean Patent No. 10-0459869 discloses a large amount of cordyceps sinensis by using silkworm or silkworm pupae as host.
  • 'Cultivation method of cordyceps sinensis using silkworm medium or silkworm pupae medium' for the method of culturing by the present invention is disclosed, but the Paciromomyces Hepiali CS4 strain isolated from bat moth cordyceps of the present invention and its culture method None is described.
  • the present invention aimed to provide a culture method that significantly separates the Pacillomyces hepiali CS4 strain from bat moth cordyceps collected from China, and provides a markedly improved adenosine production capacity, which is an indicator of the efficacy of cordyceps. .
  • the present invention was derived from the above needs, the object of which is isolated from the natural bat moth cordyceps of China, China, and provides a Paecilomyces hepiali CS4 strain having a significantly improved adenosine production capacity It is.
  • the present invention provides a Pacillomyces Hepiali CS4 strain [Accession No .: KCTC 13285BP] isolated from wild bat moth cordyceps harvested in Cambodia, China.
  • the strain may be one having improved adenosine production capacity.
  • the strain may be cultured in pupa medium.
  • Paecilomyces hepiali CS4 strain having a markedly improved (180 mg / 100 g medium) adenosine production ability which is an indicator of the efficacy of Cordyceps sinensis, can be obtained as compared to natural strains. .
  • adenosine which is an indicator material showing the efficacy of Cordyceps sinensis, and an ingredient effective for enhancing immunity, anti-aging, and improving heart / soy.
  • FIG. 1 is a photograph (right) of the bat moth cordyceps herb (left) and the Paciromyces hepiali CS4 strain isolated from the bat moth cordyceps (left).
  • Figure 2 is an image of RAPD results for the distinction of bat moth cordyceps fungi according to the present invention (No. 1 to 4, No. 7 is isolated bacterium, No. 5 is Codyceps militaris, No. 6 is Cordyceps Cicada) (Codyceps cicadae).
  • Figure 3 is a graph comparing the adenosine production capacity of bat moth cordyceps isolated strains isolated according to the present invention.
  • Figure 4 is a comparison image of the ITS sequence of bat moth Cordyceps sinensis isolate.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of adenosine production capacity of the Pacillomyces hepiali CS4 strain of the present invention using various materials as a medium.
  • Figure 6 is a graph showing mating sarcoma using Cordyceps spore-derived haploid bacteria.
  • Figure 7 is a graph showing the results of adenosine content analysis in each culture condition of the Pacillomyces hepiali CS4 strain of the present invention.
  • Bat moth cordyceps is a strain belonging to Paecilomyces hepiali (Paecilomyces hepiali), dated June 13, 2017 to the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Paecilomyces hepiali (Paecilomyces hepiali) It is a strain deposited under the name YC1-4 and given accession number KCTC 13285BP.
  • the Pacicilomyces hepiali YC1-4 strain may have adenosine production capacity of 180 mg / 100 g medium when cultured in pupa medium.
  • the culture of the strain is not limited to the type of medium, but may be cultured in brown rice medium, brown rice + silkworm powder medium and the like.
  • Adenosine as described above is an indicator that shows the efficacy of Cordyceps sinensis and is known to exhibit significant effects on enhancing immunity, anti-aging and improving heart / soy.
  • the present invention can provide Cordyceps sinensis extract according to another embodiment.
  • the Cordyceps sinensis extract is an extract of the Paecilomyces hepiali YC1-4 strain, which may include adenosine as an active ingredient, and may additionally contain amino acids, vitamin precursors, and / or mannitol.
  • the Cordyceps sinensis extract not only extracts an active ingredient from the Paecilomyces hepiali YC1-4 strain, but also purifies the Paecilomyces hepiali YC1-4 strain itself or a part thereof. Or processed.
  • Cordyceps sinensis extract can be used a conventional method in the art to extract the extract from natural products.
  • an extract of the Paecilomyces hepiali YC1-4 strain can be obtained according to a method using a conventional extraction solvent under conventional temperature and pressure conditions.
  • Solvents commonly used in extraction processes such as anhydrous or hydrous lower alcohols of 4, acetone, ethyl acetate, butyl acetate, dichloromethane and 1,3-butylene glycol can be used.
  • the present invention may provide a health functional food, health supplements, health foods, cosmetics, medicines and quasi-drugs, etc., including Cordyceps sinensis extract according to another embodiment.
  • the functional food, health supplement, health food, cosmetics, pharmaceuticals and quasi-drugs containing the Cordyceps sinensis extract may further include food, cosmetic or pharmaceutically acceptable ingredients.
  • Examples of the food acceptable ingredients include proteins, carbohydrates, fats, nutrients and seasonings. Specifically, monosaccharides (glucose, fructose, etc.), disaccharides (maltose, sucrose, etc.), oligosaccharides, polysaccharides (dextrins, cyclodextrins), and sugar alcohols (xylitol, sorbitol, erythritol) are specifically mentioned as carbohydrates. 3) etc., and natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) are mentioned as a flavoring agent.
  • Such cosmetic or pharmaceutically acceptable ingredients include, for example, carriers, binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, stabilizers, bases, lubricants, preservatives, wetting agents, emulsifiers, suspending agents, viscosity modifiers. Preservatives, surfactants, antioxidants, moisturizers, fragrances and colorings.
  • the drug and quasi-drug containing the Cordyceps sinensis extract may be formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. It may be prepared in unit dose form or incorporated into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the wild bat moth cordyceps harvested in the Qinghai region of China shown in FIG. 1 was washed with 70% ethanol, the washed cordyceps was incised, and the internal tissues were sliced into 0.1-0.3 cm in size to contain PDA medium (ampicillin 100 mg / ml). ) was incubated for at least 1 week at a culture temperature of 18 °C.
  • chromosomal DNA was extracted from the mycelia of each bacterium, and the extracted chromosomal DNA was extracted from i-genomic plant DNA extraction.
  • the kit was separated using Intron Biotech.
  • OPS1 CACTGCGCT
  • OPS10 GTCGTTCCTG
  • primer primer
  • PCR was repeated 35 times under the conditions of 10 min heating at 94 ° C., 45 sec heating at 94 ° C., 30 sec heating at 48 ° C., and 1 min heating at 72 ° C., and the PCR product was subjected to 1% agarose gel.
  • strains 1 to 4 and strain 7 is isolated bacteria
  • strain 5 is Codyceps militaris
  • strain 6 is Cordyceps Cicada It was confirmed that the (Codyceps cicadae) bacteria
  • strains 2 and 3 of the strains corresponding to the isolate was the same bacteria
  • strain 4 and strain 7 was found to be the same bacteria.
  • strain 1 strain 1
  • strain 2 strain 2
  • each of the isolated strains (strain 1, strain 2, strain 4) was incubated for one week while maintaining at 20 °C in PDB medium, compared to the adenosine content produced, as a result in Figure 3
  • adenosine content of strain 4 was the highest among the isolated strains
  • strain 7 identified as the same species in RAPD showed about 80% of the production of strain 4
  • the remaining three strains were adenosine.
  • ITS Internal Transcribed Spacer
  • the strain isolated through the present invention is consistent with the Paciillomyces hepiali CS4 strain It turned out.
  • the production capacity was investigated in 8 medium materials.
  • the culture was carried out for 20 days at 23 ° C. and dark conditions. After the incubation, samples were taken from each culture condition and analyzed for adenosine content.
  • the adenosine production capacity in the pupa medium was examined as shown in the following Figure 1, and additionally, brown rice and brown rice + silkworm powder medium were also examined.
  • a medium was prepared in the same manner as described above, and inoculated with YC1-4 bacteria of the present invention, followed by (1) light condition, (2) cancer condition, and (3) light condition for 12 hours. It was cultured for 20 days under conditions such as crossover of 12 hours of cancer.
  • the result showed the highest adenosine production capacity in the pupa medium cultured in the light condition.
  • the adenosine production reached 180 mg / 100 g medium.
  • Adenosine production of bat moths such as Paecillomyces hepiali CS4 or Opiocordyceps sinensis is typically only 0.3-0.5 mg / g medium.
  • the adenosine production capacity of the newly isolated Paciillomyces hepiali CS4 YC1-4 strain by optimizing the medium conditions was found to reach 180 mg / 100 g medium, so that the bat moth In comparison, it can be seen that adenosine production capacity is significantly improved.

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Abstract

본 발명에서는 박쥐나방 동충하초에서 분리한 신규한 아데노신 고생산능 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) CS4 균주[수탁번호: KCTC 13285BP]가 제공된다.

Description

박쥐나방 동충하초에서 분리한 아데노신 고생산능 패실로마이세스 헤피알리 CS4 균주
본 발명은 박쥐나방 동충하초에서 분리한 아데노신 고생산능 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) CS4 균주에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 중국 티벳지역에서 채취한 자연산 박쥐나방 동충하초로부터 분리되며, 현저하게 향상된 아데노신(Adenosine) 생산능을 갖는 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) CS4 균주에 관한 것이다.
일반적으로, 자낭균류의 곰팡이들 중 일부는 곤충을 숙주로 하여 곤충 안에서 자라다가 일정 조건이 되면 곤충을 뚫고 나와 자실체를 만드는데, 이를 통칭하여 동충하초(冬蟲夏草:Cordyceps)라 하며, 숙주인 곤충의 종류와 기생하는 곰팡이균의 종류에 따라 다양한 동충하초가 발견되고 있다.
이 같은 동충하초속 균으로는 균주와 숙주가 되는 곤충의 종류에 따라 누에 번데기를 기주로 하는 번데기 동충하초(붉은 동충하초, Cordyceps millitaris), 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica), 풍뎅이 동충하초(Cordyceps scarabaeicola), 노린재 동충하초(Cordyceps mutans), 매미 동충하초(Cordyceps sobolifera), 박쥐나방 동충하초(Cordyceps sinensis) 등 수 백여 종이 알려져 있는데, 그 중에서도 특히, 박쥐나방 유충을 기주로 하는 박쥐나방 동충하초(Cordyceps sinensis)는 예로부터 그 약효가 가장 탁월한 것으로 널리 알려져 있다.
상기한 박쥐나방 동충하초는 중국의 티벳, 청해지역과 네팔 등지의 고산지대에서 채취되고 있는데, 중국에서는 3대 전통약재로 취급될 정도로 귀한 약재이다.
그러나, 중국에서는 자연생태의 파괴에 대한 우려로 박쥐나방 동충하초의 채취가 극도로 제한되고 있고, 최근 자연상태의 동충하초에서 비소와 같은 중금속이 발견됨에 따라 자연채취 동충하초의 식품안전에 대한 우려가 증가하고 있는 실정이다.
상기 박쥐나방 동충하초(Cordyceps sinensis)는 유성 및 무성 포자 또는 균사가 박쥐나방 유충에 감염하여, 겨울에는 박쥐나방 유충의 체내에서 균사가 영양분을 취하며 생장하고 유충은 죽게 되는데, 여름이 되면 박쥐나방 동충하초(Cordyceps sinensis)균이 발육하여 숙주의 머리부분에서 자실체가 성장하여 숙주를 뚫고 나온 후 야구막대기 모양의 형태를 갖는다.
박쥐나방 동충하초는 도 1에 나타낸 바와 같이 전체 길이는 약 10cm 내외이며, 직경이 0.5cm 내외인 원형으로써 초기에는 연한 녹색을 띠다가 진한 갈색으로 변하며, 자실체의 머리 부분은 약간 불룩하여 원주형 및 타원형을 이루고 있다.
상기한 박쥐나방 곰팡이균으로는 오피오코디셉스 시넨시스(Ophiocordyceps sinensis), 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali), 레카니실리움( Lecanicillium) 등 여러 곰팡이균들이 알려져 있다.
한편, 동충하초에는 종류에 따라 다당류, 코디세핀(Cordycepin), 아데노신(Adenosine), 로바스타틴(Lovastatin), 에르고스테롤(Ergosterol), 각종 불포화지방산 등의 다양한 저분자물질들이 포함되어 있어 인체의 생리활성에 기여하는 것으로 보고되고 있는데(Lo et al. A Systematic Review of the Mysterious Caterpillar Fungus Ophiocordyceps sinensis in Dong-ChongXiaCao(冬蟲夏草) and Related Bioactive Ingredients. J Tradit Complement Med, 2013, 3, 16-32), 이 외에도 동충하초는 간염, 당뇨병, 결핵 등에 효험이 있고 혈액순환 개선, 강장제로서의 효과뿐만 아니라, 면역기능 강화 등 다양한 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
그러나 번데기 동충하초(Cordyceps militaris), 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica) 등의 여러 종의 동충하초가 이미 인공재배에 성공하여 대량생산 단계에 접어들었으나, 그 효능이 가장 탁월한 것으로 알려진 박쥐나방 동충하초(Cordyceps sinensis) 만은 현재까지 인공적인 재배에 성공하지 못한 상태여서 자연산에만 의존하고 있는 실정이다.
이는 종균의 분리기술의 문제와 분리된 종균의 배양기술 등이 개발되지 못하였기 때문이며, 따라서 두 가지의 기술이 개발되어야만 비로소 인공적인 동충하초 대량생산이 가능해 질 수 있으며, 제품화를 위한 안정적인 원료공급과 제품의 표준화가 가능하다.
한편, 한국등록특허 제10-0415893호에는 '코디셉스 시넨시스균의 분리방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0459869호에는 기주로서 누에 또는 누에번데기를 이용함으로써 코디셉스 시넨시스를 대량으로 배양하는 방법에 관한 '누에배지 또는 누에번데기 배지를 사용한 코디셉스 시넨시스의 배양방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 박쥐나방 동충하초로부터 분리한 패실로마이세스 헤피알리 CS4 균주 및 이의 배양방법에 관해서는 기재된 바가 없다.
또, 중국 식약국에서는 특히 아데노신(Adenosine)을 동충하초의 효능을 나타내는 지표물질로 인정하고 있는데, 상기한 선행기술에서는 향상된 아데노신 생산능을 갖는 배양방법이 기재되어 있지 않다.
이러한 배경으로 본 발명은 중국 티벳지역에서 채취한 박쥐나방 동충하초로부터 패실로마이세스 헤피알리 CS4 균주를 분리하고, 동충하초의 효능을 나타내는 지표물질인 아데노신 생산능이 현저하게 향상된 배양법을 제공하는 것을 목표로 하였다.
본 발명은 상기와 같은 필요에 의하여 도출된 것으로, 그 목적은 중국 티벳지역의 자연산 박쥐나방 동충하초로부터 분리되고, 현저하게 향상된 아데노신 생산능을 갖는 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) CS4 균주를 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 중국 티벳지역에서 채취한 자연산 박쥐나방 동충하초로부터 분리한 패실로마이세스 헤피알리 CS4 균주[수탁번호: KCTC 13285BP]를 제공한다.
본 발명에서 상기 균주는 향상된 아데노신 생산능을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 균주는 번데기 배지에서 배양된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 자연산 균주에 비해 동충하초의 효능을 나타내는 지표물질인 아데노신 생산능이 현저하게 향상(180mg/100g배지)된 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) CS4 균주를 확보할 수 있다.
또한, 동충하초의 효능을 나타내는 지표물질이면서 면역력 증강, 노화방지 및 심장/간장의 개선에 유효한 성분인 아데노신을 고농도 및 대량으로 생산할 수 있다.
이러한 본 발명의 실시예들에 따른 효과는 위에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 채취된 박쥐나방 동충하초 사진(좌) 및 박쥐나방 동충하초로부터 분리한 패실로마이세스 헤피알리 CS4 균주를 배양접시에 배양한 사진(우)이다.
도 2는 본 발명에 따른 박쥐나방 동충하초 곰팡이의 구분을 위한 RAPD 결과의 이미지(1∼4번, 7번은 분리균, 5번은 코디셉스 밀리타리스(Codyceps militaris)균, 6번은 코디셉스 시카다에(Codyceps cicadae)균)이다.
도 3은 본 발명에 따라 분리된 박쥐나방 동충하초 분리균주들의 아데노신 생산능을 비교한 그래프이다.
도 4는 박쥐나방 동충하초 분리균주의 ITS 염기서열 비교 이미지이다.
도 5는 다양한 재료를 배지로 한 본 발명의 패실로마이세스 헤피알리 CS4 균주의 아데노신 생산능 조사결과 그래프이다.
도 6은 동충하초 포자유래 반수체균을 이용한 교배육종을 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 패실로마이세스 헤피알리 CS4 균주의 각 배양조건에서의 아데노신 함량 분석결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 도면을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 박쥐나방 동충하초 균주는 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali)에 속하는 균주로서, 2017년 06월 13일자로 한국생명공학연구원에 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) YC1-4 라는 명칭으로 기탁되어 수탁번호 KCTC 13285BP를 부여받은 균주이다.
상기 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) YC1-4 균주는 번데기 배지에서 배양되었을 때 180mg/100g배지의 아데노신 생산능을 갖는 것일 수 있다.
다만, 상기 균주의 배양은 배지의 종류에 제한되는 것은 아니며, 현미배지, 현미+누에가루 배지 등에서도 배양될 수 있다.
상기한 아데노신은 동충하초의 효능을 나타내는 지표물질이면서 면역력 증강, 노화방지 및 심장/간장의 개선에 대한 상당한 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 다른 실시예에 따라 동충하초 추출물을 제공할 수 있다.
상기 동충하초 추출물은 상기 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) YC1-4 균주의 추출물로서, 아데노신을 유효성분으로서 포함할 수 있으며, 아미노산, 비타민 전구체 및/또는 만니톨 등을 추가적으로 함유할 수 있다.
상기한 동충하초 추출물은 상기 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) YC1-4 균주로부터 유효성분을 추출한 것 뿐만 아니라, 상기 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) YC1-4 균주 자체 또는 그 일부를 정제하거나 가공한 것도 의미한다.
상기한 동충하초 추출물을 얻기 위해 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계의 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 통상적인 온도 및 압력 조건하에서 통상적인 추출 용매를 사용하는 방법에 따라 상기 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) YC1-4 균주의 추출물을 얻을 수 있는데, 추출 용매로서 물, 탄소수 1∼4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄 및 1,3-부틸렌 글리콜 등 추출공정에서 일반적으로 사용되는 용매를 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 실시예에 따라 동충하초 추출물을 포함하는 건강기능성 식품, 건강보조식품, 보건식품, 화장품, 의약품 및 의약외품 등을 제공할 수 있다.
상기한 동충하초 추출물을 포함하는 건강기능성 식품, 건강보조식품, 보건식품, 화장품, 의약품 및 의약외품은 식품학적, 화장품학적 또는 약제학적으로 허용되는 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기한 식품학적으로 허용되는 성분으로는 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 특히 탄수화물로서 모노사카라이드(글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(덱스트린, 시클로덱스트린) 및 당알코올(자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 들 수 있고, 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 들 수 있다.
상기한 화장품학적 또는 약제학적으로 허용되는 성분으로는 예를 들어, 담체, 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 안정화제, 기제, 윤활제, 보존제, 습윤제, 유화제, 현탁화제, 점도조절제, 방부제, 계면활성제, 산화방지제, 보습제, 향료 및 색소 등을 들 수 있다.
또, 상기한 동충하초 추출물을 포함하는 의약품 및 의약외품은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다.
이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하에서는 상기 패실로마이세스 헤피알리(Paecilomyces hepiali) YC1-4 균주의 분리, 배양방법 및 아데노신 생산능 조사에 관한 실험예에 대해 구체적으로 설명한다.
실시예1 : 본 발명의 균주 분리 및 배양
-자연산 박쥐나방 동충하초로부터 곰팡이 균주의 분리-
도 1에 나타낸 중국 청해지역에서 채취한 자연산 박쥐나방 동충하초를 70% 에탄올로 세척하고, 세척된 동충하초를 절개한 다음 내부조직을 0.1∼0.3㎝ 크기로 조각낸 후 PDA배지(ampicillin 100 mg/㎖ 포함)에서 18℃의 배양온도로 1주일 이상 배양하였다.
그런 다음 배양기간을 통하여 자라나오는 곰팡이균들을 새로운 PDA 배지에서 옮겨서 순수배양하였으며, 그 결과 총 5종의 곰팡이를 분리하였다.
실시예2 : 박쥐나방 동충하초에서 분리한 곰팡이의 구분 및 아데노신 생산능 조사
- 박쥐나방 동충하초로부터 분리한 곰팡이의 구분-
RAPD 방법을 이용하여 분리된 곰팡이균들이 서로 같은 균인지 또는 다른 균인지 확인하는 실험을 진행하였는바, 이를 위하여 우선 각 균의 균사에서 염색체 DNA를 추출하고, 추출한 염색체 DNA는 i-genomic plant DNA extraction kit(Intron Biotech)를 사용하여 분리하였다.
이와 같이 분리된 곰팡이 DNA 1㎖에 OPS1(CTACTGCGCT), OPS10(GTCGTTCCTG) 프라이머(primer)를 각각 0.1 mM, 2X PCR premix (Intron Biotech) 10㎖, 증류수 8㎖를 첨가하고 PCR 반응을 수행하였다.
PCR은 94℃에서 10분 가열, 94℃에서 45초 가열, 48℃에서 30초 가열, 72℃에서 1분 가열의 조건으로 35회 반복하였으며, PCR산물을 1% 아가로즈겔(agarose gel) 전기영동을 통하여 확인한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 1∼4번 균주와 7번 균주는 분리균, 5번 균주는 코디셉스 밀리타리스(Codyceps militaris)균, 6번 균주는 코디셉스 시카다에(Codyceps cicadae)균인 것을 확인하였으며, 상기 분리균에 해당되는 균주중 2번 균주와 3번 균주는 같은 균, 4번 균주와 7번 균주가 같은 균으로 판명되었다.
따라서, 총 3종(1번 균주, 2번 균주, 4번 균주)의 곰팡이가 분리되었다.
- 분리된 각 균주의 아데노신 생산능 조사-
상기와 같이 분리된 각 균주의 아데노신 생산능을 조사하였다.
이를 위하여, 분리된 각 균주들(1번 균주, 2번 균주, 4번 균주)을 PDB배지에서 20℃로 유지하면서 1주일 동안 배양하고, 생산된 아데노신 함량을 비교하였는바, 그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 분리된 균주중에서 4번 균주의 아데노신함량이 가장 높았으며, RAPD에서 같은 종규의 균주로 확인된 7번 균주가 4번 균주의 80% 가량의 생산능을 보였고, 나머지 세 균주는 아데노신 생산능이 현저히 떨어졌다.
실시예3 : 동충하초 분리균의 동정
상기 실험을 통하여 박쥐나방 동충하초로부터 분리한 곰팡이균주중 4번 균주에 대하여 ITS(Internal Transcribed Spacer) 염기서열을 결정하였다.
상기 4번 균주에서 결정된 염기서열을 기존 동충하초균들의 염기서열과 비교한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명을 통하여 분리된 균주는 패실로마이세스 헤피알리(Paecillomyces hepiali) CS4 균주와 일치하는 것이 밝혀졌다.
이에 따라 상기한 4번 균주를 본 발명에 따른 패실로마이세스 헤피알리(Paecillomyces hepiali) CS4 YC1-4로 명명하였다.
실시예4: 본 발명의 패실로마이세스 헤피알리(Paecillomyces hepiali) CS4 YC1-4의 배양조건 연구
본 발명에 따른 박쥐나방 동충하초 분리균주인 패실로마이세스(Paecilomyces hepiali) CS4 YC1-4(이하 'YC1-4'라 함)의 최적 배양조건을 알아보기 위하여 본 발명에서 얻어진 YC1-4균주의 아데노신 생산능을 8가지 배지재료에서 조사하였다.
이를 위하여, 메주콩, 번데기, 검은콩1, 검은콩2, 강낭콩, 땅콩, 캐슈넛, 쌀의 8종류의 배지재료를 준비하고, 각각의 배지재료 50g을 물에 세척한 다음 추가적으로 물 30㎖를 첨가하여 살균하였으며, 살균된 각각의 배지재료에 PDB배지에서 1주일간 배양한 본 발명에 따른 YC1-4 균주를 3㎖씩 접종하였다.
상기한 각각의 배지재료에 본 발명의 YC1-4 균주를 접종한 후 23℃, 암(暗)조건에서 20일간 배양하였으며, 배양이 끝난 후 각 배양조건에서 시료를 채취하여 아데노신 함량을 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 8가지 배지재료중 번데기에서 가장 많은 아데노신이 생산되었다.
상기의 실험을 통하여 번데기가 아데노신 생산에 가장 우수한 배지재료였으므로, 다음의 그림 1에서와 같이 번데기배지에서의 아데노신 생산능을 조사하였으며, 추가적으로 현미, 현미+누에가루 배지도 함께 조사하였다.
상기한 방법과 동일하게 배지를 제조하고, 본 발명의 YC1-4균을 접종한 후, (1)명(明)조건, (2)암(暗)조건, (3)명(明) 12시간∼암(暗) 12시간 교차 등의 조건으로 20일간 배양하였다.
Figure PCTKR2019003485-appb-I000001
그림 1.본 발명의 패실로마이세스 헤피알리 CS4 YC1-4(약칭:YC1-4) 균주의 배양 10일 후 모양
상기한 바와 같이 배양이 완료된 후,각 시료내의 아데노신 함량을 HPLC분석하였으며, 그 분석결과와 전체결과를 각각 도 6 및 도 7에 나타내었다.
상기 도 6 및 도 7에 따르면, 결과적으로 명(明)조건에서 배양한 번데기배지에서 가장 높은 아데노신 생산능을 보였으며, 이 조건에서 아데노신 생산량은 180mg/100g배지 에 도달하였다.
일반적인 패실로마이세스 헤피알리(Paecillomyces hepiali) CS4나 오피오코디셉스 시넨시스(Ophiocordyceps sinensis) 같은 박쥐나방 동충하초 균들의 아데노신 생산능은 대체로 0.3∼0.5mg/g배지 정도에 불과하다.
그러나, 본 발명에서는 배지조건 최적화를 통하여 새롭게 분리한 패실로마이세스 헤피알리(Paecillomyces hepiali) CS4 YC1-4 균주의 아데노신 생산능은 180mg/100g배지에 달하는 것으로 나타남에 따라 기존의 박쥐나방 동충하초 균주에 비하여 아데노신 생산능이 현저하게 향상되는 것을 확인할 수 있다.
Figure PCTKR2019003485-appb-I000002
Figure PCTKR2019003485-appb-I000003

Claims (1)

  1. 박쥐나방 동충하초로부터 분리하고, PDB배지에서 1주일간 배양한 YC1-4 균주 3㎖를, 세척 후 30㎖의 물을 첨가하여 살균한 번데기배지재료 50g에 접종한 다음 23℃의 명(明)조건에서 20일간 배양함으로써 배지 100g당 아데노신 생산량이 180㎎인 것을 특징으로 하는 박쥐나방 동충하초로부터 분리한 아데노신 고생산능 패실로마이세스 헤피알리(Paecillomyces hepiali) CS4 균주[수탁번호: KCTC 13285BP].
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