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WO2018212626A1 - 헴, 코프로포르피린 iii 및 우로포르피린 iii의 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 헴, 코프로포르피린 iii 및 우로포르피린 iii의 생산방법 - Google Patents

헴, 코프로포르피린 iii 및 우로포르피린 iii의 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 헴, 코프로포르피린 iii 및 우로포르피린 iii의 생산방법 Download PDF

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WO2018212626A1
WO2018212626A1 PCT/KR2018/005740 KR2018005740W WO2018212626A1 WO 2018212626 A1 WO2018212626 A1 WO 2018212626A1 KR 2018005740 W KR2018005740 W KR 2018005740W WO 2018212626 A1 WO2018212626 A1 WO 2018212626A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
iii
heme
recombinant microorganism
uroporphyrin
coproporphyrin
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/005740
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
한성옥
고영진
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고려대학교 산학협력단 filed Critical 고려대학교 산학협력단
Priority to US16/611,929 priority Critical patent/US11193152B2/en
Priority claimed from KR1020180056906A external-priority patent/KR102052134B1/ko
Publication of WO2018212626A1 publication Critical patent/WO2018212626A1/ko

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin

Definitions

  • the present invention is a recombinant microorganism with improved production capacity of heme, coproporphyrin III (Copro III) and uroporphyrin III (uroprophyrin III; Uro III) and heme, coproporphyrin III and uroporphyrin III using the same
  • L-glutamic acid L-glutamic acid
  • L-glutamic acid over-producing strain of the porphyrin metabolic pathway is a precursor of heme 5-aminolevulinic acid (5-aminolevulinic acid, ALA) and glutamyl-tRNA reductase (HemA), glutamate-1-semialdehyde aminotransferase (HemL) for the production of coproporphyrin III and uroporphyrin III
  • Heme is a porphyrin complex containing iron ions (Fe 2+ ), and is a pathway by the polymerization of succinyl-CoA and glycine (C4 pathway).
  • glutamate is synthesized in vivo through a pathway (C5 pathway) using ATP and NADPH coenzymes as starting materials. Preference for these two pathways varies from species to species.
  • 5-aminolevulinic acid synthase for the C4 pathway, glutamyl-tRNA synthetase (GltX) from glutamate for the C5 pathway, glutamyl-tRNA lysine Synthesis of 5-aminolevulinic acid (ALA) by the action of glutamyl-tRNA reductase (HemA) and glutamate-1-semialdehyde aminotransferase (HemL)
  • the heme metabolic pathway begins from and the heme synthesis is completed by incorporating iron ions into the protoporphyrin IX (Proto IX) by ferrochelatase (HemH) (Frankenberg, N., Moser, J. & Jahn, D., Appl. Microbiol.Biotechnol. 63: 115-127, 2003).
  • Porphyrin analogs include porphobilinogen (PBG), 1-hydroxymethylbilane (HMB), uroporphyrin I (Uro I), uroporphyrin III (uroporphyrin III, Uro III), Coproporphyrin I (Copro I), Coproporphyrin III (Copro III), Protoporphyrin IX (protoporphyrin IX) and the like.
  • Heme can be used as a source of iron in organic form.
  • Organic forms of iron are two times higher in vivo absorption than inorganic forms of iron, making them a better source of iron (Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 31: 333-367, 1992; Acta. Med. Scand 629: 1-46, 1980).
  • heme is highly applicable to iron feed, anemia treatment, and iron feed or feed additives in livestock applications.
  • various researches on applying heme such as improving protein activity and optical sensors, have been underway, and potential polymers have been suggested through the use of polymers synthesized with heme as precursors. have.
  • 5-Aminolevulinic acid is a precursor to heme and is used as an environmentally friendly biopesticide (photoactive herbicide) and plant growth promoter.
  • biopesticide photoactive herbicide
  • Crops such as rice and corn are known to promote 10-60% growth compared to untreated groups (Hotta, Y., Tanaka, T., Plant Growth Regulation 22: 109-114, 1997). It can also be used in medicine.
  • 5-aminolevulinic acid is currently used as a treatment for skin diseases such as acne and atopy, and for treating skin cancer, and is also used in cosmetics. In the field of livestock, it can be used as a growth accelerator for replacing antibiotics for the purpose of enhancing the autoimmunity of livestock and improving feed efficiency (Korea Patent Registration 10-0459918).
  • 5-aminolevulinic acid is known to be biosynthesized by two biosynthetic systems (C4 pathway or C5 pathway).
  • C4 compounds found in animals, fungi and aerobic bacteria are glycine and succinyl-CoA. Produced by condensation of CoA), and this reaction is catalyzed by 5-aminolevulinic acid synthase, a pyridoxal phosphate dependent enzyme.
  • Another pathway, C5 is found in plants, algae, and Escherichia coli, which are derived from glutamate from glutamyl-tRNA synthetase (GltX), glutamyl-tRNA reductase (HemA) and glutamate-1-semialdehyde amino. It is converted to 5-aminolevulinic acid by a series of reactions by transferase (HemL).
  • 5-aminolevulinic acid is produced using a complex organic synthesis method (Beale SI, et al., Phytochemistry, 18: 441, 1979), but due to its high production cost, it is not profitable, so Rhodobacter sphaeroides, Clostridium thermoaceticum, Methanobacterium thermoautotropicum, Agnemellum quadruplicum, Anacystis marina and Chlorella vulgaris
  • Rhodobacter sphaeroides Clostridium thermoaceticum, Methanobacterium thermoautotropicum, Agnemellum quadruplicum, Anacystis marina and Chlorella vulgaris
  • the molecular biological 5-aminolevulinic acid biosynthetic pathway has been identified through the isolation of the 5-aminolevulinic acid nutrient strain (ALA auxotrophy).
  • the 5-aminolevulinic acid synthase gene in the C4 pathway has two isozymes. (isozyme) It was found that hemA and hemT are present, while the C5 pathway is composed of hemA, hemL and hemM genes.
  • the present inventors have developed a recombinant microorganism having improved heme production capacity using Corynebacterium glutamicum , which overproduces L-glutamic acid, a starting material of the C5 production pathway of heme.
  • Corynebacterium glutamicum which overproduces L-glutamic acid, a starting material of the C5 production pathway of heme.
  • we used recombinant microorganisms that introduced genes that over-produce heme precursor 5-aminolevulinic acid, and transcription factors that regulate the transcription of genes involved in heme synthesis and degradation to improve heme biosynthesis.
  • heme, coproporphyrin III and uroporphyrin III can be produced in high yield, and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a recombinant microorganism with improved production capacity of heme, coproporphyrin III (Copro III) and uroporphyrin III (Uro III).
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing heme by culturing the recombinant microorganism in a medium containing iron ions (Fe 2+ ).
  • Still another object of the present invention is to provide a method for producing coproporphyrin III by culturing the recombinant microorganism.
  • Still another object of the present invention is to provide a method of producing uroporphyrin III by culturing the recombinant microorganism.
  • the present invention is a gene encoding glutamyl-tRNA reductase (HemA) in a microorganism having a glutamic acid (glutamic acid) generating ability, glutamate-1-semialdehyde aminotransase (Glutamic acid) generating ability, glutamate-1-semialdehyde aminotransase (Glutamic acid) generating ability, glutamate-1-semialdehyde aminotransase (Glutamic acid) generating ability, glutamate-1-semialdehyde aminotransase ( Provided are recombinant microorganisms in which a gene encoding glutamate-1-semialdehyde aminotransferase (HemL) and a gene encoding Diphtheria toxin Repressor (DtxR) are introduced.
  • HemL glutamate-1-semialdehyde aminotransferase
  • DtxR Diphtheria to
  • the invention also, (a) to produce a hem by being cultivated in a culture medium containing the recombinant microorganism iron ions (Fe 2+); And (b) provides a method for producing heme comprising the step of extracting and obtaining the resulting heme.
  • the present invention also comprises the steps of (a) culturing the recombinant microorganism to produce coproporphyrin III; And (b) provides a method for producing coproporphyrin III comprising the step of obtaining the resulting coproporphyrin III.
  • the present invention also comprises the steps of (a) culturing the recombinant microorganism to produce uroporphyrin III; And (b) provides a method for producing uroporphyrin III comprising the step of obtaining the produced uroporphyrin III.
  • FIG. 1 shows the structure of the overexpressed recombinant vector (pMT- tac ::: hemA ) of glutamyl-tRNA reductase (HemA) in E. coli and Corynebacterium glutamicum . It is shown.
  • Figure 2 shows the structure of the overexpressed recombinant vector (pMT- tac ::: hemL ) of glutamate-1-semialdehyde aminotransferase (HemL) in E. coli and Corynebacterium glutamiccum. It is shown.
  • Figure 3 is an overexpression recombinant vector (pMT- tac :::: hemAL of glutamyl-tRNA reductase (HemA) and glutamate-1-semialdehyde aminotransferase (HemL) in E. coli and Corynebacterium glutamiccum. ) Is shown.
  • pMT- tac hemAL of glutamyl-tRNA reductase
  • HemL glutamate-1-semialdehyde aminotransferase
  • Figure 4 shows the structure of the overexpressed recombinant vector (pMT- tac ::: dtxR ) of Diphtheria toxin Repressor (DtxR) in E. coli and Corynebacterium glutamiccum.
  • Figure 5 is E.coli and Corynebacterium glutamic mikkum from glutamyl -tRNA Li deokte rise (HemA) and glutamate-1-semi-aldehyde amino transferase raised (HemL) and diphtheria toxin repressor over-expressing recombinant vector of (DtxR) (pMT- tac ::: hemALdtxR ) shows the structure.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of a method for obtaining heme from recombinant Corynebacterium glutamiccum.
  • Figure 7 shows the heme production amount according to the extraction method of heme produced from recombinant microorganisms.
  • FIG. 8 shows the results of heme, coproporphyrin III (Copro III), uroporphyrin III (Uro III) and total porphyrin production of wild-type strains and respective recombinant microorganisms.
  • Figure 9 shows the heme production results according to the iron ion (Fe 2 + ) concentration of each recombinant microorganism.
  • FIG. 10 shows a comparison of the relative messenger RNA expression levels of recombinant microorganisms expressing HemA, HemL and recombinant microorganisms expressing HemA, HemL, and DtxR.
  • 5-aminolevulinic acid a precursor of heme, using a strain that overproduces L-glutamic acid, a starting material of porphyrin metabolic pathway, For production of ALA) and coproporphyrin III (Copro III) and uroporphyrin III (Uro III), glutamyl-tRNA reductase (HemA), glutamate-1 A gene encoding Diphtheria toxin Repressor (DtxR), a transcription factor capable of inducing the expression of glutamate-1-semialdehyde aminotransferase (HemL) and genes related to heme metabolic pathways, has been introduced. In the case of recombinant microorganisms that were found to be able to produce heme, coproporphyrin III and uroporphyrin III in high yield (Fig. 8).
  • the present invention a gene encoding glutamyl-tRNA reductase, a gene encoding glutamate-1-semialdehyde aminotransferase and a gene encoding a diphtheria toxin repressor are introduced into a microorganism having glutamic acid production ability.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism.
  • the recombinant microorganism may be characterized in that the production capacity of heme, coproporphyrin III and uroporphyrin III is improved.
  • the glutamyl-tRNA reductase may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • glutamate-1-semialdehyde aminotransase may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the diphtheria toxin refresher may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the glutamyl-tRNA reductase (HemA), glutamate-1-semialdehyde aminotransferase (HemL) and Diphtheria toxin Repressor (Diphtheria toxin Repressor) , DtxR) is hereinafter referred to as HemA, HemL, and DtxR.
  • the microorganism having the above-glutamic acid producing ability may be characterized in that the Corynebacterium glutamic mikkum (Corynebacterium glutamicum).
  • vector is meant a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in a suitable host.
  • Vectors can be plasmids, phage particles or simply potential genomic inserts. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are the most commonly used form of current vectors, “plasmid” and “vector” are sometimes used interchangeably in the context of the present invention.
  • plasmid vectors For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors.
  • Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication, including several to hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with plasmid vectors. It has a structure that includes an antibiotic resistance gene that allows it to be used and a restriction enzyme cleavage site (c) into which foreign DNA fragments can be inserted. Although no appropriate restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods facilitates ligation of the vector and foreign DNA.
  • the term "recombinant vector” generally refers to a fragment of a double strand of DNA as a recombinant carrier into which a fragment of heterologous DNA is inserted.
  • heterologous DNA refers to heterologous DNA, which is DNA not naturally found in host cells. Once in a host cell, the recombinant vector can replicate independently of the host chromosomal DNA and produce several copies of the vector and the inserted (heterologous) DNA thereof.
  • the gene or the recombinant vector is transformed or transfected into a host cell.
  • Many different types of techniques commonly used to introduce exogenous nucleic acids (DNA or RNA) into prokaryotic or eukaryotic host cells for "transformation” or “transfection”, such as electrophoresis, calcium phosphate precipitation, DEAE-dextran transfection or lipofection may be used.
  • an expression vector known in the art may be used as the vector used for overexpression of the gene according to the present invention.
  • the gene must be operably linked to transcriptional and translational expression control sequences that function in the chosen expression host.
  • the expression control sequence and the gene of interest are included in one recombinant vector including the bacterial selection marker and the replication origin. If the host cell is a eukaryotic cell, the recombinant vector must further comprise an expression marker useful in the eukaryotic expression host.
  • Host cells transformed with the recombinant vectors described above constitute another aspect of the present invention.
  • transformation means that DNA is introduced into a host so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
  • vectors function equally well to express the DNA sequences of the present invention.
  • hosts function equally for the same expression system.
  • those skilled in the art can make appropriate choices among various vectors, expression control sequences and hosts without departing from the scope of the present invention without undue experimental burden. For example, in selecting a vector, the host must be considered, since the vector must be replicated in it. The number of copies of the vector, the ability to control the number of copies, and the expression of other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, must also be considered.
  • preferred host cells are prokaryotic cells.
  • Suitable prokaryotic host cells include C. glutamicum ATCC 13826, C. glutamicum ATCC 13032, C. glutamicum ATCC 13761, C. glutamicum ATCC 13058, C. glutamicum ATCC 14067, C. glutamicum ATCC 13058, C. glutamicum ATCC 13745 but
  • the present invention is not limited thereto.
  • E. coli DH5 ⁇ , E. coli JM101, E. coli TOP10, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL1-Blue (Stratagene), E. coli B, E. coli E. coli strains such as BL21 and other prokaryotic species and genera may be used.
  • the present invention in another aspect, (a) culturing the recombinant microorganisms in a medium containing iron ions to produce heme; And (b) extracting and obtaining the resulting heme.
  • the iron ions are characterized by, and is characterized in that the addition in order to enable the dtxR gene, the addition of preferably an iron ion (Fe 2 SO 4) of 10 ⁇ 200 ⁇ M and, more preferably 160 ⁇ M of iron ions may be added.
  • an iron ion Fe 2 SO 4
  • the extraction of heme may be characterized by using acetone-acid treatment method.
  • the acid of the acetone-acid treatment method may be characterized in that the hydrogen chloride (HCl).
  • the acetone-acid treatment method may be characterized in that the mixture of 99% acetone and 1.6 M hydrogen chloride (HCl) mixture in a 95: 5 ratio.
  • the present invention in another aspect, (a) culturing the recombinant microorganism to produce coproporphyrin III; And (b) relates to a method for producing coproporphyrin III comprising the step of obtaining the resulting coproporphyrin III.
  • the present invention (a) culturing the recombinant microorganism to produce uroporphyrin III; And (b) relates to a method for producing uroporphyrin III comprising the step of obtaining the produced uroporphyrin III.
  • the hemA gene and the hemL gene were obtained from a constant expression recombinant vector for producing 5-aminolevulinic acid (Korean Patent No. 10-1326255), and the dtxR gene was obtained from Corynebacterium glutamiccum genomic DNA.
  • Each gene was synthesized each of the forward and reverse primers including the corresponding restriction enzyme sequence of the vector for cloning into a pMT- tac vector whose expression is regulated by lacI and has a high expression tac promoter. PCR was performed.
  • HemA amino acid sequence was SEQ ID NO: 1
  • HemL amino acid sequence was SEQ ID NO: 2
  • DtxR amino acid The sequence is shown in SEQ ID NO: 3
  • the nucleotide sequence of the hemA gene is SEQ ID NO: 4
  • the nucleotide sequence of the hemL gene is SEQ ID NO: 5
  • the nucleotide sequence of the dtxR gene is shown in SEQ ID NO: 6.
  • Example 2 Introduction of secured hemA, hemL genes into pMT-tac vector and transformation of the constructed recombinant vector into E. coli and Corynebacterium glutamiccum strains
  • a PCR fragment containing a gene of hemA obtained in Example 1 and a pMT-tac vector having a high expression tac promoter regulated by lacI were prepared. restriction enzyme and then treated with BamH1 and Cla1, was in progress the ligation reaction was then transformed into E. coli DH5a strain (wild-type E. coli) and Corynebacterium glutamic mikkum KCTC 3017 strain.
  • Example 1 Treated with Example 1 pMT-tac vector with high expression of the tac promoter whose expression is controlled by a PCR fragment with lacI containing the gene of hemL obtained in order to construct a recombinant vector expressing HemL with restriction enzyme BamH1 and Kpn1 Then, the ligation reaction was carried out and then transformed into E. coli DH5a strain (wild-type Escherichia coli) and Corynebacterium glutamiccum KCTC 3017 strain.
  • the transformed recombinant vector is as shown in Figure 2, named pMT- tac :: hemL .
  • the recombinant microorganism into which the recombinant vector of FIG. 2 was inserted into Escherichia coli was named E. coli DH5a pMT- tac :: hemL
  • the recombinant microorganism inserted into Corynebacterium glutamicum KCTC 3017 was Corynebacterium glutamicum KCTC 3017 pMT- tac :: hemL .
  • the transformed recombinant vector is as shown in Figure 3, named pMT- tac :: hemAL .
  • a PCR fragment containing the gene of dtxR obtained in Example 1 and a pMT- tac vector having a high expression tac promoter regulated by lacI were treated with restriction enzyme Not1.
  • the ligation reaction was carried out and then transformed into E. coli DH5a strain and Corynebacterium glutamiccum KCTC 3017 strain.
  • the transformed recombinant vector is as shown in Figure 4, named pMT- tac :: dtxR .
  • Recombinant microorganism inserted the recombinant vector of E. coli was named E. coli DH5a pMT- tac :: dtxR and the recombinant microorganism inserted in Corynebacterium glutamiccum KCTC 3017 is Corynebacterium glutamiccum KCTC 3017 It was named pMT- tac :: dtxR .
  • PCR fragment containing the dtxR gene obtained in Example 1 and pMT- tac :: hemAL vector prepared in Example 2 were treated with Not1 , followed by ligation. After the reaction, the strain was transformed into E. coli DH5a strain and Corynebacterium glutamiccum KCTC 3017 strain.
  • the transformed recombinant vector is as shown in Figure 5, named pMT- tac :: hemALdtxR .
  • the recombinant microorganism into which the recombinant vector of FIG. 5 was inserted into Escherichia coli was named E. coli DH5a pMT- tac :: hemALdtxR . 3017 pMT- tac :: hemALdtxR .
  • Acetone (hydrogen chloride (HCl) addition) extraction method of heme proceeded to the result of culturing Corynebacterium glutamiccum KCTC 3017 pMT- tac :: hemALdtxR prepared in Example 4.
  • the recombinant microorganism contains 50 mL of CGXII (20 g (NH 4 ) 2 SO 4 , 5 g urea, 1 g K 2 HPO 4 , 1 g KH 2 PO 4 , 10 mg per liter of distilled water containing 4% glucose).
  • the yield of heme was compared. Cultivation was carried out for 72 hours at 30 ° C. and 150 rpm, and the conditions for expression of each protein were expressed in IPTG in a 100 mL CGXII liquid medium flask. Fe 2 SO 4 ) was added, and the other analytical methods were performed in the same manner as in Example 5. As shown in Figure 9, it was confirmed that the highest production yield of heme at a concentration of iron ions (Fe 2+ ) of 160 ⁇ M.
  • the recombinant microorganisms overexpressing dtxR was the highest in all recombinant microorganisms, including Corynebacterium glutamicumcum wild-type strains, rather than the recombinant microorganisms into which hemA and hemL genes were introduced. It confirmed that the production yield of was shown.
  • Example 8 Comparative experiment of relative messenger RNA (mRNA) expression levels in recombinant microorganisms expressing HemA, HemL and recombinant microorganisms expressing HemA, HemL, and DtxR
  • Corynebacterium glutamic mikkum KCTC 3017 pMT- tac :: hemALdtxR as in a Corynebacterium glutamic mikkum KCTC 3017 pMT- tac :: hemAL relative expression level of messenger RNA produced in Example 2 prepared in Example 4 Compared. Corynebacterium glutamiccum recombinant microorganisms and wild-type strains were cultured for 12 hours at 30 ° C. and 150 rpm in a 100 ml CGXII liquid medium flask containing 4% glucose. Proceeded.
  • the recombinant Corynebacterium glutamiccum prepared in Example 4 in which DtxR was expressed with HemA and HemL was shown in FIG.
  • RNA expression levels of genes related to the heme and porphyrin biosynthetic pathways were higher than the recombinant Corynebacterium glutamicum.
  • the relative messenger RNA expression levels of the hrrA gene encoding the transcriptional regulator HrrA which inhibits the expression of heme metabolic pathway genes, were further reduced. This means that additional expression of DtxR enhances messenger RNA expression of heme metabolic pathways.
  • HemA glutamyl-tRNA reductase
  • HemL glutamate-1-semialdehyde aminotransferase
  • DtxR Diphtheria toxin Repressor
  • Heme, coproporphyrin III (Copro III) and uroporphyrin III (Uro III) can be economically produced by regulating expression with one transcription factor, the diphtheria toxin repressor.

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Abstract

본 발명은 헴(heme), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III, Copro III) 및 우로포르피린 III(uroporphyrin III, Uro III)의 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 헴, 코프로포르피린 III 및 우로포르피린 III의 생산 방법에 관한 것으로, 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA), 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL) 및 헴 대사경로 관련 유전자의 발현을 유도할 수 있는 전사인자인 디프테리아 톡신 리프레서(Diphtheria toxin Repressor, DtxR)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물을 이용하는 경우 포르피린(porphyrin) 계열 구조물들을 높은 수율로 생산할 수 있으며 경제적이다.

Description

헴, 코프로포르피린 III 및 우로포르피린 III의 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 헴, 코프로포르피린 III 및 우로포르피린 III의 생산방법
본 발명은 헴(heme), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III; Copro III) 및 우로포르피린 III(uroporphyrin III; Uro III)의 생산능력이 향상된 재조합 미생물 및 이를 이용한 헴, 코프로포르피린 III 및 우로포르피린 III의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 포르피린 (porphyrin) 대사경로의 개시물질인 L-글루탐산(L-glutamic acid) 과생산 균주에 헴의 전구물질인 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, ALA)과 코프로포르피린 III 및 우로포르피린 III의 생산을 위해 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA), 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL) 및 헴 대사경로 관련 유전자의 발현을 유도할 수 있는 전사인자인 디프테리아 톡신 리프레서(Diphtheria toxin Repressor, DtxR)를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물 및 이를 이용한 헴, 코프로포르피린 III 및 우로포르피린 III의 생산방법에 관한 것이다.
헴(heme)은 철 이온(Fe2+)을 함유한 포르피린(porphyrin) 복합체(complex)이며, 숙시닐-코에이(succinyl-CoA)와 글리신(glycine)의 중합반응에 의한 경로(C4 경로) 또는 글루타메이트(glutamate)를 출발물질로 ATP, NADPH 조효소를 사용하는 경로(C5 경로)를 통하여 생체 내에서 합성된다. 이 두 경로에 대한 선호도는 종에 따라 다르다. C4 경로의 경우 5-아미노레불린산 합성효소(5-aminolevulinic acid synthase, ALAS)의 작용, C5 경로의 경우 글루타메이트로부터 글루타밀-tRNA 합성효소(glutamyl-tRNA synthetase, GltX), 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA) 및 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL)의 작용에 의한 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid, ALA)의 합성으로부터 헴 대사경로는 시작되며, 철 이온이 페로케라타아제(ferrochelatase, HemH)에 의해 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX, Proto IX)에 삽입(integration)됨으로써 헴의 합성이 완료된다(Frankenberg, N., Moser, J. & Jahn, D., Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 115-127, 2003).
헴 생합성 과정에서는 다양한 포르피린 유사체(derivatives)들이 생성된다. 포르피린 유사체로는 포르포빌리노겐(porphobilinogen, PBG), 1-하이드록시메틸빌란(1-hydroxymethylbilane, HMB), 우로포르피린 I(uroporphyrin I, Uro I), 우로포르피린 III(uroporphyrin III, Uro III), 코프로포르피린 I(coproporphyrin I, Copro I), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III, Copro III), 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX) 등이 있다.
헴은 산소 전달(oxygen transfer), 활성산소(reactive oxygen) 제거, 에너지 생산과 관련한 전자 전달(electron transfer)에 있어 중요한 역할을 한다(Einstein, A., B. Podolsky, Cell 122: 487-489, 2005). 포르피린 유사체나 복합체 중에 상업적으로 그 중요성이 특히 높은 것이 바로 헴이다. 헴은 유기형태의 철분 공급원으로 활용될 수 있다. 유기형태의 철분제는 생체 내 흡수율이 무기형태의 철분제에 비하여 2배 정도 높아서 보다 우수한 철분 공급원으로 인정받고 있다(Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 31: 333-367, 1992; Acta. Med. Scand. 629: 1-46, 1980). 이러한 이유로 헴은 철분 공급제나 빈혈 치료제, 축산분야에서의 철분 공급제나 사료 첨가제로서의 활용 가능성이 매우 높다. 또한, 최근 생명공학 분야에서 단백질의 활성 향상이나 광센서 등 헴을 응용한 다양한 연구가 진행되고 있으며, 헴을 전구물질로 합성한 중합체를 통해 전도성 바이오 플라스틱으로서의 가능성이 제시되어 활용 가능한 분야가 확대되고 있다.
5-아미노레불린산은 헴의 전구체로서, 친환경적인 생물 농약(광활성 제초제) 및 식물 생장 촉진제로 활용되고 있는데, 5-아미노레불린산을 저농도로 처리할 경우에 무, 강낭콩, 보리, 감자, 마늘, 벼, 옥수수 같은 작물 등에서 처리하지 않은 군과 비교하여 10-60%의 생육을 촉진한다고 알려져 있다(Hotta, Y., Tanaka, T., Plant Growth Regulation 22: 109-114, 1997). 또한 의약부분에서도 활용이 가능하다. 5-아미노레불린산은 여드름, 아토피 등의 피부질환 치료제나 피부암 치료제 등으로 현재 활용되고 있으며, 화장품에도 사용되고 있다. 축산분야에서도 가축의 자가 면역력을 증진시키고 사료 효율을 향상시키고자 하는 목적으로의 항생제 대체용 성장 촉진제로 활용될 수 있다(대한민국 등록특허 10-0459918).
5-아미노레불린산은 두 가지의 생합성계(C4 경로 또는 C5 경로)에 의하여 생합성되는 것으로 알려져 있는데, 동물, 진균, 호기성 세균류 등에서 발견되는 C4 계는 글리신(glycine)과 숙시닐-CoA(succinyl - CoA)의 축합에 의하여 생성되며, 이 반응은 피리독살 인산 의존성(pyridoxal phosphate dependent) 효소인 5-아미노레불린산 합성효소에 의하여 촉매된다. 또 다른 경로인 C5계는 식물, 조류, 대장균 등에서 발견되고 있으며, 이 경로는 글루타메이트로부터 글루타밀-tRNA 합성효소(GltX), 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(HemA) 및 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(HemL)에 의한 일련의 반응에 의해서 5-아미노레불린산으로 전환된다.
현재 5-아미노레불린산은 복잡한 유기 합성법을 이용하여 생산하고 있으나(Beale S.I., et al., Phytochemistry, 18:441, 1979), 생산 단가가 높아서 채산성이 없으므로, 로도박터 스패로이데(Rhodobacter sphaeroides), 클로스트리디움 써모아세티움(Clostridium thermoaceticum), 메타노박터리움 써모오토트로피컴(Methanobacterium thermoautotropicum), 아그네멜룸 쿠아드러프리컴(Agnemellum quadruplicum), 아나시스티스 마리나(Anacystis marina) 및 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 등 미생물의 발효를 이용한 5-아미노레불린산의 생산법 및 그 이용에 관한 연구들이 진행되고 있다(Sasaki K., et al., J. Ferment. Technol., 65:511, 1987; Sasaki K., et al., Biotechnol. Lett., 15:859(1993); Tanaka T., et al., Biotechnol. Lett., 13:589, 1991; Janschen R., et al., FEMS Microb. Lett., 12:167, 1981; Kipe-Not J.A. and Steven S.E., Plant Physiol., 65:126, 1980; Beale S.I., and Castelfranco P.A., Plant Physiol., 53:297, 1974).
분자 생물학적인 5-아미노레불린산 생합성 경로는 5-아미노레불린산 영양 요구 변이주(ALA auxotrophy)의 분리를 통하여 밝혀졌는데, C4 경로의 5-아미노레불린산 합성효소 유전자는 두 가지의 동위효소(isozyme) hemA 및 hemT가 존재하는 것으로 밝혀졌고, 반면에 C5 경로는 hemA, hemL 및 hemM 유전자들에 의하여 구성되어 있다. 이러한 미생물에 의한 5-아미노레불린산의 합성 증대를 위하여 전구체를 배양액 중에 보강하거나 유기 폐자원으로부터 저급 지방산의 분리 및 첨가 효과 등에 관한 연구가 있었으며, pH, 온도의 조절, 산소의 공급, 광합성 세균들의 경우에는 빛의 조사 등에 의한 5-아미노레불린산 생성량의 증가에 관한 연구 등도 보고되었다(한국미생물·생명공학회지, 37권 2호, pp.153-15, 2009). 그러나 아직까지 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴을 효율적으로 생산할 수 있는 생물학적 방법의 개발은 미흡한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 헴의 C5 생산 경로의 개시물질인 L-글루탐산(L-glutamic acid)을 과생산하는 코리네박테리움 글루타믹쿰(Corynebacterium glutamicum)을 이용하여 헴의 생산능이 향상된 재조합 미생물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 헴의 전구물질인 5-아미노레불린산을 과생산하는 유전자 및 헴 생합성을 향상시키기 위해 헴 합성과 분해에 관련된 유전자들의 전사를 조절하는 전사인자를 도입한 재조합 미생물을 이용할 경우, 기존의 헴 생산능을 가지는 미생물과 비교하여 높은 수율로 헴, 코프로포르피린 III 및 우로포르피린 III을 생산할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은, 헴(heme), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III, Copro III) 및 우로포르피린 III(uroporphyrin III, Uro III)의 생산능이 향상된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 미생물을 철 이온(Fe2+)을 포함하는 배지에서 배양하여 헴을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 미생물을 배양하여 코프로포르피린 III을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 미생물을 배양하여 우로포르피린 III을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루탐산(glutamic acid) 생성능을 가지는 미생물에 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA)를 코딩하는 유전자, 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL)를 코딩하는 유전자 및 디프테리아 톡신 리프레서(Diphtheria toxin Repressor, DtxR)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 철 이온(Fe2+)을 포함하는 배지에서 배양하여 헴을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 헴을 추출 및 수득하는 단계를 포함하는 헴의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 코프로포르피린 III을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 코프로포르피린 III을 수득하는 단계를 포함하는 코프로포르피린 III의 생산방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 우로포르피린 III을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 우로포르피린 III을 수득하는 단계를 포함하는 우로포르피린 III의 생산방법을 제공한다.
도 1은 E. coli 및 코리네박테리움 글루타믹쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA)의 과발현 재조합 벡터(pMT-tac:::hemA)의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 E. coli 및 코리네박테리움 글루타믹쿰에서 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL)의 과발현 재조합 벡터(pMT-tac:::hemL)의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 E. coli 및 코리네박테리움 글루타믹쿰에서 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(HemA)와 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(HemL)의 과발현 재조합 벡터(pMT-tac:::hemAL)의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 E. coli 및 코리네박테리움 글루타믹쿰에서 디프테리아 톡신 리프레서(Diphtheria toxin Repressor, DtxR)의 과발현 재조합 벡터(pMT-tac:::dtxR)의 구조를 나타낸 것이다.
도 5은 E.coli 및 코리네박테리움 글루타믹쿰에서 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(HemA)와 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(HemL) 및 디프테리아 톡신 리프레서(DtxR)의 과발현 재조합 벡터(pMT-tac:::hemALdtxR)의 구조를 나타낸 것이다.
도 6은 재조합 코리네박테리움 글루타믹쿰에서 헴(heme)을 획득하기 위한 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 재조합 미생물로부터 생산된 헴의 추출 방법에 따른 헴 생산량을 나타낸 것이다.
도 8은 야생형 균주와 각 재조합 미생물의 헴, 코프로포르피린 III(coproporphyrin III, Copro III), 우로포르피린 III(uroporphyrin III, Uro III) 및 전체 포르피린(porphyrin) 생산량 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 각 재조합 미생물의 철 이온(Fe2+) 농도에 따른 헴 생산량 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 HemA, HemL을 발현하는 재조합 미생물과 HemA, HemL 및 DtxR을 발현하는 재조합 미생물의 상대적 전령 RNA 발현 수준 비교 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 포르피린(porphyrin) 대사경로의 개시물질인 L-글루탐산(L-glutamic acid)을 과생산하는 균주를 이용하여 헴(heme)의 전구물질인 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid; ALA)과 코프로포르피린 III(coproporphyrin III; Copro III) 및 우로포르피린 III(uroporphyrin III; Uro III)의 생산을 위해, 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA), 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL) 및 헴 대사경로 관련 유전자의 발현을 유도할 수 있는 전사인자인 디프테리아 톡신 리프레서(Diphtheria toxin Repressor, DtxR)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물의 경우 높은 수율로 헴, 코프로포르피린 III 및 우로포르피린 III을 생산할 수 있는 것을 확인하였다(도 8).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 글루탐산 생성능을 가지는 미생물에 글루타밀-tRNA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자, 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈를 코딩하는 유전자 및 디프테리아 톡신 리프레서를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 헴, 코프로포르피린 III 및 우로포르피린 III의 생산능이 향상된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 글루타밀-tRNA 리덕테이즈는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 디프테리아 톡신 리프레서는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA), 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL) 및 디프테리아 톡신 리프레서(Diphtheria toxin Repressor, DtxR)를 이하 HemA, HemL 및 DtxR로 표기한다.
본 발명에 있어서, 상기 글루탐산 생성능을 가지는 미생물은 코리네박테리움 글루타믹쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 재조합 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
라이게이션 후에, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 형질전환 또는 트랜스펙션(transfection)된다. "형질전환" 또는 "트랜스펙션"시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 발명에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적인 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 C. glutamicum ATCC 13826, C. glutamicum ATCC 13032, C. glutamicum ATCC 13761, C. glutamicum ATCC 13058, C. glutamicum ATCC 14067, C. glutamicum ATCC 13058, C. glutamicum ATCC 13745 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, E. coli DH5α, E. coli JM101, E. coli TOP10, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL1-Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli BL21 등과 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(species) 및 속(genera)등이 사용될 수 있다.
본 발명에서는, HemA, HemL 및 DtxR을 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 철 이온(Fe2+)을 포함하는 배지에서 배양한 후에, 아세톤-산 처리 방법으로 헴을 추출하여 생산량을 비교한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 160 μM의 철 이온 농도에서 가장 높은 헴의 생산 수율을 가지는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 철 이온을 포함하는 배지에서 배양하여 헴을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 헴을 추출 및 수득하는 단계를 포함하는 헴의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 철 이온은 dtxR 유전자를 활성화하기 위하여 첨가하는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 10 ~ 200 μM의 철 이온(Fe2SO4)을 첨가하는 것을 특징으로 하며, 더욱 바람직하게는 160 μM의 철 이온을 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 헴의 추출은 아세톤-산 처리 방법을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아세톤-산 처리 방법의 산은 염화수소(HCl)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아세톤-산 처리방법은 99% 아세톤과 1.6 M 염화수소(HCl) 혼합물이 95 : 5 비율로 혼합된 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는, HemA, HemL 및 DtxR를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물이 코리네박테리움 글루타믹쿰 야생형 균주에 비하여 코프로포르피린 III 과 우로포르피린 III의 생산 수율이 높은 것을 확인하였다(도 8).
따라서 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 코프로포르피린 III을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 코프로포르피린 III을 수득하는 단계를 포함하는 코프로포르피린 III의 생산방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 우로포르피린 III을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 우로포르피린 III을 수득하는 단계를 포함하는 우로포르피린 III의 생산방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: hemA, hemL 및 dtxR 유전자 확보
hemA 유전자와 hemL 유전자는 기존 5-아미노레불린산 생산용 항시성 발현 재조합 벡터(대한민국 등록특허 10-1326255)로부터 확보하였으며, dtxR 유전자는 코리네박테리움 글루타믹쿰 지노믹 DNA로부터 확보하였다. 각각의 유전자는 lacI에 의해 발현이 조절되고 고발현 tac 프로모터를 가지는 pMT-tac 벡터로 클로닝하기 위하여 벡터의 해당 제한효소 서열을 포함하여 각각의 정, 역방향 프라이머를 합성하였으며, 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
그 결과, 1263bp의 hemA 유전자와 1263bp의 hemL 유전자와 2562bp의 hemAL 유전자를 확보하였고 687bp의 dtxR 유전자를 확보하였으며, 각각 HemA의 아미노산 서열은 서열번호 1, HemL의 아미노산 서열은 서열번호 2, DtxR의 아미노산 서열은 서열번호 3, hemA 유전자의 염기서열은 서열번호 4, hemL 유전자의 염기서열은 서열번호 5, dtxR 유전자의 염기서열은 서열번호 6으로 나타내었다.
Figure PCTKR2018005740-appb-T000001
실시예 2: 확보된 hemA, hemL 유전자의 pMT-tac 벡터로의 도입 및 구축된 재조합 벡터의 대장균과 코리네박테리움 글루타믹쿰 균주로의 형질전환
HemA를 발현하는 재조합 벡터를 구축하기 위해 실시예 1에서 얻은 hemA의 유전자를 포함하는 PCR 단편과 lacI에 의해 발현이 조절되는 고발현 tac 프로모터를 가진 pMT-tac 벡터(대한민국 등록특허 10-1756338)를 제한효소 BamH1과 Cla1로 처리한 후, 라이게이션 반응을 진행하였고 이 후 E. coli DH5a 균주 (야생형 대장균)와 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 균주로 형질전환하였다.
형질전환된 재조합 벡터는 도 1에 나타낸 바와 같으며, pMT-tac::hemA이라 명명하였다. 도 1의 재조합 벡터를 대장균에 삽입한 재조합 미생물은 E. coli DH5a pMT-tac::hemA이라 명명하였으며, 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017에 삽입한 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemA이라 명명하였다.
HemL을 발현하는 재조합 벡터를 구축하기 위해 실시예 1에서 얻은 hemL의 유전자를 포함하는 PCR 단편과 lacI에 의해 발현이 조절되는 고발현 tac 프로모터를 가진 pMT-tac 벡터를 제한효소 BamH1과 Kpn1로 처리한 후, 라이게이션 반응을 진행하였고 이 후 E. coli DH5a 균주 (야생형 대장균)와 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 균주로 형질전환하였다.
형질전환된 재조합 벡터는 도 2에 나타낸 바와 같으며, pMT-tac::hemL이라 명명하였다. 도 2의 재조합 벡터를 대장균에 삽입한 재조합 미생물은 E. coli DH5a pMT-tac::hemL이라 명명하였으며, 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017에 삽입한 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemL이라 명명하였다.
HemA와 HemL를 동시에 발현하는 재조합 벡터를 구축하기 위해 실시예 1에서 얻은 hemA와 hemL 유전자를 포함하는 PCR 단편과 lacI에 의해 발현이 조절되는 고발현 tac 프로모터를 가진 pMT-tac 벡터를 제한효소 BamH1과 Not1로 처리한 후, 라이게이션 반응을 진행하였고 이 후 E. coli DH5a 균주 (야생형 대장균)와 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 균주로 형질전환하였다.
형질전환된 재조합 벡터는 도 3에 나타낸 바와 같으며, pMT-tac::hemAL이라 명명하였다. 도 3의 재조합 벡터를 대장균에 삽입한 재조합 미생물은 E. coli DH5a pMT-tac::hemAL이라 명명하였으며, 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017에 삽입한 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemAL이라 명명하였다.
실시예 3: 확보된 dtxR 유전자의 pMT-tac 벡터로의 도입 및 구축된 재조합 벡터의 대장균과 코리네박테리움 글루타믹쿰 균주로의 형질전환
DtxR을 발현하는 재조합 벡터를 구축하기 위해 실시예 1에서 얻은 dtxR의 유전자를 포함하는 PCR 단편과 lacI에 의해 발현이 조절되는 고발현 tac 프로모터를 가진 pMT-tac 벡터를 제한효소 Not1로 처리한 후, 라이게이션 반응을 진행하였고 이 후 E.coli DH5a 균주와 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 균주로 형질전환하였다.
형질전환된 재조합 벡터는 도 4에 나타낸 바와 같으며, pMT-tac::dtxR이라 명명하였다. 도 4의 재조합 벡터를 대장균에 삽입한 재조합 미생물은 E. coli DH5a pMT-tac::dtxR이라 명명하였으며 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017에 삽입한 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::dtxR이라 명명하였다.
실시예 4: 확보된 hemA, hemL 및 dtxR 유전자의 pMT-tac 벡터로의 도입 및 구축된 재조합 벡터의 대장균과 코리네박테리움 글루타믹쿰 균주로의 형질전환
HemA, HemL 및 DtxR을 발현하는 재조합 벡터를 구축하기 위하여, 실시예 1에서 얻은 dtxR 유전자를 포함하는 PCR 단편과 실시예 2에서 제작한 pMT-tac::hemAL 벡터를 Not1로 처리한 후, 라이게이션 반응을 진행한 후 E. coli DH5a 균주와 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 균주로 형질전환하였다.
형질전환된 재조합 벡터는 도 5에 나타낸 바와 같으며, pMT-tac::hemALdtxR이라 명명하였다. 도 5의 재조합 벡터를 대장균에 삽입한 재조합 미생물은 E. coli DH5a pMT-tac::hemALdtxR이라 명명하였으며, 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017에 삽입한 재조합 미생물은 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemALdtxR이라 명명하였다.
실시예 5: 재조합 미생물로부터 생산된 헴의 아세톤(염화수소 추가) 추출 방법 및 이를 통한 야생형 균주와 각 재조합 미생물의 헴 생산량 비교 실험
헴의 아세톤(염화수소(HCl) 추가) 추출 방법은 실시예 4에서 제작한 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemALdtxR를 배양한 결과물로 진행하였다. 재조합 미생물은 4%의 glucose가 포함된 50 mL의 CGXII(1 L의 증류수 당 20 g (NH4)2SO4, 5 g urea, 1 g K2HPO4, 1 g KH2PO4, 10 mg CaCl2, 0.25 g MgSO4·7H2O, 10 mg FeSO4·7H2O, 10 mg MnSO4·H2O, 1 mg ZnSO4·7H2O, 0.31 mg CuSO4·5H2O, 0.02 mg NiCl2·6H2O, 0.2 mg biotin을 포함하는 성분의 배지) 액체 배지 플라스크에서 HemA, HemL 및 DtxR 단백질이 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 발현되도록 하는 조건을 조성하여 30 ℃, 150 rpm에서 72시간 동안 배양을 진행하였다. 72시간 배양 후, 세포를 펠렛(pellet)으로 확보하기 위해 배양 결과물을 4 ℃에서 13000 rpm으로 5분 동안 원심분리를 진행하여 잔여 배양액을 제거하였다. 세포 펠렛은 99% 아세톤과 1.6 M 염화수소(HCl) 혼합물(95:5)로 처리하고 30초간 볼택싱(Vortexing)하여 파쇄시킨 후에 0.1 N 수산화나트륨(NaOH)에 희석하였다. 이 추출 방법의 전체 모식도는 도 4에 나타낸 바와 같다. 생산된 헴의 농도는 HPLC(high performance liquid chromatography)를 통하여 측정하였으며, 분석 결과는 도 7에 나타낸 바와 같이, 동일한 샘플에서 본 발명의 최적화된 99% 아세톤과 1.6 M 염화수소(HCl) 혼합물(95:5)의 아세톤-산 처리 방법을 사용할 경우, 비드(bead)를 이용한 물리적인 세포 파쇄법에 비하여 1.42배 증가된 헴의 추출이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 2, 3 및 4에서 제작한 각 재조합 미생물과 코리네박테리움글루타믹쿰 야생형 균주에서의 헴의 생산 수율은 아세톤-산 처리 방법을 이용하여 추출한 헴을 비교하여 측정하였다. 코리네박테리움 글루타믹쿰 재조합 미생물과 야생형 균주는 4%의 glucose가 포함된 100 mL의 CGXII 액체 배지 플라스크 (철 이온(Fe2+) 160 μM 첨가)에서 각 단백질이 IPTG로 발현되도록 하는 조건을 조성하여 30 ℃, 150 rpm에서 72시간 동안 배양을 진행하였으며, 이 외 분석 방법은 위와 동일하다. 도 8에 나타낸 바와 같이, hemA, hemL 및 dtxR 유전자가 도입된 재조합 미생물이 가장 높은 헴 생산량을 보였고 코리네박테리움 글루타믹쿰 야생형 균주에 비하여 6.7배 더 높은 헴 생산 수율을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 6: HemA, HemL 및 DtxR을 발현하는 재조합 미생물의 각 철 이온 농도에 따른 헴 생산량 비교 실험
실시예 4에서 제작한 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemALdtxR을 이용하여 dtxR 유전자가 활성화 가능한 배양 조건을 최적화하기 위하여, 배양 배지 내 철 이온(Fe2+)의 농도에 따른 헴의 생산량을 비교하였다. 배양은 100 mL의 CGXII 액체 배지 플라스크에서 각 단백질이 IPTG로 발현되도록 하는 조건을 조성하여 30 ℃, 150 rpm에서 72시간 동안 배양을 진행하고 플라스크마다 각각 40, 80, 120, 160 μM의 철 이온(Fe2SO4)을 추가하였으며, 이 외 분석 방법은 실시예 5와 동일하게 진행하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 160 μM의 철 이온(Fe2+) 농도에서 가장 높은 헴의 생산 수율을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 7: 야생형 균주와 각 재조합 미생물의 코프로포르피린 III, 우로포르피린 III 생산량 비교 실험
실시예 2, 3 및 4에서 제작한 각 재조합 미생물과 코리네박테리움 글루타믹쿰 야생형 균주에서의 코프로포르피린 III, 우로포르피린 III의 생산은 균주 배양액의 상등액을 수득하여 진행하였다. 코리네박테리움 글루타믹쿰 재조합 미생물과 야생형 균주는 4%의 glucose가 포함된 100 mL의 CGXII 액체 배지 플라스크에서 각 단백질이 IPTG로 발현되도록 하는 조건을 조성하여 30 ℃, 150 rpm에서 72시간 동안 배양을 진행하였으며, 생산된 코프로포르피린 III, 우로포르피린 III의 농도는 400 nm 파장에서 HPLC를 통하여 측정하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, hemA 및 hemL 유전자가 도입된 재조합 미생물 보다 추가적으로 dtxR이 과발현된 재조합 미생물이 코리네박테리움 글루타믹쿰 야생형 균주를 포함한 모든 재조합 미생물에서 가장 높은 코프로포르피린 III, 우로포르피린 III의 생산 수율을 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 8: HemA, HemL을 발현하는 재조합 미생물과 HemA, HemL 및 DtxR을 발현하는 재조합 미생물에서의 상대적 전령 RNA (messenger RNA, mRNA) 발현 수준 비교 실험
실시예 4에서 제작한 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemALdtxR과 실시예 2에서 제작한 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemAL의 상대적 전령 RNA 발현 수준을 비교하였다. 코리네박테리움 글루타믹쿰 재조합 미생물과 야생형 균주는 4%의 glucose가 포함된 100ml의 CGXII 액체 배지 플라스크에서 각 단백질이 IPTG로 발현되도록 하는 조건을 조성하여 30 ℃, 150 rpm에서 12시간 동안 배양을 진행하였다. 이를 통해 확보된 샘플에서 전체 RNA를 추출 후 역전사 효소 (Bioneer, M-MLV reverse transcriptase)를 통해 cDNA로 합성하였고, SYBR green 기반의 Real time PCR (Qiagen)분석을 통해 전령 RNA 발현 수준을 비교하였다. 실시예 2에서 제작한 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemAL의 전령 RNA의 발현 수준을 1로 설정하고, 실시예 4에서 제작한 코리네박테리움 글루타믹쿰 KCTC 3017 pMT-tac::hemALdtxR의 상대적 전령 RNA의 발현 수준을 비교하였을 때, 도 10에 나타낸 바와 같이 DtxR이 HemA, HemL과 함께 발현된 실시예 4에서 제작한 재조합 코리네박테리움 글루타믹쿰은 실시예 2에서 제작한 재조합 코리네박테리움 글루타믹쿰 보다 헴 및 포르피린 생합성 경로와 관련된 유전자들(hemA, hemL, hemB, hemC, hemD, hemE, hemY)의 상대적 전령 RNA 발현 수준이 더 높은 것으로 나타났다. 하지만 헴 대사경로 유전자들의 발현을 억제하는 transcriptional regulator HrrA를 코딩하는 hrrA 유전자의 상대적 전령 RNA 발현 수준은 더 감소하는 것을 확인하였다. 이것은 DtxR의 추가적인 발현이 헴 대사경로의 전령 RNA 발현을 향상시키는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA)를 코딩하는 유전자, 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL)를 코딩하는 유전자 및 디프테리아 톡신 리프레서(Diphtheria toxin Repressor, DtxR)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물을 이용할 경우, 포르피린(porphyrin) 계열 구조물들을 높은 수율로 생산할 수 있고, 또한 많은 효소들이 관여하는 헴 대사경로 상 관련 유전자들의 발현을 하나의 전사인자인 디프테리아 톡신 리프레서로 조절함으로서 헴(heme), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III, Copro III) 및 우로포르피린 III(uroporphyrin III, Uro III)을 경제적으로 생산할 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (12)

  1. 글루탐산(glutamic acid) 생성능을 가지는 미생물에 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA)를 코딩하는 유전자, 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL)를 코딩하는 유전자 및 디프테리아 톡신 리프레서(Diphtheria toxin Repressor, DtxR)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 헴(heme), 코프로포르피린 III(coproporphyrin III, Copro III) 및 우로포르피린 III(uroporphyrin III, Uro III)의 생산능이 향상된 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글루타밀-tRNA 리덕테이즈(glutamyl-tRNA reductase, HemA)는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼레이즈(glutamate-1-semialdehyde aminotransferase, HemL)는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 디프테리아 톡신 리프레서(Diphtheria toxin Repressor, DtxR)는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 글루탐산(glutamic acid) 생성능을 가지는 미생물은 코리네박테리움 글루타믹쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  7. 다음 단계를 포함하는 헴(heme)의 생산방법:
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 철 이온(Fe2+)을 포함하는 배지에서 배양하여 헴을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 헴을 추출 및 수득하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 (b)단계의 추출은 아세톤-산 처리 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 생산방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 산은 염화수소(HCl)인 것을 특징으로 하는 생산방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 (a)단계의 배지 내에 포함되는 철 이온(Fe2+)의 농도는 10 ~ 200 μM인 것을 특징으로 하는 생산방법.
  11. 다음 단계를 포함하는 코프로포르피린 III(coproporphyrin III, Copro III)의 생산방법:
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 코프로포르피린 III을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 코프로포르피린 III을 수득하는 단계.
  12. 다음 단계를 포함하는 우로포르피린 III(uroporphyrin III, Uro III)의 생산방법:
    (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 우로포르피린 III 을 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 우로포르피린 III을 수득하는 단계.
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KR20140058046A (ko) * 2012-11-06 2014-05-14 주식회사 인트론바이오테크놀로지 5-아미노레불린산, 포르피린, 포르피린 유사체 또는 헴을 효율적으로 생산할 수 있는 생물학적 방법

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