Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

WO2018111156A1 - Средство для лечения заболеваний, сопровождающихся отеком макулы вследствие повышенной экспрессии vegf-a - Google Patents

Средство для лечения заболеваний, сопровождающихся отеком макулы вследствие повышенной экспрессии vegf-a Download PDF

Info

Publication number
WO2018111156A1
WO2018111156A1 PCT/RU2017/050121 RU2017050121W WO2018111156A1 WO 2018111156 A1 WO2018111156 A1 WO 2018111156A1 RU 2017050121 W RU2017050121 W RU 2017050121W WO 2018111156 A1 WO2018111156 A1 WO 2018111156A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fragment
ranibizumab
lucentis
proteins
vegf
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/050121
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Александр Михайлович ШУСТЕР
Равиль Авгатович ХАМИТОВ
Игорь Павлович ФАБРИЧНЫЙ
Дмитрий Александрович ПОТЕРЯЕВ
Вероника Николаевна БАДЭ
Светлана Георгиевна АББАСОВА
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" (Ооо "Мбц "Генериум")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" (Ооо "Мбц "Генериум") filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Международный Биотехнологический Центр "Генериум" (Ооо "Мбц "Генериум")
Publication of WO2018111156A1 publication Critical patent/WO2018111156A1/ru

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02Ophthalmic agents

Definitions

  • the invention relates to medicine and can be used in the pharmaceutical industry for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease accompanied by macular edema due to increased expression of vascular endothelial growth factor VEGF-A.
  • AMD age-related macular retinal degeneration
  • Age-related macular degeneration of the retina is divided into two types - exudative (wet form) and non-exudative (dry form).
  • the dry form is about 90% of cases of AMD and is characterized by a slow decrease in visual acuity, the appearance of colloidal formations (drusen) on the retina and degradation of the pigment epithelium, there are known cases of the transition of the dry form of AMD to wet [Solomon SD, et al. "Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database" // Syst Rev. 2014, 29; 8: CD005139].
  • the wet form is about 10% of AMD, characterized by the rapid development of the disease, retinal neovascularization, hemorrhages and often leads to vision loss [Comprehensive Ophthalmology. Ed. by AK Khurana. New Age International (P) Ltd ,, Publishers, New Delhi, 2007.].
  • the incidence of AMD in the Russian Federation is 15: 1000 population and in 54.4% of cases is the cause of serious visual impairment, and in 22.9% of cases - the cause of blindness [Agarkova D.I. “Mathematical Algorithm for Diagnosing Age-related Macular Degeneration” // Fundamental Research, 2013, JVfe 5 (Part 1), p. 17-22; Rein DB, et al. "Vision Health Cost-Effectiveness Study Group. Forecasting age-related macular degeneration through the year 2050: the potential impact of new treatments" II Arch Ophthalmol. 2009, vol. 127 (4), pp. 533-40].
  • Diabetic retinopathy is one of the main complications of diabetes mellitus (DM) of the first and second type, the number of patients which is growing steadily every year.
  • DM diabetes mellitus
  • the prevalence rate of DR among patients with diabetes is 45.8%.
  • the most severe form of eye damage is proliferative diabetic retinopathy, characterized by an uncontrollable growth of pathological tissue structures in the retina, which appear in approximately 10-40% of all patients with diabetes, which, despite treatment, quickly and steadily leads to loss of vision in 2% of cases and 10% of cases — to severe visual impairment.
  • DR Diabetic retinopathy
  • DM diabetes mellitus
  • VEGF-A vascular endothelial growth factor
  • the VEGF family includes several ligands that differ structurally and functionally: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D and P1GF.
  • VEGF-A is the main factor stimulating the growth and neoplasm of blood vessels, it has a mitogenic effect and promotes the migration of endotheliocytes.
  • UEOR-A in turn, combines several structurally related proteins that are products of alternatively spliced mRNAs - VEGF165, VEGF121 and VEGF110.
  • the main isoforms of VEGF-A that determine its activity are the isoforms VEGF165 and VEGF121.
  • VEGF-B also contributes to angiogenesis
  • VEGF-C is involved in lymphangiogenesis during embryonic development, as well as in the functioning of differentiated lymphatic endotheliocytes of adults.
  • VEGF-D stimulates the growth of lymphatic and vascular endothelium.
  • P1GF is involved in angiogenesis, wound healing, and the inflammatory response, [Ohr M. and Kaiser P. "Aflibercept in wet age-related macular degeneration: a perspective review" // Therapeutic Advances in Chronic Disease, 2012, vol. 3 (4), pp. 153-161].
  • Lucene 1 * (ranibizumab) is a Fab fragment of a humanized monoclonal antibody against human VEGF-A (IgGlO)) and effectively blocks the interaction of the main VEGF-A isoforms - VEGFies, VEGF 12 i and VEGFno with VEGF receptors of the first and second types, [Hutton- Smith LA et.al. "A Mechanistic Model of the Intra vitreal Pharmacokinetics of Large Molecules and the Pharmacodynamic Suppression of Ocular Vascular Endothelial Growth Factor Levels by Ranibizumab in Patients with Neovascular Age-Related Macular Degeneration" II Molecular Pharmaceutics, 2016, vol. 13 (9), pp.
  • Eyelea ® is a chimeric protein based on the VEGF receptor domains (3rd domain of VEGFRl and 2nd domain of VEGFR2) and the Fc fragment of an IgGl antibody, [Wells J. et.al. "Aflibercept, Bevacizumab, or Ranibizumab for Diabetic Macular Edema. Two-Year Results from a Comparative Effectiveness Randomized Clinical Trial II Ophthalmology, 2016, vol. 123 (6), pp. 1351-9].
  • Molecular mass Lucentis ⁇ - 50 kDa molecular weight of Eyelea ® - 115 kDa, including oligosaccharide chains.
  • Lucentis * " and Eyelea ® are prescribed in the following mode - first three injections in a row (1 time per month), then according to indications
  • the median number of injections for the 2nd year of therapy was 5, 6 and 6, respectively, and for 2 years - 15 , 16 and 15, respectively, with comparable drug efficacy, [Wells J. et. al.
  • Preparations for intravitreal administration should have a low systemic effect.
  • the systemic availability of macromolecules during intravitreal administration due to the presence of a blood-phthalmic barrier is reduced, but nevertheless a small fraction of the drug (about 1%) enters the blood [BLA 125156, Summary Review 125387Origl s000], to reduce the systemic effect, the developers of ranibizumab used the Fab format of the molecule due to its rapid elimination from the bloodstream, since Fab does not interact with FcRn.
  • Fc-fragment of antibodies stabilizes molecules, increases their half-life from blood flow, therefore, this approach is widely used in the creation of chimeric proteins [Czajkowsky, D., et al.
  • PEGs polyethylene glycols
  • the adverse properties of pegylated proteins are the chemical heterogeneity of the modified molecules due to the heterogeneity of the structure of the modifying agent and the non-selective (random) mechanism of this process, as well as the accumulation in the body of PEG derivatives that are not subject to biodegradation, [Verhoef J., Anchordoquy T. "Questioning the Use of PEGylation for Drug Delivery. " Drug Deliv. Transl. Res., 2013, 3 (6), 499-5038].
  • polypeptides include:
  • CTP C-terminal peptide
  • a method for prolonging therapeutic protein molecules using unstructured polypeptides involves the genetic hybridization of proteins with highly soluble, chemically and immunologically inert unstructured polypeptides (NPs).
  • NPs highly soluble, chemically and immunologically inert unstructured polypeptides
  • Such NPs in aqueous solutions under physiological salt, temperature, and buffer conditions are resistant to folding (the formation of a tertiary structure) and maintain a stable disordered type of “ball”, the hydrodynamic volume of which depends only on the number of amino acid residues in the composition of the NP, the intrinsic size (diameter) of the modified protein and conformational flexibility of NP.
  • NPs can mediate a significant increase in the hydrodynamic volume of conjugated proteins, causing weakening of renal filtration and lengthening the lifetime of proteins in blood plasma, [Binder U., Skerra A. "Half-Life Extension of Therapeutic Proteins via Genetic Fusion to Recombinant PEG Mimetics. Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives ", First Edition. Edited by Roland Kontermann. 2012. Wiley- VCH Verlag].
  • NPs for protein prolongation has advantages over chemical modification using PEG, in particular:
  • proteins modified by this technology can be expressed both intracellularly and secreted in various types of cells, including bacteria and yeast, which can significantly reduce the cost and speed up their production and purification;
  • modifying NPs have extremely low immunogenicity and, like PEG, are able to screen foreign proteins from recognition by the immune system; • modifying NPs are biodegradable, which significantly reduces the risk of toxicity or accumulation in any organs (for example, in the kidneys or liver) or cells (for example, in macrophages);
  • these characteristic features are characteristic of three known types of NPs that can prolong the action of proteins up to 100 times:
  • Gcg-XTEN an improved glucagon capable of preventing hypoglycemia without increasing baseline blood glucose
  • PAS polypeptides containing proline, alanine and serine residues [WO 2011144756, NZ 580670, US 20100292130, EP 2173890, WO 2008155134, Skerra A. "'PASylation': a superior technology to extend the plasma half-life of biologicals" , 2010, URL: http://www.ideas-exchange.org/Upload/Content/Documents/Skerra_ASylation_13-10-10.pdf];
  • HAP polypeptides which are glycine-rich sequences [Schlapschy M., et al. "Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life" // Protein Engineering, Design & Selection, 2007, 20, 273-284; WO2007103515] containing residues of glycine (G) and serine (S).
  • unstructured polypeptides not only increase the life span of a therapeutic protein in the blood, but can lead to screening active sites and reducing their target biological activity.
  • the prior art shows an increase in the lifespan of a therapeutic protein modified with an unstructured polypeptide in the blood only.
  • the present invention solves the problem of creating a preparation of an antibody fragment with an increased exposure time in the vitreous body and high binding affinity for the target.
  • the genetic engineering construct G (a ′ ′) of 2-ranibizumab for eukaryotic expression was obtained, containing on the heavy chain a hinje site with cysteine residues for the formation of disulfide bonds.
  • G (ab ') 2-ranibizumab was used as the basic structure for the development of other variants of molecules modified with various polypeptides in order to increase their mass and hydrodynamic volume.
  • polypeptides that modify G (a b ') 2-ranibizumab we used either the Fc fragment of immunoglobulin IgGl, or the CHZ domain of the Fc fragment of immunoglobulin IgGl, or unstructured hydrophilic polypeptides (NGP), fused either to the hinje site or to SNZ the Fc domain of the IgGl immunoglobulin fragment, or with the light chain of the ranibizumab molecule.
  • NGP unstructured hydrophilic polypeptides
  • an object of the present invention is a polypeptide containing F (ab ') 2 , a fragment of a therapeutic antibody, for administration to the vitreous body for the treatment and / or prevention of a disease in respect of which the antibody has therapeutic activity.
  • Said protein is preferably ranibizumab, and said disease is any disease accompanied by macular edema due to increased expression of VEGF-A.
  • the P (ab ') 2 fragment of the therapeutic antibody of the invention can be supplemented with other polypeptide sequences.
  • polypeptide sequences can be the SNZ domain of an antibody and / or NP, including the HAP polypeptide sequences S (G 4 S) i6 and S (G 4 S) 2 o and others according to the NP mentioned in the "Background" section. Therefore, the P (a ′ ′) 2 fragment of the therapeutic antibody of the invention may further include polypeptide sequences selected, inter alia, from S (G 4 S) 16, S (G 4 S) 20 , the CHZ domain, or a combination thereof.
  • the use of the invention allows to increase the convenience of anti-VEGF-A therapy for macular edema due to the increased exposure time in the vitreous body and high binding affinity of the anti-VEGF-A polypeptide to the target, which will significantly reduce the number of administrations of the therapeutic agent.
  • FIG. 1 The binding of proteins based on the P (ab ') 2 fragment of ranibizumab with recombinant human endothelial growth factor rhVEGFi 2 i, determined by ELISA.
  • FIG. 2a The dependence of the median concentration of the protein being determined on the day of vitreous sampling.
  • FIG. 26 The dependence of the median concentration of the protein being determined on the day of sampling of aqueous humor.
  • FIG. 2c Dependence of the median concentration of the determined protein on the time of blood sampling.
  • Stage 1 Obtaining genetic engineering constructs for eukaryotic expression. Using routine genetic engineering methods, cloning of synthetic DNA sequences encoding the heavy and light chains of the P (aB ') 2 fragment of ranibizumab (Lucentis®) into plasmid vectors designed for expression of proteins in eukaryotic cells was performed.
  • plasmid DNA intended for expression in the eukaryotic cells of the proteins Lucentis-NS-NGP, Lucentis-LC- ⁇ ⁇ and Lucentis-HC-SNZ-NGP fused to unstructured hydrophilic peptide (GP) was carried out using routine genetic engineering methods using auxiliary plasmids containing sequences encoding the corresponding proteins, and the correct fusion of the sequences of these proteins with the sequence and encoding NG P.
  • Target expression plasmids were obtained by transferring fragments of auxiliary plasmids encoding the proteins Lucent is-HC-NGP, Lucentis-LC- ⁇ and Lucentis-HC-CHZ-NGP to plasmid vectors designed for expression of proteins in eukaryotic cells. Stage 2. Obtaining clones producing proteins based on eukaryotic cells. The prepared HICs were used for electroporation of eukaryotic cells and the creation of producer clones based on them.
  • the cultivation of clones producing the target proteins based on F (ab ') 2 - ranibizumab fragment was carried out in a disposable wave bioreactor in the fed-batch mode (periodic cultivation with recharge).
  • Protein isolation was carried out in several stages - the affinity chromatography stage using Capto L sorbents (GE Healthcare) or KappaSelect (GE Healthcare), the hydroxyapatite ion exchange chromatography stage (CHT-I, Bio-Rad) and SP-sepharose (GE Healthcare).
  • the isolated proteins were characterized on the basis of the E (a b ') 2 fragment of ranibizumab by means of PAGE-electrophoresis with sodium dodecyl sulfate, HPLC gel filtration, ELISA, plasmon surface resonance and inhibition test of VEGF-A-induced proliferation of HUVEC cells (primary from endothelial cell culture human umbilical vein).
  • Step 5 Evaluation of the pharmacokinetic parameters of proteins based on the Prbb fragment of ranibizumab upon intravitreal administration to rabbits.
  • the aim of the study was a comparative assessment of pharmacokinetics and toxiko kinetics of proteins based on the E (ab ') 2 fragment of ranibizumab and Lucentis ® (Novartis) after a single intravitreal administration to Soviet chinchilla rabbits.
  • Example 1 Construction of a Recombinant Plasmid pRA1654 Encoding the Heavy Chain of P (aB) 2 Ranibizumab Fragment (Lucentis®).
  • a DNA fragment is synthesized having open “sticky” ends identical to the “sticky” ends created by Hindlll restriction endonucleases at the 5 ′ end and Xbal at the 3 ′ end, and the coding polypeptide
  • the recombinant plasmid pRA1654 is constructed on the basis of a plasmid vector for expression of proteins in eukaryotic cells, which incorporates the following structural elements: structural elements of the CMV promoter (CMV enhancer, EF- ⁇ promoter, EF la intron A); bovine growth hormone polyadenylation signal (bGH poly (A) signal); high copy plasmid replication origin (ori ColEl / pMBl / pBR322 / pUC); a gene encoding ⁇ -lactamase providing resistance to ampicillin, carbenicillin and similar antibiotics (AmpR, AmpR promoter); bacteriophage fl replication origin fl (fl ori); early promoter of the SV40 virus (SV40 promoter); SV40 virus replication origin (SV40 ori); the PuroR gene encoding puromycin N-acetyltransferase, which provides resistance to puromycin (alternatively, may contain HygR, encoding h
  • the synthetic DNA fragment is cloned into a selected vector that is cleaved at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites are restored in the resulting plasmid.
  • the result is a recombinant plasmid pRA1654 containing a cloned synthetic DNA fragment encoding the heavy chain P (ab) 2-fragment of ranibizumab (Lucentis®)
  • Example 2 Construction of a recombinant plasmid pRA1655 encoding the light chain P (aB) 2 fragment of ranibizumab (Lucentis).
  • a DNA fragment is synthesized having open “sticky” ends identical to the “sticky” ends created by Hindlll restriction endonucleases at the 5 ′ end and Xbal at the 3 ′ end, and the coding polypeptide
  • Recombinant plasmid pRA1655 is constructed on the basis of a plasmid vector for expression of proteins in eukaryotic cells, which incorporates the structural elements mentioned in Example 1.
  • the synthetic DNA fragment is cloned into a selected vector that is cleaved at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites are restored in the resulting plasmid.
  • the result is a recombinant plasmid pRA1655 containing cloned a synthetic DNA fragment encoding the light chain P (ab) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis ® ).
  • Example 3 Construction of a recombinant plasmid pMT1605 encoding the heavy chain P (aB) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis®) with the CH3 domain of human IgGl.
  • Reaction 1 As a matrix, the recombinant plasmid pRA1654 was used (the preparation is described in Example 1), synthetic oligonucleotides were used as seed crystals:
  • the obtained fragment with the Dral restriction endonuclease recognition site inserted at the 5'-end encodes the CH3 domain of human IgGl.
  • the recombinant plasmid pMT1605 was constructed on the basis of a plasmid vector for the expression of proteins in eukaryotic cells, which incorporates the structural elements mentioned in Example 1.
  • the fragment obtained during Reaction 1 was cleaved using Hindlll and Smal restriction endonucleases; and the fragment obtained during Reaction 2, using Dral and Xbal.
  • the resulting fragments are purified using spin columns and used in a three-component (vector + insert 1 + insert 2) ligation reaction with the selected vector cleaved at the Hindlll and Xbal sites so that the Hindlll and Xbal cloning sites are restored as part of the resulting plasmid.
  • the result is a recombinant plasmid pMT1605 containing a cloned DNA fragment encoding the heavy chain P (ab) of the 2 fragment of ranibizumab (Lucentis®) fused to the CHZ domain of human IgGl encoding a polypeptide
  • Recombinant auxiliary plasmid N ° l is constructed on the basis of any laboratory plasmid vector containing unique recognition sites of Hindlll and Xbal restriction endonucleases, as well as structural elements such as the origin of replication of high copy plasmids (ori ColEl / pMBl / pBR322 / pUC); a gene encoding ⁇ -lactamase providing resistance to ampicillin, carbenicillin and similar antibiotics (AmpR, AmpR promoter); bacteriophage fl replication origin fl (fl ori); and that does not contain a Sapl restriction endonuclease recognition site, for example, a modified plasmid pBK685.
  • the recombinant plasmid pMT1605 encoding the heavy chain of the P (ab) 2 fragment of ranibizumab (Lucentis®) fused to the CH3 domain of human IgGl is cleaved using Hindlll and Xbal restriction endonucleases and the resulting restriction fragments are gel-separated.
  • the smaller DNA fragment is eluted from the gel and is called fragment 1.
  • Fragment-1 is cloned into a selected vector that is split at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites are restored in the resulting plasmid.
  • auxiliary plasmid N ° la or pMT1608 containing a cloned DNA fragment encoding the heavy chain of the P (ab) 2 fragment of ranibizumab (Lucentis®) with the CHS domain of human IgGl.
  • the DNA fragment obtained during Reaction 3 was digested using restriction endonucleases Hindlll and Xbal; purified by spin columns and used in the ligation reaction with the selected vector (pBK685) cleaved at the Hindlll and Xbal sites so that the Hindlll and Xbal cloning sites are restored as part of the resulting plasmid (auxiliary plasmid N ° 16).
  • the auxiliary plasmid N ° 16 was digested at the Sapl restriction endonuclease recognition site.
  • the recombinant plasmid encoding NGP was cleaved at the Sapl restriction endonuclease recognition site and the resulting restriction fragments were separated in a gel. A smaller DNA fragment is eluted from the gel and is called fragment-2. Fragment-2 was cloned into an auxiliary plasmid N ° 16, split at the Sapl site.
  • the resulting recombinant auxiliary plasmid N ° l contains a cloned DNA fragment encoding the heavy chain P (ab) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis ® ) with the CHS domain of human IgGl fused to NGP.
  • the recombinant plasmid pMT1616 is constructed on the basis of a plasmid vector for expression of proteins in eukaryotic cells, which incorporates the structural elements mentioned in Example 1.
  • the recombinant accessory plasmid N ° l was digested at the recognition sites with Hindlll and Xbal restriction endonucleases and the resulting restriction fragments were separated in a gel. Smaller DNA Fragment elute from the gel and call fragment-3. Fragment-3 is cloned into a selected vector for eukaryotic expression, cleaved at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites are restored in the resulting plasmid.
  • the result is a recombinant plasmid pMT1616 containing a cloned DNA fragment encoding the heavy chain of the F (ab) 2 fragment of ranibizumab (Lucentis ® ) with the CHS domain of human IgGl fused to NGP.
  • Recombinant plasmid pMT 1616 encodes a polypeptide
  • Example 5 Construction of a recombinant plasmid pMT1612 encoding the heavy chain G (ab) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis®), fused with NGP.
  • the auxiliary plasmid N ° 2 was obtained.
  • Recombinant auxiliary plasmid N ° 2 receive as well as the recombinant auxiliary plasmid N ° l described in Example 4.
  • the recombinant plasmid pRA1654 from Example 1 encoding the heavy chain G (ab) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis®) is cleaved using restriction endonucleases Hindlll and Xbal and the resulting restriction fragments are separated in a gel. A smaller DNA fragment is eluted from the gel and is called fragment-4. Fragment-4 was cloned in the pBK685 vector described in Example 4, split at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites were restored in the resulting plasmid.
  • the result is a recombinant accessory plasmid N ° 2a (pMT1606) containing the cloned DNA fragment encoding the heavy chain P (aB) 2 fragment of ranibizumab (Lucentis®).
  • the DNA fragment obtained during Reaction 4 was digested using restriction endonucleases Hindlll and Xbal; purified by spin columns and used in the ligation reaction with the selected pBK685 vector cleaved at the Hindlll and Xbal sites so that the Hindlll and Xbal cloning sites are restored as part of the resulting plasmid (auxiliary plasmid N ° 26).
  • the auxiliary plasmid N ° 26 was digested at the Sapl restriction endonuclease recognition site.
  • the recombinant plasmid encoding NGP was cleaved at the Sapl restriction endonuclease recognition site and the resulting restriction fragments are separated in a gel. A smaller DNA fragment is eluted from the gel and is called fragment-5. Fragment-5 was cloned into an auxiliary plasmid N ° 26, split at the Sapl site.
  • the resulting recombinant auxiliary plasmid N ° 2 contains a cloned DNA fragment encoding the heavy chain of the P (ab) 2 fragment of ranibizumab (Lucentis®) fused to NGP.
  • the recombinant plasmid pMT1612 is constructed on the basis of a plasmid vector for expression of proteins in eukaryotic cells, which incorporates the structural elements mentioned in Example 1.
  • the recombinant accessory plasmid N ° 2 was digested at the recognition sites with the restriction endonucleases Hindlll and Xbal, and the resulting restriction fragments were separated in a gel. A smaller DNA fragment is eluted from the gel and is called fragment-6. Fragment-6 was cloned into a selected vector for eukaryotic expression, split at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites were restored as part of the resulting plasmid. The result is a recombinant plasmid pMT1612 containing a cloned DNA fragment encoding the heavy chain of the F (ab) 2 fragment of ranibizumab (Lucentis®) fused to NGP.
  • Recombinant plasmid pMT1612 encodes a polypeptide
  • Example 6 Construction of recombinant plasmids pMT1613, pMT1614 and pMT1615 encoding the light chain P (aB) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis®) fused to NGP.
  • the auxiliary plasmid N ° 3 was obtained.
  • Recombinant auxiliary plasmid N ° 3 receive as well as recombinant auxiliary plasmids N ° l and N ° 2 described in Examples 4 and 5.
  • the recombinant plasmid pRA1655 from Example 2 encoding the light chain P (ab) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis®) was digested with the restriction endonucleases Hindlll and Xbal and the resulting restriction fragments were separated in a gel. A smaller DNA fragment is eluted from the gel and is called fragment-7. Fragment-7 was cloned in the pBK685 vector described in Example 4, split at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites were restored in the resulting plasmid.
  • the result is a recombinant accessory plasmid N ° 3a (pMT1607) containing a cloned DNA fragment encoding the light chain P (aB) of the 2 fragment of ranibizumab (Lucentis®).
  • the obtained fragment with the Sapl restriction endonuclease recognition site inserted at the 3 'end encodes the C-terminal modified light chain of the P (ab) 2 fragment of ranibizumab (Lucentis ® ).
  • the DNA fragment obtained during Reaction 5 was digested using restriction endonucleases Hindlll and Xbal; purified by spin columns and used in the ligation reaction with the selected pBK685 vector cleaved at the Hindlll and Xbal sites so that the Hindlll and Xbal cloning sites are restored as part of the resulting plasmid (auxiliary plasmid N ° 36).
  • the auxiliary plasmid N ° 36 is digested at the Sapl restriction endonuclease recognition site.
  • the recombinant plasmid encoding NGP was cleaved at the Sapl restriction endonuclease recognition site and the resulting restriction fragments were separated in a gel. A smaller DNA fragment is eluted from the gel and is called fragment-8. Fragment-8 was cloned into an auxiliary plasmid N ° 36, cleaved at the Sapl site.
  • the resulting recombinant auxiliary plasmid N ° 3 contains a cloned DNA fragment encoding the light chain P (aB) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis®) fused to NGP.
  • the recombinant plasmid pMT1613 is constructed on the basis of a plasmid vector for the expression of proteins in eukaryotic cells, which incorporates the structural elements mentioned in Example 1.
  • the recombinant accessory plasmid N ° 3 was digested at the recognition sites with Hindlll and Xbal restriction endonucleases and the resulting restriction fragments were separated in a gel. A smaller DNA fragment is eluted from the gel and is called fragment-9. Fragment-9 is cloned into a selected eukaryotic expression vector, cleaved at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites are restored in the resulting plasmid.
  • the result is a recombinant plasmid pMT1613, containing a cloned DNA fragment encoding the light chain of the F (ab) 2 fragment of ranibizumab (Lucentis®) fused to NGP.
  • the recombinant plasmid pMT1614 is constructed on the basis of a plasmid vector for the expression of proteins in eukaryotic cells, which differs from the vector containing the structural elements mentioned in Example 1 in that the PuroR element encoding puromycin ⁇ -acetyltransferase, which provides resistance to puromycin, is replaced HygR encoding hygromycin B phosphotransferase providing resistance to hygromycin B.
  • fragment-9 is cloned into a selected eukaryotic expression vector, split at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites are restored in the resulting plasmid.
  • the result is a recombinant plasmid pMT1614 containing a cloned DNA fragment encoding the light chain G (ab) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis®), fused to NGP.
  • the recombinant plasmid pMT1615 is constructed on the basis of a plasmid vector for the expression of proteins in eukaryotic cells, which differs from the vector containing the structural elements mentioned in Example 1 in that the PuroR element encoding puromycin ⁇ -acetyltransferase, which provides resistance to puromycin, is replaced on NeoR / KanR encoding an aminoglycoside phosphotransferase from Tp5, which provides resistance to neomycin, kanamycin and G418 (Geneticin®).
  • fragment-9 is cloned into a selected eukaryotic expression vector, cleaved at the Hindlll and Xbal sites so that the cloning sites are restored in the resulting plasmid.
  • the result is a recombinant plasmid pMT1615 containing a cloned DNA fragment encoding the light chain G (ab) of the 2-fragment of ranibizumab (Lucentis®) fused to NGP.
  • Recombinant plasmids pMT1613, pMT1614 and pMT1615 encode the polypeptide A VSQALRLLCLLLGLQGCLAOlQLTQSPSSLSASVGORVTYTCSASQDlSNYL NWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDN ALQ S GNS QE S VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK VY ACE VTHQGL S SPVTKSF RGECGSS- ⁇ , corresponding light chain F (ab) 2 fragment ranibizumab (Lucentis®), fused to the PNC (bold) with ⁇ - the terminal leader sequence (italics) of the coagulation factor FVII, removed from the composition of the target protein during transport
  • Example 7 Obtaining clones producing proteins based on eukaryotic cells.
  • the prepared HICs were used to create producing clones based on eukaryotic cells.
  • the preparations of the plasmids described in examples 1-6 encoding the light and heavy chains of the corresponding protein were mixed, and eukaryotic cells were transfected by electroporation.
  • the transfected cells were selected by cultivation on a selective antibiotic. After obtaining stable pools of producer cells of the corresponding proteins, they were cloned, the culture fluid of single clones was tested by solid-phase ELISA on immobilized recombinant human VEGF-A, and clones were selected with the maximum productivity of the target proteins based on the P (ab ') 2 fragment of ranibizumab.
  • Example 8 Cultivation of producer clones and protein isolation.
  • the cultivation of clones producing the target proteins based on F (ab ') 2 - ranibizumab fragment was carried out in a disposable wave bioreactor in the fed-batch mode (periodic cultivation with recharge).
  • SFM4CHO HyClone, USA
  • BalanCD CHO Feed 2 Irvine Scientific, USA
  • the cultivation duration was 10 days.
  • cell suspensions were carried out through a 3-stage clarification filtration and the target proteins were extracted from the culture fluid.
  • a multimodal sorbent hydroxyapatite (CHT-I, Bio-Rad) was used, which is often used to purify antibodies from related impurities and residual proteins of producer cells.
  • the sorbent was pre-equilibrated with a solution of 50 mM histidine, pH 7.0, then protein eluates were applied after the affinity step, diluted with water to a conductivity of 3-5 mS / cm, the sorbent was washed with a balancing buffer, then with a buffer containing 50 mM histidine, 1 M sodium chloride, pH 7.0.
  • Target proteins were eluted with a linear gradient of sodium phosphate (pH 7.0) to a concentration of 300 mM.
  • Table 1 The nominal molecular weight of the proteins based on F (ab ') 2 - a fragment of ranibizumab.
  • Variants of proteins based on the P (a b ') 2 fragment of ranibizumab T3, T4, T5, T6 and T7 have, according to HPLC gel filtration, a large apparent molecular weight that exceeds their nominal molecular weight from 2.61 to 4.96 times, which due to the presence of NGP in their structure.
  • Example 10 The interaction of proteins with recombinant VEGF-A (rhVEGF121) person, determined by ELISA.
  • Protein preparations based on the T (ab ') 2 fragment of ranibizumab were characterized by ELISA by binding to the recombinant human vascular endothelial growth factor rhVEGF 121 manufactured by MBC Generium LLC.
  • rhVEGFm manufactured by MBC Generium LLC were introduced into the wells of ELISA plates of 100 ⁇ in a concentration of 1 ⁇ / ⁇ 1 in carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.5) and sorbed overnight at + 4 ° C.
  • Residual free plastic binding sites were blocked with PBS-Tha solution (PanEco, KaT.N ° E4100-110) for 1 hour at room temperature, after which 100 ⁇ l of protein solutions diluted with PBS-0.05% were added to the wells Tw20 sequential 3-fold dilutions from 100 to 0.002 pM.
  • the plates were incubated for 1 hour, unbound antibodies were washed off, protein complexes with rhVEGFni were detected using biotinylated polyclonal rat antibodies to ranibizumab manufactured by MBC Generium LLC and streptavidin horseradish peroxidase conjugated (Abeam, ab7403).
  • TMB (USA, Party: TMBPD 10222-2-10273-A) was used as a substrate for horseradish peroxidase, the reaction was stopped with a solution of 2M H 2 S0 4. The development of the reaction was evaluated by the optical density measured at a wavelength of 450 nm. The results of the study are presented in Figure 1.
  • Table 2 shows the averaged data on the affinity G R049-candidates (EC50, pM) obtained using ELISA.
  • the kinetic characteristics of the interaction of proteins based on the F (ab ') 2 fragment of ranibizumab was evaluated by surface plasmon resonance on a Biacore T200 instrument.
  • the kinetic characteristics of the interaction of the commercial drug Lucentis ® (Novartis) and the P (ab ') 2 fragment of ranibizumab obtained at LLC MBC Generium were compared.
  • N ° RPO923U-100 were covalently immobilized on a CM-5 chip, then Lucentis ® solutions were passed ( Novartis) and F (ab ' ⁇ fragment of ranibizumab in HBS-EP + buffer. Working concentrations 0.74, 2.22, 6.67, 20, 60 pM. Association 210 sec in HBS-EP + buffer. Dissociation 14400 sec (4 hours) in 20mM Na buffer - Acetate, 150 tM NaCl, 3M EDTA, 0.005% Tween20, pH 4.5. Final regeneration with a 50 tM Gly-HCl solution, pH 2.5. Due to the low pH used for dissociation, apparent KD for variants of Lucentis with human VEGF121. Apparent K D was calculated from the mathematical model of protein-protein interaction 1: 1. The data are shown in table 3.
  • a significant decrease in RUmax for proteins with NGP can be explained both by a small fraction of active molecules in the protein preparation, and by the fact that the modified NGP molecules have a larger hydrodynamic volume, and when complexed with rhVEGF 121 covalently immobilized on a chip substrate ; NGP shields the neighboring immobilized rhVEGF 121 molecule ; creating the effect of decreasing the density of immobilized rhVEGF 121 molecules ; available for interaction, which leads to a decrease in RUmax.
  • Example 12 The formation of a complex of proteins based on the P (ab ') 2 fragment of ranibizumab with recombinant human vascular endothelial growth factor rhVEGFi 2 i in solution.
  • Proteins were mixed with in equimolar ratio in a PBS solution, they were incubated overnight at + 4 ° ⁇ , then HPLC-gel filtration was performed on a Superdex S200 column, complexation efficiency was estimated by the peak area of free rhVEGFni in comparison with the corresponding value for Lucentis ® (Novartis). The data are shown in table 5. Table 5. The peak area of free rhVEGFi 2 i when evaluating the complexation of proteins based on the F (ab ' ⁇ fragment of ranibizumab with rhVEGFi 2 i in solution at an equimolar ratio.
  • the peak area of free rhVEGFi 2 i at the equimolar ratio of Lucentis ® (Novartis) and rhVEGFi 2 i is 34% of the peak area of rhVEGFi 2 i without adding any binding agent.
  • T5 the peak area of free rhVEGFi 2 i for which was 57%, the corresponding indicator for other proteins based on the P (aB ') 2 fragment of ranibizumab varies from 16% to 37%, which proves the high antigen-binding ability of the developed molecules, not inferior such a characteristic for lucentis.
  • Example 13 Inhibition of hUEPCS-induced proliferation of HUVEC cells by proteins based on the E (ab ') 2 fragment of ranibizumab.
  • a comparative determination of the biological activity of protein preparations based on the P (aB ') 2 fragment of ranibizumab and the Lucentis ® preparation (Novartis) was carried out in the inhibition test for hCUEPp-induced proliferation of the primary culture of human umbilical vein endotheliocytes (HUVEC, Lonza, Cat. JVfe CC2517).
  • HUVEC I (PI) cells were thawed and plated in complete growth medium EGM-2 (Endothelial Growth Medium) in a T25 vial precoated with a solution of 0.1% gelatin.
  • the cells After the cells reached a monolayer (P2), they were removed from the plastic by treatment with a nektase solution and plated in a T75 vial, also previously coated with a solution of 0.1% gelatin. When the cells reached maximum density (RE), they were plated in gelatin-coated wells of a 96-well flat-bottom plate in the amount of 10 thousand cells per well in complete growth medium EGM-2 (passage 3). The next day, HUVEC cells were washed gently twice with sterile PBS and incubated in EBM supplemented with 0.2% FBS (test medium) for 2.5-4 hours.
  • EBM complete growth medium
  • Protein preparations based on the E (ab ') 2 fragment of ranibizumab, Lucentis ®, and rh EGFni were diluted in test medium in accordance with the experimental design. Then, each of the tested preparations in a series of 8 consecutive 3-fold dilutions from 100 to 0.05 pM was incubated with rhVEGFi 2 i (125 ng / ml) for 2 hours, after which the pre-incubated solutions were added to tablets with HUVEC cells according to the experimental design. The following controls were additionally made on each tablet — wells containing only rhVEGFi 2 i (125 ng / ml); wells containing complete growth medium and wells with test medium.
  • VEGF-0 corresponds to the average optical density of wells containing only test medium without the addition of growth additives.
  • protein preparations based on the T (ab ') 2 fragment of ranibizumab are not inferior in biological activity to the drug Lucentis ® (Novartis) in the inhibition test of in vitro hUVEC-induced cell proliferation of HUVEC cells.
  • This test has a high predictive ability of the antiangiogenic efficacy of drugs in vivo, including when administered to humans.
  • the half-maximal concentration of inhibition (IC50) of the rhUEPF-induced proliferation of the Lucentis ® preparation (Novartis) varied from 2.5 to 3.2 pM, the average value was 2.9 pM, and the standard deviation was 0.3 pM.
  • the IC50 of protein preparations based on the F (ab ' ⁇ fragment of ranibizumab varied from 1.3 pM to 2.5 pM, which suggests that all proteins have high antiangiogenic activity, comparable to that for the "gold standard" in the treatment of ophthalmic diseases whose pathogenesis is due to the high activity of the vascular endothelial growth factor - ranibizumab.
  • Example 14 Preclinical in vivo studies - a study of the pharmacokinetics and toxicokinetics of proteins based on the P (aB ') 2 fragment of ranibizumab with a single intravitreal administration to Soviet chinchilla rabbits.
  • the aim of the study was a comparative determination of the main parameters of pharmacokinetics and toxicokinetics with an assessment of ophthalmotoxicity and possible total toxic effect of proteins based on the F (ab ' ⁇ fragment of ranibizumab and Lucentis ® (Novartis) with a single intravitreal administration to Soviet chinchilla rabbits.
  • F ab ' ⁇ fragment of ranibizumab and Lucentis ® (Novartis) with a single intravitreal administration to Soviet chinchilla rabbits.
  • NGO House of Pharmacy "(Russia, Leningrad Region, Vsevolozhsk municipal district, Kuzmolov urban settlement) in accordance with the basic principles of a proper laboratory the beaten practices and ethical standards for the protection of animals used for scientific purposes.
  • the objectives of the study included the study of the influence of the tested objects on the biometric parameters of the studied animals — mortality and dynamics of body weight; study of the influence of the tested objects on the clinical condition of the eye structures of the studied animals; ophthalmoscopic assessment of the influence of test objects on the fundus of experimental animals.
  • Tables 7 and 8 show the main groups of animals, the dose of drugs for intravitreal administration and the main procedures performed during the study.
  • test objects were administered intravitreal to animals at a dose of 50 ⁇ l in each eye of the animal.
  • the volume of administration of test objects for the study of pharmacokinetics with an assessment of ophthalmotoxicity was chosen based on bioethical principles, taking into account the invasiveness and pain of the intravitreal administration procedure, as well as on the basis of data on the maximum recommended volumes of intravitreal administration to rabbits.
  • An intravitreal route of administration has been used since this route of administration is the intended mode of use in clinical practice.
  • Intravitreal injections were carried out after anesthesia of animals by intravenous administration of a mixture of Zoetil®100 preparations (Virbac, France) at a dose of 1.5 mg / kg and Rometar® (Bioveta, Czech Republic) at a dose of 1.5 mg / kg (SOP EZh-20) .
  • a mixture of anesthetics in this dose made it possible to achieve the optimal duration of anesthesia for injections in both eyes of the animal and ensured the complete absence of a corneal reflex throughout the duration of the manipulations.
  • a solution of local anesthetic (Inocain®, eye drops, Promed Export PVT. LTD) was added to the conjunctival sac.
  • the sequence of manipulations during intravitreal injection was as follows: 1) introduction of a solution of mydriatic (Irifrin®, eye drops, Promed Export PVT. LTD) into the conjunctival sac, waiting 5 minutes; 2) washing the surface of the cornea with sterile saline; 3) the introduction of a solution of local anesthetic (Inocain®) in the conjunctival sac, waiting 3 minutes; 4) washing the surface of the cornea with sterile saline; 5) the introduction of Betadine, 0.5% solution (Pharmaceuticals PLC (Hungary)); 6) holding the needle of a disposable insulin syringe through the sclera at a distance of 2-3 mm from the limb towards the equator in the upper-outer quadrant; holding the needle deep into the vitreous body 2-3 mm parallel to the lens.
  • mydriatic Irifrin®, eye drops, Promed Export PVT. LTD
  • Inocain® local anesthetic
  • Feed deprivation - animals were deprived of morning feeding before the administration and weighing of animals. Access to water was not restricted.
  • Body weight was recorded in the morning immediately before administration, then weekly. The procedure was carried out on the scales of the medical benchtop MT Karapuz 20 VZhA- (5g, P) bA, manager 1 ⁇ ° 488688. Smallest limit weighing - 100 g. The maximum weighing limit is 20 kg. The price of calibration is 5 g. Accuracy class 3.
  • Blood sampling (1 ml each) was carried out in sterile tubes with EDTA at 4, 8, 24, 48, 72, 96, 192 and 384 hours after drug administration. Blood samples were centrifuged to obtain plasma. Each plasma sample was divided into two parts, placed in labeled cryostable tubes, the labeling of each tube included the experimental group number, animal number, species bio-sample, date and time of sampling. All samples were frozen, stored at -70 ° C and transported to the Research Sponsor for further analyzes in dry ice.
  • each biological sample was divided into two parts, placed in labeled cryostable tubes, the labeling of each tube included the number of the experimental group, the number of the animal, the type of biosample, the date and time of sampling. All samples were frozen, stored at -70 ° C and transported to the Research Sponsor for further analyzes in dry ice.
  • polyclonal rat antibodies to ranibizumab were introduced into the wells of ELISA plates of 100 ⁇ at a concentration of 1 ⁇ / ⁇ 1 in carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.5) and immobilized overnight at + 4 ° C. Residual free plastic binding sites were blocked with PBS-Tha solution (PanEco, Cat. N ° E4100-110) for 1 hour at room temperature. After that, biological samples diluted with a solution of PBS-0.05% Tw20 in serial 2-fold dilutions were added to the wells of the plates.
  • the plates were incubated for 1 hour, unbound antibodies were washed and a solution of biotinylated polyclonal rabbit anti-ranibizumab antibodies was introduced (MBC Generium LLC). After an incubation of 1 hour, unbound antibodies were washed off and horseradish peroxidase conjugated streptavidin was added at a dilution recommended by the manufacturer (Abeam, ab7403). Incubated 40 minutes at room temperature and the horseradish peroxidase substrate was added. TMB (USA, Party: TMBPD 10222-2-10273-A) was used as a substrate for HRP, the reaction was stopped with a solution of 2M H 2 SO 4. The reaction was evaluated by optical density measured on a Bio-Rad xMark microplate spectrophotometer at 450 nm wavelength. The obtained data were calculated using the Bio-Rad Microplale Manager 6 software for a microplate spectrophotometer.
  • the design of the comparative screening study included only three time points for the selection of biological samples, in accordance with the basic principles of ethical standards for the treatment of laboratory animals and minimization of the number of experimental animals, since the main objective of the study was a comparative study of the pharmacoka netikp parameters with I.
  • pharmacoka netikp parameters with I.
  • vitreous samples were collected from of experimental animals after euthanasia and enucleation eye on the 1st day (4 hours), on the 14th and 30th day after the IVT injection.
  • concentration of protein preparations based on the F (ab ') 2 fragment of rayibizumab was determined by the method described above with respect to the corresponding calibration curve for each of the studied proteins.
  • Figures 2a, 26, and 2c show graphs of the dependence of the median concentration of the determined proteins in the vitreous, aqueous humor, and plasma in molar terms on the time of taking biological samples after a single IVT injection.
  • V ss ivT is the equilibrium volume of distribution in the vitreous
  • D I V T is the IVT dose
  • ⁇ / 2 ⁇ is the half-life from the vitreous.
  • the maximum exposure time in the vitreous body was determined for the drug Lucentis ® with its greater relative to other drugs, molar D I V T - 6667 nM, molar IVT doses of other drugs were significantly (4.5 to 2.4 times) less than D I V T lucentis and, accordingly, their AUC I V T were less than AUC I V T FOR Lucentis ® 2.3 to 3 times.
  • the smallest D I V T of T7 (4.5 times less than the dose of Lucentis ® )
  • its AUC I V T was only 2.5 times less than the corresponding value of Lucentis ® .
  • the elimination rate of the studied molecules was significantly lower for protein preparations based on the F (ab ' ⁇ fragment of ranibizumab modified with NGP than for the Lucentis ® preparation and unmodified NGP protein variants. The lowest elimination rate was shown for T7.
  • the data presented in table 10 indicate that the maximum medians of the concentration of the drugs in aqueous humor were determined 4 hours after the IVT injection, the maximum value of the median concentration after 4 hours was observed for the drug lucentis, the minimum for the drug T7.
  • the concentration of drugs in all groups decreased; on day 30, only modified NGP protein variants were determined in samples of aqueous humor, which indicates that on day 30 of the study, these drugs were still contained in the vitreous, unlike lucentis and unmodified NGP proteins, since proteins enter the vitreous humor. This fact is consistent with the determination of the concentration of the studied drugs in the vitreous body. AiS water indicator.
  • V l of the corresponding normalized index in the vitreous Nom body - ⁇ was also maximum for the drug Lucentis and minimum for the drug T7, this indicator also reflects the effectiveness of removing drugs from the vitreous through the aqueous humor of the anterior chamber of the eye.
  • Table 11 presents the main pharmacokinetic parameters of the studied preparations T6 and T7, for which an increased exposure time in the vitreous body is shown, in comparison with the drug Lucentis ® .
  • Table 11. AIS ( PL azma), A ( plasma)% A (PL azma) from ⁇ for Lucentis and T7 after a single IWT administration to Soviet chinchilla rabbits.
  • the calculated value of AIS ( PL azma) for the drug Lucentis is 2.4 times higher than the corresponding value for the drug G R049 / T7, but the IVT dose of the drug Lucentis ® is 4 times higher than the D I V T of the drug G R049 / T7, Normalized relative to D I V T values A&S ( Plaza M a) - A ( plasma ) more informatively reflect both the ability of drugs to enter the bloodstream and the time of their exposure in the bloodstream,
  • the value of A ( plasma ) for T7 is greater than the corresponding value for Lucentis ® only 1.9 times, which with the proven safety of the drug Lucentis ® in clinical practice, most likely, will not lead to adverse events due to the systemic effect of the T7 drug, which is a modified version of the Lucentis ® preparation,
  • the new T7 protein is expressed in a eukaryotic system with productivity acceptable for production, has high comparable to ranibizumab, affinity for human and rabbit VEGF-A, high efficiency in inhibiting VEGF-A-induced proliferation of HUVEC cells, tentatively estimated T7 half-life from the vitreous body during IVT administration to rabbits is approximately 2 times higher than the corresponding indicator for ranibizumab with comparable indicators of the systemic effect of these drugs.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства лекарственного средства для лечения заболевания, сопровождающегося отеком макулы вследствие повышенной экспрессии VEGF-A. F(ab)2 -фрагмент антитела к VEGF-A предложен в качестве активного начала лекарственного средства для лечения заболевания, сопровождающегося отеком макулы, обусловленным повышенной экспрессией VEGF-A. При этом указанный димер может содержать дополнительные аминокислотные последовательности, улучшающие его фармакологические свойства. Использование изобретения позволяет повысить удобство анти- VEGF-A терапии при отеке макулы.

Description

Средство для лечения заболеваний, сопровождающихся отеком макулы вследствие повышенной экспрессии VEGF-A
Область техники
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в фармацевтической промышленности для производства лекарственного средства для лечения заболевания, сопровождающегося отеком макулы вследствие повышенной экспрессии фактора роста эндотелия сосудов - VEGF-A.
Уровень техники
Потеря зрения, связанная с патогенетическим механизмом неоангиогенеза, в основе которого лежит повышенная экспрессия VEGF-A и ряда других факторов роста, становится все более актуальной проблемой во всем мире, к числу таких заболеваний относятся влажная форма возрастной макулярной дегенерации, диабетическая ретинопатия, миопическая ХНВ, отек макулы вследствие окклюзии вен сетчатки и др. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, возрастная макулярная дегенерация сетчатки (ВМД) является одной из наиболее частых причин слепоты и ухудшения зрения у лиц старше 59 лет в экономически развитых странах. Так, примерно у 10% пациентов в возрасте от 66 до 74 лет выявляется ВМД, у пациентов в возрасте от 75 до 85 лет частота данного заболевания возрастает до 30%. Возрастная макулярная дегенерация сетчатки подразделяется на два типа — экссудативная (влажная форма) и неэкссудативная (сухая форма). Сухая форма составляет около 90% случаев ВМД и характеризуется медленным снижением остроты зрения, появлением коллоидных образований (друз) на сетчатке и деградацией пигментного эпителия, известны случаи перехода сухой формы ВМД во влажную [Solomon S.D., et al. "Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database" // Syst Rev. 2014, 29; 8:CD005139]. Влажная форма составляет около 10% ВМД, характеризуется быстрым развитием болезни, неоваскуляризацией сетчатки, геморрагиями и чаще приводит к потере зрения [Comprehensive Ophthalmology. Ed. by A.K. Khurana. New Age International (P) Ltd,, Publishers, New Delhi, 2007.]. Заболеваемость ВМД в РФ составляет 15: 1000 населения и в 54,4% случаев является причиной серьезных нарушений зрения, а в 22,9% случаев - причиной слепоты [Агаркова Д.И. «Математическая алгоритмизация диагностики возрастной макулярной дегенерации» // Фундаментальные исследования, 2013, JVfe 5 (ч.1), с. 17-22; Rein D.B., et al. "Vision Health Cost-Effectiveness Study Group. Forecasting age-related macular degeneration through the year 2050: the potential impact of new treatments" II Arch Ophthalmol. 2009, vol. 127(4), pp. 533-40].
Диабетическая ретинопатия (ДР) является одним из основных осложнений при сахарном диабете (СД) первого и второго типа, число больных которым неуклонно с каждым годом нарастает. Так, по оценкам экспертов ВОЗ, в 1995 г. больных СД было 135 млн, а уже в 2001 году их число достигло 175,4 млн, к 2025 году это число возрастет до 300 миллионов, а к 2030 году достигнет 366 млн человек. Показатель распространенности ДР среди больных СД составляет 45,8%. Самой тяжелой формой поражения глаз является пролиферативная диабетическая ретинопатия, характеризующаяся неудержимым ростом патологических тканевых структур в сетчатке, которые появляются примерно у 10-40 % всех больных СД, что, несмотря на лечение, быстро и неуклонно приводит к потере зрения в 2 % случаев и в 10 % случаев— к тяжелым нарушениям зрения. За последнее десятилетие отмечается рост частоты ДР, которая в настоящее время стала основной причиной необратимой слепоты, особенно у лиц трудоспособного возраста, что создает серьезные медико- социальные проблемы во многих странах мира.
Важнейшим патогенетическим фактором влажной формы ВМД, ДР и отека макулы вследствие окклюзии вен сетчатки является фактор роста эндотелия сосудов - VEGF-A (vascular endothelial growth factor). К семейству VEGF относятся несколько лигандов, отличающихся структурно и функционально: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и P1GF. VEGF-A является основным фактором, стимулирующим рост и новообразование сосудов, он обладает митогенным действием и способствует миграции эндотелиоцитов.УЕОР-А, в свою очередь, объединяет несколько структурно родственных белков, являющихся продуктами альтернативно сплайсированной мРНК - VEGF165, VEGF121 и VEGF110. Основными изоформами VEGF-A, определяющими его активность, являются изоформы VEGF165 и VEGF121. VEGF-B также способствует ангиогенезу, VEGF-C участвует в лимфоангиогенезе во время эмбрионального развития, а также в функционировании дифференцированных лимфатических эндотелиоцитов взрослых. VEGF-D стимулирует рост лимфатического и сосудистого эндотелия. P1GF участвует в ангиогенезе, заживлении ран и воспалительном ответе, [Ohr М. and Kaiser P. "Aflibercept in wet age-related macular degeneration: a perspective review" // Therapeutic Advances in Chronic Disease, 2012, vol. 3(4), pp. 153-161].
Лекарственные средства, ингибирующие связывание VEGF-A с его рецепторами, такие как ранибизумаб (Lucentis®) и Eyelea® являются основными и наиболее эффективными лекарственными препаратами, применяемыми для терапии влажной формы ВМД, миопической XFIB, диабетической ретинопатии и отека макулы вследствие окклюзии вен сетчатки. Интравитреальное (ИВТ) применение таких препаратов не только замедляет развитие этих заболеваний, но может и несколько улучшить зрение [BLA 125156; Summary Review 125387Origl s000.]. Первым препаратом для анти-VEGF терапии в виде интравитреальных инъекций, сертифицированным в России для применения в офтальмологии, был ранибизумаб, совершивший настоящую революцию в лечении ВМД и ставший «золотым стандартом». В июне 2006 года он был утвержден американским агентством по контролю за лекарственными средствами (FDA) как уникальное средство для лечения возрастной макулярной дегенерации, а в 2008 году был зарегистрирован и в России.
Хотя существующие в данное время препараты для ИВТ инъекций обладают высокой эффективностью, но сама техника выполнения данной манипуляции зачастую сопровождается значительными осложнениями со стороны органа зрения для пациентов, приводим выдержку из инструкции по применению луцентиса: «очень часто - интраокулярное воспаление, воспаление стекловидного тела, отслойка стекловидного тела, кровоизлияние в сетчатку глаза, нарушения зрения, боль в глазу, деструкция стекловидного тела, кровоизлияние в конъюнктиву, раздражение глаза, ощущения постороннего тела в глазу, повышенное слезоотделение, блефарит, сухость глаз, гиперемия глаза, ощущения зуда в глазу, повышение внутриглазного давления; часто - дистрофия сетчатки глаза, нарушения функций сетчатки глаза, отслаивание сетчатки глаза, разрыв сетчатки, отслаивание пигментного эпителия сетчатки, отрыв пигментного эпителия сетчатки, снижения остроты зрения, кровоизлияние в стекловидное тело, нарушение функции стекловидного тела, увеит, ирит, иридоциклит, катаракта, субкапсулярная катаракта, помутнение задней капсулы, з точечный кератит; повреждение роговицы, воспаления передней камеры глаза, затуманенное зрение, геморрагии в месте инъекции, кровоизлияние в глаз, конъюнктивит, аллергический конъюнктивит; выделения из глаза, фотопсия, фотофобия, ощущение дискомфорта в глазу, отек век, боль в веке, гиперемия конъюнктивы, слепота, эндофтальмит, ползучая язва роговицы, кровотечение в переднюю камеру глаза, кератопатия, спайки радужки, отложения на роговице, отек роговицы, образование линий растяжения (стрии) на роговице, боль в участке инъекции, покраснение в участке инъекции, повышенная чувствительность глаза, раздражение века». Вследствие этого современная тенденция компаний- разработчиков новых антиангиогенных лекарственных средств для НВТ инъекций - создание препаратов с увеличенным временем полувыведения из стекловидного тела, что позволило бы снизить частоту ИВТ инъекций, тем самым снизив вероятность возникновения нежелательных побочных явлений и повысив качество жизни пациентов, принимающих данные препараты [Wells J. et.al. "Aflibercept, Bevacizumab, or Ranibizumab for Diabetic Macular Edema. Two-Year Results from a Comparative Effectiveness Randomized Clinical Trial II Ophthalmology, 2016, vol. 123(6), pp. 1351-9].
Луцентие1* (ранибизумаб) является Fab-фрагментом гуманизированного моноклонального антитела против VEGF-A человека (IgGlO )) и эффективно блокирует взаимодействие основных изоформ VEGF-A - VEGFies, VEGF12i и VEGFno с рецепторами VEGF первого и второго типов, [Hutton-Smith L.A. et.al. "А Mechanistic Model of the Intra vitreal Pharmacokinetics of Large Molecules and the Pharmacodynamic Suppression of Ocular Vascular Endothelial Growth Factor Levels by Ranibizumab in Patients with Neovascular Age-Related Macular Degeneration" II Molecular Pharmaceutics, 2016, vol. 13(9), pp. 2941-2950]. Eyelea® является химерным белком на основе доменов рецепторов VEGF (3-го домена VEGFRl и 2-го домена VEGFR2) и Fc-фрагмента антитела класса IgGl , [Wells J. et.al. "Aflibercept, Bevacizumab, or Ranibizumab for Diabetic Macular Edema. Two- Year Results from a Comparative Effectiveness Randomized Clinical Trial II Ophthalmology, 2016, vol. 123(6), pp. 1351-9]. Молекулярная масса Луцентис^ - 50 кДа, молекулярная масса Eyelea® - 115 кДа, включая олигосахаридные цепи. Луцентис*" и Eyelea® назначаются в следующем режиме - вначале три инъекции подряд ( 1 раз в месяц), далее - по показаниям По данным, опубликованным в журнале американского общества офтальмологов, по результатам двухлетних сравнительных рандомизированных исследований эффективности препаратов Eyelea®, Авастин* и Луцентис*, медиана количества инъекций на 2-й год терапии (по показаниям) составила 5, 6 и 6, соответственно, а в течение 2-х лет - 15, 16 и 15, соответственно, при сопоставимой эффективности препаратов, [Wells J. et. al. "Aflibercept, Bevacizumab, or Ranibizumab for Diabetic Macular Edema: Two-Year Results from a Comparative Effectiveness Randomized Clinical Trial" // Ophthalmology, 2016, vol. 123(6), pp. 1351 -9].
Элиминация препаратов из стекловидного тела при интравитреальном введении происходит через переднюю камеру глаза или через сосудистую оболочку задней камеры глаза, при этом выведение высокомолекулярных соединений из стекловидного тела происходит, в основном, через переднюю камеру глаза по механизму диффузии с потоком водянистой влаги и, в значительно меньшей степени, через сосудистую оболочку глаза вследствие существования гематоофтальмического барьера. Скорость диффузии зависит от молекулярной массы молекулы. Hutton-Smith и соавторы разработали математическую механистическую модель фармакокинетики макромолекул при интравитреальном введении, основные выкладки которой хорошо согласуются с экспериментальными данными доклинических и клинических исследований ранибизумаба и бевацизумаба, в которой показали, что увеличение времени экспозиции макромолекул в стекловидном теле можно достичь увеличением массы молекулы [Hutton-Smith L.A. et.al. "A Mechanistic Model of the Intravitreal Pharmacok netics of Large Molecules and the Pharmacodynamic Suppression of Ocular Vascular Endothelial Growth Factor Levels by Ranibizumab in Patients with Neovascular Age-Related Macular Degeneration" /7 Molecular Pharmaceutics, 2016, vol. 13(9), pp. 2941-2950].
Препараты для интравитреального введения должны обладать низким системным влиянием. Системная доступность макромолекул при интравитреальном введении вследствие наличия гематоофтальмического барьера снижена, но тем не менее небольшая доля препарата (около 1%) поступает в кровь [BLA 125156, Summary Review 125387Origl s000], для уменьшения системного влияния разработчики ранибизумаба использовали Fab-формат молекулы вследствие его быстрой элиминации из кровотока, поскольку Fab не взаимодействует с FcRn. Fc- фрагмент антител стабилизирует молекулы, увеличивает период их полувыведения из кровотока, поэтому данный подход широко используется при создании химерных белков [Czajkowsky, D., et al. "Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives" // EMBO Mol. Med., 2012, 4, 1015-1028], в том числе и для препарата Eyelea®, [Wells J. et. al. "Aflibercept, Bevacizumab, or Ranibizumab for Diabetic Macular Edema: Two-Year Results from a Comparative Effectiveness Randomized Clinical Trial" // Ophthalmology, 2016, vol. 123(6), pp. 1351-9]. Известны и другие способы модификации белков, увеличивающие как молекулярную массу молекул и физические размеры (гидродинамический объем), так и время их жизни в плазме крови. ["Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives", First Edition. Edited by Roland Kontermann. 2012, Wiley- VCH Verlag]. Одной из таких модификаций является химическая модификация белков с помощью полиэтиленгликолей (ПЭГ), [Veronese, F., Pasut, G. "PEGylation, successful approach to drug delivery" // Drug Discovery Today, 2005, vol. 10, N°21, pp. 1451-58]. Однако неблагоприятными свойствами пэгилированных белков являются химическая неоднородность модифицированных молекул вследствие неоднородности структуры модифицирующего агента и не избирательном (случайном) механизме этого процесса, а также накопление в организме производных ПЭГ, не подверженных биодеградации, [Verhoef J., Anchordoquy Т. " Questioning the Use of PEGylation for Drug Delivery". Drug Deliv. Transl. Res., 2013, 3(6), 499-5038].
Существуют и другие способы модификации белков, которые основываются не на химической модификации, а на создании генетических конструкций (ГК), в результате трансляции которых экспрессируются целевые белки, слитые с модифицирующими полипептидами, придавая исходным белкам желаемые свойства. К числу таких полипептидов относятся:
• искусственные полипептиды, в которых содержатся сайты N- гликозилирования и преобладают повторы из остатков глицина, аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты [US 20090298762];
• полианионные полипептиды из остатков глутаминовой кислоты (84 и 173 остатка) [US 20020169125, AU 2002252429, WO 02077036];
• С-концевой пептид (СТР) β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, содержащего 28 аминокислотных остатков, формирующих четыре сайта О-гликозилирования [US 20120015437]; Одна или несколько копий СТР, присоединяемых к С-концу молекул, существенно удлиняют время жизни терапевтических белков в плазме крови [US 2012035101, US 2012015437, US 2012004286, US 2011286967, US 2010317585, US 2010081614, US 5759818]. Использование СТР-технологии ограничено необходимостью получать модифицированные белки исключительно в клетках животных, обеспечивающих корректное О-гликозилирование;
• Неструктурированные полипептиды.
Способ пролонгирования терапевтических белковых молекул с использованием неструктурированных полипептидов предполагает генетическую гибридизацию белков с высоко растворимыми, химически и иммунологически инертными неструктурированными полипептидами (НП). Такие НП в водных растворах при физиологических солевых, температурных и буферных условиях устойчивы к фолдингу (формированию третичной структуры) и поддерживают стабильное неупорядоченное состояние типа "клубок", гидродинамический объем которого зависит только от числа аминокислотных остатков в составе НП, собственного размера (диаметра) модифицируемого белка и конформационной гибкости НП. В этой связи НП способны опосредовать значительное увеличение гидродинамического объема коньюгированных белков, вызывающее ослабление почечной фильтрации и удлиняющее время жизни белков в плазме крови, [Binder U., Skerra A. "Half-Life Extension of Therapeutic Proteins via Genetic Fusion to Recombinant PEG Mimetics. Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives", First Edition. Edited by Roland Kontermann. 2012. Wiley- VCH Verlag].
Использование НП для пролонгирования белков имеет преимущества перед химической модификацией с помощью ПЭГ, в частности:
• белки, модифицированные по этой технологии, могут быть экспрессированы и внутриклеточно, и в секретированном виде в различных типах клеток, включая бактерии и дрожжи, что позволяет значительно удешевить и ускорить их получение и очистку;
• модифицирующие НП обладают крайне низкой иммуногенностью и подобно ПЭГ способны экранировать чужеродные белки от распознавания иммунной системой; • модифицирующие НП являются биоразлагаемыми, что значительно снижает риск появления токсичности или накопления в каких-либо органах (например, в почках или печени) или клетках (например, в макрофагах);
• генетически кодируемая последовательность НП гарантирует неизменность и точность модификации белка.
В основных чертах эти характерные особенности свойственны трем известным типам НП, способным пролонгировать действие белков до 100 раз:
1) ΧΤΕΝ-полипептидам, содержащим случайное чередование 6 аминокислотных остатков аланина, глутаминовой кислоты, глицина, пролина, серина и треонина [ЕР 2402754, US 20110312881, WO 2011123830, WO 2011123813, US 20110151433, US 20100323956, WO 2010144502, WO 2010091122, CA 2748314, WO 2007103515, US 7846445, US 7855279; Geething N.C., et al. "Gcg-XTEN: an improved glucagon capable of preventing hypoglycemia without increasing baseline blood glucose" // PLoS ONE, 2010, 5:el0175; Schellenberger V., et al. "A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner" // Nat Biotechnol, 2009, 27, 1186-1190];
2) PAS-полипептидам, содержащим остатки пролина, аланина и серина [WO 2011144756, NZ 580670, US 20100292130, ЕР 2173890, WO 2008155134, Skerra А. "'PASylation': a superior technology to extend the plasma half-life of biologicals", 2010, URL: http://www.ideas-exchange.org/Upload/Content/Documents/Skerra_ASylation_13- 10-10.pdf];
3) НАР-полипептидам, являющимися глицин-богатыми последователь- ностями [Schlapschy М., et al. "Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo- amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life" // Protein Engineering, Design & Selection, 2007, 20, 273-284; WO 2007103515], содержащими остатки глицина (G) и серина (S).
Показано пролонгирование действия ИФН за счет использования НП PAS, наименьший размер которых составлял около 200 аминокислотных остатков [WO2008155134A1]. Показано пролонгирование действия ИФН альфа-2 человека за счет использования НАР-полипептидов S(G4S)i6 и S(G4S)2o [RU 2515913 С1].
Однако неструктурированные полипептиды не только увеличивают продолжительность жизни в крови терапевтического белка, но могут привести к экранированию активных сайтов и снижению их целевой биологической активности. Кроме того, в уровне техники показано увеличение продолжительности жизни терапевтического белка, модифицированного с помощью неструктурированного полипептида только в крови.
Таким образом, до сих пор сохраняется насущная потребность в решении задачи создания препарата фрагмента антитела с увеличенным временем экспозиции в стекловидном теле и высокой аффинностью связывания с мишенью.
Раскрытие сущности изобретения
Настоящее изобретение решает задачу создания препарата фрагмента антитела с увеличенным временем экспозиции в стекловидном теле и высокой аффинностью связывания с мишенью.
Для создания препарата с увеличенным временем экспозиции в стекловидном теле была взята за основу концепция математической механистической модели фармакокинетики препаратов при интравитреальном введении - увеличение массы терапевтического белка. Однако было решено отойти от традиционного подхода увеличения массы терапевтического белка путем модификации его с помощью НП, ПЭГ. На примере ранибизумаба авторами настоящего изобретения была исследована возможность увеличения массы терапевтического фрагмента антитела за счет добавления Г(аЬ')-фрагмента. В результате был получен генно-инженерный конструкт Г(аЬ')2-ранибизумаба для эукариотической экспрессии, содержащий на тяжелой цепи hinje-участок с цистеиновыми остатками для образования дисульфидных связей. Молекулу Г(аЬ')2-ранибизумаб мы использовали как базисную структуру для разработки других вариантов молекул, модифицированных различными полипептидами с целью увеличения их массы и гидродинамического объема. В качестве полипептидов, модифицирующих Г(аЬ')2-ранибизумаб мы использовали либо Fc-фрагмент иммуноглобулина IgGl, либо СНЗ -домен Fc- фрагмента иммуноглобулина IgGl, либо неструктурированные гидрофильные полипептиды (НГП), слитые либо с hinje-участком, либо с СНЗ -доменом Fc- фрагмента иммуноглобулина IgGl, либо с легкой цепью молекулы ранибизумаба. Многочисленные исследования полученного продукта показали, что F(ab')2- ранибизумаб имеет увеличенное время экспозиции в стекловидном теле и при этом характеризуется неожиданно высокой аффинностью к VEGF-A по сравнению с ранизумабом.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является полипептид, содержащий F(ab')2 - фрагмент терапевтического антитела, для введения в стекловидное тело для целей лечения и/или профилактики заболевания, в отношении которого указанное антитело имеет терапевтическую активность.
Указанным белком предпочтительно является ранибизумаб, а указанным заболеванием - любое заболевание, сопровождающееся отеком макулы вследствие повышенной экспрессии VEGF-A.
При этом специалисту в уровне техники очевидно, что для последующего увеличения массы и времени действия Р(аЬ')2-фрагмента терапевтического антитела по изобретению может быть дополнен другими полипептидными последовательностями. Например, такими полипептидными последовательностями может быть домен СНЗ антитела и/или НП, включая НАР-полипептидные последовательности S(G4S)i6 и S(G4S)2o и другие по НП, упомянутые в разделе «Уровень техники». Поэтому Р(аЬ')2-фрагмент терапевтического антитела по изобретению может дополнительно включать полипептидные последовательности, выбираемые, в том числе, из S(G4S)16, S(G4S)20, домена СНЗ или их комбинации.
Использование изобретения позволяет повысить удобство анти- VEGF-A терапии при отеке макулы за счет увеличенного времени экспозиции в стекловидном теле и высокой аффинности связывания анти- VEGF-A полипептида с мишенью, что позволит значительно сократить количество введений терапевтического средства.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Связывание белков на основе Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба с рекомбинантным человеческим эндотелиальным фактором роста rhVEGFi2i, определенное методом ИФА.
Фиг. 2а. Зависимость медианы концентрации определяемого белка от дня отбора образцов стекловидного тела. Фиг. 26. Зависимость медианы концентрации определяемого белка от дня отбора образцов водянистой влаги.
Фиг. 2в. Зависимость медианы концен трации определяемого белка от времени отбора образцов крови.
Осуществление изобретении
Этапы получения и характеризации зая вляемых гибридных белков на основе Р(аЬ )2-ранибизумаба.
Этап 1. Получение генно-инженерных конструкций для эукарио тической экспрессии. Используя рутинные методы генетической инженерии, осущес твляли клонирование синтетических последовательностей ДНК, кодирующих тяжелую и легкую цепи Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) в плазмидные векторы, предназначенные для экспрессии белков в эукариотических клетках.
Используя рутинные методы генетической инженерии, осуществляли корректное слияние последовательностей ДНК, кодирующих тяжелую цепь F(ab')2- фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) и третий константный домен тяжелой цепи (СНЗ домен) иммуноглобулина человека подкласса 1 класса IgG, полученный методом П ЦР с использованием соответствующих оригинальных праймеров.
Конструирование плазмидных ДНК, предназначенных для экспрессии в эукариотических клетках белков Lucentis-НС-НГП, Lucentis-LC-Η ΓΠ и Lucentis-HC- СНЗ-НГП, слитых с неструктурированным гидрофильным пеп тидом (Н ГП), осуществляли с помощью рутинных методов генетической инженерии с использованием вспомогательных плазмид, содержащих последовательности, кодирующие соответствующие белки, и корректного слияния последовательностей данных белков с последовательностя и, кодирующими НГ П . Целевые экспрессиоиные плазм иды получали путем перемещения фрагментов вспомогательных плазмид, кодирующих белки Lucent is-НС-НГП, Lucentis-LC-ΗΠΊ и Lucentis-HC-СНЗ-НГП, в плазмидные векторы, предназначенные для экспрессии белков в эукариотических клетках. Этап 2. Получение клонов-продуцентов белков на основе эукариотических клеток. Приготовленные ГИК использовали для электропорации эукариотических клеток и создания клонов-продуцентов на их основе.
Этап 3. Культивирование клонов-продуцентов и выделение белков.
Культивирование клонов-продуцентов целевых белков на основе F(ab')2- фрагмента ранибизумаба осуществляли в одноразовом волновом биореакторе в режиме фед-батч (периодическое культивирование с подпиткой).
Выделение белков осуществляли в нескольких стадий - стадия аффинной хроматографии с использованием сорбентов Capto L (GE Healthcare) или KappaSelect (GE Healthcare), стадии ионообменной хроматографии на гидроксиапатите (CHT-I, Bio-Rad) и SP-sepharose (GE Healthcare).
Этап 4. Изучение физико-химических и функциональных свойств in vitro и in vivo.
Характеризацию выделенных белков на основе Е(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба осуществляли методами ПААГ-электрофореза с додецилсульфатом натрия, ВЭЖХ гель-фильтрации, ИФА, плазмонного поверхностного резонанса и в тесте ингибирования VEGF-A-индуцированной пролиферации клеток HUVEC (первичной культуры эндотелиоцитов из пупочной вены человека).
Этап 5. Оценка фармакокинетических параметров белков на основе РГаЬ'Ъ-Фрагмента ранибизумаба при интравитреальном введении кроликам.
Целью исследования была сравнительная оценка параметров фармако кинетики и то ксико кинетики белков на основе Е(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба и препарата Lucentis® (Novartis) после однократного интравитреального введения кроликам породы Советская шиншилла.
Далее осуществление изобретения показано на конкретных примерах, что не должно восприниматься как ограничение в отношении созданного изобретения. Специалисту в уровне техники ясно, что без затрат изобретательского творчества могут быть разработаны дополнения и изменения относительно раскрытого в ниже представленных примерах в рамках настоящего изобретения. Пример 1 Конструирование рекомбинантной плазмиды pRA1654, кодирующей тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®).
Синтезируют фрагмент ДНК, имеющий открытые «липкие» концы, идентичные «липким» концам, создаваемым эндонуклеазами рестрикции Hindlll на 5 '-конце и Xbal на 3' -конце, и кодирующий полипептид
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAEYQLYESGGGLyQPGGSLRLSCAASGYO^TH YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNS LRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVM PSNTKVDKKVEPKSCDKTHLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG, соответствующий тяжелой цепи Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с Ν-концевой лидерной последовательностью (курсив) фактора свертываемости крови FVII, удаляемой из состава целевого белка в процессе транспорта из цитоплазмы клеток клона-продуцента.
Рекомбинантную плазмиду pRA1654 конструируют на основе плазмидного вектора для экспрессии белков в эукариотических клетках, который имеет в своем составе следующие структурные элементы: структурные элементы CMV промотора (CMV enhancer, EF-Ια promoter, EF- la intron А); сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH poly(A) signal); ориджин репликации высококопийных плазмид (ori ColEl/pMBl/pBR322/pUC); ген, кодирующий β-лактамазу, обеспечивающую устойчивость к ампициллину, карбенициллину и подобным антибиотикам (AmpR, AmpR promoter); ориджин репликации бактериофага fl (fl ori); ранний промотор вируса SV40 (SV40 promoter); ориджин репликации вируса SV40 (SV40 ori); ген PuroR, кодирующий пуромицин N- ацетилтрансферазу, обеспечивающую устойчивость к пуромицину (альтернативно может содержат HygR, кодирующий гигромицин В фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость к гигромицину В, или NeoR/KanR, кодирующую аминогликозид фосфотрансферазу из Тп5, обеспечивающую устойчивость к неомицину, канамицину и G418 (Geneticin®); синтетический сигнал полиаденилирования (poly(A) signal); а также уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции Hindlll и Xbal, расположенные последовательно.
С этой целью синтетический фрагмент ДНК клонируют в выбранном векторе, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную плазмиду pRA1654, содержащую клонированный синтетический фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®)
Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pRA1655, кодирующей легкую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis ).
Синтезируют фрагмент ДНК, имеющий открытые «липкие» концы, идентичные «липким» концам, создаваемым эндонуклеазами рестрикции Hindlll на 5 '-конце и Xbal на 3' -конце, и кодирующий полипептид
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAOlQLTQS^SSLSASYGDRYTnCSASQOlSNY NWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDN ALQ S GNS QE S VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK V Y АСЕ VTHQGL S SPVTKSF RGEC, соответствующий легкой цепи Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с Ν-концевой лидерной последовательностью (курсив) фактора свертываемости крови FVII, удаляемой из состава целевого белка в процессе транспорта из цитоплазмы клеток клона-продуцента.
Рекомбинантную плазмиду pRA1655 конструируют на основе плазмидного вектора для экспрессии белков в эукариотических клетках, который имеет в своем составе структурные элементы, упомянутые в Примере 1.
С этой целью синтетический фрагмент ДНК клонируют в выбранном векторе, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную плазмиду pRA1655, содержащую клонированный синтетический фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®).
Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмиды рМТ1605, кодирующей тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с СНЗ доменом IgGl человека.
Для получения рекомбинантной плазмиды рМТ1605, кодирующей тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с СНЗ доменом IgGl человека, проведены 2 полимеразных цепных реакции.
Реакция 1. В качестве матрицы использована рекомбинантная плазмида pRA1654 (получение описано в Примере 1), в качестве затравок синтеза использованы синтетические олигонуклеотиды:
St3_for
5' - CCTCAGACAGTGGTTCAAAG - 3' и оМТ907
5' - GTCGCAGGACCCGGGCTCCACC - 3'; полученный фрагмент с внесенным сайтом узнавания эндонуклеазой рестрикции Smal на 3 '-конце кодирует тяжелую цепь F(ab)2- фрагмента ранибизумаба (Lucentis®).
Реакция 2. В качестве матрицы использована лабораторная рекомбинантная плазмида, кодирующая третий константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека подкласса 1 класса IgG (СНЗ домен IgGl человека), в качестве затравок использованы синтетические олигонуклеотиды: оМТ908
5' - GCCGCTGAGTTTAAAAGCTGCGAC - 3'
и
ORA405 5' - GCAACTAGAAGGCACAGTC- 3';
полученный фрагмент с внесенным сайтом узнавания эндонуклеазой рестрикции Dral на 5'-конце кодирует СНЗ домен IgGl человека.
Рекомбинантную плазмиду рМТ1605 конструируют на основе плазмидного вектора для экспрессии белков в эукариотических клетках, который имеет в своем составе структурные элементы, упомянутые в Примере 1.
Фрагмент, полученный в ходе Реакции 1, расщепляют с использованием эндонуклеаз рестрикции Hindlll и Smal; а фрагмент, полученный в ходе Реакции 2, с использованием Dral и Xbal. Полученные фрагменты очищают с помощью спин- колонок и используют в трехкомпонентной (вектор+вставка 1+вставка 2) реакции лигирования с выбранным вектором, расщепленным по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования Hindlll и Xbal были восстановлены. В результате получают рекомбинантную плазмиду рМТ1605, содержащую клонированный фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) слитую с СНЗ доменом IgGl человека, кодирующий полипептид
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAEY Q YESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYD^Tll YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNS LRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVMH PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK соответствующий тяжелой цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) слитой с СНЗ доменом IgGl человека с Ν-концевой лидерной последовательностью (курсив) фактора свертываемости крови FVII, удаляемой из состава целевого белка в процессе транспорта из цитоплазмы клеток клона-продуцента. Пример 4. Конструирование рекомбинантной плазмиды рМТ1616, кодирующей тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с СНЗ доменом IgGl человека, слитую с НГП.
Для получения рекомбинантной плазмиды рМТ1616, кодирующей тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с СНЗ доменом IgGl человека слитую с НГП, получена вспомогательная плазмида N° 1.
Рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°l конструируют на основе любого лабораторного плазмидного вектора, содержащего уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции Hindlll и Xbal, а также такие структурные элементы как ориджин репликации высококопийных плазмид (ori ColEl/pMBl/pBR322/pUC); ген, кодирующий β-лактамазу, обеспечивающую устойчивость к ампициллину, карбенициллину и подобным антибиотикам (AmpR, AmpR promoter); ориджин репликации бактериофага fl (fl ori); и не содержащую сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl, например, модифицированную плазмиду рВК685.
С этой целью рекомбинантную плазмиду рМТ1605, кодирующей тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) слитую с СНЗ доменом IgGl человека, расщепляют с использованием эндонуклеаз рестрикции Hindlll и Xbal и образовавшиеся фрагменты рестрикции разделяют в геле. Меньший по размеру фрагмент ДНК элюируют из геля и называют фрагмент- 1. Фрагмент- 1 клонируют в выбранном векторе, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°la или рМТ1608, содержащую клонированный фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с СНЗ доменом IgGl человека.
Реакция 3. Для внесения сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl в области 3 '-конца за 4 п.н. до стоп-кодона проведена ПНР. В качестве матрицы использована рекомбинантная плазмида рМТ1608; в качестве затравок использованы синтетические олигонуклеотиды: оМТ909 5' - GCAGCCGGATCTCAGTGGTGGT - 3'
и
oMT910
5'
CCCTCTAGATTACTAGGCAGAAGAGCCCTTGCCGGGGCTCAGGCTCAGA - 3'; полученный фрагмент с внесенным сайтом узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl на 3 '-конце кодирует модифицированную на С-конце тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с СНЗ доменом IgGl человека.
Фрагмент ДНК, полученный в ходе Реакции 3, расщепляют с использованием эндонуклеаз рестрикции Hindlll и Xbal; очищают с помощью спин-колонок и используют в реакции лигирования с выбранным вектором (рВК685), расщепленным по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды (вспомогательная плазмида N°16) сайты клонирования Hindlll и Xbal были восстановлены.
Для получения рекомбинантной вспомогательной плазмиды N°l вспомогательную плазмиду N°16 расщепляют по сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl. Одновременно, рекомбинантную плазмиду, кодирующую НГП расщепляют по сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl и образовавшиеся фрагменты рестрикции разделяют в геле. Меньший по размеру фрагмент ДНК элюируют из геля и называют фрагмент-2. Фрагмент-2 клонируют в вспомогательную плазмиду N°16, расщепленную по сайту Sapl. Полученная рекомбинантная вспомогательная плазмида N°l содержит клонированный фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с СНЗ доменом IgGl человека слитую с НГП.
Рекомбинантную плазмиду рМТ1616 конструируют на основе плазмидного вектора для экспрессии белков в эукариотических клетках, который имеет в своем составе структурные элементы, упомянутые в Примере 1.
С этой целью рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°l расщепляют по сайтам узнавания эндонуклеазами рестрикции Hindlll и Xbal и образовавшиеся фрагменты рестрикции разделяют в геле. Меньший по размеру фрагмент ДНК элюируют из геля и называют фрагмент-3. Фрагмент-3 клонируют в выбранном векторе для эукариотической экспрессии, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную плазмиду рМТ1616, содержащую клонированный фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь F(ab)2- фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) с СНЗ доменом IgGl человека, слитую с НГП.
Рекомбинантная плазмида рМТ 1616 кодирует полипептид
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAEY Q YESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYD^Tll YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNS LRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVM PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSGGQPREPQV YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSS-ΗΓΠ, соответствующий тяжелой цепь Г(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®) слитой с СНЗ доменом IgGl человека, слитой с НГП (жирный), с Ν-концевой лидерной последовательностью (курсив) фактора свертываемости крови FVII, удаляемой из состава целевого белка в процессе транспорта из цитоплазмы клеток клона-продуцента.
Пример 5. Конструирование рекомбинантной плазмиды рМТ1612, кодирующей тяжелую цепь Г(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП.
Для получения рекомбинантной плазмиды рМТ1612, кодирующей тяжелую цепь Г(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП, получена вспомогательная плазмида N°2.
Рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°2 получают также, как и рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°l, описанную в Примере 4.
С этой целью рекомбинантную плазмиду pRA1654 из Примера 1, кодирующей тяжелую цепь Г(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), расщепляют с использованием эндонуклеаз рестрикции Hindlll и Xbal и образовавшиеся фрагменты рестрикции разделяют в геле. Меньший по размеру фрагмент ДНК элюируют из геля и называют фрагмент-4. Фрагмент-4 клонируют в векторе рВК685, описанном в Примере 4, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°2a (рМТ1606), содержащую клонированный фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®).
Реакция 4. Для внесения сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl в области 3 '-конца за 4 п.н. до стоп-кодона проведена ПНР. В качестве матрицы использована рекомбинантная плазмида рМТ1606; в качестве затравок использованы синтетические олигонуклеотиды: оМТ909
5' - GCAGCCGGATCTCAGTGGTGGT - 3'
и
оМТ911
5' - CCCTCTAGATTACTAGGCAGAAGAGCCAGGGCCTCCCAGC - 3', полученный фрагмент с внесенным сайтом узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl на 3 '-конце кодирует модифицированную на С-конце тяжелую цепь
Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®).
Фрагмент ДНК, полученный в ходе Реакции 4, расщепляют с использованием эндонуклеаз рестрикции Hindlll и Xbal; очищают с помощью спин-колонок и используют в реакции лигирования с выбранным вектором рВК685, расщепленным по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды (вспомогательная плазмида N°26) сайты клонирования Hindlll и Xbal были восстановлены.
Для получения рекомбинантной вспомогательной плазмиды N°2 вспомогательную плазмиду N°26 расщепляют по сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl. Одновременно, рекомбинантную плазмиду, кодирующую НГП расщепляют по сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl и образовавшиеся фрагменты рестрикции разделяют в геле. Меньший по размеру фрагмент ДНК элюируют из геля и называют фрагмент-5. Фрагмент-5 клонируют во вспомогательную плазмиду N°26, расщепленную по сайту Sapl. Полученная рекомбинантная вспомогательная плазмида N°2 содержит клонированный фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП.
Рекомбинантную плазмиду рМТ1612 конструируют на основе плазмидного вектора для экспрессии белков в эукариотических клетках, который имеет в своем составе структурные элементы, упомянутые в Примере 1.
С этой целью рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°2 расщепляют по сайтам узнавания эндонуклеазами рестрикции Hindlll и Xbal и образовавшиеся фрагменты рестрикции разделяют в геле. Меньший по размеру фрагмент ДНК элюируют из геля и называют фрагмент-6. Фрагмент-6 клонируют в выбранном векторе для эукариотической экспрессии, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную плазмиду рМТ1612, содержащую клонированный фрагмент ДНК, кодирующий тяжелую цепь F(ab)2- фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП.
Рекомбинантная плазмида рМТ1612 кодирует полипептид
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAEY Q YESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYD^Tll YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNS LRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVM PSNTKVDKKVEPKSCDKTHLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP GSS-ΗΓΠ, соответствующий тяжелой цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитой с НГП (жирный), с Ν-концевой лидерной последовательностью (курсив) фактора свертываемости крови FVII, удаляемой из состава целевого белка в процессе транспорта из цитоплазмы клеток клона-продуцента. Пример 6. Конструирование рекомбинантных плазмид рМТ1613, рМТ1614 и рМТ1615, кодирующих легкую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП.
Для получения рекомбинантной плазмиды рМТ1613, рМТ1614 и рМТ1615, кодирующих легкую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП, получена вспомогательная плазмида N°3.
Рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°3 получают также, как и рекомбинантные вспомогательные плазмиды N°l и N°2, описанные в Примерах 4 и 5.
С этой целью рекомбинантную плазмиду pRA1655 из Примера 2, кодирующей легкую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), расщепляют с использованием эндонуклеаз рестрикции Hindlll и Xbal и образовавшиеся фрагменты рестрикции разделяют в геле. Меньший по размеру фрагмент ДНК элюируют из геля и называют фрагмент-7. Фрагмент-7 клонируют в векторе рВК685, описанном в Примере 4, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°3a (рМТ1607), содержащую клонированный фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®).
Реакция 5. Для внесения сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl в области 3 '-конца за 4 п.н. до стоп-кодона проведена ПЦР. В качестве матрицы использована рекомбинантная плазмида рМТ1607; в качестве затравок использованы синтетические олигонуклеотиды: оМТ909
5' - GCAGCCGGATCTCAGTGGTGGT - 3'
и
оМТ912
5' - CCCTCTAGATTACTAGGCAGAAGAGCCGCACTCGCCTCTATTG - 3', полученный фрагмент с внесенным сайтом узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl на 3 '-конце кодирует модифицированную на С-конце легкую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®).
Фрагмент ДНК, полученный в ходе Реакции 5, расщепляют с использованием эндонуклеаз рестрикции Hindlll и Xbal; очищают с помощью спин-колонок и используют в реакции лигирования с выбранным вектором рВК685, расщепленным по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды (вспомогательная плазмида N°36) сайты клонирования Hindlll и Xbal были восстановлены.
Для получения рекомбинантной вспомогательной плазмиды N°3 вспомогательную плазмиду N°36 расщепляют по сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl. Одновременно, рекомбинантную плазмиду, кодирующую НГП расщепляют по сайту узнавания эндонуклеазы рестрикции Sapl и образовавшиеся фрагменты рестрикции разделяют в геле. Меньший по размеру фрагмент ДНК элюируют из геля и называют фрагмент-8. Фрагмент-8 клонируют во вспомогательную плазмиду N°36, расщепленную по сайту Sapl. Полученная рекомбинантная вспомогательная плазмида N°3 содержит клонированный фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП.
Рекомбинантную плазмиду рМТ1613 конструируют на основе плазмидного вектора для экспрессии белков в эукариотических клетках, который имеет в своем составе структурные элементы, упомянутые в Примере 1.
С этой целью рекомбинантную вспомогательную плазмиду N°3 расщепляют по сайтам узнавания эндонуклеазами рестрикции Hindlll и Xbal и образовавшиеся фрагменты рестрикции разделяют в геле. Меньший по размеру фрагмент ДНК элюируют из геля и называют фрагмент-9. Фрагмент-9 клонируют в выбранном векторе для эукариотической экспрессии, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную плазмиду рМТ1613, содержащую клонированный фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь F(ab)2- фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП.
Рекомбинантную плазмиду рМТ1614 конструируют на основе плазмидного вектора для экспрессии белков в эукариотических клетках, который отличается от вектора, имеющего в своем составе структурные элементы, упомянутые в Примере 1, тем, что элемент PuroR, кодирующий пуромицин Ν-ацетилтрансферазу, обеспечивающую устойчивость к пуромицину, заменен на HygR, кодирующий гигромицин В фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость к гигромицину В.
Для получения целевого экспрессионного вектора рМТ1614 фрагмент-9 клонируют в выбранном векторе для эукариотической экспрессии, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную плазмиду рМТ1614, содержащую клонированный фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь Г(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП.
Рекомбинантную плазмиду рМТ1615 конструируют на основе плазмидного вектора для экспрессии белков в эукариотических клетках, который отличается от вектора, имеющего в своем составе структурные элементы, упомянутые в Примере 1, тем, что элемент PuroR, кодирующий пуромицин Ν-ацетилтрансферазу, обеспечивающую устойчивость к пуромицину, заменен на NeoR/KanR, кодирующую аминогликозид фосфотрансферазу из Тп5, обеспечивающую устойчивость к неомицину, канамицину и G418 (Geneticin®).
Для получения целевого экспрессионного вектора рМТ1615 фрагмент-9 клонируют в выбранном векторе для эукариотической экспрессии, расщепленном по сайтам Hindlll и Xbal таким образом, чтобы в составе результирующей плазмиды сайты клонирования были восстановлены. В результате получают рекомбинантную плазмиду рМТ1615, содержащую клонированный фрагмент ДНК, кодирующий легкую цепь Г(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитую с НГП.
Рекомбинантные плазмиды рМТ1613, рМТ1614 и рМТ1615 кодируют полипептид A VSQALRLLCLLLGLQGCLAOlQLTQSPSSLSASVGORVTYTCSASQDlSNYL NWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ YSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDN ALQ S GNS QE S VTEQD SKD STYSLSSTLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SPVTKSF RGECGSS-ΗΓΠ, соответствующий легкой цепь Р(аЬ)2-фрагмента ранибизумаба (Lucentis®), слитой с НГП (жирный), с Ν-концевой лидерной последовательностью (курсив) фактора свертываемости крови FVII, удаляемой из состава целевого белка в процессе транспорта из цитоплазмы клеток клона-продуцента.
Пример 7. Получение клонов-продуцентов белков на основе эукариотических клеток.
Приготовленные ГИК использовали для создания клонов-продуцентов на основе эукариотических клеток. Для этого смешивали препараты плазмид, описанных в примерах 1-6, кодирующих легкую и тяжелую цепи соответствующего белка, и трансфецировали эукариотические клетки методом электропорации. Проводили селекцию трансфецированных клеток методом культивирования на селективном антибиотике. После получение стабильных пулов клеток-продуцентов соответствующих белков производили их клонирование, культуральную жидкость одиночных клонов тестировали методом твердофазного ИФА на иммобилизованном рекомбинантном человеческом VEGF-A и выбирали клоны с максимальной продуктивностью целевых белков на основе Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба.
Пример 8. Культивирование клонов-продуцентов и выделение белков.
Культивирование клонов-продуцентов целевых белков на основе F(ab')2- фрагмента ранибизумаба осуществляли в одноразовом волновом биореакторе в режиме фед-батч (периодическое культивирование с подпиткой). В качестве базовой питательной среды использовали SFM4CHO (HyClone, США), в качестве подпитки - BalanCD СНО Feed 2 (Irvine Scientific, США). Продолжительность культивирования составляла 10 суток. По окончании культивирования суспензии клеток проводили через 3-х-ступенчатую осветляющую фильтрацию и проводили выделение целевых белков из культуральной жидкости. На первой стадии очистки всех вариантов белков на основе F(ab' ^-фрагмента ранибизумаба применяли аффинную хроматографию с использованием сорбентов Capto L (GE Healthcare) или KappaSelect (GE Healthcare). Оба сорбента специфично связывают легкую цепь иммуноглобулинов типа IgG-каппа за ее вариабельную (Capto L) или константную (KappaSelect) часть. Сорбенты уравновешивали фосфатно- солевым буфером, наносили осветленную культуральную жидкость, промывали уравновешивающим буфером от несвязавшихся примесей, затем элюировали целевые белки буфером, содержащим 50 мМ гистидина, рН 2,5. Для всех белков показали схожую эффективность выделения при использовании обоих сорбентов.
На второй стадии очистки использовали мультимодальный сорбент гидроксиапатит (CHT-I, Bio-Rad), который часто применяется для очистки антител от родственных примесей и остаточных белков клеток-продуцентов. Сорбент предварительно уравновешивали раствором 50 мМ гистидина, рН 7,0, затем наносили элюаты белков после аффинной стадии, разведенные водой до проводимости 3-5 мСм/см, промывали сорбент уравновешивающим буфером, затем буфером, содержащим 50 мМ гистидин, 1 М хлорид натрия, рН 7,0. Целевые белки элюировали линейным градиентом фосфата натрия (рН 7,0) до концентрации 300 мМ. Все полученные на этой хроматографической стадии фракции анализировали с помощью ВЭЖХ гель-фильтрации и ПААГ-электрофореза с додецилсульфатом натрия для выбора фракций, содержащих целевые формы белков. Очистка на гидроксиапатите позволяла эффективно удалить низкомолекулярные родственные примеси, а также остаточные примесные белки.
При необходимости проводили доочистку целевого белка путем фильтрации через катионообменный сорбент SP-sepharose (GE Healthcare) при рН 5,5 и проводимости 4-6 мСм/см, а также концентрирование и диафильтрацию образцов в требуемый буфер на концентраторах Amicon Ultra (Millipore) с отсечкой по молекулярной массе 30-50 кДа. По окончании выделения чистота белка составляла не менее 90% целевой формы белка по данным электрофореза и ВЭЖХ гель- фильтрации. Пример 9. Физико-химические свойства белков, определяемые методом ВЭЖХ гель-фильтрации.
Всего было получено 7 разных белков на основе F(ab' ^-фрагмента ранибизумаба, проводили характеризацию выделенных белков методом ВЭЖХ гель- фильтрации. Для этого использовали систему ВЭЖХ Alliance 2695 (Waters), с детектором UV/Visible Detector 2487 (Waters) и колонку Superdex200 (Increase 10/300 GL, Lot. 10226065, No. 0128; GE Healthcare). В качестве подвижной фазы использовали фосфатно-солевой изотонический буфер. В таблице 1 даны условное обозначение белков, их номинальная и кажущаяся молекулярная масса, полученная при ВЭЖХ гель-фильтрации.
Таблица 1. Номинальная молекулярная масса белков на основе F(ab')2- фрагмента ранибизумаба.
Figure imgf000029_0001
Варианты белков на основе Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба ТЗ, Т4, Т5, Т6 и Т7 имеют по данным ВЭЖХ гель-фильтрации большую кажущуюся молекулярную массу, превышающую их номинальную молекулярную массу от 2,61 до 4,96 раз, что обусловлено наличием в их структуре НГП.
Пример 10. Взаимодействие белков с рекомбинантным VEGF-A (rhVEGF121) человека, определяемое методом ИФА.
Препараты белков на основе Т(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба были охарактеризованы методом ИФА по связыванию с рекомбинантным человеческим фактором роста эндотелия сосудов - rhVEGF121 производства ООО «МБЦ «Генериум». Для этого rhVEGFm производства ООО «МБЦ «Генериум» вносили в лунки ИФА планшетов по 100 μΐ в концентрации 1 μ§/ιη1 в карбонат-бикарбонатном буфере (pH 9,5) и сорбировали в течение ночи при +4°С. Остаточные свободные центры связывания пластика блокировали раствором PBS-Tha («ПанЭко», KaT.N° Э4100- 110) в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего в лунки планшетов вносили по 100 мкл растворов белков, разведенных PBS-0,05%Tw20 последовательными 3 -кратными разведениями от 100 до 0,002 пМ. Планшеты инкубировали в течение 1 часа, отмывали несвязавшиеся антитела, детекцию комплексов белков с rhVEGFni проводили с помощью биотинилированных поликлональных крысиных антител к ранибизумабу производства ООО «МБЦ «Генериум» и конъюгированного с пероксидазой хрена стрептавидина (Abeam, ab7403). В качестве субстрата для пероксидазы хрена использовали ТМБ (США, Партия: TMBPD 10222-2- 10273 -А), реакцию останавливали раствором 2М H2S04. Развитие реакции оценивали по оптической плотности, измеренной при длине волны 450 нм. Результаты исследования представлены на рисунке 1.
В таблице 2 приведены усредненные данные по аффинности G R049- кандидатов (ЕС50, пМ), полученные с помощью ИФА.
Таблица 2. Доля НГП- полипептида (%) и ЕС50 (пМ) связывания белков на основе Г(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба с rhVEGF121, полученных методом ИФА.
Figure imgf000030_0001
Все белки на основе Т(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба взаимодействуют с рекомбинантным человеческим энд отел иал ьным фактором роста rhVEGFi2i; при этом варианты белков, несущие НГП, дают меньшую оптическую плотность при насыщающих концентрациях в сравнении с белками без НГП, а кажущийся аффинитет белков, несущих НГП, уменьшается с возрастанием доли НГП- полипептида в молекулярной массе. Пример 11. Взаимодействие белков с рекомбинантным VEGF-A (rhVEGF121) человека, определяемое методом поверхностного плазмонного резонанса.
Кинетические характеристики взаимодействия белков на основе F(ab')2- фрагмента ранибизумаба оценивали методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore Т200. В первой серии экспериментов сравнивали кинетические характеристики взаимодействия коммерческого препарата Lucentis® (Novartis) и Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба, полученного в ООО «МБЦ «Генериум». Для этого рекомбинантный человеческий белок rhVEGF121 производства ООО «МБЦ «Генериум» и рекомбинантный коммерческий VEGF-A кролика (Kingfisher Biotech, Inc., Cat. N° RPO923U-100) ковалентно иммобилизовали на чип СМ-5, затем пропускали растворы Lucentis® (Novartis) и F(ab '^-фрагмента ранибизумаба в буфере HBS-EP+. Рабочие концентрации 0.74, 2.22, 6.67, 20, 60 пМ. Ассоциация 210 сек в буфере HBS-EP+. Диссоциация 14400 сек (4 часа) в буфере 20mM Na- Acetate, 150тМ NaCl, ЗтМ EDTA, 0.005% Tween20, рН 4.5. Финальная регенерация раствором 50 тМ Gly-HCl, рН 2.5. В связи с использованием низкого рН при диссоциации, получены кажущиеся KD для вариантов Lucentis с human VEGF121. Кажущиеся KD рассчитывали из математической модели белок-белкового взаимодействия 1 : 1. Данные приведены в таблице 3.
Таблица 3. Константы диссоциации (KD) препаратов белков Lucentis (Novartis) и F(ab '^-фрагмента ранибизумаба (Т1), полученного в ООО «МБЦ «Генериум» с рекомбинантными факторами роста сосудов человека и кролика.
Figure imgf000031_0001
Изменение формата молекулы с Fab-фрагмента на F(ab '^-фрагмент при неизменной первичной структуре привело к повышению кажущейся аффинности примерно в 10 раз, столь значительное повышение аффинности F(ab '^-фрагмента ранибизумаба явилось неожиданным.
Во второй серии экспериментов оценивали кинетические характеристики взаимодействия других вариантов белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба с рекомбинантным человеческим фактором роста эндотелия сосудов rhVEGFni методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore Т200 по приведенной выше методике. Данные приведены в таблице 4.
Таблица 4. Кинетические характеристики и константы диссоциации (KD) препаратов белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба с рекомбинантным человеческим фактором роста эндотелия сосудов rhVEGFni методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore Т200
Figure imgf000032_0001
Как видно из данных, представленных в таблице 4, кинетические характеристики взаимодействия белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба с рекомбинантным фактором роста сосудов человека rhVEGFni -константы скорости ассоциации комплекса Каоп) и скорости диссоциации комплекса Kd (K0ff), также, как и равновесная константа диссоциации комплекса KD, у всех вариантов димерных молекул не уступают, и даже превосходят таковые характеристики для ранибизумаба. В то же время, RUmax для белков, несущих в своей структуре НГП, достоверно меньше, чем для белков без НГП, тогда как данный показатель должен расти с увеличением молекулярной массы, что мы и наблюдаем для мономера и димера ранибизумаба - для мономера RUmax составляет 52,83, а для димеров - 78,07 и 96,27. Достоверное снижение RUmax для белков с НГП может объясняться как малой долей активных молекул в белковом препарате, так и тем, что модифицированные НГП молекулы имеют больший гидродинамический объем, и при образовании комплекса с ковалентно иммобилизованным на подложке чипа rhVEGF121; НГП экранирует соседнюю иммобилизованную молекулу rhVEGF121; создавая эффект уменьшения плотности иммобилизованных молекул rhVEGF121; доступных для взаимодействия, что и приводит к снижению RUmax. Объяснение феномена снижения RUmax для препаратов белков с НГП при анализе на Biacore Т200 потребовало от нас постановки эксперимента с образованием комплекса каждого из белков с rhVEGFni в растворе, поскольку в растворе отсутствуют стерические затруднения комплексообразования.
Пример 12. Образование комплекса белков на основе Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба с рекомбинантным человеческим фактором роста эндотелия сосудов rhVEGFi2i в растворе.
При анализе кинетических характеристик взаимодействия препаратов с rhVEGFi2i на Biacore Т200 наблюдали значимое снижение RUmax для модифицированных НГП белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба, что могло свидетельствовать как о стерических затруднениях взаимодействия белков, несущих НГП, с иммобилизованным на подложке антигеном вследствие их большого гидродинамичского радиуса, так и о том, что какая-то доля белка в препаратах не активна. Для этого проводили дополнительный анализ активности приготовленных препаратов, изучая их взаимодействие с rhVEGFni в растворе при эквимолярном соотношении. Белки смешивали с
Figure imgf000033_0001
в эквимолярном соотношении в растворе PBS, инкубировали в течение ночи при +4°С, затем проводили ВЭЖХ-гель- фильтрацию на колонке Superdex S200, эффективность комплексообразования оценивали по площади пика свободного rhVEGFni в сравнении с соответствующим показателем для препарата Lucentis® (Novartis). Данные приведены в таблице 5. Таблица 5. Площадь пика свободного rhVEGFi2i при оценке комплексообразования белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба с rhVEGFi2i в растворе при эквимолярном соотношении.
Figure imgf000034_0001
Как видно из данных, представленных в таблице 5, площадь пика свободного rhVEGFi2i при эквимолярном соотношении Lucentis® (Novartis) и rhVEGFi2i составляет 34% от площади пика rhVEGFi2i без добавления какого-либо связывающего его агента. За исключением Т5, площадь пика свободного rhVEGFi2i для которого составила 57%, соответствующий показатель для других белков на основе Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба варьирует от 16% до 37%, что доказывает высокую антигенсвязывающую способность разработанных молекул, не уступающую таковой характеристике для луцентиса.
Пример 13. Ннгибирование гпУЕСРШ-индуцированной пролиферации клеток HUVEC белками на основе Е(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба.
Было проведено сравнительное определение биологической активности препаратов белков на основе Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба и препарата Lucentis® (Novartis) в тесте ингибирования гпУЕОРш-индуцированной пролиферации первичной культуры человеческих эндотелиоцитов пупочной вены (HUVEC, Lonza, Cat. JVfe CC2517). Для этого клетки HUVEC I пассажа (PI) (Lonza, Cat. JVfe CC2517) размораживали и высевали в полную ростовую среду EGM-2 (Endothelial Growth Medium) во флакон T25, предварительно покрытый раствором 0.1% желатина. После достижения клетками монослоя (Р2) их снимали с пластика с помощью обработки раствором аккутазы и высевали во флакон Т75, также предварительно покрытый раствором 0.1% желатина. Когда клетки достигали максимальной плотности (РЗ) их высевали в покрытые желатином лунки 96-луночного плоскодонного планшета в количестве 10 тысяч клеток на лунку в полной ростовой среде EGM-2 (пассаж 3). На следующий день клетки HUVEC дважды аккуратно отмывали стерильным раствором PBS и инкубировали в среде ЕВМ с добавлением 0,2% FBS (среда для постановки теста) на протяжении 2.5-4 часов. Препараты белков на основе Е(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба, Lucentis® и rh EGFni разводили в среде для постановки теста в соответствии со схемой эксперимента. Затем каждый из тестируемых препаратов в серии 8 последовательных 3-х- кратных разведений от 100 до 0.05 пМ инкубировали с rhVEGFi2i (125 ng/ml) в течение 2 часов, после чего вносили прединкубированные растворы в планшеты с клетками HUVEC согласно схеме эксперимента. На каждом планшете были дополнительно сделаны следующие контроли - лунки, содержащие только rhVEGFi2i (125 ng/ml); лунки, содержащие полную ростовую среду, и лунки со средой для постановки теста. Все комбинации тестируемых веществ были добавлены к клеткам в трипликатах. Планшеты помещали в С02-инкубатор и инкубировали при 37С и 5% СОг в течение 72 часов. После окончания инкубации для оценки жизнеспособности клеток в лунки планшетов добавляли реагент ХТТ (Roche, Cat. N° 11465015001) согласно инструкции производителя и дополнительно инкубировали планшеты при 37С и 5% СОг в течение 4-6 часов. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 пМ и референсной длине волны 690 пМ. Процент ингибирования VEGF-A-индуцированной пролиферации клеток HUVEC вычисляли по формуле:
(Abs. VEGF121/T х - средняя Abs.VEGF-0) * 100
(средняя Abs.VEGF121 - средняя Abs.VEGF-0)
где "средняя Abs. VEGF121 - средняя Abs.VEGF-0" соответствует разности средней оптической плотности в лунках с добавлением rhVEGFni (125 ng/ml) и средней оптической плотности в лунках со средой для постановки теста, т.е. максимальной пролиферации клеток HUVEC за время теста; "Abs. VEGF121/ T-x" соответствует оптической плотности в лунке, содержащей исследуемый белок в определенной концентрации и rhVEGF121, а
"средняя Abs. VEGF-0" соответствует средней оптической плотности лунок, содержащих только тестовую среду без добавления ростовых добавок.
Полученные данные обсчитывали в программе GraphPad Prism версии 6.0 с использованием 4-х параметрической логистической функции «доза-ответ - ингибирование», данные представлены в таблице 6.
Таблица 6. IC50 для препаратов белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба и Lucentis® (Novartis) в тесте гпУЕОТш-индуцированной пролиферации клеток HUVEC.
Figure imgf000036_0001
Как видно из данных, представленных в таблице 6, препараты белков на основе Т(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба не уступают по биологической активности препарату Lucentis® (Novartis) в тесте ингибирования гпУЕОТш-индуцированной пролиферации клеток HUVEC in vitro. Данный тест обладает высокой предсказательной способностью антиангиогенной эффективности препаратов in vivo, в том числе, при введении человеку. Полумаксимальная концентрация ингибирования (IC50) гпУЕОБш-индуцированной пролиферации препарата Lucentis® (Novartis) варьировала от 2,5 до 3,2 пМ, среднее значение - 2,9 пМ, стандартное отклонение - 0,3 пМ. IC50 препаратов белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба изменялось от 1,3 пМ до 2,5 пМ, что говорит о том, что все белки обладают высокой антиангиогенной активностью, сопоставимой с таковым показателем для «золотого стандарта» в лечении офтальмологических заболеваний, патогенез которых обусловлен высокой активностью фактора роста эндотелия сосудов - ранибизумаба. Пример 14. Доклинические исследования in vivo - исследование фармакокинетики и токсикокинетики белков на основе Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба при однократном интравитреальном введении кроликам породы Советская шиншилла.
Целью исследования было сравнительное определение основных параметров фармакокинетики и токсикокинетики с оценкой офтальмотоксичности и возможного общего токсического действия белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба и препарата Lucentis® (Novartis) при однократном интравитреальном введении кроликам породы Советская шиншилла. Исследование было выполнено в ЗАО «НПО «Дом фармации» (Россия, Ленинградская область, Всеволожский муниципальный район, Кузьмоловское городское поселение) в соответствии с основными принципами надлежащей лабораторной практики и этическими нормами по охране животных, используемых в научных целях.
Задачи исследования включали изучение влияния тестируемых объектов на биометрические параметры исследуемых животных - смертность и динамику массы тела; изучение влияния тестируемых объектов на клиническое состояние структур глаза исследуемых животных; офтальмоскопическую оценку влияния тестируемых объектов на состояние глазного дна экспериментальных животных. В таблицах 7 и 8 представлены основные группы животных, доза препаратов для интравитреального введения и основные процедуры, выполненные в ходе исследования.
Таблица 7. Группы животных при однократном интравитреальном введении кроликам в исследовании фармакокинетики и токсикокинетики препаратов белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба и сравнительного препарата Lucentis® (Novartis)
Figure imgf000037_0001
5 7 T5 50 0.40 животному из
6 7 T6 50 0.40 каждой группы);
7 7 Τ7 50 0.43 14-й день (по 3
8 7 Τ8 (буфер) 50 - животных из
9 7 Луцентис® 50 0.50 каждой группы)
30-й день (по 3 животных из каждой группы)
Материалы и методы. Исследование проводили на половозрелых самцах кроликов породы Советская шиншилла. Тестируемые объекты вводили животным интравитреально в дозе 50 мкл в каждый глаз животного. Объем введения тестируемых объектов для исследования фармакокинетики с оценкой офтальмотоксичности был выбран, опираясь на биоэтические принципы, учитывая травматичность и болезненность процедуры интравитреального введения, а также на основании данных о максимальных рекомендуемых объемах интравитреального введения кроликам. Был использован интравитреальный путь введения, так как этот способ введения является планируемым способом применения в клинической практике.
Таблица 8. Основные методы в ходе выполнения исследования фармакокинетики, токсикокинетики с оценкой офтальмотоксичности и возможного общего токсического действия препаратов белков на основе Т(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба и сравнительного препарата Lucentis® (Novartis)
Figure imgf000038_0001
стекловидного тела и день
водянистой влаги при
эвтаназии
Забор крови Через 4, 8, 24, 48, 72, 96, 192 и 384 часов после
введения
Эвтаназия животных 1-й день, через 4 часа после введения препаратов (по
1 животному из каждой группы); 14-й день (по 3 животных из каждой группы); 30-й день (по 3 животных из каждой группы)
Интравитреальные инъекции осуществляли после наркотизации животных путем внутривенного введения им смеси препаратов Золетил®100 (Virbac, Франция) в дозе 1,5 мг/кг и Рометар® (Bioveta, Чехия) в дозе 1,5 мг/кг (СОП ЭЖ-20). Смесь анестетиков в данной дозе позволяла достичь оптимальной длительности наркоза для проведения инъекций в оба глаза животного и обеспечивала полное отсутствие роговичного рефлекса на всей продолжительности проведения манипуляций. Для местного обезболивания в конъюнктивальный мешок вносили раствор местного анестетика (Инокаин®, глазные капли, Промед Экспорте ПВТ. ЛТД). Очередность манипуляций при выполнении интравитреальной инъекции была следующей: 1) внесение раствора мидриатика (Ирифрин®, глазные капли, Промед Экспорте ПВТ. ЛТД) в конъюнктивальный мешок, ожидание 5 минут; 2) промывание поверхности роговицы стерильным физиологическим раствором; 3) внесение раствора местного анестетика (Инокаин®) в конъюнктивальный мешок, ожидание 3 минуты; 4) промывание поверхности роговицы стерильным физиологическим раствором; 5) внесение препарата Бетадин, 0,5% раствор (Pharmaceuticals PLC (Венгрия)); 6) проведение иглы одноразового инсулинового шприца через склеру на расстоянии 2-3 мм от лимба в направлении к экватору в верхнее-наружном квадранте; проведение иглы вглубь стекловидного тела на 2-3 мм параллельно хрусталику.
Осмотр животных в клетках содержания, с целью выявления смертности или признаков отклонения в состоянии здоровья, проводили ежедневно.
Лишение корма - животные были лишены утреннего кормления до процедуры введения и взвешивания животных. Доступ к воде не был ограничен.
Массу тела регистрировали в утренние часы непосредственно перед введением, далее еженедельно. Процедуру проводили на весах настольных медицинских МТ "Карапуз" 20 ВЖА-(5г,Р)бА, зав..1\°488688. Наименьший предел взвешивания - 100 г. Наибольший предел взвешивания - 20 кг. Цена поверочного деления 5 г. Класс точности 3.
Клинический осмотр видимых структур глаза проводили непосредственно перед началом исследования, далее - ежедневно. Осуществляли полуколичественную оценку параметров офтальмотоксичности в баллах. При наличии патологического признака присваивали 1 балл, при отсутствии признака - балл был равен 0. Оценивали следующие показатели офтальмотоксичности:
- Ксерофтальмия (сухость роговицы и конъюнктивы глаза, возникающая из-за нарушения слезоотделения);
- Кератит (воспаление роговицы глаза, сопровождающееся ее помутнением);
- Слезотечение;
- Нагноение;
- Отечность;
- Покраснение;
- Экзофтальм (смещение кпереди глазных яблок);
- Мидриаз (расширение зрачка);
- Миоз (значительное сужение зрачка, физиологическая рефлекторная реакция, которая возникает при освещении глаз светом большой яркости). Офтальмоскопическую оценку состояния глазного дна осуществляли до начала исследования, на 2-й, 13-й и 29-й дни после инъекций препаратов путем прямой офтальмоскопии и осмотра переднего отдела глаза с помощью лупы (40 дптр) после введения в каждый глаз препарата Атропин (капли глазные 1% (Московский эндокринный завод (Россия)). Оценивали патологические изменения в области жёлтого пятна, центральной области сетчатки, диска зрительного нерва и сосудов сетчатки.
Отбор крови (по 1 мл) осуществляли в стерильные пробирки с ЭДТА через 4, 8, 24, 48, 72, 96, 192 и 384 часов после введения препаратов. Образцы крови центрифугировали для получения плазмы. Каждый образец плазмы делили на две части, помещали в промаркированные криоустойчивые пробирки, маркировка каждой пробирки включала номер экспериментальной группы, номер животного, вид биообразца, дату и время забора материала. Все полученные образцы замораживали, хранили при температуре -70° и транспортировали Спонсору исследования для проведения дальнейших анализов в сухом льду.
Эвтаназию животных в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях от 22 сентября 2010 г., проводили путем передозировки средствами для наркоза. Эвтаназию осуществляли с помощью препаратов Золетил® и Рометар®, после введения животных в глубокий наркоз осуществляли внутривенное введение препарата Лидокаин (Дальхимфарм (Россия)). Данный вид эвтаназии является гуманным и не противоречит нормативным документам, сопровождается минимумом боли, страдания и дистресса, и был проведен компетентными сотрудниками.
После эвтаназии животных производили забор полного объема стекловидного тела и водянистой влаги. Каждый биологический образец делили на две части, помещали в маркированные криоустойчивые пробирки, маркировка каждой пробирки включала в себя номер экспериментальной группы, номер животного, вид биообразца, дату и время забора материала. Все полученные образцы замораживали, хранили при температуре -70° и транспортировали Спонсору исследования для проведения дальнейших анализов в сухом льду.
Статистический анализ данных массы тела животных - данные проверяли на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро- Уилка. В случае нормального распределения считали среднее значение и стандартную ошибку среднего, которые вместе со значением п (количество наблюдений) представлены в итоговых таблицах. Для оценки данных с признаками нормального распределения использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), предназначенный для сравнения нескольких выборок (групп) и вычисления общего уровня значимости различий. Статистический анализ выполнялся с помощью программного обеспечения Statistica 6.0. (StatSoft, USA).
Заключения и выводы ЗАО «НПО «Дом фармации» об оценке офтальмотоксичности и общего токсического действия препаратов белков на основе F(ab ^-фрагмента ранибизумаба и сравнительного препарата Lucentis® (Novartis) при однократном интравитреалъном введении кроликам породы Советская шиншилла: 1. Тестируемые объекты Tl, Т2, ТЗ, Т4, Т5, Т6, Т7, Т8, так же, как и референсный препарат Луцентис®, не повлияли на динамику массы тела животных.
2. Во всех группах (Tl, Т2, ТЗ, Т4, Т5, Т6, Т7, Т8,) не было статистически значимых отклонений от контрольных групп по частоте возникновения изучаемых клинически значимых отклонений.
Результаты оценки параметров фармакокинетики и токсикокинетики препаратов белков на основе Р(аЬ')2-фрагмента ранибизумаба при однократном интравитреальном введении кроликам породы Советская шиншилла, полученные в ООО «МБЦ «Генериум»
С целью определения концентрации препаратов в биологических образцах кроликов был разработан специфичный и высоко чувствительный метод в варианте «сэндвич»-ИФА на основе поликлональных крысиных антител к ранибизумабу, полученных в ООО «МБЦ «Генериум».
Кратко, поликлональные крысиные антитела к ранибизумабу вносили в лунки ИФА планшетов по 100 μΐ в концентрации 1 μ /ηι1 в карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,5) и иммобилизовали в течение ночи при +4°С. Остаточные свободные центры связывания пластика блокировали раствором PBS-Tha («ПанЭко», Кат. N° Э4100- 110) в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого в лунки планшетов вносили биологические образцы, разведенные раствором PBS-0,05%Tw20, в последовательных 2-кратных разведениях. Планшеты инкубировали в течение 1 часа, отмывали несвязавшиеся антитела и вносили раствор биотинилированных поликлональных кроличьих антител к ранибизумабу (ООО «МБЦ «Генериум»). После инкубации в течение 1 часа отмывали несвязавшиеся антитела и добавляли конъюгированный с пероксидазой хрена стрептавидин в разведении, рекомендованном производителем (Abeam, ab7403). Инкубировали 40 минут при комнатной температуре и вносили субстрат для пероксидазы хрена. В качестве субстрата для HRP использовали ТМБ (США, Партия: TMBPD 10222-2- 10273 -А), реакцию останавливали раствором 2М H2SO4. Реакцию оценивали по оптической плотности, измеренной на микропланшетном спектрофотометре Bio-Rad xMark при длине волны 450 нм. Полученные данные обсчиты вали с помощью программного обеспечения Bio-Rad Microplale Manager 6 для микропланшетного спектрофотометра.
Концентрация исследуемых препаратов в стекловидном теле после однократного ИН Г введения и предварительная оценка соотношения периодов полувыведешш из стекловидного тела препаратов белков на основе F(ab')2- фрагмснта раиибизумаба и препарата Lucentis'"' (iNovariis)
Дизайн проведенного сравни тельного скринингового исследования включал всего три временных точки отбора биологических образцов, в соответствии с основными принципами этических норм обращения с лабораторными животным и и минимизации количества экспериментальных животных, поскольку основной задачей исследования было сравнит ельное изучение параметров фармакоки нетикп при И В введении большой панели изучаемых препарат ов и препара та Lucent is " . Мы не стремились к точному определению параметров фармакокинетики, таких как скорость и период полувыведения препара тов из стекловидного т ела, эта задача потребовала бы значительно больше лабораторных животных, а хотели лишь установи ть соотношение данных параметров у каждого из изучаемых препаратов и препара та Lucentis®. Образцы стекловидного тела забирали у эксперимен тальных животных после эвтаназии и энуклеации глаз на 1 -й день (через 4 часа), на 14-й и 30-й день после ИВТ инъекций. Концентрацию препаратов белков на основе F(ab' )2- фрагмента раиибизумаба определяли описанным выше методом относи тельно соответствующей калибровочной кривой для каждого из изучаем ых белков.
На фигурах 2а, 26 и 2в приведены графики зависимости медиан концен трации определяемых белков в стекловидном теле, водянистой влаге и плазме- крови в молярном выражении, от времени забора биологических образцов после однократной ИВТ инъекции.
Рассчитывали один из основных критериев фармакокине тики. о тражающий экспозицию каждого из исследуемых препаратов в стекловидном теле, - площадь под каждой кривой (AUC ιν , нМ/(мл*ч), (рис 33), в соответствии с линейным правилом трапеций с помощью приложения Excel Р Solver 2.0. Для расчета скорости элиминации (клиренса, С1) использовали следующую формулу [I lutton-Smith LA. ei.al. "A Mechanistic Model of the Imravitreal Pharmacokinetics o f Large Mo lecu les and the Pharmacodynamic Suppression of Ocular Vascular Endothelial Growth Factor Levels by Ranibizumab in Patients with Neovascular Age-Related Macular Degeneration" // Molecular Pharmaceutics, 2016, vol. 13(9), pp. 2941-2950]:
DivT V SS IVT * 0,693
CI IVT Vss IVT * Kelimination — —
AUC IVT T 1/2 IVT
, где Vss ivT - равновесный объем распределения в стекловидном теле, DIVT - ИВТ доза, Τι/2 ΐντ - период полувыведения из стекловидного тела.
Исходя из предположения, что равновесный объем распределения в стекловидном теле одинаков для всех исследованных молекул и для Lucentis®, получается следующее равенство:
CI IVT (Lucentis®) Т1/2 IVT (GNR049)
CI IVT (GNR049) 1/2 IVT (Lucentis®)
Данные расчётов приведены в таблице 9.
Таблица 9. AUC IVT (нМ/(л*сут.)), клиренс FVT (МЛ*Ч) И соотношение периодов полувыведения препарата Lucentis® и исследуемых препаратов белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба в стекловидном теле при однократном ИВТ введении кроликам породы Советская шиншилла.
Figure imgf000044_0001
Как видно из данных таблицы 9, максимальное время экспозиции в стекловидном теле было определено для препарата Lucentis® при его большей, относительно других препаратов, молярной DIVT - 6667 нМ, молярные ИВТ дозы других препаратов были значительно (от 4.5 до 2.4 раза) меньше DIVT луцентиса и, в соответствии с этим, их показатели AUCIVT были меньше показателя AUCIVT ДЛЯ Lucentis® от 2.3 до 3 раз. При самой малой DIVT препарата Т7 (меньше в 4.5 раза дозы Lucentis®) его показатель AUCIVT был меньше соответствующего значения препарата Lucentis® лишь в 2.5 раза. Скорость элиминации исследуемых молекул была достоверно меньше для препаратов белков на основе F(ab '^-фрагмента ранибизумаба, модифицированных НГП, чем для препарата Lucentis® и немодифицированных НГП вариантов белков. Самая низкая скорость элиминации была показана для препарата Т7. Соотношение периодов полувыведения исследуемых препаратов и препарата Lucentis® из стекловидного тела было больше 1 для всех модифицированных НГП вариантов, а для вариантов Т6 и Т7 данное соотношение составило 1.5 и 1.8, соответственно. Это означает, что период полувыведения последних больше TmivT препарата Lucentis® как минимум в 1 ,5 и 1 , 8 раза, поскольку расчет AUCIVT, на основании которого рассчитывали скорость выведения, производили только до 30 дня, когда уже не определялась концентрация Lucentis®, но еще достоверно определялись и Т6, и Т7. Для точного определения периода полувыведения препаратов Т6 и Т7 из стекловидного тела необходимо провести дополнительное исследование с большим количеством временных точек отбора в интервале от 1 до 45-60 дня исследования.
Таблица 10. АиСВОд.вл. (нМ/(л*ч)), Авод.Вл. (AUCB(W.M. DIVT) и доля Авод.Вл. от Αιντ. для препарата Lucentis® и исследуемых G R049-npenapaTOB после однократного ИВТ введения кроликам породы Советская шиншилла
Figure imgf000045_0001
вл. нМ/(м
103,9 33,4 23,7 22,2 16,5 20,8 16,7 7.2 л*ч)
Л A вод.вл.
ч/мл 10,4 7,9 9,4 8,5 6,3 8, 1 6,5 3.2
Figure imgf000046_0001
% от А ιντ
5
(AUC(IVT) DIVT) 8.2 ,9 7,2 5,1 4Д 5,6 3,2 1,4
Данные, представленные в таблице 10, говорят о том, максимальные медианы концентрации препаратов в водянистой влаге были определены через 4 часа после ИВТ инъекций, максимальное значение медианы концентрации через 4 часа наблюдали для препарата луцентис, минимальное - для препарата Т7. На 14 сутки концентрация препаратов во всех группах снижалась, на 30-е сутки в образцах водянистой влаги определяли только модифицированные НГП варианты белков, что свидетельствует о том, что на 30-й день исследования данные препараты еще содержались в стекловидном теле, в отличие от луцентиса и немодифицированных НГП белков, поскольку в водянистую влагу белки поступают именно из стекловидного тела. Данный факт согласуется с данными определения концентрации исследуемых препаратов в стекловидном теле. Показатель АиСвод.Вл. был максимальным для препарата луцентис в соответствии с его DIVT, поэтому для более корректного сравнения данного показателя между экспериментальными группами мы вычисляли нормированный относительно соответствующей DIVT показатель AUCB(W.M. - Авод.вл., который отражает эффективность поступления препарата из стекловидного тела в переднюю камеру глаза. Данный показатель (АВОд.Вл.) был максимальным для луцентиса и минимальным - для препарата Т7. Процентная доля показателя АВОд.Вл. от соответствующего нормированного показателя в стекловидном теле - Αιντ была также максимальной для препарата луцентис и минимальной - для препарата Т7, данный показатель также отражает эффективность выведения препаратов из стекловидного тела через водянистую влагу передней камеры глаза.
В таблице 11 представлены основные фармакокинетические параметры исследуемых препаратов Т6 и Т7, для которых показано увеличенное время экспозиции в стекловидном теле, в сравнении с препаратом Lucentis®. Таблица 11. АиС(ПЛазма), А(плазма) % А(плазма) от Αιντ для препарата Lucentis и препарата Т7 после однократного ИВТ введения кроликам породы Советская шиншилла.
Figure imgf000047_0001
Вычисленное значение АиС(ПЛазма) для препарата Lucentis в 2,4 раза больше, чем соответствующее значение для препарата G R049/T7, но ИВТ доза препарата Lucentis® в 4 раза превышает DIVT препарата G R049/T7, Нормированные относительно DIVT значения АиС(ПлазМа) - А(плазма) более информативно отражают как способность препаратов поступать в кровоток, так и время их экспозиции в кровеносном русле, Значение А(плазма) для препарата Т7 больше соответствующего значения для препарата Lucentis® лишь в 1,9 раза, что при доказанной безопасности применения препарата Lucentis® в клинической практике, скорее всего, не приведет к нежелательным явлениям, обусловленным системным влиянием препарата Т7, который представляет модифицированный вариант препарата Lucentis®,
Таким образом, новый белок Т7 экспрессируется в эукариотической системе с приемлемой для производства продуктивностью, обладает высокой, сопоставимой с ранибизумабом, аффинностью к VEGF-A человека и кролика, высокой эффективностью в ингибировании VEGF-A-индуцированной пролиферации клеток HUVEC, предварительно оцененный период полувыведения Т7 из стекловидного тела при ИВТ введении кроликам примерно в 2 раза превышает соответствующий показатель для ранибизумаба при сопоставимых показателях системного влияния этих препаратов.

Claims

Формула изобретения
1. Полипептид, содержащий F(ab')2 терапевтического антитела, для введения в стекловидное тело для целей лечения и/или профилактики заболевания, в отношении которого указанное антитело имеет терапевтическую активность.
2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанное терапевтическое антитело представляет собой ранибизумаб, а указанное заболевание является заболеванием, сопровождающимся отеком макулы вследствие повышенной экспрессии VEGF-A.
3. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит полипептидные последовательности, выбранные из домена СНЗ антитела, неструктурированных полипептидов, в том числе, НАР-полипептидных последовательностей S(G4S)i6 и S(G4S)2o, или их комбинации.
- 46 -
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2017/050121 2016-12-13 2017-12-07 Средство для лечения заболеваний, сопровождающихся отеком макулы вследствие повышенной экспрессии vegf-a WO2018111156A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016148710A RU2669787C2 (ru) 2016-12-13 2016-12-13 Средство для лечения заболевания, сопровождающегося отеком макулы вследствие повышенной экспрессии VEGF-A
RU2016148710 2016-12-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018111156A1 true WO2018111156A1 (ru) 2018-06-21

Family

ID=62559578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/050121 WO2018111156A1 (ru) 2016-12-13 2017-12-07 Средство для лечения заболеваний, сопровождающихся отеком макулы вследствие повышенной экспрессии vegf-a

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2669787C2 (ru)
WO (1) WO2018111156A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2761339C1 (ru) * 2021-03-09 2021-12-07 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней имени Гельмгольца" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ГБ им. Гельмгольца" Минздрава России) Способ определения уровня экспрессии гена, кодирующего VEGF-A в тканях глаза кролика Oryctolagus cuniculus, и набор для его определения

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2366388C1 (ru) * 2008-04-29 2009-09-10 Федеральное государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" Способ хирургического лечения субретинальных кровоизлияний на фоне возрастной макулодистрофии с субретинальной неоваскулярной мембраной
JP2012072152A (ja) * 2003-08-27 2012-04-12 Ophthotech Corp 眼血管新生疾患の治療のための併用療法
RU2530583C2 (ru) * 2008-09-10 2014-10-10 Дженентек, Инк. Способы ингибирования глазного ангиогенеза

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012072152A (ja) * 2003-08-27 2012-04-12 Ophthotech Corp 眼血管新生疾患の治療のための併用療法
RU2366388C1 (ru) * 2008-04-29 2009-09-10 Федеральное государственное учреждение "Межотраслевой научно-технический комплекс "Микрохирургия глаза" имени академика С.Н. Федорова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" Способ хирургического лечения субретинальных кровоизлияний на фоне возрастной макулодистрофии с субретинальной неоваскулярной мембраной
RU2530583C2 (ru) * 2008-09-10 2014-10-10 Дженентек, Инк. Способы ингибирования глазного ангиогенеза

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOROL A.R. ET AL.: "Vliyanie intravitrealnogo vvedeniya ranibizumaba, pegaptaniba natriya, bevatsizumba na gemodinamiku glaz krolikov", TAVRICHESKY MEDIKO-BIOLOGICHESKY VESTNIK, vol. 15, no. 59, 2012, pages 74 - 77 *
MAGDELAINE-BEUZELIN CHARLOTTE ET AL.: "Therapeutic antibodies in ophthalmology Old is new again.", MABS, vol. 2, no. 2, March 2010 (2010-03-01), pages 176 - 180, XP055079691 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016148710A (ru) 2018-06-13
RU2016148710A3 (ru) 2018-06-13
RU2669787C2 (ru) 2018-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6796184B2 (ja) 二重特異性抗vegf/抗ang−2抗体及び眼血管疾患の処置におけるそれらの使用
RU2670943C2 (ru) Антагонисты ил-6 и их применение
AU2007238677B2 (en) Use of IL-I antibodies for treating ophthalmic disorders
JP7107914B2 (ja) VE-PTP(HPTP-β)を標的化するヒト化モノクローナル抗体
AU2015342882B2 (en) Improved IL-6 antibodies
EP2846836B1 (en) Method of treating amd in patients refractory to anti-vegf therapy
TW201427989A (zh) 長效性蛋白質之組合物及方法
CN110283248B (zh) 一种长效低毒的重组抗vegf人源化单克隆抗体及其生产方法
EP2766044A1 (en) Treatment of ocular disease
CN117467025B (zh) 一种抗vegf和补体双功能融合蛋白及其应用
RU2669787C2 (ru) Средство для лечения заболевания, сопровождающегося отеком макулы вследствие повышенной экспрессии VEGF-A
CN116390767A (zh) 用于长效递送治疗剂的多功能蛋白聚糖 (vg1) 的透明质酸结合衍生物
CN116761634A (zh) 用于长效眼部递送的非共价蛋白质-透明质酸缀合物
JP2024543158A (ja) 多重特異性リガンド結合分子及びその用途
BR112015000800B1 (pt) Método para a redução da viscosidade de um anticorpo, anticorpos biespecíficos, composição farmacêutica compreendendo um anticorpo, método para preparação de um anticorpo biespecífico e anticorpos biespecíficos bivalentes

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17881737

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17881737

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1