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WO2017187696A1 - 神経細胞を培養する装置、神経細胞を培養する方法、培養された神経細胞、軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法並びに神経細胞の使用方法 - Google Patents

神経細胞を培養する装置、神経細胞を培養する方法、培養された神経細胞、軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法並びに神経細胞の使用方法 Download PDF

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WO2017187696A1
WO2017187696A1 PCT/JP2017/003653 JP2017003653W WO2017187696A1 WO 2017187696 A1 WO2017187696 A1 WO 2017187696A1 JP 2017003653 W JP2017003653 W JP 2017003653W WO 2017187696 A1 WO2017187696 A1 WO 2017187696A1
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WO
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axon
chamber
cell
cell body
bundle
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PCT/JP2017/003653
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French (fr)
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藤井　輝夫
与志穂 池内
祥平 金田
治良 川田
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一般財団法人生産技術研究奨励会
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    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Definitions

  • the present disclosure relates to a device for culturing nerve cells, a method for culturing nerve cells, a method for analyzing and identifying cultured nerve cells, proteins in axon bundles, and a method for using nerve cells.
  • Non-Patent Document 1 and Patent Document 1 are microfluidic platforms with multiple compartments that can grow and separate axons.
  • One of the advantages of the present disclosure is that it can provide a device for culturing neurons that rapidly grows axon bundles extending from neurons in vitro.
  • the device is a device for culturing a nerve cell having an axon, comprising a culture plate and a plurality of modules arranged in the culture plate, each module comprising a cell body of a nerve cell.
  • a channel capable of receiving at least one first chamber, at least one second chamber, and an axon bundle extending from a cell body, the channel connecting the first chamber and the second chamber;
  • a module including at least one of the first chamber, the lower ends of the first chamber, the second chamber, and the channel are closed, and the upper ends of the first chamber and the second chamber are opened.
  • a culture solution is further placed in the first chamber, the second chamber, and the channel, and the upper end of the second chamber is closed by at least one sealing member.
  • the second chamber can receive skeletal muscle, whereby the axon bundle extending from the cell body is joined to the skeletal muscle.
  • the channel has a width of 100 to 150 [ ⁇ m] and a height of 100 to 200 [ ⁇ m].
  • a method for culturing a nerve cell having an axon comprising: at least one of a first chamber, at least one of a second chamber, and a channel connecting the first chamber and the second chamber. Supplying a culture solution to at least one, wherein the first chamber, the second chamber and the channel are included in at least one of the modules disposed in the culture plate; and in the first chamber Seeding the nerve cells with each other, and culturing the nerve cells, whereby an axon bundle grows and extends through each channel.
  • skeletal muscle is further seeded in at least one of the second chambers, whereby the axon bundle extending from the nerve cell is joined to the skeletal muscle.
  • a nerve cell is a plurality of nerve cells cultured by seeding in a culture solution, and includes a cell body and at least one axon bundle extending from the cell body in a predetermined direction.
  • the cell body, axon bundle and axon end are further spatially separated.
  • the nerve cells are spheroid-like, and the axon bundle can be extended.
  • the axon bundle is joined to skeletal muscle.
  • a method for analyzing and identifying a protein in an axon bundle comprising culturing a nerve cell so that at least one of the axon bundle grows and extends from the cell body of the nerve cell, and Western blotting And confirming that the marker indicating the presence of the cell body is negative in the axon bundle.
  • the markers are map 2 (Map2) and nucleoporin.
  • a method for analyzing and identifying a protein in an axon bundle comprising culturing the nerve cell such that at least one of the axon bundle grows and extends from the cell body of the nerve cell; Slicing the axon bundle, and analyzing and identifying a protein present in the axon bundle.
  • axon bundles extending from nerve cells can be rapidly grown in vitro.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a background in the present embodiment
  • FIG. 2 is a diagram showing a concept in the present embodiment
  • 2A is a schematic diagram of nerve cells
  • FIG. 2B is a diagram showing the results of conventional culture
  • FIG. 2C is a diagram showing the concept of the present embodiment.
  • This embodiment proposes a new process for culturing nerve cells equipped with axons, a new apparatus suitable for culture, and a cluster of nerve cells equipped with cultured axon bundles.
  • a neuron includes a cell body (cell body) and an axon (axon terminal ⁇ ) having an axon end (axon).
  • motoneuron axons are bundled, and axon ends are joined to cells of a plurality of skeletal muscles. Therefore, as shown in FIG.
  • cells having axons in bundles with the cell bodies, axons, and axon ends spatially separated from each other by in-vitro culture It is desirable to produce a dense body, ie, a spheroid of the cell body.
  • a dense body ie, a spheroid of the cell body.
  • FIG. 2B only cell bodies with axons in a random state in which cell bodies and axons are spatially mixed can be provided.
  • FIG. 3 is a view showing a culture plate in the present embodiment
  • FIG. 4 is a view showing a culture module in the culture plate in the present embodiment
  • FIG. 5 is a view showing a culture module having a seal in the present embodiment. is there. 3, (a) is a plan view, (b) is an enlarged side sectional view of the culture module in (a), FIG. 4 (a) is a photograph of the culture plate, and (b) is a culture module.
  • FIG. 5 is a schematic plan view of the culture module.
  • FIG. 5A is a schematic side cross-sectional view of the culture module with a seal
  • FIG. 5B is a seal.
  • FIG. 4 is a schematic side cross-sectional view of a culture module that does not include a seal.
  • the culture plate 10 is used. As shown in FIGS. 3 (a) and 4 (a), the culture plate 10 is a rectangular plate-like member, and includes a plurality of modules 11 arranged side by side in the row direction and the column direction.
  • the culture plate 10 includes a substrate 15 made of a cover slip, which is a transparent glass plate, and an upper plate 16 attached to the surface of the substrate 15. A plurality of modules 11 are formed on the upper plate 16. As shown in FIGS.
  • each module 11 has a dumbbell-like shape in plan view, and has a U-shaped cross-sectional shape as a whole, and includes a first chamber 12a, A two-chamber 12b and a channel 13 connecting the bottoms of the first and second chambers 12a and 12b are included.
  • the upper plate 16 may be a PDMS poly (poly-dimethyl-siloxane) sheet, and can be produced using a known photolithography technique (see, for example, Non-Patent Document 1 and Patent Document 1).
  • the upper plate 16 may be a plate-like member made of another polymer such as Pyrex (registered trademark) or glass, for example, and is formed using a method such as hot embossing or drilling. It may be.
  • Each of the first and second chambers 12a and 12b is a cylindrical recess, and is formed as a well-like depression whose bottom is closed by the substrate 15 and whose top is open.
  • One end of the channel 13 opens at the lower end of the side wall of the first chamber 12a, and the other end opens at the lower end of the side wall of the second chamber 12b.
  • the width of the channel 13 is preferably 100 to 150 [ ⁇ m], and the height thereof is preferably 100 to 200 [ ⁇ m], but these dimensions are not limited to such numerical values, It can be adjusted as needed.
  • the first and second chambers 12 a and 12 b and the channel 13 are filled with the culture solution 18. Since the module 11 has a simple configuration, the culture solution 18 can smoothly flow into the module 11.
  • the culture solution 18 in the first and second chambers 12a and 12b is natural. Can be mixed.
  • the planar shape of each of the first and second chambers 12a and 12b is preferably circular as shown in FIG. 4 (e), but is not limited to a circular shape and is changed as necessary. be able to.
  • the planar shape of the first chamber 12a is perfect.
  • the second chamber 12b is deformed rather than circular, but the planar shape of the second chamber 12b is almost completely circular because the inlet portion 13a of the channel 13 is linear.
  • the entrance portion 13 a has a tapered planar shape, the axon is effectively guided into the channel 13. Even if the inlet portion 13 a has a linear shape, the axons can form a bundle in the channel 13.
  • a cell body of a nerve cell is placed, that is, seeded.
  • the chamber in which the cell body is seeded either the first chamber 12a or the second chamber 12b can be selected. However, in the present embodiment, for convenience, the cell body is seeded in the first chamber 12a.
  • a plurality of nerve cell bodies are seeded separately, that is, in a dissociated cell state.
  • a plurality of nerve cell bodies are seeded densely, that is, in a spheroid state. Then, after culturing for a while, nerve cell axons extend in the channel 13 to the second chamber 12b and form bundles in the channel 13.
  • the inner diameter of the channel 13 is preferably large enough to accommodate the axon bundle of nerve cells.
  • a seal member 17 is placed on the second chamber 12b in order to close the open end of the second chamber 12b in which the nerve cell body is not seeded. It is desirable to place it.
  • the seal member 17 is preferably made of a PCR (Polymerase Chain Reaction) sealing plate or sealing film, but is not necessarily limited to this, and any material suitable for sealing can be used. It may consist of.
  • FIGS. 5C and 5D when the open end of the second chamber 12b is closed by the seal member 17, the culture solution is prevented from flowing into the second chamber 12b. It becomes easy to seed and keep the cell body in the first chamber 12a. As shown in FIG.
  • the neuronal cell body placed in the first chamber 12a is moved into the second chamber 12b together with the culture solution. It tends to flow in. If the neuronal cell body is seeded in the first chamber 12a in a spheroid state, the spheroid of the cell body is too large to flow in the channel 13, and thus the seal member 17 can be omitted.
  • FIG. 6 is a photograph showing axons grown in the channel of the culture plate in the present embodiment
  • FIG. 6A is another photograph showing axons grown in the channel of the culture plate in the present embodiment
  • FIG. 7 is a book. It is a photograph which shows the axon extracted from the culture plate in embodiment.
  • (a) is a photograph of a part of the culture plate
  • (b) is a photograph of one axon of the modules shown in (a)
  • (a) is an axon.
  • (b) is a photograph showing an example of an axon length of 9 [mm]
  • (b) is a fluorescence photograph of the cell nucleus (using the marker Hoechst)
  • (c) is a fluorescence photograph of the whole nerve (using the marker Tuj 1).
  • motor neurons derived from human iPS cells (409B2 cell line) were used. Spheroids of cell bodies of motor neurons were seeded and cultured in the first chamber 12a. Motor neurons were obtained from human iPS cells using well plates or dishes. And the spheroid of the cell body was obtained using the non-adhesive culture plate. The culture was performed in an environment of 37 [° C.], O 2 : 20 [%], and CO 2 : 5 [%]. Then, as shown in FIG. 6, an axon grew in the channel 13 and extended to the second chamber 12b. After the culture, a collection of motor neurons was extracted from the module 11 of the culture plate 10, that is, taken out.
  • the aggregate of motor neurons extracted from the module 11 includes a large axon bundle extending from the aggregate of cell bodies, as shown in FIG.
  • FIG. 7 (b) cell nuclei present in the cell body and stained with the marker Hoechst were observed in the assembly of motor neurons.
  • FIG. 7C an aggregate of motor neurons stained with Tuj 1 as a marker was observed.
  • Tuj 1 as a marker was observed.
  • axon bundles extend from the assembly of cell bodies.
  • axon bundles of various sizes can be obtained by changing the length and inner diameter of the channel 13. For example, in the example shown in FIG. 6A (a), the length of the axon is 4.5 [mm], and in the example shown in FIG.
  • the length of the axon is 9 [mm]. is there.
  • the length of the axon is preferably 1 [mm] or more.
  • the width of the axon bundle can be set to 100 [ ⁇ m], for example. In this case, when observed with a TEM image of the cross section of the axon bundle as shown in FIG.
  • axon bundles can be obtained by culturing in each module 11 of the culture plate 10. Therefore, by applying a drug to the axon bundle in each module 11, drug screening can be performed quickly. Furthermore, since the axon bundle is separated from the cell body in each module 11, it is possible to screen a drug effective for neurological diseases by accurately applying the drug to the axon bundle in each module 11. In addition, it is possible to confirm in which part of the axon bundle, for example, the distal end or the proximal end, the drug is effective.
  • FIG. 8 is a diagram showing an experiment for joining axons of motor neurons derived from the 409B2 cell line in this embodiment and skeletal muscles of laboratory mice
  • FIG. 9 shows motor nerves derived from the 409B2 cell line in this embodiment
  • FIG. 10 is a diagram showing a long-term experiment for joining cell axons and skeletal muscles of laboratory mice.
  • FIG. 10 shows motor neuron axons derived from the 409B2 cell line and skeletal muscles derived from the C2C12 cell line in this embodiment. It is a figure which shows the experiment which joins.
  • FIG. 10 is an enlarged photograph of an axon when there is a myotube, and in FIG. 10, (a) is a schematic plan view of the module, and (b) is an enlarged photograph of a joint portion.
  • motor neurons derived from human iPS cells (409B2 cell line) were used as nerve cells, and myotubes of laboratory mice (shown in FIG. 8 (a)) were used as skeletal muscles. Motor neurons and cell body spheroids were obtained in the same manner as described above. Moreover, those culture
  • FIGS. 8 (c) and (d) show the inside of the channel 13 after 28 days in culture when the myotube is not seeded in the second chamber 12b and when the myotube is seeded in the second chamber 12b, respectively. Shows the growth state of axons.
  • a longer period (43 days) than in the first experiment (28 days) but as shown in FIGS. 9 (a) and (b), the same as the first experiment.
  • Module 11 and similar motor neurons and myotubes were used in the same manner and co-cultured. It was found that when the myotube is not seeded in the second chamber 12b, the morphology of the axon bundle is degenerated.
  • FIGS. 8 (c) and (d) show the inside of the channel 13 after 28 days in culture when the myotube is not seeded in the second chamber 12b and when the myotube is seeded in the second chamber 12b, respectively. Shows the growth state of axons.
  • motor neurons derived from human iPS cells (409B2 cell line) were used as nerve cells, and striated muscles derived from mouse myoblasts (C2C12 cell line) were used as skeletal muscles.
  • FIG. 10A nerve cells were seeded in the first chamber 12a, skeletal muscle was seeded in the second chamber 12b, and nerve cells and skeletal muscle were co-cultured.
  • the part where the axon and skeletal muscle were joined was stained with ⁇ -Bungarotoxin, and the axon was stained with Tuj 1.
  • FIG. 10 (b) the junction between the axon and the skeletal muscle was observed.
  • the end of the axon can be joined to the skeletal muscle in the second chamber 12b away from the first chamber 12a where the cell body exists.
  • this embodiment can provide a situation similar to that in the body. Therefore, a drug effective for a neurological disease can be screened by accurately applying the drug to the junction between the axon bundle and the skeletal muscle in each module 11.
  • FIG. 11 is a photograph of the axon bundle used for protein observation in the present embodiment.
  • (a) is a photograph of a spheroid of a cell body having an axon bundle extracted outside the culture plate, and (b) is an axon (marker Tau 1 in the spheroid shown in (a)).
  • (C) is a fluorescence photograph of the cell nucleus in the spheroid shown in (b) (using the marker Hoechst),
  • (d) is in the axon bundle slice shown in (a)
  • (E) is a fluorescent photograph showing the absence of cell nuclei in the axon bundle slices.
  • motor neurons derived from human iPS cells (409B2 cell line) were used. Spheroids of cell bodies of motor neurons were seeded and cultured in the first chamber 12a. Motor neurons and cell body spheroids were obtained in the same manner as described above. Moreover, those culture
  • spheroids of cell bodies integrated with axon bundles can be taken out from each module 11 of the culture plate 10. Therefore, by slicing the axon bundle and observing the protein inside it, it is possible to analyze and identify the protein present in the axon bundle, and to perform screening and identification of neurological diseases, Furthermore, screening for drugs effective for neurological diseases can be performed.
  • the conventional method of culturing motor nerves it is not possible to obtain a cell tissue in which the assembly of cell bodies and axon bundles are integrated. It was difficult to observe the inside of each.
  • FIG. 12 is a photograph of the axon bundle used for extension in the present embodiment.
  • (a) is a photograph of a spheroid provided with an axon bundle before extension outside the culture plate
  • (b) is a photograph of a spheroid provided with an axon bundle after extension outside the culture plate.
  • motor neurons derived from human iPS cells (409B2 cell line) were used. Spheroids of cell bodies of motor neurons were seeded and cultured in the first chamber 12a. Motor neurons and cell body spheroids were obtained in the same manner as described above. Moreover, those culture
  • the axon bundle is extended to a length of 6.4 mm as shown in FIG. It was. It was confirmed that the axon bundle has extensibility as much as twice.
  • the axon bundle integrated with the spheroid of the cell body can be extracted from each module 11 of the culture plate 10, that is, taken out.
  • the axon bundle can then be mechanically extended, as confirmed in the previous experiment. Therefore, the axon bundle of motor nerve cells can be transplanted by culturing in advance a desired type of motor nerve cells integrated with the axon bundle. Since it was difficult to test and evaluate the physical characteristics of axon bundles in the body, this embodiment can obtain axon bundles on the millimeter scale and higher, such as extension of axon bundles. Various experiments can be performed.
  • FIG. 13 is a photograph of the motor nerve cell used for calcium imaging in the present embodiment.
  • (a) is a photograph of a spheroid provided with axon bundles before calcium addition outside the culture plate
  • (b) is a photograph of a spheroid provided with axon bundles after calcium addition outside the culture plate. .
  • motor neurons derived from human iPS cells (409B2 cell line) were used. Spheroids of cell bodies of motor neurons were seeded and cultured in the first chamber 12a. Motor neurons and cell body spheroids were obtained in the same manner as described above. Moreover, those culture
  • motor neurons including spheroids of cell bodies and axon bundles can be taken out from each module 11 of the culture plate 10. And, as confirmed in the previous experiment, motor neurons can be used for calcium imaging. Therefore, it was difficult to evaluate the electrophysiological activity on axon bundles in vitro, and given to the cell body by pre-culturing the desired type of motor nerve cells integrated with axon bundles It is possible to observe how the stimulus is transmitted through the axon, and it can be applied to the development of nerve prosthesis technology.
  • FIG. 14 is a schematic diagram showing various examples of the culture module in the present embodiment.
  • (a) to (g) are diagrams showing different types of arrangement of chambers and channels, respectively.
  • the arrangement of the chambers 12a and 12b and the channel 13 in the module 11 is not necessarily limited to the one including a pair of chambers 12a and 12b connected by the channel 13, as shown in FIGS. It is not something.
  • the module 11 includes two first chambers 12a, one second chamber 12b, each of which is seeded with a cell body spheroid, and each of the first chambers 12a. It includes two channels 13 that connect one and the second chamber 12b.
  • the module 11 includes one first chamber 12a in which cell body spheroids are seeded, two second chambers 12b, and each of the first chamber 12a and the second chamber 12b.
  • the module 11 includes two channels 13 that connect one of the chambers 12b.
  • the module 11 includes two first chambers 12a, one second chamber 12b, and two first chambers 12a, each of which is seeded with a spheroid of a cell body.
  • One channel 13 branched into two in the middle so as to be connected to the second chamber 12b is included.
  • the module 11 includes one first chamber 12a in which cell body spheroids are seeded, two second chambers 12b, a first chamber 12a, and two second chambers. It includes one channel 13 branched into two on the way so as to connect the chamber 12b.
  • FIG. 14 (c) the module 11 includes two first chambers 12a, one second chamber 12b, and two first chambers 12a, each of which is seeded with a spheroid of a cell body.
  • One channel 13 branched into two in the middle so as to be connected to the second chamber 12b is included.
  • the module 11 includes one first chamber 12a in which cell
  • the module 11 includes one first chamber 12a in which cell body spheroids are seeded, four second chambers 12b, and each of the first chamber 12a and the second chamber 12b. It includes four channels 13 that connect one of the chambers 12b.
  • the axon grows in the channel 13 and extends toward the second chamber 12b.
  • the skeletal muscle is seeded in the second chamber 12b, the distal end of the axon and the skeletal muscle are joined in the second chamber 12b.
  • the cell body spheroids can be applied to the central nerve model by seeding both the first chamber 12 a and the second chamber 12 b.
  • spheroids of cell bodies of lower motor neurons are seeded in the first chamber 12a, and spheroids of cell bodies of upper motor neurons are seeded in the second chamber 12b.
  • FIG. 15 is a diagram showing a process of separating the axon from the cell body in the present embodiment.
  • each of (a-1) to (a-5) is a photograph showing the upper side of the module
  • each of (b-1) to (b-5) is (a-1) to (a-5). It is a schematic cross-sectional view of the module corresponding to each.
  • the motor nerve cells including the cell body and the axon bundle can be extracted as a whole, but also the axon bundle is converted into the cell body in the module 11. They can be separated and extracted separately.
  • the cell body of motor neurons is seeded and cultured in the first chamber 12a of the module 11, whereby the axon bundle is Grows and extends through the channel 13 from the first chamber 12a to the second chamber 12b.
  • the axon bundle is separated from the cell body by the cutter 21 as shown in FIGS.
  • the cutter 21 can smoothly cut the axon bundle together with the upper plate 16.
  • the cell body is taken out from the first chamber 12a by picking up using the pipette 22, that is, picked up.
  • the remaining axon bundles are transferred to the channel 13 along with the flow of the culture medium 18 generated by spraying using the pipette 22.
  • the axon bundle is taken out from the second chamber 12b by picking up using the pipette 22, that is, picked up.
  • the axon bundle can be separated from the cell body in the module 11 and only the axon bundle can be extracted. Thereby, analysis of protein and RNA existing only in the axon bundle can be performed. Such analysis is an important process for analyzing neurological diseases.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing the cause of ALS
  • FIG. 17 is a photograph showing the result of the stress test in the present embodiment
  • FIG. 17A is a diagram showing the orientation evaluation result of the stress test in the present embodiment
  • FIG. 18 is a photograph showing the results of co-culture with glial cells in the present embodiment
  • FIG. 19 is a photograph of axon bundles extending from spheroids in the cell body with and without glial cells in the present embodiment.
  • . 17A is a photograph of an axon bundle when there is no stress
  • FIG. 17B is a photograph of an axon bundle when there is ER stress
  • FIG. 18A is a photograph of glial cells.
  • a photograph of a spheroid of a cell body at a certain time is a photograph of a spheroid of a cell body when there are no glial cells
  • (b) is a photograph of a spheroid of a cell body when there are no glial cells
  • FIG. 19 is a photograph of a spheroid of an axon bundle when there are glial cells.
  • (B) are photographs of spheroids of axon bundles when there are no glial cells.
  • ALS diseases include hyperglutamate (toxicityexof glutamate), hyperexcitability, glial toxicity (mitochondria dysfunction), axon transport disorder (disruption of axonal transport). ), Physical damage, oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, inclusion body formation, and the like. If even one of these causes can be reproduced artificially, it will lead to the discovery of a drug effective for ALS. In order to reproduce these causes, the inventor conducted several experiments using the culture plate 10 according to the present embodiment.
  • a first experiment was conducted to confirm the effect of ER stress on motor nerves using thapsigargin.
  • motor neurons derived from human iPS cells (409B2 cell line) were used.
  • Motor cell spheroids were seeded in the first chamber 12a and cultured.
  • Motor neurons and cell body spheroids were obtained in the same manner as described above.
  • the culture was performed in the same manner as described above. After culturing, motor neurons having sufficiently grown and extended axon bundles were treated with a culture solution containing 1.5 [mol] thapsigargin for 5 hours. Then, after 6 days, the evaluation of the morphology of the axon bundle as shown in FIG.
  • FIG. 17 (b) was performed, and the morphology of the axon bundle of the motor nerve cell that was not treated with thapsigargin as shown in FIG. 17 (a). Compared to and went. Moreover, as shown in FIG. 17A, the orientation of axons was evaluated. When stress is applied, the orientation becomes low, that is, the axon is denatured. It was confirmed that morphological changes were observed in motor nerves subjected to ER stress.
  • FIG. 18 (a) shows motor neurons mixed with glial cells
  • FIG. 18 (b) shows motor neurons without mixed glial cells.
  • GFAP is a marker for identifying glial cells
  • the glial cells were uniformly distributed in the spheroid of the cell body. Furthermore, after 10 days of culturing, even when the glial cells are mixed with the motor neurons as shown in FIG. 19 (a), the glial cells are added to the motor neurons as shown in FIG. 19 (b). Similar to the unmixed case, the axon bundle grew and extended into the channel 13 from the spheroid of the cell body.
  • the co-culture system with glial cells can be used for drug screening for reproduction of neurodegeneration due to glial toxicity and development of drugs effective for ALS. Application can be expected.
  • FIG. 20 is a diagram showing a result of observing axon bundles grown in the channels of the culture plate in the present embodiment
  • FIG. 20A is a nerve cell including axon bundles grown in the channels of the culture plate in the present embodiment.
  • FIG. 20B is another photograph showing a cross section of a nerve cell including an axon bundle grown in the channel of the culture plate in the present embodiment.
  • FIG. 20A is a diagram showing the results.
  • (a-1) and (a-2) are photographs showing cross sections of cell bodies stained with various markers, and (b-1) and (b-2), respectively.
  • FIG. 20 is a photograph showing cross sections of axon bundles corresponding to (a-1) and (a-2).
  • FIG. 20A is a diagram showing the results.
  • (a-1) and (a-2) are photographs showing cross sections of cell bodies stained with various markers, and (b-1) and (b-2), respectively.
  • FIG. 20 is a photograph showing cross sections of axon bundles corresponding to (a-1) and (a-2).
  • each of (a-1) to (a-3) is stained with various markers.
  • (B-1) to (b-3) are photographs showing the cross-sections of the cell bodies, respectively,
  • (a-1) to (a-3) Is a photograph showing a cross-section of the response to axon bundle.
  • motor neurons derived from human iPS cells (409B2 cell line) were used. Spheroids of cell bodies of motor neurons were seeded and cultured in the first chamber 12a. Motor neurons and cell body spheroids were obtained in the same manner as described above. Moreover, those culture
  • 20 (a-1) to (a-3) are cross sections of cell bodies stained with Hoechst and Tau 1, cross sections of cell bodies stained with Hoechst, Tau 1 and Synapsin 1, Hoechst, Map 2 and Synapsin, respectively.
  • 20 (b-1) to (b-3) are axons stained so as to correspond to FIGS. 20 (a-1) to (a-3), respectively. It is a cross section of a bundle.
  • 20A (a-1) and (a-2) are a cross section of a cell body stained with Tau 1 and a cross section of a cell body stained with Hoechst and Tau 1, respectively
  • FIG. 20A (b-1) And (b-2) are cross sections of axon bundles dyed so as to correspond to FIGS.
  • 20B (a-1) to (a-3) are a cross-section of a cell body stained with Hoechst, a cross-section of a cell body stained with Map 2, and a cross-section of a cell body stained with Synapsin 1, respectively.
  • 20B (b-1) to (b-3) are cross sections of axon bundles dyed so as to correspond to FIGS. 20B (a-1) to (a-3), respectively. Since the axons are bundled, the cross section of the axon can be easily observed by immunostaining.
  • FIG. 20C is a TEM image of the cross section of the axon bundle, that is, a photograph taken with a transmission electron microscope. Since the axons are bundled, the cross section of a plurality of axons can be easily observed with a transmission electron microscope. As a result, the state of mitochondria, synapses, and microtubules in the axon can be observed, and can be used for evaluating the effect of the drug.
  • FIG. 20 (d) shows spheroids of cell bodies stained with the markers Map ⁇ ⁇ ⁇ 2, Nucleoporin, Tau 1, Synapsin 1 and Synaptophysin by known Western blotting (Western blot ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ analysis). And the results of protein analysis of axon bundles. Note that [kDa] indicates a unit kilodalton. Since axons are bundled, it is possible to efficiently collect a sample of only axons, and to analyze specific proteins of axons.
  • Map ⁇ ⁇ ⁇ 2 the markers Map ⁇ ⁇ ⁇ 2
  • Nucleoporin Nucleoporin
  • Tau 1 Tau 1
  • Synaptophysin by known Western blotting (Western blot ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ analysis).
  • [kDa] indicates a unit kilodalton. Since axons are bundled, it is possible to efficiently collect a sample of only ax
  • FIGS. 20 (d) when the spheroid sample of the cell body and the sample of the axon bundle are compared, it can be seen that, in the sample of the axon bundle, Map ⁇ 2 and Nucleoporin, which are markers of the cell body, are negative. Therefore, it can be seen that the axonal bundle sample does not contain cell bodies, that is, the axonal bundle sample has high axon purity. This is shown in FIGS. 20 (b-1) to (b-3), FIGS. 20A (b-1) and (b-2), and FIGS. 20B (b-1) to (b-3).
  • FIG. 21 is a photograph showing a result of observing the surface of the axon bundle grown in the channel of the culture plate in this embodiment with a scanning electron microscope.
  • (a-1) and (a-2) are low and high magnification photographs when no stress is applied
  • (b-1) and (b-2) are respectively (a-1 )
  • (a-2) are photographs when stresses corresponding to the respective are applied.
  • the axon bundle is the same as that used in the observation shown in FIG. Since the axons are bundled, the surface of the axon bundle can be easily observed with a scanning electron microscope. Since the axons are bundled and extend in the same direction, for example, when stress is applied (the example shown in FIGS. 21 (b-1) and (b-2) is oxidative stress) The change is clear.
  • FIG. 22 is a photograph showing an axon bundle when stress is applied in the channel of the culture plate in the present embodiment
  • FIG. 23 is an axon bundle when stress is applied in the channel of the culture plate in the present embodiment. It is a graph which shows the experimental result of a form change.
  • (a) is a photograph when no stress is applied
  • (b) is a photograph when oxidative stress is applied
  • (c) is a photograph when oxidative stress and an antioxidant are applied.
  • spheroids of cell bodies were prepared by seeding motor neurons derived from human iPS cells (409B2 cell line) on non-adhesive culture plate 10. Subsequently, spheroids of cell bodies were cultured for 10 days, and then seeded in the first chamber 12a of the module 11 of the culture plate 10. Then, on the 30th day of the culture, the following conditions (1) to (3) were processed.
  • H 2 O 2 3hour treatment >>> PBS washing >>> culture medium
  • H 2 O 2 3hour treatment >>> PBS washing >>> culture medium containing Edaravone
  • the evaluation item is Directionality: axon directionality. Specifically, the directionality of the object in FIG. 22 was measured. In this case, 0 degree is the flow path (channel 13) direction. Since the axons are bundled and extend in the same direction, for example, when oxidative stress is applied in the channel 13 as shown in FIG. 22 (b) or shown in FIG. 22 (c). As described above, it is possible to compare morphological changes when oxidative stress and an antioxidant (Edaravone) used as a drug for neurological diseases are simultaneously applied. And, as a result of the evaluation experiment as shown in FIG.
  • FIG. 24 is a diagram showing myelination of axons in the module of the culture plate in the present embodiment.
  • (a) is a schematic diagram for explaining myelination of neurons in the module
  • (b) is a photograph of axons when there is no Schwann cell
  • (c) is an axon when there is Schwann cell. It is a photograph of.
  • the conventional method is complex because the cell body of nerve cells and the cell body of Schwann cells and oligoderonsite are mixed (each It was difficult to identify cell bodies.)
  • the culture plate 10 according to the present embodiment is used, as shown in FIG. 24 (a), the cell body of nerve cells in the channel 13 of the module 11 and in the second chamber 12b on the opposite side. It is easy to observe how axons and myelinating cells behave because of the absence of.
  • the IMS32 cell line was seeded and cultured in the first chamber 12a, and after the axons became bundles, Schwann cells, which are myelinating cells, were seeded. Compared with the example shown in FIG. 24 (b) where Schwann cells are not present, myelination can be easily observed in the example shown in FIG. 24 (c) where Schwann cells are present.
  • FIG. 25 is a schematic diagram showing the applicable fields of the apparatus in the present embodiment
  • FIG. 26 is a schematic diagram showing other applicable fields of the apparatus in the present embodiment.
  • (a) is a diagram showing application to drug screening
  • (b) is a diagram showing application to a phenotype device.
  • the culture plate 10 By using the culture plate 10 according to the present embodiment, as shown in FIG. 25 (a), screening for a nerve tissue having a thick axon bundle, that is, a co-culture system of nerve cells and other tissues. It can be performed. In addition, as shown in FIG. 25B, the phenotype can be comprehensively examined by using the tissue derived from the patient.
  • the culture plate 10 can be applied to the development of diagnostic agents by phenotypic analysis.
  • the nerve tissue having a thick axon bundle cultured using the culture plate 10 according to the present embodiment can be used for development and testing of a medical device such as a pacing system. . It can also be expected to be used for transplantation.
  • the present disclosure can be applied to an apparatus and a method suitable for culturing nerve cells.

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Abstract

in vitroで神経細胞から延びる軸索束を迅速に成長させるようにする。そのため、軸索を有する神経細胞を培養する装置であって、培養プレートと、該培養プレート内に配置された複数のモジュールであって、各モジュールは、神経細胞の細胞体を受容可能な第１チャンバーを少なくとも１つ、第２チャンバーを少なくとも１つ、及び、細胞体から延びた軸索束を受容可能なチャネルであって前記第１チャンバーと第２チャンバーとを接続するチャネルを少なくとも１つ含むモジュールと、を備え、前記第１チャンバー、第２チャンバー及びチャネルの下端が閉止され、前記第１チャンバー及び第２チャンバーの上端が開放されている。

Description

神経細胞を培養する装置、神経細胞を培養する方法、培養された神経細胞、軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法並びに神経細胞の使用方法
　本開示は、神経細胞を培養する装置、神経細胞を培養する方法、培養された神経細胞、軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法並びに神経細胞の使用方法に関するものである。
　神経疾患に効果のある薬剤を迅速に開発するためには、in vitro（体外）で神経細胞及び軸索を培養する必要がある。従来、神経細胞及び軸索を培養するための装置がいくつか提案されている（例えば、非特許文献１及び特許文献１参照。）。これらの装置は、複数の区画室を備えるマイクロ流体プラットホームであって、軸索を成長させて分離することができる。
Taylor, Anne M et al. "A Microfluidic Culture Platform for CNS Axonal Injury, Regeneration and Transport "  Nature methods 2.8 (2005):599-605. PMC. Web. 8 Mar. 2016.
米国特許出願公開第２００４／０１０６１９２号公報（Ａ１）
　しかしながら、前記従来の技術は、十分なものではなかった。ドラッグスクリーニング等において神経組織を評価するためには、細胞体、軸索、及び、細胞体と軸索との接合部をそれぞれ評価する必要があるが、前述の方法では、それぞれの部位を空間的に分け、評価することができない。
　本開示の利点の１つは、in vitroで神経細胞から延びる軸索束を迅速に成長させる神経細胞を培養する装置を提供することができることである。
　そのために、装置においては、軸索を有する神経細胞を培養する装置であって、培養プレートと、該培養プレート内に配置された複数のモジュールであって、各モジュールは、神経細胞の細胞体を受容可能な第１チャンバーを少なくとも１つ、第２チャンバーを少なくとも１つ、及び、細胞体から延びた軸索束を受容可能なチャネルであって前記第１チャンバーと第２チャンバーとを接続するチャネルを少なくとも１つ含むモジュールと、を備え、前記第１チャンバー、第２チャンバー及びチャネルの下端が閉止され、前記第１チャンバー及び第２チャンバーの上端が開放されている。
　他の装置においては、さらに、前記第１チャンバー、第２チャンバー及びチャネル内に培養液が入れられ、前記第２チャンバーの上端が少なくとも１つのシール部材によって閉止される。
　更に他の装置においては、さらに、前記第２チャンバーは骨格筋を受容可能であり、これにより、細胞体から延びた軸索束が骨格筋に接合する。
　更に他の装置においては、さらに、前記チャネルは、幅１００～１５０〔μｍ〕及び高さ１００～２００〔μｍ〕である。
　方法においては、軸索を有する神経細胞を培養する方法であって、第１チャンバーの少なくとも１つ、第２チャンバーの少なくとも１つ、及び、前記第１チャンバーと第２チャンバーとを接続するチャネルの少なくとも１つに培養液を供給するステップであって、前記第１チャンバー、第２チャンバー及びチャネルは培養プレート内に配置されたモジュールの少なくとも１つに含まれているステップと、前記第１チャンバー内に神経細胞を播種するステップと、前記神経細胞を培養し、これにより、軸索束が成長して各チャネル内を延びるステップと、を備える。
　他の方法においては、さらに、前記第２チャンバーの少なくとも１つに骨格筋が播種され、これにより、神経細胞から延びた軸索束が骨格筋に接合する。
　神経細胞においては、培養液内に播種することによって培養された複数の神経細胞であって、細胞体と、該細胞体から所定の方向に延びた少なくとも１つの軸索束とを備える。
　他の神経細胞においては、さらに、前記細胞体、軸索束及び軸索末端は、空間的に分離されている。
　更に他の神経細胞においては、さらに、前記神経細胞はスフェロイド状であり、前記軸索束は伸展可能である。
　更に他の神経細胞においては、さらに、前記軸索束は骨格筋に接合する。
　更に他の神経細胞においては、さらに、培養液内に播種することによって培養された複数の神経細胞であって、細胞体と、該細胞体から所定の方向に延びた少なくとも１つの軸索束とを備え、該軸索束は細胞体を含んでいない。
　方法においては、軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法であって、軸索束の少なくとも１つが成長して神経細胞の細胞体から伸展するように神経細胞を培養するステップと、ウェスタンブロッティングによって、前記軸索束内では、前記細胞体の存在を示すマーカーがネガティブであることを確認するステップと、を備える。
　他の方法においては、さらに、前記マーカーは、マップ２（Ｍａｐ２）及びヌクレオポリン（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｉｎ）である。
　更に他の方法においては、軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法であって、軸索束の少なくとも１つが成長して神経細胞の細胞体から伸展するように神経細胞を培養するステップと、前記軸索束をスライスするステップと、前記軸索束内に存在するプロテインを解析及び同定するステップと、を備える。
　更に他の方法においては、軸索束を含む神経細胞を使用する方法であって、軸索束の少なくとも１つが成長して神経細胞の細胞体から伸展するように神経細胞を培養するステップと、前記神経細胞に蛍光処理を施すステップと、電気生理学的活動を観察するために前記細胞体にＫＣｌを付与するステップと、を備える。
　本開示によれば、in vitroで神経細胞から延びる軸索束を迅速に成長させることができる。
本実施の形態における背景を示す模式図である。 本実施の形態における概念を示す図である。 本実施の形態における培養プレートを示す図である。 本実施の形態における培養プレート内の培養モジュールを示す図である。 本実施の形態におけるシールを備えた培養モジュールを示す図である。 本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索を示す写真である。 本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索を示す他の写真である。 本実施の形態における培養プレートから抽出した軸索を示す写真である。 本実施の形態における４０９Ｂ２細胞株由来の運動神経細胞の軸索と実験室マウスの骨格筋とを接合する実験を示す図である。 本実施の形態における４０９Ｂ２細胞株由来の運動神経細胞の軸索と実験室マウスの骨格筋とを接合する長期間の実験を示す図である。 本実施の形態における４０９Ｂ２細胞株由来の運動神経細胞の軸索とＣ２Ｃ１２細胞株由来の骨格筋とを接合する実験を示す図である。 本実施の形態におけるタンパク質の観察に使用した軸索束の写真である。 本実施の形態における伸展に使用した軸索束の写真である。 本実施の形態におけるカルシウムイメージングに使用した運動神経細胞の写真である。 本実施の形態における培養モジュールの種々の例を示す模式図である。 本実施の形態における軸索を細胞体から分離する工程を示す図である。 ＡＬＳの原因を示す模式図である。 本実施の形態におけるストレステストの結果を示す写真である。 本実施の形態におけるストレステストの軸索の配向性評価結果を示す図である。 本実施の形態におけるグリア細胞との共培養の結果を示す写真である。 本実施の形態におけるグリア細胞があるとき及びないときに細胞体のスフェロイドから延びた軸索束の写真である。 本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索束を観察した結果を示す図である。 本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索束を含む神経細胞の断面を示す写真である。 本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索束を含む神経細胞の断面を示す他の写真である。 本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索束の表面を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。 本実施の形態における培養プレートのチャネル内でストレスをかけたときの軸索束を示す写真である。 本実施の形態における培養プレートのチャネル内でストレスをかけたときの軸索束の形態変化の実験結果を示すグラフである。 本実施の形態における培養プレートのモジュールでの軸索のミエリン化を示す図である。 本実施の形態における装置の適用可能分野を示す模式図である。 本実施の形態における装置の他の適用可能分野を示す模式図である。
　以下、本実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。
　図１は本実施の形態における背景を示す模式図、図２は本実施の形態における概念を示す図である。なお、図２において、（ａ）は神経細胞の模式図、（ｂ）は従来の培養の結果を示す図、（ｃ）は本実施の形態の概念を示す図である。
　本実施の形態は、軸索を備える神経細胞を培養する新しいプロセス、培養に適した新しい装置及び培養された軸索束を備える神経細胞の密集体を提案する。神経疾患に有効な薬剤を迅速に探索するためには、体内と類似した環境で神経細胞を培養することが重要である。図２に示されるように、神経細胞（neuron）は、細胞体（cell body ）と軸索末端（axon）を有する軸索（axon terminal ）とを具備する。そして、図１に示されるように、体内において、運動神経（motoneuron）の軸索は束になり、軸索末端は複数の骨格筋（skeltal muscle）の細胞に接合している。したがって、in vitroの培養によって、図２（ｃ）に示されるように、細胞体、軸索及び軸索末端が互いに空間的に分離した状態で、束（bundle）になった軸索を有する細胞体の密集体、すなわち、細胞体のスフェロイド（spheroid）を生成することが望ましい。薬剤の効果を適確に確認するためには、薬剤を、評価対象である細胞体、軸索束、軸索末端等の各部位に付与し、各部位における薬剤の効果を評価することが必要である。しかしながら、従来の培養方法では、図２（ｂ）に示されるように、細胞体と軸索とが空間的に混ざったランダムな状態の軸索付きの細胞体しか提供することができなかった。
　次に、本実施の形態において使用される装置の構成について説明する。
　図３は本実施の形態における培養プレートを示す図、図４は本実施の形態における培養プレート内の培養モジュールを示す図、図５は本実施の形態におけるシールを備えた培養モジュールを示す図である。なお、図３において、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）における培養モジュールの拡大側断面図であり、図４において、（ａ）は培養プレートの写真、（ｂ）は培養モジュールの模式側断面図、（ｃ）～（ｅ）の各々は培養モジュールの模式平面図であり、図５において、（ａ）はシールを備えた培養モジュールの模式側断面図、（ｂ）はシールを備えた培養モジュールの写真、（ｃ）はシール及び細胞を備えた培養モジュールの模式側断面図、（ｄ）はシール及び細胞体のスフェロイドを備えた培養モジュールの模式側断面図、（ｅ）はシールを備えない培養モジュールの模式側断面図である。
　本実施の形態においては、培養プレート１０を使用する。図３（ａ）及び４（ａ）に示されるように、培養プレート１０は、矩形形状の板状部材であり、行方向及び列方向に並んで配置された複数のモジュール１１を含んでいる。そして、培養プレート１０は、透明なガラス板であるカバースリップから成る基板１５と、該基板１５の表面に取り付けられた上板１６とを含んでいる。該上板１６には複数のモジュール１１が形成されている。図３及び４に示されるように、各モジュール１１は、平面視においてダンベルのような形状を有し、全体として、Ｕ字のような形状の断面形状を有し、第１チャンバー１２ａと、第２チャンバー１２ｂと、第１及び第２チャンバー１２ａ、１２ｂの底部を連結するチャネル１３とを含んでいる。
　上板１６は、ＰＤＭＳ (poly-dimethyl-siloxane) シートであってもよく、公知のフォトリソグラフィー技術を使用して作成することができる（例えば、非特許文献１及び特許文献１参照。）。なお、上板１６は、例えば、Ｐｙｒｅｘ（登録商標）等の他のポリマー又はガラスから成る板状部材であってもよく、例えば、ホットエンボス加工、穴開け加工等の方法を使用して作成されたものであってもよい。
　第１及び第２チャンバー１２ａ、１２ｂの各々は、円筒状の凹部であって、底面が基板１５によって閉止され、上面が開口する井戸状の窪みとして作成されている。チャネル１３の一端は第１チャンバー１２ａの側壁の下端に開口し、その他端は第２チャンバー１２ｂの側壁の下端に開口する。チャネル１３の幅は、好適には１００～１５０〔μｍ〕であり、その高さは、好適には１００～２００〔μｍ〕であるが、これらの寸法は係る数値に限定されるものでなく、必要に応じて調整することができる。そして、第１及び第２チャンバー１２ａ、１２ｂ並びにチャネル１３の内部には、培養液１８が充填される。モジュール１１の構成が簡素なので、培養液１８はモジュール１１内にスムーズに流入可能である。また、チャネル１３のサイズが、従来の装置におけるもの（例えば、非特許文献１及び特許文献１参照。）と比較して大きいので、第１及び第２チャンバー１２ａ、１２ｂ内の培養液１８は自然に混ざることができる。第１及び第２チャンバー１２ａ、１２ｂの各々の平面形状は、図４（ｅ）に示されるように、円形であることが望ましいが、円形に限定されるものでなく、必要に応じて変化させることができる。図３（ａ）、４（ｃ）及び４（ｄ）に示される例では、チャネル１３の入口部１３ａがテーパーの付いた平面形状となっているので、第１チャンバー１２ａの平面形状は完全な円形でなく変形しているが、一方、第２チャンバー１２ｂの平面形状は、チャネル１３の入口部１３ａが直線的形状なので、ほぼ完全な円形になっている。入口部１３ａがテーパーの付いた平面形状となっていると、軸索はチャネル１３内に効果的に導かれる。入口部１３ａが直線的形状であっても、軸索はチャネル１３内で束を形成することができる。
　第１及び第２チャンバー１２ａ、１２ｂのうちの一方の内部には、神経細胞の細胞体が入れられる、すなわち、播種される。細胞体が播種されるチャンバーとしては、第１及び第２チャンバー１２ａ、１２ｂのうちのいずれをも選択することもできるが、本実施の形態においては、便宜上、第１チャンバー１２ａを細胞体が播種されるチャンバーとする。図４（ｃ）に示される例においては、複数の神経細胞体が、別々で、すなわち、解離（disociated）細胞状態で、播種されている。また、図４（ｄ）及び（ｅ）に示される例においては、複数の神経細胞体が、密集して、すなわち、スフェロイドの状態で、播種されている。そして、しばらく培養した後には、神経細胞の軸索がチャネル１３内を第２チャンバー１２ｂにまで伸びて、チャネル１３内で束を形成する。チャネル１３の内径は、神経細胞の軸索束を収容するのに十分な大きさであることが望ましい。
　図５（ａ）及び（ｂ）に示されるように、中に神経細胞体が播種されていない第２チャンバー１２ｂの開放端を閉止するために、第２チャンバー１２ｂの上にシール部材１７を載置することが望ましい。該シール部材１７は、好適にはＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction ）のシーリング板又はシーリングフィルムから成るものであるが、必ずしもこれに限定されるものでなく、シーリングに適した材料であれば、いかなる材料から成るものであってもよい。図５（ｃ）及び（ｄ）に示されるように、第２チャンバー１２ｂの開放端がシール部材１７によって閉止されていると、培養液が第２チャンバー１２ｂに流れ込むことが防止されるので、神経細胞体を第１チャンバー１２ａ内に播種して保っておくことが容易になる。図５（ｅ）に示されるように、第２チャンバー１２ｂの開放端が開放されたままであると、第１チャンバー１２ａ内に入れられた神経細胞体は、培養液とともに、第２チャンバー１２ｂ内に流入しがちである。神経細胞体をスフェロイドの状態で第１チャンバー１２ａ内に播種するのであれば、細胞体のスフェロイドは大き過ぎてチャネル１３内を流れないので、シール部材１７を省略することができる。
　次に、本実施の形態による培養プレート１０を使用して発明者が行った軸索を成長させる実験の結果を説明する。
　図６は本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索を示す写真、図６Ａは本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索を示す他の写真、図７は本実施の形態における培養プレートから抽出した軸索を示す写真である。なお、図６において、（ａ）は培養プレートの一部の写真、（ｂ）は（ａ）に示されるモジュールのうちの１つの軸索の写真であり、図６Ａにおいて、（ａ）は軸索の長さが４．５〔ｍｍ〕の例を示す写真、（ｂ）は軸索の長さが９〔ｍｍ〕の例を示す写真であり、図７において、（ａ）は神経組織の拡大写真、（ｂ）は細胞核の蛍光写真（マーカーHoechst を使用）、（ｃ）は神経全体の蛍光写真（マーカーTuj 1 を使用）である。
　本実験においては、ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を使用した。運動神経細胞の細胞体のスフェロイドを、第１チャンバー１２ａ内に播種して培養した。ウェルプレートすなわち皿を使用して、ヒトｉＰＳ細胞から運動神経細胞を取得した。そして、非接着性の培養プレートを使用して細胞体のスフェロイドを得た。なお、培養は、３７〔℃〕、Ｏ2 ：２０〔％〕、ＣＯ2 ：５〔％〕の環境下で行われた。すると、図６に示されるように、チャネル１３内で軸索が成長して第２チャンバー１２ｂにまで伸びた。培養後、運動神経細胞の集合体を、培養プレート１０のモジュール１１から抽出した、すなわち、取り出した。モジュール１１から抽出した運動神経細胞の集合体は、図７（ａ）に示されるように、細胞体の集合体から延在する大きな軸索束を備える。図７（ｂ）に示されるように、細胞体内に存在し、マーカーであるHoechst によって染色された細胞核が、運動神経細胞の集合体内に観られた。また、図７（ｃ）に示されるように、マーカーであるTuj 1 によって染色された運動神経細胞の集合体が、観られた。軸索束は、細胞体の集合体から延在していることが、明瞭に認識された。なお、チャネル１３の長さや内径を変更することによって、種々の大きさの軸索束を得ることができる。例えば、図６Ａ（ａ）に示される例においては軸索の長さが４．５〔ｍｍ〕であり、図６Ａ（ｂ）に示される例においては軸索の長さが９〔ｍｍ〕である。観察や実験に使用するためには、軸索の長さは、１〔ｍｍ〕以上であることが望ましい。また、軸索束の幅は、例えば、１００〔μｍ〕にすることができる。この場合、後述する図２０（ｃ）に示されるような軸索束の断面のＴＥＭ画像で観察すると、約５５００本の軸索が含まれていることが分かる。
　前述のように、本実施の形態によれば、培養プレート１０の各モジュール１１内での培養によって軸索束を得ることができる。したがって、各モジュール１１内の軸索束に薬剤を付与することによって、薬剤のスクリーニングを迅速に行うことができる。さらに、各モジュール１１内において軸索束が細胞体から分離されているので、各モジュール１１内の軸索束に薬剤を正確に付与することによって、神経疾患に有効な薬剤をスクリーニングすることができ、また、軸索束のどの部分に、例えば、遠位端や近位端に、薬剤が効くのかを確認することができる。
　次に、本実施の形態による培養プレート１０を使用して発明者が行った軸索と骨格筋とを接合する実験の結果を説明する。
　図８は本実施の形態における４０９Ｂ２細胞株由来の運動神経細胞の軸索と実験室マウスの骨格筋とを接合する実験を示す図、図９は本実施の形態における４０９Ｂ２細胞株由来の運動神経細胞の軸索と実験室マウスの骨格筋とを接合する長期間の実験を示す図、図１０は本実施の形態における４０９Ｂ２細胞株由来の運動神経細胞の軸索とＣ２Ｃ１２細胞株由来の骨格筋とを接合する実験を示す図である。なお、図８及び９において、（ａ）は実験室マウスの筋管の写真、（ｂ）はモジュールの模式平面図、（ｃ）は筋管がない場合の軸索の拡大写真、（ｄ）は筋管がある場合の軸索の拡大写真であり、図１０において、（ａ）はモジュールの模式平面図、（ｂ）は接合部分の拡大写真である。
　第１の実験においては、神経細胞としてヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を使用し、骨格筋として（図８（ａ）に示される）実験室マウスの筋管を使用した。運動神経細胞及び細胞体のスフェロイドは、前述の方法と同様の方法で得た。また、それらの培養も前述の方法と同様の方法で行った。図８（ｂ）に示されるように、神経細胞を第１チャンバー１２ａ内に播種し、骨格筋を第２チャンバー１２ｂ内に播種して、神経細胞及び骨格筋の共培養を行った。骨格筋を第２チャンバー１２ｂ内に播種した場合、そうでない場合よりも、軸索の成長速度が高く、軸索束が成長して厚くなるのが早いことが分かった。図８（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、筋管が第２チャンバー１２ｂ内に播種されない場合、及び、筋管が第２チャンバー１２ｂ内に播種された場合の、培養２８日後におけるチャネル１３内の軸索の成長状態を示している。第２の実験においては、第１の実験（２８日）よりも長期間（４３日）に亘って、しかし、図９（ａ）及び（ｂ）に示されるように、第１の実験と同様のモジュール１１並びに同様の運動神経細胞及び筋管を同様に使用し、共培養を行った。筋管が第２チャンバー１２ｂ内に播種されない場合には、軸索束の形態が変性することが分かった。図９（ｃ）及び（ｄ）は、それぞれ、筋管が第２チャンバー１２ｂ内に播種されない場合、及び、筋管が第２チャンバー１２ｂ内に播種された場合の、培養４３日後におけるチャネル１３内の軸索の成長状態を示している。
　第３の実験においては、神経細胞としてヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を使用し、骨格筋としてマウス筋原細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞株）由来の横紋筋を使用した。図１０（ａ）に示されるように、神経細胞を第１チャンバー１２ａ内に播種し、骨格筋を第２チャンバー１２ｂ内に播種して、神経細胞及び骨格筋の共培養を行った。そして、軸索と骨格筋とが接合した部分をα-Bungarotoxin によって染色し、軸索をTuj 1 によって染色した。図１０（ｂ）に示されるように、軸索と骨格筋との接合が観られた。
　前述のように、本実施の形態によれば、軸索末端を、細胞体が存在する第１チャンバー１２ａから離れた第２チャンバー１２ｂ内において、骨格筋に接合することができる。換言すると、本実施の形態は、体内と類似した状況を提供することができる。したがって、各モジュール１１内の軸索束と骨格筋との接合部分に薬剤を正確に付与することによって、神経疾患に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。
　次に、本実施の形態による培養プレート１０を使用して発明者が行った軸索を成長させ、成長させた軸索をスライスして内部のタンパク質（プロテイン）を観察する実験の結果を説明する。
　図１１は本実施の形態におけるタンパク質の観察に使用した軸索束の写真である。なお、図において、（ａ）は培養プレートの外に抽出された軸索束を備える細胞体のスフェロイドの写真、（ｂ）は（ａ）に示されるスフェロイド内での軸索（マーカーTau 1 を使用）の存在を示す写真、（ｃ）は（ｂ）に示されるスフェロイド内での細胞核の蛍光写真（マーカーHoechst を使用）、（ｄ）は（ａ）に示される軸索束の薄片内での軸索の存在を示す写真、（ｅ）は軸索束の薄片内での細胞核の不存在を示す蛍光写真である。
　本実験においては、ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を使用した。運動神経細胞の細胞体のスフェロイドを、第１チャンバー１２ａ内に播種して培養した。運動神経細胞及び細胞体のスフェロイドは、前述の方法と同様の方法で得た。また、それらの培養も前述の方法と同様の方法で行った。図１１（ａ）に示されるように、１０日間の培養後、大きく成長して長く延びた軸索束を含む運動神経細胞の１つを培養プレート１０のモジュール１１から抽出した、すなわち、取り出した。そして、軸索束をスライスし、内部に存在するタンパク質の観察に適するような軸索束の薄片を得た。図１１（ｄ）に示されるように、軸索束の内部にタンパク質が観察されることを確認した。また、図１１（ｅ）に示されるように、軸索束の内部には細胞核が存在しないことを確認し、軸索束は軸索の純粋な集合であることを確認した。
　前述のように、本実施の形態によれば、培養プレート１０の各モジュール１１から、軸索束と一体となった細胞体のスフェロイドを取り出すことができる。したがって、軸索束をスライスしてその内部のタンパク質を観察することによって、軸索束に存在するタンパク質の解析及び同定を行うことができ、また、神経疾患のスクリーニング及び同定を行うことができ、さらに、神経疾患に有効な薬剤のスクリーニングを行うことができる。これに対して、従来の運動神経を培養する方法では、細胞体の集合及び軸索束が統合された細胞組織を得ることができず、従来の培養装置の外で細胞体及び軸索束のそれぞれの内部を観察することが困難であった。
　次に、本実施の形態による培養プレート１０を使用して発明者が行った成長させた軸索を伸展させる実験の結果を説明する。
　図１２は本実施の形態における伸展に使用した軸索束の写真である。なお、図において、（ａ）は培養プレートの外における伸展前の軸索束を備えるスフェロイドの写真、（ｂ）は培養プレートの外における伸展後の軸索束を備えるスフェロイドの写真である。
　本実験においては、ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を使用した。運動神経細胞の細胞体のスフェロイドを、第１チャンバー１２ａ内に播種して培養した。運動神経細胞及び細胞体のスフェロイドは、前述の方法と同様の方法で得た。また、それらの培養も前述の方法と同様の方法で行った。図１２（ａ）に示されるように、培養後、細胞体のスフェロイド及び大きく成長して長く延びた軸索束を含む運動神経細胞の１つを培養プレート１０のモジュール１１の外へ取り出した。その全長は３．１〔ｍｍ〕であった。そして、軸索束の近位端及び遠位端をピンセットでつまんで引っ張ると、図１２（ｂ）に示されるように、軸索束は伸展して６．４〔ｍｍ〕の長さになった。軸索束は、２倍になるほどの伸展性を有することが確認された。
　前述のように、本実施の形態によれば、細胞体のスフェロイドと一体となった軸索束は、培養プレート１０の各モジュール１１から抽出する、すなわち、取り出すことができる。そして、前述の実験で確認されたように、軸索束を機械的に伸展させることができる。したがって、軸索束と一体となった所望の種類の運動神経細胞を事前に培養することによって、運動神経細胞の軸索束の移植を行うことができる。体内の軸索束の物理的特性を試験し、評価することが困難であったところ、本実施の形態によってミリメータスケール以上の軸索束を得ることができるので、軸索束の伸展のような様々の実験を行うことができる。
　次に、本実施の形態による培養プレート１０を使用して発明者が行った成長させた軸索のカルシウムイメージング実験の結果を説明する。
　図１３は本実施の形態におけるカルシウムイメージングに使用した運動神経細胞の写真である。なお、図において、（ａ）は培養プレートの外におけるカルシウム付与前の軸索束を備えるスフェロイドの写真、（ｂ）は培養プレートの外におけるカルシウム付与後の軸索束を備えるスフェロイドの写真である。
　本実験においては、ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を使用した。運動神経細胞の細胞体のスフェロイドを、第１チャンバー１２ａ内に播種して培養した。運動神経細胞及び細胞体のスフェロイドは、前述の方法と同様の方法で得た。また、それらの培養も前述の方法と同様の方法で行った。培養後、大きく成長して長く延びた軸索束を含む運動神経細胞の１つを培養プレート１０のモジュール１１から抽出した、すなわち、取り出した。そして、図１３（ａ）に示されるように、細胞体のスフェロイド及び軸索束を含む運動神経細胞に蛍光処理を施した。続いて、細胞体のスフェロイドに１〔ｍｏｌ〕のＫＣｌを付与すると、図１３（ｂ）に示されるように、ＫＣｌの刺激によって誘発された電気生理学的活動の結果により、蛍光が強くなった。ＫＣｌを付与することによって、細胞体のスフェロイド及び軸索束を含む運動神経細胞が電気生理学的に活発になることが確認された。
　前述のように、本実施の形態によれば、細胞体のスフェロイド及び軸索束を含む運動神経細胞は培養プレート１０の各モジュール１１から取り出すことができる。そして、前述の実験で確認されたように、運動神経細胞をカルシウムイメージングに使用することができる。したがって、軸索束に対する電気生理学的活動の体外における評価が困難であったところ、軸索束と一体となった所望の種類の運動神経細胞を事前に培養することによって、細胞体に与えられた刺激が軸索を通ってどのように伝わるのかを観察することができ、神経補綴技術の開発に応用することができる。
　次に、本実施の形態におけるモジュール１１のチャンバー１２ａ、１２ｂ及びチャネル１３の配置の種々の例について説明する。
　図１４は本実施の形態における培養モジュールの種々の例を示す模式図である。なお、図において、（ａ）～（ｇ）は、各々、チャンバー及びチャネルの配置の異なるタイプを示す図である。
　本実施の形態において、モジュール１１におけるチャンバー１２ａ、１２ｂ及びチャネル１３の配置は、必ずしも、図３及び４に示されるように、チャネル１３によって連結された一対のチャンバー１２ａ、１２ｂを含むものに限定されるものではない。図１４（ａ）に示される例によれば、モジュール１１は、各々に細胞体のスフェロイドが播種される２つの第１チャンバー１２ａと、１つの第２チャンバー１２ｂと、各々が第１チャンバー１２ａの１つと第２チャンバー１２ｂとを接続する２つのチャネル１３とを含んでいる。図１４（ｂ）に示される例によれば、モジュール１１は、細胞体のスフェロイドが播種される１つの第１チャンバー１２ａと、２つの第２チャンバー１２ｂと、各々が第１チャンバー１２ａと第２チャンバー１２ｂの１つとを接続する２つのチャネル１３とを含んでいる。図１４（ｃ）に示される例によれば、モジュール１１は、各々に細胞体のスフェロイドが播種される２つの第１チャンバー１２ａと、１つの第２チャンバー１２ｂと、２つの第１チャンバー１２ａと第２チャンバー１２ｂとを接続するように途中で２つに分岐した１つのチャネル１３とを含んでいる。図１４（ｄ）に示される例によれば、モジュール１１は、細胞体のスフェロイドが播種される１つの第１チャンバー１２ａと、２つの第２チャンバー１２ｂと、第１チャンバー１２ａと２つの第２チャンバー１２ｂとを接続するように途中で２つに分岐した１つのチャネル１３とを含んでいる。図１４（ｅ）に示される例によれば、モジュール１１は、細胞体のスフェロイドが播種される１つの第１チャンバー１２ａと、４つの第２チャンバー１２ｂと、各々が第１チャンバー１２ａと第２チャンバー１２ｂの１つとを接続する４つのチャネル１３とを含んでいる。
　前述のように、本実施の形態によれば、神経細胞が第１チャンバー１２ａ内に播種されて培養されると、軸索はチャネル１３内で成長して第２チャンバー１２ｂに向けて延び、さらに、骨格筋が第２チャンバー１２ｂ内に播種されると、軸索の遠位端と骨格筋とが第２チャンバー１２ｂ内で接合する。さらに、図１４（ｆ）に示されるように、細胞体のスフェロイドを第１チャンバー１２ａ及び第２チャンバー１２ｂの両方の内部に播種することによって、中枢神経モデルに応用することができる。また、図１４（ｇ）に示されるように、下位運動神経細胞の細胞体のスフェロイドを第１チャンバー１２ａ内に播種し、上位運動神経細胞の細胞体のスフェロイドを第２チャンバー１２ｂ内に播種し、骨格筋を他の第２チャンバー１２ｂ内に播種することによって、下位運動神経、上位運動神経及び骨格筋を含む系に応用することができる。したがって、種々の培養モジュール１１を用意すれば、神経細胞、軸索及び骨格筋の間の種々の形態の接合関係をin vitroで得ることができ、神経疾患に有効な薬剤の種々の実験や研究に使用することができる。
　次に、本実施の形態における培養プレート１０のモジュール１１内で軸索を細胞体から分離して軸索と細胞体とを別々に抽出する方法について説明する。
　図１５は本実施の形態における軸索を細胞体から分離する工程を示す図である。なお、図において、（ａ－１）～（ａ－５）の各々はモジュールの上側を示す写真、（ｂ－１）～（ｂ－５）の各々は（ａ－１）～（ａ－５）にそれぞれ対応するモジュールの模式断面図である。
　本実施の形態によれば、図１１～１３に示されるように、細胞体及び軸索束を含む運動神経細胞を全体として抽出することができるだけでなく、モジュール１１内で軸索束を細胞体から分離してそれらを別々に抽出することができる。まず、図１５（ａ－１）及び（ｂ－１）に示されるように、運動神経細胞の細胞体がモジュール１１の第１チャンバー１２ａ内に播種されて培養され、それにより、軸索束が成長し、チャネル１３を通って第１チャンバー１２ａから第２チャンバー１２ｂにまで延びる。続いて、図１５（ａ－２）及び（ｂ－２）に示されるように、カッター２１によって軸索束が細胞体から分離される。この場合、少なくとも上板１６が好適にはＰＤＭＳのような軟らかい材料から成るので、カッター２１は、上板１６とともに軸索束をスムーズに切断することができる。続いて、図１５（ａ－３）及び（ｂ－３）に示されるように、ピペット２２を使用して吸い出すことによって、第１チャンバー１２ａから細胞体が取り出される、すなわち、つまみ上げられる。続いて、図１５（ａ－４）及び（ｂ－４）に示されるように、ピペット２２を使用して吹き付けることによって発生した培養液１８の流れとともに、残留していた軸索束がチャネル１３から第２チャンバー１２ｂ内に追い出される。最後に、図１５（ａ－５）及び（ｂ－５）に示されるように、ピペット２２を使用して吸い出すことによって、第２チャンバー１２ｂから軸索束が取り出される、すなわち、つまみ上げられる。
　前述のように、本実施の形態によれば、モジュール１１内で軸索束を細胞体から分離して軸索束だけを抽出することができる。これにより、軸索束内だけに存在するタンパク質やＲＮＡの解析を行うことができる。このような解析は、神経疾患を分析するための重要なプロセスである。
　次に、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に有効な薬剤の開発のための本実施の形態における装置の有用性について説明する。
　図１６はＡＬＳの原因を示す模式図、図１７は本実施の形態におけるストレステストの結果を示す写真、図１７Ａは本実施の形態におけるストレステストの軸索の配向性評価結果を示す図、図１８は本実施の形態におけるグリア細胞との共培養の結果を示す写真、図１９は本実施の形態におけるグリア細胞があるとき及びないときに細胞体のスフェロイドから延びた軸索束の写真である。なお、図１７において、（ａ）はストレスがないときの軸索束の写真、（ｂ）はＥＲストレスがあるときの軸索束の写真であり、図１８において、（ａ）はグリア細胞があるときの細胞体のスフェロイドの写真、（ｂ）はグリア細胞がないときの細胞体のスフェロイドの写真であり、図１９において、（ａ）はグリア細胞があるときの軸索束のスフェロイドの写真、（ｂ）はグリア細胞がないときの軸索束のスフェロイドの写真である。
　図１６に示されるように、ＡＬＳの疾患は、グルタミン酸過剰（toxicity of glutamate ）、過興奮（hyperexcitability ）、グリア毒性（glial toxicity）、ミトコンドリア障害（mitochondria dysfunction）、軸索輸送障害（disruption of axonal transport）、物理的ダメージ（physical damage ）、酸化ストレス（oxidative stress）、小胞体（ＥＲ：endoplasmic reticulum ）ストレス、封入体形成（inclusion bodies）などが原因であると考えられている。これらの原因の１つでも人工的に再現することができれば、ＡＬＳに有効な薬剤の発見につながると考えられる。これらの原因を再現するために、本実施の形態による培養プレート１０を使用して、発明者はいくつかの実験を行った。
　タプシガルジン（thapsigargin）を使用して、運動神経に対するＥＲストレスの効果を確認するために、第１の実験を行った。第１の実験においては、ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を使用した。運動神経細胞の細胞体のスフェロイドを第１チャンバー１２ａ内に播種して培養した。運動神経細胞及び細胞体のスフェロイドは、前述の方法と同様の方法で得た。また、培養も前述の方法と同様の方法で行った。培養後、十分に成長して延びた軸索束を備える運動神経細胞を、１．５〔ｍｏｌ〕のタプシガルジンを含む培養液で５時間処理した。そして、６日後に、図１７（ｂ）に示されるような軸索束の形態の評価を、図１７（ａ）に示されるようなタプシガルジンで処理されなかった運動神経細胞の軸索束の形態と比較して、行った。また、図１７Ａに示されるように、軸索の配向性の評価を行った。ストレスをかけると、配向性が低くなる、すなわち、軸索が変性している、と言える。ＥＲストレスを受けた運動神経では形態が変化することを確認した。
　特定の遺伝子の変異に起因するグリア細胞のＡＬＳに関する毒性が議論されているので、本実施の形態による培養プレート１０を使用して運動神経細胞をグリア細胞と共培養することができることを確認するために、第２の実験を行った。第２の実験においては、ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を使用した。第１チャンバー１２ａ内で培養することによって得た運動神経細胞の細胞体のスフェロイドを、グリア細胞を混ぜた後、培養した。続いて、運動神経細胞をマーカーであるHoechst 、Tuj 1 及びＧＦＡＰ（Glia Fibrillary Acidic Protein）によって染色した。図１８（ａ）はグリア細胞を混ぜた運動神経細胞を示し、図１８（ｂ）はグリア細胞を混ぜなかった運動神経細胞を示している。ＧＦＡＰはグリア細胞を識別するためのマーカーなので、グリア細胞が細胞体のスフェロイド内に一様に分布していることを確認した。さらに、１０日間の培養後、図１９（ａ）に示されるような運動神経細胞にグリア細胞を混ぜた場合であっても、図１９（ｂ）に示されるような運動神経細胞にグリア細胞を混ぜなかった場合と同様に、軸索束は、成長して細胞体のスフェロイドからチャネル１３内に延びた。このように、グリア細胞との共培養系を得ることができることを確認したので、グリア細胞との共培養系をグリア毒性による神経変性の再現及びＡＬＳに有効な薬剤開発のための薬剤スクリーニングへの応用を期待することができる。
　次に、本実施の形態による培養プレート１０を使用して成長させた軸索束を細胞体と比較して観察した結果について説明する。
　図２０は本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索束を観察した結果を示す図、図２０Ａは本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索束を含む神経細胞の断面を示す写真、図２０Ｂは本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索束を含む神経細胞の断面を示す他の写真である。なお、図２０において、（ａ－１）～（ａ－３）は各種のマーカーによって染色した細胞体の断面を示す写真、（ｂ－１）～（ｂ－３）の各々は（ａ－１）～（ａ－３）にそれぞれ対応する軸索束の断面を示す写真、（ｃ）は軸索束の断面の透過型電子顕微鏡写真、（ｄ）は細胞体及び軸索束のタンパク質解析の結果を示す図であり、図２０Ａにおいて、（ａ－１）及び（ａ－２）は各種のマーカーによって染色した細胞体の断面を示す写真、（ｂ－１）及び（ｂ－２）の各々は（ａ－１）及び（ａ－２）にそれぞれ対応する軸索束の断面を示す写真であり、図２０Ｂにおいて、（ａ－１）～（ａ－３）の各々は各種のマーカーによって染色した細胞体の断面を示す写真、（ｂ－１）～（ｂ－３）の各々は（ａ－１）～（ａ－３）にそれぞれ対応する軸索束の断面を示す写真である。
　ここでは、ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を使用した。運動神経細胞の細胞体のスフェロイドを、第１チャンバー１２ａ内に播種して培養した。運動神経細胞及び細胞体のスフェロイドは、前述の方法と同様の方法で得た。また、それらの培養も前述の方法と同様の方法で行った。培養後、大きく成長して長く延びた軸索束を含む運動神経細胞の１つを培養プレート１０のモジュール１１から抽出した、すなわち、取り出した。そして、細胞体のスフェロイド及び軸索束をマーカーであるHoechst 、Tau 1 、Synapsin 1及びMap 2 によって染色した。図２０（ａ－１）～（ａ－３）は、それぞれ、Hoechst 及びTau 1 によって染色した細胞体の断面、Hoechst 、Tau 1 及びSynapsin 1によって染色した細胞体の断面、Hoechst 、Map 2 及びSynapsin 1によって染色した細胞体の断面であり、図２０（ｂ－１）～（ｂ－３）は、それぞれ、図２０（ａ－１）～（ａ－３）に対応するように染色した軸索束の断面である。また、図２０Ａ（ａ－１）及び（ａ－２）は、それぞれ、Tau 1 によって染色した細胞体の断面とHoechst 及びTau 1 によって染色した細胞体の断面であり、図２０Ａ（ｂ－１）及び（ｂ－２）は、それぞれ、図２０Ａ（ａ－１）及び（ａ－２）に対応するように染色した軸索束の断面である。さらに、図２０Ｂ（ａ－１）～（ａ－３）は、それぞれ、Hoechst によって染色した細胞体の断面、Map 2 によって染色した細胞体の断面、Synapsin 1によって染色した細胞体の断面であり、図２０Ｂ（ｂ－１）～（ｂ－３）は、それぞれ、図２０Ｂ（ａ－１）～（ａ－３）に対応するように染色した軸索束の断面である。軸索が束になっているので、軸索の断面を容易に免疫染色で観察することができる。
　また、図２０（ｃ）は、軸索束の断面のＴＥＭ画像、すなわち、透過型電子顕微鏡によって撮像した写真である。軸索が束になっているので、複数の軸索の断面を容易に透過型電子顕微鏡で観察することができる。これにより、軸索内のミトコンドリア、シナプス、微小管の状態を観察することができ、薬剤の効果の評価に利用することができる。
　さらに、図２０（ｄ）は、公知のウェスタンブロッティング（Western blotting）すなわちウェスタンブロット方法（Western blot analysis ）により、マーカーであるMap 2 、Nucleoporin 、Tau 1 、Synapsin 1　及びSynaptophysin によって染色した細胞体のスフェロイド及び軸索束のタンパク質解析の結果を示している。なお、〔ｋＤａ〕は、単位キロドルトンを示している。軸索が束になっているので、効率的に軸索だけのサンプルを回収することができ、軸索の特異的なタンパク質の解析を行うことができる。図２０（ｄ）において、細胞体のスフェロイドのサンプルと軸索束のサンプルとを比較すると、軸索束のサンプルでは、細胞体のマーカーであるMap 2 及びNucleoporin がネガティブであることが分かる。したがって、軸索束のサンプルには細胞体が含まれていないこと、すなわち、軸索束のサンプルは軸索の純度が高いことが分かる。なお、このことは、図２０（ｂ－１）～（ｂ－３）、図２０Ａ（ｂ－１）及び（ｂ－２）並びに図２０Ｂ（ｂ－１）～（ｂ－３）に示される免疫染色において、軸索束のサンプルでは、細胞体のマーカーであるMap 2 及び核染色のHoechst がネガティブであることからも、分かる。なお、Synapsin 1は、神経全体に存在しているので、軸索束にも細胞体にも観察される。
　次に、本実施の形態による培養プレート１０を使用して成長させた軸索束を走査型電子顕微鏡で観察した結果について説明する。
　図２１は本実施の形態における培養プレートのチャネル内で成長した軸索束の表面を走査型電子顕微鏡で観察した結果を示す写真である。なお、図において、（ａ－１）及び（ａ－２）はストレスをかけなかったときの低倍率及び高倍率の写真、（ｂ－１）及び（ｂ－２）の各々は（ａ－１）及び（ａ－２）にそれぞれ対応するストレスをかけたときの写真である。
　軸索束は、図２０に示される観察で使用したものと、同様のものである。軸索が束になっているので、軸索束の表面を容易に走査型電子顕微鏡で観察することができる。また、軸索は、束になっていて同じ方向に延びているので、例えば、ストレス（図２１（ｂ－１）及び（ｂ－２）に示される例は、酸化ストレス）をかけたときの変化が明確である。
　次に、本実施の形態による培養プレート１０を使用して成長させた軸索束にストレスをかけたときの形態変化について説明する。
　図２２は本実施の形態における培養プレートのチャネル内でストレスをかけたときの軸索束を示す写真、図２３は本実施の形態における培養プレートのチャネル内でストレスをかけたときの軸索束の形態変化の実験結果を示すグラフである。なお、図２２において、（ａ）はストレスをかけないときの写真、（ｂ）は酸化ストレスをかけたときの写真、（ｃ）は酸化ストレス及び抗酸化剤を付与したときの写真である。
　ここでは、ヒトｉＰＳ細胞（４０９Ｂ２細胞株）由来の運動神経細胞を非接着性の培養プレート１０に播種して細胞体のスフェロイドを作製した。続いて、細胞体のスフェロイドを１０日間培養した後、培養プレート１０のモジュール１１の第１チャンバー１２ａ内に播種した。そして、培養３０日目に、以下の（１）～（３）の条件の処理を行った。
（１）control PBS (Phosphate Buffered Saline) washing>>>culture medium
（２）H2O2  3hour treatment>>>PBS washing>>>culture medium
（３）H2O2　3hour treatment>>>PBS washing>>>culture medium containing Edaravone
処理を行ってから２日後に、マーカーであるTau 1 で免疫染色した後、評価を行った。なお、評価項目は、Directionality：軸索の方向性である。具体的には、図２２内のオブジェクトの方向性を計測した。この場合、０度が流路（チャネル１３）方向である。軸索は、束になっていて同じ方向に延びているので、チャネル１３内で、例えば、図２２（ｂ）に示されるように、酸化ストレスを付与したときや、図２２（ｃ）に示されるように、酸化ストレスと、神経疾患の薬剤として用いられる抗酸化剤（Edaravone ）とを同時に付与したときの形態変化を比較することができる。そして、図２３に示されるような評価実験の結果は、酸化ストレスを付与すると、軸索方向に伸展する軸索が変性するので、流路方向（０度）への方向性が減少し複雑な形状に変化することを示している。形態変化の評価として、図２３に示されるオブジェクトの配向性（Directionality）を調べると、負荷をかけていないnegative controlの軸索束の配向性が高く、次に、薬剤及びストレスを付与したとき、その次に、酸化ストレスだけを付与したとき、という順で、配向性の差を観ることができた。これにより、神経細胞が受けたストレスを、軸索の形態変化として、画像処理に基づいて評価することができることが分かる。
　次に、本実施の形態による培養プレート１０を使用して成長させた軸索束のミエリン化について説明する。
　図２４は本実施の形態における培養プレートのモジュールでの軸索のミエリン化を示す図である。なお、図において、（ａ）はモジュール内の神経細胞のミエリン化を説明する模式図、（ｂ）はシュワン細胞がないときの軸索の写真、（ｃ）はシュワン細胞があるときの軸索の写真である。
　体内のミエリン（髄鞘）をin vitroで再現する際、従来の方法では、神経細胞の細胞体とシュワン細胞やオリゴデロンサイトの細胞体とが混ざっているので、評価が複雑であった（それぞれの細胞体を識別することが困難であった。）。これに対して、本実施の形態における培養プレート１０を使用すると、図２４（ａ）に示されるように、モジュール１１のチャネル１３内及び反対側にある第２チャンバー１２ｂ内に神経細胞の細胞体が存在しないので軸索とミエリン化する細胞とがどのように振る舞うのかを容易に観察することができる。具体的には、ＩＭＳ３２細胞株を第１チャンバー１２ａ内に播種して培養し、軸索が束になった後に、ミエリン化する細胞であるシュワン細胞を播種した。シュワン細胞が存在しない図２４（ｂ）に示される例と比較すると、シュワン細胞が存在する図２４（ｃ）に示される例では、ミエリン化を容易に観察することができる。
　次に、本実施の形態における装置の適応性について説明する。
　図２５は本実施の形態における装置の適用可能分野を示す模式図、図２６は本実施の形態における装置の他の適用可能分野を示す模式図である。なお、図２５において、（ａ）は薬剤スクリーニングへの応用を示す図、（ｂ）は表現型（phenotype ）装置への応用を示す図である。
　本実施の形態による培養プレート１０を使用することによって、図２５（ａ）に示されるように、太い軸索束を備える神経組織すなわち神経細胞と他の組織との共培養系に対してのスクリーニングを行うことができる。また、図２５（ｂ）に示されるように、患者由来の組織を使用することによって、表現型を網羅的に調べることができる。培養プレート１０は、表現型解析による診断薬の開発に応用することができる。図２６に示されるように、本実施の形態による培養プレート１０を使用して培養された太い軸索束を備える神経組織は、ペーシングシステムのような医用器具の開発や試験に使用することができる。また、移植への利用も期待することができる。
　なお、本明細書の開示は、好適で例示的な実施の形態に関する特徴を述べたものである。ここに添付された特許請求の範囲内及びその趣旨内における種々の他の実施の形態、修正及び変形は、当業者であれば、本明細書の開示を総覧することによって、当然に考え付くことである。
　本開示は、神経細胞の培養に適した装置及び方法に適用することができる。
１０　　培養プレート
１１　　モジュール
１２ａ　第１チャンバー
１２ｂ　第２チャンバー
１３　　チャネル
１５　　基板
１６　　上板
１７　　シール部材
１８　　培養液
２１　　カッター
２２　　ピペット

Claims (15)

  1. 　軸索を有する神経細胞を培養する装置であって、
    　培養プレート（１０）と、
    　該培養プレート（１０）内に配置された複数のモジュール（１１）であって、各モジュール（１１）は、神経細胞の細胞体を受容可能な第１チャンバー（１２ａ）を少なくとも１つ、第２チャンバー（１２ｂ）を少なくとも１つ、及び、細胞体から延びた軸索束を受容可能なチャネル（１３）であって前記第１チャンバー（１２ａ）と第２チャンバー（１２ｂ）とを接続するチャネル（１３）を少なくとも１つ含むモジュール（１１）と、
    を備え、
    　前記第１チャンバー（１２ａ）、第２チャンバー（１２ｂ）及びチャネル（１３）の下端が閉止され、前記第１チャンバー（１２ａ）及び第２チャンバー（１２ｂ）の上端が開放されている装置。
  2. 　前記第１チャンバー（１２ａ）、第２チャンバー（１２ｂ）及びチャネル（１３）内に培養液（１８）が入れられ、前記第２チャンバー（１２ｂ）の上端が少なくとも１つのシール部材（１７）によって閉止される請求項１に記載の装置。
  3. 　前記第２チャンバー（１２ｂ）は骨格筋を受容可能であり、これにより、細胞体から延びた軸索束が骨格筋に接合する請求項１に記載の装置。
  4. 　前記チャネル（１３）は、幅１００～１５０〔μｍ〕及び高さ１００～２００〔μｍ〕である請求項１に記載の装置。
  5. 　軸索を有する神経細胞を培養する方法であって、
    　第１チャンバー（１２ａ）の少なくとも１つ、第２チャンバー（１２ｂ）の少なくとも１つ、及び、前記第１チャンバー（１２ａ）と第２チャンバー（１２ｂ）とを接続するチャネル（１３）の少なくとも１つに培養液を供給するステップであって、前記第１チャンバー（１２ａ）、第２チャンバー（１２ｂ）及びチャネル（１３）は培養プレート（１０）内に配置されたモジュール（１１）の少なくとも１つに含まれているステップと、
    　前記第１チャンバー（１２ａ）内に神経細胞を播種するステップと、
    　前記神経細胞を培養し、これにより、軸索束が成長して各チャネル（１３）内を延びるステップと、
    を備える方法。
  6. 　前記第２チャンバー（１２ｂ）の少なくとも１つに骨格筋が播種され、これにより、神経細胞から延びた軸索束が骨格筋に接合する請求項５に記載の方法。
  7. 　培養液内に播種することによって培養された複数の神経細胞であって、
    　細胞体と、該細胞体から所定の方向に延びた少なくとも１つの軸索束とを備える神経細胞。
  8. 　前記細胞体、軸索束及び軸索末端は、空間的に分離されている請求項７に記載の神経細胞。
  9. 　前記神経細胞はスフェロイド状であり、前記軸索束は伸展可能である請求項７に記載の神経細胞。
  10. 　前記軸索束は骨格筋に接合する請求項７に記載の神経細胞。
  11. 　培養液内に播種することによって培養された複数の神経細胞であって、
    　細胞体と、該細胞体から所定の方向に延びた少なくとも１つの軸索束とを備え、該軸索束は細胞体を含んでいない神経細胞。
  12. 　軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法であって、
    　軸索束の少なくとも１つが成長して神経細胞の細胞体から伸展するように神経細胞を培養するステップと、
    　ウェスタンブロッティングによって、前記軸索束内では、前記細胞体の存在を示すマーカーがネガティブであることを確認するステップと、
    を備える方法。
  13. 　前記マーカーは、マップ２（Ｍａｐ２）及びヌクレオポリン（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｉｎ）である請求項１２に記載の方法。
  14. 　軸索束内のプロテインを解析及び同定する方法であって、
    　軸索束の少なくとも１つが成長して神経細胞の細胞体から伸展するように神経細胞を培養するステップと、
    　前記軸索束をスライスするステップと、
    　前記軸索束内に存在するプロテインを解析及び同定するステップと、
    を備える方法。
  15. 　軸索束を含む神経細胞を使用する方法であって、
    　軸索束の少なくとも１つが成長して神経細胞の細胞体から伸展するように神経細胞を培養するステップと、
    　前記神経細胞に蛍光処理を施すステップと、
    　電気生理学的活動を観察するために前記細胞体にＫＣｌを付与するステップと、
    を備える方法。
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