Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

WO2017170343A1 - 細胞シートを含有する積層体、心疾患治療剤および細胞シート積層用フィルム - Google Patents

細胞シートを含有する積層体、心疾患治療剤および細胞シート積層用フィルム Download PDF

Info

Publication number
WO2017170343A1
WO2017170343A1 PCT/JP2017/012285 JP2017012285W WO2017170343A1 WO 2017170343 A1 WO2017170343 A1 WO 2017170343A1 JP 2017012285 W JP2017012285 W JP 2017012285W WO 2017170343 A1 WO2017170343 A1 WO 2017170343A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
film thickness
film
cell sheet
polymer film
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/012285
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
中村　健太郎
進弥 佐野
陽介 車
鮫島　正
Original Assignee
富士フイルム株式会社
テルモ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社, テルモ株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Priority to JP2018509315A priority Critical patent/JP6682620B2/ja
Priority to EP17774880.3A priority patent/EP3438246B1/en
Priority to CN201780019950.0A priority patent/CN109089422B/zh
Publication of WO2017170343A1 publication Critical patent/WO2017170343A1/ja
Priority to US16/139,814 priority patent/US20190008791A1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/222—Gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/367—Muscle tissue, e.g. sphincter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L89/00—Compositions of proteins; Compositions of derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/64—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/20—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of the heart, e.g. heart valves

Definitions

  • the present invention relates to a laminate composed of a cell sheet and a polymer film.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for heart disease comprising the above laminate.
  • the invention further relates to films for cell sheet lamination.
  • Patent Document 1 forms a cell sheet substantially without proliferation for the purpose of providing a production method using a cell culture solution that does not contain a production process-derived impurity component that interferes with clinical application.
  • a method of producing a cell sheet has been described which comprises culturing cells at a high density in a cell culture medium free of an effective amount of growth factor.
  • Patent Document 2 describes genetically modified gelatin that is particularly useful for several applications involving cell attachment, such as cell culture operations and applications involving cell culture of anchorage-dependent cells, as well as a variety of medical applications. It is done.
  • An object of the present invention is to provide a laminate containing a cell sheet which is strong and easy to handle at the time of transplantation or transportation.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for heart disease and a film for cell sheet lamination using the above laminate.
  • the inventors of the present invention laminated the biocompatibility polymer film of 500 ⁇ g / cm 2 to 10 mg / cm 2 on the cell sheet to obtain strength and handling performance of the cell sheet. It has been found that it can be enhanced, and the present invention has been completed. According to the present invention, the following inventions are provided.
  • a laminate comprising a biocompatibility polymer film of 500 ⁇ g / cm 2 to 10 mg / cm 2 and a cell sheet disposed on at least one surface of the biocompatibility polymer film.
  • the biocompatible polymer film satisfies the following formula 1.
  • Formula 1 (film thickness upon swelling / film thickness upon drying) ⁇ 100 ⁇ ⁇ 27.5 ⁇ film thickness upon drying + 880 However, the unit of film thickness at the time of swelling and film thickness at the time of drying is ⁇ m.
  • Formula 2 (film thickness upon swelling / film thickness upon drying) ⁇ 100 ⁇ ⁇ 27.5 ⁇ film thickness upon drying + 962.5 However, the unit of film thickness at the time of swelling and film thickness at the time of drying is ⁇ m.
  • Formula 3 (film thickness when swollen / film thickness when dried) ⁇ 100 However, the unit of film thickness at the time of swelling and film thickness at the time of drying is ⁇ m.
  • [5] The laminate according to any one of [1] to [4], wherein the dry film thickness of the biocompatible polymer film is 5 to 200 ⁇ m.
  • Formula 4 A-[(Gly-X-Y) n ] m- B
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence
  • n pieces of X each independently represent any of amino acids
  • n pieces of Y each independently represent amino acids
  • n represents an integer of 3 to 100
  • m represents an integer of 2 to 10.
  • the n pieces of Gly-X-Y may be the same or different.
  • Formula 5 Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y) 63 ] 3 -Gly
  • 63 Xs each independently represent any of amino acids
  • 63 Ys each independently represent any of amino acids.
  • the 63 Gly-X-Y groups may be the same or different.
  • the laminate according to any one of [8] to [11], wherein the recombinant gelatin has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • a therapeutic agent for heart disease comprising the laminate according to any one of [1] to [12].
  • a film for laminating a cell sheet comprising a biocompatibility polymer film of 500 ⁇ g / cm 2 to 10 mg / cm 2 .
  • the strength and handling performance of the cell sheet can be enhanced.
  • the agent for treating heart disease of the present invention can treat heart disease.
  • the film for cell sheet lamination of the present invention is useful in the production of the laminate of the present invention.
  • FIG. 1 shows the result of the handling performance evaluation of the polymer film.
  • FIG. 2 shows a schematic view of a test system and test results for a protein permeation test of a polymer film.
  • FIG. 3 shows the results of the protein permeation test of the polymer film.
  • FIG. 4 shows the results of plotting the protein permeability of the polymer film on a graph of the swelling ratio and the film thickness at the time of drying.
  • FIG. 5 shows changes in left ventricular space area change rate (FAC) after transplantation into an infarct model.
  • FIG. 6 shows the results of skeletal myoblasts confirmed by immunostaining of myosin heavy chain (MHC).
  • MHC myosin heavy chain
  • the laminate of the present invention is a laminate comprising a biocompatibility polymer film of 500 ⁇ g / cm 2 to 10 mg / cm 2 and a cell sheet disposed on at least one surface of the biocompatibility polymer film. is there.
  • the biocompatible polymer film is also referred to as a polymer film.
  • a laminate containing one bioaffinity polymer film and one cell sheet ie, a cell sheet is formed only on one surface of the bioaffinity polymer film
  • Laminates present, as well as laminates in which one biocompatibility polymer film is present between two cell sheets ie, lamination in which cell sheets are present on both surfaces of the biocompatibility polymer film) Body
  • one biocompatibility polymer film is present between two cell sheets
  • the density of the biocompatible polymer film used in the present invention is 500 ⁇ g / cm 2 to 10 mg / cm 2 . By setting the density within the above range, it is possible to manufacture a laminate having sufficient strength.
  • the density of the biocompatible polymer film is preferably 500 ⁇ g / cm 2 to 5.0 mg / cm 2 , more preferably 500 ⁇ g / cm 2 to 2.0 mg / cm 2 .
  • the density of the biocompatible polymer film is calculated by "coating mass / coating area" at the time of preparation.
  • the applied mass means the mass of the applied biocompatible polymer.
  • the biocompatible polymer film used in the present invention preferably satisfies the following formula 1.
  • Formula 1 (film thickness upon swelling / film thickness upon drying) ⁇ 100 ⁇ ⁇ 27.5 ⁇ film thickness upon drying + 880
  • the unit of film thickness at the time of swelling and film thickness at the time of drying is ⁇ m.
  • the handling performance of the biocompatible polymer film is further improved, which is preferable.
  • a biocompatible polymer film satisfying the above formula 1 And the handling performance is further improved.
  • a biocompatible polymer film is produced by drying at room temperature (25 ° C.), a biocompatible polymer film not satisfying the above-mentioned formula 1 is obtained.
  • the biocompatible polymer film used in the present invention more preferably satisfies the following formula 2.
  • Formula 2 (film thickness upon swelling / film thickness upon drying) ⁇ 100 ⁇ ⁇ 27.5 ⁇ film thickness upon drying + 962.5
  • the unit of film thickness at the time of swelling and film thickness at the time of drying is ⁇ m.
  • the dry film thickness is obtained by measuring the thickness of the dried biocompatible polymer film with a micrometer (such as Mitutoyo Soft Touch Micro CLM).
  • the film thickness upon swelling is obtained by measuring the thickness of the biocompatible polymer film sufficiently moistened with water for injection using a micrometer.
  • the swelling ratio represented by the following formula 3 of the biocompatible polymer film used in the present invention is preferably 230% or more.
  • Formula 3 (film thickness when swollen / film thickness when dried) ⁇ 100
  • the unit of film thickness at the time of swelling and film thickness at the time of drying is ⁇ m.
  • the swelling ratio represented by the formula 3 By setting the swelling ratio represented by the formula 3 to 230% or more, the permeability of a protein (a protein of 66 kDa in the example) can be improved. That is, it is preferable because coexistence of prevention of cell infiltration and permeation of protein (nutrient component etc.) can be achieved.
  • the swelling ratio represented by the formula 3 is more preferably 250% or more, still more preferably 270% or more, and particularly preferably 300% or more. Although the upper limit of the swelling ratio shown by Formula 3 is not specifically limited, Generally it is 1000% or less.
  • the dry film thickness of the biocompatible polymer film is not particularly limited, but is preferably 5 to 200 ⁇ m, more preferably 10 to 100 ⁇ m, still more preferably 20 to 50 ⁇ m, and particularly preferably 20 to 40 ⁇ m It is.
  • the wet film thickness of the biocompatible polymer film is not particularly limited, but preferably 50 to 500 ⁇ m. By setting it as said range, the curvature of a bioaffinity polymer film can be prevented.
  • the wet film thickness of the biocompatible polymer film is more preferably 50 to 300 ⁇ m, and still more preferably 100 to 300 ⁇ m.
  • Biocompatible polymer Biocompatibility means that when it comes into contact with a living body, it does not cause significant adverse reactions such as long-term and chronic inflammatory reactions.
  • the biocompatible polymer used in the present invention is not particularly limited as long as it is degraded in the living body as long as it has an affinity to the living body, but is preferably a biodegradable polymer.
  • Specific examples of non-biodegradable polymers include polytetrafluoroethylene (PTFE), polyurethane, polypropylene, polyester, vinyl chloride, polycarbonate, acrylic, silicone, and MPC (2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine).
  • biodegradable polymers include naturally occurring peptides, recombinant peptides, and polypeptides such as chemically synthesized peptides (eg, gelatin described below), polylactic acid, polyglycolic acid, lactic acid / glycolic acid Copolymers (PLGA), hyaluronic acid, glycosaminoglycans, proteoglycans, chondroitin, cellulose, agarose, carboxymethylcellulose, chitin, chitosan and the like.
  • recombinant peptides are particularly preferred.
  • These biocompatibility polymers may be designed to improve cell adhesion.
  • a cell adhesion substrate (fibronectin, vitronectin, laminin) to a substrate surface or a cell adhesion sequence (represented by a single amino acid code, RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, RYVVLPR sequence) , Coating with LGTIPG sequence, RNIAEIIKDI sequence, IKVAV sequence, LRE sequence, DGEA sequence, and HAV sequence) peptide, "amination of substrate surface, cationization", or "plasma treatment of substrate surface, hydrophilicity by corona discharge” Methods such as sex processing can be used.
  • polypeptide containing recombinant peptide or chemically synthesized peptide is not particularly limited as long as it has biocompatibility, but, for example, gelatin, collagen, atelocollagen, elastin, fibronectin, pronectin, laminin, tenascin, fibrin, fibroin, entactin , Thrombospondin and retronectin are preferred, and most preferred are gelatin, collagen and atelocollagen.
  • the gelatin for use in the present invention is preferably natural gelatin, recombinant gelatin or chemically synthesized gelatin, and more preferably recombinant gelatin.
  • natural gelatin means gelatin made from collagen of natural origin.
  • chemically synthesized peptide or chemically synthesized gelatin is meant an artificially synthesized peptide or gelatin.
  • the synthesis of the peptide such as gelatin may be solid phase synthesis or liquid phase synthesis, but is preferably solid phase synthesis.
  • Solid phase synthesis of peptides is known to the person skilled in the art, for example Fmoc group synthesis using Fmoc group (Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl group) as protection of amino group, as well as Boc group (tert-Butyl as protection of amino group A Boc group synthesis method using an Oxy Carbonyl group) and the like can be mentioned.
  • the preferred embodiments of chemically synthesized gelatin can be applied to the contents described in recombinant gelatin described later in this specification.
  • the hydrophilicity value "1 / IOB" value of the biocompatible polymer used in the present invention is preferably 0 to 1.0. More preferably, it is 0 to 0.6, and more preferably 0 to 0.4.
  • the IOB is an indicator of hydrophilicity / hydrophobicity based on an organic conceptual diagram representing the polarity / non-polarity of the organic compound proposed by Atsushi Fujita, and the details are described in, for example, "Pharmaceutical Bulletin", vol. 2, 2, pp .163-173 (1954), "Domain of Chemistry” vol. 11, 10, pp. 719-725 (1957), “Fragrance Journal", vol. 50, pp. 79-82 (1981), etc. There is.
  • the source of all organic compounds is methane (CH 4 ), and all the other compounds are regarded as derivatives of methane, and their carbon numbers, substituents, modified parts, rings, etc. are set to certain numerical values.
  • the scores are added to obtain the organic value (OV) and the inorganic value (IV), and this value is plotted on the diagram with the organic value on the X axis and the inorganic value on the Y axis. It is something.
  • the IOB in the organic conceptual diagram means the ratio of the inorganic value (IV) to the organic value (OV) in the organic conceptual diagram, that is, "inorganic value (IV) / organic value (OV)".
  • hydrophilicity is expressed by "1 / IOB” value which is the reciprocal of IOB. The smaller the “1 / IOB” value (closer to 0), the more hydrophilic the expression.
  • the hydrophilicity index represented by Grand average of hydropathicity (GRAVY) value is 0.3 or less, minus 9.0 or more, More preferably, it is 0.0 or less and -7.0 or more.
  • Grand average of hydropathicity (GRAVY) values can be obtained from Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins MR, Appel RD, Bairoch A .; Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). Pp.
  • the biocompatible polymer is preferably a recombinant gelatin.
  • the recombinant gelatin is a polypeptide or protein-like substance having a gelatin-like amino acid sequence produced by genetic engineering technology, and is preferably a recombinant of an amino acid sequence derived from a partial amino acid sequence of collagen.
  • the recombinant gelatin is preferably one having a repeat of the sequence represented by Gly-XY characteristic of collagen (X and Y each independently represent any amino acid).
  • the plurality of Gly-X-Y may be the same or different.
  • the recombinant gelatin those described, for example, in EP 1014176, US Pat. No. 6,992,172, International Publication WO 2004/85473, International Publication WO 2008/103041, etc. can be used, but the present invention is not limited thereto.
  • Preferred as the recombinant gelatin used in the present invention is a recombinant gelatin of the following aspect.
  • the recombinant gelatin is excellent in biocompatibility due to the natural performance of natural gelatin, and is not of natural origin, so there is no concern such as bovine spongiform encephalopathy (BSE) and is excellent in noninfectiousness.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • the recombinant gelatin is more uniform than the natural gelatin and the sequence is determined, it is possible to design the blur less precisely by the cross-linking and the like also in the strength and the degradability.
  • the molecular weight of the recombinant gelatin is not particularly limited, but is preferably 2000 or more and 100000 or less (2 kDa (kilodalton) or more and 100 kDa or less), more preferably 2500 or more and 95000 or less (2.5 kDa or more and 95 kDa or less) Is 5000 or more and 90000 or less (5 kDa or more and 90 kDa or less), and most preferably 10000 or more and 90000 or less (10 kDa or more and 90 kDa or less).
  • the recombinant gelatin preferably has a repeat of the sequence shown by Gly-XY characteristic of collagen.
  • the plurality of Gly-X-Y may be the same or different.
  • Gly-XY Gly represents glycine
  • X and Y represent any amino acids (preferably, any amino acids other than glycine).
  • the sequence represented by Gly-XY, which is characteristic of collagen, is a highly specific partial structure in the amino acid composition and sequence of gelatin-collagen as compared with other proteins. In this part, glycine accounts for about one third of the whole, and in the amino acid sequence, one out of every three repeats.
  • Glycine is the simplest amino acid, has less restriction on the arrangement of molecular chains, and greatly contributes to regeneration of the helical structure upon gelation.
  • the amino acids represented by X and Y contain a large amount of imino acids (proline and oxyproline), and preferably account for 10% to 45% of the total.
  • at least 80%, more preferably at least 95%, most preferably at least 99% of the amino acids of the recombinant gelatin sequence are the repeated structure of Gly-XY.
  • common polar amino acids are charged and uncharged at 1: 1.
  • polar amino acids specifically refer to cysteine, aspartic acid, glutamic acid, histidine, lysine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and arginine
  • polar uncharged amino acids among these include cysteine, asparagine, glutamine, serine , Threonine and tyrosine.
  • the proportion of polar amino acids is 10 to 40%, preferably 20 to 30%, of the total amino acids constituting the composition.
  • the ratio of the uncharged amino acid in the polar amino acid is preferably 5% or more and less than 20%, more preferably 5% or more and less than 10%. Furthermore, it is preferable not to include any one amino acid, preferably two or more amino acids of serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine on the sequence.
  • polypeptides the minimum amino acid sequence that works as a cell adhesion signal is known (eg, “Pathophysiology” Vol. 9, No. 7 (1990) page 527) published by Nagai Publishing Co., Ltd.
  • the recombinant gelatin used in the present invention may have two or more of these cell adhesion signals in one molecule.
  • Specific sequences include RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence, YIGSR sequence, PDSGR sequence, RYVVLPR sequence, LGTIPG sequence, RNIAEIIKDI sequence, which is expressed by single-letter amino acid notation in that there are many types of cells to adhere.
  • the sequences of IKVAV, LRE, DGEA and HAV are preferred.
  • RGD sequences More preferred are RGD sequences, YIGSR sequences, PDSGR sequences, LGTIPG sequences, IKVAV sequences and HAV sequences, and particularly preferred are RGD sequences.
  • RGD sequences preferred are ERGD sequences.
  • the number of amino acids between RGDs is not uniform between 0 and 100, preferably between 25 and 60.
  • the content of the minimum amino acid sequence is preferably 3 to 50, more preferably 4 to 30, and particularly preferably 5 to 20 in one molecule of protein. Most preferably, it is twelve.
  • the ratio of the RGD motif to the total number of amino acids is preferably at least 0.4%. Where the recombinant gelatin comprises more than 350 amino acids, it is preferred that each stretch of 350 amino acids comprises at least one RGD motif.
  • the ratio of RGD motif to the total number of amino acids is more preferably at least 0.6%, still more preferably at least 0.8%, still more preferably at least 1.0%, particularly preferably at least 1.2. %, Most preferably at least 1.5%.
  • the number of RGD motifs in the recombinant peptide is preferably at least 4, more preferably 6, more preferably 8, particularly preferably 12 to 16, per 250 amino acids.
  • a percentage of 0.4% of the RGD motif corresponds to at least one RGD sequence per 250 amino acids. Because the number of RGD motifs is an integer, gelatin consisting of 251 amino acids must contain at least two RGD sequences in order to meet the 0.4% feature.
  • the recombinant gelatin of the present invention comprises at least 2 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably at least 3 RGD sequences per 250 amino acids, more preferably at least 4 per 250 amino acids. Contains RGD sequence.
  • a further embodiment of the recombinant gelatin of the present invention comprises at least 4 RGD motifs, preferably 6, more preferably 8 and even more preferably 12 or more and 16 or less.
  • the recombinant gelatin may be partially hydrolyzed.
  • the recombinant gelatin used in the present invention is represented by the following formula 4.
  • Formula 4 A-[(Gly-X-Y) n ] m- B
  • A represents any amino acid or amino acid sequence
  • B represents any amino acid or amino acid sequence
  • n pieces of X each independently represent any of amino acids
  • n pieces of Y each independently represent amino acids Indicates one.
  • n is preferably an integer of 3 to 100, more preferably an integer of 15 to 70, and most preferably an integer of 50 to 65.
  • m preferably represents an integer of 2 to 10, more preferably an integer of 3 to 5.
  • the n pieces of Gly-X-Y may be the same or different.
  • the recombinant gelatin used in the present invention is represented by the following formula 5.
  • Formula 5 Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y) 63 ] 3 -Gly
  • 63 Xs each independently represent any of amino acids
  • 63 Ys each independently represent any of amino acids.
  • the 63 Gly-X-Y groups may be the same or different.
  • the naturally occurring collagen referred to here may be any naturally occurring collagen, but is preferably type I, II, III, IV or V collagen. More preferably, it is type I, type II or type III collagen. According to another form, the collagen is preferably human, bovine, porcine, murine or rat, more preferably human.
  • the isoelectric point of the recombinant gelatin used in the present invention is preferably 5 to 10, more preferably 6 to 10, and still more preferably 7 to 9.5.
  • the measurement of the isoelectric point of recombinant gelatin was described in Isoelectric focusing (Maxey, CR (1976; Phitogr. Gelatin 2, Editor Cox, P. J. Academic, London, Engl.). Thus, it can be carried out by measuring the pH after passing a 1% by mass gelatin solution through a mixed crystal column of cation and anion exchange resin.
  • the recombinant gelatin is not deaminated.
  • the recombinant gelatin does not have telopentide.
  • the recombinant gelatin is a substantially pure polypeptide prepared by a nucleic acid encoding an amino acid sequence.
  • recombinant gelatin is (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; or (2) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more) Amino acid sequences with sequence identity and biocompatibility: Have.
  • the recombinant gelatin most preferably has the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant gelatin may consist of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and may have a bioaffinity amino acid sequence.
  • the "one or several" in the "amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added” is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5 It means one, particularly preferably 1 to 3.
  • the recombinant gelatin can be produced by gene recombination technology known to those skilled in the art, and for example, according to the method described in EP1014176A2, U.S. Pat. No. 6,992,172, WO 2004/85473, WO 2008/103041, etc. It can manufacture according to the same. Specifically, a gene encoding an amino acid sequence of a predetermined recombinant gelatin is obtained and incorporated into an expression vector to prepare a recombinant expression vector, which is introduced into an appropriate host to prepare a transformant. . Since the recombinant gelatin is produced by culturing the obtained transformant in an appropriate medium, the recombinant gelatin used in the present invention can be prepared by recovering the recombinant gelatin produced from the culture. .
  • the method for producing the biocompatible polymer film is not particularly limited, and the biocompatible polymer film can be produced by a conventional method.
  • a biocompatible polymer film can be produced by pouring an aqueous solution of a biocompatible polymer into a plastic tray and drying at a low temperature (eg, in a refrigerator at 4 ° C.) or at room temperature.
  • the aqueous solution of the biocompatible polymer is dried at low temperature (eg, in a refrigerator at 4 ° C., etc.).
  • the biocompatible polymer in the biocompatible polymer film can be crosslinked.
  • Common crosslinking methods include thermal crosslinking, crosslinking with aldehydes (eg, formaldehyde, glutaraldehyde, etc.), crosslinking with condensing agents (carbodiimide, cyanamide, etc.), enzymatic crosslinking, photocrosslinking, ultraviolet crosslinking, hydrophobic interaction, Hydrogen bonds, ionic interactions and the like are known, and the above crosslinking method can be used in the present invention as well.
  • the crosslinking method used in the present invention is more preferably thermal crosslinking, ultraviolet crosslinking or enzyme crosslinking, and particularly preferably thermal crosslinking.
  • the enzyme When performing crosslinking by an enzyme, the enzyme is not particularly limited as long as it has a crosslinking action between polymer materials, but preferably, crosslinking can be performed using transglutaminase and laccase, most preferably transglutaminase .
  • a specific example of the protein which is enzymatically crosslinked by transglutaminase is not particularly limited as long as it is a protein having a lysine residue and a glutamine residue.
  • the transglutaminase may be of mammalian origin or of microbial origin.
  • Ajinomoto's Activa series mammalian transglutaminase released as a reagent, for example, Human-derived blood coagulation factors (Factor XIIIa, Haematologic Technologies, Inc., such as guinea pig liver-derived transglutaminase such as Oriental Yeast Co., Ltd., Upstate USA Inc., Biodesign International, goat-derived transglutaminase, rabbit-derived transglutaminase, etc. Company) and the like.
  • Human-derived blood coagulation factors Factor XIIIa, Haematologic Technologies, Inc., such as guinea pig liver-derived transglutaminase such as Oriental Yeast Co., Ltd., Upstate USA Inc., Biodesign International, goat-derived transglutaminase, rabbit-derived transglutaminase, etc. Company
  • the reaction temperature at the time of crosslinking is not particularly limited as long as crosslinking is possible, but is preferably ⁇ 100 ° C. to 500 ° C., more preferably 0 ° C. to 300 ° C., further preferably C. to 300.degree. C., still more preferably 100.degree. C. to 250.degree. C., particularly preferably 120.degree. C. to 200.degree.
  • reaction time for crosslinking is not particularly limited, it is generally 1 hour to 72 hours, preferably 2 hours to 48 hours, and more preferably 4 hours to 36 hours. is there.
  • the cell sheet in the present invention means a sheet containing cells as a main component.
  • the cell sheet is a sheet in which cells are linked to each other and has a sheet-like shape, and the configuration thereof is not particularly limited, and a monolayer cell sheet, a sheet formed of two or more layers of cells, or It may be any sheet formed of cells cultured in three dimensions.
  • the cells may be linked to each other directly and / or via an mediator.
  • the mediator is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least mechanically connecting the cells, and examples thereof include extracellular matrix.
  • the mediator is preferably of cell origin, in particular of the cells constituting the cell sheet.
  • the cells are at least mechanically linked, but may be further functionally, eg chemically, electrically linked.
  • the cell sheet in the present invention includes any cell capable of forming a cell sheet.
  • Examples of cells include, but are not limited to, cardiomyocytes, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), fibroblasts, synoviocytes, epithelial cells, and endothelial cells. Among the above, cardiomyocytes and skeletal myoblasts are preferred.
  • cells cells derived from any organism that can be treated by a cell sheet can be used. The organism is not particularly limited, and examples thereof include humans, non-human primates (such as monkeys), dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, mice, rats and hamsters. In addition, although only one type of cells may be used, two or more types of cells can also be used. When there are two or more types of cells forming the cell sheet, the ratio (purity) of the largest number of cells is preferably 25% or more, more preferably 50% or more, at the end of cell sheet production, and more preferably 60% or more.
  • the cell sheet can be produced by a known method for producing a cell sheet or a method analogous thereto.
  • the cells may be cultured in a culture dish, and the sheets may be collected from the culture dish when the cells are sheeted.
  • the method for producing the cell sheet is not particularly limited, but as an example, the cell sheet can be produced by the method described in JP-A-2010-81829.
  • the cell sheet may be produced by culturing cells in a density that can form a cell sheet substantially without proliferation, in a cell culture medium free of an effective amount of growth factor.
  • the "density capable of forming a cell sheet substantially without proliferation” means a cell density capable of forming a cell sheet when cultured in a growth factor-free medium.
  • a cell density capable of forming a cell sheet when cultured in a growth factor-free medium.
  • cells were seeded with a density of about 6,500 cells / cm 2 in order to form a cell sheet, Even if the cells at the above density are cultured in a growth factor-free medium, no cell sheet can be formed.
  • "the density at which cell sheets can be formed substantially without proliferation” is typically 300,000 cells / cm 2 or more.
  • the upper limit of the cell density is not particularly limited as long as the cell sheet formation is not impaired and the cells go into differentiation, and for skeletal myoblasts, it is, for example, 1,100,000 cells / cm 2 .
  • the cells may or may not proliferate, but even if they do, they do not proliferate to the point of changing the cell properties.
  • skeletal myoblasts begin to differentiate when confluent. Skeletal myoblasts are preferably seeded at a density that forms a cell sheet but does not go into differentiation. Preferably, the cells do not grow beyond the range of measurement error.
  • Whether or not the cells have proliferated can be evaluated, for example, by comparing the number of cells at the time of seeding with the number of cells after formation of the cell sheet.
  • the number of cells after cell sheet formation is typically 300% or less, preferably 200% or less, more preferably 150% or less, still more preferably 125% or less, particularly preferably the number of cells at the time of seeding. It is 100% or less.
  • the culture of the cells is performed within a predetermined period, preferably, a period during which the cells do not go into differentiation.
  • the cells are maintained in an undifferentiated state during the culture period.
  • the transition to cell differentiation can be assessed by any method known to one skilled in the art.
  • expression of myosin heavy chain (MHC) and multinucleation of cells can be used as an indicator of differentiation.
  • the culture time is preferably within 48 hours, more preferably within 40 hours, and still more preferably within 24 hours.
  • growth factor any substance that promotes cell proliferation relative to its absence, eg, epidermal growth factor (EGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), or fibroblast growth factor ( FGF) and the like.
  • EGF epidermal growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • an effective amount of growth factor is the amount of growth factor that promotes cell proliferation significantly, as compared to in the absence of growth factor, or conveniently added for the purpose of cell proliferation in the art Means quantity.
  • the significance of cell growth promotion can be appropriately evaluated, for example, by any statistical method known in the art, such as t-test, etc., and the usual addition amount can be varied according to various technical fields. It can be known from known literature.
  • the effective amount of EGF in the culture of skeletal myoblasts is, for example, 0.005 ⁇ g / mL or more.
  • the concentration of growth factor in the culture medium is less than such effective amount.
  • the concentration of EGF in the culture medium in the culture of skeletal myoblasts is preferably less than 0.005 ⁇ g / mL, more preferably less than 0.001 ⁇ g / mL.
  • the concentration of growth factor in the culture medium is less than the normal concentration in the organism.
  • the concentration of EGF in the culture medium in the culture of skeletal myoblasts is preferably less than 5.5 ng / mL, more preferably less than 1.3 ng / mL, still more preferably 0.5 ng / mL. It is less than mL.
  • the culture medium in the present invention is substantially free of growth factors.
  • the term “substantially free” means that the growth factor content in the culture solution is such that the cell sheet is not adversely affected when applied to a living body, and preferably, the growth factor in the culture solution is positively Means not added to
  • the culture medium does not contain other components therein, such as growth factors at concentrations above that contained in serum or the like.
  • the cell culture solution (sometimes referred to simply as “culture solution”) is not particularly limited as long as it can maintain cell survival, but typically contains amino acids, vitamins, and electrolytes as main components. Available.
  • the culture medium is based on a basal medium for cell culture.
  • the basal medium is not limited to, for example, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), MEM (Eagle minimal essential medium), F12, Ham, RPMI 1640, MCDB (MCDB 102, 104, 107, 131, 153, 199 etc.), L15, SkBM (registered trademark), RITC80-7 and the like. Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known.
  • the basal medium may be used as a standard composition (for example, as it is marketed), or its composition may be changed as appropriate depending on the cell type and cell conditions.
  • the basal medium is not limited to those of known composition, and may be one in which one or more components are added, removed, increased or decreased.
  • the amino acids contained in the basal medium are not particularly limited, and examples thereof include L-arginine, L-cystine, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, and the like. Examples include L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine and the like.
  • the vitamins contained in the basal medium are not particularly limited.
  • calcium D-pantothenate, choline chloride, folic acid, i-inositol, niacinamide, riboflavin, thiamine, pyridoxine, biotin, lipoic acid, vitamin B 12 , Adenine, thymidine and the like can be mentioned.
  • the electrolyte contained in the basal medium is not particularly limited.
  • CaCl 2 , KCl, MgSO 4 , NaCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , Fe (NO 3 ) 3 , FeSO 4 , CuSO 4 , MnSO 4 , Na 2 SiO 3 , (NH 4 ) 6Mo 7 O 24 , NaVO 3 , NiCl 2 , ZnSO 4 and the like can be mentioned.
  • the basal medium may contain, in addition to these components, saccharides such as D-glucose, sodium pyruvate, pH indicators such as phenol red, putrescine, and the like.
  • the cell culture medium is substantially free of the steroid component.
  • the "steroid agent component” refers to a compound having a steroid nucleus that can exert adverse effects such as adrenocortical dysfunction, Cushing's syndrome and the like on a living body.
  • the compound is not particularly limited, and examples thereof include cortisol, prednisolone, triamcinolone, dexamethasone, betamethasone and the like. Therefore, the phrase "substantially free of steroid component” means that the content of the above-mentioned compound in the culture solution is not adversely affected when the cell sheet is applied to a living body, and preferably in the culture solution. In other words, the culture solution does not contain the steroid component at a higher concentration than that contained in other components such as serum.
  • the cell culture medium is substantially free of heterologous serum components.
  • heterologous serum component means a serum component derived from an organism of a species different from that of the recipient.
  • serum derived from bovine or horse such as fetal bovine serum (FBS, FCS), calf serum (CS), equine serum (HS), etc. corresponds to different serum components.
  • substantially free of heterologous serum components means that the content of these sera in the culture solution is not adversely affected when the cell sheet is applied to the living body (for example, the serum albumin content in the cell sheet) Is preferably less than 50 ng, which preferably means that these substances are not actively added to the culture solution.
  • the cell culture medium comprises allogeneic serum components.
  • homologous serum component means a serum component derived from an organism of the same species as the recipient.
  • human serum corresponds to the homologous serum component.
  • the allogeneic serum component is an autologous serum component, ie a serum component derived from the recipient.
  • the content of the allogeneic serum component is not particularly limited as long as it allows formation of a cell sheet, but preferably 5 to 40 v / v (volume / volume)%, more preferably 10 to 20 v / v (volume / volume) ) Is%.
  • the cell culture medium is substantially free of selenium components.
  • the "selenium component” includes a selenium molecule and a selenium-containing compound, in particular, a selenium-containing compound capable of releasing a selenium molecule in vivo, such as selenium acid and the like. Therefore, the phrase "substantially free of selenium component” means that the content of these substances in the culture solution is not adversely affected when the cell sheet is applied to a living body, and preferably in the culture solution. In other words, the culture solution does not contain the selenium component at a concentration higher than that contained in other components such as serum etc.
  • the selenium concentration in the culture solution is the normal value (for example, 10.6 to 17.4 ⁇ g / dL) in human serum, and the proportion of human serum contained in the medium is It is lower than the multiplied value (ie, if the content of human serum is 10%, the selenium concentration is, for example, less than 1.0 to 1.7 ⁇ g / dL).
  • Cell sheets are typically manufactured by seeding the cells in culture medium and culturing the cells to form a cell sheet.
  • Culturing of the cells can be performed under conditions commonly used in the art.
  • typical culture conditions include culture at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • the culture period is preferably within 48 hours, more preferably within 40 hours, still more preferably within 24 hours, from the viewpoint of sufficient formation of the cell sheet and prevention of cell differentiation.
  • Culturing can be performed in vessels of any size and shape.
  • ⁇ Method of manufacturing laminate> It will not be limited especially if it is a method which can make a cell sheet and a biocompatibility polymer film laminate as a manufacturing method of a layered product of the present invention.
  • the biocompatibility polymer film may be laminated on the surface of the cell sheet, or the cell sheet on the surface of the biocompatibility polymer film May be laminated.
  • the laminate may be prepared by forming a cell sheet by seeding and culturing cells on the surface of the biocompatible polymer film.
  • the laminate of the present invention can be used to treat a subject's disease or illness.
  • a cell sheet of skeletal myoblasts can be used as a therapeutic agent for heart disease.
  • Heart diseases include, for example, myocardial infarction, ischemic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, angina pectoris and the like.
  • Examples of the administration method of the therapeutic agent for heart disease containing the laminate of the present invention include a method for directly sticking the therapeutic agent for heart disease on the injured site of the damaged myocardial tissue.
  • the administration target of the agent for treating heart disease containing the laminate of the present invention is not particularly limited, but preferably human, non-human primate (such as monkey), dog, cat, pig, horse, goat, sheep, rat, mouse and hamster And the like, and more preferably human.
  • the biocompatibility polymer film of 500 ⁇ g / cm 2 to 10 mg / cm 2 can be produced by laminating the cell sheet on the laminate of the present invention. Therefore, according to the present invention, there is provided a film for cell sheet lamination comprising a biocompatible polymer film of 500 ⁇ g / cm 2 to 10 mg / cm 2 . Details and preferred embodiments of the biocompatible polymer film are as described hereinabove.
  • CBE3 Recombinant gelatin
  • CBE3 Molecular weight: 51.6 kD Structure: GAP [(GXY) 63 ] 3 G Amino acid number: 571 RGD sequence: 12 imino acid content: 33% Almost 100% of the amino acids are GXY repeating structures.
  • the amino acid sequence of CBE3 does not include serine, threonine, asparagine, tyrosine and cysteine.
  • CBE3 has the ERGD sequence. Isoelectric point: 9.34 GRAVY value: -0.682 1 / IOB value: 0.
  • a recombinant gelatin film was prepared using CBE3 of Example 1 as a representative example of a polymer film.
  • a 1% by weight, 2% by weight, 3% by weight or 4% by weight CBE3 aqueous solution was prepared, and 4 mL of this CBE3 aqueous solution was poured into a plastic tray provided with a silicone frame (8 cm ⁇ 10 cm). The plastic tray was dried at 4 ° C. or room temperature until the water was gone to obtain a recombinant gelatin film.
  • the above-mentioned recombinant gelatin film was taken out from the plastic tray / silicone frame, and thermally crosslinked at 160 ° C. under reduced pressure (crosslinking time was 6 hours, 12 hours, 24 hours) to obtain an insoluble recombinant gelatin film sample.
  • the swelling ratio was evaluated as a physical property value for each of the recombinant gelatin films produced in the above (2).
  • a recombinant gelatin film was cut out with a biopsy tray with a diameter of 8 mm to prepare a disc-like film with a diameter of 8 mm.
  • the thickness at the time of drying was measured and it was set as the film thickness at the time of drying.
  • the disk-like film was sufficiently wetted with water for injection, and then the wet thickness was measured to obtain a wet film thickness.
  • the film thickness was measured using a micrometer (Mitsutoyo manufactured soft touch micro CLM).
  • the swelling ratio ((Swelling film thickness [ ⁇ m] / drying film thickness [ ⁇ m]) ⁇ 100) was calculated from the wet film thickness and the dry film thickness.
  • the polymer film has a swelling ratio ((film thickness when swollen [ ⁇ m] / film thickness when dried [ ⁇ m]) ⁇ 100) ⁇ ⁇ 27.5 ⁇ film thickness when dried [ ⁇ m] +880 Is preferably Swelling ratio ((film thickness when swollen [ ⁇ m] / film thickness when dried [ ⁇ m]) x 100) -2 -27.5 ⁇ film thickness when dried [ ⁇ m] + 962.5 It was found to be more preferable.
  • Fig. 2 shows a schematic diagram of the test system and the results.
  • an albumin solution in which albumin was dissolved in PBS (phosphate buffered saline) at 41 mg / mL was placed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • various polymer films were placed, and the amount of albumin permeating to the lower solution (PBS) was measured over time.
  • Bio-Rad Protein Assay BIO-RAD
  • the permeated albumin maintains the same molecular weight of 66 kDa as the upper solution. I understood. Moreover, it was also confirmed that there is a large difference in the amount of albumin permeated between the film group having high protein permeability and the film group having low protein permeability.
  • a recombinant gelatin film swollen with the same medium is placed on the bottom of a 6 mm diameter silicone frame, and rat skeletal myoblasts are seeded at 1.3 ⁇ 10 6 cells in the same manner as above, 37 ° C., 5% CO 2
  • a laminate of a recombinant gelatin film and a cell sheet was obtained.
  • the left ventricular short axis image is drawn at the papillary muscle level with an echocardiography device (HD11XE, Philips Electronics Japan Co., Ltd.), and the left ventricular end diastolic cross section (hereinafter referred to as LVEDA) and the left ventricular end systolic cross section
  • LVEDA left ventricular end diastolic cross section
  • FAC left ventricular cavity area change rate
  • LVESA left ventricular cavity area change rate
  • the group to which the laminate of the polymer film and the cell sheet was transplanted was found to maintain the value of FAC until 12 weeks after transplantation and maintain cardiac function.
  • 3 out of 4 mice died of heart failure by 12 weeks after transplantation, and FAC of individuals who survived 12 weeks after transplantation was also significantly reduced.
  • transplantation of a laminate of a polymer film and a cell sheet maintains cardiac function and has an effect of improving the survival rate. Furthermore, since there was no significant difference in FAC value between the group in which the laminate of the polymer film and the cell sheet was transplanted and the group in which the cell sheet was transplanted, the polymer film and the cell sheet were laminated. Even when the body was transplanted, it was considered that the therapeutic effect of the cell transplantation was not inhibited compared to the case where the cell sheet was transplanted.
  • Myosin Heavy Chain positive skeletal myoblasts remained in layers in an individual to which a laminate of a polymer film and a cell sheet was transplanted.
  • These Myosin Heavy Chain positive cells had a sarcomere structure characteristic of skeletal muscle cells, and it was considered that skeletal myoblasts engrafted and matured into skeletal muscle cells.
  • the survival of such transplanted cells could not be confirmed in individuals transplanted with the cell sheet, by transplanting the laminate of the polymer film and the cell sheet, the condition of the cells after transplantation can be improved. It was thought that the engraftment of transplanted cells could be promoted by maintaining and improving blood flow from the heart including angiogenesis.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)

Abstract

本発明の課題は、強度があり、移植時または輸送時のハンドリングが容易である細胞シートを含有する積層体、並びに上記積層体を用いた心疾患治療剤、および細胞シート積層用フィルムを提供することである。本発明によれば、５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２の生体親和性高分子フィルムと、上記生体親和性高分子フィルムの少なくとも一方の表面上に配置された細胞シートとを含む、積層体、並びに上記積層体を用いた心疾患治療剤、および細胞シート積層用フィルムが提供される。

Description

細胞シートを含有する積層体、心疾患治療剤および細胞シート積層用フィルム
　本発明は、細胞シートと高分子フィルムから構成される積層体に関する。本発明はまた上記積層体を含む心疾患治療剤に関する。本発明はさらに、細胞シート積層用フィルムに関する。
　近年、多くの再生医療および細胞移植治療が実施されている。特に、細胞を細胞シートとして、細胞のみをシート状にして移植する治療が多く検討されている。個々の細胞を懸濁液として投与することに比べて、細胞シートは構造物として維持されることから、体内での生着が良く有効性が向上するとされている。特許文献１には、臨床への適用に障害となる製造工程由来不純物成分を含まない細胞培養液を用いた製造方法を提供することを目的として、実質的に増殖することなく細胞シートを形成し得る密度の細胞を、有効量の成長因子を含まない細胞培養液中で培養することを含む、細胞シートの製造方法が記載されている。
　一方、シート状でない個々の細胞については、細胞の支持体となる足場材料と細胞を組み合わせて移植することが検討されている。細胞の支持体となる足場材料としては、遺伝子組換えゼラチンが知られている。特許文献２には、細胞付着を伴う幾つかの用途、例えば、細胞培養作業、および足場依存性細胞の細胞培養を伴う用途、ならびに多様な医療用途にも特に有用な、遺伝子組換えゼラチンが記載されている。
特開２０１０－８１８２９号公報 国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報
　細胞のみでシートを作製する場合、細胞シートは非常にもろく、初期の形状を維持しにくいという問題やハンドリングが困難になるという問題がある。細胞シートの移植においては上記の問題を解決することが望まれている。本発明は、強度があり、移植時または輸送時のハンドリングが容易である細胞シートを含有する積層体を提供することを解決すべき課題とする。本発明は上記積層体を用いた心疾患治療剤、および細胞シート積層用フィルムを提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞シートに５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２の生体親和性高分子フィルムを積層することによって、細胞シートの強度およびハンドリング性能を高めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］　５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２の生体親和性高分子フィルムと、上記生体親和性高分子フィルムの少なくとも一方の表面上に配置された細胞シートとを含む、積層体。
［２］　生体親和性高分子フィルムが、下記式１を満たす、［１］に記載の積層体。
式１：（膨潤時膜厚／乾燥時膜厚）×100≧－27.5×乾燥時膜厚＋880
但し、膨潤時膜厚および乾燥時膜厚の単位はμｍである。
［３］　生体親和性高分子フィルムが、下記式２を満たす、［１］または［２］に記載の積層体。
式２：（膨潤時膜厚／乾燥時膜厚）×100≧－27.5×乾燥時膜厚＋962.5
但し、膨潤時膜厚および乾燥時膜厚の単位はμｍである。
［４］　生体親和性高分子フィルムの下記式３で示される膨潤率が２３０％以上である、［１］～［３］の何れか一に記載の積層体。
式３：（膨潤時膜厚／乾燥時膜厚）×100
但し、膨潤時膜厚および乾燥時膜厚の単位はμｍである。
［５］　生体親和性高分子フィルムの乾燥時膜厚が、５～２００μｍである、［１］～［４］のいずれか一に記載の積層体。
［６］　生体親和性高分子フィルムの湿潤時膜厚が、５０～５００μｍである、［１］～［５］のいずれか一に記載の積層体。
［７］　細胞が、心筋細胞または骨格筋芽細胞である、［１］～［６］のいずれか一に記載の積層体。
［８］　生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、［１］～［７］のいずれか一に記載の積層体。
［９］　リコンビナントゼラチンが、下記式４で示される、［８］に記載の積層体。
式４：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸のいずれかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸のいずれかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
［１０］　リコンビナントゼラチンが、下記式５で示される、［８］または［９］に記載の積層体。
式５：　Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
［１１］　リコンビナントゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、［８］～［１０］のいずれか一に記載の積層体。
［１２］　リコンビナントゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、［８］～［１１］のいずれか一に記載の積層体。
［１３］　［１］～［１２］のいずれか一に記載の積層体を含む、心疾患治療剤。
［１４］　５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２の生体親和性高分子フィルムからなる、細胞シート積層用フィルム。
［１５］　心疾患の治療において使用するための、［１］～［１２］のいずれか一に記載の積層体。
［１６］　心疾患治療剤の製造のための、［１］～［１２］のいずれか一に記載の積層体の使用。
［１７］　［１］～［１２］のいずれか一に記載の積層体を、心疾患治療を必要とする対象に移植することを含む、心疾患の治療方法。
　本発明の積層体によれば、細胞シートの強度およびハンドリング性能を高めることができる。本発明の心疾患治療剤によれば、心疾患を治療することができる。本発明の細胞シート積層用フィルムは、本発明の積層体の製造において有用である。
図１は、高分子フィルムのハンドリング性能評価の結果を示す。 図２は、高分子フィルムの蛋白質透過試験について、試験系の模式図と試験結果を示す。 図３は、高分子フィルムの蛋白質透過試験の結果を示す。 図４は、高分子フィルムの蛋白質透過性を膨潤率と乾燥時膜厚のグラフにプロットした結果を示す。 図５は、梗塞モデルへの移植後の左室内腔面積変化率(FAC)の変化を示す。 図６は、骨格筋芽細胞をミオシン重鎖（Myosin Heavy Chain：MHC）の免疫染色で確認した結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜積層体＞
　本発明の積層体は、５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２の生体親和性高分子フィルムと、上記生体親和性高分子フィルムの少なくとも一方の表面上に配置された細胞シートとを含む積層体である。本明細書において、生体親和性高分子フィルムは高分子フィルムとも言う。
　本発明の積層体の具体例としては、１枚の生体親和性高分子フィルムと１枚の細胞シートとを含む積層体（即ち、生体親和性高分子フィルムの一方の表面上のみに細胞シートが存在する積層体）、並びに２枚の細胞シートの間に１枚の生体親和性高分子フィルムが存在する積層体（即ち、生体親和性高分子フィルムの両方の表面上に細胞シートが存在する積層体）を挙げることができるが、特に限定されない。
［生体親和性高分子フィルム］
（生体親和性高分子フィルムの特性）
　本発明で用いる生体親和性高分子フィルムの密度は、５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２である。密度を上記の範囲内とすることにより、十分な強度を有する積層体を製造することが可能になる。生体親和性高分子フィルムの密度は、好ましくは５００μｇ／ｃｍ２～５．０ｍｇ／ｃｍ２であり、より好ましくは５００μｇ／ｃｍ２～２．０ｍｇ／ｃｍ２である。
　生体親和性高分子フィルムの密度は、作製時の「塗布質量÷塗布面積」で算出する。なお、塗布質量とは塗布された生体親和性高分子の質量を意味する。
　本発明で用いる生体親和性高分子フィルムは、好ましくは下記式１を満たす。
式１：（膨潤時膜厚／乾燥時膜厚）×100≧－27.5×乾燥時膜厚＋880
但し、膨潤時膜厚および乾燥時膜厚の単位はμｍである。
　式１を満たすことにより、生体親和性高分子フィルムのハンドリング性能がより向上するので好ましい。なお、生体親和性高分子溶液を乾燥させてフィルムを作製する際に、４℃でゲル化させた状態のまま乾燥させてフィルムを作製する場合には上記式１を満たす生体親和性高分子フィルムが得られ、ハンドリング性能がより向上する。一方、室温（２５℃）で乾燥させることによって生体親和性高分子フィルムを作製すると、上記式１を満たさない生体親和性高分子フィルムが得られる。
　本発明で用いる生体親和性高分子フィルムは、より好ましくは下記式２を満たす。
式２：（膨潤時膜厚／乾燥時膜厚）×100≧－27.5×乾燥時膜厚＋962.5
但し、膨潤時膜厚および乾燥時膜厚の単位はμｍである。
　式２を満たすことにより、生体親和性高分子フィルムのハンドリング性能は、式１を満たす場合と比較して、さらに向上する。
　乾燥時膜厚は、乾燥した生体親和性高分子フィルムの厚さをマイクロメータ（ミツトヨ製ソフトタッチマイクロCLMなど）で測定したものである。膨潤時膜厚は、注射用水で十分に湿潤した生体親和性高分子フィルムの厚さをマイクロメータで測定したものである。
　本発明で用いる生体親和性高分子フィルムの下記式３で示される膨潤率は、好ましくは２３０％以上である。
式３：（膨潤時膜厚／乾燥時膜厚）×１００
但し、膨潤時膜厚および乾燥時膜厚の単位はμｍである。
　式３で示される膨潤率を２３０％以上とすることにより、タンパク質（実施例では６６ｋＤａのタンパク質）の透過性を向上させることができる。即ち、細胞の浸潤防止とタンパク質（栄養成分など）の透過の両立を達成することができるので、好ましい。
　式３で示される膨潤率は、より好ましくは２５０％以上であり、さらに好ましくは２７０％以上であり、特に好ましくは３００％以上である。式３で示される膨潤率の上限は特に限定されないが、一般的には１０００％以下である。
　生体親和性高分子フィルムの乾燥時膜厚は、特に限定されないが、好ましくは５～２００μｍであり、より好ましくは１０～１００μｍであり、さらに好ましくは２０～５０μｍであり、特に好ましくは２０～４０μｍである。
　生体親和性高分子フィルムの湿潤時膜厚は、特に限定されないが、好ましくは５０～５００μｍである。上記の範囲とすることにより、生体親和性高分子フィルムの反りを防止することができる。生体親和性高分子フィルムの湿潤時膜厚は、より好ましくは５０～３００μｍであり、さらに好ましくは１００～３００μｍである。
（生体親和性高分子）
　生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性高分子として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、シリコーン、およびＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性高分子としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、およびキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、または「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
　リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチンまたは化学合成ゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンから作られたゼラチンを意味する。
　化学合成ペプチドまたは化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチドまたはゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記するリコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
　本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ４）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図－基礎と応用－」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
　本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ吸水性が高くなる。
　本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（ＧＲＡＶＹ）値で表される親疎水性指標が、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
　本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
（リコンビナントゼラチン）
　生体親和性高分子は、好ましくは、リコンビナントゼラチンである。
　リコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質であり、好ましくはコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体である。
　リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列（ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
　リコンビナントゼラチンとしては、例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
　リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度および分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
　リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
　リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙの繰り返し構造である。
　一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が好ましくは５％以上２０％未満であり、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
　一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有するものでもよい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間、好ましくは２５～６０の間で均一でないことが好ましい。
　この最小アミノ酸配列の含有量は、タンパク質１分子中３～５０個が好ましく、さらに好ましくは４～３０個、特に好ましくは５～２０個である。最も好ましくは１２個である。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、さらに好ましくは少なくとも０．８％であり、さらに一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、さらに好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
　リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
　好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、下記式４で示される。
式４：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸のいずれかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸のいずれかを示す。ｎは３～１００の整数が好ましく、１５～７０の整数がさらに好ましく、５０～６５の整数が最も好ましい。ｍは好ましくは２～１０の整数を示し、より好ましくは３～５の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
　より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、下記式５で示される。
式５：　Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ
式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
　繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、またはV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、またはIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
　本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、さらに好ましくは７～９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
　リコンビナントゼラチンは、特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上）の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列：
を有する。
　リコンビナントゼラチンは、最も好ましくは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
　本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
　２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
　リコンビナントゼラチンは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するアミノ酸配列を有するものでもよい。
　「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　リコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
（生体親和性高分子フィルムの製造方法）
　生体親和性高分子フィルムの製造方法は特に限定されず、生体親和性高分子フィルムは常法により製造することができる。例えば、生体親和性高分子の水溶液を、プラスチックトレーに流し込み、低温下（例えば、４℃の冷蔵庫中など）または室温において乾燥することにより生体親和性高分子フィルムを製造することができる。好ましくは、生体親和性高分子の水溶液は、低温下（例えば、４℃の冷蔵庫中など）において乾燥する。
　生体親和性高分子フィルムにおける生体親和性高分子は架橋することができる。
　一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
　酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
　架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、－１００℃～５００℃であり、より好ましくは０℃～３００℃であり、さらに好ましくは５０℃～３００℃であり、さらに一層好ましくは１００℃～２５０℃であり、特に好ましくは１２０℃～２００℃である。
　架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応時間は特に限定されないが、一般的には１時間から７２時間であり、好ましくは２時間から４８時間であり、より好ましくは４時間から３６時間である。
［細胞シート］
　本発明における細胞シートとは、細胞を主成分とするシートを意味する。細胞シートは、細胞が互いに連結してシート状になったものであり、シート形状である限り、その構成は特に限定されず、単層細胞シート、二層以上の細胞で形成されたシート、または三次元培養された細胞で形成されたシートの何れでもよい。
　細胞同士は、直接および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも機械的に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞シートを構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも機械的に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。
　本発明における細胞シートには、細胞シートを形成し得る任意の細胞が含まれる。細胞の例としては、特に限定されず、心筋細胞、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞）、線維芽細胞、滑膜細胞、上皮細胞、および内皮細胞などが含まれる。上記の中でも好ましくは、心筋細胞、および骨格筋芽細胞である。細胞としては、細胞シートによる治療が可能な任意の生物に由来する細胞を使用することができる。生物は、特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（サルなど）、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットおよびハムスターなどが挙げられる。また、用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。細胞シートを形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、細胞シート製造終了時において、好ましくは２５％以上であり、より好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは６０％以上である。
　細胞シートは、公知の細胞シートの製造方法またはそれに準ずる方法で製造することができる。例えば、細胞を培養皿で培養し、細胞がシート状になったら、シートを培養皿から回収すればよい。上記の通り、細胞シートの製造方法は特に限定されないが、一例としては、特開２０１０－８１８２９号公報に記載の方法により細胞シートを製造することができる。具体的には、実質的に増殖することなく細胞シートを形成し得る密度の細胞を、有効量の成長因子を含まない細胞培養液中で培養することによって、細胞シートを製造してもよい。
 「実質的に増殖することなく細胞シートを形成し得る密度」とは、成長因子を含まない培養液で培養した場合に、細胞シートを形成することができる細胞密度を意味する。例えば、骨格筋芽細胞の場合、成長因子を含む培養液を用いる従来法では、細胞シートを形成するために、約６，５００個／ｃｍ２の密度の細胞をプレートに播種していたが、上記密度の細胞を、成長因子を含まない培養液で培養しても細胞シートを形成することはできない。例えば、骨格筋芽細胞については、「実質的に増殖することなく細胞シートを形成し得る密度」は、典型的には３００，０００個／ｃｍ２以上である。細胞密度の上限は、細胞シートの形成が損なわれず、細胞が分化に移行しなければ特に制限されないが、骨格筋芽細胞については、例えば、１，１００，０００個／ｃｍ２である。当業者であれば、適切な細胞密度を、実験により適宜決定することができる。培養期間中、細胞は増殖してもしなくてもよいが、増殖するとしても、細胞の性状が変化する程には増殖しない。例えば、骨格筋芽細胞はコンフルエントになると分化を開始する。骨格筋芽細胞は、細胞シートは形成するが、分化に移行しない密度で播種されることが好ましい。好ましくは、細胞は計測誤差の範囲を超えて増殖しない。細胞が増殖したか否かは、例えば、播種時の細胞数と、細胞シート形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本態様において、細胞シート形成後の細胞数は、典型的には播種時の細胞数の３００％以下、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、さらに好ましくは１２５％以下、特に好ましくは１００％以下である。
　一例としては、細胞の培養は、所定の期間内、好ましくは、細胞が分化に移行しない期間内に行われる。この場合、細胞は、培養期間中、未分化の状態に維持される。細胞の分化への移行は、当業者に知られた任意の方法で評価することができる。例えば、骨格筋芽細胞の場合は、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）の発現や、細胞の多核化を分化の指標とすることができる。培養時間は、好ましくは４８時間以内であり、より好ましくは４０時間以内であり、さらに好ましくは２４時間以内である。
　成長因子は、細胞の増殖を、それがない場合に比べて促進する任意の物質を意味し、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、または線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などを含む。
　有効量の成長因子とは、細胞の増殖を、成長因子がない場合に比べて、有意に促進する成長因子の量、または、便宜的に、本技術分野において細胞の増殖を目的として通常添加する量を意味する。細胞増殖促進の有意性は、例えば、本技術分野で知られた任意の統計学的手法、例えば、ｔ検定などにより適宜評価することができ、また、通常の添加量は本技術分野の種々の公知文献から知ることができる。具体的には、骨格筋芽細胞の培養におけるＥＧＦの有効量は、例えば０．００５μｇ／ｍＬ以上である。
  従って、「有効量の成長因子を含まない」とは、培養液における成長因子の濃度がかかる有効量未満であることを意味する。例えば、骨格筋芽細胞の培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは０．００５μｇ／ｍＬ未満、より好ましくは０．００１μｇ／ｍＬ未満である。好ましい態様においては、培養液における成長因子の濃度は、生体における通常の濃度未満である。かかる態様においては、例えば、骨格筋芽細胞の培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは５．５ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは１．３ｎｇ／ｍＬ未満、さらに好ましくは、０．５ｎｇ／ｍＬ未満である。さらに好ましい態様において、本発明における培養液は、成長因子を実質的に含まない。ここで、実質的に含まないとは、培養液中の成長因子の含量が、細胞シートを生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液に成長因子を積極的に添加しないことを意味する。従って、この態様においては、培養液は、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度の成長因子を含まない。
  細胞培養液（単に「培養液」と呼ぶ場合もある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。例えば、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＭＥＭ（イーグル最小必須培地）、Ｆ１２、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ(登録商標)、ＲＩＴＣ８０－７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。従って、基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものでもよい。
  基礎培地に含まれるアミノ酸としては、特に限定されず、例えば、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンなどが挙げられる。
　基礎培地に含まれるビタミン類としては、特に限定されず、例えば、Ｄ－パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ１２、アデニン、チミジンなどが挙げられる。
　基礎培地に含まれる電解質としては、特に限定されず、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮａＶＯ３、ＮｉＣｌ２、ＺｎＳＯ４などが挙げられる。
　基礎培地には、これらの成分のほか、Ｄ－グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬、プトレシンなどを含んでもよい。
  ヒトへの適用を想定した一例において、細胞培養液は、ステロイド剤成分を実質的に含まない。ここで「ステロイド剤成分」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。上記化合物としては、特に限定されず、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。従って、「ステロイド剤成分を実質的に含まない」とは、培養液における上記化合物の含量が、細胞シートを生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの化合物を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のステロイド剤成分を含まないことを意味する。
　ヒトへの適用を想定した一例において、細胞培養液は、異種血清成分を実質的に含まない。ここで「異種血清成分」は、レシピエントとは異なる種の生物に由来する血清成分を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清成分に該当する。従って、「異種血清成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの血清の含量が、細胞シートを生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度（例えば、細胞シート中の血清アルブミン含量が５０ｎｇ未満となる量）であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないことを意味する。
　ヒトへの適用を想定した一例において、細胞培養液は同種血清成分を含む。ここで「同種血清成分」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清成分を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清成分に該当する。同種血清成分が、自己血清成分、すなわち、レシピエントに由来する血清成分であることが好ましい。同種血清成分の含量は、細胞シートの形成を可能とする量であれば特に限定されないが、好ましくは５～４０ｖ／ｖ（容量／容量）％、より好ましくは１０～２０ｖ／ｖ（容量／容量）％である。
　一例において、細胞培養液は、セレン成分を実質的に含まない。ここで「セレン成分」は、セレン分子、およびセレン含有化合物、特に、生体内でセレン分子を遊離し得るセレン含有化合物、例えば、亜セレン酸などを含む。従って、「セレン成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの物質の含量が、細胞シートを生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のセレン成分を含まないことを意味する。具体的には、例えば、ヒトの場合、培養液中のセレン濃度は、ヒト血清中の正常値（例えば、１０．６～１７．４μｇ／ｄL）に、培地中に含まれるヒト血清の割合を乗じた値よりも低い（すなわち、ヒト血清の含量が１０％であれば、セレン濃度は、例えば、１．０～１．７μｇ／ｄL未満である）。
  細胞シートは、典型的には、細胞を培養液に播種する工程、および細胞を培養して細胞シートを形成させる工程により製造される。
  細胞の培養は、本技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。培養期間は、細胞シートの十分な形成、および、細胞分化防止の観点から、好ましくは４８時間以内、より好ましくは４０時間以内、さらに好ましくは２４時間以内である。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。
＜積層体の製造方法＞
  本発明の積層体の製造方法としては、細胞シートと生体親和性高分子フィルムとを積層させることができる方法であれば、特に限定されない。例えば、細胞シートと生体親和性高分子フィルムとを別々に作製した後に、細胞シートの表面に生体親和性高分子フィルムを積層化してもよいし、あるいは生体親和性高分子フィルムの表面に細胞シートを積層化してもよい。あるいは、生体親和性高分子フィルムを予め作製した後に、生体親和性高分子フィルムの表面上に細胞を播種して培養することによって細胞シートを形成することによって積層体を調製してもよい。
＜心疾患治療剤＞
　本発明の積層体は、対象の疾病、傷病の治療に用いることができる。例えば、骨格筋芽細胞による細胞シートは、心疾患治療剤として使用することができる。心疾患としては、例えば、心筋梗塞、虚血性心筋症、拡張型心筋症、狭心症などが挙げられる。
　本発明の積層体を含む心疾患治療剤の投与方法としては、例えば、障害を受けた心筋組織の障害部位に心疾患治療剤を直接貼り付ける方法などが挙げられる。
　本発明の積層体を含む心疾患治療剤の投与対象は特に限定されないが、好ましくはヒト、非ヒト霊長類（サルなど）、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウスおよびハムスターなどが挙げられ、より好ましくはヒトである。
＜細胞シート積層用フィルム＞
　上記した通り、５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２の生体親和性高分子フィルムは、細胞シートに積層することによって、本発明の積層体を製造することができる。従って、本発明によれば、５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２の生体親和性高分子フィルムからなる細胞シート積層用フィルムが提供される。生体親和性高分子フィルムの詳細および好ましい態様は本明細書中上記した通りである。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
（１）リコンビナントゼラチン
　リコンビナントゼラチンとして以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：　ＧＡＰ［（ＧＸＹ）６３］３Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：－０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
（２）リコンビナントゼラチンフィルムの作製
　高分子フィルムの代表例として、実施例１のＣＢＥ３を用いてリコンビナントゼラチンフィルムを作製した。１質量％、２質量％、３質量％または４質量％のＣＢＥ３水溶液を調製し、このＣＢＥ３水溶液４ｍＬを、シリコーン枠（８ｃｍ×１０ｃｍ）を設置したプラスチックトレーに流し込んだ。このプラスチックトレーを４℃または室温にて、水分が無くなるまで乾燥させることによって、リコンビナントゼラチンフィルムを得た。
　上記のリコンビナントゼラチンフィルムをプラスチックトレー／シリコーン枠から取り出し、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は６時間、１２時間、２４時間）を施し、不溶性のリコンビナントゼラチンフィルム試料を得た。
　上記のような作製方法で、５００μｇ／ｃｍ２、１ｍｇ／ｃｍ２、１．５ｍｇ／ｃｍ２および２．０ｍｇ／ｃｍ２のリコンビナントゼラチンフィルムを得た。リコンビナントゼラチンフィルムの密度は、作製時の「塗布質量÷塗布面積」で算出した。なお、塗布質量とは塗布されたリコンビナントゼラチンの質量を意味する。
（３）高分子フィルムの膨潤率の評価
　上記（２）で作製した各々のリコンビナントゼラチンフィルムについて、物性値として膨潤率の評価を行った。評価にあたっては、リコンビナントゼラチンフィルムを直径８ｍｍの生検トレパンでくり貫き、直径８ｍｍの円盤状フィルムを用意した。この際、乾燥時の厚さを測定し乾燥時膜厚とした。この円盤状フィルムを注射用水で十分に湿潤させた後に、湿潤時の厚さを測定し湿潤時膜厚とした。なお、膜厚の測定は、マイクロメータ（ミツトヨ製ソフトタッチマイクロCLM）を用いて行った。
　この湿潤時膜厚と乾燥時膜厚から、膨潤率（（膨潤時膜厚［μｍ］／乾燥時膜厚［μｍ］）×100）を算出した。
（４）高分子フィルムのハンドリング性能の評価
　上記（３）のようにして得た湿潤状態の円盤状フィルムを用いてハンドリング性能の評価を実施した。この湿潤状態の円盤状フィルムの片側をピンセットでつまみ水平に持ち上げた場合、フィルムが水平を維持している場合をＡ、フィルムの先（ピンセットから遠い側）が下に垂れ３０度以上曲がる場合をＢ、半分に折りたたまれる場合をＣとしてハンドリング性能を評価した。なお、ハンドリング性能の評価がＣであるフィルムも、所望により使用方法を工夫することにより（例えば、フィルムに枠をつけて使用するなど）、実用上は問題なく使用することができる。
　また、高分子フィルムを細胞シートに積層した場合のハンドリング性能は高分子フィルムのみの場合と同じ結果であった。
（５）膨潤率、乾燥時膜厚およびハンドリング性能の評価のまとめ
　上記（３）および（４）で評価した全ての結果を、膨潤率と乾燥時膜厚を縦軸と横軸に採ったグラフにプロットし、まとめた（図１）。また、個々の高分子フィルムのハンドリング性能評価（Ａ、Ｂ、Ｃ）をもとにプロットした点を群分けした（図１）。その結果、乾燥時膜厚と膨潤率のグラフにおいて、ハンドリング性能と相関する境界線を引くことが可能になる、ということが分かった。
　ハンドリング性能ＡとＢの境界には、
膨潤率（（膨潤時膜厚［μｍ］／乾燥時膜厚［μｍ］）×100）＝－27.5×乾燥時膜厚［μｍ］＋962.5
という境界線（境界線２）が存在することを見出した。
　ハンドリング性能ＢとＣの境界には、
膨潤率（（膨潤時膜厚［μｍ］／乾燥時膜厚［μｍ］）×100）＝－27.5×乾燥時膜厚［μｍ］＋880
という境界線（境界線１）が存在することを見出した。
　従って、高分子フィルムのハンドリング性能は、
高分子フィルムが、膨潤率（（膨潤時膜厚［μｍ］／乾燥時膜厚［μｍ］）×100）≧－27.5×乾燥時膜厚［μｍ］＋880
であることが好ましく、
膨潤率（（膨潤時膜厚［μｍ］／乾燥時膜厚［μｍ］）×100）≧－27.5×乾燥時膜厚［μｍ］＋962.5
であることがより好ましいことが分かった。
（６）高分子フィルムの蛋白質透過試験
　上記（２）で作製した高分子フィルムを用いて、蛋白質成分の透過試験を実施した。蛋白質成分としては代表的アルブミン（分子量６６ｋＤａ）を選択した。この蛋白質成分がフィルムを透過すれば、フィルムを介して栄養分のやり取りが可能になることを示している。
　図２に試験系の模式図とその結果を示した。上液としてアルブミンをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に４１ｍｇ／ｍＬで溶解させたアルブミン溶液を設置した。その下に各種高分子フィルムを設置し、下液（ＰＢＳ）へ透過してくるアルブミン量を経時的に測定した。アルブミンの測定はバイオ・ラッドプロテインアッセイ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社）を使用した。
　その結果、アルブミン分子は高分子フィルムを透過して、下液に出てくることが分かった（図２）。また、種々のフィルムを試験していく中で蛋白質透過性の高いフィルム群（ａ群）と、蛋白質透過性の低いフィルム群（ｂ群）が存在することが分かった。
（７）高分子フィルムの蛋白質透過試験（SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動））
　上記（６）で行った蛋白質透過試験について、アルブミンが分解せず、同じ分子量のままに上液から下液へ高分子フィルムフィルムを透過しているのか解析するために、SDS-PAGEを行い透過したアルブミンの分子量を確認した。
　その結果、図３に示すように、蛋白質の透過性が高いフィルム群でも、蛋白質の透過性が低いフィルム群でも、透過してきたアルブミンは上液と同様の６６ｋＤａの分子量を維持していることが分かった。また、蛋白質透過性の高いフィルム群と、蛋白質透過性の低いフィルム群では、透過したアルブミン量に大きな差があることも確認された。
（８）蛋白質透過性と、膨潤率、乾燥時膜厚
　上記（６）および（７）で確認された蛋白質の透過性を、高分子フィルムの物性で解析した。上記（３）で実施した膨潤率と乾燥時膜厚をそれぞれ縦軸と横軸に採用したグラフを作成し、そこに試験した高分子フィルムをプロットした。その上で、上記（６）および（７）のａ群とｂ群を群分けした（図４）。結果、ａ群とｂ群の間には、境界線として膨潤率＝２３０という境界が引けることが分かった。
　従って、蛋白質透過性の観点において、膨潤率≧２３０％の高分子フィルムを用いることで、蛋白質透過の高い構成を作り出せることが分かった。膨潤率≧２３０％の高分子フィルムとすることで、細胞が必要とする栄養素や液性因子を効果的に透過させやすい高分子フィルムとして高い治療効果を生むことが考えられる。
（９）細胞シート並びにリコンビナントゼラチンフィルムと細胞シートとの積層体の作製
　高分子フィルムと細胞シートとの積層体の代表例として、リコンビナントゼラチンフィルムと細胞シートとの積層体を作製した。DMEM low glucouse（Thermo Fisher Scientific社製）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Moregate社製）を２０容量％加えた培地にラット骨格筋芽細胞を懸濁させ、４８穴マルチウェル温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ：セルシード社）に１．３×１０６ｃｅｌｌｓずつ播種し、３７℃、５％　ＣＯ２条件下にて一晩培養後、培養皿を室温下に置くことで細胞シートを得た。
　同様に直径６ｍｍシリコーン枠の底面に同培地で膨潤させたリコンビナントゼラチンフィルムを設置し、ラット骨格筋芽細胞を上記と同様に１．３×１０６ｃｅｌｌｓずつ播種し、３７℃、５％　ＣＯ２条件下にて一晩培養することでリコンビナントゼラチンフィルムと細胞シートとの積層体を得た。
（１０）ラット梗塞モデルの作製
　生後８週齢の成体ラット（Ｌｅｗｉｓ系、雄、日本チャールスリバー社製）に対してイソフルラン（アッヴィ社製）で吸入麻酔を行い、気管チューブを挿入して小動物用ベンチレータで強制呼吸させた状態で心臓を露出させ、冠動脈（ＬＡＤ）を結紮し、閉胸した。１週間後心エコー装置（ＨＤ１１ＸＥ、フィリップスエレクトロニクスジャパン社製）にて乳頭筋レベルで心臓左室短軸画像を描出し、左室拡張末期断面積（以下、ＬＶＥＤＡという）および左室収縮末期断面積（以下、ＬＶＥＳＡという）から心機能（左室内腔面積変化率、以下ＦＡＣという）を測定し（下式参照）、ＦＡＣの値が６０％を下回っていた個体について梗塞モデルが成立していると判断し、移植に供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
（１１）積層体または細胞シートの移植
　梗塞モデル化した個体を、モデル作製処置と同様に麻酔処置を施した後、肋間を切開し心臓を露出させた。上記（９）で作製した高分子フィルムと細胞シートとの積層体、または細胞シートを心臓左室前壁部に移植した後、表面にフィブリン製剤（化学及血清療法研究所）を塗布した。フィブリン製剤が固まったことを確認した後、閉胸した（ｓｈａｍ群（偽群）はフィブリン製剤の塗布のみ）。実施数は、高分子フィルムと細胞シートとの積層体を移植した群は６匹、細胞シートを移植した群は４匹、ｓｈａｍ群４匹とした。
（１２）有効性の評価
　観察期間は、高分子フィルムと細胞シートとの積層体、または細胞シートを移植した後１２週間までとした。梗塞モデル作製処置前、モデル判定・移植時、移植３週後、移植４週後、移植８週後および移植１２週後に、心エコー検査を実施し、ＦＡＣの変化から有効性を判断した。また、各群はＴｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法にて多重比較を行い、ＦＡＣ変化の有意差を判定した。結果を図５に示す。
　高分子フィルムと細胞シートとの積層体を移植した群は、移植１２週後までＦＡＣの値が維持され、心機能が維持されていることが分かった。一方ｓｈａｍ群では、移植１２週後までに４匹中３匹が心不全で死亡し、また移植１２週後に生存していた個体のＦＡＣも大幅な低下が見られた。
　これらの結果から高分子フィルムと細胞シートとの積層体を移植することで心機能が維持され、生存率を高める効果があることが示された。さらに、高分子フィルムと細胞シートとの積層体を移植した群と、細胞シートを移植した群との間でＦＡＣ値に有意差が認められなかったことから、高分子フィルムと細胞シートとの積層体を移植した場合であっても、細胞シートを移植した場合と比較して、細胞移植の治療効果は阻害されないと考えられた。
（１３）病理解析
　１０質量％中性緩衝ホルマリンで移植後１２週目の心臓を固定後、輪切りにしたものをパラフィン包埋し、３～４μｍで薄切した。切片を脱パラフィンした後、０．３質量％過酸化水素加メタノールで処理し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロッキングを行った。Monoclonal Anti-skeletal Myosin(FAST) Clone MY-32、Mouse Ascites Fluid（Sigma-Aldrich社製）を混合して、冷蔵で一晩反応させ、二次抗体としてEnvision +Dual Link System-HRP（Dako社製）を用いて、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で可視化し、ヘマトキシリンで対比染色した。結果を図６に示す。
　その結果、高分子フィルムと細胞シートとの積層体を移植した個体で、Myosin Heavy Chain陽性の骨格筋芽細胞が層状に残存していることを確認した。これらのMyosin  Heavy Chain陽性細胞は、骨格筋細胞に特徴的なサルコメア構造を有しており、骨格筋芽細胞が生着し、骨格筋細胞に成熟したものと考えられた。一方、細胞シートを移植した個体では、このような移植細胞の残存は確認できなかったことから、高分子フィルムと細胞シートとの積層体を移植することで、移植後の細胞の状態を良好に保ち、血管新生を含む心臓からの血流供給を向上させることにより、移植細胞の生着を促進できると考えられた。
　また、高分子フィルムと細胞シートとの積層体の移植部周辺においてリンパ球などの炎症性単球の集積は認められず、高分子フィルムは免疫原性なく心表面へ移植可能であると考えられた。

Claims (14)

  1. ５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２の生体親和性高分子フィルムと、前記生体親和性高分子フィルムの少なくとも一方の表面上に配置された細胞シートとを含む、積層体。
  2. 生体親和性高分子フィルムが、下記式１を満たす、請求項１に記載の積層体。
    式１：（膨潤時膜厚／乾燥時膜厚）×100≧－27.5×乾燥時膜厚＋880
    但し、膨潤時膜厚および乾燥時膜厚の単位はμｍである。
  3. 生体親和性高分子フィルムが、下記式２を満たす、請求項１または２に記載の積層体。
    式２：（膨潤時膜厚／乾燥時膜厚）×100≧－27.5×乾燥時膜厚＋962.5
    但し、膨潤時膜厚および乾燥時膜厚の単位はμｍである。
  4. 生体親和性高分子フィルムの下記式３で示される膨潤率が２３０％以上である、請求項１～３の何れか一項に記載の積層体。
    式３：（膨潤時膜厚／乾燥時膜厚）×100
    但し、膨潤時膜厚および乾燥時膜厚の単位はμｍである。
  5. 生体親和性高分子フィルムの乾燥時膜厚が、５～２００μｍである、請求項１～４のいずれか一項に記載の積層体。
  6. 生体親和性高分子フィルムの湿潤時膜厚が、５０～５００μｍである、請求項１～５のいずれか一項に記載の積層体。
  7. 細胞が、心筋細胞または骨格筋芽細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の積層体。
  8. 生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１～７のいずれか一項に記載の積層体。
  9. リコンビナントゼラチンが、下記式４で示される、請求項８に記載の積層体。
    式４：　Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎ］ｍ－Ｂ
    式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸のいずれかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸のいずれかを示し、ｎは３～１００の整数を示し、ｍは２～１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
  10. リコンビナントゼラチンが、下記式５で示される、請求項８または９に記載の積層体。
    式５：　Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）６３］３－Ｇｌｙ
    式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
  11. リコンビナントゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、請求項８～１０のいずれか一項に記載の積層体。
  12. リコンビナントゼラチンが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、請求項８～１１のいずれか一項に記載の積層体。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の積層体を含む、心疾患治療剤。
  14. ５００μｇ／ｃｍ２～１０ｍｇ／ｃｍ２の生体親和性高分子フィルムからなる、細胞シート積層用フィルム。
     
PCT/JP2017/012285 2016-03-29 2017-03-27 細胞シートを含有する積層体、心疾患治療剤および細胞シート積層用フィルム WO2017170343A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018509315A JP6682620B2 (ja) 2016-03-29 2017-03-27 細胞シートを含有する積層体、心疾患治療剤および細胞シート積層用フィルム
EP17774880.3A EP3438246B1 (en) 2016-03-29 2017-03-27 Laminate containing cell sheet, agent for treating cardiac diseases, and film for being laminated on cell sheet
CN201780019950.0A CN109089422B (zh) 2016-03-29 2017-03-27 含有细胞片的层叠体、心脏疾病治疗剂及细胞片层叠用薄膜
US16/139,814 US20190008791A1 (en) 2016-03-29 2018-09-24 Laminate containing cell sheet, agent for treating cardiac diseases, and film for being laminated on cell sheet

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-065395 2016-03-29
JP2016065395 2016-03-29

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/139,814 Continuation US20190008791A1 (en) 2016-03-29 2018-09-24 Laminate containing cell sheet, agent for treating cardiac diseases, and film for being laminated on cell sheet

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017170343A1 true WO2017170343A1 (ja) 2017-10-05

Family

ID=59965548

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/012285 WO2017170343A1 (ja) 2016-03-29 2017-03-27 細胞シートを含有する積層体、心疾患治療剤および細胞シート積層用フィルム

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190008791A1 (ja)
EP (1) EP3438246B1 (ja)
JP (2) JP6682620B2 (ja)
CN (1) CN109089422B (ja)
WO (1) WO2017170343A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008538707A (ja) * 2005-04-06 2008-11-06 フジフィルム マニュファクチャリング ユーロプ ビー．ブイ． 細胞培養用非孔質フィルム
JP2010519251A (ja) * 2007-02-21 2010-06-03 フジフィルム・マニュファクチュアリング・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップ 組換えゼラチン
WO2014104366A1 (ja) * 2012-12-27 2014-07-03 新田ゼラチン株式会社 ヒト角膜内皮細胞シート
WO2014192909A1 (ja) * 2013-05-31 2014-12-04 ｉＨｅａｒｔ Ｊａｐａｎ株式会社 ハイドロゲルを組み込んだ積層化細胞シート

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2928727B2 (ja) * 1994-07-18 1999-08-03 グンゼ株式会社 保存、輸送に供する培養皮膚の処理方法
JP2001299326A (ja) * 2000-04-19 2001-10-30 Minoru Ueda 培養器
JP5257355B2 (ja) * 2007-05-11 2013-08-07 大日本印刷株式会社 寸法が保持された細胞シート、その製造方法、及びそのための細胞培養担体
US20120263681A1 (en) * 2011-04-12 2012-10-18 Fujifilm Corporation Composition comprising cell and biocompatible polymer
EP2962703B1 (en) * 2013-02-27 2020-08-19 FUJIFILM Corporation Cell construct for cell transplantation, biocompatible polymer block, and method for producing the same
JP6048858B2 (ja) * 2013-03-13 2016-12-21 国立研究開発法人物質・材料研究機構 接着性骨補填剤及び接着性骨補填剤キット

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008538707A (ja) * 2005-04-06 2008-11-06 フジフィルム マニュファクチャリング ユーロプ ビー．ブイ． 細胞培養用非孔質フィルム
JP2010519251A (ja) * 2007-02-21 2010-06-03 フジフィルム・マニュファクチュアリング・ヨーロッパ・ベスローテン・フエンノートシャップ 組換えゼラチン
WO2014104366A1 (ja) * 2012-12-27 2014-07-03 新田ゼラチン株式会社 ヒト角膜内皮細胞シート
WO2014192909A1 (ja) * 2013-05-31 2014-12-04 ｉＨｅａｒｔ Ｊａｐａｎ株式会社 ハイドロゲルを組み込んだ積層化細胞シート

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020099355A (ja) 2020-07-02
JP6920499B2 (ja) 2021-08-18
CN109089422A (zh) 2018-12-25
EP3438246A1 (en) 2019-02-06
EP3438246B1 (en) 2020-08-26
JPWO2017170343A1 (ja) 2019-01-17
EP3438246A4 (en) 2019-04-10
US20190008791A1 (en) 2019-01-10
JP6682620B2 (ja) 2020-04-15
CN109089422B (zh) 2022-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jansen et al. Zwitterionic PEG-PC hydrogels modulate the foreign body response in a modulus-dependent manner
US9211266B2 (en) Cell construct for cell transplantation and cell aggregate for cell transplantation
US20180361020A1 (en) Cell construct for cell transplantation, biocompatible polymer block, and method for producing the same
US9597432B2 (en) Cell construct comprising polymer blocks having biocompatibility and cells
JP6535072B2 (ja) 生体親和性高分子多孔質体の製造方法、生体親和性高分子多孔質体、生体親和性高分子ブロック並びに細胞構造体
JP5808631B2 (ja) 血管新生用足場、及び再生医療用の血管の製造方法
JP6330039B2 (ja) 細胞構造体及び細胞構造体の製造方法
JP5990298B2 (ja) 細胞移植用細胞構造体および細胞移植用細胞集合体
JP2021514744A (ja) 神経再生、骨形成、及び血管新生を刺激するためのヒドロゲル
JP2019030733A (ja) 管状構造物、管状構造物を製造するための装置、及び管状構造物の製造方法
JP6586160B2 (ja) 軟骨再生材料
JP6920499B2 (ja) 細胞シートを含有する積層体、心疾患治療剤および細胞シート積層用フィルム
US20200015475A1 (en) Cell mass or cell structure-embedding agent, cell mass or cell structure-containing composition, and kit
WO2017022613A1 (ja) 細胞構造体、非ヒトモデル動物、非ヒトモデル動物の製造方法、及び被験物質の評価方法
JP6903295B2 (ja) ライソゾーム病処置剤
Kim Enzymatically degradable versatile hydrogel platform for cell sheet engineering
Enomoto et al. Regenerative Therapy

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018509315

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017774880

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017774880

Country of ref document: EP

Effective date: 20181029

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17774880

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1