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WO2017159464A1 - 多能性幹細胞からの心臓前駆細胞と心筋細胞の製造方法 - Google Patents

多能性幹細胞からの心臓前駆細胞と心筋細胞の製造方法 Download PDF

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WO2017159464A1
WO2017159464A1 PCT/JP2017/009053 JP2017009053W WO2017159464A1 WO 2017159464 A1 WO2017159464 A1 WO 2017159464A1 JP 2017009053 W JP2017009053 W JP 2017009053W WO 2017159464 A1 WO2017159464 A1 WO 2017159464A1
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WO
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cells
expression
pluripotent stem
cell
tbx6
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Application number
PCT/JP2017/009053
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English (en)
French (fr)
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真樹 家田
威太郎 貞廣
まり 礒見
直樹 五島
Original Assignee
学校法人慶應義塾
国立研究開発法人産業技術総合研究所
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Publication date
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Priority to US16/084,432 priority patent/US20190078053A1/en
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing cardiac progenitor cells and cardiomyocytes from ES cells and iPS cells, and cardiac progenitor cells and cardiomyocytes produced by the method.
  • Heart disease continues to increase with aging, and the incidence of heart failure among men over 80 years old is as high as 14.7%.
  • the heart is composed of cells such as cardiomyocytes and fibroblasts, the cardiomyocytes responsible for the pulsatile function have little or no regenerative capacity, and so far, there are limited methods for treating heart disease. ing.
  • Non-Patent Document 1 a method for directly producing cardiomyocyte-like cells from fibroblasts without iPS cells by introducing three myocardial reprogramming factors (Gata4, Mef2c, Tbx5, hereinafter also referred to as GMT).
  • GMT myocardial reprogramming factors
  • Non-patent Document 3 a method of inducing cardiac progenitor cells and cardiomyocytes from pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells using humoral factors
  • Non-patent Document 4 a method of inducing cardiac progenitor cells using transcription factors
  • the method of inducing cardiac progenitor cells and cardiomyocytes using humoral factors from pluripotent stem cells has problems in terms of reproducibility and cost, so stable myocardial induced pluripotent stem cells by introducing transcription factors If a strain can be produced, it is clinically useful.
  • the method of inducing cardiac progenitor cells and cardiomyocytes from pluripotent stem cells using transcription factors so far uses serum and special culture conditions, but there is no report on serum-free medium.
  • the reports so far are only mouse cells, and there are no reports on methods for inducing cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in human cells.
  • Eomesodermin induces Mesp1 expression and cardiac differentiation from embryonic stem cells in the absence of Activin.
  • the present inventors have stably induced myocardial induction by introducing a Tbx6-expressing lentiviral vector capable of controlling expression with doxycycline into mouse ES cells and human iPS cells. Pluripotent stem cells were obtained. Then, the present inventors have obtained cardiac progenitor cells without using serum-free and humoral factors used in the conventional method by turning on the expression of Tbx6 by turning on the myocardial induced pluripotent stem cells. Furthermore, it was found that cardiomyocytes are induced in large amounts by turning off the expression of Tbx6. The present invention has been completed based on these findings.
  • the present invention is as follows.
  • [1] A method for producing cardiac progenitor cells from pluripotent stem cells, comprising expressing the Tbx6 gene in pluripotent stem cells.
  • [2] (i) a step of inducing cardiac progenitor cells from pluripotent stem cells, comprising expressing Tbx6 gene in pluripotent stem cells, and (ii) a step comprising suppressing expression of Tbx6 gene
  • a method for producing cardiomyocytes from pluripotent stem cells comprising a step of inducing cardiomyocytes from cardiac progenitor cells induced in i).
  • the step of expressing the Tbx6 gene in pluripotent stem cells comprises: Introducing into the pluripotent stem cell an expression cassette capable of inducing Tbx6 gene expression in response to an external stimulus; and the presence of the external stimulus in the pluripotent stem cell into which the expression cassette has been introduced.
  • the step of expressing the Tbx6 gene in pluripotent stem cells comprises: Introducing into the pluripotent stem cell an expression cassette capable of inducing Tbx6 gene expression in response to an external stimulus; and the presence of the external stimulus in the pluripotent stem cell into which the expression cassette has been introduced.
  • the step of suppressing the expression of the Tbx6 gene comprises: Culturing pluripotent stem cells into which an expression cassette capable of inducing expression of Tbx6 gene in response to an external stimulus is introduced in the absence of the external stimulus [2] to [5] ]
  • the pluripotent stem cells are ES cells or iPS cells.
  • the external factor is tetracycline or doxycycline.
  • An expression cassette capable of inducing the expression of the Tbx6 gene in response to an external stimulus has been introduced, and is induced in cardiac progenitor cells by culturing in the presence of the external stimulus. Capable stem cells.
  • An expression cassette capable of inducing the expression of the Tbx6 gene in response to an external stimulus is introduced, and after culturing in the presence of the external stimulus, culturing in the absence of the external stimulus Pluripotent stem cells from which cardiomyocytes are induced.
  • the pluripotent stem cells of [9] and [10] are cells containing the expression cassette since an expression cassette capable of inducing Tbx6 gene expression in response to external stimuli has been introduced. is there.
  • the present invention provides a method for inducing cardiac progenitor cells and cardiomyocytes from pluripotent stem cells.
  • the present invention also provides cells that induce cardiac progenitor cells and / or cardiomyocytes from pluripotent stem cells.
  • the myocardial induced pluripotent stem cell of the present invention can regulate the induction of cardiac progenitor cells and the induction of cardiomyocytes by turning on and off the expression of Tbx6, respectively.
  • a cardiac progenitor cell is converted from a mouse ES cell or a human iPS cell.
  • the method for producing cardiac progenitor cells and cardiomyocytes of the present invention has an efficiency 2 to 3 times higher than that of Eomes, which has been reported in the past, in mouse cells. Progenitor cells and cardiomyocytes can be produced.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a tetracycline gene expression regulation system.
  • FIG. 2 is a diagram showing the expression level of Tbx6 in the presence of doxycycline in cells into which Tbx6 has been introduced.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the addition timing of doxycycline in Example 4.
  • FIG. 4 shows cell lines of Example 4 without addition of doxycycline (“Off”), cell lines of Example 4 in which Tbx6 was induced by addition of doxycycline (“On”), and BMP4 on Day 4 (FIG. 3).
  • FIG. 4 is a diagram showing a GFP image of cardiac progenitor cells (“BMP4 / Activin”) differentiated from ES cells by Activin.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a tetracycline gene expression regulation system.
  • FIG. 2 is a diagram showing the expression level of Tbx6 in the presence of doxycycline in cells into which Tbx6 has been introduced.
  • FIG. 5 shows the cell line of Example 4 without addition of doxycycline (“Off”), the cell line of Example 4 with Tbx6 induced by addition of doxycycline (“On”), and BMP4 on Day 4 (FIG. 3).
  • FIG. 4 shows GFP expression in cardiac progenitor cells (“BMP4 / Activin”) differentiated from ES cells by Activin.
  • FIG. 6 shows the cell line of Example 4 without addition of doxycycline (“Off”), the cell line of Example 4 (“On”) in which Tbx6 was induced by addition of doxycycline, and BMP4 on Day 4 (FIG. 3).
  • FIG. 2 shows the expression of Flk-1 and PDGFR ⁇ in cardiac progenitor cells (“BMP4 / Activin”) differentiated from ES cells with Activin.
  • FIG. 7 shows the cell line of Example 4 without addition of doxycycline (“Dox Off”) on Day 14 (FIG. 3) and the cell line of Example 4 in which Tbx6 was induced by addition of doxycycline (“Dox On”). It is a figure which shows the image of (alpha) -actinin and cardiac troponin.
  • FIG. 8 shows the cell line of Example 4 without addition of doxycycline (“Off”), the cell line of Example 4 in which Tbx6 was induced by addition of doxycycline (“On”), and BMP4 on Day 14 (FIG. 3).
  • FIG. 8 shows the cell line of Example 4 without addition of doxycycline (“Off”), the cell line of Example 4 in which Tbx6 was induced by addition of doxycycline (“On”), and BMP4 on Day 14 (
  • FIG. 5 shows cardiac troponin expression in cardiac progenitor cells (“BMP4 / Activin”) differentiated from ES cells with Activin.
  • FIG. 9 shows the cell line of Example 4 without addition of doxycycline (“Off”), the cell line of Example 4 in which Tbx6 was induced by addition of doxycycline (“On”), and BMP4 on Day 14 (FIG. 3).
  • FIG. 4 is a graph showing the expression levels of actinin (Actn2), cardiac troponin (TnnT2), and Nkx2.5 in cardiac progenitor cells (“BMP4 / Activin”) differentiated from ES cells by Activin.
  • FIG. 10 is a diagram showing induction from human iPS cells into human cardiac progenitor cells and differentiation from the human progenitor cells into cardiomyocytes by Tbx6 expression.
  • the present invention relates to a cell that induces cardiac progenitor cells and cardiomyocytes from pluripotent stem cells (myocardial induced pluripotent stem cells).
  • the myocardial induced pluripotent stem cell of the present invention can regulate the induction of cardiac progenitor cells and the induction of cardiomyocytes by turning on / off the expression of Tbx6 in response to external stimuli.
  • the present invention relates to a method for producing cardiac progenitor cells from pluripotent stem cells by expressing Tbx6 gene in the pluripotent stem cells.
  • expression of Tbx6 gene is controlled by external stimulation such as doxycycline administration, and the expression cassette suppresses the expression and expression of Tbx6 gene in response to the external stimulation. Is called.
  • cardiac progenitor cells are induced by culturing in the presence of external stimuli of pluripotent stem cells introduced with the expression cassette. More preferably, cardiac progenitor cells can be induced by culturing pluripotent stem cells introduced with the expression cassette in the presence of external stimuli and in the absence of serum.
  • cardiac progenitor cells that express T, Flk-1, or PDGFR ⁇ which are genes specific to cardiac progenitor cells, are induced by inducing a single factor (Tbx6). Is induced.
  • Tbx6 a single factor
  • the proportion of cells expressing these cardiac progenitor cell-specific markers is similar to the proportion by the conventional method of inducing cardiac progenitor cells using Activin A or BMP4. Therefore, the method of the present invention can be said to be a method that can achieve the same induction efficiency at a lower cost and more easily than the conventional method.
  • cardiomyocytes are induced by suppressing the expression of Tbx6 gene after the expression of Tbx6 gene in pluripotent stem cells. That is, the present invention relates to a method for producing cardiomyocytes from pluripotent stem cells by suppressing the expression of Tbx6 gene after the expression of Tbx6 gene. Suppression of Tbx6 gene expression in pluripotent stem cells into which an expression cassette capable of inducing Tbx6 gene expression in response to external stimuli has been introduced is to culture the cells in the absence of external stimuli. Can be performed.
  • the induction from cardiac progenitor cells to cardiomyocytes in the present invention includes a step of suppressing the expression of the Tbx6 gene.
  • the cells may be cultured in the presence of bFGF or FGF10 as in the conventional method. Such culture induces pulsating mature cardiomyocytes.
  • bFGF fibroblast growth factor
  • FGF10 fibroblast growth factor
  • the method for producing cardiomyocytes of the present invention includes suppressing the expression of Tbx6 gene after the expression of Tbx6 gene in pluripotent stem cells.
  • functionally mature cardiomyocytes are induced when the expression of Tbx6 gene is suppressed after induction of cardiac progenitor cells under the absence of external stimuli such as drug administration cessation. .
  • the pluripotent stem cell used in the present invention may be either an embryonic stem (ES) cell or an induced pluripotent stem (iPS) cell.
  • ES embryonic stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • the stem cells may be those derived from mammals. Examples of mammals include, but are not limited to, humans, monkeys, horses, cows, sheep, goats, pigs, dogs, rats, mice and the like. In one embodiment of the invention, the stem cells are derived from humans, and in another embodiment are derived from non-human mammals such as mice.
  • ES cells are pluripotent stem cells collected from the inner cell mass of the embryo (Strelchenko N et al., (2004) Reprod Biomed Online. 9: 623-629.).
  • ES cells are not limited to primary cell lines collected from the inner cell mass, but may be ES cell lines that have already been cell-lined. Examples of cell line ES cell lines include cell lines distributed from cell populations obtained by growing ES cell lines already established, or lysed and cultured from a cryopreserved state. ES cell line and the like. If it is a cell line ES cell line, it can be obtained without going through the step of disrupting the fertilized egg.
  • the ES cell used in the present invention may be established using only a single blastomere of an embryo in the cleavage stage before the blastocyst stage without impairing the embryo developmental ability. .
  • Such ES cells can be obtained without destroying fertilized eggs (Klimanskaya I et al., (2006) Nature 444: 481-485; and Chung Y et al., (2008) Cell Stem Cell 2: 113-117).
  • Human-derived ES cell culture methods include, for example, RIKEN CDB / Human Stem Cell Research Support Laboratory Protocol (2008), Takahashi, K. et al. (Cell (2007), Nov 30: 131, pp.72861-872) and Thomson , JA et al. (Science (1998) Nov 6: 282, pp. 1145-1147).
  • RIKEN CDB Human Stem Cell Research Support Laboratory Protocol (2008)
  • Takahashi, K. et al. Cell (2007), Nov 30: 131, pp.72861-872
  • Thomson JA et al.
  • the iPS cells used in the present invention include several reprogramming genes (Oct3 / 4, Sox2, c-Myc, Klf4, NANOG) in somatic cells (fibroblasts, epithelial cells, etc.) of mammals (including humans).
  • somatic cells fibroblasts, epithelial cells, etc.
  • a gene such as LIN28 it is an undifferentiated pluripotent stem cell that has basically the same multipotency as an ES cell (JP 2009-165478; Takahashi K et al., ( 2006) Cell 126: 663-676; and Takahashi Ket et al., (2007) Cell 131: 861-872, etc.).
  • iPS cells can be cultured in the same manner as ES cells.
  • Tbx6 In the method for producing cardiac progenitor cells or cardiomyocytes of the present invention, a pluripotent stem cell is introduced with a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding Tbx6.
  • a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding Tbx6.
  • the amino acid sequence of Tbx6 and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence are known in the art.
  • Tbx6 polypeptide (Tbox transcription factor 6) is a transcription factor that binds to and recognizes the T box in the promoter region of some genes.
  • Amino acid sequences for Tbx6 polypeptides derived from various species, and nucleotide sequences encoding Tbx6 polypeptides are known.
  • Genbank accession number NM_004608.3 human, nucleotide sequence, SEQ ID NO: 1, CDS 61..1371)
  • NP_004599.2 human, amino acid sequence, SEQ ID NO: 2
  • NM_011538.2 humane, nucleotide sequence, sequence No. 3, CDS 25..1335)
  • NP_035668.2 (mouse, amino acid sequence, SEQ ID NO: 4) and the like can be referred to.
  • the Tbx6 polypeptide has at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, A polypeptide having an amino acid sequence having 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity and having a function of inducing cardiac progenitor cells when expressed in pluripotent stem cells Including.
  • the Tbx6 polypeptide has 1 to 50, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, and more preferably 1 to 20, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • 1 to 10 for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acids are deleted, substituted, inserted or added, or a combination thereof.
  • the Tbx6 polypeptide has at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, Has amino acid sequence encoded by nucleotide sequence with 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity and induces in cardiac progenitor cells when expressed in pluripotent stem cells A polypeptide having a function is included.
  • the Tbx6 gene (nucleic acid) has at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% nucleotide sequence with sequence identity and induced in cardiac progenitor cells when the encoded polypeptide is expressed in pluripotent stem cells
  • cardiac progenitor cells can be produced from pluripotent stem cells by using transcription factors and humoral factors such as BMP4, Activin A, and Wnt. In the present invention, it is not necessary to culture in the presence of such a humoral factor. In the present invention, the step of inducing cardiac progenitor cells from pluripotent stem cells is preferably cultured under serum-free conditions. Moreover, it is not necessary to combine such transcription factors with humoral factors.
  • the Tbx6 gene can be introduced into pluripotent stem cells in vitro.
  • the pluripotent stem cells are induced in cardiac progenitor cells or cardiomyocytes in vitro. Induced cardiac progenitor cells or cardiomyocytes can be introduced into an individual.
  • the Tbx6 gene can be introduced into pluripotent stem cells in vitro.
  • the pluripotent stem cell into which the Tbx6 gene has been introduced in vitro is introduced into the individual, and is induced into cardiac progenitor cells or cardiomyocytes in vivo.
  • the introduction of Tbx6 gene into pluripotent stem cells can be performed by introducing a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding Tbx6 into pluripotent stem cells.
  • the introduced pluripotent stem cells are induced into cardiac progenitor cells through the expression of Tbx6.
  • introducing a Tbx6 gene into a pluripotent stem cell can include introducing a Tbx6 polypeptide into the pluripotent stem cell.
  • the species from which Tbx6 is derived and the species from which the pluripotent stem cells are derived preferably match, for example, human and human.
  • the method for producing cardiac progenitor cells of the present invention can include a step of transforming pluripotent stem cells using Tbx6 gene.
  • the method for producing cardiac progenitor cells of the present invention can include a step of expressing a Tbx6 gene in pluripotent stem cells.
  • the method for producing cardiomyocytes of the present invention can include a step of suppressing the expression of Tbx6 gene following the step of expressing Tbx6 gene in pluripotent stem cells.
  • the expression of the Tbx6 gene can be time-specifically controlled by an expression cassette that regulates the expression in response to an external stimulus response.
  • an expression cassette is a nucleic acid construct including at least a promoter capable of inducing expression of a downstream gene in response to an external stimulus and a Tbx6 gene whose expression is controlled by the promoter.
  • the promoter is not particularly limited as long as it is a promoter capable of inducing expression of a downstream gene in response to an external stimulus.
  • a tetracycline antibiotic tetracycline or a tetracycline derivative such as doxycycline
  • the external stimulus is absence of a tetracycline antibiotic
  • a promoter capable of inducing expression of a downstream gene by dissociation of the tetracycline repressor can be mentioned.
  • ecdysteroid ecdysone, muristerone A, ponasterone A, etc.
  • the binding of ecdysteroid and the ecdysone receptor-retinoid receptor complex causes the downstream gene Examples include promoters that can induce expression.
  • FKCsA expression of downstream genes can be induced by binding of FKCsA to a Gal4 DNA binding domain fused to FKBP12-VP16 activator domain complex fused to cyclophilin A promoter is mentioned.
  • the sputum expression cassette may contain an enhancer, a silencer, a selectable marker gene (for example, a drug resistance gene such as a neomycin resistance gene), an SV40 replication origin, and the like as necessary. Further, those skilled in the art can consider an enhancer, a silencer, a selectable marker gene, a terminator, and the like in consideration of the type of the promoter to be used and the like by appropriately selecting from a known one and combining them at a desired expression level. An expression cassette capable of inducing the expression of the HPV-E6 / E7 gene can be constructed.
  • external stimulation includes culturing in the presence or absence of a drug.
  • the expression of a target gene is controlled in the presence of doxycycline using a tetracycline expression induction system (for example, Takara).
  • a vector is prepared so that the Tbx6 gene can be expressed under the control of a tetracycline-sensitive (Tet-On) promoter.
  • Tet-On tetracycline-sensitive
  • a Tet-On regulatory plasmid that expresses a reverse tetracycline-regulated transactivator (rtTA) is prepared, and the regulatory plasmid is introduced into the pluripotent stem cell.
  • rtTA reverse tetracycline-regulated transactivator
  • Tetracycline sensitive expression systems may be commercially available (eg, Knockout TM Tet RNAi System P (Clontech)) or Dickins RA. Et al., (Nature Genetics, 39 (7): 914-921 (2007 )).
  • the method for introducing the expression cassette into pluripotent stem cells is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used.
  • the expression cassette is inserted into an appropriate expression vector, viral infection using a viral vector such as a retrovirus vector or adenovirus vector, lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate method, DEAE dextran method, micro It can be performed by a known transformation method such as an injection method.
  • expression vectors examples include lentiviruses, retroviruses, herpesviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, Sendai virus and other viral vectors, and animal cell expression plasmids.
  • a lentivirus is preferable from the viewpoint that the introduction efficiency of sex stem cells into genomic DNA is extremely high.
  • a suitable addition concentration of doxycycline is 0.1 to 10 ⁇ g / ml, more preferably 1 to 2 ⁇ g / ml.
  • Examples of the culture medium that is used for induction into the cardiac progenitor cells or cardiomyocytes and to which the external stimulus is added include IMDM solution, a-MEM solution, and DMEM solution. Additives usually added to the culture may be included. However, in the induction to cardiac progenitor cells, it is not necessary to add serum, and in one embodiment of the present invention, induction to cardiac progenitor cells is performed in the absence of serum.
  • Pluripotent stem cells into which the Tbx6 gene has been introduced are subjected to external stimuli such as doxycycline from 0 (eg, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 hours) to Present for 4 days, preferably 0-3 days.
  • external stimuli such as doxycycline from 0 (eg, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 hours) to Present for 4 days, preferably 0-3 days.
  • pluripotent stem cells are induced into cardiac progenitor cells.
  • the induction of cardiac progenitor cells can be confirmed, for example, by the expression of a specific marker of cardiac progenitor cells within a certain period (for example, 4 days) from the start of induction.
  • the pluripotent stem cells are subsequently induced into cardiomyocytes as a result of terminating the presence of external stimuli.
  • the induction of cardiomyocytes is confirmed by, for example, expression of a specific marker of cardiomyocytes within a certain period (eg, 3 to 10 days, preferably 3 to 5 days) after the end of external stimulation. can do.
  • a specific marker of cardiomyocytes within a certain period (eg, 3 to 10 days, preferably 3 to 5 days) after the end of external stimulation.
  • a population of pluripotent stem cells is introduced with the Tbx6 gene and given external stimulation of doxycycline, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 30%, at least 50%, at least 70% of the population .
  • At least 90% have been confirmed to be induced into cardiac progenitor cells within 4 days from the start of induction, and cardiomyocytes within a period of 3 to 10 days, preferably 3 to 5 days after the end of external stimulation
  • the guidance to can be confirmed.
  • the method for producing cardiac progenitor cells or the method for producing cardiomyocytes of the present invention is performed after a certain period of time (for example, 0 to 4 days, preferably 0 to 3 days from the start of induction) of the Tbx6 gene introduction step into pluripotent stem cells.
  • the proportion of cardiac progenitor cells can be enriched by sorting the pluripotent stem cell population. By performing a sorting process on a pluripotent stem cell specific marker, a pluripotent stem cell specific protein, a pluripotent stem cell surface antigen, etc., if there is a residual pluripotent stem cell, it can be removed.
  • the ratio of each cell can also be enriched by performing the sorting process regarding the expression of a marker specific to cardiac progenitor cells or cardiomyocytes.
  • the method for producing cardiac progenitor cells or the method for producing cardiomyocytes of the present invention provides a means for a sorting step by including a step of introducing a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a detectable marker into a pluripotent stem cell, Alternatively, a means of confirming the induction of cardiac progenitor cells or cardiomyocytes can be provided.
  • the nucleotide sequence encoding the detectable marker is operably linked to a cardiac progenitor cell specific promoter or cardiomyocyte specific promoter, or the nucleotide sequence encoding a cardiac progenitor cell specific marker or cardiomyocyte specific Linked to the nucleotide sequence encoding the marker.
  • the detectable marker is, for example, a polypeptide that directly generates a detectable signal, for example, a fluorescent protein such as GFP, YEP, or BFP, or an enzyme that generates a detectable signal when acting on a substrate, for example, , Luciferase, alkaline phosphatase and the like.
  • a detectable signal for example, a fluorescent protein such as GFP, YEP, or BFP
  • an enzyme that generates a detectable signal when acting on a substrate for example, Luciferase, alkaline phosphatase and the like.
  • Examples of the cardiac progenitor cell specific promoter include Mesp1, T, and Flk1 (KDR) promoters.
  • promoters specific to cardiomyocytes include ⁇ -myosin heavy chain promoter and cTnT promoter.
  • Expression of the detectable marker can allow detection of cardiac progenitor cells or cardiomyocytes, so that confirmation of the induction of cardiac progenitor cells or cardiomyocytes, or sorting of induced cardiac progenitor cells or induced cardiomyocytes Can be provided.
  • operably linked refers to a functional link between nucleic acids that provides a desired function such as transcription, translation, and the like.
  • it includes a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence such as a promoter or signal sequence and a second polynucleotide.
  • the expression control sequence affects the transcription and / or translation of the second polynucleotide.
  • a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a Tbx6 polypeptide can be an expression cassette that enables the regulation of Tbx6 expression in pluripotent stem cells in response to an external stimulus.
  • the expression cassette is a viral construct, such as a recombinant adeno-associated virus construct (see, eg, US Pat. No. 7,078,387), a recombinant adenovirus construct, a recombinant lentivirus construct, and the like. .
  • Suitable expression vectors include viral vectors (eg, vaccinia virus-based viral vectors; polioviruses; adenoviruses (eg Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35: 2543 2549,1994; Borras et al., Gene Ther 6: 515 524,1999); Li and Davidson, PNAS 92: 7700 7704,1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5: 1088 1097,1999; International Patent Application Publication 94/12649, International Patent Application Publication 93/03769; International Patent Application Publication 93/19191; International Patent Application Publication 94/28938; see International Patent Application Publication 95/11984 and International Patent Application Publication 95/00655); Adeno-related viruses (eg, Ali et al., Hum Gene Ther 9: 81F86,1998, Flannery et al., PNAS 94: 6916).
  • viral vectors eg,
  • Suitable expression vectors are known in the art, and many are commercially available. The following vectors are presented for illustration, and for eukaryotic host cells include pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, and pSVLSV40 (Pharmacia). However, any other vector can be used as long as it is compatible with the host cell.
  • any of a number of suitable transcriptional and translational control elements may be used in the expression vector, such as constitutive and inducible promoters, transcription enhancer elements, transcription terminators, etc. (eg Bitter Et al. (1987) MethodsMethodin Enzymology, 153: 516-544).
  • the Tbx6 CDR sequence may be operably linked to a regulatory element, such as a transcriptional regulatory element, such as a promoter.
  • a regulatory element such as a transcriptional regulatory element, such as a promoter.
  • Transcriptional control elements function in eukaryotic cells, such as mammalian cells. Suitable transcription control elements include promoters and enhancers.
  • the promoter is inducible.
  • the expression cassette used in the method for producing cardiac progenitor cells or the method for producing cardiomyocytes of the present invention comprises an inducible promoter.
  • the inducible promoter contained in the expression cassette in the present invention induces expression of an operably linked gene in response to an external stimulus.
  • the Tbx6 nucleotide sequence is operably linked to a heart-specific transcriptional control element (TRE), where the TRE can include a promoter and an enhancer.
  • TREs include, but are not limited to, the following genes: TRE derived from myosin light chain-2, ⁇ -myosin heavy chain, AE3, cardiac troponin C, and cardiac actin (Franz et al., (1997) Cardiovasc.Res.35: 560-566; Robbins et al., (1995) Ann.NYAcad.Sci.752: 492-505; Linn et al., (1995) Circ.Res.
  • Expression vectors may contain ribosome binding sites for translation initiation and transcription initiation.
  • the expression vector may include appropriate sequences for amplifying expression.
  • suitable mammalian expression vectors include recombinant viruses, nucleic acid vectors such as plasmids, bacterial artificial chromosomes, yeast artificial chromosomes, human artificial chromosomes, cDNA, cRNA, and polymerase chain reaction.
  • PCR polymerase chain reaction
  • suitable promoters for driving the expression of nucleotide sequences encoding Tbx6 include, but are not limited to, inducible promoters, such as those containing Tet-operator elements.
  • the mammalian expression vector may encode a marker gene that facilitates identification or selection of transfected or infected cells.
  • marker genes are fluorescent proteins such as enhanced green fluorescent protein, Ds-Red (DsRed: Discosomasp. Red fluorescent protein (RFP); Bevis and Glick (2002) Nat. Biotechnol. 20:83), yellow fluorescent protein, and cyano A gene encoding a fluorescent protein; and a gene encoding a protein conferring resistance to a selective agent, such as, but not limited to, a neomycin resistance gene, a puromycin resistance gene, a blasticidin resistance gene, and the like.
  • suitable viral vectors include, but are not limited to, retroviral viral vectors (including lentiviruses); adenoviruses; and adeno-associated viruses.
  • retroviral vectors are murine moloney leukemia virus (MMLV) vectors; other recombinant retroviruses may also be used, such as avian leukemia virus, bovine leukemia virus, murine leukemia virus ( MLV), mink cell focus-inducing virus, murine sarcomeric virus, reticuloendotheliosis virus, gibbon leukemia virus, Mason Pfizer simian virus, or Rous sarcomeric virus, for example, see US Pat. No. 6,333,195.
  • the retroviral vector is a lentiviral vector (eg, human immunodeficiency virus-1 (HIV-1); simian immunodeficiency virus (SIV); or feline immunodeficiency virus (FIV));
  • lentiviral vector eg, human immunodeficiency virus-1 (HIV-1); simian immunodeficiency virus (SIV); or feline immunodeficiency virus (FIV)
  • HAV-1 human immunodeficiency virus-1
  • SIV simian immunodeficiency virus
  • FIV feline immunodeficiency virus
  • the recombinant retrovirus may include a viral polypeptide (eg, a retroviral env) to assist entry into the target cell.
  • a viral polypeptide eg, a retroviral env
  • the viral polypeptide may be an amphoteric viral polypeptide, such as an amphoteric env, which aids entry into cells derived from a number of species, including cells outside the original host species. To do.
  • the viral polypeptide may be a heterotrophic viral polypeptide that aids entry into cells outside the original host species.
  • the viral polypeptide is an ecotropic viral polypeptide, such as ecotropic env, which aids entry into the cells of the original host species.
  • VSV-g varicella stomatitis virus-g protein
  • HIV-1 env HIV-1 env
  • GALV gibbon leukemia virus
  • FeLV-C FeLV-C
  • FeLV-B FeLV10A1env gene
  • variants thereof including but not limited to chimeras. See, for example, Yee et al. (1994), Methods Cell Biol., PtA: 99-112 (VSV-G); US Pat. No. 5,449,614.
  • recombinant viruses are produced by introducing viral DNA or RNA constructs into producer cells.
  • the producer cell does not express a foreign gene.
  • the producer cell encodes one or more foreign genes, such as one or more gag, pol, or env polypeptides and / or one or more retroviral gag, pol, or env polypeptides.
  • Retroviral packaging cells may contain genes encoding viral polypeptides, such as VSV-g that assists in entry into target cells.
  • the packaging cell contains a gene encoding one or more lentiviral proteins, such as gag, pol, env, vpr, vpu, vpx, vif, tat, rev, or nef.
  • the packaging cell contains a gene encoding an adenoviral protein, such as E1A or E1B or other adenoviral proteins.
  • proteins supplied by the packaging cell include retroviral derived proteins such as gag, pol, and env; lentiviral derived proteins such as gag, pol, env, vpr, vpu, vpx, vif, tat, rev, and nef; and adenovirus-derived proteins such as E1A and E1B.
  • the packaging cell supplies a protein derived from a different virus than the virus from which the viral vector was derived.
  • Packaging cell lines include, but are not limited to, any readily transfectable cell line.
  • the packaging cell line can be based on the 293T cell, NIH3T3, COS or HeLa cell line.
  • Packaging cells are frequently used to package viral vector plasmids that have a deletion in at least one gene encoding a protein required for viral packaging. Any cell capable of supplying a protein or polypeptide deleted from the protein encoded by such a viral vector plasmid may be used as the packaging cell.
  • Examples of packaging cell lines include, but are not limited to, Platinum-E (Plat-E); Platinum-A (Plat-A); BOSC23 (ATCC CRL 11554); and Bing (ATCC CRL 11270). Et al.
  • Retroviral constructs may be derived from a range of retroviruses, such as MMLV, HIV-1, SIV, FIV, or other retroviruses described herein.
  • a retroviral construct may encode all viral polypeptides necessary for more than one cycle of replication of a particular virus. In some cases, the efficiency of virus entry is improved by the addition of other factors or other viral polypeptides. In another case, the viral polypeptide encoded by the retroviral construct does not support more than one cycle of replication, as described in US Pat. No. 6,872,528. In such situations, the addition of other factors or other viral polypeptides can assist in promoting viral entry.
  • the recombinant retrovirus is an HIV-1 virus that includes a VSV-g polypeptide but does not include an HIV-1 env polypeptide.
  • Retroviral constructs may include promoters, multiple cloning sites, and / or resistance genes. Promoters include, but are not limited to, inducible promoters such as tetracycline operator elements.
  • the retroviral construct may also include a packaging signal (eg, a packaging signal derived from an MFG vector; psi packaging signal). Examples of some retroviral constructs known in the art include, but are not limited to, pMX, pBabeX or derivatives thereof. See, for example, Onishi et al. (1996), Experimental Hematology, 24: 324-329.
  • the retroviral construct is a self-inactivating lentiviral vector (SIN) vector, see for example Miyoshi et al.
  • the retroviral construct is LL-CG, LS-CG, CL-CG, CS-CG, CLG or MFG. Miyoshi et al., (1998), J. Virol., 72 (10): 8150-8157; Onishi et al., (1996), Experimental Hematology, 24: 324-329; Riviere et al., (1995), PNAS, 92: 6733- See 6737.
  • Viral vector plasmids are pMXs, pMxs-IB, pMXs-puro, pMXs-neo (pMXs-IB is a vector carrying a blasticidin resistance gene instead of the puromycin resistance gene of pMXs-puro) (2003), Experimental Hematology, 31: 1007-1014; MFG iv Riviere et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the retroviral construct comprises blasticidin (eg, pMXs-IB), puromycin (eg, pMXs-puro, pBabePuro); or neomycin (eg, pMXs-neo).
  • blasticidin eg, pMXs-IB
  • puromycin eg, pMXs-puro, pBabePuro
  • neomycin eg, pMXs-neo
  • Viral constructs include calcium phosphate method, lipofection method (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417), electroporation method, microinjection method, fusene transfection, etc. Including, but not limited to, any of the methods described in the book. It may be introduced into the host pluripotent stem cell by any method known in the art.
  • the nucleic acid construct can be introduced into the host cell using a variety of well-known techniques such as non-viral transfection of cells.
  • the construct is incorporated into a vector and introduced into a host cell. Electroporation, calcium phosphate-mediated transfer, nucleofection, sonoporation, heat shock, magnetofection, liposome-mediated transfer, microinjection, microprojectile-mediated transfer (nanoparticles), cationic polymer-mediated transfer Including but not limited to (DEAE dextran, polyethyleneimine, polyethylene glycol (PEG), etc.) or cell fusion. It may be performed by any non-viral transfection known in the art. Other methods of transfection include transfection reagents such as Lipofectamine, DojindodHilymax, Fugene, jetPEI, Effectene, and DreamFect.
  • the present invention includes pluripotent stem cells containing an exogenous Tbx6 gene, and the pluripotent stem cells are induced into cardiac progenitor cells by expressing Tbx6.
  • the pluripotent stem cell containing the exogenous Tbx6 gene of the present invention is induced in cardiomyocytes by expressing Tbx6, then suppressing the expression of Tbx6 and culturing in a medium containing bFGF or FGF10.
  • a “foreign” gene refers to a nucleic acid that is introduced into the cell.
  • the present invention includes pluripotent stem cells comprising an expression cassette capable of inducing Tbx6 gene expression in response to an external stimulus.
  • Pluripotent stem cells containing an expression cassette capable of inducing Tbx6 gene expression in response to an external stimulus have the ability to be induced in cardiac progenitor cells in the presence of the external stimulus.
  • a pluripotent stem cell comprising an expression cassette capable of inducing Tbx6 gene expression in response to an external stimulus releases the presence of the external stimulus following the expression of Tbx6 by the external stimulus (ie, In the absence of the external stimulus, it has the ability to be induced in cardiomyocytes.
  • the pluripotent stem cell cell containing the exogenous Tbx6 gene of the present invention is in an in vitro state.
  • the pluripotent stem cell comprising an exogenous Tbx6 gene of the invention is a mammalian cell, eg, a human cell, or is derived from a human cell.
  • a pluripotent stem cell line containing the Tbx6 gene can be established more stably.
  • a screening method can be appropriately selected and carried out by those skilled in the art.
  • a “cardiac progenitor cell” is a cell characterized by expressing a marker specific for cardiac progenitor cells. Markers specific to cardiac progenitor cells are factors specifically expressed in cardiac progenitor cells (cardiac progenitor cell-related factors), and include T, Mesp1, Flk1 (KDR), Pdgfr ⁇ , Isl1, and the like.
  • the cardiac progenitor cells express at least one of markers specific for cardiac progenitor cells, more preferably at least two and even more preferably at least three.
  • the cardiac progenitor cells are preferably cells that express T, Mesp1, and Flk1 (KDR).
  • cardiac progenitor cells are derived from pluripotent stem cells, and therefore may be referred to as induced cardiac progenitor cells.
  • cardiomyocytes are cells characterized by expressing a specific marker for cardiomyocytes. Markers specific to cardiomyocytes are factors specifically expressed in cardiomyocytes (cardiomyocyte-related factors), and include cardiac troponin (cTnT), Nkx2.5, Actn2, and the like.
  • the cardiomyocytes express at least one, more preferably at least two, and even more preferably at least three of the markers specific for cardiomyocytes.
  • the cardiomyocytes are preferably cells that express cTnT and Nkx2.5.
  • cardiomyocytes can be characterized by pulsation. Furthermore, “cardiomyocytes” in the present invention may be characterized by forming a striated structure. In the present invention, cardiomyocytes are also derived from pluripotent stem cells and are therefore sometimes referred to as induced cardiomyocytes.
  • the expression of various markers specific to cardiac progenitor cells or cardiomyocytes can be detected by biochemical or immunochemical techniques (for example, enzyme-linked immunosorbent test, immunohistochemical test, etc.). Alternatively, it can also be detected by measuring the expression of nucleic acids encoding various markers specific for cardiac progenitor cells or cardiomyocytes. Expression of nucleic acids encoding various markers specific to cardiac progenitor cells or cardiomyocytes can be confirmed by molecular biological techniques such as RT-PCR and hybridization. Primers and probes used in these methods can be appropriately designed and manufactured by those skilled in the art using information available from databases such as Genbank.
  • the pulsation of the cardiomyocytes can be confirmed visually or by a bright field image.
  • Spontaneous contraction can also be confirmed by standard electrophysiological methods such as patch clamp.
  • the formation of the striated structure of cardiomyocytes can be confirmed visually or by a bright field image. It can also be confirmed by immunostaining of proteins that contribute to the myocardial structure such as troponin.
  • the present invention further relates to cardiac progenitor cells derived from pluripotent stem cells (induced cardiac progenitor cells, cardiac progenitor cell-like cells) or cardiomyocytes (induced cardiomyocytes) produced by the method for producing cardiac progenitor cells or cardiomyocytes described above. , Myocardial cells). Since the induced cardiac progenitor cells or induced cardiomyocytes of the present invention are derived from pluripotent stem cells containing an exogenous Tbx6 gene, the induced cardiac progenitor cells or induced cardiomyocytes of the present invention also contain the Tbx6 gene. In another embodiment of the invention, the induced cardiac progenitor cells or induced cardiomyocytes of the invention are in the form of in vitro. In another embodiment of the invention, the induced cardiac progenitor cells or induced cardiomyocytes of the invention are mammalian cells such as human cells or are derived from mammals such as human cells.
  • the cells derived from pluripotent stem cells are cardiac progenitor cells as described above.
  • a cell in which expression of a marker specific for cardiac progenitor cells is confirmed in this way is also referred to as a cardiac progenitor cell-like cell.
  • the cells derived from pluripotent stem cells can be confirmed to be cardiomyocytes by the expression of a specific marker for cardiomyocytes as described above.
  • cells in which expression of a marker specific for cardiac progenitor cells has been confirmed are also referred to as cardiac muscle-like cells. Marker expression can be confirmed by gene level or protein level.
  • the present invention also provides a composition containing pluripotent stem cells containing Tbx6 gene, or cardiac progenitor cells or cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells containing Tbx6 gene.
  • the composition of the present invention comprises the above-mentioned pluripotent stem cell or induced cardiac progenitor cell or induced cardiomyocyte, and further includes a salt; a buffer; a stabilizer; a protease inhibitor; a cell membrane and / or cell wall preserving compound as appropriate components For example, glycerol, dimethyl sulfoxide and the like; a nutrient medium suitable for cells may be included.
  • the present invention also provides a cardiac progenitor cell inducer from pluripotent stem cells or a cardiomyocyte inducer from pluripotent stem cells.
  • the inducing agent of the present invention comprises 1) a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a Tbx6 polypeptide, and an expression cassette that regulates the expression of a Tbx6 gene in response to an external stimulus.
  • the inducer of the present invention includes 2) external stimulation, 3) bFGF, FGF10, etc.
  • the inducer of the present invention can be directly administered to an individual.
  • the inducer of the present invention is useful for inducing pluripotent stem cells into cardiac progenitor cells or cardiomyocytes, and this induction can be performed in vitro or in vivo. Inducing pluripotent stem cells into cardiac progenitor cells or cardiomyocytes can be used to treat various cardiac disorders and for research in the heart field.
  • the inducing agent of the present invention may include pharmaceutically acceptable excipients.
  • suitable excipients are, for example, water, saline, dextrose, glycerol, ethanol and the like, and combinations thereof.
  • it may contain minor amounts of auxiliary substances such as wettable or emulsifying agents or buffering agents. Actual methods of preparing such dosage forms are known. See, for example, Remington's Pharmaceuticals Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985.
  • compositions such as vehicles, adjuvants, carriers or diluents are readily available.
  • pharmaceutically acceptable auxiliary substances such as pH adjusting and buffering agents, tension adjusting agents, stabilizers, wettable powders and the like can be easily purchased.
  • Pluripotent stem cells comprising the Tbx6 gene of the present invention can be used for such treatment in individuals in need of treatment.
  • the induced cardiac progenitor cells or induced cardiomyocytes of the present invention can be used for such treatment in an individual in need of treatment.
  • the pluripotent stem cell containing the Tbx6 gene of the present invention, or the induced cardiac progenitor cell or induced cardiomyocyte of the present invention can be introduced into a recipient individual (individual in need of treatment).
  • Introduction of pluripotent stem cells comprising a Tbx6 gene, or induced cardiac progenitor cells or induced cardiomyocytes of the invention into a recipient individual treats a condition or disorder in the individual.
  • the present invention relates to a therapeutic method comprising administering to an individual a pluripotent stem cell comprising the Tbx6 gene of the present invention, or the induced cardiac progenitor cell or induced cardiomyocyte of the present invention.
  • the therapeutic methods of the invention i) generate induced cardiac progenitor cells or induced cardiomyocytes in vitro; and ii) require induced cardiac progenitor cells or induced cardiomyocytes Introducing into an individual.
  • the therapeutic methods of the present invention include heart or cardiovascular diseases or disorders such as cardiovascular disease, aneurysm, angina, arrhythmia, atherosclerosis, cerebrovascular accident (stroke), cardiovascular disease, congenital Heart disease, congestive heart failure, myocarditis, coronary valvular disease, dilated arterial disease, diastolic dysfunction, endocarditis, hypertension, cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, restrictive cardiomyopathy, resulting in ischemic Useful for treating individuals with coronary artery disease leading to cardiomyopathy, mitral valve prolapse, myocardial infarction (heart attack), or venous thromboembolism.
  • cardiovascular diseases or disorders such as cardiovascular disease, aneurysm, angina, arrhythmia, atherosclerosis, cerebrovascular accident (stroke), cardiovascular disease, congenital Heart disease, congestive heart failure, myocarditis, coronary valvular disease, dilated arterial disease, diastolic dysfunction, endocarditis, hypertension,
  • the unit dosage form of the induced cardiac progenitor cells, or population of induced cardiomyocytes is from about 10 3 to about 10 9 , eg from about 10 3 to about 10 4 , from about 10 4 to about 10 5 , about 10 5 From about 10 6 cells, from about 10 6 cells to about 10 7 cells, from about 10 7 cells to about 10 8 cells, or from about 10 8 cells to about 10 9 cells.
  • Example 1 Cultivation of mouse ES cells
  • Mouse coated T-GFP ES cells (Prof. Gordon Keller, Toronto Medical Discovery Tower MaRS Center 101 College Street, Room) on a gelatin-coated 10 cm tissue culture dish (Thermo Scientific, 172958) 8-706 Toronto, ON M5G 1L7 obtained from CANADA) was inoculated at a concentration of 1.0 ⁇ 10 6 cell / dish, and cultured at 37 ° C./5% CO 2 using ES cell medium (Table 1). Thereafter, subculture was performed every 2-3 days.
  • T-GFP ES cells are cells that are positive for GFP when T, a marker transcription factor for cardiac mesoderm, is expressed.
  • Example 2 Induction of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes from mouse ES cells using cytokines ES cells passaged in Example 1 were washed with PBS (-) after aspirating the medium for ES cells, 2 mL of 0.05% Trypsin-EDTA was added to each dish, and the plate was allowed to stand at 37 ° C./5% CO 2 for 3 minutes. After confirming that the cells floated in the culture solution, the cells were neutralized with 1 mL FBS / 7 mL IMDM solution, and the cells were collected in a 15 mL tube (Corning, 430791).
  • Serum-free differentiation medium (Table 3) in which L-ascorbic acid and 1-thyolglycerol are added to 10 mL of serum-free medium (Table 2) is added to the cell precipitate, and then added to a 10 cm sterile petri dish (IWAKI, SH90-15). Sowing (day 0).
  • the formed embryoid body was transferred to a 15 mL tube together with the medium, centrifuged at 700 RPM / 3 minutes, and the supernatant was aspirated. 2 mL of 0.05% Trypsin-EDTA was added to the precipitated embryoid body, and the mixture was allowed to stand for 2 minutes at 37 ° C / 5% CO 2 . After repeated pipetting, the solution was neutralized with 1 mL FBS / 7 mL IMDM solution, centrifuged at 1200 RPM / 3 minutes, and the supernatant was aspirated. The precipitate was diluted with 10 mL IMDM, and the number of cells was counted.
  • the 7.5 ⁇ 10 5 cell solution was transferred to a new 15 mL tube, centrifuged at 1100 RPM / 3 minutes, and the supernatant was aspirated.
  • 10 mL of a cardiac progenitor cell induction medium (Table 4) was added and seeded in a sterile petri dish.
  • Cardiac progenitor cells were induced on day 4. Similarly to day 2, the formed embryoid body was transferred to a 15 mL tube together with the medium, centrifuged at 700 RPM / 3 minutes, and the supernatant was aspirated. To the precipitated embryoid body, 2 mL of 0.05% Trypsin-EDTA was added and allowed to stand at 37 ° C./5% CO 2 for 2 minutes. After repeated pipetting, the solution was neutralized with 1 mL FBS / 7 mL IMDM solution, centrifuged at 1200 RPM / 3 minutes, and the supernatant was aspirated. The precipitate was diluted with 10 mL IMDM, and the number of cells was counted.
  • the 6.0 ⁇ 10 5 cell / well solution was transferred to a new 15 mL tube, centrifuged at 1100 RPM / 3 minutes, and the supernatant was aspirated.
  • the cell precipitate was added with a medium for cardiomyocyte induction (Table 5) and seeded on a gelatin-coated 24-well cell culture multiwell plate (FALCON, 353047). After allowing the cells to adhere for 15 minutes, the cells were cultured under conditions of 37 ° C./5% CO 2 . Thereafter, the medium was changed every 2-3 days. When good induction was obtained, myocardial pulsation was observed from day 7.
  • Example 3 Introduction of Tetracycline Gene Expression Regulation System into Mouse ES Cells
  • Tbx6 was introduced into mouse ES cells using a lentivirus.
  • the vector used can control the expression of the transgene in a time-specific manner by adding doxycycline (FIG. 1).
  • 293T cells were seeded at a concentration of 6.0 ⁇ 10 6 cells / dish in a 10 cm tissue culture dish (Corning, 353047) and allowed to stand at 37 ° C./5% CO 2 (day 1).
  • solution A in which Lipofectamine 36 ⁇ L (Invitrogen, 1168-019) was mixed with 1500 ⁇ L Opti-MEM (gibco, 31985-070), and CSIV-TRE-RfA-UbC-KT- in 1500 ⁇ L Opti-MEM
  • the medium after 24 hours (day 3) was replaced with a medium prepared by mixing 10 ⁇ M of Forskolin (WAKO, 66575-29-9) with 293T cell culture solution.
  • ES cells were seeded at a concentration of 3.0 ⁇ 10 5 cells / well in a gelatin-coated 12-well cell culture multiwell plate (FALCON, 353043). Cultured.
  • the culture supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m pore size Minisart filter (Sartorius Stedim Biotech, 17598) and then collected in a 50 mL tube (Corning, 430829).
  • the collected 10 mL supernatant was subjected to ultracentrifugation at 23000 RPM / 2 hours using an ultra high speed centrifuge (Beckman, Optima XL). After centrifugation, the supernatant is aspirated and the precipitate is dissolved in 1 ⁇ mL of ES cell medium mixed with 1.3 ⁇ L Polybrene Transfection Reagent (10 mg / mL) (Millipore, # TR-1003-G). A virus solution was used. The ES cell culture medium that had been cultured from the previous day (day 3) was replaced with a lentivirus solution to infect the virus (infection).
  • the lentiviral solution was replaced with a medium for ES cells, and the culture was continued. After the infected cells became confluent, they were passaged to 10 cm tissue culture dishes. At the stage when the colony became an appropriate size, the colony was collected and separated using a pipetteman tip under a microscope, and ES cells were cloned from a single colony.
  • Example 4 Serum-free cardiac progenitor cell induction with Tbx6
  • ES cells cloned in Example 3 were seeded using the same method as in Example 2.
  • doxycycline Sigma, D9891
  • a serum-free differentiation medium supplemented with doxycycline was used as in day 0.
  • the petri dish was stirred in the same manner as in Example 2.
  • the induced cardiac progenitor cells were analyzed. Moreover, after day4, the experiment was performed in the same manner as in Example 3.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the expression level of Tbx6 mRNA in the cell line obtained by cloning. In the presence (+) of doxycycline (Dox), expression of Tbx6 mRNA was observed.
  • Example 5 Verification of induction of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes without serum by Tbx6
  • FACS analysis method The embryoid body containing cardiac progenitor cells was collected together with the medium, 0.25% Trypsin-EDTA was added, and the mixture was allowed to stand for 2 minutes at 37 ° C./5% CO 2 to form single cells. After neutralizing Trypsin-EDTA, cells were collected in a 15 mL tube (Corning, 430791). The collected cells were centrifuged at 1500 rpm / 5 minutes / 4 ° C. After aspirating the supernatant, 100 ⁇ L of FACS enforcement solution (5% FBS / PBS) (Table 6-2) was added to the cell precipitate and mixed well.
  • FACS enforcement solution 5% FBS / PBS
  • FIG. 4 is an image of GFP by immunostaining.
  • the ES cells (T-GFP ES cells) used in the Examples are cells that are positive for GFP when T, which is a marker transcription factor of heart mesoderm, is expressed. “Off” is the cell line of Example 4 to which doxycycline is not added, “On” is the cell line of Example 4 in which Tbx6 is induced by doxycycline, and “BMP4 / Activin” is differentiated from ES cells by BMP4 and Activin. (Day 4) shows the results of the cultured cells (Example 2).
  • Tbx6 In cells in which Tbx6 gene was introduced into mouse ES cells using the tetracycline gene expression regulation system (Examples 3 and 4), GFP was positive by the addition of doxycycline, and thus T, which is a marker transcription factor for cardiac mesoderm. It can be seen that. Further, in the ES cells of Examples 3 and 4, GFP was expressed by doxycycline to the same extent as cells using cytokines such as BMP4 and Activin (Example 2). Therefore, it was shown that when Tbx6 is introduced into ES cells, cardiac progenitor cells can be induced without using serum-free and humoral factors. Further, in this example, it was shown that cardiac progenitor cells can be induced with the same induction efficiency as when cytokine was used (BMP4 / Activin).
  • FIG. 5 shows the results of measuring the expression of GFP by FACS.
  • the ES cells used in the examples are positive for GFP when T, which is a marker transcription factor of cardiac mesoderm, is expressed.
  • T which is a marker transcription factor of cardiac mesoderm
  • “Off” is the cell line of Example 4 to which doxycycline is not added
  • “On” is the cell line of Example 4 in which Tbx6 is induced by doxycycline
  • BMP4 / Activin is differentiated from ES cells by BMP4 and Activin.
  • Day 4 shows the results of the cultured cells (Example 2).
  • cardiac progenitor cells are induced from ES cells only by the expression of Tbx6. Moreover, it has been clarified that the method of the present invention can induce cardiac progenitor cells with the same efficiency as the conventional method using serum, humoral factors, or the like.
  • Tbx6 expression was discontinued after 3 days after induction of cardiac progenitor cells, and matured beating cardiomyocytes were induced. Specifically, doxycycline was present in the medium only for 3 days from the start of induction (FIG. 3), and the induction of cardiomyocytes on Day 14 was examined.
  • FIG. 8 shows the results of measuring the expression of troponin T by FACS.
  • the percentage of cells expressing troponin T was 66.7%, whereas ES cells were treated with conventional solutions such as BMP4 and Activin.
  • BMP4 and Activin In cells induced with sex factors, troponin T expression was 63.9%. Therefore, the induction efficiency of troponin T was equivalent to the method of the present invention using Tbx6 and the conventional method using humoral factors.
  • mRNA of a myocardial related marker was examined (FIG. 9).
  • Actinin 2 Actn2
  • troponin T2 TnnT2
  • Nkx2.5 Nkx2.5
  • mRNA expression of these marker genes was confirmed in the cells in which Tbx6 gene-induced cells were treated with doxycycline for 3 days (“On” in FIG. 9). Their expression was similar to that of cardiomyocytes (BMP4 / Activin) induced from ES cells by the conventional method.
  • ES cells containing the Tbx6 gene differentiated into cardiomyocytes as with BMP4 / Activin by expressing the Tbx6 gene and inducing cardiac progenitor cells and then controlling the expression of Tbx6. Therefore, it was revealed that cardiac progenitor cells were induced from ES cells by expressing Tbx6, and that cardiac progenitor cells differentiated into cardiomyocytes when Tbx6 expression was controlled.
  • Example 6 Culture of human iPS cells Human iPS cells in a 10 cm tissue culture dish coated with hES-qualified Matrix (Corning, 354277) (obtained from iPS Cell Research Institute (CiRA), Kyoto University) was seeded in a state of about 10 cells / colony, and cultured under conditions of 37 ° C./5% CO 2 using a medium for human iPS cells (mTESRTM TM 1 (STEMCELL, 05850)). Thereafter, passage was performed every 7 days.
  • mTESRTM TM 1 a medium for human iPS cells
  • Example 7 Induction into cardiac progenitor cells and cardiomyocytes using cytokines from human iPS cells Human iPS cells were aspirated with PBS (-after 4 days before the start of induction (day-4). ), 500 ⁇ L of StemPro Accutase Cell dissociation Reagent (GIBCO, A1115-01) was added to each dish and allowed to stand at 37 ° C./5% CO 2 for 3 minutes. The cells are washed with PBS ( ⁇ ), suspended in a medium for human iPS cells, passed through a 40 ⁇ m filter, and single cells are collected. Count the number of cells, 1x10 5 cells / well and Matrigel coated 12w The cells were seeded on a multiwell plate for ell cell culture.
  • GEBCO StemPro Accutase Cell dissociation Reagent
  • the cells were cultured in a human serum-free differentiation medium supplemented with VEGF, and the medium was changed every 2 to 3 days. When good guidance was obtained, myocardial pulsation was observed from day 8.
  • Example 8 Introduction of tetracycline gene expression regulatory system into human iPS cells A lentivirus solution was prepared in the same manner as in Example 3 (mouse ES cells). A multiwell plate for 6-well cell culture was coated with Matrigel, 2 ⁇ 10 4 cells of human iPS cells were added to 2 mL of the virus solution, and seeded on the coated plate. From the next day, the cells were cultured in mTESR1. After the infected cells became confluent, they were passaged to 10 cm tissue culture dishes. At the stage when the colony became an appropriate size, the colony was collected and separated using a pipetteman tip under a microscope, and human iPS cells were cloned from a single colony. A human iPS cell line expressing Tbx6 in a time-specific manner was established.
  • Example 9 Induction of serum-free human cardiac progenitor cells and cardiomyocytes by Tbx6
  • the human iPS cells cloned in Example 8 were cloned using the same technique as in Example 7 four days before the start of induction (day-4). Seeding (FIG. 10 protocol).
  • day-1 2 ⁇ g / mL of doxycycline was added to mTESR1.
  • day 1 2 ⁇ g / mL of doxycycline was added to mTESR1.
  • the cells were washed with PBS ( ⁇ ), replaced with a human serum-free differentiation medium, and cultured for 3 days. From day 3 onward, cells were cultured in the same manner as in Example 7.
  • Tbx6 When Tbx6 was expressed by doxycycline treatment in human iPS cells into which Tbx6 had been introduced, the expression of cardiac mesoderm marker transcription factor T was confirmed by FACS and immunostaining on Day 1 (FIGS. 10A and 10B). Therefore, it was revealed that human cardiac progenitor cells are induced from human iPS cells by Tbx6 expression.
  • cardiac progenitor cells derived from human iPS cells by Tbx6 can differentiate into not only human myocardium but also vascular endothelial cells and smooth muscle cells. Therefore, it was shown that cardiac progenitor cells derived from human iPS cells with Tbx6 have pluripotency.
  • the present invention provides a method for inducing cardiac progenitor cells and cardiomyocytes from pluripotent stem cells.
  • the present invention also provides cells that induce cardiac progenitor cells and / or cardiomyocytes from pluripotent stem cells.
  • the myocardial induced pluripotent stem cell of the present invention can regulate the induction of cardiac progenitor cells and the induction of cardiomyocytes by turning on / off the expression of Tbx6.
  • cardiac progenitor cells are induced from mouse ES cells or human iPS cells using a system capable of controlling gene expression by external stimulation such as doxycycline administration, and further, Tbx6 is removed by removing the external stimulation.
  • Suppressing expression induces functionally mature cardiomyocytes.
  • the method for producing cardiac progenitor cells and cardiomyocytes of the present invention has an efficiency 2 to 3 times higher than that of Eomes, which has been reported in the past, in mouse cells. Progenitor cells and cardiomyocytes can be produced.
  • SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence of human Tbx6.
  • SEQ ID NO: 2 amino acid sequence of human Tbx6.
  • SEQ ID NO: 3 Nucleotide sequence of mouse Tbx6.
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of mouse Tbx6.

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Abstract

多能性幹細胞から心臓前駆細胞または心筋細胞を誘導する方法の提供。　本発明は、多能性幹細胞にTbx6を発現させることを含む、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を製造する方法を提供する。さらに、本発明は、多能性幹細胞にTbx6を発現させることを含む、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を誘導する工程、およびTbx6遺伝子の発現を抑制することを含む、前記工程で誘導された心臓前駆細胞から心筋細胞を誘導する工程とを含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法を提供する。

Description

多能性幹細胞からの心臓前駆細胞と心筋細胞の製造方法
　本発明は、ES細胞やiPS細胞から心臓前駆細胞および心筋細胞を製造するための方法、並びに当該方法により製造される心臓前駆細胞および心筋細胞に関する。
　心臓疾患は、高齢化に伴い増加の一途をたどっており、80歳以上の男性の心不全発生率は１４．７％と高い。心臓は、心筋細胞や線維芽細胞などの細胞で構成されるが、拍動機能を担う心筋細胞はほとんどまたは全く再生能力を有さないため、現在までのところ、心臓疾患の治療方法は限定されている。
　これまでに、３つの心筋リプログラミング因子（Gata4、Mef2c、Tbx5、以下GMTとも称する）の導入により、線維芽細胞からiPS細胞を介さずに心筋様細胞を直接作製する方法が見出されている（非特許文献１）。この方法では、培養細胞およびマウス生体内においても、３因子GMTにより線維芽細胞から心筋を直接作製し得ることが明らかにされている（特許文献１）。また、転写因子（Mesp1、Ets2）と複数の液性因子とを使用することで、線維芽細胞から心臓前駆細胞を介して機能的に未熟な心筋様細胞を作製できることが報告されている（非特許文献２）。また、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞から液性因子を用いて心臓前駆細胞や心筋細胞を誘導する方法（非特許文献３）や、マウスES細胞から血清使用下や特殊な培養条件下で転写因子を用いて心臓前駆細胞を誘導する方法が報告されている（非特許文献４）。
　一方、多能性幹細胞から液性因子を用いて心臓前駆細胞および心筋細胞を誘導する方法は、再現性やコスト面で課題があるため、転写因子の導入により、安定した心筋誘導多能性幹細胞株を作製できれば臨床的に有用である。
　また、これまでに転写因子を用いた多能性幹細胞からの心臓前駆細胞および心筋細胞誘導法は、血清や特殊な培養条件を使用するものであるが、無血清培地での報告はない。また、これまでの報告はマウス細胞のみであり、ヒト細胞での心臓前駆細胞および心筋細胞誘導法に関する報告はまだない。
WO2011/139688
Ieda, M., Fu, J.D., Delgado-Olguin, P., Vedantham, V., Hayashi, Y., Bruneau, B.G., and Srivastava, D. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytes by Defined Factors. Cell 142:375-386. 2010. Islas JF, Liu Y, Weng KC, et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2012;109(32):13016-21. Kattman SJ, Witty AD, Gagliardi M, et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell 2011;8(2):228-40. van den Ameele J, Tiberi L, Bondue A, et al. Eomesodermin induces Mesp1 expression and cardiac differentiation from embryonic stem cells in the absence of Activin. EMBO reports 2012;13(4):355-62.
　このような状況下、転写因子の導入により、無血清条件下で多能性幹細胞から心臓前駆細胞を誘導する方法の開発が求められている。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、マウスES細胞およびヒトiPS細胞にドキシサイクリンで発現を制御できるTbx6発現レンチウイルスベクターを遺伝子導入することによって、安定した心筋誘導多能性幹細胞を取得した。そして、本発明者らは、取得した心筋誘導多能性幹細胞が、Tbx6の発現をオンにすることにより、無血清かつ従来法で使用された液性因子などを使用せずに、心臓前駆細胞を誘導することができ、さらに、Tbx6の発現をオフにすることにより、心筋細胞が多量に誘導されることを見出した。
　本発明は、これらの知見に基づき完成されたものである。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
　［１］　多能性幹細胞にTbx6遺伝子を発現させることを含む、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を製造する方法。
　［２］　(i)　多能性幹細胞にTbx6遺伝子を発現させることを含む、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を誘導する工程、および
　(ii)　Tbx6遺伝子の発現を抑制することを含む、工程（i）で誘導された心臓前駆細胞から心筋細胞を誘導する工程
を含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
　［３］　Tbx6遺伝子の発現および発現の抑制が、外的刺激に応答して発現調節する発現カセットを用いて行われるものである、［１］または［２］の方法。
　［４］　多能性幹細胞にTbx6遺伝子を発現させる工程が、
　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットを、多能性幹細胞に導入する工程；および
　前記発現カセットが導入された多能性幹細胞を、外的刺激の存在下に培養する工程
を含む、［１］～［３］のいずれか1項に記載の方法。
　［５］　多能性幹細胞にTbx6遺伝子を発現させる工程が、
　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットを、多能性幹細胞に導入する工程；および
　前記発現カセットが導入された多能性幹細胞を、外的刺激の存在下、かつ血清非存在下に培養する工程
を含む、［１］～［４］のいずれか1項に記載の方法。
　［６］　Tbx6遺伝子の発現を抑制する工程が、
　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入された多能性幹細胞を、外的刺激の非存在下に培養する工程
を含む、［２］～［５］いずれか1項に記載の方法。
　［７］　多能性幹細胞が、ES細胞またはiPS細胞である、［１］～［６］のいずれか1項に記載の方法。
　［８］　外的因子がテトラサイクリンまたはドキシサイクリンである、［１］～［７］のいずれか1項に記載の方法。
　［９］　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されており、前記外的刺激存在下に培養することにより、心臓前駆細胞に誘導される、多能性幹細胞。
　［１０］　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されており、前記外的刺激存在下に培養後に、前記外的刺激非存在下に培養することにより、心筋細胞が誘導される、多能性幹細胞。
　前記［９］および［１０］の多能性幹細胞は、Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されていることから、当該発現カセットを含む細胞である。
　本発明により、多能性幹細胞から心臓前駆細胞および心筋細胞を誘導する方法が提供される。また、本発明により、多能性幹細胞から心臓前駆細胞および／または心筋細胞を誘導する細胞が提供される。本発明の心筋誘導多能性幹細胞は、Tbx6の発現のオンおよびオフによって心臓前駆細胞の誘導および心筋細胞の誘導をそれぞれ調節することができる。
　詳しくは、本発明により、ドキシサイクリン投与等の外的刺激によりTbx6遺伝子発現を制御できるシステムを用いて、外的刺激の存在下にTbx6を発現させるとマウスES細胞またはヒトiPS細胞から心臓前駆細胞が誘導され、さらに、当該外的刺激を取り除くことによりTbx6発現を抑制すると、機能的に成熟な心筋細胞が誘導される。
　本発明の心臓前駆細胞および心筋細胞の製造方法は、マウス細胞では既報にあるEomesによる心臓前駆細胞および心筋細胞の誘導効率と比較して2～3倍の効率を有することから、高率に心臓前駆細胞および心筋細胞を製造することができる。
図１は、テトラサイクリン遺伝子発現調節システムを示す模式図である。 図２は、Tbx6を遺伝子導入した細胞における、ドキシサイクリン存在下におけるTbx6の発現量を示す図である。 図３は、実施例４におけるドキシサイクリンの添加タイミングを示す模式図である。 図４は、Day 4（図３）における、ドキシサイクリン添加なしの実施例４の細胞株（「Off」）、ドキシサイクリン添加によりTbx6を誘導させた実施例４の細胞株（「On」）、およびBMP4およびActivinによりES細胞から分化させた心臓前駆細胞（「BMP4/Activin」）のGFPの像を示す図である。 図５は、Day 4（図３）における、ドキシサイクリン添加なしの実施例４の細胞株（「Off」）、ドキシサイクリン添加によりTbx6を誘導させた実施例４の細胞株（「On」）、およびBMP4およびActivinによりES細胞から分化させた心臓前駆細胞（「BMP4/Activin」）のGFPの発現を示す図である。 図６は、Day 4（図３）における、ドキシサイクリン添加なしの実施例４の細胞株（「Off」）、ドキシサイクリン添加によりTbx6を誘導させた実施例４の細胞株（「On」）、およびBMP4およびActivinによりES細胞から分化させた心臓前駆細胞（「BMP4/Activin」）のFlk-1およびPDGFRαの発現を示す図である。 図７は、Day 14（図３）における、ドキシサイクリン添加なしの実施例４の細胞株（「Dox Off」）、およびドキシサイクリン添加によりTbx6を誘導させた実施例４の細胞株（「Dox On」）のα-アクチニンおよび心臓トロポニンの像を示す図である。 図８は、Day 14（図３）における、ドキシサイクリン添加なしの実施例４の細胞株（「Off」）、ドキシサイクリン添加によりTbx6を誘導させた実施例４の細胞株（「On」）、およびBMP4およびActivinによりES細胞から分化させた心臓前駆細胞（「BMP4/Activin」）の心臓トロポニンの発現を示す図である。 図９は、Day 14（図３）における、ドキシサイクリン添加なしの実施例４の細胞株（「Off」）、ドキシサイクリン添加によりTbx6を誘導させた実施例４の細胞株（「On」）、およびBMP4およびActivinによりES細胞から分化させた心臓前駆細胞（「BMP4/Activin」）における、アクチニン（Actn2）、心臓トロポニン（TnnT2）、およびNkx2.5の発現量を示す図である。 図１０はTbx6発現によりヒトiPS細胞からヒト心臓前駆細胞への誘導、および当該ヒト前駆細胞から心筋細胞への分化を示す図である。
　本発明は、多能性幹細胞から心臓前駆細胞および心筋細胞を誘導する細胞（心筋誘導多能性幹細胞）に関する。本発明の心筋誘導多能性幹細胞は、外的刺激に応答してTbx6の発現をオン・オフすることによって、心臓前駆細胞の誘導・心筋細胞の誘導を調節することができる。
　本発明は、多能性幹細胞にTbx6遺伝子を発現させることにより、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を製造する方法に関する。本発明においては、ドキシサイクリン投与等の外的刺激によってTbx6遺伝子の発現を制御する発現カセットを、多能性幹細胞に導入することにより、外的刺激に応じてTbx6遺伝子の発現および発現の抑制が行われる。より具体的には、心臓前駆細胞は、当該発現カセットを導入された多能性幹細胞の外的刺激の存在下における培養により誘導される。より好ましくは、心臓前駆細胞は、当該発現カセットを導入された多能性幹細胞を、外的刺激の存在下、かつ血清非存在下に培養することで、誘導することができる。
　これまでに、ES細胞をActivin A、BMP4、Wntなどの転写因子や液性因子の存在下で培養することを含む心臓前駆細胞の誘導方法が開発されている。しかしながら、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を誘導する転写因子およびメカニズムは明らかでは無く、また、液性因子による誘導は、コストが高く、また、煩雑な培養工程が必要であるばかりでなく、細胞株間による誘導の不安定性といった問題があった。
　それに対し、本発明の心臓前駆細胞の製造方法においては、単一の因子（Tbx6）を誘導することにより、心臓前駆細胞に特異的遺伝子であるT、Flk-1またはPDGFRαを発現する心臓前駆細胞が誘導される。これらの心臓前駆細胞特異的マーカーを発現する細胞の割合は、従来のActivin AやBMP4を用いる心臓前駆細胞の誘導方法による割合と同程度である。したがって、本発明の方法は、従来法に比べて安価でかつ簡便に、同程度の誘導効率を達成できる方法であるといえる。
　また、本発明においては、多能性幹細胞におけるTbx6遺伝子の発現後にTbx6遺伝子の発現を抑制することにより、心筋細胞が誘導される。すなわち、本発明は、Tbx6遺伝子の発現後にTbx6遺伝子の発現を抑制することにより、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法に関する。Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入された多能性幹細胞におけるTbx6遺伝子の発現抑制は、当該細胞を外的刺激の非存在下に培養することにより行うことができる。本発明における心臓前駆細胞から心筋細胞への誘導は、Tbx6遺伝子の発現を抑制する工程が含まれる。また、心臓前駆細胞から心筋細胞への誘導においては、従来法と同様にbFGFやFGF10の存在下で培養すればよい。このような培養により、拍動する成熟心筋細胞が誘導される。また、誘導された心筋細胞では、心筋特異的な遺伝子であるα-アクチニン、心臓トロポニン、Nkx2.5の発現や、横紋構造の形成が確認される。
　すなわち、本発明の心筋細胞の製造方法は、多能性幹細胞におけるTbx6遺伝子の発現後に、Tbx6遺伝子の発現を抑制することを含む。本発明の心筋細胞の製造方法によれば、心臓前駆細胞誘導後に、薬剤投与中止等の外的刺激の非存在条件によりTbx6遺伝子の発現を抑制すると、機能的に成熟な心筋細胞が誘導される。
［多能性幹細胞］
　本発明において用いられる多能性幹細胞は、胚性幹（ES）細胞および人工多能性幹（iPS）細胞のいずれでもよい。
　また、前記幹細胞は、哺乳動物に由来するものであればよい。哺乳動物の例としては、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ラット、マウスなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のある実施態様において前記幹細胞はヒト由来のものであり、別の実施態様では非ヒト哺乳動物、例えば、マウス由来のものである。
　ES細胞は、胚の内部細胞塊から採取された多分化能を有する幹細胞である（Strelchenko N et al., (2004) Reprod Biomed Online. 9: 623-629.）。本発明において、ES細胞は内部細胞塊から採取された初代細胞株に限定されるものではなく、すでにセルライン化されたES細胞株であってもよい。セルライン化されたES細胞株の例としては、すでに樹立されたES細胞株を増殖させて得られた細胞集団から分与された細胞株、あるいは凍結保存された状態から溶解して培養されたES細胞株等が挙げられる。セルライン化されたES細胞株であれば、受精卵を崩壊させる工程を経ることなく入手することが可能である。
　あるいは、本発明において使用されるES細胞は、胚盤胞期以前の卵割期の胚の単一割球のみを用いて、胚の発生能を損なうことなく樹立されたものであってもよい。このようなES細胞であれば受精卵を破壊せずに得ることが可能である（Klimanskaya I et al., (2006) Nature 444: 481-485; and Chung Y et al., (2008) Cell Stem Cell 2: 113-117）。
　ヒト由来ES細胞の培養方法は、例えば、理研CDB・ヒト幹細胞研究支援室プロトコール(2008)、Takahashi, K. et al. （Cell(2007), Nov 30: 131, pp. 861-872）およびThomson, J.A. et al.（Science (1998) Nov 6：282, pp. 1145-1147）に記載されている。当業者は公知の方法を用いて、哺乳動物由来のES細胞を適宜培養することができる。
　本発明において使用されるiPS細胞とは、哺乳動物（ヒトを含む）の体細胞（線維芽細胞、上皮細胞等）に数種類の初期化遺伝子（Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、NANOG、LIN28等の遺伝子）を導入することにより、基本的にES細胞と同様の多分化能を有する、未分化状態の多能性幹細胞である（特開2009-165478; Takahashi K et al., (2006) Cell 126: 663-676; and Takahashi K et al., (2007) Cell 131: 861-872等）。iPS細胞はES細胞と同様の方法により培養することができる。
［Tbx6］
　本発明の心臓前駆細胞または心筋細胞の製造方法において、多能性幹細胞は、Tbx6をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入される。本発明において、Tbx6のアミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は当分野で公知である。
　Tbx6ポリペプチド（Tbox転写因子６）は、一部の遺伝子のプロモーター領域におけるTボックスと結合してこれを認識する転写因子である。種々の種に由来するTbx6ポリペプチドに関するアミノ酸配列、およびTbx6ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が知られている。例えば、Genbankアクセッション番号NM_004608.3（ヒト、ヌクレオチド配列、配列番号１、CDS 61..1371）、NP_004599.2（ヒト、アミノ酸配列、配列番号２）、NM_011538.2（マウス、ヌクレオチド配列、配列番号３、CDS 25..1335）、NP_035668.2（マウス、アミノ酸配列、配列番号４）等を参照することができる。
　また、本発明の一態様において、Tbx6ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、多能性幹細胞で発現した場合に心臓前駆細胞に誘導する機能を有するポリペプチドを含む。
　また、本発明の一態様において、Tbx6ポリペプチドは、配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１～５０個、好ましくは１～４０個、より好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が、欠失、置換、挿入あるいは付加またはそれらの組み合わせられたアミノ酸配列を有し、多能性幹細胞で発現した場合に心臓前駆細胞に誘導する機能を有するポリペプチドを含む。
　また、本発明の一態様において、Tbx6ポリペプチドは、配列番号１または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有し、多能性幹細胞で発現した場合に心臓前駆細胞に誘導する機能を有するポリペプチドを含む。
　また、本発明の一態様において、Tbx6遺伝子（核酸）は、配列番号１または配列番号３で表されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、コードするポリペプチドが多能性幹細胞で発現した場合に心臓前駆細胞に誘導する機能を有する核酸を含む。
　これまでに、BMP4やActivin A、Wntといった転写因子や液性因子を用いることにより、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を作製できることが報告されている。本発明においては、このような液性因子存在下で培養する必要はない。また、本発明においては、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を誘導する工程においては、無血清条件で培養することが好ましい。また、このような転写因子と液性因子を組み合わせることも必要としない。
［多能性幹細胞でのTbx6の発現］
　本発明の一態様において、Tbx6遺伝子は、多能性幹細胞にin vitroで導入され得る。また、当該多能性幹細胞はin vitroで心臓前駆細胞または心筋細胞に誘導される。誘導された心臓前駆細胞または心筋細胞は個体内に導入できる。
　本発明の別の態様において、Tbx6遺伝子は、多能性幹細胞にin vitroで導入され得る。また、Tbx6遺伝子をin vitroで導入された当該多能性幹細胞は個体内に導入され、in vivoで心臓前駆細胞または心筋細胞に誘導される。
　Tbx6遺伝子の多能性幹細胞への導入は、Tbx6をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を多能性幹細胞に導入することにより行うことができる。導入された多能性幹細胞は、Tbx6の発現を介し心臓前駆細胞に誘導される。したがって、Tbx6遺伝子を多能性幹細胞に導入する工程は、Tbx6ポリペプチドを多能性幹細胞に導入することを含み得る。Tbx6の由来する種と多能性幹細胞の由来する種は、例えば、ヒトとヒトなど、一致することが好ましい。
　また、本発明の心臓前駆細胞製造方法は、多能性幹細胞をTbx6遺伝子を用いて形質転換する工程を含み得る。また、本発明の心臓前駆細胞製造方法は、多能性幹細胞においてTbx6遺伝子を発現させる工程を含み得る。また、本発明の心筋細胞の製造方法は、多能性幹細胞においてTbx6遺伝子を発現させる工程に続き、Tbx6遺伝子の発現を抑制する工程を含み得る。
　本発明において、Tbx6遺伝子は、外的刺激の応答に応じて発現調整する発現カセットにより時期特異的に発現制御され得る。そのような発現カセットは、外的刺激に応答して下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターと、当該プロモーターによって発現が制御されるTbx6遺伝子を少なくとも含む核酸コンストラクトである。
　プロモーターとしては、外的刺激に応答して下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターであれば特に制限はなく、例えば、外的刺激がテトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、またはドキシサイクリン等のテトラサイクリン誘導体）の存在である場合には、テトラサイクリン系抗生物質とテトラサイクリントランスアクチベーターとの複合体の結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。一方、外的刺激がテトラサイクリン系抗生物質の非存在である場合には、テトラサイクリンリプレッサーの解離によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。また、外的刺激がエクジステロイド（エクジソン、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ等）の存在である場合には、エクジステロイドと、エクジソン受容体－レチノイド受容体複合体との結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。さらに、外的刺激がＦＫＣｓＡの存在である場合には、ＦＫＣｓＡと、ＦＫＢＰ１２に融合したＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン－シクロフィリンに融合したＶＰ１６アクチベータードメイン複合体との結合によって、下流の遺伝子の発現を誘導できるプロモーターが挙げられる。
  発現カセットは、必要に応じて、エンハンサー、サイレンサー、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含んでいても良い。また、当業者であれば、利用する前記プロモーターの種類等を考慮して、エンハンサー、サイレンサー、選択マーカー遺伝子およびターミネーター等を、公知のものから適宜選択して組み合わせることにより、所望の発現レベルにてＨＰＶ－Ｅ６／Ｅ７遺伝子の発現を誘導することが可能な発現カセットを構築することができる。
　このように、外的刺激は、薬物の存在または非存在下での培養が含まれる。例えば、テトラサイクリン発現誘導システム（例えば、タカラなど）用いて、ドキシサイクリン存在下で目的遺伝子の発現を制御する。例えば、Tbx6遺伝子はテトラサイクリン感受性（Tet-On）のプロモーター制御下で発現できるようにベクターを作製する。次に、前記Tbx6発現ベクターを多能性幹細胞にトランスフェクションして、トランスジェニック多能性幹細胞を作製する。一方で、リバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（rtTA）を発現するTet-On調節プラスミドを作製し、当該調節プラスミドを前記多能性幹細胞に導入する。培地中にドキシサイクリンを添加すると、rtTAはテトラサイクリン応答因子と結合して、下流の遺伝子発現が誘導される。また、培地中にドキシサイクリンが存在しないと、下流の目的遺伝子の発現は誘導されない。
　テトラサイクリン感受性発現システムは、市販のもの（例えば、KnockoutTM Tet RNAi System P（Clontech））を用いてもよく、またはDickins RA. et al.，(Nature Genetics, 39(7): 914-921 (2007))に記載の方法で作製してもよい。
  本発明において、前記発現カセットを多能性幹細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。例えば、前記発現カセットを適当な発現ベクターに挿入し、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクター等のウイルスベクターを用いたウイルス感染、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法等の公知の形質転換方法により行うことができる。
  このような発現ベクターとしては、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、増殖活性があまり高くない多能性幹細胞のゲノムＤＮＡへの導入効率が極めて高いという観点から、レンチウイルスが好ましい。
  また、前記外的刺激に関しては、当業者であれば、利用する前記プロモーターの種類等を考慮して、後述の培地への添加量を適宜調製することができる。例えば、外的刺激がドキシサイクリンの存在である場合には、ドキシサイクリンの好適な添加濃度としては、０．１～１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１～２μｇ／ｍｌである。
  心臓前駆細胞または心筋細胞への誘導のために用いられ、前記外的刺激が添加される培養液としては、例えば、ＩＭＤＭ溶液、a－ＭＥＭ溶液またはＤＭＥＭ溶液が挙げられる。培養に通常添加される添加物が含まれていてもよい。ただし、心臓前駆細胞への誘導の際は、血清を加える必要はなく、本発明の一態様においては、心臓前駆細胞への誘導は、血清非存在下で行われる。
　Tbx6遺伝子を導入した多能性幹細胞は、ドキシサイクリンなどの外的刺激を０（例えば、１、２、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２時間）～４日、好ましくは０～３日間存在させる。その結果、多能性幹細胞は、心臓前駆細胞に誘導される。心臓前駆細胞に誘導されたことは、例えば、誘導開始から一定期間（例えば４日）中に心臓前駆細胞の特異的マーカーの発現により確認することができる。また、前記多能性幹細胞は、続いて外的刺激の存在を終了させる結果、心筋細胞に誘導される。心筋細胞に誘導されたことは、例えば、外的刺激の終了後から一定期間（例えば３～１０日、好ましくは３～５日の期間）のうちに心筋細胞の特異的なマーカーの発現により確認することができる。例えば、多能性幹細胞の集団が、Tbx6遺伝子を導入されドキシサイクリンの外的刺激が与えられる場合、集団の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％が、誘導開始から４日のうちに心臓前駆細胞への誘導を確認され、また、外的刺激終了後から３～１０日、好ましくは３～５日の期間のうちに心筋細胞への誘導を確認され得る。
　本発明の心臓前駆細胞製造方法または心筋細胞製造方法は、多能性幹細胞へのTbx6遺伝子の導入工程の一定期間（例えば誘導開始から０～４日、好ましくは０～３日の期間）の後に、当該多能性幹細胞の集団をソーティングする工程により、心臓前駆細胞の割合を富化させることができる。多能性幹細胞特異的マーカー、多能性幹細胞特異的タンパク質、多能性幹細胞表面抗原などに関してソーティング工程を行うことにより、残存多能性幹細胞がある場合にはそれを除去することができる。また、心臓前駆細胞または心筋細胞に特異的なマーカーの発現に関してソーティング工程を行うことにより、それぞれの細胞の割合を富化することもできる。
　また、本発明の心臓前駆細胞製造方法または心筋細胞製造方法は、検出可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を多能性幹細胞に導入する工程を含むことにより、ソーティング工程の手段を与え、あるいは、心臓前駆細胞または心筋細胞の誘導を確認する手段を与えることができる。検出可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列は、心臓前駆細胞特異的プロモーターまたは心筋細胞特異的プロモーターに作動可能に連結しているか、あるいは、心臓前駆細胞特異的マーカーをコードするヌクレオチド配列または心筋細胞特異的マーカーをコードするヌクレオチド配列に連結する。検出可能なマーカーは、例えば、検出可能なシグナルを直接発生するポリペプチド、例えば、GFP、YEP、BFP等の蛍光タンパク質や、基質に対して作用する際に検出可能なシグナルを発生する酵素、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ等が含まれる。心臓前駆細胞特異的プロモーターとしては、例えばMesp1、T、Flk1（KDR）のプロモーターが含まれる。また、心筋細胞に特異的なプロモーターは、例えばα-ミオシン重鎖プロモーター、cTnTプロモーターなどが含まれる。検出可能なマーカーの発現は、心臓前駆細胞または心筋細胞の検出を可能にすることができ、その結果、心臓前駆細胞または心筋細胞の誘導の確認、あるいは、誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞のソーティングの手段を与えることができる。
　本明細書において、「作動可能に連結する」とは、転写、翻訳等のような所望の機能を与える核酸間の機能的連結を指す。例えば、プロモーターやシグナル配列などの核酸発現制御配列と第二のポリヌクレオチドとの間の機能的連結を含む。発現制御配列は第２のポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響する。
　前述のとおり、Tbx6ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、外的刺激に応答して多能性幹細胞中のTbx6の発現調節を可能にする発現カセットであり得る。本発明の別の実施態様においては、発現カセットはウイルスコンストラクト、例えば組換えアデノ関連ウイルスコンストラクト（例えば米国特許第７，０７８，３８７参照）、組換えアデノウイルスコンストラクト、組換えレンチウイルスコンストラクト等である。
　適当な発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス系ウイルスベクター;ポリオウイルス;アデノウイルス(例えばLi等、Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549,1994;Borras等、Gene Ther 6:515 524,1999;Li and Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995;Sakamoto等、H Gene Ther 5:1088 1097,1999;国際特許出願公開９４／１２６４９，国際特許出願公開９３／０３７６９；国際特許出願公開９３／１９１９１；国際特許出願公開９４／２８９３８；国際特許出願公開９５／１１９８４および国際特許出願公開９５／００６５５参照）；アデノ関連ウイルス（例えばAli等、Hum Gene Ther 9:81 86,1998,Flannery等、PNAS 94:6916 6921,1997;Bennett等、Invest Opthalmol Vis Sci38:2857-2863,1997;Jomary等、Gene Ther4:683-690,1997,Rolling等、Hum Gene Ther 10:641 648,1999;Ali等、Hum Mol Genet 5:591-594,1996;Srivastava、国際特許出願公開９３／０９２３９、Samulski等、J. Vir.(1989)63:3822 3828;Mendelson等、Virol. (1988)166:154 165；およびFlotte等、PNAS(1993)90:10613-10617参照);ＳＶ４０；単純疱疹ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えばMiyoshi等、PNAS94:10319-23,1997;Takahashi等、J Virol73:7812 7816,1999参照);レトロウイルスベクター（例えば、ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびレトロウイルスから派生させたベクター、例えばラウス筋節ウイルス、ハーベイ筋節ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性筋節ウイルス、乳癌ウイルス）等を包含するが、これらに限定されない。
　多くの適当な発現ベクターが当該分野で知られており、そして多くのものが商業的に入手可能である。以下のベクターが例示のため提示され、真核生物宿主細胞に関してはｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。しかしながら、何れかの他のベクターも、宿主細胞と適合する限りにおいて使用することができる。
  使用する宿主／ベクター系に応じて、多くの適当な転写および翻訳の制御エレメントの何れか、例えば、構成および誘導プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を発現ベクター中で使用してよい（例えばBitter等、(1987)Methods in Enzymology,153:516-544参照）。
  本発明の別の実施態様においては、Tbx6　CDR配列は制御エレメント、例えば転写制御エレメント、例えばプロモーターに作動可能に連結させてもよい。転写制御エレメントは真核生物細胞、例えば哺乳類細胞において機能する。適当な転写制御エレメントはプロモーターおよびエンハンサーを包含する。本発明の別の実施形態において、プロモーターは誘導性である。本発明の心臓前駆細胞を製造する方法または心筋細胞を製造する方法において使用される発現カセットは、誘導性プロモーターを含む。
  本発明における発現カセットに含まれる誘導性プロモーターは、外的刺激に応答して作動可能に連結した遺伝子の発現を誘導する。
  本発明の別の実施態様においては、Tbx6ヌクレオチド配列は心特異的転写制御エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結しており、その場合ＴＲＥはプロモーターおよびエンハンサーを包含することができる。適当なＴＲＥは、以下の遺伝子、すなわち、ミオシン軽鎖－２、α－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心トロポニンＣ、および心アクチンから派生させたＴＲＥを包含するが、これらに限定されない（Franz等、(1997)Cardiovasc.Res.35:560-566;Robbins等、(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752:492-505;Linn等、(1995)Circ.Res.76:584-591;Parmacek等、(1994)Mol.Cell.Biol.14:1870-1885;Hunter等、(1993)Hypertension 22:608-617;およびSartorelli等、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4047-4051.）。
  適切なベクターおよびプロモーターの選択は当該分野で良く知られている。発現ベクターは、翻訳開始および転写開始のためのリボソーム結合部位を含有してよい。発現ベクターは発現を増幅するための適切な配列を包含してよい。
  適当な哺乳類発現ベクター（哺乳類宿主細胞における使用に適する発現ベクター）の例は、組換えウイルス、核酸ベクター、例えばプラスミド、細菌人工染色体、コウボ人工染色体、ヒト人工染色体、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物発現カセットを包含するが、これらに限定されない。Tbx6をコードするヌクレオチド配列の発現を駆動するための適当なプロモーターの例は、誘導プロモーター、例えばＴｅｔ－オペレーターエレメントを含有するものを包含するが、これらに限定されない。一部の場合において、哺乳類発現ベクターはTbx6ポリペプチドのほかに、トランスフェクトまたは感染されている細胞の識別または選択を容易にするマーカー遺伝子をコードしてもよい。マーカー遺伝子の例は蛍光タンパク質、例えば増強緑色蛍光タンパク質、Ｄｓ－Ｒｅｄ（ＤｓＲｅｄ：Ｄｉｓｃｏｓｏｍａｓｐ．赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）；Bevis and Glick(2002)Nat. Biotechnol.20:83)、黄色蛍光タンパク質、およびシアノ蛍光タンパク質をコードする遺伝子；および選択剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジン耐性遺伝子等を包含するが、これらに限定されない。
  適当なウイルスベクターの例は、レトロウイルス系のウイルスベクター（レンチウイルスを包含する）；アデノウイルス；およびアデノ関連ウイルスを包含するが、これらに限定されない。適当なレトロウイルス系ベクターの例は、ネズミモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）系のベクターであるが；他の組換えレトロウイルスも使用してよく、例えばトリ白血症ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス、ネズミ筋節ウイルス、網内皮症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ  Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、またはラウス筋節ウイルスが挙げられ、例えば米国特許６，３３３，１９５を参照できる。
  別の場合においては、レトロウイルス系ベクターはレンチウイルス系ベクター（例えば、ヒト免疫不全ウイルス-1 (HIV-1);サル免疫不全ウイルス(SIV);またはネコ免疫不全ウイルス(FIV))であり、例えばJohnston等、(1999),Journal of Virology,73(6):4991-5000 (FIV);Negre D等、(2002),Current Topics in Microbiology and Immunology,261:53-74(SIV); Naldini等、(1996),Science,272:263-267(HIV)を参照できる。
  組換えレトロウイルスは標的細胞内への進入を支援するためにウイルスポリペプチド（例えばレトロウイルスｅｎｖ）を含んでよい。そのようなウイルスポリペプチドは当該分野で十分樹立されており、例えば米国特許５，４４９，６１４を参照できる。ウイルスポリペプチドは両栄養性ウイルスポリペプチド、例えば両栄養性ｅｎｖであってよく、これは、元の宿主種の外にある細胞を包含する多数の種から派生された細胞内への進入を支援する。ウイルスポリペプチドは元の宿主種の外にある細胞内への進入を支援する異種栄養性ウイルスポリペプチドであってよい。本発明の別の実施態様においては、ウイルスポリペプチドはエコトロピックウイルスポリペプチド、例えばエコトロピックｅｎｖであり、これは元の宿主種の細胞内への進入を支援する。
  細胞内へのレトロウイルスの進入を支援することができるウイルスポリペプチドの例はＭＭＬＶ両栄養性ｅｎｖ、ＭＭＬＶエコトロピックｅｎｖ、ＭＭＬＶ異種栄養性ｅｎｖ、水痘性口内炎ウイルス－ｇタンパク質（ＶＳＶ－ｇ）、ＨＩＶ－１ｅｎｖ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖ、ＲＤ１１４、ＦｅＬＶ－Ｃ、ＦｅＬＶ－Ｂ、ＭＬＶ１０Ａ１ｅｎｖ遺伝子、およびこれらの変異体、例えばキメラを包含するが、これらに限定されない。例えばYee等、(1994),Methods Cell Biol.,PtA:99-112(VSV-G)；米国特許５，４４９，６１４を参照できる。一部の場合において、ウイルスポリペプチドは発現または受容体への増強された結合を促進するために遺伝子的に修飾される。
  一般的に、組換えウイルスはプロデューサー細胞内にウイルスＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを導入することにより生産される。一部の場合において、プロデューサー細胞は外来性遺伝子を発現しない。別の場合においては、プロデューサー細胞は１つ以上の外来性遺伝子、例えば１つ以上のｇａｇ、ｐｏｌ、またはｅｎｖポリペプチドおよび／または１つ以上のレトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、またはｅｎｖポリペプチドをコードする遺伝子を含む「パッケージング細胞」である。レトロウイルスパッケージング細胞はウイルスポリペプチドをコードする遺伝子、例えば標的細胞内への進入を支援するＶＳＶ－ｇを含んでよい。一部の場合において、パッケージング細胞は１つ以上のレンチウイルスタンパク質、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、またはｎｅｆをコードする遺伝子を含む。一部の場合において、パッケージング細胞はアデノウイルスタンパク質、例えばＥ１ＡまたはＥ１Ｂまたは他のアデノウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、パッケージング細胞により供給されるタンパク質は、レトロウイルス派生タンパク質、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ；レンチウイルス派生タンパク質、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｎｅｆ；およびアデノウイルス派生タンパク質、例えばＥ１ＡおよびＥ１Ｂであってよい。多くの例において、パッケージング細胞はウイルスベクターの派生元のウイルスとは異なるウイルスから派生させたタンパク質を供給する。
  パッケージング細胞系統は何れかの容易にトランスフェクションできる細胞系統を包含するが、これらに限定されない。パッケージング細胞系統は293T細胞、NIH3T3、COSまたはHeLa細胞系統に基づくものであることができる。パッケージング細胞は頻繁には、ウイルスパッケージングのために必要なタンパク質をコードする遺伝子少なくとも１つにおいて欠失があるウイルスベクタープラスミドをパッケージングするために使用される。そのようなウイルスベクタープラスミドによりコードされるタンパク質から欠失しているタンパク質またはポリペプチドを供給できる何れかの細胞をパッケージング細胞として使用してよい。パッケージング細胞系統の例はＰｌａｔｉｎｕｍ－Ｅ（Ｐｌａｔ－Ｅ）；Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ａ（Ｐｌａｔ－Ａ）；ＢＯＳＣ２３（ＡＴＣＣＣＲＬ１１５５４）；およびＢｉｎｇ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１２７０）を包含するが、これらに限定されず、例えばMorita等、(2000),Gene Therapy,7:1063-1066; Onishi等、(1996)、Experimental Hematology,24:324-329；米国特許６，９９５，００９を参照できる。市販されているパッケージング系統も有用であり、例えばＡｍｐｈｏ－Ｐａｋ２９３細胞系統、Ｅｃｏ－Ｐａｋ２－２９３細胞系統、ＲｅｔｒｏＰａｃｋＰＴ６７細胞系統、およびＲｅｔｒｏ－ＸＵｎｉｖｅｒｓａｌＰａｃｋａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（全て入手元はＣｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
  レトロウイルスコンストラクトはある範囲のレトロウイルス、例えばＭＭＬＶ、ＨＩＶ－１、ＳＩＶ、ＦＩＶ、または本明細書に記載する他のレトロウイルスから派生させて良い。レトロウイルスコンストラクトは特定のウイルスの複製１サイクル超のために必要な全てのウイルスポリペプチドをコードしてよい。一部の場合において、ウイルス進入の効率は他の因子または他のウイルスポリペプチドの追加により改善する。別の場合においては、レトロウイルスコンストラクトによりコードされるウイルスポリペプチドは米国特許６，８７２，５２８に記載される通り、１サイクルより多い複製を支援しない。そのような状況においては、他の因子または他のウイルスポリペプチドの追加によりウイルス進入促進を支援できる。例示される実施形態においては、組換えレトロウイルスはＶＳＶ－ｇポリペプチドを含むがＨＩＶ－１ｅｎｖポリペプチドを含まないＨＩＶ－１ウイルスである。
  レトロウイルスコンストラクトはプロモーター、マルチクローニングサイト、および／または耐性遺伝子を含んでよい。プロモーターはテトラサイクリンオペ-レーターエレメント等の誘導プロモーターを包含するが、これらに限定されない。レトロウイルスコンストラクトは又パッケージングシグナル（例えばＭＦＧベクターから派生させたパッケージングシグナル；ｐｓｉパッケージングシグナル）を含んでよい。当該分野で知られている一部のレトロウイルスコンストラクトの例はｐＭＸ、ｐＢａｂｅＸまたはこれらの派生物を包含するが、これらに限定されない。例えばOnishi等、(1996),Experimental Hematology,24:324-329を参照できる。一部の場合において、レトロウイルスコンストラクトは自己不活性化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ）ベクターであり、例えばMiyoshi等、(1998),J.Virol.,72(10):8150-8157を参照できる。一部の場合において、レトロウイルスコンストラクトはＬＬ－ＣＧ、ＬＳ－ＣＧ、ＣＬ－ＣＧ、ＣＳ－ＣＧ、ＣＬＧまたはＭＦＧである。Miyoshi等、(1998),J.Virol.,72(10):8150-8157;Onishi等、(1996),Experimental Hematology,24:324-329;Riviere等、(1995),PNAS,92:6733-6737を参照できる。ウイルスベクタープラスミド（またはコンストラクト）はｐＭＸｓ、ｐＭｘｓ－ＩＢ、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ、ｐＭＸｓ－ｎｅｏ（ｐＭＸｓ－ＩＢはｐＭＸｓ－ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラスチシジン耐性遺伝子を担持しているベクターである）Kimatura等、(2003),Experimental Hematology,31:1007-1014;MFG Riviere等、(1995),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92:6733-6737;ｐＢａｂｅＰｕｒｏ；Morgenstern等、(1990),Nucleic Acids Research,18:3587-3596;LL-CG,CL-CG,CS-CG,CLG Miyoshi等、(1998),Journal of Virology,72:8150-8157等をレトロウイルス系として、そしてｐＡｄｅｘ１；Kanegae等、(1995),Nucleic Acids Research,23:3816-3821等をアデノウイルス系として包含する。例示される実施形態においては、レトロウイルスコンストラクトはブラスチシジン（例えば、ｐＭＸｓ－ＩＢ）、ピューロマイシン（例えば、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ）；またはネオマイシン（例えば、ｐＭＸｓ－ｎｅｏ）を含む。例えばMorgenstern等、(1990),Nucleic Acids Research、8:3587-3596を参照できる。
  パッケージング細胞から組換えウイルスを生産する方法およびそれらの使用は十分確立されており；例えば米国特許５，８３４，２５６；６，９１０，４３４；５，５９１，６２４；５，８１７，４９１；７，０７０，９９４；および６，９９５，００９を参照できる。多くの方法がウイルスコンストラクトをパッケージング細胞系統に導入することから開始する。ウイルスコンストラクトは、リン酸カルシウム法、リポフェクション法（Felgner等、(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413-7417)、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、フュージーントランスフェクション等、および本明細書に記載する何れかの方法を包含するが、これらに限定されない。何れかの当該分野で知られている方法により宿主である多能性幹細胞に導入してよい。
  核酸コンストラクトは細胞の非ウイルス系トランスフェクションのような種々の良く知られた手法を用いて宿主細胞内に導入できる。例示される側面において、コンストラクトはベクター内に取り込まれ、そして宿主細胞内に導入される。細胞への導入はエレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介移行、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介移行、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介移行（ナノ粒子）、カチオン重合体媒介移行（ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）または細胞融合を包含するがこれらに限定されない。当該分野で知られている何れかの非ウイルス系トランスフェクションにより実施してよい。トランスフェクションの他の方法はトランスフェクション試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｈｉｌｙｍａｘ、Ｆｕｇｅｎｅ、ｊｅｔＰＥＩ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ、およびＤｒｅａｍＦｅｃｔを包含する。
［Tbx6遺伝子を含む多能性幹細胞］
　本発明は、外来性のTbx6遺伝子を含む多能性幹細胞を含み、当該多能性幹細胞は、Tbx6を発現させることにより心臓前駆細胞に誘導される。また、本発明の外来性のTbx6遺伝子を含む多能性幹細胞は、Tbx6を発現させた後、Tbx6の発現を抑制し、bFGFやFGF10を含む培地で培養することによって、心筋細胞に誘導される。本明細書において「外来性」遺伝子とは、その細胞に導入される核酸をいう。本発明は、Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導可能な発現カセットを含む、多能性幹細胞を含む。Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導可能な発現カセットを含む多能性幹細胞は、前記外的刺激存在下で心臓前駆細胞に誘導される能力を有する。また、Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導可能な発現カセットを含む多能性幹細胞は、前記外的刺激によるTbx6の発現に続き前記外的刺激の存在を解除すること（すなわち、前記外的刺激の非存在下にすること）により、心筋細胞に誘導される能力を有する。
　本発明の別の実施態様においては、本発明の外来性のTbx6遺伝子を含む多能性幹細胞胞はin vitroの状態にある。本発明の別の実施態様においては、本発明の外来性のTbx6遺伝子を含む多能性幹細胞は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞から派生されている。
　Tbx6遺伝子を含む多能性幹細胞をスクリーニングすることにより、Tbx6遺伝子をより安定に含む多能性幹細胞株を樹立することもできる。スクリーニング方法は、当業者であれば適宜選択し、実施することができる。
［心臓前駆細胞］
　本発明において「心臓前駆細胞」は、心臓前駆細胞に特異的なマーカーを発現することにより特徴付けられる細胞である。心臓前駆細胞に特異的なマーカーは、心臓前駆細胞に特異的に発現する因子（心臓前駆細胞関連因子）であり、T、Mesp1、Flk1（KDR）、Pdgfrα、Isl1などが含まれる。心臓前駆細胞は、心臓前駆細胞に特異的なマーカーのうちの少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つを発現する。心臓前駆細胞は、好ましくは、T、Mesp1、およびFlk1（KDR）を発現する細胞である。
　また、本発明においては、心臓前駆細胞は多能性幹細胞から誘導されるため、誘導心臓前駆細胞と称することもある。
［心筋細胞］
　本発明において「心筋細胞」は、心筋細胞に特異的なマーカーを発現することにより特徴付けられる細胞である。心筋細胞に特異的なマーカーは、心筋細胞に特異的に発現する因子（心筋細胞関連因子）であり、心トロポニン（cTnT）、Nkx2.5、Actn2などが含まれる。心筋細胞は、心筋細胞に特異的なマーカーのうちの少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つを発現する。心筋細胞は、好ましくは、cTnT、およびNkx2.5を発現する細胞である。
　また、本発明において「心筋細胞」は拍動することにより特徴付けられ得る。さらにまた、本発明において「心筋細胞」は、横紋構造を形成することによって特徴付けられ得る。
　また、本発明においては、心筋細胞は多能性幹細胞から誘導されることから、誘導心筋細胞と称することもある。
　心臓前駆細胞または心筋細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、生化学的または免疫化学的な手法（例えば、酵素結合免疫吸着試験、免疫組織化学試験等）により検出することができる。または、心臓前駆細胞または心筋細胞に特異的な種々のマーカーをコードする核酸の発現を測定することにより検出することもできる。心臓前駆細胞または心筋細胞に特異的な種々のマーカーをコードする核酸の発現は、RT-PCR、ハイブリダイゼーション等の分子生物学的手法により確認することができる。これらの手法に用いるプライマーやプローブは、Genbankなどのデータベースより入手可能な情報を用いて、当業者であれば適宜設計し、製造することができる。
　また、心筋細胞の拍動は、目視または明視野像により確認することができる。また、パッチクランプなどの標準的な電気生理学的方法により、自発的収縮を確認することもできる。
　また、心筋細胞の横紋構造形成は、目視または明視野像により確認することができる。また、トロポニン等の心筋構造に寄与するタンパク質の免疫染色によっても確認することができる。
  本発明は、さらに上記の心臓前駆細胞または心筋細胞の製造方法により製造される、多能性幹細胞に由来する心臓前駆細胞（誘導心臓前駆細胞、心臓前駆細胞様細胞）または心筋細胞（誘導心筋細胞、心筋様細胞）に関する。本発明の誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞は、外来性のTbx6遺伝子を含む多能性幹細胞から誘導されるため、本発明の誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞も、Tbx6遺伝子を含む。本発明の別の実施態様においては、本発明の誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞はin vitroの形態にある。本発明の別の実施態様においては、本発明の誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物の細胞であるか、またはヒト細胞などの哺乳動物から誘導されている。
　多能性幹細胞から誘導された細胞が心臓前駆細胞であることは、前述のとおり心臓前駆細胞に特異的なマーカーの発現により確認することができる。このように心臓前駆細胞に特異的なマーカーの発現が確認された細胞は、心臓前駆細胞様細胞とも称される。
　同様に、多能性幹細胞から誘導された細胞が心筋細胞であることは、前述のとおり心筋細胞に特異的なマーカーの発現により確認することができる。このように心臓前駆細胞に特異的なマーカーの発現が確認された細胞は、心筋様細胞とも称される。
　マーカー発現は、遺伝子レベルまたはタンパク質レベルにより確認することができる。
　本発明は、Tbx6遺伝子を含む多能性幹細胞、またはTbx6遺伝子を含む、多能性幹細胞由来の心臓前駆細胞または心筋細胞を含む組成物をも提供する。本発明の組成物は、上記多能性幹細胞または誘導心臓前駆細胞もしくは誘導心筋細胞を含み、さらに、適当な成分として塩；緩衝剤；安定化剤；プロテアーゼ阻害剤；細胞膜および／または細胞壁保存化合物、例えばグリセロール、ジメチルスルホキシド等；細胞に適する栄養培地等を包含してもよい。
［誘導剤］
　本発明は、多能性幹細胞からの心臓前駆細胞誘導剤、または多能性幹細胞からの心筋細胞誘導剤をも提供する。
  本発明の別の実施態様においては、本発明の誘導剤は、１）Tbx6ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して発現調節する発現カセットを含む。本発明の誘導剤は、上記発現カセットに加えて、２）外的刺激、３）心臓前駆細胞から心筋細胞誘導時の培地に添加するbFGF、FGF10など、４）塩、例えばＮａＣｌ、ＭｇＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４等；緩衝剤、例えばトリス緩衝液、Ｎ-（２-ヒロドキシエチル）ピペラジン-Ｎ'-（２-エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２-（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）；等、可溶化剤;洗剤、例えばノニオン系洗剤、例えばＴｗｅｅｎ－２０；等、プロテアーゼ阻害剤；グリセロール；等の１つ以上を含むことができる。また、本発明の誘導剤は、Tbx6ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、多能性幹細胞に導入するための試薬を含むことができる。
　本発明の誘導剤は個体に直接投与することができる。本発明の誘導剤は多能性幹細胞を、心臓前駆細胞または心筋細胞に誘導するのに有用であり、この誘導はin vitroまたはin vivoにおいて実施できる。多能性幹細胞を心臓前駆細胞または心筋細胞に誘導することは、種々の心臓障害を治療するため、また、心臓分野における研究に使用できる。
  したがって、本発明の誘導剤は薬学的に許容しうる賦形剤を包含してもよい。適当な賦形剤は例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびこれらの組み合わせである。さらにまた、所望により、少量の補助的物質、例えば水和剤、または乳化剤、または緩衝剤を含有してよい。そのような剤型を調製する実際の方法は知られている。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania、17th edition、1985を参照できる。
  薬学的に許容しうる賦形剤、例えばベヒクル、アジュバント、担体または希釈剤は容易に入手できる。さらに、薬学的に許容しうる補助的物質、例えばｐＨ調節剤および緩衝剤、張力調節剤、安定化剤、水和剤等は容易に購入することもできる。
［細胞を用いた治療方法］
  本発明のTbx6遺伝子を含む多能性幹細胞は、治療の必要な個体においてそのような治療のために使用できる。同様に、本発明の誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞は治療の必要な個体においてそのような治療のために使用できる。本発明のTbx6遺伝子を含む多能性幹細胞、または本発明の誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞は、レシピエント個体（治療の必要な個体）中に導入することができ、その場合、本発明のTbx6遺伝子を含む多能性幹細胞、または本発明の誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞のレシピエント個体への導入は、個体における状態または障害を治療する。したがって、本発明は、本発明のTbx6遺伝子を含む多能性幹細、または本発明の誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞を個体に投与することを含む治療方法に関する。
  例えば、一部の実施形態においては、本発明の治療方法は、ｉ）in vitroで誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞を発生させること；およびｉｉ）誘導心臓前駆細胞または誘導心筋細胞をそれを要する個体中に導入すること、を含む。
  本発明の治療方法は、心臓または心臓血管の疾患または障害、例えば心臓血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管偶発症（卒中）、心臓血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心障害、心筋炎、冠状静脈弁疾患、拡張性動脈疾患、拡張期機能不全、心内膜炎、高血圧、心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、結果として虚血性心筋症をもたらす冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓を有する個体を治療するために有用である。
  誘導心臓前駆細胞、または誘導心筋細胞の集団の単位剤型は約１０３個～約１０９個、例えば約１０３個～約１０４個、約１０４個～約１０５個、約１０５個～約１０６個、約１０６個～約１０７個、約１０７個～約１０８個、または約１０８個～約１０９個の細胞を含有できる。
［実施例１］　マウスES細胞の培養
　ゼラチンコーティングした10 cm組織培養用dish（Thermo Scientific社、172958）にマウスT-GFP ES細胞（Prof. Gordon Keller, Toronto Medical Discovery Tower MaRS Centre  101 College Street, Room 8-706 Toronto, ON M5G 1L7 CANADAより入手）を1.0×106 cell/dishの濃度で播種し、ES細胞用培地（表１）を用いて37℃/5％ CO2条件下で培養した。以降、2～3日毎に継代を行った。T-GFP ES細胞は、心臓中胚葉のマーカー転写因子であるTが発現した際に、GFPが陽性となる細胞である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２］　サイトカインを用いたマウスES細胞からの心臓前駆細胞および心筋細胞への誘導
　実施例１で継代したES細胞は、ES細胞用培地を吸引した後にPBS（－）で洗浄し、各dishに対して0.05％Trypsin-EDTAを2 mL加え、37℃/5％ CO2条件下で3分間静置した。細胞が培養液に浮き上がることを確認した後、1 mL FBS/7 mL IMDM溶液で中和し、15 mLチューブ（Corning社、430791）に細胞を回収した。1100 RPM/3分間遠心した後に上清を吸引し、細胞沈殿物にIMDM 10 mLを加え、細胞数を計測した。7.5×105 cellの溶液を新しい15 mLチューブに移し、1100 RPM/3分間遠心した後に、上清を吸引した。無血清培地（表２）10 mLにL-ascorbic acidおよび1-thyolglycerolを加えた無血清分化用培地（表３）を細胞沈殿物に加え、10 cm滅菌シャーレ（IWAKI社、SH90-15）に播種した（day0）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　day1には、シャーレを前後左右に撹拌し、細胞を均一に分布させた。
　day2には、形成された胚葉体を培地ごと15 mLチューブに移し、700 RPM/3分間遠心し、上清を吸引した。沈殿した胚葉体に0.05％ Trypsin-EDTAを2 mL加え、37℃/5％ CO2条件下で2分間静置した。ピペッティングを繰り返した後に、1 mL FBS/7 mL IMDM溶液で中和し、1200 RPM/3分間遠心した後に上清を吸引した。沈殿物を10 mL IMDMで希釈し、細胞数を計測した。7.5×105 cellの溶液を新しい15 mLチューブに移し、1100 RPM/3分間遠心した後に上清を吸引した。細胞沈殿物に心臓前駆細胞誘導用培地（表４）10 mLを加え、滅菌シャーレに播種した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　day3にはシャーレを前後左右に撹拌し、細胞を均一に分布させた。
　day4に心臓前駆細胞が誘導された。day2と同様に、形成された胚葉体を培地ごと15 mLチューブに移し、700 RPM/3分間遠心した後に上清を吸引した。沈殿した胚葉体に0.05％ Trypsin-EDTAを2 mL加え37℃/5％ CO2条件下で2分間静置した。ピペッティングを繰り返した後に、1 mL FBS/7 mL IMDM溶液で中和し、1200 RPM/3分間遠心した後に上清を吸引した。沈殿物を10 mL IMDMで希釈し、細胞数を計測した。6.0×105 cell/wellの溶液を新しい15 mLチューブに移し、1100 RPM/3分間遠心した後に上清を吸引した。細胞沈殿物に心筋細胞誘導用培地（表５）を加え、ゼラチンコーティングした24 well細胞培養用マルチウェルプレート（FALCON社、353047）に播種した。細胞を接着させるために15分静置した後に、37℃/5％ CO2条件下で培養した。以降、2～3日毎に培地を交換した。良好な誘導が得られている場合はday7より心筋拍動が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［実施例３］　テトラサイクリン遺伝子発現調節システムのマウスES細胞への導入
　実施例３では、レンチウイルスを用いてマウスES細胞にTbx6を遺伝子導入した。用いたベクターは、ドキシサイクリンの添加によって、時期特異的に導入遺伝子の発現を制御することが可能である（図１）。
　10 cm組織培養用dish（Corning社、353047）に293T細胞を6.0×106 cell/dishの濃度で播種し、37℃/5％ CO2条件下で静置した（day1）。
　翌日（day2）、1500μL Opti-MEM（gibco社、31985-070）にLipofectamine 36μL（Invitrogen社、1168-019）を混合した溶液Ａと、1500μL Opti-MEMにCSIV-TRE-RfA-UbC-KT-Tbx6プラスミド 25μg、pMDL 10μg、およびpCMV-VSV-G-RSV-Rev 10μgを混合した溶液Ｂとを作製し、室温で5分間静置した。その後、溶液Ａと溶液Ｂを混合した混合液Ｃを作製し、20分間静置した。day1に用意した293T細胞から培地を吸引した後に、混合液Ｃ 3mLと293T細胞用培地（表６－１）7mLとを混合した溶液を加え、37℃/5％ CO2条件下で培養した（トランスフェクション）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　24時間後（day3）の培地を、293T細胞培養液にForskolin（WAKO社、66575-29-9）10μMを混合した培地に交換した。
　また、day4でのウイルス液感染用に、ゼラチンコーティングした12 well細胞培養用マルチウェルプレート（FALCON社、353043）にES細胞を3.0×105 cell/wellの濃度で播種し、ES細胞用培地で培養した。
　トランスフェクションの48時間後（day4）、培養上清を0.45μm pore size Minisart フィルター（Sartorius Stedim Biotech社、17598）で濾過を行った後、50 mLチューブ（Corning社、430829）に回収した。回収した上清10 mLは超高速遠心機（Beckman社、Optima XL）を用いて23000 RPM/2時間で超遠心を行った。遠心後に上清を吸引し、沈殿を1.3μL Polybrene Transfection Reagent（10 mg/mL）（Millipore社、#TR-1003-G）を混注したES細胞用培地1 mLで溶解し、これをTbx6に対するレンチウイルス溶液とした。前日（day3）より培養していたES細胞の培地をレンチウイルス溶液に交換し、ウイルスを感染させた（インフェクション）。
　day5にレンチウイルス液をES細胞用培地に交換し、培養を継続した。感染細胞がコンフルエントになった後に、10 cm組織培養dishに継代した。コロニーが適度な大きさになった段階で、顕微鏡下でピペットマン先端を用いてコロニーを採取分離し、単一コロニーからのES細胞のクローニングを行った。
［実施例４］　Tbx6による無血清での心臓前駆細胞誘導
　day0では、実施例２と同様の手法を用いて、実施例３でクローニングしたES細胞を播種した。その際に、血清分化用培地にはドキシサイクリン （Sigma社、D9891）2μg/mLを添加した。
　day1では、実施例２と同様にシャーレの撹拌を行った。
　day2においても、実施例２と同様の手法で滅菌シャーレに細胞を播種した。ただし、この際の培地はday0と同様にドキシサイクリンを添加した無血清分化用培地を使用した。
　day3では、実施例２と同様にシャーレの撹拌を行った。
　day4において、誘導された心臓前駆細胞の解析を行った。また、day4以降は、実施例３と同様に実験を行った。
　ドキシサイクリンは、誘導開始から３日間存在させ（図３「Dox On」）、３日間Tbx6を発現させた。図２は、クローニングにより得られた細胞株におけるTbx6 mRNAの発現量を測定した結果を示す。ドキシサイクリン（Dox）存在下（＋）に、Tbx6 mRNAの発現が認められた。
［実施例５］　Tbx6による無血清での心臓前駆細胞および心筋細胞の誘導の検証
［FACS解析方法］
　心臓前駆細胞を含む胚葉体を培地と共に回収し、0.25％ Trypsin-EDTAを加え、37℃/5％ CO2条件下で2分間静置し、単一細胞にした。Trypsin-EDTAを中和した後に、15 mLチューブ（Corning社、430791）に細胞を回収した。回収した細胞を1500rpm/5分間/4℃で遠心分離した。上清を吸引後、細胞沈殿物にFACS施行用溶液（5％FBS/PBS）（表６－２）100μLを加え、十分に混ぜ合わせた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　この混合物と、anti-mouse Flk1 conjugated with APC抗体（ebioscience, 17-5821）とanti-mouse PdgfR-a (CD140a) conjugated with BV421抗体（BD Biosciences, 562774）をそれぞれ50:1の濃度で30分反応させた。遠心後に抗体を除去し、沈殿した細胞塊に再度FACS施行用溶液350μLを加えた。この濁液をセルストレーナー・キャップ付き5 mLポリスチレン ラウンドチューブ（FALCON社、REF 353335）にてフィルターをかけ、FACS用試料とした。
　フローサイトメトリー（日本ベクトン・ディッキンソン、FACS AriaIIIu）を使用し、上記の試料における測定を行った。
［免疫染色による心臓前駆細胞の誘導の検証］
　図４は、免疫染色によるGFPの画像である。実施例で使用したES細胞（T-GFP ES細胞）は心臓中胚葉のマーカー転写因子であるTが発現した際に、GFPが陽性となる細胞である。「Off」は、ドキシサイクリンを添加しない実施例４の細胞株、「On」はドキシサイクリンによりTbx6を誘導させた実施例４の細胞株、「BMP4/Activin」は、BMP4およびActivinによりES細胞から分化させた細胞（実施例２）の結果を示す（Day 4）。テトラサイクリン遺伝子発現調節システムを用いてマウスES細胞にTbx6遺伝子を導入した細胞（実施例３および４）では、ドキシサイクリンの添加によってGFPが陽性となったことから、心臓中胚葉のマーカー転写因子であるTが発現したことがわかる。また、実施例３および４のES細胞では、ドキシサイクリンによって、BMP4およびActivinなどのサイトカインを使用した細胞（実施例２）と同程度にGFPが発現した。
　したがって、Tbx6をES細胞に遺伝子導入すると、無血清かつ液性因子を使用せずに心臓前駆細胞を誘導できることが示された。また、本実施例では、サイトカインを使用した場合（BMP4/Activin）と同程度の誘導効率で心臓前駆細胞を誘導できることが示された。
［FACSによる心臓前駆細胞の誘導の検証］
　図５は、GFPの発現をFACSで測定した結果を示す。前述のとおり、実施例で使用したES細胞は心臓中胚葉のマーカー転写因子であるTが発現した際に、GFPが陽性となる。「Off」は、ドキシサイクリンを添加しない実施例４の細胞株、「On」はドキシサイクリンによりTbx6を誘導させた実施例４の細胞株、「BMP4/Activin」は、BMP4およびActivinによりES細胞から分化させた細胞（実施例２）の結果を示す（Day 4）。テトラサイクリン遺伝子発現調節システムを用いてマウスES細胞にTbx6遺伝子を導入した細胞（実施例３および４）では、ドキシサイクリンの添加によってGFP発現陽性細胞が８１．３％であったのに対し、「BMP4/Activin」では、９５．６％の細胞がGFP陽性細胞であった。この結果から、Tbx6をES細胞に遺伝子導入し、発現させると、心臓中胚葉のマーカー転写因子であるTが発現し、心臓前駆細胞が誘導されることがわかった。
　次に、心臓前駆細胞ではFlk-1およびPDGFRαの両表面マーカーが共陽性となることが知られている。Flk-1およびPDGFRαの発現を測定した結果を図６に示す（Day 4）。Tbx6をES細胞に遺伝子導入し、発現させると（図６「on」）、Flk-1（＋）／PDGFRα（＋）細胞が３７．５％であったのに対し、「BMP4/Activin」では、３５．４％がFlk-1（＋）／PDGFRα（＋）細胞であった。このことから、テトラサイクリン遺伝子発現調節システムを用いてマウスES細胞にTbx6遺伝子を導入し、発現させた細胞では、心臓前駆細胞が誘導されることが分かった。また、本発明においては、BMP4およびActivinといったサイトカインを使用した従来の方法で誘導した場合と同程度の効率で心臓前駆細胞を誘導できることが分かった。
　したがって、これらの実施例より、Tbx6の発現のみで、ES細胞から心臓前駆細胞が誘導されることが明らかとなった。また、本発明の方法は、血清や液性因子等を使用する従来の方法と同様の効率で心臓前駆細胞を誘導できることが明らかとなった。
［心筋細胞の誘導の検証］
　心臓前駆細胞誘導3日目以降にTbx6発現を中止し、成熟分化した拍動心筋細胞を誘導させた。具体的には、ドキシサイクリンは、誘導開始から3日間のみ培地に存在させ（図３）、Day 14における心筋細胞の誘導を検討した。
　まず、免疫染色により、心筋のマーカーであるα-アクチニン（α-Actinin）および心臓トロポニンＴ（cTnT）の発現を測定した。その結果、ドキシサイクリン処理を行った細胞（図７「Dox On」）では、トロポニンT、アクチニンなどの構造タンパク質の発現が確認されたが、ドキシサイクリン処理をしない細胞（図７「Dox Off」）では、これらのタンパク質の発現は検出されなかった。
　トロポニンTの発現をFACSで測定した結果を図８に示す。Tbx6遺伝子誘導細胞に3日間ドキシサイクリン処理した細胞（図８「On」）では、トロポニンTを発現した細胞の割合は６６．７％であったのに対し、ES細胞をBMP4およびActivinといった従来の液性因子で誘導した細胞では、トロポニンTの発現は６３．９％であった。したがって、トロポニンTの誘導効率は、Tbx6を使用する本発明の方法と、液性因子を使用した従来法と同等であった。
　また、心筋関連マーカーのmRNAの発現を調べた（図９）。アクチニン２（Actn2）、トロポニンT2（TnnT2）、およびNkx2.5等は、心筋細胞特有に発現するマーカーである。図９に示すとおり、Tbx6遺伝子誘導細胞に3日間ドキシサイクリン処理した細胞（図９「On」）では、これらのマーカー遺伝子のmRNA発現が確認された。これらの発現は、従来法によりES細胞より誘導された心筋細胞（BMP4/Activin）と同程度であった。
　また、Tbx6で誘導した心臓前駆細胞から分化させた心筋細胞は、拍動することも確認された。
　このように、Tbx6遺伝子を含むES細胞は、Tbx6遺伝子を発現させて心臓前駆細胞を誘導させた後、Tbx6の発現が制御されることにより、BMP4/Activin使用時と同様に心筋細胞に分化した。したがって、Tbx6を発現させることによってES細胞から心臓前駆細胞が誘導され、Tbx6の発現を制御すると心臓前駆細胞が心筋細胞に分化することが明らかになった。
［実施例６］　ヒトiPS細胞の培養
　hES-qualified Matrix（Corning社、354277）でコーティングした10 cm組織培養用dishにヒトiPS細胞（京都大学 iPS細胞研究所（CiRA）医療応用推進室より入手）を約10 cells/colonyの状態で播種し、ヒトiPS細胞用培地（mTESRTMTM1（STEMCELL社、05850））を用いて37℃/5％ CO2条件下で培養した。以降、7日毎に継代を行った。
［実施例７］　ヒトiPS細胞からのサイトカインを用いた心臓前駆細胞および心筋細胞への誘導
　誘導開始4日前（day-4）にヒトiPS細胞用培地を吸引した後に、ヒトiPS細胞をPBS（－）で洗浄し、各dishに対してStemPro Accutase Cell dissociation Reagent（GIBCO社、A1115-01）を500μL加え、37℃/5％ CO2条件下で3分間静置した。細胞をPBS（-）で洗浄した後、ヒトiPS細胞用培地で懸濁して40μmフィルターを通し、単細胞を回収する。細胞数を計測し、1×105 cell/wellでMatrigelコーティング済みの12w
ell細胞培養用マルチウェルプレートに播種した。
　day0にPBSで洗浄した後にヒト心臓前駆細胞誘導用培地（表７）に交換して2日間培養した。day2にPBS（-）で洗浄した後に、ヒト無血清分化用培地（表８）に交換した。　day3に、培地をヒト心筋細胞誘導用培地に換えて4日間培養した（表９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　day7以降はヒト無血清分化用培地にVEGFを添加した培地で培養し、2～3日ごとに培地を交換した。良好な誘導が得られている場合はday8から心筋拍動が認められた。
［実施例８］　テトラサイクリン遺伝子発現調節システムのヒトiPS細胞への導入
　実施例３（マウスES細胞）と同様に、レンチウイルス溶液を調製した。
　6 well細胞培養用マルチウェルプレートをMatrigelでコーティングしておき、ウイルス溶液2 mLに対してヒトiPS細胞を2×104cell加え、コーティング済みのプレートに播種した。
　翌日からmTESR1で培養した。感染細胞がコンフルエントになった後、10 cm組織培養dishに継代した。コロニーが適度な大きさになった段階で、顕微鏡下でピペットマン先端を用いてコロニーを採取分離し、単一コロニーからのヒトiPS細胞のクローニングを行った。時期特異的にTbx6を発現するヒトiPS細胞株を樹立した。
［実施例９］　Tbx6による無血清でのヒト心臓前駆細胞、心筋細胞誘導
　誘導開始４日前（day-4）において、実施例７と同様の手法を用いて実施例８でクローニングしたヒトiPS細胞を播種した（図１０　プロトコール）。
　誘導開始１日前（day-1）に、mTESR1にドキシサイクリン2μg/mLを添加した。
　day0に、細胞をPBS（-）で洗った後、ヒト無血清分化用培地に交換し、3日間培養した。
　day3以降は実施例７と同様の方法で細胞を培養した。
［心臓前駆細胞の誘導の検証］
　ES細胞を用いたときと同様に、iPS細胞からの心臓前駆細胞の誘導を検証した。ES細胞とは異なり、ヒトiPS細胞の場合は誘導開始前1日間のみ（Day-1）、Tbx6を発現させた（図１０　プロトコール、Dox On）。
　Tbx6を遺伝子導入したヒトiPS細胞において、ドキシサイクリン処理によってTbx6を発現させると、Day１において、心臓中胚葉のマーカー転写因子Tの発現がFACSおよび免疫染色により確認された（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
　したがって、Tbx6発現によって、ヒトiPS細胞からヒト心臓前駆細胞が誘導されることが明らかとなった。
［心筋細胞の誘導の検証］
　Tbx6を遺伝子導入したヒトiPS細胞において、ドキシサイクリン処理によってTbx6を発現させると、Day 14において、心筋細胞のマーカーであるトロポニンTの発現がFACSにより確認された（図１０Ｃ）。また、Tbx6発現により誘導した心臓前駆細胞は拍動する成熟心筋細胞まで分化することが確認された（Day 14）。
　また、トロポニンTの他、心臓前駆細胞由来の血管内皮細胞マーカー（CD31）および平滑筋マーカー（Calponin）の発現が認められた（図１０Ｄ）。
　したがって、Tbx6によりヒトiPS細胞から誘導された心臓前駆細胞は、ヒト心筋だけではなく、血管内皮細胞や平滑筋細胞にも分化し得ることが示された。よって、Tbx6によりヒトiPS細胞から誘導された心臓前駆細胞は多能性を有することが示された。
　本発明により、多能性幹細胞から心臓前駆細胞および心筋細胞を誘導する方法が提供される。また、本発明により、多能性幹細胞から心臓前駆細胞および／または心筋細胞を誘導する細胞が提供される。本発明の心筋誘導多能性幹細胞は、Tbx6の発現のオン・オフによって心臓前駆細胞の誘導・心筋細胞の誘導を調節することができる。
　詳しくは、本発明により、ドキシサイクリン投与等の外的刺激により遺伝子発現を制御できるシステムを用いて、マウスES細胞またはヒトiPS細胞から心臓前駆細胞が誘導され、さらに、外的刺激を取り除くことによりTbx6発現を抑制すると、機能的に成熟な心筋細胞が誘導される。
　本発明の心臓前駆細胞および心筋細胞の製造方法は、マウス細胞では既報にあるEomesによる心臓前駆細胞および心筋細胞の誘導効率と比較して2～3倍の効率を有することから、高率に心臓前駆細胞および心筋細胞を製造することができる。
　配列番号１：ヒトTbx6のヌクレオチド配列。
　配列番号２：ヒトTbx6のアミノ酸配列。
　配列番号３：マウスTbx6のヌクレオチド配列。
　配列番号４：マウスTbx6のアミノ酸配列。

Claims (10)

  1. 　多能性幹細胞にTbx6遺伝子を発現させることを含む、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を製造する方法。
  2. 　(i)　多能性幹細胞にTbx6遺伝子を発現させることを含む、多能性幹細胞から心臓前駆細胞を誘導する工程、および
    　(ii)　Tbx6遺伝子の発現を抑制することを含む、工程（i）で誘導された心臓前駆細胞から心筋細胞を誘導する工程
    を含む、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法。
  3. 　Tbx6遺伝子の発現および発現の抑制が、外的刺激に応答して発現調節する発現カセットを用いて行われるものである、請求項１または２の方法。
  4. 　多能性幹細胞にTbx6遺伝子を発現させる工程が、
    　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットを、多能性幹細胞に導入する工程；および
    　前記発現カセットが導入された多能性幹細胞を、外的刺激の存在下に培養する工程
    を含む、請求項１～３のいずれか1項に記載の方法。
  5. 　多能性幹細胞にTbx6遺伝子を発現させる工程が、
    　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットを、多能性幹細胞に導入する工程；および
    　前記発現カセットが導入された多能性幹細胞を、外的刺激の存在下、かつ血清非存在下に培養する工程
    を含む、請求項１～４のいずれか1項に記載の方法。
  6. 　Tbx6遺伝子の発現を抑制する工程が、
    　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入された多能性幹細胞を、外的刺激の非存在下に培養する工程
    を含む、請求項２～５いずれか1項に記載の方法。
  7. 　多能性幹細胞が、ES細胞またはiPS細胞である、請求項１～６のいずれか1項に記載の方法。
  8. 　外的因子がテトラサイクリンまたはドキシサイクリンである、請求項１～７のいずれか1項に記載の方法。
  9. 　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されており、前記外的刺激存在下に培養することにより、心臓前駆細胞に誘導される、多能性幹細胞。
  10. 　Tbx6遺伝子の発現を外的刺激に応答して誘導することが可能な発現カセットが導入されており、前記外的刺激存在下に培養後に、前記外的刺激非存在下に培養することにより、心筋細胞が誘導される、多能性幹細胞。
     
      
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