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WO2016207448A1 - Composiciones celulolíticas que comprenden enzimas polisacárido monooxigenasa con actividad mejorada - Google Patents

Composiciones celulolíticas que comprenden enzimas polisacárido monooxigenasa con actividad mejorada Download PDF

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WO2016207448A1
WO2016207448A1 PCT/ES2015/070485 ES2015070485W WO2016207448A1 WO 2016207448 A1 WO2016207448 A1 WO 2016207448A1 ES 2015070485 W ES2015070485 W ES 2015070485W WO 2016207448 A1 WO2016207448 A1 WO 2016207448A1
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WO
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nickel
enzyme
cation
combination
beta
Prior art date
Application number
PCT/ES2015/070485
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Francisco Manuel REYES SOSA
Bruno Díez García
Noelia VALBUENA CRESPO
Antonio Javier MORENO PÉREZ
Dolores PÉREZ GÓMEZ
Ana Isabel PLATERO GÓMEZ
Lucía MARTÍN PÉREZ
Sandra GAVALDÁ MARTÍN
Laura VIÑAS DE LA CRUZ
Laura SÁNCHEZ ZAMORANO
Consolación ÁLVAREZ NÚÑEZ
María de los Angeles BERMÚDEZ ALCÁNTARA
Javier ROCHA MARTÍN
Laura LEDESMA GARCÍA
Juan Luis RAMOS MARTÍN
Original Assignee
Abengoa Bioenergía Nuevas Tecnologías, S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US15/739,679 priority patent/US10626381B2/en
Priority to EP15745231.9A priority patent/EP3315609A1/en
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    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13025—Methane monooxygenase (1.14.13.25)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the invention relates to the field of bioproducts, more particularly to the improvement of enzymatic mixtures comprising polypeptides with monooxygenase polysaccharide activity and their use for the production of fermentable sugars from cellulosic biomass during bioproduct production processes, such as bioethanol. .
  • Plant biomass provides an abundant source of potential energy in the form of carbohydrates that can be used in numerous industrial and agricultural processes and, therefore, is an important renewable source for generating fermentable sugars.
  • the fermentation of these sugars can produce final products with commercial value such as biofuels and chemical bioproducts.
  • the objective of any saccharification technology is to change or eliminate structural and compositional obstacles in order to improve the rate of enzymatic hydrolysis and increase the yield of fermentable sugars obtained from cellulose or hemicellulose (N. Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96, 673-686).
  • the fermentation process is carried out. Therefore, the greater the amount of complex sugars left at the end of the hydrolytic process, the lower the yield in ethanol production at the end of the fermentation process. Therefore, a field of research aimed at reducing costs and improving the performance of biofuel production procedures is focused on improving the technical effectiveness of hydrolytic enzymes, or in general on improving the effectiveness of enzymatic cocktails used to generate sugars Fermentable from biomass.
  • Cellulases are multienzyme complexes comprising at least three major components, endo-p-glucanase (EC 3.2.1 .4), exo-p-glucanase or cellobiohydrolase (EC 3.2.1 .9.1) and ⁇ -glucosidase (EC 3.2. 1 .21), and have been shown to act synergistically in the hydrolysis of cellulose (Woodward, J. 1991, Bioresource Technology ⁇ / o ⁇ 36, p. 67-75).
  • Microbial cellulases have become reference biocatalysts due to their complex nature and extensive industrial applications (Kuhad R. C. et al., 201 1, Enzyme Research, Article ID 280696). Recently, considerable attention has been given to current knowledge about cellulase production and the challenges in cellulase research have focused especially on obtaining cellulases with increased activity and improved properties.
  • glycosyl hydrolase proteins of family 61 have been known for 20 years. These GH61 proteins are auxiliary proteins that contribute to cellulose degradation. The fact that these enzymes act by direct oxidation of cellulose, instead of by hydrolysis, has led to its current name: Cu-dependent polysaccharide monooxygenases (Polysaccharide Monoxygenase; PMOs). Compared to other cellulolytic enzymes, PMOs are relatively small proteins with typical molecular weights between 20 and 50 kDa (Baldrian and Valaskova 2008, FEMS Microbiology Reviews 32: 501-521; Harris et al., 2010, Biochemistry 49: 3305-3316 ).
  • the hydrolytic efficacy of a multienzyme complex in the saccharification process of cellulosic material depends on both the properties of individual enzymes and the proportion of each enzyme present in the complex. Therefore, in the context of biofuel production procedures, it is necessary to design enzyme cocktails with better individual activities. Specifically, it would be an advantage in the art to improve the activity and stability of PMO polypeptides. In this sense, several publications have proposed to supplement the enzymatic mixtures containing cellulases and PMOs with copper, which is a cofactor of PMOs, to increase the activity and stability of these enzymes (US2014127771, WO2012138772).
  • the present invention relates to methods and compositions for stabilizing and increasing the activity of enzyme mixtures comprising GH61 (or PMO) polypeptides used for degradation. of cellulosic material during the saccharification stage of biofuel production procedures. This improvement is achieved by the presence or addition of a nickel cation to said enzymatic mixtures before and / or during the saccharification stage.
  • the examples show that the presence of nickel in said enzymatic mixtures leads to a higher yield of fermentable sugars (mainly glucose) released in a biomass saccharification process, compared to the presence of other divalent metals, such as Mg 2+ or Mn 2+ (figure 5).
  • Figure 4 shows that PMOs are more stable in the presence than in the absence of nickel, which contributes to the improvement of their activity in the enzymatic mixture.
  • nickel does not affect the thermostability of other cellulolytic enzymes.
  • the invention shows that the presence of nickel in enzyme cocktails comprising GH61 polypeptides or PMOs contributes to improving the hydrolytic process performance of the Cellulosic biomass in which these cocktails are used. Consequently, this leads to improved biofuel production.
  • composition of the invention relates to a composition comprising at least one polysaccharide monooxygenase (PMO) enzyme and a nickel cation.
  • PMO polysaccharide monooxygenase
  • the nickel cation is present in a concentration of more than 0.0001 mM and less than 50 mM, preferably between 0.001 and 20 mM, more preferably between 0.001 and 5 mM, even more preferably between 0.05 and 5 mM and even more preferably between 0.05 and 0.5 mM.
  • a concentration of nickel between 0.05 and 0.5 mM gives the highest glucose yield by the enzyme mixture on cellulosic biomass, compared to other nickel concentrations outside this range. Therefore, this range for nickel concentrations in the composition of the invention is most preferred.
  • the nickel concentration is between 0.075 and 0.125 mM, even more preferably the nickel concentration is 0.125 mM.
  • the nickel cation is a divalent cation.
  • the divalent nickel cation is preferably present as a soluble salt, for example, a salt of chlorate, chloride, chromate, acetate, citrate, fluoride, formate, iodide, nitrate, oxalate, perchlorate, selenate or sulfate, or as an insoluble salt , for example, a carbonate, hydroxide, oxide, phosphate, pyrophosphate or sulphide salt.
  • the nickel cation is in the form of a salt.
  • the nickel salt is selected from nickel sulfate, nickel chloride, nickel nitrate, nickel acetate or nickel hydroxide, or any combination thereof.
  • the nickel cation can be added to the composition of the invention and / or it may already be present in the bioreactor where the hydrolysis of biomass with the enzymatic composition is to be carried out, since the cellulosic biomass can comprise a series of divalent metal cations, including Ni. Therefore, cellulosic biomass can be, partly or totally, a source of the nickel cation. This nickel cation can be soluble or insoluble. However, the nickel cation may not be available in solution because, for example, it is complexing with a component of cellulosic biomass. For this reason, the addition or supplementation of the composition of the invention with a nickel cation may be necessary.
  • polysaccharide monooxygenase PMO
  • polypeptide that enhances cellulolytic activity Glycosyl hydrolases of family 61 or GH61
  • PMO polysaccharide monooxygenase
  • GH61 glycosyl hydrolases of family 61
  • PMO polypeptide that enhances cellulolytic activity
  • glycosyl hydrolases of family 61 GH61
  • PMO polypeptide that enhances cellulolytic activity
  • GH61 glycosaccharide monooxygenase
  • GH61 glycosaccharide monooxygenase
  • a saccharification reaction for example, one in which endoglucanases, beta-glucosidases and cellobiohydrolases are used
  • results in a greater amount (higher yield) of one or more soluble sugars (eg glucose) released compared to the saccharification reaction performed under the same conditions but in the absence of the GH61 protein.
  • the activity of the PMO can be determined, for example, by indirect oxidative assays that show by colorimetry the phenomenon of electron transfer using different electron donor and acceptor compounds (Kitt et al., 2012, Biotechnology for Biofuels Vol. 5: 79, p. 1-13).
  • the efficiency on biomass could be measured, for example, by combining the PMO polypeptide with cellulase enzymes in a saccharification reaction and determining if there is an increase in glucose yield compared to the same saccharification reaction performed in the absence of this polypeptide.
  • PMO polypeptides can be obtained, without limitation, from a filamentous fungus such as Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Gibberella, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomycesces, Penicillromycesomy, Penicillizyromycesum, Penicillizyromycesum, Penicillizromycesum, Penicillium Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma or Myceliophthora.
  • a filamentous fungus such as Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Gibberella, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomycesces, Penicillromyceso
  • the PMO is a PMO of Myceliophthora thermophila, Gibberella zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Talaromyces magnefei, Trichoderma harzianum, Trichoderma trichoderma trichoderma, Trichoderma trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma, trichoderma
  • the invention encompasses the perfect and imperfect states, and other taxonomic equivalents, for example the anamorph, with respect to the name of the species by which they are known.
  • taxonomic equivalents for example the anamorph
  • suitable equivalents For example, Myceliophthora thermophila is equivalent to Chrysosporium lucknowense.
  • PM01 is a polypeptide comprising SEQ ID NO: 1
  • PMO2 is a polypeptide comprising SEQ ID NO: 2
  • PMO3 is a polypeptide comprising SEQ ID NO: 3.
  • the PMO enzyme (s) comprised in the composition of the invention can preferably be isolated from M. thermophila, or produced recombinantly.
  • the PMO enzyme (s) can be synthesized for example, but without limitation, in vitro. For example, by solid phase peptide synthesis or by recombinant DNA procedures.
  • the PMO enzyme (s) can be produced recombinantly, not only directly, but also as a fusion polypeptide together with a homologous or heterologous polypeptide, which may contain, for example, but not limited to, a signal sequence, or other polypeptide that it has a protease cleavage site, for example, but without limitation, at the N-terminal end of the mature protein or polypeptide.
  • composition of the invention may further comprise other enzymatic activities such as aminopeptidase, amylase, carbohydrase, carboxyptidase, catalase, cellulase, such as endoglucanases, beta-glucosidases and / or cellobiohydrolase activities; chitinase, cutinase, cyclodextrin glycosyltransferase, deoxyribonuclease, esterase, alpha-galactosidase, beta-galactosidase, glucoamylase, alpha-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacasa, lipase, mannosidase, oxidase, reductase, pectinlutamine enzyme, peptidoglytic, peptido-lysine peroxidase, phytase, polyphenoloxidase, protease, proteolytic enzyme
  • the enzyme or additional enzymes may be produced, for example, by a microorganism belonging to the genus Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus such as Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Aspergill nipergillus Asper
  • the composition of the invention further comprises cellulolytic enzymes.
  • cellulolytic enzymes also known as “cellulases” refers to a class of enzymes capable of hydrolyzing cellulose ( ⁇ -1, 4-glucan or ⁇ -D-glucosidic bonds) or hemicelluloses in shorter oligosaccharides, cellobiose and / or glucose
  • cellulolytic enzymes are, but are not limited to, endoglucanases, beta-glucosidases, cellobiohydrolases, beta-xylosidases, endo (xyl) glucanases or endoxylanases.
  • the cellulolytic enzymes are selected from endoglucanase, beta-glucosidase, cellobiohydrolase, beta-xylosidase, xyloglucanase, xylanase, arabinofuranosidase or any combination thereof.
  • EG animallucanase
  • E.C. 3.2.1 .4 cellulase enzymes classified as E.C. 3.2.1 .4. These enzymes hydrolyse the internal ⁇ -1, 4-glucosidic bonds of cellulose.
  • cellobiohydrolase (EC 3.2.1 .91 and EC 3.2.1 .176) refers to a protein that catalyzes cellulose cellulose hydrolysis by exoglucanase activity, sequentially releasing cellobiose molecules from reducing or non-reducing ends of cello-oligosaccharides.
  • beta-glucosidase (EC 3.2.1 .21) as used herein, refers to an enzyme that catalyzes the hydrolysis of a sugar dimer, including but not limited to cellobiose, with the release of a corresponding sugar monomer, used for, but not limited to, the synthesis of ethanol.
  • the beta-glucosidase enzyme acts on the ⁇ 1 ⁇ 4 bonds that bind two substituted glucose or glucose molecules (i.e., the cellobiose disaccharide). It is an exocellulase with specificity for a variety of beta-D-glycoside substrates. It catalyzes the hydrolysis of non-reducing terminal residues in beta-D-glycosides with the release of glucose.
  • xylanase refers to an enzyme that catalyzes the endohydrolysis of 1,4-beta-D-xylosidic bonds in xylanes.
  • ⁇ -xylosidase (EC 3.2.1 .37) refers to a protein that hydrolyzes 1,4-p-D-xyl-oligomers short in xylose.
  • xyloglucanase refers to a specific xyloglycan enzyme that can catalyze the solubilization of xyloglucan in oligosaccharides, but does not show substantial cellulolytic activity.
  • arabinofuranosidase (EC 3.2.1 .55) refers to the enzyme that catalyzes the hydrolysis of non-reducing alpha-L-arabinofuranoside terminal residues in alpha-L-arabinosides.
  • PMOs and cellulolytic enzymes comprised in the composition of the invention can be derived from any microorganism capable of producing cellulolytic enzymes.
  • the PMO enzyme (s) and cellulolytic enzymes are an enzymatic mixture secreted by Myceliophthora thermophila, more preferably by strain C1 of M. thermophila.
  • the strain of Myceliophthora thermophila can be a natural strain or a mutant strain that has been modified, for example, to overexpress one or more of the secreted enzymes or to overexpress mutant enzymes with improved properties.
  • the composition of the invention is an enzymatic mixture secreted by Myceliophthora thermophila comprising PMOs and cellulolytic enzymes and further comprising a nickel cation.
  • PMOs and cellulolytic enzymes can be found naturally in the microorganism that secretes them (i.e., wild-type or native proteins), or they can be proteins encoded by polynucleotides artificially introduced into the genome of said microorganism . Therefore, these enzymes can be homologous (native) or heterologous (foreign) to the microorganism that secretes them. In addition, they may be modified recombinant proteins to improve one or more enzyme properties, or they may be a combination of wild type proteins and recombinant proteins.
  • secreted or “expressed” includes any stage involved in the production of the polypeptide that includes, but is not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification and secretion of a functional polypeptide into the culture medium.
  • the Myceliophthora thermophila cell can be cultured in a suitable nutrient medium, solid or liquid, for the production of PMOs and cellulolytic enzymes, using procedures well known in the state of the art.
  • the cell can be grown in a flask with shaking or by small or large-scale fermentation (including continuous, batch or batch fermentation, with discontinuous feeding, in batch or solid state) carried out in a laboratory or industrial bioreactor, in a suitable medium and under conditions that allow the expression and / or isolation of PMOs and cellulolytic enzymes.
  • the culture takes place in a suitable nutrient medium comprising carbon and nitrogen sources and inorganic salts, using the procedures known in the state of the art.
  • PMOs and cellulolytic enzymes are secreted into the nutrient medium and can be recovered directly from it.
  • PMOs and cellulolytic enzymes can be recovered from the medium using procedures known in the state of the art. For example, they can be recovered from the nutrient medium by conventional procedures including, but not limited to, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation or precipitation. These enzymes can be purified by a variety of procedures known in the state of the art including, but not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic, chromato-focus and size exclusion), electrophoretic procedures (e.g., preparatory isoelectric focusing), differential solubility (for example, precipitation with ammonium sulfate), SDS-PAGE or extraction.
  • chromatography e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic, chromato-focus and size exclusion
  • electrophoretic procedures e.g., preparatory isoelectric focusing
  • differential solubility for example, precipitation with ammonium sulfate
  • SDS-PAGE or extraction
  • Another aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention for the degradation of cellulosic biomass.
  • cellulosic biomass means the biodegradable fraction of products, residues and residues of biological origin from agriculture (including plant substances such as crop residues and animal substances), forestry (such as timber resources) and related industries that include fishing and aquaculture, as well as the biodegradable fraction of industrial and urban waste such as municipal solid waste or paper waste.
  • the cellulosic biomass is straw or the organic fraction of municipal solid waste.
  • the cellulosic biomass is plant biomass, preferably selected from the list consisting of: biomass rich in fermentable sugars such as sugar cane; starch biomass, for example wheat grain or straw; corn or corn straw or corn fiber or corn grain or corn stubble; or barley grain or straw; or sorghum grain or straw.
  • Biomass can also be rice, grass, shrubs, bagasse, etc.
  • composition of the invention can be used in the production of monosaccharides, disaccharides and polysaccharides as chemicals or fermentation raw materials to produce ethanol, butanol, plastics, alkanes, alkenes and other products or intermediates from biomass. Therefore, in a preferred embodiment, the degradation of cellulosic biomass takes place in a bioproduct production process.
  • bioproduct refers to materials, chemicals and energy derived from renewable biological sources.
  • bioproducts are, but are not limited to, hydrocarbon compounds of different forms such as aliphatic (saturated, unsaturated, cyclic) or aromatic compounds, such as alkanes, alkenes, alkynes, cyclic forms of these compounds or aromatic hydrocarbons; oxygenated substances such as alcohols (such as ethanol, butanol, sorbitol), ethers, aldehydes, ketones or carboxylic acids; nitrogenous substances such as amines, amides, nitro compounds or nitriles; halogenated substances such as halides; organic acids (such as lactic acid, acrylic acid, acetic acid, succinic acid, glutamic acid, citric acid or propionic acid).
  • bioproducts also includes any combination of the foregoing compounds, compounds further derived from the foregoing compounds by any type of physical, chemical or biological treatment, polymers of the foregoing compounds, compounds described above substituted by any group or functional element in one or more of its bound forms and branched with the compounds described above.
  • Ethanol can be produced by enzymatic degradation of biomass and conversion of the released saccharides into ethanol. This type of ethanol is often called bioethanol. It can be used as a fuel additive or extender in mixtures of less than 1% up to 100% (a fuel substitute).
  • the bioproduct is a biofuel.
  • the biofuel is bioethanol or butanol.
  • biofuel refers to a hydrocarbon or a mixture thereof, which can be used as a fuel and is obtained using fermentable biomass as the starting material.
  • biofuels include, without limitation, ethanol or bioethanol, butanol or biobutanol and biodiesel.
  • bioethanol refers to an alcohol prepared by fermentation from fermentable biomass, such as carbohydrates produced in sugar or starch crops, such as corn or sugarcane.
  • butanol refers to a primary alcohol with a 4-carbon structure and the chemical formula C4H9OH. Its isomers include isobutanol, 2-butanol and tert-butanol. Butanol has more than two carbon atoms and has significant water solubility. N-butanol is found as a minor product of the fermentation of sugars and other carbohydrates.
  • the predominant polysaccharide in the primary cell wall of plant biomass is cellulose, the second most abundant is hemicellulose and the third, depending on the biomass in question, may be pectin.
  • the secondary cell wall produced after the cell has stopped its growth, also contains polysaccharides and is reinforced by polymeric lignin covalently bound to hemicellulose.
  • Cellulose is a homopolymer of anhydrocellulose and is therefore a linear beta- (1-4) -D-glucan, while hemicellulose includes a variety of compounds, such as xylans, xyloglucans, arabinoxylans and mannans in complex branched structures with A variety of substituents. Although generally polymorphic, cellulose is found in plant tissue primarily as an insoluble crystalline matrix of parallel glucan chains. Hemicelluloses normally bind to each other by hydrogen bonds to cellulose, as well as to other hemicelluloses, which helps stabilize the cell wall matrix.
  • the composition of the invention can be used to degrade the cellulose component of the biomass substrate.
  • first process of the invention relates to a process for producing fermentable sugars, hereinafter "first process of the invention", comprising: a. Incubate the cellulosic biomass with the composition of the invention, and b. Recover the fermentable sugars obtained after the incubation of step (a).
  • the nickel cation can be present in the bioreactor in which the incubation step (a) is carried out and / or can be added to the enzyme mixture before the step of saccharification of cellulosic biomass and / or during it. Therefore, in one embodiment of the present invention, the nickel cation is added to the enzyme mixture comprising the PMOs and cellulolytic enzymes before use in said stage, preferably during the storage stage of the enzyme mixture. This is advantageous to enhance the stability of PMOs in the composition.
  • the nickel cation is added during the saccharification stage, that is, at the same time or after the enzymatic mixture comprising the PMOs and cellulolytic enzymes is contacted or incubated with the cellulosic biomass .
  • another aspect of the invention relates to a process for producing fermentable sugars, hereinafter referred to as the "second process of the invention", which comprises: a. Incubate the cellulosic biomass with an enzymatic mixture comprising cellulolytic enzymes and at least one monooxygenase polysaccharide enzyme,
  • the PMO enzyme is selected from PMO1, PMO2, PMO3 or any combination thereof.
  • the PMO is PMO1 and / or PMO2.
  • the PMO is PMO1 and PMO2.
  • cellulolytic enzymes are selected from endoglucanase, beta-glucosidase, cellobiohydrolase, beta-xylosidase, xyloglucanase, xylanase, arabinofuranosidase or any combination thereof.
  • the enzyme mixture used in step (a) is an enzyme mixture secreted by M. thermophila.
  • the nickel cation is added in step (b) in a concentration of more than 0.0001 mM and less than 50 mM, preferably between 0.001 and 20 mM, more preferably between 0.001 and 5 mM, even more preferably between 0.05 and 5 mM and even more preferably between 0.05 and 0.5 mM.
  • the nickel cation is added in step (b) in a concentration between 0.075 and 0.125 mM, even more preferably, the nickel cation is added in step (b) in a concentration of 0.125 mM .
  • the nickel cation is added in step (b) in the form of a salt selected from nickel sulfate, nickel chloride, nickel nitrate, nickel acetate or nickel hydroxide , or any combination thereof.
  • fermentable sugar refers to simple sugars (monosaccharides, disaccharides and short oligosaccharides) such as glucose, xylose, arabinose, galactose, mainous, rhamnose, sucrose or fructose, among others.
  • a fermentable sugar is any that can be used or fermented by a microorganism.
  • sacharification by using the composition of the invention, can be followed by a fermentation process in which the fermentable sugars obtained are used in order to finally obtain a bioproduct such as bioethanol.
  • another aspect of the present invention relates to a process for producing a bioproduct from cellulosic biomass, hereinafter referred to as the "third process of the invention", comprising: a. Incubate cellulosic biomass with the composition of the invention, b. Ferment the fermentable sugars obtained after the incubation of step (a) with at least one fermenting microorganism, and
  • Another aspect of the invention relates to a process for producing a bioproduct from cellulosic biomass, hereinafter the "fourth process of the invention", comprising: a. Incubate the cellulosic biomass with an enzymatic mixture comprising cellulolytic enzymes and at least one monooxygenase polysaccharide enzyme,
  • the PMO enzyme is selected from PM01, PM02, PM03 or any combination thereof.
  • the PMO is PMO1 and / or PMO2.
  • the PMO is PMO1 and PMO2.
  • cellulolytic enzymes are selected from endoglucanase, beta-glucosidase, cellobiohydrolase, beta-xylosidase, xyloglucanase, xylanase, arabinofuranosidase or any combination thereof.
  • the enzyme mixture used in step (a) is an enzyme mixture secreted by M. thermophila.
  • the nickel cation is added in step (b) in a concentration of more than 0.0001 mM and less than 50 mM, preferably between 0.001 and 20 mM, more preferably between 0.001 and 5 mM, even more preferably between 0.05 and 5 mM and even more preferably between 0.05 and 0.5 mM.
  • the nickel cation is added in step (b) in a concentration between 0.075 and 0.125 mM, even more preferably, the nickel cation is added in step (b) in a concentration of 0.125 mM .
  • add a nickel cation refers to an automatic or manual addition of nickel to the enzyme mixture.
  • this addition can be carried out at the beginning of the incubation stage (a) and / or during said incubation procedure (at any time before the hydrolysis or saccharification stage ends) .
  • these preferred concentrations of nickel cation should be maintained throughout the incubation stage (a) (saccharification stage) of the first, second, third and fourth processes of the invention, so that in another preferred embodiment, these four methods further comprise a additional step consisting of the addition, one or more times (as often as necessary), in the reaction that is being carried out in step (a), of a nickel cation to maintain the concentration of said cation in more than 0.0001 mM and less than 50 mM, preferably between 0.001 and 20 mM, more preferably between 0.001 and 5 mM, even more preferably between 0.05 and 5 mM and even more preferably between 0.05 and 0.5 mM .
  • to maintain the concentration of said cation at a concentration between 0.075 and 0.125 mM even more preferably, at a concentration of 0.125 mM.
  • the nickel cation is added in step (b) in the form of a salt selected from nickel sulfate, nickel chloride, nickel nitrate, nickel acetate or nickel hydroxide , or any combination thereof.
  • the bioproduct is biofuel, more preferably the biofuel is bioethanol or butanol.
  • the first, second, third and / or fourth processes of the invention may comprise an additional stage consisting of a pretreatment process of cellulosic biomass before the incubation stage (a).
  • a pretreatment process will result in the cellulosic material components being more accessible for later stages or more digestible by enzymes after treatment in the absence of hydrolysis.
  • the pretreatment may be chemical, physical, mechanical or biological pretreatment, or any mixture thereof.
  • fermentation refers to a process of biological transformation caused by the activity of some microorganisms, in which sugars such as glucose, fructose and sucrose are converted into ethanol.
  • the microorganisms used in this way are fermenting microorganisms that have the ability to ferment, such as yeasts of the genera Saccharomyces, Pichia or Kluyveromyces, preferably Saccharomyces cerevisiae, either natural strains or those genetically modified for the conversion of pentoses.
  • recovery refers to the recovery of fermentable sugars obtained after the incubation stage of the first and second procedures of the invention or of the bioproduct obtained after the fermentation stage of the third and fourth methods of the invention.
  • the Recovery can be carried out by any procedure known in the state of the art, including mechanical or manual procedures.
  • the biomass preferably pretreated biomass
  • the solids content during hydrolysis can be, but not limited to, between 10-30% of the total weight, preferably between 15-25% of the total weight, more preferably between 18-22% of the total weight.
  • Hydrolysis is carried out as a process in which the biomass, preferably the pretreated biomass, is incubated with the composition of the invention and thus forms the hydrolysis solution.
  • the appropriate processing time, temperature and pH conditions can easily be determined by one skilled in the art.
  • this hydrolysis is carried out at a temperature between 25 ° C and 60 ° C, preferably between 40 ° C and 60 ° C, specifically around 50 ° C.
  • the process is preferably carried out at a pH in the range of 4 to 6, preferably between 4.5 and 5.5, specifically about 5.2.
  • Hydrolysis is preferably carried out in a time between 12 and 144 hours, preferably between 16 and 120 hours, more preferably between 24 and 96 hours, and even more preferably between 32 and 72 hours.
  • the hydrolysis and fermentation of the third and fourth processes of the invention can be carried out simultaneously (SSF procedure) or sequentially (SHF procedure), that is, steps (a) and (b) of the third process of the invention and the steps (a) and (c) of the fourth process of the invention can be carried out simultaneously or sequentially.
  • the Hydrolyzed biomass, and preferably pretreated is fermented by at least one fermenting microorganism capable of fermenting fermentable sugars such as glucose, xylose, mannose and galactose, directly or indirectly in the desired fermentation product.
  • the fermentation is preferably carried out in a time of between 8 and 96 hours, preferably between 12 and 72 hours and more preferably between 24 and 48 hours.
  • the fermentation is carried out at a temperature between 20 ° C and 40 ° C, preferably between 26 ° C and 34 ° C, in particular around 32 ° C.
  • the pH is between 3 and 6 units, preferably between 4 and 5 units.
  • a yeast of the species Saccharomyces cerevisiae is preferred, preferably strains that are resistant to high levels of ethanol, up to, for example between 5% and 7% by volume of ethanol or greater, such as between 10% and 15% by volume of ethanol.
  • the presence of a nickel cation in enzyme mixtures comprising PMOs leads to greater activity and stability of PMO.
  • the term "increased activity" as used in this invention refers to the increase in yield (preferably amount) of a reaction product, for example, a fermentable sugar, produced when a particular component present during the reaction (a cation of nickel) leads to a higher production of the product by the enzyme cocktail comprising PMOs, compared with a reaction carried out under the same conditions and with the same substrate but in the absence of the component in question.
  • the term “increase in stability” refers to the maintenance or retention of the properties (eg, activity) and structure of an enzyme, in particular a PMO enzyme, in the presence of a particular component (nickel cation) during the reaction or storage, when physical conditions, such as temperature or other factors, such as pH, deviate from optimal values for the enzyme.
  • the expression “increase in stability” means “increase in thermal stability”.
  • Another aspect of the invention relates to a process for preparing the composition of the invention which comprises adding a nickel cation to an enzymatic mixture comprising at least one PMO enzyme, hereinafter referred to as the "fifth process of the invention".
  • the PMO enzyme is selected from PMO1, PMO2, PMO3 or any combination thereof.
  • the enzyme mixture further comprises cellulolytic enzymes selected from endoglucanase, beta-glucosidase, cellobiohydrolase, beta-xylosidase, xyloglucanase, xylanase, arabinofuranosidase or any combination thereof.
  • the enzyme mixture is an enzyme mixture secreted by M. thermophila.
  • the nickel cation is added in a concentration of more than 0.0001 mM and less than 50 mM, preferably between 0.001 and 20 mM, more preferably between 0.001 and 5 mM, even more preferably between 0.05 and 5 mM and even more preferably between 0.05 and 0.5 mM. In an even more preferred embodiment, the nickel cation is added in a concentration between 0.075 and 0.125 mM, even more preferably in a concentration of 0.125 mM.
  • the nickel cation is added in the form of a salt selected from nickel sulfate, nickel chloride, nickel nitrate, nickel acetate or nickel hydroxide, or any combination thereof. same.
  • composition of the invention may be in liquid form or in the form of a dry composition.
  • the composition may be in granular or microgranular form.
  • the enzymes to be included in the composition may be stabilized according to procedures known in the state of the art.
  • Figure 1 Improvement of glucose yield (g / kg) by the enzyme cocktail produced by M. thermophila C1 in the absence (0) or in the presence of different concentrations of nickel (mM) in pretreated corn bagasse (PCS).
  • Figure 2. Improved yield of glucose and xylose (g / kg) released from the corn bagasse biomass pretreated by the enzyme cocktail produced by M. thermophila C1 in the absence (control) or in the presence of different nickel salts.
  • Figure 3 Improvement of glucose (g / kg) yield on biomass by a defined enzyme composition that includes endoglucanase, beta-glucosidase, cellobiohydrolases (cellulase mixture) in the absence or in the presence of io monooxygenase polysaccharide (PM01 and / or PM02 ) and in the absence or in the presence of nickel.
  • a defined enzyme composition that includes endoglucanase, beta-glucosidase, cellobiohydrolases (cellulase mixture) in the absence or in the presence of io monooxygenase polysaccharide (PM01 and / or PM02 ) and in the absence or in the presence of nickel.
  • Example 1 Effect of the concentration of the nickel ion on the glucose yield released by the C1 enzyme composition.
  • the effect of nickel (II) ions on the saccharification performance of the preparation of C1 cellulases in pretreated corn bagasse (hereinafter PCS) was evaluated according to the procedures described below.
  • the cellulase preparation is hereinafter referred to as "composition C1".
  • composition C1 The enzymatic mixture, "composition C1", produced by Myceliophthora thermophila C1 was obtained following the procedures described previously (Verdoes et al., 2007, Ind. Biotechnol. 3 (1) and Visser et al., 201 1, Ind. Biotechnol. , 7 (3)), using an industrial platform for enzymatic production based on M. thermophila C1 developed by Dyadic Netherlands.
  • PCS obtained according to Nguyen et al. (1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72) as a substrate for the hydrolysis reaction.
  • the compositional analysis was carried out using NREL procedures as "Standard biomass analytical procedures". The biomass was neutralized, lyophilized and ground.
  • the cellcellose composition C1 of Myceliophthora thermophila was used as a cellulase preparation.
  • PCS hydrolysis was carried out in 10 ml plastic tubes with a reaction volume of 3.0 ml with 20% total solids, adding 10 mg of protein per gram of glucan with nickel sulfate hexahydrate at 0-50 mM. The tubes were mixed and incubated at 50 ° C, pH 5, 250 rpm for 72 h. All experiments were carried out at least in duplicate.
  • sample sugar concentrations diluted in the appropriate concentrations in 5 mM H 2 S0 4 , were measured using a 4.6 x 250 mm column AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA , USA) by elution with 5 mM H2SO4 with a flow rate of 0.6 ml per minute, and was quantified by integration of glucose, cellobiose and xylose signals from the detection of refractive index (CHEMSTATION®, AGILENT® 1 100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) calibrated with pure sugar samples.
  • refractive index CHEMSTATION®, AGILENT® 1 100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA
  • Figure 1 shows the effect of different concentrations of nickel (mM) on glucose release (g / kg). It can be seen that the optimum nickel concentration was 0.125 mM (125 ⁇ ).
  • Nickel was added as nickel sulfate hexahydrate, nickel chloride, nickel acetate tetrahydrate, nickel nitrate hexahydrate and nickel hydroxide, at a final nickel ion concentration of 125 ⁇ .
  • Figure 2 shows the effect of the addition of nickel salts on the release of glucose and xylose.
  • the addition of nickel improved glucose release but did not significantly affect the yield of xylose.
  • All the nickel salts used produced the same improvement in glucose release. The same effect was also obtained with nickel acetate tetrahydrate (data not shown).
  • composition C1 was replaced by an enzyme mixture containing the main cellulases, which included an endoglucanase, a beta-glucosidase, two types of cellobiohydrolases (type I and II) and two examples of polysaccharide monooxygenases, all obtained from Myceliophthora thermophila, in the preparation of cellulases.
  • the final dosage of the enzyme mixture was 8.5 mg of protein per gram of glucan.
  • Figure 3 shows the comparison of the four defined compositions: (1) defined composition with endoglucanase, beta-glucosidase, both cellobiohydrolases and without polysaccharide monooxygenases (cellulase mixture), (2) defined composition with cellulase mixture plus PM01, (3 ) mixture of cellulases supplemented with PM02 and (4) mixture of cellulases supplemented with PM01 and PM02.
  • thermofluorescence assay in 200 mM Na acetate buffer, at pH 5.0 and different concentrations of nickel. Experimental conditions they were a linear gradient of temperature 23-95 ° C (0.8 ° C / min). The detection signal was measured with protein gel staining fluorescence with SYPRO orange (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) with and without nickel in different concentrations (0-200 ⁇ ) added as nickel sulfate heptahydrate. Tm represents the temperature values (° C) at which 50% of the enzyme is denatured. PM01 and PM02 were obtained from Myceliophthora thermophila while PM03 was obtained from Penicilium sp.
  • the enriched fractions may also need an extra purification step with a HiPrep 26/10 desalination column equilibrated with 50 mM Na-phosphate buffer, at pH 7.0, or even a HiLoad 16/600 Superdex 75 pg (120 ml) , this column was equilibrated with 50 mM phosphate-Na buffer, at pH 7.0.
  • FIG. 4 shows that the average Tm of the PMOs increased approximately 5 ° C when the Ni concentration was added. This indicates that when the nickel concentration increases, the PMOs become more stable as shown by the increase in Tm, indicating that a higher temperature is necessary to denature the PMO when nickel is present. This figure also shows that the thermostability of other cellulolytic enzymes is not affected by the addition of nickel.
  • Example 5 Comparison of nickel and other divalent salts in saccharification of pretreated corn bagasse.
  • nickel was compared with the addition of other divalent ions such as magnesium or manganese in different concentrations, following the same procedure described in example 1.
  • Nickel was added as nickel acetate tetrahydrate, magnesium as magnesium sulfate heptahydrate and manganese sulfate monohydrate.

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Abstract

La invención se refiere a procedimientos y composiciones para estabilizar y aumentar la actividad de mezclas enzimáticas que comprenden polipéptidos GH61 (PMO o polisacárido monooxigenasa) usados para la degradación de material celulósico durante la etapa de sacarificación de procedimientos de producción de biocombustibles. Esta mejora se logra por la adición de un catión de níquel a dichas mezclas enzimáticas antes y/o durante la etapa de sacarificación. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden PMOs, enzimas celulolíticas y un catión de níquel, así como procedimientos para preparar dichas composiciones y procedimientos para producir azúcares fermentables y bioproductos, preferiblemente bioetanol, a partir de biomasa celulósica, en los que se usan dichas composiciones.

Description

COMPOSICIONES CELULOLÍTICAS QUE COMPRENDEN ENZIMAS POLISACÁRIDO MONOOXIGENASA CON ACTIVIDAD MEJORADA
DESCRIPCIÓN
La invención se refiere al campo de los bioproductos, más en particular a la mejora de mezclas enzimáticas que comprenden polipéptidos con actividad polisacárido monooxigenasa y a su uso para la producción de azúcares fermentables a partir de biomasa celulósica durante procedimientos de producción de bioproductos, tales como bioetanol.
ANTECEDENTES
La biomasa vegetal proporciona una fuente abundante de energía potencial en forma de hidratos de carbono que se puede usar en numerosos procedimientos industriales y agrícolas y, por lo tanto, es una fuente renovable importante para generar azúcares fermentables. La fermentación de estos azúcares puede producir productos finales con valor comercial tales como biocombustibles y bioproductos químicos.
Aunque la fermentación de azúcares en etanol es relativamente directa, la conversión eficaz de biomasa celulósica en azúcares fermentables tales como glucosa es un reto mayor. La enorme energía potencial de las grandes cantidades de hidratos de carbono en la biomasa vegetal no se usa suficientemente porque los azúcares forman parte de polímeros complejos (polisacáridos, tales como celulosa y hemicelulosa) y, por lo tanto, no se encuentran fácilmente accesibles para la fermentación. Por lo tanto, la celulosa se puede pre-tratar de forma mecánica, química, enzimática o de otras formas para aumentar su susceptibilidad a la hidrólisis. Después de este procedimiento de pretratamiento, hay una etapa de sacarificación o hidrólisis que consiste en un procedimiento enzimático en el que hidratos de carbono complejos (tales como almidón o celulosa) son hidrolizados en sus componentes monosacáridos. Por lo tanto, el objetivo de cualquier tecnología de sacarificación es cambiar o eliminar los obstáculos estructurales y de composición con el fin de mejorar la tasa de hidrólisis enzimática y aumentar el rendimiento de azúcares fermentables obtenidos a partir de celulosa o hemicelulosa (N. Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96, 673-686). Después de la etapa de sacarificación, se lleva a cabo el procedimiento de fermentación. Por lo tanto, cuanto mayor es la cantidad de azúcares complejos que quedan al final del procedimiento hidrolítico, menor es el rendimiento en la producción de etanol al final del procedimiento de fermentación. Por lo tanto, un campo de investigación dirigido a reducir costes y mejorar el rendimiento de los procedimientos de producción de biocombustible se centra en mejorar la eficacia técnica de las enzimas hidrolíticas, o en general en mejorar la eficacia de los cócteles enzimáticos usados para generar azúcares fermentables a partir de biomasa.
Se ha mostrado que las enzimas individuales solo son capaces de digerir parcialmente la celulosa y hemicelulosa y por lo tanto se requiere la acción combinada de diferentes clases de enzimas para completar su conversión en azúcares monómeros. Se necesitan muchas más enzimas para digerir la hemicelulosa en azúcares monómeros que para la celulosa, incluyendo enzimas con actividad xilanasa, beta-xilosidasa, arabinofuranosidasa, mananasa, galactosidasa y glucuronidasa. También pueden estar implicadas otras enzimas sin actividad glicosil hidrolasa tales como la acetil-xilano esterasa y ácido ferúlico esterasa. Por lo tanto, la hidrólisis enzimática de polisacáridos para su conversión en azúcares solubles y, finalmente, en monómeros tales como xilosa, glucosa y otras pentosas y hexosas, es catalizada por diferentes enzimas que en conjunto se denominan "celulasas". Las celulasas son complejos multienzimáticos que comprenden al menos tres componentes principales, endo-p-glucanasa (EC 3.2.1 .4), exo-p-glucanasa o celobiohidrolasa (EC 3.2.1 .9.1 ) y β- glucosidasa (EC 3.2.1 .21 ), y se ha mostrado que actúan de forma sinérgica en la hidrólisis de la celulosa (Woodward, J. 1991 , Bioresource Technology \/o\ 36, pág. 67-75).
Las celulasas microbianas se han convertido en biocatalizadores de referencia debido a su naturaleza compleja y sus extensas aplicaciones industriales (Kuhad R. C. et al., 201 1 , Enzyme Research, Article ID 280696). Recientemente, se ha prestado una considerable atención a los conocimientos actuales sobre la producción de celulasas y los retos en la investigación de celulasas se han centrado en especial en la obtención de celulasas con mayor actividad y propiedades mejoradas.
Por otra parte, se conocen desde hace 20 años las proteínas glicosil hidrolasa de la familia 61 (GH61 ). Estas proteínas GH61 son proteínas auxiliares que contribuyen a la degradación de la celulosa. El hecho de que estas enzimas actúen por oxidación directa de la celulosa, en lugar de por hidrólisis, ha conducido a su nombre actual: polisacárido monooxigenasas dependientes de Cu (Polisacárido Monooxigenasa; PMOs). Comparadas con otras enzimas celulolíticas, las PMOs son proteínas relativamente pequeñas con pesos moleculares típicos de entre 20 y 50 kDa (Baldrian y Valaskova 2008, FEMS Microbiology Reviews 32: 501 -521 ; Harris et al., 2010, Biochemistry 49: 3305-3316). Estas proteínas requieren dos moléculas de oxígeno para producir la rotura y oxidación del producto. Una de estas moléculas deriva del agua, la otra entra en la reacción en forma de oxígeno molecular, que es necesario para la oxidación directa del sustrato. Por lo tanto, los miembros de esta familia de enzimas actúan como monooxigenasas de Cu que catalizan la rotura de la celulosa por un mecanismo oxidativo, liberando celodextrinas (Langston et al., 201 1 , Applied and Environmental Microbiology 77: 7007-7015).
La eficacia hidrolítica de un complejo multienzimático en el procedimiento de sacarificación del material celulósico depende tanto de las propiedades de las enzimas individuales como de la proporción de cada enzima presente en el complejo. Por lo tanto, en el contexto de los procedimientos de producción de biocombustible, es necesario diseñar cócteles enzimáticos con mejores actividades individuales. Específicamente, sería una ventaja en la técnica mejorar la actividad y estabilidad de polipéptidos PMO. En este sentido, varias publicaciones han propuesto suplementar las mezclas enzimáticas que contienen celulasas y PMOs con cobre, que es un cofactor de las PMO, para aumentar la actividad y estabilidad de estas enzimas (US2014127771 , WO2012138772).
En resumen, el uso de mezclas enzimáticas que contienen polipéptidos PMO con actividad y/o estabilidad mejorada durante la etapa de sacarificación o hidrólisis de biomasa celulósica, conducirá a una mejora en el rendimiento de esta etapa, mediante un aumento de la cantidad de azúcares fermentables finales. Más tarde, estos azúcares se pueden fermentar para producir biocombustibles tales como bioetanol, por lo que esto finalmente aumentaría la eficacia y rentabilidad de todo el procedimiento de producción de biocombustible.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para estabilizar y aumentar la actividad de mezclas enzimáticas que comprenden polipéptidos GH61 (o PMO) usados para la degradación de material celulósico durante la etapa de sacarificación de los procedimientos de producción de biocombustible. Esta mejora se logra por la presencia o adición de un catión de níquel a dichas mezclas enzimáticas antes y/o durante la etapa de sacarificación.
Los ejemplos mostrados a continuación ponen de manifiesto que la presencia de níquel en las mezclas enzimáticas que comprenden PMOs y enzimas celulolíticas producidas por la cepa C1 de Myceliophthora thermophila dan como resultado una mayor concentración de azúcares fermentables (principalmente glucosa) liberados en un procedimiento de sacarificación de biomasa comparado con una mezcla enzimática que comprende las mismas enzimas, pero que carece de níquel (figuras 1 , 2, 3 y 5). Esto indica que la presencia de níquel conduce a un aumento de la actividad celulolítica de los cócteles enzimáticos mediante un aumento en la actividad de las PMO incluidas en los mismos.
Los ejemplos también muestran que la presencia de níquel en dichas mezclas enzimáticas conduce a un mayor rendimiento de azúcares fermentables (principalmente glucosa) liberados en un procedimiento de sacarificación de biomasa, comparado con la presencia de otros metales divalentes, tales como Mg2+ o Mn2+ (figura 5).
Además, la figura 4 muestra que las PMO son más estables en presencia que en ausencia de níquel, lo que contribuye a la mejora de su actividad en la mezcla enzimática. Además, la adición de níquel no afecta a la termoestabilidad de otras enzimas celulolíticas.
Por lo tanto, la invención muestra que la presencia de níquel en cócteles enzimáticos que comprenden polipéptidos GH61 o PMOs contribuye a mejorar el rendimiento del procedimiento hidrolítico de la biomasa celulósica en el que se usan estos cócteles. Por consiguiente, esto conduce a la mejora de la producción de biocombustible.
Por lo tanto, un primer aspecto de esta invención se refiere a una composición que comprende al menos una enzima polisacárido monooxigenasa (PMO) y un catión de níquel. En lo sucesivo, esta composición se denominará como "composición de la invención".
En una realización preferida de la composición de la invención, el catión de níquel está presente en una concentración de más de 0,0001 mM y menos de 50 mM, preferiblemente entre 0,001 y 20 mM, más preferiblemente entre 0,001 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 5 mM e incluso más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM. Como se muestra en los ejemplos más abajo, una concentración de níquel entre 0,05 y 0,5 mM da el mayor rendimiento de glucosa por parte de la mezcla enzimática sobre la biomasa celulósica, comparado con otras concentraciones de níquel fuera de este intervalo. Por lo tanto, este intervalo para las concentraciones de níquel en la composición de la invención es el más preferido. En una realización incluso más preferida, la concentración de níquel está entre 0,075 y 0,125 mM, incluso más preferiblemente la concentración de níquel es 0,125 mM.
En una realización más preferida de la composición de la invención, el catión de níquel es un catión divalente. El catión de níquel divalente preferiblemente está presente como una sal soluble, por ejemplo, una sal de clorato, cloruro, cromato, acetato, citrato, fluoruro, formiato, yoduro, nitrato, oxalato, perclorato, selenato o sulfato, o como una sal insoluble, por ejemplo una sal de carbonato, hidróxido, óxido, fosfato, pirofosfato o sulfuro.
Más preferiblemente, el catión de níquel está en forma de una sal. Incluso más preferiblemente, la sal de níquel se selecciona de sulfato de níquel, cloruro de níquel, nitrato de níquel, acetato de níquel o hidróxido de níquel, o cualquier combinación de los mismos.
El catión de níquel se puede añadir a la composición de la invención y/o puede estar ya presente en el biorreactor en donde se va a llevar a cabo la hidrólisis de biomasa con la composición enzimática, puesto que la biomasa celulósica puede comprender una serie de cationes metálicos divalentes, incluyendo Ni. Por lo tanto, la biomasa celulósica puede ser, en parte o totalmente, una fuente del catión de níquel. Este catión de níquel puede ser soluble o insoluble. Sin embargo, el catión de níquel puede no estar disponible en solución porque, por ejemplo, esté formando complejo con un componente de la biomasa celulósica. Por esta razón, puede ser necesaria la adición o suplementación de la composición de la invención con un catión de níquel.
Las expresiones "polisacárido monooxigenasa", "PMO", "polipéptido que potencia la actividad celulolítica", "glicosil hidrolasas de la familia 61 " o "GH61 " se refieren a una enzima con actividad GH61 o PMO, que cataliza la potenciación de la hidrólisis de un material celulósico por enzimas que tienen actividad celulolítica. Cuando se incluye en una reacción de sacarificación (por ejemplo, aquella en la que se usan endoglucanasas, beta-glucosidasas y celobiohidrolasas) da como resultado una mayor cantidad (rendimiento mayor) de uno o más azúcares solubles (por ejemplo, glucosa) liberados, comparado con la reacción de sacarificación realizada en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína GH61 . La actividad de la PMO se puede determinar, por ejemplo, por ensayos oxidativos indirectos que muestran mediante colorimetría el fenómeno de la transferencia de electrones usando diferentes compuestos donadores y aceptores de electrones (Kitt et al., 2012, Biotechnology for Biofuels Vol. 5:79, pág. 1 -13). Por otra parte, la eficacia sobre la biomasa se podría medir, por ejemplo, combinando el polipéptido PMO con enzimas celulasa en una reacción de sacarificación y determinando si hay un aumento del rendimiento de glucosa comparado con la misma reacción de sacarificación realizada en ausencia de este polipéptido.
Los polipéptidos PMO se pueden obtener, sin limitación, de un hongo filamentoso tal como Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Gibberella, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma o Myceliophthora. Ejemplos de PMOs que se pueden usar, pero sin limitación, en la presente invención, son los descritos en la solicitud número ES201430155 y publicaciones número WO2013048661 A1 , WO2012061517A1 y WO2013028701 A1 . En una realización más preferida, la PMO es una PMO de Myceliophthora thermophila, Gibberella zeae, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Talaromyces magnefei, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride. En una realización incluso más preferida de la composición de la invención, la enzima PMO es una PMO de Myceliophthora thermophila o de Penicillium sp., más preferiblemente, la PMO es una PMO de Myceliophthora thermophila, más preferiblemente, la enzima PMO se selecciona de PMO1 , PMO2, PMO3 o cualquier combinación de las mismas. En una realización más preferida, la composición de la invención comprende PMO1 y PMO2.
Se entiende que para las especies mencionadas antes, la invención abarca los estados perfecto e imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo el anamorfo, con respecto al nombre de la especie por el que se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes adecuados. Por ejemplo, Myceliophthora thermophila es equivalente a Chrysosporium lucknowense.
En una realización más preferida, la PM01 es un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 1 , PMO2 es un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 y PMO3 es un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 3.
La o las enzimas PMO comprendidas en la composición de la invención se pueden aislar preferiblemente de M. thermophila, o producir de forma recombinante. La o las enzimas PMO se pueden sintetizar por ejemplo, pero sin limitación, in vitro. Por ejemplo, por síntesis de péptidos en fase sólida o por procedimientos de ADN recombinantes. La o las enzimas PMO se pueden producir de forma recombinante, no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión junto con un polipéptido homólogo o heterologo, que puede contener, por ejemplo, pero sin limitación, una secuencia señal, u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión de proteasa, por ejemplo, pero sin limitación, en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido.
La composición de la invención puede comprender además otras actividades enzimáticas tales como actividades aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, tal como endoglucanasas, beta-glucosidasas y/o celobiohidrolasa; quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa- glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, reductasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, proteasa, enzimas proteolíticas, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa, o cualquier combinación de éstas. La enzima o enzimas adicionales se pueden producir, por ejemplo, por un microorganismo que pertenece al género Acremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus tal como Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae; Aureobasidium, Bjerkandera tal como Bjerkandera adusta, Botryospaeria, Candida, Ceriporiopsis tal como Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa o Ceriporiopsis subvermispora, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coprinus tal como Coprinus cinereus, Coptotermes, Coriolus tal como Coriolus hirsutus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium tal como Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium pseudograminearum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum; Gibberella tal como Gibberella zeae; Holomastigotoides, Humicola tal como Humicola insolens o Humicola lanuginosa; Irpex, Kluyveromyces, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor tal como Mucor miehei, Myceliophthora tal como Myceliophthora thermophila, Neocallimastix, Neurospora tal como Neurospora crassa, Paecilomyces, Penicillium tal como Penicillium purpurogenum, Phanerochaete tal como Phanerochaete chrysosporium, Phlebia tal como Phlebia radiata, Pichia, Piromyces, Pleurotus tal como Pleurotus eryngii, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia tal como Thielavia terrestris, Tolypocladium, Trametes tal como Trametes villosa o Trametes versicolor, Trichoderma tal como Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, Xylaria o Yarrowia.
En una realización más preferida, la composición de la invención comprende además enzimas celulolíticas. La expresión "enzimas celulolíticas" también conocidas como "celulasas" se refiere a una clase de enzimas capaces de hidrolizar la celulosa (β-1 ,4-glucano o enlaces β-D-glucosídicos) o hemicelulosas en oligosacáridos más cortos, celobiosa y/o glucosa. Ejemplos de enzimas celulolíticas son, pero sin limitación, endoglucanasas, beta-glucosidasas, celobiohidrolasas, beta- xilosidasas, endo(xilo)glucanasas o endoxilanasas. En una realización incluso más preferida, las enzimas celulolíticas se seleccionan de endoglucanasa, beta-glucosidasa, celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, xiloglucanasa, xilanasa, arabinofuranosidasa o cualquier combinación de las mismas.
El término "endoglucanasa" o "EG" se refiere a un grupo de enzimas celulasas clasificadas como E.C. 3.2.1 .4. Estas enzimas hidrolizan los enlaces β-1 ,4-glucosídicos internos de la celulosa.
El término "celobiohidrolasa" (EC 3.2.1 .91 y EC 3.2.1 .176) se refiere a una proteína que cataliza la hidrólisis de la celulosa en celobiosa por actividad exoglucanasa, liberando secuencialmente moléculas de celobiosa de los extremos reductores o no reductores de celo- oligosacáridos. El término "beta-glucosidasa" (E.C. 3.2.1 .21 ) como se usa en el presente documento, se refiere a una enzima que cataliza la hidrólisis de un dímero de azúcar, incluyendo pero sin limitación, celobiosa, con la liberación de un monómero de azúcar correspondiente, usada para, pero sin limitación, la síntesis de etanol. La enzima beta-glucosidasa actúa en los enlaces β1→4 que unen dos moléculas de glucosa o glucosa sustituida (es decir, el disacárido celobiosa). Es una exocelulasa con especificidad para una variedad de sustratos beta-D- glucósidos. Cataliza la hidrólisis de residuos terminales no reductores en los beta-D-glucósidos con la liberación de glucosa.
El término "xilanasa" se refiere a una enzima que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1 ,4-beta-D-xilosídicos en xilanos.
El término "β-xilosidasa" (EC 3.2.1 .37) se refiere a una proteína que hidroliza 1 ,4-p-D-xilo-oligómeros cortos en xilosa.
El término "xiloglucanasa" se refiere a una enzima específica de xiloglucano que puede catalizar la solubilización de xiloglucano en oligosacáridos, pero no muestra actividad celulolítica sustancial.
El término "arabinofuranosidasa" (EC 3.2.1 .55) se refiere a la enzima que cataliza la hidrólisis de residuos terminales alfa-L- arabinofuranósidos no reductores en alfa-L-arabinósidos.
Como se ha expuesto antes, las PMO y las enzimas celulolíticas comprendidas en la composición de la invención pueden derivar de cualquier microorganismo capaz de producir enzimas celulolíticas. En una realización incluso más preferida de la composición de la invención, la o las enzimas PMO y las enzimas celulolíticas son una mezcla enzimática secretada por Myceliophthora thermophila, más preferiblemente por la cepa C1 de M. thermophila. La cepa de Myceliophthora thermophila puede ser una cepa natural o una cepa muíante que se ha modificado, por ejemplo, para que sobreexprese una o más de las enzimas secretadas o para que sobreexprese enzimas mutantes con propiedades mejoradas. Esto significa que, preferiblemente, la composición de la invención es una mezcla enzimática secretada por Myceliophthora thermophila que comprende PMOs y enzimas celulolíticas y que comprende además un catión de níquel. Las PMO y enzimas celulolíticas se pueden encontrar de forma natural en el microorganismo que las secreta (es decir, proteínas de tipo natural (wild type) o nativas), o pueden ser proteínas codificadas por polinucleótidos introducidos de forma artificial en el genoma de dicho microorganismo. Por lo tanto, estas enzimas pueden ser homologas (nativas) o heterólogas (extrañas) al microorganismo que las secreta. Además, pueden ser proteínas recombinantes modificadas para mejorar una o más propiedades de la enzima, o pueden ser una combinación de proteínas de tipo natural (wild type) y proteínas recombinantes.
El término "secretado" o "expresado" incluye cualquier etapa implicada en la producción del polipéptido que incluye, pero sin limitación, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional y secreción de un polipéptido funcional al medio de cultivo.
La célula de Myceliophthora thermophila se puede cultivar en un medio nutritivo adecuado, sólido o líquido, para la producción de PMOs y enzimas celulolíticas, usando procedimientos bien conocidos en el estado del arte. Por ejemplo, la célula se puede cultivar en un matraz con agitación o mediante una fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentación continua, discontinua o en batch, con alimentación discontinua, en batch o en estado sólido) llevada a cabo en un biorreactor de laboratorio o industrial, en un medio adecuado y en condiciones que permitan la expresión y/o aislamiento de las PMO y enzimas celulolíticas. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando los procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Las PMO y enzimas celulolíticas son secretadas al medio nutritivo y se pueden recuperar directamente del mismo.
Las PMO y enzimas celulolíticas se puede recuperar del medio usando procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, se pueden recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitación, centrifugación, filtración, extracción, secado por atomización, evaporación o precipitación. Estas enzimas se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en el estado de la técnica incluyendo, pero sin limitación, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la degradación de biomasa celulósica.
La expresión "biomasa celulósica" significa la fracción biodegradable de los productos, restos y residuos de origen biológico de la agricultura (incluyendo sustancias vegetales tales como residuos de cosechas y sustancias animales), silvicultura (tales como recursos madereros) e industrias relacionadas que incluyen pesca y acuicultura, así como la fracción biodegradable de residuos industriales y urbanos tales como residuos sólidos municipales o residuos de papel. En una realización preferida, la biomasa celulósica es paja o la fracción orgánica de residuos sólidos municipales. En una realización más preferida, la biomasa celulósica es biomasa vegetal, preferiblemente seleccionada de la lista que consiste en: biomasa rica en azúcares fermentables tales como caña de azúcar; biomasa de almidón, por ejemplo grano o paja de trigo; maíz o paja de maíz o fibra de maíz o grano de maíz o rastrojo de maíz; o grano o paja de cebada; o grano o paja de sorgo. La biomasa también puede ser arroz, hierba, arbustos, bagazo, etc.
La composición de la invención se puede usar en la producción de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos como productos químicos o materias primas de fermentación para producir etanol, butanol, plásticos, alcanos, alquenos y otros productos o intermedios a partir de biomasa. Por lo tanto, en una realización preferida, la degradación de biomasa celulósica tiene lugar en un procedimiento de producción de bioproducto.
El término "bioproducto" o "producto de base biológica" se refiere a materiales, productos químicos y energía derivada de fuentes biológicas renovables. Ejemplos de bioproductos son, pero sin limitación, compuestos hidrocarbonados de diferentes formas tales como compuestos alifáticos (saturados, insaturados, cíclicos) o aromáticos, tales como alcanos, alquenos, alquinos, formas cíclicas de estos compuestos o hidrocarburos aromáticos; sustancias oxigenadas tales como alcoholes (tales como etanol, butanol, sorbitol), éteres, aldehidos, cetonas o ácidos carboxílicos; sustancias nitrogenadas tales como aminas, amidas, compuestos nitro o nitrilos; sustancias halogenadas tales como haluros; ácidos orgánicos (tales como ácido láctico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido glutámico, ácido cítrico o ácido propiónico). El término "bioproductos" también incluye cualquier combinación de los compuestos anteriores, compuestos derivados adicionalmente de los compuestos anteriores por cualquier tipo de tratamiento físico, químico o biológico, polímeros de los compuestos anteriores, compuestos descritos arriba sustituidos por cualquier grupo o elemento funcional en una o más de sus formas unidas y ramificadas con los compuestos descritos arriba.
Se puede producir etanol por degradación enzimática de biomasa y conversión de los sacáridos liberados en etanol. Este tipo de etanol a menudo se llama bioetanol. Se puede usar como un aditivo de combustible o extensor en mezclas de menos de 1 % hasta 100% (un sustituto de combustible). En una realización más preferida, el bioproducto es un biocombustible. En una realización incluso más preferida, el biocombustible es bioetanol o butanol.
El término "biocombustible" como se usa en el presente documento se refiere a un hidrocarburo o una de sus mezclas, que se puede usar como un combustible y se obtiene usando biomasa fermentable como el material de partida. Los ejemplos de biocombustibles incluyen, sin limitación, etanol o bioetanol, butanol o biobutanol y biodiesel.
El término "bioetanol" se refiere a un alcohol preparado por fermentación a partir de biomasa fermentable, tal como hidratos de carbono producidos en cosechas de azúcar o almidón, tales como maíz o caña de azúcar.
El término "butanol" se refiere un alcohol primario con una estructura de 4 carbonos y la fórmula química C4H9OH. Sus isómeros incluyen el isobutanol, 2-butanol y tert-butanol. El butanol tiene más de dos átomos de carbono y tiene solubilidad significativa en agua. El n-butanol se encuentra como un producto minoritario de la fermentación de azúcares y otros hidratos de carbono. El polisacárido predominante en la pared celular primaria de la biomasa vegetal es la celulosa, el segundo más abundante es la hemicelulosa y el tercero, dependiendo de la biomasa en cuestión, puede ser la pectina. La pared celular secundaria, producida después de que la célula ha detenido su crecimiento, también contiene polisacáridos y está reforzada por lignina polimérica unida de manera covalente a la hemicelulosa. La celulosa es un homopolímero de anhidrocelobiosa y por lo tanto es un beta-(1 -4)-D-glucano lineal, mientras que la hemicelulosa incluye una variedad de compuestos, tales como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos y mananos en estructuras ramificadas complejas con una variedad de sustituyentes. Aunque generalmente polimorfa, la celulosa se encuentra en el tejido vegetal principalmente como una matriz cristalina insoluble de cadenas paralelas de glucano. Las hemicelulosas normalmente se unen entre sí por enlaces de hidrógeno a celulosa, así como a otras hemicelulosas, lo que ayuda a estabilizar la matriz de la pared celular. La composición de la invención se puede usar para degradar el componente de celulosa del sustrato de biomasa.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para producir azúcares fermentables, en lo sucesivo "primer procedimiento de la invención", que comprende: a. Incubar la biomasa celulósica con la composición de la invención, y b. Recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a).
En la presente invención, el catión de níquel puede estar presente en el biorreactor en el que se lleva a cabo la etapa de incubación (a) y/o se puede añadir a la mezcla enzimática antes de la etapa de sacarificación de la biomasa celulósica y/o durante la misma. Por lo tanto, en una realización de la presente invención, se añade el catión de níquel a la mezcla enzimática que comprende las PMO y enzimas celulolíticas antes de su uso en dicha etapa, preferiblemente durante la etapa de almacenamiento de la mezcla enzimática. Esto es ventajoso para potenciar la estabilidad de las PMO en la composición. Alternativa o adicionalmente a esta realización, el catión de níquel se añade durante la etapa de sacarificación, es decir, al mismo tiempo o después de que la mezcla enzimática que comprende las PMO y enzimas celulolíticas se ponga en contacto o se incube con la biomasa celulósica.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para producir azúcares fermentables, en lo sucesivo el "segundo procedimiento de la invención", que comprende: a. Incubar la biomasa celulósica con una mezcla enzimática que comprende enzimas celulolíticas y al menos una enzima polisacárido monooxigenasa,
b. Añadir el catión de níquel a la etapa de incubación (a), y
c. Recuperar los azúcares fermentables obtenidos.
En una realización preferida del segundo procedimiento de la invención, la enzima PMO se selecciona de PMO1 , PMO2, PMO3 o cualquier combinación de las mismas. En una realización más preferida, la PMO es PMO1 y/o PMO2. En una realización incluso más preferida, la PMO es PMO1 y PMO2.
En otra realización preferida del segundo procedimiento de la invención, las enzimas celulolíticas se seleccionan de endoglucanasa, beta-glucosidasa, celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, xiloglucanasa, xilanasa, arabinofuranosidasa o cualquier combinación de las mismas.
En una realización más preferida del segundo procedimiento de la invención, la mezcla enzimática usada en la etapa (a) es una mezcla enzimática secretada por M. thermophila.
En otra realización preferida del segundo procedimiento de la invención, el catión de níquel se añade en la etapa (b) en una concentración de más de 0,0001 mM y menos de 50 mM, preferiblemente entre 0,001 y 20 mM, más preferiblemente entre 0,001 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 5 mM e incluso más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM. En una realización incluso más preferida, el catión de níquel se añade en la etapa (b) en una concentración entre 0,075 y 0,125 mM, incluso más preferiblemente, el catión de níquel se añade en la etapa (b) en una concentración de 0,125 mM.
En una realización más preferida del segundo procedimiento de la invención, el catión de níquel se añade en la etapa (b) en forma de una sal seleccionada de sulfato de níquel, cloruro de níquel, nitrato de níquel, acetato de níquel o hidróxido de níquel, o cualquier combinación de los mismos.
La expresión "azúcar fermentable" como se usa en el presente documento se refiere a azúcares simples (monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos cortos) tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, mañosa, ramnosa, sacarosa o fructosa, entre otros. Un azúcar fermentable es cualquiera que se pueda usar o fermentar mediante un microorganismo.
A la degradación o hidrólisis de biomasa en azúcares fermentables, un procedimiento conocido como "sacarificación", mediante el uso de la composición de la invención, le puede seguir un procedimiento de fermentación en el que los azúcares fermentables obtenidos se usan con el fin de obtener finalmente un bioproducto tal como bioetanol.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa celulósica, en lo sucesivo el "tercer procedimiento de la invención", que comprende: a. Incubar biomasa celulósica con la composición de la invención, b. Fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a) con al menos un microorganismo fermentador, y
c. Recuperar el bioproducto obtenido después de la etapa de fermentación (b).
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa celulósica, en lo sucesivo el "cuarto procedimiento de la invención", que comprende: a. Incubar la biomasa celulósica con una mezcla enzimática que comprende enzimas celulolíticas y al menos una enzima polisacárido monooxigenasa,
b. Añadir un catión de níquel a la etapa de incubación (a),
c. Fermentar los azúcares fermentables obtenidos con al menos un microorganismo fermentador, y
d. Recuperar el bioproducto obtenido después de la etapa de fermentación (c).
En una realización preferida del cuarto procedimiento de la invención, la enzima PMO se selecciona de PM01 , PM02, PM03 o cualquier combinación de las mismas. En una realización más preferida, la PMO es PMO1 y/o PMO2. En una realización incluso más preferida, la PMO es PMO1 y PMO2.
En otra realización preferida del cuarto procedimiento de la invención, las enzimas celulolíticas se seleccionan de endoglucanasa, beta- glucosidasa, celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, xiloglucanasa, xilanasa, arabinofuranosidasa o cualquier combinación de las mismas.
En una realización más preferida del cuarto procedimiento de la invención, la mezcla enzimática usada en la etapa (a) es una mezcla enzimática secretada por M. thermophila.
En otra realización preferida del cuarto procedimiento de la invención, el catión de níquel se añade en la etapa (b) en una concentración de más de 0,0001 mM y menos de 50 mM, preferiblemente entre 0,001 y 20 mM, más preferiblemente entre 0,001 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 5 mM e incluso más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM. En una realización incluso más preferida, el catión de níquel se añade en la etapa (b) en una concentración entre 0,075 y 0,125 mM, incluso más preferiblemente, el catión de níquel se añade en la etapa (b) en una concentración de 0,125 mM.
La expresión "añadir un catión de níquel", como se usa en la presente invención, se refiere a una adición de níquel automática o manual a la mezcla enzimática. En el segundo y cuarto procedimientos de la invención, esta adición se puede llevar a cabo al principio de la etapa de incubación (a) y/o durante dicho procedimiento de incubación (en cualquier momento antes de que termine la etapa de hidrólisis o sacarificación). Estas concentraciones preferidas de catión de níquel deben mantenerse durante toda la etapa de incubación (a) (etapa de sacarificación) del primero, segundo, tercer y cuarto procedimientos de la invención, de modo que en otra realización preferida, estos cuatro procedimientos comprenden además una etapa adicional que consiste en la adición, una o más veces (tan a menudo como sea necesario), en la reacción que se está llevando a cabo en la etapa (a), de un catión de níquel para mantener la concentración de dicho catión en más de 0,0001 mM y menos de 50 mM, preferiblemente entre 0,001 y 20 mM, más preferiblemente entre 0,001 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 5 mM e incluso más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM. En una realización incluso más preferida, para mantener la concentración de dicho catión en una concentración entre 0,075 y 0,125 mM, incluso más preferiblemente, en una concentración de 0,125 mM.
En una realización más preferida del cuarto procedimiento de la invención, el catión de níquel se añade en la etapa (b) en forma de una sal seleccionada de sulfato de níquel, cloruro de níquel, nitrato de níquel, acetato de níquel o hidróxido de níquel, o cualquier combinación de los mismos.
En otra realización preferida del tercer y cuarto procedimientos de la invención, el bioproducto es biocombustible, más preferiblemente el biocombustible es bioetanol o butanol.
Con frecuencia es necesario un procedimiento de pretratamiento de la biomasa con el fin de aumentar el acceso de las enzimas a sus sustratos y por consiguiente una hidrólisis eficaz. El pretratamiento usa diferentes técnicas que incluyen, pero sin limitación, tratamiento químico (por ejemplo, explosión de fibra con amoniaco o exposición a un disolvente), tratamiento físico (por ejemplo, explosión con vapor de agua a temperaturas elevadas), tratamiento mecánico (por ejemplo, trituración o molienda), tratamiento biológico, o cualquiera de sus combinaciones, para alterar la estructura de la biomasa celulósica y hacer que la celulosa sea más accesible. Por lo tanto, el primer, segundo, tercer y/o cuarto procedimientos de la invención pueden comprender una etapa adicional que consiste en un procedimiento de pretratamiento de la biomasa celulósica antes de la etapa de incubación (a). En general, un procedimiento de pretratamiento dará como resultado que los componentes del material celulósico sean más accesibles para las etapas posteriores o sean más digeribles por las enzimas después de tratamiento en ausencia de hidrólisis. El pretratamiento puede ser pretratamiento químico, físico, mecánico o biológico, o cualquier mezcla de éstos.
El término "fermenta o fermentación" como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento de transformación biológica causada por la actividad de algunos microorganismos, en el que azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se convierten en etanol. Los microorganismos usados de esta forma son microorganismos fermentadores que tienen la capacidad de fermentar, tales como levaduras de los géneros Saccharomyces, Pichia o Kluyveromyces, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae, bien sean cepas naturales o aquellas modificadas genéticamente para la conversión de pentosas.
El término "recuperación" como se usa en el presente documento, se refiere a la recuperación de azúcares fermentables obtenidos después de la etapa de incubación del primer y segundo procedimientos de la invención o del bioproducto obtenido después de la etapa de fermentación del tercer y cuarto procedimientos de la invención. La recuperación se puede llevar a cabo por cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica, incluyendo procedimientos mecánicos o manuales.
Antes (es decir en la etapa (a)) y/o simultáneamente con la etapa de fermentación del tercer y cuarto procedimientos de la invención, la biomasa, preferiblemente biomasa pretratada, se hidroliza para degradar la celulosa y hemicelulosa en azúcares y/u oligosacáridos. El contenido en sólidos durante la hidrólisis puede ser, pero sin limitación, entre el 10-30% del peso total, preferiblemente entre el 15-25% del peso total, más preferiblemente entre el 18-22% del peso total. La hidrólisis se lleva a cabo como un procedimiento en el que la biomasa, preferiblemente la biomasa pretratada, se incuba con la composición de la invención y así forma la solución de hidrólisis. El tiempo de procesamiento, temperatura y condiciones de pH adecuados los puede determinar fácilmente el experto en la materia. Preferiblemente, esta hidrólisis se lleva a cabo a una temperatura de entre 25°C y 60°C, preferiblemente entre 40°C y 60°C, específicamente alrededor de 50°C. El procedimiento se lleva a cabo preferiblemente a un pH en el intervalo de 4 a 6, preferiblemente entre 4,5 y 5,5, específicamente alrededor de 5,2. La hidrólisis se lleva a cabo preferiblemente en un tiempo entre 12 y 144 horas, preferiblemente entre 16 y 120 horas, más preferiblemente entre 24 y 96 horas, e incluso más preferiblemente entre 32 y 72 horas.
La hidrólisis y fermentación del tercer y cuarto procedimientos de la invención se pueden llevar a cabo simultáneamente (procedimiento SSF) o secuencialmente (procedimiento SHF), es decir, las etapas (a) y (b) del tercer procedimiento de la invención y las etapas (a) y (c) del cuarto procedimiento de la invención se pueden llevar a cabo simultánea o secuencialmente. De acuerdo con la invención, la biomasa hidrolizada, y preferiblemente pretratada, se fermenta mediante al menos un microorganismo fermentador capaz de fermentar azúcares fermentables tales como glucosa, xilosa, mañosa y galactosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. La fermentación se lleva a cabo preferiblemente en un tiempo de entre 8 y 96 horas, preferiblemente entre 12 y 72 horas y más preferiblemente entre 24 y 48 horas. En otra realización preferida, la fermentación se lleva a cabo a una temperatura entre 20°C y 40°C, preferiblemente entre 26°C y 34°C, en particular alrededor de 32°C. En otra realización preferida, el pH está entre 3 y 6 unidades, preferiblemente entre 4 y 5 unidades. Para la fermentación de etanol, se prefiere una levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae, preferiblemente cepas que son resistentes a niveles altos de etanol, de hasta, por ejemplo entre el 5% y 7% en volumen de etanol o mayor, tal como entre el 10% y 15% en volumen de etanol.
Como se ha explicado antes, la presencia de un catión de níquel en las mezclas enzimáticas que comprenden PMOs, como propone la presente invención, conduce a una actividad y estabilidad mayor de la PMO. La expresión "aumento de actividad" como se usa en esta invención, se refiere al aumento en el rendimiento (preferiblemente cantidad) de un producto de reacción, por ejemplo, un azúcar fermentable, producido cuando un componente particular presente durante la reacción (un catión de níquel) conduce a una producción mayor del producto por el cóctel enzimático que comprende PMOs, comparado con una reacción llevada a cabo en las mismas condiciones y con el mismo sustrato pero en ausencia del componente en cuestión. La expresión "aumento en la estabilidad" se refiere al mantenimiento o retención de las propiedades (p. ej., actividad) y estructura de una enzima, en particular de una enzima PMO, en presencia de un componente particular (catión de níquel) durante la reacción o almacenamiento, cuando las condiciones físicas, tales como temperatura u otros factores, tales como el pH, se desvían de los valores óptimos para la enzima. En una realización preferida, la expresión "aumento en la estabilidad" significa "aumento en la estabilidad térmica".
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para preparar la composición de la invención que comprende añadir un catión de níquel a una mezcla enzimática que comprende al menos una enzima PMO, en lo sucesivo el "quinto procedimiento de la invención".
En una realización preferida del quinto procedimiento de la invención, la enzima PMO se selecciona de PMO1 , PMO2, PMO3 o cualquier combinación de las mismas.
En otra realización preferida del quinto procedimiento de la invención, la mezcla enzimática comprende además enzimas celulolíticas seleccionadas de endoglucanasa, beta-glucosidasa, celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, xiloglucanasa, xilanasa, arabinofuranosidasa o cualquier combinación de las mismas.
En una realización más preferida del quinto procedimiento de la invención, la mezcla enzimática es una mezcla enzimática secretada por M. thermophila.
En otra realización preferida del quinto procedimiento de la invención, el catión de níquel se añade en una concentración de más de 0,0001 mM y menos de 50 mM, preferiblemente entre 0,001 y 20 mM, más preferiblemente entre 0,001 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 5 mM e incluso más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM. En una realización incluso más preferida, el catión de níquel se añade en una concentración entre 0,075 y 0,125 mM, incluso más preferiblemente en una concentración de 0,125 mM.
En una realización más preferida del quinto procedimiento de la invención, el catión de níquel se añade en forma de una sal seleccionada de sulfato de níquel, cloruro de níquel, nitrato de níquel, acetato de níquel o hidróxido de níquel, o cualquier combinación de los mismos.
La composición de la invención puede estar en forma líquida o en forma de una composición seca. Por ejemplo, la composición puede estar en forma granular o microgranular. Las enzimas que se van a incluir en la composición pueden estar estabilizadas de acuerdo con procedimientos conocidos en el estado de la técnica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no se pretende que excluyan otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Para un experto en el campo, se pondrán de manifiesto otros objetos, beneficios y características de la invención, en parte a partir de la descripción y en parte a partir de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan solo con propósitos ilustrativos y no se pretende que sean limitantes de esta invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Mejora del rendimiento de glucosa (g/kg) por el cóctel enzimático producido por M. thermophila C1 en ausencia (0) o en presencia de diferentes concentraciones de níquel (mM) en bagazo de maíz pretratado (PCS). Figura 2. Mejora del rendimiento de glucosa y xilosa (g/kg) liberados de la biomasa de bagazo de maíz pretratado por el cóctel enzimático producido por M. thermophila C1 en ausencia (control) o en presencia de diferentes sales de níquel.
5
Figura 3. Mejora del rendimiento de glucosa (g/kg) sobre biomasa por una composición de enzimas definida que incluye endoglucanasa, beta-glucosidasa, celobiohidrolasas (mezcla de celulasas) en ausencia o en presencia de polisacárido i o monooxigenasas (PM01 y/o PM02) y en ausencia o en presencia de níquel.
Figura 4. Estabilidad de varias enzimas celulolíticas en presencia de diferentes concentraciones de níquel (μΜ). Esta figura representa
15 los valores de Tm (°C) a los que el 50% de la enzima está desnaturalizada. A medida que aumenta la concentración de níquel, las PMO se hacen más estables como se muestra por el aumento de la Tm que indica que es necesaria una temperatura mayor para desnaturalizar la PMO. La termoestabilidad de otras enzimas
20 celulolíticas no se ve afectada por la adición de níquel.
Figura 5. Mejora del rendimiento de glucosa (g/kg) por el cóctel enzimático producido por M. thermophila C1 en ausencia (0) o en presencia de diferentes concentraciones (mM) de diferentes 25 cationes divalentes sobre la biomasa.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Efecto de la concentración del ion de níquel en el 30 rendimiento de glucosa liberada por la composición enzimática C1. Se evaluó el efecto de los iones de níquel (II) en el rendimiento de sacarificación de la preparación de celulasas de C1 en bagazo de maíz pretratado (en lo sucesivo PCS, por sus siglas en inglés Pretreted Corn Stover), de acuerdo con los procedimientos descritos a continuación. La preparación de celulasas se denomina en lo sucesivo la "composición C1 ".
La mezcla enzimática, "composición C1 ", producida por Myceliophthora thermophila C1 se obtuvo siguiendo los procedimientos descritos previamente (Verdoes et al., 2007, Ind. Biotechnol. 3 (1 ) y Visser et al., 201 1 , Ind. Biotechnol., 7 (3)), usando una plataforma industrial para la producción enzimática basada en M. thermophila C1 desarrollada por Dyadic Netherlands.
Se usó PCS obtenido de acuerdo con Nguyen et al. (1998, Appl. Biochem. Biotechnol. 70-72) como sustrato para la reacción de hidrólisis. El análisis composicional se llevó a cabo usando los procedimientos de NREL como "Procedimientos analíticos estándares de biomasa". La biomasa se neutralizó, liofilizó y molió.
Se usó la composición de celulasas C1 de Myceliophthora thermophila como preparación de celulasas. La hidrólisis de PCS se llevó a cabo en tubos de plástico de 10 mi con un volumen de reacción de 3,0 mi con 20% de sólidos totales, añadiendo 10 mg de proteína por gramo de glucano con sulfato de níquel hexahidratado a 0-50 mM. Los tubos se mezclaron y se incubaron a 50°C, pH 5, 250 rpm durante 72 h. Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos por duplicado.
Después de la hidrólisis, las muestras se filtraron usando un filtro de nailon de 0,22 μιη y se analizó el contenido de azúcar de los filtrados como se describe a continuación. Se midieron las concentraciones de azúcar de las muestras, diluidas en las concentraciones adecuadas en H2S04 5 mM, usando una columna de 4,6 x 250 mm AMINEX® HPX- 87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) por elución con H2SO4 5 mM con un caudal de 0,6 mi por minuto, y se cuantificó por integración de las señales de glucosa, celobiosa y xilosa a partir de la detección del índice de refracción (CHEMSTATION®, AGILENT® 1 100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) calibrado con muestras de azúcares puros.
La figura 1 muestra el efecto de diferentes concentraciones de níquel (mM) en la liberación de glucosa (g/kg). Se puede ver que la concentración de níquel óptima era 0,125 mM (125 μΜ).
Ejemplo 2. Comparación de diferentes sales de níquel en la liberación de glucosa.
Se compararon diferentes sales de níquel siguiendo el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 1 . Se añadió níquel en forma de sulfato de níquel hexahidratado, cloruro de níquel, acetato de níquel tetrahidratado, nitrato de níquel hexahidratado e hidróxido de níquel, en una concentración final de ion de níquel de 125 μΜ.
La figura 2 muestra el efecto de la adición de sales de níquel en la liberación de glucosa y xilosa. La adición de níquel mejoró la liberación de glucosa pero no afectaba significativamente al rendimiento de xilosa. Todas las sales de níquel usadas producían la misma mejora en la liberación de glucosa. También se obtuvo el mismo efecto con el acetato de níquel tetrahidratado (no se muestran los datos).
Ejemplo 3. Evaluación de la adición de níquel en la actividad polisacárido monooxigenasa.
Se comparó el efecto de la adición de níquel en varias enzimas celulolíticas siguiendo el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 1 . Aquí, la composición C1 se sustituyó por una mezcla enzimática que contenía las celulasas principales, donde se incluyeron una endoglucanasa, una beta-glucosidasa, dos tipos de celobiohidrolasas (tipo I y II) y dos ejemplos de polisacárido monooxigenasas, todas ellas obtenidas de Myceliophthora thermophila, en la preparación de celulasas. La dosificación final de la mezcla enzimática era 8,5 mg de proteína por gramo de glucano.
La figura 3 muestra la comparación de las cuatro composiciones definidas: (1 ) composición definida con endoglucanasa, beta- glucosidasa, ambas celobiohidrolasas y sin polisacárido monooxigenasas (mezcla de celulasas), (2) composición definida con mezcla de celulasas más PM01 , (3) mezcla de celulasas complementada con PM02 y (4) mezcla de celulasas complementada con PM01 y PM02.
La adición de níquel en concentración 125 μΜ mejoró todas las composiciones definidas que contenían polisacárido monooxigenasas (PM01 o/y PM02), pero no mejoró la composición definida sin polisacárido monooxigenasas.
Ejemplo 4. Evaluación de la adición de níquel en la estabilidad de la polisacárido monooxigenasa.
Se evaluó la estabilidad de diferentes PMOs con ensayo de termofluorescencia en tampón de acetato de Na 200 mM, a pH 5,0 y diferentes concentraciones de níquel. Las condiciones experimentales eran un gradiente lineal de temperatura 23-95°C (0,8°C/min). La señal de detección se midió con fluorescencia de tinción en gel de proteínas con naranja SYPRO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) con y sin níquel en diferentes concentraciones (0-200 μΜ) añadido en forma de sulfato de níquel heptahidratado. Tm representa los valores de temperatura (°C) a los que el 50% de la enzima está desnaturalizada. PM01 y PM02 se obtuvieron de Myceliophthora thermophila mientras que PM03 se obtuvo de Penicilium sp.
Como procedimiento general para purificar estas PMOs, se centrifugaron los cultivos fúngicos (21 .000 x g, 40 min, 5°C) para obtener sobrenadantes enriquecidos en celulasa que se aplicaron en una columna HiLoad 26/10 Q-Sepharose de alto rendimiento (53 mi) preequilibrada con tampón de Tris-HCI 50 mM, a pH 7,0. Después de lavar con el mismo tampón la proteína unida se eluyó con un gradiente de NaCI 0-0,5 M con un caudal de 8 ml/min. Las fracciones enriquecidas en PMOs se recogieron y cargaron en una columna HiLoad 26/10 Phenyl-Sepharose de alto rendimiento (53 mi) preequilibrada con tampón de fosfato-Na 100 mM, a pH 7,0, (NH4)2SO4 1 M. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de tampón fosfato-Na 100 mM, a pH 7,0, con un caudal de 8 ml/min. Las fracciones enriquecidas podían necesitar también una etapa de purificación extra con una columna de desalación HiPrep 26/10 equilibrada con tampón de fosfato-Na 50 mM, a pH 7,0, o incluso una HiLoad 16/600 Superdex 75 pg (120 mi), esta columna se equilibró con tampón de fosfato-Na 50 mM, a pH 7,0.
La figura 4 muestra que la Tm media de las PMO aumentó aproximadamente 5°C cuando se añadió la concentración de Ni. Esto indica que cuando la concentración de níquel aumenta, las PMO se vuelven más estables como se muestra por el aumento de Tm, indicando que es necesaria una temperatura mayor para desnaturalizar la PMO cuando hay níquel presente. Esta figura también pone de manifiesto que la termoestabilidad de otras enzimas celulolíticas no está afectada por la adición de níquel.
Ejemplo 5. Comparación de níquel y otras sales divalentes en la sacarificación de bagazo de maíz pretratado.
Se comparó la adición de níquel con la adición de otros iones divalentes tales como magnesio o manganeso en diferentes concentraciones, siguiendo el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 1 .
Se añadió el níquel como acetato de níquel tetrahidratado, el magnesio como sulfato de magnesio heptahidratado y sulfato de manganeso monohidratado.
La adición de níquel potenció la liberación de glucosa (g/kg) más que otros iones divalentes (figura 5).

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Una composición que comprende al menos una enzima polisacárido monooxigenasa y un catión de níquel.
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 , en la que el catión de níquel está presente en una concentración de más de 0,0001 mM y menos de 50 mM, preferiblemente entre 0,001 y 20 mM, más preferiblemente entre 0,001 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM, e incluso más preferiblemente entre 0,075 y 0,125 mM.
3. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el catión de níquel está en forma de una sal.
4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que la sal de níquel se selecciona de sulfato de níquel, cloruro de níquel, nitrato de níquel, acetato de níquel o hidróxido de níquel, o cualquier combinación de los mismos.
5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la enzima polisacárido monooxigenasa se selecciona de PM01 , PM02, PM03 o cualquier combinación de las mismas.
6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composición comprende además enzimas celulolíticas.
7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que las enzimas celulolíticas se seleccionan de endoglucanasa, beta- glucosidasa, celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, xiloglucanasa, xilanasa, arabinofuranosidasa o cualquier combinación de las mismas.
8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la enzima polisacárido monooxigenasa y las enzimas celulolíticas son una mezcla enzimática secretada por Myceliophthora thermophila.
9. Uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la degradación de biomasa celulósica.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la degradación de biomasa celulósica se produce en un procedimiento de producción de bioproducto.
1 1 . Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el bioproducto es un biocombustible.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 1 , en el que el biocombustible es bioetanol o butanol.
13. Un procedimiento para producir azúcares fermentables que comprende: a. Incubar biomasa celulósica con la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y
b. Recuperar los azúcares fermentables obtenidos después de incubación de la etapa (a).
14. Un procedimiento para producir azúcares fermentables que comprende: a. Incubar biomasa celulósica con una mezcla enzimática que comprende enzimas celulolíticas y al menos una enzima polisacárido monooxigenasa,
b. Añadir un catión de níquel a la etapa de incubación (a), y
c. Recuperar los azúcares fermentables obtenidos.
15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la enzima polisacárido monooxigenasa se selecciona de PM01 , PM02, PM03 o cualquier combinación de las mismas.
16. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, en el que las enzimas celulolíticas se seleccionan de endoglucanasa, beta-glucosidasa, celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, xiloglucanasa, xilanasa, arabinofuranosidasa o cualquier combinación de las mismas.
17. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que la mezcla enzimática usada en la etapa (a) es una mezcla enzimática secretada por Myceliophthora thermophila.
18. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que el catión de níquel se añade en la etapa (b) en una concentración de más de 0,0001 mM y menos de 50 mM, preferiblemente entre 0,001 y 20 mM, más preferiblemente entre 0,001 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM, e incluso más preferiblemente entre 0,075 y 0,125 mM.
19. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el catión de níquel se añade en la etapa (b) en forma de una sal seleccionada de sulfato de níquel, cloruro de níquel, nitrato de níquel, acetato de níquel o hidróxido de níquel, o cualquier combinación de los mismos.
20. Un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa celulósica que comprende: a. Incubar biomasa celulósica con la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
b. Fermentar los azúcares fermentables obtenidos después de la incubación de la etapa (a) con al menos un microorganismo fermentador, y
c. Recuperar el bioproducto obtenido después de la etapa de fermentación (b).
21 . Un procedimiento para producir un bioproducto a partir de biomasa celulósica, que comprende: a. Incubar la biomasa celulósica con una mezcla enzimática que comprende enzimas celulolíticas y al menos una enzima polisacárido monooxigenasa,
b. Añadir un catión de níquel a la etapa de incubación (a),
c. Fermentar los azúcares fermentables obtenidos con al menos un microorganismo fermentador, y
d. Recuperar el bioproducto obtenido después de la etapa de fermentación (c).
22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21 , en el que la enzima polisacárido monooxigenasa se selecciona de PM01 , PM02, PM03 o cualquier combinación de las mismas.
23. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, en el que las enzimas celulolíticas se seleccionan de endoglucanasa, beta-glucosidasa, celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, xiloglucanasa, xilanasa, arabinofuranosidasa o cualquier combinación de las mismas.
24. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en el que la mezcla enzimática usada en la etapa (a) es una mezcla enzimática secretada por Myceliophthora thermophila.
25. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el que el catión de níquel se añade en la etapa (b) en una concentración de más de 0,0001 mM y menos de 50 mM, preferiblemente entre 0,001 y 20 mM, más preferiblemente entre 0,001 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM, e incluso más preferiblemente entre 0,075 y 0,125 mM.
26. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, en el que el catión de níquel se añade en la etapa (b) en forma de una sal seleccionada de sulfato de níquel, cloruro de níquel, nitrato de níquel, acetato de níquel o hidróxido de níquel, o cualquier combinación de los mismos.
27. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, en el que el bioproducto es biocombustible.
28. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el biocombustible es bioetanol o butanol.
29. Un procedimiento para preparar la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende añadir un catión de níquel a una mezcla enzimática que comprende al menos una enzima polisacárido monooxigenasa.
30. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29, en el que el catión de níquel se añade en una concentración de más de 0,0001 mM y menos de 50 mM, preferiblemente entre 0,001 y 20 mM, más preferiblemente entre 0,001 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 5 mM, incluso más preferiblemente entre 0,05 y 0,5 mM, e incluso más preferiblemente entre 0,075 y 0,125 mM.
31 . El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 o 30, en el que el catión de níquel se añade en forma de una sal seleccionada de sulfato de níquel, cloruro de níquel, nitrato de níquel, acetato de níquel o hidróxido de níquel, o cualquier combinación de los mismos.
32. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 , en el que la enzima polisacárido monooxigenasa se selecciona de PM01 , PM02, PM03 o cualquier combinación de las mismas.
33. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en el que la mezcla enzimática comprende además enzimas celulolíticas seleccionadas de endoglucanasa, beta- glucosidasa, celobiohidrolasa, beta-xilosidasa, xiloglucanasa, xilanasa, arabinofuranosidasa o cualquier combinación de las mismas.
34. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33, en el que la mezcla enzimática es una mezcla enzimática secretada por Myceliophthora thermophila.
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