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WO2016047652A1 - Ｆｖｉｉｉの反応性を測定する方法 - Google Patents

Ｆｖｉｉｉの反応性を測定する方法 Download PDF

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WO2016047652A1
WO2016047652A1 PCT/JP2015/076848 JP2015076848W WO2016047652A1 WO 2016047652 A1 WO2016047652 A1 WO 2016047652A1 JP 2015076848 W JP2015076848 W JP 2015076848W WO 2016047652 A1 WO2016047652 A1 WO 2016047652A1
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WO
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coagulation factor
binds
antibody
binding site
fviii
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/076848
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恵嗣 野上
緑倫 嶋
哲弘 添田
剛久 北澤
Original Assignee
公立大学法人奈良県立医科大学
中外製薬株式会社
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Publication date
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    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the reactivity of FVIII (for example, a method for measuring FVIII activity and FVIII inhibitor titer) in the presence of a substance having a coagulation factor VIII (FVIII) function-substituting activity.
  • the present invention also relates to a kit for measuring FVIII reactivity in the presence of a substance having FVIII function-substituting activity.
  • Hemophilia is a hemorrhagic disease caused by a congenital defect or dysfunction of FVIII or coagulation factor IX (FIX).
  • the former is called hemophilia A and the latter is called hemophilia B.
  • hemophilia A Since both genes are present on the X chromosome and genetic abnormalities take the X chromosome-linked recessive form, more than 99% of affected patients are male. It is known that the prevalence is approximately 1 per 10,000 male births, and the ratio of hemophilia A to hemophilia B is approximately 5: 1.
  • Major hemorrhage sites in hemophilia patients include intra-articular, intramuscular, subcutaneous, intraoral, intracranial, gastrointestinal tract, and intranasal cavities.
  • intra-articular, intramuscular, subcutaneous, intraoral, intracranial, gastrointestinal tract, and intranasal cavities In particular, repeated bleeding into the joint progresses to hemophilic arthropathy with joint damage and difficulty walking, and joint replacement may eventually be required. Therefore, it is a major factor that lowers the QOL of hemophilia patients.
  • hemophilia The severity of hemophilia is well correlated with FVIII activity or FIX activity in blood. Patients with clotting factor activity less than 1% are classified as severe, those with activity between 1% and less than 5% are moderate, and those with activity between 5% and less than 40% are classified as mild. Severe patients, accounting for about half of hemophilia patients, exhibit bleeding symptoms several times a month without preventive replacement therapy described below, which is significantly more frequent than moderate and mild patients.
  • vWF von Willebrand factor
  • blood coagulation factors purified from plasma or produced by gene recombination techniques are mainly used.
  • maintaining FVIII activity or FIX activity in blood at 1% or higher by FVIII or FIX replacement therapy is considered to be effective in preventing bleeding symptoms (Non-patent literature). 1, 2).
  • an antibody against FVIII or FIX called an inhibitor may be generated in hemophilia patients, particularly severe hemophilia patients.
  • an inhibitor is generated, the effect of the coagulation factor formulation is hindered by the inhibitor.
  • neutralization therapy using a large amount of coagulation factor preparation or bypass therapy using complex preparation (complexcomconcentrate) or activated coagulation factor VII preparation (FVIIa preparation) is performed.
  • the measurement of FVIII activity in hemophilia A is mainly based on an activated partial thromboplastin time (APTT) based one-stage clotting assay (Non-patent Document 3) and a chromogenic assay that is a reconstitution system using purified coagulation factors ( Non-patent document 4).
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • Non-patent Document 4 a chromogenic assay that is a reconstitution system using purified coagulation factors
  • the titer measurement of FVIII inhibitor in hemophilia A is mainly carried out by Bethesda assay or Nijmegen Bethesda assay (Non-patent Documents 5 and 6).
  • FIXa FIX and / or activated coagulation factor IX
  • FX coagulation factor X
  • FXa activated blood coagulation factor X
  • Bispecific antibodies have been found to substitute for the function of promoting FX activation by (Non-patent Documents 7 and 8, Patent Documents 1, 2, and 3). This bispecific antibody replaces the function of FVIII and improves the decrease in coagulation due to FVIII deficiency and dysfunction.
  • this bispecific antibody shortens APTT in plasma from hemophilia A patients and increases thrombin generation regardless of the presence of FVIII inhibitors.
  • the APTT shortening action of this bispecific antibody is remarkable compared to FVIII. This is because FVIII in plasma exhibits cofactor activity only when it is activated by thrombin or activated factor X (FXa), whereas this bispecific antibody does not require such an activation process, This is because the cofactor function is exhibited earlier.
  • an antibody against FIXa Fab and an antibody against FX Fab of the bispecific antibody were obtained, and the concentration of the bispecific antibody in a plasma sample of animal experiments was measured (Non-patent Document 9).
  • Bispecific antibodies replace FVIII cofactor functions and thus affect assay systems that measure the reactivity of FVIII itself.
  • plasma FVIII activity is measured in one-stage clotting assay based on APTT.
  • APTT clotting assay based on APTT.
  • its coagulation time shortening promoting action strongly interferes, and accuracy is greatly impaired.
  • plasma FVIII inhibitor titer with BethesdaBeassay based on APTT
  • this bispecific antibody in the presence of this bispecific antibody, its coagulation time shortening accelerating action strongly interferes, and accuracy is greatly impaired.
  • FVIII activity and FVIII inhibitor titer cannot be accurately measured in patients administered this bispecific antibody. Therefore, a method capable of measuring FVIII activity and FVIII inhibitor titer even in the presence of this bispecific antibody has been desired.
  • the present invention relates to a method for measuring the reactivity of FVIII in the presence of a substance having an FVIII function-substituting activity, for example, a method for measuring FVIII activity or FVIII inhibitor titer.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for measuring FVIII reactivity, for example, FVIII activity and FVIII inhibitor titer, in the presence of a substance having FVIII function-substituting activity.
  • the present inventors made a substance that neutralizes the activity of the bispecific antibody for the test item for measuring the reactivity of FVIII, and in the presence of the bispecific antibody.
  • a neutralizing antibody against the bispecific antibody at an appropriate concentration (for example, a concentration that can sufficiently neutralize the bispecific antibody), thereby allowing one-
  • the stage clotting assay found that FVIII activity in the plasma of hemophilia A patients could be accurately evaluated, and the APTT-based Bethesda assay revealed that the FVIII inhibitor titer in the plasma of patients with hemophilia A carrying an FVIII inhibitor It was also found that can be evaluated accurately.
  • a method for measuring the reactivity of coagulation factor VIII comprising a step of contacting the following (1) and (2): (1) Blood-derived sample containing a substance having a function-substituting activity for coagulation factor VIII (2) One or more substances that neutralize a substance having a function-substitution activity for coagulation factor VIII [2] Function of coagulation factor VIII
  • the substance having an alternative activity is a bispecific antibody that binds to coagulation factor IX and / or activated coagulation factor IX and coagulation factor X and / or activated blood coagulation factor X [1] the method of.
  • the bispecific antibody is any one of the antibodies described below, wherein the first polypeptide and the third polypeptide are associated, and the second polypeptide and the fourth polypeptide are associated.
  • the first polypeptide is an H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9
  • the second polypeptide is the H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11
  • the third polypeptide and the fourth polypeptide is a bispecific antibody (Q499-z121 / J327-z119 / L404-k), wherein the peptide consists of a common L chain described in SEQ ID NO: 10.
  • the first polypeptide is an H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36
  • the second polypeptide is the H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37
  • a third polypeptide and a fourth polypeptide.
  • a bispecific antibody (Q153-G4k / J142-G4h / L180-k), wherein the peptide comprises the common L chain set forth in SEQ ID NO: 38.
  • the substance to be neutralized is one or more substances selected from the group consisting of peptides, polypeptides, organic compounds, aptamers, and antibodies that neutralize the substance having the function-substituting activity of the coagulation factor VIII. [1] to [3].
  • [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the neutralizing substance is one or more combinations selected from the group consisting of the following antibody combinations.
  • Antibody binding to Fab containing antigen binding site and antibody binding to Fab containing antigen binding site binding to coagulation factor X (c) Antibody binding to Fab containing antigen binding site binding to coagulation factor IX and activity An antibody that binds to a Fab containing an antigen binding site that binds to coagulation factor IX (d) An antibody that binds to a Fab containing an antigen binding site that binds to coagulation factor IX, and an antigen binding site that binds to coagulation factor X An antibody that binds to a Fab and an antibody that binds to an Fab containing an antigen binding site that binds to activated coagulation factor IX [7] A method for measuring the reactivity of coagulation factor VIII measures coagulation factor VIII activity A method or a method for measuring the coagulation factor VIII inhibitor titer [1] to [6].
  • An antibody that binds to a Fab containing an antigen binding site that binds to coagulation factor IX, an antibody that binds to a Fab containing an antigen binding site that binds to activated coagulation factor IX, and an antigen binding to bind to coagulation factor X An antibody that binds to a Fab containing a site, an antibody that binds to a Fab containing an antigen binding site that binds to activated coagulation factor X, and an antigen binding site that binds to coagulation factor IX and / or activated coagulation factor IX
  • the kit according to [8] comprising one or more combinations selected from the group consisting of the following antibody combinations.
  • Antibody binding to Fab containing antigen binding site and antibody binding to Fab containing antigen binding site binding to coagulation factor X (c) Antibody binding to Fab containing antigen binding site binding to coagulation factor IX and activity An antibody that binds to a Fab containing an antigen binding site that binds to coagulation factor IX (d) An antibody that binds to a Fab containing an antigen binding site that binds to coagulation factor IX, and an antigen binding site that binds to coagulation factor X Using the method according to any one of [10] [1] to [7], comprising an antibody that binds to a Fab and an antibody that binds to a Fab comprising an antigen binding site that binds to activated coagulation factor IX, coagulation factor VIII A person who diagnoses the severity of a patient who has been administered a substance having a function-substituting activity of a factor .
  • [11] A method for diagnosing the inhibitor titer of a patient administered with a substance having a function-substituting activity for coagulation factor VIII, using the method according to any one of [1] to [7].
  • [12] A method for monitoring the pharmacological activity of an FVIII preparation in a patient administered with a substance having a function-substituting activity for coagulation factor VIII and an FVIII preparation using the method according to any one of [1] to [7].
  • the patient is a hemophilia A patient, an acquired hemophilia A patient, a von Willebrand disease patient, and blood in which an inhibitor of blood coagulation factor VIII and / or activated blood coagulation factor VIII appears.
  • kits for monitoring the pharmacological activity of an FVIII preparation in a patient administered with a substance having a function-substituting activity of coagulation factor VIII and an FVIII preparation wherein the kit according to [8] or [9].
  • the patient is a hemophilia A patient, an acquired hemophilia A patient, a von Willebrand disease patient, and blood in which an inhibitor of blood coagulation factor VIII and / or activated blood coagulation factor VIII appears.
  • the present invention provides a method capable of measuring FVIII activity and FVIII inhibitor titer without being affected by the activity of a substance having FVIII alternative activity.
  • Substances having FVIII surrogate activity include FIX and / or FIXa and bispecific antibodies that bind to FX and / or FXa.
  • a buffer containing two antibodies against anti-FIXa / FX bispecific antibody against FVIII-deficient plasma containing 10 or 100 U / dL recombinant FVIII supplemented with anti-FIXa / FX bispecific antibody ACE910.
  • FVIII-deficient plasma containing 10 U / dL recombinant FVIII supplemented with anti-FIXa / FX bispecific antibody ACE910 contains two antibodies AQ1 and AJ541 against anti-FIXa / FX bispecific antibody
  • buffer (# 5) or diluted with buffer containing two antibodies AQ1 and AJ522 against anti-FIXa / FX bispecific antibody (# 6) no anti-FIXa / FX bispecific antibody added FVIII activity similar to the group (# 1) was shown.
  • FVIII-deficient plasma containing 10 U / dL recombinant FVIII supplemented with anti-FIXa / FX bispecific antibody hBS23 contains two antibodies AQ512 and AJ114 against anti-FIXa / FX bispecific antibody
  • buffer (# 5) or diluted with a buffer containing two antibodies against anti-FIXa / FX bispecific antibodies, AQ512 and AJ521 (# 6) no anti-FIXa / FX bispecific antibody added FVIII activity similar to the group (# 1) was shown.
  • the FVIII inhibitor plasma (# 3) containing only the anti-FIXa / FX bispecific antibody ACE910 showed activity of FVIII 100% or more of the standard curve.
  • FVIII inhibitor plasma (# 4) containing two antibodies against anti-FIXa / FX bispecific antibody and anti-FIXa / FX bispecific antibody has the same FVIII as that of additive-free inhibitor plasma (# 1). Inhibitor titers were shown.
  • FVIII inhibitor plasma (# 2) containing only antibodies against two anti-FIXa / FX bispecific antibodies showed similar results to # 1.
  • the method for measuring the activity of FVIII of the present invention comprises the following steps (1) and (2).
  • the rest can be carried out according to a commonly used method for measuring FVIII activity. Specifically, it will be described in the embodiment.
  • FVIII activity measurement method As a commonly used FVIII activity measurement method, methods known to those skilled in the art can be used. For example, factor VIII-deficient plasma (Sysmex) based on clotting time (aPTT measurement) can be used. , Kobe, Japan), one-stage clotting assay (Casillas et al., (1971) Coagulation 4: 107-11) can be used. The one-stage clotting assay is performed, for example, by the following method. Mix 3 solutions of 10-fold diluted test plasma 50 ⁇ L, FVIII-deficient plasma 50 ⁇ L, and APTT reagent 50 ⁇ L, incubate at 37 ° C.
  • FVIII activity can be measured by a thrombin generation test (TGA), a measurement method using rotational thromboelastometry, an FVIII chromogenic assay, coagulation waveform analysis, thrombin, and active factor X A production test or the like can be used.
  • TGA thrombin generation test
  • FVIII chromogenic assay coagulation waveform analysis
  • thrombin active factor X
  • the method for measuring the titer of the FVIII inhibitor of the present invention comprises the following steps (1) and (2). The remainder can be carried out according to a commonly used FVIII inhibitor titer measurement method. Specifically, it will be described in the embodiment.
  • FVIII inhibitor titration method As a commonly used FVIII inhibitor titration method, a method known to those skilled in the art can be used. For example, Bethesda assay (Kasper et al., (1975) Thrombos Diath Haemorrh 34: 869-872), ELISA method, Nijmegen Bethesda assay (Nijmegen modification assay) (Verbruggen et al., (1995) Thromb Haemost 73: 247-251) can be used. The Bethesda assay is performed by the following method, for example.
  • FVIII FVIII is one of a series of molecules involved in blood coagulation. When activated by thrombin or FXa, it exhibits cofactor activity and promotes FX activation by FIXa.
  • FVIII inhibitors are alloantibodies against foreign FVIII that occur in 20-30% of hemophilia A patients. Moreover, even in an originally normal individual, an autoantibody can be raised against FVIII. In general, the majority of FVIII inhibitor alloantibodies and autoantibodies function as anti-FVIII neutralizing antibodies and reduce or eliminate FVIII activity.
  • FVIII substitute activity The substance having FVIII function substitute activity of the present invention can also be referred to as a substance having FVIII-like activity.
  • substitute the function of FVIII means promoting the activation of FX by FIXa (facilitating the production of FXa by FIXa). More specifically, in the present invention, “substitute the function of FVIII” means that FIX and / or FIXa and FX and / or FXa are recognized and FX activation by FIXa is promoted (FXa by FIXa). Production).
  • FXa production promoting activity can be evaluated by a measurement system comprising, for example, FIXa, FX, synthetic substrate S-2222 (FXa synthetic substrate), and phospholipid.
  • a measurement system correlates with disease severity and clinical symptoms in hemophilia A cases (Rosen S, Andersson M, Blomba ⁇ ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23).
  • FIX and / or FIXa and bispecific antibody binding to FX and / or FXa can be exemplified.
  • Such an antibody can be obtained, for example, according to the method described in WO2005 / 035756, WO2006 / 109592, WO2012 / 067176, and the like.
  • the bispecific antibodies of the present invention include the antibodies described in these documents.
  • ACE910 Q499-z121 / J327-z119 / L404-k
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9 which is a bispecific antibody described in the patent document (WO 2012/067176)
  • H chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 and the L chain shown in SEQ ID NO: 10 are associated with each other.
  • BShBS23 Q153-G4k / J142-G4h / L180-k
  • SEQ ID NO: 37 A bispecific antibody in which the H chain consisting of the described amino acid sequence is associated with the L chain described in SEQ ID NO: 38.
  • Neutralization in a substance that neutralizes a substance having FVIII function-substituting activity in the present invention refers to, for example, inhibiting all or part of the FVIII function-substituting activity of a substance having FVIII function-substituting activity. Inhibition of FVIII function-substituting activity in whole or in part can be achieved by, for example, inhibiting all or part of antibody binding to an antigen when the substance having FVIII function-substituting activity is an antibody. It is not limited.
  • Substance to be neutralized is, for example, a peptide, a polypeptide, which binds to a substance having a function-substituting activity of FVIII, It refers to organic compounds, aptamers, antibodies, etc.
  • a plurality of neutralizing substances can be used in combination.
  • an antibody and an aptamer can be used in combination.
  • polypeptide in the present invention usually refers to peptides and proteins having a length of about 10 amino acids or more. Moreover, although it is normally a polypeptide derived from a living organism
  • Organic compound in this invention is a low molecular weight compound, for example, Preferably molecular weight is 1000 or less.
  • aptamer refers to a nucleic acid molecule that specifically binds to a target molecule, such as a polypeptide.
  • the aptamer of the present invention can be an RNA aptamer that can specifically bind to a substance having FVIII alternative activity.
  • the production and therapeutic use of aptamers is well established in the art.
  • aptamers can be obtained by using the SELEX method (see US Pat. Nos. 5475096, 5580737, 5567588, 5707796, 5763177, 6966943, etc.).
  • an antibody that binds to a substance having a function-substituting activity of antibody FVIII for example, if the substance having a function-substituting activity of FVIII is a bispecific antibody that binds to FIX and / or FIXa and FX and / or FXa,
  • An antibody that binds to a Fab that contains an antigen-binding site that binds an antibody that binds to an Fab that contains an antigen-binding site that binds to FIXa, an antibody that binds to an Fab that contains an antigen-binding site that binds to FX, and an antigen-binding site that binds to FXa Selected from the group consisting of an antibody that binds to a Fab containing, a Fab that contains an antigen binding site that binds to FIX and / or FIXa, and a bispecific antibody that binds to a Fab that contains an antigen binding site that bind
  • the above antibodies can be used alone or in combination.
  • a plurality of antibodies that bind to a Fab including an antigen binding site that binds to one type of antigen for example, a plurality of antibodies that bind to a Fab including an antigen binding site that binds to FIX, can be used.
  • the substance having a function-substituting activity of FVIII is a bispecific antibody that binds to FIX and / or FIXa and FX and / or FXa, for example, the following combinations can be used.
  • Examples of antibodies that bind to Fab including an antigen binding site that binds to FIX and / or FIXa include AQ8, AQ1, and AQ512 antibodies.
  • the base sequence of the variable region and the amino acid sequence predicted therefrom were analyzed by GENETYX Ver.9 (GENETYX CORPORATION).
  • the amino acid sequence and nucleic acid sequence of the heavy chain variable region of AQ8 are shown by the following SEQ ID NOs.
  • Nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 5 The amino acid sequence and nucleic acid sequence of the AQ8 L chain variable region are shown by the following SEQ ID NOs.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 2 Nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 6
  • the amino acid sequence and nucleic acid sequence of AQ8 H chain CDR1 to 3 are shown by the following SEQ ID NOs.
  • CDR2 nucleic acid sequence SEQ ID NO: 16
  • CDR3 nucleic acid sequence SEQ ID NO: 17
  • the amino acid sequence and nucleic acid sequence of L chain CDR1-3 of AQ8 are shown by the following SEQ ID NOs.
  • CDR1 amino acid sequence SEQ ID NO: 18 CDR2 amino acid sequence: SEQ ID NO: 19 CDR3 amino acid sequence: SEQ ID NO: 20 CDR1 nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 21 CDR2 nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 22 CDR3 nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 23
  • Examples of the antibody that binds to Fab including an antigen binding site that binds to FX and / or FXa include the AJ540, AJ541, AJ522, AJ114, and AJ521 antibodies.
  • the base sequence of the variable region and the amino acid sequence predicted therefrom were analyzed by GENETYX Ver.9 (GENETYX CORPORATION).
  • the amino acid sequence and nucleic acid sequence of the heavy chain variable region of AJ540 are represented by the following SEQ ID NOs.
  • Nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 7 The amino acid sequence and nucleic acid sequence of the light chain variable region of AJ540 are represented by the following SEQ ID NOs.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 4
  • Nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 8 The amino acid sequence and nucleic acid sequence of HJ CDR1 to 3 of AJ540 are shown by the following SEQ ID NOs.
  • CDR3 nucleic acid sequence: SEQ ID NO: 29 The amino acid sequence and nucleic acid sequence of L chain CDR1 to 3 of AJ540 are shown by the following SEQ ID NOs.
  • CDR1 amino acid sequence SEQ ID NO: 30
  • CDR2 amino acid sequence SEQ ID NO: 31
  • CDR3 amino acid sequence SEQ ID NO: 32
  • CDR1 nucleic acid sequence SEQ ID NO: 33
  • CDR2 nucleic acid sequence SEQ ID NO: 34
  • CDR3 nucleic acid sequence SEQ ID NO: 35
  • antibody is used in the broadest sense and is monoclonal, polyclonal, dimeric, multimeric, multispecific (eg, bispecific) as long as it exhibits the desired biological activity. Alternatively, it may be an antibody derivative or a modified antibody (Miller K et al. J Immunol. 2003, 170 (9), 4854-61).
  • the antibody may be a mouse antibody, a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, or may be derived from another species or artificially synthesized.
  • the antibodies disclosed herein can be any type of immunoglobulin molecule (eg, IgG, IgE, IgM, IgD and IgA), class (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) or subclass. It can be.
  • the immunoglobulin can be from any species (eg, human, mouse or rabbit).
  • the terms “antibody”, “immunoglobulin” and “immunoglobulin” are used interchangeably in a broad sense.
  • Antibody derivatives comprise a portion of an antibody, preferably the variable region of an antibody, or at least the antigen binding region of an antibody.
  • the antibody derivative for example Fab, Fab ', F (ab ') 2, Fv fragments, linear antibodies, single-chain antibodies (scFv), sc (Fv) 2, Fab 3, domain antibodies (dAb) (WO 2004/058821, International Publication No. 2003/002609), including but not limited to multispecific antibodies formed from diabodies, triabodies, tetrabodies, minibodies and antibody derivatives.
  • Fab is composed of one light chain and the CH1 region and variable region of one heavy chain.
  • “Fv” is the smallest antibody derivative and includes a complete antigen recognition region and an antigen binding region.
  • the antibody derivative may be, for example, a fusion of IgG antibody with Fc.
  • US Pat. No. 5,461,870, Example 2 Zapata G et al. Protein Eng. 1995, 8 (10), 1057-1062; Olafsen T et al. Protein Eng. Design & Sel. 2004, 17 (4 ): 315-323; Holliger P et al. Nat. Biotechnol. 2005, 23 (9); 1126-36; Fischer N et al. Pathobiology. 2007, 74 (1): 3-14; Shen J et al. J Immunol Methods. 2007, 318, 65-74; Wu et al. Nat Biotechnol. 2007, 25 (11), 1290-7.
  • modified antibody examples include antibodies bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the antibody of the present invention includes these modified antibodies.
  • the substance to be bound is not limited. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • Bispecific antibody refers to an antibody having variable regions that recognize different epitopes within the same antibody molecule.
  • the bispecific antibody may be an antibody that recognizes two or more different antigens, or an antibody that recognizes two or more different epitopes on the same antigen.
  • Bispecific antibodies may include whole antibodies as well as antibody derivatives.
  • the antibodies of the present invention also include bispecific antibodies.
  • the anti-FIXa / FX bispecific antibody is used synonymously with a bispecific antibody that binds to FIXa and FX.
  • Recombinant antibody produced using a gene recombination technique can be used.
  • Recombinant antibodies are produced by cloning DNA encoding them from hybridomas or antibody-producing cells such as sensitized lymphocytes that produce antibodies, incorporating them into vectors, and introducing them into hosts (host cells). Can be obtained.
  • the origin of the antibody is not limited, such as a human antibody, a mouse antibody, or a rat antibody. Further, it may be a genetically modified antibody such as a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • a target human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a target antigen (International Patent Application Publication) No. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • a chimeric antibody is an antibody comprising the H chain and L chain variable regions of an immunized animal antibody, and the H chain and L chain constant regions of a human antibody.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating a DNA encoding the variable region of an antibody derived from an immunized animal with a DNA encoding the constant region of a human antibody, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host, and producing it. .
  • a humanized antibody is a modified antibody also referred to as a reshaped human antibody.
  • Humanized antibodies are constructed by grafting the CDRs of antibodies from immunized animals to the complementarity determining regions of human antibodies. Its general genetic recombination techniques are also known (European Patent Application Publication Number EP 239400, International Patent Application Publication Number WO 96/02576, Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856, International Patent Application Publication number WO 99/51743).
  • Bispecific antibodies are antibodies that have specificity for two different antigens.
  • Bispecific antibodies are not limited to those of IgG type, but for example, IgG type bispecific antibodies can be secreted by hybrid hybridoma (quadroma) generated by fusing two hybridomas that produce IgG antibodies. (Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540). Moreover, it can be secreted by co-expressing the L chain and H chain genes constituting the two kinds of target IgG, a total of four kinds of genes by introducing them into cells.
  • hybrid hybridoma quadroma
  • the antibody may be an antibody having a common L chain.
  • An antibody that is an embodiment of a substance that neutralizes a substance having a function-substituting activity of FVIII in the present invention is an antibody that binds to an epitope that overlaps with an epitope to which the antibody binds, more preferably an antibody that binds to the same epitope Is also included.
  • Whether an antibody recognizes an overlapping epitope or the same epitope as another antibody can be confirmed by competition for the epitopes of both. Competition between antibodies can be evaluated by competitive binding assays, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescence energy transfer assay (FRET), and fluorescence microassay technology (FMAT (registered trademark)). Is mentioned.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • FRET fluorescence energy transfer assay
  • FMAT fluorescence microassay technology
  • the antibody labeled with an appropriate label and the test antibody are simultaneously added to the antigen, and the bound antibody is detected using the label.
  • the amount of the antibody bound to the antigen can be easily measured by labeling the antibody in advance.
  • This labeling is not particularly limited, but a labeling method corresponding to the technique is selected. Specific examples of the labeling method include fluorescent labeling, radiolabeling, enzyme labeling and the like.
  • an antibody that binds to an overlapping epitope or “an antibody that binds to the same epitope” means a concentration (IC that reduces the binding amount by 50% by binding of the unlabeled antibody to the labeled antibody. 50 ), the test antibody is usually 100 times, preferably 80 times, more preferably 50 times, more preferably 30 times, more preferably 10 times higher than the IC 50 of the unlabeled antibody at least 50 times. %, An antibody that can reduce the amount of the labeled antibody bound.
  • the analysis of the epitope recognized by the antibody can be performed by methods known to those skilled in the art, for example, Western blotting.
  • the antibody of the present invention can be produced by methods known to those skilled in the art. Specifically, DNA encoding the target antibody is incorporated into an expression vector. In that case, it integrates into an expression vector so that it may express under the control of an expression control region, for example, an enhancer and a promoter. Next, host cells are transformed with this expression vector to express the antibody. In that case, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • vectors examples include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, and pCR-Script.
  • pGEM-T pDIRECT, pT7 and the like can be used in addition to the above vector.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing an antibody.
  • an expression vector for example, when the host is E. coli such as JM109, DH5 ⁇ , HB101, XL1-Blue, a promoter that can be efficiently expressed in E. coli, such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341). , 546544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB promoter (Better et al., Science (1988) 1240, 1041-1043), or the T7 promoter is essential.
  • such vectors include pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAexpress® system” (QIAGEN), pEGFP, or pET (in this case, the host expresses T7 RNA polymerase).
  • pGEX-5X-1 Pulacia
  • QIAexpress® system QIAGEN
  • pEGFP pEGFP
  • pET in this case, the host expresses T7 RNA polymerase.
  • BL21 is preferred).
  • the vector may also contain a signal sequence for polypeptide secretion.
  • a signal sequence for polypeptide secretion for example, a pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli.
  • Introduction of a vector into a host cell can be performed using, for example, a calcium chloride method or an electroporation method.
  • vectors for producing the antibody of the present invention include, for example, mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS® (Nucleic® Acids.® Res. 1990, 18).
  • mammalian-derived expression vectors for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BOS® (Nucleic® Acids.® Res. 1990, 18).
  • Bacillus subtilis (17), p5322), pEF, pCDM8), insect cell-derived expression vectors (eg “Bac-to-BAC baculovirus expression system” (GIBCO BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg pMH1, pMH2 ), Animal virus-derived expression vectors (for example, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (for example, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (for example, “Pichia® Expression® Kit” (manufactured by Invitrogen), pNV11 , SP-Q01), and an expression vector derived from Bacillus subtilis (for example, pPL608, pKTH50).
  • Bacillus subtilis for example, pPL608, pKTH50.
  • promoters necessary for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), It is essential to have MMTV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CAG promoter (Gene. (1991) 108, 193), CMV promoter, etc. More preferably, it has a gene for selecting transformed cells. Examples of genes for selecting transformed cells include drug resistance genes that can be distinguished by drugs (neomycin, G418, etc.). Examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • a vector having a DHFR gene complementary to the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway for example, , PCHOI, etc.
  • amplifying with methotrexate (MTX) for example, COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome
  • COS with a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome An example is a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using cells.
  • a vector such as pcD
  • the replication origin those derived from polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vectors are selectable markers: aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase ( dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • the antibody of the present invention thus obtained can be isolated from the inside of the host cell or outside the cell (medium etc.) and purified as a substantially pure and homogeneous antibody. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used in normal antibody purification, and are not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, When combined, antibodies can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC. Examples of columns used for affinity chromatography include Protein A column and Protein G column. For example, as a column using Protein A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (GE Amersham Biosciences) and the like can be mentioned. The present invention also encompasses antibodies highly purified using these purification methods.
  • the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing etc. (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), but is not limited to these. Examples of the column used for affinity chromatography include a Protein A column, a Protein G column, and the like.
  • the blood-derived sample is preferably a blood-derived sample collected from a subject.
  • a blood-derived sample can be obtained from a subject who has been administered a substance having FVIII alternative activity.
  • the subject include patients with hemorrhagic symptoms (hemorrhagic disease patients) at any site in the body.
  • major bleeding sites include, but are not limited to, intra-articular, intramuscular, subcutaneous, intraoral, intracranial, gastrointestinal tract, and intranasal cavity.
  • the hemorrhagic disease patient preferably includes a hemorrhagic disease patient caused by a decrease or deficiency of FVIII and / or FVIIIa activity.
  • Patients with hemorrhagic disease caused by decreased or deficient activity of FVIII and / or FVIIIa are patients with hemorrhagic symptoms, either congenital or acquired, either FVIII and / or FVIIIa activity
  • a patient with reduced or deficient can be exemplified.
  • these activities are preferably less than 40% (eg, less than 40%, less than 30%, less than 20%, less than 10%), more preferably 10%, compared with healthy subjects Less than (eg less than 10%, less than 9%, less than 8%, less than 7%, less than 6%), more preferably less than 5% (eg less than 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%), especially Preferably, fewer than 1% of patients are included, but not limited thereto.
  • hemophilia hemophilia A, hemophilia B
  • acquired hemophilia hemophilia A, hemophilia B
  • von Willebrand factor (vWF) dysfunction or deficiency examples include, but are not limited to, von Willebrand disease.
  • a blood-derived sample includes serum, plasma, or whole blood. In the present invention, it is preferable to use a plasma sample. Methods for obtaining blood-derived samples from subjects are well known to those skilled in the art.
  • kits Various reagents such as buffers necessary for the method for measuring the reactivity of FVIII according to the present invention can be packaged in advance and supplied as a kit.
  • the kit of the present invention includes, in addition to buffers, plasma samples isolated from humans with normal FVIII and FIX activities in blood, substances having an FVIII alternative activity, those usable for FVIII activity measurement, FVIII inhibitor potency What can be used for the valence measurement can be included.
  • the various reagents contained in the kit can be in the form of powder or liquid depending on the mode of use. Moreover, these can be stored in a suitable container and can be used timely.
  • the severity of a patient who has been administered a substance having a function-substituting activity of FVIII can be diagnosed.
  • FVIII reactivity can be measured, and based on the measurement results, the patient's severity and / or inhibitor titer can be diagnosed and determined. Diagnosis / judgment methods can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • the method of the present invention can be used to monitor, for example, the pharmacological activity of an FVIII preparation in a patient administered with a substance having an FVIII function-substituting activity and an FVIII preparation. Monitoring can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • the kit of the present invention can be used, for example, as a kit for diagnosing the severity of a patient who has been administered a substance having a function-substituting activity of FVIII.
  • the reactivity of FVIII is measured using the kit of the present invention, and the severity of the patient can be diagnosed and determined based on the measurement result. Diagnosis / judgment methods can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • the kit of the present invention can be used, for example, as a kit for monitoring the pharmacological activity of an FVIII preparation in a patient administered with a substance having an FVIII function-substituting activity and an FVIII preparation. Monitoring can be performed by methods known to those skilled in the art.
  • a method of treating a patient (a) administering a first dose of a substance having a function-substituting activity of FVIII; (b) monitoring the patient's FVIII reactivity; (c) determining a second dose of the substance having FVIII function-substituting activity based on the observed FVIII reactivity; and (d) a step of administering a second dose of a substance having a function-substituting activity of FVIII to the patient; Can be used.
  • a method of treating a patient (a) administering a substance having a function-substituting activity of FVIII at a first administration interval; (b) monitoring the patient's FVIII reactivity; (c) determining a second dosing interval for a substance having FVIII function alternative activity based on the observed FVIII reactivity; and (d) administering to the patient a substance having a function-substituting activity of FVIII at a second administration interval; Can be used.
  • a method for treating a patient wherein FVIII reactivity is monitored, and the dose or / and the administration interval of a substance having a function-substituting activity of coagulation factor VIII is changed according to FVIII reactivity
  • a method of treating a patient can be used.
  • the substance having a function-substituting activity of FVIII is preferably FIX and / or FIXa and bispecific antibody that binds to FX and / or FXa. More preferably, it is an antibody described below, which is a bispecific antibody in which the first polypeptide and the third polypeptide are associated, and the second polypeptide and the fourth polypeptide are associated.
  • the first polypeptide is an H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9
  • the second polypeptide is the H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, and the third polypeptide and the fourth polypeptide.
  • a bispecific antibody (Q499-z121 / J327-z119 / L404-k) consisting of a common L chain described in SEQ ID NO: 10 or a first polypeptide derived from the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 36 H chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37, and a second polypeptide consisting of the common L chain described in SEQ ID NO: 38.
  • Specific antibody (Q153-G4k / J142-G4h / L180-k)
  • the dose is 0.001 to 100 mg / kg.
  • They are 50 mg / kg, about 60 mg / kg, about 70 mg / kg, about 80 mg / kg, about 90 mg / kg, and about 100 mg / kg.
  • the dose may be the same or different before and after monitoring.
  • the administration interval is at least one day. Preferably, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 5 weeks, 6 weeks, 7 weeks, 8 weeks, 9 weeks, 10 weeks 11 weeks, 12 weeks, 13 weeks, 14 weeks, 15 weeks, 16 weeks, 17 weeks, 18 weeks, 19 weeks, 20 weeks, 21 weeks, 22 weeks, 23 weeks, 24 weeks, 25 weeks, 1 month, 2 Months, 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, 1 year.
  • the administration interval may be the same before and after monitoring, or may be different.
  • Patients subject to the method or kit of the present invention include, for example, hemophilia A, acquired hemophilia A, von Willebrand disease, and hemophilia A in which inhibitors against FVIII and / or FVIIIa have appeared. I am a patient.
  • mice and rats were immunized with anti-FIXa-F (ab ′) 2 or anti-FX-F (ab ′) 2.
  • Cells obtained from spleen or rat lymph nodes isolated from mice or rats were fused with mouse myeloma cells according to a conventional method to prepare hybridomas.
  • Hybridoma culture supernatant is evaluated by ELISA to detect binding of ACE910 to anti-FIXa-arm or anti-FX-arm, and finally binds only to anti-FIXa-arm of ACE910 and binds to anti-FX-arm
  • Rat antibodies AJ540, AJ114, AJ521, AJ522, and AJ541 that bind only to the anti-FX-arm of mouse antibody AQ8, AQ1, rat antibody AQ512, and ACE910 but not to anti-FIXa-arm were selected. Furthermore, the base sequence of the variable region of AQ8 antibody or AJ540 antibody was analyzed. The base sequence of the variable region of AQ8 and AJ540 and the amino acid sequence predicted therefrom were analyzed by GENETYX Ver. 9 (GENETYX CORPORATION).
  • Recombinant mouse antibody AQ8 is a constant region of mouse IgG2b known in the variable region sequence of AQ8 antibody obtained in Example 1.
  • the full length of the antibody gene was prepared by combining the sequences (heavy chain: EMBL accession No. J00461, light chain: EMBL accession No. V00807) and inserted into an expression vector.
  • recombinant rat-rabbit chimeric antibody AJ540 was prepared by combining a known rabbit IgG (heavy chain: EMBL accession No. L29172, light chain: EMBL accession No.
  • the prepared expression clone plasmid was introduced into HEK293 cells and purified by mass culture and protein A and gel filtration to prepare recombinant mouse antibody AQ8 (rAQ8-mIgG2b) and recombinant rat-rabbit chimeric antibody AJ540 (rAJ540-rbtIgG). .
  • Example 3 Implementation of one-stage clotting assay under neutralization of anti-FIXa / FX bispecific antibody using rAQ8-mIgG2b and rAJ540-rbtIgG 10 or 100 U / dL of recombinant FVIII (coordinate FS, Bayer Anti-FIXa / FX bispecific antibody ACE910 was added to FVIII-deficient plasma (George King) containing Yakuhin Co., Ltd. at 0 or 300 ⁇ g / mL.
  • each prepared plasma was diluted 10-fold with imidazole buffer (Kyowa Medex), and two groups were diluted 10-fold with imidazole buffer to which rAQ8-mIgG2b and rAJ540-rbtIgG were added to 300 ⁇ g / mL, respectively.
  • the sample solution for measurement was prepared by dividing into groups.
  • rAQ8-mIgG2b and rAJ540-rbtIgG were added in amounts necessary to sufficiently neutralize ACE910. Details of the combination are shown below.
  • solutions were prepared by diluting Coagtrol N (Sysmex), which is standard plasma, 10, 20, 40, 80, 160 times with imidazole buffer (solution for calibration curves)
  • the respective FVIII activities were 93, 46.5, 23.3, 11.6, and 5.81%).
  • a sample solution for measurement or a calibration curve solution (50 ⁇ L), factor VIII-deficient human plasma (Sysmex) (50 ⁇ L), and thrombocheck APTT-SLA (Sysmex) (50 ⁇ L) were mixed and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • Example 4 Implementation of one-stage clotting assay under neutralization of anti-FIXa / FX bispecific antibody with AQ1 and AJ541 or AQ1 and AJ522 10 U / dL recombinant FVIII (Coordinate FS, Bayer Yakuhin Co., Ltd.)
  • the anti-FIXa / FX bispecific antibody ACE910 was added to FVIII-deficient plasma (George King) containing 0) or 10 ⁇ g / mL.
  • each prepared plasma was diluted 10-fold with imidazole buffer (Kyowa Medex), and AQ1 and AJ522 were respectively diluted 10-fold with imidazole buffer to which AQ1 and AJ541 were added at 100 ⁇ g / mL, respectively.
  • the sample solution for measurement was prepared by dividing into three groups of 10-fold dilution with imidazole buffer added to 100 ⁇ g / mL.
  • AQ1, AJ541, and AJ522 were added in an amount necessary to sufficiently neutralize ACE910. Details of the combination are shown below.
  • a solution was prepared by diluting Coagtrol N (Sysmex), which is standard plasma, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 times with imidazole buffer ( The FVIII activity of each of the calibration curve solutions was 102, 51.0, 25.5, 12.8, 6.38, 3.19, 1.59%).
  • Sample solution for measurement or calibration curve solution, 50 ⁇ L of factor VIII-deficient human plasma (Sysmex), and 50 ⁇ L of thrombocheck APTT-SLA (Sysmex) were mixed and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • a buffer containing two antibodies AQ1 and AJ541 against anti-FIXa / FX bispecific antibody against FVIII-deficient plasma containing 10 U / dL recombinant FVIII supplemented with anti-FIXa / FX bispecific antibody ACE910 When diluted with (# 5) or with a buffer containing two antibodies AQ1 and AJ522 against anti-FIXa / FX bispecific antibody (# 6), no anti-FIXa / FX bispecific antibody added group FVIII activity similar to (# 1) was exhibited.
  • Example 5 Implementation of one-stage clotting assay under neutralization of anti-FIXa / FX bispecific antibody with AQ512 and AJ114 or AQ512 and AJ521 10 U / dL recombinant FVIII (Coordinate FS, Bayer Yakuhin Co., Ltd.)
  • the anti-FIXa / FX bispecific antibody hBS23 was added to FVIII-deficient plasma (George King) containing 0) or 10 ⁇ g / mL.
  • each prepared plasma was diluted 10-fold with imidazole buffer (Kyowa Medex), and AQ512 and AJ521 were respectively diluted 10-fold with imidazole buffer added with AQ512 and AJ114 to 100 ⁇ g / mL.
  • the sample solution for measurement was prepared by dividing into three groups of 10-fold dilution with imidazole buffer added to 100 ⁇ g / mL.
  • AQ512, AJ114, and AJ521 were added in an amount necessary to sufficiently neutralize hBS23. Details of the combination are shown below.
  • a solution was prepared by diluting Coagtrol N (Sysmex), which is standard plasma, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 times with imidazole buffer ( The FVIII activity of each of the calibration curve solutions was 102, 51.0, 25.5, 12.8, 6.38, 3.19, 1.59%).
  • Sample solution for measurement or calibration curve solution, 50 ⁇ L of factor VIII-deficient human plasma (Sysmex), and 50 ⁇ L of thrombocheck APTT-SLA (Sysmex) were mixed and incubated at 37 ° C. for 5 minutes.
  • RAQ8-mIgG2b and rAJ540-rbtIgG were not added to the standard plasma Coagtrol N (Sysmex) or 300 ⁇ g / mL, respectively.
  • Two types of each prepared plasma were mixed in equal amounts in the following combinations (total of 8 types) and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
  • the mixed solution was further diluted 10 times with BSA-imidazole to prepare a sample solution for measurement. Further, for the preparation of a calibration curve for converting the coagulation time into the FVIII activity value, a solution in which Coagtrol N was diluted 20, 40, 80, 160, 320 times with BSA-imidazole was prepared (each FVIII of the calibration curve solution). The activity was 100, 50, 25, 12.5, 6.25%).
  • the clotting time of the measurement sample was converted to FVIII activity. Further, after calculating the Bethesda value in the measurement sample as 1 Bethesda when the residual FVIII activity was 50%, the average value of the values multiplied by 25 and 30 was calculated as the inhibitor titer in each sample stock solution.
  • the results are shown in FIG.
  • the FVIII inhibitor plasma (# 3) containing only the anti-FIXa / FX bispecific antibody showed an activity of 100% or more of FVIII on the standard curve, so the FVIII inhibitor titer could not be measured.
  • FVIII inhibitor plasma (# 4) containing two antibodies against anti-FIXa / FX bispecific antibody and anti-FIXa / FX bispecific antibody has the same FVIII as that of additive-free inhibitor plasma (# 1). Inhibitor titers were shown.
  • Inhibitor titers were shown.
  • FVIII inhibitor plasma (# 2) containing only antibodies against two anti-FIXa / FX bispecific antibodies showed the same results as # 1, indicating that it was against anti-FIXa / FX bispecific antibodies.
  • the antibody was found to have a specific neutralizing action against the bispecific antibody.
  • the present invention provides a method for measuring the reactivity of FVIII in the presence of a bispecific antibody having FVIII function-substituting activity, for example, a method for measuring FVIII activity and FVIII inhibitor titer.
  • FVIII reactivity of a patient can be accurately measured in the treatment of hemorrhagic diseases such as hemophilia with the bispecific antibody.

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Abstract

FVIII機能代替活性を有する二重特異性抗体の活性を中和する物質を作製し、本二重特異性抗体存在下でも正確性が保たれるFVIIIの反応性を測定する方法の構築を試みた。その結果、APTTをベースとしたone-stage clotting assayにて、血友病A患者血漿中のFVIII活性を正確に評価できることを見出し、さらにAPTTをベースとしたBethesda assayにて、FVIIIインヒビター保有血友病A患者血漿中のFVIIIインヒビター力価を正確に評価できることも見出した。

Description

ＦＶＩＩＩの反応性を測定する方法
　本発明は、凝固第VIII因子(FVIII)機能代替活性を有する物質存在下において、FVIIIの反応性を測定する方法（例えば、FVIII活性、FVIIIインヒビター力価を測定する方法）に関する。また本発明はFVIII機能代替活性を有する物質存在下において、FVIIIの反応性を測定するためのキット等に関する。
　血友病は、FVIIIまたは凝固第IX因子（FIX）の先天的欠損又は機能不全に起因する出血性疾患である。前者は血友病A、後者は血友病Bと称される。いずれの遺伝子もX染色体上に存在し、遺伝子異常はX染色体連鎖劣性遺伝形式をとるため、発症患者の99%以上は男性である。有病率はおおよそ出生男子1万人につき1人で、血友病Aと血友病Bの比率は、おおよそ5:1であることが知られる。
　血友病患者における主な出血部位としては、関節内、筋肉内、皮下、口腔内、頭蓋内、消化管、鼻腔内などが挙げられる。中でも関節内への繰返し出血は、関節障害、歩行困難を伴う血友病性関節症に進展し、最終的には関節置換術が必要となる場合もある。そのため、血友病患者のQOLを低下させる大きな要因となっている。
　血友病の重症度は、血液中のFVIII活性あるいはFIX活性とよく相関している。凝固因子活性1%未満の患者が重症、活性1%以上5%未満の患者が中等症、活性5%以上40%未満の患者が軽症と分類される。血友病患者の約半数を占める重症患者においては、後述する予防的補充療法なしでは月に数回の出血症状を呈するが、これは中等症患者及び軽症患者に比べ顕著に高頻度である。
　関連する出血異常症として、血友病、後天性血友病のほかに、フォンビルブランド因子（vWF）の機能異常または欠損に起因するフォンビルブランド病が知られている。vWFは、血小板が、血管壁の損傷部位の内皮下組織に正常に粘着するのに必要であるだけでなく、FVIIIと複合体を形成し、血液中のFVIIIレベルを正常に保つのにも必要である。フォンビルブランド病患者では、これらの機能が低下し、止血機能異常を来たしている。
　血友病患者における出血の予防及び/又は治療には、主として、血漿から精製された若しくは遺伝子組換え技術により作製された血液凝固因子が使用される。重症血友病患者においては、FVIIIあるいはFIXの補充療法により、血液中のFVIII活性あるいはFIX活性を1%以上に維持することが、出血症状の発現阻止に有効と考えられている（非特許文献１，２）。一方、血友病患者、特に重症血友病患者には、インヒビターと呼ばれるFVIIIあるいはFIXに対する抗体が発生する場合がある。インヒビターが発生すると、凝固因子製剤の効果がインヒビターにより妨げられる。その結果、大量の凝固因子製剤を用いる中和療法か、複合体製剤（complex concentrate）あるいは活性化凝固第VII因子製剤（FVIIa製剤）を用いるバイパス療法が実施される。
　血友病AにおけるFVIII活性測定は、主に活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）をベースとしたone-stage clotting assay（非特許文献３）及び精製凝固因子を用いた再構築系であるchromogenic assay（非特許文献４）によって実施される。
　血友病AにおけるFVIIIインヒビターの力価測定は、主にBethesda assayまたはNijmegen Bethesda assayによって実施される（非特許文献５、６）。
　近年、FIXおよび／または活性化凝固第IX因子（FIXa）ならびに凝固第X因子（FX）および/または活性化血液凝固第X因子(FXa)の双方に結合し、FVIIIの補因子機能、すなわちFIXaによるFX活性化を促進する機能を代替する二重特異性抗体が見出された（非特許文献７、８、特許文献１、２、３)。本二重特異性抗体はFVIIIの機能を代替することで、FVIII欠損及び機能異常による凝固反応の低下を改善する。例えば、凝固反応の指標であるAPTT、トロンビン生成に関して、本二重特異性抗体は、FVIIIインヒビターの存在に関わらず血友病A患者由来血漿のAPTTを短縮させ、トロンビン生成を増大させる。本二重特異性抗体のAPTT短縮作用は、FVIIIに比し顕著である。それは、血漿中のFVIIIはトロンビンや活性化第X因子(FXa)により活性化されて初めて補因子活性を呈するのに対し、本二重特異性抗体はそのような活性化過程は必要でなく、その分早く補因子機能を発揮するからである。
　また、本二重特異性抗体のFIXa Faｂに対する抗体、FX Fabに対する抗体が取得され、動物実験の血漿サンプル中の本二重特異性抗体の濃度測定が行われた（非特許文献９)
　二重特異性抗体はFVIIIの補因子機能を代替することから、FVIII自体の反応性を測定するアッセイ系に影響する。例えば、血友病Aの重症度を診断するために、またはFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングするために、APTTをベースとしたone-stage clotting assayにて血漿FVIII活性を測定する場合、本二重特異性抗体存在下では、その凝固時間短縮促進作用が強く干渉するため、正確性が大きく損なわれる。また、APTTをベースとしたBethesda assayにて、血漿FVIIIインヒビター力価を測定する場合、本二重特異性抗体存在下では、その凝固時間短縮促進作用が強く干渉するため、正確性が大きく損なわれる。すなわち、本二重特異性抗体を投与した患者では、FVIII活性、FVIIIインヒビター力価を正確に測定することができない。そのため本二重特異性抗体存在下においても、FVIII活性及びFVIIIインヒビター力価を測定できる方法が望まれていた。
N Engl J Med. 2007;357(6):535-44 Thromb Res. 2011;127　(suppl1):S14-7 Thromb Diath Haemorrh. 1962 May 15;7:215-28 Haemostasis. 1989 19:196-204. Thromb Diath Haemorrh. 1975;34(3):869-72 Thromb Haemost. 1995 Feb;73(2):247-51. Nat Med. 2012; 18(10):1570-74 PLoS One. 2013; 8(2):e57479. J Thromb Haemost. 2014; 12(2):206-13 Supporting Information
WO2005/035756 WO2006/109592 WO2012/067176
　本願発明は、FVIII機能代替活性を有する物質存在下において、FVIIIの反応性を測定する方法、例えばFVIII活性、FVIIIインヒビター力価を測定する方法に関する。また本発明はFVIII機能代替活性を有する物質存在下において、FVIIIの反応性、例えばFVIII活性及びFVIIIインヒビター力価、を測定するためのキット等を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく、FVIIIの反応性を測定する検査項目を対象に、本二重特異性抗体の活性を中和する物質を作製し、本二重特異性抗体存在下でも正確性が保たれる測定条件を探索した。その結果本発明者らは、二重特異性抗体に対する中和抗体を適切な濃度（例えば、二重特異性抗体を十分に中和できる濃度）で使用することで、APTTをベースとしたone-stage clotting assayにて、血友病A患者血漿中のFVIII活性を正確に評価できることを見出し、さらにAPTTをベースとしたBethesda assayにて、FVIIIインヒビター保有血友病A患者血漿中のFVIIIインヒビター力価を正確に評価できることも見出した。また本発明者らは、本測定に用いられる、FVIII代替活性を有する二重特異性抗体に対する中和抗体を含むキットを見出すことに成功した。本発明はこのような知見に基づくものであり、以下を提供するものである。
〔１〕凝固第VIII因子の反応性を測定する方法であって、以下の（１）と（２）を接触させる工程を含む方法。
 （１）凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を含む血液由来サンプル
 （２）凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を中和する一以上の物質
〔２〕凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質が、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子ならびに凝固第X因子および/または活性化血液凝固第X因子に結合する二重特異性抗体である〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記二重特異性抗体が以下に記載のいずれかの抗体であって、第一のポリペプチドと第三のポリペプチドが会合し、第二のポリペプチドと第四のポリペプチドが会合する二重特異性抗体である〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
　第一のポリペプチドが配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号：１０に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体（Q499-z121/J327-z119/L404-k）。
　第一のポリペプチドが配列番号：３６に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号：３７に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号：３８に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体（Q153-G4k/J142-G4h/L180-k）。
〔４〕前記中和する物質が、前記凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を中和するペプチド、ポリペプチド、有機化合物、アプタマー、および抗体からなる群から選ばれる１以上の物質である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕前記中和する物質が、凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、及び、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabならびに凝固第X因子および/または活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる１以上の抗体である、〔２〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記中和する物質が、以下の抗体の組み合わせからなる群から選ばれる１以上の組み合わせである、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
 (a) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
 (b) 活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
 (c) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
 (d) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及び活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
〔７〕凝固第VIII因子の反応性を測定する方法が、凝固第VIII因子活性を測定する方法又は凝固第VIII因子インヒビター力価を測定する方法である、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、及び、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabならびに凝固第X因子および/または活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる１以上の抗体を含む、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
〔９〕以下の抗体の組み合わせからなる群から選ばれる１以上の組み合わせを含む、〔８〕に記載のキット。
 (a) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
 (b) 活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
 (c) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
 (d) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及び活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
〔１０〕〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断する方法。
〔１１〕〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者のインヒビター力価を診断する方法。
〔１２〕〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングする方法。
〔１３〕前記患者が血友病A患者、後天性血友病A患者、フォンビルブランド病患者、ならびに血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している血友病A患者からなる群より選択される患者である、〔１０〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕〔８〕又は〔９〕に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断するためのキット。
〔１５〕〔８〕又は〔９〕に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者のインヒビター力価を診断するためのキット。
〔１６〕〔８〕又は〔９〕に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングするためのキット。
〔１７〕前記患者が血友病A患者、後天性血友病A患者、フォンビルブランド病患者、ならびに血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している血友病A患者からなる群より選択される患者である、〔１４〕～〔１６〕のいずれかに記載のキット。
　本発明により、FVIII代替活性を有する物質の活性の影響を受けずに、FVIII活性及びFVIIIインヒビター力価を測定することが可能な方法が提供された。FVIII代替活性を有する物質としては、FIXおよび/またはFIXaならびにFXおよび/またはFXaに結合する二重特異性抗体が挙げられる。
rAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGを用いた抗FIXa/FX二重特異性抗体中和下でのone-stage clotting assayの結果を示す図である。抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を添加した10又は100 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿をバッファーで希釈した場合 (#3、#7)、検量線の範囲以上のFVIII活性を示した。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を添加した10又は100 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体を含むバッファーで希釈した場合（#4、#8）、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1、#5）と同様のFVIII活性を示した。10又は100 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体のみを含むバッファーで希釈した場合(#2、#6)、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1、#5）と同様のFVIII活性を示した。 AQ1とAJ541、又はAQ1とAJ522による抗FIXa/FX二重特異性抗体中和下でのone-stage clotting assayの結果を示す図である。抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿をバッファーで希釈した場合 (#4)、検量線の範囲以上のFVIII活性を示した。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ1とAJ541を含むバッファーで希釈した場合（#5）又は抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ1とAJ522を含むバッファーで希釈した場合（#6）、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1）と同様のFVIII活性を示した。10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ1とAJ541のみを含むバッファーで希釈した場合(#2)又は2種類の抗体AQ1とAJ522のみを含むバッファーで希釈した場合(#3)、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1）と同様のFVIII活性を示した。 AQ512とAJ114、又はAQ512とAJ521による抗FIXa/FX二重特異性抗体中和下でのone-stage clotting assayの結果を示す図である。抗FIXa/FX二重特異性抗体hBS23を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿をバッファーで希釈した場合 (#4)、検量線の範囲以上のFVIII活性を示した。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体hBS23を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ512とAJ114を含むバッファーで希釈した場合（#5）又は抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ512とAJ521を含むバッファーで希釈した場合（#6）、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1）と同様のFVIII活性を示した。10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ512とAJ114のみを含むバッファーで希釈した場合(#2)又は2種類の抗体AQ512とAJ521のみを含むバッファーで希釈した場合(#3)、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1）と同様のFVIII活性を示した。 rAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGを用いた抗FIXa/FX二重特異性抗体中和下でのベセスダ法の結果を示す図である。抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910のみを含むFVIIIインヒビター血漿(#3)では、検量線のFVIII 100%以上の活性を示した。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体及び抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体を含むFVIIIインヒビター血漿(#4)では、無添加のインヒビター血漿(#1)と同様のFVIIIインヒビター力価を示した。2種類の抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体のみを含むFVIIIインヒビター血漿(#2)は、#1と同様の結果を示した。
　本発明のFVIIIの活性を測定する方法は、以下の（１）と（２）を接触させる工程を含む。その余は、一般的に用いられているFVIII活性測定方法に従って行うことができる。具体的には実施例においても説明する。
（１）FVIIIの機能代替活性を有する物質を含む血液由来サンプル
（２）FVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質
FVIII活性測定法
　一般的に用いられているFVIII活性測定方法としては、当業者に公知の方法を用いることができるが、例えば凝固時間（ａＰＴＴ測定）を基本とした、第VIII因子欠乏血漿（Sysmex, Kobe, Japan）を使用したone-stage clotting assay（Casillas et al., (1971) Coagulation 4: 107-11）を用いることができる。one-stage clotting assayは、例えば、以下の方法で実施される。10倍希釈した被験血漿 50 μL、FVIII欠乏血漿 50 μL、及びAPTT試薬 50 μLの3溶液を混合し、37℃、5分間インキュベーション後、カルシウム溶液 50 μLを添加することにより凝固反応を開始させ、凝固するまでの時間を測定する。また、被験血漿の代わりに、正常血漿希釈系列サンプル（10倍希釈した正常血漿中に含まれるFVIII活性を100%とする）を測定し、横軸にFVIII活性、縦軸に凝固時間をプロットした検量線を作成する。検量線から、被験血漿の凝固時間をFVIII活性に換算し、被験血漿中のFVIII活性を算出する。尚、本明細書においては、「FVIII活性の測定」は特に断らない限り、「活性化凝固第VIII因子（FVIIIa）の活性の測定」を含み得るものとして使われる。
　FVIII活性を測定する方法としては、one-stage clotting assay以外にも、トロンビン生成試験（ＴＧＡ）、回転トロンボエラストメトリーを用いた測定法、FVIII chromogenic assay、凝固波形解析，トロンビンおよび活性型第X因子生成試験などを用いることができる。本発明のFVIIIインヒビターの力価を測定する方法は、以下の（１）と（２）を接触させる工程を含む。その余は、一般的に用いられているFVIIIインヒビター力価測定方法に従って行うことができる。具体的には実施例においても説明する。
（１）FVIIIの機能代替活性を有する物質を含む血液由来サンプル
（２）FVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質
FVIIIインヒビター力価測定法
　一般的に用いられているFVIIIインヒビター力価測定方法としては、当業者に公知の方法を用いることができるが、例えばBethesda assay（Kasper et al., (1975) Thrombos Diath Haemorrh 34:869-872）、ＥＬＩＳＡ法、Nijmegen Bethesda assay（Nijmegen modification assay）（Verbruggen et al., (1995) Thromb Haemost 73:247-251）を用いることができる。Bethesda assayは、例えば以下の方法で実施される。正常血漿と被験血漿を等量混合した溶液を37℃、2時間インキュベーション後、正常血漿中の残存第VIII因子活性を、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）をベースとしたone-stage clotting assayにて測定する。正常血漿中の第VIII因子活性の50%を阻害する作用を1ベセスダ(1BU)と規定されており、そのためFVIIIインヒビターの力価はベセスダの単位で算出する。なお、被験血漿中に含まれるFVIIIインヒビター力価が高く、残存第FVIII活性が25 - 75%の範囲に収まらない場合は、緩衝液で適当に希釈した被験血漿を用いて、再度ベセスダ単位を算出した後、希釈倍率を乗じて被験血漿中のFVIIIインヒビター力価を算出する。
FVIII
　FVIIIは血液凝固に関与する一連の分子の１つであり、トロンビンやFXaにより活性化を受けると補因子活性を呈し、FIXaによるFX活性化反応を促進する。
FVIIIインヒビター
　FVIIIインヒビターは、20～30%の血友病A患者において生じる、外来性のFVIIIに対する同種抗体である。また、元は正常であった個体においても、後天的にFVIIIに対して自己抗体を生じ得る。一般に、FVIIIインヒビター同種抗体及び自己抗体の大部分は抗FVIII中和抗体として機能し、FVIII活性を減少させるか、又は消滅させる。
FVIII代替活性
　本発明のFVIII機能代替活性を有する物質は、FVIII様活性を有する物質と言い換えることもできる。本発明において「FVIIIの機能を代替する」とは、FIXaによるFXの活性化を促進する（FIXaによるFXa産生を促進する）ことを意味する。また、より具体的には、本発明において「FVIIIの機能を代替する」とは、FIXおよび/またはFIXaならびにFXおよび/またはFXaを認識し、FIXaによるFXの活性化を促進する（FIXaによるFXa産生を促進する）ことを意味する。FXa産生促進活性は、例えば、FIXa、FX、合成基質S-2222（FXaの合成基質）、リン脂質から成る測定系で評価することができる。このような測定系は、血友病A症例における疾患の重症度および臨床症状と相関性を示す(Rosen S, Andersson M, Blomba¨ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23)。
　本発明に記載のFVIIIの機能を代替する活性を有する物質の好ましい態様として、FIXおよび/またはFIXaならびにFXおよび/またはFXaに結合する二重特異性抗体を例示することができる。このような抗体は、例えばWO2005/035756、WO2006/109592、WO2012/067176などに記載の方法に従って取得することができる。本発明の二重特異性抗体にはこれらの文献に記載の抗体が含まれる。
　好ましい二重特異性抗体として、特許文献（WO 2012/067176）に記載の二重特異性抗体であるACE910 （Q499-z121/J327-z119/L404-k）（配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：１０に記載のL鎖が会合し、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：１０に記載のL鎖が会合している二重特異性抗体）、 hBS23 （Q153-G4k/J142-G4h/L180-k）（配列番号：３６に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３８に記載のL鎖が会合し、配列番号：３７に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：３８に記載のL鎖が会合している二重特異性抗体）を挙げることができる。
中和
　本発明におけるFVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質における「中和」とは例えばFVIII機能代替活性を有する物質のFVIII機能代替活性を全部または一部阻害することをいう。FVIII機能代替活性のを全部または一部の阻害は、例えばFVIIIの機能代替活性を有する物質が抗体の場合、抗体の抗原への結合を全部または一部阻害することによって実現しうるが、これに限定されるものではない。
中和する物質
　本発明におけるFVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質における中和する物質の「物質」とは、例えば、FVIIIの機能代替活性を有する物質に結合するペプチド、ポリペプチド、有機化合物、アプタマー、抗体などを言う。
　中和する物質は複数組み合わせて使用することができ、例えば抗体とアプタマーを組み合わせて使用することができる。
ポリペプチド
　本発明におけるポリペプチドとは、通常、１０アミノ酸程度以上の長さを有するペプチド、およびタンパク質を指す。また、通常、生物由来のポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに含まれる。
有機化合物
　本発明における有機化合物は、例えば低分子化合物であり、好ましくは分子量が１０００以下である。
アプタマー
　「アプタマー」は、ポリペプチドなどの標的分子に特異的に結合する核酸分子を指す。例えば、本発明のアプタマーは、FVIII代替活性を有する物質に特異的に結合することができるＲＮＡアプタマーであることができる。アプタマーの生成および治療的使用は当分野において十分に確立されている。例えば、アプタマーはSELEX法（米国特許第5475096号、同5580737号、同5567588号、同5707796号、同5763177号、同6699843号などを参照）を用いることで取得可能である。
抗体
　FVIIIの機能代替活性を有する物質に結合する抗体としては、例えばFVIIIの機能代替活性を有する物質がFIXおよび/またはFIXaならびにFXおよび/またはFXaに結合する二重特異性抗体の場合、FIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、FIXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、FXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、FXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、FIXおよび/またはFIXaに結合する抗原結合部位を含むFabならびにFXおよび/またはFXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる抗体を挙げることができる。上記抗体を単独で使用することができ、また複数組み合わせて使用することができる。例えば、1種類の抗原に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体を複数、例えばFIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体を複数種類、使用することもできる。FVIIIの機能代替活性を有する物質がFIXおよび/またはFIXaならびにFXおよび/またはFXaに結合する二重特異性抗体の場合、例えば以下の組み合わせで使用することができる。
(a) FIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体とFXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(b) FIXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体とFXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(c) FIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体とFIXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
(d) FIXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と、FXに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及びFIXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
　FIXおよび/又はFIXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体としては、例えばAQ8、AQ1、AQ512抗体を挙げることができる。可変領域の塩基配列とそれから予測されるアミノ酸配列は、GENETYX Ver.9 (GENETYX CORPORATION)にて解析した。
AQ8のH鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
アミノ酸配列：配列番号：１
核酸配列：配列番号：５
AQ8のL鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
アミノ酸配列：配列番号：２
核酸配列：配列番号：６
AQ8のH鎖CDR１～３のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
CDR１アミノ酸配列：配列番号：１２
CDR２アミノ酸配列：配列番号：１３
CDR３アミノ酸配列：配列番号：１４
CDR１核酸配列：配列番号：１５
CDR２核酸配列：配列番号：１６
CDR３核酸配列：配列番号：１７
AQ8のL鎖CDR１～３のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
CDR１アミノ酸配列：配列番号：１８
CDR２アミノ酸配列：配列番号：１９
CDR３アミノ酸配列：配列番号：２０
CDR１核酸配列：配列番号：２１
CDR２核酸配列：配列番号：２２
CDR３核酸配列：配列番号：２３
　FXおよび/又はFXaに結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体としては、例えばAJ540、AJ541、AJ522、AJ114、AJ521抗体を挙げることができる。可変領域の塩基配列とそれから予測されるアミノ酸配列は、GENETYX Ver.9 (GENETYX CORPORATION)にて解析した。
AJ540のH鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
アミノ酸配列：配列番号：３
核酸配列：配列番号：７
AJ540のL鎖可変領域のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
アミノ酸配列：配列番号：４
核酸配列：配列番号：８
AJ540のH鎖CDR１～３のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
CDR１アミノ酸配列：配列番号：２４
CDR２アミノ酸配列：配列番号：２５
CDR３アミノ酸配列：配列番号：２６
CDR１核酸配列：配列番号：２７
CDR２核酸配列：配列番号：２８
CDR３核酸配列：配列番号：２９
AJ540のL鎖CDR１～３のアミノ酸配列及び核酸配列は以下の配列番号で示される。
CDR１アミノ酸配列：配列番号：３０
CDR２アミノ酸配列：配列番号：３１
CDR３アミノ酸配列：配列番号：３２
CDR１核酸配列：配列番号：３３
CDR２核酸配列：配列番号：３４
CDR３核酸配列：配列番号：３５
　「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体誘導体及び抗体修飾物であってもよい（Miller K et al. J Immunol. 2003, 170(9), 4854-61）。抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体であってもよく、または他の種由来であっても、人工的に合成したものであってもよい。本明細書中に開示される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgDおよびIgA）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2）またはサブクラスであり得る。免疫グロブリンは、任意の種（例えば、ヒト、マウスまたはウサギ）由来であり得る。尚、「抗体」、「免疫グロブリン」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われる。
　「抗体誘導体」とは抗体の一部、好ましくは抗体の可変領域、または少なくとも抗体の抗原結合領域を含む。抗体誘導体には、例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv断片、線状抗体、一本鎖抗体（scFv）、sc(Fv)2、Fab3、ドメイン抗体 （dAb）（国際公開第2004/058821号、国際公開第2003/002609号）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ及び抗体誘導体から形成される多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ここで、「Fab」は一本の軽鎖、ならびに一本の重鎖のCH1領域および可変領域から構成される。また、「Fv」は最小の抗体誘導体であり、完全な抗原認識領域と抗原結合領域を含む。また抗体誘導体は例えばIgG抗体のFcとの融合体であってもよい。例えば、米国特許第5641870号明細書、実施例2；Zapata G et al. Protein Eng.1995, 8(10), 1057-1062 ; Olafsen T et al. Protein Eng. Design & Sel. 2004, 17(4):315-323 ; Holliger P et al. Nat. Biotechnol. 2005, 23(9);1126-36；Fischer N et al. Pathobiology. 2007, 74(1):3-14 ; Shen J et al. J Immunol Methods. 2007, 318, 65-74 ; Wu et al. Nat Biotechnol. 2007, 25(11), 1290-7を参照できる。
　抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体には、これらの抗体修飾物も包含される。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
　「二重特異性」抗体は、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいう。二重特異性抗体は2つ以上の異なる抗原を認識する抗体であってもよいし、同一抗原上の異なる2つ以上のエピトープを認識する抗体であってもよい。二重特異性抗体には、wholeの抗体だけでなく抗体誘導体が含まれていてもよい。本発明の抗体には、二重特異性抗体も含まれる。なお、本明細書において、抗FIXa/FX二重特異性抗体は、FIXa及びFXに結合する二重特異性抗体と同義で用いられる。
遺伝子組換え抗体の作成方法
　抗体としては、遺伝子組換え技術を用いて産生した組換え型抗体を用いることができる。組換え型抗体は、それをコードするDNAをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、ベクターに組み込んで、これを宿主（宿主細胞）に導入し産生させることにより得ることができる。
　抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、その由来は限定されない。またキメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子改変抗体でもよい。
　ヒト抗体の取得方法は既に知られており、例えば、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。
　遺伝子改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たとえばキメラ抗体は、免疫動物の抗体のH鎖、およびL鎖の可変領域と、ヒト抗体のH鎖およびL鎖の定常領域からなる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコードするDNAを、ヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。
　ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のCDRを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 239400、国際特許出願公開番号WO 96/02576、Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851-856、国際特許出願公開番号WO 99/51743参照）。
　二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）は、二種の異なる抗原に対して特異性を有する抗体である。
　二重特異性抗体はIgGタイプのものに限られないが、例えばIgGタイプ二重特異性抗体はIgG抗体を産生するハイブリドーマ二種を融合することによって生じるhybrid hybridoma(quadroma)によって分泌させることが出来る（Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540）。また目的の二種のIgGを構成するL鎖及びH鎖の遺伝子、合計4種の遺伝子を細胞に導入することによって共発現させることによって分泌させることが出来る。
　この際H鎖のCH3領域に適当なアミノ酸置換を施すことによってH鎖についてヘテロな組合せのIgGを優先的に分泌させることも出来る（Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16: 677-681、WO2006/106905、Davis JH et al. Protein Eng Des Sel. 2010, 4: 195-202.）。
　また、L鎖に関しては、H鎖可変領域に比べてL鎖可変領域の多様性が低いことから、両H鎖に結合能を与え得る共通のL鎖が得られることが期待され、本発明の抗体は、共通のL鎖を有する抗体であってもよい。この共通L鎖と両H鎖遺伝子を細胞に導入することによってIgGを発現させることで効率の良い二重特異性IgGの発現が可能となる。
エピトープ
　本発明におけるFVIIIの機能代替活性を有する物質を中和する物質の一実施形態である抗体は、当該抗体が結合するエピトープと重複するエピトープに結合する抗体、より好ましくは同じエピトープに結合する抗体も包含する。
　ある抗体が他の抗体と重複するエピトープ又は同じエピトープを認識するか否かは、両者のエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、競合結合アッセイによって評価することができ、その手段として酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、蛍光エネルギー転移測定法（FRET）や蛍光微量測定技術（FMAT(登録商標)）などが挙げられる。抗原に結合した該抗体の量は、重複するエピトープ又は同一のエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被検抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち、重複するエピトープ又は同一のエピトープに対する被検抗体の量や親和性が大きくなるほど、該抗体の抗原への結合量は低下し、抗原への被検抗体の結合量は増加する。具体的には、抗原に対し、適当な標識をした該抗体と、被検抗体と、を同時に添加し、標識を利用して結合している該抗体を検出する。抗原に結合した該抗体量は、該抗体を予め標識しておくことで、容易に測定できる。この標識は特には制限されないが、手法に応じた標識方法を選択する。標識方法は、具体的には蛍光標識、放射標識、酵素標識などが挙げられる。
　ここでいう「重複するエピトープに結合する抗体」又は「同一のエピトープに結合する抗体」とは、標識該抗体に対して、非標識の該抗体の結合により結合量を50%低下させる濃度（IC50）に対して、被検抗体が非標識該抗体のIC50の通常、100倍、好ましくは80倍、さらに好ましくは50倍、さらに好ましくは30倍、より好ましくは10倍高い濃度で少なくとも50%、標識該抗体の結合量を低下させることができる抗体である。なお、抗体が認識するエピトープの解析は当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えばウェスタンブロッティング法などにより行うことが可能である。
抗体の製造方法
　本発明の抗体は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、目的とする抗体をコードするDNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
　ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などを用いることができる。
　抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（Pharmacia社製）、「QIAexpress system」（QIAGEN社製）、pEGFP、またはpET（この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。
　また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、例えばpelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
　大腸菌発現ベクターの他、本発明の抗体を製造するためのベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovirus expression system」（GIBCO BRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
　CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CAGプロモーター（Gene. (1991) 108, 193）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、形質転換細胞を選抜するための遺伝子を有すればさらに好ましい。形質転換細胞を選抜するための遺伝子としては、例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子がある。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
　さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
　これにより得られた本発明の抗体は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の抗体の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせれば抗体を分離、精製することができる。
　クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、Protein Aカラム、Protein Gカラムが挙げられる。例えば、Protein Aを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose FF（GE Amersham Biosciences）等が挙げられる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製された抗体も包含する。
　得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組合せれば、抗体を分離、精製することができる(Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、Protein Aカラム、Protein Gカラムなどが挙げられる。
サンプル取得方法
　本発明において、血液由来サンプルは好ましくは被験者から採取された血液由来サンプルである。このような血液由来サンプルは、FVIII代替活性を有する物質を投与された被験者から取得することができる。被験者としては、体内のいずれかの部位に出血性の症状を伴う患者（出血性疾患患者）が挙げられる。主な出血部位としては、関節内、筋肉内、皮下、口腔内、頭蓋内、消化管、鼻腔内などが挙げられるがこれらに限定されない。出血性疾患患者としては、好ましくはFVIII及び/又はFVIIIaの活性の低下あるいは欠損が原因の出血性疾患患者が挙げられる。FVIII及び/又はFVIIIaの活性の低下あるいは欠損が原因の出血性疾患患者としては、出血性の症状を有する患者であって、先天的あるいは後天的に、FVIII及びFVIIIaのいずれか一方又は両方の活性が低下または欠損した患者を例示することができる。FVIII、FVIIIaの活性の低下としては、健常者と比較して、これらの活性が好ましくは40％未満（例えば40％未満、30％未満、20％未満、10％未満）、より好ましくは10％未満（例えば10％未満、9％未満、8％未満、7％未満、6％未満）、さらに好ましくは5％未満（例えば5％未満、4％未満、3％未満、2％未満）、特に好ましくは1％未満の患者が挙げられるがこれらに限定されない。
　より具体的には、このような疾患の例として、血友病（血友病A、血友病B）、後天性血友病及び、フォンビルブランド因子（vWF）の機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病から選ばれる疾患が挙げられるがこれらに限定されない。血液由来サンプルには、血清、血漿、または全血が含まれる。本発明においては、血漿サンプルを使用することが好ましい。被験者からの血液由来サンプルの取得方法は当業者に周知である。
キット
　本発明によるFVIIIの反応性を測定する方法に必要なバッファーなど各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキットとして供給することができる。本発明のキットには、バッファーのほか、血液中のFVIII活性やFIX活性が正常なヒトから単離された血漿サンプル、FVIII代替活性を有する物質、FVIII活性測定に使用可能なもの、FVIIIインヒビター力価測定に使用可能なものなどを含むことができる。またキットに含まれる各種の試薬は、その使用態様に応じて粉末状あるいは液状とすることができる。またこれらを適当な容器に収納し、適時に使用することができる。
　本発明の方法を用いて、例えば、FVIIIの機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断することができる。本発明の方法を用いてFVIIIの反応性を測定し、その測定結果に基づき、患者の重症度及び／またはインヒビター力価を診断・判定することができる。診断・判定方法は当業者に公知の方法により行うことができる。
　本発明の方法を用いて、例えば、FVIIIの機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングすることができる。モニタリングは当業者に公知の方法により行うことができる。
　本発明のキットは、例えば、FVIIIの機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断するキットとして用いることができる。本発明のキットを用いてFVIIIの反応性を測定し、その測定結果に基づき、患者の重症度を診断・判定することができる。診断・判定方法は当業者に公知の方法により行うことができる。
　本発明のキットは、例えば、FVIIIの機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングするキットとして用いることができる。モニタリングは当業者に公知の方法により行うことができる。
　例えば、患者を治療する方法であって、
(a) 第一の投与量のFVIIIの機能代替活性を有する物質を投与する工程；
(b)患者のFVIIIの反応性をモニタリングする工程；
(c) 観測されたFVIIIの反応性に基づいて、FVIIIの機能代替活性を有する物質の第二の投与量を決定する工程、及び
(d)第二の投与量のFVIIIの機能代替活性を有する物質を該患者に投与する工程；
を含む方法を用いることができる。
　また、例えば、患者を治療する方法であって、
(a) 第一の投与間隔でFVIIIの機能代替活性を有する物質を投与する工程；
(b)患者のFVIIIの反応性をモニタリングする工程；
(c) 観測されたFVIIIの反応性に基づいて、FVIIIの機能代替活性を有する物質の第二の投与間隔を決定する工程、及び
(d)第二の投与間隔でFVIIIの機能代替活性を有する物質を該患者に投与する工程；
を含む方法を用いることができる。
　また、例えば、患者を治療する方法であって、FVIIIの反応性をモニタリングし、FVIIIの反応性に応じて凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与する量または/および投与間隔を変える、患者を治療する方法を用いることができる。
　FVIIIの機能代替活性を有する物質は、好ましくは、FIXおよび/またはFIXaならびにFXおよび/またはFXaに結合する二重特異性抗体である。さらに好ましくは以下に記載の抗体であって、第一のポリペプチドと第三のポリペプチドが会合し、第二のポリペプチドと第四のポリペプチドが会合する二重特異性抗体である。第一のポリペプチドが配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号：１０に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体（Q499-z121/J327-z119/L404-k）、又は第一のポリペプチドが配列番号：３６に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号：３７に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号：３８に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体（Q153-G4k/J142-G4h/L180-k）
　投与量は、例えば前記二重特異性抗体の場合、0.001～100mg/kgである。好ましくは、約0.001 mg/kg、約0.003 mg/kg、約0.005 mg/kg、約0.01 mg/kg、約0.03 mg/kg、約0.05 mg/kg、約0.1 mg/kg、約0.3 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、約3 mg/kg、約5 mg/kg 、約10 mg/kg 、約20 mg/kg、約30 mg/kg、約40 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kgである。投与量はモニタリングの前後で同じであってもよく、異なっていてもよい。投与間隔は、例えば前記二重特異性抗体の場合、少なくとも1日以上である。好ましくは、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、13週間、14週間、15週間、16週間、17週間、18週間、19週間、20週間、21週間、22週間、23週間、24週間、25週間、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、8カ月、9カ月、10カ月、11カ月、1年である。投与間隔はモニタリングの前後で同じであってもよく、異なっていてもよい。
　本発明の方法又はキットの対象となる患者は、例えば、血友病A、後天性血友病A、フォンビルブランド病、ならびにFVIIIおよび/またはFVIIIaに対するインヒビターが出現している血友病Aの患者である。
　本明細書において用いる場合、「・・・を含む（comprising）」との表現により表される態様は、「本質的に・・・からなる（essentially consisting of）」との表現により表される態様、ならびに「・・・からなる（consisting of）」との表現により表される態様を包含する。
　本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。
　本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体の作製及び可変領域の配列決定
　特許文献3（WO 2012/067176）に記載の二重特異性抗体であるACE910 （Q499-z121/J327-z119/L404-k）（配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：１０に記載のL鎖が会合し、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖と配列番号：１０に記載のL鎖が会合している二重特異性抗体）に対する抗体作製を試みた。遺伝子組み換え手法及びPepsin消化を用い、抗FIXa側、抗FX側それぞれのFabで構成されたF(ab')2を作製した。
　マウス及びラットに、抗FIXa-F(ab')2または抗FX-F(ab')2を免疫した。マウスまたはラットより摘出した脾臓あるいはラットリンパ節より得られた細胞とマウスミエローマ細胞を常法に従い細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清はACE910の抗FIXa-armまたは抗FX-armへの結合を検出するELISAで評価し、最終的にACE910の抗FIXa-armにのみに結合し、抗FX-armには結合しないマウス抗体AQ8、AQ1、ラット抗体AQ512、及びACE910の抗FX-armにのみ結合し、抗FIXa-armには結合しないラット抗体AJ540、AJ114、AJ521、AJ522、AJ541を選択した。さらに、AQ8抗体またはAJ540抗体の可変領域の塩基配列を解析した。AQ8およびAJ540の可変領域の塩基配列とそれから予測されるアミノ酸配列は、GENETYX Ver.9 (GENETYX CORPORATION)にて解析した。
〔実施例２〕リコンビナントマウス抗体AQ8およびリコンビナントラット-ウサギキメラ抗体AJ540の発現ベクターの作製
　リコンビナントマウス抗体AQ8は、実施例１で得られたAQ8抗体の可変領域の配列に既知のマウスIgG2bの定常領域配列（重鎖: EMBL accession No. J00461, 軽鎖: EMBL accession No. V00807）を組み合せて抗体遺伝子の全長を作製し、発現ベクターに挿入した。同様に、リコンビナントラット-ウサギキメラ抗体AJ540は、AJ540抗体の可変領域に既知のラビットIgG (重鎖: EMBL accession No. L29172,軽鎖: EMBL accession No. X00231)を組み合せて作製した。作製した発現クローンプラスミドをHEK293細胞に導入し、大量培養及びProtein Aおよびゲルろ過による精製を行い、リコンビナントマウス抗体AQ8 (rAQ8-mIgG2b)およびリコンビナントラット-ウサギキメラ抗体AJ540 (rAJ540-rbtIgG)を作製した。
〔実施例３〕rAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGを用いた抗FIXa/FX二重特異性抗体中和下でのone-stage clotting assayの実施
　10又は100 U/dLのリコンビナントFVIII(コージネイトFS、バイエル薬品株式会社)を含むFVIII欠乏血漿（George King）に、抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を、0又は300 μg/mLとなるように添加した。さらに各調製した血漿を、イミダゾールバッファー(協和メデックス)で10倍希釈する群と、rAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGをそれぞれ300 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群の2群に分けて、測定用サンプル溶液を調製した。尚、ACE910を十分に中和するのに必要な量のrAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGを加えた。組合せの詳細は以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、凝固時間をFVIII活性に換算する検量線用に、標準血漿であるコアグトロールN（シスメックス）をイミダゾールバッファーにて10、20、40、80、160倍希釈した溶液を調製した(検量線用溶液のそれぞれのFVIII活性は93、46.5、23.3、11.6、5.81%とした)。測定用サンプル溶液又は検量線用溶液 50 μL、第VIII因子欠乏ヒト血漿（シスメックス） 50 μL、及びトロンボチェックAPTT-SLA(シスメックス) 50 μLを混合し、37℃5分間インキュベーションした。インキュベーション後、0.02 mol/L塩化カルシウム溶液(シスメックス) 50 μLを添加して凝固を開始し、血液凝固自動測定装置KC4デルタ（Stago）で凝固時間を測定した。
　検量線用溶液の各FVIII活性における凝固時間から、測定用サンプルの凝固時間をFVIII活性に換算した。
結果
　結果を図１に示した。抗FIXa/FX二重特異性抗体を添加した10又は100 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿をバッファーで希釈した場合 (#3、#7)、検量線の範囲以上のFVIII活性を示し、正しく測定することができなかった。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体を添加した10又は100 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体を含むバッファーで希釈した場合（#4、#8）、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1、#5）と同様のFVIII活性を示した。したがって、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体は二重特異性抗体の活性を完全に中和することにより、二重特異性抗体が存在しているにもかかわらず血漿中のFVIII活性を正確に測定できることを示した。なお、10又は100 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体のみを含むバッファーで希釈した場合(#2、#6)、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1、#5）と同様のFVIII活性を示したことから、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体は二重特異性抗体に対して特異的な中和作用を有することが分かった。
〔実施例４〕AQ1とAJ541、又はAQ1とAJ522による抗FIXa/FX二重特異性抗体中和下でのone-stage clotting assayの実施
　10 U/dLのリコンビナントFVIII(コージネイトFS、バイエル薬品株式会社)を含むFVIII欠乏血漿（George King）に、抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を、0又は10 μg/mLとなるように添加した。さらに各調製した血漿を、イミダゾールバッファー(協和メデックス)で10倍希釈する群と、AQ1およびAJ541をそれぞれ100 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群、AQ1とAJ522をそれぞれ100 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群の3群に分けて、測定用サンプル溶液を調製した。尚、ACE910を十分に中和するのに必要な量のAQ1、AJ541、AJ522を加えた。組合せの詳細は以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　また、凝固時間をFVIII活性に換算する検量線用に、標準血漿であるコアグトロールN（シスメックス）をイミダゾールバッファーにて10、20、40、80、160、320、640倍希釈した溶液を調製した(検量線用溶液のそれぞれのFVIII活性は102、51.0、25.5、12.8、6.38、3.19、1.59%とした)。測定用サンプル溶液又は検量線用溶液 50 μL、第VIII因子欠乏ヒト血漿（シスメックス） 50 μL、及びトロンボチェックAPTT-SLA(シスメックス) 50 μLを混合し、37℃5分間インキュベーションした。インキュベーション後、0.02 mol/L塩化カルシウム溶液(シスメックス) 50 μLを添加して凝固を開始し、血液凝固自動測定装置KC4デルタ（Stago）で凝固時間を測定した。
　検量線用溶液の各FVIII活性における凝固時間から、測定用サンプルの凝固時間をFVIII活性に換算した。
結果
　結果を図２に示した。抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿をバッファーで希釈した場合 (#4)、検量線の範囲以上のFVIII活性を示し、正しく測定することができなかった。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ1とAJ541を含むバッファーで希釈した場合（#5）又は抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ1とAJ522を含むバッファーで希釈した場合（#6）、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1）と同様のFVIII活性を示した。したがって、二重特異性抗体ACE910の活性を完全に中和する抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体として、rAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGだけでなく、別の抗体の組み合わせでも有効であった。
〔実施例５〕AQ512とAJ114、又はAQ512とAJ521による抗FIXa/FX二重特異性抗体中和下でのone-stage clotting assayの実施
　10 U/dLのリコンビナントFVIII(コージネイトFS、バイエル薬品株式会社)を含むFVIII欠乏血漿（George King）に、抗FIXa/FX二重特異性抗体hBS23を、0又は10 μg/mLとなるように添加した。さらに各調製した血漿を、イミダゾールバッファー(協和メデックス)で10倍希釈する群と、AQ512およびAJ114をそれぞれ100 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群、AQ512とAJ521をそれぞれ100 μg/mLとなるように添加したイミダゾールバッファーで10倍希釈する群の3群に分けて、測定用サンプル溶液を調製した。尚、hBS23を十分に中和するのに必要な量のAQ512、AJ114、AJ521を加えた。組合せの詳細は以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、凝固時間をFVIII活性に換算する検量線用に、標準血漿であるコアグトロールN（シスメックス）をイミダゾールバッファーにて10、20、40、80、160、320、640倍希釈した溶液を調製した(検量線用溶液のそれぞれのFVIII活性は102、51.0、25.5、12.8、6.38、3.19、1.59%とした)。測定用サンプル溶液又は検量線用溶液 50 μL、第VIII因子欠乏ヒト血漿（シスメックス） 50 μL、及びトロンボチェックAPTT-SLA(シスメックス) 50 μLを混合し、37℃5分間インキュベーションした。インキュベーション後、0.02 mol/L塩化カルシウム溶液(シスメックス) 50 μLを添加して凝固を開始し、血液凝固自動測定装置KC4デルタ（Stago）で凝固時間を測定した。
　検量線用溶液の各FVIII活性における凝固時間から、測定用サンプルの凝固時間をFVIII活性に換算した。
結果
　結果を図３に示した。抗FIXa/FX二重特異性抗体hBS23を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿をバッファーで希釈した場合 (#4)、検量線の範囲以上のFVIII活性を示し、正しく測定することができなかった。一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体hBS23を添加した10 U/dLのリコンビナントFVIIIを含むFVIII欠乏血漿に対して抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ512とAJ114を含むバッファーで希釈した場合（#5）又は抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体AQ512とAJ521を含むバッファーで希釈した場合（#6）、抗FIXa/FX二重特異性抗体無添加群（#1）と同様のFVIII活性を示した。ACE910とは異なる二重特異性抗体hBS23でも、その活性を完全に中和することにより、二重特異性抗体が存在しているにもかかわらず血漿中のFVIII活性を正確に測定できたため、本アプローチは様々なFVIII代替活性を有する二重特異性抗体に対して有効であることを示した。
〔実施例６〕rAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGを用いた抗FIXa/FX二重特異性抗体中和下でのベセスダ法の実施
　第VIII因子欠乏ヒト血漿（含FVIIIインヒビター）（George King Bio-Medical）に抗FIXa/FX二重特異性抗体ACE910を、0又は300 μg/mLとなるように添加した。さらに各調製した血漿を0.25% (w/v)ウシ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）含有イミダゾールバッファー(協和メデックス) (以下BSA-imidazole)にて25倍希釈又は30倍希釈した。標準血漿であるコアグトロールN（シスメックス）にrAQ8-mIgG2bおよびrAJ540-rbtIgGを無添加、又はそれぞれ300 μg/mLとなるように添加した。
　調製した各血漿のうちの2種類を以下の組合せ（計8種類）で等量混合し、37℃、2時間インキュベーションした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　インキュベーション後、さらに混合溶液をBSA-imidazoleにて10倍希釈し、測定用サンプル溶液を調製した。また、凝固時間をFVIII活性値に換算する検量線作成用に、コアグトロールNをBSA-imidazoleにて20、40、80、160、320倍希釈した溶液を調製した(検量線用溶液のそれぞれのFVIII活性は100、50、25、12.5、6.25%とした)。
　測定用サンプル溶液又は検量線用溶液 50 μL、第VIII因子欠乏ヒト血漿（シスメックス） 50 μL、及びトロンボチェックAPTT-SLA(シスメックス) 50 μLを混合し、37℃で3分間インキュベーションした。インキュベーション後、0.02 mol/L塩化カルシウム溶液(シスメックス) 50 μLを添加して凝固を開始し、血液凝固自動測定装置KC4デルタ（Stago）で凝固時間を測定した。
　検量線用溶液の各FVIII活性における凝固時間から、測定用サンプルの凝固時間をFVIII活性に換算した。さらに残存FVIII活性が50%のときに1ベセスダとして、測定用サンプル中のベセスダ値を算出後、25倍及び30倍をかけた値の平均値を各サンプル原液中のインヒビター力価として算出した。
結果
　結果を図４に示した。抗FIXa/FX二重特異性抗体のみを含むFVIIIインヒビター血漿(#3)では、検量線のFVIII 100%以上の活性を示したことから、FVIIIインヒビター力価が測定できなかった。
　一方、抗FIXa/FX二重特異性抗体及び抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する2種類の抗体を含むFVIIIインヒビター血漿(#4)では、無添加のインヒビター血漿(#1)と同様のFVIIIインヒビター力価を示した。したがって、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体は二重特異性抗体の活性を完全に中和することにより、二重特異性抗体が存在しているにもかかわらず血漿中のFVIIIインヒビター力価を正確に測定できることを示した。なお、2種類の抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体のみを含むFVIIIインヒビター血漿(#2)は、#1と同様の結果を示したことから、抗FIXa/FX二重特異性抗体に対する抗体は二重特異性抗体に対して特異的な中和作用を有することが分かった。
　本発明により、FVIII機能代替活性を有する二重特異性抗体の存在下において、FVIIIの反応性を測定する方法、例えばFVIII活性、FVIIIインヒビター力価を測定する方法が提供された。本発明の方法を使用することにより、当該二重特異性抗体による血友病等の出血性疾患の治療において、患者のFVIIIの反応性を正確に測定することができる。

Claims (17)

  1. 　凝固第VIII因子の反応性を測定する方法であって、以下の（１）と（２）を接触させる工程を含む方法。
     （１）凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を含む血液由来サンプル
     （２）凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を中和する一以上の物質
  2. 　凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質が、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子ならびに凝固第X因子および/または活性化血液凝固第X因子に結合する二重特異性抗体である請求項１に記載の方法。
  3. 　前記二重特異性抗体が以下に記載のいずれかの抗体であって、第一のポリペプチドと第三のポリペプチドが会合し、第二のポリペプチドと第四のポリペプチドが会合する二重特異性抗体である請求項１又は２に記載の方法。
    　第一のポリペプチドが配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号：１０に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体（Q499-z121/J327-z119/L404-k）
    　第一のポリペプチドが配列番号：３６に記載のアミノ酸配列からなるH鎖、第二のポリペプチドが配列番号：３７に記載のアミノ酸配列からなるH鎖および第三のポリペプチドと第四のポリペプチドが配列番号：３８に記載の共通L鎖からなる二重特異性抗体（Q153-G4k/J142-G4h/L180-k）
  4. 　前記中和する物質が、前記凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を中和するペプチド、ポリペプチド、有機化合物、アプタマー、および抗体からなる群から選ばれる１以上の物質である、請求項1～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記中和する物質が、凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、及び、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabならびに凝固第X因子および/または活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる１以上の抗体である、請求項２～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記中和する物質が、以下の抗体の組み合わせからなる群から選ばれる１以上の組み合わせである、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
     (a) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
     (b) 活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
     (c)凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
     (d) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及び活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
  7. 　凝固第VIII因子の反応性を測定する方法が、凝固第VIII因子活性を測定する方法又は凝固第VIII因子インヒビター力価を測定する方法である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、及び、凝固第IX因子および/または活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabならびに凝固第X因子および/または活性化凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する二重特異性抗体からなる群から選ばれる１以上の抗体を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
  9. 　以下の抗体の組み合わせからなる群から選ばれる１以上の組み合わせを含む、請求項８に記載のキット。
     (a) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
     (b) 活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
     (c)凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体と活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
     (d) 凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体、凝固第X因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体及び活性化凝固第IX因子に結合する抗原結合部位を含むFabに結合する抗体
  10. 　請求項１～７のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断する方法。
  11. 　請求項１～７のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者のインヒビター力価を診断する方法。
  12. 　請求項１～７のいずれかに記載の方法を用いて、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングする方法。
  13. 　前記患者が血友病A患者、後天性血友病A患者、フォンビルブランド病患者、ならびに血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している血友病A患者からなる群より選択される患者である、請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 　請求項８又は９に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者の重症度を診断するためのキット。
  15. 　請求項８又は９に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質を投与した患者のインヒビター力価を診断するためのキット。
  16. 　請求項８又は９に記載のキットが、凝固第VIII因子の機能代替活性を有する物質及びFVIII製剤を投与した患者におけるFVIII製剤の薬理活性をモニタリングするためのキット。
  17. 　前記患者が血友病A患者、後天性血友病A患者、フォンビルブランド病患者、ならびに血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している血友病A患者からなる群より選択される患者である、請求項１４～１６のいずれかに記載のキット。
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