Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

WO2015115448A1 - 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法 - Google Patents

細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015115448A1
WO2015115448A1 PCT/JP2015/052264 JP2015052264W WO2015115448A1 WO 2015115448 A1 WO2015115448 A1 WO 2015115448A1 JP 2015052264 W JP2015052264 W JP 2015052264W WO 2015115448 A1 WO2015115448 A1 WO 2015115448A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substrate
cell membrane
observation
cell
analysis
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/052264
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆幸 中谷
礼文 坂根
清人 阿部
裕也 和田
貴士 奥野
啓史 佐藤
Original Assignee
並木精密宝石株式会社
国立大学法人山形大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 並木精密宝石株式会社, 国立大学法人山形大学 filed Critical 並木精密宝石株式会社
Priority to US15/115,420 priority Critical patent/US20170167957A1/en
Priority to JP2015559957A priority patent/JP6630875B2/ja
Priority to EP15743933.2A priority patent/EP3101421A4/en
Priority to KR1020167020726A priority patent/KR20160113136A/ko
Publication of WO2015115448A1 publication Critical patent/WO2015115448A1/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N1/31—Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5088—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above confining liquids at a location by surface tension, e.g. virtual wells on plates, wires
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/34—Microscope slides, e.g. mounting specimens on microscope slides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50857—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates using arrays or bundles of open capillaries for holding samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
    • G01N2001/368—Mounting multiple samples in one block, e.g. TMA [Tissue Microarrays]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N2035/00039—Transport arrangements specific to flat sample substrates, e.g. pusher blade
    • G01N2035/00059—Transport arrangements specific to flat sample substrates, e.g. pusher blade vacuum chucks

Definitions

  • the present invention relates to a cell membrane observation and analysis apparatus and a cell membrane observation and analysis method capable of observing and analyzing a biological function of a cell membrane from both sides of the cell membrane.
  • Anti-cancer drugs have stronger side effects than normal drugs, and effective drugs differ depending on the individual patient, and sufficient therapeutic effects may not be obtained depending on the patient. In addition, the inability to obtain a therapeutic effect by administering an expensive anticancer agent leads to an increase in medical costs. In order to solve these problems, anticancer drug susceptibility tests have been devised in which an anticancer drug is tested to be effective for an individual patient before the anticancer drug is administered.
  • cancer cells obtained by surgical sections or biopsies are used as cell suspensions by cell culture medium reflux method or enzyme treatment method and anticancer drugs Cultivate with a culture solution containing, culture for several days to several tens of days, light-visible or stained with Giemsa, etc., whether the cancer cells are sensitive to the anticancer drug used A method to check was taken.
  • Patent Document 1 For example, see Patent Document 1
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and it is an object of the present invention to provide a cell membrane observation and analysis apparatus and a cell membrane observation and analysis method capable of tracking biological functions occurring in the cell membrane with high sensitivity.
  • the cell membrane observation and analysis apparatus of the present invention is composed of at least a microscope and a substrate having a plurality of holes, each cell membrane is disposed on each hole of the substrate, the cell membrane is disposed on the substrate, While the cell membrane is sucked, the cell membrane is immersed in a buffer solution, and the buffer solution is sealed, and the cell membrane is observed and analyzed.
  • one embodiment of the cell membrane observation and analysis apparatus of the present invention is further provided with a substrate placement member provided with a substrate, and the orthogonal biaxial abutting portion is the outermost surface of the substrate placement member. It is preferable that at least a part and an arrangement part where the substrate is arranged are respectively provided in parallel to the two axes.
  • a light transmission window that transmits light is provided on the other side of the substrate placement member on which the substrate is provided, and light that has passed through the light transmission window. It is preferable that the cell membrane is irradiated and the light transmission window is removable from the substrate placement member.
  • the biological functions of each surface of the cell membrane are analyzed separately for each surface.
  • the light transmission window is preferably made of glass having a visible light transmittance of 90% or more.
  • a substrate having a plurality of holes is prepared, then the cell membrane is dispersed in a buffer solution to prepare a suspension, and the suspension is dropped on the substrate surface. Next, the cell membrane is sucked with a pump through each hole, the cell membrane is placed on each hole, and then the cell membrane is immersed in the second buffer solution while continuing the suction of the cell membrane. The cell membrane is observed and analyzed with a microscope.
  • a substrate placement member provided with a substrate placed thereon is further prepared, and at least one of the orthogonal biaxial abutting portions is at least one of the outermost surfaces of the substrate placement member.
  • the board and the placement part where the board is placed are arranged parallel to the two axes, and the two sides orthogonal to the outermost surface of the board are brought into contact with the abutting part of the placement part of the board.
  • the biaxially abutting portion of the outermost surface of the substrate placement member that is perpendicular to the outermost surface of the member is placed in the perpendicular biaxial direction of the placement location of the substrate placement member of the microscope. It is preferable that the substrate placement member is placed at the placement location of the microscope in contact with the pad.
  • the cell membrane can be observed and analyzed from both sides. Therefore, it is possible to trace the biological function occurring in the cell membrane with high sensitivity, and a large amount of cell sample is not required for the drug sensitivity test, and the test can be performed promptly. Furthermore, the trouble of replacing the sample is omitted, and it is possible to quickly observe and analyze both surfaces of the cell membrane.
  • FIG. 1 It is a perspective view which shows typically the board
  • B is an enlarged plan view schematically showing a plurality of holes formed in the substrate shown in FIG.
  • A It is an expanded sectional view showing typically a plurality of holes formed in a substrate with which a cell membrane observation and analysis device of an embodiment of the present invention is formed, and a cell membrane arranged on each hole.
  • FIG. 1 (a) An enlarged cross-sectional view schematically showing a state in which a part of the cell membrane shown in FIG. 1 (a) is removed and a part of the remaining cell membrane is arranged on each hole of the substrate.
  • FIG. 1 It is an expanded sectional view showing typically the state where a cell membrane arranged in a plurality of holes formed in a substrate provided in a cell membrane observation and analysis device of an embodiment of the present invention and each cell membrane are sucked.
  • A It is a top view of the member for board
  • B It is a front view of the member for board
  • C It is a bottom view of the board
  • (A) It is a top view which shows the fixing state of the member for board
  • (B) It is a front view which shows the fixing state of the board
  • (C) It is a bottom view which shows the fixing state of the board
  • (A) It is an expansion perspective view which shows typically the arrangement
  • (B) It is an expansion perspective view which shows typically the state by which the board
  • (A) It is a perspective view which shows typically the arrangement
  • (B) It is a perspective view which shows typically the state by which the board
  • It is explanatory drawing which shows typically the state which observes and analyzes with the inverted microscope the board
  • positioning member shown in FIG. 2 is a fluorescence micrograph of a HeLa cell membrane captured and arranged in each hole formed in a substrate, which is provided in the cell membrane observation and analysis apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • the cell membrane observation and analysis apparatus includes a substrate on which a cell membrane is arranged, and observes and analyzes the cell membrane arranged on the substrate.
  • the substrate 1 As the substrate 1, there is prepared a substrate 1 having outer dimensions of a depth L of 10 mm, a width W of 10 mm, a thickness T of 0.2 mm, and a plurality of holes 2 as shown in FIG.
  • the substrate 1 is made of a transparent material that transmits light, or other substrates.
  • the transparent material is, for example, quartz glass or sapphire, and the quartz glass has physical properties of light transmittance of 90% or more and a refractive index of 1.5 when the wavelength ⁇ of visible light is 588 nm.
  • sapphire has physical properties such that the visible light wavelength ⁇ is 588 nm and the light transmittance is 80% or more and the refractive index is 1.8.
  • the substrate other than the transparent body includes a substrate made of plastic, silicon, or the like that does not transmit light in the visible light region, or a substrate that does not transmit light by attaching a shielding film or a seal to the surface of the substrate 1.
  • a shielding film or a seal to the surface of the substrate 1.
  • the planar shape of the hole 2 is circular, and the sectional shape of the hole 2 is a straight hole or a tapered hole although not shown.
  • the arrangement side of the cell membrane is a small diameter.
  • the number of holes 2 requires a minimum of 500 samples required for observation and analysis of the biological function of the cell membrane, and a total of 625 are formed in 25 ⁇ 25 rows.
  • the range in which each hole 2 is formed is within 1 mm square.
  • the diameter ⁇ of each hole 2 is 2.0 ⁇ m, the distance D between the central portions of each hole 2 is 40 ⁇ m, and the aspect ratio of each hole 2 is 100 (the substrate thickness T0.2 mm is divided by the hole diameter ⁇ 2.0 ⁇ m). Value).
  • the number of holes 2 is omitted from the viewability of the drawing, and the ratio of the diameter ⁇ of each hole 2 to the outer dimension of the substrate 1 is enlarged. Show.
  • cell membranes cell membranes derived from cancer cells in cells such as human cells, non-human mammalian cells, and animal cells such as insect cells are to be observed and analyzed. Furthermore, the incubated cell membrane may be used as a target sample.
  • the sample containing the cell membrane of these cells is preferably a sample containing at least 500 to 100,000 cell membranes.
  • the cell membrane is dispersed in a buffer solution, and the suspension is dropped onto the surface of the substrate 1, so that the cell membrane 3 is curled and adsorbed on the surface of the substrate 1 as shown in FIG. Also, a predetermined amount of the second buffer solution is put in advance in a saucer as shown in FIG.
  • the buffer PBS (Phosphate Buffered Saline) may be used as an example, but is not limited thereto.
  • the cell membrane may be washed with a buffer solution.
  • the rounded portion of the cell membrane 3 is removed by physical stimulation such as ultrasonic waves on the cell membrane 3 that is curled up and adsorbed on the surface of the substrate 1, and only a part of the cell membrane 3 adsorbed on the surface of the substrate 1 in advance is shown. It remains as shown in 2 (b).
  • a shielding film or a seal is attached in advance to the surface of the substrate 1, the surface of the substrate 1 on which the cell membrane 3 is adsorbed is the surface opposite to the surface on which the shielding film or the seal is attached.
  • the board placement member 4 is made of stainless steel, and has a placement portion of the light transmission window 5, a placement portion of the board 1, and a counterbore portion formed in the circumferential direction to receive the peripheral portion 6 a of the tray 6. Formed.
  • the arrangement part of the light transmission window 5 in the substrate arrangement member 4 is provided on the other side of the side on which the substrate 1 is provided.
  • the light transmissive window is received by the ring member 7 having a planar shape of O and is disposed inside the arrangement portion, and is further restrained and fixed from the upper surface by the restraining member 8 of the light transmissive window 5.
  • the light transmission window 5 is preferably made of glass having physical properties of a light transmittance of 90% or more and a refractive index of 1.5 in visible light. Examples of the wavelength of visible light include 588 nm.
  • the holding member 8 is made of, for example, polytetrafluoroethylene (PTFE), and is fixed to one surface side of the board arranging member 4 by fastening four corners with bolts. In this way, the light transmission window 5 is provided so as to be removable from the board arranging member 4.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • abutting portions 4a and 4a are provided on one surface side of the substrate arranging member 4 in a direction parallel to two orthogonal axes as shown in FIGS.
  • the height of the abutting portions 4a and 4a is equal to or greater than the thickness T of the substrate.
  • the substrate 1 in which the cell membrane is dropped on the orthogonal biaxial abutting portions 4a and 4a provided on one surface side of the substrate arrangement member 4 The two sides of the outermost surface that are orthogonal to each other come into contact with each other, and the substrate 1 is placed on the substrate placement member 4.
  • the external dimensions of the substrate 1 and the formation positions of the holes 2 are set in advance so that all the holes 2 are arranged on the daylighting holes 4b provided in the arrangement member 4. Shall be kept.
  • the hole 4b is formed in a circular shape having a diameter of about 5.0 mm.
  • the placement portion of the substrate 1 and the placement portion of the light transmission window 5 are provided. Between the two. Therefore, the cell membrane 3 dropped on the surface of the substrate 1 is irradiated with the light transmitted through the light transmission window 5.
  • a second hole 4c is formed in a direction orthogonal to the side surface of the hole 4b, and is connected to a pump such as a vacuum pump (not shown) through a joint port (groove) 12.
  • the hole 4c is also formed in a circular shape having a diameter of about 5 mm.
  • the cell membrane 3 adsorbed on the surface of the substrate 1 from the holes 4b and 4c is attracted to the center of each hole 2 and moves. , Pressed against the surface of the substrate 1.
  • the suction direction is schematically shown by an arrow pointing downward from each hole 2 in FIG.
  • the suction pressure at 800 Pa or 1000 Pa, the cell membrane 3 can be continuously pushed onto the surface of the substrate 1 through the hole 2 without damaging the cell membrane 3 and without passing through the hole 2. This is possible and preferable.
  • the substrate placement member 4 is inverted while performing the suction operation, and the receiving tray 6 containing the second buffer solution is fitted into the substrate placement member 4.
  • the tray 6 is made of glass at least at the bottom, and the peripheral edge 6a is formed of polystyrene.
  • the receiving tray 6 is fitted by inserting the peripheral edge 6a of the receiving tray 6 into the counterbore part, and further, the ball plunger 9 shown in FIG. This is done by locking.
  • the ball plunger 9 is illustrated in FIGS. 4 (b) and 5 (b).
  • illustration of the ball plunger 9 which appears in an external appearance is abbreviate
  • the saucer 6 is fitted into the substrate placement member 4 by setting the height dimensions of the abutting portions 4a, 4a in the substrate placement member 4, the thickness T of the substrate 1, and the amount of the second buffer solution to be placed in the saucer 6. When this occurs, the bottom surface of the inner surface of the tray 6 comes into contact with the surface of the substrate placement member 4 on the side where the substrate 1 is placed, and when it further comes into contact, the cell membrane 3 placed on the surface of the substrate 1 Sealed with the second buffer solution.
  • the substrate placement member 4 is placed on the microscope while the suction by the pump is continued, and the cell membrane 3 is observed and analyzed.
  • the substrate placement member 4 is placed on the microscope in the biaxial abutting portion 4d provided on the outermost surface of the substrate placement member 4 while suctioning with the holding member 8 side of the substrate placement member 4 facing upward. 4d is brought into contact with the receiving L-shaped butting 10 provided on the stage of the microscope (see FIG. 9). Therefore, the abutment 10 becomes an arrangement location of the substrate arrangement member 4 in the microscope.
  • the abutting portions 4d and 4d are respectively provided on at least a part of the outermost surface of the board arranging member 4. In the present invention, it is assumed that the microscope constitutes a cell membrane observation and analysis device.
  • a fluorescence microscope As the microscope, a fluorescence microscope, an electron microscope, a scanning probe microscope (including an atomic force microscope), a confocal microscope, or a laser microscope may be used.
  • a fluorescence microscope As the microscope, a fluorescence microscope, an electron microscope, a scanning probe microscope (including an atomic force microscope), a confocal microscope, or a laser microscope may be used.
  • the ball plunger 9 and the joint port 12 appearing in the appearance are not shown.
  • the abutting portions 4d and 4d are also provided in a direction parallel to two orthogonal axes, similarly to the abutting portions 4a and 4a. Therefore, as shown in FIG. 4C and FIG. 5C, the abutting portions 4a and 4a and the abutting portions 4d and 4d are provided in parallel to each other. Therefore, if the L-shaped butting 10 is prepared on the stage of the microscope, the biaxial direction of the stage and the biaxial direction of the hole of the substrate 1 are parallel to each other. It is possible to easily perform the number measurement of 3.
  • fluorescence observation and analysis imaging observation and analysis
  • the fluorescence observation and analysis according to the present invention can be broadly divided into two observation methods and analysis methods. The first is to attach a fluorescent staining agent to the cell membrane 3 as a sample, and to irradiate the fluorescent staining agent with excitation light to emit red or green light, and to observe and analyze the fluorescence of the cell membrane 3. The second is to analyze the biological function of each cell membrane 3 on each surface separately for each surface.
  • the microscope shown in FIG. 10 shows an observation and analysis state with an inverted microscope in which the objective lens 11 is provided on the lower side of the drawing through a hole in the stage 13 of the microscope.
  • excitation light is applied from the bottom to the top through the objective lens 11, and the fluorescent stain applied to the sample cell membrane 3 is irradiated with the excitation light to emit red or green.
  • a transmission illumination unit (not shown) is attached to the stage 13 side, so that the transmission illumination unit is placed above the cell membrane 3 when performing visible light observation and analysis. Then, by applying illumination light in the visible light region from the top to the bottom of FIG. 10, it is possible to observe and analyze the state, shape, or contour of the entire cell membrane 3.
  • the structure of the microscope is not limited to the inverted type, and the substrate arrangement member 4 may be placed on an upright type microscope.
  • the microscope shown in FIG. 11 shows an observation and analysis state with an upright microscope in which the objective lens 11 is provided on the upper side of FIG.
  • the objective lens is on the upper side of FIG. 11, and observation and analysis are performed from the upper side of the substrate 1.
  • excitation light is applied from the top to the bottom through the objective lens 11, and the fluorescent staining agent attached to the cell membrane 3 as a sample is irradiated with the excitation light to emit red or green, and the entire cell membrane 3 is emitted. Can be observed and analyzed with fluorescence.
  • the transmission illumination unit since a transmission illumination unit (not shown) is attached to the stage 13 side, the transmission illumination unit is held near the lower side of the cell membrane 3 when performing visible light observation and analysis. Now, by applying illumination light in the visible light region from the bottom to the top of FIG. 11, it is possible to observe and analyze the state, shape, or contour of the entire cell membrane 3.
  • the substrate arrangement member 4 is turned over and the arrangement side of the substrate 2 is arranged so as to face the objective lens 11, so that the entire state, shape, or outline of the cell membrane 3 can be observed with visible light. You may analyze.
  • the tray 6 is not used. Since the cell membrane 3 and the objective lens 11 can be brought close to each other by facing the arrangement side of the substrate 2 to the objective lens 11, the cell membrane 3 can be observed and analyzed at a higher magnification.
  • the cell membrane 3 arranged on each hole 2 maintains the front and back state of the collected cell membrane. Therefore, it is possible to independently evaluate the binding properties of target molecules such as proteins and drugs to the surface side and the back side of the cell membrane 3. For example, it is possible to analyze the concentration-dependent binding amount of the fluorescently labeled target molecule bound on the surface of the cell membrane 3 and estimate the affinity of the target molecule to both surfaces of the cell membrane 3. Therefore, in the present invention, it is possible to analyze the biological function of each cell membrane 3 on each surface separately for each surface. In the fluorescence observation and analysis by the inverted microscope shown in FIG.
  • the fluorescence labeled target molecule is bound on the surface of the cell membrane 3, and excitation light is input from the bottom upward through the objective lens 11, thereby the cell membrane of the target molecule. It is possible to estimate the affinity to the surface on the objective lens 11 side among the three surfaces.
  • the substrate 1 When observing and analyzing the cell membrane 3 with visible light, if the substrate 1 is made of a transparent material, it is possible to clearly observe and analyze the state, shape, or contour of the entire cell membrane 3.
  • the substrate 1 when the substrate 1 is made of a light-impermeable plastic, silicon, or the like in the visible light region, or when a shielding film or a seal is attached to the surface of the substrate 1 to form a light-impermeable substrate, the cell membrane 3
  • the visible light only the cell membrane of the same area as the opening area of the hole 2 can be observed and analyzed. However, since the amount of light passing through the substrate 1 becomes a constant value corresponding to the total opening area of each hole 2, quantitative observation and analysis are possible.
  • the cancer cell-derived cell membrane in each cell such as a human cell, a non-human mammalian cell, an animal cell such as an insect cell, etc.
  • Biological functions can be observed and analyzed with high sensitivity.
  • the cell membrane 3 can be observed and analyzed from both sides. Therefore, it is possible to trace the biological function occurring in the cell membrane 3 with high sensitivity, and a large amount of cell sample is not required for the drug sensitivity test, and the test can be performed promptly. Furthermore, the trouble of replacing the sample is omitted, and it is possible to quickly observe and analyze both surfaces of the cell membrane 3. In addition, a desired biological reaction can be performed on both surfaces of the cell membrane 3 or on any one surface.
  • the buffer solution (suspension) or the second buffer solution in which the cell membrane 3 is dispersed is sucked by the suction of the pump, contacts the light transmission window 5 through the hole 4b, and the light transmission window 5 becomes dirty.
  • the light transmission window 5 is provided so as to be removable from the substrate placement member 4, the light transmission window 5 can be easily cleaned.
  • the cell membrane observation and analysis apparatus includes an inverted microscope and a substrate made of a transparent body.
  • a substrate made of quartz glass having outer dimensions of 10 mm in depth, 10 mm in width, and 0.2 mm in thickness is prepared, and has a light transmittance of 90% or more and a refractive index of 1.5 at a wavelength ⁇ of visible light of 588 nm.
  • the holes formed in the substrate have a circular planar shape and a cross-sectional shape formed as a straight hole. A total of 625 holes of 25 x 25 rows were formed. The diameter (diameter) of each hole was 2.0 ⁇ m, the distance between the center portions of each hole was 40 ⁇ m, and the aspect ratio of each hole was 100.
  • the cell membrane to be observed and analyzed was a HeLa cell-derived cell, and a cell cultured in a MEM medium was used. HeLa cells that reached about 90% confluency were prepared in 10 cm dishes. As a sample containing HeLa cells, a sample containing 500,000 cells per ml was prepared. In addition, 10 ⁇ l of 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) (1 mg / ml) was added to 5 ml of MEM and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for 10 minutes.
  • DI 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate
  • the HeLa cells were then washed with 5 ml of buffer A (2 mM CaCl 2 , 10 mM Tris / HCl pH 7.5, 150 mM NaCl). Further, Buffer B (Buffer A plus 25 mM formaldehyde and 2 mM DTT) was added to the HeLa cells.
  • buffer A 2 mM CaCl 2 , 10 mM Tris / HCl pH 7.5, 150 mM NaCl.
  • Buffer B Buffer A plus 25 mM formaldehyde and 2 mM DTT
  • GPMVs giant plasma membrane vesicles
  • the GPMVs suspension (500,000 pieces / ml) was dropped on the substrate in a volume of 50 ⁇ l and left for 1 minute under reduced pressure of at least about 20% of atmospheric pressure.
  • the substrate placement member, the light transmission window, the light transmission window restraining member, and the receiving tray used the materials described in the above embodiment, and the arrangement and assembly between the components were also as described in the above embodiment.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Optical Measuring Cells (AREA)

Abstract

【課題】細胞膜で発生する生体機能を高感度に追跡可能な細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法を提供する。 【解決手段】細胞膜観察及び解析装置は、顕微鏡、及び複数の穴を有する基板で少なくとも構成され、基板の各穴の上にそれぞれ細胞膜が配置されて基板上に細胞膜が配置され、穴を介して細胞膜が吸引されながら細胞膜が緩衝液に浸漬され、更に緩衝液が封止され、細胞膜を観察及び解析する。この細胞膜観察及び解析装置を用いて、基板を用意し、次に細胞膜を緩衝液に分散して懸濁液を作製し、その懸濁液を基板面上に滴下し、次に各穴を介して細胞膜をポンプで吸引して各穴の上に細胞膜を配置し、次に細胞膜の吸引を継続しながら細胞膜を第２の緩衝液に浸漬して、第２の緩衝液を封止し、細胞膜を顕微鏡により観察及び解析する。

Description

細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法
　本発明は、細胞膜の生体機能をその細胞膜の両面から観察や解析が可能な、細胞膜観察及び解析装置と、細胞膜観察及び解析方法に関する。
　抗がん剤は通常の薬剤に比べて副作用が強く、個々の患者毎に有効な薬剤が異なり、患者によっては十分な治療効果が得られない場合がある。また、高価な抗がん剤を投与して治療効果が得られないことは、医療費の高騰にもつながる。これらの問題を解決するため、抗がん剤を投与する前に、その抗がん剤が個々の患者に有効な薬剤かどうか検査する抗がん剤感受性試験が考案されている。
　これまでに知られているがん細胞の薬剤感受性試験の方法として、手術切片やバイオプシーにより得られたがん細胞を細胞培養液還流法や酵素処理法により細胞浮遊液とし、それと抗がん剤を含む培養液と共にカルチャープレートに蒔き、数日～十数日間培養を行い、光顕化あるいはギムザ等の染色をし、使用した抗がん剤に対し、がん細胞が感受性を有するか否かを調べる方法が取られていた。（例えば、特許文献１参照）
特公平０６－０９０２０５
　しかしながら、薬剤の感受性などの解析に必要な生体機能は細胞膜で起こっていた。従って、薬剤感受性試験を信頼良く行うためには、細胞膜で起こる薬物輸送（薬剤の搬入又は排出のポンプ機能）、感染、情報伝達などの生体機能を高感度に観察及び解析することが必要であった。しかし、従来の薬剤感受性試験は細胞で試験を行っていたため、細胞膜の生体機能を高感度に追跡することは困難であった。また、薬剤感受性試験には多量の細胞サンプルが必要であり、試験の実施に時間を要していた。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞膜で発生する生体機能を高感度に追跡可能な細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法の提供を課題とする。
　前記課題は、以下の本発明により達成される。即ち本発明の細胞膜観察及び解析装置は、顕微鏡、及び複数の穴を有する基板で少なくとも構成され、基板の各穴の上にそれぞれ細胞膜が配置されて基板上に細胞膜が配置され、穴を介して細胞膜が吸引されながら細胞膜が緩衝液に浸漬され、更に緩衝液が封止され、細胞膜を観察及び解析することを特徴とする。
　更に本発明の細胞膜観察及び解析装置の一実施形態は、基板を配置して備える基板配置用部材が更に備えられると共に、直交する二軸方向の突き当て部分が、基板配置用部材の最外面の少なくとも一部と、基板を配置する配置部分に、それぞれ二軸に対して平行に設けられていることが好ましい。
　更に本発明の細胞膜観察及び解析装置の他の実施形態は、基板配置用部材で基板が備えられる側の他方側に、光を透過する光透過窓が備えられると共に、光透過窓を透過した光で細胞膜が照射され、更に、光透過窓が基板配置用部材から取り外し可能であることが好ましい。
　更に本発明の細胞膜観察及び解析装置の他の実施形態は、細胞膜の互いの面での生体機能が、面ごとに別々に解析されることが好ましい。
　更に本発明の細胞膜観察及び解析装置の他の実施形態は、光透過窓が、可視光の光透過率90％以上であるガラス製であることが好ましい。
　また本発明の細胞膜観察及び解析方法は、複数の穴を有する基板を用意し、次に細胞膜を緩衝液に分散して懸濁液を作製し、その懸濁液を基板面上に滴下し、次に各穴を介して細胞膜をポンプで吸引し、各穴の上に細胞膜を配置し、次に細胞膜の吸引を継続しながら細胞膜を第２の緩衝液に浸漬して、第２の緩衝液を封止し、細胞膜を顕微鏡により観察及び解析することを特徴とする。
　更に本発明の細胞膜観察及び解析方法の一実施形態は、基板を配置して備える基板配置用部材を更に用意し、直交する二軸方向の突き当て部分を基板配置用部材の最外面の少なくとも一部と、基板を配置する配置部分に、それぞれ二軸に対して平行に設け、基板の最外面の直交する二辺を、基板の配置部分の突き当て部分に当接して、基板を基板配置用部材の、基板の配置部分に配置し、次に、基板配置用部材の最外面の直交する二軸方向の突き当て部分を、顕微鏡の基板配置用部材の配置箇所の直交する二軸方向の突き当てに当接して、基板配置用部材を顕微鏡の配置箇所に配置することが好ましい。
　更に本発明の細胞膜観察及び解析方法の他の実施形態は、細胞膜の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析することが好ましい。
　本発明の細胞膜観察及び解析装置に依れば、細胞膜を両面から観察及び解析することが出来る。従って、細胞膜で起こる生体機能を高感度に追跡することが可能となり、薬剤感受性試験に多量の細胞サンプルが不要となり、試験の実施を速やかに行うことが可能となる。更に、サンプルの差し替えの手間が省略され、速やかに細胞膜両面を観察及び解析することが可能となる。
（a）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる基板を模式的に示す斜視図である。（b）同図(a)に示す基板に形成される複数の穴を模式的に示す拡大平面図である。 （a）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる、基板に形成される複数の穴と、各穴の上に配置される細胞膜を模式的に示す拡大断面図である。（b）同図(a)に示す細胞膜の一部を除去し、残存した細胞膜の一部が基板の各穴の上に配置された状態を模式的に示す拡大断面図である。 本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる、基板に形成される複数の穴の上に配置される細胞膜と、各細胞膜が吸引される状態を模式的に示す拡大断面図である。 （a）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる、基板配置用部材の平面図である。（b）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる、基板配置用部材の正面図である。（c）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる、基板配置用部材の底面図である。 （a）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる基板配置用部材、及び受け皿の固定状態を示す平面図である。（b）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる基板配置用部材とその内部構造、及び基板と受け皿の固定状態を示す正面図である。（c）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる基板配置用部材、及び受け皿の固定状態を示す底面図である。 （a）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に備えられる基板配置用部材に対する基板の配置状態を模式的に示す拡大斜視図である。（b）同図(a)に示す基板配置用部材に基板が配置された状態を模式的に示す拡大斜視図である。 光透過窓、窓抑え部材、基板配置用部材、基板、及び受け皿の組み立て状態を示す断面図である。 光透過窓、窓抑え部材、基板配置用部材、基板、及び受け皿を組み立てた状態を示す断面図である。 （a）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に対する基板配置用部材の配置状態を模式的に示す斜視図である。（b）本発明の実施形態の細胞膜観察及び解析装置に基板配置用部材が配置された状態を模式的に示す斜視図である。 図８に示す、基板配置用部材に配置された基板を、倒立型顕微鏡で観察及び解析する状態を模式的に示す説明図である。 図８に示す、基板配置用部材に配置された基板を、正立型顕微鏡で観察及び解析する状態を模式的に示す説明図である。 本発明に係る実施例の細胞膜観察及び解析装置に備えられる、基板に形成される各穴の上に捕捉されて配置された、HeLa細胞膜の蛍光顕微鏡写真である。
　以下、図１～図１１を参照して、本発明に係る実施形態の細胞膜観察及び解析装置と、細胞膜観察及び解析方法を詳細に説明する。本実施形態の細胞膜観察及び解析装置は、細胞膜が配置された基板を備えると共に、基板上に配置された細胞膜を観察及び解析するものである。
　基板１として、外形寸法が奥行きＬを10ｍｍ、幅Ｗを10ｍｍ、厚みＴを0.2ｍｍで、図１（a）に示すように穴２が複数形成されている基板１を用意する。基板１は、光を透過する透明体な材料から成るか、それ以外の基板が挙げられる。透明体な材料とは、例えば石英ガラス又はサファイア等であり、石英ガラスは可視光の波長λが588ｎｍにおいて光透過率90％以上、屈折率1.5の物性を有するものとする。一方のサファイアは可視光の波長λが588ｎｍにおいて光透過率80％以上、屈折率1.8の物性を有するものとする。一方、透明体以外の基板とは、可視光域において光非透過性のプラスチックやシリコン等から成る基板か、又は基板１表面に遮蔽膜やシールを貼り付けて光非透過性とした基板を含むものとする。但し、遮蔽膜やシールを貼り付けた上で、穴２は形成されているものとする。
　図１（b）より穴２の平面形状は円形状であり、且つ穴２の断面形状は図示しないがストレート穴又はテーパ穴とする。穴２がテーパ状の断面形状に形成される場合、細胞膜の配置側を小径とする。穴２の数は細胞膜の生体機能の観察及び解析に最低限必要とされるサンプル数500個以上が必要であり、25個×25列で計625個形成する。各穴２が形成される範囲は１ｍｍ角内としている。各穴２の径φは2.0μｍ、各穴２の中心部どうしの間の間隔Ｄは40μｍ、更に各穴２のアスペクト比は100（基板の厚みＴ0.2ｍｍを穴径φ2.0μｍで除した値）とする。なお、図１（a）又は図６では図の見易さの点から穴２の数を省略して図示すると共に、基板１の外形寸法に対する各穴２の径φの比率を拡大して図示している。
　細胞膜としては、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳動物細胞、昆虫細胞等の動物細胞等の各細胞におけるがん細胞由来の細胞膜を観察及び解析の対象とする。更に、インキュベートされた細胞膜を対象のサンプルとしても良い。これら細胞の細胞膜を含むサンプルとしては、少なくとも500～10万個の細胞膜を含むサンプルが好ましい。
　細胞膜は緩衝液に分散され、その懸濁液が基板１の面上に滴下されることで、基板１の面上に細胞膜３が図２（a）に示すように丸まって吸着する。また、図７に示すような受け皿の中にも予め、所定量の第２の緩衝液を入れておく。その緩衝液としては、一例としてPBS（Phosphate Buffered Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を用いれば良いが、これに限定されない。また細胞膜を緩衝液で洗浄しても良い。
　更に丸まって基板１の面上に吸着された細胞膜３に超音波などの物理的刺激により、細胞膜３の丸まっていた部分が除去され、予め基板１の面上に吸着していた一部のみ図２（b）に示すように残存される。なお、基板１の表面に遮蔽膜やシールが予め貼り付けている場合は、細胞膜３を吸着させる基板１の表面は、遮蔽膜やシールを貼り付けた側の面の反対側の面とする。
　次に細胞膜３の一部が面上に吸着した基板１を、図４～図８に示すような基板配置用部材４に配置する。基板配置用部材４はステンレス鋼からなり、光透過窓５の配置部分と、基板１の配置部分、及び受け皿６の周縁部6aを受け入れるために周方向に形成された座ぐり部とを有するように形成される。
　基板配置用部材４において光透過窓５の配置部分は、基板１が備えられる側の他方側に設けられる。光透過窓は平面形状がＯ形のリング部材７で受け止められて前記配置部分の内部に配置され、更に上面から光透過窓５の抑え部材８で抑えられて固定され、基板配置用部材４に備えられる。光透過窓５は、可視光において光透過率90％以上、屈折率1.5の物性を有するガラス製であることが好ましい。可視光の波長としては、588ｎｍが挙げられる。また、抑え部材８は例えばポリテトラフルオロエチレン (PTFE：polytetrafluoroethylene)で作製され、四隅をボルト締めにより基板配置用部材４の一方の面側に固定される。このようにして、光透過窓５は基板配置用部材４から取り外し可能なように備えられる。
　基板配置用部材４の一方の面側には基板１の配置部分として、図４～図８に示すように直交する二軸に対して平行な方向に突き当て部分4a、4aが設けられる。突き当て部分4a、4aの高さは基板の厚みＴと同じかそれ以上とする。図４～図８（特に図６）に示すように、基板配置用部材４の一方の面側に設けられた直交する二軸方向の突き当て部分4a、4aに、細胞膜が滴下された基板１の最外面の直交する二辺が当接して、基板１が基板配置用部材４に配置される。このような配置状態の時に、配置用部材４内に設けられた採光用の穴4b上に、各穴２が全て配置されるように、予め基板１の外形寸法及び穴２の形成位置を設定しておくものとする。
　穴4bは直径5.0ｍｍ程度の円形に成形され、基板配置用部材４において図５（b）又、図７、図８に示すように、基板１の配置部分と、光透過窓５の配置部分の間を連結するように設けられる。従って、光透過窓５を透過した光によって、基板１の面上に滴下されている細胞膜３が照射される。更に、その穴4bの側面から直交方向に、第２の穴4cが形成され、図示しない真空ポンプ等のポンプへと、ジョイント口（ぐち）12を介して連結されている。穴4cも直径５ｍｍ程度の円形に形成される。
　その真空ポンプで吸引を行うことで図３に示されるように、前記穴4b及び4cから基板１の面上に吸着されている細胞膜３が、各穴２の中心部に吸い寄せられて移動すると共に、基板１の面上に対して押し付けられる。図３の各穴２から下方に向かう矢印によって、吸引方向を模式的に示している。吸引圧力は一例として800Ｐａ又は1000Ｐａで行うことで、細胞膜３を傷つけること無く、また穴２を細胞膜３が通過すること無く、細胞膜３を基板１の面上に穴２を介して押し続けることが可能となり、好ましい。
　吸引動作を行いながら基板配置用部材４を反転し、前記第２の緩衝液を入れた受け皿６を基板配置用部材４に嵌め込む。受け皿６は少なくとも底面がガラス製であり、周縁部6aはポリスチレン（polystyrene）で形成されている。その受け皿６の嵌め込みは、受け皿６の周縁部6aを前記座ぐり部内に嵌め込むことで行い、更に、周縁部6a外側の90°等間隔の四点を、図５に示すボールプランジャー９で係止することによって行われる。なお、ボールプランジャー９による周縁部6a外側の係止の図示を優先するため、図４（a）及び図５（a）のボールプランジャー９の設置位置と異なる位置であることを前提として、図４（b）及び図５（b）でボールプランジャー９を図示している。また、図４（b）及び図５（b）では、外観に現れるボールプランジャー９の図示を省略している。
　基板配置用部材４における突き当て部分4a、4aの高さ寸法と、基板１の厚みＴ、及び受け皿６に入れる第２の緩衝液の量の設定により、受け皿６が基板配置用部材４に嵌め込まれたときに、受け皿６の内面の底面が、基板配置用部材４の基板１の配置側の面上に当接し、更に当接したときに基板１の面上に配置されている細胞膜３が第２の緩衝液で封止されることとする。
　次に、ポンプによる吸引を継続しながら、基板配置用部材４を顕微鏡に載置し、細胞膜３を観察及び解析する。顕微鏡への基板配置用部材４の配置は、基板配置用部材４の抑え部材８側を上にして、吸引を行いながら基板配置用部材４の最外面に設けた二軸方向の突き当て部分4d、4dを、顕微鏡のステージ上に設けた受け入れ用のＬ字型の突き当て10に当接して行う（図９参照）。従って、突き当て10が顕微鏡における基板配置用部材４の配置箇所となる。突き当て部分4d、4dはそれぞれ基板配置用部材４の最外面の少なくとも一部に設けられる。本発明では、顕微鏡が細胞膜観察及び解析装置を構成しているものとする。顕微鏡としては、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡（原子間力顕微鏡含む）、共焦点顕微鏡、レーザ顕微鏡を使用すれば良い。なお図９では、外観に現れるボールプランジャー９及びジョイント口12の図示を省略している。
　突き当て部分4d、4dも前記突き当て部分4a、4aと同様に、直交する二軸に対して平行な方向にそれぞれ設けられる。従って、図４（c）及び図５（c）に示すように、各突き当て部分4a、4aと各突き当て部分4d、4dは、それぞれ互いに平行に設けられることとなる。従って、顕微鏡のステージにＬ字型の突き当て10を用意しておけば、ステージの二軸方向と基板１の穴の二軸方向がそれぞれ平行となり、細胞膜３を観察及び解析する際に、細胞膜３の個数測定を容易に行うことが可能となる。
　次に、ポンプの吸引により基板１の面上に押しつけられている各細胞膜３に、蛍光顕微鏡等によるイメージング観察及び解析（以下、説明の便宜上「蛍光観察及び解析」と記載）を行う。本発明に係る蛍光観察及び解析は、大きく分けて２つの観察法及び解析法が挙げられる。第１は、サンプルである細胞膜３に蛍光染色剤を付着させ、更にその蛍光染色剤に励起光を照射することで赤や緑に発光させ、細胞膜３を蛍光観察及び解析することである。第２は、各細胞膜３の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析することである。
　最初に、蛍光染色剤を使用する観察法及び解析法を説明する。図１０に示す顕微鏡は、対物レンズ11が顕微鏡のステージ13の穴を介して、図の下側に設けられた倒立型の顕微鏡による観察及び解析状態を示している。倒立型顕微鏡による蛍光観察及び解析では、対物レンズ11を通して下から上に向かって励起光を入れ、サンプルである細胞膜３に付けた蛍光染色剤に励起光が照射することで赤や緑に発光し、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を蛍光観察及び解析することが可能となる。
　また倒立型顕微鏡による可視光観察及び解析（透過観察及び解析）は、図示しない透過照明ユニットがステージ13側に付属しているため、可視光観察及び解析を行う時に透過照明ユニットを細胞膜３の上側に持ってきて、図１０の上から下に向けて可視光域の照明光を当てることで、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を観察及び解析することが可能となる。
　また顕微鏡の構造は倒立型に限定されず、他にも正立型の顕微鏡に基板配置用部材４を載置しても良い。図１１に示す顕微鏡は、対物レンズ11が図１１の上側に設けられた正立型の顕微鏡による観察及び解析状態を示している。
　正立型顕微鏡による観察及び解析の場合は、対物レンズが図１１の上側となり、基板１の上側から観察及び解析することとなる。蛍光観察及び解析は、対物レンズ11を通して上から下に向かって励起光を入れ、サンプルである細胞膜３に付けた蛍光染色剤に励起光が照射することで赤や緑に発光し、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を蛍光観察及び解析することが可能となる。
　また可視光観察及び解析（透過観察及び解析）は、図示しない透過照明ユニットがステージ13側に付属しているため、可視光観察及び解析を行う時に透過照明ユニットを細胞膜３の下側付近に持ってきて、図１１の下から上に向けて可視光域の照明光を当てることで、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を観察及び解析することが可能となる。
　或いは正立型顕微鏡においては、基板配置用部材４を裏返して基板２の配置側を対物レンズ11と対向するように配置することで、細胞膜３全体の様子や形状又は輪郭を可視光で観察及び解析しても良い。この場合、受け皿６は使用しない。基板２の配置側を対物レンズ11と対向することで、細胞膜３と対物レンズ11を近づけることが出来るので、より高倍率で細胞膜３を観察及び解析することが可能となる。
　次に、各細胞膜３の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析する観察法及び解析法を説明する。各穴２上に配置される細胞膜３は、採取した細胞膜の表裏状態を維持している。そのため、細胞膜３の表面側と裏面側へのタンパク質や薬物などの標的分子の結合性を独立して評価可能である。例えば、細胞膜３の面上に結合した蛍光ラベル化標的分子の濃度依存的な結合量を解析し、標的分子の細胞膜３両面への親和性を見積もる事が可能となる。従って、本発明では、各細胞膜３の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析することが可能となる。図１０に示す倒立型顕微鏡による蛍光観察及び解析では、細胞膜３の面上に蛍光ラベル化標的分子を結合させ、対物レンズ11を通して下から上に向かって励起光を入れることで、標的分子の細胞膜３両面のうち対物レンズ11側の面への親和性を見積もる事が可能となる。
　また、図１１に示す正立型顕微鏡による蛍光観察及び解析では、細胞膜３の面上に蛍光ラベル化標的分子を結合させ、対物レンズ11を通して上から下に向かって励起光を入れることで、標的分子の細胞膜３両面のうち対物レンズ11と反対側の面への親和性を見積もる事が可能となる。
　細胞膜３を可視光観察及び解析する際に、基板１が透明体な材料で構成されている場合は、細胞膜３全体の様子や形状または輪郭を明確に観察及び解析することが可能となる。一方、基板１が可視光域で光非透過性のプラスチックやシリコン等で構成されているか、基板１の表面に遮蔽膜やシールを貼り付けて光非透過性の基板とした場合は、細胞膜３を可視光観察及び解析する際、穴２の開口面積と同面積分の細胞膜のみ観察及び解析可能となる。しかし、基板１を透過する光の光量が各穴２の全開口面積分に応じた一定値となるため、定量的な観察や解析が可能となる。
　以上、本発明に係る細胞膜観察及び解析装置及び細胞膜観察及び解析方法に依れば、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳動物細胞、昆虫細胞等の動物細胞等の各細胞におけるがん細胞由来の細胞膜の生体機能を、高感度に観察及び解析することが可能となった。
　更に、細胞膜３を両面から観察及び解析することが出来る。従って、細胞膜３で起こる生体機能を高感度に追跡することが可能となり、薬剤感受性試験に多量の細胞サンプルが不要となり、試験の実施を速やかに行うことが可能となる。更に、サンプルの差し替えの手間が省略され、速やかに細胞膜３両面を観察及び解析することが可能となる。また、細胞膜３両面または任意の片面に、所望の生体反応を施すことも可能となる。
　更に、ポンプの吸引により細胞膜３が分散されている緩衝液（懸濁液）又は第２の緩衝液が吸引され、穴4bを通って光透過窓５に接触して光透過窓５が汚れても、光透過窓５は基板配置用部材４から取り外し可能なように備えられているため、光透過窓５の洗浄を容易に行うことが出来る。
　以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は以下の実施例にのみ限定されるものではない。
　本実施例に係る細胞膜観察及び解析装置には、倒立型の顕微鏡を用いると共に、透明体からなる基板を備える。基板は、外形寸法が奥行き10ｍｍ、幅10ｍｍ、厚み0.2ｍｍの石英ガラスからなるものを用意し、可視光の波長λが588ｎｍにおいて光透過率90％以上、屈折率1.5の物性を有する。その基板に形成される穴は、平面形状が円形状であり、断面形状がストレート穴に形成されている。穴は25個×25列の計625個形成した。各穴の径（直径）は2.0μｍ、各穴の中心部どうしの間の間隔は40μｍ、更に各穴のアスペクト比は100とした。
　観察及び解析対象の細胞膜はHeLa細胞由来の細胞とし、MEM培地で培養された細胞を用いた。90%程度のコンフルエンシーに達したHeLa細胞を 10ｃｍ ディッシュ準備した。HeLa細胞を含むサンプルとして、１ｍｌ当たり50万個の細胞を含むサンプルを準備した。なお、MEM ５ｍｌに対して３，３’－ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩(DiO) (１ｍｇ／ｍｌ)を10μｌ添加し、37℃、5%CO2の条件で10分インキュベートした。
　次にHeLa細胞を 緩衝液Ａ（２ｍＭ CaCl2、10ｍＭ Tris／HCl pH 7.5、150ｍＭ NaCl）５ｍｌで洗浄した。更に、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａに、25ｍＭ フォルムアルデヒドと２ｍＭ DTTを加えたもの）をHeLa細胞に加えた。
　次に、37℃、５％CO2の条件で30分インキュベートし、その上澄みを蛍光染色剤で染色したGPMVs （giant plasma membrane vesicles）懸濁液とした。GPMVsは培養細胞から切り出された10μｍ程度の球状の細胞膜構造体である。
　そのGPMVs懸濁液(500,000個／ml)を50μl、基板上に滴下し、大気圧の少なくとも20％程度の減圧下に１分放置した。基板配置用部材、光透過窓、光透過窓の抑え部材、及び受け皿は、前記実施形態で記載した物を用い、各部品間の配置や組み立ても前記実施形態で記載した通りとした。
　なおGPMVsの吸引には真空ポンプを用い、吸引圧力は800Ｐａとした。その真空ポンプによる吸引を継続しながら、基板配置用部材を倒立型顕微鏡に載置し、蛍光染色剤による染色処理を行った後、紫外または可視光領域の光を照射して、蛍光観察及び解析を行うことで、HeLa細胞膜を観察及び解析した。その蛍光顕微鏡写真を図１２に示す。以上により、本発明の目的が達成される。
　　　１　　　　　基板
　　　２　　　　　穴
　　　３　　　　　細胞膜
　　　４　　　　　基板配置用部材
　　　4a、4d　　　突き当て部分
　　　4b、4c　　　穴
　　　５　　　　　光透過窓
　　　６　　　　　受け皿
　　　6a　　　　　受け皿の周縁部
　　　７　　　　　リング部材
　　　８　　　　　光透過窓の抑え部材
　　　９　　　　　ボールプランジャー
　　　10　　　　　突き当て
　　　11　　　　　顕微鏡の対物レンズ
　　　12　　　　　ポンプへのジョイント口
　　　13　　　　　ステージ

Claims (8)

  1. 　顕微鏡、及び複数の穴を有する基板で少なくとも構成され、基板の各穴の上にそれぞれ細胞膜が配置されて基板上に細胞膜が配置され、穴を介して細胞膜が吸引されながら細胞膜が緩衝液に浸漬され、更に緩衝液が封止され、細胞膜を観察及び解析することを特徴とする細胞膜観察及び解析装置。
  2. 　前記基板を配置して備える基板配置用部材が更に備えられると共に、直交する二軸方向の突き当て部分が、基板配置用部材の最外面の少なくとも一部と、前記基板を配置する配置部分に、それぞれ二軸に対して平行に設けられていることを特徴とする請求項１記載の細胞膜観察及び解析装置。
  3. 　前記基板配置用部材で前記基板が備えられる側の他方側に、光を透過する光透過窓が備えられると共に、光透過窓を透過した光で前記細胞膜が照射され、
    　更に、光透過窓が前記基板配置用部材から取り外し可能であることを特徴とする請求項２記載の細胞膜観察及び解析装置。
  4. 　前記細胞膜の互いの面での生体機能が、面ごとに別々に解析されることを特徴とする請求項１～３の何れかに記載の細胞膜観察及び解析装置。
  5. 　前記光透過窓が、可視光の光透過率90％以上であるガラス製であることを特徴とする請求項３又は４記載の細胞膜観察及び解析装置。
  6. 　複数の穴を有する基板を用意し、次に細胞膜を緩衝液に分散して懸濁液を作製し、その懸濁液を基板面上に滴下し、次に各穴を介して細胞膜をポンプで吸引し、各穴の上に細胞膜を配置し、次に細胞膜の吸引を継続しながら細胞膜を第２の緩衝液に浸漬して、第２の緩衝液を封止し、細胞膜を顕微鏡により観察及び解析することを特徴とする細胞膜観察及び解析方法。
  7. 　前記基板を配置して備える基板配置用部材を更に用意し、直交する二軸方向の突き当て部分を基板配置用部材の最外面の少なくとも一部と、前記基板を配置する配置部分に、それぞれ二軸に対して平行に設け、
    　前記基板の最外面の直交する二辺を、前記基板の配置部分の突き当て部分に当接して、前記基板を基板配置用部材の、基板の配置部分に配置し、
    　次に、基板配置用部材の最外面の直交する二軸方向の突き当て部分を、前記顕微鏡の基板配置用部材の配置箇所の直交する二軸方向の突き当てに当接して、基板配置用部材を前記顕微鏡の配置箇所に配置することを特徴とする請求項６記載の細胞膜観察及び解析方法。
  8. 　前記細胞膜の互いの面での生体機能を、面ごとに別々に解析することを特徴とする請求項６又は７記載の細胞膜観察及び解析方法。
PCT/JP2015/052264 2014-01-30 2015-01-28 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法 WO2015115448A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/115,420 US20170167957A1 (en) 2014-01-30 2015-01-28 Cell membrane observation and analysis device and cell membrane observation and analysis method
JP2015559957A JP6630875B2 (ja) 2014-01-30 2015-01-28 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法
EP15743933.2A EP3101421A4 (en) 2014-01-30 2015-01-28 Cell membrane observation and analysis device and cell membrane observation and analysis method
KR1020167020726A KR20160113136A (ko) 2014-01-30 2015-01-28 세포막 관찰 및 해석 장치, 세포막 관찰 및 해석 방법

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-015080 2014-01-30
JP2014015080 2014-01-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015115448A1 true WO2015115448A1 (ja) 2015-08-06

Family

ID=53757021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/052264 WO2015115448A1 (ja) 2014-01-30 2015-01-28 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20170167957A1 (ja)
EP (1) EP3101421A4 (ja)
JP (1) JP6630875B2 (ja)
KR (1) KR20160113136A (ja)
WO (1) WO2015115448A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106706397A (zh) * 2017-01-24 2017-05-24 贵州大学 一种昆虫用解剖板

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0690205B2 (ja) 1989-07-18 1994-11-14 株式会社エスアールエル 薬剤感受性試験方法
JPH10165166A (ja) * 1996-12-10 1998-06-23 Takayuki Tsuji 細胞固定用プレ−ト及び細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法
JP2008275481A (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 生体分子機能構造解析装置およびこれを用いた生体分子機能構造解析方法
JP2009204407A (ja) * 2008-02-27 2009-09-10 National Institutes Of Natural Sciences パッチクランプ素子用基板、平面基板型パッチクランプ素子及び細胞イオンチャンネル活性測定方法
WO2012002515A1 (ja) * 2010-06-30 2012-01-05 東ソー株式会社 粒子固定用構造体、及び、粒子解析装置
WO2013094418A1 (ja) * 2011-12-20 2013-06-27 独立行政法人科学技術振興機構 プレーナーパッチクランプ装置、該装置用電極部及び細胞イオンチャンネル電流計測方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2295441A1 (fr) * 1974-03-26 1976-07-16 Anvar Porte-objet microthermometrique
JP2650011B2 (ja) 1992-09-08 1997-09-03 移動通信システム開発株式会社 移動通信システムのチャネル割当て方式
US6758961B1 (en) * 1997-12-17 2004-07-06 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Positioning and electrophysiological characterization of individual cells and reconstituted membrane systems on microstructured carriers
DE19948473A1 (de) * 1999-10-08 2001-04-12 Nmi Univ Tuebingen Verfahren und Vorrichtung zum Messen an in einer flüssigen Umgebung befindlichen Zellen
US7330306B2 (en) * 2003-11-25 2008-02-12 Leica Microsystems Cms Gmbh Interchangeable microscope stage drive assembly
EP1901067A3 (en) * 2004-08-03 2009-05-13 On-Chip Cellomics Consortium Cellomics system
JP4585280B2 (ja) * 2004-11-08 2010-11-24 一般社団法人オンチップ・セロミクス・コンソーシアム 細胞チップおよび細胞改変方法および細胞制御方法
JPWO2006022092A1 (ja) * 2004-08-25 2008-05-08 松下電器産業株式会社 細胞電位測定プローブ
US8003380B2 (en) * 2006-01-04 2011-08-23 Agency For Science, Technology And Research High throughput cell-based assays fabricated with integrated silicon and cell culture technologies
DE102007002913A1 (de) * 2007-01-19 2008-07-24 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Chip für optische Einzeltransporter-Analyse
EP1990626A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-12 CSEM Centre Suisse d'Electronique et de Microtechnique SA Probe arrangement for electrophysiological analysis in an AFM
JP2008295376A (ja) * 2007-05-31 2008-12-11 Fujitsu Ltd 細胞捕捉プレート、マイクロインジェクション装置、および細胞捕捉プレートの製造方法
JP5278913B2 (ja) * 2007-08-01 2013-09-04 国立大学法人東京農工大学 単一細胞捕捉用マイクロ流路デバイス
JP5581851B2 (ja) * 2009-12-25 2014-09-03 ソニー株式会社 ステージ制御装置、ステージ制御方法、ステージ制御プログラム及び顕微鏡
JP5278625B2 (ja) * 2011-01-13 2013-09-04 パナソニック株式会社 センサチップおよびその保管方法
US8673628B2 (en) * 2011-06-10 2014-03-18 Essen Instruments, Inc. Methods and apparatus for improving in vitro measurements using boyden chambers
JP2014160209A (ja) * 2013-02-20 2014-09-04 Olympus Corp ステージ装置

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0690205B2 (ja) 1989-07-18 1994-11-14 株式会社エスアールエル 薬剤感受性試験方法
JPH10165166A (ja) * 1996-12-10 1998-06-23 Takayuki Tsuji 細胞固定用プレ−ト及び細胞固定用プレ−トへの細胞の固定方法
JP2008275481A (ja) * 2007-04-27 2008-11-13 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 生体分子機能構造解析装置およびこれを用いた生体分子機能構造解析方法
JP2009204407A (ja) * 2008-02-27 2009-09-10 National Institutes Of Natural Sciences パッチクランプ素子用基板、平面基板型パッチクランプ素子及び細胞イオンチャンネル活性測定方法
WO2012002515A1 (ja) * 2010-06-30 2012-01-05 東ソー株式会社 粒子固定用構造体、及び、粒子解析装置
WO2013094418A1 (ja) * 2011-12-20 2013-06-27 独立行政法人科学技術振興機構 プレーナーパッチクランプ装置、該装置用電極部及び細胞イオンチャンネル電流計測方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3101421A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106706397A (zh) * 2017-01-24 2017-05-24 贵州大学 一种昆虫用解剖板

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2015115448A1 (ja) 2017-03-23
EP3101421A1 (en) 2016-12-07
KR20160113136A (ko) 2016-09-28
EP3101421A4 (en) 2017-08-30
US20170167957A1 (en) 2017-06-15
JP6630875B2 (ja) 2020-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Roddy et al. Identification of cellular sections with imaging mass spectrometry following freeze fracture
Myers et al. Single-platelet nanomechanics measured by high-throughput cytometry
Kang et al. Mini-pillar array for hydrogel-supported 3D culture and high-content histologic analysis of human tumor spheroids
WO2023045494A1 (zh) 一种药物的筛选方法以及三维肿瘤切片模型的培养方法
CN102782561A (zh) 对生物有机体进行时间相关的显微镜检查的系统和方法
JP2005529341A (ja) サンプルを含む流体のｓｅｍ検査のための方法
FR3061203A1 (fr) Chambre de culture et d&#39;imagerie d&#39;echantillons biologiques
EP3019625B1 (en) New use of a fluidic device
US9983197B2 (en) Low-cost portable microfluidic system for cell migration
JP2024023740A (ja) 組織の特性評価とスクリーニングのために改善したサイトメトリー
US20190046978A1 (en) Multiwell instrument
WO2015115448A1 (ja) 細胞膜観察及び解析装置、細胞膜観察及び解析方法
Cheong et al. Using a microfluidic device for high-content analysis of cell signaling
KR20150059218A (ko) 슬라이드 분리형 세포 배양 접시 및 이를 이용한 세포 분석 방법
Gibson et al. Fluorescing the electron: strategies in correlative experimental design
Woo et al. Comparative analyses of clearing efficacies of tissue clearing protocols by using a punching assisted clarity analysis
Alfano et al. Lysyl-oxidase dependent extracellular matrix stiffness in Hodgkin lymphomas: mechanical and topographical evidence
Zarnescu et al. Label-free characterization of vitrification-induced morphology changes in single-cell embryos with full-field optical coherence tomography
Sibert et al. Whole-cell cryo-electron tomography of cultured and primary eukaryotic cells on micropatterned TEM grids
Sakai et al. Membrane-integrated glass chip for two-directional observation of epithelial cells
Raja et al. Development path and current status of the NANIVID: a new device for cancer cell studies
von Philipsborn et al. Substrate-bound protein gradients for cell culture fabricated by microfluidic networks and microcontact printing
Axelsson Detection of cytokine-secreting cells by enzyme-linked Immunospot (ELISpot)
JP3983593B2 (ja) 磁性粒子懸濁液測定装置
Liu et al. A Microfluidic 3D‐Tumor‐Spheroid Model for the Evaluation of Targeted Therapies from Angiogenesis‐Related Cytokines at the Single Spheroid Level

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15743933

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015559957

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20167020726

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15115420

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015743933

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015743933

Country of ref document: EP