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WO2014207402A1 - Anticorps dirigés contre le canal sodique nav1.9 humain et leurs utilisations en diagnostic - Google Patents

Anticorps dirigés contre le canal sodique nav1.9 humain et leurs utilisations en diagnostic Download PDF

Info

Publication number
WO2014207402A1
WO2014207402A1 PCT/FR2014/051643 FR2014051643W WO2014207402A1 WO 2014207402 A1 WO2014207402 A1 WO 2014207402A1 FR 2014051643 W FR2014051643 W FR 2014051643W WO 2014207402 A1 WO2014207402 A1 WO 2014207402A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nav
antibody
seq
human
peptide
Prior art date
Application number
PCT/FR2014/051643
Other languages
English (en)
Inventor
Marcel Crest
Patrick Delmas
Aurélie LONIGRO-RAME
Nancy OSORIO
Original Assignee
Galderma Research & Development
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite D'aix-Marseille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Galderma Research & Development, Centre National De La Recherche Scientifique, Universite D'aix-Marseille filed Critical Galderma Research & Development
Publication of WO2014207402A1 publication Critical patent/WO2014207402A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the invention relates to antibodies directed against the Nav 1.9 sodium channel and their use in the diagnosis of pathologies associated with enteric or orofacial pain.
  • Voltage-dependent sodium channels are essential actors in the initiation and propagation of action potentials at so-called "excitable" cells. These sodium channels are mainly expressed at the level of neurons of the central and peripheral nervous system and at the level of muscle cells. These are transmembrane proteins comprising a broad alpha (a) subunit of approximately 260 kDa associated with one or more beta subunits of 33 to 38 kDa.
  • the alpha subunit forms the heart of the channel and comprises four homologous membrane domains (I-IV), each consisting of 6 transmembrane segments (S1-S6).
  • the membrane domains of the alpha subunit are interconnected by large intracellular loops that include many regulatory sites.
  • the alpha subunit is responsible for the channel conductance and selectivity properties, while the beta subunits are involved in the stabilization and kinetic properties of the channel.
  • 10 isoforms for the alpha subunit have been identified in humans. The name assigned to these isoforms contains the symbol of the transported ion (Na), with the subscript as the regulating element (the voltage v).
  • the following figures indicate the subfamily of genes and the number associated with the isoform considered.
  • the main gene subfamily identified includes Navl isoforms. l at Navl.9. An additional isoform, further away, Nax was also identified.
  • the percentage sequence identity between Navl isoform differences. l at Nav 1.9 is at least 60%.
  • Navl.9 are differentiated by, among other things, their sensitivity to tetrodotoxin (TTX), a very potent and selective blocker of sodium channels, and by their tissue distribution.
  • TTX tetrodotoxin
  • the Navl.1, Navl.4, Navl.6 and Nav 1.7 isoforms are said to be TTX-sensitive with EC50s of the order of nanomolar.
  • the Navl.5, Navl.8 and Navl.9 isoforms are considered, in turn, resistant to TTX.
  • TEC50 of the TTX for Nav 1.9 is about 200 ⁇ .
  • the tissue distribution the Navl isoforms.
  • Nav 1.9 was initially detected in the sensory neurons of trigeminal ganglia and spinal ganglia. Invalidation experiments of the Nav 1.9 gene confirmed the involvement of this sodium channel in nociception, in particular in the hyperexcitability of nociceptors and hyperalgesia associated with inflammation. More recently, Padilla et al.
  • Nav 1.9 is expressed at the nerve endings of the trigeminal nerve, and at the afferent sensory neurons of the myenteric plexus. and submucosal duodenum. This tissue distribution suggests that Nav 1.9 may be involved in the perception of orofacial pain and some intestinal disorders.
  • Lolignier et al. (PlosOne, 2011, e23083) showed an overexpression of Nav 1.9 in nerve fibers innervating an inflammatory focus in a mouse model of acute inflammation.
  • the subject of the invention is an antibody directed against human Nav 1.9 characterized in that said antibody binds to an epitope included in a peptide of sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3.
  • the antibody according to the invention is suitable for use for the detection or quantification of Nav 1.9 in a biological sample, preferably a tissue sample.
  • the antibody according to the invention may be a polyclonal antibody, preferably an IgG or IgM isotype, or a monoclonal antibody.
  • the antibody can be chimeric or humanized.
  • the antibody according to the invention does not bind to Nav 1.5 and Nav 1.7, preferably human.
  • the antibody according to the invention is obtained from antibodies, or cells expressing antibodies, from a non-human animal immunized with an antigenic compound comprising at least one peptide having at least one 90% sequence identity with SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3.
  • the antigenic compound comprises at least one peptide of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a peptide having a sequence which differs from SEQ ID NO: 1, NO: 2. or No. 3 under one, two, or three amino acid modifications.
  • the antibody according to the invention may be coupled to a detection means, preferably selected from an enzyme producing a detectable signal such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, 3-galactosidase, or glucose-6-phosphate dehydrogenase , a chromophore, a fluorescent compound, a luminescent compound, a radionuclide such as
  • a metal particle for example a gold nanoparticle, a biotin, a streptavidin, an avidin, a sugar or a lectin.
  • a further object of the invention is a method for preparing an antibody directed against human Nav 1.9 comprising a step of immunizing a non-human animal with an antigenic compound comprising at least one peptide having at least 90% of sequence identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the antigenic compound comprises at least one peptide of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a peptide having a sequence which differs from SEQ ID NO: 1, NO: 2. or No. 3 under one, two, or three amino acid modifications.
  • the antigenic compound may further comprise a carrier protein coupled to one or more copies of said peptide.
  • the method of preparation according to the invention may further comprise the recovery of the antibody against human Nav 1.9 from the blood plasma of the non-human animal after immunization.
  • the method of preparation according to the invention may comprise the production of the antibody directed against Nav 1.9 by a hybridoma obtained from a cell expressing antibodies, preferably a B lymphocyte, originating from of the non-human animal, after immunization.
  • the invention also relates to the use of an antibody as described above for the detection or quantification of Nav 1.9 in a human biological sample.
  • the biological sample may be a surgical residue, a biopsy or a post-harvest sample. mortem.
  • a further object of the invention is the use of said antibody for the diagnosis, prognosis and / or in vitro prediction of a pathology, preferably of an inflammatory nature, associated with enteric pain or orofacial pain.
  • Pathologies associated with enteric pain include irritable bowel syndrome, inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative colitis.
  • Pathologies causing orofacial pain include, among others, dental hypersensitivity (sensitive teeth), pulpitis, toothache, maxillary muscle pain or temporomandibular joints, neuralgia, preferably idiopathic, trigeminal nerve, headache and an idiopathic burn of the tongue and mouth.
  • the antibody against Nav 1.9 according to the invention is used to detect or quantify Nav 1.9 in a human tissue sample comprising a ganglion and / or a sensory nerve fiber of the intestinal tract or of an orofacial area.
  • the tissue sample can thus be selected from a sample of dental pulp, a sample of myenteric ganglia, a sample of submucosal plexus ganglia, a sample comprising nerve fibers of the myenteric or submucosal plexus.
  • Detection or quantification of Nav 1.9 by the antibody according to the invention can be carried out by Western blot, by immunoassay or by immunostaining.
  • a particularly preferred method of detection or quantification of Nav 1.9 is immunohistochemistry.
  • the subject of the present invention is also a kit, or the use of a kit, for the diagnosis of a pathology associated with visceral pain or orofacial pain, comprising at least one antibody directed against Nav 1.9 according to US Pat. invention and optionally means for detecting said antibody.
  • Figure 1 shows the immunostaining results of HEK cells after binding to 2% PAF (paraformaldehyde) with an anti-Myc monoclonal antibody and the anti-hNav 1.9 Rbaa4 antibody.
  • Figure la cells transfected with phNavl.9-myc.
  • Figurelb untransfected cells.
  • Figure 2 shows the immunolabeling results with the Rbaa4 antibody of cells co-transfected with hNav 1.5 and a plasmid encoding GFP (Figure 2A) or hNav 1.7 and a plasmid encoding GFP ( Figure 2B). While the signal emitted by GFP is clearly visible, labeling with Rbaa4 cells is very weak or non-existent.
  • Figure 3 shows western blots made on protein extracts of HEK cells not transfected or transfected with a plasmid encoding hNav 1.9-myc.
  • NT lysate of non-transfected cells (negative control)
  • T lysate of transfected cells.
  • Rbaa4 and Rbaao antibodies recognize a protein band
  • Figure 4 shows the immunostaining of a cross section of colon chemically bound to paraformaldehyde. From top to bottom: labeling with an anti HuC / D antibody, labeling with the Rbaa4 antibody, comarking HuC / D and Nav 1.9. *: immunopositive neurons for Nav 1.9, 0 : immunonegative neurons for Nav 1.9.
  • Figure 5 shows the immunostaining of a cross section of colon chemically bound to paraformaldehyde by an anti-HuC / D antibody (Figure 5A) and by the Rbaao antibody (Figure 5B). The co-marking result is shown in Figure 5C.
  • * immunopositive neurons for Nav 1.9
  • 0 immunonegative neurons for Nav 1.9.
  • Figure 6 shows the immunostaining of a cross section of cryofixed colon. From top to bottom: labeling with an anti-NF200 antibody, labeling with the antibody 3881.1, comarquage. *: immunopositive neurons for Nav 1.9, 0 : immunonegative neurons for Nav 1.9.
  • Figure 7 shows the immunostaining of a paraformaldehyde-fixed dental root pulp sample by an anti-peripherin antibody (Figure 7A) and by the antibody Rbaa4 ( Figure 7B). The co-marking result is shown in Figure 7C.
  • Figure 8 shows the immunostaining of a paraformaldehyde-fixed root dental pulp sample by an anti-peripherin antibody (Figure 8A) and by the Rbaao antibody (Figure 8B). The co-marking result is shown in Figure 8C.
  • Figure 9 shows the immunostaining of a sub-odonblastic plexus sample (coronary dental pulp) cryofixed with anti-peripherin antibody (Figure 9A) and antibody 3881.1 (Figure 9B). The co-marking result is shown in Figure 9C.
  • Figure 10 shows the immunostaining of a cryofixed root canal sample of dental pulp with an anti-peripherin antibody (Figure 10A) and antibody 3881.1 (Figure 10B). The co-marking result is shown in Figure 10C.
  • Figure 11 shows the immunostaining of a sample of trigeminal ganglion (post-mortem sample) cryofixed with an anti-NF200 antibody (Figure 11A) and by the Rbaao antibody ( Figure 11B). The co-marking result is shown in Figure 11C.
  • Figure 11A shows the immunostaining of a sample of trigeminal ganglion (post-mortem sample) cryofixed with an anti-NF200 antibody (Figure 11A) and by the Rbaao antibody ( Figure 11B).
  • Figure 11C The co-marking result is shown in Figure 11C.
  • Applicants have prepared three polyclonal antibodies - hereinafter referred to as Rbaa4, 3881-1 and Rbaao - directed against human Nav 1.9. These antibodies were obtained by immunizing a non-human animal (rabbit) with an antigenic compound comprising a peptide of sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3.
  • the peptide of sequence SEQ ID No. 1 corresponds to a fragment of the N-terminal part of human Nav 1.9 (hNav 1.9) whereas the peptides of sequence SEQ No. 2 and SEQ ID No. 3 are fragments originating from intracellular loops. linking the transmembrane domains I-II and II-III of hNav 1.9, respectively.
  • the present invention relates to antibodies directed against human Nav 1.9, and their method of preparation.
  • the invention also relates to the use of these antibodies in the diagnosis of pathologies associated with orofacial or enteric pain, preferably of an inflammatory nature.
  • the invention relates to an antibody against human Nav 1.9 (also referred to herein as hNav 1.9 and Nav 1.9).
  • This antibody is characterized in that it is capable of binding to an epitope included in a peptide of sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3.
  • Nav 1.9 or "hNav 1.9” means the human subunit Nav 1.9 Nav 1.9 constitutive of certain sodium channels dependent on the potential (or voltage-dependent) human.
  • the alpha Nav 1.9 subunit is encoded by the SCN11A gene which is also referred to as NaN, SCN12A and SNS-2 in the literature.
  • the identifier number of the human Nav 1.9 gene in the NCBI gene base is 11289 (NCBI Gene ID).
  • NCBI Gene ID The human Nav 1.9 protein sequence is notably described in the UniProt sequence database (Sequence reference: Q9UI33) and that of NCBI (NCBI sequence reference: NP_054858). Regarding the mRNA for Nav 1.9, or even the NCBI reference sequence: NM_014139.
  • the peptide of sequence SEQ ID No. 1 corresponds to a fragment of the N-terminal part of hNav 1.9 (amino acids of position 31 to 47 of hNavl.9) whereas the peptides of sequence SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3 are fragments from the intracellular loops connecting the membrane domains I-II and II-III of hNav 1.9, respectively. More specifically, the peptide of SEQ ID No. 2 corresponds to the fragment ranging from amino acid 473 to amino acid 488 of the sequence of hNav1.9 and the peptide of SEQ ID No. 3 corresponds to the fragment ranging from amino acid 945 to amino acid 961 of the sequence of Nav 1.9.
  • anti-Nav 1.9 antibody or "antibody against Nav 1.9” means any antibody or polypeptide comprising an antibody fragment capable of recognizing and specifically binding to an epitope of the human alpha Nav 1.9 subunit. said epitope preferably having an amino acid sequence included in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • Nav 1.9 may be combined with other proteins, for example a beta subunit, and / or expressed at the level of a cell membrane.
  • the antibodies of the invention can bind to Nav 1.9 present in an isolated form (e.g. in a pre-purified, purified and / or non-entrenched form in a cell membrane).
  • the antibodies according to the invention are capable of recognizing Nav 1.9 expressed at the level of a cell membrane and / or in the form of cytoplasmic vesicles.
  • the antibodies according to the invention are particularly suitable for use for the detection or quantification of Nav 1.9 in a biological sample, preferably a tissue sample.
  • the antibodies according to the invention can be used to detect or quantify Nav 1.9 by immunolabeling and / or immunoassay and / or western blotting techniques.
  • the antibodies according to the invention are particularly suitable for use in the detection or quantification of Nav 1.9 by immunohistochemistry.
  • the samples are human biological samples that is to say samples that are previously collected or taken from a human being. The preferred biological samples according to the invention are described in detail below.
  • the Applicants are of the opinion that the detection properties of the antibodies according to the invention result from the specific Nav 1.9 epitopes against which the antibodies are directed. Indeed, the Applicants have shown that antibodies directed against other regions of Nav 1.9 - for example against the peptide of SEQ ID NO: 4 of the intracellular loop binding the membrane domains II-III of Nav 1.9 - exhibit either a too low sensitivity (ie, an affinity that is too low for Nav 1.9) and / or a too low specificity for be used for tissue detection or quantification of Nav 1.9.
  • the antibody according to the invention has been obtained from an antibody, preferably a plasma antibody, or a cell expressing antibodies, said antibody or said cell originating from an immunized non-human animal. with an antigenic compound comprising at least one peptide having at least 90% sequence identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the antigenic compound comprises at least one peptide of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or a peptide having a sequence which differs from SEQ ID NO: 1, NO: 2. or No. 3 under one, two, or three amino acid modifications.
  • the antigenic compound comprises at least one peptide of sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3.
  • the term "antigenic compound” means a compound whose administration to a non-human animal, alone or in combination with an immunoadjuvant, is capable of inducing a humoral immune reaction.
  • the antigenic compound comprises several copies of said peptide or said peptides described above, possibly coupled together.
  • the antigenic compound comprises a carrier protein to which is grafted one or more copies of a peptide or more peptides as defined above.
  • an antibody according to the invention may be any antibody or polypeptide comprising an antibody fragment capable of recognizing and binding specifically to human Nav 1.9, preferably to an epitope included in a Nav 1.9 region of sequence selected from SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3.
  • the antibody according to the invention may be a monoclonal or polyclonal antibody.
  • polyclonal antibodies or “polyclonal antibody” means a mixture of antibodies directed against several epitopes.
  • the term “monoclonal antibody” or “monoclonal antibody” means an antibody or a set of antibodies that recognize the same and unique epitope.
  • the antibody according to the invention may be a humanized or chimeric antibody. In some embodiments, it is prepared by a method including a step of immunizing a non-human animal. Alternatively, it can be prepared by genetic engineering techniques. In some embodiments, the antibody is an "entire" immunoglobulin, i.e., it has the structure of an immunoglobulin naturally present in a blood plasma. It may be an immunoglobulin comprising 2 heavy chains and 2 light chains, for example an isotype G immunoglobulin, or a heavy chain antibody, that is to say composed of 2 heavy chains and lacking light chains such as a heavy chain antibody of a camelid (HcAb) or an IgNAR of a cartilaginous fish.
  • HcAb camelid
  • the antibody according to the invention is a polypeptide comprising a fragment of an immunoglobulin, preferably a variable domain capable of binding to Nav 1.9, in particular to an epitope included in a sequence peptide.
  • the antibody according to the invention may be chosen from a ScFv, a VH, a V H H (also called single domain antibody), a V NAR , a Fab, or a Fab2, the chimeric and humanized versions thereof and polypeptides comprising them.
  • the antibody according to the invention may be a fusion protein comprising a humanized ScFv domain fused with the CH3-CH2 domains of the Fc domain of a human IgG.
  • the antibody according to the invention is a polyclonal antibody.
  • the antibody is Nav 1.9 specific, particularly with respect to Nav 1.5 and / or Nav 1.7. This means that the affinity of the antibody according to the invention for Nav 1.9 is greater than that observed for another protein, in particular Nav 1.5 and / or Nav 1.7.
  • the specificity of the antibody according to the invention for Nav 1.9 can be determined by any method known to those skilled in the art.
  • the antibody according to the invention is monoclonal, one can compare for example its dissociation constant (Kd) for Nav 1.9 with respect to its possible Kd for the other protein.
  • Kd dissociation constant
  • the dissociation constants can be determined by any suitable method, including surface plasmon resonance. It can be considered that the antibody according to the invention is specific for Nav 1.9 with respect to another protein if its dissociation constant for Nav 1.9 is at least 10 times lower, preferably at least 100 or even 1000 times lower, than that observed for the other protein.
  • the Kd of a monoclonal antibody according to the invention is generally less than 10 -6 , preferably 10 -9 M.
  • immunolabeling is carried out with the antibody according to the invention a first cell culture recombinantly expressing human Nav 1.9, and a second cell culture recombinantly expressing the other protein.
  • the antibody is considered to be Nav 1.9 specific to the other protein if the labeling obtained for the first Nav 1.9 expressing cell culture is greater (at least 20%, preferably at least 50% by weight). intensity and / or surface) compared to that obtained for the second cell culture.
  • the specificity of an antibody can be evaluated by western blot experiments performed on protein extracts from the aforementioned cell systems.
  • the antibody according to the invention does not bind Nav 1.5 and / or Nav.1.7.
  • the ratio of its dissociation constant for Nav 1.9 to that of Nav 1.5 and / or Nav 1.7 is at most equal to 10 -3 , preferably 10 -4, and / or labeling with the antibody according to the invention of a cell culture expressing Nav 1.5 and / or Nav 1.7 (without expressing Nav 1.9) is weak or non-existent, in comparison with the labeling obtained for an identical cell line expressing Nav 1.9 (without expressing Nav 1.5 or Nav 1.7 ).
  • the antibody according to the invention does not exhibit cross-reactivity with a human Nav 1.9 homologous protein.
  • the antibody according to the invention does not bind Nav 1.9 from rats, rabbits or mice.
  • the antibody according to the invention does not exhibit cross-reactivity with respect to hNav 1.8, and / or hNav 1.7 and / or hNav 1.5, and / or non-human Nav 1.9.
  • the antibody against Nav 1.9 is coupled to a means for its detection.
  • the detection means may be any means known to those skilled in the art. It may be an enzyme producing a signal detectable for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, 3-galactosidase, or glucose-6-phosphate dehydrogenase.
  • the antibody may be coupled to a chromophore, for example, a fluorescent, luminescent or dye compound.
  • fluorescent molecules mention may be made of Alexa or phycocyanines.
  • the detection means may also be chosen from radionuclides such as 32 P, 35 S or 125 I, metal particles, for example, gold nanoparticles or quantum dots.
  • the detection of the antibody may also be carried out using a biotin / streptavidin or avidin or sugar / lectin type recognition system.
  • the antibody can be, for example, coupled to biotin and the detection is done with streptavidin or avidin itself labeled with a detection means such as those mentioned above.
  • the antibody according to the invention is not coupled to a detection means.
  • the antibody according to the invention can be detected indirectly by using a detection antibody (also called secondary antibody) itself coupled to a detection means as described above.
  • the detection antibody may for example be directed against the Fc portion of the antibody according to the invention.
  • An additional object according to the invention is a method for preparing an antibody directed against human Nav 1.9.
  • This method may comprise a step of immunizing a non-human animal with an antigenic compound comprising a peptide having at least 80%, preferably 90% sequence identity with SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the method of preparing an antibody against Nav 1.9 comprises a step of immunizing a non-human animal with an antigenic compound comprising a peptide of SEQ ID No. 1, No. 2 or No. No. 3, or comprising a peptide whose sequence differs from a sequence chosen from SEQ ID No. 1, 2 and 3 by virtue of one, two or three amino acid modifications.
  • an amino acid modification includes the replacement (or the substitution) of an amino acid with another amino acid, the deletion of an amino acid or the insertion of an amino acid.
  • amino acid modification (s) are conservative substitutions.
  • the non-human animal may be any animal used to generate antibodies in the laboratory or in the pharmaceutical industry. It may be, for example, a mouse, a rat, a goat or a rabbit. To obtain a heavy chain antibody, the non-human animal is selected from a camelid or a cartilaginous fish.
  • the antigenic compound comprises at least one peptide of sequence chosen from SEQ ID No. 1, SEQ No. 2 and SEQ ID No. 3.
  • the antigenic compound may comprise several peptides, for example a peptide of sequence SEQ ID No. 1 and a peptide of sequence SEQ ID No. 2, or a peptide of SEQ ID No. 2 and a peptide of SEQ ID No. 3, or a peptide of SEQ ID No. 1 and a peptide of SEQ ID No. 3.
  • the antigenic compound comprises a carrier protein coupled to one or more copies of said peptide or peptides.
  • the carrier protein may be chosen for example from KLH (Keyhole limpet hemocyanin), a serum albumin, an ovalbumin, a poly-L-lysine or a toxoid, for example tetanus toxoid.
  • step method of immunizing the non-human animal comprises administering to the non-human animal the antigenic compound, alone or in combination with an immunoadjuvant.
  • the immunoadjuvant can be any immunoadjuvant conventionally used in research, for example, Freund's adjuvant, a mineral oil such as specol, a squalene or an aluminum salt.
  • Administration of the antigenic compound may be by any route, preferably subcutaneously, intramuscularly or intraperitoneally.
  • the dose of the antigenic compound varies according to the animal-non-human to be immunized and is generally between 10 ⁇ g and 10 mg.
  • the administration of the antigenic compound may be repeated several times, for example 2, 3, 4, 5, 6 times until a satisfactory humoral immune response is obtained. Each administration may be spaced one or more days, typically 7 to 30 days.
  • the steps of the preparation method according to the invention vary according to whether it is desired to obtain a monoclonal antibody, a polyclonal antibody or a chimeric or humanized antibody.
  • the monoclonal antibodies can be obtained from antibody-producing cells, for example B-cells, taken after immunization of the non-human animal. In this case, the conventional hybridoma preparation technique well known to those skilled in the art is used.
  • a polyclonal antibody can be obtained from the blood plasma of the non-human animal, taken after immunization, by carrying out conventional purification steps such as centrifugation, precipitation and affinity chromatography steps, in particular using as affinity ligand the peptide derived from Nav 1.9 present in the antigenic compound used to immunize the non-human animal or the protein hNav 1.9 itself. It is preferred to use an affinity chromatography in which the affinity ligand is chosen from the group consisting of the peptide of sequence SEQ ID No. 1, the peptide of sequence SEQ ID No. 2 and the peptide of sequence SEQ ID No. 3.
  • the invention also relates to a method for selecting an antibody directed against hNav 1.9 adapted for use for the detection or quantification of hNav 1.9 in a biological sample, preferably a tissue sample, for example a skin sample, said selection method comprising the steps of:
  • step (b) contacting the antibody (s) provided in step (a) with a peptide having at least 90%, preferably 100%, sequence identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID No. 3, said peptide preferably being immobilized on a support, and
  • step (c) selecting the antibody (s) having complexed with the peptide in step (b).
  • the antibody or antibodies of step (a) may be provided in the form of a solution comprising a mixture of antibodies, for example a solution derived from a blood plasma, in an isolated form (purified or pre-purified) each antibody being tested separately, or in the form of an antibody library expressed on the surface of phages or cells.
  • the present invention also relates to an antibody against Nav 1.9 obtained or obtainable by one of the methods of preparation described above.
  • the antibodies according to the invention are particularly suitable for use for the detection and / or quantification of Nav 1.9 in biological samples, in particular human tissue samples.
  • the antibodies according to the invention can therefore be used as a diagnostic tool. These antibodies have applications in anapathology, forensic medicine and medical research, among others.
  • hNav 1.9 can therefore be considered as a marker for the diagnosis of pathologies associated with orofacial pain.
  • Nav 1.9 is expressed at the ganglia of the myenteric plexus (also called Auerbach's plexus) present in healthy surgical colon residues of cancer patients.
  • the Applicants are also of the opinion that Nav 1.9 is expressed at the level of the submucosal plexus (also called Meissner plexus). More generally, the Applicants believe that hNavl.9 is also a marker for the diagnosis of certain pathologies affecting the gastrointestinal tract and characterized by enteric pain or abdominal discomfort.
  • an additional object according to the invention is the use of an antibody as described above for the detection or quantification of Nav 1.9 in a human biological sample, preferably a tissue sample.
  • the invention also relates to the use of an antibody according to the invention for the diagnosis, prognosis and / or prediction of a pathology associated with enteric pain or orofacial pain.
  • the pathology is an inflammatory pathology.
  • a pathology according to the invention may be an associated disease (or disorder) caused or involving an inflammatory reaction.
  • the term “diagnosis” means a method for determining whether an individual is actually affected by a pathology associated with enteric pain or orofacial pain.
  • the term “prognosis” is intended to mean a method for evaluating the progression of a pathology associated with enteric pain or orofacial pain in a patient who has it, possibly in the presence of a therapeutic treatment.
  • Prediction means a method of assessing whether an individual is likely to develop said pathology associated with enteric pain or orofacial pain.
  • a pathology associated with enteric pain a disease or a disorder which one of the possible symptoms is enteric pain.
  • enteric pain refers to pain that affects or originates in a tissue or organ of the digestive system. It may be oesophageal pain, gastric pain, epigastric pain, intestinal pain, or rectal pain. Preferably, it is a pathology affecting the small intestine, and / or the colon and / or the rectum. For example, it may be an irritable bowel syndrome or a chronic inflammatory bowel disease.
  • the main inflammatory bowel diseases are Crohn's disease and ulcerative colitis (also called ulcerative colitis).
  • These pathologies also include pouchitis and so-called microscopic colitis such as collagenous and lymphocytic colitis.
  • pathology associated with orofacial pain means a disease or a disorder of which one of the possible symptoms is orofacial pain.
  • Patients suffering from a pathology associated with orofacial pain include patients suffering from said pathology and actually suffering from orofacial pain, as well as patients suffering from said pathology but who do not have, or who have not yet developed, an Orofacial pain.
  • Orofacial pain means pain affecting an area of the ENT face, neck, mouth or sphere, particularly the ear or nose. It can be a pain affecting a muscle or a facial joint, a dental pain or a facial neuralgia.
  • the pathology associated with orofacial pain is selected from the group consisting of dental hypersensitivity (sensitive teeth), pulpitis, toothache, maxillary muscle pain or temporomandibular joints, neuralgia, preferably idiopathic, trigeminal nerve, headache, and idiopathic burn of tongue and mouth.
  • the uses according to the invention are uses ex vivo, more exactly in vitro. In particular, these uses do not cover uses in which the antibody would interact directly with the human body or an animal.
  • the uses according to the invention generally comprise the detection or the quantification of Nav 1.9 in a biological sample of the patient with the aid of an antibody according to the invention.
  • the uses according to the invention generally comprise contacting a biological sample of the patient under conditions allowing the formation of an immune complex between Nav 1.9, potentially present in the sample, and the antibody against Nav 1.9, whereby the expression of Nav 1.9 in the biological sample can be detected and / or quantified.
  • the biological sample may undergo a number of treatments prior to contact with the antibody against Nav 1.9.
  • the present invention also relates to an in vitro method for diagnosis or prognosis of a pathology associated with orofacial or enteric pain in an individual, said method comprising the detection of Nav 1.9, using an antibody according to the invention , in a biological sample of the individual. More specifically, this method may include the steps of:
  • step (b) comparing the expression of Navl.9 obtained in step (a) with the expression of Navl.9 detected or quantified in one or more biological samples from one or more control subjects.
  • the test subject or subjects are individuals suffering from the pathology that it is desired to diagnose in the patient.
  • the one or more control subjects correspond to healthy patients, that is to say to individuals who do not suffer from the pathology associated with orofacial or enteric pain.
  • the patient is diagnosed as suffering from, or likely to suffer from, the disease (i.e., diagnosed as a patient at risk), if his or her biological sample has a superior Nav 1.9 expression. to that of the sample (s) from healthy patients.
  • the expression of Nav 1.9 determined in step (a) is less than or equal to that of the samples from the (healthy) control patients, then the diagnosis can be considered negative.
  • the patient sample can be considered positive if the sample has a Nav 1.9 expression at least 10% higher, preferably at least 20% or even at least 50% higher than that of the healthy patient sample (s).
  • the detection or quantification of Nav 1.9 in the biological samples of the control subject (s) may be concomitant with those carried out for the patient sample or from data previously collected and available, for example, on a database.
  • the subject of the invention is also the use of an antibody according to the invention for evaluating the efficacy of a medicament in the treatment of a pathology associated with orofacial or enteric pain as described above.
  • an antibody according to the invention for evaluating the efficacy of a medicament in the treatment of a pathology associated with orofacial or enteric pain as described above.
  • step (c) comparing the expression of Navl.9 of step (a) with the expression of Navl.9 of step (b).
  • the effectiveness of the treatment is determined by comparing the expressions of Nav 1.9 in samples (a) and (b). If the expression of Nav 1.9 is lower in the sample of step (b) than in the sample of step (a), this means that the treatment is effective. If there is an increase in the expression of Nav 1.9, we can consider that the treatment is little active or inactive depending on the magnitude of the observed variation. In certain embodiments, it is considered that the treatment has a therapeutic effect on the pathology considered if it involves a decrease in expression of Nav 1.9 of at least 10%, preferably at least 20%, even more so. preferred by at least 50%.
  • the same antibody according to the invention is used in both steps (a) and (b).
  • Another object according to the invention is the use of an antibody according to the invention for the in vitro monitoring of the evolution of a pathology associated with enteric or orofacial pain as described above. To do this, the following steps can be performed:
  • step (c) comparing the Navl.9 expression of step (b) with the Navl.9 expression of step (a).
  • step (c) the same antibody according to the invention is used.
  • the comparison of Nav 1.9 expression levels in step (c) is a criterion for determining the progression or stage of the disease under consideration. It is thus possible to determine whether the disease is in regression, stationary or worsening.
  • step (b) If the sample of step (b) has a Nav 1.9 expression level lower than the expression level measured in step (a), it can be concluded that the pathology considered is in regression. Conversely, if the sample of step (b) has a level of expression of Nav 1.9 greater than that measured in the first step, the pathology is in progress.
  • the time t2 may be after at least 1 month, preferably at least 6 months, or even at least 1 year at time tl.
  • the invention also relates to the use of an antibody according to the invention for generating data and / or information useful for diagnosing, and / or for predicting and / or for following the evolution of a pathology associated with orofacial or enteric pain, these methods may contain any of the combinations of steps described above.
  • the pathology associated with orofacial pain preferably a dental hypersensitivity or neuralgia, or with enteric pain, preferably irritable bowel syndrome or Crohn's disease, uses and methods described above, the nature of the biological samples varies according to the purpose sought, and the pathology to be diagnosed or predict.
  • the biological sample is a tissue sample comprising ganglia and / or sensory nerve fibers innervating a region of the digestive tract, particularly the colon, small intestine or rectum, or an orofacial area.
  • the biological sample can be any type of adapted tissue sample taken post-mortem.
  • the biological sample may be a biopsy or an operative residue.
  • the biological sample may be a biopsy taken during an endoscopy or a colonoscopy or during a visceral surgery. Alternatively, it may be an operative residue obtained during an intestinal or rectal resection.
  • the biological sample is preferably a sample of myenteric ganglia, a sample of submucosal plexus ganglia or a sample comprising nerve fibers of the myenteric plexus or submucosal plexus.
  • the biological sample is a sample of colon or small intestine.
  • the biological sample may be a dental pulp sample.
  • This sample of dental pulp can be obtained after extraction of a definitive tooth or a tooth of milk or by sampling with a suitable means through the dental crown.
  • the dental pulp sample may be root or coronary. Alternatively, it may also be a biopsy of a tissue comprising nerve fibers of the trigeminal nerve. As detailed below, the biological sample may undergo one or more treatments to allow the detection or quantification of Nav 1.9 by an antibody according to the invention.
  • the methods and uses according to the invention are generally based on a step of contacting the biological sample with the antibody according to the invention under conditions allowing the formation of an immune complex between Nav 1.9, potentially present in the body. sample, and said antibody.
  • the detection and / or quantification of Nav 1.9 in the sample is generally carried out via the formation and optionally the detection of the immune complex.
  • Detection and / or quantification of Nav 1.9 with the aid of an antibody according to the invention can be carried out by any method known to those skilled in the art, for example by immunoassay, by Western blotting or by immunostaining, in particular by immunohistochemistry or immunocytochemistry.
  • RIA radioimmunoassays
  • MIA magnetic immunoassay
  • sandwich or competitive ELISA tests Quantification and / or detection of Nav 1.9 in a biological sample may be based on a separative step by immunochromatography in which the antibody according to the invention is used as an affinity ligand. It can be envisaged to detect or quantify Nav 1.9 in a biological sample by immunoprecipitation or by surface plasmon resonance in which the antibody according to the invention is immobilized on the surface of the sensor.
  • the preferred techniques are immunohistochemistry and western blotting. These are techniques well known to those skilled in the art. Examples of implementations are presented in the experimental part of the present application.
  • the Western blot technique comprises the preparation of a protein extract from the biological sample, the implementation of an electrophoresis step generally under denaturing conditions (SDS-PAGE gel), the transfer of the proteins having migrated onto a membrane and then an immunodetection step using a primary antibody (anti-Nav 1.9 antibody according to the invention) and a step of revealing the antibody-Nav 1.9 complex possibly formed.
  • an antibody according to the invention directed against an epitope included in a peptide of sequence SEQ ID No. 1 or SEQ ID No. 3.
  • the immunohistochemistry technique involves the preparation of a tissue section that can be either cryofixed or chemically fixed.
  • the tissue section may be optionally rehydrated before contacting the antibody according to the invention.
  • the sample is incubated with the antibody according to the invention under favorable conditions for the formation of the antibody-Nav 1.9 complex.
  • the detection of the complex can be carried out directly if the antibody is coupled to a detection means or, if appropriate with the aid of a secondary antibody.
  • the detection means coupled to the antibody according to the invention or, where appropriate, to the secondary antibody is a fluorescent molecule.
  • the detection of the Nav 1.9-antibody complexes according to the invention can then be carried out by fluorescence microscopy.
  • co-labeling with a second antibody can be performed.
  • co-labeling with an anti-peripherin antibody can be performed.
  • the antibodies according to the invention are particularly suitable for use in immunolabeling.
  • the antibodies directed against an epitope included in the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 3 can be used on cryofixed or chemically fixed tissues. These antibodies can also be used in immunocytochemistry.
  • the antibodies according to the invention directed against an epitope contained in SEQ ID No. 2 are preferably used to detect or quantify Nav 1.9 on cryofixed tissue sections.
  • the methods and uses according to the invention may comprise the detection of an additional marker to Nav 1.9 or the evaluation of a particular symptom of the pathology considered.
  • the invention also relates to a kit for the diagnosis of a pathology associated with orofacial or enteric pain comprising an antibody according to the invention and optionally a means for detecting said antibody.
  • the diagnostic kit may also include one or more additional objects, for example, an explanatory note for the implementation of the diagnostic test, one or more reagents for the preparation of the biological sample, or one or more means useful for the sampling. of the biological sample.
  • the invention also relates to the use of a kit comprising an antibody according to the invention and optionally a means for detecting said antibody in the in vitro diagnosis of a pathology associated with orofacial or enteric pain.
  • Two rabbits were each immunized with a peptide mixture containing the 2 peptides (SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 3) coupled to KLH (schedule hereafter). Control of the immune response by ELIS A. Purification on affinity column (Hi-trap NHS coupling) samples J63 and J77.
  • the Rbcca4 antibody was isolated by a purification method comprising an affinity chromatography step in which the immobilized ligand was the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • the Rbcca ⁇ antibody was isolated by a purification method comprising an affinity chromatography step in which the immobilized ligand was the peptide of SEQ ID NO: 3.
  • the 3881.1 antibody was isolated by a purification method comprising an affinity chromatography step in which the immobilized ligand was the peptide of SEQ ID NO: 2.
  • the 3881.2 antibody was isolated by a purification method comprising an affinity chromatography step in which the immobilized ligand was the peptide of SEQ ID NO: 4.
  • HEK-293 cells were transfected: 1) with a plasmid containing the nucleic sequence coding for the human subclass alpha Navl.9 tagged myc at its C-terminus or 2) with the sequences coding for Nav 1.5 or Nav 1.7 humans (hNavl.5 and hNavl.7). The latter not being labeled, they were co-transfected with a plasmid encoding the expression of GFP. .
  • hNav1.9 is tested by co-labeling with an anti-myc monoclonal antibody while the expression of hNav1.5 and hNav1.7 is tested with a PanNav antibody, recognizing all sodium channels.
  • FIG. 1 shows the co-labeling results with the anti-Myc monoclonal antibody and the Raab4 polyclonal antibody for recombinant cells expressing hNav1.9-Myc (FIG. 1A) and non-recombinant cells. ( Figure 1B). Identical markings were obtained for the Rbaao antibody (data not shown).
  • FIG. 2 shows the immunolabeling results with the Rbaa4 antibody of HEK cells expressing hNav1.5, identified by GFP ( Figure 2A) and HEK cells expressing hNav1.7, identified by GFP ( Figure 2B). ). While the signal emitted by GFP is clearly visible, labeling with Rbaa4 cells is very weak or non-existent.
  • the Rbaa4 and Rbaao antibodies recognize a band having a molecular weight around 250 kDa ( Figure 2). This band is also present during detection with the anti-myc antibody. In addition, this band is not detected for the extract from untransfected cells (negative control).
  • the molecular weight of the specific band is a little higher than the expected molecular weight for hNav 1.9-Myc (about 210 kDa). This difference in molecular weight is certainly attributable to post-translational modifications, in particular to glycosylations.
  • a deglycosylation experiment on the protein lysate was performed and showed a decrease in the intensity of the band at 250 kDa, which supports this hypothesis.
  • Myenteric lymph nodes Operative colonic residues (healthy parts) are recovered quickly after collection, placed on ice in carbogenous Krebs, supplemented with muscle contraction blockers (atropine, 2 ⁇ l and nicardipine, 6 ⁇ l), before dissection.
  • composition of the carbogen Krebs (in mM): 118 NaCl, 4.8 KCl, 1 NaH2PO4, 25 NaHCO3, 1.2 MgCl2, 2.5 CaCl2 and 11 Glucose, equilibrated at pH 7.4 with 95% O2-5% CO2.
  • Dissection consists of removing the mucosa, the submucosa and reducing the thickness of the tissue by removing some muscle (longitudinal and circular) so that the neurons of the myenteric ganglia are accessible (Osorio and Delmas, 2010, Nature Protocols , 6 (1): 15-27).
  • the tissue is then incubated 1 h in PBS 4% sucrose (mass / volume) at 4 ° C, then 12 h in PBS 20% sucrose, still at 4 ° C.
  • Composition of PBS in mM: 140 NaCl, 10 mM PO4 Buffer (NaHPO4 and NaH2PO4), 3 mM KCl, pH 7.2.
  • Dental pulp After sampling, the tooth is kept in PBS at 4 ° C. The dental pulp is extracted from the enamel, then incubated 1 h in PBS 4% sucrose (mass / volume) at 4 ° C, then 12 h in PBS 20% sucrose, still at 4 ° C.
  • Trigeminal ganglion After sampling (12-24h post-mortem), the ganglia are incubated for 2h in PBS 4% sucrose (mass / volume) at 4 ° C, then 12h in PBS 20% sucrose, always at 4 ° C.
  • the tissues are included in OCT and frozen in isopentane refreshed with dry ice.
  • the blocks are stored at -80 ° C.
  • the cross sections of 15-30 ⁇ are made by cryostat, mounted on Superfrost blades, dried (lh under Sorbonne) and then stored at -80 ° C until use.
  • the slides are dried for 30 minutes under a fume cupboard.
  • the tissues can then be treated in two different ways depending on whether the primary antibody requires cryofixed or chemically fixed tissue. They are therefore:
  • the sections are incubated for one hour at room temperature in saturation medium: PBS + 3% (mass / volume) BSA + 0.3% (volume / volume) Triton X-100.
  • Primary antibodies are added to the saturation medium for incubation for 12 h at 4 ° C in a humid chamber.
  • the sections are then rinsed 4 times 15 min in PBS before 45 min of incubation at room temperature with the secondary antibodies in PBS + 3% (w / v) BSA in a humid chamber. Finally, the sections are rinsed 4 times 15 min in PBS before being mounted in a mounting medium (Mowiol or Prolong Gold)
  • the antibodies Rbaa4 and Rbaao give an interesting labeling of Nav 1.9 for the various human tissues tested, whether they are chemically or cryo-fixed.
  • the antibodies Rbaa4 and Rbaao are thus able to detect the presence of Nav 1.9 at cross sections of colon, dental pulp, and trigeminal ganglia after chemical fixation or cryofixation.
  • Examples of immunolabeling (non-exhaustive) obtained by the Applicants with the antibodies Rbaa4 and Rbaao are illustrated in FIGS. 4 and 5 (colon), 7 and 8 (dental pulp) and 11 (trigeminal ganglion).
  • Antibody 3881.1 very effectively and sensitively marks cryo-fixed tissues, in particular of dental pulp (FIGS. 9 and 10) and of myenteric plexus (FIG. 6). In contrast, the 3881.1 antibody is ineffective on chemically bound tissue (data not shown) and gives weak labeling of trigeminal ganglia.
  • the dental pulp is innervated by a large number of non-myelinated or weakly myelinated nerve fibers of the mandibular branch of the trigeminal nerve.
  • the immunolabelings of the coronal and root dental pulp by the antibodies according to the invention have shown that Nav 1.9 is essentially expressed in level of non-myelinated and peripherin-positive fibers. It is also noted that the marking of Nav 1.9 is not uniform, contrary to what is observed for the peripherin, which suggests the presence of "cluster" of expression for Nav 1.9.

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Abstract

L'invention a pour objet des anticorps dirigés contre le canal sodique Nav1.9 humain et leur utilisation dans le diagnostic de pathologies associées à une douleur entérique ou orofaciale. L'invention concerne également un procédé de préparation d'anticorps dirigés contre Nav 1.9 humain.

Description

ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE CANAL SODIQUE NAV1.9 HUMAIN ET
LEURS UTILISATIONS EN DIAGNOSTIC
Domaine de l'invention
L'invention concerne des anticorps dirigés contre le canal sodique Nav 1.9 et leur utilisation dans le diagnostic de pathologies associées à une douleur entérique ou orofaciale.
Contexte de l'invention
Les canaux sodium voltage-dépendants sont des acteurs essentiels de l'initiation et de la propagation des potentiels d'actions au niveau des cellules dites « excitables ». Ces canaux sodiques sont principalement exprimés au niveau des neurones du système nerveux central et périphérique et au niveau des cellules musculaires. Il s'agit de protéines transmembranaires comprenant une large sous-unité alpha (a) d'environ 260 kDa associée à une ou plusieurs sous-unités béta de 33 à 38 kDa. La sous-unité alpha forme le cœur du canal et comprend quatre domaines membranaires homologues (I-IV), chacun constitué de 6 segments transmembranaires (S1-S6). Les domaines membranaires de la sous unité alpha sont reliés entre eux par de grandes boucles intracellulaires qui comprennent de nombreux sites de régulation. La sous-unité alpha est responsable des propriétés de conductance et de sélectivité du canal alors que les sous-unités béta sont impliquées dans la stabilisation et dans les propriétés cinétiques du canal. A ce jour, 10 isoformes pour la sous-unité alpha ont été identifiées chez l'homme. Le nom attribué à ces isoformes contient le symbole de l'ion transporté (Na), avec en indice l'élément régulateur (le voltage v). Les chiffres qui suivent désignent la sous-famille de gènes et le numéro associé à l'isoforme considérée. A ce jour, la principale sous-famille de gènes identifiée comprend les isoformes Navl. l à Navl.9. Une isoforme supplémentaire, plus éloignée, Nax a été également identifiée. Le pourcentage d'identité de séquence entre les différences isoformes Navl. l à Nav 1.9 est d'au moins 60%. Les isoformes Navl. l à Navl.9 se différencient, entre autres, par leur sensibilité à la tétrodotoxine (TTX), un bloqueur très puissant et sélectif des canaux sodiques, et par leur distribution tissulaire. Les isoformes Navl.l à Navl.4, Navl.6 et Nav 1.7 sont dites sensibles à la TTX avec des EC50 de l'ordre du nanomolaire. Les isoformes Navl.5, Navl.8 et Navl.9 sont considérées, quant à elles, comme résistantes à la TTX. A cet égard, TEC50 de la TTX pour Navl.9 est d'environ 200 μΜ. En ce qui concerne la distribution tissulaire, les isoformes Navl. l, Nav 1.2, Nav 1.3 et Navl.6 sont principalement exprimées au niveau du système nerveux central. L'isoforme Navl.4 est exprimée principalement au niveau des myocytes squelettiques alors que Nav 1.5 est essentiellement présente, chez l'individu adulte, au niveau des myocytes cardiaques. Enfin, les isoformes Navl.7, Navl.8 et Navl.9 sont exprimées au niveau du système nerveux périphérique (SNP). Nav 1.9 a été initialement détecté au niveau des neurones sensitifs des ganglions trijumeaux et des ganglions spinaux. Des expériences d'invalidation du gène de Nav 1.9 ont confirmé l'implication de ce canal sodique dans la nociception, en particulier dans l'hyperexcitabilité des nocicepteurs et l'hyperalgie associée à l'inflammation. Plus récemment, Padilla et al. (Molecular and Cellular Neuroscience , 2007; 35(1): 138-52) ont mis en évidence, chez le rat, que Nav 1.9 est exprimé au niveau des terminaisons nerveuses du nerf trijumeau, et au niveau des neurones sensitifs afférents du plexus myentérique et sous-muqueux du duodénum. Cette distribution tissulaire suggère que Nav 1.9 pourrait être impliqué dans la perception des douleurs orofaciales et dans certains troubles intestinaux. Enfin, Lolignier et al. (PlosOne, 2011, e23083) ont montré une surexpression de Nav 1.9 au niveau des fibres nerveuses innervant un foyer inflammatoire chez un modèle murin d'inflammation aiguë. Ces auteurs ont également montré, grâce à des modèles murins, que Nav 1.9 est impliqué dans l'hypersensibilité à la douleur mécanique et thermique associée aux inflammations subaiguë et chronique.
Néanmoins, l'implication de Nav 1.9 dans les pathologies humaines reste encore à explorer. A la connaissance des demandeurs, aucun anticorps ciblant spécifiquement Nav 1.9 humain (hNav 1.9) et utilisable pour la détection et la quantification de cette protéine dans des tissus humains n'a été décrit à ce jour. Il existe donc à l'heure actuelle un besoin de nouveaux outils biochimiques de détection et de quantification tissulaire de hNav 1.9.
Résumé de l'invention
L'invention a pour objet un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à un épitope inclus dans un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. L'anticorps selon l'invention est adapté à une utilisation pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique, de préférence tissulaire. L'anticorps selon l'invention peut être un anticorps polyclonal, de préférence d' isotype IgG ou IgM, ou un anticorps monoclonal. L'anticorps peut être chimérique ou humanisé. Il peut être choisi parmi une immunoglobuline comprenant 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères, un anticorps à simple domaine (sdab), ou une IgNar, un polypeptide comprenant un domaine variable d'un anticorps tel qu'un ScFv, un VH, un VHH, un VNAR, un Fab, et les versions chimériques ou humanisés de ceux-ci. Dans certains modes de réalisation, l'anticorps selon l'invention ne se lie pas à Nav 1.5 et Nav 1.7, de préférence humain. Dans un mode de réalisation supplémentaire, l'anticorps selon l'invention est obtenu à partir d'anticorps, ou de cellules exprimant des anticorps, provenant d'un animal non-humain immunisé avec un composé antigénique comprenant au moins un peptide ayant au moins 90% d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend au moins un peptide de SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou un peptide ayant une séquence qui diffère de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3 en vertu d'une, de deux, ou de trois modifications d'acide aminé.
L'anticorps selon l'invention peut être couplé à un moyen de détection, de préférence choisi parmi une enzyme produisant un signal détectable telle que la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la 3-galactosidase, ou la glucose-6-phosphate déshydrogénase, un chromophore, un composé fluorescent, un composé luminescent, un radionucléide tel que
32 P, 35 S ou 125 I, une particule métallique, par exemple une nanoparticule d'or, une biotine, une streptavidine, une avidine, un sucre ou une lectine.
Un objet supplémentaire de l'invention est une méthode de préparation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain comprenant une étape d'immunisation d'un animal non-humain avec un composé antigénique comprenant au moins un peptide ayant au moins 90% d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, de SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend au moins un peptide de SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou un peptide ayant une séquence qui diffère de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3 en vertu d'une, de deux, ou de trois modifications d'acide aminé. Le composé antigénique peut en outre comprendre une protéine porteuse couplée à une ou plusieurs copies dudit peptide.
Dans certains modes de réalisation, la méthode de préparation selon l'invention peut comprendre, en outre, la récupération de l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain à partir du plasma sanguin de l'animal non-humain, après immunisation.
Dans d'autres modes de réalisation, la méthode de préparation selon l'invention peut comprendre, la production de l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 par un hybridome obtenu à partir d'une cellule exprimant des anticorps, de préférence un lymphocyte B, provenant de l'animal non-humain, après immunisation.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps tel que décrit précédemment pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique humain. L'échantillon biologique peut être un résidu chirurgical, une biopsie ou un prélèvement post- mortem. Un objet supplémentaire de l'invention est l'utilisation dudit anticorps pour le diagnostic, le pronostic et/ou la prédiction in vitro d'une pathologie, de préférence à caractère inflammatoire, associée à une douleur entérique ou à une douleur orofaciale. Les pathologies associées à une douleur entérique comprennent, entre autres, le syndrome de l'intestin irritable, les maladies inflammatoires chroniques intestinales telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. Les pathologies provoquant une douleur orofaciale comprennent, entre autres, une hypersensibilité dentaire (dents sensibles), une pulpite, une odontalgie, une douleur des muscles maxillaires ou des articulations temporo-mandibulaires, une névralgie, de préférence idiopathique, du nerf trijumeau, une céphalée et une brûlure idiopathique de la langue et de la bouche.
Dans des modes de réalisations préférés, l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 selon l'invention est utilisé pour détecter ou quantifier Nav 1.9 dans un échantillon tissulaire humain comprenant un ganglion et/ou une fibre nerveuse sensitive du tube intestinal ou d'une zone orofaciale. L'échantillon tissulaire peut être ainsi choisi parmi un échantillon de pulpe dentaire, un échantillon de ganglions myentériques, un échantillon de ganglions du plexus sous-muqueux, un échantillon comprenant des fibres nerveuses du plexus myentérique ou sous-muqueux. La détection ou la quantification de Nav 1.9 par l'anticorps selon l'invention peut être réalisée par western blot, par immunodosage ou par immunomarquage. Une méthode de détection ou de quantification de Nav 1.9 particulièrement préférée est l'immunohistochimie.
Enfin, la présente invention a également pour objet un kit, ou l'utilisation d'un kit, pour le diagnostic d'une pathologie associée à une douleur viscérale ou à une douleur orofaciale, comprenant au moins un anticorps dirigé contre Nav 1.9 selon l'invention et en option un moyen de détection dudit anticorps.
Figures
La Figure 1 montre les résultats d'immunomarquage de cellules HEK après fixation au PAF (paraformaldéhyde) 2% par un anticorps monoclonal anti-Myc et l'anticorps anti-hNav 1.9 Rbaa4. Figure la : cellules transfectées avec phNavl.9-myc. Figurelb : cellules non transfectées.
La Figure 2 montre les résultats d'immunomarquage avec l'anticorps Rbaa4 des cellules co- transfectées avec hNav 1.5 et un plasmide codant pour la GFP (Figure 2A) ou hNav 1.7 et un plasmide codant pour la GFP (Figure 2B). Alors que le signal émis par la GFP est clairement visible, le marquage avec Rbaa4 des cellules est très faible voire inexistant. La Figure 3 montre les western blot réalisés sur des extraits protéiques de cellules HEK non transfectées ou transfectées avec un plasmide codant pour hNav 1.9-myc. NT : lysat de cellules non-transfectées (témoin négatif), T : lysat de cellules transfectées. Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô reconnaissent une bande protéique
d'un poids moléculaire d'environ 250 kDa qui n'est pas détectée pour les cellules non transfectées. Cette bande est bien reconnue par l'anticorps anti-Myc.
La Figures 4 montre l'immunomarquage d'une coupe transverse de côlon chimiquement fixée au paraformaldéhyde. De haut en bas : marquage avec un anticorps anti HuC/D, marquage avec l'anticorps Rbaa4, comarquage HuC/D et Nav 1.9. * : neurones immunopositifs pour Nav 1.9, 0 : neurones immunonégatifs pour Nav 1.9.
La Figures 5 montre l'immunomarquage d'une coupe transverse de côlon chimiquement fixée au paraformaldéhyde par un anticorps anti-HuC/D (figure 5 A) et par l'anticorps Rbaaô (Figure 5B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 5C. * : neurones immunopositifs pour Nav 1.9, 0 : neurones immunonégatifs pour Nav 1.9.
La Figure 6 montre l'immunomarquage d'une coupe transverse de côlon cryofixée. De haut en bas : marquage avec un anticorps anti-NF200, marquage avec l'anticorps 3881.1, comarquage. * : neurones immunopositifs pour Nav 1.9, 0 : neurones immunonégatifs pour Nav 1.9.
La Figure 7 montre l'immunomarquage d'un échantillon de pulpe dentaire radiculaire fixée au paraformaldéhyde par un anticorps anti-périphérine (Figure 7 A) et par l'anticorps Rbaa4 (Figure 7B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 7C.
La Figure 8 montre l'immunomarquage d'un échantillon de pulpe dentaire radiculaire fixée au paraformaldéhyde par un anticorps anti-périphérine (Figure 8 A) et par l'anticorps Rbaaô (Figure 8B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 8C.
La Figure 9 montre l'immunomarquage d'un échantillon de plexus sub-odonblastique (pulpe dentaire coronaire) cryofixée par un anticorps anti-périphérine (Figure 9A) et par l'anticorps 3881.1 (Figure 9B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 9C.
La Figure 10 montre l'immunomarquage d'un échantillon de pulpe dentaire radiculaire cryofixée par un anticorps anti-périphérine (Figure 10A) et par l'anticorps 3881.1 (Figure 10B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 10C.
La Figure 11 montre l'immunomarquage d'un échantillon de ganglion trijumeau (prélèvement post-mortem) cryofixé par un anticorps anti-NF200 (Figure 11 A) et par l'anticorps Rbaaô (Figure 11B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 11C. Description détaillée de l'invention
Les Demandeurs ont préparé trois anticorps polyclonaux - dénommés ci-après Rbaa4, 3881-1 et Rbaaô - dirigés contre Nav 1.9 humain. Ces anticorps ont été obtenu par immunisation d'un animal non-humain (lapin) avec un composé antigénique comprenant un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Le peptide de séquence SEQ ID N°l correspond à un fragment de la partie N-terminale de Nav 1.9 humain (hNav 1.9) alors que les peptides de séquence SEQ N°2 et SEQ ID N°3 sont des fragments provenant des boucles intracellulaires reliant les domaines transmembranaires I-II et II- III de hNav 1.9, respectivement. Les Demandeurs ont mis en évidence que ces anticorps polyclonaux sont capables de détecter in vitro la présence de Nav 1.9 et ceci de manière spécifique. Grâce à ces anticorps, les Demandeurs ont montré que hNav 1.9 est exprimé au niveau des fibres sensitives non- myélinisées de la pulpe dentaire et du plexus myentérique provenant d'échantillons humains. Ces résultats suggèrent fortement une implication de Nav 1.9 dans des pathologies associées à une douleur entérique ou orofaciale. Par ailleurs, les Demandeurs ont également montré que le canal sodique Nav 1.9 est impliqué dans les mécanismes de relargage de peptides proinflammatoires par les neurones sensitifs, consécutivement à leur stimulation. Nav 1.9 serait donc également impliquée dans la potentialisation des réponses inflammatoires neurogènes. Ainsi, la présente invention concerne des anticorps dirigés contre Nav 1.9 humain, et leur procédé de préparation. L'invention concerne également l'utilisation de ces anticorps dans le diagnostic de pathologies associées à une douleur orofaciale ou entérique, de préférence à caractère inflammatoire.
■ Anticorps dirigés contre Nav 1.9
Selon un premier aspect, l'invention concerne un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain (également désigné ici hNav 1.9 et Nav 1.9). Cet anticorps est caractérisé en ce qu'il est capable de se lier à un épitope inclus dans un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3.
On entend par « Nav 1.9 » ou « hNav 1.9 » la sous-unité alpha humaine Nav 1.9 constitutifs de certains canaux sodiques dépendants du potentiel (ou voltage-dépendants) humains. La sous- unité alpha Nav 1.9 est codée par le gène SCN11A qui est également dénommé NaN, SCN12A et SNS-2 dans la littérature. Le numéro d'identifiant du gène Nav 1.9 humain dans la base de gènes du NCBI est 11289 (NCBI Gene ID). La séquence protéique de Nav 1.9 humain est notamment décrite dans la base de séquences UniProt (Référence de séquence : Q9UI33) et celle du NCBI (référence de séquence NCBI : NP_054858). En ce qui concerne l'ARNm pour Nav 1.9, voire la séquence de référence NCBI : NM_014139.
Le peptide de séquence SEQ ID N°l correspond à un fragment de la partie N-terminale de hNav 1.9 (acides aminés de la position 31 à 47 de hNavl.9) alors que les peptides de séquence SEQ N°2 et SEQ ID N°3 sont des fragments provenant des boucles intracellulaire reliant les domaines membranaires I-II et II- III de hNav 1.9, respectivement. Plus précisément, le peptide de SEQ ID N°2 correspond au fragment allant de l'acide aminé 473 à l'acide aminé 488 de la séquence de hNavl.9 et le peptide de SEQ ID N°3 correspond au fragment allant de l'acide aminé 945 à l'acide aminé 961 de la séquence de Nav 1.9.
On entend par « anticorps anti-Nav 1.9 » ou par « anticorps dirigé contre Nav 1.9 » tout anticorps ou tout polypeptide comprenant un fragment d'anticorps capable de reconnaître et de se lier spécifiquement à un épitope de la sous-unité alpha Nav 1.9 humain, ledit épitope ayant de préférence une séquence en acides aminés incluse dans SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Nav 1.9 peut être associé à d'autres protéines, par exemple à une sous-unité beta, et/ou exprimé au niveau d'une membrane cellulaire. Dans certains modes de réalisation, les anticorps selon l'invention peuvent se lier à Nav 1.9 présent sous une forme isolée (par exemple sous une forme pré-purifiée, purifiée et/ou non-enchâssée dans une membrane cellulaire). Dans d'autres modes de réalisations les anticorps selon l'invention sont capables de reconnaître Nav 1.9 exprimé au niveau d'une membrane cellulaire et/ou sous la forme de vésicules cytoplasmiques
Les Demandeurs ont montré que les anticorps selon l'invention sont particulièrement adaptés à une utilisation pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique, de préférence un échantillon tissulaire. Les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés pour détecter ou quantifier Nav 1.9 par des techniques d'immunomarquage, et/ou d'immunodosage et/ou par western blot. Les anticorps selon l'invention sont particulièrement adaptés à une utilisation dans la détection ou la quantification de Nav 1.9 par immunohistochimie. Il va de soi que les échantillons sont des échantillons biologiques humains c'est-à-dire des échantillons qui sont préalablement collectés ou prélevés sur un être humain. Les échantillons biologiques préférés selon l'invention sont décrits en détail ci- après.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les Demandeurs sont d'avis que les propriétés de détection des anticorps selon l'invention résultent des épitopes spécifiques de Nav 1.9 contre lesquels les anticorps sont dirigés. En effet, les Demandeurs ont montré que des anticorps dirigés contre d'autres régions de Nav 1.9 - par exemple contre le peptide de SEQ ID N°4 de la boucle intracellulaire liant les domaines membranaires II- III de Nav 1.9 - présentent soit une sensibilité trop faible (c'est-à-dire une affinité trop faible pour Nav 1.9) et/ou une spécificité trop faible pour être utilisés pour la détection ou la quantification tissulaire de Nav 1.9.
Dans certains modes de réalisations, l'anticorps selon l'invention a été obtenu à partir d'un anticorps, de préférence plasmatique, ou d'une cellule exprimant des anticorps, ledit anticorps ou ladite cellule provenant d'un animal non-humain immunisé avec un composé antigénique comprenant au moins un peptide ayant au moins 90% d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend au moins un peptide de SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou un peptide ayant une séquence qui diffère de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3 en vertu d'une, de deux, ou de trois modifications d'acide aminé.
De préférence, le composé antigénique comprend au moins un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. On entend par « composé antigénique » un composé dont l'administration à un animal non-humain, seule ou en combinaison avec un immunoadjuvant, est capable d'induire une réaction immunitaire humorale. Dans un mode de réalisation préféré, le composé antigénique comprend plusieurs copies dudit peptide ou desdits peptides ci-dessus décrits, éventuellement couplées entre elles. Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend une protéine porteuse sur laquelle est greffée une ou plusieurs copies d'un peptide ou de plusieurs peptides tels que définis précédemment.
Des méthodes pour obtenir un anticorps selon l'invention sont décrites en détails ci-après. Comme mentionné ci-avant, un anticorps selon l'invention peut être tout anticorps ou polypeptide comprenant un fragment d'anticorps capable de reconnaître et de se lier spécifiquement à Nav 1.9 humain, de préférence à un épitope inclus dans une région de Nav 1.9 de séquence choisie parmi SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. L'anticorps selon l'invention peut être un anticorps monoclonal ou polyclonal. On entend, par « anticorps polyclonaux » ou « anticorps polyclonal », un mélange d'anticorps dirigés contre plusieurs épitopes. On entend par « anticorps monoclonal » ou « anticorps monoclonaux », un anticorps ou un ensemble d'anticorps qui reconnaisse un même et unique épitope.
L'anticorps selon l'invention peut être un anticorps humanisé ou chimérique. Dans certains modes de réalisations, il est préparé par un procédé incluant une étape d'immunisation d'un animal non-humain. A titre alternatif, il peut être préparé par des techniques de génie génétique. Dans certains modes de réalisation, l'anticorps est une immunoglobuline « entière » c'est-à- dire qu'il a la structure d'une immunoglobuline présente naturellement dans un plasma sanguin. Il peut s'agir d'une immunoglobuline comportant 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères, par exemple une immunoglobuline d'isotype G, ou d'un anticorps à chaîne lourde, c'est-à-dire constitué de 2 chaînes lourdes et dépourvu de chaînes légères tel qu'un anticorps à chaîne lourde d'un camélidé (HcAb) ou une IgNAR d'un poisson cartilagineux.
Dans d'autres modes de réalisation, l'anticorps selon l'invention est un polypeptide comprenant un fragment d'une immunoglobuline, de préférence un domaine variable capable de se lier à Nav 1.9, en particulier à un épitope inclus dans un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. L'anticorps selon l'invention peut être choisi parmi un ScFv, un VH, un VHH (également appelé anticorps à simple domaine), un VNAR, un Fab, ou un Fab2, les versions chimériques et humanisés de ceux-ci et les polypeptides les comprenant. A titre d'exemple, l'anticorps selon l'invention peut être une protéine de fusion comprenant un domaine ScFv humanisé fusionné avec les domaines CH3-CH2 du domaine Fc d'une IgG humaine.
Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps selon l'invention est un anticorps polyclonal. Dans un mode de réalisation supplémentaire, l'anticorps est spécifique de Nav 1.9, en particulier par rapport à Nav 1.5 et/ou Nav 1.7. Ceci signifie que l'affinité de l'anticorps selon l'invention pour Nav 1.9 est supérieure à celle observée pour une autre protéine, en particulier Nav 1.5 et/ou Nav 1.7.
La spécificité de l'anticorps selon l'invention pour Nav 1.9 peut être déterminée par toute méthode connue de l'homme du métier. Lorsque l'anticorps selon l'invention est monoclonal, on peut comparer par exemple sa constante de dissociation (Kd) pour Nav 1.9 par rapport à son éventuel Kd pour l'autre protéine. Les constantes de dissociation peuvent être déterminées par toute méthode adaptée, y compris par résonance plasmonique de surface. On peut considérer que l'anticorps selon l'invention est spécifique de Nav 1.9 par rapport à une autre protéine si sa constante de dissociation pour Nav 1.9 est au moins 10 fois inférieure, de préférence au moins 100 voire au moins 1000 fois inférieure, à celle observée pour l'autre protéine.
De manière générale, le Kd d'un anticorps monoclonal selon l'invention est généralement inférieur à 10"6, de préférence 10"9 M.
Lorsque l'anticorps selon l'invention est polyclonal, on peut évaluer sa spécificité vis-à-vis de Nav 1.9 et d'une autre protéine par immunomarquage, comme cela est illustré dans les exemples. A cette fin, on effectue un immunomarquage avec l'anticorps selon l'invention d'une première culture cellulaire exprimant de manière recombinante le Nav 1.9 humain, et d'une seconde culture cellulaire exprimant de manière recombinante l'autre protéine.
On considère que l'anticorps est spécifique de Nav 1.9 par rapport à l'autre protéine si le marquage obtenu pour la première culture cellulaire exprimant Nav 1.9 est plus important (d'au moins 20%, de préférence d'au moins 50% en intensité et/ou en surface) par rapport à celui obtenu pour la seconde culture cellulaire. A titre alternatif, la spécificité d'un anticorps peut être évaluée grâce à des expériences de western blot effectuées sur des extraits protéiques provenant des systèmes cellulaires ci-dessus mentionnés.
Dans certains modes de réalisation, l'anticorps selon l'invention ne lie pas Nav 1.5 et/ou Nav.1.7. En d'autres termes, le rapport de sa constante de dissociation pour Nav 1.9 sur celle de Nav 1.5 et/ou Nav 1.7 est au plus égale à 10"3, de préférence 10"4 et/ou le marquage avec l'anticorps selon l'invention d'une culture cellulaire exprimant Nav 1.5 et/ou Nav 1.7 (sans exprimer Nav 1.9) est faible, voire inexistant, en comparaison avec le marquage obtenu pour une lignée cellulaire identique exprimant Nav 1.9 (sans exprimer Nav 1.5 ou Nav 1.7).
Dans d'autres modes de réalisation l'anticorps selon l'invention ne présente pas une réactivité croisée vis-à-vis d'une protéine homologue à Nav 1.9 humain. Par exemple, l'anticorps selon l'invention ne lie pas Nav 1.9 de rat, de lapin ou de souris.
Dans un mode de réalisation supplémentaire, l'anticorps selon l'invention ne présente pas de réactivité croisée vis-à-vis de hNav 1.8, et/ou hNav 1.7 et/ou hNav 1.5, et/ou des Nav 1.9 non- humains.
Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 est couplé à un moyen permettant sa détection. Le moyen de détection peut être tout moyen connu par l'homme du métier. Il peut s'agir d'une enzyme produisant un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la 3-galactosidase, ou la glucose-6-phosphate déshydrogénase. A titre alternatif, l'anticorps peut être couplé à un chromophore, par exemple, un composé fluorescent, luminescent ou colorant. A titre d'exemple de molécules fluorescentes, on peut citer les Alexa ou les phycocyanines. Le moyen de détection peut être également choisi parmi les radionucléides tels que 32 P, 35 S ou le 125 I, les particules métalliques, par exemple, les nanoparticules d'or ou encore les quantum dots. La détection de l'anticorps peut être également effectuée grâce à un système de reconnaissance de type biotine/streptavidine ou avidine ou encore sucre/lectine. Dans ce cas, l'anticorps peut être, par exemple, couplé à la biotine et la détection se fait grâce à la streptavidine ou Γ avidine elle-même marquée par un moyen de détection tels que ceux précédemment cités. Dans d'autres modes de réalisation, l'anticorps selon l'invention n'est pas couplé à un moyen de détection. Dans ce cas, l'anticorps selon l'invention peut être détecté de manière indirecte en utilisant un anticorps de détection (également appelé anticorps secondaire) lui-même couplé à un moyen de détection comme décrit précédemment. L'anticorps de détection peut être par exemple dirigé contre la partie Fc de l'anticorps selon l'invention.
■ Méthode de préparation d'un anticorps selon l'invention
Un objet supplémentaire selon l'invention est une méthode de préparation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain. Cette méthode peut comprendre une étape d'immunisation d'un animal non-humain avec un composé antigénique comprenant un peptide ayant au moins 80%, de préférence 90% d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Dans certains modes de réalisation, la méthode de préparation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 comprend une étape d'immunisation d'un animal non-humain avec un composé antigénique comprenant un peptide de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3, ou comprenant un peptide dont la séquence diffère d'une séquence choisie parmi SEQ ID N°l, 2 et 3 en vertu d'une, deux ou trois modifications d'acide aminé.
Au sens de l'invention, une modification d'acide aminé englobe le remplacement (ou la substitution) d'un acide aminé par un autre acide aminé, la délétion d'un acide aminé ou l'insertion d'un acide aminé.
De préférence, la ou les modifications d'acide aminé sont des substitutions conservatives.
L'animal non-humain peut être tout animal utilisé pour générer des anticorps en laboratoire ou dans l'industrie pharmaceutique. Il peut s'agir, par exemple, d'une souris, d'un rat, une chèvre ou d'un lapin. Pour obtenir un anticorps à chaîne lourde, l'animal non-humain est choisi parmi un camélidé ou un poisson cartilagineux.
De préférence, le composé antigénique comprend au moins un peptide de séquence choisie parmi SEQ ID N°l, SEQ N°2 et SEQ ID N°3.
Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique peut comprendre plusieurs peptides, par exemple un peptide de séquence SEQ ID N°l et un peptide de séquence SEQ ID N°2, ou un peptide de SEQ ID N°2 et un peptide de SEQ ID N°3, ou encore un peptide de SEQ ID N° 1 et un peptide de SEQ ID N°3.
Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend une protéine porteuse couplée à une ou plusieurs copies dudit peptide ou desdits peptides. La protéine porteuse peut être choisie par exemple parmi la KLH (Keyhole limpet hemocyanin), une albumine sérique, une ovalbumine, une poly-L-lysine ou un toxoïde, par exemple le toxoïde tétanique. L'étape d'immunisation de l'animal non-humain comprend l'administration à l'animal non-humain du composé antigénique, seul ou en combinaison avec un immunoadjuvant. L' immuno-adjuvant peut être tout immunoadjuvant classiquement utilisé en recherche, par exemple, l'adjuvant de Freund, une huile minérale comme le specol, un squalène ou un sel d'aluminium. L'administration du composé antigénique peut être faite par toute voie, de préférence par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intra-péritonéale. La dose du composé antigénique varie selon l'animal-non humain à immuniser et est comprise généralement entre 10 μg et 10 mg. L'administration du composé antigénique peut être renouvelée plusieurs fois, par exemple 2, 3, 4, 5, 6 fois jusqu'à obtenir une réponse immunitaire humorale satisfaisante. Chaque administration peut être espacée d'un ou plusieurs jours, typiquement de 7 à 30 jours. Les étapes de la méthode de préparation selon l'invention varient selon que l'on souhaite obtenir un anticorps monoclonal, polyclonal ou encore un anticorps chimérique ou humanisé. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus à partir de cellules productrices d'anticorps, par exemple des lymphocytes B, prélevées après immunisation de l'animal non-humain. Dans ce cas, on utilise la technique classique de préparation d'hybridomes bien connue de l'homme du métier.
Un anticorps polyclonal peut être obtenu à partir du plasma sanguin de l'animal non-humain, prélevé après immunisation, en mettant en œuvre des étapes classiques de purification comme des étapes de centrifugation, de précipitation et de chromatographies d'affinité, en particulier en utilisant comme ligand d'affinité le peptide dérivé de Nav 1.9 présent dans le composé antigénique utilisé pour immuniser l'animal non-humain ou la protéine hNav 1.9 elle-même. On préfère utiliser une chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand d'affinité est choisi parmi le groupe constitué par le peptide de séquence SEQ ID N°l, le peptide de séquence SEQ ID n°2 et le peptide de séquence SEQ ID N°3.
Selon un aspect supplémentaire, l'invention a également pour objet une méthode de sélection d'un anticorps dirigé contre hNav 1.9 adapté à une utilisation pour la détection ou la quantification de hNav 1.9 dans un échantillon biologique, de préférence un échantillon tissulaire, par exemple un échantillon de peau, ladite méthode de sélection comprenant les étapes consistant à :
(a) fournir un ou plusieurs anticorps susceptibles d'être dirigé contre hNav 1.9,
(b) mettre en contact le ou les anticorps fournis à l'étape (a) avec un peptide ayant au moins 90%, de préférence 100%, d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, ledit peptide étant de préférence immobilisé sur un support, et
(c) sélectionner le ou les anticorps ayant formé un complexe avec le peptide à l'étape (b). Le ou les anticorps de l'étape (a) peuvent être fournis sous la forme d'une solution comprenant un mélange d'anticorps, par exemple une solution dérivant d'un plasma sanguin, sous une forme isolée (purifiée ou pré-purifiée), chaque anticorps étant testé séparément, ou encore sous la forme d'une librairie d'anticorps exprimée à la surface de phages ou de cellules.
Il va de soi que la présente invention concerne également un anticorps dirigé contre Nav 1.9 obtenu ou susceptible d'être obtenu par l'une des méthodes de préparation ci-dessus décrites.
■ Utilisations de l'anticorps selon l'invention
Comme mentionné précédemment, les anticorps selon l'invention sont particulièrement adaptés pour une utilisation pour la détection et/ou la quantification de Nav 1.9 dans des échantillons biologiques, en particulier des échantillons tissulaires humains. Les anticorps selon l'invention sont donc utilisables en tant qu'outil diagnostique. Ces anticorps trouvent des applications, entre autres, en anapathologie, en médecine légale et en recherche médicale.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les Demandeurs sont également d'avis qu'une surexpression de Nav 1.9 au niveau des neurones sensitifs, en particulier au niveau des terminaisons nerveuses, est impliquée dans la pathogénèse de certaines pathologies se caractérisant par des douleurs aiguës. A cet égard, les Demandeurs ont mis en évidence l'expression de hNav 1.9 au niveau des corps cellulaires des neurones du ganglion trijumeau mais également au niveau des fibres nerveuses sensitives de la pulpe dentaire, à partir d'échantillons humains de dents de sagesse. hNav 1.9 peut donc être considéré comme un marqueur pour le diagnostic de pathologies associée à une douleur orofaciale.
Les Demandeurs ont également montré que Nav 1.9 est exprimé au niveau des ganglions du plexus myentérique (également appelé plexus d'Auerbach) présent dans des résidus chirurgicaux sains de côlon de patients atteints de cancer Les Demandeurs sont également d'avis que Nav 1.9 est exprimé au niveau du plexus sous-muqueux (également appelé plexus de Meissner). De manière plus générale, les Demandeurs sont d'avis que hNavl.9 est également un marqueur pour le diagnostic de certaines pathologies touchant l'appareil gastro- intestinal et se caractérisant par des douleurs entériques ou un inconfort abdominal.
Ainsi, un objet supplémentaire selon l'invention est l'utilisation d'un anticorps tel que décrit précédemment pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique humain, de préférence un échantillon tissulaire. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour le diagnostic, le pronostic et/ou la prédiction d'une pathologie associée à une douleur entérique ou à une douleur orofaciale. Dans certains modes de réalisation, la pathologie est une pathologie inflammatoire. En d'autres termes, une pathologie selon l'invention peut être une maladie (ou un désordre) associée, causée ou impliquant une réaction inflammatoire.
Au sens de l'invention, on entend par « diagnostic » une méthode permettant de déterminer si un individu est effectivement atteint par une pathologie associée à une douleur entérique ou à une douleur orofaciale. On entend par « pronostic » une méthode permettant d'évaluer l'évolution d'une pathologie associée à une douleur entérique ou à une douleur orofaciale chez un patient qui en est atteint, éventuellement en présence d'un traitement thérapeutique. On entend par « prédiction » une méthode permettant d'évaluer si un individu est susceptible de développer ladite pathologie associée à une douleur entérique ou une douleur orofaciale. Au sens de l'invention, on entend par « une pathologie associée à une douleur entérique » une maladie ou un désordre dont un des symptômes possibles est une douleur entérique. Les patients atteints par une pathologie associée à une douleur entérique englobe les patients atteints par ladite pathologie et souffrant effectivement d'une douleur entérique ainsi que les patients atteints par ladite pathologie mais qui ne présentent pas, ou qui n'ont pas encore développé, une douleur entérique. Une douleur entérique fait référence à une douleur touchant, ou trouvant son origine, dans un tissu ou un organe de l'appareil digestif. Il peut s'agir d'une douleur œsophagienne, d'une douleur gastrique, d'une douleur épigastrique, d'une douleur intestinale ou d'une douleur rectale. De préférence, il s'agit d'une pathologie affectant l'intestin grêle, et/ou le côlon et/ou le rectum. A titre d'exemple, il peut s'agir d'un syndrome de l'intestin irritable ou d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Les principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse (également appelé rectocolite hémorragique). Ces pathologies englobent également la pochite et les colites dites microscopiques telles que les colites collagénique et lymphocytaire.
Au sens de l'invention, on entend par « pathologie associée à une douleur orofaciale » une maladie ou un désordre dont un des symptômes possibles est une douleur orofaciale. Les patients atteints par une pathologie associée à une douleur orofaciale englobe les patients atteints par ladite pathologie et souffrant effectivement d'une douleur orofaciale ainsi que les patients atteints par ladite pathologie mais qui ne présentent pas, ou qui n'ont pas encore développé, une douleur orofaciale. On entend par « douleur orofaciale » une douleur affectant une zone du visage, du cou, de la bouche ou de la sphère ORL en particulier de l'oreille ou du nez. Il peut s'agir d'une douleur affectant un muscle ou une articulation faciale, d'une douleur dentaire ou encore d'une névralgie faciale.
De préférence, la pathologie associée à une douleur orofaciale est choisie dans le groupe constitué parmi une hypersensibilité dentaire (dents sensibles), une pulpite, une odontalgie, une douleur des muscles maxillaires ou des articulations temporo-mandibulaires, une névralgie, de préférence idiopathique, du nerf trijumeau, une céphalée, et une brûlure idiopathique de la langue et de la bouche.
Typiquement, les utilisations selon l'invention sont des utilisations ex vivo, plus exactement in vitro. En particulier, ces utilisations ne couvrent pas des utilisations dans lesquelles l'anticorps serait en interaction directe avec le corps humain ou un animal. Les utilisations selon l'invention comprennent généralement la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique du patient à l'aide d'un anticorps selon l'invention. En d'autres termes, les utilisations selon l'invention comprennent généralement la mise en contact d'un échantillon biologique du patient dans des conditions permettant la formation d'un complexe immun entre Nav 1.9, potentiellement présent dans l'échantillon, et l'anticorps dirigé contre Nav 1.9, ce par quoi l'expression de Nav 1.9 dans l'échantillon biologique peut être détectée et/ou quantifiée. Comme cela sera exprimé ci-après, l'échantillon biologique peut subir un certain nombre de traitement avant la mise en contact avec l'anticorps dirigé contre Nav 1.9. La présente invention concerne également une méthode in vitro de diagnostic ou de pronostic d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique chez un individu, ladite méthode comprenant la détection de Nav 1.9, à l'aide d'un anticorps selon l'invention, dans un échantillon biologique de l'individu. Plus précisément, cette méthode peut comprendre les étapes consistant à:
(a) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9 dans un échantillon biologique du patient avec un anticorps selon l'invention, et
(b) comparer l'expression de Navl.9 obtenue à l'étape (a) avec l'expression de Navl.9 détectée ou quantifiée dans un ou plusieurs échantillons biologiques provenant d'un ou plusieurs sujets contrôles.
Dans certains modes de réalisations, le ou les sujets contrôles sont des individus souffrant de la pathologie que l'on souhaite diagnostiquer chez le patient. Dans ce mode de réalisation, on peut considérer que le patient souffre, ou est très susceptible de souffrir à court terme, de ladite pathologie si l'expression de Nav 1.9 déterminée à l'étape (a) est au moins égale à celle détectée dans les échantillons des sujets contrôles. Si l'expression de Nav 1.9 déterminée à l'étape (a) est significativement inférieure à celle détectée pour les sujets contrôles, le diagnostic est négatif. Enfin, si l'expression de Nav 1.9 déterminée à l'étape (a) n'est que très légèrement inférieure à celle déterminée pour les sujets contrôles, le patient peut être diagnostiqué comme un patient à risque, c'est-à-dire un patient susceptible de développer la pathologie considérée.
Dans d'autres modes de réalisation, le ou les sujets contrôles correspondent à des patients sains, c'est-à-dire à des individus qui ne souffrent pas de la pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique. Dans ces modes de réalisations, le patient est diagnostiqué comme souffrant de la maladie considérée, ou susceptible d'en souffrir (c'est-à-dire diagnostiqué comme un patient à risque), si son échantillon biologique présente une expression de Nav 1.9 supérieure à celle du ou des échantillons provenant des patients sains. En revanche, si l'expression de Nav 1.9 déterminée à l'étape (a) est inférieure ou égale à celle des échantillons provenant des patients contrôles (sains), alors le diagnostic peut être considéré comme négatif. On peut considérer que l'échantillon du patient est positif si l'échantillon présente une expression pour Nav 1.9 au moins 10% supérieure, de préférence au moins 20% voire au moins 50% supérieure à celle du ou des échantillons des patients sains.
La détection ou la quantification de Nav 1.9 dans les échantillons biologiques du ou des sujets contrôles peuvent être concomitantes à celles effectuées pour l'échantillon du patient ou provenir de données collectées antérieurement et disponibles, par exemple, sur une base de données.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour évaluer l'efficacité d'un médicament dans le traitement d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique telle que décrite précédemment. Afin de suivre l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une maladie cutanée inflammatoire chez un patient, on peut mettre en œuvre les étapes suivantes:
(a) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9, à l'aide de l'anticorps selon l'invention, dans un échantillon biologique du patient avant traitement,
(b) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9, à l'aide de l'anticorps selon l'invention, dans un échantillon biologique du patient après traitement, et
(c) comparer l'expression de Navl.9 de l'étape (a) avec l'expression de Navl.9 de l'étape (b).
L'efficacité du traitement est déterminée en comparant les expressions de Nav 1.9 dans les échantillons (a) et (b). Si l'expression de Nav 1.9 est plus faible dans l'échantillon de l'étape (b) que dans l'échantillon de l'étape (a), ceci signifie que le traitement est efficace. S'il y a une augmentation de l'expression de Nav 1.9, on peut considérer que le traitement est peu actif ou inactif selon l'importance de la variation observée. Dans certains modes réalisations, on considère que le traitement a un effet thérapeutique sur la pathologie considérée s'il implique une diminution d'expression de Nav 1.9 d'au moins 10%, de préférence d'au moins 20%, de manière encore plus préférée d'au moins 50%.
De préférence, dans les deux étapes (a) et (b), on utilise le même anticorps selon l'invention. Un autre objet selon l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour le suivi in vitro de l'évolution d'une pathologie associée à une douleur entérique ou orofaciale telle que décrite ci-avant. Pour ce faire, les étapes suivantes peuvent être réalisées :
(a) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9, à l'aide d'un anticorps selon l'invention, dans un premier échantillon biologique du patient à un temps tl,
(b) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9, à l'aide d'un anticorps selon l'invention, dans un second échantillon biologique du patient, à un temps t2 postérieur au temps tl, et
(c) comparer l'expression de Navl.9 de l'étape (b) avec l'expression de Navl.9 de l'étape (a).
De préférence, dans les deux étapes (a) et (b), on utilise le même anticorps selon l'invention. La comparaison des taux d'expressions de Nav 1.9 dans l'étape (c) est un critère permettant de déterminer la progression ou le stade de la maladie considérée. Il est ainsi possible de déterminer si la maladie est en régression, stationnaire ou s'aggrave.
Si l'échantillon de l'étape (b) présente un taux d'expression de Nav 1.9 inférieur au taux d'expression mesuré à l'étape (a), il peut être conclu que la pathologie considérée est en régression. A l'inverse, si l'échantillon de l'étape (b) présente un taux d'expression de Nav 1.9 supérieur à celui mesuré à la première étape, la pathologie est en voie de progression. Le temps t2 peut être postérieur d'au moins 1 mois, de préférence d'au moins 6 mois, voire d'au moins 1 an au temps tl.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour générer des données et/ou des informations utiles pour diagnostiquer, et/ou pour prédire et/ou pour suivre l'évolution d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique, ces méthodes pouvant contenir l'une quelconque des combinaisons d'étapes ci-dessus décrites. Dans l'ensemble des méthodes et utilisations ci-dessus décrites, la pathologie associée à une douleur orofaciale de préférence une hypersensibilité dentaire ou une névralgie, ou à une douleur entérique de préférence le syndrome de l'intestin irritable ou la maladie de Crohn Dans les utilisations et méthodes ci-dessus décrites, la nature des échantillons biologiques varie en fonction de la finalité recherchée, et de la pathologie à diagnostiquer ou à pronostiquer. De manière générale, l'échantillon biologique est un échantillon tissulaire comprenant des ganglions et/ou des fibres nerveuses sensitives innervant une région de l'appareil digestif, en particulier le côlon, l'intestin grêle ou le rectum, ou une zone orofaciale. Lorsque l'anticorps est utilisé pour détecter et quantifier hNav 1.9 en recherche médicale ou en médecine légale, l'échantillon biologique peut être tout type d'échantillon tissulaire adapté, prélevé post-mortem
Lorsque l'anticorps est utilisé à des fins diagnostiques chez un patient, l'échantillon biologique peut correspondre à une biopsie ou à un résidu opératoire.
Lorsque la pathologie à diagnostiquer ou à pronostiquer est une pathologie associée à une douleur entérique, l'échantillon biologique peut être une biopsie prélevée au cours d'une endoscopie ou d'une coloscopie ou encore au cours d'une chirurgie viscérale. A titre alternatif, il peut s'agir d'un résidu opératoire obtenu au cours d'une résection intestinale ou rectale. Pour le diagnostic ou le pronostic d'une pathologie associée à une douleur entérique, l'échantillon biologique est de préférence un échantillon de ganglions myentériques, un échantillon de ganglions du plexus sous-muqueux ou encore un échantillon comprenant des fibres nerveuses du plexus myentérique ou du plexus sous-muqueux. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de côlon ou d'intestin grêle.
Lorsque la pathologie à diagnostiquer ou à pronostiquer est une pathologie associée à une douleur orofaciale, l'échantillon biologique peut être un échantillon de pulpe dentaire. Cet échantillon de pulpe dentaire peut être obtenu après extraction d'une dent définitive ou d'une dent de lait ou par prélèvement à l'aide d'un moyen adapté au travers de la couronne dentaire.
L'échantillon de pulpe dentaire peut être radiculaire ou coronaire. A titre alternatif, il peut s'agir également d'une biopsie d'un tissu comprenant des fibres nerveuses du nerf trijumeau. Comme cela est détaillé ci-après, l'échantillon biologique peut subir un ou plusieurs traitements afin de permettre la détection ou la quantification de Nav 1.9 par un anticorps selon l'invention.
Les méthodes et utilisations selon l'invention sont généralement basées sur une étape de mise en contact de l'échantillon biologique avec l'anticorps selon l'invention dans des conditions permettant la formation d'un complexe immun entre Nav 1.9, potentiellement présent dans l'échantillon, et ledit anticorps. La détection et/ou la quantification de Nav 1.9 dans l'échantillon est en général réalisée via la formation et éventuellement la détection du complexe immun. La détection et/ou la quantification de Nav 1.9 à l'aide d'un anticorps selon l'invention peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par immunodosage, par western blot ou par immunomarquage, en particulier par immunohistochimie ou par immunocytochimie. A titre d'exemple de techniques d'immuno- dosages, on peut citer les dosages radio-immunologiques (RIA), les dosages immunologiques « magnétiques » (magnetic immunoassay MIA), les tests ELISA en sandwich ou par compétition. La quantification et/ou la détection de Nav 1.9 dans un échantillon biologique peut être basée sur une étape séparative par immuno-chromatographie dans laquelle l'anticorps selon l'invention est utilisé en tant que ligand d'affinité. Il peut être envisagé de détecter ou de quantifier Nav 1.9 dans un échantillon biologique par immunoprécipitation ou encore par résonance plasmonique de surface dans laquelle l'anticorps selon l'invention est immobilisé à la surface du senseur.
Les techniques préférées sont Γ immunohistochimie et le western blot. Il s'agit là de techniques bien connues de l'homme du métier. Des exemples de mises en œuvre sont présentés dans la partie expérimentale de la présente demande.
Brièvement, la technique par western blot comprend la préparation d'un extrait protéique à partir de l'échantillon biologique, la mise en œuvre d'une étape d'électrophorèse généralement en conditions dénaturantes (gel SDS-PAGE), le transfert des protéines ayant migré sur une membrane puis une étape d'immunodétection à l'aide d'un anticorps primaire (anticorps anti-Nav 1.9 selon l'invention) puis une étape de révélation du complexe anticorps- Nav 1.9 éventuellement formé.
Pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique par western blot, on préfère utiliser un anticorps selon l'invention dirigé contre un épitope inclus dans un peptide de séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°3.
La technique d' immunohistochimie comprend la préparation d'une coupe tissulaire qui peut être soit cryofixée, soit fixée chimiquement. La coupe de tissu peut être en option réhydratée avant la mise en contact avec l'anticorps selon l'invention. L'échantillon est incubé avec l'anticorps selon l'invention dans des conditions favorables à la formation du complexe anticorps-Nav 1.9. La détection du complexe peut être effectuée directement si l'anticorps est couplé à un moyen de détection ou, le cas échéant à l'aide d'un anticorps secondaire. En général, le moyen de détection couplé à l'anticorps selon l'invention, ou le cas échéant, à l'anticorps secondaire est une molécule fluorescente. La détection des complexes Nav 1.9- anticorps selon l'invention peut alors être effectuée par microscopie à fluorescence. Dans certains modes de réalisation, afin de visualiser les structures cellulaires au niveau desquelles une expression de Nav 1.9 est attendue, un co-marquage avec un second anticorps peut être effectué. A titre d'exemple, afin de visualiser les fibres nerveuses sensitives susceptibles d'exprimer Nav 1.9 au niveau de la pulpe dentaire, un co-marquage avec un anticorps anti- périphérine peut être réalisé. Les anticorps selon l'invention sont particulièrement adaptés à une utilisation en immunomarquage.
Les anticorps dirigés contre un épitope inclus dans les séquences SEQ ID N°l et SEQ ID N°3 sont utilisables sur tissus cryofixés ou chimiquement fixés. Ces anticorps sont également utilisables en immunocytochimie.
Les anticorps selon l'invention dirigés contre un épitope contenu dans SEQ ID N°2 sont de préférence utilisés pour détecter ou quantifier Nav 1.9 sur des coupes tissulaires cryofixées. Dans certains modes de réalisations, les méthodes et utilisations selon l'invention peuvent comprendre la détection d'un marqueur supplémentaire à Nav 1.9 ou l'évaluation d'un symptôme particulier de la pathologie considérée.
Enfin, l'invention concerne également un kit pour le diagnostic d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique comprenant un anticorps selon l'invention et en option un moyen de détection dudit anticorps. Le kit diagnostic peut également comprendre un ou plusieurs objets supplémentaires, par exemple, une notice explicative pour la mise en œuvre du test diagnostic, un ou plusieurs réactifs pour la préparation de l'échantillon biologique, ou encore un ou plusieurs moyens utiles pour le prélèvement de l'échantillon biologique. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un kit comprenant un anticorps selon l'invention et en option un moyen de détection dudit anticorps dans le diagnostic in vitro d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Ces exemples doivent être considérés comme illustratifs et en aucun cas comme limitant la portée de l'invention.
Exemples
Exemple 1 : préparation d'anticorps polyclonaux
Anticorps Rbaa4 et Rbaa6 :
Deux lapins ont été, chacun, immunisés avec un mélange peptidique contenant les 2 peptides (SEQ ID N°l et SEQ ID N°3) couplés à KLH (calendrier ci-après). Contrôle de la réponse immunitaire par ELIS A. Purification sur colonne d'affinité (couplage Hi-trap NHS) des prélèvements J63 et J77.
L'anticorps Rbcca4 a été isolé par un procédé de purification comprenant une étape de chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand immobilisé était le peptide de SEQ ID N°l. L'anticorps Rbccaô a été isolé par un procédé de purification comprenant une étape de chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand immobilisé était le peptide de SEQ ID N°3.
Anticorps 3881.2 et 3881.1 :
Deux lapins ont été, chacun, immunisés avec un mélange peptidique contenant les 2 peptides (SEQ ID N°2 et SEQ ID N°4) couplés à KLH (calendrier ci-après). Purification sur colonne d'affinité (AF-Amino TOYOPEARL/MBS) des prélèvements J28. L'anticorps 3881.1 a été isolé par un procédé de purification comprenant une étape de chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand immobilisé était le peptide de SEQ ID N°2. L'anticorps 3881.2 a été isolé par un procédé de purification comprenant une étape de chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand immobilisé était le peptide de SEQ ID N°4.
Figure imgf000022_0001
Exemple 2 : Caractérisations des anticorps 1. Immunofluorescence sur systèmes hétérologues
Un système d'expression hétérologue a été utilisé pour sélectionner les anticorps et tester leur spécificité. Des cellules HEK-293 ont été transfectées : 1) avec un plasmide contenant la séquence nucléique codant pour la sous-unité alpha Navl.9 humaine étiquetée myc à son extrémité C-terminale ou 2) avec les séquences codant pour Nav 1.5 ou Nav 1.7 humains (hNavl.5 et hNavl.7). Ces derniers n'étant pas étiquetés, ils ont été co-transfectés avec un plasmide codant pour l'expression de la GFP. .
24 h après transfection, les cellules ont été fixées au paraformaldéhyde 2% (PAF), perméabilisées au triton 0,1% puis incubées avec l'anticorps anti-hNav 1.9 à tester. L'expression de hNavl.9 est testée par un co-marquage avec un anticorps monoclonal anti- myc alors que l'expression de hNavl.5 et hNavl.7 est testée avec un anticorps PanNav, reconnaissant tous les canaux sodiques.
- Résultats
Le marquage du système hétérologue exprimant hNavl.9-myc avec l'anticorps Rbaa4 ou l'anticorps Rbaaô est co-localisé avec le marquage anti-myc. On ne distingue aucun marquage par Rbaa4 et Rbaaô des cellules non-transfectées, ce qui montre que ces anticorps ne se lient pas à une protéine endogène. A titre d'illustration, la Figure 1 montre les résultats de co-marquage avec l'anticorps monoclonal anti-Myc et l'anticorps polyclonal Raab4 pour des cellules recombinantes exprimant hNavl.9-Myc (Figure 1A) et des cellules non- recombinantes (Figure 1B). Des marquages identiques ont été obtenus pour l'anticorps Rbaaô (données non montrées).
Il apparaît également que les anticorps Rbaa4 et Rbaaô ne marquent pas les systèmes hétérologues exprimant hNav 1.5 et hNav 1.7, dont le pourcentage d'identité est de 56 % et 55 % avec hNavl.9. Ceci montre que Rbaa4 et Rbaaô n'ont pas de réactivité croisée vis-à-vis de hNav 1.5 et hNavl.7. A cet égard, la Figure 2 montre les résultats d'immunomarquage avec l'anticorps Rbaa4 des cellules HEK exprimant hNavl.5, identifiées par la GFP (Figure 2A) et des cellules HEK exprimant hNavl.7, identifiées par la GFP (Figure 2B). Alors que le signal émis par la GFP est clairement visible, le marquage avec Rbaa4 des cellules est très faible voire inexistant. Le marquage avec un anticorps monoclonal anti-PanNav a confirmé une expression correcte de hNav 1.5 ou hNav 1.7 par les cellules HEK. Des marquages identiques ont été obtenus pour l'anticorps Rbaaô (données non montrées). Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô reconnaissent donc de manière spécifique hNav 1.9 et ne présentent pas de réactivité croisée avec hNav 1.5 et hNav 1.7.
Aucun marquage n'est détecté avec l'anticorps 3888.1 que ce soit avec les cellules transfectées ou non-transfectées. Cette absence de détection résulte du procédé de fixation chimique qui doit induire une altération de la conformation de la région de hNav 1.9 reconnue par cet anticorps. En revanche, cet anticorps marque de manière très efficace et sensible des tissus cryofixés (voir ci-après). L'anticorps dirigé contre le peptide SEQ ID N°4 est incapable de détecter hNav.1.9, quel que soit le système cellulaire et le tissu analysé.
2. Western Blot
Des analyses par western blot d'extraits protéiques issus de la lyse des cellules HEK transfectées avec hNavl.9 ont été réalisés afin de conforter la spécificité de détection des anticorps Rbaa4 et Rbaaô.
- Résultats
Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô reconnaissent une bande ayant un poids moléculaire aux alentours de 250 kDa (Figure 2). Cette bande est aussi présente lors de la détection avec l'anticorps anti-myc. De plus, cette bande n'est pas détectée pour l'extrait provenant de cellules non transfectées (contrôle négatif). Le poids moléculaire de la bande spécifique est un peu plus haut que le poids moléculaire attendu pour hNav 1.9-Myc (210 kDa environ). Cette différence de poids moléculaire est certainement attribuable à des modifications post- traductionnelles, en particulier à des glycosylations. Une expérience de déglycosylation sur le lysat protéique a été réalisée et a mis en évidence une diminution de l'intensité de la bande à 250 kDa, ce qui conforte cette hypothèse.
Exemple 3 : Immunohistochimie sur tissus humains
Des essais d'immunomarquage de ganglions myentériques, de pulpe dentaire et de ganglions trijumeaux humains ont été réalisés à l'aide des anticorps Rbaa4, Rbaaô et 3881.1.
■ Préparation des échantillons biologiques
Ganglions myentériques : Les résidus opératoires de côlon (parties saines) sont récupérés rapidement après prélèvement, placés sur glace dans du Krebs carbogéné, additionné de bloqueurs de la contraction musculaire (atropine, 2 μΜ et nicardipine, 6 μΜ), avant dissection.
Composition du Krebs carbogéné (en mM) : 118 NaCl, 4.8 KC1, 1 NaH2P04, 25 NaHC03, 1.2 MgC12, 2.5 CaC12 et 11 Glucose, équilibré à pH 7.4 avec 95% 02-5% C02.
La dissection consiste à enlever la muqueuse, la sous-muqueuse et à réduire l'épaisseur du tissu en enlevant un peu de muscle (longitudinal et circulaire) de manière à rendre accessible les neurones des ganglions myentériques (Osorio et Delmas, 2010, Nature Protocols, 6(1) : 15-27). Le tissu est ensuite incubé lh dans du PBS 4% sucrose (masse/volume) à 4°C, puis 12h dans du PBS 20% sucrose, toujours à 4°C.
Composition du PBS (en mM) : 140 NaCl, 10 mM P04 Buffer (NaHP04 et NaH2P04), 3 mM KCI, pH 7.2.
Pulpe dentaire : Après prélèvement, la dent est conservée dans du PBS à 4°C. La pulpe dentaire est extraite de l'émail, puis incubé lh dans du PBS 4% sucrose (masse/volume) à 4°C, puis 12h dans du PBS 20% sucrose, toujours à 4°C.
Ganglion trijumeau : Après prélèvement (12-24h post-mortem), les ganglions sont incubés 2h dans du PBS 4% sucrose (masse/volume) à 4°C, puis 12h dans du PBS 20% sucrose, toujours à 4°C.
Enfin, les tissus sont inclus dans de l'OCT et congelés dans de l'isopentane rafraîchi avec de la carboglace. Les blocs sont stockés au -80°C.
Les coupes transverses de 15-30 μιη sont faites au cryostat, montées sur des lames Superfrost, séchées (lh sous Sorbonne) puis stockées au -80°C jusqu'à utilisation.
A la sortie du congélateur, les lames sont séchées 30 min sous une sorbonne.
Les tissus peuvent ensuite être traités de deux manières différentes selon que l'anticorps primaire nécessite un tissu cryofixé ou fixé chimiquement. Ils sont donc :
Réhydratées avec du PBS pendant lh : tissu cryofixé
ou fixés avec du paraformaldéhyde (PAF) 4% (volume/volume) pendant 10 min, puis rincées 4 x 10 min dans du PBS : tissu fixé chimiquement
■ Protocole d'immunomarquage
Les coupes sont incubées lh30 à température ambiante dans un milieu de saturation : PBS + 3% (masse/volume) BSA + 0.3% (volume/volume) Triton X-100. Les anticorps primaires sont ajoutés au milieu de saturation pour une incubation de 12 h à 4°C en chambre humide. Les coupes sont ensuite rincées 4 fois 15 min dans du PBS avant 45 min d'incubation à à température ambiante avec les anticorps secondaires dans du PBS + 3% (masse/volume) BSA en chambre humide. Enfin, les coupes sont rincées 4 fois 15 min dans du PBS avant d'être montées dans un milieu de montage (Mowiol ou Prolong Gold)
Des co-marquages avec un anticorps anti-HuC/D ou anti-NF200 pour les ganglions myentériques, avec un anticorps anti-périphérine pour la pulpe dentaire ou avec un anticorps anti-NF200 pour le ganglion trijumeau ont été réalisés afin de visualiser les corps cellulaires ou les fibres des neurones. ■ Résultats
Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô donnent un marquage intéressant de Nav 1.9 pour les différents tissus humains testés, qu'ils soient chimiquement ou cryo-fixés. Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô sont ainsi capables de détecter la présence de Nav 1.9 au niveau de coupes transversales de côlon, de pulpe dentaire, et de ganglions trijumeaux après fixation chimique ou cryofixation. Des exemples d'immunomarquages (non-exhaustifs) obtenus par les Demandeurs avec les anticorps Rbaa4 et Rbaaô sont illustrés par les Figures 4 et 5 (côlon), 7 et 8 (pulpe dentaire) et 11 (ganglion trijumeau).
L'anticorps 3881.1 marque de manière très efficace et sensible les tissus cryo-fixés, en particulier de pulpe dentaire (Figures 9 et 10) et de plexus myentérique (Figure 6). En revanche, l'anticorps 3881.1 est inefficace sur tissu fixé chimiquement (données non montrées) et donne un marquage faible des ganglions trijumeau.
Le marquage obtenu pour les coupes de côlon révèle que certains neurones du plexus myentérique expriment fortement Nav 1.9 (neurones immunopositifs) alors que d'autres sont immunonégatifs. Un tel résultat suggère que Nav 1.9 est exprimé par une sous-population de neurones du plexus myentérique. Aucun marquage des muscles longitudinal et circulaire n'a été détecté, ce qui confirme la spécificité des anticorps selon l'invention.
La pulpe dentaire est innervée par un grand nombre de fibres nerveuses non-myélinisée ou faiblement myélinisée de la branche mandibulaire du nerf trijumeau Les immunomarquages de la pulpe dentaire coronaire et radiculaire par les anticorps selon l'invention ont montré que Nav 1.9 est essentiellement exprimé au niveau des fibres non-myélinisées et positives à la périphérine. On note également que le marquage de Nav 1.9 n'est pas uniforme, contrairement à ce qui est observé pour la périphérine, ce qui suggère la présence de « cluster » d'expression pour Nav 1.9.
Enfin, immunomarquage de coupes de ganglion trijumeau a montré que Nav 1.9 est présent au niveau des corps cellulaires de neurones sensitifs de petite et moyenne taille.
Ces expériences d' immunomarquage démontrent que les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés pour la détection de hNav 1.9 au niveau de différents tissus humains par immunohistochimie. Ces expériences suggèrent également l'implication de Nav 1.9 dans la transmission de la douleur orofaciale, en particulière dentaire, et dans des pathologies associées à une douleur entérique. Tableau de séquences
Référence Séquence
Peptide inclus dans l'extrémité N-terminale de hNavl.9 :
SEQ ID N01
IAIQKEKKKSKDQTGEV
Peptide de la boucle intracellulaire I-II
SEQ ID N°2
ESGKDQPPGSDSDEDC
Peptide de la boucle intracellulaire II- III
SEQ ID N°3
Q A YELHQENKKPTS QR V
Peptide de la boucle intracellulaire II- III
SEQ ID N°4
SNEERNGNLEGEARK

Claims

Revendications
1. Anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à un épitope inclus dans un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3.
2. Anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain selon la revendication 1 en ce qu'il est adapté à une utilisation pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique humain.
3. Anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain selon la revendication 1 ou 2, ledit anticorps étant un anticorps polyclonal.
4. Anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain selon la revendication 1 ou 2, ledit anticorps étant choisi parmi un anticorps monoclonal, de préférence une immunoglobuline (Ig), un anticorps à simple domaine (sdab), ou une IgNar, un polypeptide comprenant un domaine variable d'un anticorps tel qu'un ScFv, un VH, un VHH, un VNAR, un Fab, et les versions chimériques ou humanisés de ceux-ci.
5. Anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il ne se lie pas à Nav 1.5 et Nav 1.7.
6. Anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'anticorps ou de cellules exprimant des anticorps provenant d'un animal non-humain immunisé avec un composé antigénique comprenant au moins un peptide de SEQ ID N° 1 , SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou un peptide ayant une séquence qui diffère de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3 en vertu d'une, de deux, ou de trois modifications d'acide aminé.
7. Anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce qu'il est couplé à un moyen de détection, de préférence choisi parmi une enzyme produisant un signal détectable telle que la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la 3-galactosidase, ou la glucose-6-phosphate déshydrogénase, un chromophore, un composé fluorescent, un composé luminescent, un radionucléide tel que 32 P, 35 S ou 125 I, une particule métallique, par exemple une nanoparticule d'or, une biotine, une streptavidine, une avidine, un sucre ou une lectine.
8. Méthode de préparation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain comprenant une étape d'immunisation d'un animal non-humain avec un composé antigénique comprenant au moins un peptide de SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou un peptide ayant une séquence qui diffère de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3 en vertu d'une, de deux, ou de trois modifications d'acide aminé.
9. Méthode de préparation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain selon la revendication 8 dans laquelle le composé antigénique comprend une protéine porteuse couplée à une ou plusieurs copies dudit peptide.
10. Méthode de préparation selon la revendication 8 ou 9 comprenant, en outre, la récupération de l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain à partir du plasma sanguin de l'animal non-humain, après immunisation.
11. Méthode de préparation selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain est produit par un hybridome obtenu à partir d'une cellule exprimant des anticorps, de préférence un lymphocyte B provenant de l'animal non-humain après immunisation.
12. Anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain susceptible d'être obtenu selon l'une quelconque des revendications 8 à 11.
13. Utilisation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 12 pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique humain.
14. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 12 caractérisé en ce que l'échantillon est un résidu chirurgical, une biopsie ou un prélèvement post-mortem.
15. Utilisation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 7 ou 12 pour le diagnostic, le pronostic et/ou la prédiction in vitro d'une pathologie, de préférence à caractère inflammatoire, associée à une douleur entérique ou à une douleur orofaciale.
16. Utilisation selon la revendication 15 dans laquelle la pathologie associée à une douleur entérique est choisie parmi le groupe constitué par un syndrome de l'intestin irritable et une maladie inflammatoire chronique intestinale telle que la maladie de Crohn et une colite ulcéreuse.
17. Utilisation selon la revendication 15 dans laquelle la pathologie associée à une douleur orofaciale est choisie parmi le groupe constitué par une hypersensibilité dentaire (dents sensibles), une pulpite, une odontalgie, une douleur des muscles maxillaires ou des articulations temporo-mandibulaires, une névralgie, de préférence idiopathique, une céphalée, du nerf trijumeau et une brûlure idiopathique de la langue et de la bouche.
18. Utilisation selon l'une quelconques des revendications 13 à 17 dans laquelle l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 est utilisé pour détecter ou quantifier Nav 1.9 dans un échantillon biologique choisi parmi un échantillon comprenant des ganglions et/ou des fibres nerveuses sensitives innervant une région de l'appareil digestif ou une zone orofaciale.
19. Utilisation selon la revendication 18 dans laquelle l'échantillon tissulaire est choisi parmi un échantillon de pulpe dentaire, un échantillon de ganglions myentériques, un échantillon de ganglions du plexus sous-muqueux, un échantillon comprenant des fibres nerveuses du plexus myentérique ou sous-muqueux.
20. Utilisation selon l'une des revendications 13-19 dans laquelle Nav 1.9 est détecté ou quantifié par immunodosage, par western blot ou par immunomarquage, de préférence par immunohistochimie.
21. Kit pour le diagnostic d'une pathologie, de préférence à caractère inflammatoire, provoquant une douleur viscérale ou une douleur orofaciale, comprenant au moins un anticorps dirigé contre Nav 1.9 tel que défini dans l'une des revendications 1 à 7 ou 12 et en option un moyen de détection dudit anticorps.
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