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WO2013061859A1 - 細胞濃縮液の製造方法 - Google Patents

細胞濃縮液の製造方法 Download PDF

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WO2013061859A1
WO2013061859A1 PCT/JP2012/076964 JP2012076964W WO2013061859A1 WO 2013061859 A1 WO2013061859 A1 WO 2013061859A1 JP 2012076964 W JP2012076964 W JP 2012076964W WO 2013061859 A1 WO2013061859 A1 WO 2013061859A1
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WO
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cell
cell suspension
cells
hollow fiber
separation membrane
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/076964
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English (en)
French (fr)
Inventor
修平 谷口
Original Assignee
株式会社カネカ
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Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
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Priority to JP2013540746A priority patent/JP6204193B2/ja
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    • B01D—SEPARATION
    • B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
    • B01D63/02—Hollow fibre modules
    • B01D63/031—Two or more types of hollow fibres within one bundle or within one potting or tube-sheet
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/26—Polyalkenes
    • B01D71/261—Polyethylene
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/06—Organic material
    • B01D71/66—Polymers having sulfur in the main chain, with or without nitrogen, oxygen or carbon only
    • B01D71/68—Polysulfones; Polyethersulfones
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
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    • B01D—SEPARATION
    • B01D2323/00—Details relating to membrane preparation
    • B01D2323/02—Hydrophilization
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2325/00—Details relating to properties of membranes
    • B01D2325/20—Specific permeability or cut-off range

Definitions

  • the present invention relates to a technique for concentrating cells from a cell suspension. More specifically, the present invention relates to a method for producing a cell concentrate using a cell suspension treatment device equipped with a hollow fiber type separation membrane.
  • a method in which cells collected from a living body are cultured directly or ex vivo and then transplanted into the body.
  • the cells used for transplantation are suspended in a solution suitable for transplantation, adjusted to an appropriate concentration, and transplanted.
  • cells collected from a living body or subjected to in vitro culture contain impurities derived from tissues, culture media, and the like, and are often collected in a diluted state in a solution. Therefore, in order to use for transplantation, it is necessary to remove impurities and culture medium, replace with a solution suitable for transplantation (washing), and concentrate to a cell concentration suitable for transplantation.
  • concentration and washing operations using centrifugation have been widely performed.
  • Patent Document 1 a method using centrifugation to separate and concentrate regenerative cells from human tissue has been disclosed.
  • the centrifugal separation method has a concern that the facilities that can be used are limited due to the fact that the apparatus becomes large, the cell is loaded, and the cost increases.
  • Patent Document 2 a compact and simple apparatus has been proposed.
  • hollow fiber type separation membranes those having various pore diameters have been proposed, and they are properly used depending on the size of the separation object, the filtration flow rate, and the like.
  • a hollow fiber having a large pore diameter is used to obtain a large filtration flow rate, but if the pore diameter becomes too large, clogging or the like may occur due to proteins or cells in the separation target.
  • a hollow fiber material that prevents clogging by containing an anionic resin in the hollow fiber while increasing the filtration flow rate by using a hollow fiber having a relatively large average pore diameter and aiming for high productivity. has been reported (Patent Document 3).
  • Patent Document 4 proposes a technique such as washing and setting of filtration conditions.
  • An object of the present invention is to solve problems in the production of a cell concentrate using the hollow fiber separation membrane. Specifically, a method for producing a cell concentrate that maintains an efficient cell recovery rate and suppresses clogging when a cell suspension is concentrated is provided. Furthermore, this invention is providing the manufacturing method of a cell concentrate with little damage to a cell, maintaining an efficient cell recovery rate and suppressing clogging.
  • the present inventor has secured a large filtration flow rate using a hollow fiber having a relatively large pore diameter, and an initial filtration speed and a cell suspension treatment device. It has been found that the above problem can be solved by setting the ratio of the linear velocity of the cell suspension flowing in the hollow fiber to a certain range, and the present invention has been completed.
  • the present invention includes a cell suspension inlet, a filtrate outlet, a cell suspension outlet, and a hollow fiber type separation membrane disposed between the cell suspension inlet and the cell suspension outlet.
  • a method for producing a cell concentrate using a cell suspension treatment apparatus of an internal pressure filtration method, wherein the average pore diameter of the inner pores of the hollow fiber separation membrane is 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, and the filtrate It is related with the manufacturing method of a cell concentrate whose value which remove
  • the flow rate of the cell suspension flowing into the cell suspension inlet is preferably 200 mL / min to 1200 mL / min.
  • the hollow fiber type separation membrane is preferably made of a synthetic polymer material.
  • the hollow fiber type separation membrane is preferably made of a polysulfone-based or polyolefin-based polymer material.
  • the hollow fiber type separation membrane is preferably made of polyethersulfone, polysulfone, or polyethylene.
  • the cell suspension is preferably an immune cell suspension.
  • the method for producing the cell concentrate further includes a step of washing the cells.
  • the present invention also relates to a cell growth method comprising the step of mixing the cell concentrate obtained by the above method with a medium.
  • the present invention also relates to a method for cryopreserving cells, comprising a step of cryopreserving a cell concentrate obtained by the above production method or growth method using liquid nitrogen.
  • cells can be collected with high efficiency while removing impurities such as proteins other than cells in the suspension, and a cell concentrate can be produced while reducing clogging of cells in the hollow fiber. Further, since a method for suppressing clogging by reverse washing of the membrane, which causes cell loading, is not used, damage to cells is reduced and cell survival rate is increased. In addition, since the cells can be processed in a sterile closed system, the concentrated cells can be provided for cell therapy.
  • the cell suspension processing device used for the Example of this invention is shown.
  • the present invention will be described below.
  • the cylindrical container 1 is composed of a straight body portion 2, head portions 3 on both sides thereof, and header portions 9, and the head portion 3 and the header portion 9 are provided with a filtrate outlet 4.
  • the filtrate outlet may be provided on one side or on both ends.
  • a header 9 is provided with a cell suspension inlet 8a
  • a head 3 is provided with a cell suspension outlet 8b.
  • a bundle 5 of hollow fiber type separation membranes loaded and a bundle 5 of hollow fiber type separation membranes provided inside the header portion 9 are fixed inside the container and hollow fiber type separation is performed.
  • the resin layer portion 7 forming the opening end 6 of the film and the structure equivalent to this provided inside the head portion 3 are provided.
  • the resin layer portion 7 and the open end 6 have a structure covered with the header portion 9 (or the head portion 3).
  • the cell suspension inlet 8a, the cell suspension outlet 8b, and the filtrate outlet 4 are separated by wall materials constituting the hollow fiber type separation membrane, and have a non-continuous structure.
  • each part is distinguished as a barrel 2, a head 3, and a header 9 of a cylindrical container, but this is for convenience.
  • the cell suspension outlet is continuous without being separated by the wall material constituting the hollow fiber type separation membrane, and the cell suspension outlet and filtrate outlet are further separated by the wall material constituting the hollow fiber type separation membrane. If it has the structure which has, it can take various structures.
  • the cell suspension treatment apparatus of the present invention it is preferable to fill a cylindrical container with a bundle of dozens to thousands of hollow fiber type separation membranes.
  • the arrangement of the hollow fiber type separation membrane may be linear, bent, or helical, and it is between the cell suspension inlet and the cell suspension outlet.
  • the shape is not particularly limited as long as both ends of the hollow fiber type separation membrane are held.
  • acrylonitrile polymers such as acrylonitrile butadiene styrene terpolymer; polytetrafluoroethylene, polychlorotrifluoroethylene, copolymers of tetrafluoroethylene and hexafluoropropylene, polyvinyl chloride, etc.
  • Halogenated polymer Polyamide, polyimide, polysulfone, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride acrylic copolymer, polycarbonate acrylonitrile butadiene styrene, polystyrene, polymethylpentene and the like can be used.
  • a sterilization-resistant material specifically, a block copolymer such as polypropylene, polyvinyl chloride, polyethylene, polyimide, polycarbonate, polysulfone, polymethylpentene, and polystyrene.
  • the material for the resin layer portion for fixing the hollow fiber type separation membrane general adhesive materials such as polyurethane resin, epoxy resin, and silicon resin can be preferably used.
  • the internal pressure filtration system means that a filtrate substantially free of cells is filtered out from the inside to the outside of the hollow fiber separation membrane.
  • the filtrate substantially free of cells means that the number of cells contained in the filtrate does not exceed 0.1% of the number of cells in the cell suspension before inflow.
  • the filtrate may be separated by the water pressure when the cell suspension flowing from the cell suspension inlet flows into the inside of the hollow fiber separation membrane bundled in the cell suspension treatment device.
  • the outside of the hollow fiber separation membrane may be set to a negative pressure, and the filtrate may be filtered out to the outside.
  • those having an average pore diameter of the inner pores of 0.05 ⁇ m to 20 ⁇ m are preferably used, more preferably 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, and still more preferably.
  • the thing of 0.5 micrometer or more and 10 micrometers or less is used. If it is less than 0.1 ⁇ m, there is a tendency that a sufficient filtration rate cannot be obtained or impurities such as unnecessary proteins cannot be efficiently removed. If it exceeds 10 ⁇ m, the cells to be treated enter the pores, which may reduce the cell recovery rate, which is not preferable.
  • the average pore diameter on the inner side of the hollow fiber type separation membrane is the largest pore among the fine pores that can be observed within the range of 62 ⁇ m ⁇ 43 ⁇ m or 25 ⁇ m ⁇ 17 ⁇ m in the scanning electron microscope observation at a magnification of 2000 times or 5000 times. The diameters of the individual holes are measured and averaged.
  • the initial filtration rate of the filtrate means the filtration rate during the initial filtration of 500 mL.
  • the filtration rate is a value obtained by dividing the amount of filtrate filtered from the entire hollow fiber type separation membrane per unit time by the filtration area. For example, it is a value obtained by dividing the amount of filtrate flowing out per unit time from the filtrate outlet of the cell suspension treatment device shown in FIG. 1 by the filtration area.
  • the linear velocity is a value obtained by dividing the amount of liquid flowing into the hollow fiber per unit time by the cross-sectional area inside the hollow fiber. For example, it is a value obtained by dividing the amount of liquid flowing into the cell suspension inlet of the cell suspension processor shown in FIG. 1 by the total cross-sectional area inside the hollow fiber contained in the cell suspension processor.
  • the value obtained by dividing the initial filtration rate of the filtrate by the linear velocity of the cell suspension is preferably 3.0 or less, and the viewpoint that the cells are concentrated without loss. To 2.5 or less. When this value is larger than 3.0, the cell recovery rate tends to decrease.
  • the cell recovery rate is a value obtained by dividing the total cell number in the cell suspension after concentration by the total cell number in the cell suspension before concentration.
  • the cell suspension flow rate in the present invention is preferably from 100 mL / min to 1500 mL / min, more preferably from 200 mL / min to 1200 mL / min, and preferably from 300 mL / min to 800 mL / min. Further preferred. If the flow rate is less than 200 mL / min, there is a limit to increasing the filtration flow rate while maintaining the cell recovery efficiency, and efficient concentration cannot be achieved. If it exceeds 1200 mL / min, it is necessary to add high pressure to the cell suspension to increase the amount of liquid to be transferred, and strong shear and pressure are applied to the cells when flowing in the circuit and hollow fiber. There is a possibility of causing damage, and as a result, there is a tendency to cause a decrease in recovery rate and a decrease in survival rate ratio.
  • the resin material of the hollow fiber type separation membrane used in the present invention is preferably a synthetic polymer material from the viewpoints of material safety and stability. Among these, it is more preferable to use a polysulfone-based or polyolefin-based polymer material. Furthermore, it is most preferable to use polyethersulfone, polysulfone or polyethylene in view of safety, stability and availability of the material.
  • the filtration area of the hollow fiber type separation membrane used in the present invention is preferably in the range of 0.01 to 1.0 m 2 , and more preferably in the range of 0.02 to 1.0 m 2 .
  • the filtration area is less than 0.01 m 2 , a sufficient filtration amount per unit time cannot be obtained, and when it is larger than 1.0 m 2 , the cell suspension remains in the hollow fiber type separation membrane and the recovery rate This is not preferable because of the possibility of lowering the cost and cost.
  • the total cross-sectional area inside the hollow fiber type separation membrane of the present invention is preferably 0.1 cm 2 or more and 3.0 cm 2 or less, more preferably 0.3 cm 2 or more and 2.0 cm 2 or less. If it is less than 0.1 cm 2 , the linear velocity will be too high, which may damage the cells. Moreover, if it exceeds 3.0 cm 2 , the cell suspension that has flowed into the cell suspension treatment device may not efficiently flow into the hollow fiber membrane separation membrane.
  • the cell suspension treatment device of the present invention may be used after sterilization.
  • the sterilization method is not particularly limited, and sterilization methods widely used for sterilization of medical devices such as ⁇ -ray sterilization, electron beam sterilization, EOG sterilization, and high-pressure steam sterilization can be suitably used.
  • Examples of cells that can be concentrated in the present invention include artificial pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells (ES cells), mesenchymal stem cells, adipose-derived mesenchymal cells, adipose-derived stromal stem cells, pluripotency Multipotent biological stem cells such as adult stem cells, bone marrow stromal cells, hematopoietic stem cells, lymphocytes such as T cells, B cells, killer T cells (cytotoxic T cells), NK cells, NKT cells, regulatory T cells Cells, macrophages, monocytes, dendritic cells, granulocytes, erythrocytes, platelets, neurons, somatic cells such as myocytes, fibroblasts, hepatocytes, cardiomyocytes, or treatments such as gene transfer or differentiation The cell which performed is illustrated.
  • iPS cells artificial pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • mesenchymal stem cells adipose-derived mesenchy
  • a concentrated solution of immune cells such as granulocytes, T cells, B cells, killer T cells (cytotoxic T cells), NK cells, NKT cells, regulatory T cells, macrophages, dendritic cells, etc. is preferably produced. be able to.
  • the cell suspension used in the present invention is not particularly limited as long as it is a suspension containing cells.
  • a suspension containing cells For example, fat, skin, blood vessel, cornea, oral cavity, kidney, liver, pancreas, heart, nerve, muscle
  • suspensions after subjecting biological tissues such as prostate, intestine, amniotic membrane, placenta, and umbilical cord to enzyme treatment, crushing treatment, extraction treatment, degradation treatment, and / or ultrasonic treatment.
  • biological tissues such as prostate, intestine, amniotic membrane, placenta, and umbilical cord
  • enzyme treatment crushing treatment
  • extraction treatment degradation treatment
  • / or ultrasonic treatment examples thereof include cell suspensions prepared by subjecting blood and bone marrow fluid to pretreatment such as density gradient centrifugation, filtration, enzyme treatment, decomposition treatment, and / or ultrasonic treatment.
  • the cells exemplified above are cultured in vitro using, for example, a culture solution such as DMEM, ⁇ -MEM, MEM, IMEM, RPMI-1640, etc., cytokines, antibodies, peptides, etc. Examples of the cell suspension after culturing using the above-mentioned stimulating factor are exemplified.
  • the cell concentrate produced using the cell suspension processor may be further washed. Washing is the replacement of a body fluid or medium in which cells are suspended with a liquid that does not contain cells, such as physiological saline or infusion. Thereby, unnecessary impurities in the concentrate can be removed, and it can be suitably used for transplantation to humans and animals.
  • the cell-free liquid used for washing includes physiological saline, infusion, medium, distilled water, inorganic salt, sugar, serum, protein-containing liquid, buffer, medium, plasma, etc.
  • physiological saline or infusion can be preferably used.
  • Cells isolated according to the present invention include leukemia treatment, myocardial regeneration and vascular regeneration, stem cell exhaustion disease, bone disease, cartilage disease, ischemic disease, vascular disease, neurological disease, burn, chronic inflammation, heart disease, immunodeficiency, Regenerative medicine such as Crohn's disease, breast augmentation, wrinkle removal, cosmetic molding, tissue enlargement such as tissue depression, immunotherapy such as T cell therapy, NKT cell therapy, dendritic cell transfer therapy, gene-transferred cells Although it can be used for the gene therapy used, it is not limited to these. It is also possible to dissociate the separated cells in a scaffold or other structural material and use it for treatment.
  • the medium used for cell growth include DMEM, ⁇ -MEM, MEM, IMEM, RPMI-1640, and culture may be performed using stimulating factors such as cytokines, antibodies, and peptides.
  • a pharmaceutical composition can be produced by concentrating cells according to the method for producing a cell concentrate and mixing the concentrated cells with a pharmaceutically acceptable additive.
  • pharmaceutically acceptable additives include anticoagulants, nutrient sources such as vitamins, antibiotics, and the like.
  • the cell concentrate produced using the cell suspension processor may be further stored frozen. From the viewpoint of reducing damage to cells, it is preferable to cryopreserve using liquid nitrogen. Also, cryopreserved cells can be thawed and used for transplantation into humans and animals, used for research, or re-cultured. Since the cells concentrated by the above method are less damaged by the concentration operation, they can be suitably used for cryopreservation and use after thawing.
  • the filtrate substantially free of cells is filtered out of the hollow fiber separation membrane, and the cell suspension enriched with cell components flows out from the cell suspension outlet.
  • the filtrate substantially free of cells means that the number of cells contained in the filtrate does not exceed 0.1% of the number of cells in the cell suspension before inflow. means.
  • tubes and the like are attached to the cell suspension inlet and outlet of the cell suspension treatment device (part of the circuit for the cell suspension to flow into and out of the hollow fiber in the treatment device), and the attached tubes Is connected to a container such as a cell bag containing the cell suspension so that the cell suspension can circulate between the container such as the bag and the cell suspension treatment device. It is conceivable that a machine such as a pump is interposed in this circuit in order to circulate the liquid. Moreover, it is preferable to connect the tube connected to the waste liquid tank etc. to the filtrate outlet. At this time, it is preferable that the entire circuit is attached in an aseptic environment.
  • a washing solution such as a buffer is added, and the concentration can be repeated to wash the cells and exchange the medium.
  • the cleaning liquid is supplied from an inlet provided in the tube of the circulation circuit. At this time, it is preferable to use an inlet capable of aseptically injecting the liquid.
  • the concentrated and washed cell suspension can be collected in a collection bag and used for subsequent treatment.
  • the collection bag is preferably connected aseptically by separately providing an outlet such as a three-way stopcock on the tube of the circulation circuit.
  • the cell recovery rate is a value obtained by dividing the number of cells in the cell suspension when concentrated to a certain amount by the initial number of cells, and indicates that the higher the value, the better the recovery efficiency.
  • the survival ratio means that cells stained by trypan blue staining are dead cells, the number of living cells not stained is divided by the total number of cells, and the survival rate is calculated. The value divided by the survival rate was defined as the survival rate ratio.
  • the number of cells was determined by measuring the cell suspension with a blood cell counter (Sysmex, K-4500), calculating the cell concentration of the leukocyte fraction as the cell concentration in this example, and calculating from the cell suspension amount and the cell concentration. did.
  • Cell concentration in each example was performed by the following method.
  • a PVC tube was connected to the inlet and outlet of the cell suspension treatment device described in each example.
  • the cell suspension was stored in a plastic container and both ends of a PVC tube extending from both ends of the cell suspension processor were suspended in the suspension so that the suspension could circulate through the module and the tube.
  • a pump was installed in the PVC tube so that the suspension flow could be set to an appropriate flow rate.
  • a tube was also attached to the filtrate outlet of the cell suspension processor, and this was set up to be poured into a waste container. The flow rate was adjusted by a pump, and filtration was performed while circulating the cell suspension in the circuit.
  • Example 1 Cell concentration using a polyethersulfone hollow fiber separation membrane [Model: M2-M02E-300-F1N (manufactured by Spectrum Laboratories), filtration area 0.31 m 2 , pore diameter 0.2 ⁇ m, cross-sectional area 1.737 cm 2 ]. Study was carried out. The average pore diameter inside the hollow fiber separation membrane measured from a 2000 times SEM image was 5.57 ⁇ m.
  • the cultured Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium (10% FBS), and the medium was filtered from 1500 mL of this cell suspension (concentration: about 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL).
  • the conditions for liquid passage were a flow rate of 200 mL / min and an initial filtration rate of 181 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 84%, and the survival rate ratio was 97%.
  • Example 2 A separation membrane similar to that in Example 1 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 555 mL / min and an initial filtration rate of 425 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 81% and the survival rate ratio was 95%.
  • Example 3 A separation membrane similar to that in Example 1 was used. The conditions for the flow were a flow rate of 650 mL / min and an initial filtration rate of 250 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 92%, and the survival rate ratio was 99%.
  • Example 4 A separation membrane similar to that in Example 1 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 830 mL / min and an initial filtration rate of 645 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 91%, and the survival rate ratio was 99%.
  • Example 5 A separation membrane similar to that in Example 1 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 1000 mL / min and an initial filtration rate of 1290 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 93%, and the survival rate ratio was 98%.
  • Example 1 A separation membrane similar to that in Example 1 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 360 mL / min and an initial filtration rate of 645 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 60%, and the survival rate ratio was 98%.
  • Example 2 A separation membrane similar to that in Example 1 was used. The conditions for the flow were a flow rate of 520 mL / min and an initial filtration rate of 857 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 53%, and the survival rate ratio was 99%.
  • Example 6 Cell concentration using a polyethersulfone hollow fiber separation membrane [Model: M2-M05E-300-F1N (Spectrum Laboratories), filtration area 0.31 m 2 , pore diameter 0.5 ⁇ m, cross-sectional area 1.737 cm 2 ]. Study was carried out. The average pore diameter inside the hollow fiber separation membrane measured from a 2000 times SEM image was 3.86 ⁇ m.
  • the culture medium was filtered from 1500 mL of cell suspension (concentration of about 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL) in which cultured Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium (10% FBS). The conditions for liquid passage were a flow rate of 660 mL / min and an initial filtration rate of 510 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 81% and the survival rate ratio was 93%.
  • Example 7 A separation membrane similar to that in Example 6 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 730 mL / min and an initial filtration rate of 390 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 91%, and the survival rate ratio was 96%.
  • Example 8 A separation membrane similar to that in Example 6 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 750 mL / min and an initial filtration rate of 1074 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 90%, and the survival rate ratio was 99%.
  • Example 3 A separation membrane similar to that in Example 6 was used. The conditions for the flow were a flow rate of 750 mL / min and an initial filtration rate of 1378 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 33%, and the survival rate ratio was 94%.
  • Example 9 Cell concentration using polyethersulfone hollow fiber separation membrane [Model: M2-M02E-100-F1N (Spectrum Laboratories), filtration area 0.105 m 2 , pore size 0.2 ⁇ m, cross-sectional area 0.588 cm 2 ] Study was carried out. The same hollow fiber as in Example 1 was used. The culture medium was filtered from 1500 mL of cell suspension (concentration of about 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL) in which the cultured Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium (10% FBS). The conditions for liquid passage were a flow rate of 600 mL / min and an initial filtration rate of 1002 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 102%, and the survival rate ratio was 100%.
  • Example 10 A separation membrane similar to that in Example 9 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 600 mL / min and an initial filtration rate of 1511 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 96%, and the survival rate ratio was 97%.
  • Example 11 A separation membrane similar to that in Example 9 was used.
  • the conditions for liquid passage were a flow rate of 600 mL / min and an initial filtration rate of 2116 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 88%, and the survival rate ratio was 99%.
  • Example 4 A separation membrane similar to that in Example 9 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 620 mL / min and an initial filtration rate of 3174 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 76%, and the survival rate ratio was 98%.
  • Example 12 Cell concentration studies were carried out using a polyethylene hollow fiber separation membrane [model: PSP-103 (manufactured by Asahi Kasei Chemicals), filtration area 0.17 m 2 , pore diameter 0.1 ⁇ m, cross-sectional area 1.510 cm 2 ].
  • the culture medium was filtered from 1500 mL of cell suspension (concentration of about 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL) in which cultured Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium (10% FBS).
  • the conditions for liquid passage were a flow rate of 200 mL / min and an initial filtration rate of 315 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 83%, and the survival rate ratio was 100%.
  • Example 13 A separation membrane similar to that in Example 12 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 820 mL / min and an initial filtration rate of 1262 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 88%, and the survival rate ratio was 98%.
  • Example 5 A separation membrane similar to that in Example 12 was used. The conditions for passing the liquid were a flow rate of 480 mL / min and an initial filtration rate of 1336 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 62%, and the survival rate ratio was 99%.
  • Example 14 Cell concentration was examined using a polysulfone hollow fiber type separation membrane (model: M20S-300-01P (Spectrum Laboratories), filtration area 0.31 cm 2 , pore diameter 0.05 ⁇ m, cross-sectional area 1.737 cm 2 ). .
  • the culture medium was filtered from 1500 mL of cell suspension (concentration of about 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL) in which cultured Jurkat cells were suspended in RPMI 1640 medium (10% FBS).
  • the conditions for liquid passage were a flow rate of 820 mL / min and an initial filtration rate of 716 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 91%, and the survival rate ratio was 99%.
  • Example 15 A separation membrane similar to that in Example 14 was used.
  • the conditions for liquid passage were a flow rate of 800 mL / min and an initial filtration rate of 1075 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 87%, and the survival rate ratio was 99%.
  • Example 6 A separation membrane similar to that in Example 14 was used. The conditions for liquid passage were a flow rate of 810 mL / min and an initial filtration rate of 1489 mL / m 2 / min. As a result, the cell recovery rate was 79%, and the survival rate ratio was 92%.
  • the value obtained by dividing the initial filtration rate by the linear velocity of the cell suspension flowing through the hollow fiber should be 2.5 or less.
  • the cell suspension can be concentrated with high efficiency.
  • the initial filtration rate was divided by the linear velocity of the cell suspension flowing in the hollow fiber when the average pore diameter inside the hollow fiber side separation membrane was in the range of 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m. By setting the value to 2.5 or less, the cell suspension can be concentrated with high efficiency.
  • the average pore diameter of the inner pores of the hollow fiber type separation membrane was 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, and the initial filtration rate of the filtrate was divided by the linear velocity of the cell suspension flowing in the hollow fiber.
  • the cells can be recovered with high efficiency while removing contaminants such as proteins other than the cells in the suspension, as in each example.
  • a cell concentrate can be produced while avoiding clogging.
  • no washing method or the like that would load the cells was used, it was confirmed that the damage to the cells was reduced and the cell viability was increased.
  • the method of the present invention is used, only target cells can be efficiently concentrated by aseptic manipulation. Since a plurality of hollow fibers are not used, leakage of materials can be prevented, safety is high, and cells for cell therapy can be provided.

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Abstract

簡便な方法で、短時間に、細胞をロスすることなく、細胞へ大きなダメージを与えることなく、細胞濃縮液を製造する方法を提供する。細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び、前記細胞懸濁液入口と前記細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いる細胞濃縮液の製造方法であって、前記中空糸型分離膜の内側の孔の平均孔径が０．１μｍ～１０μｍであり、かつ、ろ液の初期ろ過速度を中空糸内を流れる細胞懸濁液の線速度で除した値が２．５以下である、細胞濃縮液の製造方法を提供する。

Description

細胞濃縮液の製造方法
本発明は、細胞懸濁液から細胞を濃縮するための技術に関する。さらに詳しくは、中空糸型分離膜を備えた細胞懸濁液処理器を用いる、細胞濃縮液の製造方法に関する。
細胞医療の分野では、生体から採取した細胞を直接、又は生体外で培養した後、体内に移植する方法が用いられている。これら移植に用いる細胞は、移植に適した溶液に懸濁され、また適切な濃度に調整され移植される。しかしながら、生体から採取した又は体外での培養を経た細胞は、組織由来の夾雑物や培地などを含んでおり、また、溶液に希釈された状態で採取されることが多い。そこで、移植に用いるためには、夾雑物や培地を取り除いて移植に適した溶液に置換され（洗浄）、移植に適した細胞濃度に濃縮される必要がある。この目的のため、従来は、遠心分離を用いた濃縮、洗浄操作が広く行われてきた。
たとえば、ヒト組織から再生細胞を分離して濃縮するために遠心分離を用いる方法が開示されている（特許文献１）。しかし、遠心分離法は、装置が大型になること、細胞に負荷がかかること、及びコストが増大することにより、利用できる施設が限定されることが懸念される。
これに対して、中空糸型分離膜を用いた細胞懸濁液の分離、精製やろ過に関しては、コンパクトで簡便な装置のものが提案されている（特許文献２）。
このような中空糸型分離膜には、様々な孔径のものが提案されており、分離対象物の大きさ、ろ過流量などによって使い分けられている。例えば、大きなろ過流量を得るために大きな孔径の中空糸が用いられるが、孔径が大きくなりすぎると分離対象物中の蛋白質や細胞によって目詰まり等が起こってしまう。これに対して、平均細孔径が比較的大きな中空糸を用いることでろ過流量を大きくし高生産性を目指しつつ、中空糸にアニオン性の樹脂を含有することで、目詰まりを防ぐ中空糸材料が報告されている（特許文献３）。しかしながら、培養細胞を濃縮して再び体内に戻すことを意図する場合、安全性の面から中空糸に複数の材料を含有させることは、材料の漏洩などが危惧されるため好ましくない。また、目詰まりの抑制のために、洗浄やろ過条件の設定などの技術が提案されている（特許文献４）が、中空糸膜の逆洗浄を行うため細胞へのダメージが大きいことが懸念される。
特表２００７－５２４３９６号公報 特許第２９２８９１３号公報 特開２００８－２２９６１２号公報 特開平６－９８７５８号公報
本発明の目的は、上記中空糸型分離膜を用いた細胞濃縮液の製造における問題点を解決することを課題とする。具体的には、細胞懸濁液を濃縮するに際して、効率的な細胞回収率を維持し、目詰まりが抑制される細胞濃縮液の製造方法を提供する。更に、本発明は効率的な細胞回収率を維持し目詰まりを抑制しつつ、細胞へのダメージが少ない細胞濃縮液の製造方法を提供することである。
本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、比較的孔径の大きな中空糸を用いて、大きなろ過流量を確保し、且つろ過の初速度と、細胞懸濁液処理器中の中空糸内を流れる細胞懸濁液の線速度との比率を、ある一定の範囲に設定することで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び、前記細胞懸濁液入口と前記細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いる細胞濃縮液の製造方法であって、前記中空糸型分離膜の内側の孔の平均孔径が０．１μｍ～１０μｍであり、かつ、ろ液の初期ろ過速度を中空糸内を流れる細胞懸濁液の線速度で除した値が２．５以下である、細胞濃縮液の製造方法に関する。
前記細胞懸濁液入口に流入する細胞懸濁液の流速が、２００ｍＬ／分～１２００ｍＬ／分であることが好ましい。
前記中空糸型分離膜が、合成高分子材料よりなることが好ましい。
前記中空糸型分離膜が、ポリスルホン系又はポリオレフィン系の高分子材料よりなることが好ましい。
前記中空糸型分離膜が、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、又はポリエチレンからなることが好ましい。
前記細胞懸濁液が、免疫細胞懸濁液であることが好ましい。
前記細胞濃縮液の製造方法は、さらに、細胞を洗浄する工程を含むことが好ましい。
また、本発明は、前記の方法により得られた細胞濃縮液を培地と混合させる工程を含む、細胞の増殖方法に関する。
また、本発明は、前記の製造方法、又は増殖方法により得られた細胞濃縮液を、液体窒素を用いて凍結保存する工程を含む、細胞の凍結保存方法に関する。
本発明によれば、懸濁縣濁液中の細胞以外の蛋白質などの夾雑物を取り除きつつ、高効率に細胞を回収でき、中空糸における細胞の目詰まりを低減しながら細胞濃縮液を製造できる。更に、細胞の負荷となるような膜の逆洗浄による目詰まりの抑制方法等を使用しないので、細胞へのダメージが少なくなり、細胞生存率が高くなる。また、無菌的な閉鎖系で処理することが可能なので、濃縮された細胞は細胞治療用として提供できる。
本発明の実施例に用いた細胞懸濁液処理器を示す。
以下に、本発明について説明する。
本発明における細胞懸濁液処理器は、図１に例示されるが、これに限定されるものではない。筒状容器１はストレートな胴部２とその両側の頭部３、ヘッダー部９からなり、頭部３、ヘッダー部９にはろ液出口４が備えられている。このろ液出口は一方に備えられていても、両端に備えられていてもよい。この例ではヘッダー部９に細胞懸濁液入口８ａ、頭部３には細胞懸濁液出口８ｂが設けられている。該筒状容器１内部には、装填された中空糸型分離膜の束５と、ヘッダー部９の内部に設けられた中空糸型分離膜の束５を容器内部に固定するとともに中空糸型分離膜の開口端６を形成している樹脂層部７、更に頭部３の内部に設けられたこれと同等の構造を有している。この樹脂層部７および開口端６は、ヘッダー部９（或いは頭部３）に被冠された構造となっており、細胞懸濁液入口８ａ及び細胞懸濁液出口８ｂと、ろ液出口４が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられ、連続しない構造となっている。
なお、図１に示した例では、各部分を筒状容器の胴部２、頭部３、ヘッダー部９というように区別しているが、これは便宜的なものである。設計上、ヘッダー部９が筒状容器の頭部３に一体化したものや、筒状容器の胴部２と頭部３が別々のパーツから形成されている場合でも、細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口が中空糸型分離膜を構成する壁材で隔てられることなく連続しており、更に細胞懸濁液出入口とろ液出口が中空糸型分離膜を構成する壁材により隔てられている構造を備えていれば、各種構造をとることが可能である。
本発明の細胞懸濁液処理器には、中空糸型分離膜を数十から数千本程度束ねたものを筒状の容器内に充填していることが好ましい。尚、本発明において、中空糸型分離膜の配置は、直線状になっていても、撓んでいても、らせん状になっていてもよく、細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に中空糸型分離膜の両端が保持されていれば特に形状は限定されない。
細胞懸濁液処理器の筒状容器の素材として、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、ポリカーボネートアクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等を使用できる。特に耐滅菌性を有する素材、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン等のブロック共重合体を使用することが好ましい。
中空糸型分離膜を固定する樹脂層部の素材としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、およびシリコン樹脂など一般的な接着材料が好ましく用いることができる。
本発明において内圧ろ過方式とは、中空糸分離膜内側から外側に向けて、細胞を実質上含まないろ液がろ別されることを意味する。なお、ここで細胞を実質上含まないろ液とは、ろ液に含まれる細胞の数が、流入前の細胞懸濁液中の細胞の数の０．１％を上回らない範囲であることを意味する。例えば、細胞懸濁液入口より流入した細胞懸濁液が、細胞懸濁液処理器内で束ねられた中空糸分離膜の内側に流入する際の水圧によりろ液がろ別されてもよいし、中空糸分離膜外側を陰圧にしてろ液を外側にろ別してもよい。
本発明における中空糸型分離膜には、内側の孔の平均孔径が０．０５μｍ以上２０μｍ以下のものが好適に用いられ、より好ましくは０．１μｍ以上１０μｍ以下のものが用いられ、さらに好ましくは０．５μｍ以上１０μｍ以下のものが用いられる。０．１μｍ未満であると、十分なろ過速度を得ることができなかったり、不要な蛋白質などの夾雑物を効率的に除去できない傾向がある。１０μｍを超えると、処理する細胞が孔に入りこむことで、細胞の回収率が低下する可能性があるため好ましくない。ここで、中空糸型分離膜内側の平均孔径とは、倍率２０００倍又は５０００倍の走査型電子顕微鏡観察において６２μｍ×４３μｍ又は２５μｍ×１７μｍの範囲内で観察できる細孔のうち、大きいほうから２０個の孔の直径を測定し、平均したものとする。
ろ液の初期ろ過速度とは、最初５００ｍＬをろ過する間のろ過速度を意味する。ろ過速度とは、単位時間当たりに中空糸型分離膜全体よりろ過されるろ液量をろ過面積により除した値である。例えば、図１に示した細胞懸濁液処理器のろ液出口より単位時間あたりに流れ出るろ液量をろ過面積により除した値である。ろ過面積とは、（ろ過面積）＝（糸本数）×π×（中空糸内径）×（有効長）である。
線速度とは、単位時間当たりに中空糸の内側に流入する液量を中空糸内側の断面積で除した値である。例えば、図１に示した細胞懸濁液処理器の細胞懸濁液入口に流入した液量を、細胞懸濁液処理器内に含まれる中空糸内側の総断面積で除した値である。
本発明の細胞濃縮液の製造方法は、ろ液の初期ろ過速度を細胞懸濁液の線速度で除した値が３．０以下であることが好ましく、細胞をロスすることなく濃縮するという観点から２．５以下であることがより好ましい。この値が３．０より大きくなると細胞の回収率が低下する傾向がある。細胞の回収率とは、濃縮後の細胞懸濁液中の総細胞数を、濃縮前の細胞懸濁液中の総細胞数で除した値である。
本発明における細胞懸濁液流速は１００ｍＬ／分以上１５００ｍＬ／分以下であることが好ましく、２００ｍＬ／分以上１２００ｍＬ／分以下であることがより好ましく、３００ｍＬ／分以上８００ｍＬ／分以下であることがさらに好ましい。流速が２００ｍＬ／分未満であると、細胞の回収効率を維持したままろ過流量を大きくすることに限界があり、効率的な濃縮ができない。１２００ｍＬ／分を超えると、送液量を大きくするために高い圧力を細胞懸濁液に加えて送液する必要があり、回路や中空糸内を流れる際に、細胞へ強いせん断や圧力が加わり損傷を与える可能性があり、結果として回収率の低下や生存率比の低下を引き起こす傾向がある。
本発明に用いられる中空糸型分離膜の樹脂材料は、材料の安全性、安定性などの点から合成高分子材料を用いることが好ましい。この中でも、ポリスルホン系又はポリオレフィン系の高分子材料を用いることがより好ましい。さらに、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン又はポリエチレンを用いることが、材料の安全性、安定性、入手のしやすさから、最も好ましい。
本発明に用いられる中空糸型分離膜のろ過面積は０．０１～１．０ｍ２の範囲が好ましく、０．０２～１．０ｍ２の範囲が更に好ましい。ろ過面積が０．０１ｍ２を下回ると、十分な単位時間あたりのろ過量を得ることができず、１．０ｍ２より大きすぎると細胞懸濁液が中空糸型分離膜内に残存し回収率が低下する可能性や、コストが大きくなり好ましくない。
本発明の中空糸型分離膜の内側の総断面積は０．１ｃｍ２以上３．０ｃｍ２以下であることが好ましく、０．３ｃｍ２以上２．０ｃｍ２以下であることがより好ましい。０．１ｃｍ２未満であると、線速度が大きくなりすぎるため細胞に損傷を与える可能性がある。また、３．０ｃｍ２を超えると、細胞懸濁液処理器内に流入した細胞懸濁液が効率よく中空糸膜分離膜に流入しない可能性がある。中空糸型分離膜の総断面積とは、細胞懸濁液処理器内に備えた中空糸型分離膜の内側の断面積の合計面積であり、（総断面積）＝（糸本数）×π×（中空糸内径）×（中空糸内径）で求めることができる。
本発明の細胞懸濁液処理器は滅菌して用いてもよい。滅菌方法は、特に限定されず、γ線滅菌や電子線滅菌やＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌などの医療用具の滅菌に汎用されている滅菌方法を好適に用いることができる。
本発明で濃縮し得る細胞としては、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞などのリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板など、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞などの体細胞または、遺伝子の導入や分化などの処理を行った細胞が例示される。
中でも顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等の免疫細胞の濃縮液を、好適に製造することができる。
また、本発明で用いる細胞懸濁液としては、細胞を含む懸濁液であれば特に限定されないが、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などの生体組織を、酵素処理、破砕処理、抽出処理、分解処理、及び／又は超音波処理などをした後の懸濁液が例示される。また、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理、ろ過処理、酵素処理、分解処理、及び／又は超音波処理などの前処理をして調製された細胞懸濁液等が例示される。また、上記に例示した細胞を生体外で、例えば、ＤＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０などの培養液を用いて培養した後の細胞懸濁液や、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子などを用いて培養した後の細胞懸濁液が例示される。
細胞懸濁液処理器を使用して製造した細胞濃縮液を、さらに洗浄してもよい。洗浄とは、細胞が懸濁されている体液や培地などを、生理食塩水や輸液などの細胞を含まない液体に置換することである。これにより、濃縮液中の不要な夾雑物を取り除いたりすることができ、ヒトや動物への移植に好適に使用することができる。
洗浄の際に用いられる、細胞を含まない液体としては、生理食塩水、輸液、培地、蒸留水、無機塩、糖類、血清、蛋白質を含む液体、緩衝液、培地、血漿等であって細胞を含まない液体が挙げられ、特に安全性の観点から生理食塩水や輸液を好適に用いることができる。
本発明により分離される細胞は、白血病治療、心筋再生や血管再生、幹細胞疲弊疾患、骨疾患、軟骨疾患、虚血性疾患、血管系疾患、神経病、やけど、慢性炎症、心疾患、免疫不全、クローン病等の疾患、豊胸、しわとり、美容成形、組織陥没症等の組織増大などの再生医療、Ｔ細胞療法、ＮＫＴ細胞療法、樹状細胞移入療法などの免疫療法、遺伝子導入した細胞を用いる遺伝子療法などに用いることも可能であるが、これらに限定されるものではない。また、分離された細胞をスキャフォールドなどの構造材料に播種して治療に用いることも可能である
細胞懸濁液処理器を使用して製造した細胞濃縮液を、さらに培養してもよい。洗浄により細胞が懸濁されている体液や培地などを置換し、さらに培養することで、細胞数の増加、細胞の分化、形質転換、遺伝子導入などを行うことができる。細胞の増殖に用いられる培地としては、ＤＭＥＭ、α－ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０が挙げられ、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子などを用いて培養してもよい。
上記の細胞濃縮液の製造方法に従って細胞を濃縮し、該濃縮細胞を製薬的に許容される添加剤と混合することで医薬組成物を製造できる。製薬的に許容される添加剤としては、例えば、抗凝固剤、ビタミン等の栄養源、抗生物質等が挙げられる。
細胞懸濁液処理器を使用して製造した細胞濃縮液を、さらに凍結保存してもよい。細胞へのダメージを少なくできる点から、液体窒素を用いて凍結保存することが好ましい。また、凍結保存した細胞を融解して、ヒトや動物への移植に使用し、研究に使用し、または再度培養することができる。上記の方法で濃縮した細胞は、濃縮操作によるダメージが少ないことから、凍結保存して融解後の使用などにも好適に用いることができる。
以下、本発明の細胞懸濁液処理器を用いて細胞を分離する方法を例示するが、本発明はこれに限定されるものではなく、本発明の主旨に反しない範囲で各種変更をすることができる。
本発明の細胞懸濁液処理器を用いた細胞懸濁液から細胞の分離（濃縮）では、細胞懸濁液処理器内に備えられた中空糸型分離膜に流入した細胞懸濁液から、内圧ろ過により、細胞を実質上含まないろ液が中空糸型分離膜の外側にろ別され、細胞成分が濃縮された細胞懸濁液が細胞懸濁液出口より流出する。なお、ここで細胞を実質上含まないろ液とは、ろ液に含まれる細胞の数が、流入前の細胞懸濁液中の細胞の数の０．１％を上回らない範囲であることを意味する。
まず、細胞懸濁液処理器の細胞懸濁液入口および出口にチューブ等を取り付け（処理器内の中空糸に細胞懸濁液が流入および流出する回路の一部となる）、更に取り付けたチューブを細胞懸濁液が入った細胞バッグなどの容器に連結し、バッグなどの容器と細胞懸濁液処理器との間で細胞懸濁液が循環できるようにする。なお、液を循環させるために、ポンプなどの機械をこの回路に介在させることが考えられる。また、ろ液出口には廃液タンクなどに連絡されたチューブを連結しておくことが好ましい。このとき、回路の全体の取り付けは、無菌的な環境下で行われることが好ましい。また、この際に、細胞懸濁液出口側の流路を狭くするなどして、分離膜に圧力をかけることもできるし、ろ過側のチューブにポンプ等を用いて圧力をかけながらろ過を行ってもよく、一般的に中空糸型分離膜で用いられる各種ろ過方法を併用することができる。
一方、濃縮が進んだ後、バッファーなどの洗浄液を追加し、濃縮を繰り返すことで、細胞の洗浄や培地の交換を行うことができる。この際、洗浄液の投入は、循環回路のチューブに設けた流入口から行う。この際、無菌的に液を注入できる流入口を用いることが好ましい。
濃縮・洗浄された細胞懸濁液は、回収バッグなどに収集して、その後の治療などに用いることができる。この際、回収バッグは、循環回路のチューブに別途三方活栓などの流出口を設けて無菌的に接続することが好ましい。
以下、実験結果を用いて本発明を説明する。なお、ここで細胞回収率とは、一定量まで濃縮した時点での細胞懸濁液中の細胞数を初期細胞数で除した値で、値が高いほど回収効率に優れていることを示す。また生存率比とは、トリパンブルー染色により染色された細胞を死細胞とし、染色されていない生細胞数を全細胞数で除して生存率を算出し、処理後の生存率を処理前の生存率で除した値を生存率比とした。細胞数は、細胞懸濁液を血球カウンター（シスメックス、Ｋ－４５００）により測定し、白血球分画の細胞濃度を本実施例での細胞濃度として算出し、細胞懸濁液量と細胞濃度より算出した。
各実施例における細胞濃縮は、以下の方法で行った。各実施例に記載した細胞懸濁液処理器の入り口と出口に塩ビチューブをつなげた。プラスチック容器に細胞懸濁液を貯留させて、懸濁液がモジュールおよびチューブを循環できるように細胞懸濁液処理器の両端から延びる塩ビチューブの両端を懸濁液中に垂らした。塩ビチューブにはポンプを設置し、懸濁液の流れを適当な流速に設定できるようにした。細胞懸濁液処理器のろ液出口にもチューブを取り付け、こちらは廃液入れに注ぐように設置した。ポンプにより流速を調整し、回路に細胞懸濁液を循環させながらろ過を行った。一定量まで濃縮した後、チューブや中空糸型分離膜内の細胞懸濁液をエアーで押し出し、ポンプを停止し、プラスチック容器中の細胞懸濁液の細胞数を測定し、回収率を算出した。以下の実施例では、市販されている中空糸型分離膜モジュールを本発明の細胞懸濁液処理器として実験を実施した。
［実施例１］
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２－Ｍ０２Ｅ－３００－Ｆ１Ｎ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ろ過面積０．３１ｍ２、孔径０．２μｍ、断面積１．７３７ｃｍ２〕を用いて細胞濃縮検討を行った。２０００倍のＳＥＭ画像より測定した中空糸分離膜内側の平均孔径は、５．５７μｍであった。培養したＪｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）に懸濁し、この細胞懸濁液（濃度約２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）１５００ｍＬから培地をろ過した。通液の条件は、流速２００ｍＬ／分、初期ろ過速度１８１ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は８４％、生存率比９７％であった。
［実施例２］
実施例１と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速５５５ｍＬ／分、初期ろ過速度４２５ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は８１％、生存率比９５％であった。
［実施例３］
実施例１と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速６５０ｍＬ／分、初期ろ過速度２５０ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は９２％、生存率比９９％であった。
［実施例４］
実施例１と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速８３０ｍＬ／分、初期ろ過速度６４５ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は９１％、生存率比９９％であった。
［実施例５］
実施例１と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速１０００ｍＬ／分、初期ろ過速度１２９０ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は９３％、生存率比９８％であった。
［比較例１］
実施例１と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速３６０ｍＬ／分、初期ろ過速度６４５ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は６０％、生存率比９８％であった。
［比較例２］
実施例１と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速５２０ｍＬ／分、初期ろ過速度８５７ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は５３％、生存率比９９％であった。
［実施例６］
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２－Ｍ０５Ｅ－３００－Ｆ１Ｎ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ろ過面積０．３１ｍ２、孔径０．５μｍ、断面積１．７３７ｃｍ２〕を用いて細胞濃縮検討を行った。２０００倍のＳＥＭ画像より測定した中空糸分離膜内側の平均孔径は、３．８６μｍであった。培養したＪｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）に懸濁された細胞懸濁液（濃度約２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）１５００ｍＬから培地をろ過した。通液の条件は、流速６６０ｍＬ／分、初期ろ過速度５１０ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は８１％、生存率比９３％であった。
［実施例７］
実施例６と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速７３０ｍＬ／分、初期ろ過速度３９０ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は９１％、生存率比９６％であった。
［実施例８］
実施例６と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速７５０ｍＬ／分、初期ろ過速度１０７４ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は９０％、生存率比９９％であった。
［比較例３］
実施例６と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速７５０ｍＬ／分、初期ろ過速度１３７８ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は３３％、生存率比９４％であった。
［実施例９］
ポリエーテルスルホンの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２－Ｍ０２Ｅ－１００－Ｆ１Ｎ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ろ過面積０．１０５ｍ２、孔径０．２μｍ、断面積０．５８８ｃｍ２〕を用いて細胞濃縮検討を行った。中空糸は実施例１と同じものを用いた。培養したＪｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）に懸濁された細胞懸濁液（濃度約２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）１５００ｍＬから、培地をろ過した。通液の条件は、流速６００ｍＬ／分、初期ろ過速度１００２ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は１０２％、生存率比１００％であった。
［実施例１０］
実施例９と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速６００ｍＬ／分、初期ろ過速度１５１１ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は９６％、生存率比９７％であった。
［実施例１１］
実施例９と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速６００ｍＬ／分、初期ろ過速度２１１６ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は８８％、生存率比９９％であった。
［比較例４］
実施例９と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速６２０ｍＬ／分、初期ろ過速度３１７４ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は７６％、生存率比９８％であった。
［実施例１２］
ポリエチレンの中空糸型分離膜〔型式：ＰＳＰ－１０３（旭化成ケミカルズ社製）、ろ過面積０．１７ｍ２、孔径０．１μｍ、断面積１．５１０ｃｍ２〕を用いて細胞濃縮検討を行った。５０００倍のＳＥＭ画像より測定した中空糸分離膜内側の平均孔径は、０．７５μｍであった。培養したＪｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）に懸濁された細胞懸濁液（濃度約２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）１５００ｍＬから培地をろ過した。通液の条件は、流速２００ｍＬ／分、初期ろ過速度３１５ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は８３％、生存率比１００％であった。
［実施例１３］
実施例１２と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速８２０ｍＬ／分、初期ろ過速度１２６２ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は８８％、生存率比９８％であった。
［比較例５］
実施例１２と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速４８０ｍＬ／分、初期ろ過速度１３３６ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は６２％、生存率比９９％であった。
［実施例１４］
ポリスルホンの中空糸型分離膜〔型式：Ｍ２０Ｓ－３００－０１Ｐ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ろ過面積０．３１ｃｍ２、孔径０．０５μｍ、断面積１．７３７ｃｍ２〕を用いて細胞濃縮検討を行った。２０００倍のＳＥＭ画像より測定した中空糸分離膜内側の平均孔径は、２．４４μｍであった。培養したＪｕｒｋａｔ細胞がＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）に懸濁された細胞懸濁液（濃度約２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）１５００ｍＬから培地をろ過した。通液の条件は、流速８２０ｍＬ／分、初期ろ過速度７１６ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は９１％、生存率比９９％であった。
［実施例１５］
実施例１４と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速８００ｍＬ／分、初期ろ過速度１０７５ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は８７％、生存率比９９％であった。
［比較例６］
実施例１４と同様の分離膜を用いた。通液の条件は、流速８１０ｍＬ／分、初期ろ過速度１４８９ｍＬ／ｍ２／分とした。結果、細胞回収率は７９％、生存率比９２％であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
表１より、中空糸型分離膜の内側の総断面積や膜面積によらず、初期ろ過速度を、中空糸内を流れる細胞懸濁液の線速度で除した値が２．５以下であれば、高い効率で細胞懸濁液を濃縮できる。また、表１と表２より、中空糸側分離膜内側の平均孔径が０．１μｍ～１０μｍの範囲であれば、初期ろ過速度を、中空糸内を流れる細胞懸濁液の線速度で除した値が２．５以下とすることで、高い効率で細胞懸濁液を濃縮できる。
以上のように、該中空糸型分離膜の内側の孔の平均孔径を０．１μｍ～１０μｍとし、かつ、ろ液の初期ろ過速度を中空糸内を流れる細胞懸濁液の線速度で除した値を２．５以下とすることで、各実施例の場合のように、懸濁液中の細胞以外の蛋白質などの夾雑物を取り除きつつ、高効率に細胞を回収でき、中空糸における細胞の目詰まりを回避しながら細胞濃縮液を製造できる。更に細胞の負荷となるような洗浄方法等を使用しないので、細胞へのダメージが少なくなり、細胞生存率が高くなることを確認した。
したがって、本発明の方法を用いれば、無菌的な操作処理で目的細胞だけを効率的に濃縮できる。複数の中空糸を使用しないので材料の漏洩も防ぐことができ、安全性が高く、細胞治療用途の細胞も提供できる。
　１．筒状容器
　２．胴部
　３．頭部
　４．ろ液出口
　５．中空糸型分離膜の束
　６．開口端（点線部）
　７．樹脂層部（斜線部）
　８ａ．細胞懸濁液入口
　８ｂ．細胞懸濁液出口
　９．ヘッダー部

Claims (9)

  1. 細胞懸濁液入口、ろ液出口、細胞懸濁液出口、及び、前記細胞懸濁液入口と前記細胞懸濁液出口の間に配置された中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いる細胞濃縮液の製造方法であって、
    前記中空糸型分離膜の内側の孔の平均孔径が０．１μｍ～１０μｍであり、かつ、ろ液の初期ろ過速度を中空糸内を流れる細胞懸濁液の線速度で除した値が２．５以下である、細胞濃縮液の製造方法。
  2. 前記細胞懸濁液入口に流入する細胞懸濁液の流速が、２００ｍＬ／分～１２００ｍＬ／分である請求項１に記載の細胞濃縮液の製造方法。
  3. 前記中空糸型分離膜が合成高分子材料よりなる請求項１又は２に記載の細胞濃縮液の製造方法。
  4. 前記中空糸型分離膜がポリスルホン系又はポリオレフィン系の高分子材料よりなる請求項１～３のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
  5. 前記中空糸型分離膜がポリエーテルスルホン、ポリスルホン、又はポリエチレンからなる請求項１～４のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
  6. 前記細胞懸濁液が免疫細胞懸濁液である請求項１～５のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
  7. さらに、細胞を洗浄する工程を含む、請求項１～６のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
  8. 請求項１～７のいずれかに記載の方法により得られた細胞濃縮液を培地と混合させる工程を含む、細胞の増殖方法。
  9. 請求項１～７のいずれかに記載の製造方法、又は請求項８に記載の増殖方法により得られた細胞濃縮液を、液体窒素を用いて凍結保存する工程を含む、細胞の凍結保存方法。
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