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WO2011108304A1 - 皮膚外用剤 - Google Patents

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WO2011108304A1
WO2011108304A1 PCT/JP2011/051113 JP2011051113W WO2011108304A1 WO 2011108304 A1 WO2011108304 A1 WO 2011108304A1 JP 2011051113 W JP2011051113 W JP 2011051113W WO 2011108304 A1 WO2011108304 A1 WO 2011108304A1
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WO
WIPO (PCT)
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skin
inhibitor
acid
poe
heparanase
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/051113
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English (en)
French (fr)
Inventor
俊介 入山
健一 海塩
誠 常長
猪股　慎二
Original Assignee
株式会社資生堂
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Publication date
Application filed by 株式会社資生堂 filed Critical 株式会社資生堂
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    • A61K2800/782—Enzyme inhibitors; Enzyme antagonists

Definitions

  • the present invention relates to an external preparation for skin comprising a matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor and a heparanase inhibitor, and more particularly to an external preparation for skin for preventing or improving a decrease in the barrier function and moisturizing function of the skin.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • Skin covering the entire body of various animals including human beings is exposed to external factors such as sunlight, dryness, oxidation, environmental stress, mental stress, and wrinkle formation due to aging, hardening, spots, dullness, elasticity It is exposed to changes such as decline.
  • Natural skin is roughly divided into two layers, the epidermis and the dermis, and a thin and delicate membrane called the epidermis basement membrane exists between the epidermis and the dermis.
  • Epidermal metabolism depends on factors and blood supply produced by dermal cells through this basement membrane, and epidermal proliferation and differentiation in the skin is thought to be regulated by the basement membrane and dermis . Therefore, it is presumed that communication between the epidermis and dermis via the basement membrane plays an important role in regulating the function of the skin epidermis.
  • An object of the present invention is to provide a novel external preparation for skin for preventing or improving changes in skin function, in particular, deterioration of skin barrier function and moisturizing function.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • this application encompasses the following inventions: [1] A skin external preparation comprising a matrix metalloproteinase inhibitor and a heparanase inhibitor. [2] The external preparation for skin according to [1], for preventing or improving a decrease in skin barrier function and moisturizing function.
  • a topical skin preparation comprising a matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor and a heparanase inhibitor of the present invention to the skin surface
  • MMP matrix metalloproteinase
  • heparanase inhibitor of the present invention By applying a topical skin preparation comprising a matrix metalloproteinase (MMP) inhibitor and a heparanase inhibitor of the present invention to the skin surface, the amount of hyaluronic acid and heparan sulfate present in the epidermis of the skin is significantly increased. And normalization and differentiation of epidermal cells. This makes it possible to improve the barrier function and moisturizing function of the skin epidermis.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • the barrier function to prevent the transpiration of moisture present in the body and the invasion of foreign substances from the outside world. It is essential.
  • a moisturizing function for retaining moisture in the body is also extremely important, whereby the skin contains appropriate moisture, and the skin can be kept flexible and moist.
  • the present inventors have now introduced artificial skin (control group), N-hydroxy-2-[[(4-methoxyphenyl) sulfonyl] 3-picolyl) amino] -3 formed in a culture medium to which a solvent has been added.
  • -Artificial skin (MMP inhibitor group) 1- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- (MMP inhibitor group) formed in a culture solution added with methylbutanamide hydrochloride
  • Artificial skin (heparanase inhibitor group) formed in a culture solution supplemented with 1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -urea, and N-hydroxy-2-[[(4-methoxyphenyl) sulfonyl] 3-picolyl) amino] -3-methylbutanamide hydrochloride and 1- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- (1H
  • the combination of an MMP inhibitor and a heparanase inhibitor has an action of significantly suppressing the degradation of hyaluronic acid and heparan sulfate in the epidermis.
  • the inhibitory action on the degradation of heparan sulfate by the combination of the MMP inhibitor and the heparanase inhibitor is markedly observed in the epidermis of the MMP inhibitor + heparanase inhibitor group by immunostaining of percan, which is heparan sulfate and heparan sulfate proteoglycan. (See FIG. 4).
  • Hyaluronic acid and heparan sulfate are one type of glucosaminoglycan and are known to exist widely on the surface of mammalian cells. As shown in FIG. 3, among the various glucosaminoglycans, hyaluronic acid and heparan sulfate have a remarkably low moisture transpiration rate constant, and it has been found that hyaluronic acid and heparan sulfate have a strong water retention effect. did. Therefore, it is considered that the skin moisturizing function can be significantly improved by the combination of the MMP inhibitor and the heparanase inhibitor.
  • the present inventors have found that the combination of an MMP inhibitor and a heparanase inhibitor allows the artificial skin to be reconstructed into a structure that closely resembles normal natural skin.
  • the expression levels of loricrin and filaggrin known as epidermal molecular markers, are significantly increased, and their differentiation
  • the marker is present uniformly not only in the basement membrane but also in the epidermal granule layer.
  • filaggrin and loricrin are thought to be involved in the barrier function of the skin as a protein that binds keratin present in the epidermal granule layer.
  • Ki67-positive proliferating cells still exist at a high rate even on the 8th day after the culture (see FIG. 6). This indicates that the proliferation of the basal cells of the epidermis is maintained.
  • a combination of an MMP inhibitor and a heparanase inhibitor as an active ingredient is used for medical or cosmetic purposes in order to prevent or improve changes in skin function, in particular, lowering of the skin barrier function and moisturizing function.
  • a combination of an MMP inhibitor and a heparanase inhibitor as an active ingredient is used for medical or cosmetic purposes in order to prevent or improve changes in skin function, in particular, lowering of the skin barrier function and moisturizing function.
  • Matrix metalloprotease (MMP) inhibitor used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance having inhibitory activity against matrix metalloprotease.
  • matrix metalloproteases include gelatinase, collagenase, stromelysin, matrilysin and the like. Therefore, the MMP inhibitor can be selected as a substance that inhibits, for example, gelatinase, collagenase, stromelysin, matrilysin and the like.
  • matrix metalloprotease inhibitors include the substance CGS27023A (N-hydroxy-2-[[(4-methoxyphenyl) sulfonyl] 3-picolyl) amino] -3-methylbutanamide hydrochloride) (J. Med. Chem. 1997, Vol. 40, p. 2525-2532), MMP-inhibitor (p-NH 2 -Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala-NHOH) (FN-437) (BBRC, 1994, Vol. 199, p. 1442-1446).
  • the MMP inhibitor is the CGS27023A substance.
  • Such plants include Thymus serpyllum L., Valeriana fauriei Briquet, or other related plants (Valerianaceae), Diospyros kaki Thunberg (Ebenaceae), Astragalussnecus () ), Hawthorn (Crataegus cuneata Siebold et Zuccarini (Rosaceae)), buttons (Paeonia suffruticosa Andrews (Poeonia montan Sims) (Paconiaceae)), kocha (Thea sinensis Linne var.
  • Extracts of these plants are obtained from roots, leaves, stems, flowers, etc. for herbaceous plants, and roots, buds, bark, fruits, leaves, flowers, etc. for woody plants. To obtain an extract. Extracts from these plants can be obtained by drying the plant material as necessary, further shredding or grinding as necessary, and then extracting with an aqueous extractant or an organic solvent.
  • aqueous extractant for example, cold water, hot water, or hot water having a boiling point or lower than that can be used, and as the organic solvent, methanol, ethanol, 1,3-butanediol, ether, and the like are used at room temperature. Or it can be used by heating.
  • Heparanase inhibitor used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance having inhibitory activity against heparanase.
  • Heparanase is an enzyme that exists in various cells and specifically degrades the heparan sulfate chain of various heparan sulfate proteoglycans.
  • epidermis keratinocytes constituting the epidermis, dermal fibroblasts, vascular endothelial cells and the like are produced. Production of various cancer cells is known to increase, and a relationship with the malignancy of cancer has also been suggested.
  • High heparanase production in cancer cells is known to be highly metastatic and induce angiogenesis (see Vlodavsky I et al., Semin Cancer Biol. 2002; 12 (2): 121-129. )
  • heparanase inhibitors include 4-1H-benzimidazol-2-yl-phenylamine and derivatives thereof, cinnamic acid derivatives such as (E) -N- (5-methylisooxazol-3-yl) -3 -(3,4,5-trimethoxyphenyl) acrylamide or (E) -3- (2-chlorophenyl) -N- (pyridin-3-ylmethyl) acrylamide, tetrazole derivative, naphthalene derivative, cycloalkanone derivative, 4 An alkylresorcinol, for example 4-isobutylresorcinol, or 1- [4- (1H-benzoimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -Urea.
  • various plant extracts and purified products obtained therefrom can be used.
  • plant extracts include valerian extract (Valeriana fauriei Briquet) or other related plants (Valerianaceae), cypress extract, cypress (Chamaecyparis), such as Japanese cypress (Chamaccyparis obtusc), Taiwan cypress (Chamaecyparis) oatuse var. formosana), Asunalo (Thujopsis delabrata) or its variant hiba (T. d. var. hondae), cypress extract, kiwi extract from kiwi (A.
  • cninensis lemon (C. limon) Lemon extract obtained from Tomato extract obtained from tomato (L. esculentum), Garlic extract obtained from garlic (A. sativum), Lilium, for example lily extract obtained from L. candidum, long life grass ( Long life grass extract obtained from P. ⁇ japonicum, Spruce extract obtained from C. aurantium, Mukuro Extract from S. mukorossi, parsley extract from parsley (P. crispum), tiso extract from jujuba (.juvar. Var. Inermis), C. unshiu or related Examples thereof include a chimney extract obtained from a seed (C. chachiensis) and a nettle extract obtained from nettle (U. thunbergiana).
  • MMP matrix metalloproteinase
  • heparanase inhibitors can be used as the active ingredient.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • These can take the form of aqueous solutions, oil solutions, other solutions, emulsions, creams, gels, suspensions, microcapsules, powders, granules, capsules, solids, and the like.
  • lotion preparations, emulsions, creams, ointments, plasters, haptics, aerosols, injections, internal preparations (tablets, powders, granules, Pills, syrups, lozenges, etc.), suppositories, etc. can be applied, affixed, sprayed, injected, drunk, inserted into the body.
  • external preparations for skin such as lotion preparations, emulsions, creams, ointments, plasters, haptics, aerosols, etc. are considered to be preferable dosage forms.
  • the preparations described here include pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, etc., and will be used in the same meaning hereinafter.
  • the amount of the MMP inhibitor contained in the external preparation for skin of the present invention varies depending on the type, but is typically about 10 ⁇ g / L to 10 g / L, preferably about 100 ⁇ g / L to 1 g / L. Yes, and optimally between about 1 mg / L and 100 mg / L.
  • the amount of heparanase inhibitor contained in the external preparation for skin of the present invention varies depending on the type, but is typically about 10 ⁇ g / L to 100 g / L, preferably about 100 ⁇ g / L to 10 g / L. Yes, and optimally between about 1 mg / L and 1 g / L.
  • the external preparation for skin of the present invention includes excipients, fragrances and the like commonly used in preparing them, oils and fats, surfactants, preservatives, chelating agents, water-soluble polymers, alcohols, additives.
  • a viscosity agent, a powder component, an ultraviolet protective agent, a moisturizer, a medicinal component, an antioxidant, a neutralizer, a pH adjuster, a cleaning agent, a desiccant, an emulsifier, and the like can be appropriately blended.
  • these various components are blended in the external preparation for skin of the present invention, it is necessary to carry out within a range that does not impair the intended effect of the present invention.
  • the oil component includes lauryl alcohol, cetyl alcohol, stearyl alcohol, myristyl alcohol, oleyl alcohol and other linear alcohols, monostearyl glycerin ether, lanolin alcohol, cholesterol, phytosterol, isostearyl.
  • Higher alcohols such as branched chain alcohols such as alcohol, higher fatty acids such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, waxes such as solid paraffin, bees wax, hydrogenated castor oil, carnauba wax, barico wax, beef tallow, lard Sheepskin, squalane, palm oil, palm oil, palm kernel oil, soybean oil, olive oil, cottonseed oil, jojoba oil, castor oil, lanolin, and other animal and vegetable oils, liquid paraffin, petroleum jelly and other mineral oils, trimethylpro Triisostearate, isopropyl myristate, glycerol tri-2-ethylhexanate, pentaerythritol tetra-2-ethylhexanate, silicone oil, polyoxyethylene (hereinafter also referred to as POE) polyoxypropylene (hereinafter also referred to as POP) (Described) Synthetic oils such as pentaerythr
  • surfactants include soap bases, fatty acid soaps such as sodium laurate and sodium palmitate, higher alkyl sulfates such as sodium lauryl sulfate and potassium lauryl sulfate, POE lauryl sulfate triethanolamine, and POE sodium lauryl sulfate.
  • N-acyl sarcosine acid such as sodium lauroyl sarcosine, N-myristoyl-N-methyl taurine sodium, higher fatty acid amide sulfonic acid such as coconut oil fatty acid methyl tauride sodium, phosphorus such as POE stearyl ether phosphoric acid Acid ester salt, sulfosuccinate such as sodium monolauroyl monoethanolamide POE sodium sulfosuccinate, sodium lauryl polypropylene glycol sulfosuccinate, linear dodeci Alkylbenzene sulfonates such as sodium benzene sulfonate, linear dodecyl benzene sulfonate triethanolamine, N-acyl glutamate such as disodium N-stearoyl glutamate, monosodium N-stearoyl glutamate, hydrogenated coconut oil fatty acid sodium glycerol sulfate, etc
  • Higher fatty acid ester sulfate, sulfated oil such as funnel oil, POE alkyl ether carboxylic acid, POE alkyl allyl ether carboxylate, higher fatty acid ester sulfonate, secondary alcohol sulfate, higher fatty acid alkylolamide sulfate
  • Anionic surfactants such as salt, sodium lauroyl monoethanolamide succinate, sodium caseinate; stearyltrimethylammonium chloride, lauryltrimethy chloride Alkyl trimethyl ammonium salts such as ammonium, dialkyl dimethyl ammonium salts such as distearyl dimethyl ammonium chloride, alkyl pyridinium salts such as cetyl pyridinium chloride, alkyl quaternary ammonium salts, alkyl dimethyl benzyl ammonium salts, alkyl isoquinolinium salts, dialkyl Cationic surfactants such as morifonium salt, POE
  • alcohols examples include lower alcohols such as ethanol, propanol and isopropanol.
  • Thickeners include arabic gum, tragacanth cam, galactan, carop gum, guar gum, carrageenan, pectin, agar, starch (corn, wheat, potato, rice) and other vegetative polymers, dextran, pullulan and other microbial polymers, Starch polymers such as carboxymethyl starch and methylhydroxypropyl starch, animal polymers such as collagen, casein, gelatin, methylcellulose, nitrocellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, sodium cellulose sulfate, hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose, crystalline cellulose Cellulose polymers such as sodium alginate, alginic acid polymers such as propylene glycol alginate, polyvinyl methyl ether Vinyl polymers such as carboxyvinyl polymer, POE polymers, POE / POP copolymer polymers, acrylic polymers such as sodium polyacrylate, polyacrylate amide, polyethyleneimine, cationic polymer, be
  • Chelating agents include citramalic acid, agaric acid, glyceric acid, shikimic acid, hinokitiol, gallic acid, tannic acid, caffeic acid, ethylenediaminetetraacetic acid, ethyleneglycoldiaminetetraacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, phytic acid, polyphosphoric acid, metaphosphoric acid , As well as their analogs and their alkali metal salts and carboxylic acid esters.
  • UV absorbers examples include benzoic acid UV absorbers such as paraaminobenzoic acid; anthranilic acid UV absorbers such as methyl anthranilate; salicylic acid UV absorbers such as octyl salicylate; isopropyl paramethoxycinnamate and paramethoxysilicate.
  • benzoic acid UV absorbers such as paraaminobenzoic acid
  • anthranilic acid UV absorbers such as methyl anthranilate
  • salicylic acid UV absorbers such as octyl salicylate
  • isopropyl paramethoxycinnamate and paramethoxysilicate examples include cinnamic acid-based ultraviolet absorbers such as octyl cinnamate.
  • Moisturizers include polyethylene glycol, propylene glycol, dipropylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin, diglycerin, xylitol, maltitol, maltose, D-mannitol, glucose, fructose, sodium chondroitin sulfate, sodium hyaluronate , Sodium lactate, glucosamine, cyclodextrin and the like.
  • Medicinal properties include vitamin A oil, retinol, retinol palmitate, pyridoxine hydrochloride, benzyl nicotinate, nicotinamide, dl- ⁇ -tocopherol nicotinate, magnesium ascorbate phosphate, vitamin D2, dl- ⁇ -tocopherol, pantothene Vitamins such as acid and biotin; anti-inflammatory agents such as azulene and glycyrrhizin; whitening agents such as arbutin, potassium 4-methoxysalicylate, 2-O-ethylascorbic acid and ascorbic acid glucoside; hormones such as estradiol; zinc oxide; Astringents such as tannic acid; refreshing agents such as L-menthol and camphor; other lysozyme chloride, pyridoxine hydrochloride, sulfur and the like can be added.
  • Vitamins such as acid and biotin
  • anti-inflammatory agents such as azulene and
  • various extracts showing various medicinal effects can be blended.
  • dokudami extract apricot extract, licorice extract, peony extract, button pi extract, loofah extract, saxifrage extract, eucalyptus extract, clove extract, maronier extract, cornflower extract, seaweed extract, thyme extract and the like.
  • Preservatives include paraoxybenzoates such as methylparaben, ethylparaben, and butylparaben, benzoic acid, salicylic acid, sorbic acid, parachlorometacresol, hexachlorophene, benzalkonium chloride, chlorhexidine chloride, trichlorocarbanilide, photosensitive Element, phenoxyethanol, isomethylthiazolinone and the like.
  • neutralizing agent examples include 2-amino-2-methyl-1-propanol, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, potassium hydroxide, potassium hydroxide, triethanolamine, sodium carbonate and the like. It is done.
  • pH adjuster examples include lactic acid, citric acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, malic acid, sodium hydrogen carbonate, ammonium hydrogen carbonate and the like.
  • antioxidant examples include ascorbic acid, ⁇ -tocopherol, carotenoid and the like.
  • the external preparation for skin of the present invention can prevent or improve the decrease in skin function, in particular, skin barrier function and moisturizing function. Therefore, the external preparation for skin of the present invention is a disease or symptom caused by a decrease in the skin barrier function and moisturizing function, such as contact dermatitis, allergic dermatitis, atopic dermatitis, dry skin, sensitive skin, oily skin Effective for acne, burns, sunburn, spots, wrinkles, skin aging, etc.
  • an artificial skin culture solution comprising a metalloprotease inhibitor and a heparanase inhibitor is provided.
  • any medium conventionally used for the production of artificial skin can be used, and these mediums include Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM containing 10% fetal calf serum).
  • DMEM-Ham'sF12 (3: 1) containing 10% fetal bovine serum, transferrin 5 ⁇ g / ml, insulin 5 ⁇ g / ml, tri-iodothyronine 2 nM, cholera toxin 0.1 nM, hydrocortisone 0.4 ⁇ g / ml; Examples thereof include a medium in which keratinocyte growth medium (KGM) and DMEM containing 10% fetal bovine serum are mixed 1: 1.
  • KGM keratinocyte growth medium
  • the amount of MMP inhibitor added to these basal media varies depending on the type, but is typically about 10 ⁇ g / L to 10 g / L, preferably about 100 ⁇ g / L to 1 g / L, Optimally, it is about 1 mg / L to 100 mg / L.
  • the amount of heparanase inhibitor added to the basal medium varies depending on the type, but is typically about 10 ⁇ g / L to 100 g / L, preferably about 100 ⁇ g / L to 10 g / L, and Optimally about 1 mg / L to 1 g / L.
  • the above-mentioned components conventionally used for the preparation of the culture solution can be appropriately blended.
  • these various components are blended in the artificial skin culture solution of the present invention, it is necessary to carry out within a range that does not impair the intended effect of the present invention.
  • the dermis model is a contracted type I collagen gel containing human fibroblasts, cross-linked with chitin chitosan, chondroitin sulfate and collagen, or containing human fibroblasts in the upper part or compressed collagen gel by centrifugation or the like
  • Post-human fibroblasts may be contained in the middle or upper part.
  • it can be prepared as follows. After preparing a fibroblast-suspended collagen solution on ice, collagen is gelled in a Petri dish. Thereafter, the gel is peeled off from the wall surface of the Petri dish, and the collagen gel is contracted in a CO 2 incubator.
  • it can also contain vascular endothelial cells, fat cells and nerve cells in addition to fibroblasts.
  • epidermis cells such as human normal epidermal keratinocytes are cultured on the dermis model to form the epidermis.
  • Formation of the epidermal layer by culturing skin cells can be performed as follows. First, place the dermis model on a wire mesh or place it in a cell culture insert. Further, a glass ring is placed on the dermis model, and a human-derived epidermal keratinocyte suspension is placed in the glass ring so as not to leak liquid. Alternatively, the dermis model is brought into close contact with the inner wall of the cell culture insert, and the epidermal keratinocyte suspension is added so as not to spill out except on the dermis model.
  • keratinocytes When keratinocytes are adhered in a CO 2 incubator and a ring is used, either the ring may be removed or the culture may be continued as it is.
  • a rubber ring may be used instead of the glass ring.
  • pigment cells or Langerhans cells may be added in addition to epidermal cells. The medium is filled up to the boundary of the epidermal layer, and the culture is continued while the epidermal layer is exposed to air to form a stratum corneum.
  • artificial skin that is very close to the epidermis structure of normal natural skin can be obtained in a very short period of about 1 day to 4 weeks, typically about 4 days to 2 weeks after culturing.
  • Ki67 positive proliferating cells are still present at a high rate even on the 8th day from the culture. It is considered that the artificial skin formed in the culture solution can be cultured for a long time.
  • the artificial skin of the present invention thus obtained can be clinically transplanted as a substitute when the natural skin of the living body is accompanied by a lesion or damage due to some cause.
  • the artificial skin of the present invention is cosmetically applied to the uneven surface on the skin in order to correct keloid marks, skin graft marks, surgical marks, deep wrinkles, deep scars, acne marks, large pores, fine lines, etc. due to burns. It is also possible to apply.
  • the artificial skin of the present invention can be used as a research or test model, for example to test skin permeation tests or efficacy or toxicity of drugs or cosmetics, or for wound healing, cell migration, cancer cell invasion, cancer cells. It can be used to study metastasis of cancer or progression of cancer.
  • the skin model (EFT-400, manufactured by MatTeK) was cultured in a special medium (EFT-400-ASY, manufactured by MatTeK).
  • EFT-400-ASY dimethyl sulfoxide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • ethanol ethanol
  • 50 mM 1- [4- was added so that the final concentration was 50 ⁇ M.
  • (1H-Benzimidazol-2-yl) -phenyl] -3- [4- (1H-benzimidazol-2-yl) -phenyl] -urea (DMSO solvent) was added to a dedicated medium to prepare an MMP inhibitor group.
  • n means the number of each skin model subjected to the test.
  • the epidermis and dermis were separated, solubilized in LIPA buffer (Nacalai), and the supernatant obtained by removing the insoluble fraction by centrifugation was used as the epidermal fraction of the skin model.
  • the culture supernatant stored at ⁇ 80 ° C.
  • the weight (mg) from 3 minutes after the start of measurement to 8 minutes was plotted on the vertical axis, and the slope (mg / min) with the horizontal axis as the elapsed time (minutes) was calculated as the moisture evaporation rate constant (FIG. 3). ).
  • the moisture transpiration rate constant of 0.2% hyaluronic acid was remarkably small, but the moisture transpiration rate constant of 0.2% heparan sulfate was the same as that of 5% glycerin. It turns out that it is suppressing.
  • the obtained immunostained images are shown in FIGS.
  • the heparanase inhibitor group, the MMP inhibitor group, the MMP inhibitor + heparanase inhibitor group, the expression levels of heparan sulfate, filaggrin and loricrin were increased compared to the control group. There was a marked increase in the drug group. In addition, it was revealed that the presence of Ki67 positive proliferating cells was maintained in the group containing heparanase inhibitor.
  • the expression of the gene group (cell cycle) related to cell proliferation decreased, while the expression of the gene group (Keratinization) related to cell differentiation increased. Therefore, it was confirmed that the combination of a heparanase inhibitor and an MMP inhibitor suppresses the proliferation of epidermal cells and enhances differentiation.

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Abstract

　本発明は、皮膚のバリア機能及び保湿機能の低下を予防又は改善することを目的とし、これは、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤とを含んで成る皮膚外用剤を皮膚に適用することにより達成される。

Description

皮膚外用剤
　本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤とを含んで成る皮膚外用剤、特に皮膚のバリア機能及び保湿機能の低下を予防又は改善するための皮膚外用剤に関する。
　人類を始めとする様々な動物の身体全体を覆う皮膚は、日光、乾燥、酸化、環境によるストレス、精神的ストレスなどの外的因子及び加齢によるしわの形成、硬化、しみ、くすみ、弾力性の低下等の変化に曝されている。
　天然皮膚においては、大きく分けて、表皮と真皮の二つの層から構成されており、表皮と真皮の間には表皮基底膜と呼ばれる薄くて繊細な膜が存在する。表皮の代謝は、この基底膜を通して真皮の細胞が産生する因子や血液供給に依存しており、そして皮膚における表皮の増殖と分化は、基底膜と真皮によって調節されているものと考えられている。したがって、基底膜を介する表皮・真皮間のコミュニケーションは、皮膚表皮の機能調節にとって重要な役割を担っているものと推測される。
　これに関して、マトリックスメタロプロテアーゼの阻害剤、又はマトリックスメタロプロテアーゼとマトリックスタンパク質産生亢進剤の両者を投与することで皮膚基底膜構造の再形成が促進されることが知られており（特開 2001-269398 号公報）、そしてセリンプロテアーゼを阻害する物質及び表皮基底膜成分の主要構成成分であるＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲン又はラミニン５の産生量を高める物質によって、マトリックスプロテアーゼ阻害剤による基底膜形成促進効果をさらに促進させることが知られている（特開 2004－75661 号公報）。また、ヘパラナーゼ活性を阻害する化合物は、しわ形成過程において生体内の基底膜機能を改善し、しわの形成を抑制することが知られている（WO 2009/123215 号）。
　しかしながら、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤の組み合わせによって表皮のバリア機能及び保湿機能を有意に改善することについては知られておらず、また基底膜を介する表皮・真皮間の相互作用は極めて複雑であるため、このような組み合わせが皮膚のバリア機能や保湿機能を有意に改善するという事実は極めて意外である。
特開２００１－２６９３９８号公報 特開２００４－７５６６１号公報 ＷＯ２００９／１２３２１５号
　本発明の目的は、皮膚機能の変化、特に皮膚のバリア機能及び保湿機能の低下を予防又は改善するための新規な皮膚外用剤を提供することである。
　このたび、本発明者は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤との組み合わせによって表皮のバリア機能及び保湿機能を有意に改善することを見出した。
　したがって、本願は以下の発明を包含する：
［１］　マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤とを含んで成る皮膚外用剤。
［２］　皮膚のバリア機能及び保湿機能の低下を予防又は改善するための、［１］に記載の皮膚外用剤。
　本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤とを含んで成る皮膚外用剤を皮膚表面に適用することによって、皮膚の表皮中に存在するヒアルロン酸及びヘパラン硫酸量を有意に増加させ、そして表皮細胞の分化・増殖を正常化させることができる。これにより皮膚表皮のバリア機能及び保湿機能を改善することが可能となる。
コントロール群、ＭＭＰ阻害剤群、ヘパラナーゼ阻害剤群、及びＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群における表皮中のヒアルロン酸量を示すグラフである。 コントロール群、ＭＭＰ阻害剤群、ヘパラナーゼ阻害剤群、及びＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群における培養上清中のヒアルロン酸量を示すグラフである。 コントロール群、ＭＭＰ阻害剤群、ヘパラナーゼ阻害剤群、及びＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群における表皮中のヘパラン硫酸量を示すグラフである。 コントロール群、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤群、ヘパラナーゼ阻害剤群、及びＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群における培養上清中のヘパラン硫酸量を示すグラフである。 水、５％グリセリン、及び各種の０．２％グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｂ）の水分蒸散速度定数を示すグラフである。 コントロール群、ＭＭＰ阻害剤群、ヘパラナーゼ阻害剤群、及びＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群における表皮中のパールカン及びヘパラン硫酸の免疫染色を示す写真である。 コントロール群、ＭＭＰ阻害剤群、ヘパラナーゼ阻害剤群、及びＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群における表皮中のロリクリン及びフィラグリンの免疫染色を示す写真である。 培養４日目及び８日目のコントロール群、ＭＭＰ阻害剤群、ヘパラナーゼ阻害剤群、及びＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群における表皮中のＫｉ６７陽性の増殖性細胞の免疫染色を示す写真である。
　ヒトの体内の約７０％は水分で構成されており、乾燥した大気中で生命活動を営むためには、体内に存在する水分の蒸散、及び外界からの異物の侵入を防ぐためのバリア機能が不可欠である。また体内の水分を保持するための保湿機能も極めて重要であり、これによって皮膚は適度な水分を含有し、皮膚に柔軟性や潤いを保つことができる。
　正常な天然の皮膚においては、表皮の最も内側に存在する基底層では細胞分裂によって新しい細胞が絶えず一定の割合で増殖しており、これらの基底細胞は上方へと押し上げられて、有棘細胞、顆粒細胞及び角質細胞へと分化し、最終的には角片となって剥がれ落ちる。しかしながら、何らかの原因によって表皮の高次構造に異常がある場合には、このような表皮細胞の角化プロセスが正常に行なわれず、表皮の保湿機能及びバリア機能が低下するものと考えられる。
　このたび、本発明らは、溶媒を添加した培養液中で形成された人工皮膚（コントロール群）、Ｎ－ヒドロキシ－２－［［（４－メトキシフェニル）スルホニル］３－ピコリル）アミノ］－３－メチルブタンアミド塩酸塩を添加した培養液中で形成された人工皮膚（ＭＭＰ阻害剤群）、１－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－３－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－ウレアを添加した培養液中で形成された人工皮膚（ヘパラナーゼ阻害剤群）、及びＮ－ヒドロキシ－２－［［（４－メトキシフェニル）スルホニル］３－ピコリル）アミノ］－３－メチルブタンアミド塩酸塩と１－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－３－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－ウレアを添加した培養液中で形成された人工皮膚（ＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群）において、これらの各皮膚モデルの表皮中に存在するヒアルロン酸量及びヘパラン硫酸量を測定したところ、ＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群においてヒアルロン酸量とヘパラン酸量が共に増大していたことを見出した。これはＭＭＰ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤の組み合わせが、表皮中のヒアルロン酸及びヘパラン硫酸の分解を有意に抑制する作用を有することを意味する。また、ＭＭＰ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤の組み合わせによるヘパラン硫酸の分解の抑制作用は、ヘパラン硫酸及びヘパラン硫酸プロテオグリカンであるパールカンの免疫染色により、これらがＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群の表皮中に顕著に存在していることからも確認できる（図４を参照のこと）。
　ヒアルロン酸及びヘパラン硫酸はグルコサミノグリカンの１種であり、哺乳類の細胞表面に広く存在していることが知られている。図３に示されるとおり、各種のグルコサミノグリカンの中でもヒアルロン酸及びヘパラン硫酸の水分蒸散速度定数は顕著に低いことから、ヒアルロン酸及びヘパラン硫酸は強力な保水作用を有していることが判明した。したがって、ＭＭＰ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤の組み合わせによって、皮膚の保湿機能を有意に改善することができるものと考えられる。
　さらに驚くべきことに、本発明らは、ＭＭＰ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤の組み合わせにより、人工皮膚の表皮構造が正常な天然皮膚と極めて近似する構造に再構築されることを見出した。具体的には、図５に示されるとおり、ＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群の皮膚モデルでは、表皮の分子マーカーとして知られるロリクリン及びフィラグリンの発現量が有意に増加しており、そしてこれらの分化マーカーは基底膜だけでなく、表皮顆粒層にも均一に存在している。正常な天然皮膚においては、フィラグリンやロリクリンは表皮顆粒層中に存在するケラチンを束ねるタンパクとして皮膚のバリア機能に関わっているものと考えられている。したがって、ＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群の皮膚モデルにおいて有意な量のフィラグリンやロリクリンが顆粒層に均一に存在しているという事実は、ＭＭＰ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤の組み合わせが、皮膚のバリア機能を有意に改善することを示す重要な証拠である。
　またさらに、ＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群における皮膚モデルにおいては、培養から８日目においても依然としてＫｉ６７陽性の増殖性細胞が高い割合で存在している（図６を参照のこと）。これは表皮の基底細胞の増殖性が維持されていることを示す。
　したがって、本発明においては、皮膚機能の変化、特に、皮膚のバリア機能及び保湿機能の低下を予防又は改善するために、活性成分としてＭＭＰ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤との組み合わせを、医学的又は美容学的に使用することができる。
　マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤
　本発明において使用するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としては、マトリックスメタロプロテアーゼに対して阻害活性を有する物質であればよく、特に制限はない。マトリックスメタロプロテアーゼとしては、例えばゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン等が挙げられる。従って、ＭＭＰ阻害剤は、例えばゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン等を阻害する物質として選択することができる。
　マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の具体例としては、ＣＧＳ２７０２３Ａ物質（Ｎ－ヒドロキシ－２－［［（４－メトキシフェニル）スルホニル］３－ピコリル）アミノ］－３－メチルブタンアミド塩酸塩）（J. Med. Chem. 1997, Vol. 40, p. 2525-2532）、ＭＭＰ－インヒビター（p-NH2-Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala-NHOH）（FN-437）（BBRC, 1994, Vol. 199, p. 1442-1446）などが挙げられる。好適には、ＭＭＰ阻害剤はＣＧＳ２７０２３Ａ物質である。
　さらに、本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としては、種々の植物抽出物やそれらから得られる精製物を使用することができる。このような植物としては、イブキジャコウソウ（Thymus serpyllum L.）、カノコソウ（Valeriana fauriei Briquet）又はその他の近縁植物（Valerianaceae）、カキノキ（Diospyros kaki Thunberg（Ebenaceae））、レンゲソウ（Astragalus sinicus Linne（Leguminosae））、サンザシ（Crataegus cuneata Siebold et Zuccarini（Rosaceae））、ボタン（Paeonia suffruticosa Andrews（Poeonia montan Sims）（Paconiaceae））、コウチャ（Thea sinensis Linne var. assamica Pierre,（Thcaccae））、ユーカリ（Eucalyptus globulus Labillardiere）又はその近縁植物（Myrtaceae）、トルメンチラ（Potentilla tormentilla Schrk（Rosaceae））、シナノキ（Tilia corda:a Mill., Tilia platyphyllus Scop., Tilia europaea Linne（Tiliaceae））、シラカバ（Betula alba Linne（Betulaceze））、マジョラム（Origanummajorana L.）、アセンヤク（Uncaria gambir Roxburgh（Rubiaceae））、クルミ殻（Juglans regia Linne var. sinensis De Candolie）又はその近縁植物（Juglandaceae）、クララ（Sophora flavescens Aiton（Leguminosae））、ワレモコウ（Sanguisorba officinalis Linne（Rosaceae））、オトギリソウ（Hypericum perforatum Linne又はHypericum erectum Thunberg（Guttiferae））、チャ（Thea sinensis Linne（Theaceae））、ウコン（Curcuma longa L（Zingiberaceae））、ウコンの抽出精製物であるクルクミン、ハマスゲ（Symplocos racemosa, Cyperus rotundus）、ミロバランノキ（Cyperus scariosus, Gaultheria fragrantissima, Acacia fornensia, Terminalia chebula）、ベンガルボダイジュ（バンヤジュ）（Ficus bengalensis）、ナンバンサイカチ（Cassia fistula Linn）、ネジキ（Lyonia ovalifolia）、テリハボク（ヤラボ、タマナ）（Calophyllum inophyllum）、テンジクボダイジュ（Ficus religiosa）、トルメンチラ（Potentilla tormentilla S.）の抽出物、アボガド（Persea americana Mill.）の抽出物、マンゴスタン（Garcinia mangostana L.）の抽出物、ヤシ（Cocos balsamifera (L) DC.）の抽出物、又はケイ（Cinnamomum cassia BI.）の抽出物等を挙げることができる。
　これらの植物の抽出物は、草本植物にあっては、根、葉、茎、花等から抽出物が得られ、木本植物にあっては、根、芽、樹皮、果実、葉、花等から抽出物が得られる。これらの植物からの抽出物は、植物材料を必要に応じて乾燥させ、さらに必要に応じて細断又は粉砕した後、水性抽出剤又は有機溶剤により抽出することにより得られる。水性抽出剤としては、例えば、冷水、温水、又は沸点もしくはそれより低温の熱水を用いることができ、また有機溶剤としては、メタノール、エタノール、１，３－ブタンジオール、エーテル等を、常温で又は加熱して用いることができる。
　ヘパラナーゼ阻害剤
　本発明において使用するヘパラナーゼ阻害剤としては、ヘパラナーゼに対して阻害活性を有する物質であればよく、特に制限はない。ヘパラナーゼは、種々の細胞に存在し、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖を特異的に分解する酵素である。皮膚では、表皮を構成する表皮角化細胞及び真皮の線維芽細胞、血管内皮細胞などが産生する。各種癌細胞でも産生が高まっていることが知られ、癌の悪性度との関係も示唆されている。癌細胞でヘパラナーゼの産生が高いと転移性が高く、血管新生の誘導性も高いことが知られている（Vlodavsky I et al., Semin Cancer Biol. 2002; 12 (2): 121-129を参照のこと）。
　ヘパラナーゼ阻害剤の具体例としては、４－１Ｈ－ベンゾイミダゾール２－イル－フェニルアミン及びその誘導体、ケイヒ酸誘導体、例えば（Ｅ）－Ｎ－（５－メチルイソオキザゾールー３―イル）－３－（３，４，５－トリメトキシフェニル）アクリルアミド又は、（Ｅ）－３－（２－クロロフェニル）－Ｎ－（ピリジン－３－イルメチル）アクリルアミド、テトラゾール誘導体、ナフタレン誘導体、シクロアルカノン誘導体、４－アルキルレソルシノール、例えば４－イソブチルレソルシノール、又は１－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－３－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－ウレアが挙げられる。
　さらに、本発明のヘパラナーゼ阻害剤としては、種々の植物抽出物やそれから得られる精製物を使用することができる。このような植物抽出物としては、カノコソウ（Valeriana fauriei Briquet）又はその他の近縁植物（Valerianaceae）から得られるカノコウソウエキス、ヒノキ（Chamaecyparis）、例えば日本産ヒノキ（Chamaccyparis obtusc）、タイワンヒノキ（Chamaecyparis oatuse var. formosana）、アスナロ（Thujopsis delabrata）又はその変種であるヒバ（T. d. var. hondae）から得られるヒノキエキス、キウイ（A. cninensis）から得られるキウイエキス、レモン（C. limon）から得られるレモンエキス、トマト（L. esculentum）から得られるトマトエキス、ニンニク（A. sativum）から得られるニンニクエキス、ユリ（Lilium）、例えばニワシロユリ（L. candidum）から得られるユリエキス、長命草（P. japonicum）から得られる長命草エキス、ダイダイ（C. aurantium）から得られるトウヒエキス、ムクロジ（S. mukorossi）から得られるムクロジエキス、パセリ（P. crispum）から得られるパセリエキス、ナツメ（Z. jujuba. var. inermis）から得られるタイソウエキス、ウンシュウミカン（C. unshiu）又はその近縁種（C. chachiensis）から得られるチンピエキス、イラクサ（U. thunbergiana）から得られるイラクサエキス等を挙げることができる。
　これらの植物抽出物もまた上述したとおり、当業界において慣習的な方法を用いて抽出することが可能である。
　本発明においては、活性成分として、１又は複数のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤及び１又は複数のヘパラナーゼ阻害剤の組み合わせを用いることができる。これらは水溶液、油液、その他の溶液、乳液、クリーム、ゲル、懸濁液、マイクロカプセル、粉末、顆粒、カプセル、固形等の形態をとり得る。それ自体既知の方法でこれらの形態に調製した上で、例えばローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤、注射剤、内服剤（錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤、トローチ剤等）、坐剤等として、身体に塗布、貼付、噴霧、注射、飲用、挿入することができる。これらの製剤形の中でも、ローション製剤、乳液剤、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、ハップ剤、エアゾール剤等の皮膚外用剤が、好ましい剤形であると考えられる。ここで記す製剤、特に皮膚外用剤には、医薬品、医薬部外品、化粧料等が含まれ、以下同様の意味で用いることとする。本発明の皮膚外用剤に含有されるＭＭＰ阻害剤の量は、その種類により異なるが、典型的には約１０μｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌであり、好適には約１００μｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌであり、そして最適には約１ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌである。本発明の皮膚外用剤に含有されるヘパラナーゼ阻害剤の量は、その種類により異なるが、典型的には約１０μｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであり、好適には約１００μｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌであり、そして最適には約１ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌである。
　本発明の皮膚外用剤には、それらを調製する際に常用されている賦形剤、香料等をはじめ、油脂類、界面活性剤、防腐剤、キレート剤、水溶性高分子、アルコール類、増粘剤、粉末成分、紫外線防御剤、保湿剤、薬効成分、酸化防止剤、中和剤、ｐＨ調整剤、洗浄剤、乾燥剤、乳化剤等を適宜配合できる。これら各種成分を本発明の皮膚外用剤に配合する場合には、本発明の所期の効果を損なわない範囲内で行う必要がある。
　上記適宜配合される任意配合成分のうち、油分としては、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、オレイルアルコール等の直鎖アルコール、モノステアリルグリセリンエーテル、ラノリンサルコール、コレステロール、フィトステロール、イソステアリルアルコール等の分岐鎖アルコール等の高級アルコール、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸等の高級脂肪酸、固形パラフィン、ビースワックス、硬化ヒマシ油、カルナウバロウ、バリコワックス等のワックス、牛脂、豚脂、羊脂、スクワラン、ヤシ油、パーム油、パーム核油、大豆油、オリーブ油、綿実油、ホホバ油、ヒマシ油、ラノリン等の動植物油脂、流動パラフィン、ワセリン等の鉱物油、トリメチルプロパントリイソステアレート、イソプロピルミリステート、グリセロールトリ－２－エチルヘキサネート、ペンタエリスリトールテトラ－２－エチルヘキサネート、シリコーン油、ポリオキシエチレン（以下、ＰＯＥとも記載する）ポリオキシプロピレン（以下、ＰＯＰとも記載する）ペンタエリスリトールエーテル等の合成油等が挙げられる。
　界面活性剤としては、セッケン用素地、ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等の脂肪酸セッケン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム等の高級アルキル硫酸エステル塩、ＰＯＥラウリル硫酸トリエタノールアミン、ＰＯＥラウリル硫酸ナトリウム等のアルキルエーテル硫酸エステル塩、ラウロイルサルコシンナトリウム等のＮ－アシルサルコシン酸、Ｎ－ミリストイル－Ｎ－メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリッドナトリウム等の高級脂肪酸アミドスルホン酸、ＰＯＥステアリルエーテルリン酸等のリン酸エステル塩、モノラウロイルモノエタノールアミドＰＯＥスルホコハク酸ナトリウム、ラウリルポリプロピレングリコールスルホコハク酸ナトリウム等のスルホコハク酸塩、リニアドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、リニアドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｎ－ステアロイルグルタミン酸ジナトリウム、Ｎ－ステアロイルグルタミン酸モノナトリウム等のＮ－アシルグルタミン酸塩、硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム等の高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、ロート油等の硫酸化油、ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸、ＰＯＥアルキルアリルエーテルカルボン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸ナトリウム、カゼインナトリウム等のアニオン系界面活性剤；塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム等のアルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム塩等のジアルキルジメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩、アルキル四級アンモニウム塩、アルキルジメチルベンジルアンモニウム塩、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ＰＯＥアルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム等のカチオン系界面活性剤；２－ココイル－２－イミダゾリニウムヒドロキシド－１－カルボキシエチロキシ二ナトリウム塩等のイミダゾリン系両性界面活性剤、アミドベタイン、スルホベタイン等のベタイン系界面活性剤等の両性界面活性剤；ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタントリオレエート等のソルビタン脂肪酸エステル類、モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、セスキオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリンリンゴ酸塩等のグリセリンポリグリセリン脂肪酸類、モノステアリン酸プロピレングリコール等のプロピレングリコール脂肪酸エステル類、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥ・メチルポリシロキサン共重合体等の親油性非イオン界面活性剤；ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート等のＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類、ＰＯＥソルビットモノラウレート、ＰＯＥソルビットモノオレエート、ＰＯＥソルビットモノステアレート等のＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類、ＰＯＥグリセリンモノオレエート、ＰＯＥグリセリンジステアレート等のＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類、ＰＯＥモノオレエート、ＰＯＥジステアレート、ＰＯＥモノジオレエート等のＰＯＥ脂肪酸エステル類、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥオレイルエーテル、ＰＯＥコレスタノールエステル等のＰＯＥアルキルエーテル類、ＰＯＥオクチルフェニルエーテル、ＰＯＥノニルフェニルエーテル等のＰＯＥアルキルフェニルエーテル類、ブルロニック等のプルアロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰモノブチルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰセチルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰグリセリンエーテル等のＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類、ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油モノイソステアレート、ＰＯＥ硬化ヒマシ油マレイン酸等のＰＯＥヒマシ油硬化ヒマシ油誘導体、ＰＯＥソルビットミツロウ等のＰＯＥミツロウ・ラノリン誘導体、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、脂肪酸イソプロパノールアミド等のアルカノールアミド、ＰＯＥプロピレングリコール脂肪酸エステル、ＰＯＥ脂肪酸アミド、ＰＯＥアルキルアミン、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルエトキシジメチルアミンオキシド等の親水性非イオン界面活性剤等が挙げられる。
　アルコール類としては、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール等が挙げられる。
　増粘剤としては、アラビアゴム、トラガントカム、ガラクタン、キャロプガム、グアーガム、カラギーナン、ペクチン、寒天、デンプン（トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、コメ）等の植物系高分子、デキストラン、プルラン等の微生物系高分子、カルボキシメチルデンプン、メチルヒドロキシプロピルデンプン等のデンプン系高分子、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン等の動物系高分子、メチルセルロース、ニトロセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、セルロース硫酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース等のセルロース系高分子、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル等のアルギン酸系高分子、ポリビニルメチルエーテル、カルボキシビニルポリマー等のビニル系高分子、ＰＯＥ系高分子、ＰＯＥ・ＰＯＰ共重合体系高分子、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸アミド等のアクリル系高分子、ポリエチレンイミン、カチオンポリマー、ベントナイト、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ラポナイト、ヘクトライト、無水ケイ酸等の無機系水溶性高分子等の水溶性高分子等が挙げられる。
　キレート剤としては、シトラマル酸、アガル酸、グリセリン酸、シキミ酸、ヒノキチオール、没食子酸、タンニン酸、コーヒー酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコールジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、フィチン酸、ポリリン酸、メタリン酸、ならびにこれらの類似体ならびにこれらのアルカリ金属塩およびカルボン酸エステル等が挙げられる。
　紫外線吸収剤としては、パラアミノ安息香酸等の安息香酸系紫外線吸収剤；アントラニル酸メチル等のアントラニル酸系紫外線吸収剤；サリチル酸オクチル等のサリチル酸系紫外線吸収剤；パラメトキシケイ皮酸イソプロピル、パラメトキシケイ皮酸オクチル等のケイ皮酸系紫外線吸収剤等が挙げられる。
　保湿剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、キシリトール、マルチトール、マルトース、Ｄ－マンニット、ブドウ糖、果糖、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、グルコサミン、シクロデキストリン等が挙げられる。
　薬効成分としては、ビタミンＡ油、レチノール、パルミチン酸レチノール、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸ベンジル、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ｄｌ－α－トコフェロール、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、ビタミンＤ２、ｄｌ－α－トコフェロール、パントテン酸、ビオチン等のビタミン類；アズレン、グリチルリチン等の抗炎症剤；アルブチン、４－メトキシサリチル酸カリウム、２－Ｏ－エチルアスコルビン酸、アスコルビン酸グルコシド等の美白剤、エストラジオール等のホルモン類；酸化亜鉛、タンニン酸等の収斂剤；Ｌ－メントール、カンフル等の清涼剤；その他塩化リゾチーム、塩酸ピリドキシン、イオウ等を配合することができる。さらに多様な薬効を示す各種抽出物を配合することができる。すなわちドクダミエキス、オウバクエキス、カンゾウエキス、シャクヤクエキス、ボタンピエキス、ヘチマエキス、ユキノシタエキス、ユーカリエキス、チョウジエキス、マロニエエキス、ヤグルマギクエキス、海藻エキス、タイムエキス等が挙げられる。
　防腐剤としては、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類、安息香酸、サリチル酸、ソルビン酸、パラクロルメタクレゾール、ヘキサクロロフェン、塩化ベンザルコニウム、塩化クロルヘキシジン、トリクロロカルバニリド、感光素、フェノキシエタノール、イソメチルチアゾリノン等が挙げられる。
　中和剤としては、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール、水酸化カリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
　ｐＨ調整剤としては、乳酸、クエン酸、グリコール酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム等が挙げられる。
　酸化防止剤としては、アスコルビン酸、α－トコフェロール、カロチノイド等が挙げられる。
　上記成分は例示であり、これらに限定されるものではない。またこれら成分は、所望する形態に応じた処方に従い、適宜組み合わせて配合することが可能である。
　なお、その薬剤成分に関しては、その配合により本発明の所期の効果が損なわれない範囲で広く配合することができる。このようにして調製された本発明の皮膚外用剤は、皮膚の機能、特には皮膚のバリア機能及び保湿機能の低下を予防又は改善することができる。したがって、本発明の皮膚外用剤は、皮膚のバリア機能及び保湿機能の低下に起因する疾患又は症状、例えば接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、乾燥肌、敏感肌、脂性肌、アクネ、火傷、日焼け、シミ、シワ、皮膚老化等に有効である。
　また、本発明の他の実施態様においてメタロプロテアーゼ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤とを含んで成る人工皮膚培養液が提供される。
　人工皮膚の製造に用いる基礎培地としては、人工皮膚の製造に従来から使用されている任意の培地を用いることができ、これらの培地としては１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）；１０％の牛胎児血清、トランスフェリン５μｇ／ｍｌ、インシュリン５μｇ／ｍｌ、ｔｒｉ－ヨードチロニン２ｎＭ、コレラトキシン０．１ｎＭ、ヒドロコーチゾン０．４μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ－Ｈａｍ’ｓＦ１２（３：１）；ケラチノサイト増殖培地（KGM）と１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭとを１：１に混合した培地、等が挙げられる。これらの基礎培地に添加されるＭＭＰ阻害剤の量は、その種類により異なるが、典型的には約１０μｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌであり、好適には約１００μｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌであり、そして最適には約１ｍｇ／Ｌ～１００ｍｇ／Ｌである。また基礎培地に添加されるヘパラナーゼ阻害剤の量は、その種類により異なるが、典型的には約１０μｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌであり、好適には約１００μｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌであり、そして最適には約１ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌである。
　本発明の人工皮膚培養液にも、培養液の調製に常用的に使用されている上述の成分を適宜配合できる。これら各種成分を本発明の人工皮膚培養液に配合する場合には、本発明の所期の効果を損なわない範囲内で行う必要がある。
　人工皮膚の製造においてはまず、真皮モデルを作成する。真皮モデルはヒト線維芽細胞を含む収縮Ｉ型コラーゲンゲル、キチンキトサンとコンドロイチン硫酸およびコラーゲンで架橋形成した中あるいは上部にヒト線維芽細胞を含ませたもの、あるいはコラーゲンゲルを遠心などによって圧縮させた後ヒト線維芽細胞を中あるいは上部に含ませたものでもよい。例えば次のようにして調製することができる。線維芽細胞懸濁コラーゲン溶液を氷上にて作製後、ペトリ皿内にてコラーゲンをゲル化させて調製する。その後、ペトリ皿壁面からゲルを剥離し、コラーゲンゲルをCO2インキュベーター内にて収縮させる。また皮膚真皮に似せるために、線維芽細胞に加えて血管内皮細胞、脂肪細胞や神経細胞を含有することもできる。
　次に、上記真皮モデルの上に、表皮細胞、例えばヒト正常表皮ケラチノサイトを培養し、表皮を形成する。皮膚細胞の培養による表皮層の形成は次のようにして行うことができる。まず真皮モデルを金網などの上にのせる、もしくはセルカルチャーインサート内に静置する。さらにガラスリングをこの真皮モデルの上にのせ、このガラスリング内に液漏れをさせないようにヒト由来の表皮ケラチノサイト懸濁液を入れる。あるいはセルカルチャーインサート内壁に真皮モデルを密着させ、表皮ケレチノサイト懸濁液を真皮モデル上部以外に零れ落ちないように加える。CO2インキュベーター内にてケラチノサイトを接着させ、リングを使用した場合はリングを外すもしくはそのまま継続して培養するなどどちらでもよい。ガラスリングの代わりにゴムリングを利用してもよい。またヒト表皮に似せるために、表皮細胞の他に色素細胞やランゲルハンス細胞を加えてもよい。上記培地を表皮層の境界まで満たし、表皮層を空気に曝しながら、培養を継続し、角層を形成させる。
　この方法によれば、培養から約１日～４週間、典型的には約４日～２週間という極めて短期間で、正常な天然皮膚の表皮構造に極めて近い人工皮膚を得ることができる。また、図６に示されるとおり、ＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群における皮膚モデルにおいては、培養から８日目においても依然としてＫｉ６７陽性の増殖性細胞が高い割合で存在していることから、本発明の培養液中で形成された人工皮膚は長期間の培養が可能であると考えられる。
　そのようにして得られた本発明の人工皮膚は、生体の天然皮膚が何らかの原因による病変又は損傷を伴う場合には、その代替物として臨床的に移植することができる。また、本発明の人工皮膚は、火傷によるケロイド跡、植皮跡、手術跡、深いしわ、深い傷跡、ニキビ跡、大きな毛穴、小じわ等を補正するために、皮膚上の凹凸表面に美容学的に適用することも可能である。さらに、本発明の人工皮膚は、研究用又は試験用モデルとして、例えば医薬又は化粧料の皮膚透過試験又は効能もしくは毒性を試験するために、あるいは創傷治癒、細胞遊走、癌細胞の侵入、癌細胞の転移又は癌の進行等を研究するために用いることができる。
１．皮膚モデルの培養方法
　皮膚モデル（EFT-400、MatTeK 社製）を専用培地（EFT-400-ASY、MatTeK 社製）中で培養した。コントロール群として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とエタノールを終濃度が０．１％となるように専用培地に添加し、ヘパラナーゼ阻害剤群として、終濃度が５０μＭとなるように５０ｍＭの１－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－３－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－ウレア（ＤＭＳＯ溶媒）を専用培地に添加し、ＭＭＰ阻害剤群として、終濃度が１０μＭとなるように１０ｍＭのＮ－ヒドロキシ－２－［［（４－メトキシフェニル）スルホニル］３－ピコリル）アミノ］－３－メチルブタンアミド塩酸塩（CGS27023A, エタノール溶媒）を専用培地に添加し、そしてヘパラナーゼ阻害剤＋メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤群として、各々終濃度が５０μＭ及び１０μＭとなるように５０ｍＭの１－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－３－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－ウレア（ＤＭＳＯ溶媒）及び１０ｍＭのＣＧＳ２７０２３Ａ（エタノール溶媒）を専用培地に添加して、これらを培養した。培地交換は毎日２ｍＬ／ウェルで行い、培養から４日目及び８日目に皮膚モデルを回収して実験に用いた。また培地交換の際に、培養液を全て回収し、－８０℃にて保管し、そしてこれらを以下の実験に用いた。
２．ヒアルロン酸量測定
　上記において培養したコントロール群（ｎ＝５）、ＭＭＰ阻害剤群（ｎ＝５）、ヘパラナーゼ阻害剤群（ｎ＝５）、及びＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群（ｎ＝５）をヒアルロン酸量測定試験に供した（ｎは試験に供した各々の皮膚モデル数を意味する）。各々の皮膚モデルは表皮と真皮を分離して、ＬＩＰＡバッファー（ナカライ社）に可溶化させ、不溶画分を遠心にて除去した上清を皮膚モデルの表皮画分とした。－８０℃で保管してある培養上清を解凍し、これらの溶液中のヒアルロン酸量をヒアルロン酸量測定キット（生化学工業）にて測定を行った。皮膚モデル表皮中では、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群の表皮にて有意なヒアルロン酸量の増加が確認できた（図１Ａ）。一方で、培養上清中のヒアルロン酸量は、ヘパラナーゼ阻害剤を含む群にて、有意なヒアルロン酸量の低下が確認できた（図１Ｂ）。これらの結果から、ヘパラナーゼ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤の両方が存在することで、ヒアルロン酸の分解を抑制し、表皮のヒアルロン酸量を高めることが明らかとなった。
３．ヘパラン硫酸量測定
　ヒアルロン酸測定と同様に、上記において培養したコントロール群（ｎ＝５）、ＭＭＰ阻害剤群（ｎ＝５）、ヘパラナーゼ阻害剤群（ｎ＝５）、及びＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群（ｎ＝５）をヘパラン硫酸量測定試験に供した（ｎは試験に供した各々の皮膚モデル数を意味する）。培養上清と皮膚モデル表皮画分中のヘパラン硫酸量を、ヘパラン硫酸量測定キット（生化学工業）にて測定を行った。培養上清中のヘパラン硫酸量結果において、ＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群は、コントロール群と比較して有意にヘパラン硫酸量が低下していた（図２Ｂ）。また皮膚モデル表皮中のヘパラン硫酸量を測定したところ、ＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群ではコントロール群と比較して有意にヘパラン硫酸量が増加していた（図２Ａ）。これらの結果から、ヘパラナーゼ阻害剤を含む群、特にＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群では、ヘパラン硫酸の分解が抑制され、表皮中のヘパラン硫酸量が増加することが明らかとなった。
４．水分蒸散速度係数の測定
　ヘパラン硫酸（ｎ＝５）、コンドロイチン硫酸Ａ（ｎ＝５）、コンドロイチン硫酸Ｂ（ｎ＝５）、ケラタン硫酸（ｎ＝５）、及びヒアルロン酸（生化学工業）（ｎ＝５）をＭｉｌｌｉＱに溶解して各０．２％水溶液を作成し、また５．０％グリセリン（ｎ＝５）及びＭｉｌｌｉＱを比較サンプルとして用意した（ｎは各々の試料数を意味する）。天秤に２×２ｃｍにカットした濾紙を設置し、各溶液１０μＬを浸み込ませ１分毎に８分間濾紙の重量を測定した。測定開始３分後から８分までの重量（ｍｇ）を縦軸にプロットし、横軸を経過時間（分）としたときの傾き（ｍｇ／分）を水分蒸散速度定数として算出した（図３）。この中でも０．２％ヒアルロン酸の水分蒸散速度定数は顕著に小さかったが、次いで０．２％ヘパラン硫酸の水分蒸散速度定数も５％グリセリンの水分蒸散速度定数と同程度であり、水分の蒸散を抑えていることがわかった。
５．皮膚モデルの免疫染色
　培養後の皮膚モデルをメスにて半分にカットし、４℃のアセトンに入れて４℃で４８時間以上静置させた。アセトン、安息香酸メチル、キシレンと順に溶液置換を行い、パラフィンにて包埋することでＡＭｅＸ法によるパラフィンブロックを作成した。３μｍの組織切片を作製し、パールカン（図４Ａ－Ｄ）、ヘパラン硫酸（図４Ｅ－Ｈ）、ロリクリン（図５Ａ－Ｄ）、フィラグリン（図５Ｅ－Ｈ）、ならびに培養４日目及び８日目におけるＫｉ６７（図６）の免疫染色を実施した。得られた免疫染色画像を図４～６に示す。ヘパラナーゼ阻害剤群、ＭＭＰ阻害剤群、ＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群では、コントロール群と比較して、ヘパラン硫酸、フィラグリン及びロリクリンの発現量が増加していたが、特にＭＭＰ阻害剤＋ヘパラナーゼ阻害剤群においては顕著に増加していた。また、ヘパラナーゼ阻害剤を含む群においては、Ｋｉ６７陽性の増殖性細胞の存在が維持されていることが明らかになった。
６．遺伝子抽出
　半分にカットした培養後の皮膚モデルをピンセットで素早く表皮と真皮を分けた。それぞれを３５０μＬのＲＬＴ緩衝液（RNeasy mini kit, QIAGEN）に入れ、ジルコニアボールを加え、粉砕器にて組織を破砕した。その後、RNeasy mini kit（QIAGEN）にてＲＮＡを抽出した。さらに、Quick Amp-Labeling kit（Agilent）にてＣｙ３ラベル化し、増幅を行い、そして全ヒトマイクロアレイアッセイを行った。Genespring GX にて発現変動している遺伝子群の解析を行った。その結果、ヘパラナーゼ阻害剤＋ＭＭＰ阻害剤群においては、細胞増殖に関連する遺伝子群（cell cycle）の発現が低下しており、その一方で細胞分化に関連する遺伝子群（Keratinization）の発現は増大していたことからヘパラナーゼ阻害剤とＭＭＰ阻害剤との組み合わせにより、表皮細胞の増殖が抑制され、分化が亢進されることが確認された。

Claims (2)

  1. 　マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤とを含んで成る皮膚外用剤。
  2. 　皮膚のバリア機能及び保湿機能の低下を予防又は改善するための請求項１に記載の皮膚外用剤。
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