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WO2010100816A1 - 分析装置 - Google Patents

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WO2010100816A1
WO2010100816A1 PCT/JP2010/000215 JP2010000215W WO2010100816A1 WO 2010100816 A1 WO2010100816 A1 WO 2010100816A1 JP 2010000215 W JP2010000215 W JP 2010000215W WO 2010100816 A1 WO2010100816 A1 WO 2010100816A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substance
internal standard
standard substance
measurement target
sample
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/000215
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
野上真
橋本雄一郎
和氣泉
神田勝弘
Original Assignee
株式会社 日立ハイテクノロジーズ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社 日立ハイテクノロジーズ filed Critical 株式会社 日立ハイテクノロジーズ
Priority to JP2011502602A priority Critical patent/JP5325973B2/ja
Priority to DE112010000967T priority patent/DE112010000967T5/de
Priority to CN2010800083733A priority patent/CN102326073B/zh
Priority to US13/201,659 priority patent/US20120058009A1/en
Publication of WO2010100816A1 publication Critical patent/WO2010100816A1/ja
Priority to US14/535,424 priority patent/US20150064739A1/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4055—Concentrating samples by solubility techniques
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
    • G01N2001/4083—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids sedimentation
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
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    • H01J49/0009—Calibration of the apparatus
    • H—ELECTRICITY
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    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
    • H01J49/0031—Step by step routines describing the use of the apparatus
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    • H01J49/04—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
    • H01J49/0431—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components for liquid samples
    • H01J49/0436—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components for liquid samples using a membrane permeable to liquids

Definitions

  • the present invention relates to an analyzer that analyzes a biological sample such as blood using mass spectrometry, and more particularly to an analyzer that includes a pretreatment device that performs pretreatment such as solid phase extraction.
  • immunization an antibody (antigen) that specifically recognizes a measurement target component in a sample is applied.
  • the primary antibody is further selectively selected.
  • Detection is performed using a supplementary secondary antibody.
  • a label is added to the secondary antibody in order to increase sensitivity.
  • the label may be, for example, a fluorescent substance or a substance necessary for enzyme chemiluminescence. Since the immunization method is a technique that allows simple and highly sensitive detection, it is suitable for quantitative measurement of trace components in a specimen. On the other hand, cross-reactivity is a problem in immunization.
  • the cross-reactivity is a phenomenon in which not only a measurement target component that should be originally recognized by the primary antibody but also a molecule having a similar structure such as a metabolite of the measurement target component. This means that the quantitative result is higher than the true value, and the measurement target component cannot be accurately quantified. Especially in the case of low molecular weight compounds, the cross-reactivity tends to be remarkable, and it is necessary to polymerize by adding carrier protein to the measurement target component during antibody production. One of the causes is that depending on the position, it becomes impossible to distinguish the structural difference from the metabolite. In order to suppress this cross-reaction, production of a primary antibody capable of discriminating differences between various similar structural molecules is required. However, production is difficult and costly and labor intensive, which is inefficient.
  • mass spectrometry is a measurement technique that can be distinguished from similar structural molecules such as metabolites because measurement is performed based on the mass of the component to be measured.
  • MS / MS analysis and MSn analysis techniques are techniques that enable high-precision identification of similar structural components by converting the measurement target components into fragment signals. As described above, mass spectrometry is superior in selectivity and accuracy compared with immunization, and thus has been widely used in clinical applications.
  • identification can be performed with specific mass information of the compound.
  • this mass information it is possible to separate the measurement target component by the mass number from the contaminated component in the actual sample.
  • a standard substance is analyzed at several concentrations.
  • the signal intensity change over time is acquired, and the peak area of the mass chromatogram is obtained.
  • a calibration curve is created from the relationship between the area and the standard substance concentration.
  • the same substance whose concentration is unknown is analyzed to determine the peak area of the mass chromatogram.
  • Non-Patent Document 1 after adding an organic solvent to a sample and precipitating a protein, the sample is introduced into a mass spectrometer while being separated by a liquid chromatograph / mass spectrometer (LC / MS). Twelve hormones such as estradiol and testosterone that are not included are detected simultaneously. As the internal standard substance, a stable isotope labeled substance for each component to be measured is used.
  • This internal standard substance is added to the buffer solution during protein precipitation.
  • a biological sample such as serum or urine is treated with a 96-well solid phase extraction plate and measured with a mass spectrometer, thereby quantifying amino acids, carnitines, sugars, immunosuppressants, and the like.
  • pseudo-compounds with similar chemical structures are used as internal standard substances. This internal standard substance is added to the buffer solution during protein precipitation.
  • mass spectrometry when applying mass spectrometry clinically, ion suppression inherent to mass spectrometry becomes a problem.
  • components need to be signaled, and the inhibition of signal efficiency (ion suppression) affects the accuracy of quantification. Therefore, stable isotope labeling that can normally be considered to produce the same ion suppression is required.
  • the substance is used.
  • mass spectrometry can be measured at intervals of several ms for each component to be measured, multi-component quantification can be performed with high throughput, but the same number of stable isotope-labeled substances as the number of components. Is required.
  • a pseudo compound may be used for the internal standard substance.
  • the influence of the matrix component (contaminant) is not equivalent between the measurement target substance and the internal standard substance, and correction is performed. There is no guarantee that accurate values will be obtained. Therefore, when using a pseudo compound as the internal standard substance, in order to separate the matrix component and the measurement target substance, for example, pretreatment of LC or solid phase extraction treatment is performed to reduce the influence of the matrix.
  • Non-Patent Document 2 a matrix is introduced into a mass spectrometer by post-column infusion, and a component to be measured is sent by infusion from another route, and data indicating in which time zone the matrix effect is large is obtained in advance.
  • the LC conditions are devised so that the component to be measured is not introduced into mass spectrometry during that time period.
  • these methods increase time and cost, and make the operation complicated.
  • mass spectrometry when mass spectrometry is applied clinically, there should be no change in data by facility or user.
  • the internal standard method when performing a quantitative analysis using a mass spectrometer, the internal standard method is used.
  • the internal standard is ideally corrected using a stable isotope that has the same physical properties as the substance to be measured.
  • a mass spectrometer when a mass spectrometer is used, ion suppression due to contaminants in the matrix significantly affects the data accuracy. Therefore, when a pseudo compound rather than a stable isotope substance is used as an internal standard substance, it is sufficiently separated and purified by LC, GC or the like so that ion suppression due to contaminants in the matrix does not occur.
  • sample pretreatment also affects data accuracy due to the influence of contaminants, so data reproducibility is low compared to other measurement systems.
  • the conventional method when quantitative analysis is performed using a mass spectrometer, the conventional method creates a calibration curve for each measurement, and calculates the concentration of the substance to be measured in the sample using the internal standard method. For this reason, when a stable isotope substance is used as a measurement target substance, there is a problem in terms of cost. On the other hand, when a pseudo compound is used as a substance to be measured, there are problems in labor for separation and purification, cost of separation solvent, and throughput. In addition, since it was necessary to create a calibration curve for each measurement, there was a problem in reagent cost and throughput.
  • a solid-phase extraction cartridge 101 that allows a test solution to flow and selectively separates a specific component, a cartridge holding container 102 that holds a separating agent therein, and a cartridge transfer means 103 that can hold a plurality of storage portions and has an endless track.
  • a preloading process including a pressure loading unit 107 capable of continuously and randomly accessing the container, and an extraction solution receiving mechanism 108 that selectively receives the extraction solution from the separating agent stored in the container.
  • the measurement target substance and the internal standard substance having a known concentration are added to the matrix having different physical properties in advance in the data processing unit 112, and correlation data between the physical property and sensitivity of the matrix are stored.
  • the sensitivity is a value obtained by dividing the signal intensity by the density.
  • data on the recovery rate of the measurement target substance in the physical properties of the matrix is also stored for the recovery rate of the pretreatment such as solid phase extraction.
  • a sample to which a known concentration of the internal standard substance and the measurement target substance are added is measured, and the value of the physical property of the matrix is calculated from the measured value of the signal intensity of the internal standard substance.
  • the internal standard substance is added to the extraction solution receiving mechanism 108 by the rotary arm 105 immediately before being transferred to the mass analysis unit 111 by the pretreatment sample transfer means 109. That is, when the signal intensity of the internal standard substance having a known concentration is actually measured by the mass analyzer 111, the data processor 112 is accessed, and the values of the physical properties of the matrix are calculated from the stored data.
  • the data processing unit 112 is accessed, and the values of each physical property of the matrix calculated from the stored data and the signal intensity of the measurement target substance
  • the concentration of the substance to be measured is calculated from
  • the physical property parameters of the specimen are, for example, phospholipid concentration, viscosity (concentration, dilution rate), pH, and total protein amount.
  • the concentration of the measurement object is calculated by reflecting the recovery rate of the pretreatment of the measurement object substance in the physical properties of the matrix.
  • the concentration of the measurement target substance can be used from the correlation data stored in the data processing unit 112 using the internal standard substance having a known concentration.
  • the present invention it is possible to easily and accurately correct the recovery rate of ion suppression and pretreatment, for example, solid phase extraction, which has been a problem in the conventional method.
  • correction can be made without using the internal standard substances of the individual substances to be measured.
  • it is not necessary to prepare several stable isotope-labeled substances as measurement target substances and internal standard substances at known concentrations and create a calibration curve, leading to time and cost efficiency. From these facts, complicated pre-processing can be omitted, so that the apparatus configuration can be further simplified and a simple and highly accurate clinical examination apparatus can be realized.
  • Schematic of apparatus configuration Schematic of measurement flow. Schematic of the correction method.
  • Schematic of measurement flow Schematic of the correction method.
  • the schematic diagram of the input value and output value of a data processing part The conceptual diagram of the signal strength dependence (sensitivity) with respect to the value regarding the physical property of a matrix.
  • TDM blood concentration monitoring
  • an immunosuppressive agent used for suppressing rejection of a transplanted organ is a drug for which TDM is always performed.
  • the immunosuppressive agent has a low therapeutic range of several ng / mL to several hundred ng / mL.
  • blood levels beyond the therapeutic range may cause serious side effects such as hypertension, dyslipidemia, hyperglycemia, peptic ulcers, liver and kidney dysfunction. Therefore, in general, cocktail administration is performed to reduce side effects, and several types of immunosuppressants and steroids are used in combination.
  • an immunosuppressive agent is difficult to chemically synthesize, there is no stable isotope-labeled substance serving as an internal standard substance, and therefore, a pseudo compound is generally used as the internal standard substance.
  • This example is an example of an automatic analyzer that uses solid-phase extraction for pretreatment and mass spectrometry for the detection unit.
  • a solid-phase extraction cartridge 101 capable of selectively separating a specific component by passing a test solution
  • a cartridge holding container 102 holding a separating agent therein
  • a cartridge transporting means 103 capable of holding a plurality of storage portions and having an endless track.
  • a whole blood processing unit 113 that can purify whole blood
  • a reagent tank 104 that can store a plurality of reagents
  • a rotary arm 105 that can transport the reagents from the reagent tank to the solid-phase extraction cartridge, and all the reagents from the reagent tank.
  • Rotating arm 106 that can be transported to the blood treatment unit, pressure load unit 107 that can continuously and randomly access pressure in the storage unit, and extraction solution that selectively receives the extraction solution from the separating agent stored in the storage unit
  • a pre-processing device including a receiving mechanism 108, a pre-processing sample transport unit 109 from the pre-processing device, and the sample is ionized and introduced into the mass analysis unit, and the ionization unit 1 0 consists capable analytical measuring mass analyzer 111 and the data processing unit 112.
  • the mass analyzer 111 uses a triple quadrupole mass spectrometer (Teiple QMS), but in addition, a single quadrupole mass spectrometer (QMS), a time-of-flight mass spectrometer (TOFMS), An ion trap mass spectrometer (ITMS) and a Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer (FT-ICRMS) can also be used.
  • QMS triple quadrupole mass spectrometer
  • TOFMS time-of-flight mass spectrometer
  • ITMS ion trap mass spectrometer
  • FT-ICRMS Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer
  • the whole blood processing unit 113 is dispensed with 100 ⁇ L of a patient sample administered with an immunosuppressant, and 200 ⁇ L of a methanol solution containing 0.2 M zinc sulfate stocked in the reagent tank 104 is transferred by the rotating arm 106. It is dispensed into each cell of the whole blood processing unit 113.
  • the whole blood processing device 113 is equipped with an ultrasonic wave generation function, and the cell membrane of red blood cells is disintegrated (hemolysis) by applying ultrasonic waves for about 1 minute. At this time, by applying ultrasonic waves at a high temperature of 70 ° C.
  • a hemolyzing operation is not necessary for a drug having no blood cell migration property such as an antiepileptic agent or an antibacterial agent, and 100 ⁇ L of a patient sample dispensed to the whole blood processing unit 113 is centrifuged, and the supernatant serum or The plasma component is dispensed to the solid phase extraction cartridge 101 by the rotating arm 106.
  • a drug having no blood cell migration property such as an antiepileptic agent or an antibacterial agent
  • the solid-phase extraction cartridge 101 is activated and equilibrated before the treatment liquid after the above-described hemolysis operation is dispensed. Specifically, 200 ⁇ L of a 100% methanol solution stocked in the reagent tank 104 is dispensed to the solid-phase extraction cartridge 101 by the rotating arm 105, and the pressure loading unit 107 existing at least at one location by the cartridge transport means 103. The filler is activated by being transported to the position, and applying pressure and passing through the cartridge. Similarly, 200 ⁇ L of a 100% aqueous solution stocked in the reagent tank 104 is dispensed to the solid-phase extraction cartridge 101 by the rotating arm 105 and is transported to the position of the pressure load unit 107 by the cartridge transport means 103 to apply pressure.
  • the filler is equilibrated by passing the liquid through the cartridge. Thereafter, the treatment liquid after the hemolysis operation is dispensed to the solid-phase extraction cartridge 101 by the rotating arm 106, and the pressure is applied in the same manner, whereby the measurement target substance and the internal standard substance are supplemented by the filler. Next, cleaning is performed by passing 200 ⁇ L of a 100% aqueous solution. Finally, 100 ⁇ L of a 100% methanol solution is passed therethrough, and the solid phase extracted processing solution is eluted into the extraction solution receiving mechanism 108. The processing liquid is transported by the pretreatment sample transporting means 109, ionized by the ionization unit 110, introduced into the mass analysis unit 111, and measurement is performed.
  • the internal standard substance stocked in the reagent tank 104 is dispensed to the extraction solution receiving mechanism 108 by the rotating arm 105 and added to the processing liquid.
  • the composition of the solvent used in the washing process and the elution process varies depending on the combination of the internal standard substance and the substance to be measured. That is, in order to purify impurities as much as possible in the solid phase extraction process, for example, 40% methanol may be used in the washing process, and 90% methanol may be used in the elution process.
  • the purification means in addition to solid phase extraction, liquid / liquid extraction, protein removal, ultrafiltration membrane, and antibody magnetic beads can be used.
  • the correction method will be described.
  • the recovery rate and ion suppression of the pretreatment greatly affect the data reproducibility and accuracy.
  • the horizontal axis represents the measurement target substance concentration
  • the vertical axis represents the internal standard substance and measurement target.
  • a calibration curve in which the signal intensity ratio corresponding to each m / z signal of the substance is plotted is created. The patient specimen is actually measured, and the concentration is calculated from the signal intensity ratio corresponding to each m / z signal of the internal standard substance and the measurement target substance and the created calibration curve.
  • a correction method according to the present invention will be described with reference to FIG.
  • a measurement target substance and an internal standard substance having a known concentration are added to a matrix having different physical properties in advance, the horizontal axis represents a value related to the physical property of the matrix, and the vertical axis represents the m / Correlation data of signal intensity dependency (sensitivity) corresponding to each signal of z is stored in the data processing unit 112 (FIG. 4).
  • the sensitivity here is a value obtained by dividing the signal intensity corresponding to each m / z signal by the concentration, and the value relating to the physical properties of the matrix is the phospholipid concentration.
  • Phospholipids include glycerophospholipids and sphingophospholipids.
  • glycerophospholipids lecithin phosphatidylcholine
  • cephalin phosphatidylethanolamine
  • viscosity, total protein amount, and pH are used as values relating to the physical properties of the matrix.
  • the sensitivity functions S 0 (p) and S IS (p) of the measurement target substance and the internal standard substance with the value relating to the physical properties of the matrix, here, the concentration p of lecithin, which is a phospholipid as a variable, are stored in advance as data. Stored in the processing unit 112.
  • the value X relating to the physical properties of the matrix can be calculated from the result obtained in (Equation 1) and the function S IS (p) stored in advance in the database.
  • the sensitivity S 0 (X) of the substance to be measured is obtained from the value X related to the physical properties of the matrix and the function S 0 (p) stored in the data processing unit 112 in advance.
  • the concentration C 0 of the S 0 (X) and the analyte signal strength of the measurement target substance measured from I 0 in the mass analyzer 111 is determined by equation (2).
  • the ion suppression can be corrected by the above work.
  • the sensitivity functions of the measurement target substance and internal standard substance using the values related to the physical properties of the matrix stored in the data processing unit 112 as variables are a plurality of measures that may affect ion suppression as a measure for improving the accuracy of correction. It is also possible to employ a multidimensional sensitivity function of the substance to be measured and the internal standard substance with the values relating to the physical properties of the matrix as variables.
  • the recovery rate R (p) of the measurement target substance using the phospholipid concentration p as a variable is stored in the data processing unit 112 in advance.
  • the recovery rate R (p) here refers to the signal intensity obtained by adding the measurement target substance to the matrix having the phospholipid concentration p after pretreatment and MS measurement, and adding the measurement target substance to the matrix of the phospholipid concentration p. Divided by the measured signal strength.
  • the concentration C 00 of the measurement target substance before pretreatment is obtained by (Equation 3).
  • the value X relating to the physical properties of the matrix can be calculated from the result obtained in (Equation 1) and the function S IS (p) stored in advance in the database.
  • the recovery rate R (p) varies depending on values relating to the physical properties of the matrix, such as other phospholipids, viscosity, total protein amount and pH of lecithin. Further, since it varies depending on the type of filler in the solid-phase extraction cartridge 101, the function of the recovery rate R x (p) in these cases is stored in the data processing unit 112.
  • the concentration of the substance to be measured can be used from the correlation data stored in the data processing unit 112 using the internal standard substance of known concentration added to the specimen.
  • this correction method it is possible in principle to correct a plurality of substances to be measured with only one internal standard substance without creating a calibration curve.
  • Example 1 a measurement target substance and an internal standard substance having a known concentration are added to matrices having different physical properties, a value related to the physical property of the matrix is plotted on the horizontal axis, and a test target substance and an internal standard substance are plotted on the vertical axis.
  • Correlation data of signal intensity dependency (sensitivity) corresponding to each m / z signal is stored in the data processing unit 112, and the measured signal intensity in the mass analysis unit 111 of an internal standard substance with a known concentration added to the specimen is stored.
  • the concentration of the measurement target substance is obtained from the values relating to the actual measurement signal intensity of the measurement target substance and the physical properties of the matrix. Then, the concentration of the measurement target substance before the pretreatment process is obtained from the recovery rate of the measurement target substance in the pretreatment process using the value relating to the physical properties of the matrix stored in advance in the data processing unit 112 as a variable.
  • Example 2 the correlation data of the signal intensity dependency (sensitivity) corresponding to each m / z signal intensity of the measurement target substance with respect to the m / z signal intensity of the substance related to the physical properties of the matrix, and the measurement target substance in the preprocessing step
  • the recovery rate is stored in the data processing unit 112 in advance.
  • the signal intensity dependency (sensitivity) and the recovery rate with the signal intensity of lecithin as a variable are stored in the data processing unit 112 as a substance relating to the physical property of the matrix (FIG. 8).
  • the substance to be measured is actually measured alternately at intervals of several msec to several hundred msec by the mass analyzer 111.
  • the concentration of the measurement target substance is calculated from the signal intensity of the substance (here, lecithin) that influences ion suppression in the matrix and the measurement target substance (here tacrolimus) and the correlation data stored in the data processing unit 112.
  • the concentration of the measurement target substance is calculated from the signal intensity of the substance (here, lecithin) that influences ion suppression in the matrix and the measurement target substance (here tacrolimus) and the correlation data stored in the data processing unit 112.
  • the first internal standard substance stocked in the reagent tank 104
  • 10 ⁇ L of the first internal standard substance stocked in the reagent tank 104 is transferred to the whole blood by the rotating arm 106. It is dispensed into each cell of the processing unit 113.
  • the second internal standard substance is extracted from the internal standard substance stored in the reagent tank 104 by the rotary arm 105 before the pretreated solution is transported by the pretreated sample transport means 109 as in the first embodiment. Dispensed to the receiving mechanism 108 and added to the processing solution. Other steps are the same as those in the first embodiment.
  • the first internal standard substance may be added in advance to a blood collection tube used when a specimen is collected from a patient. In this case, it is necessary to prepare a blood collection tube for each internal standard substance.
  • a first internal standard substance, a second internal standard substance, and a substance to be measured having a known concentration are added to a matrix having different physical properties.
  • the horizontal axis indicates the values related to the physical properties of the matrix, and the vertical axis indicates the values related to the physical properties of the matrix.
  • Correlation data of signal intensity dependency (sensitivity) corresponding to each m / z signal of the measurement target substance and the internal standard substance is stored in the data processing unit 112.
  • the sensitivity here is a value obtained by dividing the signal intensity corresponding to each m / z signal by the concentration, and the value relating to the physical properties of the matrix is the phospholipid concentration.
  • 0 (p) is stored in the data processing unit 112 in advance.
  • a phospholipid concentration containing a first internal standard substance and a second internal standard substance having a known concentration is added to an unknown matrix component (actual sample), and the first internal standard substance measured by the mass spectrometer 111 is measured.
  • the signal strengths of the second internal standard substance and the measurement target substance are I 1 , I 2 and I 0
  • the value relating to the physical properties of the matrix is X
  • the known first internal standard substance having the same concentration is C 1 , C 2, and C 0
  • the second internal standard substance sensitivity S 2 (X) is expressed by (Equation 1 ′). Since the first internal standard substance and the second internal standard substance have the same ionization efficiency, the correlation data of the signal intensity dependency (sensitivity) corresponding to m / z is also the same (Equation 2 ′).
  • the recovery rates R 1 (p) and R 0 (p) of the measurement target substance with the phospholipid concentration p of the first internal standard substance and the measurement target substance as variables are stored in the data processing unit 112 in advance. deep.
  • the recovery rates R 1 (p) and R 0 (p) here are the signal intensity measured by MS measurement after adding an internal standard substance and a substance to be measured to a matrix having a phospholipid concentration p after pretreatment.
  • the first internal standard substance and the substance to be measured are added to the matrix of concentration p and divided by the signal intensity measured by MS.
  • the value X relating to the physical properties of the matrix can be calculated from the result obtained by (Equation 1 ′) and the function S 2 (p) stored in advance in the database.
  • the sensitivity S 0 (X) of the substance to be measured is obtained from the value X related to the physical properties of the matrix and the function S 0 (p) stored in the data processing unit 112 in advance.
  • S 0 concentration C 0 of analyte the signal strength of the measurement target substance measured from I 0 (X) and the mass analyzer 111 is obtained by (Equation 3 ').
  • the ion suppression can be corrected by the above work.
  • the signal intensity I 1 of the first internal standard substance actually measured by the mass analyzer 111 is a value reflecting the recovery rate and ionization efficiency of the pretreatment, and the known concentration C 1 , (Expression 2 ′), and sensitivity
  • the function S 2 (p) is a signal intensity dependency (sensitivity) corresponding to each m / z signal of the first internal standard substance with respect to the value related to the physical property of the matrix on the horizontal axis and the value related to the physical property of the matrix on the vertical axis. Therefore, (Equation 4 ′) holds in the recovery rate R 1 (p) in the pretreatment.
  • the left term of (4 ′) is an actual measurement value
  • the right term is a value stored in the data processing unit 112.
  • the pretreatment process is a hemolysis process of whole blood, and includes complicated operations such as stirring, sonication, centrifugation, and dispensing, and errors may occur. That is, (Equation 4 ′) does not hold, and (Equation 4 ′′) and (Equation 4 ′ ′′) are obtained.
  • a threshold value for a difference from the value stored in the data processing unit 112 is set in advance, and “value stored in the data processing unit 112”, “correction by actual measurement value”, and “ By selecting “Reexamination”, the concentration of the substance to be measured can be calculated more accurately (FIG. 8).
  • the concentration of the substance to be measured can be calculated more accurately (FIG. 8).
  • the algorithm is stored in the data processing unit 112 so that the process can be shifted to “re-inspection” when “correction by” and ⁇ 10% or more.
  • the difference is within ⁇ 3%, the value stored in the data processing unit 112, that is, the recovery rate R 0 (p) is corrected.
  • a measurement target component concentration C 00 including correction is calculated.
  • the measurer can set the threshold for the difference from the value stored in the data processing unit 112 in advance by a panel operation.
  • the correction method of the present invention uses the stable isotope-labeled substance of the measurement target substance as the internal standard substance as in the conventional method, and it is not necessary to create a calibration curve for each examination, and addition and deletion of the measurement target substance Is easy.
  • Correlation data of signal intensity dependence (sensitivity) corresponding to m / z signals of a plurality of measurement target substances and at least one internal standard substance with respect to each physical property value of the matrix, and recovery rate of the measurement target substance with respect to the matrix Is stored in the data processing unit 201, and the concentration of the measurement target substance is calculated from the signal intensity of the measurement target substance and at least one internal standard substance.
  • the m / z of the measurement target substance to be newly added to each physical property value of the matrix is added to the information of the internal standard substance and the measurement target substance already registered in the data processing unit 201.
  • the correlation information of signal intensity dependency (sensitivity) corresponding to each signal, the recovery rate of the newly added measurement target substance with respect to the matrix, and m / z of the newly added measurement target substance This makes it possible to add substances to be measured.
  • a plurality of substances to be measured can be added. These three pieces of information can be obtained by automatic measurement by the mass analyzer 202.
  • a measurement target substance to be newly added is subjected to infusion measurement by the mass analysis unit 202 in advance to obtain m / z data.
  • m / z of the substance to be measured is input to the m / z input unit 204 on the screen of the data processing unit 201, and an automatic calculation button 205 is clicked, so that the mass analysis unit 111 performs actual measurement while changing the parameters.
  • the data processing unit 112 calculates the conditions (ionization conditions, cleavage voltage, etc.) necessary for the mass analysis of the measurement target substance, and then adds new values for each physical property value of the matrix.
  • Correlation data of signal intensity dependency (sensitivity) corresponding to each m / z signal of the measurement target substance is output to the output unit 206, and the recovery rate of the measurement target substance to be newly added to the matrix is calculated.
  • the data is output to the output unit 207. All information obtained during this process (all m / z detected at each time and signal intensity data of that m / z) is stored and can be output at any time. In other words, if any inspection failure occurs, it is possible to review the data of the set conditions and correct the conditions, thereby reducing time, cost, and labor loss for setting the conditions again.
  • the measurement target substance is newly added. In principle, a plurality of measurement target substances can be automatically added to any internal standard substance.

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Abstract

　複数の擬似化合物を用いて、検量線を作成することなしに正確な補正が可能な技術を提供する。また、多成分の測定対象物質が混在したサンプルについて、内部標準物質に個々の安定同位体標識物質を用いなくても補正可能な技術を提供する。 　固相抽出機構を含む前処理装置と、該前処理装置で前処理されたサンプルをイオン化した後、質量分析する質量分析装置を備えた分析装置において、前記サンプル中のイオン化を阻害する物質の濃度と、測定対象物質及び内部標準物質の信号強度依存性、及び回収率に関するデータを記憶する記憶部を備え、前記サンプル、及び前記内部標準物質の測定結果を前記記憶部に記憶された前記データに基づき補正する補正部を備えた分析装置。

Description

分析装置
　本発明は血液などの生体サンプルを質量分析を用いて分析する分析装置に係り、特に固相抽出などの前処理を行う前処理装置を備えた分析装置に関する。
　臨床検査における普及した検査手法の一つに免疫法がある。免疫法は、サンプル中の測定対象成分を特異的に認識する抗体（抗原）を応用し、例えば液体中の測定対象成分を抗体（一次抗体）で補足した後に、その一次抗体をさらに選択的に補足する二次抗体を利用して検出する。このときの検出は、高感度化を図るために二次抗体に標識を付加している。標識は、例えば蛍光物質の場合や、酵素化学発光に必要な物質などの場合がある。免疫法は、簡便に高感度検出可能な技術であることから、検体中の微量成分の定量測定に適している。一方、免疫法では交差反応性が問題となっている。交差反応性は、一次抗体が本来認識すべき測定対象成分だけではなく、例えば測定対象成分の代謝物のように類似した構造を有する分子をも捕捉してしまう現象である。このことは、定量結果が真値よりも高くなり、測定対象成分を正確に定量できないことを意味している。特に低分子化合物の場合は交差反応性が顕著になる傾向があり、抗体作製の際に測定対象成分へのキャリアタンパク質の付加により高分子化する必要があるため、その付加位置以外の部位のみエピトープとなり得ることから、位置によっては代謝物との構造差異の識別が不可能となることが原因の一つである。この交差反応を抑制するためには、各種類似構造分子の差異を識別できる一次抗体の作製が求められるが、作製は困難であるとともにコストと労力がかかるため、非効率的である。
　免疫法に対して質量分析法は、測定対象成分の質量に基づいて測定するため、例えば代謝物などの類似構造分子との識別が可能な測定技術である。特にＭＳ／ＭＳ解析やＭＳｎ解析の手法は、測定対象成分をフラグメント信号化することにより、類似構造成分どうしの高精度識別を可能にする技術である。このように質量分析法は免疫法に比べて、選択性及び正確性に優れていることから、臨床に応用する動きが広まっている。
　例えば、特許文献１では、濾紙血を検体とし、液／液抽出により測定対象成分を抽出し、質量分析計で測定することにより、アラニンやバリンのアミノ酸やアシルカルニチン類を定量し、生体内での対象物質の代謝反応の度合いを検査する代謝異常スクリーニングを行っている。ＭＳモードは、選択性の高い三連四重質量分析計のＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring）モード用いている。ＭＲＭは、一段目の四重極でプリカーサ信号のみを通し、その信号を次のコリジョンセルで開裂させ、生成した化合物に特異的なプロダクト信号のみを二段目の四重極でモニターする方法である。この方法では、化合物の特異的な質量情報で同定が可能となる。また、この質量情報を利用することで実試料中の夾雑成分から測定対象成分を質量数で分離することが可能となる。定量方法は、従来のように、先ず、幾つかの濃度で標準物質を分析する。そして、その標準物質由来のｍ／ｚ（質量／電荷）の信号に対し、信号強度の時間変化（マスクロマトグラム）を取得し、マスクロマトグラムのピーク面積を求める。この面積と標準物質濃度との関係より、検量線を作成する。次に、濃度が不明の同一物質を分析して、マスクロマトグラムのピーク面積を求める。そして、作成された検量線に基づき、マスクロマトグラムのピーク面積に対応する物質濃度を決定する。測定全体の補正には内部標準物質を用いており、内部標準物質には、測定対象成分ごとに安定同位体標識物質を採用している。この内部標準物質は、濾紙血を液／液抽出する際の溶出溶液に添加している。非特許文献１では、検体に有機溶媒を添加しタンパク質沈殿した後、液体クロマトグラフ／質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ）で分離を行いながら質量分析計に導入することで、生体中に低濃度しか含まれないエストラジオールやテストステロンなどの１２種類のホルモン類を同時に検出している。内部標準物質には、測定対象成分ごとの安定同位体標識物質を用いている。この内部標準物質は、タンパク質沈殿する際のバーファー溶液に添加している。特許文献２では、血清や尿などの生体試料を９６穴の固相抽出プレートで処理し、質量分析計で測定することにより、アミノ酸，カルニチン類，糖及び免疫抑制剤などの定量を行っている。内部標準物質には、安定同位体標識物質の他に、化学構造の似通った擬似化合物を用いている。この内部標準物質は、タンパク質沈殿する際のバーファー溶液に添加している。
　ところで、質量分析法を臨床応用する場合、質量分析法の固有のイオンサプレッションが問題になる。質量分析法は、成分を信号化する必要があり、その信号化効率阻害（イオンサプレッション）が定量精度を左右することから、通常は、同一のイオンサプレッションを生じるとみなすことができる安定同位体標識物質を用いている。また、質量分析法は、測定対象成分ごとに数ｍｓ間隔で測定が可能であるため、多成分の定量を高スループットで行うことが可能であるが、その成分数と同数の安定同位体標識物質が必要となる。しかし、安定同位体標識物質の合成にはコストがかかるだけではなく、合成できない成分については安定同位体標識物質を作製できない問題がある。特許文献２のように、内部標準物質に擬似化合物を用いる場合もあるが、この場合、マトリックス成分（夾雑物）の影響が、測定対象物質と内部標準物質とで等価ではなく、補正をおこなっても正確な値が得られる保証はない。そこで、内部標準物質に擬似化合物を用いる場合には、マトリックス成分と測定対象物質とを分離するために、例えばＬＣや固相抽出処理の前処理を行い、マトリックスの影響を軽減させている。また、非特許文献２では、ポストカラムインヒュージョンにより、マトリックスを質量分析計に導入しつつ、別経路からインヒュージョンで測定対象成分を送液し、どの時間帯にマトリックス効果が大きいか事前にデータを取得し、その時間帯に測定対象成分が質量分析に導入されないようにＬＣの条件を工夫している。しかし、これらの方法だと、時間，コストが増大し、操作も煩雑になる。
　また、質量分析法を臨床に応用する場合、施設ごと及び使用者によるデータの変動があってはならない。つまり、できるだけ簡便で使い勝手の良い質量分析計を提供することが重要である。すなわち、前処理工程，ＭＳ測定及びデータ解析の各工程でできるだけ手技操作を排除し、全自動検査が行える質量分析計が望まれる。この場合、イオンサプレッションと同様に、前処理工程の安定性及び回収率がデータ精度に大きな影響を与える。
ＵＳ２００６／０００８９２２　Ａ１ ＵＳ２００７／０００４０４４　Ａ１
T. Guo, R. L. Taylor, R. J. Singh, S. J. Soldin, Simultaneous determination of 12 steroids by isotope dilution liquid chromatography-photospray ionization tandem mass spectrometry, Clinica. Chemica. Acta., 372, 76-82, 2006 T. M. Annesley, Ion Suppression in Mass Spectrometry, Clin. Chem. 49:7, 1041-1044, 2003
　このように質量分析計を用いて定量解析する場合、内標準法を用いている。内部標準物質には理想的には測定対象物質と物性が同様の安定同位体物質を用い補正を行っている。分光光度計やＵＶ検出器とは異なり質量分析計を用いた場合はマトリックス中の夾雑物によるイオンサプレッションが著しくデータ精度に影響する。そこで内部標準物質に安定同位体物質ではなく擬似化合物を用いる場合にはマトリックス中の夾雑物によるイオンサプレッションが起こらないようにＬＣやＧＣ等で十分に分離、精製を行っている。また、夾雑物の影響により、イオンサプレッションに加えて、試料の前処理もデータ精度に影響するため、データ再現性も他測定系に比べて低い。そこで質量分析計を用いて定量解析する場合、従来法は測定毎に検量線を作成し、内標準法を用いて試料中の測定対象物質の濃度を算出している。このため、測定対象物質に安定同位体物質を用いる場合は、コスト面で課題があった。一方、測定対象物質に擬似化合物を用いた場合は、分離，精製を行う手間，分離溶媒のコストおよびスループットに問題があった。また、測定毎に検量線を作成する必要があったため試薬コストおよびスループットに問題があった。
　本発明は手間、コストおよびスループットの問題を鑑み、質量分析計ではマトリックス中の夾雑物がデータ精度に影響する点に着目し、簡易的ながらも実用に耐えうるデータ補正方法を考案した。具体的には、多成分の測定対象物質が混在したサンプルについて、個々の内部標準物質を用いなくてもひとつ以上の擬似化合物を用いての正確な補正ができることを特徴とする。被検液を通液させて特定成分を選択的に分離させる固相抽出カートリッジ１０１と、内部に分離剤を保持するカートリッジ保持容器１０２と、収容部を複数保持でき無限軌道を持つカートリッジ搬送手段１０３と、収容部内に継続的かつランダムアクセス的に圧力を負荷できる圧力負荷部１０７と、収容部内に収容された分離剤からの抽出溶液を選択的に受ける抽出溶液受機構１０８とを備えた前処理装置と、前記前処理装置から前処理試料搬送手段１０９と、全自動で分析測定が可能な質量分析部１１１とデータ処理部１１２を提供することで、多数の検体を同時並行的に処理可能にし、検査結果を得ることができる。
　内部標準物質による補正は、データ処理部１１２に、事前に物性の異なるマトリックスに既知濃度の測定対象物質及び内部標準物質を添加し、マトリックスの物性と感度との相関データを格納しておく。ここでいう感度とは、信号強度を濃度で除算した値である。また、前処理、例えば固相抽出の回収率についてもマトリックスの物性における測定対象物質回収率のデータを格納しておく。次に、既知濃度の内部標準物質と測定対象物質を添加した検体を測定し、内部標準物質の信号強度の実測値から、マトリックスの物性の値を算出する。内部標準物質は、前処理試料搬送手段１０９で質量分析部１１１に搬送する直前に、回転アーム１０５により抽出溶液受機構１０８へ添加される。つまり、濃度が既知の内部標準物質を質量分析部１１１で信号強度を実測した時点で、データ処理部１１２にアクセスし、格納したデータからマトリックスの各物性の値を算出する。次に、測定対象物質を質量分析部１１１で実測して信号強度が得られた後に、データ処理部１１２にアクセスし、格納したデータから算出したマトリックスの各物性の値と測定対象物質の信号強度から測定対象物質の濃度を算出する。ここで、検体の物性のパラメーターは、例えばリン脂質濃度，粘度（濃さ，希釈率），ｐＨ及び総タンパク質量である。最後に、マトリックスの物性における測定対象物質の前処理の回収率を反映させることで測定対象物の濃度が算出される。このように濃度既知の内部標準物質を用いて、データ処理部１１２に格納した相関データから測定対象物質の濃度を用いることができる。この補正方法を用いることで、原理的にはたったひとつの内部標準物質で複数の測定対象成分を、検量線を作成することなしに補正することができる。
　本発明により、従来法で問題になっていたイオンサプレッション及び前処理、例えば固相抽出の回収率を簡便に正確に補正できる。多成分の測定対象物質が混在したサンプルについて、個々の測定対象物質の内部標準物質を用いなくても補正できる。また、従来法のように既知濃度の測定対象物質及び内部標準物質として安定同位体標識物質を幾つか調製し、検量線を作成する必要もなく、時間及びコストの効率化につながる。これらのことから、操作の煩雑な前処理も省略することが可能であるので、装置構成がより簡素化でき、簡便かつ高精度の臨床検査装置を実現できる。
装置構成の概略図。 測定の流れの概略図。 補正方法の概略図。 マトリックスの物性に関する値に対する信号強度依存性（感度）の概念図。 マトリックスの物性に関する値に対する信号強度依存性（感度）の概念図。 測定の流れの概略図。 補正方法の概略図。 データ処理部の入力値及び出力値の概要図。 マトリックスの物性に関する値に対する信号強度依存性（感度）の概念図。 マトリックスの物性に関する値に対する信号強度依存性（感度）の概念図。
　本発明の実施例を、図面を用いてより詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
　質量分析を用いた臨床応用の目的は、血中濃度モニタリング（Therapeutic Drug Monitoring，ＴＤＭ）である。ＴＤＭの一例として、薬物体内動態観察が挙げられる。医療の現場で患者に薬剤を投与する際には、適用する患者の症状に合わせて個別に投与計画することが、有効性・安全性を保障するうえで重要である。同一容量の薬剤を服用しても人によって治療効果の異なる原因として、薬物体内動態の個人差によって血中濃度に違いが出てくることがある。そこで、個々の患者の血中濃度を測定することにより、治療域に収まるように容量・用法を最適化する技術、つまり、ＴＤＭが行われている。例えば、移植した臓器に対する拒絶反応の抑制に用いられる免疫抑制剤は必ずＴＤＭが行われる薬剤である。免疫抑制剤は治療域が数ｎｇ／ｍＬから数百ｎｇ／ｍＬと低濃度である。加えて血中濃度が治療域を超えると高血圧，異脂肪血症，高血糖，消化性潰瘍，肝臓や腎臓の機能障害などの重大な副作用を引き起こす場合もある。そこで一般的には、副作用を軽減させるためにカクテル投与が行われ、数種類の免疫抑制剤とステロイドを併用し、投与する。また、免疫抑制剤は化学合成が難しいため、内部標準物質となる安定同位体標識物質が存在しないことから、内部標準物質として一般的に擬似化合物が用いられる。
　本実施例では、前処理に固相抽出を、検出部に質量分析を用いた自動分析装置の事例である。
　装置構成について図１を用いて説明する。被検液を通液させて特定成分を選択的に分離できる固相抽出カートリッジ１０１と、内部に分離剤を保持するカートリッジ保持容器１０２と、収容部を複数保持でき無限軌道を持つカートリッジ搬送手段１０３と、全血の精製処理ができる全血処理部１１３と、複数の試薬を保管できる試薬槽１０４と、試薬槽から試薬を固相抽出カートリッジに搬送できる回転アーム１０５と、試薬槽から試薬を全血処理部に搬送できる回転アーム１０６と、収容部内に継続的かつランダムアクセス的に圧力を負荷できる圧力負荷部１０７と、収容部内に収容された分離剤からの抽出溶液を選択的に受ける抽出溶液受機構１０８とを備えた前処理装置と、前記前処理装置から前処理試料搬送手段１０９と、試料をイオン化し質量分析部に導入しイオン化部１１０と、分析測定が可能な質量分析部１１１及びデータ処理部１１２からなる。本実施例では、質量分析部１１１は三連四重極質量分析計（Teiple　ＱＭＳ）を用いたが、その他、単連四重極質量分析計（ＱＭＳ），飛行時間質量分析計（ＴＯＦＭＳ），イオントラップ質量分析計（ＩＴＭＳ）及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴ－ＩＣＲＭＳ）を用いることもできる。
　測定の流れについて図２を用いて説明する。全血処理部１１３には、免疫抑制剤を投与した１００μＬの患者検体が分注されており、試薬槽１０４にストックされている２００μＬの０.２Ｍの硫酸亜鉛を含むメタノール溶液が回転アーム１０６により全血処理部１１３の各セルに分注される。全血処理装置１１３には超音波発生機能が搭載されており、１分間程度、超音波を負荷することにより赤血球の細胞膜が崩壊（溶血）する。この時、７０℃～８０℃の高温下で超音波を負荷することにより溶血の効率が飛躍的に向上し、１０秒程度の短時間での処理が可能となる。硫酸亜鉛を添加することで除タンパクの作用がある。次に、遠心分離を行い、約２００μＬの上清が回転アーム１０６により固相抽出カートリッジ１０１に分注される。免疫抑制剤は血球移行性があり、この溶血操作が必須となる。一方、例えば、抗てんかん剤や抗菌剤のような血球移行性のない薬剤について溶血操作は必要なく、全血処理部１１３に分注した１００μＬの患者検体を遠心分離し、上清である血清または血漿成分が回転アーム１０６により固相抽出カートリッジ１０１に分注される。
　固相抽出カートリッジ１０１は、前述の溶血操作後の処理液が分注される前に、活性化及び平衡化処理が行われる。具体的には、試薬槽１０４にストックされている２００μＬの１００％メタノール溶液が、回転アーム１０５により固相抽出カートリッジ１０１に分注され、カートリッジ搬送手段１０３により、少なくとも一箇所存在する圧力負荷部１０７の位置まで搬送され、圧力が印加されカートリッジ内を通液することで充填剤の活性化が行われる。同様に、試薬槽１０４にストックされている２００μＬの１００％水溶液が回転アーム１０５により固相抽出カートリッジ１０１に分注され、カートリッジ搬送手段１０３により、圧力負荷部１０７の位置まで搬送され、圧力が印加されカートリッジ内を通液することで充填剤の平衡化が行われる。この後、溶血操作後の処理液が回転アーム１０６が固相抽出カートリッジ１０１に分注され、同様に圧力が印加されることで、測定対象物質及び内部標準物質が充填剤に補足される。次に、２００μＬの１００％水溶液を通液することで洗浄が行われる。最後に、１００μＬの１００％メタノール溶液を通液し、固相抽出された処理液が抽出溶液受機構１０８に溶出される。処理液は、前処理試料搬送手段１０９により搬送され、イオン化部１１０でイオン化されることで質量分析部１１１に導入され、測定が行われる。前処理試料搬送手段１０９で搬送する前に、試薬槽１０４にストックされている内部標準物質を回転アーム１０５により抽出溶液受機構１０８に分注し、処理液に添加する。また、洗浄工程及び溶出工程で用いた溶媒の組成は、内部標準物質と測定対象物質の組合せによって変わる。つまり、固相抽出工程でできるだけ夾雑物を精製するために、例えば洗浄工程では４０％のメタノールを用い、溶出工程では９０％のメタノールを用いる場合もある。精製手段は、固相抽出の他、液／液抽出，除タンパク質，限外濾過膜及び抗体磁気ビーズを用いることも可能である。
　ここで、補正方法について説明する。前処理で固相抽出を用い、ＭＳに導入する本自動分析装置は、前処理の回収率及びイオンサプレッションがデータ再現性及び精度に大きく影響する。一般的には、幾つかの既知濃度の内部標準物質及び測定対象物質を前処理前の検体に添加しＭＳ測定することで、横軸に測定対象物質濃度，縦軸に内部標準物質及び測定対象物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度比をプロットした検量線を作成する。そして患者検体を実測し、内部標準物質及び測定対象物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度比と作成した検量線から濃度を算出する。この方法では、試薬代コスト，検量線を作成する時間及び操作が煩雑になる。また、内部標準物質及び測定対象物質のイオンサプレッションが同等である必要があり、内部標準物質には測定対象物質の安定同位体標識物質が必須であった。本発明での補正方法について図３を用いて説明する。予め、物性の異なるマトリックスに既知濃度の測定対象物質及び内部標準物質を添加し、横軸にマトリックスの物性に関する値を、縦軸にマトリックスの物性に関する値に対する測定対象物質及び内部標準物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度依存性（感度）の相関データをデータ処理部１１２に格納しておく（図４）。ここでいう感度とは、ｍ／ｚの各信号に対応する信号強度を濃度で除算した値であり、マトリックスの物性に関する値とは、リン脂質濃度である。リン脂質は、グリセロリン脂質類やスフィンゴリン脂質類があるが、本実施例では、グリセロリン脂質類であるレシチン（ホスファチジルコリン）をマトリックスに添加
した。その他のリン脂質として、グリセロリン脂質では、リゾレシチン及びセファリン（フォスファチジルエタノールアミン）が、グリセロリン脂質では、スフィンゴミエリンが考えられる。マトリックスの物性に関する値は、この他、粘度，総タンパク質量及びｐＨが用いられる。具体的には、マトリックスの物性に関する値、ここではリン脂質であるレシチンの濃度ｐを変数とした測定対象物質及び内部標準物質の感度関数Ｓ0(ｐ)，ＳIS(ｐ)を予め、データ処理部１１２に格納しておく。質量分析部１１１で実測した測定対象物質及び内部標準物質の信号強度をＩ0，ＩIS、測定対象物質に含まれるマトリックスの物性に関する値をＸ、内部標準物質の濃度をＣIS、得られる測定対象物質の濃度をＣ0とすると、標準化合物の感度ＳIS(Ｘ)、は（数１）で表される。
　　ＳIS(Ｘ)＝ＩIS／ＣIS　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（１）
　（数１）で求められた結果とデータベースに予め格納されている関数ＳIS(ｐ)から、マトリックスの物性に関する値Ｘが算出できる。次に、マトリックスの物性に関する値Ｘと予めデータ処理部１１２に格納された関数Ｓ0(ｐ)から、測定対象物質の感度Ｓ0(Ｘ)が求まる。Ｓ0(Ｘ)と質量分析部１１１で実測した測定対象物質の信号強度をＩ0から測定対象物質の濃度Ｃ0は（数２）で求められる。
　　Ｃ0＝Ｉ0／Ｓ0(Ｘ)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 …（２）
　以上の作業で、イオンサプレッションを補正することができる。なお、データ処理部１１２に格納するマトリックスの物性に関する値を変数とした測定対象物質及び内部標準物質の感度関数は、補正の精度を向上させるための施策として、イオンサプレッションに影響すると考えられる複数のマトリックスの物性に関する値を変数とした測定対象物質及び内部標準物質の多次元の感度関数を採用することもできる。
　次に、前処理の回収率の補正について説明する。リン脂質濃度ｐを変数とした測定対象物質の回収率Ｒ(ｐ)を予め、データ処理部１１２に格納しておく。ここでいう回収率Ｒ(ｐ)とは、前処理した後にリン脂質濃度ｐになるマトリックスに測定対象物質を添加しＭＳ測定した信号強度を、リン脂質濃度ｐのマトリックスに測定対象物質添加しＭＳ測定した信号強度で除算したものである。前処理前の測定対象物質の濃度Ｃ00は（数３）で求められる。マトリックスの物性に関する値Ｘは、（数１）で求められた結果とデータベースに予め格納されている関数ＳIS(ｐ)から算出することができる。
　　Ｃ00＝Ｃ0／Ｒ(Ｘ)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 …（３）
　なお、回収率Ｒ(ｐ)は、リン脂質濃度の他に、マトリックスの物性に関する値、例えば、レシチンの他のリン脂質，粘度，総タンパク質量及びｐＨにより変動する。また、固相抽出カートリッジ１０１の充填剤の種類によっても変動するため、これらの場合での回収率Ｒx(ｐ)の関数がデータ処理部１１２に格納されていることになる。
　このように検体に添加した濃度既知の内部標準物質を用いて、データ処理部１１２に格納した相関データから測定対象物質の濃度を用いることができる。この補正方法を用いることで、原理的にはたったひとつの内部標準物質で複数の測定対象物質を、検量線を作成することなしに補正することができる。
　補正の方法に関して、マトリックスの物性の異なる物質をリアルタイムで実測しながら、補正フィードバックをかける方法について説明する。装置構成及び測定の流れは実施例と同様である。実施例１と異なる補正方法について説明する。実施例１では、物性の異なるマトリックスに既知濃度の測定対象物質及び内部標準物質を添加し、横軸にマトリックスの物性に関する値を、縦軸にマトリックスの物性に関する値に対する測定対象物質及び内部標準物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度依存性（感度）の相関データをデータ処理部１１２に格納しおき、検体に添加した既知濃度の内部標準物質の質量分析部１１１での実測信号強度からマトリックスの物性に関する値を求める。次に、測定対象物質の実測信号強度及びマトリックスの物性に関する値から測定対象物質の濃度を求める。そして、データ処理部１１２に予め格納しておいたマトリックスの物性に関する値を変数とした前処理工程における測定対象物質の回収率から、前処理工程前の測定対象物質の濃度を求めていた。
　実施例２では、マトリックスの物性に関する物質のｍ／ｚの信号強度に対する測定対象物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度依存性（感度）の相関データ及び前処理工程における測定対象物質の回収率を事前にデータ処理部１１２に格納しておく。本実施例では、マトリックスの物性に関する物質としてレシチンの信号強度を変数とした信号強度依存性（感度）及び回収率をデータ処理部１１２に格納しておき（図８）、マトリックスの物性に関する物質及び測定対象物質を質量分析部１１１で数ｍsec～数百ｍsecの間隔で交互に実測する。例えば、測定対象物質が免疫抑制剤のタクロリムスである場合、質量分析部１１１は三連四重極質量分析計を用いているので、ｍ／ｚの値は、タクロリムス（Ｑ１：Ｑ３＝８２１.５／７６８.５），レシチン（Ｑ１：Ｑ３＝７８７／１８４）に設定し、イオン化は、ポジティブイオンで実測を行うことになる。そして、マトリックス中のレシチンの信号強度からタクロリムスの感度が算出される。そして、タクロリムスの実測の信号強度からタクロリムスの濃度が算出される。このように、マトリックス中のイオンサプレッションに影響する物質（ここでは、レシチン）及び測定対象物質（ここではタクロリムス）の信号強度とデータ処理部１１２に格納した相関データから測定対象物質の濃度が算出される。この方法を用いることで、理論的には内部標準物質を用いなくともイオンサプレッションの補正が可能であり、加えて測定毎に検量線を作成する必要もなく、容易に補正することができる。
　２種類の内部標準物質を添加し、より正確に、測定対象物質の濃度を算出する方法を説明する。２種類の内部標準物質は同様なイオン化効率をもつ物質を用いる。２種類のイオン化効率が同様な内部標準物質を用いることで前処理部の実測の回収率を算出することが可能であり、データベースに格納されている値との差異を把握することで、前処理部の異常を把握することができる。測定の流れについて実施例１と異なる点、つまり、第一の内部標準物質と第二の内部標準物質の添加方法について図６を用いて説明する。まず、全血処理部１１３には、採血管から分注された１００μＬの患者検体がストックされており、試薬槽１０４にストックされている１０μＬの第一の内部標準物質が回転アーム１０６により全血処理部１１３の各セルに分注される。第二の内部標準物質は実施例１のように、前処理後の溶液を前処理試料搬送手段１０９で搬送する前に、試薬槽１０４にストックされている内部標準物質を回転アーム１０５により抽出溶液受機構１０８に分注し、処理液に添加する。他の工程は、実施例１と同様である。なお、第一の内部標準物質は、患者から検体を採取する際に用いられる採血管に事前に添加しておくことも考えられる。この場合、内部標準物質ごとに採血管を準備しておく必要がある。
　補正方法について図７を用いて説明する。予め、物性の異なるマトリックスに既知濃度の第一の内部標準物質、第二の内部標準物質及び測定対象物質を添加し、横軸にマトリックスの物性に関する値を、縦軸にマトリックスの物性に関する値に対する測定対象物質及び内部標準物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度依存性（感度）の相関データをデータ処理部１１２に格納しておく。ここでいう感度とは、ｍ／ｚの各信号に対応する信号強度を濃度で除算した値であり、マトリックスの物性に関する値とは、リン脂質濃度である。マトリックスの物性に関する値は、この他、粘度，総タンパク質量及びｐＨも用いられる。具体的には、リン脂質濃度ｐを変数とした第一の内部標準物質，第二の内部標準物質及び測定対象物質の感度関数Ｓ1(ｐ)，感度関数Ｓ2(ｐ)及び感度関数Ｓ0(ｐ)を予め、データ処理部１１２に格納しておく。
　次に、既知濃度の第一の内部標準物質及び第二の内部標準物質を含むリン脂質濃度を未知のマトリックス成分（実試料）に添加し、質量分析部１１１で実測した第一の内部標準物質，第二の内部標準物質及び測定対象物質の信号強度をＩ1，Ｉ2及びＩ0とし、マトリックスの物性に関する値をＸ、同濃度である既知の第一の内部標準物質，第二の内部標準物質の濃度をＣ1，Ｃ2及びＣ0とすると、第二の内部標準物質感度Ｓ2(Ｘ)は（数１′）で表される。第一の内部標準物質及び第二の内部標準物質は同様なイオン化効率をもつため、ｍ／ｚに対応する信号強度依存性（感度）の相関データも同様になる（数２′）。
　　Ｓ2(Ｘ)＝Ｉ2／Ｃ2　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 …（１′）
　　Ｓ2(ｐ)＝Ｓ1(ｐ)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（２′）
　次に、第一の内部標準物質及び測定対象物質のリン脂質濃度ｐを変数とした測定対象物質の回収率Ｒ1(ｐ)及びＲ0(ｐ)を予め、データ処理部１１２に格納しておく。ここでいう回収率Ｒ1(ｐ)及びＲ0(ｐ)とは、前処理した後にリン脂質濃度ｐになるマトリックスに内部標準物質及び測定対象物質を添加しＭＳ測定した信号強度を、リン脂質濃度ｐのマトリックスに第一の内部標準物質及び測定対象物質添加しＭＳ測定した信号強度で除算したものである。（数１′）で求められた結果とデータベースに予め格納されている関数Ｓ2(ｐ)から、マトリックスの物性に関する値Ｘが算出できる。次に、マトリックスの物性に関する値Ｘと予めデータ処理部１１２に格納された関数Ｓ0(ｐ)から、測定対象物質の感度Ｓ0(Ｘ)が求まる。Ｓ0(Ｘ)と質量分析部１１１で実測した測定対象物質の信号強度をＩ0から測定対象物質の濃度Ｃ0は（数３′）で求められる。
　　Ｃ0＝Ｉ0／Ｓ0(Ｘ)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 …（３′）
　以上の作業で、イオンサプレッションを補正することができる。
　質量分析部１１１にて実測された第一の内部標準物質の信号強度Ｉ1は、前処理の回収率及びイオン化効率が反映された値であり、既知濃度Ｃ1と（数２′）及び感度関数Ｓ2(ｐ)は横軸にマトリックスの物性に関する値を、縦軸にマトリックスの物性に関する値に対する第一の内部標準物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度依存性（感度）であることから、前処理での回収率Ｒ1(ｐ)において（数４′）が成り立つ。
　　Ｉ1／Ｓ1(ｐ)／Ｃ１＝Ｒ1(ｐ)　　　　　　　　　　　　　　 …（４′）
　（４′）の左項は実測値、右項はデータ処理部１１２に格納されている値である。しかし、前処理工程は、全血の溶血工程で攪拌，超音波処理，遠心分離及び分注といった複雑な操作からなり、誤差が生じる可能性がある。つまり（数４′）が成り立たず、（数４″）及び（数４′′′）のようになる。
　　Ｉ1／Ｓ1(ｐ)／Ｃ１＞Ｒ1(ｐ)　　　　　　　　　　　　　　 …（４″）
　　Ｉ1／Ｓ1(ｐ)／Ｃ１＜Ｒ1(ｐ)　　　　　　　　　　　　 …（４′′′）
　これらの場合には、データ処理部１１２に格納されている値との差異に対する閾値を事前に設定しておき、「データ処理部１１２に格納されている値」，「実測値による補正」及び「再検査」を選択することで、より正確な測定対象物質の濃度を算出できる（図８）。例えば、実測値とデータ処理部１１２に格納されている値の差異が±３％以内の場合は「データ処理部１１２に格納されている値」、±３～±１０％の場合は「実測値による補正」及び±１０％以上の場合は「再検査」に移行できるようアルゴリズムをデータ処理部１１２に格納しておく。具体的には、差異が±３％以内の場合は、データ処理部１１２に格納されている値、つまり回収率Ｒ0(ｐ)で補正することとなり、（数５′）で前処理工程の補正を含めた測定対象成分濃度Ｃ00が算出される。
　　Ｃ00＝Ｃ0／Ｒ0(Ｘ)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　…（５′）
　±３～±１０％の場合は実測値で補正することとなり、（数５″）で前処理工程の補正を含めた測定対象成分濃度Ｃ00が算出される。
　　Ｃ00＝(Ｃ0×Ｒ1(Ｘ))／{Ｒ0(Ｘ)×(Ｉ1／Ｓ1(ｐ)／Ｃ１)}　 …（５″）
　±１０％以上の場合は再検査となる。
　データ処理部１１２に格納されている値との差異に対する閾値を事前は測定者がパネル操作により設定可能である。
　本自動分析装置に搭載されている測定対象物質に、ユーザーが新たに測定対象物質を追加する方法について説明する。臨床の現場では、患者ごとの疾患，年齢，性別，症状の進行度及び検査施設ごと（国，規模の大小）に投薬設計は異なり、従って検査項目も異なる。質量分析計（ＭＳ）を検出器に用いる手法は、従来のイムノアッセイが薬剤ごとに専用試薬（抗体試薬）が必要であるのに比べてｍ／ｚ（質量／電荷）で選択するので多項目測定に優れている。つまり、測定対象物質の追加及び削除がフレキシブルに対応可能である。特に、本発明の補正方法は、従来法のように内部標準物質に測定対象物質の安定同位体標識物質を用いて、検査毎に検量線を作成する必要がなく、測定対象物質の追加及び削除が容易である。マトリックスの各物性の値に対する複数の測定対象物質及び少なくともひとつの内部標準物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度依存性（感度）の相関データ及び、上記マトリックスに対する測定対象物質の回収率をデータ処理部２０１に格納し、測定対象物質及び少なくともひとつの内部標準物質の信号強度から、測定対象物質の濃度を算出する。新たに測定対象物質を追加する場合、既にデータ処理部２０１に登録されている内部標準物質及び測定対象物質の情報に、マトリックスの各物性の値に対する新たに追加する測定対象物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度依存性（感度）の相関データ、上記マトリックスに対する新たに追加する測定対象物質の回収率及び新たに追加する測定対象物質のｍ／ｚの３つの情報を登録することで、測定対象物質の追加が可能となる。原理的には、複数の測定対象物質を追加することができる。これらの３つの情報は、質量分析部２０２で自動測定により得ることが可能である。測定対象具体的には、新たに追加する測定対象物質を事前に質量分析部２０２でインヒュージョン測定を行い、ｍ／ｚのデータを取得しておく。次に、データ処理部２０１のスクリーン上に測定対象物質のｍ／ｚをｍ／ｚ入力部２０４に入力し、自動演算ボタン２０５をクリックすることで、パラメーターを変化させながら質量分析部１１１で実測し、そのデータをもとにしてデータ処理部１１２で測定対象物質に関する質量分析に必要な条件（イオン化条件及び解裂電圧など）が算出され、その後に、マトリックスの各物性の値に対する新たに追加する測定対象物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度依存性（感度）の相関データが出力部２０６に出力され、また上記マトリックスに対する新たに追加する測定対象物質の回収率が算出され、出力部２０７に出力される。この工程中に得られた全ての情報（各時間における検出された全てのｍ／ｚ及びそのｍ／ｚの信号強度データ）は保存されており、随時出力することができる。つまり、何らかの検査の不具合が起こった場合、設定した条件のデータを見直し、条件を修正することが可能となり、再度条件設定を行う時間，コスト，労力のロスが軽減される。以上のように新たに測定対象物質の追加が行われ、原理的には、どのような内部標準物質に対しても、自動的に、複数の測定対象物質の追加が可能となる。
１０１　固相抽出カートリッジ
１０２　カートリッジ保持容器
１０３　カートリッジ搬送手段
１０４　試薬槽
１０５，１０６　回転アーム
１０７　圧力負荷部
１０８　抽出溶液受機構
１０９　前処理試料搬送手段
１１０　イオン化部
１１１　質量分析部
１１２　データ処理部
１１３　全血処理部

Claims (16)

  1. 　固相抽出機構を含む前処理装置と、該前処理装置で前処理されたサンプルをイオン化した後、質量分析する質量分析装置を備えた分析装置において、
    　前記サンプル中のイオン化を阻害する物質の濃度と、測定対象物質及び内部標準物質の信号強度依存性、及び回収率に関するデータを記憶する記憶部を備え、
    　前記サンプル、及び前記内部標準物質の測定結果を前記記憶部に記憶された前記データに基づき補正する補正部を備えたことを特徴とする分析装置。
  2. 　請求項１に記載の分析装置において、
    　前記イオン化を阻害する物質がリン脂質であることを特徴とする分析装置。
  3. 　請求項２に記載の分析装置において、
    　前記リン脂質が、グリセロリン脂質またはスフィンゴリン脂質の少なくともいずれかであることを特徴とする分析装置。
  4. 　請求項３記載の分析装置において、
    　前記グリセロリン脂質が、
    　レシチン（ホスファチジルコリン），リゾレシチン及びセファリン（フォスファチジルエタノールアミン）の中から選ばれた少なくとも何れかであることを特徴とする分析装置。
  5. 　請求項３記載の分析装置において、
    　前記スフィンゴリン脂質が、スフィンゴミエリンであることを特徴とする分析装置。
  6. 　固相抽出機構を含む前処理装置と、該前処理装置で前処理されたサンプルをイオン化した後、質量分析する質量分析装置を備えた分析装置において、
    　前記サンプル中の粘度，総タンパク質量，ｐＨの少なくともいずれかと、測定対象物質及び内部標準物質の信号強度依存性、及び回収率に関するデータを記憶する記憶部を備え、
    　前記サンプル、及び前記内部標準物質の測定結果を前記記憶部に記憶された前記データに基づき補正する補正部を備えたことを特徴とする分析装置。
  7. 　固相抽出カートリッジと、内部に分離剤を保持するカートリッジ保持容器と、収容部を複数保持でき無限軌道を持つカートリッジ搬送手段と、全血の精製処理ができる全血処理部と、複数の試薬を保管できる試薬槽と、試薬槽から試薬を固相抽出カートリッジに搬送できる回転アームと、試薬槽から試薬を全血処理部に搬送できる回転アームと、収容部内に継続的かつランダムアクセス的に圧力を負荷できる圧力負荷部と、収容部内に収容された分離剤からの抽出溶液を選択的に受ける抽出溶液受機構とを備えた前処理装置と、前記前処理装置から前処理試料搬送手段と、試料をイオン化し質量分析部に導入しイオン化部と、分析測定が可能な質量分析部及びデータ処理部を有する分析装置において、
    　少なくともひとつ内部標準物質を用い、上記データ処理部に予め、含有するリン脂質濃度が異なるマトリックスに対する測定対象物質及び内部標準物質のｍ／ｚの各信号に対応する信号強度依存性（感度）の相関データ及び、上記マトリックスに対する測定対象物質の回収率データをデータ処理部に格納し、質量分析部で実測された測定対象物質及び内部標準物質の信号強度から、リン脂質濃度及び測定対象物質の濃度を算出することを特徴とする分析装置。
  8. 　請求項７に記載の分析装置において、
    　前記リン脂質がレシチン（ホスファチジルコリン），リゾレシチン及びセファリン（フォスファチジルエタノールアミン），スフィンゴミエリンの少なくとも何れかであることを特徴とする分析装置。
  9. 　請求項７に記載の分析装置において、
    　少なくともひとつの内部標準物質を全血処理部に搬送されてきた検体に添加する第１の内部標準物質添加機構と、少なくともひとつの前記内部標準物質を前記抽出溶液受機構に分注されている抽出溶液に添加する第２の内部標準物質添加機構と、を備えたことを特徴とする分析装置。
  10. 　請求項７に記載の分析装置において、
    　前記内部標準物質は、測定対象物質の安定同位体標識物質または擬似化合物であることを特徴とする分析装置。
  11. 　請求項１に記載の分析装置において、
    　前記前処理装置の固相抽出機構が、液／液抽出機構であることを特徴とする分析装置。
  12. 　請求項１に記載の分析装置において、
    　前記前処理装置の固相抽出機構が、除タンパク質機構であることを特徴とする分析装置。
  13. 　請求項１に記載の分析装置において、
    　前記前処理装置の固相抽出機構が、限外濾過膜機構であることを特徴とする分析装置。
  14. 　請求項１に記載の分析装置において、
    　前記前処理装置の固相抽出機構が、抗体磁気ビーズを用いることを特徴とする分析装置。
  15. 　請求項７に記載の分析装置において、
    　前記全血処理部は、超音波発生機構，遠心分離機構，攪拌機構及び溶液の分注機構を有しており、処理液を前記固相抽出カートリッジに分注できる機構を有することを特徴とする分析装置。
  16. 　請求項１５に記載の分析装置において、
    　前記超音波発生機構は温度調整機能を備えたことを特徴とする分析装置。
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