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WO2009113637A1 - 新規なチアゾール誘導体、チアゾール誘導体固定化マトリックス、及びそれらの製造方法 - Google Patents

新規なチアゾール誘導体、チアゾール誘導体固定化マトリックス、及びそれらの製造方法 Download PDF

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WO2009113637A1
WO2009113637A1 PCT/JP2009/054805 JP2009054805W WO2009113637A1 WO 2009113637 A1 WO2009113637 A1 WO 2009113637A1 JP 2009054805 W JP2009054805 W JP 2009054805W WO 2009113637 A1 WO2009113637 A1 WO 2009113637A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
optionally substituted
carbon atoms
gel
solution
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/054805
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
竜太 大野
均 柿谷
俊薫 豊嶋
博之 伊藤
晴宇 家亀
真帆 河野
朋子 折笠
章夫 沖崎
映一 秋山
Original Assignee
東ソー株式会社
財団法人相模中央化学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2009007094A external-priority patent/JP5498025B2/ja
Priority claimed from JP2009007093A external-priority patent/JP5455380B2/ja
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Publication of WO2009113637A1 publication Critical patent/WO2009113637A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/38—Nitrogen atoms
    • C07D277/44—Acylated amino or imino radicals
    • C07D277/46—Acylated amino or imino radicals by carboxylic acids, or sulfur or nitrogen analogues thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes

Definitions

  • the present invention relates to a novel thiazole derivative, a thiazole derivative-immobilized matrix that can be used for analysis or purification of proteins, particularly immunoglobulins, and a method for producing them.
  • Protein purification techniques generally include chromatographic separation techniques such as gel permeation chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography, and affinity chromatography.
  • chromatographic separation techniques such as gel permeation chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, reverse phase chromatography, and affinity chromatography.
  • using a separating agent or apparatus used in a laboratory is not economical and is not practical.
  • a purification process in which several techniques are combined is generally employed (Patent Document 1).
  • the thiazole derivative which has a chemical structure similar to said thiazole derivative (1) used for manufacture of the matrix of this invention in patent document 5 and nonpatent literature 2 is reported, the thiazole as described in these literatures Regarding the chemical structure of the derivative, the 2-position of the thiazole ring is limited to an amino group or an alkyl group, and there is no description of a compound in which a benzoylamino group is substituted at the 2-position as in the thiazole derivative (1).
  • the compound described in Non-Patent Document 2 is a thiazole derivative similar to the above thiazole derivative (1), but their use is limited to use as a histamine H2 receptor agonist, and for purifying immunoglobulins. There is no description about the use.
  • Patent Document 6 describes a thiazole derivative in which a benzoylamino group is substituted at the 2-position of the thiazole ring, but the substituent at the 4-position of the thiazole ring of these compounds is carbonyl, and the 5-position is unsubstituted. They are limited, and their use is only mentioned as an active ingredient of a medicine having an action for improving gastrointestinal motility. Furthermore, the compound of Patent Document 6 is not immobilized on a matrix, and there is no description about the use for purifying immunoglobulin.
  • An object of the present invention is to provide thiazole derivatives useful for analysis or purification of proteins, particularly immunoglobulins, and methods for producing the same, as well as a matrix on which the thiazole derivatives useful for analysis or purification of proteins, particularly immunoglobulins, are immobilized. It is to provide a manufacturing method.
  • the present inventor has found that the thiazole derivative of the present invention represented by the following general formula (1) selectively interacts with immunoglobulins, and the general formula ( It has been found that the thiazole-immobilized matrix of the present invention represented by the general formula (6) in which the thiazole derivative of the present invention represented by 1) is immobilized on a matrix enables easy analysis or purification of proteins, particularly immunoglobulins.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is represented by the general formula (1)
  • R 1 and R 2 represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 3 represents a phthalimide group, an amino group or an ammonium salt
  • Ar represents a substituted group. Represents an aromatic group which may be used, and n represents an integer of 1 to 12.).
  • the present invention also provides a general formula (2)
  • R 1 and R 2 represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • Ar represents an optionally substituted aromatic group
  • n represents 1 to 12 It represents an integer
  • M represents a matrix
  • the matrix of M is any of vinyl polymer, agarose, chitosan, dextran, cellulose, silica and polystyrene.
  • the present invention relates to a thiazole derivative-immobilized matrix. Further, the present invention provides a compound represented by the general formula (1 ′)
  • the method relates to a method for producing a thiazole derivative-immobilized matrix.
  • the present invention also provides a general formula (6)
  • R 1 , R 2 , Ar, n and M represent the same meaning as described above, and relates to a method for protein analysis or purification using a thiazole derivative-immobilized matrix.
  • the thiazole derivative of the present invention is useful as a low molecular weight ligand for analysis and purification of proteins, particularly immunoglobulins, and the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention in which the thiazole derivative is bound to a matrix is used for proteins, particularly immunoglobulins. Since it is a selective adsorption / desorption agent that is useful for analysis and purification and has high durability, it is extremely useful in industrial purification of medical proteins, particularly immunoglobulins.
  • the chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of compound 286).
  • the chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of the compound 304).
  • the chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of the compound 320).
  • the chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of compound 329).
  • the chromatographic result of the immunoglobulin using the thiazole derivative fixed HiTrap column (result of compound 384).
  • the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms represented by R 1 and R 2 may be linear or branched, and includes a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, Isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isoamyl, neopentyl, 2-pentyl, 3-pentyl, tert-pentyl, hexyl, isohexyl, 2-hexyl, 3- A hexyl group can be exemplified.
  • alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms may be substituted with a halogen atom or the like, and more specifically, a difluoromethyl group, a trifluoromethyl group, a 2,2,2-trifluoroethyl group, a per Examples thereof include a fluorobutyl group, a hydroxymethyl group, a carboxymethyl group, and a 4-morpholinocarbonylmethyl group.
  • R 1 is preferably a methyl group and R 2 is preferably a hydrogen atom in view of good performance in immunoglobulin analysis or purification.
  • the ammonium salt represented by R 3 and R 3a is represented by Z ⁇ H 3 + N (Z ⁇ represents a conjugate base). Specifically Cl - H 3 + N, Br - H 3 + N, F - H 3 + N, I - H 3 + N, NO 3 - H 3 + N, 1/2 (SO 4 2-) H 3 + N, 1/3 (PO 4 3 ⁇ ) H 3 + N, CH 3 SO 3 ⁇ H 3 + N, 4-CH 3 C 6 H 4 SO 3 ⁇ H 3 + N, CH 3 COO ⁇ H 3 + N, CF 3 COO ⁇ H 3 + N and the like can be exemplified.
  • R 3 and R 3a are excellent in the operability and isolation of the reaction in synthesizing the thiazole derivative (1) and the thiazole derivative (1 ′), and in the reactivity and operability of immobilization on the matrix.
  • Cl ⁇ H 3 + N or Br ⁇ H 3 + N is preferable.
  • the aromatic group that may be substituted represented by Ar is not particularly limited, but furan-2-yl group, furyl group, thienyl group, thiophen-3-yl group, pyrrol-2-yl group, Pyrrol-3-yl group, pyrazol-3-yl group, pyrazol-4-yl group, isothiazol-3-yl group, isothiazol-4-yl group, isoxazol-3-yl group, isoxazol-4-yl group Imidazol-2-yl group, imidazol-4-yl group, imidazol-5-yl group, oxazol-2-yl group, oxazol-4-yl group, oxazol-5-yl group, thiazol-2-yl group, Thiazol-4-yl group, thiazol-5-yl group, 1,2,4-triazol-3-yl group, phenyl group, 2-pyridyl group, 3-pyridyl group,
  • a phenyl group, a 2-pyridyl group, a 3-pyridyl group, or a 4-pyridyl group is preferable in that it exhibits good performance in immunoglobulin analysis or purification.
  • the substituent of the optionally substituted aromatic group represented by Ar is not particularly limited, but may be a halogen atom, an optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or optionally substituted.
  • optionally substituted acyloxy group having 1 to 6 carbon atoms optionally substituted alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, optionally substituted alkyl having 1 to 6 carbon atoms
  • halogen atom examples include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • the optionally substituted alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be linear, branched or cyclic, and may be a methyl group, an ethyl group, a cyclopropyl group, a propyl group, an isopropyl group, Cyclopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, isoamyl group, neopentyl group, 2-pentyl group, 3-pentyl group, 2-methylbutyl group, tert-pentyl group, hexyl Examples thereof include a group, an isohexyl group, a 2-hexyl group and a 3-hexyl group.
  • alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms are halogen atoms, cycloalkyl groups having 3 to 8 carbon atoms, alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms, alkoxycarbonyl groups having 1 to 6 carbon atoms, carboxy groups, and acyl groups.
  • One or more aromatic groups which may be substituted may be substituted, and more specifically, 2-chloroethyl group, 3-chloropropyl group, difluoromethyl group, 3-fluoropropyl group, methoxymethyl group 2-ethoxyethyl group, cyclopropylmethyl group, cyclopentylmethyl group, cyclohexylmethyl group, 2-methylthioethyl group, 2-ethylthioethyl group, 2-allylthioethyl group, 2-propargylthioethyl group, 2-benzyl Thioethyl group, 2- (2-chlorobenzyl) thioethyl group, 2- (2,4-dichlorobenzyl) thioethyl Group, 2-methylsulfinylethyl group, 2-methylsulfonylethyl group, ethoxymethyl group, 2-methoxyethyl group, 2-chloroethoxymethyl group, methoxycarbon
  • the optionally substituted alkoxy group having 1 to 12 carbon atoms may be linear or branched, and is a methoxy group, ethoxy group, propyloxy group, isopropyloxy group, butoxy group, isobutyl group.
  • alkoxy groups may be halogen atoms, cycloalkyl groups having 3 to 8 carbon atoms, alkoxy groups having 1 to 6 carbon atoms, alkoxycarbonyl groups having 1 to 6 carbon atoms, carboxy groups, acyl groups,
  • One or more aromatic groups may be substituted, and more specifically, 2-chloroethoxy group, 3-chloropropyloxy group, difluoromethoxy group, 4-trifluoromethoxy group, 3-fluoropropyloxy Group, cyclopropylmethoxy group, cyclopentylmethoxy group, cyclohexylmethoxy group, 2-methylthioethoxy group, 2-ethylthioethoxy group, 2-allylthioethoxy group, 2-propargylthioethoxy group, 2-benzylthioethoxy group, 2 -(2-chlorobenzyl) thioethoxy group, 2- (2,4-dichlorobenzyl) Thioeth
  • Examples of the optionally substituted cycloalkoxy group having 3 to 8 carbon atoms include cyclopropyloxy group, cyclobutyloxy group, cyclopentyloxy group, 2-methylcyclobutyloxy group, cyclohexyloxy group, 2-methylcyclopentyloxy group And 3-methylcyclopentyloxy group, 4-methylcyclopentyloxy group, and cyclooctyloxy group.
  • Examples of the optionally substituted alkenyloxy group having 3 to 6 carbon atoms include allyloxy group, 2-methyl-2-propenyloxy group, 2-butenyloxy group, 1-buten-3-yloxy group, 3-butenyloxy group, Examples include 4-pentenyloxy group and 5-hexenyloxy group. Further, these alkenyloxy groups having 3 to 6 carbon atoms may be substituted with a halogen atom or the like, such as 3,3-difluoroallyloxy group, 3,3-dichloroallyloxy group, 3,3-dibromoallyloxy group. Groups can be exemplified.
  • Examples of the optionally substituted alkynyloxy group having 3 to 6 carbon atoms include propargyloxy group, 1-butyn-3-yloxy group, 2-butynyloxy group, 3-butynyloxy group, 2-pentynyloxy group, 3- Examples include pentynyloxy group, 4-pentynyloxy group, 2-hexynyloxy group, 3-hexynyloxy group, 4-hexynyloxy group, and 5-hexynyloxy group.
  • these optionally substituted alkynyloxy groups having 3 to 6 carbon atoms may be substituted with halogen atoms, etc., and examples thereof include 4,4,4-trifluorobutyn-2-yl groups and the like. Can do.
  • optionally substituted acyloxy group having 1 to 6 carbon atoms examples include an acetoxy group and a propionyloxy group. Further, these optionally substituted acyloxy groups may be substituted with a halogen atom or the like, and examples thereof include a trifluoroacetoxy group and a 2,2,2-trifluoropropionyloxy group.
  • Examples of the optionally substituted alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms include methylthio group, ethylthio group, propylthio group, isopropylthio group, butylthio group, isobutylthio group, sec-butylthio group, pentylthio group, isoamylthio group, neo Examples thereof include a pentylthio group, a 2-pentylthio group, a 3-pentylthio group, a 2-methylbutylthio group, a hexylthio group, an isohexylthio group, a 3-methylpentylthio group, and a 2-methylpentylthio group.
  • alkylthio groups may be substituted with a halogen atom, a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, and more specifically, 2-chloroethylthio group, 3-chloropropylthio group, difluoro Examples thereof include a methylthio group, a 3-fluoropropylthio group, a cyclopropylmethylthio group, a cyclopentylmethylthio group, and a cyclohexylmethylthio group.
  • Examples of the optionally substituted alkylsulfinyl group having 1 to 6 carbon atoms include methylsulfinyl group, ethylsulfinyl group, propylsulfinyl group, isopropylsulfinyl group, butylsulfinyl group, isobutylsulfinyl group, sec-butylsulfinyl group, pentylsulfinyl group Group, isoamylsulfinyl group, neopentylsulfinyl group, 2-pentylsulfinyl group, 3-pentylsulfinyl group, 2-methylbutylsulfinyl group, hexylsulfinyl group, isohexylsulfinyl group, 3-methylpentylsulfinyl group, 2-methylpentyl A sulfinyl group can be exemplified.
  • alkylsulfinyl groups may be substituted with a halogen atom, a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, and more specifically, a 2-chloroethylsulfinyl group, a 3-chloropropylsulfinyl group, Examples thereof include a difluoromethylsulfinyl group, a 3-fluoropropylsulfinyl group, a cyclopropylmethylsulfinyl group, a cyclopentylmethylsulfinyl group, and a cyclohexylmethylsulfinyl group.
  • Examples of the optionally substituted alkylsulfonyl group having 1 to 6 carbon atoms include methylsulfonyl group, ethylsulfonyl group, propylsulfonyl group, isopropylsulfonyl group, butylsulfonyl group, isobutylsulfonyl group, sec-butylsulfonyl group, pentylsulfonyl Group, isoamylsulfonyl group, neopentylsulfonyl group, 2-pentylsulfonyl group, 3-pentylsulfonyl group, 2-methylbutylsulfonyl group, hexylsulfonyl group, isohexylsulfonyl group, 3-methylpentylsulfonyl group, 2-methylpentyl A sulfonyl group can be illustrated.
  • alkylsulfonyl groups may be substituted with a halogen atom or a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, and more specifically, 2-chloroethylsulfonyl group, 3-chloropropylsulfonyl group, difluoro Examples thereof include a methylsulfonyl group, a 3-fluoropropylsulfonyl group, a cyclopropylmethylsulfonyl group, a cyclopentylmethylsulfonyl group, and a cyclohexylmethylsulfonyl group.
  • Examples of the optionally substituted alkoxycarbonyl group having 1 to 12 carbon atoms include methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, propoxycarbonyl group, butoxycarbonyl group, hexyloxycarbonyl group, dodecyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, tert -A butoxycarbonyl group can be exemplified. Further, one or more of these alkoxycarbonyl groups may be substituted with a halogen atom or the like, and more specifically, a trifluoromethoxycarbonyl group, a 2,2,2-trifluoroethoxycarbonyl group and the like can be exemplified. .
  • the amino group which may be substituted includes methylamino group, dimethylamino group, ethylamino group, N-ethyl-N-methylamino group, diethylamino group, N-methyl-N-propylamino group, N-ethyl- N-propylamino group, 2,2,2-trifluoroethylamino group, dipropylamino group, isopropylamino group, N-methyl-N-isopropylamino group, butylamino group, N-butyl-N-methylamino group , Isobutylamino group, sec-butylamino group, pentylamino group, isoamylamino group, neopentylamino group, 2-pentylamino group, 3-pentylamino group, 2-methylbutylamino group, hexylamino group, isohexylamino Group, 4-methylpentylamino
  • the aromatic group having a substituent among the optionally substituted aromatic groups represented by Ar is not particularly limited, but includes 5-bromofuran-2-yl group and 5-methylfuran-2-yl.
  • Group, 5-ethoxythiophen-3-yl group 1-methylpyrrol-2-yl group, 1-methylpyrrol-3-yl group, 1-ethylpyrazol-3-yl group, 3-ethoxy-1-methylpyrazole -2-yl group, 1-ethyl-4-methoxypyrazol-3-yl group, 5-methoxyisothiazol-3-yl group, 1-methylimidazol-2-yl group, 1-methylimidazole 4-yl group, 1-methylimidazol-5-y
  • Ar is a 4-methylphenyl group, a 4-ethylphenyl group, a 3,4-dimethylphenyl group, a 3-ethyl-4-methylphenyl group, 4 in view of showing good performance in immunoglobulin analysis or purification.
  • -Ethyl-3-methylphenyl group 4-methoxyphenyl group, 4-ethoxyphenyl group, 3,4-dimethoxyphenyl group, 3,4-diethoxyphenyl group, 3-ethoxy-4-methoxyphenyl group, 4- Ethoxy-3-methoxyphenyl group, 4-methoxy-3-methylphenyl group, 4-methyl-3-ethoxyphenyl group, 4-dimethylaminophenyl group, 2-methoxypyridin-5-yl group, 2-ethoxypyridine- 5-yl group, 2,3-dimethylpyridin-5-yl group, 4-pyridyl group, 2-methylpyridin-4-yl group, 2-ethyl Pyridin-4-yl group, 2-methoxypyridin-4-yl group, 2-ethoxypyridin-4-yl group, 2-chloropyridin-5-yl group, 3-methoxy-4-methylphenyl group, 3-hydroxy Either a -4-methylpheny
  • Examples of the leaving group represented by Y include a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a methylsulfonyloxy group, and a tosyl group.
  • a bromine atom is preferable in that the yield of the target product is good.
  • the material of the matrix represented by M is not particularly limited.
  • a polypeptide or protein such as cross-linked albumin, agarose, alginate, carrageenan, chitin, cellulose, dextrin, dextran, starch or other polysaccharides, polyacrylamide, polystyrene , Synthetic polymers such as polyacrolein, polyvinyl alcohol, polymethacrylate, poly (2-hydroxyethyl methacrylate), polyurethane, inorganic compounds such as silica, glass, porous diatomaceous earth, alumina, zirconia, iron oxide or other metal oxides And a matrix such as a copolymer formed by arbitrarily combining two or more of the above substances.
  • thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention contains compounds such as dextran, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol or hydrolyzed polymers such as hydrolyzed starch used in liquid phase partitioning, or compounds such as perfluorodecalin used to form emulsions.
  • An included matrix is also included.
  • vinyl polymers such as Toyopearl (trade name) (manufactured by Tosoh Corporation), agarose, chitosan, dextran, cellulose, silica, and polystyrene are preferable.
  • the vinyl polymer here refers to a polymer obtained by vinyl polymerization of a monomer having a vinyl group or the like, and examples of the monomer include methyl methacrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, acrylamide, and vinyl ester. Furthermore, the vinyl polymer here includes a copolymer using two or more of the above-mentioned monomers, and a crosslinked one.
  • the matrix may be granular or non-particulate, soluble or insoluble in an aqueous solvent, porous or non-porous.
  • N can be suitably selected from an integer of 1 to 12, but as the thiazole derivative used for producing the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention, n is preferably 3, 4 or 5.
  • Step 1 is a method of synthesizing the thiazole derivative (1a) by reacting the phthalimide derivative (2) with the acylthiourea derivative (3).
  • the phthalimide derivative (2) can be synthesized with reference to Non-Patent Document 2, Patent Document 7, and the like.
  • the reaction is preferably performed in a solvent, and any solvent that does not harm the reaction can be used.
  • the solvent include ether solvents such as diethyl ether, tetrahydrofuran (hereinafter THF), 1,2-dimethoxyethane (hereinafter DME), 1,4-dioxane, ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone, ethyl acetate, acetic acid, and the like.
  • Ester solvents such as butyl, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene, xylene and chlorobenzene, N, N-dimethylformamide (hereinafter DMF), N-methylpyrrolidone and the like
  • DMF N, N-dimethylformamide
  • An amide solvent, an alcohol solvent such as methanol or ethanol, dimethyl sulfoxide (hereinafter DMSO), water, or a mixed solvent thereof can be used. It is preferable to use DMF in terms of a good yield.
  • the target object can be obtained by making it react at the temperature chosen suitably from the range of 0 degreeC to 150 degreeC, and it is in the range of 60 degreeC to 150 degreeC at a point with a sufficient yield. It is preferable to react.
  • This step can also be carried out in the presence of a base.
  • the base include sodium hydride, sodium amide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, hydroxide
  • Alkali metal bases such as potassium, organic amines such as triethylamine, tributylamine, N-methylmorpholine, pyridine and dimethylaniline can be used.
  • the amount of the base used is not particularly limited, but the target product can be obtained with good yield by carrying out the reaction using an equal amount or more with respect to the reaction substrate.
  • the desired product can be obtained by ordinary post-treatment operations, but if necessary, it can be purified by a method such as column chromatography or recrystallization.
  • Step 2 is a method for producing a thiazole derivative (1 ') by treating the thiazole derivative (1a) with a base.
  • Bases include alkali metal bases such as sodium hydride, sodium amide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, methylamine, ethylamine, dimethyl Organic amines such as amines and hydrazines can be used. Hydrazine or methylamine is preferred in terms of good yield.
  • the target product can be obtained in good yield by carrying out the reaction with the use amount of the base preferably 2 equivalents or more with respect to the reaction substrate.
  • the reaction is preferably carried out in a solvent, and any solvent that does not harm the reaction can be used.
  • the solvent include ether solvents such as diethyl ether, THF, DME, dioxane, ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone, ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, Use aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene, xylene, chlorobenzene, amide solvents such as DMF and N-methylpyrrolidone, alcohol solvents such as methanol, ethanol, isopropyl alcohol, DMSO, water, or a mixed solvent thereof.
  • ether solvents such as diethyl ether, THF, DME, dioxane
  • ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone
  • ester solvents such
  • a target object can be obtained by making it react at the temperature chosen suitably from the range of 0 to 150 degreeC.
  • the desired product can be obtained by ordinary post-treatment operations, but if necessary, it can be purified by a method such as column chromatography or recrystallization.
  • finish of reaction it can process with an acid and can also be isolated as an ammonium salt. Any acid that does not harm the reaction can be used.
  • hydrochloric acid for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydrofluoric acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and other inorganic acids, methanesulfonic acid, toluenesulfonic acid, trifluoroacetic acid
  • hydrochloric acid it is preferable to use hydrochloric acid because the target product can be easily isolated.
  • Production method 2 is a method for producing a thiazole derivative (1a) by reacting a 2-substituted aminothiazole derivative (4) with an acid halide (5).
  • the reaction is preferably carried out in a solvent, and any solvent that does not harm the reaction can be used.
  • the solvent examples include halogen solvents such as dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane, ether solvents such as diethyl ether, THF, DME, dioxane, ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone, ethyl acetate, butyl acetate, and the like.
  • a solvent can be used.
  • a halogen-based solvent such as dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethane.
  • reaction temperature there is no restriction
  • the target object can be obtained by making it react at the temperature chosen suitably from the range of 0 degreeC to 150 degreeC, and it is in the range of 0 degreeC to 100 degreeC at a point with a sufficient yield. It is preferable to react. This step can also be carried out in the presence of a base.
  • Examples of the base include sodium hydride, sodium amide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, hydroxide
  • Alkali metal bases such as potassium, organic amines such as triethylamine, tributylamine, N-methylmorpholine, pyridine and dimethylaniline can be used.
  • the amount of the base used is not particularly limited, but the target product can be obtained with good yield by carrying out the reaction using an equal amount or more with respect to the reaction substrate. After completion of the reaction, the desired product can be obtained by ordinary post-treatment operations, but can be purified by column chromatography or recrystallization if necessary.
  • the thiazole derivative (1a) synthesized by this method can be led to the thiazole derivative (1 ′) by passing through step 2 of production method 1.
  • Production method 3 is a novel thiazole derivative (1 ′) produced in the above step and an activating group (an activating group is a functional group that can easily react with an amino group or an ammonium salt.
  • an activating group is a functional group that can easily react with an amino group or an ammonium salt.
  • succinimide An oxycarbonyl group, a formyl group, a carboxyl group, a 2,2,2-trifluoroethylsulfonyl group (tresyl group), a sulfonyl chloride group, a tosyl group, a vinylsulfonyl group, and an epoxy group.
  • the activating group of the activating group-containing matrix used in the method is particularly a succinimideoxycarbonyl group, formyl group, 2,2,2-trifluoroethylsulfonyl group (tresyl group), epoxy group, or carboxyl group. preferable.
  • HiTrap NHS-activated HP (trade name) (manufactured by GE Healthcare Bioscience), Epoxy Toyopearl (trade name), Formyl Toyopearl (trade name), Tresyl Toyopearl (trade name), Carboxy Toyopearl ( (Trade name) (manufactured by Tosoh Corporation), activated chitopearl K-66 (trade name) gel (manufactured by Fujibo Holdings), BIOACT EPO (trade name) gel (manufactured by Showa Denko KK), POROS-EP (trade name) Gel (manufactured by Applied Biosystems), Cellufine Formyl (trade name) gel (manufactured by Chisso Corporation), Profinity Epoxide (trade name) gel (manufactured by Biorad), M.C. S. A commercially available carrier for immobilizing a ligand, such as GEL Epoxy-D-50-1000AW (trade name, manufactured by AGC S-
  • the desired product can be easily obtained by reacting under neutral or basic conditions.
  • a matrix with a high immobilization rate of thiazole derivatives can be obtained.
  • the base include sodium hydride, sodium amide, sodium carbonate, potassium carbonate, sodium methoxide, sodium ethoxide, alkali metal bases such as potassium tert-butoxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, triethylamine, tributylamine, N -Organic amines such as methylmorpholine, pyridine, dimethylaniline can be used.
  • the amount of the base used is not particularly limited, but by carrying out the reaction using equimolar amounts or more with respect to the reaction substrate, a matrix having a high immobilization ratio of the desired thiazole derivative can be obtained. Moreover, in order to maintain the pH of a solution, it can also react by adding a buffer solution. The reaction is preferably carried out in a solvent, and any solvent that does not harm the reaction can be used.
  • the solvent examples include ether solvents such as diethyl ether, THF, DME, dioxane, ketone solvents such as acetone and ethyl methyl ketone, ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate, and nitriles such as acetonitrile and propionitrile.
  • ether solvents such as diethyl ether, THF, DME, dioxane
  • ketone solvents such as acetone and ethyl methyl ketone
  • ester solvents such as ethyl acetate and butyl acetate
  • nitriles such as acetonitrile and propionitrile.
  • Aromatic hydrocarbon solvents such as benzene, toluene, xylene and chlorobenzene, amide solvents such as DMF and N-methylpyrrolidone, DMSO, water or a mixed solvent thereof can be used.
  • the target thiazole derivative fixed matrix can be obtained by making it react at the temperature selected suitably from the range of 0 to 150 degreeC.
  • the amount of the thiazole derivative immobilized on the matrix can be measured by using an analytical method such as absorbance analysis, high performance liquid chromatography, elemental analysis alone or in combination.
  • the thiazole derivative-immobilized matrix obtained by the production method 3 is packed in a column tube, and a buffer solution, an aqueous solution of a metal salt, an amino acid solution, an alcohol solution, or the like is passed as an eluent, and the protein is analyzed or separated. Isolation and purification can be performed. Proteins that can be analyzed, separated, or isolated and purified by this method include plasma protein components and milk protein components, and naturally occurring proteins such as plasma immunoglobulins, serum albumin, blood coagulation Examples include factors, lactalbumin, and lactoferrin.
  • the recombinant protein can be exemplified by peptide hormones, interferons, interleukins, growth factors, growth inhibitory factors, and vaccines that are naturally present in minute amounts or are artificially designed.
  • the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention is suitable for immunoglobulin purification.
  • Examples of the buffer solution to be passed include phosphate buffer solution, citrate buffer solution, Tris, PIPES, ACES, Cholamine, BES, MOPS, TES, HEPES, and metal salts include sodium sulfate, potassium sulfate, lithium sulfate, Examples include magnesium sulfate, ammonium sulfate, sodium citrate, potassium citrate, sodium chloride, and potassium chloride.
  • Examples of amino acids include glycine, arginine, beta-alanine, and gamma aminobutyric acid.
  • Examples of alcohol include ethanol, isopropyl alcohol, glycerol, and ethylene. A glycol can be illustrated and these can also be used as a mixed solvent.
  • the target protein can be separated, isolated or purified within a pH range of 3 to 11, but preferably purified within a pH range of 5 to 9.
  • the protein can be analyzed, separated, isolated, or purified using a chromatography apparatus such as AKTAprime plus (trade name) (manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • a phosphate buffer containing sodium sulfate or ammonium sulfate is passed through.
  • the pH is preferably in the range of 5 to 9, and the chromatography using hydrophobic interaction is preferably carried out.
  • An immunoglobulin analog here refers to a natural or artificially produced protein or protein conjugate that retains at least part of its structure and function, and an immunoglobulin fragment is an enzymatic treatment. Alternatively, it refers to a protein having an immunoglobulin partial structure produced by genetic engineering design.
  • An immunoglobulin fusion is a functional part of a protein having biological activity such as various cytokines or cytokine receptors. It refers to those produced by fusing all or part of them with genetic engineering.
  • the thiazole derivative-immobilized matrix obtained by the production method 3 includes alkaline aqueous solutions such as sodium hydroxide aqueous solution and potassium hydroxide aqueous solution, acidic aqueous solutions such as hydrochloric acid aqueous solution, sulfuric acid aqueous solution, nitric acid aqueous solution and phosphoric acid aqueous solution, guanidine hydrochloride aqueous solution, urea Protein denaturant aqueous solution such as aqueous solution, aqueous solution containing amino acids such as arginine and histidine, aqueous surfactant solution such as SDS, Tween, alcohol solution such as methanol, ethanol, isopropanol, glycerol, ethylene glycol, or these By washing with the mixed aqueous solution, it can be returned to the initial state and can be used repeatedly.
  • alkaline aqueous solutions such as sodium hydroxide aqueous solution and potassium hydroxide aque
  • 6-phthalimido-1-hexanal (4.95 g, 20.2 mmol) is dissolved in carbon tetrachloride (100 mL), and a solution of bromine (1.03 mL, 20.2 mmol) in carbon tetrachloride (100 mL) is added dropwise to react for 2 hours. did.
  • the reaction mixture was washed with water (100 mL) and then with saturated brine (100 mL) and dried over anhydrous magnesium sulfate.
  • the desiccant was filtered off and the solvent was evaporated under reduced pressure to give an oil.
  • the obtained oil was dissolved in DMF (100 mL), 4-methylbenzoylthiourea (5.87 g, 26.3 mmol) was added, and the mixture was heated to reflux for 10 hr. After completion of the reaction, 1M hydrochloric acid (300 mL) was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted twice with ethyl acetate (300 mL). The organic layers were combined and washed twice with saturated brine (300 mL). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the desiccant was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • N- (3-acetoxy-4-methylbenzoyl) thiourea was added to a solution of N- (5-bromo-6-oxoheptyl) phthalimide (1.30 g, 3.85 mmol) in DMF (20 mL) at 7O 0 C. Reacted for hours. After completion of the reaction, 1M hydrochloric acid (30 mL) was added to the reaction mixture, followed by extraction twice with ethyl acetate (50 mL), and the organic layers were combined and washed twice with saturated brine (30 mL). The organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate, the desiccant was filtered off, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • Triethylamine (2.50 mL, 18 mmol) was added to a solution of compound 276 (2.50 g, 8.64 mmol) in chloroform (50 mL).
  • methacrylic acid chloride (0.93 mL, 9.5 mmol) was added dropwise under ice cooling, and the mixture was reacted for 30 minutes under ice cooling.
  • chloroform 50 mL was added to the reaction mixture, and the mixture was washed successively with water (100 mL), saturated aqueous sodium carbonate solution (100 mL), and saturated brine (100 mL).
  • immobilization was performed by passing 2 mL of the thiazole derivative solution. Unreacted succinimideoxycarbonyl group was blocked according to the method described in Non-Patent Document 3.
  • the amount of immobilization was determined by measuring the absorbance at the ultraviolet absorption maximum wavelength (around 300 nm) of the ligand (thiazole derivative) solution before and after passing through the HiTrap column according to “B. Acidic condition method” in the method described in Non-Patent Document 3. It was calculated by measuring with a 2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.).
  • Table 42 shows the immobilized ligand density of each compound immobilized by this method.
  • the compound numbers described in the examples and thereafter correspond to the compound numbers described in Tables 33 to 41.
  • the amount of immobilization was determined by measuring the absorbance at the ultraviolet absorption maximum wavelength (around 300 nm) of the ligand (thiazole derivative) solution before and after passing through the HiTrap column according to “B. Acidic condition method” in the method described in Non-Patent Document 3. It was calculated by measuring with a 2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.). Table 43 shows the immobilized ligand density of Compound 304 immobilized by this method.
  • the eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate.
  • the results of chromatography performed using a HiTrap column immobilized with a thiazole derivative are shown in FIG. 1 to FIG. 6, and the immunoglobulin recovery rate in these chromatography is shown in Table 44.
  • the immunoglobulin was recovered at a recovery rate of 50% or more, and the adsorption / desorption of the immunoglobulin by the thiazole derivative-immobilized HiTrap column was confirmed.
  • the recovery rate when using compounds 286, 304, and 329 was as extremely high as 90% or more.
  • the column was regenerated by passing 10 mL of a 100 mM aqueous sodium hydroxide solution. All of the above-mentioned thiazole derivative-immobilized HiTrap columns could be restored to the initial state by this regeneration treatment, and their characteristics were not changed by repeated use.
  • Table 45 shows the recovery rates of bovine serum albumin in these chromatography.
  • bovine serum albumin was eluted by the 10th fraction, and almost no adsorption was observed on the column.
  • the results shown in FIGS. 1 to 6 were significantly different from the results obtained when the immunoglobulin was passed. Therefore, it was shown that the immunoglobulin and bovine serum albumin in the sample can be separated by using the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention.
  • the column was regenerated by passing 10 mL of a 100 mM aqueous sodium hydroxide solution. Any HiTrap column immobilized with the above thiazole derivative could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its characteristics were not changed by repeated use.
  • Example 6 Adsorption / desorption of protein using thiazole derivative-immobilized agarose gel (Part 3) A HiTrap column on which compound 286 prepared by the method described in Example 2 was immobilized was attached to AKTAprime plus (trade name) (a chromatography device manufactured by GE Healthcare Bioscience), and 20 mL of the equilibration buffer was passed through. And equilibrated.
  • AKTAprime plus trade name
  • the column was regenerated by passing 10 mL of a 100 mM sodium hydroxide aqueous solution.
  • the above-mentioned thiazole derivative-immobilized HiTrap column could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its characteristics did not change even after repeated use.
  • Example 7 Protein Adsorption / Desorption Using Thiazole Derivative-Immobilized Agarose Gel (Part 4)
  • Rituxan (trade name) (manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 10 mg / mL), which is a human-mouse chimeric antibody, was treated with immobilized papain (Immobilized Papain, manufactured by PIERCE) at 37 ° C. for 10 hours according to the method described in the instructions. By doing so, a limited hydrolyzate was obtained.
  • I is Fab (composed of 27 kDa protein derived from H chain and 27 kDa protein which is L chain)
  • II is Fc (composed of dimer of 30 kDa protein derived from H chain)
  • III is partial digestion
  • An antibody consisting of a 60 kDa protein that is an H chain, a 30 kDa protein derived from the H chain, and a 27 kDa protein that is an L chain
  • an IV is an undigested antibody (a dimer of an 60 kDa protein that is an H chain and an 27 kDa protein that is an L chain) It was shown that each fragment derived from an antibody can be separated.
  • Epoxy Toyopearl (trade name) gel manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 ⁇ mol / g (gel) was added.
  • the centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours.
  • acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter.
  • the Toyopearl gel obtained was put into a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5M monoethanolamine, 0.5M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added.
  • a blocking solution composition: 0.5M monoethanolamine, 0.5M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL
  • the centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 20 hours.
  • the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5M monoethanolamine, 0.5M aqueous sodium chloride solution ( The solvent was water), pH 8.3; 5 mL).
  • a blocking solution composition: 0.5M monoethanolamine, 0.5M aqueous sodium chloride solution ( The solvent was water), pH 8.3; 5 mL).
  • the centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 20 hours.
  • acetonitrile 5 mL was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the blocking solution were separated with a glass filter.
  • the Toyopearl gel obtained was put into a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5M monoethanolamine, 0.5M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added.
  • a blocking solution composition: 0.5M monoethanolamine, 0.5M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL
  • the centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 20 hours.
  • the Toyopearl gel obtained was put into a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5M monoethanolamine, 0.5M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL) was added.
  • a blocking solution composition: 0.5M monoethanolamine, 0.5M sodium chloride aqueous solution, pH 8.3 (solvent is water); 5 mL
  • the centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 20 hours.
  • Epoxy Toyopearl (trade name) gel manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 ⁇ mol / g (gel) was added.
  • the centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours.
  • acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter.
  • Epoxy Toyopearl (trade name) gel manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 ⁇ mol / g (gel) was added.
  • the centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours.
  • acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter.
  • Epoxy Toyopearl (trade name) gel manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 ⁇ mol / g (gel) was added.
  • the centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours.
  • acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter.
  • Epoxy Toyopearl (trade name) gel manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 ⁇ mol / g (gel) was added.
  • the centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours.
  • acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter.
  • Tresyl Toyopearl (trade name) gel manufactured by Tosoh Corporation, tresyl group content: not disclosed
  • the centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 16 hours.
  • acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter.
  • the Toyopearl gel obtained was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: 0.5M trishydroxymethylaminomethane hydrochloride, 0.5M Sodium chloride aqueous solution, pH 8.3; 5 mL) was added.
  • a blocking solution composition: 0.5M trishydroxymethylaminomethane hydrochloride, 0.5M Sodium chloride aqueous solution, pH 8.3; 5 mL
  • the centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set to an internal temperature of 40 ° C., and the remaining tresyl group in the gel was blocked with trishydroxymethylaminomethane by stirring and shaking at 165 rpm for 16 hours.
  • Epoxy Toyopearl (trade name) gel manufactured by Tosoh Corporation, epoxy group content: 804 ⁇ mol / g (gel) was added.
  • the centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 63 hours.
  • acetonitrile (5 mL) was added to the centrifuge tube, and Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter.
  • 1,4-dioxane (10 mL) and triethylamine (120 ⁇ L, 0.9 mmol) were added to the centrifuge tube to confirm that compound 358 was dissolved, and then 2.5 mL of Toyopearl CM-650S (trade name) gel (Tosoh Corporation; ion exchange capacity: 0.1 mol / L (gel)) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (154 mg, 0.8 mmol) were added.
  • the centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 25 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 14 hours.
  • Toyopearl gel and the reaction solution were separated with a glass filter.
  • reaction solution and the combined washings high performance liquid chromatography (column: Tosoh TSK-gel ODS-80T M (trade name) (inner diameter 4.6 mm ⁇ length 15cm), eluent 0.05% trifluoroacetic acid CH 3 CN / 0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution, flow rate: 1 mL / min, temperature: 25 ° C., detection: UV 254 nm) was used to quantify the remaining compound 358, and compound 358 was immobilized at 16 ⁇ mol / mL (gel). Toyopearl CM-650S gel was obtained.
  • the eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate.
  • the results of chromatography performed using Compound 286-immobilized Epoxy Toyopearl gel are shown in FIG. 16, and the recovery rate of immunoglobulin in this chromatography is shown in Table 47.
  • the immunoglobulin eluted in the 20th to 50th fractions somewhat wider than when the HiTrap column was used (see FIG. 1).
  • the column was regenerated by passing 10 mL of 100 mM sodium hydroxide.
  • the compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties did not change even after repeated use.
  • Example 23 Protein adsorption / desorption using thiazole derivative-immobilized vinyl polymer gel (Part 2) A TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences) was packed with 1 mL of Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel prepared by the method described in Example 8, and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare). (Chromatographic apparatus manufactured by Bioscience) and equilibrated with 20 mL of 0.7 M sodium sulfate, 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5). AKTAprime plus was automatically operated at a flow rate of 1 mL / min.
  • FIG. 17 shows the results of chromatography performed using Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel
  • Table 48 shows the recovery rates of humanized monoclonal antibodies in this chromatography.
  • the humanized monoclonal antibody eluted in the 30th to 45th fractions, and was eluted at a position somewhat behind the immunoglobulin (see FIG. 16).
  • the column was regenerated by passing 10 mL of 100 mM sodium hydroxide.
  • the compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties did not change even after repeated use.
  • Example 24 Protein adsorption / desorption using thiazole derivative-immobilized vinyl polymer gel (part 3)
  • TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Biosciences) was packed with 1 mL of Compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel prepared by the method described in Example 8, and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare). (Chromatographic apparatus manufactured by Bioscience) and equilibrated with 20 mL of 0.7 M sodium sulfate, 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5).
  • the eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate.
  • the results of chromatography performed using Compound 286-immobilized Epoxy Toyopearl gel are shown in FIG. 18, and the recovery rate of bovine serum albumin in this chromatography is shown in Table 49.
  • Bovine serum albumin elutes by the 10th fraction, which is a fraction different from that of immunoglobulin (see FIG. 16), and the results are the same as when using HiTrap columns (see FIG. 1 and FIG. 7). became. From this, it was shown that even when the matrix to be immobilized with the thiazole derivative was changed from agarose to Toyopearl, the same immunoglobulin separation performance was obtained.
  • the column was regenerated by passing 10 mL of 100 mM sodium hydroxide.
  • the compound 286-immobilized epoxy toyopearl gel could be restored to its initial state by this regeneration treatment, and its properties did not change even after repeated use.
  • FIG. 20 shows the results of chromatography performed using Compound 329-immobilized epoxy toyopearl gel, and Table 51 shows the recovery rate of bovine serum albumin by this chromatography.
  • Bovine serum albumin elutes by the 10th fraction, which is a fraction different from the humanized monoclonal antibody (see FIG. 19) and is the same as when compound 286 was used as the thiazole derivative (see FIG. 18). The result was. From this, it was shown that even when the thiazole derivative was changed from compound 286 to compound 329, the protein separation performance was similar.
  • Example 28 Adsorption / desorption of protein using thiazole derivative-immobilized vinyl polymer gel (part 7)
  • Compound 286-immobilized formyltoyopearl gel prepared by the method described in Example 10 was packed into a TRICORN column (trade name) (manufactured by GE Healthcare Bioscience), and AKTAprime plus (trade name) (GE Healthcare Bio A chromatography apparatus manufactured by Science Co., Ltd.), and 20 mL of 0.7 M sodium sulfate, 10 mM sodium phosphate-10 mM sodium citrate buffer (pH 7.5) was passed through and equilibrated.
  • the eluate was fractionated by 1 mL, and the absorbance at 280 nm of each fraction was measured with a U-2900 spectrophotometer (manufactured by Hitachi, Ltd.) to calculate the recovery rate.
  • the results of chromatography performed using Compound 286-immobilized formyl toyopearl gel are shown in FIG. 22, and the recovery rate of bovine serum albumin by this chromatography is shown in Table 53.
  • Bovine serum albumin elutes by the 10th fraction, which is a fraction different from the humanized monoclonal antibody (see FIG. 21), and when epoxytoyopearl was used for immobilization of thiazole derivatives (see FIG. 18). ) And similar results. From this, it was shown that even if the activation group of the matrix used for immobilizing the thiazole derivative is changed from an epoxy group to a formyl group, the same protein separation performance is obtained.
  • acetonitrile (1.7 mL), 1M aqueous sodium hydroxide solution (1.2 mL), and water (6.8 mL) were added to the centrifuge tube to confirm that compound 286 was dissolved, and then 0.5 g of BIOACT- EPO (trade name) gel (manufactured by Showa Denko KK, epoxy group content: 200 ⁇ mol / g (gel)) was added.
  • BIOACT- EPO trade name
  • the centrifuge tube containing the mixture obtained by the above operation was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and stirred and shaken at 165 rpm for 43 hours.
  • BIOACT-EPO gel and the reaction solution were separated with a glass filter.
  • the obtained BIOACT-EPO gel was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: acetonitrile; 2 mL, 0.5 M mono). Ethanolamine, 0.5 M aqueous sodium chloride solution, pH 8.3 (solvent is water); 4 mL) was added.
  • the centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set to an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 23 hours.
  • BIOACT-EPO gel and the blocking solution were separated with a glass filter. Subsequently, the gel was washed twice with ethanol (5 mL) and water (5 mL), respectively, to obtain a BIOACT-EPO gel in which compound 286 was immobilized. Further, when the compound 286 remaining in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution was measured by high performance liquid chromatography, it was confirmed that the compound 286 did not remain in the solution obtained by combining the blocking solution and the washing solution.
  • the obtained POROS-EP gel was placed in a centrifuge tube and a blocking solution (composition: acetonitrile; 2 mL, 0.5M mono). Ethanolamine, 0.5 M aqueous sodium chloride solution, pH 8.3 (solvent is water); 4 mL) was added.
  • the centrifuge tube containing the reaction solution was set on a desktop shaker set at an internal temperature of 40 ° C., and the remaining epoxy groups in the gel were blocked with monoethanolamine by stirring and shaking at 165 rpm for 6 hours.
  • Immobilization was performed by contacting the compound 286 solution having a concentration of 0.5 mg / mL at 25 ° C. for 5 minutes. Thereafter, unreacted succinimideoxycarbonyl groups were blocked using a 1M monoethanolamine aqueous solution. A series of immobilization processes was monitored by increasing SPR resonance units (RU) on the surface of the sensor chip CM5.
  • RU SPR resonance units
  • Example 33 Affinity analysis using BIACORE (trade name)
  • HBS-EP buffer Composition: Mouse IgM (10 ⁇ g / mL, sample A) diluted with 10 mM HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% SP20), mouse IgG (320 ⁇ g / mL, sample B), chicken IgY ( 400 ⁇ g / mL, sample C) and bovine serum albumin (320 ⁇ g / mL, sample D) were each passed through for 120 seconds (binding phase), and then replaced with HBS-EP buffer for 280 seconds (dissociation phase) to increase affinity.
  • HBS-EP buffer Composition: Mouse IgM (10 ⁇ g / mL, sample A) diluted with 10 mM HEPES (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% SP20
  • mouse IgG 320 ⁇ g / mL, sample B
  • FIG. 23 and Table 54 show that mouse IgM (sample A) has a higher affinity for the sensor chip CM5 on which compound 286 is immobilized than the other samples (samples B, C, and D). Therefore, it was found that dextran gel immobilized with compound 286 specifically adsorbs mouse IgM.
  • borane-pyridine complex (0.17 mL, 1.7 mmol) was added and shaken for 16 hours under the same conditions.
  • the polystyrene beads and the washing liquid were separated, and vacuum-dried to obtain pale blue poly (2-hydroxyethyl methacrylate) -modified polystyrene beads (18.4 g, graft ratio: 1200%).
  • the polystyrene beads and the washing liquid were separated, followed by vacuum drying to obtain light brown poly (2-hydroxyethyl methacrylate) modified polystyrene beads (2.61 g) to which a thiazole derivative was bound.
  • light brown poly (2-hydroxyethyl methacrylate) modified polystyrene beads (2.61 g) to which a thiazole derivative was bound.
  • Example 38 Immobilization of 4-methyl-N- [4-methyl-5- ⁇ 3- (2-propenylcarbonylamino) propyl ⁇ thiazol-2-yl] benzamide on polystyrene beads (Part 2)
  • copper (I) chloride 500 mg, 5.0 mmol
  • pentamethyldiethylenetriamine (1.30 g, 7.5 mmol
  • 2-propanol 22 mL
  • an aqueous acrylamide solution composition: 17.8 g / 22 mL
  • chloromethylated polystyrene beads produced by Peptide Institute, chloromethyl group content: 0.97 meq / g
  • the reaction vessel was stirred at 80 ° C. for 18 hours.
  • the polystyrene beads and the washing liquid were separated, and vacuum-dried to obtain a light blue polyacrylamide-modified polystyrene beads (12.3 g, graft ratio: 146%).
  • the thiazole derivative of the present invention is useful as a low molecular weight ligand for analysis and purification of proteins, particularly immunoglobulins, and the thiazole derivative-immobilized matrix of the present invention in which the thiazole derivative is bound to a matrix is used as a medical protein, particularly It is extremely useful in industrial purification of immunoglobulins, and its industrial applicability is extremely high.

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Abstract

　タンパク質の分析または精製のための低分子化合物、及びそれらを固定化したマトリックスを提供すること。 　タンパク質の分析または精製に有用な、一般式（１） （式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ｒ３はフタルイミド基、アミノ基又はアンモニウム塩であることを表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表す。）で表されるチアゾール誘導体、及びそれらを用いて得られる一般式（６） （式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表し、Ｍはマトリックスを表す。）で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを提供するものである。

Description

新規なチアゾール誘導体、チアゾール誘導体固定化マトリックス、及びそれらの製造方法
　本発明は、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析または精製に使用可能な新規なチアゾール誘導体、チアゾール誘導体固定化マトリックス、及びそれらの製造方法に関する。
　近年、医療用タンパク質の需要は拡大しつつあり、その簡便で大規模に実施できる工業的精製技術の確立が切望されている。一般にタンパク質の精製技術には、ゲル透過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー分離技術があるが、医療用タンパク質の精製を工業的に実施する場合には、実験室で用いられるような分離剤や装置を使用したのでは経済性に乏しく、実用的とは言い難い。また、医療用タンパク質を工業的に製造する過程では多種類のタンパク質が混在しているため、上記の中の一つの精製技術を用いて目的とするタンパク質を純粋に得ることは極めて困難である。そのため通常はいくつかの技術を複合させた精製プロセスが採用されている（特許文献１）。
　近年、医療用タンパク質の一つである免疫グロブリンを精製するための低分子化合物とそれらが結合したマトリックスが数多く報告されており、スルホン誘導体（特許文献２）、トリアジン誘導体（特許文献３）、メルカプト複素環式化合物（特許文献４）、４－ピリジルエチルチオアルキル誘導体（非特許文献１）などの低分子化合物が結合したマトリックスが知られている。しかしながら、本発明のマトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体（１）が免疫グロブリンを精製するための低分子化合物として有用であるとの報告はない。また、特許文献５や非特許文献２に本発明のマトリックスの製造に用いる、上記のチアゾール誘導体（１）に類似の化学構造を有するチアゾール誘導体が報告されているものの、これらの文献に記載のチアゾール誘導体の化学構造は、チアゾール環の２位がアミノ基あるいはアルキル基に限定されており、上記のチアゾール誘導体（１）のように２位にベンゾイルアミノ基が置換した化合物についての記載はない。とりわけ非特許文献２に記載の化合物は、上記チアゾール誘導体（１）に類似のチアゾール誘導体ではあるものの、それらの用途はヒスタミンＨ２レセプターアゴニストとしての用途に限定されており、免疫グロブリンを精製するための用途についての記載はない。
　なお、特許文献６にはチアゾール環の２位にベンゾイルアミノ基が置換したチアゾール誘導体が記載されているが、これらの化合物のチアゾール環の４位の置換基はカルボニル、５位は無置換にそれぞれ限定されており、それらの用途としては消化管運動改善作用を有する医薬の有効成分として言及されているのみである。更には特許文献６の化合物はマトリックスに固定化されたものではなく、免疫グロブリンを精製するための用途についての記載もない。
ＷＯ２００４／０８７７６１号 米国特許４６９６９８０号 米国特許６１１７９９６号 特許第３８４４４９６号 ＷＯ１９９１／１０６５６号 ＷＯ１９９８／１７６５４号 ＷＯ１９８９／１０３６０号 Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，９（４），２１１－２２１，２０００ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１７），３２３９－３２４６，１９９２ はじめてのリガンドカップリングハンドブック、アマシャムバイオサイエンス株式会社刊、２００５
　本発明の課題は、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析または精製に有用なチアゾール誘導体及びそれらの製造方法、並びに、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析または精製に有用な該チアゾール誘導体を固定化したマトリックス及びその製造方法を提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、下記一般式（１）で示される本発明のチアゾール誘導体が免疫グロブリンと選択的に相互作用することを見出すと共に、一般式（１）で示される本発明のチアゾール誘導体をマトリックスに固定した一般式（６）で示される本発明のチアゾール固定化マトリックスが、タンパク質、特に免疫グロブリンの簡便な分析または精製を可能にすることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ｒ３はフタルイミド基、アミノ基又はアンモニウム塩であることを表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表す。）で表されるチアゾール誘導体に関するものである。
また本発明は、一般式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式中、Ｒ１及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｙは脱離基を表す。）で表されるフタルイミド誘導体と、一般式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中、Ｒ２及びＡｒは前記と同じ意味を表す。）で表されるアシルチオウレア誘導体を反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体の製造方法に関するものである。
また本発明は、一般式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びｎは前記と同じ意味を表す。）で表されるチアゾール誘導体と一般式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 （式中、Ａｒは前記と同じ意味を表し、Ｗはハロゲン原子を表す。）で示される酸ハロゲン化物を塩基存在下にて反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体の製造方法に関するものである。
また本発明は、一般式（１ａ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）で表されるチアゾール誘導体を塩基によって処理し、一般式（１ａ’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）を得た後、酸によって処理することを特徴とする、一般式（１ａ’’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｚ－は共役塩基を表す。）で示されるチアゾール誘導体の製造方法に関するものである。
また本発明は、一般式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 （式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表し、Ｍはマトリックスを表す。）で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックスに関するものである。
　また本発明は、一般式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）においてＭのマトリックスがビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンのいずれかであることを特徴とする、チアゾール誘導体固定化マトリックスに関するものである。
また本発明は、一般式（１’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 　（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｒ３ａはアミノ基又はアンモニウム塩を表す。）で示されるチアゾール誘導体と、活性化基含有マトリックスとを反応させることを特徴とする、一般式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法に関するものである。
また本発明は、一般式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを使用し、タンパク質の分析または精製を行なう方法に関するものである。
　本発明のチアゾール誘導体はタンパク質、特に免疫グロブリンの分析および精製用低分子リガンドとして有用であり、また上記チアゾール誘導体をマトリックスに結合させた本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスは、タンパク質、特に免疫グロブリンの分析および精製に有用かつ耐久性に富む選択的な吸脱着剤となることから医療用タンパク質、特に免疫グロブリンの工業的な精製において極めて有用である。
チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物２８６の結果）。 チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３０４の結果）。 チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３２０の結果）。 チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３２９の結果）。 チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物３８４の結果）。 チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果（化合物４２３の結果） チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物２８６の結果） チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３０４の結果） チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３２０の結果） チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３２９の結果） チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物３８４の結果） チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果（化合物４２３の結果） 化合物２８６固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたリボヌクレア－ゼＡ、リゾチ－ム、αキモトリプシノ－ゲンＡの混合液のクロマトグラフィー結果 化合物２８６固定化ＨｉＴｒａｐカラムを用いたヒト－マウスキメラ抗体のパパイン消化物のクロマトグラフィー結果 図１４の画分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果 化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いた免疫グロブリンのクロマトグラフィー結果 化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果 化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果 化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果 化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果 化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いたヒト化モノクローナル抗体のクロマトグラフィー結果 化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いたウシ血清アルブミンのクロマトグラフィー結果 化合物２８６固定化ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップＣＭ５に各種抗体をアナライトとして流したＢＩＡＣＯＲＥセンサーグラム（Ａ：マウスＩｇＭ、Ｂ：マウスＩｇＧ、Ｃ：ニワトリＩｇＹ、Ｄ：ウシ血清アルブミン）
　以下、本発明をさらに詳細に説明する。
　本発明のチアゾール誘導体（１）又は（１’）、及びチアゾール誘導体固定化マトリックス（６）における、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒで表される置換基、Ｒ３及びＲ３aで表されるアンモニウム塩（Ｚ－Ｈ３ ＋Ｎ）、並びにチアゾール誘導体（１ａ）の合成原料であるフタルイミド誘導体（２）におけるＹで表される置換基の定義について以下に示す。
　Ｒ１及びＲ２で表される炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖状もしくは分枝状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、２－ペンチル基、３－ペンチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、２－ヘキシル基、３－ヘキシル基を例示することができる。また、これらの炭素数１から６のアルキル基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、さらに具体的にはジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、パーフルオロブチル基、ヒドロキシメチル基、カルボキシメチル基、４－モルホリノカルボニルメチル基等を例示することができる。特に本発明の固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体としては、免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Ｒ１はメチル基が好ましく、Ｒ２は水素原子が好ましい。
　Ｒ３及びＲ３aで表されるアンモニウム塩はＺ－Ｈ３ ＋Ｎ（Ｚ－は共役塩基を表す。）で表される。具体的にはＣｌ－Ｈ３ ＋Ｎ、Ｂｒ－Ｈ３ ＋Ｎ、Ｆ－Ｈ３ ＋Ｎ、Ｉ－Ｈ３ ＋Ｎ、ＮＯ３ －Ｈ３ ＋Ｎ、１／２（ＳＯ４ ２－）Ｈ３ ＋Ｎ、１／３（ＰＯ４ ３－）Ｈ３ ＋Ｎ、ＣＨ３ＳＯ３ －Ｈ３ ＋Ｎ、４－ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３ －Ｈ３ ＋Ｎ、ＣＨ３ＣＯＯ－Ｈ３ ＋Ｎ、ＣＦ３ＣＯＯ－Ｈ３ ＋Ｎ等を例示することができる。Ｒ３及びＲ３ａは、チアゾール誘導体（１）及びチアゾール誘導体（１’）を合成する上での反応の操作性や単離が簡便な点及びマトリックスへの固定化の反応性や操作性に優れている点で、Ｃｌ－Ｈ３ ＋Ｎ又はＢｒ－Ｈ３ ＋Ｎが好ましい。
　Ａｒで表される置換されていてもよい芳香族基としては、特に制限はないが、フラン－２－イル基、フリル基、チエニル基、チオフェン－３－イル基、ピロール－２－イル基、ピロール－３－イル基、ピラゾール－３－イル基、ピラゾール－４－イル基、イソチアゾール－３－イル基、イソチアゾール－４－イル基、イソキサゾール－３－イル基、イソキサゾール－４－イル基、イミダゾール－２－イル基、イミダゾール－４－イル基、イミダゾール－５－イル基、オキサゾール－２－イル基、オキサゾール－４－イル基、オキサゾール－５－イル基、チアゾール－２－イル基、チアゾール－４－イル基、チアゾール－５－イル基、１，２，４－トリアゾール－３－イル基、フェニル基、２－ピリジル基、３－ピリジル基、４－ピリジル基、２－ピリミジル基、４－ピリミジル基、５－ピリミジル基、１，２，４－トリアジン－３－イル基、１，２，４－トリアジン－５－イル基、１，２，４－トリアジン－６－イル基、ベンゾジオキソラン－３－イル基、ベンゾフラン－２－イル基、ベンゾフラン－３－イル基、ベンゾフラン－４－イル基、ベンゾフラン－５－イル基、ベンゾフラン－６－イル基、ベンゾフラン－７－イル基、ベンゾチオフェン－２－イル基、ベンゾチオフェン－３－イル基、ベンゾチオフェン－４－イル基、ベンゾチオフェン－５－イル基、ベンゾチオフェン－６－イル基、ベンゾチオフェン－７－イル基、インドール－２－イル基、インドール－３－イル基、インドール－４－イル基、インドール－５－イル基、インドール－６－イル基、インドール－７－イル基、ベンゾチアゾール－２－イル基、ベンゾチアゾール－４－イル基、ベンゾチアゾール－５－イル基、ベンゾチアゾール－６－イル基、ベンゾチアゾール－７－イル基、インダゾール－３－イル基、インダゾール－４－イル基、インダゾール－５－イル基、インダゾール－６－イル基、インダゾール－７－イル基、ベンズイソキサゾール－３－イル基、ベンズイソキサゾール－４－イル基、ベンズイソキサゾール－５－イル基、ベンズイソキサゾール－６－イル基、ベンズイソキサゾール－７－イル基、ナフタレン－１－イル基、ナフタレン－２－イル基、キノリン－２－イル基、キノリン－３－イル基、キノリン－４－イル基、キノリン－５－イル基、キノリン－６－イル基、キノリン－７－イル基、キノリン－８－イル基、キノキサリニル基、キノキサリン－５－イル基、キノキサリン－６－イル基、キナゾリニル基、キナゾリン－４－イル基、キナゾリン－５－イル基、キナゾリン－６－イル基、キナゾリン－７－イル基、キナゾリン－８－イル基、ベンゾオキサジン－５－イル基、ベンゾオキサジン－６－イル基、ベンゾオキサジン－７－イル基、ベンゾオキサジン－８－イル基、ベンゾチアジン－５－イル基、ベンゾチアジン－６－イル基、ベンゾチアジン－７－イル基、ベンゾチアジン－８－イル基、１，３－ベンゾジオキソール－４－イル基、１，３－ベンゾジオキソール－５－イル基、１，３－ベンゾジオキソール－６－イル基、１，３－ベンゾジオキソール－７－イル基、アントラセン－１－イル基を例示できる。特に、免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、芳香族基としては、フェニル基、２－ピリジル基、３－ピリジル基あるいは４－ピリジル基が好ましい。
　Ａｒで表される置換されていてもよい芳香族基の置換基としては、特に制限はないが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基が好ましい。
　ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子あるいはヨウ素原子を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基としては、直鎖状、分枝状もしくは環状のいずれであってもよく、メチル基、エチル基、シクロプロピル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、２－ペンチル基、３－ペンチル基、２－メチルブチル基、ｔｅｒｔ－ペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、２－ヘキシル基、３－ヘキシル基を例示することができる。また、これらの炭素数１から６のアルキル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、アシル基、置換されていてもよい芳香族基で１個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２－クロロエチル基、３－クロロプロピル基、ジフルオロメチル基、３－フルオロプロピル基、メトキシメチル基、２－エトキシエチル基、シクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、２－メチルチオエチル基、２－エチルチオエチル基、２－アリルチオエチル基、２－プロパルギルチオエチル基、２－ベンジルチオエチル基、２－（２－クロロベンジル）チオエチル基、２－（２，４－ジクロロベンジル）チオエチル基、２－メチルスルフィニルエチル基、２－メチルスルホニルエチル基、エトキシメチル基、２－メトキシエチル基、２－クロロエトキシメチル基、メトキシカルボニルメチル基、エトキシカルボニルメチル基、１－メトキシカルボニルエチル基、１－エトキシカルボニルエチル基、２－エトキシカルボニルエチル基、カルボキシメチル基、アセトニル基、１－アセチルエチル基、３－アセチルプロピル基、フェナシル基、４－クロロフェナシル基、２，４－ジフルオロフェナシル基、４－メチルフェナシル基、４－イソプロピルフェナシル基、４－イソブチルフェナシル基、４－シクロヘキシルフェナシル基、４－シアノフェナシル基、４－ニトロフェナシル基、チエニル基、２－（チオフェン－２－イル）エチル基、２－（チオフェン－３－イル）エチル基、フルフリル基、（５－メチルフラン－２－イル）メチル基、（５－エチルフラン－２－イル）メチル基、（５－クロロフラン－２－イル）メチル基、２－（５－フルオロフラン－２－イル）エチル基、テトラヒドロフルフリル基、２－ピリジルメチル基、３－ピリジルメチル基、４－ピリジルメチル基、２－（ピリジン－２－イル）エチル基、２－（ピリジン－３－イル）エチル基、２－（ピリジン－４－イル）エチル基、３－（ピリジン－２－イル）プロピル基、３－（ピリジン－３－イル）プロピル基、３－（ピリジン－４－イル）プロピル基を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基としては、直鎖状もしくは分枝状のいずれであってもよく、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ブトキシ基、イソブチルオキシ基、ｓｅｃ－ブチルオキシ基、ｔｅｒｔ－ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソアミルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、２－ペンチルオキシ基、３－ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ－ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、２－ヘキシルオキシ基、３－ヘキシルオキシ基、デセニルオキシ基を例示することができる。また、これらのアルコキシ基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、アシル基、置換されていてもよい芳香族基等で１個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２－クロロエトキシ基、３－クロロプロピルオキシ基、ジフルオロメトキシ基、４－トリフルオロメトキシ基、３－フルオロプロピルオキシ基、シクロプロピルメトキシ基、シクロペンチルメトキシ基、シクロヘキシルメトキシ基、２－メチルチオエトキシ基、２－エチルチオエトキシ基、２－アリルチオエトキシ基、２－プロパルギルチオエトキシ基、２－ベンジルチオエトキシ基、２－（２－クロロベンジル）チオエトキシ基、２－（２，４－ジクロロベンジル）チオエトキシ基、２－メチルスルフィニルエトキシ基、２－メチルスルホニルエトキシ基、メトキシメトキシ基、エトキシメトキシ基、２－メトキシエトキシ基、２－クロロエトキシメトキシ基、メトキシカルボニルメトキシ基、エトキシカルボニルメトキシ基、１－メトキシカルボニルエトキシ基、１－エトキシカルボニルエトキシ基、２－エトキシカルボニルエトキシ基、カルボキシメトキシ基、１－アセチルエトキシ基、３－アセチルプロポキシ基、２－ピリジルメトキシ基、３－ピリジルメトキシ基、４－ピリジルメトキシ基、２－（ピリジン－２－イル）エトキシ基、２－（ピリジン－３－イル）エトキシ基、２－（ピリジン－４－イル）エトキシ基、３－（ピリジン－２－イル）プロポキシ基、３－（ピリジン－３－イル）プロポキシ基、ベンジルオキシ基を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基としては、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、２－メチルシクロブチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、２－メチルシクロペンチルオキシ基、３－メチルシクロペンチルオキシ基、４－メチルシクロペンチルオキシ基、シクロオクチルオキシ基を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基としては、アリルオキシ基、２－メチル－２－プロペニルオキシ基、２－ブテニルオキシ基、１－ブテン－３－イルオキシ基、３－ブテニルオキシ基、４－ペンテニルオキシ基、５－ヘキセニルオキシ基を例示することができる。また、これらの炭素数３から６のアルケニルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、３，３－ジフルオロアリルオキシ基、３，３－ジクロロアリルオキシ基、３，３－ジブロモアリルオキシ基を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基としては、プロパルギルオキシ基、１－ブチン－３－イルオキシ基、２－ブチニルオキシ基、３－ブチニルオキシ基、２－ペンチニルオキシ基、３－ペンチニルオキシ基、４－ペンチニルオキシ基、２－ヘキシニルオキシ基、３－ヘキシニルオキシ基、４－ヘキシニルオキシ基、５－ヘキシニルオキシ基を例示することができる。また、これらの置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、４，４，４－トリフルオロブチン－２－イル基等を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基としては、アセトキシ基、プロピオニルオキシ基を例示することができる。また、これらの置換されていてもよいアシルオキシ基はハロゲン原子等で置換されていてもよく、トリフルオロアセトキシ基や２，２，２－トリフルオロプロピオニルオキシ基等を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基としては、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ－ブチルチオ基、ペンチルチオ基、イソアミルチオ基、ネオペンチルチオ基、２－ペンチルチオ基、３－ペンチルチオ基、２－メチルブチルチオ基、ヘキシルチオ基、イソヘキシルチオ基、３－メチルペンチルチオ基、２－メチルペンチルチオ基を例示することができる。また、これらのアルキルチオ基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２－クロロエチルチオ基、３－クロロプロピルチオ基、ジフルオロメチルチオ基、３－フルオロプロピルチオ基、シクロプロピルメチルチオ基、シクロペンチルメチルチオ基、シクロヘキシルメチルチオ基を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基としては、メチルスルフィニル基、エチルスルフィニル基、プロピルスルフィニル基、イソプロピルスルフィニル基、ブチルスルフィニル基、イソブチルスルフィニル基、ｓｅｃ－ブチルスルフィニル基、ペンチルスルフィニル基、イソアミルスルフィニル基、ネオペンチルスルフィニル基、２－ペンチルスルフィニル基、３－ペンチルスルフィニル基、２－メチルブチルスルフィニル基、ヘキシルスルフィニル基、イソヘキシルスルフィニル基、３－メチルペンチルスルフィニル基、２－メチルペンチルスルフィニル基を例示することができる。また、これらのアルキルスルフィニル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２－クロロエチルスルフィニル基、３－クロロプロピルスルフィニル基、ジフルオロメチルスルフィニル基、３－フルオロプロピルスルフィニル基、シクロプロピルメチルスルフィニル基、シクロペンチルメチルスルフィニル基、シクロヘキシルメチルスルフィニル基を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基としては、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、プロピルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基、ブチルスルホニル基、イソブチルスルホニル基、ｓｅｃ－ブチルスルホニル基、ペンチルスルホニル基、イソアミルスルホニル基、ネオペンチルスルホニル基、２－ペンチルスルホニル基、３－ペンチルスルホニル基、２－メチルブチルスルホニル基、ヘキシルスルホニル基、イソヘキシルスルホニル基、３－メチルペンチルスルホニル基、２－メチルペンチルスルホニル基を例示することができる。また、これらのアルキルスルホニル基はハロゲン原子、炭素数３から８のシクロアルキル基で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的には２－クロロエチルスルホニル基、３－クロロプロピルスルホニル基、ジフルオロメチルスルホニル基、３－フルオロプロピルスルホニル基、シクロプロピルメチルスルホニル基、シクロペンチルメチルスルホニル基、シクロヘキシルメチルスルホニル基を例示することができる。
　置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、ドデシルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を例示することができる。また、これらのアルコキシカルボニル基はハロゲン原子等で一個以上置換されていてもよく、さらに具体的にはトリフルオロメトキシカルボニル基、２，２，２－トリフルオロエトキシカルボニル基等を例示することができる。
　置換されていてもよいアミノ基としては、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ基、ジエチルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－プロピルアミノ基、Ｎ－エチル－Ｎ－プロピルアミノ基、２，２，２－トリフルオロエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、Ｎ－メチル－Ｎ－イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、Ｎ－ブチル－Ｎ－メチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ－ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、イソアミルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、２－ペンチルアミノ基、３－ペンチルアミノ基、２－メチルブチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、イソヘキシルアミノ基、４－メチルペンチルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基、Ｎ－ベンゼンスルホニル－Ｎ－メチルアミノ基、ｐ－トルエンスルホニルアミノ基、４－クロロベンゼンスルホニルアミノ基、４－ニトロベンゼンスルホニルアミノ基、メチルスルホニルアミノ基、クロロメチルスルホニルアミノ基、トリフルオロメチルスルホニルアミノ基、Ｎ－メチルスルホニル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－メチルスルホニル－Ｎ－エチルアミノ基、Ｎ－メチルスルホニル－Ｎ－プロピルアミノ基、エチルスルホニルアミノ基、Ｎ－エチルスルホニル－Ｎ－メチルアミノ基、Ｎ－エチルスルホニル－Ｎ－エチルアミノ基、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基を例示することができる。
　Ａｒで表される、置換されていてもよい芳香族基のうち置換基を有する芳香族基としては、特に制限はないが、５－ブロモフラン－２－イル基、５－メチルフラン－２－イル基、５－クロロチエニル基、５－ブロモチエニル基、５－メチルチエニル基、５－メトキシチエニル基、５－エトキシチエニル基、５－メチルチオフェン－３－イル基、５－メトキシチオフェン－３－イル基、５－エトキシチオフェン－３－イル基、１－メチルピロール－２－イル基、１－メチルピロール－３－イル基、１－エチルピラゾール－３－イル基、３－エトキシ－１－メチルピラゾール－２－イル基、１－エチル－４－メトキシピラゾール－３－イル基、５－メトキシイソチアゾール－３－イル基、１－メチルイミダゾール－２－イル基、１－メチルイミダゾール－４－イル基、１－メチルイミダゾール－５－イル基、３－メトキシチアゾール－２－イル基、４－メトキシチアゾール－２－イル基、２－フルオロフェニル基、３－フルオロフェニル基、４－フルオロフェニル基、２，３－ジフルオロフェニル基、３，５－ジフルオロフェニル基、３，４，５－トリフルオロフェニル基、２，３，４，５，６－ペンタフルオロフェニル基、３－フルオロ－４－メチルフェニル基、４－トリフルオロメトキシフェニル基、２－クロロフェニル基、３－クロロフェニル基、４－クロロフェニル基、４－クロロ－３－メチルフェニル基、４－クロロ－３－エチルフェニル基、４－クロロ－３－メトキシフェニル基、４－クロロ－３－エトキシフェニル基、２，３－ジクロロフェニル基、３，５－ジクロロフェニル基、３，４，５－トリクロロフェニル基、３－トリフルオロメチルフェニル基、４－トリフルオロメチルフェニル基、３－ブロモフェニル基、４－ブロモフェニル基、４－ブロモ－３－メチルフェニル基、４－ブロモ－３－エチルフェニル基、４－ブロモ－３－メトキシフェニル基、４－ブロモ－３－エトキシフェニル基、３，５－ジブロモ－４－ヒドロキシフェニル基、３－ヨードフェニル基、４－ヨードフェニル基、４－ヨード－３－メチルフェニル基、４－ヨード－３－エチルフェニル基、４－ヨード－３－メトキシフェニル基、４－ヨード－３－エトキシフェニル基、２－メチルフェニル基、３－メチルフェニル基、４－メチルフェニル基、３，４－ジメチルフェニル基、３，４，５－トリメチルフェニル基、３－ヒドロキシ－４－メチルフェニル基、２－トリフルオロフェニルメチルフェニル基、３－トリフルオロフェニルメチルフェニル基、４－トリフルオロフェニルメチルフェニル基、４－メトキシメチルフェニル基、３，４－ジエトキシフェニル基、３－エチル－４－メチルフェニル基、４－エチル－３－メチルフェニル基、４－エチルフェニル基、３，４－ジエチルフェニル基、４－プロピルフェニル基、４－イソプロピルフェニル基、３－ブチルフェニル基、４－ブチルフェニル基、４－イソブチルフェニル基、４－（ｓｅｃ－ブチル）フェニル基、４－（ｔｅｒｔ－ブチル）フェニル基、４－ペンチルフェニル基、４－イソアミルフェニル基、４－ネオペンチルフェニル基、４－（２－ペンチル）フェニル基、４－（３－ペンチル）フェニル基、４－（２－メチルブチル）フェニル基、４－（ｔｅｒｔ－ペンチル）フェニル基、４－ヘキシルフェニル基、４－イソヘキシルフェニル基、４－（２－クロロエチル）フェニル基、４－（３－クロロプロピル）フェニル基、４－（ジフルオロメチル）フェニル基、４－（３－フルオロプロピル）フェニル基、４－メトキシメチルフェニル基、４－エトキシメチルフェニル基、４－シクロプロピルメチルフェニル基、４－シクロペンチルメチルフェニル基、シクロヘキシルメチルフェニル基、４－（２－メチルチオエチル）フェニル基、４－（２－エチルチオエチル）フェニル基、４－（２－アリルチオエチル）フェニル基、４－（２－プロパルギルチオエチル）フェニル基、４－（２－ベンジルチオエチル）フェニル基、３－メトキシフェニル基、３－メトキシ－４－メチルフェニル基、４－エチル－３－メトキシフェニル基、３－メトキシ－４－プロピルフェニル基、４－メトキシフェニル基、４－メトキシ－３－メトキシフェニル基、３，４－ジメトキシフェニル基、３－エトキシ－４－メトキシフェニル基、４－エトキシ－３－メトキシフェニル基、４－イソプロピルオキシ－３－メトキシフェニル基、３－イソプロピルオキシ－４－メトキシフェニル基、３－エトキシフェニル基、４－エトキシフェニル基、４－エトキシ－３－メチルフェニル基、４－エトキシ－３－エチルフェニル基、４－エトキシ－３－プロピルフェニル基、４－エトキシ－３－イソプロピルフェニル基、４－プロピルオキシフェニル基、４－イソプロピルオキシフェニル基、４－ブトキシフェニル基、４－イソブチルオキシフェニル基、４－（ｓｅｃ－ブチルオキシ）フェニル基、３－（２－クロロエトキシ）フェニル基、３－（２－クロロエトキシ）フェニル基、４－（２－クロロエトキシ）フェニル基、３－（３－クロロプロピルオキシ）フェニル基、４－（３－クロロプロピルオキシ）フェニル基、３－ジフルオロメトキシフェニル基、４－ジフルオロメトキシフェニル基、４－（３－フルオロプロピルオキシ）フェニル基、４－シクロプロピルメトキシフェニル基、４－シクロペンチルメトキシ基、４－シクロヘキシルメトキシ基、３－シクロプロピルオキシフェニル基、４－シクロプロピルオキシフェニル基、４－シクロプロピルオキシ－３－メトキシフェニル基、４－シクロプロピルオキシ－３－メチルフェニル基、４－シクロブチルオキシフェニル基、４－シクロペンチルオキシフェニル基、４－（２－メチルシクロブチルオキシ）フェニル基、４－シクロヘキシルオキシフェニル基、４－アリルオキシフェニル基、４－（３，３－ジクロロアリルオキシ）フェニル基、４－プロパルギルオキシフェニル基、３－メチル－４－プロパルギルオキシフェニル基、３－エチル－４－プロパルギルオキシフェニル基、３－メトキシ－４－プロパルギルオキシフェニル基、３－エトキシ－４－プロパルギルオキシフェニル基、３－プロポキシ－４－プロパルギルオキシフェニル基、４－（１－ブチン－３－イルオキシ）フェニル基、４－（２－ブチニルオキシ）フェニル基、３－メチルチオフェニル基、４－メチルチオフェニル基、４－メチル－３－メチルチオフェニル基、３－メチル－４－メチルチオフェニル基、４－メトキシ－３－メチルチオフェニル基、３－エトキシ－４－メチルチオフェニル基、４－エトキシ－３－メチルチオフェニル基、３－プロポキシ－４－メチルチオフェニル基、４－エチルチオフェニル基、３－プロピルチオフェニル基、４－イソプロピルチオフェニル基、４－ブチルチオフェニル基、４－イソブチルチオフェニル基、２－（ｓｅｃ－ブチルチオ）フェニル基、２－ペンチルチオフェニル基、２－イソアミルチオフェニル基、４－ネオペンチルチオフェニル基、４－（２－クロロエチルチオ）フェニル基、３－（３－クロロプロピルチオ）フェニル基、ジフルオロメチルチオフェニル基、３－アセトキシフェニル基、４－アセトキシフェニル基、３－メチルスルフィニルフェニル基、４－メチルスルフィニルフェニル基、４－メトキシ－３－メチルスルフィニルフェニル基、３－メトキシ－４－メチルスルフィニルフェニル基、４－エトキシ－３－メチルスルフィニルフェニル基、３－エトキシ－４－メチルスルフィニルフェニル基、４－メチル－３－メチルスルフィニルフェニル基、３－エチル－４－メチルスルフィニルフェニル基、４－（２－クロロエチルスルフィニル）フェニル基、４－（３－クロロプロピルスルフィニル）フェニル基、４－（ジフルオロメチルスルフィニル）フェニル基、３－メチルスルホニルフェニル基、４－メチルスルホニルフェニル基、４－メチル－３－メチルスルホニルフェニル基、４－エチル－３－メチルスルホニルフェニル基、４－メトキシ－３－メチルスルホニルフェニル基、４－エトキシ－３－メチルスルホニルフェニル基、３－メトキシ－４－メチルスルホニルフェニル基、３－エトキシ－４－メチルスルホニルフェニル基、エチルスルホニルフェニル基、プロピルスルホニルフェニル基、イソプロピルスルホニルフェニル基、ブチルスルホニルフェニル基、２－クロロエチルスルホニルフェニル基、３－クロロプロピルスルホニルフェニル基、ジフルオロメチルスルホニルフェニル基、４－カルボキシフェニル基、４－メトキシカルボニルフェニル基、４－エトキシカルボニルフェニル基、３－メチルアミノフェニル基、４－メチルアミノフェニル基、４－メトキシ－３－メチルアミノフェニル基、３－メトキシ－４－メチルアミノフェニル基、４－エトキシ－３－メチルアミノフェニル基、３－エトキシ－４－メチルアミノフェニル基、４－メチル－３－メチルアミノフェニル基、３－メチル－４－メチルアミノフェニル基、４－エチル－３－メチルアミノフェニル基、３－ジメチルアミノフェニル基、４－ジメチルアミノフェニル基、４－メトキシ－３－ジメチルアミノフェニル基、３－メトキシ－４－ジメチルアミノフェニル基、４－エトキシ－３－ジメチルアミノフェニル基、３－エトキシ－４－ジメチルアミノフェニル基、４－メチル－３－ジメチルアミノフェニル基、３－メチル－４－ジメチルアミノフェニル基、４－エチル－３－ジメチルアミノフェニル基、３－メチル－４－ジメチルアミノフェニル基、３－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、４－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、４－メトキシ－３－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、３－メトキシ－４－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、４－エトキシ－３－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、３－エトキシ－４－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、４－メチル－３－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、３－メチル－４－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、４－エチル－３－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、３－メチル－４－（Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ）フェニル基、３－ジエチルアミノフェニル基、４－ジエチルアミノフェニル基、４－メトキシ－３－ジエチルアミノフェニル基、３－メトキシ－４－ジエチルアミノフェニル基、４－エトキシ－３－ジエチルアミノフェニル基、３－エトキシ－４－ジエチルアミノフェニル基、４－メチル－３－ジエチルアミノフェニル基、３－メチル－４－ジエチルアミノフェニル基、４－エチル－３－ジエチルアミノフェニル基、４－メチルスルホニルアミノフェニル基、４－トリフルオロメチルスルホニルアミノフェニル基、４－アセチルアミノフェニル基、２－ヒドロキシフェニル基、３－ヒドロキシフェニル基、４－ヒドロキシフェニル基、３－ヒドロキシ－４－メチルフェニル基、３－ヒドロキシ－４－エチルフェニル基、３－ヒドロキシ－４－メトキシフェニル基、４－ヒドロキシ－３－メチルフェニル基、４－ヒドロキシ－３－エチルフェニル基、４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル基、２－シアノフェニル基、３－シアノフェニル基、４－シアノフェニル基、２－ニトロフェニル基、３－ニトロフェニル基、３－ニトロ－４－メチルフェニル基、４－ニトロフェニル基、５－クロロピリジン－２－イル基、５－メチルピリジン－２－イル基、５－エチルピリジン－２－イル基、５－メトキシピリジン－２－イル基、５－エトキシピリジン－２－イル基、２，３－ジメチルピリジン－６－イル基、２，３－ジメトキシピリジン－６－イル基、２－クロロピリジン－５－イル基、２－メチルピリジン－５－イル基、２－エチルピリジン－５－イル基、２－メトキシピリジン－５－イル基、２－エトキシピリジン－５－イル基、２，３－ジメチルピリジン－５－イル基、２－メチルピリジン－４－イル基、２－エチルピリジン－４－イル基、２－メトキシピリジン－４－イル基、２－エトキシピリジン－４－イル基、５－メチルピリミジン－２－イル基、５－エチルピリミジン－２－イル基、２－エトキシピリジン－５－イル基、
２，３－ジメチルピリジン－５－イル基、２－メチルピリジン－４－イル基、２－エチルピリジン－４－イル基、２－メトキシピリジン－４－イル基、２－エトキシピリジン－４－イル基、５－クロロピリミジン－２－イル基、５－ブロモピリミジン－２－イル基、５－メトキシピリミジン－２－イル基、１－メチルインドール－２－イル基、等を例示することができる。
　特に免疫グロブリンの分析または精製において良好な性能を示す点で、Ａｒとしては４－メチルフェニル基、４－エチルフェニル基、３，４－ジメチルフェニル基、３－エチル－４－メチルフェニル基、４－エチル－３－メチルフェニル基、４－メトキシフェニル基、４－エトキシフェニル基、３，４－ジメトキシフェニル基、３，４－ジエトキシフェニル基、３－エトキシ－４－メトキシフェニル基、４－エトキシ－３－メトキシフェニル基、４－メトキシ－３－メチルフェニル基、４－メチル－３－エトキシフェニル基、４－ジメチルアミノフェニル基、２－メトキシピリジン－５－イル基、２－エトキシピリジン－５－イル基、２，３－ジメチルピリジン－５－イル基、４－ピリジル基、２－メチルピリジン－４－イル基、２－エチルピリジン－４－イル基、２－メトキシピリジン－４－イル基、２－エトキシピリジン－４－イル基、２－クロロピリジン－５－イル基、３－メトキシ－４－メチルフェニル基、３－ヒドロキシ－４－メチルフェニル基、４－メチルチオフェニル基のいずれかが好ましい。
　Ｙで表される脱離基としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メチルスルホニルオキシ基、トシル基等を挙げることができる。目的物の収率が良い点で、臭素原子が好ましい。
　Ｍで表されるマトリックスの材質としては特に限定はなく、例えば、架橋結合アルブミンなどのポリペプチドまたはタンパク質、アガロース、アルギネート、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、澱粉などの多糖、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンなどの合成高分子、シリカ、ガラス、多孔質珪藻土、アルミナ、ジルコニア、酸化鉄または他の金属酸化物などの無機化合物、上記物質を２つまたはそれ以上任意に組み合わせて構成される共重合体などのマトリックスをあげることができる。さらにそれらは、液相分配で使用されるデキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたは加水分解澱粉などの水溶性の高分子を包含するマトリックス、またはエマルジョンを形成するのに使用されるペルフルオロデカリンなどの化合物を包含するマトリックスも含まれる。特に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックス製造におけるマトリックスの材質としては、トヨパール（商品名）（東ソー社製）などのビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンが好ましい。
　ここでいうビニルポリマーとは、ビニル基などを持ったモノマーをビニル重合して得られたものを指し、モノマーとしてはメタクリル酸メチル、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリルアミド、ビニルエステルなどが含まれる。さらに、ここでいうビニルポリマーとしては前記モノマーを２種類以上用いた共重合体や、架橋したものなどが含まれる。
　また、マトリックスは、粒状物または非粒状物、水性溶媒に対して可溶性または不溶性、多孔性または非多孔性、いずれであっても良い。
　ｎについては、１から１２の整数から適宜選択することができるが、特に本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造に用いるチアゾール誘導体としては、ｎが３，４又は５が好ましい。
　次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造に用いる本発明のチアゾール誘導体の製造方法を詳細に説明する。
　［製造方法１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｒ３ａはアミノ基又はそのアンモニウム塩を表し、Ｙは脱離基を表す。）
　工程１はフタルイミド誘導体（２）をアシルチオウレア誘導体（３）と反応させ、チアゾール誘導体（１ａ）を合成する方法である。フタルイミド誘導体（２）は非特許文献２や特許文献７等を参考に合成することができる。
　工程１の反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができる。溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン（以下ＴＨＦ）、１，２－ジメトキシエタン（以下ＤＭＥ）、１，４－ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦ）、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド系溶媒、メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯ）、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができる。収率が良い点でＤＭＦを用いるのが好ましい。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができ、収率が良い点で６０℃から１５０℃の範囲で反応させるのが好ましい。本工程では、塩基存在下に行なうこともでき、塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム－ｔｅｒｔ－ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法により精製することもできる。
　工程２はチアゾール誘導体（１ａ）を塩基で処理し、チアゾール誘導体（１’）を製造する方法である。塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム－ｔｅｒｔ－ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、メチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミンなどの有機アミン類、ヒドラジン類を用いることができる。収率が良い点でヒドラジンあるいはメチルアミンが好ましい。塩基の使用量は反応基質に対して好ましくは２等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。本反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができる。溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、ＤＭＦ、Ｎ－メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどのアルコール系溶媒、ＤＭＳＯ、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができる。収率が良い点や後処理が簡便である点でメタノールやエタノールなどのアルコール系溶媒を用いることが好ましい。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法により精製することもできる。また、反応終了後、酸で処理しアンモニウム塩として単離することもできる。反応に害を及ぼさない酸であれば使用することができ、例えば、塩酸、臭化水素酸、フッ酸、硝酸、硫酸、リン酸などの無機酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸を用いることができるが、目的物の単離が容易であることから塩酸を用いるのが好ましい。
　［製造方法２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｗはハロゲン原子を表す。）
　製造方法２は、２－置換アミノチアゾール誘導体（４）と酸ハロゲン化物（５）を反応させ、チアゾール誘導体（１ａ）を製造する方法である。当該方法の反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができる。溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジオキサン等のエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼン等の芳香族炭化水素系溶媒、ＤＭＦ、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド系溶媒、ＤＭＳＯ、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができる。収率が良い点でジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒を用いるのが好ましい。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができ、収率が良い点で０℃から１００℃の範囲で反応させるのが好ましい。本工程では、塩基存在下に行なうこともでき、塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム－ｔｅｒｔ－ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリン等の有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶等により精製することもできる。当該方法で合成されたチアゾール誘導体（１ａ）は、製造方法１の工程２を経由することによって、チアゾール誘導体（１’）へと導くことができる。
　次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法を詳細に説明する。
　［製造方法３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３a、Ｍ、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）
　製造方法３は上記工程にて製造される新規なチアゾール誘導体（１’）と活性化基（活性化基とは、アミノ基あるいはアンモニウム塩と容易に反応できる官能基のことである。例えば、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、２，２，２－トリフルオロエチルスルホニル基（トレシル基）、塩化スルホニル基、トシル基、ビニルスルホニル基、及びエポキシ基を挙げることができる。）含有マトリックスとを反応させてチアゾール誘導体固定化マトリックス（６）を製造する方法である。なお、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスの活性化基としては、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、２，２，２－トリフルオロエチルスルホニル基（トレシル基）、エポキシ基、又はカルボキシル基が特に好ましい。また、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスは、活性化基を有しないマトリックスから周知の方法で活性化基を付加することで調製しても良い。また、ＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、エポキシトヨパール（商品名）、ホルミルトヨパール（商品名）、トレシルトヨパール（商品名）、カルボキシトヨパール（商品名）（以上東ソー社製）、活性化キトパールＫ－６６（商品名）ゲル（富士紡ホールディングス社製）、ＢＩＯＡＣＴ　ＥＰＯ（商品名）ゲル（昭和電工社製）、ＰＯＲＯＳ－ＥＰ（商品名）ゲル（アプライドバイオシステムズ社製）、セルファインホルミル（商品名）ゲル（チッソ社製）、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ　Ｅｐｏｘｉｄｅ（商品名）ゲル（バイオラッド社製）、Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ　Ｅｐｏｘｙ－Ｄ－５０－１０００ＡＷ（商品名、ＡＧＣエスアイテック社製）などのリガンド固定化用担体として市販されているものをそのまま用いても良い。
　本反応では、中性あるいは塩基性条件下にて反応させることにより容易に目的物を得ることができる。特に塩基性条件下にて反応を行なうことにより、チアゾール誘導体の固定化率の高いマトリックスを得ることができる。塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム－ｔｅｒｔ－ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等モル以上用いて反応を実施することにより、目的とするチアゾール誘導体の固定化比率の高いマトリックスを得ることができる。また、溶液のｐＨを保つために緩衝液を加えて反応を行なうこともできる。反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができる。溶媒としては、例えば、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＥ、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、エチルメチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、ＤＭＦ、Ｎ－メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、ＤＭＳＯ、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができる。反応温度については特に制限はないが、０℃から１５０℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより、目的とするチアゾール誘導体固定化マトリックスを得ることができる。マトリックス上のチアゾール誘導体の固定化量は、吸光度分析、高速液体クロマトグラフィー、元素分析などの分析法を単独あるいは組み合わせて用いることにより測定できる。
　次に、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いてタンパク質を分析、分離、または単離、精製する方法について説明する。
　製造方法３によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスをカラム管に充填し、溶離液として緩衝液、金属塩の水溶液、アミノ酸溶液、アルコール溶液などの溶液を通液し、タンパク質を分析や分離、及び単離や精製を行なうことができる。この方法で分析、分離、または単離、精製することができるタンパク質としては、血漿タンパク質成分や乳タンパク質成分をあげることができ、天然に存在するものでは血漿中の免疫グロブリン、血清アルブミン、血液凝固因子、ラクトアルブミン、ラクトフェリンを例示できる。また遺伝子組換えタンパク質では前記に加えて、天然には微量しか存在しない、あるいは人工的に設計されたペプチドホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、成長抑制因子、ワクチンを例示できる。特に本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスは、免疫グロブリンの精製に好適である。通液する緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、Ｃｈｏｌａｍｉｎｅ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳを例示でき、金属塩としては硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムを例示でき、アミノ酸としてはグリシン、アルギニン、ベータアラニン、ガンマアミノ酪酸を例示でき、アルコールとしてはエタノール、イソプロピルアルコール、グリセロール、エチレングリコールを例示でき、これらを混合溶媒として用いることもできる。ｐＨは３から１１の範囲内で目的とするタンパク質を分離、単離または精製することができるが、ｐＨは５から９の範囲内で精製することが好ましい。また、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）などのクロマトグラフィー装置を使用して、タンパク質を分析、分離、または単離、精製することもできる。製造方法３によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いて免疫グロブリン、またはこれらの類縁体、フラグメント、融合体を分析または精製する場合は、硫酸ナトリウムや硫酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液を通液し、ｐＨは５から９の範囲で、疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーを実施することが好ましい。ここでいう免疫グロブリンの類縁体とは免疫グロブリンの構造や機能が少なくとも部分的に保持された天然あるいは人工的に作られたタンパク質あるいはタンパク質コンジュゲートを指し、免疫グロブリンのフラグメントとは酵素的な処理あるいは遺伝子工学的な設計によって作製された免疫グロブリンの部分構造を持ったタンパク質を指し、免疫グロブリンの融合体とは各種サイトカインあるいはサイトカイン受容体などの生物活性をもったタンパク質の機能部分を免疫グロブリンの全部または一部と遺伝子工学的に融合させて作製したものを指す。
　製造方法３によって得られたチアゾール誘導体固定化マトリックスは、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液などのアルカリ性水溶液、塩酸水溶液、硫酸水溶液、硝酸水溶液、リン酸水溶液などの酸性水溶液、塩酸グアニジン水溶液、尿素水溶液などのタンパク変性剤水溶液、アルギニンやヒスチジンなどのアミノ酸を含んだ水溶液、ＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコールなどのアルコール溶液、あるいは、これらを含んだ混合水溶液を用いて洗浄することによって、初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の解釈がこれらに限定されるものではない。
　［実施例１］　チアゾール誘導体の合成
　（合成例１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 　６－フタルイミド－１－ヘキサナール（４．９５ｇ，２０．２ｍｍｏｌ）を四塩化炭素（１００ｍＬ）に溶解し臭素（１．０３ｍＬ，２０．２ｍｍｏｌ）の四塩化炭素溶液（１００ｍＬ）を滴下し２時間反応した。反応液を水（１００ｍＬ）、次いで飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去し油状物を得た。得られた油状物をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解し、４－メチルベンゾイルチオウレア（５．８７ｇ，２６．３ｍｍｏｌ）を加え、１０時間加熱還流した。反応終了後、反応混合物に１Ｍ塩酸（３００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３００ｍＬ）で二回抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水（３００ｍＬ）で二回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し、溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製することによって、４－メチル－Ｎ－［５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミドの白色固体（０．４２４ｇ，５％）を得た。ｍ．ｐ．２０３から２０５℃；１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ　１．５８から１．８２（ｍ，４Ｈ），２．４４（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６９から７．８６（ｍ，４Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（合成例２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 　２－アミノ－４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール（０．５０ｇ，１．６６ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液に、４－メチルベンゾイルクロリド（０．３１ｇ，１．９９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１ｍＬ）を加え、２日間撹拌した。反応終了後、反応液を水（１０ｍＬ）で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し、溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２）で精製し、４－メチル－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミドの白色固体（０．４０ｇ，５６％）を得た。ｍ．ｐ．１７８から１８０℃；１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ　１．５８から１．６６（ｍ，４Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），　２．４１（ｓ，３Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．７６から７．８６（ｍ，６Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（合成例３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 　Ｎ－（５－ブロモ－６－オキソヘプチル）フタルイミド（１．３０ｇ，３．８５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、Ｎ－（３－アセトキシ－４－メチルベンゾイル）チオウレアを加え、８０℃で７時間反応させた。反応終了後、反応混合物に１Ｍ塩酸（３０ｍＬ）を加え、次いで酢酸エチル（５０ｍＬ）で二回抽出し、有機層を合わせて飽和食塩水（３０ｍＬ）で二回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し、溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム（山善社製；Ｒｆ＝０．３２：ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）で精製し、得られた褐色固体を酢酸エチル／ヘキサンの混合溶媒で洗浄することによって、白色固体の３－アセトキシ－４－メチル－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミド（０．８２３ｇ，４９％）を得た。：ｍ．ｐ．１７０から１７２℃；１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．６０から１．６６（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ），２．７２から２．７４（ｍ，２Ｈ），３．５３から３．６４（ｍ，２Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７９から７．９３（ｍ，６Ｈ），１２．４（ｂｒ　ｓ，１Ｈ）。
　（合成例４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 　モノテレフタル酸メチルクロリド（１．４１ｇ，７．１０ｍｍｏｌ）のクロロホルム（３０ｍＬ）溶液に、氷冷下にて２－アミノ－４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール（１．５６ｇ，４．７４ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．２０ｍＬ，７．９８ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液を加え、一晩反応させた。反応終了後、反応混合物を水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム（山善社製；Ｒｆ＝０．１６：ヘキサン／酢酸エチル＝２／１）で精製し、４－メトキシカルボニル－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミドの白色固体（０．８１５ｇ，３３％）を得た。：ｍ．ｐ．１７３から１７４℃；１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．６０から１．６７（ｍ，４Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ），２．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．９０（ｄ，３Ｈ），７．８０から７．９０（ｍ，４Ｈ），８．０６から８．２０（ｍ，４Ｈ），１２．７（ｂｒ　ｓ，１Ｈ）。
　（合成例５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 　２－アミノ－４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール（１．０ｇ，３．１７ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液に、３－シアノベンゾイルクロリド（０．７９ｇ，４．７５ｍｍｏｌ）を氷冷下にて加えた。次いでトリエチルアミン（０．７２ｍＬ，４．７９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１０ｍＬ）溶液を滴下し、一晩反応させた。反応終了後、反応混合物を水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し、溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２）で精製し、３－シアノ－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミドの白色固体（０．５７ｇ，４０％）を得た。ｍ．ｐ．１７０から１７２℃；１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ　１．６９から１．７０（ｍ，４Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝６．５，２Ｈ），３．７３（ｔ，Ｊ＝６．８，２Ｈ），７．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．０　ａｎｄ　８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１から７．８６（ｍ，５Ｈ），８．０５（ｍ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（参考例１）
　アルゴン雰囲気下、４－メチル－Ｎ－｛５－（４－フタルイミドブチル）チアゾール－２－イル｝ベンズアミド（０．１０５ｇ，０．２５ｍｍｏｌ）とフェロセン（０．０２３ｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）に、ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）、３Ｍ－ヨウ化トリフルオロメチル／ＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ，０．７５ｍｍｏｌ）、及び１Ｍ－硫酸／ＤＭＳＯ溶液（０．２５ｍＬ，０．２５ｍｍｏｌ）を加えて撹拌した。この溶液に、室温下で３１％過酸化水素水（７５μＬ，０．７５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応終了後、反応溶液を水（２００ｍＬ）にあけ、しばらく撹拌した。クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、４－メチル－Ｎ－｛４－トリフルオロメチル－５－（４－フタルイミドブチル）チアゾール－２－イル｝ベンズアミドの白色固体（０．０２３ｇ，１９％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ　１．７９から１．８２（ｍ，４Ｈ），２．４７（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．７６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．７２から７．９０（ｍ，６Ｈ），９．３７（ｓ，１Ｈ）；１９Ｆ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：－６０．８７。
　（合成例６から８１）
　合成例１または２の方法に準じて、表１から１２に記載したチアゾール誘導体を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
　（合成例８２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 　４－メチル－Ｎ－｛５－（４－フタルイミドブチル）チアゾール－２－イル｝ベンズアミド（０．６０ｇ，１．４３ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（０．３５ｍＬ、７．１２ｍｍｏｌ）を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、１Ｍ　塩酸（６ｍＬ）を加えた。析出した固体を濾別し、濾液を酢酸エチルで洗浄し、水層を減圧留去した。得られた固体にエタノールとトルエンを加え共沸し十分に乾燥し、固体を瀘取した。得られた固体を酢酸エチルにて洗浄することによって、４－｛２－（４－メチルベンゾイル）アミノチアゾール－５－イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．４４ｇ，収率：９５％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．６４から１．６７（ｍ，４Ｈ），２．４０（ｓ，３Ｈ），２．７７から２．８０（ｍ，４Ｈ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．３５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），８．０７（ｂｒ　ｓ，３Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（合成例８３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 　２－クロロ－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミド（０．２２ｇ，０．４８ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、０．０５Ｍのヒドラジンエタノール溶液（３４ｍＬ）を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、１Ｍ　塩酸（３ｍＬ）を加えた。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４－｛２－（２－クロロベンゾイルアミノ）－４－メチルチアゾール－５－イル｝ブチルアミン塩酸塩の褐色固体（０．０５０ｇ，収率：２１％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．４２から１．７７（ｍ，４Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．６３から２．９２（ｍ，４Ｈ），７．３３から７．６７（ｍ，４Ｈ），７．６８から８．１６（ｍ，３Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（合成例８４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 　３，４－ジクロロ－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミド（０．２５ｇ，０．５１ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（０．０７ｍＬ，１．５３ｍｍｏｌ）を室温にて加え、一晩撹拌した。反応終了後、反応溶液を留去し、１Ｍ　塩酸（３ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４－｛２－（３，４－ジクロロベンゾイルアミノ）－４－メチルチアゾール－５－イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．１０ｇ，　収率：５０％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．４６から１．７４（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），　２．６２から２．９１（ｍ，４Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８５から７．９９（ｍ，３Ｈ），８．０３から８．１３（ｍ，１Ｈ），８．０４（ｄｄ，Ｊ＝２．０　ａｎｄ　８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）。
　（合成例８５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 　４－メチル－Ｎ－［４－メチル－５-｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミド（０．２３ｇ，０．５３ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、ヒドラジン一水和物（０．２３ｍＬ，５．３０ｍｍｏｌ）を加え３時間還流した。反応終了後、反応溶液を留去し、残渣に１Ｍ　塩酸（５ｍＬ）を加え、撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４－｛４－メチル－２－（４－メチルベンゾイルアミノ）チアゾール－５－イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．０４３ｇ，収率：２４％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．５５から１．８０（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．６４から２．９２（ｍ，４Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．７８から８．０５（ｍ，３Ｈ），７．９９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（合成例８６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 　４－トリフルオロメチル－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミド（０．３０ｇ，０．６２ｍｍｏｌ）のエタノール（５ｍＬ）溶液に、０．０５Ｍ　ヒドラジンエタノール溶液（３０ｍＬ）を室温にて加え、２時間還流した。反応終了後、反応溶液を留去し、１Ｍ　塩酸（３ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。析出した固体を濾別し、濾液を減圧留去した。得られた固体をエタノール並びに酢酸エチルを用いて洗浄することにより、４－｛４－メチル－２－（４－トリフルオロメチルベンゾイルアミノ）チアゾール－５－イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．１０ｇ，収率：４１．７％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．４９から１．７３（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．６０から２．９０（ｍ，４Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．９７から８．１９（ｍ，３Ｈ），８．２６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（合成例８７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 　４－メトキシカルボニル－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］－ベンズアミド（０．５３５ｇ，１．１２ｍｍｏｌ）に０．５Ｍヒドラジンエタノール溶液（１３．５ｍＬ）を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去した。残渣に１Ｍ塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで固体を濾別した。濾液を減圧留去し、固体を再度析出させ、少量の熱エタノールを加え洗浄することによって、４－［２－｛４－（メトキシカルボニル）ベンゾイルアミノ｝－４－メチルチアゾール－５－イル］ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．３６ｇ，収率：８４％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．６０から１．７０（ｍ，４Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ），２．７２から２．８０（ｍ，４Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），７．９７（ｂｒ　ｓ，３Ｈ），８．０７から８．２１（ｍ，４Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（合成例８８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 　３－アセトキシ－４－メチル－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミド（０．８０ｇ，１．６２ｍｍｏｌ）に０．５Ｍヒドラジンエタノール溶液（１０ｍＬ）を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、反応溶液を減圧留去した後、残渣に１Ｍ塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで固体を濾別した。濾液を減圧留去し、固体を再度析出させ、少量の熱エタノールを加え洗浄することによって、４－｛２－（３－ヒドロキシ４－メチルベンゾイルアミノ）－４－メチルチアゾール－５－イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．４８ｇ，収率：７５％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．６０から１．７０（ｍ，４Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．２３（ｓ，３Ｈ），２．７２から２．８１（ｍ，４Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４４から７．５０（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｂｒ　ｓ，３Ｈ）９．８０（ｂｒ　ｓ，１Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（合成例８９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 　３－シアノ－Ｎ－［４－メチル－５－｛４－（フタルイミド）ブチル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミドに０．５Ｍヒドラジンエタノール溶液（７ｍＬ）を加え常温で一晩反応させた。反応終了後、溶媒を減圧留去し、残渣に１Ｍ塩酸を加え超音波で懸濁し、セライトを敷いたガラスフィルターで濾過した。溶媒を減圧留去し、少量のエタノールを加え溶解した後、酢酸エチルで再沈殿させて精製し、４－｛２－（３－シアノベンゾイルアミノ）－４－メチルチアゾール－５－イル｝ブチルアミン塩酸塩の白色固体（０．２５ｇ，収率：４６％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．６２から１．６５（ｍ，４Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），３．４３から３．４６（ｍ，４Ｈ），７．５６（ｄｄ，Ｊ＝８．０　ａｎｄ　８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１０から８．２２（ｍ，４Ｈ），８．４９（ｓ，１Ｈ）。アミドのプロトンは帰属できなかった。
　（合成例９０から１７９）
　合成例８９の方法に準じて、表１３から２６に記載したチアゾール誘導体を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000065
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000066
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000067
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000068
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000069
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000070
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000071
　合成例１から８１に例示した方法によって合成した本発明に関わるチアゾール誘導体（１ａ）を表２７から３２にまとめて例示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000073
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000074
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000075
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000076
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000077
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
　また、合成例８２から１７９に例示した方法によって合成した本発明に関わるチアゾール誘導体（１’）を表３３から４１にまとめて例示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000080
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000081
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000082
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000083
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000084
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000085
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000087
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000088
　（参考例２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 　化合物２７６（２．５０ｇ，８．６４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（５０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（２．５０ｍＬ，１８ｍｍｏｌ）を添加した。次に氷冷下でメタクリル酸クロリド（０．９３ｍＬ，９．５ｍｍｏｌ）を滴下した後、氷冷下で３０分反応させた。反応終了後、反応混合物にクロロホルム（５０ｍＬ）を添加し、水（１００ｍＬ）、飽和炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し、溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝１／２（ｖ／ｖ））で精製することで、淡黄色粘性液体の４－メチル－Ｎ－［４－メチル－５－｛３－（２－プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミド（１．０７ｇ，３．０ｍｍｏｌ，収率：３５％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６，ＤＭＳＯ，ｐｐｍ）：δ　１．７０から１．８２（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），３．１０から３．２５（ｍ，２Ｈ），５．３２（ｓ，１Ｈ），５．６４（ｓ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ）。
　［実施例２］　チアゾール誘導体のアガロースゲルへの固定化（その１）
　チアゾール誘導体を４０μｍｏｌ／ｍＬになるようＤＭＳＯに溶解し、これに等量の０．５Ｍ　塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ　炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を加えて濃度２０μｍｏｌ／ｍＬのチアゾール誘導体溶液を調製した。Ｎ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）にて活性化されたアガロースゲルであるＨｉＴｒａｐ　ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＨＰ　１ｍＬ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製；以下ＨｉＴｒａｐカラムと略記する）に、非特許文献３に記載された方法に従って前記チアゾール誘導体溶液を２ｍＬ通液することによって固定化を行なった。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献３に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献３に記載された方法のうち「Ｂ．酸性条件法」に従って、ＨｉＴｒａｐカラム通液前後のリガンド（チアゾール誘導体）溶液の紫外吸収極大波長（３００ｎｍ付近）における吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定することにより算出した。当該方法で固定化した各化合物の固定化リガンド密度を表４２に示す。なお、本実施例以降で記載の化合物番号は表３３から４１記載の化合物番号に対応する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000090
　［実施例３］　チアゾール誘導体のアガロースゲルへの固定化（その２）
　チアゾール誘導体を２０μｍｏｌ／ｍＬ及びトリエチルアミンを４０μｍｏｌ／ｍＬ含むＤＭＳＯ溶液を調製した。ＨｉＴｒａｐカラムをＤＭＳＯで置換後、これに前記チアゾール誘導体－トリエチルアミンのＤＭＳＯ溶液を２ｍＬ通液した。一時間放置した後、ＨｉＴｒａｐカラムに３ｍＬのＤＭＳＯを通液して、さらに５ｍＬの０．５Ｍ　塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ　炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）を通液した。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献３に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献３に記載された方法のうち「Ｂ．酸性条件法」に従って、ＨｉＴｒａｐカラム通液前後のリガンド（チアゾール誘導体）溶液の紫外吸収極大波長（３００ｎｍ付近）における吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定することにより算出した。当該方法で固定化した化合物３０４の固定化リガンド密度を表４３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
 　［実施例４］　チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その１）
　実施例２あるいは３に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ　硫酸ナトリウムを含む１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、平衡化緩衝液と呼ぶ）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト血漿由来免疫グロブリン製剤（化血研製、本製剤の免疫グロブリンは免疫グロブリンＧである）０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。チアゾール誘導体を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１から図６に示し、これらのクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表４４に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときも免疫グロブリンは５０％以上の回収率で回収され、チアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムによる免疫グロブリンの吸脱着が確認された。特に化合物２８６、３０４、３２９を用いた場合の回収率は９０％以上と極めて高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
 　それぞれの吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムはいずれもこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例５］　チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その２）
　実施例２あるいは３に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製）０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。各種チアゾール誘導体を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図７から１２に示す。また、これらのクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表４５に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときもウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出しており、カラムへの吸着はほとんど見られなかった。また、図１から６に示した免疫グロブリンを通液したときの結果とは大きく異なっていた。よって、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとウシ血清アルブミンとの分離が可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
 　それぞれの吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体を固定化ＨｉＴｒａｐカラムはいずれもこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例６］　チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その３）
　実施例２に記載の方法にて調製した化合物２８６を固定化したＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したリボヌクレア－ゼＡ、リゾチ－ム、αキモトリプシノ－ゲンＡの混合液（リボヌクレア－ゼＡ　０．１５ｍｇ、リゾチ－ム　０．０３ｍｇ、αキモトリプシノ－ゲンＡ　０．０４ｍｇ）（ＯＤ２８０＝０．２４）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。タンパク質のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度の吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６を固定化したＨｉＴｒａｐカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１３に示し、このクロマトグラフィーにおけるタンパク質の回収率を表４６に示す。いずれのタンパク質も１０番目の画分以内に溶出しており、免疫グロブリン（２５番目から４５番目までの画分に溶出、図１参照）とは異なる画分となった。このことから、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとリボヌクレア－ゼＡ、リゾチ－ム、αキモトリプシノ－ゲンＡとの分離が可能であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000094
 　吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。前記のチアゾール誘導体固定化ＨｉＴｒａｐカラムはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例７］　チアゾール誘導体固定化アガロースゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その４）
　ヒト－マウスキメラ抗体であるリツキサン（商品名）（中外製薬社製、１０ｍｇ／ｍＬ）を固定化パパイン（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｐａｐａｉｎ、ＰＩＥＲＣＥ社製）を用い、同説明書記載の方法で３７℃、１０時間処理することによって、限定加水分解物を得た。
　実施例２に記載の方法にて調製した化合物２８６を固定化したＨｉＴｒａｐカラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、上記パパイン処理抗体を１．２ｍｇ（ＯＤ２８０＝１．７）添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。タンパク質のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出し、溶出液は１ｍＬずつ分画した。このクロマトグラフィーの結果を図１４に示す。またこのうち７、２９、３９、４３番目の画分（それぞれＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶと表記）についてそれぞれ５μＬを還元条件下で１５％アクリルアミドを含むＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、銀染色試薬（銀染色「第一」（商品名）、第一化学薬品社製）を用いて染色した（図１５）。これにより、ＩはＦａｂ（Ｈ鎖に由来する２７ｋＤａタンパク質とＬ鎖である２７ｋＤａタンパク質より構成される）、ＩＩはＦｃ（Ｈ鎖に由来する３０ｋＤａタンパク質のダイマーで構成される）、ＩＩＩは部分消化抗体（Ｈ鎖である６０ｋＤａタンパク質とＨ鎖に由来する３０ｋＤａタンパク質とＬ鎖である２７ｋＤａタンパク質で構成される）、ＩＶは未消化抗体（Ｈ鎖である６０ｋＤａタンパク質のダイマーとＬ鎖である２７ｋＤａタンパク質のダイマーで構成される）と同定され、抗体に由来する各フラグメントの分離が可能であることが示された。
　［実施例８］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１）
　遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認した後、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８６が１２７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることを確認した。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８６が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
　［実施例９］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その２）
　遠沈管に化合物３２９（１０７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液（２．４ｍＬ）、水（５．６ｍＬ）を添加して化合物３２９が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物３２９を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３２９が８１μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３２９が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３２９を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３２９は残存していないことが確認された。
　［実施例１０］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その３）
　遠沈管に化合物２８６（３０ｍｇ、８８μｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．１ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（２．４ｍＬ）、緩衝液（組成：０．１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０；２．５ｍＬ）、トリエチルアミン（３０μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、３ｍＬのホルミルトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、ホルミル基含量：６５μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温２５℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから３０分後、遠沈管にボラン－ピリジン複合体（２５０μＬ、２．５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１６５ｒｐｍで２．５時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、化合物２８６が１９μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
　［実施例１１］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その４）
　遠沈管に化合物３２０（１１１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液（０．６ｍＬ）、水（７．４ｍＬ）を添加して化合物３２０が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３２０を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３２０が１７６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液（溶媒は水）、ｐＨ８．３；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３２０が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３２０を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３２０は残存していないことが確認された。
　［実施例１２］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その５）
　遠沈管に化合物３８４（１１２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液（０．９ｍＬ）、水（７．１ｍＬ）を添加して化合物３８４が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物３８４を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３８４が１２６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３８４が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３８４を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３８４は残存していないことが確認された。
　［実施例１３］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その６）
　遠沈管に化合物４２３（１１１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、０．５Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液（０．９ｍＬ）、水（７．１ｍＬ）を添加して化合物４２３が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２４時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物４２３を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物４２３が１１４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２０時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物４２３が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物４２３を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物４２３は残存していないことが確認された。
　［実施例１４］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その７）
　遠沈管に化合物２８３（９４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８３が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８３を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８３が１０２μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８３が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８３を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８３は残存していないことが確認された。
　［実施例１５］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その８）
　遠沈管に化合物２８４（９８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８４が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８４を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８４が１１７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８４が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８４を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８４は残存していないことが確認された。
　［実施例１６］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その９）
　遠沈管に化合物２９２（１９１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．５ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．５ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；４ｍＬ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加して化合物２９２が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２９２を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２９２が５６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２９２が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２９２を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２９２は残存していないことが確認された。
　［実施例１７］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１０）
　遠沈管に化合物３６４（１９３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．５ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．５ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加して化合物３６４が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物３６４を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物３６４が２５７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物３６４が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物３６４を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物３６４は残存していないことが確認された。
　［実施例１８］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１１）
　遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；４ｍＬ）、トリエチルアミン（９０μＬ、０．６ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのトレシルトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、トレシル基含量：非公開）を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、トレシルトヨパールに化合物２８６が９４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のトレシル基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：０．５Ｍ　トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３；５ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存トレシル基をトリスヒドロキシメチルアミノメタンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄し、化合物２８６が固定化されたトレシルトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
　［実施例１９］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１２）
　遠沈管に化合物３２９（３０ｍｇ、８４μｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．１ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（２．４ｍＬ）、緩衝液（組成：０．１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０；２．５ｍＬ）、トリエチルアミン（３０μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を添加して化合物３２９が溶解したことを確認したのち、３ｍＬのホルミルトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、ホルミル基含量：６５μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温２５℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから３０分後、遠沈管にボラン－ピリジン複合体（２５０μＬ、２．５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに１６５ｒｐｍで２．５時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物３２９を定量し、化合物３２９が１４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
　［実施例２０］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１３）
　遠沈管に化合物２８６（１７０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．５ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．５ｍＬ）、緩衝液（組成：０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．３；８ｍＬ）、トリエチルアミン（１４０μＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのエポキシトヨパール（商品名）ゲル（東ソー社製、エポキシ基含量：８０４μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで６３時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物２８６が１６７μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。この化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル中の窒素原子含有量及び硫黄原子含有量を測定したところ、窒素原子が１．２重量％、硫黄原子が０．８９重量％含まれることを確認した。
　［実施例２１］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１４）
　遠沈管に化合物３５８（１３４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．４ｍＬ添加した。次いで、遠沈管に１，４－ジオキサン（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（１２０μＬ、０．９ｍｍｏｌ）を添加して化合物３５８が溶解したことを確認したのち、２．５ｍＬのトヨパールＣＭ－６５０Ｓ（商品名）ゲル（東ソー社製；イオン交換容量：０．１ｍｏｌ／Ｌ（ｇｅｌ））と１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１５４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温２５℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで１４時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを１，４－ジオキサン（１０ｍＬ）で２回洗浄したのち、洗浄液（組成：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝４５／５５；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ２５４ｎｍ）にて残存する化合物３５８を定量し、化合物３５８が１６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたトヨパールＣＭ－６５０Ｓゲルを得た。
　［実施例２２］　チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その１）
　実施例８に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル１ｍＬをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、前記平衡化緩衝液を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト血漿由来免疫グロブリン製剤（化血研製）０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、平衡化緩衝液から１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１６に示し、このクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表４７に示す。免疫グロブリンはＨｉＴｒａｐカラムを用いたとき（図１参照）よりもいくぶん幅広く２０番目から５０番目までの画分に溶出していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000095
 　吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例２３］　チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その２）
　実施例８に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル１ｍＬをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ　硫酸ナトリウム、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１７に示し、このクロマトグラフィーにおけるヒト化モノクローナル抗体の回収率を表４８に示す。ヒト化モノクローナル抗体は３０番目から４５番目までの画分に溶出し、免疫グロブリン（図１６参照）と比べていくぶん後ろの位置で溶出していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000096
 　吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例２４］　チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その３）
　実施例８に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲル１ｍＬをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ　硫酸ナトリウム、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１８に示し、このクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表４９に示す。ウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出し、これは免疫グロブリン（図１６参照）とは異なる画分であり、ＨｉＴｒａｐカラムを用いたとき（図１及び図７参照）と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体と固定化するマトリックスをアガロースからトヨパールに変更しても同様な免疫グロブリンの分離性能を有していることが示された。
　吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例２５］　チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その４）
　実施例９に記載の方法にて調製した化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ　硫酸ナトリウム、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．７）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図１９に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表５０に示す。ヒト化モノクローナル抗体は３０番目から４５番目までの画分に溶出と、化合物２８６をチアゾール誘導体として用いたとき（図１７参照）と同じ画分の位置で溶出していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000098
 　吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例２６］　チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その５）
　実施例９に記載の方法にて調製した化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ　硫酸ナトリウム、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図２０に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表５１に示す。ウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体（図１９参照）とは異なる画分であり、化合物２８６をチアゾール誘導体として用いたとき（図１８参照）と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体を化合物２８６から化合物３２９に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000099
 　吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物３２９固定化エポキシトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例２７］　チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その６）
　実施例１０に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを１ｍＬ　ＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ　硫酸ナトリウム、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．８）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図２１に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表５２に示す。ヒト化モノクローナル抗体は３０番目から４５番目までの画分に溶出と、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき（図１７参照）と同じ画分の位置で溶出していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000100
 　吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例２８］　チアゾール誘導体固定化ビニルポリマーゲルを用いたタンパク質の吸脱着（その７）
　実施例１０に記載の方法にて調製した化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルをＴＲＩＣＯＲＮカラム（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に充填し、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ（商品名）（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製クロマトグラフィー装置）に取り付け、０．７Ｍ　硫酸ナトリウム、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を２０ｍＬ通液し平衡化した。ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを流速１ｍＬ／ｍｉｎで自動運転し、平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン０．５ｍｇ（ＯＤ２８０＝０．３）を添加した。さらに平衡化緩衝液を１０ｍＬ通液後、１０ｍＭ　リン酸ナトリウム－１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は２８０ｎｍにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は１ｍＬずつ分画し、各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度をＵ－２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し回収率を算出した。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図２２に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表５３に示す。ウシ血清アルブミンは１０番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体（図２１参照）とは異なる画分であり、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき（図１８参照）と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体の固定化に用いるマトリックスの有する活性化基をエポキシ基からホルミル基に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000101
 　吸脱着操作後には１００ｍＭ　水酸化ナトリウムを１０ｍＬ通液してカラムの再生を行なった。化合物２８６固定化ホルミルトヨパールゲルはこの再生処理によって初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用によってもその特性は変化しなかった。
　［実施例２９］　チアゾール誘導体のキトサンゲルへの固定化
　水で洗浄した５ｍＬの活性化キトパールＫ－６６（商品名）ゲル（富士紡ホールディングス社製；スクシンイミドオキシカルボニル基含量：１５μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ））を遠沈管に計り取り、これにＤＭＳＯを１０ｍＬ添加した。次に化合物２８６のＤＭＳＯ溶液（０．２５Ｍ）を９００μＬ、１Ｍの１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液を２２５μＬ、トリエチルアミンを６８μＬ、順次添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで３時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでキトパールゲルと反応溶液を分離し、グラスフィルター上のキトパールゲルをジメチルスルホキシド（５ｍＬ）、洗浄液（組成：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５；１５ｍＬ）で洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（商品名）（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＯＨ／５０ｍＭ　ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４＝４／１／５、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量し、化合物２８６が５．０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されているキトパールゲルを得た。
　［実施例３０］　チアゾール誘導体のビニルポリマーゲルへの固定化（その１５）
　遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液（１．２ｍＬ）、水（６．８ｍＬ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．５ｇのＢＩＯＡＣＴ－ＥＰＯ（商品名）ゲル（昭和電工社製、エポキシ基含量：２００μｍｏｌ／ｇ（ｇｅｌ））を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで４３時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでＢＩＯＡＣＴ－ＥＰＯゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のＢＩＯＡＣＴ－ＥＰＯゲルを洗浄液（組成：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、ＢＩＯＡＣＴ－ＥＰＯゲルに化合物２８６が４６μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたＢＩＯＡＣＴ－ＥＰＯゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたＢＩＯＡＣＴ－ＥＰＯゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：アセトニトリル；２ｍＬ、０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；４ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで２３時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてＢＩＯＡＣＴ－ＥＰＯゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄することで、化合物２８６が固定化されたＢＩＯＡＣＴ－ＥＰＯゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
　［実施例３１］　チアゾール誘導体のスチレン－ジビニルベンゼン共重合体ゲルへの固定化
　遠沈管に化合物２８６（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を計り取り、１，２－ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液（１ｍｍｏｌ／ｍＬ）を０．３ｍＬ添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル（１．７ｍＬ）、１Ｍ　水酸化ナトリウム水溶液（１．２ｍＬ）、水（６．８ｍＬ）を添加して化合物２８６が溶解したことを確認したのち、０．３ｇのＰＯＲＯＳ－ＥＰ（商品名）ゲル（アプライドバイオシステムズジャパン社製、エポキシ基含量：非開示）を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで３６時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターでＰＯＲＯＳ－ＥＰゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のＰＯＲＯＳ－ＥＰゲルを洗浄液（組成：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１；１０ｍＬ）で２回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：０．０５％トリフルオロ酢酸含有ＣＨ３ＣＮ／０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液＝１／１、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物２８６を定量することによって、ＰＯＲＯＳ－ＥＰゲルに化合物２８６が９１μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたＰＯＲＯＳ－ＥＰゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたＰＯＲＯＳ－ＥＰゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液（組成：アセトニトリル；２ｍＬ、０．５Ｍ　モノエタノールアミン、０．５Ｍ　塩化ナトリウム水溶液、ｐＨ８．３（溶媒は水）；４ｍＬ）を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温４０℃に設定した卓上振盪機にセットし、１６５ｒｐｍで６時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル（５ｍＬ）を添加し、グラスフィルターにてＰＯＲＯＳ－ＥＰゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）でそれぞれ２回ずつ洗浄することで、化合物２８６が固定化されたＰＯＲＯＳ－ＥＰゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物２８６を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物２８６は残存していないことが確認された。
　［実施例３２］　チアゾール誘導体のセンサーチップへの固定化
　化合物２８６を４ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解し、これを１０ｍＭホウ酸－１Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で８倍に希釈して０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の化合物溶液を調製した。ＢＩＡＣＯＲＥセンサーチップＣＭ５（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＢＩＡＣＯＲＥ２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に装着し、ＢＩＡＣＯＲＥアミンカップリングキット（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてセンサーチップＣＭ５上のカルボキシメチルデキストランをＮ－ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。これに前記０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の化合物２８６溶液を２５℃で５分間接触させることにより固定化を行なった。その後１Ｍ　モノエタノールアミン水溶液を用いて未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングを行なった。一連の固定化過程はセンサーチップＣＭ５表面のＳＰＲ共鳴単位（ＲＵ）の増加によってモニタリングした。
　［実施例３３］　ＢＩＡＣＯＲＥ（商品名）を用いた親和性解析
　実施例３２によって調製したリガンド－マトリックス複合体（化合物２８６を固定化したセンサーチップＣＭ５）に対して、ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（組成：１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，３ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．００５％　ＳＰ２０）で希釈したマウスＩｇＭ（１０μｇ／ｍＬ、試料Ａ）、マウスＩｇＧ（３２０μｇ／ｍＬ、試料Ｂ）、ニワトリＩｇＹ（４００μｇ／ｍＬ、試料Ｃ）、ウシ血清アルブミン（３２０μｇ／ｍＬ、試料Ｄ）をそれぞれ１２０秒間通液（結合相）し、その後２８０秒間ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液で置換（解離相）して親和性を解析した。またそれぞれの分析終了ごとに１０ｍＭ水酸化ナトリウムを８０秒間通液してセンサーチップＣＭ５の再生を行った。化合物２８６を固定化したセンサーチップＣＭ５のセンサーグラムを図２３に示す。また解離時間２４０秒後の残存ＲＵを表５４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000102
 　図２３及び表５４より、マウスＩｇＭ（試料Ａ）が他の試料（試料Ｂ、Ｃ、Ｄ）と比較し、化合物２８６を固定化したセンサーチップＣＭ５に対する親和性が高いことが示された。よって、化合物２８６を固定化したデキストランゲルが、マウスＩｇＭを特異的に吸着することが判明した。
　［実施例３４］　チアゾール誘導体のセルロースゲルへの固定化
　０．１Ｍ　Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ９．０）／アセトニトリル＝１／１の混合液を調製し、これを溶媒として、化合物４８６と水酸化ナトリウムとをそれぞれ４１ｍＭとなるように加えた。遠沈管に３．０ｍＬのセルファインホルミル（商品名）ゲル（チッソ社製、ホルミル基を１０から１５μｍｏｌ／ｍＬ含有）をとり、そこに前記の化合物４８６を含んだ溶液を５ｍＬ加え、卓上振盪機を用いて、３０分間、２５℃、１６０ｒｐｍで振盪した後、ボラン－ピリジン複合体（０．１７ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）を添加し、同じ条件で１６時間振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル５ｍＬで１回、次いで、洗浄液（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝４５／５５／０．０５）で５ｍＬずつ４回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：洗浄液と同じ組成、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物４８６を定量することによって、セルファインホルミルゲルに化合物４８６が５μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。
　［実施例３５］　チアゾール誘導体のアクリルアミド－ビニル共重合体ゲルへの固定化
　０．１Ｍ　Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ９．０）／アセトニトリル＝１／１の混合溶媒に、化合物４８６と水酸化ナトリウムとをそれぞれ４１ｍＭとなるように加えた。遠沈管に０．３ｇのＰｒｏｆｉｎｉｔｙ　Ｅｐｏｘｉｄｅ（商品名）ゲル（バイオラッド社製、エポキシ基を５０から１３２μｍｏｌ／ｇ含有）をとり、そこに前記の化合物４８６を含んだ溶液を５ｍＬ加え、卓上振盪機を用いて、１５時間、４０℃、１６０ｒｐｍで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル５ｍＬで１回、次いで、洗浄液（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝４５／５５／０．０５）で５ｍＬずつ４回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：洗浄液と同じ組成、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物４８６を定量することによって、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ　Ｅｐｏｘｉｄｅゲルに化合物４８６が４μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。
　［実施例３６］　チアゾール誘導体のシリカゲルへの固定化
　２－ヒドロキシ－３－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］プロパンスルホン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）／アセトニトリル＝１／１の混合溶媒に、化合物４８６と水酸化ナトリウムとをそれぞれ４１ｍＭとなるように加えた。遠沈管に１．３ｇのＭ．Ｓ．ＧＥＬ　Ｅｐｏｘｙ－Ｄ－５０－１０００ＡＷ（商品名、ＡＧＣエスアイテック社製、エポキシ基を７３μｍｏｌ／ｇ含有）をとり、そこに、６．１ｍＬの前記の溶液を加え、卓上振盪機を用いて、４日間、４０℃、１６０ｒｐｍで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル５ｍＬで１回、次いで、洗浄液（アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸＝４５／５５／０．０５）で５ｍＬずつ４回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー（カラム：東ソー社製　ＴＳＫ－ｇｅｌ　ＯＤＳ－８０ＴＭ（内径４．６ｍｍ×長さ１５ｃｍ）、溶離液：洗浄液と同じ組成、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出：ＵＶ　２５４ｎｍ）にて残存する化合物４８６を定量することによって、Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ　Ｅｐｏｘｙ－Ｄ－５０－１０００ＡＷに化合物４８６が２２μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）固定化されたことを確認した。
　［実施例３７］　４－メチル－Ｎ－［４－メチル－５－｛３－（２－プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミドのポリスチレンビーズへの固定化（その１）
　２００ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（１５９ｍｇ，１．６１ｍｍｏｌ）、ペンタメチルジエチレントリアミン（４１９ｍｇ，２．４２ｍｍｏｌ）、メタノール（１９．５ｍＬ）、及び２－ヒドロキシエチルメタクリレート（１９．５ｍＬ，１６１ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に１．４ｇのクロロメチル化ポリスチレンビーズ（渡辺化学工業社製、クロロメチル基含量：１．１５ｍｅｑ／ｇ）を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を４０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをメタノール（２００ｍＬ）で２回洗浄した後、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（１Ｌ）で３回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）修飾ポリスチレンビーズ（１８．４ｇ、グラフト率：１２００％）を得た。なおここでグラフト率は、
グラフト率＝（反応後のポリスチレンビーズ重量－反応前のポリスチレンビーズ重量）／（反応前のポリスチレンビーズ重量）
と定義する。
　次に５０ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（２２ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、１，４，８，１１－テトラメチル－１，４，８，１１－テトラアザテトラデカン（５６ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）、参考例２で合成した４－メチル－Ｎ－［４－メチル－５－｛３－（２－プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミド（５２５ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）、及び２－ブタノン／２－プロパノール＝７／３（ｖ／ｖ）の混合溶媒（３ｍＬ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に２．５ｇのポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）修飾ポリスチレンビーズを添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を６０℃で６３時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、エタノール（３００ｍＬ）で２回、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（３００ｍＬ）で２回、ＤＭＦ（２００ｍＬ）で１回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することでチアゾール誘導体が結合した薄茶色のポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）修飾ポリスチレンビーズ（２．６１ｇ）を得た。得られたポリスチレンビーズの重量増加分から計算した結果、グラフト鎖末端にチアゾール誘導体が平均２分子結合しており、その当量は０．１２ｍｅｑ／ｇであると見積られた。ＦＴ－ＩＲ，ν（ｃｍ－１，ｒｅｆｌｅｃｔ）：３４４０（ｂｒ，Ｏ－Ｈ），２９４９（ｗ），１７２０（ｓ，Ｃ＝Ｏ），１６３７（ｗ，Ｃ＝Ｏ），１４５０（ｍ），１２４３（ｍ），１１４９（ｓ），１０７４（ｓ）。
　［実施例３８］　４－メチル－Ｎ－［４－メチル－５－｛３－（２－プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミドのポリスチレンビーズへの固定化（その２）
　２００ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（５００ｍｇ，５．０ｍｍｏｌ）、ペンタメチルジエチレントリアミン（１．３０ｇ，７．５ｍｍｏｌ）、２－プロパノール（２２ｍＬ）、及びアクリルアミド水溶液（組成：１７．８ｇ／２２ｍＬ；２５０ｍｍｏｌ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に５．０ｇのクロロメチル化ポリスチレンビーズ（ペプチド研究所製、クロロメチル基含量：０．９７ｍｅｑ／ｇ）を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を８０℃で１８時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをエタノール（１５０ｍＬ）で洗浄した後、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（２００ｍＬ）で２回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズ（１２．３ｇ、グラフト率：１４６％）を得た。なおここでグラフト率は
グラフト率＝（反応後のポリスチレンビーズ重量－反応前のポリスチレンビーズ重量）／（反応前のポリスチレンビーズ重量）
と定義する。
　次に５０ｍＬのナス型フラスコに塩化銅（Ｉ）（６０ｍｇ，０．６０ｍｍｏｌ）、トリス（２－（ジメチルアミノ）エチル）アミン（２０８ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）、参考例２で合成した４－メチル－Ｎ－［４－メチル－５－｛３－（２－プロペニルカルボニルアミノ）プロピル｝チアゾール－２－イル］ベンズアミド（１．０７ｇ，３．０ｍｍｏｌ）、及び２－プロパノール／水＝２／１（ｖ／ｖ）の混合溶媒（３ｍＬ）を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に１．５ｇのポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズを添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を８０℃で８７時間撹拌した。反応終了後、反応溶液にエタノール（３０ｍＬ）及び５％アンモニア水（５ｍＬ）を添加し、室温で１時間撹拌した。次にポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、エタノール／５％アンモニア水＝９／１（ｖ／ｖ）（５０ｍＬ）で２回、ＤＭＦ（２５０ｍＬ）で１回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することでチアゾール誘導体が結合した薄緑色のポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズ（１．８４ｇ）を得た。得られたポリスチレンビーズの重量増加分から計算した結果、グラフト鎖末端にチアゾール誘導体が平均２分子結合しており、その当量は０．５２ｍｅｑ／ｇであると見積られた。ＦＴ－ＩＲ，ν（ｃｍ－１，ｒｅｆｌｅｃｔ）：３３３６（ｂｒ），２９２２（ｍ），１６５４（ｓ，Ｃ＝Ｏ），１６００（ｍ），１４９２（ｍ），１４５０（ｍ），１０２８（ｗ），７５６（ｍ），６９８（ｓ）。
　本発明のチアゾール誘導体はタンパク質、特に免疫グロブリンの分析および精製用低分子リガンドとして有用であり、また、上記チアゾール誘導体をマトリックスに結合させた本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスは、医療用タンパク質、特に免疫グロブリンの工業的な精製において極めて有用であり、産業上の利用可能性は極めて高い。

　なお、２００８年３月１２日に出願された日本特許出願２００８－０６３３６４号、２００８年３月１３日に出願された日本特許出願２００８－０６４２６９号、２００８年１２月１１日に出願された日本特許出願２００８－３１６２１０号、２００９年１月１５日に出願された日本特許出願２００９－００７０９３号及び２００９年１月１５日に出願された日本特許出願２００９－００７０９４号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (15)

  1. 　　一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ｒ３はフタルイミド基、アミノ基又はアンモニウム塩であることを表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表す。）で表されるチアゾール誘導体。
  2. 　Ａｒの置換基が、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基又はシアノ基である請求項１に記載のチアゾール誘導体。
  3. 　Ａｒが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基及びシアノ基からなる群より選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい芳香族基である請求項１に記載のチアゾール誘導体。
  4. 　一般式（２）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｙは脱離基を表す。）で表されるフタルイミド誘導体と、一般式（３）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ２及びＡｒは前記と同じ意味を表す。）で表されるアシルチオウレア誘導体を反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体の製造方法。
  5. 　　一般式（４）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式中、Ｒ１、Ｒ２及びｎは前記と同じ意味を表す。）で表されるチアゾール誘導体と一般式（５）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （式中、Ａｒは前記と同じ意味を表し、Ｗはハロゲン原子を表す。）で示される酸ハロゲン化物を塩基存在下にて反応させることを特徴とする、一般式（１ａ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体の製造方法。
  6. 　　一般式（１ａ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）で表されるチアゾール誘導体を塩基によって処理し、一般式（１ａ’）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表す。）を得た後、酸によって処理することを特徴とする、一般式（１ａ’’）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｚ－は共役塩基を表す。）で示されるチアゾール誘導体の製造方法。
  7. 一般式（６） 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     （式中、Ｒ１及びＲ２は水素原子又は置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基を表し、Ａｒは置換されていてもよい芳香族基を表し、ｎは１から１２の整数を表し、Ｍはマトリックスを表す。）で表されるチアゾール誘導体固定化マトリックス。
  8. 　Ａｒの置換基が、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基、又はシアノ基である請求項７に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
  9. 　Ａｒが、ハロゲン原子、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から８のシクロアルコキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルケニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数３から６のアルキニルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアシルオキシ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルチオ基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルフィニル基、置換されていてもよい炭素数１から６のアルキルスルホニル基、置換されていてもよい炭素数１から１２のアルコキシカルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、置換されていてもよいアミノ基、水酸基及びシアノ基からなる群より選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい芳香族基である請求項７に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
  10. 　Ｍのマトリックスが、ビニルポリマー、アガロース、キトサン、デキストラン、セルロース、シリカ、ポリスチレンのいずれかであることを特徴とする、請求項７～９のいずれかに記載のチアゾール誘導体固定化マトリックス。
  11. 　一般式（１’）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ及びｎは前記と同じ意味を表し、Ｒ3ａはアミノ基又はアンモニウム塩を表す。）で示されるチアゾール誘導体と、活性化基含有マトリックスとを反応させることを特徴とする、一般式（６）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法。
  12. 　活性化基含有マトリックスの活性化基が、スクシンイミドオキシカルボニル基、エポキシ基、ホルミル基、２，２，２－トリフルオロエチルスルホニル基、カルボキシル基のいずれかであることを特徴とする請求項１１に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法。
  13. 一般式（６）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａｒ、ｎ及びＭは前記と同じ意味を表す。）で示されるチアゾール誘導体固定化マトリックスを使用し、タンパク質の分析または精製を行なう方法。
  14. 　タンパク質が免疫グロブリン、またはこれらの類縁体、フラグメント、融合体であることを特徴とする、請求項１3に記載の方法。
  15. 　免疫グロブリンが免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）であることを特徴とする、請求項１4に記載の方法。
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