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WO2008145708A2 - Aromatische alkohole zur behandlung einer biologischen probe - Google Patents

Aromatische alkohole zur behandlung einer biologischen probe Download PDF

Info

Publication number
WO2008145708A2
WO2008145708A2 PCT/EP2008/056644 EP2008056644W WO2008145708A2 WO 2008145708 A2 WO2008145708 A2 WO 2008145708A2 EP 2008056644 W EP2008056644 W EP 2008056644W WO 2008145708 A2 WO2008145708 A2 WO 2008145708A2
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WO
WIPO (PCT)
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biological sample
composition
weight
samples
frozen
Prior art date
Application number
PCT/EP2008/056644
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2008145708A3 (de
Inventor
Vera HOLLÄNDER
Original Assignee
Qiagen Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen Gmbh filed Critical Qiagen Gmbh
Publication of WO2008145708A2 publication Critical patent/WO2008145708A2/de
Publication of WO2008145708A3 publication Critical patent/WO2008145708A3/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for the treatment, in particular for the stabilization and / or preservation of a biological sample, the treated biological sample obtainable by this method, the use of an aromatic alcohol, the use of a composition and a kit.
  • nucleic acid and protein analysis have already been used in many areas, for example in medical and clinical diagnostics, in pharmacy, in the development and evaluation of pharmaceuticals, in food analysis and in the monitoring of food production, in agriculture in the cultivation of crops and Livestock, in forensics, in environmental analysis and in many other research areas.
  • RNA patterns transcription patterns
  • PCR real-time reverse transcriptase PCR
  • gene expression chip analyzes, for example, enable recognition of incorrectly expressed genes Genes, which cause, for example, metabolic diseases th, infections or the development of cancer can be detected.
  • Analysis of the DNA from cells by molecular biological methods such as PCR, RFLP, AFLP or by sequencing allows, for example, the detection of genetic defects or the determination of the HLA type and other genetic markers.
  • the analysis of genomic DNA and RNA is also used for the direct detection of infectious agents, such as viruses, bacteria, etc.
  • nucleic acid status of a biological sample changes the more, the more time passes between the taking of the sample and its analysis. Particularly fast is the degradation of ribonucleic acids (RNA) by ubiquitous RNases. Likewise, in addition to the degradation of nucleic acids, it also leads to the induction of, for example, stress genes and thus to the synthesis of new mRNA molecules, which also greatly alter the transcript pattern of the sample. Therefore, it is necessary to perform an immediate stabilization of the sample to obtain the gene expression profile to be examined. The same applies if a frozen biological sample is used for the purpose of thawed. Again, after thawing, there is a rapid change in nucleic acid status, particularly by degradation of biomolecules.
  • RNA ribonucleic acids
  • the stabilization in order to completely preserve the expression pattern in the biological sample at the time of sampling, the stabilization must begin as soon as possible after the addition of the solution, without prior pretreatment of the sample.
  • the stabilization of nucleic acids in compact tissue samples results in comparison to other biological samples a particular difficulty. Tissues are complex and heterogeneous in composition, ingredients and construction.
  • the effect of the stabilizing reagent not only has to unfold on the surface of the cells or within a cell layer, but must also act deep within the multilayered sample material.
  • tissue and / or cell types frequently have to be addressed within one and the same biological sample, for example in the cell structure, the membrane structure, the compartmentalizations and the biomolecules, for example with regard to the proteins, the carbohydrates and / or the fat content, differ.
  • fixation or stabilization reagents or methods for fixation or stabilization have been developed. wound to stabilize a wide range of different biological samples.
  • the freezing of biological samples has long been known.
  • the sample is immediately after removal from their natural environment at -80 0 C or lower, z. B. in liquid nitrogen, frozen.
  • the thus treated sample can then be stored almost indefinitely without changes in the integrity at about -70 0 C.
  • tissue structures as well as cellular and subcellular structures must be preserved in their morphological appearance during storage.
  • fixation by means of formalin and optionally the subsequent embedding of the fixed samples in paraffin has long been known.
  • stabilizing reagents include, for example, cationic detergents (US 5,010,184, US 5,300,545, WO-A-02/00599 and WO-A-02/00600) or highly concentrated ammonium sulfate solutions as described in US 6,204,375.
  • the disadvantage of the stabilization processes known from the prior art is that either the stabilization of biomolecules such as nucleic acids in the biological samples is unsatisfactory and, in particular, the yield of these biomolecules from the conventionally stabilized samples is often only low and / or Morphology of the samples is not sufficiently preserved.
  • this stabilization process requires very complicated, logistical preconditions, since thawing of the samples during transport, storage or during a wide variety of application or use processes must be prevented.
  • the use of liquid nitrogen is not only very cumbersome, but only under special precautions feasible.
  • transition solutions are known from the prior art.
  • the frozen tissue is transferred into a pre-cooled to -70 0 C to -80 0 C solutions and then stored therein for a few hours (at least 16 hours) at about -20 0 C.
  • the sample impregnated with the transition solution can then be heated to working temperatures of from -4 ° C. to room temperature only for a short period of time, for example at most for dividing the sample, without the nucleic acid status of the sample changing.
  • Such transition solutions known for example from WO-A-2004/72270, consist primarily of monohydric alcohols.
  • the present invention has for its object to overcome the disadvantages resulting from the prior art.
  • the object of the present invention was to provide a method for the treatment, in particular for the stabilization and / or preservation, of a biological sample, preferably for the stabilization of a biological sample, with which biomolecules, such as nucleic acids, proteins and metabolites, in which biological sample can be better stabilized.
  • biomolecules such as nucleic acids, proteins and metabolites
  • the object of the present invention was to provide a method for the treatment, in particular for the stabilization and / or preservation, of a biological sample, preferably for the stabilization of a biological sample, with which biomolecules, such as nucleic acids, proteins and metabolites, in which biological sample can be better stabilized.
  • biomolecules such as nucleic acids, proteins and metabolites
  • the present invention has the object to provide a method for stabilizing a biological sample, with both frozen and fresh biological samples at moderate temperature conditions, for example, at room temperature, are stabilized without affecting the expression profile or the proteome of the biological sample can.
  • the method for the treatment preferably for the stabilization of a biological sample should lead to a treated, preferably stabilized biological sample which can be analyzed not only at moderate temperatures, for example at room temperature, but optionally before or after such an analysis for as long as possible can be stored at such moderate temperature conditions.
  • stabilization should preferably be understood to mean the inhibition of the degradation, modification, induction or change in the activity of biomolecules.
  • stabilization should be used.
  • the prevention of a significant change in the morphology of the samples are understood.
  • composition comprising
  • the solvent other than an aromatic alcohol may preferably be an organic solvent.
  • compositions comprising at least one aromatic alcohol as an additive, biomolecules, such as nucleic acids, proteins or metabolites, can be better stabilized in the biological sample.
  • the aromatic alcohol compositions are superior to the corresponding compositions without the aromatic alcohol a better stabilizing ability of biomolecules in a biological sample, in particular by an improved stabilization capacity for nucleic acids.
  • the biological sample provided in method step i) can be a frozen or non-frozen biological sample, it being possible to use as biological sample all biological samples known to the person skilled in the art.
  • Preferred biological samples are selected from the group comprising biomolecules, for example natural, preferably isolated, linear, branched or circular nucleic acids such as RNA, in particular mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA or ribozymes, DNA and the like, synthetic or modified nucleic acids, for example Oligonucleotides, in particular primers, probes or standards used for the PCR, nucleic acids labeled with digoxigenin, biotin or fluorescent dyes or so-called peptide nucleic acids, natural, preferably isolated proteins or oligopeptides, synthetic or modified proteins or oligopeptides For example, antibodies coupled with fluorescent labels or enzymes, hormones, metabolites and metabolites, growth factors, lipids, oligosaccharides, polysaccharides
  • a fresh biological sample is preferably understood to be a sample which, before it is brought into contact with the composition described above in process step ii), is not more than 96 hours, preferably not more than 48 hours preferably not more than 24 hours, moreover preferably not more than 10 hours, moreover preferably not more than 60 minutes, and most preferably not more than 10 minutes before or, in the case of a synthetic biomolecule, synthesized
  • the term "fresh" biological sample also includes those samples which have been taken within the abovementioned periods but which have been pretreated before being brought into contact with the composition, for example with conventional fixatives such as formalin.
  • the preparation of fresh cell or tissue samples can be carried out by all the skilled person for this purpose preparation method, in the case of a tissue sample, for example by means of a scalpel, such as surgery or autopsy, in the case of a blood cell sample by centrifugation of fresh blood and the like.
  • a fresh biological Sample serves the composition containing the aromatic alcohol as an additive primarily as a stabilizing composition.
  • method step i) of the method according to the invention preferably uses a biological sample which, after having been isolated, for example, in the manner described above, prior to contacting with the composition described above in method step ii ) are initially at a temperature of 0 0 C or less, preferably to temperatures from -20 0 C or less, and most forthcoming Trains t to temperatures from -70 0 C or less, for example by bringing into contact with liquid nitrogen, was cooled , If a biological sample frozen in this way is used in the process according to the invention, the composition comprising the aromatic alcohol as an additive serves primarily as a transition reagent or as a transition composition.
  • the biological sample is a sample containing cells, such as tissue
  • this biological sample be in the un-lysed state.
  • un-lysed it is meant that the cells have not been lysed by mechanical stress, by treatment by proteases, or by contact with reagents which result in the lysis of cells, for example, by contact with detergents. Any pretreatment of the sample, such as lysis, prior to stabilization would lead to a time delay during which the biomolecule profile of the biological samples is not conserved and thus can be altered.
  • the biological sample having the above-described composition comprising at least one aromatic alcohol, min. at least one solvent other than this aromatic alcohol and optionally one or more additives are brought into contact.
  • the aromatic alcohol (a) is preferably one or more phenol derivatives.
  • Phenol, benzyl alcohol (phenylmethanol), 1, 2-dihydroxibenzol (brenzcachite), 1,3-dihydroxybenzene (resorcinol), 1, 4-dihydroxibenzol (hydroquinone), 1, 4-naphthohydroquinone belong to this group in particular.
  • 2,4,6-trinitrophenol (picric acid), primary phenylethyl alcohol, secondary phenylethyl alcohol, phenylpropyl alcohol, o-tolyl alcohol, p-tolyl alcohol, cumene alcohol, 4-hydroxybenzoic acid, 4-hydroxysulfonic acid, p-nitrophenol, m-, o- or p Alkylphenol, preferably m-, o- or p-methylphenol (cresol) or m-, o- or p-ethylphenol, m-, o- or p-halophenol, preferably m-, o- or p-chlorophenol or m- , o- or p-bromophenol, or mixtures of at least two of these substances. Phenol is the most preferred of all of these.
  • the solvent (b) may be any solvent, including solvents, which may be commonly used for the treatment, in particular for the stabilization of biological samples.
  • the solvent is a solvent selected from the group consisting of water, monohydric, non-aromatic alcohols (monools), polyhydric, non-aromatic alcohols, aldehydes, ketones, dimethyl sulfoxide, aromatic hydrocarbons, halogenated hydrocarbons, ethers, carboxylic acids, carboxylic acid amides, nitriles, Nitroalkanes, esters or mixtures of at least two of these solvents.
  • solvents selected from the group comprising methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1, 2-propanediol, 1,3-propanediol, 1, 2-butanediol, 1,3-butanediol, 1 , 4- Butanediol, 1,5-pentanediol, 2,4-pentanediol, ethylene glycol, propylene glycol, diethylene glycol, dipropylene glycol, triethylene glycol, tripropylene glycol, 1,2,3-propanetriol, 1,2,6-hexanetriol, 3-methyl-1, 3,5-pentane-triol, 1,2,4-butanetriol, ethylene glycol, propylene glycol, 1,2,3-propanetriol, 1,2,6-hexanetriol, 3-methyl-1,3,5-pentanetriol, acetonitrile, Acetone, anisole, benzonitrile,
  • the additive (c), which may optionally be included in the composition, may be any additive normally included in compositions for the treatment, in particular for the stabilization of biological samples.
  • Preferred additives are selected from the group comprising salts, such as, for example, ammonium sulfite, ammonium sulfate, cesium sulfate, lithium nitrate, sodium acetate, potassium acetate, sodium chloride, potassium chloride or calcium chloride, osmotically active substances, such as mannitol, detergents, inhibitors which inhibit the degradation of nucleic acids inhibit or proteins, such as the protease Inihibor PMSF or the commercially available products ANTI-RNase (Ambion, St.
  • salts such as, for example, ammonium sulfite, ammonium sulfate, cesium sulfate, lithium nitrate, sodium acetate, potassium acetate, sodium chloride, potassium chloride or calcium chloride
  • osmotically active substances such
  • RNAsecure ® (Ambion) or DEPC
  • alkylating agents alkylating agents, acetylating, halogenation intermediates, nucleotides, nucleotide analogues, amino acids, amino acid analogues, betaine, viscosity regulators, dyes, in particular dyes for the specific staining of specific cell structures, buffer compounds, for example MES, HEPES, MOPS or TRIS, preservatives, complexing agents, such as EDTA or EGTA, Reducing agents, such as, for example, 2-mercaptoethanol, dithiothreitol (DTT), pteridine hydrosulfide, ascorbic acid, NADPH, tricarboxyethylphosphine (TCEP) and hexamethylphosphoric triamide (Me2N) 3P, oxidizing agents, such as 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), substances which improve the permeability of cells,
  • the amount of water should be kept so low that the composition does not lysing when in contact with a biological sample, in particular with a cell-containing biological sample.
  • the aromatic alcohol is phenol
  • the amount of water in the composition is less than 50% by weight, more preferably less than 40% by weight, even more preferably less than 30% % By weight, more preferably less than 20% by weight, even more preferably less than 10% by weight, and most preferably less than 5% by weight, based in each case on the total weight of the composition.
  • the preparation of the composition from the solvent, the aromatic alcohol and optionally the additive is preferably carried out by simple mixing the components. If one of the components has a melting point above room temperature, it may be preferable to heat this component to the melting point and then to mix it with the other components. However, it is also conceivable that if one of the components is solid in the preparation of the composition and another component in liquid form, the solid component in the liquid component to solve.
  • a solid additive may be dissolved in a liquid mixture of solvent and aromatic phenol or solid phenol in a liquid solvent.
  • the contacting of the composition with the biological sample in method step ii) is preferably carried out in the case of a liquid composition by immersing the biological sample in the composition so that the entire sample can be impregnated by the composition.
  • a biological sample a fluid or isolated cells or z.
  • a granular sample it is contacted by mixing the biological sample with the composition or suspending the biological sample in the composition.
  • the bringing into contact the biological sample with composition at a temperature in the range from -80 0 C to +80 0 C, preferably in a range from 0 0 C to +80 0 C, more preferably in a range of 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 ° C to +80 0 C and moreover preferably in a range of 18 ° C to +80 0 C, for example at a temperature of at least -20 0 C, -19 ° C, -18 ° C, -17 ° C, -16 ° C, -15 ° C, -14 ° C, -13 ° C, -12 ° C, -I TC, -10 0 C, -9 ° C, -8 ° C, -TC, -6 ° C, -5 ° C, -4 ° C, -3 ° C - 2 ° C, -1 ° C, 0 0 C, 1 ° C, 2 ° C, 3 ° C, 4
  • the wording that "contacting the biological sample with composition at a temperature in the range from -80 0 C to +80 0 C” or is effected at one of the other above-mentioned temperatures that bringing into contact according to the the biological sample, the temperature of the mixture thus obtained within the above-mentioned temperatures with the composition for example, it may be that as the biological material is a deep-frozen to temperatures of less than -20 0 C sample, for example a stored in liquid nitrogen Sample, is used, in which case such an amount of composition at a temperature is used that after contacting the frozen biological sample with the composition, the temperature of the mixture (and thus the temperature of the biological sample) in the above mentioned temperature range is.
  • the biological sample may also be preferred for the biological sample to be in contact with the composition in process step ii), preferably under the abovementioned temperature conditions, or in a process subsequent to process step ii) step iii) at a temperature in the range from -80 0 C to +80 0 C, preferably in a range from 0 0 C to +80 0 C, more preferably in a range of 2, 3, 4, 5, 6 , 7 or 8 ° C to +80 0 C and moreover preferably in a range of 18 ° C to +80 0 C, for example at a temperature of at least -20 0 C, -19 ° C, -18 ° C, - 17 ° C, -16 ° C, -15 ° C, -14 ° C, -13 ° C, -12 ° C, -11 ° C, -10 0 C, -9 ° C, -8 ° C, -TC, -6 ° C
  • the method of the present invention allows for the storage of a treated biological sample at refrigerator temperatures, at room temperature or at even higher temperatures, without causing any detectable degradation of biomolecules such as nucleic acids or proteins in the biological sample.
  • This represents a significant advantage over conventional stabilization methods, since the process can be carried out without the use of liquid nitrogen or freezers and the stabilized sample can be stored without the use of liquid nitrogen or freezers.
  • the samples can of course, as is common practice, even at low temperatures, for example at -20 0 C or -8O 0 C, be stored, but this is not mandatory.
  • the treated biological sample can also be embedded in suitable embedding means, for example in paraffin or the like, in order then to be able to make tissue sections from the biological sample more suitable for histological examinations.
  • suitable embedding means for example in paraffin or the like, in order then to be able to make tissue sections from the biological sample more suitable for histological examinations.
  • this method step iv) may optionally be carried out before or after storage according to the method step iii) described above.
  • a histological examination is preferably understood to mean any examination method which is suitable for analyzing the morphological state of a tissue, a tissue section, a cell or subcellular structures, for example by means of microscopy and optionally using staining or labeling techniques known to the person skilled in the art.
  • Suitable biomolecules which can be analyzed are all biomolecules known to the person skilled in the art, in particular natural, modified or synthetic nucleic acids, natural, modified or synthetic proteins or oligopeptides, hormones, growth factors, substrates of metabolism, metabolites, lipids, oligosaccharides or proteoglucans.
  • Suitable nucleic acids are all nucleic acids known to the skilled worker, in particular ribonucleic acids (RNA), for example mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, t-RNA, hnRNA or ribozymes, or deoxyribonucleic acids (DNA).
  • RNA ribonucleic acids
  • the nucleic acid may be single, double or multi-stranded, linear, branched or circular. It may correspond to a molecule occurring in a cell, such as genomic DNA or messenger RNA (mRNA), or generated in vitro, such as complement DNA (cDNA), counterstrand RNA (aRNA), or synthetic nucleic acids.
  • mRNA messenger RNA
  • aRNA counterstrand RNA
  • the nucleic acid may consist of a few subunits, at least two subunits, preferably eight or more subunits, such as oligonucleotides, several hundred subunits to several thousand subunits, such as certain expression vectors, or significantly more subunits, such as genomic DNA.
  • the nucleic acid contains the coding information for a polypeptide in functional association with regulatory sequences that allow expression of the polypeptide in the cell into which the nucleic acid is introduced or naturally present.
  • the nucleic acid is an expression vector.
  • siRNA RNA-induced silencing complex
  • biomolecules are proteins and nucleic acids, with nucleic acids being particularly preferred and RNAs being most preferred.
  • analysis of biomolecules in or from the biological sample contacted with the composition means that the analysis can be done both in situ and ex situ, eg after isolation of the biomolecules from the biological sample it can be isolated from a biological sample for the purpose of analysis be advantageous, especially in the case of cells, tissues or other complex or compact samples to homogenize the samples first, this homogenization by mechanical means, for example by means of cannulas, mortars, rotor-stator homogenizers, a ball mill or the like, by chemical means the use of suitable lysis buffer, which usually include detergents and / or chaotropic substances, can be carried out enzymatically, for example using proteases, or by a combination of these measures.
  • a further contribution to achieving the object stated at the outset is also provided by the use of an aromatic alcohol, preferably of phenol derivatives, more preferably of phenol, in a composition for treating a frozen or unfrozen biological sample according to the method described above.
  • aromatic alcohol preferably of phenol derivatives, more preferably of phenol
  • aromatic alcohols and biological samples of those aromatic alcohols or biological samples are preferred, which have already been mentioned in the beginning in connection with the inventive method.
  • RNAs for the treatment of a biological sample
  • biomolecules such as nucleic acids, proteins or metabolites
  • more preferably of nucleic acids and proteins most preferably of nucleic acids and especially preferred of RNAs, such as mRNAs
  • solvents, aromatic alcohols and additives preference being given as solvents, aromatic alcohols and additives to those compounds which have already been described as preferred embodiments in connection with the process according to the invention.
  • the reagents for analyzing biomolecules in or from a biological sample or for analyzing the morphology of a biological sample may be basically all reagents known to those skilled in the art, which can be used for or in the morphological analysis of a biological sample or for or in the analysis of biomolecules in or from a biological sample.
  • reagents include, in particular, dyes for staining cells or cell components, antibodies optionally labeled with fluorescent dyes or enzymes, an absorption matrix such as DEAE cellulose or a silica membrane, substrates for enzymes, agarose gels, polyacrylamide gels, solvents such as ethanol, chaotropic reagents or phenol, aqueous buffer solutions, RNase-free water, lysis reagents, alcoholic solutions and the like.
  • kits according to the invention as a component, for example, at least one device (c), for example in the form of a sealable vessel, for collecting or receiving a solid or liquid biological sample.
  • the device (c) may optionally contain the composition before collection or uptake of the biological sample.
  • the device may be any vessel known to those skilled in the art for collecting or receiving a solid or liquid biological sample.
  • Preferred vessels are, for example, Falcon tubes, Eppendorf tubes, Greiner tubes, or one of those disclosed in US Pat. Nos. 6,602,718, US 2004/0043505 A1, US 2005/0160701 A1, US 2003/0086830 A1, US Pat.
  • a device for the collection or uptake of a solid or liquid biological sample the device optionally comprising, prior to collection or uptake of the biological sample, at least one of the (a) compounds or a composition comprising at least one compound mentioned under (a) may contain.
  • kit according to the invention may contain the above-described components (a), (b) and (c).
  • FIG. 1 shows the Western blot obtained in example 3.
  • FIG. 2 shows a 1% formaldehyde-agarose MOPS gel in which the samples from Example 6 were applied.
  • FIG. 3 shows a 1% formaldehyde-agarose MOPS gel in which the samples from example 8 were applied.
  • FIG. 4 shows a 1% formaldehyde-agarose MOPS gel in which the samples from Example 5 were applied.
  • Kidney tissue of the rat was immediately after organ removal with 500 ul 30% phenol in DMSO added and stored at different temperatures (see Table 1). Following storage, the RNA is isolated from the stored samples.
  • RNA isolation the tissue is removed after storage from the solutions and per 5 mg tissue 500 ul of a commercial guanidinium isothiocyanate buffer such.
  • B. RLT buffer the company QIAGEN admit.
  • the sample is removed by means of a ball mill, such.
  • RNA remains bound to the membrane and is subsequently washed with a first commercial guanidinium isothiocyanate-containing wash buffer, for example with the buffer RWI from QIAGEN.
  • RNA For elution, 50 ⁇ l of RNase-free water are pipetted onto the membrane to detach the purified RNA from the membrane. After incubation for 1 min at a temperature in the range 10-30 0 C, the eluate is collected by centrifugation (1 min at 10,000 ⁇ g) passed through the membrane and the elution step is repeated once more to complete the elution.
  • the amount of total isolated RN A is determined after dilution in water by photometric measurement of light absorption at a wavelength of 260 nm.
  • the quality of the RNA thus obtained is determined by the photometric determination of the ratio of light absorption at 260 nm to that at 280 nm.
  • the results of the insulations are shown in Table 1.
  • RNA is stabilized in biological samples by a composition according to the invention. 2. Stabilization of DNA in biological samples in the presence of phenol
  • Kidney tissue of the rat was immediately after organ removal with 500 ul of 30% phenol in DMSO added and stored at different temperatures (see Table 2). Following storage, the DNA is isolated from the stored samples.
  • tissue is removed after storage from the solutions and each 10 mg of tissue in 180 ul of the buffer ALT manufacturer QIAGEN add.
  • the sample is removed by means of a ball mill, such.
  • 120 .mu.l of the protease K solution manufactured by manufacturer QIAGEN
  • the lysates are incubated for 2 hours at 55 ° C. with shaking. After incubation add 4 ⁇ l RNAse A (100 mg / ml), mix and incubate the mixture for 2 min at room temperature.
  • a commercially available guanidinium hydrochloride-containing lysis buffer such as the buffer AL of the manufacturer QIAGEN
  • the samples are mixed by vortexing. There is an incubation at 70 0 C for 10 min.
  • the samples are applied to a 96-well plate (DNeasy 96-plate from QIAGEN) containing silica, and the lysate is passed through the membrane for 10 min at 6000 rpm by centrifugation.
  • the DNA remains bound to the membrane and is first washed with a first commercially available guanidinium hydrochloride-containing wash buffer, for example with the buffer AWI from QIAGEN, and then with a second alcohol-containing wash buffer, z. B. buffer AW2 from QIAGEN, washed.
  • the wash buffers are in each case passed through the membrane by centrifugation (5 min at 6000 rpm). Subsequently, the plate is incubated for 10 min at 70 0 C.
  • the elution of the DNA is carried out by application of 200 ⁇ l of the at 70 0 C warmed elution buffer AE (QIAGEN). After a one minute incubation, the elution buffer is passed through the membrane by centrifugation (5 min at 6000 rpm) and the elution is repeated.
  • the amount of isolated total DNA is determined after dilution in water by photometric measurement of light absorption at a wavelength of 260 nm.
  • the quality of the DNA thus obtained is determined by the photometric determination of the ratio of light absorption at 260 nm to that at 280 nm.
  • the results of the insulations are shown in Table 2.
  • Rat liver tissue was immediately after removal of organs with 1 ml of 30% phenol in DMSO (Probel) or PBS (as a negative control, sample 2) and stored for 3 days at 25 0 C in the incubator. Following storage, a protein extract is prepared from the stored samples. For positive control (sample 3) liver tissue is used, which after removal from the rat frozen directly in liquid nitrogen and then stored at -80 0 C.
  • the tissue is removed from the solutions after storage and 10 mg of tissue, 400 .mu.l of a conventional extraction buffer, here in a composition of 8 M urea, 100 mM sodium dihydrogen phosphate and 10 mM Tris, pH 8.0, and the sample by means of a ball mill, z. B. the Tissue Lyzer QIAGEN, homogenized.
  • the resulting lysate is centrifuged for 15 s at the highest possible speed (eg about 20,000 x g) in order to pellet undissolved constituents.
  • the proteinaceous supernatant is removed and the protein concentration is determined by means of a Bradford test.
  • 1.5 ⁇ g protein in each case is separated on an SDS-polyacrylamide gel according to the customary method and blotted to a nitrocellulose membrane by means of a mid-blotting apparatus according to the manufacturer's instructions.
  • the membrane is saturated with milk powder according to the prior art and with an ERK2-specific antibody, eg. B. the company QIAGEN, hybridized according to the manufacturer, and carried out an immunodetection. The results are shown in FIG.
  • a specific protein in this case a kinase, demonstrates that the proteins are stabilized by the phenol-containing solution at room temperature.
  • Liver and kidney tissue of the rat was immediately after organ removal with 1 ml of 30% phenol dissolved in DMSO and stored for 1 day at 25 ° C in the incubator. After storage: the tissue pieces are removed from the solutions, transferred to plastic cassettes and incubated according to standard protocols in an ascending ethanol series, as well as in xylene and embedded in paraffin. Using a microtome, sections are made from the paraffin-embedded tissue and subjected to hematoxylin-eosin staining on the slide by conventional methods. The stained tissue sections are examined by light microscopy, whereby it can be seen that the solution makes it possible to preserve the morphology of the tissue.
  • Liver tissue from rat which remain frozen after removal in liquid nitrogen and stored at -70 0 C, is used for this experiment.
  • 20 to 50 mg of tissue are weighed and frozen with various non-cooled (room temperature) treatment compositions (see Table 3) are added and stored for 3 days at 25 0 C.
  • the RNA is isolated from the stored samples.
  • the tissue is removed after storage from the treatment solutions and each 10 mg tissue 350 ul of a commercial guanidinium isothiocyanate buffer such.
  • B. RLT buffer the company QIAGEN admit.
  • the sample is removed by means of a ball mill, such.
  • B. MM300 QIAGEN homogenized over a period of 2 x 2 min at 20 Hz with a 5 mm steel ball, the guanidinium isothiocyanate buffer on known from the prior art, the cells lysiert and denature the liberated proteins , Subsequently, the lysates are centrifuged at 14000 rpm for 3 min. From the supernatant, two portions of 350 ⁇ l each, corresponding to 10 mg of tissue, are removed.
  • RNA remains bound to the membrane and is subsequently treated with a first commercially available guanidinium isothiocyanate-containing washing buffer, for example with the buffer RWI from QIAGEN, and then with a second Tris-containing or tris and alcohol-containing washing buffer, eg. B. Buffer RPE from QIAGEN, washed.
  • a first commercially available guanidinium isothiocyanate-containing washing buffer for example with the buffer RWI from QIAGEN
  • a second Tris-containing or tris and alcohol-containing washing buffer eg. B. Buffer RPE from QIAGEN
  • the wash buffers are in each case passed through the membrane by centrifugation (1 min at 10,000 ⁇ g).
  • the washing with the second Tris-containing or alcoholic washing buffer is repeated with a smaller volume, while the membrane is simultaneously dried by centrifugation (2 min at 20,000 ⁇ g).
  • 40 ⁇ l of RNase-free water are pipetted onto the membrane to detach the purified RNA from the membrane.
  • the eluate is passed through the membrane by centrifugation (1 min at 10,000 xg) and the elution step is repeated again for the purpose of complete elution.
  • RNA is analyzed on a 1.0% formaldehyde-agarose MOPS gel stained with ethidium bromide. The result is shown in FIG.
  • Table 3 and FIG. 4 show that phenol is also present in transit compositions has a positive influence on the stabilization of biomolecules such as RNA in biological samples.
  • Liver or kidney tissue of the rat which was frozen after removal in liquid nitrogen and stored at -70 0 C, is for this experiment verwen- det.
  • 20 to 50 mg of tissue are weighed and frozen with various non-cooled treatment compositions (solutions used, see Table 4) and stored at 25 ° C. for 3 days.
  • the RNA is isolated from the stored samples as described in Example 5.
  • the isolated RNA is analyzed on agarose gels stained with ethidium bromide. For example, 1.0% formaldehyde-agarose MOPS gel is prepared for this purpose. In each case 5 .mu.l of the eluate are used. The result is shown in FIG.
  • phenol has various organic properties
  • Solvents also have a positive influence on the stabilization of RNA in a transition composition.
  • Rat liver tissue which froze after removal in liquid nitrogen and stored at -70 0 C, is used for this experiment.
  • 20 to 50 mg of tissue are weighed and frozen mixed with 1 ml each of a non-cooled solution of 25% phenol and 75% DMSO and various additives (solutions used, see Table 5).
  • 950 .mu.l of the phenol-DMSO solution are mixed with 50 .mu.l of each 1 M additives, so that the final concentration of the additives is 50 mM each.
  • DTT as an additive
  • 944.5 ⁇ l of the phenol-DMSO solution are mixed with 55.5 ⁇ l of a 0.9 M DTT solution, so that here too the final additive concentration is 50 mM.
  • 1 ml of the phenol-DSMO solution is used without addition of additive.
  • the samples are stored for 3 days at 25 0 C. Following the transition and storage, the RNA is isolated from the stored samples as described in Example 5. The result is also shown in Table 5.
  • Table 5 also shows that the stabilizing properties of phenol can also be further improved in transition compositions by the addition of certain additives.
  • Liver tissue of the rat which frozen in liquid nitrogen after removal and stored at -70 0 C, is used for this experiment.
  • 20 to 50 mg of tissue are weighed and frozen with a solution of 30% phenol, dissolved in DMSO, pre-cooled to 2 ° C to 8 ° C in the refrigerator.
  • the samples are stored overnight at 2 ° -8 ° C in the refrigerator.
  • the samples are removed from the transition composition and stored dry at room temperature for 30 minutes, 45 minutes, 60 minutes, 90 minutes, 2 hours 30 minutes and 4 hours 30 minutes. Subsequently, the RNA is isolated as described in Example 1.
  • the isolated RNA is analyzed on agarose gels stained with ethidium bromide as described in Example 6. The result is shown in FIG.
  • Rat liver tissue was immediately imbibed with ImI of various compositions (see Table 6) after organ removal and stored in the refrigerator at 2-8 ° C for 3 days. Following storage, the RNA is isolated from the stored samples as described in Example 5. The result is also shown in Table 6.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierung und/oder Konservierung einer biologischen Probe, umfassend die Verfahrensschritte: i) Bereitstellen einer biologischen Probe, und ii) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit einer Zusammensetzung (a) 1 bis 90 Gew.-% mindestens eines aromatischen Alkohols, (b) 10 bis 99 Gew.-% mindestens eines von einem aromatischen Alkohol verschiedenen Lösungsmittels, sowie (c) 0 bis 89 Gew.-% mindestens eines von den Komponenten (a) und (b) verschiedenen Zusatzstoffes, wobei die Gesamtmenge der Komponenten (a) bis (c) 100 Gew.-% beträgt. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierung und/oder Konservierung einer biologischen Probe, die durch dieses Verfahren erhältliche behandelte biologische Probe, die Verwendung eines aromatischen Alkohols, die Verwendung einer Zusammensetzung sowie ein Kit.

Description

AROMATISCHE ALKOHOLE ZUR BEHANDLUNG EINER BIOLOGISCHEN PROBE
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierung und/oder Konservierung einer biologischen Probe, die durch dieses Verfahren erhältliche behandelte biologische Probe, die Verwendung eines aromatischen Alkohols, die Verwendung einer Zusammensetzung sowie ein Kit.
Es ist seit langem bekannt, dass die genetische Herkunft und die funktionelle Aktivität einer Zelle durch Studien ihrer Nukleinsäuren bestimmt und untersucht werden kann. Die Analysen der Nukleinsäuren und der Proteine ermöglichen direkte Rückschlüsse auf die Ursache der Aktivitäten von Zellen. Sie sind somit indirekten, konventionellen Methoden, wie zum Beispiel dem Nachweis von Stoffwechselprodukten, potentiell überlegen. Daher ist für die Zukunft mit einer starken Verbreitung von Nukleinsäure- und Proteinanalysen zu rechnen. So werden molekularbiologische Analysen bereits in vielen Bereichen eingesetzt, zum Beispiel in der medizinischen und klinischen Diagnostik, in der Pharmazie, bei der Entwicklung und Evaluierung von Arzneimitteln, in der Lebensmittelanalytik sowie bei der Überwachung der Lebensmittelherstellung, in der Agrarwirtschaft bei der Züchtung von Nutzpflanzen und Nutztieren, in der Forensik, in der Umweltanalytik sowie in vielen anderen Forschungsgebieten.
Durch die Analyse der RNA, speziell der mRNA in Zellen, lassen sich die Aktivi- täten von Genen direkt bestimmen. Die quantitative Analyse von Transkriptions - mustern (mRNA-Mustern) in Zellen durch moderne molekularbiologische Methoden, wie zum Beispiel Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR („Real time RT PCR") oder Genexpressions-Chip- Analysen ermöglichen zum Beispiel die Erkennung fehlerhaft exprimierter Gene, wodurch zum Beispiel Stoffwechselkrankhei- ten, Infektionen oder die Entstehung von Krebs erkannt werden können. Die Analyse der DNA aus Zellen durch molekularbiologische Methoden wie zum Beispiel PCR, RFLP, AFLP oder durch Sequenzierung ermöglicht zum Beispiel den Nachweis genetischer Defekte oder die Bestimmung des HLA-Typs sowie ande- rer genetischer Marker. Die Analyse genomischer DNA und RNA wird auch zum direkten Nachweis von infektiösen Erregern, wie zum Beispiel Viren, Bakterien usw. eingesetzt.
Unbedingte Voraussetzung für die Analyse von Biomolekülen, insbesondere von Nukleinsäuren und Proteinen, in biologischen Proben ist jedoch die sofortige Stabilisierung der biologischen Probe, da sich gerade der Status (Genexpressionsprofil oder Proteinmuster) der für die molekularbiologische Untersuchung wichtigen Bestandteile der frischen Proben bereits direkt nach der Entnahme der Probe aus ihrer natürlichen Umgebung rapide verändern kann. Eine längere Lagerung der Proben in einem unbehandelten Zustand, z. B. bedingt durch einen ungewollt verzögerten Transport in ein Labor, kann eine molekularbiologische Analyse verfälschen oder diese gar gänzlich unmöglich machen. Auch weitere Biomoleküle, wie z. B. Metabolite, sowie die Morphologie einer Probe kann durch Lagerung in unbehandeltem Zustand nachteilig beeinflusst werden.
Gerade der Nukleinsäure-Status einer biologischen Probe verändert sich umso stärker, je mehr Zeit zwischen der Entnahme der Probe und ihrer Analyse verstreicht. Besonders schnell erfolgt hierbei der Abbau der Ribonukleinsäuren (RNA) durch allgegenwärtige RNasen. Ebenso kommt es neben dem Abbau von Nukleinsäuren auch zur Induktion von beispielsweise Stressgenen und damit zur Synthese neuer mRNA-Moleküle, die das Transkriptmuster der Probe ebenfalls stark verändern. Daher ist es erforderlich, zum Erhalt des zu untersuchenden Genexpressionsprofils eine sofortige Stabilisierung der Probe durchzuführen. Das Gleiche gilt, wenn eine tiefgefrorene biologische Probe zum Zwecke ihrer Unter- suchung aufgetaut wird. Auch hier kommt es nach dem Auftauen zu einer raschen Veränderung des Nukleinsäure-Status, insbesondere durch Abbau von Biomolekülen.
Nicht nur für die Analyse von Nukleinsäuren sondern auch für detaillierte Untersuchungen des Proteoms einer biologischen Probe ist eine sofortige Stabilisierung der Probe notwendig, da auch das Proteinmuster unmittelbar nach Entnahme der Probe verändert wird. Dies erfolgt zum einen durch Degradation bzw. Neusynthese, zum anderen aber besonders rasch durch Veränderungen der Proteinmodifika- tionen, wie z. B. Phosphorylierung/ Dephosphorylierung.
Um insbesondere das Expressionsmuster in der biologischen Probe zum Zeitpunkt der Entnahme vollständig zu konservieren, muss die Stabilisierung möglichst sofort nach der Zugabe der Lösung einsetzen, ohne vorherige Vorbehandlungen der Probe. Für die Stabilisierung von Nukleinsäuren in kompakten Gewebeproben ergibt sich im Vergleich zu anderen biologischen Proben eine besondere Schwierigkeit. Gewebe sind, bezüglich ihrer Zusammensetzung, ihrer Inhaltsstoffe sowie dem Aufbau vielschichtig und heterogen. Für die Stabilisierung von Nukleinsäuren in kompakten Gewebeproben muss sich die Wirkung des stabilisierenden Re- agenzes nicht nur an der Oberfläche der Zellen bzw. innerhalb einer Zellschicht entfalten, sondern auch tief innerhalb des vielschichtigen Probenmaterials wirken. Zudem müssen häufig innerhalb ein und derselben biologischen Probe sehr verschiedene Gewebe- und/oder Zelltypen adressiert werden können, die sich beispielsweise in der Zellstruktur, dem Membranaufbau, den Kompartimentierungen und den Biomolekülen, beispielsweise hinsichtlich der Proteine, der Kohlenhydrate und/oder dem Fettgehalt, unterscheiden.
Im Laufe der Jahre wurden eine Vielzahl von unterschiedlichsten Fixierungs- oder Stabilisierungsreagenzien bzw. Methoden zur Fixierung bzw. Stabilisierung ent- wickelt, um einen großen Bereich an verschiedenartigen biologischen Proben zu stabilisieren bzw. fixieren.
So ist als eine Methode der Stabilisierung das Einfrieren biologischer Proben seit langem bekannt. Dabei wird die Probe direkt nach der Entnahme aus ihrer natürlichen Umgebung bei -800C oder tiefer, z. B. in flüssigem Stickstoff, tiefgefroren. Die so behandelte Probe kann dann ohne Integritätsveränderungen bei etwa -700C nahezu unbegrenzt gelagert werden.
Bei histologischen Analysen müssen Gewebestrukturen, sowie zelluläre und subzelluläre Strukturen in ihrem morphologischen Erscheinungsbild während der Lagerung erhalten bleiben. Bei Gewebeproben ist dabei die Fixierung mittels Formalin und gegebenenfalls das anschließende Einbetten der fixierten Proben in Paraffin seit langem bekannt.
Weitere bekannte Stabilisierungsverfahren umfassen den Einsatz bestimmter Stabilisierungsreagenzien. Diese Stabilisierungsreagenzien umfassen beispielsweise kationische Detergentien (US 5.010,184, US 5.300,545, WO-A-02/00599 und WO-A-02/00600) oder hochkonzentrierte Ammoniumsulfat-lösungen, wie in der US 6,204,375 beschrieben.
Der Nachteil der aus dem Stand der Technik bekannten Stabilisierungsverfahren besteht jedoch darin, dass entweder die Stabilisierung von Biomolekülen wie etwa Nukleinsäuren in den biologischen Proben nur unbefriedigend und insbesondere die Ausbeute an diesen Biomolekülen aus den herkömmlich stabilisierten Proben häufig nur gering ist und/oder dass die Morphologie der Proben nicht in ausreichendem Maße erhalten bleibt. Im Falle der Stabilisierung durch Einfrieren kommt noch der Nachteil hinzu, dass dieses Stabilisierungsverfahren durchweg sehr aufwendige, logistische Voraussetzungen erfordert, da ein Auftauen der Proben während des Transports, der Lagerung oder während der unterschiedlichsten An- bzw. Verwendungsprozesse ver- hindert werden muss. Neben den zusätzlichen Kosten für spezielle Probenaufnahmegefäße sowie für die permanente Kühlung der Proben, ist zudem der Einsatz von flüssigem Stickstoff nicht nur sehr umständlich, sondern auch nur unter besonderen Vorsichtsmaßnahmen durchführbar. Darüber hinaus gestaltet sich eine nachfolgende Analyse des gefrorenen Probenmaterials, insbesondere einzelner Bestandteile der Probe, zumeist sehr schwierig. Zur Verringerung der Nachteile beim Verarbeiten von gefrorenen Proben sind aus dem Stand der Technik sogenannte Transitionslösungen bekannt. Dabei wird zunächst das gefrorene Gewebe in eine auf -700C bis -800C vorgekühlte Lösungen überführt und anschließend darin für einige Stunden (mindestens 16 Std.) bei etwa -200C gelagert wird. Nach- folgend kann dann die mit der Transitionslösung durchtränkte Probe nur für einen kurzen Zeitraum, beispielsweise maximal zum Zerteilen der Probe, auf Arbeitstemperaturen von -4°C bis zu Raumtemperatur erwärmt werden, ohne dass sich der Nukleinsäurestatus der Probe verändert. Derartige, beispielsweise aus der WO-A-2004/72270 bekannte Transitionslösungen bestehen vornehmlich aus ein- wertigen Alkoholen.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.
Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierung und/oder Konservierung, einer biologischen Probe, vorzugsweise zur Stabilisierung einer biologischen Probe, anzugeben, mit dem Biomoleküle, wie Nukleinsäuren, Proteine und Metaboli- te, in der biologischen Probe besser stabilisiert werden können. Dabei sollte im Vergleich zu den herkömmlichen Stabilisierungsverfahren die Menge an isolierbaren Biomolekülen erhöht und/oder die Qualität der Biomoleküle, welche im Falle von Nukleinsäuren beispielsweise durch Gel-Analyse oder durch die Anzahl der PCR-Zyklen bis zum Erreichen einer bestimmten Nukleinsäuremenge be- stimmt werden kann, verbessert werden. Auch die Morphologie der biologischen Probe sollte durch das Stabilisierungsverfahren gut erhalten bleiben
Darüber hinaus lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe anzugeben, mit dem sowohl gefrorene als auch frische biologische Proben bei möglichst moderaten Temperaturbedingungen, beispielsweise auch bei Raumtemperatur, ohne Beeinträchtigung des Expressionsprofils oder des Proteoms der biologischen Probe stabilisiert werden können.
Weiterhin sollte das Verfahren zur Behandlung, vorzugsweise zur Stabilisierung einer biologischen Probe zu einer behandelten, vorzugsweise stabilisierten biologischen Probe führen, die nicht nur bei moderaten Temperaturen, beispielsweise bei Raumtemperatur, analysiert werden kann, sondern gegebenenfalls vor oder nach einer solchen Analyse für möglichst lange Zeit bei solchen moderaten Tem- peraturbedingungen gelagert werden kann.
Im Falle von Biomolekülen soll dabei unter dem Begriff „Stabilisierung" vorzugsweise die Hemmung des Abbaus, der Modifikation, der Induktion oder der Änderung der Aktivität von Biomolekülen verstanden werden. Im Falle von histo- logischen Analysen der biologischen Proben soll unter dem Begriff „Stabilisierung" vorzugsweise das Verhindern einer wesentlichen Änderung der Morphologie der Proben verstanden werden. Einen Beitrag zur Lösung der Eingangs genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierung und/oder Konservierung, einer biologischen Probe, umfassend die Verfahrensschritte
i) Bereitstellen einer biologischen Probe, und
ii) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit einer Zusammensetzung, umfassend
(a) 1 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 75 Gew.-% und besonders bevorzugt 1 bis 50 Gew.-% mindestens eines aromatischen Alkohols, (b) 10 bis 99 Gew.-%, vorzugsweise 20 bis 90 Gew.-% und besonders bevorzugt 30 bis 80 Gew.-% mindestens eines von einem aromatischen Alkohol verschiedenen Lösungsmittels, sowie (c) 0 bis zu 89 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 60 Gew.-% und besonders bevorzugt 1 bis 40 Gew.-% mindestens eines von den Komponenten (a) und (b) verschiedenen Zusatzstoffes,
wobei die Gesamtmenge der Komponenten (a) bis (c) 100 Gew.-% beträgt.
Bei dem von einem aromatischen Alkohol verschiedenen Lösungsmittels kann es sich bevorzugt um ein organisches Lösungsmittel handeln.
Überraschend wurde festgestellt, dass sich durch das in Kontakt bringen einer biologischen Probe mit Zusammensetzungen, welche mindestens einen aromatischen Alkohol als Additiv umfassen, Biomoleküle, wie Nukleinsäuren, Proteine oder Metabolite, in der biologischen Probe besser stabilisieren lassen. Die Zusammensetzungen mit dem aromatischen Alkohol zeichnen sich im Vergleich zu den entsprechenden Zusammensetzungen ohne den aromatischen Alkohol durch ein besseres Stabilisierungsvermögen von Biomolekülen in einer biologischen Probe, insbesondere durch ein verbessertes Stabilisierungsvermögen für Nukleinsäuren aus.
Bei der im Verfahrensschritt i) bereitgestellten biologischen Probe kann es sich um eine gefrorene oder um eine nicht gefrorene biologische Probe handeln, wobei als biologische Probe alle dem Fachmann bekannten biologischen Proben eingesetzt werden können. Bevorzugte biologische Proben sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Biomoleküle, beispielsweise natürliche, vorzugsweise isolierte lineare, verzweigte oder zirkuläre Nukleinsäuren wie RNA, insbesondere mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, tRNA, hnRNA oder Ribozyme, DNA und dergleichen, synthetische oder modifizierte Nukleinsäuren, beispielsweise Oligonukleotide, insbesondere für die PCR verwendete Primer, Sonden oder Standards, mit Digo- xigenin, Biotin oder Fluoreszensfarbstoffen markierte Nukleinsäuren oder soge- nannte PNAs („peptide nucleic acids"), natürliche, vorzugsweise isolierte Proteine oder Oligopeptide, synthetische oder modifizierte Proteine oder Oligopeptide, beispielsweise mit Fluoreszenzmarkern oder Enzymen gekoppelte Antikörper, Hormone, Stoff Wechselprodukte und Metaboliten, Wachstumsfaktoren, Lipide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Proteoglukane, Körperflüssigkeiten wie Blut, Sperma, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel, Sputum, Crusta Phlogistica oder Urin, Flüssigkeiten, welche beim Aufarbeiten von Blut erhalten werden, wie etwa Serum oder Plasma, Leukozyten-Fraktionen oder „buffy coat", Blutegelspeichel (Saliva), Fäkalien, Abstriche, Punktate, Schuppen, Haare, Hautfragmente, forensische Proben, Lebensmittel- oder Umweltproben, die freie oder gebundene Biomo- leküle, insbesondere freie oder gebundene Nukleinsäuren enthalten, Stoffwechselprodukte, ganze Organismen, vorzugsweise ganze nicht lebende Organismen, Gewebe von Mehrzellern, vorzugsweise von Insekten und Säugetieren, insbesondere vom Menschen, beispielsweise in Form von Gewebeschnitten oder - fragmenten oder Organen, isolierte Zellen, beispielsweise in Form adhärenter oder suspendierter Zellkulturen, Organellen, beispielsweise Chloroplasten oder Mito- chondrien, Vesikel, Zellkerne oder Chromosomen, Pflanzen, Pflanzenteile, Pflanzengewebe oder Pflanzenzellen, Bakterien, Viren, Viroide, Prionen, Hefen und Pilze.
Als eine nichtgefrorene biologische Probe wird im Verfahrensschritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise eine frisch hergestellte biologische Probe eingesetzt, beispielsweise eine frische Gewebeprobe oder frisch isolierte Blutzellen aus einem lebendigen oder toten Organismus oder, im Falle synthetischer Biomoleküle als biologische Probe, frisch synthetisierte Nukleinsäuren oder Proteine. Unter einer „frischen" biologischen Probe wird dabei erfindungsgemäß vorzugsweise eine Probe verstanden, die, bevor sie mit der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung im Verfahrensschritt ii) in Kontakt gebracht wird, vor nicht mehr als 96 Stunden, vorzugsweise vor nicht mehr als 48 Stunden, besonders be- vorzugt vor nicht mehr als 24 Stunden, darüber hinaus bevorzugt vor nicht mehr als 10 Stunden, darüber hinaus noch mehr bevorzugt vor nicht mehr als 60 Minuten und am meisten bevorzugt vor nicht mehr als 10 Minuten entnommen oder, im Falle eines synthetischen Biomoleküls, synthetisiert worden ist. Die Bezeichnung „frische" biologische Probe umfasst jedoch auch solche Proben, die innerhalb der vorstehend genannten Zeiträume entnommen worden sind, die jedoch vor dem in Kontakt bringen mit der Zusammensetzung noch vorbehandelt worden sind, beispielsweise mit herkömmlichen Fixativen, wie etwa Formalin, mit Farbstoffen, wie etwa Eosin, mit Antikörpern und dergleichen. Die Herstellung frischer Zell- oder Gewebeproben kann dabei durch alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Präparationsverfahren erfolgen, im Falle einer Gewebeprobe beispielsweise mittels eines Skalpells, etwa bei einer Operation oder einer Autopsie, im Falle einer Blutzellprobe durch Zentrifugation von frisch entnommenem Blut und dergleichen. Im Falle eines Einsatzes einer frischen biologischen Probe dient die Zusammensetzung beinhaltend den aromatischen Alkohol als Additiv in erster Linie als Stabilisierungszusammensetzung.
Als eine gefrorene biologische Probe wird im Verfahrensschritt i) des erfindungs- gemäßen Verfahrens vorzugsweise eine biologische Probe eingesetzt, die, nachdem sie beispielsweise auf die zuvor beschriebene Art und Weise isoliert worden ist, vor dem in Kontakt bringen mit der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung im Verfahrensschritt ii) zunächst auf Temperaturen von 00C oder weniger, vorzugsweise auf Temperaturen von -200C oder weniger und am meisten bevor- zugt auf Temperaturen von -700C oder weniger, etwa durch das in Kontakt bringen mit flüssigem Stickstoff, abgekühlt worden ist. Wird eine auf diese Weise eingefrorene biologische Probe im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt, so dient die Zusammensetzung beinhaltend den aromatischen Alkohol als Additiv in erster Linie als Transitionsreagenz bzw. als Transitionszusammensetzung.
Sofern es sich bei der biologischen Probe um eine Probe beinhaltend Zellen handelt, wie etwa einem Gewebe, so ist es besonders bevorzugt, dass diese biologische Probe im nicht-lysierten Zustand vorliegt. „Nicht-lysiert" bedeutet dabei, dass die Zellen nicht durch mechanischen Stress, durch die Behandlung mittels Proteasen oder durch das in Kontakt bringen mit Reagenzien, welche zur Lyse von Zellen führen, beispielsweise durch das in Kontakt bringen mit Detergenzien, lysiert worden sind. Jede Vorbehandlung der Probe, wie z. B. eine Lyse, vor der Stabilisierung würde zu einem zeitlichen Verzug führen, während dessen das Biomolekülprofil der biologische Proben nicht konserviert ist und somit verändert werden kann.
Im Verfahrensschritt i) wird die biologische Probe mit der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung umfassend mindestens einen aromatischen Alkohol, min- destens ein von diesem aromatischen Alkohol verschiedenes Lösungsmittel sowie gegebenenfalls einen oder mehrere Zusatzstoffe in Kontakt gebracht.
Bei dem aromatischen Alkohol (a) handelt es sich vorzugsweise um ein oder meh- rere Phenolderivate. Zu dieser Gruppe zählen nach diesseitiger Definition insbesondere Phenol, Benzylalkohol (Phenylmethanol), 1 ,2-Dihydroxibenzol (Brenzca- techin), 1,3-Dihydroxybenzol (Resorcin), 1 ,4-Dihydroxibenzol (Hydrochinon), 1 ,4-Naphthohydrochinon, 2,4,6-Trinitrophenol (Pikrinsäure), primärer Pheny- lethylalkohol, sekundärer Phenylethylalkohol, Phenylpropylalkohol, o- Tolylalkohol, p-Tolylalkohol, Cuminalkohol, 4-Hydroxybenzoesäure, 4- Hydroxysulfonsäure, p-Nitrophenol, m-, o- oder p-Alkylphenol, vorzugsweise m-, o- oder p-Methylphenol (Kresol) oder m-, o- oder p-Ethylphenol, m-, o- oder p- Halogenphenol, vorzugsweise m-, o- oder p-Chlorphenol oder m-, o- oder p- Bromphenol, oder Mischungen aus mindestens zwei dieser Substanzen. Phenol ist unter all diesen am meisten bevorzugt.
Bei dem Lösungsmittel (b) kann es sich um jedes Lösungsmittel handeln, einschließlich Lösungsmitteln, welche üblicherweise zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierung biologischer Proben eingesetzt werden können. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Lösungsmittel um ein Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasser, einwertige, nichtaromatische Alkohole (Monoole), mehrwertige, nichtaromatische Alkohole, Aldehyde, Ketone, Dimethylsulfoxid, aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ether, Carbonsäuren, Carbonsäureamide, Nitrile, Nitroalkane, Ester oder Mischungen aus mindestens zwei dieser Lösungsmittel.
Unter diesen Lösungsmitteln besonders bevorzugt sind insbesondere Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe umfassend Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2- Propanol, 1 ,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, 1 ,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4- Butandiol, 1,5-Pentandiol, 2,4-Pentandiol, Ethylenglykol, Propylenglykol, Diethy- lenglykol, Dipropylenglykol, Triethylenglykol, Tripropylenglykol, 1,2,3- Propantriol, 1,2,6-Hexantriol, 3-Methyl-l,3,5-Pentan-triol, 1,2,4-Butantriol, Ethylenglykol, Propylenglykol, 1,2,3-Propantriol, 1,2,6-Hexantriol, 3-Methyl- 1,3,5- Pentantriol, Acetonitril, Aceton, Anisol, Benzonitril, Benzylalkohol, 1-Methoxy- 2-Propanol, Quinolin, Cyclohexanon, Diacetin, Dichloromethan, Chloroform, Diethylether, Dimethylether, Toluol, Dimethylketon, Diethylketon, Dimethyladi- pat, Dimethylcarbonat, Dimethylsulfit, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Methylacetat, Ethylacetat, Benzoesäure, Methylbenzoat, Ethylbenzoat, Ethylbenzol, Formamid, Glycerintriacetat, Ethylacetoacetat, Methylacetoacetat, N,N-Diethylacetamid, N- Methyl-N-ethylacetamid, N,N-Dimethylacetamid, N,N-Dimethylformamid, N- Methyl-N-ethylformamid, N,N-Diethylformamid, N,N-Dimethylthioformamid, N,N-Diethylthioformamid, N-Methyl-N-ethylthioformamid, N,N-
Dimethylacetamid, N-Methyl-N-Ethylacetamid, N,N-Diethylacetamid, Nitro- ethan, Nitromethyltoluol, Triethylphosphat oder Mischungen aus mindestens zwei dieser Lösungsmittel, wobei Dimethylsulfoxid, Methanol, Ethanol, Diethylengly- kol, Aceton und N,N-Dimethylacetamid am meisten bevorzugt sind.
Bei dem Zusatzstoff (c), der gegebenenfalls in der Zusammensetzung enthalten sein kann, kann es sich um jeden Zusatzstoff handeln, der üblicherweise in Zusammensetzungen zur Behandlung, insbesondere zur Stabilisierung biologischer Proben enthalten ist. Bevorzugte Zusatzstoffe sind dabei ausgewählt aus der Gruppe umfassend Salze, wie beispielsweise Ammoniumsulfit, Ammoniumsulfat, Caesiumsulfat, Lithiumnitrat, Natriumacetat, Kaliumacetat, Natriumchlorid, KaIi- umchlorid oder Calciumchlorid, osmotisch aktive Substanzen, wie etwa Mannitol, Detergentien, Inhibitoren, welche den Abbau von Nukleinsäuren oder Proteinen hemmen, wie beispielsweise der Protease-Inihibor PMSF oder die kommerziell erhältlichen Produkte ANTI-RNase (Ambion, St. Austin, USA), RNAsecure® (Ambion) oder DEPC, Alkylierungsmittel, Acetylierungsmittel, Halogenierungs- mittel, Nukleotide, Nukleotid- analoge- Verbindungen, Aminosäuren, Aminosäureanaloge Verbindungen, Betain, Viskositätsregulierer, Farbstoffe, insbesondere Farbstoffe zum spezifischen Anfärben bestimmter Zellstrukturen, Pufferverbindungen, beispielsweise MES, HEPES, MOPS oder TRIS, Konservierungsstoffe, Komplexbildner, wie beispielsweise EDTA oder EGTA, Reduktionsmittel, wie beispielsweise 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol (DTT), Pterin-Hydrogensulfid, Ascorbinsäure, NADPH, Tricarboxyethylphosphin (TCEP) und Hexa- methylphosphorsäuretriamid (Me2N)3P, Oxidationsmittel wie 5,5'-Dithio-bis(2- Nitrobenzesäure) (DTNB), Substanzen, welche die Permeabilität von Zellen verbessern, beispielsweise DMSO oder DOPE, chaotrope Substanzen, wie beispielsweise Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidinium-Hydrochlorid, Fixative, wie beispielsweise Formaldehyd oder Glutardialdehyd, Essigsäure oder Trichlo- ressigsäure, Zucker, Trocknungsmittel wie etwa Silikagel sowie Mischungen aus mindestens zwei, mindestens drei, mindestens vier, mindestens fünf oder mindes- tens sechs dieser Zusatzstoffe.
Sofern Wasser als Lösungsmittel in der Zusammensetzung enthalten ist, sollte die Wassermenge so gering gehalten werden, dass die Zusammensetzung bei einem in Kontakt bringen mit einer biologischen Probe, insbesondere mit einer Zelle bein- haltenden biologischen Probe nicht lysierend wirkt. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass, wenn es sich bei dem aromatischen Alkohol um Phenol handelt, die Wassermenge in der Zusammensetzung weniger als 50 Gew.- %, besonders bevorzugt weniger als 40 Gew.-%, noch mehr bevorzugt weniger als 30 Gew.-%, noch mehr bevorzugt weniger als 20 Gew.-%, noch mehr bevorzugt weniger als 10 Gew.-%, und am meisten bevorzugt weniger als 5 Gew.-% jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, beträgt.
Die Herstellung der Zusammensetzung aus dem Lösungsmittel, dem aromatischen Alkohol und gegebenenfalls dem Zusatzstoff erfolgt vorzugsweise durch einfa- ches Vermischen der Komponenten. Sollte eine der Komponenten einen Schmelzpunkt oberhalb der Raumtemperatur haben, so kann es bevorzugt sein, diese Komponente bis zum Schmelzpunkt zu erhitzen und dann mit den übrigen Komponenten zu vermischen. Denkbar ist aber auch, dass, wenn eine der Kompo- nenten bei der Herstellung der Zusammensetzung in fester und eine andere Komponente in flüssiger Form vorliegt, die feste Komponente in der flüssigen Komponente zu lösen. So kann beispielsweise ein fester Zusatzstoff in einer flüssigen Mischung aus Lösungsmittel und aromatischem Phenol oder festes Phenol in einem flüssigen Lösungsmittel gelöst werden.
Das in Kontakt bringen der Zusammensetzung mit der biologischen Probe im Verfahrens schritt ii) erfolgt im Falle einer flüssigen Zusammensetzung vorzugsweise dadurch, dass die biologische Probe in die Zusammensetzung eingetaucht wird, so dass die gesamte Probe von der Zusammensetzung durchtränkt werden kann. Wird als biologische Probe ein Fluid oder isolierte Zellen oder z. B. eine granuläre Probe eingesetzt, so erfolgt das in Kontakt bringen durch Vermischen der biologischen Probe mit der Zusammensetzung oder durch Suspendieren der biologischen Probe in der Zusammensetzung.
Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, dass das in Kontakt bringen der biologischen Probe mit Zusammensetzung bei einer Temperatur in einem Bereich von -800C bis +800C, bevorzugt in einem Bereich von 00C bis +800C, noch mehr bevorzugt in einem Bereich von 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8°C bis +800C und darüber hinaus bevorzugt in einem Bereich von 18°C bis +800C erfolgt, beispielsweise bei einer Temperatur von mindestens -200C, -19°C, -18°C, -17°C, -16°C, -15°C, - 14°C, -13°C, -12°C, -I TC, -100C, -9°C, -8°C, -TC, -6°C, -5°C, -4°C, -3°C, - 2°C, -1°C, 00C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, 100C, 11°C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 200C, 21°C, 22°C, Raumtemperatur, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 300C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 400C, 410C, 42°C, 43°C, 44°C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 500C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C oder 600C erfolgt.
Dabei bedeutet die Formulierung, dass das „in Kontakt bringen der biologischen Probe mit Zusammensetzung bei einer Temperatur in einem Bereich von -800C bis +800C" oder bei einer der anderen, vorstehend genannten Temperaturen erfolgt, dass nach dem in Kontakt bringen der biologischen Probe mit der Zusammensetzung die Temperatur der auf diese Weise erhaltenen Mischung innerhalb der vorstehend genannten Temperaturen liegt. So kann es beispielsweise sein, dass als biologisches Material eine auf Temperaturen von weniger als -200C tiefgefrorene Probe, beispielsweise eine in flüssigem Stickstoff gelagerte Probe, eingesetzt wird, wobei in diesem Falle eine solche Menge an Zusammensetzung mit einer solchen Temperatur eingesetzt wird, dass nach dem in Kontakt bringen der tiefgefrorenen biologischen Probe mit der Zusammensetzung die Temperatur der Mischung (und somit auch die Temperatur der biologische Probe) im vorstehend genannten Temperaturbereich liegt.
Weiterhin kann es gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsge- mäßen Verfahrens auch bevorzugt sein, dass die biologische Probe nach dem in Kontakt bringen mit der Zusammensetzung im Verfahrensschritt ii), vorzugsweise unter den vorstehend genannten Temperaturbedingungen, noch in einem sich an den Verfahrensschritt ii) anschließenden Verfahrensschritt iii) bei einer Temperatur in einem Bereich von -800C bis +800C, bevorzugt in einem Bereich von 00C bis +800C, noch mehr bevorzugt in einem Bereich von 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8°C bis +800C und darüber hinaus bevorzugt in einem Bereich von 18°C bis +800C erfolgt, beispielsweise bei einer Temperatur von mindestens -200C, -19°C, -18°C, - 17°C, -16°C, -15°C, -14°C, -13°C, -12°C, -11°C, -100C, -9°C, -8°C, -TC, -6°C, - 5°C, -4°C, -3°C, -2°C, -1°C, 00C, 1°C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, 100C, I TC, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 200C, 21°C, 22°C, Raumtemperatur, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 300C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 400C, 41°C, 42°C, 43°C, 440C, 45°C, 46°C, 47°C, 48°C, 49°C, 500C, 51°C, 52°C, 53°C, 54°C, 55°C, 56°C, 57°C, 58°C, 59°C oder 6O0C gelagert wird, wobei diese Lagerung gegebenenfalls über einen Zeitraum von mindestens einem Tag, mindestens 2 Tagen, mindestens 3 Tagen, mindestens einer Woche, von mindestens zwei Wochen, von mindestens einem Monat, von mindestens drei Monaten, von mindestens sechs Monaten oder auch von mindestens 12 Monaten erfolgen kann.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Lagerung einer behandelten biologischen Probe bei Kühlschranktemperaturen, bei Raumtemperatur oder bei noch höheren Temperaturen, ohne dass es zu einem erkennbaren Abbau von Biomolekülen wie Nukleinsäuren oder Proteinen in der biologische Probe kommt. Dieses stellt einen signifikanten Vorteil gegenüber herkömmlichen Stabilisierungsverfahren dar, da das Verfahren ohne den Einsatz von flüssigem Stickstoff oder von Tiefkühlvorrichtungen durchgeführt und die stabilisierte Probe auch ohne den Einsatz von flüssigem Stickstoff oder von Tiefkühlvorrichtungen gelagert werden kann. Insbesondere zum Zwecke einer längerfristigen Archivie- rung können die Proben natürlich, wie allgemein üblich, auch bei niedrigen Temperaturen, etwa bei -200C oder -8O0C, gelagert werden, wobei dieses jedoch nicht zwingend ist.
Nach der erfindungsgemäßen Behandlung und gegebenenfalls vor oder auch nach einem möglichen Lagerungs schritt iii) kann die behandelte biologische Probe auch in geeignete Einbettungsmittel eingebettet werden, beispielsweise in Paraffin oder dergleichen, um dann aus der biologischen Probe für histologische Untersuchungen geeignete Gewebeschnitte einfacher anfertigen zu können. Weiterhin kann es gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt sein, dass sich an den Verfahrensschritt i) und ii) noch ein Verfahrensschritt
iv) Analyse von Biomolekülen in der oder aus der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe und/oder histologische Analyse der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe, besonders bevorzugt jedoch die Analyse von Biomolekülen in der oder aus der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe,
anschließt, wobei dieser Verfahrens schritt iv) gegebenenfalls auch vor oder nach einer Lagerung gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahrensschritt iii) durchgeführt werden kann.
Unter einer histologischen Untersuchung wird vorzugsweise jedes Untersuchungsverfahren verstanden, welches geeignet ist, den morphologischen Zustand eines Gewebes, eines Gewebeschnittes, einer Zelle oder von subzellulären Strukturen zu analysieren, beispielsweise mittels Mikroskopie und gegebenenfalls unter Einsatz von dem Fachmann bekannten Färbe- oder Markierungstechniken.
Als Biomoleküle, die analysiert werden können, kommen alle dem Fachmann bekannten Biomoleküle in Betracht, insbesondere natürliche, modifizierte oder synthetische Nukleinsäuren, natürliche, modifizierte oder synthetische Proteine oder Oligopeptide, Hormone, Wachstumsfaktoren, Substrate des Stoffwechsels, Metabolite, Lipide, Oligosaccharide oder Proteoglukane. Als Nukleinsäuren kommen alle dem Fachmann bekannten Nukleinsäuren in Betracht, insbesondere Ribonukleinsäuren (RNA), beispielsweise mRNA, siRNA, miRNA, snRNA, t- RNA, hnRNA oder Ribozyme, oder Deoxyribonukleinsäuren (DNA). Grundsätzlich kann es sich um jeden Typ von Polynukleotid handeln, der ein N-Glykosid oder C-Glykosid einer Purin- oder Pyrimidinbase darstellt. Die Nukleinsäure kann einzel-, doppel- oder mehrsträngig, linear, verzweigt oder zirkulär sein. Sie kann einem in einer Zelle vorkommenden Molekül entsprechen, wie etwa genomische DNA oder Boten-RNA (mRNA), oder in vitro erzeugt werden wie Komplemen- tär-DNA (cDNA), Gegenstrang-RNA (aRNA), oder synthetische Nukleinsäuren. Die Nukleinsäure kann aus wenigen Untereinheiten, mindestens zwei Untereinheiten, bevorzugt acht oder mehr Untereinheiten bestehen, wie etwa Oligonukleotide, mehreren hundert Untereinheiten bis hin zu mehreren tausend Untereinheiten, wie etwa bestimmte Expressionsvektoren, oder bedeutend mehr Untereinheiten, wie genomische DNA. Bevorzugt enthält die Nukleinsäure die kodierende Information für ein Polypeptid in funktionellem Zusammenhang mit regulatorischen Sequenzen, die die Expression des Polypeptids in der Zelle erlauben, in die die Nukleinsäure eingebracht wird oder natürlich vorliegt. So ist die Nukleinsäure in einer bevorzugten Ausführungsform ein Expressionsvektor. In einer anderen Ausfüh- rungsform ist sie eine pDNA (Plasmid-DNA), eine siRNA, eine siRNA-Duplizes oder eine siRNA-hetero-Duplizes, wobei unter dem Begriff „siRNA" Ribonukleinsäuren mit einer Länge von etwa 22 Nukleotiden verstanden werden, die durch Spaltung einer doppelsträngigen RNA (dsRNA) durch das Enzym „Dicer" entstehen und in den Enzymkomplex „RISC" (RNA-induced silencing complex) einge- baut werden.
Am meisten bevorzugt als Biomoleküle sind jedoch Proteine und Nukleinsäuren, wobei Nukleinsäuren besonders bevorzugt und RNAs am meisten bevorzugt sind.
Die Formulierung „Analyse von Biomolekülen in der oder aus der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe" bedeutet dabei, dass die Analyse sowohl in situ als auch ex situ, also beispielsweise nach Isolierung der Biomoleküle aus der biologischen Probe erfolgen kann. Sollen Biomoleküle aus einer biologischen Probe zum Zwecke der Analyse isoliert werden, so kann es vorteilhaft sein, insbesondere im Falle von Zellen, Geweben oder anderen komplexen oder kompakten Proben die Proben zunächst zu homogenisieren, wobei dieses Homogenisieren auf mechanischem Weg, beispielsweise mittels Kanülen, Mörsern, Rotor-Stator-Homogenisatoren, einer Kugelmühle oder dergleichen, auf chemischem Weg durch den Einsatz geeigneter Lysepuffer, welche üblicherweise Detergenzien und/oder chaotrope Substanzen beinhalten, auf enzymatischem Weg, beispielsweise unter Einsatz von Proteasen, oder durch eine Kombination dieser Maßnahmen, durchgeführt werden kann.
Zur histologischen Analyse oder zur Analyse von Biomolekülen in der oder aus der biologischen Probe können dabei alle dem Fachmann bekannten und geeignet erscheinenden Analyseverfahren eingesetzt werden, vorzugsweise Verfahren ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Lichtmikroskopie, die Elektronenmikroskopie, die konfokale Laserscanningmikroskopie, die Laser-Micro-Dissection, Scanningelektronenmikroskopie, das Western-Blotting, den Southern-Blotting, Northern-Blotting, den Enzyme-linked Immonosorbent-Assay (ELISA), die Im- munpräzipitation, die Affinitätschromatographie, die Mutationsanalyse, die PoIy- acrylamidgelelektrophorese (PAGE), insbesondere die zweidimensionale PAGE, die HPLC, die Polymerasekettenreaktion (PCR), die RFLP- Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism- Analyse), die S AGE- Analyse (Serial Analysis of Gen Expression), die FPLC-Analyse (Fast Protein Liquid Chromatography), die Massenspektrometrie, beispielsweise die MALDI-TOFF-Massenspektrometrie oder die SELDI-Massenspektrometrie, die Microarray-Analyse, die LiquiChip- Analyse, die Analyse der Aktivität von Enzymen, HLA-Typing, Sequenzierung, WGA („Whole Genome Amplification"), WTA ("Whole Transkriptome Amplifi- cation"), RT-PCR, Real-Time-PCR bzw. -RT-PCR, RNase-Protection-Analyse oder Primer- Extension- Analyse. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst der Verfahrensschritt iv) eine Analyse von Nukleinsäuren in der oder aus der biologischen Probe und/oder eine Analyse von Proteinen in der oder aus der biologischen Probe.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch die durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelte biologische Probe.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe leistet auch die Verwendung eines aromatischen Alkohols, vorzugsweise von Phenolderivaten, besonders bevorzugt von Phenol, in einer Zusammensetzung zur Behandlung einer gefrorenen oder nicht gefrorenen biologischen Probe gemäß dem eingangs beschriebenen Verfahren.
Auch die Verwendung eines aromatischen Alkohols, vorzugsweise von Phenolderivaten, besonders bevorzugt von Phenol, zur Behandlung einer biologischen Probe unter nicht-lysierenden Bedingungen leistet einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben, wobei als aromatische Alkohole und biologische Proben diejenigen aromatischen Alkohole bzw. biologische Proben bevorzugt sind, die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannt worden sind.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch die Verwendung einer Zusammensetzung umfassend
(a) 1 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 75 Gew.-% und besonders bevorzugt 1 bis 50 Gew.-% mindestens eines aromatischen Alkohols, (b) 10 bis 99 Gew.-%, vorzugsweise 20 bis 90 Gew.-% und besonders bevorzugt 30 bis 80 Gew.-% mindestens eines von einem aromatischen Alkohol verschiedenen Lösungsmittels, sowie
(c) 0 bis zu 89 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 bis 60 Gew.-% und besonders be- vorzugt 0,1 bis 40 Gew.-% mindestens eines von den Komponenten (a) und
(b) verschiedenen Zusatzstoffes,
wobei die Gesamtmenge der Komponenten (a) bis (c) 100 Gew.-% beträgt,
zur Behandlung einer biologischen Probe, insbesondere zur Stabilisierung von Biomolekülen wie Nukleinsäuren, Proteinen oder Metaboliten, besonders bevorzugt von Nukleinsäuren und Proteinen, am meisten bevorzugt von Nukleinsäuren und insbesondere bevorzugt von RNAs, wie etwa mRNAs, in einer oder aus einer biologischen Probe und/oder zur histologischen Analyse einer biologischen Probe, wobei als Lösungsmittel, aromatische Alkohole und Zusatzstoffe diejenigen Verbindungen bevorzugt sind, die bereits eingangs im Zusammenhang mit dem erfindungsgenannten Verfahren als bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurden.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Kit, umfassend
(a) die vorstehend beschriebene Zusammensetzung, sowie optional
(b) Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oder aus einer biologischen Probe und/oder zur Analyse der Morphologie einer biologischen Probe.
Bei den Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oder aus einer biologischen Probe oder zur Analyse der Morphologie einer biologischen Probe kann es sich grundsätzlich um alle dem Fachmann bekannten Reagenzien handeln, die zur oder bei der morphologischen Analyse einer biologischen Probe oder zur oder bei der Analyse von Biomolekülen in einer oder aus einer biologischen Probe verwendet werden können. Diese Reagenzien umfassen insbesondere Farbstoffe zum Färben von Zellen oder Zellbestandteilen, Antikörper, gegebenenfalls markiert mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Enzymen, eine Absorptionsmatrix, wie etwa DEAE- Zellulose oder eine Silica-Membran, Substrate für Enzyme, Agarose-Gele, PoIy- acrylamid-Gele, Lösungsmittel wie Ethanol, chaotrope Reagenzien oder Phenol, wässrige Pufferlösungen, RNase-freies Wasser, Lyse-Reagenzien, alkoholische Lösungen und dergleichen.
Weiterhin kann ein erfindungsgemäßes Kit als Komponente beispielsweise mindestens eine Vorrichtung (c), beispielsweise in Form eines verschließbaren Gefäßes, zur Sammlung oder Aufnahme einer festen oder flüssigen biologischen Probe enthalten. Dabei kann die Vorrichtung (c) gegebenenfalls vor Sammlung oder Aufnahme der biologischen Probe die Zusammensetzung enthalten. Bei der Vorrichtung kann es sich um jedes dem Fachmann bekannte Gefäß zur Sammlung oder Aufnahme einer festen oder flüssigen biologischen Probe handeln. Bevorzugte Gefäße sind beispielsweise Falcon-Tubes, Eppendorf-Gefäße, Greiner- Röhrchen, oder eines der in den Druckschriften US 6,602,718, US 2004/0043505 Al, US 2005/0160701 Al, US 2003/0086830 Al,
US 2003/0087423 Al oder WO 2005/014173 Al beschriebenen Gefäße.
Ein erfindungsgemäßes Kit kann dabei
(a) Eine Zusammensetzung wie oben beschrieben, sowie
(c) eine Vorrichtung zur Sammlung oder Aufnahme einer festen oder flüssigen biologischen Probe, wobei die Vorrichtung gegebenenfalls vor Sammlung oder Aufnahme der biologischen Probe mindestens eine der unter (a) ge- nannten Verbindungen oder eine Zusammensetzung beinhaltend mindestens eine unter (a) genannten Verbindungen enthalten kann.
Alternativ kann ein weiteres erfindungsgemäßes Kit die oben beschriebenen Kom- ponenten (a), (b) und (c) enthalten.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, umfassend die Verfahrensschritte:
(a) Diagnose der Krankheit durch ein Diagnoseverfahren, welches die Analyse einer biologischen Probe durch vorstehend beschriebene Verfahren umfassend die Verfahrensschritt i), ii) und iv) umfasst, sowie
(b) therapeutische Behandlung der diagnostizierten Krankheit.
Die Erfindung wird nun anhand nichtlimitierender Figuren und Beispiele näher erläutert.
Es zeigt die Figur 1 den im Beispiel 3 erhaltenen Western-Blot.
Es zeigt die Figur 2 ein l%iges Formaldehyd- Agarose-MOPS-Gel, in dem die Proben aus dem Beispiel 6 aufgetragen wurden.
Es zeigt die Figur 3 ein l%iges Formaldehyd- Agarose-MOPS-Gel, in dem die Proben aus dem Beispiel 8 aufgetragen wurden.
Es zeigt die Figur 4 ein l%iges Formaldehyd- Agarose-MOPS-Gel, in dem die Proben aus dem Beispiel 5 aufgetragen wurden. BEISPIELE
1. Stabilisierung von RNA in biologischen Proben in Gegenwart von Phenol
Nierengewebe der Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit 500 μl 30 % Phenol in DMSO versetzt und bei verschiedenen Temperaturen gelagert (siehe Tabelle 1). Im Anschluss an die Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert.
Zur RNA-Isolierung wird das Gewebe nach Lagerung aus den Lösungen entfernt und je 5 mg Gewebe 500 μl eines handelsüblichen Guanidinium-Isothiocyanat- Puffers, wie z. B. RLT-Puffer der Firma QIAGEN zugeben. Die Probe wird mit Hilfe einer Kugelmühle, wie z. B. TissueLyzer der Firma QIAGEN, über einen Zeitraum von 2 x 5 min bei 25 Hz mit einer 5 mm Stahlkugel homogenisiert, wo- bei der Guanidinium-Isothiocyanat-Puffer auf aus dem Stand der Technik bekannte Weise die Zellen lysiert und die freigesetzten Proteine denaturiert. Anschließend werden die Lysate bei 14000 UpM für 3 min zentrifugiert. Vom Überstand werden 500 μl, die 5 mg Gewebe repräsentieren, abgenommen. Zu diesen Proben wird 1 Volumen (500 μl) 70 %-iges Ethanol zugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren oder durch Vortexen über einen Zeitraum von ca. 5 s gemischt. Das Lysat wird anschließend in eine handelsübliche Silicamembran enthaltene 96 well-Platte, wie z. B. RNeasy96-plate der Firma QIAGEN, aufgetragen und durch Zentrifugation (4 min bei 6000 UpM) durch die Membran hindurchgeführt. Die RNA bleibt an der Membran gebunden und wird anschließend mit ei- nem ersten handelsüblichen Guanidinium-Isothiocyanat-haltigen Waschpuffer, beispielsweise mit dem Puffer RWl der Firma QIAGEN, gewaschen. Anschließend wird zur enzymatichen Entfernung etwaig gebundener gesamt-DNA DNA- sel in einen geeigneten Puffer auf die Säule aufgeben und für 15 min bei Raumtemperatur zwecks Abbau der gebundenen DNA inkubiert. Im Anschluss wird erneut mit einem ersten handelsüblichen Guanidinium-Isothiocyanat-haltigen Waschpuffer, beispielsweise mit dem Puffer RWl der Firma QIAGEN, und danach mit einem zweiten Tris-haltigen bzw. Tris- und alkoholhaltigen Waschpuffer, z. B. Puffer RPE der Firma QIAGEN, gewaschen. Dabei werden die Wasch- puff er jeweils durch Zentrifugation (4 min bei 6000 UpM) durch die Membran hindurchgeführt. Die Waschung mit dem zweiten Tris-haltigen bzw. Tris- und alkoholhaltigen Waschpuffer wird wiederholt wobei gleichzeitig die Membran durch die Zentrifugation (10 min 6000 UpM) getrocknet wird. Zur Elution werden 50 μl RNase-freies Wasser auf die Membran pipettiert, um die gereinigte RNA von der Membran abzulösen. Nach einer Inkubation von 1 min bei einer Temperatur im Bereich von 10 - 300C wird das Eluat durch Zentrifugation (1 min bei 10000 xg) durch die Membran hindurchgeführt und der Elutionsschritt wird zum Zwecke einer vollständigen Elution noch einmal wiederholt.
Die Menge an isolierter Gesamt- RN A wird nach Verdünnung in Wasser durch photometrische Messung der Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 260 nm ermittelt. Die Qualität der so gewonnenen RNA wird durch die photometrische Bestimmung des Verhältnisses der Lichtabsorption bei 260 nm zu derjenigen bei 280 nm bestimmt. Die Ergebnisse der Isolierungen sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Figure imgf000026_0001
Wie der Tabelle 1 zu entnehmen ist, wird durch eine erfindungsgemäße Zusammensetzung RNA in biologischen Proben stabilisiert. 2. Stabilisierung von DNA in biologischen Proben in Gegenwart von Phenol
Nierengewebe der Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit 500 μl 30 % Phenol in DMSO versetzt und bei verschiedenen Temperaturen gelagert (siehe Tabelle 2). Im Anschluss an die Lagerung wird die DNA aus den gelagerten Proben isoliert.
Zur DNA-Isolierung wird das Gewebe nach Lagerung aus den Lösungen entfernt und je 10 mg Gewebe in 180 μl des Puffers ALT des Herstellers QIAGEN zugeben. Die Probe wird mit Hilfe einer Kugelmühle, wie z. B. TissueLyzer der Firma QIAGEN, über einen Zeitraum von 30 s bei 25 Hz mit einer 5 mm Stahlkugel homogenisiert und anschließend für 15 s bei 14000 x g zentrifugiert. Nach Zugabe von 120 μl der Protease K- Lösung (Hersteller QIAGEN) werden die Lysate für 2 Stunden bei 550C unter schütteln inkubiert. Nach der Inkubation werden 4 μl RNAse A (100 mg/ml) zugeben, gemischt und die Mischung für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird 300 μl eines handelsüblichen Guanidinium-Hydrochloridhaltigen Lysepuffers, wie der Puffer AL des Herstellers QIAGEN, zugegeben und die Proben mittels Vortexen durchmischt. Es erfolgt eine Inkubation bei 700C für 10 min. Nach Mischung mit 300 μl 100 % Ethanol werden die Proben auf eine Silicamembran enthaltende 96 well-Platte (DNeasy 96-plate der Firma QIAGEN) aufgetragen und das Lysat mittels Zentri- fugaion für 10 min bei 6000 UpM durch die Membran geführt. Die DNA bleibt an der Membran gebunden und wird zunächst mit einem ersten handelsüblichen Guanidinium-Hydrochlorid-haltigen Waschpuffer, beispielsweise mit dem Puffer AWl der Firma QIAGEN, und danach mit einem zweiten alkoholhaltigen Waschpuffer, z. B. Puffer AW2 der Firma QIAGEN, gewaschen. Dabei werden die Waschpuffer jeweils durch Zentrifugation (5 min bei 6000 UpM) durch die Membran hindurchgeführt. Im Anschluss wird die Platte für 10 min bei 700C inkubiert. Die Elution der DNA erfolgt durch Auftrag von 200 μl des auf 700C vor- gewärmten Elutionspuffers AE (QIAGEN). Nach einminütiger Inkubation wird der Elutionspuffer durch Zentrifugation durch die Membran hindurchgeführt (5 min bei 6000 UpM) und die Elution wiederholt.
Die Menge an isolierter Gesamt-DNA wird nach Verdünnung in Wasser durch photometrische Messung der Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 260 nm ermittelt. Die Qualität der so gewonnenen DNA wird durch die photometrische Bestimmung des Verhältnisses der Lichtabsorption bei 260 nm zu derjenigen bei 280 nm bestimmt. Die Ergebnisse der Isolierungen sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2
Figure imgf000028_0001
Wie der Tabelle 2 zu entnehmen ist, können aus den erfindungsgemäß stabilisierten Proben, welche für mehrere Tage bei Temperaturen von bis zu 370C gelagert wurden, auch noch ausreichende Mengen an DNA isoliert werden.
3. Stabilisierung von Proteinen in biologischen Proben in Gegenwart von Phenol
Lebergewebe der Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit je 1 ml 30% Phenol in DMSO (Probel) oder PBS (als Negativkontrolle, Probe 2) versetzt und für 3 Tage bei 250C im Inkubator gelagert. Im Anschluss an die Lagerung wird ein Proteinextrakt aus den gelagerten Proben hergestellt. Zur Positivkontrolle (Probe 3) wird Lebergewebe verwendet, welches nach Entnahme aus der Ratte direkt in flüssigem Stickstoff gefroren und anschließend bei -800C gelagert wurde.
Zur Herstellung des Proteinextraktes wird das Gewebe nach Lagerung aus den Lösungen entfernt und je 10 mg Gewebe 400 μl eines üblichen Extraktionspuffers, hier in einer Zusammensetzung von 8 M Harnstoff, 100 mM Natriumdi- hydrogenphosphat und 10 mM Tris, pH 8,0, zugeben und die Probe mit Hilfe einer Kugelmühle, z. B. dem TissueLyzer der Firma QIAGEN, homogenisiert. Das so entstandene Lysat wird für 15 s bei möglichst hoher Drehzahl (z. B. ca. 20000 x g) zentrifugiert um ungelöste Bestandteile zu pelletieren. Der proteinhal- tige Überstand wird abgenommen und die Proteinkonzentration mittels eines Bradford- Testes bestimmt. Je 1,5 μg Protein wird auf einem SDS- Polyacrylamidgel nach üblichem Verfahren aufgetrennt und mittels einer Se- midry-Blotting-Apperatur nach Angaben des Herstellers auf eine Nitrozellulose- membran geblottet. Die Membran wird nach dem Stand der Technik mit Milchpulver abgesättigt und mit einem ERK2-spezifischen Antikörper, z. B. der Firma QIAGEN, nach Angaben des Herstellers hybridisiert, und eine Immunodetektion durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 gezeigt.
Der Nachweis eines spezifischen Proteins, hier einer Kinase, belegt, daß die Proteine durch die Phenolhaltige Lösung bei Raumtemperatur stabilisiert werden.
4. Histologische Analyse von stabilisierten Geweben
Leber und Nierengewebe der Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit je 1 ml 30 % Phenol gelöst in DMSO versetzt und für 1 Tag bei 25°C im Inkubator gelagert. Nach der Lagerung: werden die Gewebestücke aus den Lösungen entnommen, in Plastikkassetten überführt und nach üblichen Protokollen in einer aufsteigenden Ethanolreihe, sowie in Xylol inkubiert und in Paraffin eingebettet. Mit Hilfe eines Microtoms werden Schnitten aus dem in Paraffin eingebetteten Gewebe erstellt und diese auf dem Objektträger nach üblichen Methoden einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung unterzogen. Die gefärbten Gewebeschnitte werden lichtmikroskopisch untersucht, wobei erkennbar wird, dass die Lösung den Erhalt der Morphologie der Gewebe ermöglicht.
5. Transition gefrorener biologischer Proben in Gegenwart von Phenol
Lebergewebe aus Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff eingefro- ren und bei -700C gelagert wurde, wird für diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionssexperiment werden 20 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen, nicht-gekühlten (Raumtemperatur) Behandlungszusammensetzungen (siehe Tabelle 3) versetzt und für 3 Tage bei 250C gelagert. Im Anschluss an die Transition wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert.
Dazu wird das Gewebe nach Lagerung aus den Behandlungslösungen entfernt und zu je 10 mg Gewebe 350 μl eines handelsüblichen Guanidinium-Isothiocyanat- Puffers, wie z. B. RLT- Puffer der Firma QIAGEN zugeben. Die Probe wird mit Hilfe einer Kugelmühle, wie z. B. MM300 der Firma QIAGEN, über einen Zeit- räum von 2 x 2 min bei 20 Hz mit einer 5 mm Stahlkugel homogenisiert, wobei der Guanidinium-Isothiocyanat-Puffer auf aus dem Stand der Technik bekannte Weise die Zellen lysiert und die freigesetzten Proteine denaturiert. Anschließend werden die Lysate bei 14000 UpM für 3 min zentrifugiert. Vom Überstand werden zwei Portionen von je 350 μl, die entsprechend 10 mg Gewebe repräsentieren, abgenommen. Zu diesen Proben wird 1 Volumen (350 μl) 70 %-iger Ethanol zugefügt und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren oder durch Vortexen über einen Zeitraum von ca. 5 s gemischt. Das Lysat wird anschließend in eine handelsübliche Silicamembran enthaltene spin-Säule, wie z. B. RNeasy-Säulen der Firma QIAGEN, aufgetragen und durch Zentrifugation (1 min bei 10.000 x g) durch die Membran hindurchgeführt. Die RNA bleibt an der Membran gebunden und wird anschließend mit einem ersten handelsüblichen Guanidinium- Isothiocyanat-haltigen Waschpuffer, beispielsweise mit dem Puffer RWl der Firma QIAGEN, und danach mit einem zweiten Tris-haltigen bzw. Tris- und alko- holhaltigen Waschpuffer, z. B. Puffer RPE der Firma QIAGEN, gewaschen. Dabei werden die Waschpuffer jeweils durch Zentrifugation (1 min bei 10.000 x g) durch die Membran hindurchgeführt. Die Waschung mit dem zweiten Tris- haltigen bzw. Tris- und alkoholhaltigen Waschpuffer wird mit einem geringeren Volumen wiederholt, wobei gleichzeitig die Membran durch die Zentrifugation (2 min bei 20.000 x g) getrocknet wird. Zur Elution werden 40 μl RNase-freies Wasser auf die Membran pipettiert, um die gereinigte RNA von der Membran abzulösen. Nach einer Inkubation von 1 min. bei einer Temperatur im Bereich von 10 - 300C wird das Eluat durch Zentrifugation (1 min bei 10.000 x g) durch die Membran hindurchgeführt und der Elutionsschritt wird zum Zwecke einer voll- ständigen Elution noch einmal wiederholt.
Im Anschluss werden die Menge und Qualität der RNA bestimmt, wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind ebenfalls der Tabelle 3 zu entnehmen. Die isolierte RNA wird auf einem l,0%igen Formaldehydagarose-MOPS-Gel, das mit Ethidiumbromid angefärbt ist, analysiert. Das Ergebnis ist in Figur 4 gezeigt.
Tabelle 3
Figure imgf000031_0001
Der Tabelle 3 und der Figur 4 sind zu entnehmen, dass Phenol auch in Transiti- onszusammensetzungen einen positiven Einfluss auf die Stabilisierung von Biomolekülen wie RNA in biologischen Proben hat.
6. Transition gefrorener biologischer Proben in Gegenwart von Phenol in unterschiedlichen organischen Lösungsmitteln
Leber- oder Nierengewebe der Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -700C gelagert wurde, wird für diesen Versuch verwen- det. Für jedes Transitionsexperiment werden 20 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit verschiedenen, nicht-gekühlten Behandlungszusammensetzungen versetzt (verwendete Lösungen siehe Tabelle 4) und für 3 Tage bei 250C gelagert. Im Anschluss an Transition und Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert, wie unter Beispiel 5 beschrieben. Die isolierte RNA wird auf Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid angefärbt sind, analysiert. Hierzu werden beispielsweise l,0%ige Formaldehyd- Agarose-MOPS- GeIe angefertigt. Es werden jeweils 5 μl des Eluates eingesetzt. Das Ergebnis ist in der Figur 2 gezeigt.
Tabelle 4
Figure imgf000032_0001
Wie der Figur 2 zu entnehmen ist, weist Phenol in verschiedenen organischen Lösungsmitteln auch in einer Transitionszusammensetzung einen positiven Ein- fluss auf die Stabilisierung von RNA auf.
7. Verbesserung der Stabilisierungseigenschaften von Phenol in Behandlungs- Zusammensetzungen durch Zusatzstoffe
Lebergewebe der Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff einfroren und bei -700C gelagert wurde, wird für diesen Versuch verwendet. Für jedes Transitionsexperiment werden 20 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit je 1 ml einer nicht-gekühlten Lösung aus 25% Phenol und 75% DMSO und verschiedenen Zusatzstoffen versetzt (verwendete Lösungen siehe Tabelle 5). Hierzu werden 950 μl der Phenol-DMSO-Lösung mit je 50 μl der jeweils 1 M Zusatzstoffe versetzt, so dass die Endkonzentration der Zusatzstoffe jeweils 50 mM beträgt. Im Falle von DTT als Zusatzstoff werden 944,5 μl der Phenol-DMSO-Lösung mit 55,5 μl einer 0,9 M DTT-Lösung gemischt, so dass auch hier die Zuatzstoff- Endkonzentration 50 mM beträgt. Zum Vergleich wird 1 ml der Phenol-DSMO- Lösung ohne Zusatzstoff-Zugabe verwendet. Die Proben werden für 3 Tage bei 250C gelagert. Im Anschluss an die Transition und Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert, wie unter Beispiel 5 beschrieben. Das Ergebnis ist ebenfalls der Tabelle 5 zu entnehmen.
Tabelle 5
Figure imgf000033_0001
Auch der Tabelle 5 ist zu entnehmen, dass durch den Zusatz bestimmter Zusatzstoffe die stabilisierenden Eigenschaften von Phenol auch in Transitionszusammensetzungen weitere verbessert werden können.
8. Lagerung der Probe nach Transition außerhalb der Behandlungszusammensetzung
Lebergewebe der Ratte, welches nach Entnahme in flüssigem Stickstoff einfroren und bei -700C gelagert, wird für diesen Versuch verwendet. Für jedes Transition- sexperiment werden 20 bis 50 mg Gewebe abgewogen und gefroren mit einer auf im Kühlschrank auf 2°C bis 8°C vorgekühlten Lösung aus 30% Phenol, gelöst in DMSO, versetzt. Die Proben werden über Nacht bei 2°-8°C im Kühlschrank gelagert.
Nach der Transition werden die Proben aus der Transitionszusammensetzung entnommen und trocken bei Raumtemperatur für 30 min, 45 min, 60 min, 90 min, 2h 30 min und 4h 30 min gelagert. Anschließend wird die RNA, wie unter Beispiel 1 beschrieben, isoliert.
Die isolierte RNA wird auf Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid angefärbt sind, analysiert, wie unter Beispiel 6 beschrieben. Das Ergebnis ist in Figur 3 wiedergegeben.
Der Figur 3 kann entnommen werden, dass nach der erfindungsgemäßen Transiti- on gefrorener biologischer Proben diese Proben auch für längere Zeiträume außerhalb der Behandlungszusammensetzung ohne Einbußen hinsichtlich der Menge und der Qualität der RNA in der biologischen Probe gelagert werden können. 9. Stabilisierung von RNA in biologischen Proben in Gegenwart von Phenol
Lebergewebe der Ratte wurde unverzüglich nach Organentnahme mit ImI verschiedener Zusammensetzungen (siehe Tabelle 6) versetzt und 3 Tage im Kühl- schrank bei 2-8°C gelagert. Im Anschluss an die Lagerung wird die RNA aus den gelagerten Proben isoliert wie in Beispiel 5 beschrieben. Das Ergebnis ist ebenfalls der Tabelle 6 zu entnehmen.
Tabelle 6:
Figure imgf000035_0001
Der Tabelle 6 kann entnommen werden, dass unterschiedliche Konzentrationen des aromatischen Alkohols zur Stabilisierung verwendet werden können.
Die vorstehend beschriebenen Beispiele zeigen, dass aromatische Alkohole wie Phenol in unterschiedlichsten Zusammensetzungen einen positiven Einfluss auf die Stabilisierung von Biomolekülen, insbesondere von Nukleinsäuren oder Proteinen, sowohl bei der Behandlung frischer, nicht-geforener biologischer Proben als auch bei der Behandlung gefrorner biologischer Proben haben.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Ein Verfahren zur Behandlung einer biologischen Probe, umfassend die Verfahrensschritte
i) Bereitstellen einer biologischen Probe, und
ii) in Kontakt bringen der biologischen Probe mit einer Zusammenset- zung, umfassend
(a) 1 bis 90 Gew.-% mindestens eines aromatischen Alkohols,
(b) 10 bis 99 Gew.-% mindestens eines von einem aromatischen Alkohol verschiedenen Lösungsmittels, sowie (c) 0 bis 89 Gew.-% mindestens eines von den Komponenten (a) und (b) verschiedenen Zusatzstoffes,
wobei die Gesamtmenge der Komponenten (a) bis (c) 100 Gew.-% beträgt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei es sich bei der biologischen Probe um eine gefrorene oder eine nicht-gefrorene biologische Probe handelt.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem nicht-aromatischen Lösungsmittel um ein Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe beinhaltend Wasser, einwertige, nichtaromatische Alkohole, mehrwertige, nichtaromatische Alkohole, Aldehyde, Ketone, Dimethylsul- foxid, aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ether, Carbonsäuren, Carbonsäureamide, Nitrile, Nitroalkane, Ester oder Mischungen aus mindestens zwei dieser Lösungsmittel.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Zusatz- stoff (c) ausgewählt ist aus der Gruppe beinhaltend Detergentien, Inhibitoren, welche den Abbau von Nukleinsäuren oder Proteinen hemmen, Visko- sitätsregulierer, Farbstoffe, Pufferverbindungen, Konservierungsstoffe, Komplexbildner, Reduktionsmittel, Substanzen, welche die Permeabilität von Zellen verbessern, chaotrope Substanzen, Zucker, Trocknungsmittel, Alkylierungsmittel, kreuzvernetzende Agenden, Salze, osmotisch aktive
Substanzen, Fixative sowie Mischungen aus mindestens zwei dieser Zusatzstoffe.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Komponente (a) um ein Phenolderivat handelt, bevorzugt um Phenol.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Zusammensetzung weniger als 50 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, als Zusatzstoff beinhaltet.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das in Kontakt bringen der biologischen Probe mit der Zusammensetzung bei einer Temperatur in einem Bereich von -800C bis +800C erfolgt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zusätzlich zu den Verfahrensschritten i und ii) optional noch den Verfahrensschritt iii) Lagerung der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe bei einer Temperatur in einem Bereich von -800C bis +800C
und/oder den Verfahrens schritt
iv) Analyse von Biomolekülen in der oder aus der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe und/oder histologi- sche Analyse der mit der Zusammensetzung in Kontakt gebrachten biologischen Probe
umfasst.
9. Eine biologische Probe, erhältlich durch das Verfahren nach einem der An- sprüche 1 bis 8.
10. Verwendung eines aromatischen Alkohols in einer Zusammensetzung zur Behandlung einer gefrorenen oder nicht gefrorenen biologischen Probe gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
11. Verwendung eines aromatischen Alkohols zur Behandlung einer gefrorenen oder nicht gefrorenen biologischen Probe unter nicht-lysierenden Bedingungen.
12. Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend
(a) 1 bis 90 Gew.-% mindestens eines aromatischen Alkohols,
(b) 10 bis 99 Gew.-% mindestens eines von einem aromatischen Alkohol verschiedenen Lösungsmittels, sowie (c) 0 bis 89 Gew.-% mindestens eines von den Komponenten (a) und (b) verschiedenen Zusatzstoffes,
wobei die Gesamtmenge der Komponenten (a) bis (c) 100 Gew.-% beträgt,
zur Behandlung einer biologischen Probe.
13. Ein Kit, beinhaltend
(a) die Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 1, 3, 4, 5 und 6, sowie optional
(b) Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oder aus einer biologischen Probe und/oder zur Analyse der Morphologie einer biologischen Probe,
(c) mindestens eine ggf. verschließbare Vorrichtung zur Sammlung oder Aufnahme einer biologischen Probe, wobei gegebenenfalls die Zusammensetzung (a) zur Sammlung oder Aufnahme der biologischen Probe enthalten sein kann,
(d) mindestens ein Reagenz zur Analyse von Biomolekülen in oder aus einer biologischen Probe und/oder zur Analyse der Morphologie einer biologischen Probe sowie.
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