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WO2008080531A2 - Verfahren, vorrichtung und kit zur untersuchung einer flüssigkeitsprobe - Google Patents

Verfahren, vorrichtung und kit zur untersuchung einer flüssigkeitsprobe Download PDF

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WO2008080531A2
WO2008080531A2 PCT/EP2007/010895 EP2007010895W WO2008080531A2 WO 2008080531 A2 WO2008080531 A2 WO 2008080531A2 EP 2007010895 W EP2007010895 W EP 2007010895W WO 2008080531 A2 WO2008080531 A2 WO 2008080531A2
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WO
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sample
macromolecules
reaction
probe
reaction center
Prior art date
Application number
PCT/EP2007/010895
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English (en)
French (fr)
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WO2008080531A3 (de
Inventor
Christoph Gauer
Original Assignee
Advalytix Ag
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Publication date
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Publication of WO2008080531A2 publication Critical patent/WO2008080531A2/de
Publication of WO2008080531A3 publication Critical patent/WO2008080531A3/de

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms

Definitions

  • the invention relates to a method, apparatus and kit for assaying a liquid sample for the presence of predetermined types of sample macromolecules.
  • PCR polymerase chain reaction
  • EP 373 203 B1 discloses a method and a device for, for example, multiplexing nucleic acid assays.
  • the oligonucleotides bound in this way form "probes" which are arranged in non-overlapping cells, so-called spots, which typically have diameters of 50 to 250 ⁇ m.
  • spots typically have diameters of 50 to 250 ⁇ m.
  • a multitude of spots in a matrix is called a microarray.
  • a sample liquid containing fluorescence-labeled nucleic acid sequences is brought onto the solid-body surface under hybridization conditions, the labeled nucleic acid sequences in the sample can hybridize with the oligonucleotides of the spots. If the sample liquid is subsequently washed away from the solid surface under stringent conditions, only those nucleic acid sequences of the sample which are specifically bound to corresponding probe oligonucleotides remain on the solid.
  • By spatially resolved fluorescence measurements it is now possible to determine at which spots nucleic acid sequences of the sample were bound. Since the spotted oligonucleotides are known as probes, it is thus possible to draw conclusions about the nucleic acid sequences contained in the sample.
  • Such arrays are used, for example, in diagnostics or research for gene expression analysis (gen expression profiling) or CGH (comparative genomic hybridization).
  • GMOs genetically engineered organisms
  • microarrays using complementary molecules as probes to the transgenic elements of the GMOs.
  • detection is also based on a PCR reaction and subsequent hybridization with the PCR product. It can be exploited, for example, that according to a regulation of the European Union each approved genetically modified organism must possess a unique, specific marker, which can then be detected for example by means of a real-time PCR or ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) reaction ,
  • the quality of the product is defined by the degree of uniqueness of the sequence in a spot.
  • the goal of conventional microarrays is to achieve only one population (100% without errors) of one sequence per spot if possible.
  • the error rate is of crucial importance.
  • the object of the present invention is to provide a method, a device and a kit for testing a fluid sample for the presence of at least one of at least two predetermined different types of sample macromolecules which provide the information in a rapid and cost effective manner.
  • the presence of at least one of at least two predetermined, different species of sample macromolecules is tested.
  • a liquid sample is used, of which it can be assumed that the at least two predetermined, different types of sample macromolecules are each present with a probability of less than 20% in the sample.
  • the term presence of sample macromolecules should be understood to mean, for example, a presence in an amount in excess of the process-related detection limit.
  • the sample liquid may comprise, for example, a solution, a dispersion or a suspension of the material to be investigated.
  • the assay method of the present invention can be used to determine in a simple and rapid step whether a blood sample is infected with one of several selected pathogens or the like. If so, the corresponding blood sample, if it was intended for transfusion, for example, can be sorted out or it can be specifically determined with another test which pathogen actually exists.
  • the method according to the invention quickly provides the initial information, so that a corresponding person can be immediately isolated in order to reduce the risk of infection, while it is then first examined which of the selected pathogens is present.
  • GMOs genetically modified organisms
  • the method according to the invention makes it possible to quickly determine whether such GMOs are present. If the test method according to the invention shows that such GMOs are present, it can be tested in a further investigation step to determine which GMOs are involved.
  • the method according to the invention accordingly uses liquid samples in which the at least two predetermined, different types of sample macromolecules are present with a probability of less than 20%. For example, this probability may arise from corresponding statistics or, for example, from the assumption that a subject is usually not ill or that a food has not been genetically modified.
  • Preferred positive results probabilities are less than 15%, preferably less than 10%, more preferably less than 5% or most preferably less than 1%.
  • a carrier which has at least one reaction center to which at least two types of known macromolecules ("probe” macromolecules or "capture” macromolecules) are bound.
  • the macromolecules to be used as probe macromolecules are mixed before application to the reaction center.
  • the arrangement of the different probe macromolecules is negligible and therefore preferably randomly distributed.
  • at least one reaction center is used, to which different macromolecules to be detected (sample macromolecules) can specifically bind.
  • Macromolecules are preferably used as different probe macromolecules whose similarity is less than 90%, more preferably less than 70%, more preferably less than 40% and most preferably less than 10%.
  • the method according to the invention furthermore comprises a labeling step which serves for the labeling of optionally present molecules of the two predetermined, different types of sample macromolecules. If no molecules of at least two predetermined varieties are present in the sample, no labeling of such sample macromolecules will take place in this labeling step.
  • a labeling step is performed which acts only on sample macromolecules of the at least two different species of sample macromolecules.
  • the at least one reaction center is completely contacted with the sample solution such that a reaction between at least one type of probe macromolecules with sample macromolecules can take place if sample macromolecules are present in the sample that interfere with the probes bound to the reaction center Macromolecules can react specifically, so in particular are complementary.
  • reaction centers in which, according to the invention, several types of probe macromolecules are present, is used in the present text in particular for differentiation from “spots" of conventional microarrays, in which only one type of probe macromolecules is provided at a spot ,
  • the different types of probe macromolecules are mixed before application, for example.
  • the mixing ratio of the at least two different types of probe macromolecules of a reaction center can be determined for example in comparative preliminary experiments in such a way that the signal-to-noise ratio is optimal.
  • Such probe macromolecules, whose complementary sample macromolecules are less likely to be present in the sample may be provided in larger quantities at the reaction center, for example, than such probes. Macromolecules for which the probability of the presence of complementary sample macromolecules in the sample is greater.
  • the spots must therefore be numerous and as dense as possible on a microarray.
  • about 1,000 to 100,000 spots are spaced from a spot center to the center of an adjacent spot, typically 100-500 microns.
  • the individual spots must be very small (diameter about 50-250 microns) to get enough information even with a small sample liquid amount.
  • it is checked with a reaction center whether any sample macromolecules which are complementary to the probe macromolecules on the reaction center are present in the sample at all. It is therefore only necessary to carry out a very rapid and cost-effective examination step to determine whether, if necessary, a further examination is necessary or to decide whether the sample should be completely sorted out.
  • the sample macro-molecules of the sample liquid "see” another at different spots Sort of probe macromolecules.
  • the environment of the reaction is different in any case. However, it is not excluded that the environment itself, for example, significantly influences hybridization between probe macromolecules and sample macromolecules.
  • reaction centers are used in which probe macromolecules have been mixed, a uniform distribution of the molecules at a reaction center can be assumed. Accordingly, different sample macromolecules also see the same environment in the method according to the invention, so that an influence of the environment on the reaction is eliminated.
  • probe macromolecules are randomly distributed and the chance for a sample macromolecule to find an optional complementary probe macromolecule is accordingly higher on average.
  • a detection enhancement step is carried out in which the probability of detecting the molecules of at least one of the predetermined, different species of sample macromolecules is increased, if this variety is actually contained in the sample.
  • the detection enhancement step may simply comprise a concentration step for these proteins or peptides, preferably precipitation or dialysis.
  • the detection enhancement step comprises, for example, an amplification step, preferably a specific amplification step, which can be carried out, for example, with fluorescently labeled primers.
  • a concentration step in particular a precipitation or dialysis
  • an amplification step on the other hand, are not limited to the materials mentioned.
  • sample macromolecules of one of the at least two predetermined species are present in the sample despite the assumed low probability of such a presence, then in the detection increase step it is ensured that detection takes place even at very small amounts. If the sample does not contain any of the sample macromolecules whose presence is to be tested, the detection step will have no effect, so that no proof will be given correctly.
  • the method according to the invention yields a positive result, at least one of the at least two predetermined, different types of sample macromolecules is present in the sample despite the statistically low probability.
  • the sample can be sorted out, for example. This is conceivable, for example, if it is a blood sample for a transfusion, which is thus no longer usable. In other applications, however, it may be useful to find out which probe macromolecules contain complementary sample macro molecules in the sample. This can then be combined with another For example, a method known per se can be examined more precisely in a discrimination step.
  • mass spectroscopy or an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reaction are suitable for such a discrimination step.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • this discrimination step may comprise a PCR (polymerase chain reaction) step, a real-time PCR step, a gel electrophoresis or, for example, a dot blot Step include.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a discrimination step in particular a mass spectroscopy, an ELISA reaction, a PCR step, a gel electrophoresis or a dot blot step are not limited to the materials mentioned.
  • Discrimination step only necessary if in the test method according to the invention even a positive result is achieved. In this way, a significant cost saving is achieved because the more expensive detection methods are only necessary if a positive result has even occurred in the method according to the invention.
  • the labeling step for the sample molecules of the at least two predetermined varieties may be, for example, radioactive or electrochemical.
  • the use of a fluorescence label is particularly simple and advantageous, the fluorescence being examined at the end of the method according to the invention for testing the presence of sample macromolecules bound to the at least one reaction center.
  • an Eppendorf Silverquant® Kit for marking and a silver stain for detection can be used.
  • the labeling step for the predetermined sample macromolecules may be performed before or after the sample is contacted with the at least one reaction center. However, the labeling step can also be performed after removal of unbound sample material become. In each case, it can be used to detect whether corresponding sample macromolecules have been specifically bound to the reaction center. Finally, the marking step can also be carried out at the very beginning of the method according to the invention.
  • the labeling step for the sample macromolecules takes place in an amplification reaction, in particular by PCR (polymerase chain reaction) with, for example, fluorescently labeled primers. Only the sequences which can be amplified with the primers used are specifically labeled in this way.
  • the labeled primers for generating PCR products may be in dried form at the reaction centers themselves. If a PCR buffer is used in such embodiments of the method, with which the subsequent reaction for specific binding to the probe macromolecules of the at least one reaction center can be carried out, no further pipetting steps are necessary.
  • the marking material may then be present, for example, at the reaction center itself, for example in dried form.
  • reaction centers each having at least two types of macromolecules are used as probes on a carrier, which are preferably arranged in the form of an array.
  • a carrier which are preferably arranged in the form of an array.
  • a much smaller number of reaction centers can be provided than spots in conventional microarrays must be provided in order to obtain a sufficient information density. For example, only a few or a few tens of reaction centers are provided. This significantly reduces the manufacturing costs of the array.
  • reaction centers preferably only ten reaction centers are supported on a support. If, for example, ten different types of probe macromolecules are blended and spiked to form a reaction center, the manufacturing costs are reduced by a factor of ten compared with a conventional microarray in which only one type of probe macromolecule is provided for each spot. In addition, quality problems are reduced, since only a small number of reaction centers per carrier must be provided.
  • the information density is correspondingly higher due to the different types of probe macromolecules at a reaction center compared to a conventional microarray with spots, each containing only one type of probe macromolecule.
  • the assumed probabilities for the at least two different types of sample macromolecules may be taken into account to optimize the method.
  • the number of mixed-species probe macromolecules per reaction center on the array can be different. For example, for sample macromolecules of a pathogen that is more likely to occur, a reactivity However, for sample macromolecules of pathogens that occur with a very low probability, those reaction centers containing a larger number of probe macromolecules are blended.
  • the array should be chosen so that the probability of a positive result is approximately the same for all reaction centers. This may mean, for example, mixing between one and ten different probe macromolecules per reaction center.
  • probe macromolecules which are complementary to sample macromolecules of a particular organism are each admixed with at least two reaction centers. If this is done in a predetermined manner for all organisms whose presence in the sample is to be investigated, the organism can be determined or at least limited from the pattern of fluorescent reaction centers on the array even at the mixed reaction centers of the method according to the invention.
  • a further advantage of the method according to the invention using arrays with mixed reaction centers is that the arrays become smaller than they have to be in conventional microarrays. There may be more different tests done on a wearer of given size.
  • the carrier used for the method according to the invention may be, for example, a microtiter plate whose individual cavities are used as corresponding reaction centers, wherein a single cavity is coated with a corresponding mixture of probe macro molecules.
  • a substantially planar support is used, wherein the at least one reaction center is encompassed by an area on the support which has wetting properties other than its surroundings. If, for example, an aqueous solution is used as the sample solution, then the reaction center can be chosen to be hydrophilic in comparison to its surroundings. The reaction center may correspond to the hydrophilic region or be contained in it.
  • the sample liquid can be held in the form of a droplet held together by its surface tension on the hydrophilic area without flowing into the hydrophobic environment of the reaction center.
  • a simple localization of the sample liquid at the reaction center is possible and it can be a planar carrier, for example, a low-cost quartz or glass plate, are used.
  • a hydrophobic environment can be obtained, for example, by silanization.
  • groups of reaction centers may be comprised of a common region having different wetting properties than its environment. Such regions can in turn be arranged in a higher-order array, so that an "array-in-array" is present.
  • each reaction center is surrounded by separate areas with different wetting properties, whereby a particularly good localization and the use of very small amounts of material is possible.
  • the at least one reaction center or the plurality of reaction centers is surrounded by a group of two concentric, preferably round areas, the inner area having different wetting properties than the area of the reaction center and the outer area.
  • the inner concentric region may be hydrophobic compared to the reaction center, thus providing the described localization effect for an aqueous liquid in the form of a droplet.
  • the outer concentric region may serve and have suitable wetting properties to position an oil film on the sample liquid drop so as to cover the sample liquid during the reaction and prevent evaporation. This is particularly advantageous when small sample volumes are used, in which even small amounts of evaporation could lead to a falsification of the reaction result.
  • the prevention of evaporation during the reaction is particularly favorable when a PCR reaction is carried out, which requires the passage of a corresponding temperature profile.
  • volumes of, for example, 0.1 .mu.l to 10 .mu.l sample liquid can be examined, wherein the corresponding volume of the oil droplet, for example, by a factor of 2 to 5 greater.
  • each reaction center may also be surrounded by an individual concentric region of other wetting properties in order to hold the sample liquid at a reaction center and to disperse the array as a whole from one region.
  • sound waves in particular surface acoustic waves
  • surface acoustic waves can be sent in the direction of the sample liquid volume located on the reaction center.
  • Surface acoustic waves can be generated, for example, in a manner known per se with the aid of an interdigital transducer on a piezoelectric chip.
  • the method according to the invention is particularly suitable for testing the presence of nucleic acid sequences and / or for hybridization reactions.
  • test method for example, protein, Proteid- or peptide reactions can be examined.
  • the test method according to the invention can also be carried out with sample material which does not originate from only a single cell, whereby the sample preparation is greatly simplified.
  • sample quantities of greater than 100 pg, greater than 1 ng, or even greater than 10 ng (in each case based on the amount of DNA isolated) may be employed, thereby inherently DNA material of More than one cell (which usually has about 6 pg DNA material) is included. The higher the amount of DNA, the easier the sample preparation.
  • Sample macromolecules whose presence is to be tested may be, for example, complete sequences or partial sequences of an organism whose presence is to be tested.
  • organism is understood for the purposes of the present text in a broad sense and is intended in its use for pathogens, for example, viruses, bacteria, protozoa, spores, etc. and its use for genetically modified organisms such as varieties, lines, clones, etc . include.
  • the method according to the invention is suitable for investigations in which the at least two predetermined, different types of sample macromolecules belong to different organisms, so that the presence of these different organisms can be tested in one step. There are then at a reaction center provided probe macromolecules, which are complementary to the at least two predetermined, different types of sample macromolecules of different organisms.
  • a device has a support on which at least one reaction center is arranged, on which at least two types of probe macromolecules bound thereto are provided, which are bound to the reaction center without a predetermined spatial arrangement and thus to the predetermined, different types of sample macromolecules are complementary, that they can react specifically with them.
  • the device according to the invention is used for carrying out a method according to the invention for testing a liquid sample for the presence of at least one of at least two predetermined, different types of sample macromolecules, the at least two predetermined, different types of sample macromolecules each having a probability of less than 20%. available.
  • the probe macromolecules on the support of the device according to the invention are selected accordingly.
  • probe macromolecules are bound to a reaction center which are complementary to sample macromolecules of different organisms so that the presence of these different organisms can be tested with a reaction center.
  • the device according to the invention can have on the support a single reaction center or a plurality of reaction centers, preferably in the form of an array, each having at least two types of probe macromolecules.
  • the support may be, for example, a microtiter plate or a substantially planar support, in which case the at least one reaction center may be comprised by an area on the support having different wetting properties than its surroundings.
  • the planar support may be, for example, a glass or quartz plate or a solid state chip.
  • a preferred embodiment of the device according to the invention with a substantially planar support has around the at least one reaction center two concentric, preferably round regions, wherein the inner concentric region has different wetting properties than the reaction center and the outer region.
  • reaction centers may also each be combined to form, for example, a matrix-like group (for example in the form of a 2 ⁇ 2 or 9 ⁇ 9 matrix or another matrix-like arrangement) and be surrounded by a common range of other wetting properties.
  • regions comprising multiple reaction centers may in turn be arranged in a higher-level array (with, for example, 48, 96 or 384 regions) ("array-in-array").
  • the wetting properties are selected such that sample solution drops are held individually at the individual reaction centers and a covering oil film is held above the entire array or a group of reaction centers.
  • the reaction centers of individual hydrophobic regions and the entire array or group of reaction centers are one Area surrounding the location of an oil drop on the array.
  • a refinement of the device according to the invention has a device for generating sound waves, in particular surface acoustic waves, with the aid of which optimum distribution and / or thorough mixing of the sample liquid at a reaction center or a plurality of reaction centers can be achieved.
  • a device comprises, for example, an interdigital transducer on a piezoelectric surface. The emission direction of the interdigital transducer is selected such that it lies in the direction of a reaction center, so that sample liquid which is located on this reaction center can be set in motion with the aid of the surface acoustic waves generated with this interdigital transducer.
  • the marking step of the sample molecules of the at least two predetermined types can also take place after the application of the sample liquid to the reaction center.
  • a particularly practical embodiment of the device according to the invention has at the reaction center not only the at least two different types of probe macromolecules, but additionally material for marking at least the two different types of sample macromolecules.
  • the material for labeling may in particular comprise labeled primers for one or more PCR (polymerase chain reactions) and optionally the other components necessary for the PCR, for example polymerase.
  • PCR polymerase chain reactions
  • the material for labeling is nonspecifically bound to the at least one reaction center, for example dried.
  • the unspecifically bound material dissolves and is available for marking.
  • the sample solution is applied to a reaction center and dissolves the non-specifically bound label material, for example fluorophores, which can then react with the sample molecules of the sample solution to label them.
  • the devices thus prepared for carrying out the test method according to the invention are easy to handle and can be provided as a finished examination means for selected sample macromolecules.
  • At least one reaction center is used on which at least two types of known probe macromolecules are bound.
  • the potential probe macromolecules are for example, blended onto the solid surface of the carrier and then spotted as a reaction center. This results in a reaction center where different sample macromolecules can specifically bind a sample liquid.
  • the invention further relates to a kit for carrying out a test method according to the invention which comprises an apparatus according to the invention and a marking material, preferably in the form of a marking solution, which is suitable for marking at least one predetermined type of sample macromolecules.
  • the labeling material may in particular comprise labeled primers for one or more PCR (polymerase chain reactions) and optionally the buffers and nucleotides necessary for the PCR.
  • the material for labeling may already include the polymerase necessary for the PCR.
  • Embodiments of the kit which analogously correspond to the embodiments described for the method according to the invention or the embodiments described for the device according to the invention, are also included, without necessarily being separately listed or explained here for the kit.
  • the probe macromolecules for a reaction center to be selected for the device or the kit according to the invention are, for example, arranged in such a way that they correspond to tests to be carried out frequently. For example, for a test for genetically determined hereditary diseases in a reaction center, corresponding probe macromolecules could be pooled that would specifically react with sample macromolecules characteristic of these hereditary diseases, if any. To test whether an organism has been genetically engineered, such probe macromolecules can be used that are complementary to sample macromolecules that are characteristic of certain genetically engineered organisms.
  • selection criteria may be, for example, in particular classes or groups of organisms to be detected or sample macromolecules contained therein.
  • Fig. 1 shows an example of an inventively designed
  • 3 is a detail of an array of multiple reaction centers of an embodiment
  • 4 shows a plan view of a detail of an embodiment of a device according to the invention
  • FIG. 5 shows a section through the device according to the invention along the line IV-IV in Fig. 4, and
  • Fig. 6 is a plan view of a detail of another embodiment of a device according to the invention.
  • Fig. 1 shows a reaction center 10 to which probe macromolecules A, B, C have been applied.
  • Typical diameters of such reaction centers 10 are between 50 ⁇ m and a few millimeters.
  • A, B, C stand here by way of example for macromolecules which can react specifically with corresponding sample macromolecules in a sample liquid to be applied to the reaction center 10, of which the presence is to be investigated.
  • FIG. 1 only a few probe macromolecules of each kind are shown. In carrying out the method according to the invention, the number is usually much higher.
  • the macromolecules A, B, C are arranged randomly at the reaction center 10.
  • the typical length of the probe macromolecules used is between 15 and 100 base pairs. It is also possible to use longer PCR products or, for example, clones, antibodies or antigens or epitopes as probe macromolecules. Also, probe macromolecules of less than 15 base pairs are possible.
  • probe macromolecules A, B, C are mixed prior to application to the solid surface of a support and then spotted as a reaction center 10. Consequently The result is a reaction center where different sample macromolecules can specifically bind a sample fluid.
  • reaction centers 10 which may contain either similar or different probe macromolecules, can also be applied in the form of a matrix on a solid surface and thus form an array of reaction centers.
  • Such an arrangement is the subject of schematic Fig. 2, in the example of two of the illustrated reaction centers are designated by the reference numerals 10, 12.
  • Number of reaction centers are in the form of a matrix, which should be indicated by the dotted lines 13.
  • reaction centers on a support can be customized to test a particular selection of sample macromolecules for their presence in a sample solution.
  • prefabricated supports can be provided with selected reaction centers that combine typical classes or groups of probe macromolecules such that corresponding classes or groups of sample macromolecules can be tested for their presence in a sample solution.
  • a sample for example in the form of a sample solution
  • a sample solution for example, it is a food sample to be tested for genetically engineered changes.
  • a reaction center 10 is used, as in FIG. 1, in which probe macromolecules A, B, C are applied which lead to the macromolecules of the genetically modified organisms are complementary.
  • probe macromolecules A, B, C are applied which lead to the macromolecules of the genetically modified organisms are complementary.
  • Three different genetically modified organisms can be tested in this way, for which the sample macromolecules that are complementary to the probe macromolecules A, B, C are characteristic.
  • another, in particular much larger number is possible.
  • the food sample is subjected to a labeling step in which sample macromolecules belonging to the genetically engineered organisms to be plated are fluorescently labeled if present in the sample.
  • the corresponding labeling step is carried out, for example, by means of a polymerase chain reaction (PCR) by fluorescence-labeled primers. Only one fluorescent dye is used here so that all labels are the same.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Only one fluorescent dye is used here so that all labels are the same.
  • This step also leads to an increase in the amount of corresponding sample macromolecules of the genetically modified organisms, if such are actually present in the sample.
  • the sample is applied to the reaction center 10. It is a typical reaction time is awaited and then subjected to the solid surface, on which the reaction center 10 is a stringent washing step.
  • the fluorescence of the reaction center 10 is examined. If fluorescence-labeled sample macromolecules have bound specifically to the reaction center, they can be detected at the reaction center 10 after the washing step. If so, it can be concluded that sample macromolecules complementary to the probe macromolecules A, B, or C were present in the sample, and hence the presence of corresponding genetically engineered organisms for which the sample macromolecules are characteristic.
  • the sample will not contain a genetically modified organism, so that no fluorescence can be measured.
  • the first result will be that corresponding genetically engineered organisms are present in the sample.
  • a second step it is possible to check, if necessary, which of the three genetically modified organisms are available. This can be ascertained, for example, in a manner known per se by means of a specific PCR step or gel electrophoresis. This time-consuming and expensive step is accordingly only necessary if a fluorescence signal could previously be measured at the reaction center. Otherwise, the time-consuming and cost-intensive specific examination step can be dispensed with.
  • a polymerase chain reaction is carried out with appropriately labeled primers using, for example, a buffer with which the reaction for specific binding to the probe macromolecules of the reaction center 10 is carried out can be.
  • the marking material may be added to the sample solution and, for example, be part of a kit comprising a reaction center or an array of reaction centers according to the invention for testing the presence of certain sample macromolecules and a marking solution with the marking material.
  • the labeling step can be carried out before the reaction by applying a specific labeling method in which only the sample Macromolecules whose presence in the sample solution should be examined. On the other hand, it is also possible to carry out the labeling step only after the reaction or after removal of unbound sample material.
  • the material for marking is present at the reaction center 10, for example in dried form.
  • the reaction center 10 for example in dried form.
  • appropriately prepared examination devices which have different probe macromolecules A, B, C for the specific reaction with sample macromolecules and also the required fluorescent markers on the at least one reaction center. It may be, for example, labeled primers for PCR.
  • the sample solution is applied to such a reaction center and dissolves the nonspecifically bound fluorophores, which can then react with any sample macromolecules present in the sample to mark them.
  • Such prepared devices for carrying out the method according to the invention are easy to handle and can be provided as a finished assay for selected sample macromolecules in a sample solution.
  • a patient's blood sample can be tested for the presence of genetically manifested rare hereditary diseases in an analogous manner.
  • a reaction center 10 contains a plurality of probe macromolecules A, B, C, which are complementary to sequences or partial sequences which are characteristic of the genetic hereditary diseases to be examined.
  • probe macromolecules A, B, C which are complementary to sequences or partial sequences which are characteristic of the genetic hereditary diseases to be examined.
  • the characteristic sequences or partial sequences is very small, in particular less than 20%.
  • a reaction center comprises five different binding sites specific to different pathogens. If there is no specific binding after carrying out the method according to the invention, no pathogens above the detection limit are present in the sample.
  • probe macromolecules complementary to sample macromolecules of a particular organism may each be admixed with at least two reaction sites. If a sample macromolecule species complementary to one of the probe macromolecules is present in the sample, two reaction centers will be illuminated during the fluorescence assay. By way of example, this mechanism is shown in FIG. Here, by way of example, three reaction centers 10, 11, 12 are shown. Probe macromolecules A and B are present on the first reaction center 10, and probe macromolecules A and C on the second reaction center 11 and probe macromolecules B and C on the third reaction center 12. Macromolecules are present in the sample. Macromolecule A are complementary, so glow the first two reaction centers 10, 11 in the fluorescence study.
  • the second and third reaction centers 11, 12 are illuminated. If sample macromolecules in the sample that are complementary to the probe macromolecules B are present, the first and the third reaction centers 10, 12 illuminate during the fluorescence examination. A distinction between the existing sample macromolecule species is thus possible.
  • Fig. 4 shows the top view of a reaction center of a modified embodiment of the device according to the invention.
  • the reaction center 10 is surrounded here by a concentric region 16, which is hydrophobic compared to the reaction center 10. This can be achieved, for example, by silanizing region 16.
  • the hydrophobic region 16 is surrounded by a further concentric region 18 which has such wetting properties that it can serve to localize an oil drop held together by its surface tension, ie is correspondingly lipophilic compared to its external environment.
  • regions numbered 10 and 18 may have the same or similar wetting characteristics.
  • Fig. 5 shows a section through such a reaction center along the line IV-IV, as indicated in Fig. 4.
  • a drop 22 of sample solution is shown, which is covered by an oil film 24.
  • the solid surface for example a glass plate, is designated 20.
  • the sample solution 22 is held together by its surface tension and does not leave the region of the reaction center 10, which is hydrophilic in comparison to the hydrophobic region 16, without an external force, whereby it is located at the reaction center 10.
  • an oil drop 24 is applied above the sample solution drop 22, which does not leave the region 18 due to its surface tension.
  • the use of such an oil drop 24 is advantageous in order to prevent evaporation.
  • the geometry may also be chosen so that the oil drop covers several reaction centers and the sample solution drops thereon.
  • a lipophilic region for locating the oil droplet in comparison with its external environment surrounds a plurality of individual reaction centers, each of which in turn has its own hydrophobic region surrounding it, or a lipophilic region which is hydrophobic compared to its external environment Area surrounding a group of reaction centers (for example, each a 2x2 or 9x9 matrix or another matrix-like arrangement), so that this group is covered by a common sample liquid drop.
  • the reaction centers may each be arranged in the form of a matrix (for example as a 2x2 or 9x9 matrix).
  • FIG. 6 shows a corresponding example in which a group 26 of reaction centers 10 arranged in the form of a 3 ⁇ 3 matrix is surrounded by a common hydrophobic region 16 and a lipophilic region 18 concentric thereto in relation to its external environment.
  • groups 26 of reaction centers 10 may in turn also be arranged in a superordinate array, so that an "array-in-array" is present, wherein the superordinate array may comprise, for example, 48, 96 or 384 of such groups 26.
  • a concentric region can also act both hydrophobic and lipophilic and take over the described tasks of a hydrophobic and a lipophilic region.
  • An additional mixing of the sample solution on the surface of the support can be achieved when surface acoustic waves are sent towards the reaction center, which are generated for example by means of an interdigital transducer on the support surface, whose emission direction is directed to the reaction center.
  • the carrier material may be piezoelectrically selected or coated for this purpose.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prüfung einer flüssigen Probe auf die Anwesenheit von wenigstens einer von wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle, wobei die wenigstens zwei vorbestimmten Sorten unterschiedlicher Proben-Makromoleküle jeweils mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 20 % in der Probe vorliegen und wobei ein Träger mit wenigstens einem Reaktionszentrum bereitgestellt wird, an dem wenigstens zwei Sorten von Sonden-Makromolekülen gebunden sind, die derart zu den wenigstens zwei vorbestimmten Sorten unterschiedlicher Proben-Makromoleküle komplementär sind, dass sie mit diesen spezifisch reagieren können, ein Markierungsschritt zur Markierung zumindest der vorbestimmten Proben-Makromoleküle durchgeführt wird, die Probe mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum derart in Kontakt gebracht wird, dass eine Reaktion zwischen den vorbestimmten Proben-Makromolekülen und den jeweils komplementären Sonden-Makromolekülen stattfinden kann, ungebundenes Probenmaterial entfernt wird und das Vorhandensein von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum spezifisch gebundenen Proben-Makromolekülen geprüft wird. Die Erfmdung betrifft weiterhin eine Vorrichtung und ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäβen Verfahrens und ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäβen Vorrichtung.

Description

Verfahren, Vorrichtung und Kit zur Untersuchung einer Flüssigkeitsprobe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zur Untersuchung einer flüssigen Probe auf die Anwesenheit von vorbestimmten Sorten von Proben-Makromolekülen.
Zum Beispiel in der Diagnostik möchte man häufig die Anwesenheit von vorbestimmten Proben-Makromolekülen prüfen, wie zum Beispiel bestimmter Nukleinsäuresequenzen oder -teilsequenzen, Antikörpern, Antigenen, Proteinen etc. Beispielsweise müssen alle Proben in Blutbanken auf die Anwesenheit des HIV- und HCV- Virus geprüft werden. Vielfach werden dazu PCR-(Polymerase-Kettenreaktion-)gestützte Verfahren verwendet, die in der Regel in getrennten Reaktionen für die unterschiedlichen Teilsequenzen des HIV- Virus durchgeführt werden.
Es ist wünschenswert, wenn die Zahl der notwendigen Pipettierschritte und damit die Kosten sowie der Verbrauch von Reagenzien und Probenmaterial verringert werden. Letzteres ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn nur wenig Probenmaterial, zum Beispiel bei Blutproben von Säuglingen, vorliegt. Daher wurde vorgeschlagen, derartige Untersuchungsas- says zu parallelisieren, d.h. zu "multiplexen", um mehrere Untersuchun- gen parallel durchführen zu können.
Aus EP 373 203 Bl ist ein Verfahren und eine Vorrichtung bekannt, wie man zum Beispiel Nukleinsäureassays multiplexen kann. Dabei werden unterschiedliche Oligonukleotide auf Festkörperoberflächen in Form einer Matrix aufgebracht (zum Beispiel gespottet) und dort so gebunden, dass sie sich unter den Hybridisierungsbedingungen nicht ablösen können.
Die so gebundenen Oligonukleotide bilden "Sonden", die in nicht überlap- penden Zellen, so genannten Spots, angeordnet sind, die typischerweise Durchmesser von 50 bis 250 μm aufweisen. Eine Vielzahl von Spots in einer Matrix wird als Mikroarray bezeichnet.
Bringt man eine Probenflüssigkeit, die fluoreszenzmarkierte Nukleinsäu- resequenzen enthält, unter Hybridisierungsbedingungen auf die Festkörperoberfläche, so können die markierten Nukleinsäuresequenzen in der Probe mit den Oligonukleotiden der Spots hybridisieren. Wird im An- schluss die Probenflüssigkeit unter stringenten Bedingungen von der Festkörperoberfläche abgewaschen, bleiben nur diejenigen Nukleinsäure- Sequenzen der Probe auf dem Festkörper zurück, die spezifisch an entsprechende Sondenoligonukleotide gebunden sind. Durch ortsaufgelöstes Messen der Fluoreszenz lässt sich nun feststellen, an welchen Spots Nukleinsäuresequenzen der Probe gebunden wurden. Da die als Sonden gespotteten Oligonukleotide bekannt sind, lassen sich so Rückschlüsse auf die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuresequenzen ziehen. Derartige Arrays werden zum Beispiel in der Diagnostik oder der Forschung zur Genexpressionsanalyse (gen expression profiling) oder CGH (comparative genomic hybridization) eingesetzt.
Ähnlich können zum Beispiel gentechnisch veränderte Organismen (GVO) mit Hilfe von Mikroarrays nachgewiesen werden, wobei zu den transgenen Elementen der GVOs komplementäre Moleküle als Sonden verwendet werden. Ein solcher Nachweis basiert zum Beispiel ebenfalls auf einer PCR- Reaktion und der anschließenden Hybridisierung mit dem PCR-Produkt. Dabei kann zum Beispiel ausgenutzt werden, dass nach einer Verordnung der europäischen Union jeder zugelassene gentechnisch veränderte Organismus einen einmaligen, spezifischen Marker besitzen muss, welcher dann zum Beispiel mittels einer realtime-PCR oder ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) -Reaktion nachgewiesen werden kann.
Bei derartigen Verfahren ist es notwendig, die Fehlerraten beim Herstellen der Arrays, insbesondere beim Aufbringen der Sonden-Moleküle, sehr gering zu halten. In konventionellen Mikroarrays definiert sich die Quali- tat des Produkts geradezu nach dem Grad der Einzigartigkeit der Sequenz in einem Spot. Es ist bei konventionellen Mikroarrays das Ziel, möglichst nur eine Population (100 % ohne Fehler) einer Sequenz pro Spot zu erreichen. Insbesondere bei In-Situ-Verfahren zur Herstellung solcher Mikroarrays ist die Fehlerrate von ausschlaggebender Bedeutung. Auch Anbieter von Kontakt- oder Nicht- Kontaktprintern, die als Alternative zum In-Situ- Verfahren zum Einsatz kommen, werben für ihre Produkte damit, dass es bei der Herstellung der Mikroarrays nicht zur "Verschleppung von Material" von einem Spot zum anderen kommt, wodurch ebenfalls dokumentiert wird, dass bei konventionellen Mikroarrays gerade der Nicht- Vermischung große Bedeutung beigemessen werden muss. Es ist dementsprechend ein aufwändiger und kostenintensiver Spottingprozess mit hoher Genauigkeit notwendig, der insbesondere auch an die Qualitätskontrolle hohe Anforderungen stellt. Zudem sind die Spotmorphologien von Spots unterschiedlicher Makromoleküle abhängig von der Molekülsorte selbst, so dass die Durchmesser der Spots solcher gespotteten Mikroarrays immer ein wenig schwanken können, wodurch zum Beispiel die Auswertung mit Hilfe automatischer Bilderkennung problematisch werden kann. Schließlich ist für das Auslesen derartiger Mikroarrays mit Spots, die sich durch die aufgebrachten Makromoleküle unterscheiden, ein Scanner notwendig, der die entsprechende Ortsauflösung bietet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zur Prüfung einer Flüssigkeitsprobe auf die Anwesenheit von wenigstens einer von wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle anzugeben, die die Information auf schnelle und kostengünstige Weise bereitstellen.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren zur Prüfung einer Flüssigkeitsprobe mit den Merkmalen des Anspruchs 1 , einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 30 bzw. mit einem Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 49 gelöst. Unteransprüche sind auf bevorzugte Ausführungs- formen gerichtet. Ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist Gegenstand des Anspruchs 48.
Bei dem erfindungsgemäßen Prüfverfahren wird die Anwesenheit von wenigstens einer von wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle geprüft. Dabei wird eine Flüssigkeitsprobe eingesetzt, von der anzunehmen ist, dass die wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle jeweils mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 20 % in der Probe vorliegen. Der Begriff des Vorhandenseins von Proben-Makromolekülen soll für die Zwecke des vorliegenden Textes so verstanden werden, dass er zum Beispiel ein Vorhandensein in einer Menge oberhalb der verfahrenstechnisch bedingten Nachweisgrenze bedeutet.
Die Probenflüssigkeit kann zum Beispiel eine Lösung, eine Dispersion oder eine Suspension des zu untersuchenden Materials umfassen. Beispielsweise kann das erfindungsgemäße Prüfverfahren angewendet werden, um in einem einfachen und schnellen Schritt festzustellen, ob eine Blutprobe mit einem von mehreren ausgewählten Krankheitserregern oder ähnlichem infiziert ist. Bejahendenfalls kann die entsprechende Blutprobe, wenn sie zum Beispiel zur Transfusion vorgesehen war, aussortiert werden bzw. mit einem anderen Test spezifisch festgestellt werden, welcher Erreger tatsächlich vorliegt. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt die Erstinformation schnell zur Verfügung, so dass eine entspre- chende Person zur Verringerung der Ansteckungsgefahr gleich isoliert werden kann, während dann erst untersucht wird, welcher der ausgewählten Krankheiterreger vorhanden ist.
In der Regel wird dabei davon ausgegangen, dass in der entsprechenden Blutprobe keine Infektion vorliegt, so dass insbesondere mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 20 % angenommen werden kann, dass kein Erreger vorliegt, dessen Anwesenheit getestet werden soll.
Analog kann zum Beispiel an Hand einer Blutprobe das Vorliegen einer sich genetisch manifestierenden Erbkrankheit geprüft werden.
Ein anderes Beispiel betrifft die Prüfung, ob in einem Nahrungsmittelprodukt gegebenenfalls unerlaubterweise gentechnisch veränderte Organismen (GVO) vorliegen. Auch hier geht man in der Regel davon aus, dass die zu untersuchende Probe keine solchen GVOs enthält. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich auf schnelle Weise feststellen, ob doch solche GVOs vorhanden sind. Sollte das erfindungsgemäße Prüfverfahren ergeben, dass solche GVOs vorhanden sind, kann in einem weiteren Untersuchungsschritt geprüft werden, um welche GVOs es sich genau handelt. Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet dementsprechend Flüssigkeitsproben, bei denen die wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 20 % vorliegen. Diese Wahrscheinlichkeit kann sich zum Beispiel aus entsprechenden Statistiken ergeben oder zum Beispiel dadurch, dass davon ausgegangen wird, dass ein Proband in der Regel nicht krank ist oder ein Nahrungsmittel nicht gentechnisch verändert wurde. Bevorzugte positive Ergebniswahrscheinlichkeiten sind weniger als 15 %, bevor- zugt weniger als 10 %, besonders bevorzugt weniger als 5 % oder ganz besonders bevorzugt weniger als 1 %.
Es wird ein Träger bereitgestellt, der wenigstens ein Reaktionszentrum aufweist, an dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen ("Sonden" -Makromoleküle oder "Fänger" -Makromoleküle) gebunden sind. Dazu werden die als Sonden-Makromoleküle einzusetzenden Makromoleküle vor dem Aufbringen auf das Reaktionszentrum abgemischt. An einem Reaktionszentrum ist die Anordnung der unterschiedlichen Sonden- Makromoleküle unerheblich und daher vorzugsweise statistisch verteilt. Bei dem erfindungsgemäßen Prüfverfahren wird also zumindest ein Reaktionszentrum eingesetzt, an dem unterschiedliche nachzuweisende Makromoleküle (Proben-Makromoleküle) spezifisch binden können. Bevorzugt kommen als unterschiedliche Sonden-Makromoleküle Makromoleküle zum Einsatz, deren Ähnlichkeit geringer als 90 %, bevorzugter geringer als 70 %, besonders bevorzugt geringer als 40 % und ganz besonders bevorzugt geringer als 10 % ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiterhin einen Markierungsschritt, der zur Markierung gegebenenfalls vorhandener Moleküle der zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle dient. Sind keine Moleküle der wenigstens zwei vorbe stimmten Sorten in der Probe vorhanden, so wird in diesem Markierungsschritt auch keine Markierung solcher Proben-Makromoleküle stattfinden.
Grundsätzlich ist es auch unschädlich, wenn zusätzlich andere in der Probe vorhandene Moleküle markiert werden. Diese werden mit den speziell ausgewählten Sonden-Makromolekülen des Reaktionszentrums nicht spezifisch reagieren und insofern bei dem Schritt zur Entfernung ungebundenem Probenmateriales ohnehin entfernt. Vorzugsweise wird jedoch ein Markierungsschritt durchgeführt, der nur auf Proben-Makromoleküle der wenigstens zwei unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle wirkt.
Das wenigstens eine Reaktionszentrum wird vollständig mit der Probenlö- sung derart in Kontakt gebracht, dass eine Reaktion zwischen wenigstens einer Sorte Sonden-Makromoleküle mit Proben-Makromolekülen stattfinden kann, wenn Proben-Makromoleküle in der Probe vorhanden sind, die mit den am Reaktionszentrum gebundenen Sonden-Makromolekülen spezifisch reagieren können, also insbesondere dazu komplementär sind.
Nach Abwarten einer typischen Reaktionszeit wird ungebundenes Probenmaterial zum Beispiel durch einen stringenten Waschschritt entfernt. Schließlich wird das Vorhandensein von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum spezifisch gebundenen Proben-Makromolekülen geprüft. Eine ortsaufgelöste Auswertung der Ergebnisse ist für ein Reaktionszentrum nicht nötig, so dass einfach das Gesamtergebnis für das jeweilige Reaktionszentrum, das zum Beispiel durch eine integrale Auswertung der Fluoreszenz erhalten werden kann, verwendet werden kann. Im Vergleich zu bekannten Verfahren, bei denen konventionelle Mikroar- rays eingesetzt werden, bei denen je Spot nur eine Sorte von Makromolekülen vorhanden ist, ist der Aufwand beim Spotten zur Herstellung des Trägers zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erheblich reduziert und die Anzahl der notwendigen Pipettierschritte sehr viel kleiner.
Werden zum Beispiel zum Herstellen eines Reaktionszentrums zehn unterschiedliche Sorten Sonden-Makromoleküle abgemischt und als ein Reaktionszentrum aufgespottet, so verringern sich die Herstellkosten um einen Faktor zehn gegenüber einem konventionellen Mikroarray mit Spots, an denen sich jeweils nur eine Sorte Sonden-Makromoleküle befindet.
Der Begriff "Reaktionszentren", an denen erfindungsgemäß jeweils mehre- re Sorten Sonden-Makromoleküle vorliegen, wird im vorliegenden Text insbesondere zur Abgrenzung gegenüber "Spots" herkömmlicher Mikroar- rays verwendet, bei denen an einem Spot jeweils nur eine Sorte Sonden- Makromoleküle vorgesehen ist.
Bei der Herstellung eines Trägers zur Durchführung des erfindungsgemäßen Prüfverfahrens werden die unterschiedlichen Sorten Sonden- Makromoleküle vor dem Aufbringen zum Beispiel abgemischt. Das Mischungsverhältnis der wenigstens zwei unterschiedlichen Sorten Sonden- Makromoleküle eines Reaktionszentrums kann zum Beispiel in verglei- chenden Vorversuchen derart festgelegt werden, dass das Signal-Rausch- Verhältnis optimal ist. Solche Sonden- Makromoleküle, für deren komplementäre Proben-Makromoleküle die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins in der Probe geringer ist, können dazu zum Beispiel an dem Reaktionszentrum in größerer Menge vorgesehen sein, als solche Sonden- Makromoleküle, für die die Wahrscheinlichkeit des Vorhandenseins komplementärer Proben-Makromoleküle in der Probe größer ist.
Bei konventionellen Mikroarrays erhält man je Spot nur die Information für eine Sorte Proben-Makromoleküle. Die Spots müssen daher auf einem Mikroarray zahlreich und möglichst dicht angeordnet sein. In der Regel sind auf einem konventionellen Mikroarray ca. 1.000 bis 100.000 Spots mit einem Abstand eines Spotzentrums zum Zentrum eines benachbarten Spots von typischerweise 100-500 Mikrometer angeordnet. Infolgedessen müssen die einzelnen Spots sehr klein sein (Durchmesser etwa 50-250 Mikrometer), um auch mit einer kleinen Probenflüssigkeitsmenge ausreichend Information zu bekommen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird jedoch mit einem Reaktionszentrum geprüft, ob überhaupt in der Probe solche Proben-Makromoleküle vorhanden sind, die zu den Sonden- Makromolekülen auf dem Reaktionszentrum komplementär sind. Man benötigt also nur einen sehr schnell und kostengünstig durchzuführenden Untersuchungsschritt zur Feststellung, ob gegebenenfalls eine weitere Untersuchung notwendig ist oder um zu entscheiden, ob die Probe vollständig aussortiert werden soll.
Da die Sonden-Makromoleküle eines Reaktionszentrums nicht wie bei bekannten Mikroarrays in räumlich getrennten Spots vorliegen, ergibt sich außerdem der Vorteil, dass zum Kontakt der Proben-Makromoleküle mit den Sonden-Makromolekülen nur minimale Wegstrecken zurückgelegt werden müssen. Für diffusionslimitierte Reaktionen bringt das einen erheblichen Zeitvorteil.
Bei einem konventionellen Mikroarray, bei dem an den Spots jeweils nur eine Sorte von Makromolekülen vorhanden ist, "sehen" die Proben-Makro- moleküle der Probenflüssigkeit an unterschiedlichen Spots eine andere Sorte von Sonden-Makromolekülen. Die Umgebung der Reaktion ist also auf jeden Fall unterschiedlich. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, dass die Umgebung selbst zum Beispiel eine Hybridisierung zwischen Sonden- Makromolekülen und Proben-Makromolekülen maßgeblich beeinflusst. Beim erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem Reaktionszentren eingesetzt werden, an denen Sonden-Makromoleküle abgemischt wurden, kann man dagegen von einer gleichmäßigen Verteilung der Moleküle an einem Reaktionszentrum ausgehen. Unterschiedliche Proben-Makromoleküle sehen dementsprechend beim erfindungsgemäßen Verfahren auch dieselbe Um- gebung, so dass ein Einfluss der Umgebung auf die Reaktion wegfällt. Auch Gradienten, die auftreten können, weil die Probenlösung die Oberfläche zum Beispiel von links nach rechts benetzt und eine gewisse Zeit dazu braucht, können nicht vorkommen. Die Sonden-Makromoleküle sind statistisch verteilt und die Chance für ein Proben-Makromolekül, ein ge- gebenenfalls vorhandenes komplementäres Sonden- Makromolekül zu finden, ist dementsprechend im Durchschnitt höher.
Bei einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Nachweiserhöhungsschritt durchgeführt, bei dem die Wahrscheinlichkeit des Nachweises der Moleküle wenigstens einer der vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle erhöht wird, falls diese Sorte in der Probe tatsächlich enthalten ist.
Insbesondere, wenn zum Beispiel die Anwesenheit von vorbestimmten Proteinen oder Peptiden als Proben-Makromoleküle in der Probe geprüft werden soll, kann der Nachweiserhöhungsschritt einfacherweise einen Aufkonzentrierungsschritt für diese Proteine oder Peptide umfassen, vorzugsweise eine Fällung oder eine Dialyse. Insbesondere, wenn zum Beispiel die Anwesenheit von vorbestimmen Nukleinsäuren, insbesondere zum Beispiel DNA, als Probenmoleküle in der Probe geprüft werden soll, umfasst der Nachweiserhöhungsschritt zum Beispiel einen Amplifikationsschritt, vorzugsweise einen spezifischen Amplifikationsschritt, der zum Beispiel mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt werden kann.
Die Anwendung eines Aufkonzentrierungsschrittes, insbesondere einer Fällung oder Dialyse, einerseits und die Anwendung eines Amplifikati- onsschrittes andererseits sind nicht auf die genannten Materialien beschränkt.
Befinden sich in der Probe trotz der angenommenen geringen Wahrscheinlichkeit für ein solches Vorhandensein Proben-Makromoleküle einer der wenigstens zwei vorbestimmten Sorten, so wird in dem Nachweiserhöhungsschritt sichergestellt, dass auch bei sehr geringen Mengen ein Nachweis stattfindet. Befinden sich in der Probe keine der Proben- Makromoleküle, deren Anwesenheit geprüft werden soll, bleibt der Nachweiserhöhungsschritt wirkungslos, so dass korrekterweise auch kein Nachweis erfolgen wird.
Ergibt das erfindungsgemäße Verfahren ein positives Ergebnis, so liegt in der Probe trotz der statistisch geringen Wahrscheinlichkeit wenigstens eine der wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Pro- ben-Makromoleküle vor. Je nach Anwendung kann die Probe zum Beispiel aussortiert werden. Dies ist zum Beispiel denkbar, wenn es sich um eine Blutprobe für eine Transfusion handelt, die damit nicht mehr verwendbar ist. Bei anderen Anwendungen kann es jedoch sinnvoll sein, herauszufinden, zu welchen Sonden-Makromoleküle komplementäre Proben-Makro- moleküle in der Probe vorhanden sind. Dies kann dann mit einem ande- ren, zum Beispiel einem an sich bekannten, Verfahren in einem Diskriminierungsschritt genauer geprüft werden.
Für einen solchen Diskriminierungsschritt eignen sich zum Beispiel bei der Prüfung auf Anwesenheit von bestimmten Proteinen oder Peptiden als Proben-Makromoleküle Massenspektroskopie oder eine ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay)-Reaktion.
Bei einem Verfahren zur Überprüfung der Anwesenheit von vorbestimm- ten Nukleinsäuren, zum Beispiel DNA, als Probenmoleküle kann dieser Diskriminierungsschritt einen PCR- (Polymerase Chain Reaction-) Schritt, einen realtime-PCR-Schritt, eine Gelelektrophorese oder zum Beispiel einen Dot-Blot-Schritt umfassen.
Die Anwendung eines Diskriminierungsschrittes, insbesondere einer Massenspektroskopie, einer ELISA-Reaktion, eines PCR-Schrittes, einer Gelelektrophorese oder eines Dot-Blot-Schritts sind nicht auf die genannten Materialien beschränkt.
Die möglicherweise kostenintensiveren genaueren Analyseschritte des
Diskriminierungsschritts werden allerdings nur notwendig, wenn bei dem erfindungsgemäßen Prüfverfahren überhaupt ein positives Ergebnis erzielt wird. Auf diese Weise wird eine signifikante Kostenersparnis erreicht, da die teureren Nachweisverfahren nur dann notwendig werden, wenn über- haupt ein positives Ergebnis in dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgetreten ist.
Hier zeigt sich ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens. Im Normalfall wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren keine Hybridisie- rung zwischen Sonden-Makromolekülen und Proben-Makromolekülen stattfinden. Nur falls doch, muss gegebenenfalls in einer zweiten Untersuchung geklärt werden, welche Proben-Makromoleküle hybridisiert haben. Insofern geht das erfindungsgemäße Verfahren von einer Nullhypothese aus, d.h. zum Beispiel dass der untersuchte Organismus die durch die Sonden-Makromoleküle nachweisbaren Krankheiten nicht hat oder zum Beispiel dass ein Organismus keinen transgenen Abschnitt enthält und insofern nicht gentechnisch verändert worden ist. Das erfindungsgemäße Verfahren dient also in solchen Fällen als "Filter", um die Zahl kostenintensiver und zeitraubender nachfolgender Schritte zu reduzieren.
Aus dem Beschriebenen wird klar, dass ein Assay mit abgemischten Reaktionszentren insbesondere Vorteile bietet, wenn mit hoher Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden kann, dass es keine Reaktion gibt, d.h. keine der wenigstens zwei vorbestimmten Proben-Makromole kül- Sorten vorhanden ist.
Der Markierungsschritt für die Probenmoleküle der wenigstens zwei vorbestimmten Sorten kann zum Beispiel radioaktiv oder elektrochemisch sein. Besonders einfach und vorteilhaft ist die Verwendung einer Fluores- zenzmarkierung, wobei zur Prüfung des Vorhandenseins von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum gebundenen Proben-Makromoleküle am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens die Fluoreszenz untersucht wird.
Alternativ kann zum Beispiel ein Eppendorf Silverquant® Kit zur Markie- rung und eine Silberfärbung zum Nachweis verwendet werden.
Der Markierungsschritt für die vorbestimmten Proben-Makromoleküle kann vor oder nach dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum erfolgen. Der Markierungsschritt kann aber auch nach dem Entfernen ungebundenen Probenmaterials vorgenommen werden. In jedem Fall kann damit nachgewiesen werden, ob entsprechende Proben-Makromoleküle spezifisch an dem Reaktionszentrum gebunden wurden. Schließlich kann der Markierungsschritt auch ganz zu Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgenommen werden.
Besonders einfach ist der Nachweis, ob Proben-Makromoleküle einer der zwei vorbestimmten Sorten an den Reaktionszentren gebunden haben, wenn die Markierung, insbesondere die Fluoreszenzmarkierung, für alle Proben-Makromoleküle der zwei vorbestimmten Sorten gleich gewählt wurde.
Bei einer besonderen Ausgestaltung findet der Markierungsschritt für die Proben-Makromoleküle in einer Amplifikationsreaktion, insbesondere durch PCR (Polymerase-Kettenreaktion) mit zum Beispiel fluoreszenzmar- kierten Primern statt. Nur die mit den verwendeten Primern amplifizierba- ren Sequenzen werden auf diese Weise spezifisch markiert. Die markierten Primer zur Erzeugung von PCR-Produkten können zum Beispiel in getrockneter Form an den Reaktionszentren selbst vorliegen. Wird bei solchen Ausgestaltungen des Verfahrens ein PCR-Puffer eingesetzt, mit dem auch die anschließende Reaktion zur spezifischen Bindung an den Sonden-Makromolekülen des wenigstens eines Reaktionszentrums durchgeführt werden kann, sind keine weiteren Pipettierschritte mehr notwendig.
Das Material zur Markierung kann dann zum Beispiel an dem Reaktions- Zentrum selbst vorliegen, zum Beispiel in getrockneter Form.
Eine weitergehende Parallelisierung kann erreicht werden, wenn mehrere Reaktionszentren mit jeweils wenigstens zwei Sorten von Makromolekülen als Sonden auf einem Träger eingesetzt werden, die vorzugsweise in Form eines Arrays angeordnet sind. Auf so einem Array kann dann eine sehr viel geringere Anzahl von Reaktionszentren vorgesehen sein als Spots bei konventionellen Mikroarrays vorgesehen sein müssen, um eine ausreichende Informationsdichte zu erhalten. Zum Beispiel werden nur einige wenige oder einige zehn Reaktionszentren vorgesehen. Dadurch verringern sich die Herstellkosten des Arrays signifikant.
Vorzugsweise werden zum Beispiel nur zehn Reaktionszentren auf einem Träger aufgebracht. Werden zum Beispiel für die Bildung eines Reaktionszentrums zehn unterschiedliche Sorten Sonden-Makromoleküle abgemischt und aufgespottet, verringern sich die Herstellkosten um einen Faktor zehn gegenüber einem herkömmlichen Mikroarray, bei dem je Spot nur eine Sorte Sonden- Makromoleküle vorgesehen ist. Außerdem werden Qualitätsprobleme verringert, da nur eine geringe Anzahl an Reaktionszentren pro Träger vorgesehen sein muss.
Wird andererseits eine größere Zahl Reaktionszentren eingesetzt, ist die Informationsdichte aufgrund der unterschiedlichen Sorten Sonden- Makromoleküle an einem Reaktionszentrum gegenüber einem konventionellen Mikroarray mit Spots, die jeweils nur eine Sorte Sonden- Makromoleküle enthalten, entsprechend höher.
Beim Design solcher Arrays für das erfindungsgemäße Verfahren können die angenommenen Wahrscheinlichkeiten für die wenigstens zwei unterschiedlichen Sorten von Proben-Makromolekülen berücksichtigt werden, um das Verfahren zu optimieren. Dazu kann die Zahl der abgemischten Sorten Sonden-Makromoleküle pro Reaktionszentrum auf dem Array unterschiedlich sein. So wird zum Beispiel für Proben-Makromoleküle eines Erregers, der mit einer größeren Wahrscheinlichkeit auftritt, ein Reakti- onszentrum erzeugt, in dem nur wenige verschiedene Sorten Sonden- Makromoleküle vorgesehen sind, während für Proben-Makromoleküle von Erregern, die mit einer sehr geringen Wahrscheinlichkeit auftreten, solche Reaktionszentren abgemischt werden, die eine größere Anzahl von Son- den-Makromolekülen enthalten. Idealerweise wählt man das Array so, dass die Wahrscheinlichkeit für ein positives Ergebnis für alle Reaktionszentren in etwa gleich ist. Das kann zum Beispiel bedeuten, dass man zwischen ein und zehn verschiedenen Sonden-Makromoleküle je Reaktionszentrum abmischt.
Bei einer anderen Weiterführung des Erfindungsgedankens werden Sonden-Makromoleküle, die komplementär zu Proben-Makromolekülen eines bestimmten Organismus sind, jeweils mindestens zwei Reaktionszentren beigemischt. Macht man dies in vorbestimmter Weise für alle Organismen, deren Anwesenheit in der Probe untersucht werden soll, so lässt sich aus dem Muster fluoreszierender Reaktionszentren auf dem Array auch bei den abgemischten Reaktionszentren des erfindungsgemäßen Verfahrens der Organismus bestimmen bzw. zumindest eingrenzen.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Einsatz von Arrays mit abgemischten Reaktionszentren besteht darin, dass die Arrays kleiner werden, als sie bei konventionellen Mikroarrays sein müssen. Es können mehr unterschiedliche Testungen auf einem Träger gegebener Größe gemacht werden.
Bei dem für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Träger kann es sich zum Beispiel um eine Mikrotiterplatte handeln, deren einzelne Kavitä- ten als entsprechende Reaktionszentren eingesetzt werden, wobei eine einzelne Kavität mit einem entsprechenden Gemisch aus Sonden-Makro- molekülen beschichtet ist. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Prüfverfahrens wird ein im Wesentlichen planarer Träger eingesetzt, wobei das wenigstens eine Reaktionszentrum von einem Bereich auf dem Träger um- fasst ist, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung hat. Wird als Probenlösung zum Beispiel eine wässrige Lösung verwendet, so kann das Reaktionszentrum im Vergleich zu seiner Umgebung hydrophil gewählt werden. Das Reaktionszentrum kann dabei dem hydrophilen Bereich entsprechen oder in ihm enthalten sein. So lässt es sich erreichen, dass die Probenflüssigkeit sich in Form eines durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltenen Tropfens auf dem hydrophilen Bereich hält, ohne in die hydrophobe Umgebung des Reaktionszentrums abzufließen. Auf diese Weise ist eine einfache Lokalisierung der Probenflüssigkeit am Reaktionszentrum möglich und es kann ein planarer Träger, zum Bei- spiel ein kostengünstiges Quarz- oder Glasplättchen, eingesetzt werden. Eine hydrophobe Umgebung lässt sich zum Beispiel durch Silanisierung erhalten.
Im Falle einer arrayförmigen Anordnung von Reaktionszentren können Gruppen von Reaktionszentren von einem gemeinsamen Bereich umfasst sein, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung hat. Derartige Bereiche können wiederum in einem übergeordneten Array angeordnet werden, so dass ein "Array-im-Array" vorliegt.
Bei einer anderen erfindungsgemäßen Ausgestaltung sind einzelne Reaktionszentren von eigenen Bereichen mit unterschiedlichen Benetzungseigenschaften umgeben, wodurch eine besonders gute Lokalisierung und die Verwendung sehr geringer Materialmengen möglich ist. Besonders vorteilhaft ist es, wenn das wenigstens eine Reaktionszentrum oder die mehreren Reaktionszentren einer Gruppe von zwei konzentrischen, vorzugsweise runden Bereichen umgeben ist, wobei der innere Bereich andere Benetzungseigenschaften als der Bereich des Reaktions- Zentrums und als der äußere Bereich hat. So kann zum Beispiel der innere konzentrische Bereich im Vergleich zum Reaktionszentrum hydrophob sein und so den beschriebenen Lokalisierungseffekt für eine wässrige Flüssigkeit in Form eines Tropfens zur Verfügung stellen. Analog kann der äußere konzentrische Bereich dazu dienen und geeignete Benetzungsei- genschaften aufweisen, einen Ölfilm auf dem Probenflüssigkeitstropfen so zu positionieren, dass er die Probenflüssigkeit während der Reaktion abdeckt und eine Verdampfung verhindert. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn kleine Probenvolumina verwendet werden, bei der auch geringe Verdampfungsmengen zu einer Verfälschung des Reaktionsergebnisses füh- ren könnten.
Die Verhinderung der Verdampfung während der Reaktion ist insbesondere dann günstig, wenn eine PCR-Reaktion durchgeführt wird, die das Durchfahren eines entsprechenden Temperaturprofils erfordert.
Bei einer erfindungsgemäßen Verfahrensführung unter Verwendung eines individuellen abdeckenden Ölfilms für jedes Reaktionszentrum können Volumina von zum Beispiel 0, 1 μl bis 10 μl Probenflüssigkeit untersucht werden, wobei das entsprechende Volumen des Öltropfens zum Beispiel um einen Faktor 2 bis 5 größer gewählt wird.
Im Falle einer arrayförmigen Anordnung kann auch jedes Reaktionszentrum von einem individuellen konzentrischen Bereich anderer Benetzungseigenschaften umgeben sein, um die Probenflüssigkeit an einem Reakti- onszentrum zu halten, und das Array im Ganzen von einem Bereich ent- sprechend angepasster Benetzungseigenschaften umgeben sein, der einen gemeinsamen Öltropfen auf dem Array hält, der die einzelnen Probenlösungstropfen gemeinsam abdeckt.
Um eine optimale Verteilung der Probenflüssigkeit auf dem Reaktionszentrum bzw. auf einem aus einzelnen Reaktionszentren gebildeten Arrays zu gewährleisten, können zusätzlich Schallwellen, insbesondere Oberflächenschallwellen in Richtung des auf dem Reaktionszentrum befindlichen Probenflüssigkeitsvolumens geschickt werden. Oberflächenschallwellen kön- nen zum Beispiel in an sich bekannter Weise mit Hilfe eines Interdigi- taltransducers auf einem piezoelektrischen Chip erzeugt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Prüfung der Anwesenheit von Nukleinsäuresequenzen und/ oder für Hybridisierungs- reaktionen.
Im Falle der Prüfung, ob gentechnisch veränderte Organismen vorhanden sind, wird zum Beispiel die Anwesenheit der entsprechenden transgenen Abschnitte geprüft.
Es können auch andere spezifische Reaktionen, beispielsweise Antikörper- Antigenbindungen ausgenutzt werden, wobei sich entweder die Antikörper oder die Antigene oder entsprechende Epitope als bekannte Sonden- Makromoleküle in gebundener Phase an dem Reaktionszentrum befinden. Soll die Anwesenheit solcher Substanzen in der Probe untersucht werden, so werden Sonden-Makromoleküle eingesetzt, die zu diesen Substanzen komplementär sind.
Analog können zum Beispiel auch Protein-, Proteid- oder Peptidreaktionen untersucht werden. Das erfindungsgemäße Prüfverfahren kann insbesondere auch mit Probenmaterial durchgeführt werden, das nicht von nur einer Einzelzelle stammt, wodurch die Probenpräparation stark vereinfacht wird. Soll zum Beispiel die Anwesenheit bestimmter DNA-Stränge geprüft werden, können Probenmengen von mehr als 100 pg, mehr als 1 ng oder auch mehr als 10 ng (jeweils bezogen auf die isolierte DNA-Menge) eingesetzt werden, wobei dadurch inhärent DNA-Material von mehr als einer Zelle (die in der Regel etwa 6 pg DNA-Material aufweist) enthalten ist. Je höher die DNA- Menge ist, desto einfacher ist die Probenpräparation.
Im Falle von Protein-Proben kann vorteilhafterweise ebenfalls Material mehrerer Zellen verwendet werden, zum Beispiel in einer Menge von größer als 200 pg.
Proben-Makromoleküle, deren Anwesenheit geprüft werden soll, können zum Beispiel vollständige Sequenzen oder Teilsequenzen eines Organismus sein, dessen Anwesenheit geprüft werden soll.
Der Begriff Organismus wird für die Zwecke des vorliegenden Textes im weiten Sinne verstanden und soll bei seiner Verwendung für Krankheitserreger zum Beispiel auch Viren, Bakterien, Einzeller, Sporen, etc. und bei seiner Verwendung für gentechnisch veränderte Organismen zum Beispiel Sorten, Linien, Klone etc. umfassen.
Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren für Untersuchungen, bei denen die wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle zu unterschiedlichen Organismen gehören, so dass die Anwesenheit dieser unterschiedlichen Organismen in einem Schritt abgeprüft werden kann. Es werden dann an einem Reaktionszent- rum Sonden-Makromoleküle vorgesehen, die zu den wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle der unterschiedlichen Organismen komplementär sind.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist einen Träger auf, auf dem wenigstens ein Reaktionszentrum angeordnet ist, an dem wenigstens zwei Sorten daran gebundener Sonden-Makromoleküle vorgesehen sind, die ohne vorbestimmte räumliche Anordnung an dem Reaktionszentrum gebunden sind und derart zu den vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle komplementär sind, dass sie mit diesen spezifisch reagieren können.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung dient zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Prüfung einer Flüssigkeitsprobe auf die Anwesenheit von wenigstens einer von wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle, wobei die wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle jeweils mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 20 % vorliegen. Die Sonden-Makromoleküle auf dem Träger der erfindungsgemäßen Vorrich- tung werden entsprechend ausgewählt. Vorteilhafterweise sind an einem Reaktionszentrum Sonden-Makromoleküle gebunden, die zu Proben- Makromolekülen unterschiedlicher Organismen komplementär sind, so dass die Anwesenheit dieser unterschiedlichen Organismen mit einem Reaktionszentrum geprüft werden kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auf dem Träger ein einzelnes Reaktionszentrum oder mehrere, vorzugsweise in Form eines Arrays angeordnete Reaktionszentren mit jeweils wenigstens zwei Sorten von Sonden- Makromolekülen aufweisen. Bei dem Träger kann es sich zum Beispiel um eine M ikro titerplatte oder um einen im Wesentlichen planaren Träger handeln, wobei im letztgenannten Fall das wenigstens eine Reaktionszentrum von einem Bereich auf dem Träger umfasst sein kann, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung aufweist. Der planare Träger kann zum Beispiel ein Glas- oder Quarzplättchen oder ein Festkörperchip sein.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem im Wesentlichen planaren Träger weist um das wenigstens eine Reaktionszentrum zwei konzentrische, vorzugsweise runde Bereiche auf, wobei der innere konzentrische Bereich andere Benetzungseigenschaften als das Reaktionszentrum und als der äußere Bereich hat.
Mehrere Reaktionszentren können auch jeweils zu einer zum Beispiel matrixförmigen Gruppe (zum Beispiel in Form einer 2x2- oder 9x9 -Matrix oder einer anderen matrixförmigen Anordnung) zusammengefasst werden und von einem gemeinsamen Bereich anderer Benetzungseigenschaften umgeben sein. Solche Bereiche, die mehrere Reaktionszentren umfassen, können wiederum in einem übergeordneten Array (mit zum Beispiel 48, 96 oder 384 Bereichen) angeordnet sein ("Array-im-Array").
Im Falle einer arrayförmigen Anordnung der Reaktionszentren kann andererseits auch vorgesehen sein, dass die Benetzungseigenschaften derart gewählt sind, dass Probenlösungstropfen individuell an den einzelnen Reaktionszentren gehalten werden und ein abdeckender Ölfilm oberhalb des gesamten Arrays oder einer Gruppe von Reaktionszentren gehalten wird. Dazu sind zur Verwendung von zum Beispiel wässrigen Probenlösungen die Reaktionszentren von individuellen hydrophoben Bereichen und das gesamte Array oder eine Gruppe von Reaktionszentren von einem Bereich, der zur Lokalisierung eines Öltropfens auf dem Array dient, umgeben.
Eine Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist eine Ein- richtung zur Erzeugung von Schallwellen, insbesondere von Oberflächenschallwellen auf, mit deren Hilfe eine optimale Verteilung und/ oder Durchmischung der Probenflüssigkeit an einem Reaktionszentrum bzw. mehreren Reaktionszentren erreicht werden kann. Eine solche Einrichtung umfasst zum Beispiel einen Interdigitaltransducer auf einer piezo- elektrischen Oberfläche. Die Abstrahlrichtung des Interdigital transducers ist dabei derart gewählt, dass sie in Richtung eines Reaktionszentrums liegt, so dass Probenflüssigkeit, die sich auf diesem Reaktionszentrum befindet, mit Hilfe der Oberflächenschallwellen, die mit diesem Interdigitaltransducer erzeugt werden, in Bewegung gesetzt werden kann.
Die Wirkungen und Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der beschriebenen und anderer besonderer Ausführungsformen ergeben sich in analoger Weise aus den oben bereits für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Ausgestaltungen und die dort für das erfϊndungsgemä- ße Verfahren und seine Ausgestaltungen erläuterten Effekte und Vorteile.
Wie bereits bei dem erfindungsgemäßen Prüfverfahren beschrieben, kann der Markierungsschritt der Probenmoleküle der wenigstens zwei vorbestimmten Sorten auch nach dem Aufbringen der Probenflüssigkeit auf das Reaktionszentrum geschehen. Eine besonders praktische Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist dazu an dem Reaktionszentrum nicht nur die wenigstens zwei unterschiedlichen Sorten Sonden- Makromoleküle auf, sondern zusätzlich Material zur Markierung wenigstens der zwei unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle. Beim Auf- bringen der Probenflüssigkeit auf das Reaktionszentrum findet dann nicht nur die Reaktion zwischen den gegebenenfalls vorhandenen Proben- Makromolekülen und den komplementären Sonden-Makromolekülen statt, sondern gleichzeitig auch die Markierung der gegebenenfalls vorhandenen Proben-Makromoleküle.
Das Material zur Markierung kann insbesondere markierte Primer für eine oder mehrere PCR (Polymerase-Kettenreaktionen) und gegebenenfalls die für die PCR notwendigen anderen Bestandteile, zum Beispiel Polymerase, umfassen.
Vorzugsweise ist das Material zur Markierung an dem wenigstens einen Reaktionszentrum unspezifisch gebunden, zum Beispiel getrocknet. Beim Aufbringen der Probenflüssigkeit löst sich das unspezifisch gebundene Material und steht für eine Markierung zur Verfügung. Die Probenlösung wird auf ein Reaktionszentrum aufgebracht und löst das unspezifisch gebundene Markierungsmaterial, zum Beispiel Fluorophore, auf, das dann mit den Probenmolekülen der Probenlösung reagieren kann, um diese zu markieren. Die derart vorbereiteten Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Prüfungsverfahrens sind einfach zu handhaben und können als fertiges Untersuchungsmittel für ausgewählte Proben- Makromoleküle bereitgestellt werden.
Die Auswahl besonderer Materialien zur Markierung, deren Effekte und Vorteile wurden bereits oben mit Bezug zu den Ausgestaltungen des erfin- dungsgemäßen Prüfungsverfahrens erläutert.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kommt zumindest ein Reaktionszentrum zum Einsatz, auf dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Sonden-Makromolekülen gebunden sind. Zur Herstellung einer solchen Anordnung werden die potentiellen Sonden- Makromoleküle vor dem Auf- bringen auf die Festkörperoberfläche des Trägers zum Beispiel abgemischt und dann als ein Reaktionszentrum aufgespottet. Somit entsteht ein Reaktionszentrum, an dem unterschiedliche Proben-Makromoleküle einer Probenflüssigkeit spezifisch binden können.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Prüfverfahrens, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung und ein Markierungsmaterial, vorzugsweise in Form einer Markierungslösung, aufweist, das geeignet ist, wenigstens eine vorbestimmte Sorte von Proben-Makromolekülen zu markieren.
Das Material zur Markierung kann insbesondere markierte Primer für eine oder mehrere PCR (Polymerase-Kettenreaktionen) und gegebenenfalls die für die PCR notwendigen Puffer und Nukleotide umfassen. Schließlich kann das Material zur Markierung auch bereits die für die PCR notwendige Polymerase umfassen.
Die Vorteile und Effekte eines solchen erfindungsgemäßen Kits und seiner in den Unteransprüchen definierten speziellen Ausführungsformen erge- ben sich aus den oben beschriebenen Vorteilen und Effekten des erfindungsgemäßen Prüfverfahrens und seiner besonderen Ausgestaltungen bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen.
Ausführungsformen des Kits, die den für das erfindungsgemäße Verfahren geschilderten Ausgestaltungen bzw. den für die erfindungsgemäße Vorrichtung geschilderten Ausführungsformen analog entsprechen, sind e- benfalls umfasst, ohne dass sie notwendigerweise für das Kit hier noch einmal gesondert aufgeführt oder erläutert werden. Die für die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Kit auszuwählenden Sonden-Makromoleküle für ein Reaktionszentrum werden zum Beispiel so zusammengestellt, dass sie häufig durchzuführenden Tests entsprechen. So können zum Beispiel für einen Test auf genetisch bedingte Erbkrankheiten in einem Reaktionszentrum entsprechende Sonden-Makromoleküle zusammengefasst werden, die mit für diese Erbkrankheiten charakteristischen Proben-Makromolekülen spezifisch reagieren würden, wenn diese vorhanden sind. Für einen Test, ob ein Organismus gentechnisch verändert wurde, können solche Sonden-Makromole- küle eingesetzt werden, die zu Proben-Makromolekülen komplementär sind, die charakteristisch für bestimmte gentechnisch veränderte Organismen sind.
Andere Auswahlkriterien können zum Beispiel in besonderen Klassen oder Gruppen nachzuweisender Organismen oder darin enthaltener Proben- Makromoleküle liegen.
Die Erfindung wird anhand besonderer Ausgestaltungen unter Bezugnahme auf die anliegenden Figuren im Detail erläutert, die in schemati- scher Darstellung erfindungsgemäße Verfahrensführungen und Vorrichtungen darstellen. Dabei zeigen
Fig. 1 ein Beispiel eines erfindungsgemäß ausgestalteten
Reaktionszentrums,
Fig. 2 ein Array mehrerer Reaktionszentren,
Fig. 3 einen Detailausschnitt eines Arrays mehrerer Reaktionszentren einer Ausführungsform, Fig. 4 eine Draufsicht auf ein Detail einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 5 einen Schnitt durch die erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß der Linie IV-IV in Fig. 4, und
Fig. 6 eine Draufsicht auf ein Detail einer anderen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Fig. 1 zeigt ein Reaktionszentrum 10, an dem Sonden-Makromoleküle A, B, C aufgebracht wurden. Typische Durchmesser solcher Reaktionszentren 10 liegen zwischen 50 μm und einigen Millimetern. A, B, C stehen hier beispielhaft für Makromoleküle, die mit entsprechenden Proben-Makromolekülen in einer auf dem Reaktionszentrum 10 aufzubringenden Pro- benflüssigkeit spezifisch reagieren können, von denen die Anwesenheit untersucht werden soll. In der schematischen Darstellung der Fig. 1 sind nur wenige Sonden-Makromoleküle jeder Sorte dargestellt. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Anzahl in der Regel viel höher. Die Makromoleküle A, B, C sind an dem Reaktionszentrum 10 regellos angeordnet.
Die typische Länge der verwendeten Sonden-Makromoleküle liegt zwischen 15 und 100 Basenpaaren. Es können auch längere PCR-Produkte oder zum Beispiel Klone, Antikörper oder Antigene oder Epitope als Son- den-Makromoleküle verwendet werden. Auch Sonden-Makromoleküle mit weniger als 15 Basenpaaren sind möglich.
Zur Herstellung einer solchen Anordnung werden Sonden-Makromoleküle A, B, C vor dem Aufbringen auf die Festkörperoberfläche eines Trägers abgemischt und dann als ein Reaktionszentrum 10 aufgespottet. Somit entsteht ein Reaktionszentrum, an dem unterschiedliche Proben-Makromoleküle einer Probenflüssigkeit spezifisch binden können.
Mehrere solcher Reaktionszentren 10, die entweder gleichartige oder auch unterschiedliche Sonden-Makromoleküle enthalten können, können auch in Form einer Matrix auf einer Festkörperoberfläche aufgebracht werden und so ein Array aus Reaktionszentren bilden. Eine solche Anordnung ist Gegenstand der schematischen Fig. 2, in der beispielhaft zwei der dargestellten Reaktionszentren mit den Bezugsziffern 10, 12 bezeichnet sind. Auf der Festkörperoberfläche 14 können sich mehr als die dargestellte
Anzahl an Reaktionszentren in Form einer Matrix befinden, was durch die Punktlinien 13 angedeutet sein soll.
Die Reaktionszentren auf einem Träger können individuell angefertigt werden, wenn eine ganz bestimmte Auswahl von Proben-Makromolekülen auf ihrer Anwesenheit in einer Probenlösung getestet werden sollen. Alternativ können vorgefertigte Träger mit ausgewählten Reaktionszentren bereitgestellt werden, die typische Klassen oder Gruppen von Sonden- Makromolekülen derart zusammenfassen, dass entsprechende Klassen oder Gruppen von Proben-Makromolekülen auf ihrer Anwesenheit in einer Probenlösung getestet werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand eines ersten Beispiels erläutert, bei dem eine Probe zum Beispiel in Form einer Probenlösung auf die Anwesenheit von gentechnisch veränderten Organismen untersucht werden soll. Es handelt sich dabei zum Beispiel um eine Nahrungsmittelprobe, die daraufhin getestet werden soll, ob gentechnisch bestimmte Veränderungen vorgenommen wurden. Es wird dazu ein Reaktionszentrum 10 wie in Fig. 1 eingesetzt, bei dem Sonden-Makromoleküle A, B, C aufgebracht sind, die zu den Makromolekülen der gentechnisch veränder- ten Organismen komplementär sind. Es können auf die Weise drei unterschiedliche gentechnisch veränderte Organismen abgeprüft werden, für die die zu den Sonden-Makromolekülen A, B, C komplementären Proben- Makromoleküle charakteristisch sind. Selbstverständlich ist eine andere, insbesondere sehr viel größere Anzahl möglich.
Grundsätzlich wird davon ausgegangen, dass die Nahrungsmittelprobe keine der zu prüfenden gentechnisch veränderten Organismen enthält.
Die Nahrungsmittelprobe wird einem Markierungsschritt unterzogen, bei dem Proben-Makromoleküle, die zu den abzutestenden gentechnisch veränderten Organismen gehören, fluoreszenzmarkiert werden, falls sie in der Probe vorhanden sind. Der entsprechende Markierungsschritt wird zum Beispiel mit Hilfe von einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch mit Fluoreszenz markierten Primern durchgeführt. Es wird hier nur ein Fluoreszenzfarbstoff verwendet, so dass alle Markierungen gleich sind. Dieser Schritt führt gleichzeitig zu einer Erhöhung der Menge entsprechender Proben-Makromoleküle der gentechnisch veränderten Organismen, wenn solche in der Probe tatsächlich vorhanden sind. Nach diesem Markie- rungs-/ Nachweiserhöhungsschritt wird die Probe auf das Reaktionszentrum 10 aufgebracht. Es wird eine typische Reaktionszeit abgewartet und dann die Festkörperoberfläche, auf der sich das Reaktionszentrum 10 befindet, einem stringenten Waschschritt unterzogen. Im Anschluss wird die Fluoreszenz des Reaktionszentrums 10 untersucht. Haben an dem Reaktionszentrum fluoreszenzmarkierte Proben-Makromoleküle spezifisch gebunden, so lassen sich diese nach dem Waschschritt an dem Reaktionszentrum 10 nachweisen. Wenn dies der Fall ist, kann darauf geschlossen werden, dass zu den Sonden-Makromolekülen A, B, oder C komplementäre Proben-Makromoleküle in der Probe vorhanden waren und insofern auf die Anwesenheit entsprechender gentechnisch veränderter Organismen zurückgeschlossen werden, für die die Proben-Makromoleküle charakteristisch sind.
In der Regel wird jedoch die Probe keinen gentechnisch veränderten Orga- nismus enthalten, so dass keine Fluoreszenz gemessen werden kann.
Sollte jedoch Fluoreszenz nachgewiesen werden, wird als erstes Ergebnis festgestellt, dass entsprechende gentechnisch veränderte Organismen in der Probe vorhanden sind. In einem zweiten Schritt kann bei Bedarf über- prüft werden, welche der drei gentechnisch veränderten Organismen vorliegen. Dies kann zum Beispiel in an sich bekannter Weise durch einen spezifischen PCR-Schritt oder eine Gelelektrophorese festgestellt werden. Dieser zeitaufwändige und kostenintensive Schritt ist dementsprechend nur notwendig, wenn zuvor an dem Reaktionszentrum ein Fluoreszenzsig- nal gemessen werden konnte. Ansonsten kann auf den zeitintensiven und kostenintensiven spezifischen Untersuchungsschritt verzichtet werden.
Um eine spezifische Markierung in der Probenlösung zu erreichen, wird zum Beispiel eine Polymerase-Kettenreaktion mit entsprechend markier- ten Primern durchgeführt, wobei zum Beispiel ein Puffer eingesetzt wird, mit dem auch die Reaktion zur spezifischen Bindung an den Sonden- Makromolekülen des Reaktionszentrums 10 durchgeführt werden kann.
Das Material zur Markierung kann der Probenlösung zugeführt werden und zum Beispiel Teil eines Kits sein, das ein erfindungsgemäßes Reaktionszentrum oder ein erfindungsgemäßes Array von Reaktionszentren für die Prüfung der Anwesenheit bestimmter Proben- Makromoleküle und eine Markierungslösung mit dem Markierungsmaterial umfasst. Der Markierungsschritt kann vor der Reaktion durchgeführt werden, indem ein spezi- fisches Markierungsverfahren angewendet wird, bei dem nur die Proben- Makromoleküle markiert werden würden, deren Anwesenheit in der Probenlösung untersucht werden soll. Andererseits ist es auch möglich, den Markierungsschritt erst nach der Reaktion bzw. nach dem Entfernen ungebundenen Probenmaterials vorzunehmen.
Bei einer anderen Verfahrensführung ist das Material zur Markierung an dem Reaktionszentrum 10 vorhanden, zum Beispiel in getrockneter Form. So ist es zum Beispiel möglich, entsprechend vorbereitete Untersuchungsvorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die auf dem wenigstens einen Reaktionszentrum unterschiedliche Sonden-Makromoleküle A, B, C zur spezifischen Reaktion mit Proben-Makromolekülen als auch die benötigten Fluoreszenzmarkierungsstoffe aufweisen. Es kann sich dabei zum Beispiel um markierte Primer für PCR handeln. Die Probenlösung wird auf ein solches Reaktionszentrum aufgebracht und löst die unspezifisch gebun- denen Fluorophore auf, die dann mit den gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Proben-Makromoleküle reagieren können, um diese zu markieren. Derartig vorbereitete Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind einfach zu handhaben und können als fertiges Untersuchungsmittel für ausgewählte Proben-Makromoleküle in einer Probenlösung bereitgestellt werden.
Bei einem anderen Beispiel zur Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in analoger Weise zum Beispiel eine Patientenblutprobe auf das Vorliegen genetisch manifestierter seltener Erbkrankheiten unter- sucht werden. Dazu enthält ein Reaktionszentrum 10 mehrere Sonden- Makromoleküle A, B, C, die zu Sequenzen oder Teilsequenzen komplementär sind, die charakteristisch für die zu untersuchenden genetisch manifestierten Erbkrankheiten sind. Auch hier wird in der Regel davon ausgegangen, dass solche genetisch manifestierten Erbkrankheiten nicht vor- handen sind, so dass die Wahrscheinlichkeit des Vorliegens entsprechen- der charakteristischer Sequenzen oder Teilsequenzen sehr klein, insbesondere kleiner als 20 % ist.
Ein anderes Beispiel dient der Untersuchung einer Blutprobe auf das vorliegen pathogener Erreger. Hier umfasst ein Reaktionszentrum zum Beispiel fünf verschiedene für unterschiedliche Erreger spezifische Bindungsstellen. Kommt es zu keiner spezifischen Bindung nach der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, so sind keine Erreger oberhalb der Nachweisgrenze in der Probe vorhanden.
Kommt es jedoch zu einer spezifischen Bindung und kann dementsprechend ein Fluoreszenzsignal gemessen werden, kann gegebenenfalls mit anderen, zum Beispiel an sich bekannten, Methoden geprüft werden, welcher Erreger tatsächlich vorliegt. Das Vorschalten des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht es, dass bereits vor dem kosten- und zeitintensiven Testschritt, mit dem die genaue Art des Erregers festgestellt wird, der Patient isoliert wird, um zum Beispiel die Ansteckungsgefahr zu reduzieren.
Außerdem ist der kosten- und zeitintensive Schritt zur Feststellung der
Art des Erregers nur dann notwendig, wenn überhaupt ein Signal bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen werden kann.
Eine Erhöhung der Anzahl der parallel durchführbaren Reaktionen kann erreicht werden, wenn mehrere unterschiedlich bestückte Reaktionszentren 10, 12 in Form einer Matrix angeordnet und ausgewertet werden, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist.
Werden die oben geschilderten Experimente in einem Array aus Reakti- onszentren 10, 12 durchgeführt, wie es in Fig. 2 gezeigt ist, können die Zusammensetzungen der einzelnen Reaktionszentren auch unterschiedlich gewählt werden.
So können Sonden-Makromoleküle, die komplementär zu Proben-Makro- molekülen eines bestimmten Organismus sind, jeweils mindestens zwei Reaktionszentren 10 beigemischt werden. Sollte in der Probe eine zu einem der Sonden-Makromoleküle komplementäre Proben-Makromolekülsorte vorhanden sein, so leuchten zwei Reaktionszentren bei der Fluoreszenzuntersuchung auf. Beispielhaft ist dieser Mechanismus in Fig. 3 dargestellt. Hier sind beispielhaft drei Reaktionszentren 10, 11, 12 gezeigt. Auf dem ersten Reaktionszentrum 10 befinden sich Sonden-Makromoleküle A und B. Auf dem zweiten Reaktionszentrum 11 Sonden-Makromoleküle A und C und auf dem dritten Reaktionszentrum 12 Sonden- Makromoleküle B und C. Befinden sich in der Probe Makromoleküle, die zu dem Sonden- Makromolekül A komplementär sind, so leuchten die ersten zwei Reaktionszentren 10, 11 bei der Fluoreszenzuntersuchung. Befinden sich in der Probe zum Beispiel Proben-Makromoleküle, die zu den Sonden-Makromolekülen C komplementär sind, so leuchten das zweite und das dritte Reaktionszentrum 11, 12 auf. Befinden sich Proben- Makromoleküle in der Probe, die komplementär zu den Sonden-Makromolekülen B sind, so leuchten das erste und das dritte Reaktionszentrum 10, 12 bei der Fluoreszenzuntersuchung auf. Eine Unterscheidung der vorhandenen Proben-Makromolekülsorten ist damit möglich.
Alternativ können auf jeweils zum Beispiel zwei Reaktionszentren Sonden- Makromoleküle aufgebracht werden, die komplementär zu Proben- Makromolekülen des gleichen Organismus sind, ohne dass die Sonden- Makromoleküle notwendigerweise gleich sind. Auch so kann aus dem Muster der fluoreszierenden Reaktionszentren auf den Organismus ge- schlössen werden. Fig. 4 zeigt die Draufsicht auf ein Reaktionszentrum einer abgewandelten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Reaktionszentrum 10 ist hier von einem konzentrischen Bereich 16 umgeben, der im Vergleich zum Reaktionszentrum 10 hydrophob ist. Dies lässt sich zum Beispiel durch eine Silanisierung des Bereichs 16 erreichen. Der hydrophobe Bereich 16 ist von einem weiteren konzentrischen Bereich 18 umgeben, der solche Benetzungseigenschaften aufweist, dass er zur Lokalisierung eines durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltenen Öltropfens dienen kann, also zum Beispiel im Vergleich zu seiner äußeren Umgebung entsprechend lipophil ist.
Die Bereiche mit den Bezugsziffern 10 und 18 können zum Beispiel gleiche oder ähnliche Benetzungseigenschaften aufweisen.
Fig. 5 zeigt einen Schnitt durch ein solches Reaktionszentrum entlang der Linie IV-IV, wie sie in Fig. 4 angedeutet ist. Außerdem ist ein Tropfen 22 von Probenlösung dargestellt, der von einem Ölfilm 24 bedeckt wird. Die Festkörperoberfläche, zum Beispiel ein Glasplättchen, ist mit 20 bezeich- net.
Die Probenlösung 22 wird durch ihre Oberflächenspannung zusammengehalten und verlässt den im Vergleich zum hydrophoben Bereich 16 hydrophilen Bereich des Reaktionszentrums 10 ohne äußere Krafteinwir- kung nicht, wodurch sie am Reaktionszentrum 10 lokalisiert ist. Zum Schutz gegen Verdampfung wird oberhalb des Probenlösungstropfens 22 ein Öltropfen 24 aufgebracht, der den Bereich 18 aufgrund seiner Oberflächenspannung nicht verlässt. Insbesondere bei Verwendung von kleinen Probenvolumina von 0, 1 μl bis 10 μl ist die Verwendung eines solchen Öltropfens 24 vorteilhaft, um ein Verdampfen zu verhindern. Die Geometrie kann auch so gewählt sein, dass der Öltropfen mehrere Reaktionszentren und die darauf befindlichen Probenlösungstropfen abdeckt. Dazu kann vorgesehen sein, dass ein im Vergleich zu seiner äuße- ren Umgebung lipophiler Bereich zur Lokalisierung des Öltropfens mehrere einzelne Reaktionszentren umgibt, die ihrerseits jeweils einen eigenen sie umgebenden hydrophoben Bereich aufweisen, oder dass ein im Vergleich zu seiner äußeren Umgebung lipophiler Bereich einen hydrophoben Bereich umgibt, der eine Gruppe von Reaktionszentren (zum Beispiel je- weils eine 2x2- oder 9x9-Matrix oder eine andere matrixförmige Anordnung) umgibt, so dass diese Gruppe von einem gemeinsamen Proben- Flüssigkeitstropfen bedeckt wird. In solchen durch einen Öltropfen abzudeckenden Gruppen können die Reaktionszentren zum Beispiel jeweils matrixförmig (beispielsweise als 2x2- oder 9x9-Matrix) angeordnet sein.
Fig. 6 zeigt ein entsprechendes Beispiel, bei dem eine Gruppe 26 von in Form einen 3x3-Matrix angeordneten Reaktionszentren 10 von einem gemeinsamen hydrophoben Bereich 16 und einem dazu konzentrischen im Vergleich zu seiner äußeren Umgebung lipophilen Bereich 18 umgeben ist. Solche Gruppen 26 von Reaktionszentren 10 können wiederum auch in einem übergeordneten Array angeordnet werden, so dass ein "Array-im- Array" vorliegt, wobei das übergeordnete Array zum Beispiel 48, 96 oder 384 solcher Gruppen 26 umfassen kann.
Bei entsprechender Auswahl der Oberflächenbeschaffenheit kann ein konzentrischer Bereich auch sowohl hydrophob als auch lipophil wirken und die beschriebenen Aufgaben eines hydrophoben und eines lipophilen Bereiches übernehmen. Eine zusätzliche Durchmischung der Probenlösung auf der Oberfläche des Trägers kann erreicht werden, wenn Oberflächenschallwellen in Richtung des Reaktionszentrums geschickt werden, die zum Beispiel mit Hilfe eines Interdigitaltransducers auf der Trägeroberfläche erzeugt werden, dessen Abstrahlrichtung auf das Reaktionszentrum gerichtet ist. Gegebenenfalls kann dazu das Trägermaterial piezoelektrisch ausgewählt oder beschichtet werden.
Bezugszeichenliste
10, 11, 12 Reaktionszentren
13 Fortsetzungslinien 14 Reaktionsarray
16 hydrophober Bereich
18 lipophiler Bereich
20 Festkörperoberfläche
22 Probenflüssigkeitstropfen 24 Ölbedeckung
26 Gruppe von Reaktionszentren

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Prüfung einer flüssigen Probe (22) auf die Anwesenheit von wenigstens einer von wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle, wobei die wenigstens zwei vorbestimmten Sorten Proben- Makromoleküle jeweils mit einer Wahrscheinlichkeit von we- niger als 20 % in der Probe vorliegen und das Verfahren folgende Schritte umfasst:
Bereitstellen eines Trägers (20) mit wenigstens einem Reaktionszentrum (10, 11, 12), an dem wenigstens zwei unterschiedliche Sorten von Sonden-Makromolekülen (A, B, C) gebunden sind, die derart zu den wenigstens zwei vorbestimmten Sorten
Proben- Makromoleküle komplementär sind, dass sie mit diesen spezifisch reagieren können,
Durchführen eines Markierungsschrittes zur Markierung von Proben-Makromolekülen zumindest der wenigstens zwei vor- bestimmten Sorten Proben-Makromoleküle,
In-Kontakt-Bringen der Probe (22) mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) derart, dass eine Reaktion zwischen Proben-Makromolekülen der wenigstens zwei vorbestimmten Sorten Proben-Makromoleküle und den jeweils komplementären Sonden-Makromolekülen (A, B, C) stattfinden kann,
Entfernen von ungebundenem Probenmaterial, und Prüfen des Vorhandenseins von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) spezifisch gebundenen Proben- Makromolekülen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die vorbestimmten Sorten Proben-Makromoleküle und/oder die auf dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) vorhandenen Sonden-Makromoleküle (A, B, C)
Nukleinsäuresequenzen, insbesondere DNA, RNA oder PNA; oder
Antikörper, Antigene oder Epitope; oder Peptide, Proteine oder Proteide; oder - eine Kombination aus zwei oder mehreren der vorgenannten
Substanzen umfassen und /oder zu solchen Substanzen komplementär sind.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die Prüfung auf Anwesenheit von wenigstens einer von zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle in der Probe (22) vorgenommen wird, die jeweils mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 15 %, bevorzugt weniger als 10 %, besonders bevorzugt weniger als 5 %, ganz besonders bevorzugt weniger als 1 % in der Pro- be vorliegen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) gebundenen Sonden-Makromoleküle (A, B, C) derart ausgewählt werden, dass sie komplementär zu jeweiligen Proben-Makromolekülen sind, die mit einer statistischen Wahrscheinlichkeit von weniger als 20 %, bevorzugt weniger als 15 %, bevorzugter weniger als 10 %, besonders bevorzugt weniger als 5 % und ganz besonders bevorzugt weniger als 1 % in einer Probe vorkommen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Anzahl der an dem mindestens einen Reaktionszentrum (10, 1 1, 12) gebundenen, unterschiedlichen Sorten Sonden-Makromoleküle (A, B, C) zwischen 2 und 50, bevorzugt zwischen 2 und 30 und ganz beson- ders bevorzugt zwischen 2 und 10 liegt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Probe auf die Anwesenheit von vorbestimmten Proteinen oder Peptiden in der Probe (22) geprüft wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Probe auf die Anwesenheit von vorbestimmten Nukleinsäuren in der Probe (22) geprüft wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, mit einem Nachweiserhöhungsschritt, bei dem die Wahrscheinlichkeit eines Nachweises der Moleküle wenigstens einer der vorbestimmten Sorten Proben- Makromoleküle erhöht wird, falls diese Sorte Proben-Makromoleküle in der Probe (22) enthalten ist.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 6 und 8, bei dem der Nachweiserhöhungsschritt einen Aufkonzentrierungsschritt für die vorbestimmten Proteine oder Peptide umfasst, vorzugsweise eine Fällung oder eine Dialyse.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 7 und 8, bei dem der Nachweiserhöhungsschritt einen vorzugsweise spezifischen Amplifikati- onsschritt für die vorbestimmten Nukleinsäuren umfasst.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem im Falle eines positiven Ergebnisses des Prüfschrittes ein Diskriminierungsschritt durchgeführt wird, um festzustellen, welche der wenigstens zwei vorbestimmten Sorten Proben-Makromoleküle in der Probe (22) vorhanden ist.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 6 und 11, bei dem der Diskriminierungsschritt eine Massenspektroskopie oder eine ELISA-(Enzyme- linked Immunosorbent Assay-) Reaktion umfasst.
13. Verfahren nach den Ansprüchen 7 und 11, bei dem der Diskriminierungsschritt einen PCR- (Polymerase chain reaction-) Schritt, einen realtime-PCR-Schritt, eine Gelelektrophorese oder einen Dot-Blot- Schritt umfasst.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem als Markierung Fluoreszenzmarkierung verwendet wird und zur Prüfung des Vorhandenseins von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) nach der Reaktion gebundenen Proben-Makromolekülen die Fluoreszenz untersucht wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem gegebenenfalls vorhandene Proben- Makromoleküle der wenigstens zwei vorbestimmten Sorten Proben-Makromoleküle während des Markierungs- Schrittes gleichartig markiert werden, insbesondere mit dem gleichen Fluoreszenzfarbstoff.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem zur Markierung der Proben-Makromoleküle eine oder mehrere PCR (Polymera- sekettenreaktion(en)) mit entsprechend markierten Primern eingesetzt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem für die PCR ein Puffer einge- setzt wird, mit dem auch die Reaktion zur spezifischen Bindung an den Sonden-Makromolekülen (A, B, C) des wenigstens einen Reaktionszentrums (10, 11, 12) durchgeführt werden kann.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem die Markie- rung der Proben-Makromoleküle an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) nach dem Entfernen ungebundenen Probenmaterials erfolgt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem mehrere, vorzugsweise in Form eines Arrays angeordnete, Reaktionszentren
(10, 11, 12) mit jeweils wenigstens zwei Sorten von gebundenen Sonden-Makromolekülen (A, B, C) auf einem Träger (20) eingesetzt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Auswahl der an einem Reaktionszentrum (10, 1 1, 12) des Arrays vorhandenen Sonden- Makromoleküle (A, B, C) nicht für alle Reaktionszentren (10, 1 1, 12) gleich ist, insbesondere sich für alle Reaktionszentren (10, 11, 12) des Arrays unterscheidet.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, bei dem ein im wesentlichen planarer Träger (20) eingesetzt wird, wobei das wenigstens eine Reaktionszentrum (10) von einem Bereich auf dem Träger (20) umgeben ist, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung (16) hat.
22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem mehrere Reaktionszentren einer Gruppe (26) von einem gemeinsamen Bereich umgeben sind, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung aufweist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 oder 22, bei dem das wenigstens eine Reaktionszentrum oder die mehreren Reaktionszentren einer Gruppe von zwei konzentrischen Bereichen (16, 18) umgeben ist, wobei der innere konzentrische Bereich (16) andere Benet- Zungseigenschaften als das Reaktionszentrum (10) und als der äußere konzentrische Bereich (18) hat.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, bei dem die Probenflüssigkeit (22) während der Reaktion mit Öl (24) bedeckt wird.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, bei dem Schallwellen, vorzugsweise Oberflächenschallwellen, in Richtung der Probenflüssigkeit geschickt werden, nachdem die Probenflüssigkeit mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum in Kontakt gebracht wor- den ist.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, bei dem die Probe auf die Anwesenheit von vorbestimmten gentechnisch veränderten Organismen (GVO) geprüft wird, wobei die Anwesenheit von trans- genen Sequenzen oder Teilsequenzen als Proben-Makromoleküle geprüft wird.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, bei dem die Probe auf die Anwesenheit von vorbestimmten Krankheitserregern und/oder Viren und/oder Bakterien geprüft wird, wobei die Anwe- senheit darin enthaltener Sequenzen oder Teilsequenzen als Proben- Makromoleküle geprüft wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, bei dem die flüssige Probe Probenmaterial von mehreren Zellen umfasst.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, bei dem die wenigstens zwei vorbestimmten Sorten Proben-Makromoleküle zu unterschiedlichen Organismen gehören.
30. Vorrichtung zur Prüfung einer flüssigen Probe (22) auf die Anwesenheit von wenigstens einer von wenigstens zwei vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle, wobei die wenigstens zwei vorbestimmten Sorten Proben-Makromoleküle jeweils mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 20 % in der Probe vorliegen, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29, mit einem Träger (20) und wenigstens einem auf dem Träger (20) angeordneten Reakti- onszentrum (10, 11, 12) mit wenigstens zwei Sorten daran gebundener Sonden-Makromoleküle (A, B, C), die ohne vorbestimmte räumliche Anordnung an dem Reaktionszentrum (10, 11, 12) gebunden sind und derart zu den Proben-Makromolekülen der vorbestimmten Sorten Proben-Makromoleküle komplementär sind, dass sie mit diesen spezifisch reagieren können.
31. Vorrichtung nach Anspruch 30, bei der die auf dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) vorhandenen Sonden- Makromoleküle (A, B, C) Nukleinsäuresequenzen, insbesondere DNA, RNA oder PNA; oder
Antikörper, Antigene, oder Epitope; oder Peptide, Proteine oder Proteide; oder - eine Kombination aus zwei oder mehreren dieser Substanzen umfassen und /oder zu solchen Substanzen komplementär sind.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 oder 31 zur Prüfung einer flüssigen Probe (22), in der die wenigstens zwei vorbestimmten Sorten Proben-Makromoleküle jeweils mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 15 %, bevorzugt weniger als 10 %, besonders bevorzugt weniger als 5 %, ganz besonders bevorzugt weniger als 1 % vorliegen.
33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 32, bei der die an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) gebundenen Sonden-Makromoleküle (A, B, C) komplementär zu jeweiligen Proben-Makromolekülen sind, die mit einer statistischen Wahrscheinlichkeit von weniger als 20 %, bevorzugt weniger als 15 %, bevorzug- ter weniger als 10 %, besonders bevorzugt weniger als 5 % und ganz besonders bevorzugt weniger als 1 % in einer Probe vorkommen.
34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 33 mit mehreren, vorzugsweise in Form eines Arrays angeordneten, Reaktionszentren (10, 11, 12) mit jeweils wenigstens zwei Sorten von Sonden-Makromolekülen (A, B, C).
35. Vorrichtung nach Anspruch 34, bei der die Auswahl der Sonden- Makromoleküle (A, B, C) nicht für alle Reaktionszentren (10, 11, 12) des Arrays gleich ist, bevorzugt für alle Reaktionszentren (10, 11, 12) des Arrays unterschiedlich ist.
36. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 35 mit einem im wesentlichen planaren Träger (20), wobei das wenigstens eine Reaktionszentrum (10) von einem Bereich (16) auf dem Träger umgeben ist, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung hat.
37. Vorrichtung nach Anspruch 36, bei der mehrere Reaktionszentren einer Gruppe (26) von einem gemeinsamen Bereich umgeben sind, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung aufweist.
38. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 36 oder 37, bei der das wenigstens eine Reaktionszentrum oder die mehreren Reaktions- Zentren einer Gruppe (26) von zwei konzentrischen Bereichen (16,
18) umgeben ist, wobei der innere konzentrische Bereich (16) andere Benetzungseigenschaften als das Reaktionszentrum (10) und als der äußere konzentrische Bereich (18) hat.
39. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 38, bei der die Anzahl der an dem wenigstens einen Reaktionszentrum gebundenen unterschiedlichen Sorten Sonden-Makromoleküle (A, B, C) zwischen 2 und 50, bevorzugt zwischen 2 und 30 und ganz besonders bevorzugt zwischen 2 und 10 ist.
40. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 39 mit einer Einrichtung zur Erzeugung von Schallwellen mit einer Abstrahlrichtung in Richtung des wenigstens einen Reaktionszentrums, vorzugsweise wenigstens eines Interdigitaltransducers zur Erzeugung von Ober- flächenschallwellen.
41. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 40 zum Nachweis gentechnisch veränderter Organismen (GVO), wobei Makromoleküle als Sonden-Makromoleküle (A, B, C) eingesetzt werden, die zu den transgenen Sequenzen oder Teilsequenzen der gentechnisch veränderten Organismen komplementär sind.
42. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 40 zum Nachweis von Krankheitserregern, Viren und/oder Bakterien, wobei Sequen- zen oder Teilsequenzen als Sonden-Makromoleküle eingesetzt werden, die zu Sequenzen oder Teilsequenzen der Krankheitserreger, Viren und/oder Bakterien komplementär sind.
43. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 42, bei der die we- nigstens zwei Sorten der an dem wenigstens einen Reaktionszentrum gebundenen Sonden-Makromoleküle (A, B, C) zu Proben- Makromolekülen komplementär sind, die zu unterschiedlichen Organismen gehören.
44. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 43, bei der sich an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) Material zur Markierung von zumindest solchen Proben-Makromolekülen befindet, vorzugsweise unspezifisch gebunden ist, die zu den wenigstens zwei Sorten an dem Reaktionszentrum gebundener Sonden- Makromoleküle komplementär sind.
45. Vorrichtung nach Anspruch 44, bei der das Material zur Markierung fluoreszierend ist.
46. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 44 oder 45, bei der das Material zur Markierung für mehrere, vorzugsweise alle, Proben- Makromoleküle, die zu den an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) gebundenen Sonden-Makromolekülen komplemen- tär sind, gleich ist.
47. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 44 bis 46, bei der das Material zur Markierung markierte Primer für eine oder mehrere PCR (Polymerasekettenreaktion(en)) umfasst.
48. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 30 bis 47, bei dem eine Mischung von wenigstens zwei Sorten Sonden-Makromoleküle (A, B, C), die derart zu den Proben-Makromolekülen der vorbestimmten, unterschiedlichen Sorten Proben-Makromoleküle komplementär sind, dass sie mit diesen spezifisch reagieren können, hergestellt wird und als Reaktionszentrum (10, 11, 12) auf einen Träger (20) aufgespottet wird.
49. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 29, mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 43 und einem Markierungsmaterial, vorzugsweise in Form einer Mar- kierungslösung, das geeignet ist, zumindest solche Proben-
Makromoleküle zu markieren, die zu den wenigstens zwei Sorten an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) gebundener Sonden-Makromoleküle (A, B, C) komplementär sind.
50. Kit nach Anspruch 49, bei dem das Markierungsmaterial fluoreszierend ist.
51. Kit nach einem der Ansprüche 49 oder 50, bei dem das Material zur Markierung für mehrere, vorzugsweise alle, zu den an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 11, 12) gebundenen Sonden- Makromolekülen komplementären Proben-Makromoleküle gleich ist.
52. Kit nach einem der Ansprüche 49 bis 51, bei dem das Material zur Markierung markierte Primer für eine oder mehrere PCR (Polymera- sekettenreaktion(en)) umfasst.
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