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WO2006136639A1 - Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de adn - Google Patents

Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de adn Download PDF

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WO2006136639A1
WO2006136639A1 PCT/ES2006/070082 ES2006070082W WO2006136639A1 WO 2006136639 A1 WO2006136639 A1 WO 2006136639A1 ES 2006070082 W ES2006070082 W ES 2006070082W WO 2006136639 A1 WO2006136639 A1 WO 2006136639A1
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WO
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seq
detection
primers
sequences
probes
Prior art date
Application number
PCT/ES2006/070082
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English (en)
French (fr)
Inventor
Pedro Anda Fernandez
Raquel Escudero Nieto
Isabel Jado Garcia
Isabel Rodriguez Moreno
María Isabel JIMENEZ ALONSO
Original Assignee
Instituto De Salud Carlos Iii
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Publication date
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Priority to ES06764381T priority patent/ES2391833T3/es
Priority to PL06764381T priority patent/PL1895015T3/pl
Priority to US11/922,063 priority patent/US8445195B2/en
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Priority to US12/943,427 priority patent/US8318915B2/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to the detection and identification of different bacterial species, all of which cause zoonosis, based on DNA analysis. More specifically, the invention provides a method and kit for the simultaneous detection of bacteria and bacterial groups belonging to the genera Anaplasma, Ehrlichia,
  • Certain zoonoses tend to spread in developed countries as a result of the increase in population in urban and peri-urban areas, as well as the increase in animal trafficking internationally, which entails the risk of introducing exotic diseases in our environment.
  • the diagnostic methods currently available are limited to the detection of antibodies that, in general, are retrospective and of little help in the treatment of patients in their acute phase.
  • the culture is not considered a diagnostic method, both because of its technological difficulty, which excludes it from the usual practices in a hospital microbiology laboratory, as well as the need for P3 facilities.
  • the method provided by the present invention also proposes the use of the 16S-23S intergenic region for the detection of species belonging to the Bartonella genus, although improvements are applied with respect to the described procedures, since it is capable of detecting a much larger group of species of the same and other genera, using completely new probes and primers and with maximum sensitivity levels.
  • the present invention employs the same primers and the same region of DNA (insertion sequence IS1111) as previously described methods. As improvement, said detection is now combined with another series of completely new tests for the identification of other bacterial species, which can be transmitted by the same vectors, and also provides a new hybridization probe for the detection of Coxiella burnetü.
  • Multiple PCR or Multiplex PCR The PCR is a system of amplification or increase in the number of copies of a specific nucleotide sequence of an organism, through the use of two primers. Multiple PCR or multiplex PCR is a variant of the PCR, which allows simultaneous amplification of more than one target sequence using more than one pair of primers.
  • the present invention manages to solve the problem of the tedious and complicated that results in detecting a high number of bacteria, which they cause zoonoses that can be clinically and / or epidemiologically indistinguishable, through the development of a method and a detection Kit for the simultaneous identification of bacterial species causing zoonoses belonging to the genera: Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia and Francisella
  • the solution found by the present invention consists in analyzing different regions of the bacterial DNA simultaneously to determine in each case what species are present. Specifically, the 16S rRNA gene is analyzed for the identification of Anaplasma, Ehrlichia and Borrelia; the 23S-5S rRNA intergenic space for Rickettsia; the gene that codes for the precursor of the main TUL4 membrane protein for Francisella; the transposase gene IS1111 for Coxiella and the intergenic space 16S-23S for Bartonella.
  • a first aspect of the invention refers to a method for the detection of bacteria from a sample, which comprises the following steps:
  • this provides a method to simultaneously detect:
  • DNA fragments included or included in the sequences whose access numbers are shown in the following tables 1-6 are amplified.
  • the amplified regions have a size between 99 and 686 nucleotides and contain variable regions used for identification.
  • the variable regions contain or are included in SEQ ID NO: 55 to SEQ ID NO: 93 or complementary sequences, whose positions are shown in tables 1 to 6.
  • the amplification products which allow identifying the different species and bacterial groups are detected by the use of probes. In a more preferred embodiment, these probes are between 15 and 25 nucleotides in length.
  • the probes have sequences that comprise or are included in the sequences SEQ ID NO: 3-6; SEQ ID NO: 9-24; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 33-35; SEQ ID NO: 38-51; or complementary sequences (Tables 1-6).
  • the primers can be designed by multiple alignment with programs such as CLUSTAL X, which allow the identification of highly conserved regions that serve as a template.
  • the primers hybridize the genes indicated in the following tables from 1 to 6 and especially with sequences whose access number is shown in the following tables 1-6.
  • the primers have sequences that comprise or are included in SEQ ID NO: 1-2; SEQ ID NO: 7-8; SEQ ID NO: 25-26; SEQ ID NO: 28-29; SEQ ID NO: 31-32; SEQ ID NO: 36-37; or complementary sequences.
  • column 1 organism
  • column 2 gene
  • the genome or region of the genome that is used for the detection of the species or group of bacterial species of column 1 is indicated.
  • PCR inhibitors such as humic and fulvic acids, heavy metals, heparin, etc. that can lead to false negatives, and although there are methods that reduce the concentration of this type of molecules, it is recommended (cf. J. Hoorfar et al., "Making internal Ampllification control mandaory for diagnostic PCR” J. of Clinical Microbiology, Dec 2003, pp. 5835) that the PCR tests contain an Internal Amplification Control (CIA).
  • This CIA is nothing more than a DNA fragment, which is amplified simultaneously with the target sample, so that its absence at the end of the tests is indicative of the presence of factors, which have caused an undesired development of the PCR.
  • a second aspect of the invention relates to a method similar to that described in the first aspect thereof, including at least one CIA, preferably constituted by a DNA sequence of the Tetrahydrocannabinolic Syntase gene of the Cannabis sativa species and more preferably with Ia sequence with access number AB183705.
  • a region of the sequence AB183705 is amplified whose sequence comprises or is included in SEQ ID NO 94 or complementary sequences (Table 7).
  • the amplification of the region is carried out by specific primers whose sequences comprise or are included in SEQ ID NO 52 and SEQ ID NO 53 or complementary sequences.
  • primers comprise a nucleotide sequence completely complementary to the genes or gene fragments employed by the present invention.
  • variable regions refer to DNA sequences that allow the identification of bacterial species and groups, which are identified by the present invention.
  • the detection of the amplification of the CIA is performed by hybridization with probes.
  • these probes are between 15 and 25 nucleotides in length.
  • the probes have a sequence that comprise or are included in SEQ ID NO 54 or complementary sequences.
  • the invention also provides diagnostic kits for carrying out the method described by the invention comprising:
  • Sequence-specific primers SEQ ID 1-2, SEQ ID 7-8, SEQ ID 25-26, SEQ ID 28-29, SEQ ID 31-32, SEQ ID 36-37 and optionally SEQ ID 52 and 53 as CIA .
  • Sequence probes SEQ ID 3-6, SEQ ID 9-24, SEQ ID 27,
  • kits may include all those reagents necessary to carry out any of the methods described. This includes, without any limitation, the use of buffers, polymerases, cofactors to obtain optimum activity of these, agents to prevent contamination, etc. On the other hand, the kits can include all the necessary supports and containers for their start-up and optimization.
  • the advantages of the present method and the kits to carry it out are: speed (possible to detect 39 species and bacterial groups in less than 8 hours), specificity (the initiators used are specific to each species or group of bacteria) and the high sensitivity .
  • FIG. 1 Hybridization membrane shows the validation of primers, probes and variable regions for the detection of Anaplasma and Ehrlichia (A), Borrelia (B), Francisella (C), Bartonella (D) and Coxiella ( E), through the use of specific probes (Tables 1-5).
  • the S-CI2 probe refers to the probe (Table 7) that is used for the CIA.
  • FIG. 2 A) Hybridization membrane shows the validation of primers, probes and variable regions for the detection of Rickettsia species; B) Hybridization membrane showing an example of the simultaneous detection of the species belonging to the 7 genera.
  • the S-CI2 probe is used that refers to the probe (Table 7) that is used for the CIA.
  • FIG. 3 Hybridization membrane that shows the results of a study of specificity of the group of probes indicated (Tables 1-7) against different bacterial species, arthropods and mammals. The result shows that in no case the probes are attached to samples from the organisms tested.
  • the S-CI2 probe refers to the probe (Table 7) that is used for the CIA.
  • the species and gene groups selected for identification were obtained from private collections, from the Spanish Crops Collection Type (CECT) and / or the bank of samples available at the National Center for Microbiology (CNM). All the species analyzed are shown in Table 8.
  • Positive sample 2 Axenic culture medium, as described in:
  • a murine monoclonal antibody binds an antigenic determinant in outer surface protein A, an immunodominant basic protein of the Lyme disease spirochete. J. Immunol. 140: 265-72. 3: Axene culture medium, as described in:
  • the synthetic DNA was prepared based on the corresponding sequences cited in tables 1 to 7 (Column 6), by successive PCR elongation of the DNA chain, using primers of approximately 70 nucleotides, overlapping each other in approximately 20 nucleotides.
  • an internal amplification control (CIA) was constructed that was amplified together with the target DNAs, using specific primers (Table 7), which were designed from conserved regions of the sequence AB183705 (Table 7 ) belonging to the THC synthase gene of Cannabis sativa.
  • the amplicon that acts as a CIA corresponds to a sequence of 371 base pairs for which a probe was also designed (Table 7) for detection during the RLB.
  • the high specificity of the present method is based on the specificity of the primers and their probes, which were tested with another series of organisms (Table 9), following the method described by the present invention, verifying that in no case was the formation detected of amplicons detectable by hybridization ( Figure 3).

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Abstract

La presente invención se refiere a la detección e identificación de diferentes especies bacterianas, todas ellas causantes de zoonosis, basada en el análisis de ADN. Más concretamente, la invención proporciona los cebadores, las sondas, los genes y las regiones génicas para llevar a cabo un método para la detección simultánea de bacterias y grupos bacterianos pertenecientes a los géneros Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella mediante PCR Múltiple y análisis por RLB (Reverse Line Blotting), además de proporcionar el kit para llevarlo a cabo.

Description

Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de ADN
La presente invención se refiere a Ia detección e identificación de diferentes especies bacterianas, todas ellas causantes de zoonosis, basada en el análisis de ADN. Más concretamente, Ia invención proporciona un método y un kit para Ia detección simultánea de bacterias y grupos bacterianos pertenecientes a los géneros Anaplasma, Ehrlichia,
Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella mediante Ia amplificación de ADN.
Estado de Ia Técnica.
Actualmente hay descritas unas 200 enfermedades zoonóticas (bartonelosis, leptospirosis, borreliosis de Lyme...) que el hombre puede padecer. En los países en vías de desarrollo, son una importante causa de mortandad y suponen cuantiosas pérdidas económicas. La convivencia con animales, Ia ausencia de infraestructuras sanitarias y el bajo nivel cultural continúan siendo los principales aliados de estas enfermedades.
Determinadas zoonosis tienden a difundirse en países desarrollados como consecuencia del aumento de Ia población en zonas urbanas y periurbanas, así como del aumento del tráfico de animales a nivel internacional, que conlleva el riesgo de introducir enfermedades exóticas en nuestro entorno.
Estas circunstancias unidas al hecho frecuente del hallazgo de artrópodos infectados por más de uno de los patógenos incluidos en esta invención, da lugar a que Ia transmisión de más de una de las especies bacterianas, objeto de identificación por Ia presente invención a un mismo paciente por Ia misma picadura, sea un suceso habitual.
Así pues, cada vez son más comunes las hospitalizaciones debidas a cuadros clínicos producidos por el contacto del hombre con animales o con diferentes clases de artrópodos, tales como mosquitos, garrapatas, pulgas, piojos, acaras, etc., los cuales actúan como vectores o como reservónos de patógenos. Dichos cuadros clínicos, debido a su gran similitud, no permiten una identificación rápida y fiable del agente causante de Ia patología, por Io que un tratamiento especifico y rápido no es posible, y en ocasiones llega demasiado tarde. Esto justifica, sin dejar lugar a dudas, Ia necesidad de un método integrado de detección.
Los métodos diagnósticos disponibles actualmente se limitan a Ia detección de anticuerpos que, por Io general, es retrospectiva y de escasa ayuda en el tratamiento de los pacientes en su fase aguda. El cultivo no es considerado un método diagnóstico, tanto por su dificultad tecnológica, que Io excluye de las prácticas habituales en un laboratorio de microbiología de hospital, como por Ia necesidad de instalaciones P3.
El diagnóstico molecular por amplificación de genoma mediante PCR supone una opción diagnóstica de gran valor. Sin embargo, no siempre se dispone de suficiente cantidad de muestra clínica como para ensayarla frente a una amplia batería de patógenos o no se dispone de Ia metodología necesaria para realizar diferentes ensayos.
Recientemente se ha publicado un trabajo (Blaskovic D. et al. 2005. Oligo- based detection of tick-bome bacteria. FEMS Microbiology Letters 243:273- 8), que describe un método para Ia detección de 5 de los 6 patógenos propuestos por Ia presente invención. Dicho método está basado en el análisis de ADN ribosomal y emplea cebadores universales, que amplifican material genético tanto de bacterias diana como de otras que no los son por Io que su sensibilidad es bastante reducida.
Otros métodos como el descrito por las patentes americanas US 6,300,072 y 6,518,020 son capaces de detectar e identificar bacterias del género Bartonella, mediante el empleo de Ia misma región de ADN (espacio intergénico 16S-23S) empleada por Ia presente invención. Sin embargo, el número de especies dentro de este género ha aumentado sensiblemente desde el registro de dichas patentes y su aproximación, que consiste en una discriminación entre especies según el tamaño del amplicón obtenido en una PCR, no es útil para determinadas especies del género actualmente conocidas que comparten un tamaño similar del fragmento amplificado.
El método aportado por Ia presente invención propone también el empleo de Ia región intergénica 16S-23S para Ia detección de especies pertenecientes al género Bartonella, aunque se aplican mejoras respecto de procedimientos descritos, puesto que es capaz de detectar un grupo mucho más amplio de especies del mismo y otros géneros, utilizando sondas y cebadores completamente novedosos y con niveles de sensibilidad máximos.
Para Ia detección de Coxiella burnetü, Ia presente invención emplea los mismos cebadores y Ia misma región de ADN (secuencia de inserción IS1111 ) que métodos anteriormente descritos. Como mejora, dicha detección es ahora combinada con otra serie de pruebas completamente novedosas para Ia identificación de otras especies bacterianas, que pueden ser transmitidas por los mismos vectores, y además aporta una nueva sonda de hibridación para Ia detección de Coxiella burnetü.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Definiciones: PCR Múltiple o PCR Multiplex: Ia PCR es un sistema de amplificación o aumento en el número de copias de una secuencia de nucleótidos concreta de un organismo, mediante el uso de dos cebadores. La PCR múltiple o PCR multiplex es una variante de Ia PCR, que permite Ia amplificación simultanea de mas de una secuencia diana empleando mas de un par de cebadores.
La presente invención consigue resolver el problema de Io tedioso y complicado que resulta detectar un elevado número de bacterias, que causan zoonosis que pueden ser clínica y/o epidemiológicamente indistinguibles, mediante el desarrollo de un método y un Kit de detección para Ia identificación simultanea de especies bacterianas causantes de zoonosis pertenecientes a los géneros: Anaplasma, Ehrlichia, Borrelia, Bartonella, Coxiella, Rickettsia y Francisella.
La solución encontrada por Ia presente invención consiste en analizar diferentes regiones del ADN bacteriano simultáneamente para determinar en cada caso que especies se encuentran presentes. En concreto se analiza el gen 16S rRNA para Ia identificación de Anaplasma, Ehrlichia y Borrelia; el espacio intergénico 23S-5S rRNA para Rickettsia; el gen que codifica para el precursor de Ia proteína principal de membrana TUL4 para Francisella; el gen de Ia transposasa IS1111 para Coxiella y el espacio intergénico 16S-23S para Bartonella.
De acuerdo con Io mencionado, un primer aspecto de Ia invención se refiere a un método para Ia detección de bacterias a partir de una muestra, que comprende los siguientes pasos:
i) poner en contacto Ia muestra a analizar con una mezcla de reacción, que contiene cebadores específicos para Ia realización de PCR Multiplex. ii) amplificar mediante reacción en cadena de Ia polimerasa. iii) Identificar Ia formación de los productos del paso anterior, siendo dicha formación indicativa de Ia presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.
En relación con este primer aspecto de Ia invención, ésta proporciona un método para detectar simultáneamente:
• Anaplasma phagocytophilum, A. bovis, A. equi, A. margínale, A. céntrale y A. ovis.
• Ehrlichia chaffeensis y E. ewingii
• Bartonella henselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. vinsonii subespecie berkhofíi, B. vinsonii subespecie vinsonii, B. vnisonii subespecie aurupensis, B. bacilliformis, B. alsatica, B. bovis, B. doshiae, B. koehlerae, B. schoenbuchensis, B. taylorí y B. tribocorum.
• Todas las especies del género Borrelia. • Coxiella burnetii.
• Cualquier subespecie de Francisella turalensis, incluyendo F. tularensis subesp. tularensis, F. tularensis subesp. holarctica y F. tularensis subesp. novicida, que se detectan conjuntamente, y Ia variante 3523 de Ia misma especie y los denominados endosimbiontes de diferentes especies de ixódidos y argásidos, que se detectan diferencialmente
• El género Rickettsia, el grupo de las mismas causantes de las fiebres manchadas y el grupo causante del tifus, las especies Rickettsia akari, R. bellii, R. slovaca, R. conorii, R. aeschlimannii, R. ricketsii, R. sibiríca, R. helvética, R. felis, R. australis, R. prowazekii, y R. typhy (R. mooserii).
todas ellas capaces de provocar zoonosis, infectar conjuntamente a un individuo y difíciles de identificar por Ia observación de los cuadros clínicos, mediante Ia amplificación y análisis de genes o regiones génicas concretas presentadas en las tablas 1-6.
En una realización particular de este primer aspecto de Ia invención, se amplifican fragmentos de ADN incluidos o comprendidos en las secuencias cuyos números de acceso se muestran en las siguientes tablas 1-6.
En una realización más particular de este primer aspecto de Ia invención, las regiones amplificadas tienen un tamaño de entre 99 y 686 nucleótidos y contienen regiones variables empleadas para Ia identificación . En una realización aun más preferida de Ia invención, las regiones variables contienen o están incluidas en las SEQ ID NO:55 a SEQ ID NO:93 o secuencias complementarias, cuyas posiciones se muestran en las tablas de 1 a 6. En otra realización de este primer aspecto de Ia invención, los productos de amplificación, que permiten identificar los diferentes especies y grupos bacterianos son detectados mediante el empleo de sondas. En una realización más preferida, estas sondas tienen una longitud de entre 15 y 25 nucleótidos. Y en una realización aun más preferida, las sondas tienen secuencias que comprenden o están incluidas en las secuencias SEQ ID NO:3-6; SEQ ID NO:9-24; SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:33- 35; SEQ ID NO:38-51 ; o secuencias complementarias (Tablas 1-6).
Los cebadores pueden ser diseñados mediante alineamiento múltiple con programas como CLUSTAL X, que permiten Ia identificación de regiones muy conservadas que sirven de molde. En otra realización particular de este primer aspecto de Ia invención los cebadores hibridan los genes indicados en las siguientes tablas de 1 a 6 y especialmente con secuencias cuyo número de acceso se muestra en las siguientes tablas 1-6. En una realización aun más particular los cebadores tienen secuencias que comprenden o están incluidas en las SEQ ID NO: 1-2; SEQ ID NO:7-8; SEQ ID NO:25-26; SEQ ID NO:28-29; SEQ ID NO:31-32; SEQ ID NO:36-37; o secuencias complementarias.
Breve explicación de las tablas:
> En Ia columna 1 (organismo) se indica Ia especie o grupo de especies bacterianas que es detectado en cada caso. > En Ia columna 2 (gen) se indica el gen o región del genoma que es empleado para Ia detección de Ia especie o grupo de especies bacterianas de Ia columna 1.
> En Ia columna 3 (cebador) se indica Ia secuencia del par de cebadores necesario para llevar a cabo Ia amplificación de regiones variables del gen o región genómica indicada en cada tabla
(columna 2).
> En Ia columna 4 (sonda) se indica Ia secuencia de las sondas que son empleadas para Ia detección de las Ia especie o grupo de especies bacterianas referidas en Ia columna 1 de cada tabla. > En Ia columna 5 (secuencia 5'-3') se indican las referencias de las secuencias de las regiones variables que son amplificadas para llevar a cabo Ia detección de cada Ia especie o grupo de especies bacterianas. > En Ia columna 6 (posición 5'-3'): o En Ia primera fila: se indica un código de secuencia referente a una región del gen o región genómica referido en Ia columna 2, así como Ia posición concreta de dicha secuencia en donde híbrida el cebador (columna 3). o Desde Ia fila 2 hasta Ia última de cada tabla, se indica un código de secuencia referente a un gen o región genómica referido en Ia columna 2, así como Ia posición concreta de dicha secuencia a Ia que se une Ia sonda (columna 4).
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Dada Ia gran abundancia de inhibidores de PCR, tales como los ácidos húmico y fúlvico, metales pesados, heparina, etc. que pueden dar lugar a falsos negativos, y aunque existen métodos que reducen Ia concentración este tipo de moléculas, es recomendable (cf. J. Hoorfar et al., "Making intemal Ampllification control mandaory for diagnostic PCR" J. of Clinical Microbiology, Dec. 2003, pp.5835) que las pruebas de PCR contengan un Control Interno de Amplificación (CIA). Este CIA no es más que un fragmento de ADN, que se amplifica simultáneamente con Ia muestra diana, de tal modo que su ausencia al final de las pruebas es indicativa de Ia presencia de factores, que han provocado un indeseado desarrollo de Ia PCR.
Un segundo aspecto de Ia invención se relaciona con un método similar al descrito en el primer aspecto de Ia misma, incluyendo al menos un CIA, preferentemente constituido por una secuencia de ADN del gen de Ia Tetrahidrocannabinólico Sintasa de Ia especie Cannabis sativa y más preferentemente con Ia secuencia con número de acceso AB183705. En una realización más preferida se amplifica una región de Ia secuencia AB183705 cuya secuencia comprende o está incluida en Ia SEQ ID NO 94 o secuencias complementarias (Tabla 7).
En una realización también preferida, Ia amplificación de Ia región se lleva a cabo mediante cebadores específicos cuyas secuencias comprenden o están incluidas en las SEQ ID NO 52 y SEQ ID NO 53 o secuencias complementarias.
A Io largo de Ia descripción, el termino "específicos" implica que los cebadores comprenden una secuencia nucleotídica totalmente complementaria a los genes o fragmentos génicos empleados por Ia presente invención.
Los términos "regiones variables" hacen referencia a secuencias de ADN a que permiten Ia identificación de las especies y grupos bacterianos, que son identificados por Ia presente invención.
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En otra realización del segundo aspecto de Ia invención, Ia detección de Ia amplificación del CIA se realiza mediante hibridación con sondas. En una realización más preferida, estas sondas tienen una longitud de entre 15 y 25 nucleótidos. Y en una realización aun más preferida, las sondas tienen una secuencia que comprenden o están incluidas en Ia SEQ ID NO 54 o secuencias complementarias. Con el método proporcionado por Ia presente invención es posible detectar las bacterias y grupos bacterianos mencionados, independientemente de Ia procedencia de las muestras. Dichas muestras pueden haber sido obtenidas a partir de biopsias, raspados, insectos, fluidos biológicos (sangre, orina, saliva, etc.), campo, etc. La muestra una vez tomada es pretratada para poder llevar a cabo una PCR Múltiple y una posterior identificación de los amplicones.
La invención también proporciona kits de diagnostico para llevar a cabo el método descrito por Ia invención que comprenden:
> Cebadores específicos de secuencia: SEQ ID 1-2, SEQ ID 7-8, SEQ ID 25-26, SEQ ID 28-29, SEQ ID 31-32, SEQ ID 36-37 y opcionalmente SEQ ID 52 y 53 como CIA. > Las sondas de secuencia: SEQ ID 3-6, SEQ ID 9-24, SEQ ID 27,
SEQ ID 30, SEQ ID 33-35, SEQ ID 38-51 y opcionalmente SEQ ID 54 (S-CI2) como CIA.
Del mismo modo, los kits pueden incluir todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos. Esto incluye, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir Ia contaminación, etc. Por otro lado los kits pueden incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización.
Las ventajas del presente método y de los kits para llevarlo a cabo son: velocidad (posible detectar 39 especies y grupos bacterianos en menos de 8 horas), especificidad (los iniciadores empleados son específicos de cada especie o grupo de bacterias) y Ia elevada sensibilidad.
A Io largo de toda Ia descripción y reivindicaciones de Ia especificación, Ia palabra "comprende" y las variaciones de Ia misma, tal como
"comprendiendo", no pretende excluir otros aditivos, componentes, integrantes o etapas. Tanto el ejemplo de realización, como los dibujos que acompañan no pretenden ser limitantes de Ia invención, sino que deben ser tomados como un apoyo para Ia mejor compresión de ésta.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Membrana de hibridación muestra Ia validación de los cebadores, las sondas y las regiones variables para Ia detección de especies de Anaplasma y Ehrlichia (A), Borrelia (B), Francisella (C), Bartonella (D) y Coxiella (E), mediante el uso de sondas especificas (Tablas 1-5). La sonda S-CI2 hace referencia a Ia sonda (Tabla 7) que es empleada para el CIA.
Figura 2: A) Membrana de hibridación muestra Ia validación de los cebadores, las sondas y las regiones variables para Ia detección de especies de Rickettsia; B) Membrana de hibridación que muestra un ejemplo de Ia realización de detección Ia simultánea de especies pertenecientes a los 7 géneros. En este ejemplo: A. phagocytophilum, A. margínale. E. chaffeensis, E. ewingi, B. henselae, B. burgdorferí, F. tularensis tularensis, R. conoríi y R. prowazekii, ensayados a 103, 102 y 10 equivalentes de genoma/copias. En ambos casos (A y B) se emplea Ia sonda S-CI2 que hace referencia a Ia sonda (Tabla 7) que es empleada para el CIA.
Figura 3: Membrana de hibridación que muestra los resultados de Ia realización de un estudio de especificidad del grupo de sondas indicadas (Tablas 1-7) frente a diferentes especies bacterianas, artrópodos y mamíferos. El resultado muestra que en ningún caso las sondas se unen a muestras procedentes de los organismos ensayados. La sonda S-CI2 hace referencia a Ia sonda (Tabla 7) que es empleada para el CIA. EJEMPLO DE REALIZACIÓN
Alineamientos, diseños de cebadores y sondas
Por comparación y alineamientos múltiples de secuencias obtenidas a partir de bases de datos públicas como Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). se identificaron regiones conservadas, a partir de las cuales se diseñaron cebadores específicos (Tablas 1-6) para su empleo en PCR múltiple. La compatibilidad entre los cebadores, así como Ia concentración óptima, se comprobó empíricamente, igual que se realizó con Ia concentración de sales de magnesio y albúmina bovina sérica.
A partir de los alineamientos de las secuencias seleccionadas se identificaron regiones variables, que permitieron el diseño de sondas para
Ia diferenciación entre las diferentes especies bacterianas y grupos génicos
(Tablas 1 - 6), mediante RLB (Reverse Line Blotting) (kaufhold A,
Podbielski A, Baumgarten G, Blokpoel M, Top J, Schouls L. Rapad typing of group-a streptococci by the use of DNA amplification and nonradioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiology Letters 119: 19-
25 (1994)).
Un primer análisis de Ia especificidad de cada uno de las sondas se realizó mediante su comparación de su secuencia con bases de datos públicas (genbanck) empleando programas tales como BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). La especificidad se demostró posteriormente con ensayos frente una variedad de muestras de ADN de diferentes especies bacterianas y eucarióticas (Figura 3).
Medio de cultivo y aislamiento de ADN
Las especies y grupos génicos seleccionados para su identificación se obtuvieron de colecciones privadas, de Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y/o el banco de muestras disponibles en el Centro Nacional de Microbiología (CNM). Todas las especies analizadas se muestran en Ia tabla 8.
El aislamiento del material genético fue realizado por procedimientos disponibles comercial mente y sobradamente conocidos en el estado de Ia técnica (DNA Mini Kit, Qiagen.N. Referencia: 51304)
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Origen del ADN natural:
1 : Muestra positiva 2: Medio de cultivo axénico, según se describe en:
Benach JL, Coleman JL, and Golightly MG. 1988. A murine monoclonal antibody binds an antigenic determinant in outer surface protein A, an immunodominant basic protein of the Lyme disease spirochete. J. Immunol. 140:265-72. 3: Medio de cultivo axénico, según se describe en:
Anda P, Segura del Pozo J, Diaz García JM, Escudero R, García Peña FJ, López Velasco MC, Sellek RE, Jiménez Chillaron MR, Sánchez Serrano LP, Martínez Navarro JF. 2001. Waterbome outbreak of tularemia associated with crayfish fishing. Emerg. Infect. Dis. 7 (Suppl):575-82.
4: Composición de los medios de cultivo axénicos específicos para cada especie disponible en: http://cip.pasteur.fr/index.html.en
5: Propagación en cultivos celulares mediante Ia técnica de "shell vial", según se describe en:
Marrero M, Raoult D. 1989. Centrifugation-shell vial technique for rapid detection of Mediterranean spotted fever rickettsia in blood culture. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40: 197-9.
6: Agar "Mueller Hinton" suplementado con 5% de sangre de carnero. 7: ADN extraído de portaobjetos para inmunofluorescencia indirecta de origen comercial. 8: Medio de cultivo axénico según se describe en:
Edelstein PH. 1981. Improved semiselective médium for isolation of
Legionella pneumophila from contaminated clinical and environmental samples. J. Clin. Microbiol. 14:298-303. 9: ADN extraído de ejemplares libres de patógenos. 10: ADN extraído de muestras clínicas de pacientes con enfermedad no relacionada.
• ADN sintético
El ADN sintético se preparó en base a las correspondientes secuencias citadas en las tablas 1 a 7 (Columna 6), mediante sucesiva elongación por PCR de Ia cadena de ADN, utilizando cebadores de aproximadamente 70 nucleótidos, solapados entre sí en aproximadamente 20 nucleótidos.
Amplificación, hibridación y validación
En este paso se procede a realizar el análisis experimental de las zonas variables detectadas anteriormente mediante PCR para su validación. El ADN aislado se amplificó por PCR (Saiki et al., (1985) Science 230, 1350; 1354), aplicando el siguiente cuadro de ciclos de temperatura y composición de Ia mezcla de reacción, junto con los cebadores específicos que previamente habían sido diseñados para tal efecto.
Figure imgf000021_0001
Composición de Ia mezcla de reacción para un volumen final de 50 μl_:
- H2O: En función del volumen de ADN
- Buffer Taq GoId LD: 9 μl_
- CI2Mg [3mM]: 6 μl_
- dNTPs [20OmM] : 1 μl_ x 4
- BSA [0,8ug/uL]: 4 μl_ - 14 Cebadores específicos (SEQ ID 1-2, SEQ ID 7-8, SEQ ID 25-26, SEQ ID 28-29, SEQ ID 31-32, SEQ ID 36-37, SEQ ID 52-53) [50 pm/μL]: 0,5 μl_ de cada uno (7 μl_)
- Taq GoId LD: 0,5 μL [2,5 unidades]
- ADN problema: máximo de 800 ng
Los amplicones se secuenciaron para su validación, comprobándose que Ia secuencia amplificada coincidía con las secuencias variables deducidas de los estudios bioinformáticos. Posteriormente los amplicones se hibridaron con las sondas específicas siguiendo el protocolo de RLB descrito por Sjoerd G. T. Rijpkema et al., Journal of Clinical Microbiology, Dec. 1995, p. 3091-3095, aunque aplicando las siguientes modificaciones (Figura 1 y 2A):
- Sustrato: Super Signal West Dura (Pierce, Ref: 34075) - Sondas: se utilizan a una concentración entre 0,2 y 3,2 picomoles/microlitro
- Incubación: a 550C
- Lavados: a 520C El resultado de las hibridaciones es mostrado en las figuras 1 y 2A donde se aprecia como cada una de las sondas de Ia invención se unen específicamente a cada uno de los amplicones de cada una de las especies bacterianas que se detectan mediante el método de Ia invención.
Preparación de muestras y PCR múltiple.
Una de las ventajas de los sistemas de identificación basados en análisis por PCR y RLB consiste en que no es necesario partir de cultivos bacterianos puros. De este modo, y una vez realizada Ia validación de los cebadores y las sondas con muestras de ADN de las diferentes especies y subespecies citadas en las tablas 1-6, preparadas siguiendo los procedimientos citados en Ia tabla 8 y analizándolas por duplicado, se procedió a Ia realización de un análisis por PCR múltiple de una mezcla de ADN control preparada en laboratorio, seguido de Ia prueba de RLB, empleando los cebadores y sondas especificas diseñados, los ciclos de temperatura y Ia composición de mezcla de reacción indicados anteriormente cuyos resultados se muestran en Ia figura 2B. En Ia dicha figura se aprecia que es posible realizar Ia detección simultanea de aquellas especies bacterianas que estaban presentes en Ia muestra.
Detección de inhibidores de PCR
Para Ia detección de inhibidores de PCR, se construyó un control de interno de amplificación (CIA) que fuese amplificado junto los ADN diana, utilizando cebadores específicos (Tabla 7), que fueron diseñados a partir de regiones conservadas de Ia secuencia AB183705 (Tabla 7) perteneciente al gen de Ia THC sintasa de Cannabis sativa. Concretamente el amplicón que actúa como CIA se corresponde con una secuencia de 371 pares de bases para Ia cual se diseñó también una sonda (Tabla 7) para su detección durante el RLB.
Especificidad del método
La alta especificidad del presente método está basada de Ia especificidad de los cebadores y sus sondas, los cuales fueron probados con otra serie de organismos (Tabla 9), siguiendo el método descrito por Ia presente invención, comprobándose que en ningún caso se detectaba Ia formación de amplicones detectables mediante hibridación (Figura 3).
Figure imgf000023_0001

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para Ia detección simultanea de especies bacterianas causantes de zoonosis pertenecientes a los géneros: Anaplasma, Ehrlichia, Bartonella, Borrelia, Coxiella, Francisella y Rickettsia que comprende:
a. Poner en contacto Ia muestra a analizar con una mezcla de reacción que comprenda cebadores específicos que amplifiquen las secuencias: SEQ ID 55 -93. b. Amplificar mediante reacción en cadena de Ia polimerasa. c. Identificar Ia formación de productos del paso anterior, siendo dicha formación indicativa de Ia presencia o ausencia de bacterias causantes de zoonosis.
2. Método según Ia reivindicación 1 donde las especies bacterianas detectadas son:
a. Anaplasma phagocytophilum, A. bovis, A. equi, A. margínale, A. céntrale y A. ovis. b. Ehrlichia chaffeensis y E. ewingii. c. Bartonella henselae, B. quintana, B. clarridgeiae, B. elizabethae, B. grahamii, B. vinsonii subespecie berkhofii, B. vinsonii subespecie vinsonii, B. vnisonii subespecie arupensis, B. bacilliformis, B. alsatica, B. bovis, B. doshiae, B. koehlerae, B. schoenbuchensis, B. taylori y B. tribocorum. d. Especies del género Borrelia e. Coxiella burnetii f. Francisella turalensis subesp. holarctica y F. tularensis subesp. novicida, Ia variante 3523 de Francisella turalensis y el grupo endosimbionte de Francisella. g. Especies causantes de las fiebres manchadas y el grupo causante del tifus, las especies Rickettsia akari, R. bellii, R. slovaca, R. conorii, R. aeschlimannii, R. ricketsii, R. sibirica, R. helvética, R. felis, R. australis, R. prowazekii, y R. typhy.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los cebadores comprenden las secuencias SEQ ID 1 , 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31 , 32, 36, 37.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde Ia detección simultanea de los productos de amplificación se realiza mediante sondas que comprenden las secuencias SEQ ID 3-6, 9-24, 27, 30, 33-35, 38- 51.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende al menos un control de amplificación interno.
6. Método según Ia reivindicación 5, en donde el control de amplificación interno comprende: a. La amplificación de Ia SEQ ID 94 con cebadores específicos. b. Detección de Ia formación del producto de amplificación del paso anterior
7. Método según Ia reivindicación 6, en donde los cebadores específicos tienen las secuencias 52 y 53.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde Ia detección del producto de amplificación es llevada a cabo mediante Ia sonda de SEQ ID 54.
9. Cebadores de SEQ ID 1 , 2, 7, 8, 25, 26, 28, 29, 31 , 32, 36 y 37, caracterizados porque son capaces de amplificar las secuencias definidas según Ia reivindicación 1.
10. Cebador de SEQ ID 52 y 53, caracterizados porque son capaces de amplificar Ia secuencia definida según Ia reivindicación 6.
11. Sondas de secuencia SEQ ID 3-6, 9-24, 27, 30, 33-35 y 38-51 , caracterizadas porque son capaces de hibridar con las secuencias definidas según Ia reivindicación 1.
12. Sonda de SEQ ID 54, caracterizada porque es capaz de hibridar con Ia secuencia definida según Ia reivindicación 8.
13. Kit de diagnostico capaz de llevar a cabo el método según las reivindicaciones 1 a 8.
14. Kit según Ia reivindicación anterior que comprende cebadores según las reivindicaciones 9 y 10.
15. Kit según Ia reivindicación anterior que comprende sondas según las reivindicaciones 11 y 12.
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