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WO2006004207A1 - 抗シノビオリン抗体 - Google Patents

抗シノビオリン抗体 Download PDF

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WO2006004207A1
WO2006004207A1 PCT/JP2005/012706 JP2005012706W WO2006004207A1 WO 2006004207 A1 WO2006004207 A1 WO 2006004207A1 JP 2005012706 W JP2005012706 W JP 2005012706W WO 2006004207 A1 WO2006004207 A1 WO 2006004207A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
cells
antibody
synoviolin
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/012706
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshihiro Nakajima
Satoshi Yamasaki
Lei Zhang
Tetsuya Amano
Original Assignee
Locomogene, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Locomogene, Inc. filed Critical Locomogene, Inc.
Priority to EP05758020A priority Critical patent/EP1780221A4/en
Priority to CA002572321A priority patent/CA2572321A1/en
Priority to JP2006529014A priority patent/JPWO2006004207A1/ja
Priority to US11/631,283 priority patent/US20080305499A1/en
Priority to AU2005260424A priority patent/AU2005260424A1/en
Publication of WO2006004207A1 publication Critical patent/WO2006004207A1/ja

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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to an anti-synoviolin antibody. More specifically, the present invention relates to an antibody capable of inhibiting synoviolin auto-ubiquitination, a pharmaceutical composition containing the antibody, and a method for detecting a cell expressing synoviolin using the antibody.
  • RA Rheumatoid arthritis
  • Synovial cells are fibroblast-like cells that form 1 to 6 epithelial-like layers in the synovial membrane of the joint, and are supposed to supply proteoglycan and hyaluronic acid to the synovial fluid.
  • Symptoms such as synovial tissue proliferation, the resulting multilayered structure, and infiltration of synovial cells into other tissues are observed in the joints of RA patients.
  • autoantibodies against the Fc region of autologous immunoglobulin (IgG) are present in the serum of RA patients.
  • Autoantibodies, also called RA factors have long been used as a characteristic diagnostic indicator of RA.
  • an anti-human synovial cell antibody was obtained using the cultured human synovial cells of RA patients as an immunogen, and the cDNA library of the synovial cells was immunoscreened and expressed in the synovial tissues of RA patients. I found a new gene. This gene was also successfully isolated, and the protein encoded by it was named synoviolin, the synovial cell that expresses it, and its physiological significance was clarified. (International Publication No. WO02 / 052007 Pamphlet).
  • Synoviolin discovered by the inventors is closely related to the abnormal growth of synovial tissue, which is the main cause of RA disease, and is expected to provide extremely important information in diagnosis.
  • Synoviolin is also known to encode an E3 ubiquitin ligase with a RING finger motif from the protein structure prediction system. This motif plays an important role in the ubiquitination of proteins, but in fact, it has been proved to have self-ubiquitination activity, and it is speculated that this also controls protein functions.
  • the present inventors have found for the first time that synoviolin has a ubiquitin ligase action that causes self-ubiquitination. Disclosure of the invention
  • synoviolin has a ubiquitin ligase action that causes self-ubiquitination, and thus has an anti-inhibition effect on synoviolin self-ubiquitination.
  • a synoviolin antibody was found and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows.
  • the antibody may be a monoclonal antibody.
  • a method for producing a monoclonal antibody against Synoviolin capable of inhibiting Synoviolin auto-ubiquitination, wherein the peptide comprising any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 5 is immunized as an antigen A method comprising culturing a fusion cell of an animal antibody-producing cell and a myeloma cell, and collecting the monoclonal antibody from the obtained culture.
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody or fragment thereof according to (1) or (2).
  • This pharmaceutical composition is, for example, a cell proliferative disease, rheumatoid arthritis, cancer, fibrosis, arteriosclerosis, Castleman's disease, multiple myeloma, Crohn's disease, systemic juvenile idiopathic arthritis, brain tumor, tongue cancer, pharyngeal cancer Lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, knee cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, duodenal cancer, colorectal cancer, liver cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, kidney cancer, bladder cancer, striated muscle sarcoma, fibrosarcoma Can be used for the treatment or prevention of osteosarcoma, chondrosarcoma, skin cancer, acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocyte leukemia, adult T cell leukemia, malignant lymphoma.
  • a synoviolin self-ubiquitination inhibitor comprising the antibody or fragment thereof according to (1) or (2).
  • a synoviolin-containing cell detection reagent comprising the antibody or fragment thereof according to (1) or (2).
  • a reagent for detecting a cell proliferative disease caused by Synoviolin comprising the antibody or fragment thereof according to (1) or (2).
  • cell proliferative diseases include rheumatoid arthritis, cancer, fibrosis, arteriosclerosis, Castleman's disease, multiple myeloma, Crohn's disease, whole body Type Idiopathic arthritis, brain tumor, tongue cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, knee cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, duodenal cancer, colon cancer, liver cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, Kidney cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, skin cancer, acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocyte leukemia, adult ⁇ -cell leukemia, malignant lymphoma, etc. .
  • the above cells are synovial cells, osteoclasts, keratinized epithelial cells, blood cells, cancer cells, bone marrow cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, dermal cells, muscle cells, nerve cells, lymphocytes, vascular smoothness It may be selected from the group consisting of muscle cells, hepatocytes, pigment cells, adipocytes, uterine endothelial cells, alveolar epithelial cells, undifferentiated mesenchymal cells, and ectoderm crests.
  • a method for inhibiting synoviolin self-ubiquitination comprising reacting the antibody or fragment thereof according to (1) or (2) with synoviolin.
  • a method for detecting synopioline-expressing cells comprising reacting the antibody or fragment thereof according to (1) or (2) with a biological sample.
  • a method for detecting a cell proliferative disease with Synoviolin comprising reacting the antibody or fragment thereof according to (1) or (2) with a biological sample collected from a subject.
  • Cell proliferative diseases and cell types are the same as described above.
  • the above cells are synovial cells, osteoclasts, keratinized epithelial cells, blood cells, cancer cells, bone marrow cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, dermal cells, muscle cells, nerve cells, lymphocytes, vascular smoothness It may be any cell selected from the group consisting of muscle cells, hepatocytes, pigment cells, fat cells, uterine endothelial cells, alveolar epithelial cells, undifferentiated mesenchymal cells, and ectoderm apical ridges.
  • Fig. 1 is a photograph showing the results of Western blotting of synovial cells from patients with rheumatoid arthritis (RA: 2 samples) and osteoarthritis patients (OA: 2 samples) using SL-1 antibody. .
  • Figure 2 shows a photograph of the results of fluorescent immunostaining of RA patient-derived synoviocytes with SL-1 antibody.
  • FIG. 3 is a diagram showing immunostaining results of RA patient-derived synovial tissue with SL-1 antibody and hematoxylin'eosin (HE) -stained images.
  • Figure 4 is a photograph of a Western plotting analysis showing that self-ubiquitination of MBP-dTM Syno-His fusion protein was inhibited by SL-1 antibody.
  • Figure 5 is a photograph of a stamp stamping analysis showing that synovioline ubiquitination of the GST-P4HA1 fusion protein was not affected by the SL-1 antibody.
  • the antibody of the present invention is an antibody against Synoviolin that can inhibit Synoviolin auto-ubiquitination, and is obtained by immunizing with a peptide consisting of a part of amino acid sequence of Synoviolin RING finger region as an antigen. It is.
  • Ubiquitination is a process in which enzymes such as ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2), and ubiquitin ligase (E3) cooperate to bind ubiquitin to a substrate protein one after another. It is.
  • E1 ubiquitin-activating enzyme
  • E2 ubiquitin-conjugating enzyme
  • E3 ubiquitin ligase
  • self-ubiquitination, auto ubiquitination means that synoviolin itself has a ubiquitin ligase activity, so that synoviolin itself becomes a substrate protein for ubiquitination and is caused by other ubiquitin ligases. It is what binds ubiquitin on its own. Synopioline self-ubiquitination was revealed by the present inventors when synoviolin was found to have ubiquitin ligase activity. That is, Shino in mice Overexpression of violin causes spontaneous development of arthropathy with synovial cell proliferation
  • the “antibody” means the whole antibody molecule (which may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody) capable of binding to the antigen Synoviolin or a partial fragment thereof, That is, active fragments having antigen-antibody reaction activity, specifically, Fab, F (ab ′) 2 , Fv, recombinant Fv form, and single chain Fv are also included.
  • Synoviolin fragments having antigen-antibody reaction activity, specifically, Fab, F (ab ′) 2 , Fv, recombinant Fv form, and single chain Fv are also included.
  • an equivalent or equivalent protein, a fragment or a partial peptide thereof can be used as an immunogen. Any of them can be an antigen of an anti-sinoviolin antibody. This is because antibodies are generally induced by the recognition of a small region of the protein surface known as the epitope site, rather than the antigen being induced by comprehensive recognition of the entire protein structure. . Such epitope sites are formed by continuous or discontinuous portions of the polypeptide chain. Therefore, for a single antibody against Synoviolin, The site acting as a group corresponds to a limited peptide site of Synoviolin.
  • Synoviolin used in the present invention may be derived from humans, mice, rats, etc., and is not particularly limited.
  • synoviolin for example, a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be used.
  • proteins equivalent to or equivalent to synoviolin can also be used as antigens (described later).
  • Synoviolin can be obtained from the synovial tissue of RA patients. Since synoviocytes can be cultured in vitro, synoviolin can be recovered from this culture. Specifically, synovial cells are separated from this tissue based on synovial tissue surgically excised from RA patients by synovectomy. When the separated cells are cultured, synoviocytes can be collected as adherent cells (Nakajima T et. Al., J. Clin. Invest. 92: 186-193, 1993). Synoviolin is extracted and purified from the collected cells by combining known protein purification techniques. The obtained Synoviolin or a fragment thereof can be used as an immunogen for obtaining an antibody.
  • Synoviolin can be obtained not only as a biomaterial but also as a gene recombinant expression product by incorporating a gene encoding synoviolin into an appropriate expression system.
  • the polynucleotide encoding synoviolin may be of any origin. In other words, it can be obtained by synthesis in addition to genomic DNA and cDNA. Also, the nucleic acid can be DNA: NA. Furthermore, as long as it can encode Synoviolin, it includes a polynucleotide having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code, or one containing a modified nucleotide.
  • a cDNA library is obtained based on the mRNA extracted from the synovial cells of the RA patient, and then cloned. Just do it. That is, the desired polynucleotide can be obtained by amplifying a cDNA library by PCR or the like and screening a hybridizing clone (Short JM, et. Al., Nucleic Acid Res. 16: 7583- 7600, 1988).
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of DNA encoding the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2.
  • an expression vector pGEX and E. coli can be exemplified.
  • fusion protein expression vectors using a histidine tag, HA tag, FLAG tag, etc. are commercially available.
  • a host / vector system an expression system using a yeast of the genus Pichia or an expression system using a baculovirus vector hosted by insect cells is effective for the expression of a protein having a sugar chain.
  • transfection of vectors using a mammalian cell using a cytomegalovirus (CMV) promoter, a rous meat heavy virus (RSV) promoter, or a promoter such as SV40 is performed.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV rous meat heavy virus
  • synoviolin in the present invention, it is also possible to collect synoviolin from the above Synoviolin gene or the above vector. That is, in the present invention, synoviolin can be produced by employing a cell-free protein synthesis system without using any living cells.
  • a cell-free protein synthesis system is a system that synthesizes a protein in an artificial container such as a test tube using a cell extract.
  • the cell-free protein synthesis system used in the present invention also includes a cell-free transcription system that synthesizes RNA using DNA as a cage.
  • the organism corresponding to the above host corresponds to the organism from which the following cell extract is derived.
  • the cell extract is an extract derived from a eukaryotic cell or a prokaryotic cell, for example, an extract of wheat germ, rabbit rabbit reticulocyte, mouse L-cell, HeLa cell, CHO cell, budding yeast, E. coli, etc. Can be used. These cell extracts may be concentrated or not concentrated.
  • the cell extract can be obtained, for example, by ultrafiltration, dialysis, polyethylene glycol (PEG) precipitation or the like. Furthermore, in the present invention, cell-free protein synthesis is commercially available.
  • the kit can also be used. Examples of such kits include the reagent kit PROTEIOS TM (Toyobo), TNT TM System (Promega), the synthesizer PG-Mate TM (Toyobo), and RTS (Roche Diagnostics). Synoviolin obtained by cell protein synthesis as described above can be purified by appropriately selecting chromatography as described above.
  • Proteins that can serve as antigens when preparing anti-synoviolin monoclonal antibodies include not only human synoviolin extracted from synoviocytes, but also various proteins functionally equivalent to synoviolin. Such proteins, whether artificial or naturally occurring, have one or several amino acid substitutions, deletions, additions and / or insertions in the amino acid sequence of human synoviolin. Proteins that have been mutated due to the above, modified proteins in which amino acid side chains are modified, and fusion proteins with other proteins are also included.
  • amino acid mutations or modifications in these proteins, or the site of mutation or modification is not limited as long as the function of synoviolin is retained.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 one or more (for example, one or several) amino acids have been mutated by substitution, deletion, addition and / or insertion, etc., or the amino acid side A modified protein in which the chain is modified can be used.
  • amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 may be in other amino acids.
  • a mutant synoviolin polypeptide having an amino acid sequence obtained by combining the above (i) to (iii) and having the same action as the above-mentioned synoviolin can also be used.
  • the polypeptide used in the present invention may be a polypeptide having the above-mentioned synoviolin amino acid sequence and homozygote as long as it has a function equivalent to that of synoviolin. Examples thereof include amino acid sequences having homology of about 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more with the amino acid sequence of the above Synoviolin polypeptide.
  • a polynucleotide encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is described in ⁇ Molecular Cloning, A Laooratory Manual 2nd ed. J (Cold Spring Harbor Press 1989), ⁇ Current Protocols in Molecular Biology '' (John Wiley & Sons 1987-1997), Kunkel TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, 1985, etc. It can be prepared according to a method such as site-directed mutagenesis.
  • mutagenesis kit utilizing site-directed mutagenesis, for example QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (scan Toratajin GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKai a Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.
  • QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit scan Toratajin GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKai a Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: manufactured by Takara Bio Inc.) and the like.
  • a protein immunologically equivalent to synoviolin can be shown first. That is, as long as it is a protein functionally equivalent to synoviolin and recognizes synoviolin specifically and reacts with an antibody present in the serum of RA patients, it contains a synoviolin domain.
  • proteins that are functionally equivalent to Synoviolin are also defined based on their binding properties with ligand proteins that bind to Synoviolin.
  • HMG-CoA Reductase Degradation 3 HMG-CoA Reductase Degradation 3 (Hrd3), Procollagen-Proline, 2-oxo-Goleretanolate 4-Dioxygenase (Proline 4 hydraxylase), a 3, Rehepted I (P4HA1), omocysteine- indusible endoplasmic reticulum stress -in dusible ubiquitin-like domain member 1 (Herp)
  • Hrd3 HMG-CoA Reductase Degradation 3
  • Procollagen-Proline Procollagen-Proline
  • 2-oxo-Goleretanolate 4-Dioxygenase Proline 4 hydraxylase
  • P4HA1 Rehepted I
  • omocysteine- indusible endoplasmic reticulum stress -in dusible ubiquitin-like domain member 1 Herp
  • proteins functionally equivalent to human synoviolin include proteins that have an activity that contributes to normal bone formation or limb development. Synoviolin is strongly expressed in the sites where bone and cartilage are formed in the parietal bone, limbs, ears, etc. during development, and apical ectodermal ridge (AER) and cartilage / osteogen in the limb formation stage. Strong expression is observed in the group.
  • AER apical ectodermal ridge
  • proteins functionally equivalent to Synoviolin according to the present invention can be defined based on the biochemical activity of Synoviolin, such as ubiquitin ligase activity. These biochemical activities are supported by various motifs and experimental results found in Synoviolin.
  • Proteins that are functionally equivalent to Synoviolin include amino acid residue modifications, conservative substitutions, deletions, additions or insertions, physiological or artificial modifications such as sugar chains, labels such as fluorescent and radioactive substances, Alternatively, proteins with various modifications such as fusion with other proteins are also included.
  • proteins with various modifications such as fusion with other proteins are also included.
  • differences in modification with sugar chains may occur depending on the host to be expressed.
  • Synoviolin As an example of a fusion protein with another protein, an additional amino acid sequence such as a FLAG tag, HA tag, or histidine tag was added, and at least one property was maintained as a protein functionally equivalent to the Synoviolin. There is protein. Or even if it has an activity different from Synoviolin, Synoviolin Also included are fusion proteins that have at least one function. Since Synoviolin is self-ubiquitinated even in its intracellular domain alone, Synoviolin used in the present invention may be Synoviolin dTM excluding the transmembrane site. For example, MBP-synoviolin dTM-His in which the above tag protein is fused to the dTM can also be used in the present invention.
  • Another example is a fusion protein that has an activity different from that of Synoviolin but maintains at least one function of Synoviolin.
  • synoviolin or a protein equivalent thereto can be used as an antigen for producing an anti-synoviolin antibody.
  • antibody detection not only the antigen molecule itself (that is, synoviolin or an equivalent protein), but also fragments of these proteins, fragment peptides, and chemically synthesized oligopeptides are used as appropriate carriers.
  • a method of using a complex containing the same as an antigen is employed. The reason is that an analysis system that is specific to a particularly dominant epitope or a clinically meaningful epitope is less susceptible to nonspecific reactions.
  • a domain functioning as an epitope can be determined based on a method for obtaining an immunologically active domain peptide described later.
  • epitopes may consist of at least 3 amino acid residues. It is said that immunological discrimination from other proteins is possible with at least 8 amino acid residues. Therefore, Synoviolin or its equivalent Consisting of at least 8 consecutive amino acid residues selected from the amino acid sequence of the protein, usually 9 amino acid residues, preferably 10 amino acid residues, more preferably 11 to 15 amino acid residues, especially patient serum A fragment that reacts with the antibody therein is desirable as an antigen for antibody detection in the present invention.
  • a method for improving immunological reactivity by adding various modifications to the oligopeptide constituting the epitope is also known to those skilled in the art.
  • modifications such as addition of an inactive protein such as human serum albumin or a meaningless amino acid sequence contribute to the improvement of immunological reactivity.
  • Synoviolin fragments can be obtained by enzymatic digestion with proteases such as trypsin, chymotrypsin, pepsin or chemical cleavage using promocyan, or a combination thereof.
  • proteases such as trypsin, chymotrypsin, pepsin or chemical cleavage using promocyan, or a combination thereof.
  • known separation techniques such as chromatography and electrophoresis may be used.
  • a peptide portion that is assumed to be suitable with 14 or more amino acid residues is first determined by an analysis method that searches for the hydrophilic profile of synoviolin and other antigenic indices.
  • These peptides as immunogen candidates can be synthesized by a peptide synthesis technique based on a known technique, liquid phase method or solid phase method.
  • the solid phase synthesis method represented by the Merrifield method is simple and can be performed in a short time.
  • Tertiary ptyloxycarbonyl (Boc) is typically used as the ⁇ -amino protecting group, but the 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group (Atherton, E & Sheppard, RC, J) developed by Sheppard et al. Chem. Soc. Chem. Comm. 165, 1985) is also available (see Nobuo Izumiya, et al., “Basics and Experiments of Peptide Synthesis” on pages 194-233, Maruzen, 1985).
  • an automated peptide synthesizer based on a solid phase synthesis method may be used.
  • the synthesized peptide is cleaved from the resin in the presence of trifluoroacetic acid and then purified by reverse phase high performance liquid chromatography.
  • the purified peptide desirably has a purity of 85% or more.
  • a peptide that reacts with a polyclonal antibody collected from an immunized animal and synoviolin and shows a positive detection reaction with an enzyme-labeled anti-IgG antibody is used as an immune antigen for producing the antibody of the present invention.
  • synoviolin fragments as immunogens include at least one peptide comprising the following amino acid sequence:
  • An immunogen prepared by conjugating these peptides to a carrier protein provides an antibody that is specific for synoviolin and has sufficient binding affinity.
  • the above peptide of synoviolin which is useful as an immunogen, is sensitized to animals after binding to moss guanine (KLH) as a carrier protein.
  • carrier substances that can be used to obtain immunogens include tuberculin purified protein derivatives, tetanus denatured toxin, cholera toxin and its B subunit, diphtheria toxin, ovalbumin, ushi serum albumin, soybean trypsin inhibitor Muramyl dipeptide, brown lipoprotein, and the like.
  • the antigen prepared as described above is administered to a mammal.
  • Mammals are particularly limited Rather than, for example, rats, mice, and rabbits, but rabbits are preferred.
  • the dose of antigen per animal is 1 to 10 mg for rabbits when no adjuvant is used, and 0.1 to 1 mg when adjuvants are used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Aluminum hydroxide adjuvant examples include aluminum hydroxide adjuvant.
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks.
  • the antibody titer was measured by enzyme immunoassay (ELISA) or EIA (enzyme immunoassay), fcc radioimmunoassay fe (RlA; radioimmuno assay), etc. And collect blood on the day that shows the maximum antibody titer to obtain antiserum.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RlA radioimmunoassay
  • synoviolin as an antigen for immunization, or an immunologically equivalent protein, or a fragment or fragment peptide thereof is used alone as an immunogen at a site where mammalian antibodies can be produced. Or with a carrier and diluent.
  • an adjuvant or the like may be mixed and administered (Adv. Tubercl. Res., 1: 130-148, 1956).
  • adjuvants include FCA, FIA, and aluminum hydroxide adjuvant.
  • a monoclonal antibody forms a fusion cell between an immunocompetent cell (specifically, an antibody-producing cell) and a myeloma cell (myeloma cell), and clones the cell to produce an antibody specific for synoviolin. It can be obtained by selecting clones (Kohler, G. & Milstein, C, Nature 256: 495-7, 1975).
  • a complex containing the above peptide (or synoviolin or an immunologically equivalent protein or fragment thereof) is used as an immunogen.
  • immunize animals with 20 ig to l mg, dissolved or mixed with a suitable adjuvant.
  • mice examples include mice, guinea pigs, rabbits, rats, hedges, goats, monkeys, and dogs. In general, mice or rabbits are preferably used because of their ease of handling. .
  • the antibody-producing cells and the myeloma cells are preferably derived from the same species. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks in a period of 3 to 6 months, 2 to about L0 times.
  • To collect antibody-producing cells select an individual with an antibody titer from the antigen-sensitized animal, and collect spleen cells, lymph node cells, or B-lymphocytes 2 to 5 days after the final immunization.
  • the antibody-producing cells contained therein are fused with myeloma cells capable of self-sustaining proliferation.
  • a hyperprideoma that produces a monoclonal antibody can be prepared. The procedure should basically follow the method of Köhler (“Immunological Method”, Academic Press, New York, 391, 1979).
  • myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as P3U1, NS-1, and SP2 / 0, or mutants thereof, and P3U1 is particularly preferred.
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG), Sendai virus, and the like. Preferably, PEG is used.
  • the myeloma cells are suspended in RPMI1640 medium or the like that does not contain serum, and the suspension containing the antibody-producing cells such as spleen cells prepared above is added to the suspension for a while.
  • HAT hypoxanthine, aminopterin, thymidine
  • Cultivation is usually 20-40 ° C, preferably 34-38 ° C in an incubator under 5% carbon dioxide.
  • Hypridor grows and colony formation is observed.
  • the duration of the culture is usually 5 days to 3 weeks, preferably:! To 2 weeks.
  • Selection of monoclonal antibodies can usually be performed using animal cell culture medium supplemented with HAT.
  • the selection and breeding medium is not particularly limited as long as it can grow a high-pridoma.
  • a serum-free medium for hybridoma culture RPMI medium containing fetal calf serum (FCS), GIT medium, or the like can be used.
  • the antibody titer against the peptide in the culture supernatant of the well where proliferation has been observed is measured by an enzyme antibody method or the like, and the hybridoma is cloned by, for example, the limiting dilution method to obtain the clone of the hybridoma of the present invention.
  • the operation for screening the formed high-pridor of the present invention is generally as follows.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase such as a microplate on which the peptide used as an immunogen is adsorbed directly or together with a carrier, and then anti-immunoglobulin antibody or protein A labeled with a radioactive substance, enzyme, etc.
  • a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase is convenient.
  • a hybridoma culture supernatant may be added to a solid phase on which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, and then a labeled antigen may be added to detect a monoclonal antibody bound to the solid phase.
  • Select positive tools by the above procedure and after a few days, seed one 96-well plate per strain, for example, at 100 cells / plate, and culture for 10-14 days. Determine the colonies and apply the culture supernatant to the above-mentioned antigen-immobilized plate for screening. After culturing, the selected colonies are recloned and cultured for 10 to L4 days, and the colony determination culture supernatant assay is performed as described above. Select a tool for each parent strain, incubate on a 24 tool plate, collect the supernatant, check the clones, and test antibody subclass antibody production.
  • the present invention When the clone SL-1 selected as described above is cultured in vivo and in vitro, the present invention
  • the monoclonal antibody SL-1 antibody is produced.
  • a method commonly used in the technical field can be used.
  • Hypridoma SL-1 is cultured in an in vitro culture medium
  • the SL-1 antibody may be separated from the culture.
  • selection and maintenance of the type of medium and management of culture conditions for example, oxygen concentration in medium, stirring speed, contamination
  • monoclonal antibodies are collected from the ascites and Z or blood.
  • clones are inoculated to RPMI1640 medium supplemented with ushi fetal serum to a predetermined cell density, and then cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide in an incubator. The culture is then inoculated into the peritoneal cavity of a mouse previously administered pristane and bred in the usual way for the desired period.
  • ascites is collected, and ammonium sulfate is added to it to obtain a salting out precipitate.
  • the monoclonal antibody is separated and purified from the fraction using chromatography.
  • the method for isolating the monoclonal antibody from the culture or ascites and / or blood is the same as the conventional method for purifying polyclonal antibodies, and is based on the method for separating and purifying immunoglobulins. That is, salting-out method, dialysis method, filtration method, concentration, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, various electrophoresis methods, adsorption / desorption method by ion exchanger (DEAE resin, etc.), ultracentrifugation method, gel filtration method By using a specific affinity purification method in an appropriate combination.
  • the produced monoclonal antibody is then concentrated and dried, and is made liquid or solid depending on the application.
  • the antibody includes a humanized or humanized antibody.
  • a human antibody can be produced in the same manner as a normal monoclonal antibody by immunizing a mammal whose immune system is replaced with that of a human.
  • a humanized antibody is an antibody in which the constant region and a part of the variable region are human-type antibodies.
  • the framework region (FR) is derived from human and has a phase called CDR.
  • the complementarity determining region is derived from the mouse and is a reconstituted antibody.
  • CDRs are transplanted from the variable region of the mouse antibody into the human variable region, and then these humanized reshaped human variable regions are converted into the human constant region.
  • Link A method for producing humanized antibodies can be obtained by genetic engineering techniques and has been established in this field. (Kazuhisa Sugimura “Fully Antibody Antibody! All about Antibody Engineering and Antibody Medicine” Bio .2 No.4 Yodosha 2002).
  • Synoviolin substrate protein P4HA1 ubiquitination is not affected. That is, it does not affect the physiological functions related to ubiquitination of P4HA1.
  • the isotype of the antibody of the present invention is IgGl.
  • the antibody of the present invention (for example, SL-1 antibody) can specifically recognize synoviolin or a partial peptide thereof, various forms of use are conceivable. The following are some typical uses of the SL-1 antibody as an example.
  • Ubiquitination is a process in which ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2) and ubiquitin ligase (E3) jointly bind ubiquitin to a substrate protein.
  • E1 ubiquitin-activating enzyme
  • E2 ubiquitin-conjugating enzyme
  • E3 ubiquitin ligase
  • synoviolin self-ubiquitination means that synoviolin itself has a ubiquitin ligase activity, so that synoviolin itself becomes a substrate protein for ubiquitination and binds ubiquitin itself rather than other ubiquitin ligases. It is.
  • Enzymes such as the above-mentioned ubiquitin-activating enzyme (E1) and ubiquitin-binding enzyme (E2) are commercially available, and these can be used as appropriate.
  • E1 is in the range of 10-50 ng, preferably in the range of 20-40 ng
  • E2 is 0.:! It is used in the range of -0.5 / g, preferably in the range of 0.2-0.3 g.
  • Mg salts such as MgCl 2, MgS0 4, ATP, EDTA, NAF, DTT ( Jichiosurei Torr), it can be appropriately selected and used like okadaic acid. These compounds are also commercially available and are readily available.
  • a buffer solution for dissolving enzymes or reagents can be any known buffer solution as long as it does not inactivate the enzyme or inhibit the reaction.
  • Tris-HCl can be used.
  • Synoviolin auto-ubiquitination can usually be performed under the following conditions. To a certain amount of buffer solution (pH 6-8) as a reaction solvent, add the reactants required for synoviolin auto-ubiquitination (excluding synoviolin or its active derivative); Incubate at room temperature for 5-30 minutes. Synoviolin or its active derivative or immobilized active derivative of synoviolin is then added to initiate the synoviolin self-ubiquitination reaction. Incubate for 20-120 minutes at a constant temperature of room temperature to 37 ° C, and keep a constant stop buffer (containing 0.2 M borate buffer, TritonX-100 and EDTA). The reaction is stopped by adding an amount. Then, the amount of ubiquitin bound to synoviolin or unbound ubiquitin is measured to determine the degree of self-ubiquitination. (2) Examination ⁇ Use for diagnosis, treatment effect or drug effect determination
  • Synoviolin is strongly expressed in the synovial tissue of RA patients.
  • antibodies that recognize Synoviolin are frequently detected in the blood of RA patients.
  • synoviolin antibodies cannot be substantially detected in the blood of healthy individuals.
  • Synoviolin also allows the growth of cultured synoviocytes in the in vitro mouth. Suppress. This is thought to be because Synoviolin competes with a ligand that promotes synovial cell proliferation. Based on this information, the following molecular mechanisms can be assumed. That is, the strong expression of synoviolin in synoviocytes promotes the binding of synoviolin with a synoviolin ligand that has a growth promoting effect on synoviocytes, and as a result, the proliferation of synoviocytes is promoted. And this abnormal growth of synovial cells is nothing but the pathology of RA.
  • Cell proliferative diseases include, for example, rheumatoid arthritis, cancer, fibrosis, arteriosclerosis, Castleman's disease, multiple myeloma, Crohn's disease, systemic juvenile idiopathic arthritis, brain tumor, tongue cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, food Tract cancer, stomach cancer, knee cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, duodenal cancer, colon cancer, liver cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, Examples include, but are not limited to, chondrosarcoma, skin cancer, acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocyte leukemia, adult ⁇ cell leukemia, and malignant
  • cells are synovial cells, osteoclasts, keratinized epithelial cells, blood cells, cancer cells, bone marrow cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, dermal cells, muscle cells, nerve cells, lymphocytes, vascular smoothness Examples include, but are not limited to, myocytes, hepatocytes, pigment cells, fat cells, uterine endothelial cells, alveolar epithelial cells, undifferentiated mesenchymal cells, ectoderm crests.
  • step (ii) Step of associating the detection result of step (i) with a disease
  • any of the following markers (a) to () can be used. A method for measuring these markers will be described later.
  • synovial tissue growth due to RA indicates synovial tissue growth due to RA.
  • protein expression can be detected by using the protein itself or the presence of mRNA carrying the information as an indicator.
  • the SL-1 antibody of the present invention is preferably used. If synoviolin is detected in synovial cells, synovial tissue, etc., or in body fluids, RA is considered to have progressed.
  • the reagent for immunological analysis containing the antibody of the present invention is useful not only for diagnosis of RA but also for determination of therapeutic effect or drug effect.
  • the determination of the therapeutic effect or efficacy of RA is also basically performed in the same way as the diagnosis of RA.
  • the level of synoviolin or its antibody in synovial tissue or blood is related to the expression of the genes encoding these proteins, and their detection is an indicator of symptom progression and disease remission. It is because it has.
  • the SL-1 antibody of the present invention can be used for separation or detection of cells expressing synoviolin.
  • Synoviolin is expressed in the ectoderm crest during development, and is strongly expressed in rheumatoid synovial cells, as well as in undifferentiated mesenchymal cells that are the primordium of synovium, bone, cartilage, and limbs. Yes. Therefore, Synoviolin is particularly preferably used as a marker for ectoderm crest, rheumatic synovial cells and undifferentiated mesenchymal cells.
  • anti-Synoviolin-monoclonal antibody against Synoviolin can be appropriately labeled with fluorescence and reacted with cells, and cells expressing Synoviolin can be separated by cell sorting or the like.
  • Isolated undifferentiated mesenchymal cells are useful for in vitro or in vivo formation of tissues such as muscle, tendon, fat and bone marrow stroma, bone / cartilage, or joint reconstruction It is.
  • the reconstructed tissues and organs are expected to be used for regenerative medicine in addition to basic research.
  • the antibody of the present invention may be used for preparing an antibody column for purifying synoviolin and for detecting the protein present in each fraction during purification.
  • the use of the specific anti-synoviolin monoclonal antibody according to the present invention is not limited to these uses.
  • the measurement method using a monoclonal antibody against synoviolin or a fragment thereof is not particularly limited to a specific method, and an antibody or antigen-antibody corresponding to the amount of antigen in the sample, that is, the amount of synopioline. Any method may be used as long as it is a measurement method in which the amount of the complex is detected by a chemical or physical means and calculated from a calibration curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • Specific examples of methods for detecting the amount of antigen-antibody complex include competitive methods, immunometric methods, nephelometry methods, and sandwich methods. From the standpoint of sensitivity and specificity, The sandwich method is particularly preferred.
  • a specimen containing synoviolin to be quantified
  • the immobilized SL-1 antibody of the present invention primary reaction
  • the standard After reacting the sensitized anti-synoviolin antibody (secondary reaction), the amount of synopioline in the sample can be quantified by measuring the activity of the labeling agent on the immobilized carrier.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at different times.
  • the antibody used for the secondary reaction is preferably an antibody having a synoviolin binding site different from the SL-1 antibody of the present invention.
  • the antigen in the sample and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of the labeled monoclonal antibody, and then the solid phase and the liquid phase. Isolate.
  • react the antigen in the sample with an excess amount of the labeled monoclonal antibody then add the immobilized antigen and bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then separate the solid phase from the liquid phase. To do.
  • the amount of antigen in either phase is measured to quantify the amount of antigen in the sample.
  • the antigen in the sample and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen ( ⁇ ) bound to the antibody are separated ( ⁇ / F separation) Measure the amount of label B, F, and quantify the amount of antigen in the sample.
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • a BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a second antibody against the above antibody is used
  • a solid phase antibody is used as the first antibody
  • a soluble antibody may be used
  • a solid-phase antibody may be used as the second antibody.
  • nephrometry the amount of insoluble precipitate produced as a result of an antigen-antibody reaction in gel or solution is measured. When only a small amount of precipitate is obtained because the amount of antigen in the sample is small, laser nephrometry using laser scattering is preferably used.
  • the antigen-sensitized plate is reacted with the antibodies in the sample, and the antibody to be detected captured on the plate surface is detected with a labeled antibody as a specific antigen.
  • This is the most popular method for immunological analysis of antibodies (Imnmnocliemistry, 8: 871-879, 1971).
  • the SL-1 antibody of the present invention may be used as a labeled antibody for detecting unbound antigen on the rate.
  • a method is also known in which latex particles adsorbed with an antigen are mixed with a sample and antibodies are detected as an immunological agglutination reaction (Plotz CM & Singer JM, Am. J. Med., 21: 888-892, 1956).
  • Immunological particle agglutination is a method that allows rapid analysis with one reagent, and is suitable for large-scale screening.
  • an anti-sinoviolin monoclonal antibody can be combined with another solvent or solute to form a composition.
  • distilled water, pH buffering reagent, salt, protein, surfactant, etc. can be combined.
  • the reaction reagent has a label detectable by a suitable chemical or physical detection means.
  • suitable chemical or physical detection means examples include fluorescent substances, enzymes, radioisotopes, and luminescent substances.
  • an enzyme When an enzyme is used for labeling, it is called an ELISA method and is widely used.
  • fluorescent substances fluorescamine, fluorescein sothiocyanate, etc.
  • enzymes peroxidase, alkaline phosphatase, malate dehydration enzyme, sarcoidase, ⁇ -galactosidase, etc.
  • radioisotopes 125
  • a piotine-avidin system may be used for binding between the SL-1 antibody or antigen of the present invention and a labeling agent.
  • a labeling agent for the immobilization of an antigen or monoclonal antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for immobilizing or immobilizing a protein or an enzyme may be used.
  • synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, or glass are used.
  • a buffer solution useful for stabilizing the reaction product or stabilizing the reaction product a stabilizer for the reaction material, and the like are included.
  • a spectroscope As the detection means, a spectroscope, a radiation detector, a light scattering detector, and the like can be detected.
  • the most convenient and efficient method for this purpose is to make the above reagent into a kit.
  • a kit enables efficient quantification in a normal laboratory or laboratory without the need for special analytical equipment, skilled operation, or advanced knowledge.
  • the composition kit form of the assembly kit for performing the above-described various diagnostic methods or treatment determination methods is not particularly limited, and the content thereof is not limited as long as the predetermined purpose can be achieved.
  • the above specimen is composed of instructions for interpreting the results obtained by executing the assembly method, reaction reagents, reaction medium in which the reaction is performed, and a substrate that provides the assembly field. Is done.
  • a reference sample for use as a comparison standard or for creating a calibration curve, a detector, and the like may be included.
  • the antibody of the present invention is useful as a pharmaceutical composition for treating or preventing a cell proliferative disease.
  • cell proliferative diseases include rheumatoid arthritis, cancer, fibrosis, arteriosclerosis, Castleman's disease, multiple myeloma, Crohn's disease, systemic juvenile idiopathic arthritis, brain tumor, tongue cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, Esophageal cancer, stomach cancer, spleen cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, duodenal cancer, colorectal cancer, liver cancer, uterine cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, linear fibrosarcoma, osteosarcoma, Examples include chondrosarcoma, skin cancer, acute myeloid leukemia, acute lymphocytic leukemia, chronic lymphocyte leukemia, adult T-cell leukemia, and malignant lymphoma.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably provided in the form of a pharmaceutical composition comprising the antibody of the present invention or a fragment thereof as an active ingredient, and further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carrier refers to excipients, diluents, bulking agents, disintegrating agents, stabilizers, preservatives, buffers, emulsifiers, fragrances, coloring agents, sweeteners, viscous Agents, flavoring agents, solubilizing agents or other additives.
  • injections, solutions, force pushers, suspensions, emulsions or syrups A pharmaceutical composition in the form of a powder or the like can be prepared.
  • These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally.
  • Other forms for parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are prescribed by conventional methods.
  • the dose of the drug of the present invention varies depending on the patient's age, sex, weight and symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of high affinity antibody which is an active ingredient contained in the drug. In general, it can be administered within a range of 600 ig to 6000 mg, preferably 6 to 600 mg per adult, but is not limited to this range.
  • the concentration is 1 mg antibody / ml carrier to 100 mg antibody / ml carrier in a pharmaceutically acceptable carrier such as physiological saline or commercially available distilled water for injection. So that it can be dissolved or suspended.
  • the thus-prepared injection is administered to human patients in need of treatment at a ratio of 10 wg to 100 mg per kg body weight in a single administration, preferably 100 g to 10 mg. Can be administered once to several times per day.
  • the administration mode include intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, and the like. Power is preferably intravenous injection.
  • injections may be prepared as non-aqueous diluents (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.), suspensions or emulsions. You can also.
  • non-aqueous diluents eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, etc.
  • Such injection can be sterilized by filter sterilization using a filter, blending of a bactericide and the like.
  • An injection can be produced as a form of preparation at the time of use. That is, it can be used as a sterile solid composition by lyophilization, etc., and dissolved in sterile water for injection or other solvents before use.
  • % means “% by weight”.
  • Example 1 The purpose of this example is to produce an anti-sinoviolin monoclonal antibody.
  • Anti-Synoviolin Monoclonal antibodies were prepared by synthesizing three types of peptides containing the following partial amino acid sequences of human synoviolin as immunization peptides. These amino acid sequences are selected from the region presumed to have antigenicity.
  • Mothamine was bound to each synthetic peptide via Cys in the amino acid sequence.
  • 50 of each synthetic peptide conjugated with KLH was dissolved in 0.1 ml physiological saline, and 0.1 ml of Freund's complete adjuvant (FCA) was added to prepare an immunogen.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • Each immunogen was immunized by injecting 0.2 ml subcutaneously into the back of 8 mice (BALB / c female, 5 weeks old). Immunization was performed 4 times every 2 weeks, and one week later, another immunization was performed. Eight days after the final immunization, blood was collected from the heart, and 200 ⁇ 200 or more of serum was collected. Spleen cells were collected from individuals who were able to confirm an increase in antibody titer by ELISA, and cell fusion was performed.
  • Antibody titers were measured by ELISA for 3 mouse sera for each immunogen. Using either immunogen, individuals with increased antibody titers were identified. All of these immunogens were confirmed to be useful as synoviolin immunogens.
  • the myeloma cell line (P3U1) and mouse spleen cells were mixed at 1:10, and cell fusion was performed in the presence of 50% PEG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. PEG1540). After the fusion, the cells were plated on a 96-well plate so that the number of splenocytes was 5 ⁇ 10 5 cells / ml. After culturing in HAT medium for 10-14 days, cell growth was confirmed and the culture supernatant was assayed.
  • an ELISA plate on which each synthetic peptide was immobilized was used.
  • the operation of the test is as follows. After reacting the culture supernatant to an ELISA plate, positive wells were selected using anti-mouse IgG goat-peroxidase (POX). The cells to be subjected to crawling were selected, and other positive cells were stored frozen. Several days later, one 96-well plate per strain was seeded at 100 cells / plate (20 cells / ml) and cultured for 10-14 days. Colonies were determined and the culture supernatant was assayed. The culture supernatant was assayed by applying the supernatant 501 to the antigen-immobilized ELISA plate for screening.
  • POX anti-mouse IgG goat-peroxidase
  • Anti-mouse IgG goat-POX was used as the second antibody.
  • the selected colonies were recloned after culturing and cultured for 10 to 14 days, and colony determination and culture supernatant assay were performed as described above.
  • Wells were selected for each parent strain, cultured on 24 well plates, supernatants were collected, clones were checked, and antibody subclasses and antibody production were assayed.
  • clonal SL-1 obtained using Syno-P2 as an immunogen was selected as a hybridoma that efficiently produces a monoclonal antibody having an extremely high affinity for Synoviolin.
  • the purpose of this example is to detect synoviolin in patient samples using anti-synoviolin monoclonal antibodies.
  • the synovial cell protein from patients with rheumatoid arthritis was separated by SDS-PAGE, and Western blotting was performed. went.
  • the Western blotting method was performed using the SL-1 antibody of Example 1 as the antibody and anti-mouse IgG Hedge-HRP as the labeled antibody.
  • synovial cells from osteoarthritis patients were also analyzed.
  • a specific signal was detected in synovial cells derived from RA patients (Fig. 1 “RA” in lanes 1 and 2, bands near 85 kDa). It was confirmed that the SL-1 antibody obtained in Example 1 recognizes synopioline more specifically.
  • SL-1 antibody immunostaining of synovial tissue sections collected from RA patients was performed.
  • the immunostaining procedure described in Example 9 of WO02 / 052007 pamphlet was performed except that the SL-1 antibody of Example 1 was used as the antibody and anti-mouse IgG Hedge-HRP was used as the labeled antibody. It is as follows. Synopioline was strongly expressed in synovial tissue from RA patients (Fig. 3 SL-1 antibody panel). Simultaneously with HE staining, synovial cell proliferation was observed, confirming that the portion was stained with monoclonal antibodies. From these results, it was confirmed that the SL-1 antibody of the present invention specifically recognizes synoviolin in the synovial tissue of RA patients (Fig. 3, HE-stained panel).
  • the detection and diagnosis of RA can be carried out by detecting synoviolin in a patient sample using an anti-synoviolin antibody.
  • the purpose of this example is to develop an ELISA test agent for detecting synoviolin.
  • polyclonal antibodies were prepared by immunization of rabbits with Synoviolin based on a conventional method.
  • This polyclonal antibody was purified by gel filtration chromatography using Sephacryl S-300HR (Pharmacia), labeled with horseradish peroxidase (HRP) by the periodate oxidation method and pre-equilibrated with PBS.
  • HRP horseradish peroxidase
  • This secondary labeled antibody was a composition of a buffer reagent containing salt, stabilizer, preservative and the like.
  • the 96-well microplate having the solid phase SL-1 antibody thus obtained is dispensed with appropriately diluted patient blood, urine and other body fluids or tissues according to normal EIA. It was allowed to act for 1 hour at room temperature. At this time, only the diluent was added to control the tool. After washing with a phosphate buffer containing 0.05% Tween20, an HRP-labeled anti-mouse IgG rabbit antibody was added and allowed to react at room temperature for 30 minutes. After washing unreacted secondary labeled antibody with phosphate buffer containing 0.05% Tween20, 0.1M citrate buffer containing 0.015% hydrogen peroxide as substrate buffer, and 0-Furinary diamide as stain.
  • Nukenate buffer (10 mg / ml) was added to each tool and allowed to react at room temperature for 30 minutes, and then 2 M sulfuric acid was added to stop the color reaction. Next, coloration was determined by measuring the absorbance at 492 nm with a microplate reader to determine the amount of synoviolin in the sample.
  • synoviolin is an E3 ubiquitin-protein ligase with a RING finger motif, and the RING finger motif is thought to be the binding site for E2 ruppi: chitin conjugating enzymes.
  • E3 ubiquitin-protein ligase is known to self-ubiquitinate and has been experimentally confirmed for synoviolin auto-ubiquitination.
  • SL-1 is a mouse monoclonal antibody that uses a peptide corresponding to amino acids 328 to 342 in the RING finger region of Synoviolin protein as an antigen. (Example 1). Using His-tagged protein MBP-dTM Syno-His, antigen-antibody reaction was performed at 4 ° C for 1.5 hours by mixing with a constant concentration of SL-1 antibody, anti-FLAG antibody or mouse IgG.
  • synoviolin autobiubilation was examined using an in vitro ubiquitination reaction system.
  • E1 derived from yeast
  • E2 UbcH5c
  • ATP ATP
  • GST-HA-ubiquitin GST-HA-ubiquitin
  • MBP-dTM Syno-His previously reacted with the antibody were mixed and reacted at 37 ° C for 120 minutes.
  • 4 x SDS-PAGE buffer solution was added to each sample after reaction, boiled for 5 minutes, and then developed on 10% SDS-PAGE. Then, Western blotting analysis was used to detect synoviolin ubiquitinated bands using SL-1 antibody.
  • the purpose of this example is to examine whether SL-1 antibody also affects synovioline ubiquitination.
  • Ubiquitin is covalently bound to the target protein (substrate) by the ubiquitin system consisting of activating enzyme (E1), binding enzyme (E2), and ligase (E3), and the polyubiquitin chain formed by repeating this reaction is It acts as a force of degradation by the proteasome.
  • P4HA1 a subunit of prolyl hydroxylase, an enzyme that catalyzes the hydroxylation of proline residues of collagen, which is essential for collagen production, has been found to be a substrate for synoviolin. Since SL-1 antibody has been found to inhibit synoviolin's self-ubiquitination activity, We investigated whether this antibody also affects the ubiquitination of P4HA1 by synoviolin.
  • MBP-dTM Syno-His was mixed with a constant concentration of SL_1 antibody, anti-FLAG antibody or mouse IgG, and antigen-antibody reaction was performed at 4 ° C for 1.5 hours. Then, in vitro ubiquitination reaction system, 1 ix GST-fused P4HA1 protein GST-P4HA1 was transformed into E1 (yeast derived), E2 (UbcH5c), ATP, GST-HA-ubiquitin and each MBP- The mixture was mixed with dTM Syno-His and reacted at 37 ° C for 120 minutes. 4 x SDS-PAGE buffer was added to each sample after reaction, boiled for 5 minutes, and then developed on 10% SDS-PAGE. The ubiquitinated band of P4HA1 was detected with an anti-GST antibody by Western plotting analysis.
  • the discovery of autoantibodies that recognize Synoviolin in the blood of RA patients provides a completely new approach to the diagnosis of RA. Therefore, the pharmaceutical composition containing the antibody of the present invention can present an unprecedented new approach in the development of RA treatment methods and the like.
  • a cell producing the above antibody, and the above monoclonal antibody A synopioline-containing cell detection kit utilizing the above is also provided.
  • Synoviolin genes involved in synovial development and bone / cartilage limb development are involved in the pathogenesis of RA, and antibodies to this gene product are produced in RA patients.
  • the SL-1 antibody of the present invention can be used for specific detection and quantification of synoviolin, which is a useful marker for diagnosis of RA, and its antibody frequently found in patient sera. It contributes to diagnosis and judgment of therapeutic effect.
  • the SL-1 antibody of the present invention can recover undifferentiated mesenchymal cells from embryonic cells using synoviolin as a cell marker. Can contribute to various applications.

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Abstract

本発明は、シノビオリンの一部を認識しうるモノクローナル抗体を提供するための、シノビオリンの自己ユビキチン化を阻害することができる、シノビオリンに対する抗体又はその断片に関するものである。

Description

抗シノビオリン抗体 技術分野
本発明は、 抗シノビオリン抗体に関する。 より詳しくは、 シノビオリンの自己 ュビキチン化を阻害することができる抗体、 上記抗体を含有する医薬組成物、 上 記抗体を用いて、 シノビオリンが発現している細胞を検出する方法に関する。
明 背景技術
田
関節リゥマチ （rheumatoid arthritis, 以下、 RA と省略する） は、 関節の滑膜 組織に異常な増殖が見られる全身性の炎症性疾患である。 滑膜細胞 （synovial cell) は、 関節の滑膜で 1〜6層の上皮様層を形成する繊維芽細胞様の細胞であり、 滑液にプロテオグリカンやヒアルロン酸を供給するものとされている。 RA 患者の 関節では、 滑膜組織の増殖、 その結果として引き起こされる多層構造、 滑膜細胞 の他の組織への浸潤といったような症状が観察される。 また、 RA 患者の血清中 には自己の免疫グロブリン （IgG) の Fc領域に対する自己抗体が存在する。 RA 因子ともよばれるこの自己抗体は、 RA の特徴的な診断指標として古くから利用 されてきた。
しかしながら、 自己免疫疾患のひとつとして考えられている RAの病因は、 未 解明のままである。 RA因子の検出に基づく RAの診断には、 疾患に対する特異 性および抗体が生じるシステムの解明もなされておらず、 このため病因との関連 がはっきりしていない。
RA の病態を、 （a)生体内における多彩な免疫反応、 及び (b)骨破壊を伴った関 節滑膜の増殖という 2つの側面からとらえた場合、 前者の免疫反応に関しては多 くの研究がなされ、 その分子レベルの実体が明らかにされつつある。 しかし、 後 者の関節滑膜細胞の研究に関しては、 それが RAの主座であるにも拘らず、 その 細胞生物学的な特徴すら明らかにされていない。
そこで RAの病態解明のために、 本発明者らは、 慢性，難治性疾患の発症や進 展の背後にある分子機序を調べた。 まず RA患者の培養ヒ ト滑膜細胞を免疫原と して抗ヒ ト滑膜細胞抗体を得て、 滑膜細胞の cDNA ライブラリーをィムノスク リーユングしたところ、 RA 患者の滑膜組織で発現している新規な遺伝子を見出 した。 この遺伝子の単離にも成功し、 それがコードするタンパク質を、 発現して いる組織である滑膜細胞 （ synovial cell ) にちなみ、 シノ ビオ リ ン ( synoviolin ) と名づけ、 その生理的意義を明らかにした （国際公開第 WO02/052007 号パンフレツ ト） 。 発明者らが発見したシノビオリンは、 RA疾 患の主因である滑膜組織の異常増殖に密接に関連しており、 診断においてきわめ て重要な情報を与えることが期待される。 また、 シノビオリンは、 タンパク質構 造予測システムから、 RINGフィンガーモチーフを有する E3ュビキチンライゲ ースをコードすることが分かっている。 このモチーフは、 タンパク質のュビキチ ン化に重要な役割を果たすが、 実際、 自己ュビキチン化活性を有することが証明 されており、 これによりタンパク質機能の制御も行なっていると推測される。 本発明者らは、 シノビオリンによるシグナル伝達に関する研究を進めたところ、 シノビォリンが自己ュビキチン化 （self-ubiquitination) を起こすュビキチンリ ガーゼ作用を有することを初めて見出した。 発明の開示
上記のように、 これまで、 シノビォリンの自己ュビキチン化反応を阻害するこ とができる抗体、'上記抗体を含有する医薬組成物等の開発が望まれていた。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、 シノビオリン が自己ュビキチン化（self-ubiquitination)を起こすュビキチンリガーゼ作用を有 することに基づき、 シノビオリンの自己ュビキチン化を阻害する抗シノビオリン 抗体を見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
( 1 ) シノビオリンの自己ュビキチン化を阻害することができる、 シノビオリン に対する抗体又はその断片。 この抗体又はその断片はシノピオリンの基質タンパ ク質のュビキチン化には影響しない場合もあり うる。 また、 この抗体はモノクロ ーナル抗体であってもよい。 (2) 配列番号 3〜5 に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを 抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によつ て得られるハイブリ ド一マにより産生される、 シノビオリンに対するモノクロー ナル抗体又はその断片であって、 シノビオリンの自己ュビキチン化を阻害するこ とができる前記抗体又はその断片。
(3) 配列番号 3〜5 に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを抗 原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合によって 得られるハイプリ ドーマであって、 シノビォリンの自己ュビキチン化を阻害する ことができるモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ。
(4) シノビォリンの自己ュビキチン化を阻害することができる、 シノビオリン に対するモノクローナル抗体の製造方法であって、 配列番号 3〜5 に示されるい ずれかのアミノ酸配列からなるぺプチドを抗原として免疫された動物の抗体産生 細胞とミエローマ細胞との融合細胞を培養し、 得られる培養物から前記モノク口 ーナル抗体を採取することを特徴とする方法。
(5) (1) 又は （2) に記載の抗体又はその断片を含有する医薬組成物。 この 医薬組成物は、 例えば細胞増殖性疾患である、 関節リウマチ、 癌、 線維症、 動脈 硬化、 キャッスルマン病、 多発骨髄腫、 クローン病、 全身型若年特発性関節炎、 脳腫瘍、 舌癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳癌、 食道癌、 胃癌、 膝臓癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 肝癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋筋 肉腫、 線維肉腫、 骨肉種、 軟骨肉腫、 皮膚癌、 急性骨髄性白血病、 急性リンパ性 白血病、 慢性リンパ球白血病、 成人型 T細胞白血 、 悪性リンパ腫の治療又は予 防のために使用することができる。
(6) (1) 又は （2) に記載の抗体又はその断片を含有する、 シノビォリンの 自己ュビチキン化阻害剤。
(7) (1) 又は （2) 記載の抗体又はその断片を含有する、 シノビオリン含有 細胞検出用試薬。
(8) (1) 又は （2) 記載の抗体又はその断片を含有する、 シノビォリンによ る細胞増殖性疾患の検出用試薬。 細胞増殖性疾患としては、 例えば、 関節リウマ チ、 癌、 線維症、 動脈硬化、 キャッスルマン病、 多発骨髄腫、 クローン病、 全身 型若年特発性関節炎、 脳腫瘍、 舌癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳癌、 食道癌、 胃癌、 膝臓 癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 肝癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋筋肉腫、 線維肉腫、 骨肉種、 軟骨肉腫、 皮膚癌、 急性骨髄性 白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ球白血病、 成人型 τ細胞白血病、 悪性 リンパ腫などが挙げられる。
また、 上記細胞は、 滑膜細胞、 破骨細胞、 角化上皮細胞、 血液細胞、 癌細胞、 骨髄細胞、 線維芽細胞、 血管内皮細胞、 真皮細胞、 筋細胞、 神経細胞、 リンパ球、 血管平滑筋細胞、 肝細胞、 色素細胞、 脂肪細胞、 子宮内皮細胞、 肺胞上皮細胞、 未分化間葉系細胞、 外胚葉頂堤からなる群から選択されてもよい。
( 9 ) ( 1 ) 又は （2 ) に記載の抗体又はその断片と、 シノビォリンとを反応さ せることを特徴とする、 シノビオリンの自己ュビキチン化を阻害する方法。
( 1 0 ) ( 1 ) 又は （2 ) に記載の抗体又はその断片と、 生体試料とを反応させ ることを特徴とする、 シノピオリンの発現細胞を検出する方法。
( 1 1 ) ( 1 ) 又は （2 ) に記載の抗体又はその断片と、 被験者から採取された 生体試料とを反応させることを特徴とする、 シノビオリンによる細胞増殖性疾患 の検出方法。 細胞増殖性疾患及び細胞の種類は、 前記と同様である。
また、 上記細胞は、 滑膜細胞、 破骨細胞、 角化上皮細胞、 血液細胞、 癌細胞、 骨髄細胞、 線維芽細胞、 血管内皮細胞、 真皮細胞、 筋細胞、 神経細胞、 リンパ球、 血管平滑筋細胞、 肝細胞、 色素細胞、 脂肪細胞、 子宮内皮細胞、 肺胞上皮細胞、 未分化間葉系細胞、 外胚葉頂堤からなる群から選択されるいずれかの細胞であつ てもよい。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、 参照として本明細 書に糸且み入れられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 SL-1抗体による、 関節リゥマチ患者 （RA： 2検体） および変形性関 節症患者 （OA : 2 検体） 患者由来滑膜細胞のウェスタンブロッテイングの結果 の写真を表す図である。
図 2は、 SL-1抗体による RA患者由来滑膜細胞の蛍光免疫染色結果の写真を 表す図である。
図 3は、 SL-1 抗体による RA患者由来滑膜組織の免疫染色結果及びへマトキ シリン 'ェォシン （HE) 染色像を示す図である。
図 4は、 MBP-dTM Syno-His融合タンパク質の自己ュビキチン化が SL-1抗体 により阻害されたことを示すウェスタンプロッティング解析の写真である。
図 5は、 GST-P4HA1 融合タンパク質のシノビオリンによるュビキチン化が SL-1 抗体では影響されなかったことを示すゥヱスタンプ口ッティング解析の写 真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . 概要
本発明の抗体は、 シノビォリンの自己ュビキチン化を阻害することができる、 シノビオリンに対する抗体であり、 シノビォリンの RING フィンガー領域の一 部のアミノ酸配列からなるぺプチドを抗原として免疫することにより得られたも のである。
ュビキチン化とは、 ュビキチン活性化酵素 （E1) 、 ュビキチン結合酵素 (E2) およびュビキチンリガーゼ （E3) などの酵素が協同して、 基質となるタ ンパク質にュビキチンを次々と結合させていく過程である。 このュビキチン化の 生理的意義は、 プロテオソーム系のタンパク質分解機構へ送られるためのタグ修 飾として、 従来認識されていた。 そして、 その後の研究により、 現時点でのュビ キチン化の意義は、 タンパク質機能を制御する可逆的タンパク質修飾システムと して位置づけられている。
本明細書において 「 自 己ュ ビキチ ン化（self-ubiquitination, auto ubiquitination)」 とは、 シノビォリンがュビキチンリガーゼ活性を有すること により、 シノビオリン自体がュビキチン化の基質タンパク質となり、 他のュビキ チンリガーゼによることなく 自らュビキチンを結合させるものである。 シノピオ リンの自己ュビキチン化は、 本発明者によりシノビオリンがュビキチンリガーゼ 活性を有することが見出されて明らかとなった。 すなわち、 マウスにおいてシノ ビオリンを過剰発現することにより滑膜細胞の増殖を伴う関節症が自然発症する
(国際公開第 WO02/052007号パンフレツ ト） （Amano T, et al.， Genes Dev. 17(19)：2436-49, 2003) 。 その一方、 E3ュビキチンリガーゼの RING フィンガ 一モチーフは酵素の活性中心であり、 同モチーフ中の 1 アミノ酸が置換された だけでもまったく酵素活性が失活してしまう。 実際に、 シノビォリンの酵素活性 中心の 1 アミノ酸変異体 （C307S) を発現させたマウスではまったく関節炎を 呈さない （上掲、 Amano. Tら） 。 このことはシノビォリンの機能発現には自己 ュビキチン化が重要であり、 シノビオリンの自己ュビキチン化こそがシノビオリ ンの代表的機能となりうることを示す。 しかも、 その自己ュビキチン化は、 内在 性のシノビオリンの完全長の分子で観察されるだけでなく、 シノビオリンの細胞 内部分のみとタグタンパク質の融合したシノビオリンにおいても生起することが 明らかにされている。 本発明者は以上の知見に基づいて鋭意研究を行い、 本発明 の抗体を完成させた。
本発明において 「抗体」 とは、 抗原であるシノビオリン又はその部分断片に結 合し得る抗体分子全体 （ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であ つてもよい） を意味するが、 さらに、 その断片、 すなわち抗原抗体反応活性を有 する活性フラグメント、 具体的には、 Fab、 F(ab')2、 Fv、 組換え Fv体、 1本鎖 Fvも含まれる。 2 . シノビオリン
( 1 ) シノビォリンおよびその等価なタンパク質
シノビォリンに対する抗体を得るため、 免疫原として、 シノビオリンそのもの の他に、 それと同等の又は等価なタンパク質、 それらのフラグメント又は部分べ プチドなどを用いることができる。 そのいずれも抗シノビオリン抗体の抗原とな り得る。 その理由は、 抗体は、 一般に抗原がそのタンパク質構造全体の包括的な 認識により誘導されるというよりは、 むしろェピトープ部位として知られるタン パク質表面の小さい領域の認識により誘導されるものだからである。 このような ェピトープ部位は、 ポリぺプチド鎖の連続した部分又は不連続部分によつて形成 される。 したがって、 シノビオリンに対する 1 種類の抗体について、 ェピトー プとして作用する部位は、 シノビオリンの限定されたあるべプチド部位に対応し ている。
本発明において使用するシノビォリンの種は、 ヒ ト、 マウス、 ラットなどの由 来のものであってもよく、 特に限定されるものではない。 シノビオリンとしては、 例えば、 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用するこ とができる。
さらにシノビオリンと同等又は等価であるタンパク質もまた、 抗原として用い ることができる （後述） 。
( 2 ) 生体材料からの調製
シノビォリンは、 RA患者の滑膜組織から得ることができる。 滑膜細胞はィン ビトロで培養することができるため、 この培養物からシノビオリンを回収するこ とが可能である。 具体的には、 RA 患者から滑膜切除術 （synovectomy) により 外科的に切除された滑膜組織等をもとに、 この組織から滑膜細胞を分離する。 分 離した細胞を培養すれば、 滑膜細胞を付着性細胞として回収することができる (Nakajima T et. al.， J. Clin. Invest. 92:186-193, 1993) 。 回収した細胞から は、 公知のタンパク質精製技術を組み合わせてシノビオリンを抽出 ·精製する。 得られたシノビオリン又はそのフラグメントは、 抗体を得るための免疫原として 用いることができる。
( 3 ) 遺伝子工学的手法による調製
シノビオリンは、 生体材料のみならず、 シノビオリンをコ一ドする遺伝子を適 当な発現系に組み込んで遺伝子組み換え体の発現産物として入手することもでき る。
シノビオリンをコードするポリヌクレオチドは、 その由来を問わない。 すなわ ち、 ゲノム DNA、 cDNA のほか、 合成によって得ることもできる。 また、 核酸 は DNAであっても： NAであってもよレ、。 さらにシノビオリンをコードしうる 限り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチド、 ある いは修飾されたヌクレオチドを含有するものも含まれる。
シノビオリンをコ一ドするポリヌクレオチドを単離するには、 前記 RA患者の 滑膜細胞から抽出した mRNAをもとに cDNAライブラリーを得て、 クローニン グすればよい。 すなわち、 cDNA ライブラリーを PCRなどで増幅して、 ハイブ リダイズするクローンをスクリーユングすることにより、 所望するポリヌクレオ チドを得ることができる （Short J.M, et. al.， Nucleic Acid Res. 16:7583-7600, 1988) 。 配列番号 2 で表されるポリペプチドをコードする DNA の塩基配列を 配列番号 1 に示す。 シノビオリンをコードするポリヌクレオチドを適当な発現 系に組み込むための好適なホスト ベクター系として、 発現ベクター pGEXと大 腸菌を例示することができる。
この他にも、 細菌をホストに利用する場合には、 ヒスチジンタグ、 HA タグ、 FLAG タグ等を利用した融合タンパクの発現用ベクターが市販されている。 ホ スト/ベクタ一系として、 Pichia 属酵母を利用する発現系、 あるいは昆虫細胞 をホストとするバキュロウィルスベクターを利用した発現系は、 糖鎖を備えたタ ンパク質の発現に有効である。 さらに、 哺乳動物の細胞を利用して、 サイ トメガ ロウィルス （CMV) プロモーター、 ラウス肉月重ウィルス （RSV) プロモーター、 あるいは SV40等のプロモーターを利用したベクターのトランスフエクションが 行われている。
また、 本発明においては、 上記シノビオリン遺伝子又は上記ベクターからシノビ オリンを採取することも可能である。 すなわち、 本発明においては、 生細胞を全く 使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、 シノビオリンを産生するこ とが可能である。
無細胞タンパク質合成系とは、 細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタ ンパク質を合成する系である。 なお、 本発明において使用される無細胞タンパク質 合成系には、 DNAを铸型として RNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
この場合、 上記の宿主に対応する生物は、 下記の細胞抽出液の由来する生物に相 当する。 ここで、 上記細胞抽出液は、 真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、 例 えば、 小麦胚芽、 ゥサギ網状赤血球、 マウス L-細胞、 HeLa細胞、 CHO細胞、 出芽 酵母、 大腸菌などの抽出液を使用することができる。 なお、 これらの細胞抽出液は 濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。
細胞抽出液は、 例えば限外濾過、 透析、 ポリエチレングリコール (PEG)沈殿等に よって得ることができる。 さらに本発明において、 無細胞タンパク質合成は、 市販 のキットを用いて行うこともできる。 そのようなキットとしては、 例えば試薬キッ ト PROTEIOSTM (東洋紡） 、 TNTTM System (プロメガ） 、 合成装置の PG- MateTM (東洋紡） 、 RTS (ロシュ ·ダイァグノステイクス) などが挙げられる。 上記のように細胞タンパク質合成によって得られるシノビオリンは、 前述のよう に適宜クロマトグラフィーを選択して、 精製することができる。
( 4 ) シノピオリンと 「機能的に同等なタンパク質」
抗シノビオリン · モノクローナル抗体を調製する際の抗原となり得るタンパク 質には、 滑膜細胞から抽出されるヒ ト ' シノビオリンのみならず、 シノビオリン と機能的に同等な種々のタンパク質も含まれる。 このようなタンパク質は、 人工 的であると自然に生じたものであるとを問わず、 ヒ ト 'シノビオリンのアミノ酸 配列において 1個又は数個のアミノ酸が置換、 欠失、 付加および/または揷入な どにより変異したタンパク質、 あるいはアミノ酸側鎖などが修飾されている修飾 タンパク質、 他のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。
これらタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、 あるいは変異又は修 飾の部位は、 シノビォリンの機能が保持される限り制限はない。 例えば、 配列番 号 2 で表されるアミノ酸配列において 1個若しくは複数個 （例えば 1個又は数 個） のアミノ酸が置換、 欠失、 付加および/または挿入などにより変異したタン パク質、 又はアミノ酸側鎖などが修飾されている修飾タンパク質を使用すること ができる。
具体的には、
(i) 配列番号 2に示すァミノ酸配列のうち 1個又は複数個 （好ましくは 1個又は数 個 （例えば 1個〜 10個、 さらに好ましくは 1個〜 5個） ) のアミノ酸が欠失したァ ミノ酸配列、
(ii) 配列番号 2に示すァミノ酸配列のうち 1個又は複数個 （好ましくは 1 個又は 数個 （例えば 1個〜 10個、 さらに好ましくは 1個〜 5個） ） のアミノ酸が他のアミ ノ酸で置換したァミノ酸配列、
(iii) 配列番号 2に示すァミノ酸配列のうち 1個又は複数個 （好ましくは 1個又は 数個 （例えば 1個〜 10個、 さらに好ましくは 1個〜 5個） ） の他のァミノ酸が付カロ されたアミノ酸配列、 又は
(iv) 上記 (i)〜(iii)を組み合わせたァミノ酸配列からなり、 かつ上記シノビオリン と同様の作用を有する変異型のシノビオリンポリぺプチドを使用することもできる。 また、 本発明で用いられるポリペプチドは、 シノビォリンと同等の機能を有す る限り、 上記のシノビォリンのァミノ酸配列とホモ口ジーを有するポリぺプチド でもよい。 上記シノビオリンポリペプチドのアミノ酸配列と約 85%以上、 好ま しくは約 90%以上、 より好ましくは約 95%以上の相同性を有するァミノ酸配列など があげられる。
このような配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 1若しくは複数個のアミ ノ酸が欠失、 揷入または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、 「Molecular Cloning, A Laooratory Manual 2nd ed.J (Cold Spring Harbor Press 1989)、 「Current Protocols in Molecular Biology」 (John Wiley & Sons 1987- 1997)、 Kunkel T.A, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, 1985、 等に記載の部位 特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
また、 ポリヌクレオチドに変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped duplex 法等の公知手法により、 部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、 例えば QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit (ス トラタジーン社製） 、 GeneTailor™ Site -Directed Mutagenesis System (インビトロジェン社製） 、 TaKai a Site-Directed Mutagenesis System ( Mutan-K、 Mutan-Super Express Km等： タカラバイオ社製） 等を用いて行うことができる。
上記 「機能的に同等なタンパク質」 として、 第 1にシノビォリンと免疫学的に 同等なタンパク質を示すことができる。 すなわちシノビオリンと機能的に同等な タンパク質として、 シノビォリンを特異的に認識し、 RA 患者の血清中に存在す る抗体と反応するものであれば、 シノビオリンのドメインを含むものである。 第 2に、 シノビォリンと機能的に同等なタンパク質は、 シノビォリンに結合す るリガンドタンパク質との結合特性に基づいても定義される。 例えば、 HMG- CoA Reductase Degradation 3 (Hrd3) 、 プロコラーゲン-プロリン、 2-ォキソ グゾレタノレ酸 4-ジォキシゲナーゼ （プロ リ ン 4 ヒ ドラキシラーゼ (hydraxylase) リ 、 a 3、リへプテド I (P4HA1 ) 、 omocysteine -indusible endoplasmic reticulum stress -in dusible ubiquitin-like domain member 1 ( Herp ) などである （特願 2003-295951、 特願 2004-076931 , 特願 2003- 350704) 。
第 3に、 ヒ ト ·シノビォリンと機能的に同等なタンパク質として、 滑膜増生を 促進する活性を有するタンパク質が挙げられる。 ヒ ト ·シノビオリン遺伝子が導 入されたトランスジヱニックマウスでは、 有意な頻度で関節炎を伴う指の膨脹が 観察され、 組織学的には、 これらの指関節で滑膜増生を伴う骨破壊と異常な骨新 生が認められた。
第 4に、 ヒ ト ·シノビオリンと機能的に同等なタンパク質として、 正常な骨形 成または四肢の発達に貢献する活性を有するタンパク質が挙げられる。 シノビォ リンは発生において頭頂骨、 四肢、 耳などの骨および軟骨が形成される部位に強 く発現しており、 四肢形成期においては Apical Ectodermal Ridge (AER；外 胚葉頂堤） および軟骨 ·骨原基に強い発現が観察されている。
第 5に、 本発明によるシノビォリンと機能的に同等なタンパク質は、 シノビォ リンが有する生化学的な活性、 たとえばュビキチンリガーゼ活性に基づいて定義 することもできる。 これらの生化学的な活性は、 シノビォリンに見出された各種 のモチーフ、 実験結果などに裏付けられている。
( 5 ) シノビオリンとの融合タンパク質または修飾タンパク質
シノビォリンと機能的に同等なタンパク質には、 アミノ酸残基の修飾、 保存的 置換、 欠失、 付加または挿入、 糖鎖等の生理的または人為的な修飾、 蛍光や放射 性物質のような標識、 あるいは他のタンパク質との融合といった各種の修飾を加 えたタンパク質も含まれる。 たとえば上述の遺伝子組み換え体においては、 発現 させる宿主によって糖鎖による修飾に差異が生じる可能性がある。 しかし、 たと え糖鎖の修飾に違いを持っていても、 シノビオリンと同様の性状を示すものであ れば、 いずれもシノビオリンまたはそれと機能的に同等なタンパク質である。 他のタンパク質との融合タンパク質の例として、 FLAGタグ、 HAタグ、 ある いはヒスチジンタグなどの付加的なアミノ酸配列が付加され、 前記シノビオリン に機能的に同等なタンパク質として少なくとも一つの性状を維持したタンパク質 がある。 あるいはシノビォリンとは異なる活性を有していても、 シノビォリンが 有する少なく とも一つの機能を維持している融合タンパク質も挙げられる。 シノビオリンは、 その細胞内ドメインだけであっても、 自己ュビキチン化される ことから、 本発明に用いるシノビオリンは、 細胞膜貫通部位を除いたシノビオリン dTM であってもよい。 例えば、 当該 dTM に上記のタグタンパク質を融合させた MBP-シノビォリン dTM-Hisも本発明において用いることができる。
あるいはシノビオリンとは異なる活性を有していても、 シノビオリンが有する 少なく とも一つの機能を維持している融合タンパク質も挙げられる。
3 . 抗原の調製
抗シノビオリン抗体を作製するための抗原として、 上述したようにシノビオリ ン又はそれと同等なタンパク質を用いることができる。 しかしながら、 抗体の検 出においては、 抗原分子そのもの （すなわち、 シノビオリン又はそれと等価なタ ンパク質） のみならず、 それらのタンパク質のフラグメント、 断片ペプチド、 化 学的に合成したオリゴぺプチドを適切な担体とともに含む複合体を抗原として用 いる方法が採用されることも多い。 その理由は、 とくに優勢なェピトープ、 ある いは臨床的になんらかの意味を持つェピトープに特異的である分析系としたほう が非特異的な反応の影響を受けにく くなるためである。 すなわち、 後述するハイ プリ ドーマのクローニングおよびクローン選別が効率的に実施でき、 しかも抗体 価の高い抗シノビオリン ·モノクローナル抗体を得ることができるためである。 ェピトープ部位として抗原タンパク質の高次構造における多数の領域を認識させ るよりは、 それより低次でも特定のしかも少数の特定構造を認識させるようにす るのが好ましい。
シノビオリンに対し特異性おょぴ親和性が高いモノクローナル抗体を得る場合 においても、 このようなアプローチは有効である。 具体的には、 後述する免疫学 的に活性なドメインぺプチドを得る方法に基づいて、 ェピトープとして機能する ドメインを決定することができる。
ェピトープは少なく とも 3 アミノ酸残基で構成できる場合のあることが知ら れている。 また他のタンパク質との免疫学的な識別は、 少なく とも 8 アミノ酸 残基で可能となるといわれている。 したがって、 シノビオリン又はそれと等価な タンパク質のアミノ酸配列から選択された少なく とも連続した 8 アミノ酸残基、 通常 9ァミノ酸残基、 好ましくは 10ァミノ酸残基、 より好ましくは 11〜： 15ァ ミノ酸残基からなり、 とくに患者血清中の抗体と反応する断片は、 本発明におけ る抗体検出用の抗原として望ましい。
さらに、 ェピトープを構成するオリゴペプチドに対して、 様々な修飾を加えて 免疫学的な反応性を向上させる方法も当業者には公知である。 たとえば、 ヒ ト血 清アルブミンのような不活性タンパク質、 あるいは無意味なアミノ酸配列の付加 といった修飾が免疫学的な反応性の向上に寄与する。
シノ ビオリンの断片は、 トリプシン、 キモ トリプシン、 ペプシンなどのプロテ ァーゼを使った酵素消化又はプロモシアンなどを用いる化学的切断、 あるいはそ れらを組み合わせることにより得ることができる。 生成したぺプチド混合物から、 目的のペプチドを分離精製するには、 クロマトグラフィー、 電気泳動法などの公 知の分離技術を利用すればよい。
別の方法として、 シノビオリンをコ一ドする DNAをランダムに切断し、 それ をファージベクターに挿入してドメインぺプチドを提示したファージライブラリ 一を作成することによつても得ることができる。 これらのライブラリーを、 シノ ビオリンを認識する抗体でィムノスクリ一ユングすれば、 免疫学的に活性なドメ ィンを決定することができる。
上述の戦略的観点から、 シノビオリンの親水性プロファイルとその他の抗原性 指標を検索する解析法によって、 まずアミノ酸残基数 14個以上の好適と想定さ れるペプチド部分が決定される。 免疫原候補としてのこれらのペプチドは、 公知 技術である液相法または固相法によるペプチド合成技術により合成することがで きる。 Merrifield法に代表される固相合成法が、 簡便で短時間に行うことができ る。
α -ァミノ保護基として、 標準的には第三プチルォキシカルボニル （Boc) が用 いられるが、 Sheppard らが開発した 9-フルォレニルメ トキシカルボニル (Fmoc) 基 (Atherton, E & Sheppard, R.C, J.Chem. Soc. Chem. Comm.165, 1985) も利用可能である （泉屋信夫、 他著 「ペプチド合成の基礎と実験」 194〜 233ページ、 丸善、 1985年を参照） 。 本発明においては、 固相合成法に基づく自動化ペプチド合成機を利用してもよ い。 合成されたペプチドは、 トリフルォロ酢酸などの存在下で樹脂から切り離し、 次いで逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製する。 精製ペプチドは 85% 以上の純度を有することが望ましい。
上記候捕ペプチドのうち、 免疫感作動物から採取されるポリクローナル抗体と シノビオリンとを反応させ、 酵素標識抗 IgG 抗体による検出反応で陽性を示す ペプチドを、 本発明の抗体作出用の免疫抗原とする。
免疫原として、 とくに有用なシノビォリンの断片として、 以下のアミノ酸配列 を含む少なくとも 1つのペプチドが挙げられる。
Syno-P3 (SLALTGAWAHAYYCZ配歹 IJ番号： 3 ) 、
Syno-P2 (TCRMDVLRASLPAQSZ配列番号： 4 ) 、 および
Syno-Pl (GAATTTAAGTSATAC/配列番号： 5 )
これらのぺプチドを担体タンパク質と結合させて調製された免疫原は、 シノビ ォリンに対して特異的で、 かつ十分な結合親和性を有する抗体を与える。 免疫原 として有用なシノビォリンの上記ペプチドをスカシガイへモシァニン （KLH) を担体タンパク質として結合させてから、 動物に感作させる。
免疫原を得るために使用できるその他の担体物質として、 ッベルクリン精製タ ンパク質誘導体、 破傷風変性毒素、 コレラ毒素およびその B サブユニット、 ジ フテリア毒素、 オボアルブミン、 ゥシ血清アルブミン、 大豆トリプシンインヒビ ター、 ムラミルジペプチド、 ブラウンのリポタンパク質などが挙げられる。 ぺプ チドを担体タンパク質に結合させるための反応、 試薬などは公知の文献に記載さ れている （例えば、 大海忍、 他著 細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ 新 版 抗ペプチド抗体実験プロトコール 「遺伝子産物の同定からタンパク質機能解 析まで」 秀潤社 1994年； Coligan J.E et al.， CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Vol. 1, p.9.4.1-9.4.11, 1991) 。
4 . 免疫
( 1 ) シノビォリンに対するポリクローナル抗体の作製
上記の通り作製した抗原を哺乳動物に投与する。 哺乳動物は特に限定されるも のではなく、 例えばラット、 マウス、 ゥサギなどが挙げられるが、 ゥサギが好ま しい。
抗原の動物 1 匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは、 ゥサギで 1〜： lO mgであり、 アジュパントを用いるときは 0.1〜1 mgである。 アジュバン トとしては、 フロイント完全アジュパント （FCA) 、 フロイント不完全アジュ パント （FIA) 、 水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。 免疫は、 主 として静脈内、 皮下、 腹腔内等に注入することにより行う。 また、 免疫の間隔は 特に限定されず、 数日〜数週間間隔、 好ましくは 2〜5週間間隔で、 1〜： 10回、 好ましくは 2〜5回免疫を行う。 そして、 最終の免疫日から 6〜60 日後に、 酵素 免疫測定法 （ ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay ) 又は EIA (enzyme immunoassay) ) 、 fcc射' 免疫測定 fe (RlA； radioimmuno assay) 等で抗体価を測定し、 最大の抗体価を示した日に採血し、 抗血清を得る。
その後は、 これらタンパク質に対する抗血清中のポリクローナル抗体の反応性 を ELISA法などで測定する。
( 2 ) シノビオリンに対するモノクローナル抗体の作製
(i) 抗体産生細胞の採取
モノクローナル抗体の調製のためには、 免疫用抗原となるシノビオリンもしく は免疫学的に同等のタンパク質、 またはそのフラグメントもしくは断片べプチド を免疫原として哺乳動物の抗体産生が可能な部位に、 単独で、 または担体および 希釈剤とともに投与する。 その際、 抗体産生能力を高めるため、 アジュバントな どを混ぜて投与してもよい （Adv. Tubercl. Res., 1:130-148， 1956) 。 アジュバ ントとしては、 FCA、 FIA、 水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。 モノクローナル抗体は、 免疫担当細胞 （具体的には抗体産生細胞） と骨髄腫細 胞 （ミエローマ細胞） との間に融合細胞を形成させ、 当該細胞をクローユングし、 シノビオリンに特異的な抗体を産生するクローンを選択することにより得ること ができる (Kohler, G. & Milstein, C, Nature 256: 495-7, 1975) 。
免疫には、 免疫原として上記ペプチドを含む複合体 （またはシノビオリンもし くはそれと免疫学的に同等なタンパク質、 またはそれらの断片） を用い、 1 回当 たり、 たとえば 20 i g〜l mg、 適当なアジュバントと溶解もしくは混和して免 疫動物に免疫感作する。
免疫動物として用いる哺乳動物は、 マウス、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ラット、 ヒ ッジ、 ャギ、 サル、 ィヌなどが挙げられるが、 一般に扱いやすさなどから、 とく にマウスまたはゥサギが好ましく用いられる。 抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同 種動物由来であるほうが望ましい。 投与は、 通常 3〜6 ヶ月間の期間において、 2〜6 週ごとに 1回ずつ 2〜： L0 回程度行なわれる。
抗体産生細胞の採取は、 抗原感作された上記動物から抗体価が認められた個体 を選択し、 最終免疫の 2〜5 日後に脾臓細胞、 リンパ節細胞または B-リンパ球を 採取する。 それらに含まれる抗体産生細胞と自立増殖能を有する骨髄腫細胞とを 融合させる。 生成するハイプリ ドーマから本発明の抗シノビォリン 'モノクロ一 ナル抗体を産生するクローンを選択することにより、 モノクローナル抗体を産生 するハイプリ ドーマを調製することができる。 その手順は、 基本的には、 ケーラ 一の方法に準じて行えばよい ("Immunological Method", Academic Press, New York, 391, 1979) 。
(ii) 細胞融合
融合操作は公知の技術を使用することができ、 たとえば、 上記ケーラーとミル スタインの方法が挙げられる。 骨髄腫細胞 （ミエローマ） として、 P3U1、 NS-1、 SP2/0 といったマウス骨髄腫由来の細胞株またはその変異株などが挙げられるが、 とくに P3U1 が好ましく用いられる。 融合促進剤としてポリエチレングリコー ル （PEG) 、 センダイウィルスなどが挙げられ、 好ましくは、 PEG が用いられ る。 融合は、 血清を含有しない RPMI1640培地などに骨髄腫細胞を浮遊させ、 この浮遊液に上記で調製した脾細胞などの抗体産生細胞を含む液を加えてしばら く静置する。 軽く遠心分離して細胞を回収し、 PEGを含む RPMI1640培地を加 えて、 37 °Cで 2〜4分間インキュベートすることにより細胞融合は完了する。 反応物を遠心分離して回収したハイプリ ドーマは、 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） 培地に移し、 たとえば 96 ウェルマイク口プレート に分注したのち、 所定期間培養する。 培養は、 通常 5 %の炭酸ガス下、 インキ ュベータ中で、 20〜40 °C、 好ましくは 34〜38 °Cである。 通常 1 週間後には、 ハイプリ ドーマが生育してコロニー形成が観察される。 培養の期間は通常、 5 日〜 3 週間、 好ましくは：!〜 2 週間である。
(iii) 抗体スクリーニングおよぴクローニング
モノクローナル抗体の選別は、 通常は HAT を添加した動物細胞培養基などで 行うことができる。 選別および育種用培地としては、 ハイプリ ドーマが生育でき るものであればとくに制限はない。 たとえばハイプリ ドーマ培養用無血清培地、 牛胎仔血清 （fetal calf serum; FCS) を含む RPMI培地、 GIT培地などを用い ることができる。
増殖の見られたゥエルの培養上清中のぺプチドに対する抗体価を酵素抗体法な どによって測定し、 たとえば限界希釈法によってハイブリ ドーマのクローニング を行って本発明のハイブリ ドーマのクローンを得る。
形成された本発明のハイプリ ドーマをスク リーニングする操作は、 一般に次の とおりである。 免疫原として用いたぺプチドを直接にまたは担体とともに吸着さ せたマイクロプレートなどの固相へ、 ハイブリ ドーマ培養上清を添加し、 次いで 放射性物質、 酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン A を 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法が便利である。 あるい は抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン A を吸着させた固相にハイプリ ドー マ培養上清を添加し、 次いで標識抗原を加えて、 固相に結合したモノクローナル 抗体を検出してもよい。
上記操作により陽性ゥヱルを選択し、 数日してから、 一株につき 96 ゥエルプ レート 1 枚に、 たとえば 100 細胞/プレートとなるように撒き、 10〜14 日間培 養する。 コロニーを判定し、 培養上清を上記スクリーニング用抗原固相化プレー トに適用して、 検定を同様に行なう。 選択したコロニーは、 培養後、 リクロー- ングし、 10〜： L4 日間培養してコロニー判定おょぴ培養上清の検定を上記と同様 に実施する。 親株別にゥヱルを選択し、 24 ゥヱルプレートで培養し、 上清を回 収してクローンのチェックを行い、 抗体のサブクラスおょぴ抗体産生を検定する。
(iv) モノクローナル抗体の産生おょぴその分離
上記のようにして選別されたクローン SL-1 を生体内外で培養すると、 本発明 のモノクローナル抗体である SL-1抗体が産生される。 その培養には、 当該技術 分野において慣用されている方法を使用することができる。 ハイプリ ドーマ SL-1 を生体外の培養培地で培養した場合、 その培養物から SL-1 抗体を分離すればよい。 増殖速度、 抗体産生効率の向上には、 培地の種類 の選択と維持、 培養条件の管理 （たとえば培地内酸素濃度、 撹拌速度、 汚染） が 求められる。
ヒ トを除く温血動物を利用してクローンを培養した場合、 その腹水および Zまた は血液からモノクローナル抗体を採取する。 たとえば所定の細胞密度になるよう にクローンを、 ゥシ胎児血清を補足した RPMI1640培地などに接種したのち、 インキュベータ中、 5 %炭酸ガスの存在下、 37 °Cで培養する。 次いでその培養 物を、 予めプリスタンを投与しておいたマウスの腹腔内に接種し、 所期の期間、 通常の方法で飼育する。 通常 1〜2 週間してから、 腹水を採取し、 これに硫酸ァ ンモニゥムを添加して塩析沈殿を得る。 その分画からクロマトグラフィーなどを 利用してモノクローナル抗体を分離精製する。
培養物または腹水および/または血液からモノクローナル抗体を単離する方法 は、 通常のポリクローナル抗体の精製方法と同じであり、 免疫グロブリンの分離 精製法による。 すなわち、 塩析法、 透析法、 濾過法、 濃縮、 アルコール沈殿法， 等電点沈殿法、 各種電気泳動法、 イオン交換体 （DEAE 樹脂など） による吸脱 着法、 超遠心法、 ゲル濾過法、 特異的ァフィ二ティ精製法などを適宜組合わせて 利用することによる。 生成したモノクローナル抗体は、 その後濃縮、 乾燥し、 用 途に応じて液状または固体状とする。
(iv) ヒ ト化又はヒ ト型化抗体
本発明において、 抗体は、 ヒ ト型化又はヒ ト化されたものも含まれる。
ヒ ト抗体は、 免疫系をヒ トのものと入れ換えた哺乳動物を免疫すれば、 通常の モノクローナル抗体と同様にして作製することができる。
ヒ ト型化抗体は、 定常領域と可変領域の一部がヒ ト型の抗体であり、 可変領域 において、 フレームワーク領域 （FR) はヒ ト由来のものを、 CDR と呼ばれる相 ネ甫十生決定領域 (complementarity determining region) はマウス由来のもの力、ら なる再構成した抗体である。 ヒ ト型化抗体を作製する場合は、 マウス抗体の可変 領域から CDR をヒ ト可変領域に移植して、 次にこれらのヒ ト型化された再構成 ヒ ト可変領域をヒ ト定常領域に連結する。 ヒ ト型化抗体の作製法は、 遺伝子工学 的手法により得ることができ、 当分野において確立されている （杉村和久 「本 格化する抗体医療！抗体エンジニアリングと抗体医薬のすべて」 Bio ベンチヤ 一 Vol.2 No.4 羊土社 2002年） 。
( 3 ) 本発明の抗体の特徴
(i) シノビォリンの自己ュビキチン化を阻害することができる。
すなわち、 シノビオリンの自己ュビキチン化が原因となる疾患の治療に用いる ことができる。
(ii) シノビォリンの基質タンパク質 P4HA1 のュビキチン化には影響しない。 すなわち、 P4HA 1のュビキチン化に関わる生理機能には影響を及ぼさない。 (iii) 本発明の抗体のアイソタイプは IgGl である。
5 . 本発明のモノクローナル抗体の用途
本発明の抗体 （例えば SL-1抗体） は、 シノビオリン又はその部分べプチドを 特異的に認識することができるため、 様々な利用形態が考えられる。 以下に、 SL-1抗体を例にして、 典型的な利用の態様をいくつか示す。
( 1 ) シノビォリンの自己ュビキチン化反応の阻害
ュビキチン化は、 ュビキチン活性化酵素 （E1) 、 ュビキチン結合酵素 （E2) およぴュビキチンリガーゼ （E3) が共同して基質タンパク質にュビキチンを 次々と結合させていく過程である。 上述のように、 シノビォリンの自己ュビキチ ン化とは、 シノビォリンがュビキチンリガーゼ活性を有することにより、 シノビ ォリン自体がュビキチン化の基質タンパク質となり、 他のュビキチンリガーゼで はなく自らュビキチンを結合させるものである。
上記のュビキチン活性化酵素 （E1) 、 ュビキチン結合酵素 （E2) などの酵素 類は、 市販されており、 これらを適宜使用することができる。 96 マイクロプレ 一トのゥエル当たり、 E1は、 10〜50 ngの範囲、 好ましくは 20〜40 ngの範囲 で、 E2は、 0.：！〜 0.5 / gの範囲、 好ましくは 0.2〜0.3 gの範囲で用いられる。 ュビキチン化に必要な低分子反応因子として、 MgCl2、 MgS04などの Mg塩、 ATP、 EDTA、 NAF、 DTT (ジチオスレィ トール） 、 オカダ酸などを適宜選択 して使用することができる。 これらの化合物も市販されており、 入手は容易であ る。
さらに酵素類又は試薬を溶解する緩衝液、 洗浄用緩衝液、 測定用緩衝液、 反応 停止緩衝液などは、 酵素を失活させ、 あるいは反応を阻害しないものであれば、 任意の公知緩衝液 （例えば、 Tris-HCl) を使用することができる。
His タグ融合タンパク質 MBP-dTM Syno-Hisを用い、 上記のように作製したモ ノクローナル抗体、 抗 FLAG抗体またはマウス IgG と混合させ、 4 で 1.5 時 間、 抗原抗体反応を行う。
その後、 自己ュビキチン化反応を行う。 シノビォリンの自己ュビキチン化反応 は、 通常以下の条件で行うことができる。 反応溶媒となる緩衝液 （pH 6〜8) の 一定量に、 シノビォリンの自己ュビキチン化に必要な反応物質 （シノビオリンま たはその活性誘導体を除く） をそ ;TLぞれ上記の所定量加え、 室温で 5〜30 分間 インキュベートする。 次いでシノビオリンまたはその活性誘導体、 あるいは固定 化されたシノビオリンの活性誘導体を添加して、 シノビオリンの自己ュビキチン 化反応を開始する。 室温〜 37 °Cの一定温度のもとで、 20〜： 120分の一定時間の インキュベーションを行い、 停止緩衝液 （0.2 Mホウ酸緩衝液、 TritonX-100 お ょぴ EDTA を含有する） を一定量加えることにより反応を停止させる。 そして、 シノビオリンに結合したュビキチンまたは結合しなかったュビキチンの量を測定 して、 自己ュビキチン化の程度を求める。 ( 2 ) 検査 ·診断、 治療効果又は薬効の判定への利用
シノビオリンは RA患者の滑膜組織において強発現している。 また、 RA患者 の血中においては、 シノビオリンを認識する抗体 （自己抗体） が高い頻度で検出 される。 他方、 健常者の血中では、 シノビォリンの抗体は実質的に検出すること ができない。 さらにシノビオリンは、 インビト口において培養滑膜細胞の増殖を 抑制する。 これは、 滑膜細胞の増殖を促進するリガンドに対して、 シノビオリン が競合するためであると考えられる。 これらの情報を基に、 次のような分子的機 序が想定できる。 すなわち、 シノビォリンの滑膜細胞における強発現が、 滑膜細 胞に対して増殖促進作用を持つシノビオリンのリガンドとの結合を促し、 結果と して滑膜細胞の増殖が促進される。 そしてこの滑膜細胞の異常増殖こそが RA の病態に他ならない。
このような知見に基づいて、 SL-1 抗体の免疫学的な特性を利用することによ り、 細胞増殖性疾患の検出方法または診断方法が提供される。 細胞増殖性疾患は、 例えば、 関節リウマチ、 癌、 線維症、 動脈硬化、 キャッスルマン病、 多発骨髄腫、 クローン病、 全身型若年特発性関節炎、 脳腫瘍、 舌癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳癌、 食 道癌、 胃癌、 膝臓癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 肝癌、 子宮癌、 卵 巣癌、 前立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋筋肉腫、 線維肉腫、 骨肉種、 軟骨肉腫、 皮 膚癌、 急性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ球白血病、 成人型 τ 細胞白血病、 悪性リンパ腫などが挙げられるがこれらに限定されない。 また、 癌 に関しては原発性、 転移性を問わない。 また、 細胞は、 滑膜細胞、 破骨細胞、 角 化上皮細胞、 血液細胞、 癌細胞、 骨髄細胞、 線維芽細胞、 血管内皮細胞、 真皮細 胞、 筋細胞、 神経細胞、 リンパ球、 血管平滑筋細胞、 肝細胞、 色素細胞、 脂肪細 胞、 子宮内皮細胞、 肺胞上皮細胞、 未分化間葉系細胞、 外胚葉頂堤などが挙げら れるがこれらに限定されない。
これらの方法は、
(i) 被検者の生体試料と本発明の抗体とを反応させて、 試料中に存在する疾患 のマーカーを検出する工程、 および
(ii) 工程 （i)の検出結果を、 疾患と関連付ける工程
を含む。
上記マーカーは、 以下の (a)〜( に示すいずれかのマーカーを用いることがで きる。 これらのマーカーの測定方法は、 後述する。
(a) シノピオリンまたはシノピオリンと機能的に同等なタンパク質、
(b) シノピオリンまたはシノビォリンと機能的に同等なぺプチド、
(c) シノビオリンまたはシノピオリンと機能的に同等なタンパク質に結合する 抗体、 および
(d) シノビォリンまたはシノビォリンと機能的に同等なぺプチドに結合する抗 体
たとえば、 被検者から採取された血液試料中に、 シノビオリンまたはシノピオ リンと機能的に同等なタンパク質もしくはぺプチドと反応する抗体が見出されれ ば、 その被検者は RAである可能性が高い。
あるいは、 患者から採取された滑膜組織におけるシノビオリンまたはジノピオ リンと機能的に同等なタンパク質の発現は、 RA に起因する滑膜組織の増成を示 している。 タンパク質の発現は、 一般にタンパク質自体またはその情報を担う mRNA の存在を指標として検出することができる。 シノビォリンの検出のため には、 本発明の SL-1抗体が、 好ましく利用される。 滑膜細胞、 滑膜組織等、 ま たは体液中におけるシノビォリンが検出される場合には、 RA が進行していると 考えられる。
本発明の抗体を含む免疫学的分析用試薬は、 RA の診断のほかに、 治療効果も しくは薬効の判定にも有用である。 RA の治療効果もしくは薬効の判定もまた、 基本的には RAの診断と同様の方法で行われる。 滑膜組織や血液中におけるシノ ビオリンまたはその抗体のレベルが、 それらのタンパク質をコードする遺伝子の 発現消長に関係しており、 それらの検出は、 症状の推移、 疾患の寛解を示す指標 としての意義を有するからである。
さらに本発明の SL-1抗体は、 シノビオリンを発現する細胞の分離あるいは検 出に利用することができる。 滑膜細胞、 破骨細胞、 角化上皮細胞、 血液細胞、 癌 細胞、 骨髄細胞、 線維芽細胞、 血管内皮細胞、 真皮細胞、 筋細胞、 神経細胞、 リ ンパ球、 血管平滑筋細胞、 肝細胞、 色素細胞、 脂肪細胞、 子宮内皮細胞、 肺胞上 皮細胞、 未分化間葉系細胞、 外胚葉頂堤などが挙げられるがこれらに限定されな い。 シノビオリンは、 発生においては外胚葉頂堤で発現が見られるほか、 リウマ チ滑膜細胞、 並びに滑膜、 骨 ·軟骨および肢の原基となる未分化間葉系細胞にお いて強く発現している。 したがってシノビオリンは、 特に、 外胚葉頂堤、 リウマ チ滑膜細胞及び未分化間葉系細胞のマーカーとして使用するのが好ましい。
すなわち、 シノビォリンの発現を指標に、 滑膜細胞、 破骨細胞、 角化上皮細胞、 血液細胞、 癌細胞、 骨髄細胞、 線維芽細胞、 血管内皮細胞、 真皮細胞、 筋細胞、 神経細胞、 リンパ球、 血管平滑筋細胞、 肝細胞、 色素細胞、 脂肪細胞、 子宮内皮 細胞、 肺胞上皮細胞、 未分化間葉系細胞、 外胚葉頂堤、 特に、 外胚葉頂堤、 リゥ マチ滑膜細胞および未分化間葉系細胞を検出又は分離することができる。 例えば、 シノビオリンに対する抗シノビオリン♦モノクローナル抗体を、 適宜蛍光等によ り標識して細胞と反応させ、 セルソーティング等によりシノビオリンを発現する 細胞を分離することができる。 分離された未分化間葉系細胞は、 インビトロまた はインビボにおいて、 組織、 例えば、 筋、 腱、 脂肪、 及び骨髄等の間質 (stroma) 、 骨 ·軟骨の形成、 あるいは関節の再構築に有用である。 再構築さ れた組織や器官は、 基礎的研究の利用のほか、 再生医学的応用が期待される。 本発明の抗体は、 シノビオリンを精製するための抗体カラムの作成、 精製時の 各分画中に存在する該タンパク質の検出に利用してもよい。 もっとも、 本発明に 係る特異的な抗シノビオリン ·モノクローナル抗体の利用は、 これらの用途のみ に限定されるものではない。
( 3 ) 免疫学的分析用試薬を用いた分析
次に、 SL-1 抗体を含む免疫学的分析用試薬は、 上記の用途のためにどのよう な態様で使用されるかについて具体的に述べる。
サンプル中の抗原もしくは抗体に対する免疫学的分析方法には多くの手法が一 般に普及している。 シノビオリンまたはそのフラグメントなどに対してモノク口 —ナル抗体を用いる測定法は、 とくに特定の方法に限定されるものではなく、 検 体中の抗原量、 すなわちシノピオリンの量に対応した抗体又は抗原-抗体複合体 の量を化学的又は物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準溶液 を用いて作成した検量線から算出する測定方法であれば、 いずれの方法を用いて もよい。 抗原-抗体複合体の量の検出方法として、 具体的には競合法、 ィムノメ トリック法、 ネフエロメ トリー （nephelometry) 、 サンドィッチ法などが好適 に用いられるが、 感度おょぴ特異性の見地から、 次のサンドイッチ法がとくに好 ましい。
サンドィツチ法 （例えば ELISA法） では、 固相化した本発明の SL-1抗体に 検体 （定量対象であるシノビオリンを含有） を反応させ （1次反応） 、 さらに標 識化した抗シノビオリン抗体を反応させた （2次反応） のち、 固相化担体上の標 識剤の活性を測定することにより、 検体中のシノピオリンなどの量を定量できる。 この場合、 1次反応と 2次反応は逆順序におこなってもよく、 同時に行なっても よいし、 時間をずらして行なってもよい。 2次反応に用いられる抗体は、 シノビ ォリンの結合する部位が本発明の SL-1抗体と相異なる抗体が好ましく用いられ る。
本発明のモノクローナル抗体を使用するィムノメ トリ ック法では、 検体中の抗 原と固相化抗原とを一定量の標識化モノクローナル抗体に対して競合反応をさせ た後に、 固相と液相とを分離する。 あるいは検体中の抗原と過剰量の標識化モノ クローナル抗体とを反応させ、 次いで固相化抗原を加えて未反応の標識化抗体を 固相に結合させたのち、 固相と液相とを分離する。 次に何れかの相のネ λ識量を測 定し検体中の抗原量を定量する。
競合法では、 検体中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの ち、 未反応の標識抗原 （F) と、 抗体と結合した標識抗原 （Β) とを分離し （Β /F分離） 、 B、 F のいずれかの標識量を測定し検体中の抗原量を定量する。 另 IJ の方法として、 抗体には可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレングリコー ル、 上記抗体に対する第 2抗体などを使用する液相法、 第 1 抗体として固相化 抗体を用いるか、 あるいは第 1 抗体は可溶性のものを用い、 第 2 抗体として固 相化抗体を用いてもよい。 たとえば、 担体上に固相化した本発明の抗シノビオリ ン ·モノクローナル抗体および標識化された抗体と検体とを同時又は連続的に競 合反応させた後、 固相化担体上の標識剤の活性を測定することも可能である。 ネフエロメ トリーでは、 ゲル内または溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶 性の沈降物量を測定する。 検体中の抗原量が少量であるため微量の沈降物しか得 られない場合には、 レーザー散乱を利用するレーザーネフヱロメ トリーなどが好 ましく用いられる。
サンプル中の抗体を検出 ·分析するためには、 抗原感作プレートをサンプル中 の抗体と反応させ、 プレート表面に捕捉される検出対象となる抗体を、 特異的な 抗原とする標識抗体で検出する方法が、 抗体の免疫学的分析方法としてもっとも ポピュラーな方法である （Imnmnocliemistry, 8:871-879, 1971) 。 あるいはプ レート上の未結合抗原を検出するための標識抗体として、 本発明の SL-1抗体を 使用してもよい。 また抗原を吸着させたラテックス粒子をサンプルと混合し、 免 疫学的な凝集反応として抗体を検出する方法も公知である （Plotz CM & Singer J.M, Am. J. Med., 21:888-892， 1956) 。 免疫学的粒子凝集反応は 1試薬で迅速 な分析が可能な方法であり、 大規模なスクリーニングには好適な方法である。 本発明の SL-1抗体を細胞の分離又は検出用試薬として用いる場合には、 抗シ ノビオリン ·モノクローナル抗体を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とする ことができる。 たとえば、 蒸留水、 pH 緩衝試薬、 塩、 タンパク質、 界面活性剤 などを組み合わせることができる。
反応試薬は適当な化学的または物理的検出手段により検出可能な標識を有する。 そのような標識物質を用いる測定法に使用される標識剤として、 たとえば蛍光物 質、 酵素、 放射性同位元素、 発光物質などが用いられる。 標識にとくに酵素を用 いた場合は、 ELISA法と呼ばれ、 広く利用されている。
蛍光物質として、 フルォレスカミン、 フルォレツセィンィソチオシァネートな ど、 酵素として、 パーォキシダーゼ、 アルカリホスファターゼ、 リンゴ酸脱水酵 素、 ひ-ダルコシダーゼ、 α -ガラクトシダーゼなど、 放射性同位元素として、 125
I、 "I I ν 3 Η、 14。 など、 発光物質として、 ノレシフェリン、 ルシゲニン、 ルミ ノール、 ルミノール誘導体などが例示される。
さらに本発明の SL-1抗体または抗原と標識剤との結合にピオチン -アビジン 系を用いてもよい。 抗原またはモノクローナル抗体の固相化には、 物理的吸着を 用いてもよく、 あるいは通常タンパク質または酵素などを固相化、 固定化するた めに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。 担体として、 ポリスチレン、 ポ リアクリルアミ ド、 シリコンなどの合成樹脂、 ァガロース、 デキストラン、 セル ロースなどの不溶性多糖類、 あるいはガラスなどが用いられる。
反応媒体として、 反応の至適条件を与えるか、 反応生成物質の安定化などに有 用な緩衝液、 反応物質の安定化剤などが含まれる。
検出手段としては、 分光器、 放射線検出器、 光散乱検出器といった上記標識を検 出可能なものである。
( 4 ) 検査診断用キット 本発明の SL-1抗体を免疫学的測定方法に適用する場合、 特別の条件、 操作な どは必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作に準じて行なわ れ、 必要であれば若干の修飾を加えて好適な測定系が構築できる。
そのためのもっとも簡便かつ効率的に測定を行なうことを可能とするのは、 上 記試薬をキット化することである。 そうしたキット化により、 通常の検查室また は実験室で、 特殊な分析機器、 熟練した操作、 高度の知識は必要とせずに、 効率 的に定量を行なうことができる。 上記の各種診断方法または治療の判定方法を実 施するためのアツセィキットの構成おょぴ形態は、 とくに限定されるものでなく 所定の目的を達成できるものであればその内容は限定されない。 一般には上記検 体試料について、 アツセィ方法を実行し得られた結果を解釈するための使用説明 書、 反応試薬、 反応が行なわれる場となる反応媒体、 アツセィの場を提供する基 材などから構成される。 さらに所望により、 比較基準とするためのあるいは検量 線を作成するための照合サンプル、 検出器なども含んでもよい。 ( 5 ) 医薬組成物
本発明の抗体は、 細胞増殖性疾患の治療又は予防用医薬組成物として有用であ る。 細胞増殖性疾患としては、 例えば、 関節リウマチ、 癌、 線維症、 動脈硬化、 キャッスルマン病、 多発骨髄腫、 クローン病、 全身型若年特発性関節炎、 脳腫瘍、 舌癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳癌、 食道癌、 胃癌、 腠臓癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指腸 癌、 大腸癌、 肝癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋筋肉腫、 線 維肉腫、 骨肉種、 軟骨肉腫、 皮膚癌、 急性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ球白血病、 成人型 T細胞白血病、 悪性リンパ腫などが挙げられるがこ れらに限定されない。 また、 癌に関しては原発性、 転移性を問わない。
本'発明の医薬組成物は、 本発明の抗体又はその断片を有効成分として含み、 さ らに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。 ここで 「薬学的に許容され得る担体」 とは、 賦形剤、 希釈剤、 増量剤、 崩壌剤、 安定剤、 保存剤、 緩衝剤、 乳化剤、 芳香剤、 着色剤、 甘味剤、 粘稠剤、 矯味剤、 溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。 そのような担体の一つ以上 を用いることにより、 注射剤、 液剤、 力プセル剤、 懸濁剤、 乳剤あるいはシロッ プ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。 これらの医薬組成物は、 経 口あるいは非経口的に投与することができる。 非経口投与のためのその他の形態 としては、 一つまたはそれ以上の活性物質を含み、 常法により処方される注射剤 などが含まれる。
本発明の薬剤の投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重及び症状、 治療効果、 投与 方法、 処理時間、 あるいは該薬剤に含有される活性成分である高親和性抗体の種 類などにより異なるが、 通常成人一人当たり、 一回につき 600 i g〜6000 mg、 好ましくは 6〜600 mgの範囲で投与することができるが、 この範囲に限定され るものではない。
例えば、 注射剤の場合には、 例えば生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬 学的に許容される担体中に 1 mg抗体/ ml担体〜 100 mg抗体/ ml担体の濃度とな るように溶解または懸濁することにより製造することができる。 このようにして 製造された注射剤は、 処置を必要とするヒ ト患者に対し、 1 回の投与において 1 kg体重あたり、 10 w g〜： 100 mgの割合で、 好ましくは 100 g〜： 10 mgの割合 で、 1 日あたり 1 回〜数回投与することができる。 投与の形態としては、 静脈 内注射、 皮下注射、 皮内注射、 筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられる 力 好ましくは静脈内注射である。 また、 注射剤は、 場合により、 非水性の希釈 剤 （例えばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のよう な植物油、 エタノールのようなアルコール類など） 、 懸濁剤あるいは乳濁剤とし て調製することもできる。 そのような注射剤の無菌化は、 フィルターによる濾過 滅菌、 殺菌剤の配合等により行うことができる。 注射剤は、 用時調製の形態とし て製造することができる。 即ち、 凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、 使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 これらの実施例は、 当 業者にとり多種多様に改変可能であるが、 本発明は、 これらの実施例のみに限定 されるものではない。 なお、 特に断らない限り、 ％は重量％を示す。
〔実施例 1〕 本実施例は、 抗シノビォリン 'モノクローナル抗体の作製を目的とする。
抗シノビオリン .モノクローナル抗体の調製のために、 免疫用のぺプチドとし て、 以下に示すヒ ト ·シノビォリンの部分アミノ酸配列を含む 3種類のペプチド を合成した。 これらのアミノ酸配列は、 抗原性を有すると推測された領域から選 択されたものである。
Syno-P3 ( SLALTGAWAHAYYC) (配列番号 3 )、
Syno-P2 (TCRMDVLRASLPAQS) (配列番号 4 )、 および
Syno-Pl ( GAATTTAGTS ATAC) (配列番号 5 )
各合成ペプチドに、 アミノ酸配列中の Cys を介して、 スカシガイへモシァ- ン （KLH) を結合させた。 KLH を結合した各合成ペプチドの 50 を 0.1 ml 生理食塩水に溶解し、 フロイントの完全アジュバント (FCA) 0.1 ml を加えて 免疫原を作製した。 各免疫原をそれぞれ 8 匹のマウス （BALB/c メス、 5 週 齢） 背部皮下に 0.2 ml注射し免疫した。 免疫は 2 週間ごとに計 4 回行い、 その 1 週間後にさらに 1 回免疫した。 最終免疫の 8 日後に、 心臓から採血し血清 200 μ ΐ 以上を分取した。 ELISA によって抗体価の上昇を確認できた個体から 脾細胞を採取し、 細胞融合を行った。
各免疫原につき 3個体のマウス血清について、 ELISA による抗体価の測定を おこなった。 いずれの免疫原を用いた場合にも、 抗体価が上昇した個体が確認さ れた。 これらの免疫原がいずれもシノビオリンの免疫原として有用であることが 確認された。
ミエローマ細胞株 （P3U1) とマウス脾細胞を 1: 10で混和し、 50 %の PEG (和光純薬社 PEG1540) 存在下で細胞融合させた。 融合後、 脾細胞数が 5 X 105個/ mlとなるように 96 ゥエルプレートに播いた。 HAT培地中で 10〜14 日 培養した後、 細胞の増殖を確認し、 培養上清の検定をおこなった。
培養上清の検定には、 各合成べプチドを固相化した ELISAプレートを用いた。 検定の操作は次のとおりである。 ELISAプレートに培養上清を反応させた後、 抗マウス IgG ャギ-ペルォキシダーゼ （POX) を用いて陽性ゥエルを選択した。 クローユングに供するゥ ルを選択し、 他の陽性ゥエルの細胞については凍結保 存した。 数日後、 一株につき 96 ゥエルプレート 1 枚、 100 細胞/プレート （20 細胞 /ml) となるように撒き、 10〜14 日間培養した。 コロニーを判定し、 培養上清 の検定を行った。 培養上清の検定は、 上清 50 1を上記スクリーニング用抗原固 相化 ELISAプレートに適用して行った。 第 2抗体は、 抗マウス IgGャギ -POX を使用した。 選択したコロニーは、 培養後、 リクローユングし、 10〜14 日間培 養してコロニー判定および培養上清の検定を上記と同様に実施した。 親株別にゥ エルを選択し、 24 ゥエルプレートで培養し、 上清を回収してクローンのチエツ クを行い、 抗体のサブクラスおよび抗体産生を検定した。 クローユングの結果、 シノビオリンに対して、 きわめて高い親和性を有するモノクローナル抗体を高い 効率で産生するハイブリ ドーマとして、 Syno-P2 を免疫原として得られたク口 ーン SL-1が選択された。
〔実施例 2〕
本実施例は、 抗シノビオリン ·モノクローナル抗体を用いた患者試料のシノビ ォリンの検出を目的とする。
( 1 ) 抗シノビオリン · モノクローナル抗体による患者由来滑膜細胞のゥヱスタ ンブロッティング
実施例 1で得られた、 Syno-P2を認識する SL-1抗体を用いて、 慢性関節リゥ マチ患者 （RA) 由来滑膜細胞のタンパク質を SDS-PAGE で分離し、 ゥエスタ ンブロッテイング法を行った。 ウェスタンブロッテイング法の操作は、 抗体とし て実施例 1の SL-1抗体を、 そして標識抗体として抗マウス IgGヒッジ -HRP を 用いた。
対照として、 変形性関節症患者 （OA) 由来の滑膜細胞も解析した。 その結果、 RA患者由来の'滑膜細胞で特異的なシグナルが検出された （図 1 「RA」 レーン 1、 2の 85 kDa付近のバンド） 。 実施例 1で得られた SL-1抗体は、 シノピオリ ンをより特異的に認識することが確認された。
( 2 ) 抗シノビオリン ·モノクローナル抗体による RA患者由来滑膜細胞の蛍 光免疫染色 SL-l 抗体を用いて、 RA患者由来滑膜細胞の蛍光免疫細胞化学解析を行った。 免疫染色の操作は、 抗体として実施例 1の SL-1抗体を、 そして標識抗体として 抗マウス IgG ヒッジ -FITC を用いる他は、 国際公開第 WO02/052007号パンフ レツ トの実施例 9に記載のとおりである。 シノビオリンのシグナルは、 RA患者 由来滑膜細胞で強く検出された （図 2上パネル） 力 二次抗体のみを反応させた 対照では検出されなかった （図 2下パネル） 。
( 3 ) 抗シノビオリン . モノクローナル抗体による RA患者由来滑膜組織の免 疫染色
SL-1 抗体を用いて、 RA患者から採取した滑膜組織切片の免疫染色を行った。 免疫染色の操作は、 抗体として実施例 1の SL-1抗体を、 そして標識抗体として 抗マウス IgG ヒッジ -HRP を用いる他は、 国際公開第 WO02/052007号パンフ レッ トの実施例 9に記載のとおりである。 シノピオリンは、 RA患者由来滑膜組 織で強く発現していた （図 3 SL-1抗体のパネル） 。 同時に行った HE 染色によ り、 滑膜細胞の増殖層が観察され、 その部分がモノクローナル抗体で染色されて いることが確認された。 これらの結果から、 本発明の SL-1 抗体は、 RA患者の 滑膜組織中のシノビオリンを特異的に認識することが確認された (図 3、 HE 染 色のパネル)。
以上のように、 抗シノビオリン抗体を用いて患者試料中のシノビオリンを検出 することにより、 RAの検査および診断を実施することができる。
〔実施例 3〕
本実施例は、 シノビオリン検出用 ELISA法検査薬を開発することを目的とす る。
実施例 1の方法により得られた SL-1抗体を適量とり、 PBSに 20 i g/ml となる ように溶解した。 溶液をェンザィムィムノアッセィ （EIA) 用 96 ゥエル平底マ イク口プレートに 100 1 /ゥエルずつ分注し、 室温下で数時間、 静置した。 ゥ エルから溶液を除去し、 0.05 (V/V)% Tween20を含む PBSで洗浄し、 1 (V/V)% —牛胎仔アルブミン （BFA) を含む PBS、 100 ^ 1 /ゥェルを加えて、 4 °Cで一 晚静置してモノクローナル抗体をブロックした後、 PBS を除去して抗体プレー トを得た。
これとは別に、 常法に基づいてシノビオリンによるゥサギの免疫感作によりポ リクローナル抗体を調製した。 このポリクローナル抗体を、 過ヨウ素酸酸化方法 により西洋ヮサビペルォキシダーゼ （HRP) で標識し、 PBS で予備平衡化した セフアクリル S-300HR (Pharmacia社） を用いるゲルろ過クロマトグラフィー により精製して標識抗体を得た。 この二次標識抗体は、 塩、 安定化剤、 防腐剤な どを含む緩衝試薬の組成物とした。
このようにして得られた固相 SL-1抗体を有する、 上記 96 ウェルマイクロプ レートに、 通常の EIA に準じて、 適宜希釈した患者の血液、 尿などの体液また は組織などを分注して室温で 1時間、 作用させた。 このとき、 希釈液だけを加え てゥヱルを対照とした。 0.05 % Tween20含有リン酸緩衝液で洗浄後、 HRP標 識抗マウス IgG ゥサギ抗体を加えて、 室温で 30 分間反応させた。 未反応の二 次標識抗体を 0.05 % Tween20含有リン酸緩衝液で洗浄後、 基質緩衝液として 0.015 %過酸化水素を含有する 0.1 Mクェン酸緩衝液、 ならびに染色剤として 0 —フヱ二レンジアミンークェン酸塩緩衝液 （10 mg/ml) を各ゥヱルに加えて、 室温で 30 分間反応させた後、 2 M硫酸を添加して発色反応を停止させた。 次 いで呈色は、 492 nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定することによ り被検体中のシノビオリン量を求めた。
〔実施例 4〕
本実施例は、 シノビオリンの自己ュビキチン化を検討することを目的とする。 シノビオリンは RING フィンガーモチーフを持つ E3 ュビキチン-蛋白質リガ ーゼであり、 RING フィンガーモチーフは E2 ュピ:キチン結合酵素の結合部位 と考えられている。 また、 E3 ュビキチン-蛋白質リガーゼは、 自己ュビキチン化 をすることが知られており、 シノビオリンの自己ュビキチン化に関しても実験的 に確認されている。
マウスモノクローナル抗体である SL-1 は、 シノビオリン蛋白質の RING フ インガー領域の 328〜342 番目のアミノ酸に対応するペプチドを抗原として作製 した （実施例 1 ) 。 Hisタグ融合タンパク質 MBP-dTM Syno-Hisを用いて、 一定 濃度の SL-1 抗体、 抗 FLAG 抗体またはマウス IgG と混合させ、 4 °Cで 1.5 時 間、 抗原抗体反応を行った。
その後、 インビトロでのュビキチン化反応系を用いてシノビオリンの自己ュビ キチン化を検討した。 E1 (酵母由来） 、 E2 (UbcH5c) 、 ATP, GST-HA-ュビ キチンそしてあらかじめ抗体と反応した各 MBP-dTM Syno-His を混合し、 37 °C、 120 分間反応させた。 反応後の各サンプルに 4 x SDS-PAGE緩衝液を加え、 5 分 間沸騰させた後、 10 % SDS-PAGE 上で展開させた。 そして、 ウェスタンプロッ ティング解析法で、 シノビオリンのュビキチン化されたバンドを SL-1 抗体を用 いて検出した。
結果として、 SL-1 抗体の量に依存して 250 kDaのバンドが阻害されているこ とから、 MBP-dTM Syno-His の自己ュビキチン化が 2 gの SL_1抗体により阻 害されることが観察された。 しかし、 同量の抗 FLAG 抗体やマウス IgG では 250 kDa のパンドの阻害作用が見出されなかった（図 4上パネル)。 また、 同様の 実験で、 SL-1 抗体量を 8〜44 μ g/Lまで検討した場合も、 250 kDa付近のバン ドが阻害され、 SL-1抗体によって MBP-dTM Syno-His の自己ュビキチン化が 阻害されることが示された （図 4下パネル） 。 従って、 MBP-dTM Syno-Hisの自 己ュビキチン化は SL-1抗体により特異的に阻害されることが明らかとなった。 〔実施例 5〕
本実施例は、 SL-1 抗体がシノビオリンによるュビキチン化に対しても影響を 与えるかどうかについて検討することを目的とする。
ュビキチンは活性化酵素 （E1) 、 結合酵素 （E2) 、 リガーゼ （E3) からなる ュビキチン系により標的蛋白質 （基質） に共有結合し、 この反応が繰り返される ことにより形成されるポリュビキチン鎖が、 基質のプロテアソームによる分解マ 一力一として作用する。 コラーゲン産生において必須であるコラーゲンのプロリ ン残基の水酸化を触媒する酵素であるプロリルヒドロキシラーゼの サブュニッ トである P4HA1 はシノビオリンの基質であることが見出されている。 SL-1抗体 がシノビォリンの自己ュビキチン化活性を阻害する作用が見い出されているため、 この抗体が P4HA1 のシノビォリンによるュビキチン化に対しても影響を与える かどうかについて検討した。
まず、 MBP-dTM Syno-Hisを一定濃度の SL_1抗体、 抗 FLAG抗体またはマウ ス IgG と混合させ、 4 °Cで 1.5 時間、 抗原抗体反応を行った。 その後、 インビ トロのュビキチン化反応系において、 1 ixも の GST 融合 P4HA1 タンパク質 GST-P4HA1 を E1 (酵母由来） 、 E2 (UbcH5c) 、 ATP、 GST-HA-ュビキチン そしてあらかじめ抗体と反応した各 MBP-dTM Syno-Hisと混合させ、 37 °C、 120 分間反応させた。 反応後の各サンプルに 4 x SDS-PAGE緩衝液を加え、 5 分間沸 騰させた後、 10 % SDS-PAGE 上で展開させた。 そして、 ウェスタンプロッティ ング解析法で、 P4HA1 のュビキチン化されたバンドを抗 GST抗体により検出し た。
結果として、 MBP-dTM Syno-Hisの自己ュビキチン化が 4 gの SL-1抗体に より明らかに阻害されたが、 GST-P4HA1 のュビキチン化では 8 g の SL_1 抗 体によってもほとんど阻害されないことが明らかになった（図 5 )。 ここで、 図 5 において、 -E3はシノビオリンを含まないサンプル、 α -SLlは抗体を添加したサ ンプル、 IgG はネガティブコントロールとしておいたサンプルをそれぞれ示して おり、 GST-P4HA1 -Ubn に示した 250 kDa付近のバンドが、 ュビキチン化された GST-P4HA1 を示している。 従って、 SL- 1抗体はシノビォリンの自己ュビキチン 化を特異的に阻害し、 GST-P4HA1 のュビキチン化には影響を与えないことが明 らかとなつた。 産業上の利用可能性
本発明の抗体によれば、 シノビオリンの自己ュビキチン化を調節することがで さる。
また、 RA 患者の血中に、 シノビオリンを認識する自己抗体が見出されること で、 RA の診断上まったく新しいアプローチがもたらされる。 従って、 本発明の 抗体を含有する医薬組成物は、 RA の治療方法等の開発においても、 今までにな い新しいアプローチを提示することができる。
また、 本発明により、 上記抗体を産生する細胞、 及び上記モノクローナル抗体 を利用したシノピオリン含有細胞検出キットも提供される。
滑膜の発達ならびに骨 ·軟骨おょぴ四肢の発達に関与するシノビオリンの遺伝 子は RAの病態に関与しており、 RA患者ではこの遺伝子産物に対する抗体が産 生されている。 本発明の SL-1 抗体は、 RAの診断に有用なマーカーとなるシノ ビオリンならびに患者血清中に高頻度で見出されるその抗体の特異的な検出、 定 量に利用することができ、 RA疾患の診断や治療効果の判定に貢献するものであ る。
本発明の SL-1抗体は、 その高い特異性を利用することにより、 シノビオリン を細胞マーカーとして用いて、 胚の細胞などから未分化間葉系細胞を回収するこ とができ、 その再生医学的な応用にも資することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . シノビオリンの自己ュビキチン化を阻害することができる、 シノビオリ ンに対する抗体又はその断片。
2 . シノビォリンの基質タンパク質のュビキチン化には影響しないことを特 徴とする、 請求項 1記載の抗体又はその断片。
3 . 抗体がモノクローナル抗体である請求項 1又は 2記載の抗体又はその断 片。
4 . 配列番号 3〜 5に示されるいずれかのァミノ酸配列からなるぺプチドを 抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合に よって得られるハイプリ ドーマにより産生される、 シノビオリンに対するモ ノクローナル抗体又はその断片であって、 シノビオリンの自己ュビキチン化 を阻害することができる前記抗体又はその断片。
5 . 配列番号 3 〜 5に示されるいずれかのアミノ酸配列からなるぺプチドを 抗原として免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合に よって得られるハイブリ ドーマであって、 シノビォリンの自己ュビキチン化 を阻害することができるモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ。
6 . シノビォリンの自己ュビキチン化を阻害することができる、 シノビオリ ンに対するモノクローナル抗体の製造方法であって、 配列番号 3〜 5に示さ れるいずれかのアミノ酸配列からなるぺプチドを抗原として免疫された動物 の抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞を培養し、 得られる培養物か ら前記モノクローナル抗体を採取することを特徴とする方法。
7 . 請求項 1 〜 4のいずれか 1項に記載の抗体又はその断片を含有する医薬 組成物。
8 . 関節リウマチ、 癌、 線維症、 動脈硬化、 キャッスルマン病、 多発骨髄腫、 クローン病、 全身型若年特発性関節炎、 脳腫瘍、 舌癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳癌、 食道癌、 胃癌、 滕臓癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 肝癌、 子宮 癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋筋肉腫、 線維肉腫、 骨肉種、 軟 骨肉腫、 皮膚癌、 急性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性リンパ球白 血病、 成人型 T細胞白血病、 悪性リンパ腫の治療又は予防のための請求項 7 記載の医薬組成物。
9 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の抗体又はその断片を含有する、 シ ノビオリンの自己ュビチキン化阻害剤。
1 0 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の抗体又はその断片を含有する、 シノビオリン含有細胞検出用試薬。
1 1 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の抗体又はその断片を含有する、 シノビオリンによる細胞増殖性疾患の検出用試薬。
1 2 . 細胞増殖性疾患が、 関節リウマチ、 癌、 線維症、 動脈硬化、 キヤッス ルマン病、 多発骨髄腫、 クローン病、 全身型若年特発性関節炎、 脳腫瘍、 舌 癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳癌、 食道癌、 胃癌、 膝臓癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指 腸癌、 大腸癌、 肝癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋筋肉 腫、 線維肉腫、 骨肉種、 軟骨肉腫、 皮膚癌、 急性骨髄性白血病、 急性リンパ 性白血病、 慢性リンパ球白血病、 成人型 τ細胞白血病、 悪性リンパ腫からな る群から選ばれる少なくとも 1つである、 請求項 1 1記載の試薬。
1 3 . 細胞が、 滑膜細胞、 破骨細胞、 角化上皮細胞、 血液細胞、 癌細胞、 骨 髄細胞、 線維芽細胞、 血管内皮細胞、 真皮細胞、 筋細胞、 神経細胞、 リンパ 球、 血管平滑筋細胞、 肝細胞、 色素細胞、 脂肪細胞、 子宮内皮細胞、 肺胞上 皮細胞、 未分化間葉系細胞、 外胚葉頂堤からなる群から選択されるいずれか の細胞である、 請求項 1 0〜 1 2のいずれか 1項に記載の試薬。
1 4 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の抗体又はその断片と、 シノピオ リンとを反応させることを特徴とする、 シノビオリンの自己ュビキチン化を 阻害する方法。
1 5 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の抗体又はその断片と、 生体試料 とを反応させることを特徴とする、 シノビォリンの発現細胞を検出する方法。
1 6 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の抗体又はその断片と、 被験者か ら採取された生体試料とを反応させることを特徴とする、 シノビオリンによ る細胞増殖性疾患の検出方法。
1 7 . 細胞増殖性疾患が、 関節リウマチ、 癌、 線維症、 動脈硬化、 キヤッス ルマン病、 多発骨髄腫、 クローン病、 全身型若年特発性関節炎、 脳腫瘍、 舌 癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳癌、 食道癌、 胃癌、 膝臓癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指 腸癌、 大腸癌、 肝癌、 子宮癌、 卵巣癌、 前立腺癌、 腎癌、 膀胱癌、 横紋筋肉 腫、 線維肉腫、 骨肉種、 軟骨肉腫、 皮膚癌、 急性骨髄性白血病、 急性リンパ 性白血病、 慢性リンパ球白血病、 成人型 τ細胞白血病、 悪性リンパ腫からな る群から選ばれる少なくとも 1つである、 請求項 1 6記載の方法。
. 細胞が、 滑膜細胞、 破骨細胞、 角化上皮細胞、 血液細胞、 癌細胞、 骨 髄細胞、 線維芽細胞、 血管内皮細胞、 真皮細胞、 筋細胞、 神経細胞、 リンパ 球、 血管平滑筋細胞、 肝細胞、 色素細胞、 脂肪細胞、 子宮内皮細胞、 肺胞上 皮細胞、 未分化間葉系細胞、 外胚葉頂堤からなる群から選択されるいずれか の細胞である、 請求項 1 5〜1 7のいずれか 1項に記載の方法。
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