WO2006054458A1

WO2006054458A1 - 除草剤耐性遺伝子及びその利用

Info

Publication number: WO2006054458A1
Application number: PCT/JP2005/020439
Authority: WO
Inventors: Hisakazu Hasegawa; Teruhiko Terakawa; Kiyoshi Hirazawa
Original assignee: Hokko Chemical Industry Co., Ltd.
Priority date: 2004-11-17
Filing date: 2005-11-08
Publication date: 2006-05-26
Also published as: CA2586241C; US7795505B2; US20090158469A1; JPWO2006054458A1; CA2586241A1; JP4823919B2

Abstract

　新規な除草剤耐性遺伝子、及び同遺伝子を利用して除草剤耐性が付与された植物を提供するために、下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡで植物細胞を形質転換し、形質転換植物細胞を植物体に再生させることにより、除草剤耐性が付与された植物体を作製する。（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、除草剤耐性活性を有するタンパク質。

Description

明細書

除草剤耐性遺伝子及びその利用

技術分野

[0001] 本発明は、除草剤耐性遺伝子及びその利用に関し、詳細には除草剤耐性に関与するタンパク質、及びそれをコードする新規な遺伝子に関する。さらには、該遺伝子により形質転換された植物細胞、植物体および種子に関する。

背景技術

[0002] 近年、遺伝子工学的技術を用いて除草剤の影響を受けない除草剤耐性植物が開発されてきている。除草剤ホスフィノスリシン (PPT)は、非選択性の除草剤として利用されており、その作用機序としては、 PPTが植物体に吸収された後、 PPTによってダルタミン合成酵素が阻害され、植物体に有害な NHが蓄積することにより植物が枯死す

3

ること力 S失口られている。

[0003] PPTに対する耐性に関与する遺伝子として、ホスフィノスリシンァセチルトランスフエラーゼ遺伝子が知られており、当該遺伝子産物は酵素反応により PPTをァセチル化することにより除草効果を不活化することが知られている。

[0004] PPT耐性遺伝子としては、

(1)ストレプトミセス.ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes)から取得されたホスフィノスリシンァセチルトランスフェラーゼ遺伝子（特許文献 1、 2、 3、非特許文献 1)、

(2)ストレプトミセス'ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus)から取得されたホスフィノスリシンァセチルトランスフェラーゼ遺伝子（非特許文献 2、 3)、

(3)放線菌 AB2253株から取得されたホスフィノスリシンァセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (特許文献 4)、

(4)ストレプトミセス 'コエリカラー（Stereptomyces coelicolor)から取得されたホスフイノスリシンァセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (非特許文献 4)、

(5)大腸菌（Escherichia coli)力も取得されたホスフィノスリシンァセチルトランスフェラーゼ遺伝子（NCBI No.7427901) , (6)ァグロバタテリゥム 'ッメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)から取得されたホスフィノスリシンァセチルトランスフェラーゼ遺伝子（NCBI No.17739287)、

(7)バチルス.ズブチリス（Bacillus subtilis)力ら取得されたホスフィノスリシンァセチルトランスフェラーゼ遺伝子（NCBI Νο·2636181)、

などが知られている。

特許文献 1 :特開昭 63— 71183号公報

特許文献 2 :特許第 3062125号公報

特許文献 3 :特開平 9一 107981号公報

特許文献 4 :特許第 2539901号公報

非特許文献 1 :「ジーン（Gene)」、 1988年、 63卷、 65〜74頁

非特許文献 2 :「モレキュラージェネラルジェネティックス（Molecular General Gen etics)」、 1986年、 205卷、 42〜50頁

非特許文献 3 :「ザェンボジャーナル（The EMBO Journal)」 1987年、 6卷、 251 9〜2523頁

非特許文献 4 :「ジーン（Gene)」、 1991年、 104卷、 39〜45頁

発明の開示

[0005] 本発明の課題は、新規な除草剤耐性遺伝子を提供することであり、また該遺伝子でコードされるタンパク質を提供することにある。

[0006] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力した。そして後述される除草剤ホスフィノスリシン (PPT)に対する耐性遺伝子および該遺伝子が導入されて除草剤耐性が増強された形質転換体を構築することに成功した。すなわち、本発明の要旨とするところは、以下のとおりである。

(1)下記の（A)又は（B)のタンパク質。

(A)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。

(B)配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、除草剤耐性活性を有するタンパク質。

(2)下記の（A)又は（B)のタンパク質をコードする DNA。 (A)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。

(3)下記の（a)又は（b)の DNAである前記 DNA。

(a)配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 68〜592からなる DNA。

(b)配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 68〜592からなる DNAまたは同塩基配歹 IJから調製され得るプローブとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNA。

(4)前記 DNAを含む組換えベクター。

(5)前記 DNA、又は前記組換えベクターで形質転換された形質転換植物細胞。

(6)前記 DNA、又は前記組換えベクターで形質転換された形質転換植物。

(7)前記形質転換植物から得られる種子。

(8)前記 DNA、又は前記組換えベクターで形質転換され、前記 DNA又は組換えべクタ一に含まれる前記 DNAが発現することにより、除草剤耐性を示す除草剤耐性植物体。

図面の簡単な説明

[0007] [図 1]本発明の除草剤耐性遺伝子を内部に保有する DNA鎖を含有するストレプトミセス.エスピー AB3534株由来 5. 7kbBglII断片の制限酵素地図。

[図 2]本発明の除草剤耐性遺伝子が導入された組換えイネ植物体 (A)および対照の非組換え体「日本晴」植物体 (B)にパスタ（PPT18. 5%含有)液剤（バイエルクロップサイエンス社製）の 200倍希釈液 (雑草生育期処理濃度）を散布した 2力月後の生育状況を示す図（写真)。

発明を実施するための最良の形態

[0008] 以下に本発明を詳細に説明する。

本発明のタンパク質は、下記の（A)又は（B)のタンパク質である。

(A)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。

[0009] 配列番号 2に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、ストレプトミセス'エスピー. （ Streptomyces sp.) AB3534と命名された放線菌菌株から、除草剤耐性に関与する遺伝子として取得された遺伝子がコードするタンパク質である。

[0010] 一般に、特定の機能や生理活性を有するタンパクをコードするアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、揷入又は付加が生じた場合であっても、その機能や生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されてレ、るところである。本発明には、このような修飾が加えられ、かつ除草剤耐性活性を有するタンパク質も含まれる。すなわち、配列表の配列番号 2において、 1若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、揷入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ除草剤耐性活性を有するタンパク質も、本発明の範囲に含まれるものである。そのような改変されたタンパク質は、配列番号 2に示すアミノ酸配列をコードする DNAに、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されるように変異を導入することによって、取得することができる。

[0011] 前記「複数」としては、好ましくは 2〜25個、より好ましくは 2〜： 10個、特に好ましくは 2〜5個である。あるいは、前記「複数」は、配列番号 2のアミノ酸配列との相同性が、好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上となるような値である。

[0012] 本発明のタンパク質は、以下に説明する本発明の DNAを、適当な宿主で発現させることにより製造すること力 Sできる。前記宿主としては、大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母、昆虫培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞等が挙げられる。宿主細胞内で機能するプロモーター等の発現調節配列の下流に発現可能に連結された本発明のタンパク質をコードする本発明 DNAを、宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させる。このような形質転換は、本発明の DNAをプラスミドに連結して組換えプラスミドを構築し、そして、その得られた組換えプラスミドを宿主に導入することによって行うことができる。あるいは、相同組換え等によって本発明 DNAを宿主内の染色体 DNAに組込むことによって宿主を形質転換することもできる。得られる形質転換細胞を、前記プロモーター発現調節配列が機能する条件で培養することによって、本発明のタンパク質が産生される。

[0013] 本発明の DNAは、前記本発明のタンパク質 (A)又は（B)をコードする DNAである。タンパク質 (A)をコードする DNAとして、配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 68〜592からなる DNAが挙げられる。

[0014] また、タンパク質（B)をコードする DNAとしては、配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 68〜592からなる DNAまたは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAが挙げられる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイプリッドが形成されない条件をいう。具体的に、相同性が高レ、 2つの核酸同志、例えば 70 Q/o以上、好ましくは 80。/o、より好ましくは 90°/ο、特に好ましくは 95%以上の相同性を有する 2つの DNA同志がハイブリダィズする力 S、それより相同性の低い 2つの核酸同志がハイブリダィズしないという条件が挙げられる。より具体的には、例えば 68°Cのハイブリダィゼーシヨン溶液（500mM NaPiバッファー（ρΗ7· 2)、 7% SDS、 ImM EDTA)中において、核酸同士がハイブリダィズする条件が挙げられる。

[0015] 上記ような、タンパク質（B)をコードする DNAは、タンパク質 (A)をコードする DNA またはこれを含有する細胞に対して変異処理を行い、その後に、変異した DNAまたはこれを含む細胞から、例えば配列表の配列番号 1に記載の塩基番号 68〜592塩基配列を有する DNAに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA を選択的に分離することによつても、取得することができる。

[0016] タンパク質 (A)をコードする DNAは、本発明を完成する過程においては、後記実施例に示すように、ビアラホスを含む選択培地に放線菌を接種し、生育可能な菌株として選択されたストレプトミセス属に属する菌株から単離されたものである。尚、ビアラホスは、細胞内に取り込まれた後、加水分解を受け活性体 PPTに変換される。上記菌株は、ストレプトミセス'エスピー. （Streptomyces sp.) AB3534と命名され、 2004 年 10月 26日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM P— 20273として寄託され、 2005年 10月 5日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP— 10430が付与されている。

[0017] タンパク質（A)をコードする DNAは、上記ストレプトミセス'エスピー. AB3534株又は同株と近縁の放線菌の染色体 DNAから、配列番号 1に示す塩基配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプライマー又はプローブとする PCR又はハイブリダィゼーシヨンによって、単離することができる。

[0018] 本発明の DNAを保持する大腸菌の形質転換株は、非形質転換株が生育できない濃度のビアラホスを含む培地で生育することができる。

[0019] タンパク質（A)をコードする DNAを含むプラスミド pUC18_B2で形質転換されたェシエリヒア'コリ JM109は、ェシエリヒア'コリ JM109/pUC18— B2と命名され、 200 4年 10月 26日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM P— 20272として寄託され、 2005年 10月 5日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号 FERM BP— 10429が付与されている。

[0020] 本発明の DNA又はこれを含む組換えベクターを、本発明の DNAが発現可能な形態で植物細胞に導入することにより、同植物細胞又はこの細胞から再生させた植物体に除草剤に対する耐性を付与することができる。

[0021] 植物細胞への本発明の DNAの導入は、既に確立されている公知の方法（「細胞ェ学別冊、モデル実験のプロトコール、イネ'シロイヌナズナ編」 1996年、 78〜81頁、秀潤社発行）により行うことができ、例えばァグロバタテリゥム法、ウイスカ導入法、ェレクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン法が挙げられる。

[0022] また、本発明の DNAを植物細胞内で発現させるためのプロモーターとしては、植物細胞において発現するものであればよぐュビキチンプロモーター（「プラントモレキユラバイオロジー（Plant Molecular Biology)」 1992年、第 18卷、 675〜689)、 Ca MV35Sプロモーター（「ザェンボジャーナル（The EMBO J. )」、第 6卷、 3901 〜3907頁、（1987年））などが挙げられる。また、植物細胞内で機能するプロモータ一を含むプラスミドとしてば、例えば pUBA (「プラントモレキユラバイオロジー（Plant Molecular Biology)」 1992年、 18卷、 675〜689)や pIG121Hm (「プラントセルフィジオロジー（Plant Cell Phisiology)」 1990年、第 31卷、 805〜813)等が知られている。本発明の DNAを発現させるためのプロモーターは、構成的なプロモーターであってもよく、誘導可能なプロモーターであってもよい。

[0023] なお、本発明が適用できる植物として、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、ォォムギ、芝草、その他の単子葉植物、または、ダイズ、ヮタ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ハクサイ、キユウリなどの双子葉植物が挙げられる力これらに限定されるものではなレ、。植物細胞から植物体への再生は、公知の方法によって行うことができる（「プラントジャーナル（Plant Journal)」1994年、第 6卷、 271 〜282)。

[0024] 遺伝子導入後の細胞を、ビアラホスまたは PPTを含んだ培地上で一定期間培養することにより、形質転換細胞のみを選抜することが可能である。また、選抜された細胞からは、ビアラホスまたは PPTを含んだ培地上で一定期間培養することにより、除草剤耐性を有する植物体を再生させることが可能である。

[0025] 上記のように得られる本発明の DNAを保持する植物体から種子を採取することにより、本発明の DNAを保持する植物種子が得られる。

実施例

[0026] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

〔実施例 1〕除草剤耐性遺伝子のクローニング

(1)除草剤耐性菌のスクリーニング

ビアラホスを添加した選択培地に、出願人が保存する放線菌約 500株を接種し、 2 7°Cで 7日間培養した後、各菌の生育状態を調査した。前記選択培地は、グルコース 1 %、 L—ァスノラギン 0. 2%、 NaCl 0. 03%、 MgSO · 7Η Ο 0. 05%、微量元素溶液 0. 5% (V/V) (水 1L中に ZnCl 40mg、 FeCl · 6Η Ο 200mg、 CuCl · 2

Η〇 20mg、 MnCl ·4Η〇 20mg、 (ΝΗ ) Mo〇 ·4Η Ο 20mg、 CoCl · 6Η Ο

20mg、 CaCl · 2Η Ο lOOmgを含む）、バタトァガー 1. 8%からなる組成の培地に、ビアラホスを 50mg/lになるように加えた培地 20mlを、直径 9cmのプラスチックシャーレに入れ、固化させた寒天培地である。

[0027] その結果、選択培地上で生育の可能な菌株として AB3534株を選別した。本スクリ一二ングにより得られた AB3534株の分類学的性質は下記のとおりである。なお、実験方法は「放線菌の分類と同定」（日本学会事務センター、 2001年）に従った。

[0028] (a)菌体分析

全菌体加水分解物中のジアミノピメリン酸は LL型であった。

[0029] (b) 16SrRNA遺伝子解析

16Sリボゾーム RNAの塩基配列の相同性は、配列番号 3に示す配列を有するプライマーを用いて、 586塩基の配列を決定し、 DNAデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。この結果、本菌株の塩基配列は以下に示したとおりストレプトミセス属放線菌の 16SrRNAと高レ、相同性を示した。

[0030] [表 1]

表 1 菌株 16S rRNA配列

の相同性 0 ス卜レフ。トミセス'才リホ 'クロモケ'ネス（S. o l ivochromogenes) 99. 5

ストレトミセス 'ク'リセォク□モケ'ネス (S. gr i seochromogenes) 99. 3%

ストレフ。トミセス'力'リラェウス（S. gal i l aeus) 99. 3¾

ストレフ。トミセス'レシ'ス卜ミシフィカス（S. res i s tomyc i f i cus) 99. 3¾

ストレアトミセス'チャルトレゥシス（S. char t reuses) 99. 3%

[0031] 以上の結果から、本菌株は、放線菌ストレブトミセス属に属するー菌株と同定した。

この放線菌 AB3534株は、ストレプトミセス'エスピー.（Str印 tomyces sp.)AB3534と命名した。

[0032] (2)ハイブリッドプラスミドの作製

ストレプトミセス'エスピー AB3534を、 TRYPTIC SOY BROTH (DIFCO社製 ) 100mlを分注した 500ml容坂ロフラスコにて 27°Cで 3日間培養した。培養液を 60 00回転/分で、 15分間遠心分離して菌体を集めた後、凍結乾燥し乳鉢で粉砕した。粉砕した菌体から、 DNeasy Plant Maxi Kit (QIAGEN社製）にて全 DNAを抽出した。このようにして得た DNA5 gを制限酵素 Bglll 20単位で 37°Cで 2時間処理して DNAフラグメントを得た。一方、ストレプトミセス'リビダンス 3131 (ATCC352 87)の菌体より抽出精製したプラスミド PU703の DNA1 μ gを、同様に Bglllで切断した。この両者のフラグメントを、ジーンクリーン（BiolOl社製）にて精製した後、 Takar a Ligation kit (Takara社製）を用いて、 16°Cで 3時間反応させた。このようにしてプラスミド PU703の Bglll切断 DNAフラグメントに、ストレプトミセス'エスピー AB353 4の全 DNAの Bglll切断フラグメントを組み込んだ各種のハイブリッドプラスミドの混合物を得た。

[0033] (3)除草剤耐性遺伝子の検出とクローニング

上記のようにして得たハイブリッドプラスミド混合物を用レ、、ストレプトミセス'リビダンスのプロトプラストを形質転換した。プロトプラストを再生後、ビアラホス 10mg/Lを添加した選択培地上で、ビアラホス耐性となった形質転換株を選別した。なお、宿主として用いたストレプトミセス'リビダンスは、ストレプトミセス'リビダンス 3131力、ら、プロトプラス H匕及び再生によりプラスミド PU703を除去した菌株である。ストレプトミセス'リビダンス 3131は、昭和 60年に国立予防衛生研究所抗生物質部より入手したものである（「ザジャーナノレォブアンチバイオテイクス（The Journal of Antibiotics )」1985年、第 38卷、 390〜400頁）。

[0034] 形質転換に用いたストレプトミセス'リビダンスの上記プロトプラストの調製は、下記の通り行った。ストレプトミセス'リビダンスを、グルコース 1%、ポリペプトン（DIFCO 社製） 0. 4%、イーストエキストラタト（DIFCO社製） 0. 4%、 MgSO · 7Η Ο 0. 05

%、Κ ΗΡΟ 0. 1%、グリシン 0· 05%よりなる組成の培地 25mlに接種し、長さ 1 · 5 cm、直径 lcmのステンレス製スプリングとともに 100ml容の坂口フラスコに入れて、 2 7°Cで 2日間培養した。この培養液 2mlを、グルコース 1%、イーストエキストラクト（DI FCO社製） 0. 3%、バクトペプトン（DIFCO社製） 0· 5%、マルトエキストラタト（DIF CO社製） 0. 3%、ショ糖 34%、 MgCl · 6Η〇 0. 1%、グリシン 0. 5%よりなる組成の培地 100mlの入った 500ml容坂ロフラスコに加え、さらに 27°Cで 2日間培養した。その培養液 5mはり 8000回転 Z分で 10分間遠心分離して菌体を集め、 0. 5M ショ糖溶液で洗浄した後、 70mM NaCl、 5mM MgCl、 5mM CaCl、 0. 4Mショ糖、 25mM Good'TESバッファー（pH7. 2)よりなる組成の緩衝液 4mlに懸濁した

[0035] 上記細胞懸濁液に、 40mgZml卵白リゾチーム溶液を 100 μ 1加え、 30°Cで 90分間保温してプロトプラストを得た。プロトプラスト化しない菌体を綿ろ過で除き、 3500 回転/分、 10分間の遠心分離により、プロトプラストを集めた。集めたプロトプラストを 70mM NaCl、 10mM MgCl、 20mM CaCl、 0. 4Mショ糖、 25mM Good' TE

Sバッファー（pH7. 2)よりなる組成の緩衝液（PWP緩衝液）で 1回洗浄後、同緩衝液に約 1 X 10⁹個/ mlとなるように懸濁した。

[0036] 上記のプロトプラスト懸濁液 250 a 1に、前記（1)項で得たハイブリッドプラスミド混合物の溶液 50 μ 1と 40%ポリエチレングリコーノレ 4000 (和光純薬社製）溶液 300 μ 1を加えて、氷中で 2分間放置した後、前記の PWP緩衝液を 900 μ 1を加えてポリエチレングリコールの濃度を下げた。この混合液を、直径 9cmのプラスチックシャーレに分注し固化させた寒天培地（グルコース 1%、 KC1 0. 05%、 K HPO 0. 01 %、 MgC

1 · 6Η〇 0. 2%、 CaCl · 2Η O 0. 07%、ポリペプトン（DIFCO社製） 0. 1 %、ィーストエキストラタト（DIFCO社製） 0. 4%、微量元素溶液 0. 05% (VZV)、 25mM Good' TESバッファー（pH7. 2)、バタトァガー（DIFCO社製）） 1. 8%に、 150 μ ΐ ずつ塗布して、 27°Cで 10日間培養し、プロトプラストの再生および気中菌糸の形成を行った。なお上記微量元素溶液は、水 1L中に ZnCl 40mg、 FeCl · 6Η Ο 200 mg、 CuCl · 2Η Ο 20mg、 MnCl ·4Η〇 20mg、（ΝΗ ) Mo〇 ·4Η〇 20mg、

CoCl · 6Η〇 20mg、 CaCl · 2Η〇 lOOmgを含む水溶液である。

[0037] 再生した菌層を、グルコース 1 %、 L—ァスパラギン 0· 2%、 NaCl 0. 03%、 MgS Ο · 7Η O 0. 05%、 Κ HPO 0. 05%および上記微量元素溶液 0. 5% (V/V)、バタトァガー 1 · 8%よりなる組成物にチォストレプトンおよびビアラホスをともに 10mg /Lになるように加えて調製した選択培地にレプリカし、 27°C、 3日間培養を行い、生育のょレ、クローンの 2株を選択した。

[0038] 得られた 2株のビアラホス耐性株より、公知の方法（「カレントトピックスインマイクロノくィォロジ一アンドィムノロジー (CurrentTopics in Microbiology and Immunology)」1982年、 96卷、 69頁）にならつてプラスミドを抽出した。その結果、この 2株は、同じ分子量約 11. 4kbのプラスミドを保持していた。これら 2株由来のプラスミドを、夫々に制限酵素 Bglllで切断しァガロース電気泳動で分析した結果、どちらもベクターに用いた PU703の DNA断片に加えて、約 5. 7kbの DNA断片が検出された。さらに、前記 2株より得た夫々のプラスミドを他の制限酵素（Sacl、 EcoRI、 S malなど）で切断した時に生じる断片の大きさがいずれも同一であったことから、この 2つのプラスミドは同一のプラスミドであることが判明し、プラスミド pBRBlと命名した。このハイブリッドプラスミド pBRBlを用いて、これを再度ストレプトミセス'リビダンスに導入した結果、形質転換株は全てビアラホス耐性を示した。この事実は、ハイブリッドプラスミド pBRBl内のストレプトミセス'エスピー AB3534由来の分子量約 5. 7kbの DNA鎖には、除草剤耐性遺伝子がコードされていることを示す。

[0039] (4)除草剤耐性遺伝子のコード領域の判定

上記のようにして得られた除草剤耐性をになう遺伝子のコード領域は、図 1の EcoR I— Bglllフラグメント中に位置する。このことは、プラスミド pBRBlから作製された欠失プラスミドのビアラホス耐性を調查することにより確認された。すなわち、約 5. 7kb DNA断片中、約 1. 2kbの EcoRI、 Bglllフラグメントを保持したプラスミドのみ力ビァラホス耐性を示すことで確認された。さらに詳細な遺伝子の存在位置を確認するため、大腸菌の形質転換系を用いて試験を行った。

[0040] ビアラホス耐性遺伝子の存在が確認された約 1. 2kbEcoRI— Bglll断片を市販のプラスミドベクタ一 PUC18の EcoRI— BamHIサイトに連結し、得られたプラスミドを大腸菌に導入することにより、形質転換大腸菌株はビアラホス耐性を示す。約 1. 2k bEcoRI、 Bglll断片内に存在する Smalサイトを用いて、欠失プラスミドを作製し、大腸菌の形質転換を行った結果、本願の除草剤耐性遺伝子は約 0. 6kbの EcoRI— S mal断片上に存在することが確認された。すなわち、ハイブリッドプラスミド pBRBlの 2 /i gを制限酵素 EcoRI、 Bglllの 20単位ずつで 37°C、 2時間切断した後、ァガロース電気泳動を行い、 1. 2kbの断片のみを切り出し、ジーンクリーンにより精製した。一方 PUC18プラスミドを EcoRI、 BamHI 20単位ずつで 37°C、 2時間切断した後、ジーンクリーン（BiolOl社製）により精製した。夫々の DNAフラグメントを、 Takara Ligation kitにて、 16。C、 3時間反応させた。このようにしてプラスミド pUC18の E coRI、 BamHI切断 DNAフラグメントに、 pBRBl由来の約 1. 2kbEcoRI、 Bglll切断フラグメントを組み込んだプラスミド溶液を得た。この溶液を、コンビテントセル JM1 09 (Takara社製）に導入した。すなわち、コンビテントセル溶液 60 μ 1にライゲーション反応溶液を 5 μ ΐ加え、 0°C 30分後、 42°C 45秒、 0°C 2分の処理を行い、これに S OC溶液 500 μ 1をカロえて、 36°Cで 1時間回復培養させ、これを、寒天培地（LB培地、 1. 5%寒天、アンピシリン 100mg/L)に広げて 36°Cで培養した。 16時間後、形成したコロニーを個別に分離し、培養を行い、目的遺伝子の挿入されたプラスミドを有する菌株を単離した。こうして、プラスミド pUC18に pBRBl由来の約 1. 2kbEcoRI、 Bglll切断フラグメントをクローニングしたベクター（pUC18_Bl)を形質転換した大腸菌を得た。

[0041] pUC18 _Blで形質転換された大腸菌は、 ImMチォガラタトピラノシド（IPTG)、 1 Omg/Lビアラホスをともに含む M9寒天培地（GIBCO BRL社製）上で生育が認められた。さらに、詳細な遺伝子の位置を確認するため、約 1. 2kbEcoRI、 Bglll切断フラグメントを保持する PUC18— B1の種々の欠失プラスミドを形質転換した大腸菌のビアラホス耐性の調査から、本願の除草剤耐性遺伝子は約 0. 6kb EcoRI-Sm al断片を保持した pUC18_B2プラスミド上に存在することが確認された。すなわち、プラスミド PUC18— B1を制限酵素 EcoRI、 Smal 20単位ずつで 37°C、 2時間切断した後、ァガロース電気泳動を行レ、、 0. 6kbの断片のみを切り出し、ジーンクリーンにより精製した。一方 pUC18プラスミド 2 /i gを EcoRI、 Smal 20単位ずつで 37°C、 2時間切断した後、ジーンクリーン (BiolOl社製）により精製した。夫々の DNAフラグメントを、 Takara Ligation kitにて、 16°C、 3時間反応させた。このようにしてプラスミド PUC18の EcoRI、 Smal切断 DNAフラグメントに、 pBRBl由来の約 0. 6kb EcoRI、 Smal切断フラグメントを組み込んだプラスミド pUCl 8— B2溶液を得た。 pU C18— B2形質転換大腸菌は、 ImMチォガラタトピラノシド（IPTG)、 10mg/Lビアラホスをともに含む M9寒天培地（GIBCO BRL社製）上で生育が認められた。この約 0. 6kbの DNA断片の塩基配列を解読した結果、約 0. 6kbの DNA断片中に、配列番号 2に記載の 174残基のタンパク質をコードする配列番号 1で表される塩基配列が確認された。塩基配列の決定は DNAシークェンス受託サービス（北海道システムサイエンス (株)）を利用して行った。

[0042] (5)耐性機序の確認

本発明の除草剤耐性遺伝子を保持する PUC18— B2により形質転換された大腸菌を LB培地 50ml、アンピシリン 50mg/Lの液体培地に移植し、 37°Cで 1時間培養し、この培養液に 1Mチォガラタトピラノシド溶液を 50 μ ΐ加え、さらに 37°Cで 3時間培養した。培養終了後、 5000回転/分、 15分の遠心分離により、菌体を集め、これを生理食塩水で 1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を 20mM Trisバッファー（ρΗ8· 0)溶液 2mlに懸濁し 4°Cで超音波により菌を破砕した。この溶液を 15000回転 Z分、 15 分の遠心分離により上清を回収した。これを、 20mM Trisバッファー（pH8. 0)にて 10倍濃度に希釈して、粗酵素液とした。粗酵素液 2 を反応溶液 98 に加え、 28 °Cで 1時間反応後、 412nmの吸光度を測定し、ァセチル化反応を測定した。補酵素ァセチル CoAの存在下で PPTと反応させることにより、本発明の除草剤耐性遺伝子は PPTをァセチル化する酵素をコードしていることが確認された。なお上記のァセチノレ化反応溶液の組成は、 2mM DL—ホスフィノスリシン、 0. 2mM AcetylCoenzy meA (Sigma社製）、 0. 2mM 5, 5' _ジチォビス（2_ニトロ安息香酸）（和光純薬社製）、 lOOmM Trisバッファー（pH8. 0)から成る。

[0043] 本発明の PPTのァセチル化酵素の特性を解析するとともに、公知のストレプトミセス

'ハイグロスコピカス (Streptomyces hygroscopicus) (「サェンボジャーナル (The E MBO Journal)」1987年、第 6卷、 2519〜2523頁）、および放線菌 AB2253株（特許第 2539901号）由来の PPTのァセチル化酵素遺伝子と比較した。ストレプトミセス •ハイグロスコピカスおよび放線菌 AB2253株由来のァセチルイ匕酵素遺伝子は、両菌株から実施例 1 (2)に記載の方法により抽出した全 DNAを用いて公知の方法により単離した。

[0044] こうして得られた、それぞれの PPTァセチルイ匕酵素遺伝子を含む、本実施例の pU C18— B2、ストレプトミセス'ノヽィグロスコビカス由来 pUC19— SH、放 ,線菌 AB2253 株由来 PUC19—ABで形質転換した大腸菌より上記の手法により粗酵素液を抽出し、ァセチル化反応特性を解析した。至適 pH、 PPTおよびその構造類似体であるメチォニンスルホン (MS)に対する基質特異性 (Km値)を測定した結果を表 2に示す。この 3菌株由来の酵素は、いずれも PPTァセチル化酵素活性を保持するが、至適 pH および基質特異性が明らかに異なることから、本発明のァセチルイヒ酵素遺伝子は新規な酵素遺伝子であることが確認された。

[0045] [表 2] 表 2

Km値 (mM) ta株ベクター至適 pH

PPT MS ストレフ。トミセス'エスピ - PUC18-B2 7·5〜8.5 2.46 12.98 AB3534株（本発明区）ストレフ。トミセス'ハイク'ロスコピカス PUC19-SH 6.5 0.09 106.48

(比較区）放線菌 AB2253株 PUC19-AB 8.0〜8.5 14.31 2.20

(比較区）

[0046] 〔実施例 2〕除草剤耐性遺伝子の植物細胞への導入

(1)植物遺伝子導入用ベクターの構築

ストレプトミセス 'エスピー AB3534株由来除草剤耐性遺伝子を植物細胞内で発現させるために、配列番号 4及び 5の配列を有するプライマーを用いて、 PCR反応を行レ、、除草剤耐性遺伝子を増幅した。反応液組成は Takara ExTaq Buffer X10倍液 5 μ 1、 dNTP mixture 4μ1_Λ铸型 DNA 30ng、 ΙΟμΜ プライマー溶液各 1 μ 1, Takara ExTaq 0. 5 μ 1に、 50 μ 1になるように水を力！]え、調製した。反応条件は、 94°C30秒、 60。C30秒、 72°C45秒を、 35サイクル行った。

[0047] 反応後、ジーンクリーンで PCR断片を精製した。この PCR断片と植物細胞形質転換用ベクター PBI221 (Clontech社製）の 0. 5 μ g夫々に、制限酵素 Xbalと Saclを各 0. 5 l、T bufferXlO倍 ί夜 2 1をカロえ、全量 20 μ 1になるように水をカロえ、 36 °Cで 16時間反応させた。制限酵素反応後、ジーンクリーンで DNA断片を単離し、これらをライゲーシヨンさせた。すなわち、 DNA断片溶液 10 μΐに Takara Ligation k it— I溶液を 10 μΐ加え、 16°C、 1時間反応させた。この溶液を、コンビテントセル (Ta kara社製 DH5 a )に導入した。すなわち、コンビテントセル溶液 60 μ 1にライゲーション反応溶液を 5 1加え、 0°C 30分後、 42°C 45秒、 0°C 2分の処理を行い、これに S OC溶液 500μ1をカ卩えて、 37°Cで 1時間回復培養させ、これを、寒天培地（LB培地、寒天 1. 5%、アンピシリン 100mg/L)に広げて 37°Cで培養した。 16時間後、形成したコロニーを個別に分離し、培養を行い、目的遺伝子の挿入されたプラスミドを有する菌株を単離した。このようにしてプラスミドベクター pBI221の切断断片に前記のストレプトミセス'エスピー AB3534由来除草剤耐性遺伝子を連結してなる環状の組換えベクターを作製した。この組換えベクターを p35SHPATと称する。

ベクター P35SHPATは、 CaMV35Sプロモーターの下流に、本発明の除草剤而ォ性遺伝子を持ち、さらに下流に N〇Sターミネータ一が連結されてなる、約 4. 2kbpのサイズを有する。

[0048] (2)イネのカルス細胞への組換えベクターの導入

上記で得られた組換えベクター P35SHPATをイネのカルス細胞へ導入を行った（特許第 3312867号参照）。

[0049] まず、イネ（品種：日本晴）の完熟種子から籾殻を取り除いた。得られた種子を 70% エタノール溶液に 1分間、次いで次亜塩素酸ナトリウム 1 % (有効塩素濃度）溶液に 6 0分間浸漬して種子を殺菌処理した。公知の MS培地の無機成分組成にショ糖 30g / 植物ホルモンとして 2, 4— D2mg/L、寒天 8g/Lを添加してなる培地に、上記で殺菌したイネ種子を置床した。 28°Cで 45日間、 2000ルックスの光を 1日あたり 1 6時間照明しながらインキュベートした。カルスが形成された後、それらカルスを胚乳部分から切り出し、孔 lmmのステンレスメッシュの篩を用いて、 1mm以下のカルスを PCV (Packed Cell Volume；圧縮細胞量）として 3mlの量を得た。

[0050] チタン酸カリウム製ゥイス力 LS20 (チタン工業社製） 5mgを 1. 5ml容のチューブに入れ、エタノールを lmlカ卩ぇ 1時間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカを得た。このウイス力の入ったチューブに滅菌水 lmlを入れ、良く攪拌した。ゥイス力と滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてゥイス力を洗浄した。このウイスカ洗浄操作を 3回行った。その後、同チューブに公知の R2液体培地の 0. 5mlを加えてウイスカ懸濁液を得た。

[0051] 上記で得られたウイスカ懸濁液の入ったチューブに lmm以下のイネのカルスを 25 Ο μ ΐ入れて攪拌した後、混合物を lOOOrpmで 10秒間遠心分離し、カルスとウイスカを沈殿させ、上清を捨て、カルスとゥイス力の混合物を得た。

[0052] この混合物を入れたチューブに、前記の組換えベクター p35SHPATの ΙΟ μ ΚΐΟ / g)をカ卩え、十分振り混ぜて均一な混合物を得た。

[0053] 次に、この均一な混合物の入ったチューブを 18000xgで 5分間遠心分離した。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を 3回反復した。

[0054] 上記のようにして得られた、カルス細胞と、ゥイス力と、本発明 DNA配列を有する組換えベクターを収容しているチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸るように設置した。周波数 40kHzの超音波を強度 0. 25w/cm²で 1分間照射した。照射後、 10分間、 4°Cでこの混合物を保持した。このように超音波処理した混合物を前記の R2液体培地で洗浄し、組換えベクター p35SHPATを導入した目的の形質転換細胞を得た。

[0055] 上記で組換えベクターを導入して得た形質転換細胞を有するカルスを、 3. 5cmシヤーレに入れた。さらに、 R2培地の無機成分組成にショ糖 30g/L、 2, 4-D 2mg /Lを添加して得た液体培地を 3ml加えた。その後に、 28°Cで 2000ルックスの光を 1日当たり 16時間照射しながらロータリーシェーカー（50rpm)上でカルス細胞を培養しながら分裂細胞を得た。

[0056] 培養 3日目に、得られた分裂細胞の懸濁液 3mlを、公知の N6培地の無機成分組成に、ショ糖 30g/L、 2, 4-D 2mg/L、ゲルライト 3g/Lおよび選抜用薬剤としてビアラホス 3mg/Lを添加してなる培地上に均一に広げた。培地上の細胞を、 28°C で 2000ルックスの光を 1日あたり 16時間照射しながら 1ヶ月間培養した。

[0057] 1ヶ月後に、ビアラホス含有培地上で健全に生育している形質転換カルスを選抜し、組換えベクター p35SHPATが形質転換されてレ、るイネのカルス細胞を得た。

[0058] (3)形質転換イネカルス細胞からの植物体の再生

上記で得られたビアラホス耐性である形質転換培養細胞を、 MS培地の無機成分組成にショ糖 30gZL、ベンジルアデニン 2mgZL、ナフタレン酢酸 lmgZL、ゲルライト 3g/L、ビアラホス 3mg/Lを添加してなる培地上に移殖した。 28。Cで 2000ノレツタスの光を 1日当たり 16時間照射しながら培養した。 30日後に形成された再生植物体 (幼芽）を、ショ糖 30g/L、ゲルライト 3g/Lを含む MS培地を入れた試験管に移殖した。移殖された幼芽を 20日間培養して形質転換イネ植物体を得た。こうして、ィネのカルス 3mlから合計 17個体の形質転換体が作製された。 17個体のイネ植物体力公知の方法（「細胞工学別冊植物の PCR実験プロトコール」 1995年、 30〜33 頁、秀潤社発行）によりゲノム DNAを抽出し、前記（1)の条件で PCRを行った結果、いずれの個体においても除草剤耐性遺伝子由来の約 0. 6kbのバンドの増幅が見られ、本発明の除草剤耐性遺伝子の存在が確認された。

[0059] (4)形質転換植物体の除草剤耐性の評価

本発明の除草剤耐性遺伝子が導入された植物体における除草剤耐性を評価するため、市販の PPTを主成分とした除草剤（商品名：パスタ PPT18. 5%含有液剤（バィエルクロップサイエンス社製））を所定濃度（200倍希釈、 PPT 0. 0925%)散布処理し、生育状況を観察した。前記によって得られた組換えイネ植物体を閉鎖系温室内で 2週間順化、栽培後、非閉鎖系温室に移し、草丈約 25cmまで育成を継続した。こうして育成した組換えイネ植物体と、対照として同一生育ステージの「日本晴」植物体に、前記除草剤の 200倍希釈液 (雑草生育期処理濃度）をそれぞれ散布した。散布 1日後以降、対照である「日本晴」は葉の緑色の退色が進行し、 1週間後には完全に枯死したのに対し、本発明の除草剤耐性遺伝子組換えイネ植物体は健全な生育を示した。除草剤散布後の植物体の葉枯れの程度（全ての葉に対して緑色の退色した葉の占める面積率（％) )を表 3に示す。また、組換えイネ植物体は散布 2力月後に正常に出穂、開花、結実が見られた（図 2)。

[0060] [表 3]

表 3

1日後 3日後 5日後 7日後組換え体 0 0 0 0 '

(本発明区）非組換え体 5 30 70 100

(対照区）表内の数値は、緑色の退色した葉の占める面積率（％) を表す。産業上の利用の可能性

本発明の除草剤耐性遺伝子は、除草剤耐性植物体の作製に利用できる。本発明の除草剤耐性遺伝子を植物に遺伝子導入することにより、除草剤に対する耐性が増強された除草剤耐性植物が提供される。

Claims

請求の範囲

[1] 下記の（A)又は（B)のタンパク質。

(A)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。

(B)配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、揷入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、除草剤耐性活性を有するタンパク質。

[2] 下記の（A)又は（B)のタンパク質をコードする DNA。

(A)配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。

[3] 下記の（a)又は（b)の DNAである請求項 2に記載の DNA。

(b)配列番号 1に記載の塩基配列のうち、塩基番号 68〜592からなる DNAまたは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA。

[4] 請求項 2又は 3に記載の DNAを含む組換えベクター。

[5] 請求項 2又は 3に記載の DNA、又は請求項 4に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換植物細胞。

[6] 請求項 2又は 3に記載の DNA、又は請求項 4に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換植物。

[7] 請求項 6に記載の形質転換植物から得られる種子。

[8] 請求項 2又は 3に記載の DNA、又は請求項 4に記載の組換えベクターで形質転換され、前記 DNA又は組換えベクターに含まれる前記 DNAが発現することにより、除草剤耐性を示す除草剤耐性植物体。