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WO2005073733A1 - Método para la autoejecución del grupo sanguíneo abo - Google Patents

Método para la autoejecución del grupo sanguíneo abo Download PDF

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WO2005073733A1
WO2005073733A1 PCT/ES2004/000387 ES2004000387W WO2005073733A1 WO 2005073733 A1 WO2005073733 A1 WO 2005073733A1 ES 2004000387 W ES2004000387 W ES 2004000387W WO 2005073733 A1 WO2005073733 A1 WO 2005073733A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substances
group
abo
detection
antibody
Prior art date
Application number
PCT/ES2004/000387
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eduardo Cadorniga Martinez
Original Assignee
Eduardo Cadorniga Martinez
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eduardo Cadorniga Martinez filed Critical Eduardo Cadorniga Martinez
Publication of WO2005073733A1 publication Critical patent/WO2005073733A1/es

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/80—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood groups or blood types or red blood cells

Definitions

  • This invention relates to methods and devices for the detection of antigenic determinants and antibodies of ABO groups by means of immunocard assays, in a manner
  • the antigenic determinants of the guiding groups present in the Red Blood Cells are 5 glycoproteins or glycolipids.
  • the main ' systems soü ' ABO, D (? Rl ⁇ ), Léwis, Kidd ,. Kel ⁇ , etc.
  • the serum, of most people, contains antibodies, also called aggluti ⁇ as, in the case of the ABO group * that react with antigens of - a group other than yours.
  • people in group O have the H antigen and have anti-A and anti-B antibodies; Blood type A individuals have anti-B in their serum, etc. 0 Blood group substances differ in sugar residues.
  • H a ⁇ tigens are built on ends of precursor oligasaccharide chains. called Type 1 and Type 2.
  • the gene H produces a fucosyltransferase that adds phyllose to the terminal Gal of the chains " type 2 through an alpha bond (1-2).
  • the genes A and B produce glycosyltransferase enzymes5 that add sugars to the chains. of oligosaccharides of the H antigen.
  • the N-acetylgalactosaminotransferase encoded by gene A and the galactosaminotransferase specified by gene B add GalNAc and Gal respectively to the same Gal residue on which the transferase of gene H? by an alpha link (1-3).
  • the determination of the ABO group by conventional methods comprises agglutination and cell lysis assays. Agglutination occurs by adding the antibodies of the groups, anti-A or anti-B, to the red blood cells in the sample, which is the direct method; or adding serum or plasma from the sample to known red blood cells: reverse method. Agglutination can be reinforced by gentle centrifugation, adding bovine albumin, polyvinylpyrrolidone, etc.
  • IgM antibodies are large enough to overcome the repulsive forces of red blood cells and spread between them. These agglutinations can occur in tubes, glass plates, cards with waterproof surfaces, etc.
  • card methods where the serum with the antibodies is dried on water-proof plasticized nitrocellulose and the serum is reconstituted with distilled water. Lysis is produced by adding the antibody and complement to the blood sample. The complement fixed in the membrane results in the rupture of the cell membrane. The evaluation of these trials requires the subjective judgment of experienced personnel to distinguish the agglutination of nonspecific aggregations that cause cluster formation. Therefore, an interpretation, reading and final recording of the results is necessary. This method is also based on a card immunoassay. In 1977 Horrisberger and Rosset (J.
  • BACKGROUNDs are based on the interaction between reagents and specific substances with immunological affinity, such as AG / AC, biotin / avidin, etc.
  • the target substance of the sample binds to a specific receptor that can be an antigen or an antibody forming an antigen-antibody complex, which in turn binds to another reagent, taking advantage of the bivalence of IgG molecules that allows it to react by binding site with the antigen in solution and on the other with the antigen fixed in the membrane or porous substrate.
  • the detector reagent is conjugated with a tracer, generally colloidal gold, either directly or through protein A which has the advantage of establishing a firm bond with the IgG immunoglobulin .
  • This receptor reagent is absorbed in a redisolvable form in the membrane in the reaction field or area near the sample window. Alternatively it can be added to the reaction.
  • the complex Antigen-antibody migrates to the solid phase or membrane area intended to visualize the result where another antibody, immobilized to a different epitope, that captures the complex is immobilized.
  • the target substance is an antigen
  • two types of antibodies are usually used: a) an affinity purified monoclonal or polyclonal antibody conjugated to the tracer, which is redisolvable in the reaction field or liquid phase. It can also be arranged by coating balls of inert material or added to the reaction; b) the other preferably monoclonal antibody, directed to a different epitope, immobilized in another zone or solid phase, will capture and precipitate the previous antigen / antibody complex.
  • the target is an antibody
  • an antibody capable of recognizing immunoglobulin is sensitized with colloidal gold. The complex is captured in the visible reactive zone by a reagent that is usually the antigen.
  • sandwich-type assay the roles between antigen and antibody can be reversed, so that to detect an antibody an antigen can be immobilized.
  • An antibody can also be detected using an anti-human antibody conjugated to colloidal gold through Protein A as an indicator reagent.
  • competitive assay in which a reagent with a comparable affinity for the membrane immobilized antibody is immobilized on the membrane.
  • the sample substance and the conjugated auxiliary antigen compete for antibody binding sites. If there is no antigen in the sample the labeled antigen is added in the reaction; In this case the presence of color means negative result. If there is an antigen, color does not develop because the sites are already occupied by the sample antigen.
  • the signal is inversely proportional to the amount of antigen.
  • the reaction color can be increased with co-enhancing solutions or an equal mixture of a solution of hydroquinone and silver nitrate. About 20 uL of this mixture is added to the final stage. The reaction is stopped by washing with distilled water.
  • immunoassays that reinforce the reaction by binding to enzymes or substances such as biotin that will bind tightly with streptavidin.
  • streptavidin can be coupled to latex particles. You can also use colored latex particles.
  • These immunoassays may also contain a second or third complex without relation to the previous one.
  • the first and second zones can be separated longitudinally along the membrane.
  • the device contains various components such as: a hard case to house the assembly with openings or windows to see the result of the reaction and to add the sample and reagents; a solid support consisting of an elongated membrane or immunographic strip of suitable material, arranged on a rigid support; pads of absorbent material at the end end to drain the liquid sample and reagents; and a filter to separate the red blood cells of blood and other components.
  • the reactive zone and the membrane detection zone communicate by capillarity. When a few drops of the fluid sample are deposited, the specific receptor dissolves in the detection zone by binding with the antibody or antigen. If the sample does not flow well, a few drops of suitable buffer are added.
  • the complex with the marker diffuses passively, by lateral emigration through the membrane being captured and precipitated in the capture zone, producing a signal.
  • the rest of the conjugated antibody complex advances to the final end intended for the control of the reaction where a suitable antibody is immobilized.
  • the reaction can be controlled by immobilizing, in a certain area of the membrane, reagents that will bind to the conjugate agent regardless of the presence or not of the substance to be detected.
  • These reagents can be for example human Ig or Protein A.
  • the invention consists of a self-executing immunoassay for performing the ABO blood group, so that the same reaction produces the letters of the group. By eliminating outside intervention, the human factor is discarded.
  • the method is based on the detection of the substances that identify the group and its antibodies by means of an immunochromatographic reaction on a "lateral flow" card using a marker such as colloidal gold.
  • the present invention incorporates the known "lateral flow” card type immunoassay to detect substances or antibodies in liquid samples, adapting it to the determination of the ABO group in order to avoid the error derived from the intervention of the human factor, in addition to allowing A direct, fast and simple diagnosis.
  • the group is printed on the card because the same reaction produces or "writes" the letters of the group.
  • the test is based on the detection of agglutinins or substances of the ABO group by means of the aforementioned immunochromatography reaction with a marker such as colloidal gold. The final result will produce one or several lines or bands forming the letter or letters of the group.
  • the detection of agglutinins or substances of the groups is based on their binding to a specific receptor, forming an antigen-antibody complex.
  • the antigens or substances of the groups and their antibodies are immobilized as capture reagents in the form of specific graphs to draw the corresponding letter.
  • the ABO group can also be expressed by producing with the reaction a + or - sign (more or less), with letters preprinted on the cards.
  • the preferred technique relates to an immunoassay with colloidal gold, although they may serve other bookmarks.
  • the detection of the substances of the group includes the substances that identify it which may also be enzymes A, B and H.
  • the invention is not restricted to the materials and procedures described, modifications and variations can be introduced in the process and reagents to reach the objective of it.
  • Antibody detection For the detection of agglutinins, non-competitive sandwich assays are preferred. It is used as a receptor reagent or binding reagent, anti-human Ig antibodies conjugated to the protein A labeled with colloidal gold, or directly bound to the label. These reagents are incorporated into the reaction field in contact with the sample.
  • red blood cell membranes can be obtained from blood samples from which the plasma is removed, the red blood cells are collected by centrifugation and nine volumes of 0.1% digitonin in saline serum are added to a volume of erythrocytes. The resulting membranes are collected and washed by centrifugation until a white grain is obtained.
  • Non-competitive sandwich tests are also preferred.
  • the objective of the detection of the substances of the groups is not to isolate these substances but to release them from the wall of the red blood cells since since these immunoassays are of great sensitivity, small amounts can be detected to release them, any hemolytic substance can be used.
  • 80% of people have substances in plasma.
  • 100-300 uL of the sample (2-6 drops) are deposited in the sample chamber to be tested and one or two drops of suitable solvents are added as aqueous dilutions of inert type substances DMSO, dioxane or others. I know.
  • receptor reagent or substance binding reagent ono or polyclonal antibodies, with antUA, anti-B specificities. These antibodies are conjugated with the protein A labeled with colloidal gold or can be conjugated directly with the label. These antibodies are incorporated into the reaction field absorbed in the membrane. Alternatively they can. introduce adhered to balls of inert material or lyophilized and in protein matrix are added to the reaction. It will be used as a receptor reagent or substance binding reagent, mono or polyclonal antibodies, with specific anti-A, anti-B specificities. These antibodies conjugate with protein A marked with colloidal gold or can be conjugated directly with the marker. These antibodies are incorporated into the reaction field absorbed in the membrane.
  • the device contains: a hard case to house the assembly with openings or windows to add the sample and reagents and to see the reaction result; a solid support consisting of an elongated membrane or immunochromatographic strip of suitable material disposed on a rigid support; pads of absorbent material at the end end to drain the liquid sample and reagents and a filter to separate the red blood cells and other components.
  • a hard case to house the assembly with openings or windows to add the sample and reagents and to see the reaction result
  • a solid support consisting of an elongated membrane or immunochromatographic strip of suitable material disposed on a rigid support
  • pads of absorbent material at the end end to drain the liquid sample and reagents and a filter to separate the red blood cells and other components As indicated the area where the sample is applied is coated by the antibody or antigen conjugated with a marker such as colloidal gold, with affinity for the substance to testal-.
  • the capture area has immobilized an antibody to precipitate the complex.
  • one (or two, one at each end) are sequentially distributed reaction chambers where the sample is added and the detection field where the reaction that will be formed by zones or windows is visualized, in the sense horizontal, some following others or not divided by partitions. Between the chamber for the sample and the windows will be placed, a filter to prevent the passage of red blood cells, of 0.25 um for example.
  • the two sample chambers can be replaced by one but with different membranes, as if they were two or more tampons in one.
  • Outer case or container The device is housed in a suitable container that must be comfortable, easy to use and safe to protect the materials and reagents from the solid phase and avoid spillage when used. It must be of inert material like any variety of plastic that can be molded. A wide variety of polyethylene, polypropylene, polyacrylate, polystyrene and the like are available on the market. Any design is appropriate as long as the components can be integrated and aligned properly. The dimensions are not critical and must allow the assembly of the components and leave openings for the sample and the display. It can be approximately 2-5 cm long. Solid support or membrane.
  • the preferred solid substrate is a polystyrene polymer or also a microporous cellulose ester especially nitrocellulose ester of which there are several on the market.
  • microporous and fibrous materials could also be used as polymers of natural carbohydrates of gelatin, agar, agarose, gums, dextran, starches; Synthetic polymers of nitrocellulose, polyethylene, polyvinyl, polyesters, polyamides, polyacrylamides, polymethacrylates, hydrated gels, etc.
  • membranes There are multiple commercially available membranes. They are also offered with the treated surface, suitable for biological bonds as antigen / antibody. They can also be prepared with a substance-based treatment with carboxyl and amino groups. The most used materials, such as cellulose nitrate, contain negative charges on the surface due to nitrite groups, thus achieving a more specific bond. Pore size is important for proper interaction between reactive molecules. They are offered in various sizes.
  • Pore size selection is not critical, and can vary widely in a range, for example, between 1 and 10 nm. These membranes must have adequate capillarity for aqueous solutions, which in turn depends on the thickness. The greater the thickness, the greater the availability of the detection and capture reagent, therefore there is more sensitivity but an excessive thickness slows the flow.
  • the thickness of the strip will affect the amount of antibody solution that needs to be applied to the substrate. It can be 0.5 to 1.0 mm.
  • a band of cellulose acetate, cotton or other material can be placed at the end of the strip so that it is soaked with the excess liquid from the reaction.
  • the membrane is . Cut into strips and mount on a plastic support using a suitable adhesive. As indicated the dimensions can be modified depending on the design of the device.
  • the exposed area can be delimited with hydrophobic plastic material or similar placed and sealed with the membrane. Its extension can be about 150 mm2 (4x4 mm), but other measures are acceptable.
  • Immobilization of reagents in the membrane It is done by covalent bonding or absorption, covering the membrane or impregnating it. Covalent bonding is done through substances such as glutaraldehyde. But it is preferable to use printing machines that directly spray the membrane. There are machines available of this type that contain different jet widths to print several lines. To prevent non-specific binding of unoccupied antigenic sites, an inert or immunologically non-reactive protein is used with other test components such as albumin and casein. This treatment of Blocking is done after immobilizing the capture reagent and assembling the device.
  • reagents are also facilitated, with the coating of the surface with sugars for which the indicator reagent that permeates the thickness of the porous material is resolubilized in the detection zone.
  • the mobility of the reagent is facilitated by testing the region in which the reagent is applied with an aqueous sugar or cellulose solution.
  • Sucrose is preferred but may be others such as glucose, lactose or trehalose.
  • Pretreated membranes are also found in the market. The format of these devices is well known in the sector. Experts in this field know that several components such as porosity, thickness or type of material, etc. can be modified.
  • Reagent buffer A buffer is used to dilute the sample to resolubilize the dried conjugate reagent as well as to transport and wash reagents.
  • the resolubilization requires a physiological saline buffer. You must also bring albumin or gelatin for blocking and washing.
  • surfactants, dispersants and detergents are used, as well as a neutral pH and an ionic salt. It must also contain a pH stabilizer, a presenvante and chelator of calcium. The pH may be between 7-10.
  • Non-ionic detergents at a concentration of 0.01-0.50% (w / v) are acceptable.
  • CLNa salts at concentrations of 0-300 mM, 50-200 mM, are preferred.
  • High molecular weight polymers are used as dispersants.
  • Polyvinyl pyrrolidone (PVP) -40 at a concentration of 1.4% is preferred.
  • calcium chelator ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) is preferred at my concentration of 5-100 mM, preferably 10-50 and more
  • trizmahydrochloride is used at a concentration of 20-30 mM.
  • a monobasic and dibasic sodium phosphate buffer is preferred.
  • the preferred indicator reagent is colloidal gold.
  • colloidal gold solutions on the market.
  • preparation of colloidal gold particles is well known (can be seen in Frens, N ature 241, 20-1973). It is achieved in valuable ways and through the reduction of tetraamic acid by reacting gold chloride with sodium citrate in water producing particles of various sizes. 15-20 nm particles are preferred.
  • These particles are conjugated or coated with antibody or antigen molecules either directly or through an intermediate binding reagent such as protein A or protein G. The absorption of these substances is achieved by properly controlling the concentrations, ionic strength and pH of the mixture. Then a differential centrifugation or filtration is performed to control the particle size. The method is well known in the sector.
  • the glass surfaces must be treated with a 2% solution of dimethylchlorosilane in chloroform for 30 min. Then wash in absolute ethanol and distilled water. Prepare 1 liter of a 1% solution of gold chloride in water. Heat to 100 °, 10 minutes. Add tannic acid up to 1% and 50 ml of trisodium citrate. Boil for 5-10 minutes. Cool slowly. A gold colloid is formed with homogeneously dispersed particles of size between
  • the polypeptide and polysaccharide antigens of these groups can be chemically synthesized by duplicating the characteristic antigenic determinants. Substances of commercially available natural or synthetic groups will be used for this immunoassay. You can also use substance extracts from the groups also available in the market. On another basis, extracts of these substances can be isolated from the red blood cell membranes. The substances are diluted in phosphate, borate or carbonate bicarbonate lamp at pH 8-9, at a concentration of 10 ug / ul. These substances are deposited in the reaction field in the window of the sample.
  • the support can be coated with bovine seroalbunin with chromic chloride or other fixatives such as fibrinogen, polylysine, phytohemagglutinin, concanavalin A, antibodies, etc.
  • fixatives such as fibrinogen, polylysine, phytohemagglutinin, concanavalin A, antibodies, etc.
  • they can be added to the reaction in the form of vials.
  • a simple method is to incubate overnight at room temperature and wash with PBS-Tween 20. About 40 ul of the substance solution is necessary to cover the reaction field. It can also be incorporated by means of known printing devices.
  • Antibodies Anti-A, anti-B, anti-AB, IgG, IgM or both antibodies are used; they can be purified monoclonal or polyclonal and specifically for the determinants of blood groups so that they do not react with other substances or antigens of other groups present in the red blood cells. These antibodies are commercially available. They can also be produced by cell culture techniques and purified by affinity using the corresponding antigens A, B and D. There are methodologies available for the purification of antibodies and for the production of hybridomas. They can be diluted in various media. Phosphate buffers or 0.05 M sodium borate buffer at Ph 8 are preferred. Antibody concentrations may vary between 100 and 150 ug per ml of solution. Preferably use 120 ug / mi.
  • PROCEDURE The sample is deposited through the opening or reservoir intended for this purpose. The lowest possible amount of blood, about two or three drops (180 uL) will be used. To resolubilize the dried indicator reagent, buffer is added. About 10-15 drops of buffer are necessary. To incorporate the buffer, a mark equivalent to a certain amount of buffer can be placed in the reservoir, but it is preferable to add it with a sterile pipette. When adding the drops to the reservoir, they contact the redisolvable antibody. The red cell free sample flows laterally through the absorbent pad by contacting the free antigen binds with the antibody while the nonessential components diffuse into the absorbent pad below.
  • Figure 1 Standard card with the compartments mentioned: one or two sample chambers and zones or windows to visualize the reaction separated or not by partitions.
  • Figure 2 Scheme that presents the disposition of the antigenic substances to form the letter O. The reagents are immobilized in the windows and are presented in weak strokes that of course cannot be seen.
  • Figure 3 Scheme showing the arrangement of antigenic substances to form letters B and A with the letters superimposed forming an illegible graph on the left, and separated on the right.
  • Figure 4 scheme of the device with three windows showing the arrangement of substances B and A to identify groups A and B with the expected result: one of the letters and a semicircle.
  • Figure 5 scheme of the device with three windows showing the arrangement of substances
  • FIG. 7 scheme of the device that presents the arrangement of substances A and B to identify groups A, B and O by the method of the detection of agglutinins, showing the pre-recorded common sections of the superimposed letters A and B.
  • ABO through the detection of group antigens and antibodies or agglutinins so that the reaction reveals the group.
  • An embodiment based on the detection of antibodies and ota based on the detection of substances are proposed. As indicated, it is also possible to identify this group by detecting the enzymes of the group, enzymes A, B and H, using antibodies antibodies anti-enzymes. In this case the solution is the same as the proposal for the detection of the substances or antigens of the group.
  • substances A and B are used as capture reagents that are immobilized in complementary graphics to draw a piece of mine O with each of them.
  • These graphs can be in the form of alternating lines, alternating quadrants or semicircles vertically or horizontally, so that the positivity separately from only one of them will produce an illegible graph. Semicircles in the horizontal direction are preferred ( Figure 2).
  • the adjacent window is fixed, substance B in form A, preferably with the rounded upper leg ( Figure 3).
  • substance A is fixed or immobilized in the form of letter B on the letter
  • Groups A and B will appear with the corresponding letter and with a semicircle or contiguous arc ( Figure 4). Although these two groups present a semicircle there can be no confusion and in any case the illegible graph can be taken as another control. Optionally you can also split the card and discard this part.
  • Group AB is obtained by exclusion. Alternatively, it can be carried out on a separate card by the method of substance determination mentioned below. We must take into account the frequency of this group is usually less than 5%.
  • the illegible graph produced by the superposition of the letters A and B has common sections in the lateral lines; For this reason, another design is proposed, which consists in leaving these lines pre-recorded in the common part, in a color as close as possible to that of the reaction. These lines can be engraved by printing or screen printing methods ( Figure 7).
  • the receptor reagents are incorporated into the membrane absorbed in a redisolvable form, in the area adjacent to the sample chamber.
  • anti-A and anti-B monoclonal antibodies conjugated directly with colloidal gold or through protein A are used. They are applied by means of automatic pipettes or sprayers as indicated above.
  • lyophilisates can be added in vials or ampoules.
  • purified monoclonal or polyclonal antibodies, anti-A and anti-B will be immobilized in the form of the corresponding letter.
  • Printers are incorporated into the membrane by means of comments. Both windows must be next to each other. With this part, groups A, B and AB are identified and expressed.
  • the group O is performed through the detection of agglutinins, in the last window or separate card as "noted.
  • agglutinins in the last window or separate card as "noted.
  • To this is used as a detector reagent anti-human Ig conjugated with colloidal gold, which is incorporated redisolvible the contiguous zone to the sample chamber
  • capture reagents substances A and B are immobilized in complementary graphs to draw a part of an O each of them.
  • These graphics can be in the form of alternate lines, altered quadrants or semicircles in vertical or horizontal direction, so that the positivity separately from only one of them will produce an illegible graph
  • Semicircles are preferred horizontally ( Figure 4)
  • group A will produce an A in the window for A and also the B in the corresponding window
  • groups A or B will produce an illegible graph in the form of a semicircle Group AB will be identified by the union of the two letters s A and B.

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Abstract

Consiste en un inmunoensayo de autoejecución para la realización del grupo sanguíneo ABO de forma que la misma reacción produzca las letras del grupo. Se basa en la detección de las aglutininas y/o las sustancias de los grupos por medio de una reacción de inmunocromatografia o inmunoanálisis en tarjeta de tipo inmunogold u otras. En la región de contacto con la muestra, la membrana contiene anti-Ig humana o anticuerpos anti-sustancias de los grupos formando un complejo antígeno-anticuerpo-oro coloidal. En la fase sólida de la membrana se inmovilizarán sustancias o anticuerpos anti-sustancias en forma de las correspondientes letras. La muestra moviliza el complejo anticuerpos-coloide y es capturado en la fase sólida visualizándose en forma de letra. Se proponen varias alternativas como la detección de aglutininas y la detección conjunta de las sustancias y aglutininas.

Description

MÉTODO' PARA LA AUTO EJE CUCIO-N DEL G-RUPO SANGUÍNEO "ABO
Esta invención se reñere a métodos y dispositivos .para la detección de determinaάltes antigénicos y anticuerpos de los grupos ABO por medio de inmuno ensayos en tarjeta, de manera
5 qué ía misma reacción deja tm registro impreso del grupo, por tanto', la-tarjeta donde se realiza es el documento del grupo y de la prueba. De esta.ínanera se suprime la etapa intermedia y el error . de transcripción de la realización a la anotación. Es ün test de autoejecución, no requiere aparatos' i instrumental, no necesita preparación ni entrenamiento y puede realizarlo cualquier persona, incluso el mismo.inter'esado.'Puede ser til para
10 consultorios médicos, bancos de sangre, salas 'de urgencias, operaciones militares y áreas suBdesarrolladas.
ANTECEDENTES DE LA EWENCÍÓN Se han registrado un considerable numero dé muertes por reacción transfusioήal iemolítica
15 atribuida a inconxpatibiüdad "ABO". Los errores más frecuentes están én relación con el entornó
' 'délitospital? Son errores en la identificación del paciente, eii su ubicación, en la identificació de la muestra y en el cambio de lá unidad ' a transfundir. En cambio son' ás infrecuentes los errores eή la identificación de la unidad de sangré. ' • . Se evidencia por tanto la necesidad dé ún método que evite el error en la interpretación0 -del grupo, que permita confirmar un potencial receptor del grupo ABO a la cabecera del' enfermo- antes de transfundir, que sea fiable, rápido, seguro,' simple^ barato, sin necesidad de aparatos, con . medios simples, sin necesidad de someter las muestras a t pretratarαieiito y con resultados - estabilizados para permitir la lectura retardada; • ' Los determinantes antigénicos de los grupos sa guíneos presentes én los HematíeSj son5 gíicoproteínás o glicolípidos. Los principales 'sistemas soü'ABO, D(?Rlι), Léwis, Kidd,. Kelϊ, etc. El suero, de la mayoría de las personas contiene anticuerpos, llamadas también áglutiήíúas, en el caso d&l grupo ABO* que reaccionan con antígetios de - un grupo distinto del suyo. Así las personas del grupo O presentan el antígeno H y tienen anticuerpos antí-A y anti-B; los individuos del tipo de sangre A tienen anti-B en su suero, etc.0 Las sustancias de los grupos sanguíneos se diferencian en los residuos dé azucares . añadidos auna cadena común que a su vez dependen de unas enzimas glicosiltransferasás o enzimas • A, B y H. Los aαtígenos H se .construyen sobre extremos de cadenas de oligasacáridos precursores . llamados Tipo 1 y Tipo 2. EÍ gen H produce una fucosiltransferasa que añade fiícosa a la Gal terminal de las cadenas "tipo 2 medíante un enlace alfa (1-2). Los genes Ay B producen enzimas glicόsiltransferasas5 que añaden azúcares a lás'cadenas de oligosacáridos del antigenos H. La N-acetilgalactosaminotransferasa codificada por el gen A y la galactosaminotransferasa especificada por el gen B añaden GalNAc y Gal respectivamente al mismo residuo de Gal sobre el que actuó la transferasa del gen H? mediante un enlace alfa (1-3). La determinación del grupo ABO por métodos convencionales comprende ensayos de aglutinación y lisis de células. La aglutinación se produce al añadir los anticuerpos de los grupos, anti-A o anti-B, a los hematíes de la muestra, que es el método directo; o añadiendo suero o plasma de la muestra a hematíes conocidos: método inverso. Se puede reforzar la aglutinación por centrifugación suave, añadiendo albúmina bovina, polivinilpirrolidona, etc. Además los anticuerpos de tipo IgM son lo suficientemente grandes para vencer las fuerzas repulsivas de los hematíes y extenderse entre los mismos. Estas aglutinaciones se pueden producir en tubos, placas de vidrio, tarjetas con superficies impermeables, etc. Existen también métodos en tarjeta, donde el suero con los anticuerpos se seca sobre nitrocelulosa plastificada impermeable al agua y se reconstituye el suero con agua destilada. La lisis se produce agregando el anticuerpo y complemento a la muestra de sangre. El complemento fijado en la membrana da lugar a la ruptura da la membrana celular. La evaluación de estos ensayos requiere el juicio subjetivo de personal experimentado para distinguir la aglutinación de agregaciones inespecíficas que causan formación de racimos. Por tanto es necesario una interpretación, lectura y registro final de los resultados. Este método se basa también en un inmunoensayo en tarjeta. En 1977 Horrisberger y Rosset (J. Histochem., Cytochem., 25:295-305, 1977) describen un inmυnoensayo en el que usa partículas oro como marcador. Posteriormente Leuvering, Janssen, Valkiers y otros autores han ido perfeccionando estos métodos hasta llegar a los actuales inmυnoensayos de flujo lateral en tarjeta.
FUNDAMENTO Estos inmunoensayos se basan en la interacción entre reactivos y sustancias específicas con afinidad inmunológica, como por ejemplo AG/AC, biotina/ avidina, etc. La sustancia diana de la muestra se une a un receptor específico que puede ser un antígeno o un anticuerpo formándose un complejo antígeno-anticuerpo, que a su vez se une a otro reactivo, aprovechando la bivalencia de las moléculas IgG que le permite reaccionar por un sitio de unión con el antígeno en solución y por otro con el antígeno fijado en la membrana o sustrato poroso. Para la visualización del punto final se debe producir una señal visible, para ello el reactivo detector está conjugado con un trazador, generalmente oro coloidal, bien directamente o por medio de la proteína A que tiene la ventaja de establecer una unión firme con la inmunoglobulina IgG. Este reactivo receptor se absorbe en forma redisolvible en la membrana en el campo de reacción o zona próxima a la ventana de la muestra. Alternativamente se puede añadir a la reacción. El complejo antígeno-anticuerpo emigra a la fase sólida o zona de la membrana destinada a visualizar el resultado donde está inmovilizado otro anticuerpo, dirigido a un epítope diferente, que captura el complejo. Cuando la sustancia diana és un antígeno se suele usar dos tipos de anticuerpos: a) un anticuepo monoclonal o poíiclonal purificado por afinidad, conjugado con el trazador, que se encuentra redisolvible en el campo de reacción o fase líquida. También se puede disponer recubriendo bolas de material inerte o añadido a la reacción; b) el otro anticuerpo preferentemente monoclonal, dirigido a un epítope diferente, inmovilizado en otra zona o fase sólida, va a capturar y precipitar el anterior complejo antígeno/anticuerpo. Cuando la diana es un anticuerpo se sensibiliza con oro coloidal un anticuerpo capaz de reconocer la inmunoglobulina. El complejo es capturado en la zona visible reactiva por un reactivo que suele ser el antígeno. En este ensayo llamado de tipo sandwich se pueden invertir los papeles entre antígeno y anticuerpo, de manera que para detectar un anticuerpo se puede inmovilizar un antígeno. Se puede también detectar un anticuerpo utilizando un anticuerpo anti-humano conjugado con oro coloidal a través de la Proteína A como reactivo indicador. Existe también el ensayo competitivo, en la cual se inmoviliza en la membrana un reactivo con una afinidad comparable por el anticuerpo inmovilizado en la membrana. La sustancia de la muestra y el antígeno auxiliar conjugado compiten por los sitios de unión al anticuerpo. Si no hay antígeno en la muestra el antígeno marcado se agrega en la reacción; en este caso la presencia de color significa resultado negativo. Si hay antígeno no se desarrolla color porque ya tiene ocupados los sitios por el antígeno de la muestra. La señal es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno. Se usan para detectar la presencia de una sustancia por unión a dos receptores. Opcionahnente se puede aumentar el color de la reacción con soluciones intensificadoras co o una mezcla a partes iguales de una solución de hidroquinona y nitrato de plata. Se añade a la etapa final unos 20 uL de esta mezcla. La reacción se para lavando con agua destilada. Existen además otros inmunoensayos que refuerzan la reacción por medio la unión a enzimas o sustancias como la biotina que se unirá firmemente con la estreptavidina. Además la estreptavidina puede acoplarse a partículas de látex. También se puede utilizar partículas de látex coloreado. Estos inmunoensayos pueden contener además un segundo o tercer complejo sin relación con el anterior. Además la primera y segunda zona pueden separarse longitudinalmente a lo largo de la membrana. El dispositivo contiene diversos componentes como son: un estuche rígido para albergar el conjunto con aperturas o ventanas para ver el resultado de la reacción y para añadir la muestra y reactivos; un soporte sólido que consiste en una membrana alargada o tira imnunociOmatográfica de material adecuado, dispuesta sobre un soporte rígido; almohadillas de material absorbente en el extremo final para drenar la muestra líquida y reactivos; y un filtro para separar los hematíes de la sangre y otros componentes. La zona reactiva y la zona de detección de la membrana se comunican por capilaridad. Cuando se depositan unas gotas de la muestra fluida, en la zona de detección se disuelve el receptor específico uniéndose con la anticuerpo o el antígeno. Si la muestra no fluye bien se añaden además unas gotas de buffer adecuado. El complejo con el marcador difunde pasivamente, por emigración lateral por la membrana siendo capturado y precipitado en la zona de captura, produciéndose una señal. El resto del complejo de anticuerpos conjugados avanza hasta el extremo final destinado al control de la reacción donde se encuentra inmovilizado un anticuerpo adecuado. De esta forma se puede controlar la reación inmovilizando en una determinada zona de la membrana, reactivos que se unirán al agente conjugado con independencia de la presencia o no de la sustancia a detectar. Estos reactivos pueden ser por ejemplo Ig humanas o Proteína A.
SUMARIO La invención consiste en un inmunoensayo de autoejecución para realización del grupo sanguíneo ABO, de forma que la misma reacción produzca las letras del grupo. Al eliminar la intervenpión exterior se descarta el factor humano. El método se basa en la detección de las sustancias que identifican el grupo y sus anticuerpos por medio de una reacción inmunocromatográfica en tarjeta de tipo "lateral flow" utilizando un marcador como el oro coloidal.
DESCRIPCIÓN La presente invención incorpora el conocido inmunoensayo en tarjeta de tipo "lateral flow" para detectar sustancias o anticuerpos en muestras líquidas, adaptándolo a la determinación del grupo ABO con el fin de evitar el error derivado de la intervención del factor humano, además de permitir un diagnostico directo, rápido y sencillo. Con este método al hacer la determinación queda impreso el grupo en la tarjeta porque la misma reacción produce o "escribe" las letras del grupo. El ensayo se basa en la detección de las aglutininas o sustancias del grupo ABO por medio de la citada reacción de inmunocromatografía con un marcador como el oro coloidal. El resultado final producirá una o varias líneas o bandas conformando la letra o letras del grupo. La detección de las aglutininas o las sustancias de los grupos se basa en su unión a un receptor específico, formándose un complejo antígeno-anticuerpo. En la fase sólida o zona de la membrana destinada a visualizar el resultado, se inmovilizan como reactivos de captura los antígenos o sustancias de los grupos y sus anticuerpos en forma de gráficos específicos para dibujar la correspondiente letra. Con este procedimiento se puede expresar también el grupo ABO produciendo con la reacción un signo + o - (más o menos), con letras preimpresan en las tarjetas. La técnica preferida se refiere a un inmunoensayo con oro coloidal, aunque pueden servir otros marcadores. La detección de las sustancias del grupo incluye las sustancias que lo identifican que pueden ser también las enzimas A, B y H. La invención no se restringe a los materiales y procedimientos descritos, pudiéndose introducir modificaciones o variaciones en el procedimiento y reactivos para alcanzar el objetivo de la misma.
Detección de anticuerpos Para la detección de aglutininas se prefiere ensayos no competitivos de tipo sandwich. Se utiliza como reactivo receptor o reactivo de unión, anticuerpos de tipo anti-Ig humana conjugados con la proteína A marcada con oro coloidal, o unidos directamente al marcador. Estos reactivos se incorporan al campo de reacción en contacto con la muestra.
En la zona de caprina se inmovilizan sustancias de los grupos incluidos sus derivados, extractos, membranas de hematíes en polvo o incluso hematíes. Estas sustancias se fijan en diversos gráficos como se indicará más adelante. Las membranas de hematíes se pueden obtener a partir de muestras de sangre a la que se le retira el plasma, se recogen los hematíes por centrifugación y a un volumen de eritrocitos se agregan nueve volúmenes de digitonina al 0.1 % en suero salino. Las membranas resultantes se recogen y lavan por centrifugación hasta que se obtiene un grano blanco.
Detección de sustancias Se prefiere también ensayos no competitivos de tipo sandwich. El objetivo de la detección de las sustancias de los grupos no es aislar estas sustancias sino liberarlas de la pared de los hematíes ya que como estos inmunoensayos son de una gran sensibilidad, se pueden detectar pequeñas cantidades para liberarlas se puede utilizar cualquier sustancia hemolizante. Además el 80 % de las personas presentan sustancias en plasma. Para liberar las sustancias se depositan en la cámara de muestra 100-300 uL de la muestra (2- 6 gotas) a la cámara de la muestra a testar y se le añaden una o dos gotasde disolventes adecuados como diluciones acuosas de sustancias inertes de tipo DMSO, dioxane u otras. Se. utilizará como reactivo receptor o reactivo de unión a las sustancias, anticuerpos ono o policlonales, con especificidades antUA, anti-B. Estos anticuerpos se conjugan con la proteína A marcada con oro coloidal ó se pueden conjugar directamente con el marcador. Estos anticuerpos se incorporan al campo de reacción absorbidos en la membrana. Alternativamente se pueden. introducir adheridas a bolas de material inerte o se añaden liofilizados y en matriz proteica a la reacción. Se utilizará como reactivo receptor o reactivo de unión a las sustancias, anticuerpos mono o policlonales, con especificidades anti-A, anti-B. Estos anticuerpos se conjugan con la proteína A marcada con oro coloidal ó se pueden conjugar directamente con el marcador. Estos anticuerpos se incorporan al campo de reacción absorbidos en la membrana. Alternativamente se pueden introducir adheridas a bolas de material inerte o se añaden liofilizados y en matriz proteica a la reacción. La captura del complejo anticuerpos/sustancias se realiza en la fase sóüda en la zona de visualización del resultado, por medio de anticuerpos específicos monoclonales o policlonales purificados anti-A o anti-B inmovilizados en la forma deseada. Como se indicó son admisibles otras combinaciones de reactivos de detección o de captura, así como modificaciones o variaciones a los procesos descritos fácilmente entendibles por un experto en estas técnicas.
COMPONENTES DEL DISPOSITIVO El dispositivo contiene: un estuche rígido para albergar el conjunto con aperturas o ventanas para añadir la muestra y reactivos y para ver el resultado de la reacción; un soporte sólido que consiste en una membrana alargada o tira inmunocromatográfica de material adecuado dispuesta sobre un soporte rígido; almohadillas de material absorbente en el extremo final para drenar la muestra líquida y reactivos y un filtro para separar los hematíes de la sangre y otros componentes. Como se indicó el área donde se aplica la muestra está recubierta por el anticuerpo o antígeno conjugados con un marcador como el oro coloidal, con afinidad por la sustancia a testal-. El área de captura tiene inmovilizado un anticuerpo para precipitar el complejo. La zona reactiva y la zona de detección de la membrana se pueden comunicar por capilaiϊdad. En el dispositivo (figura 1) están distribuidos de forma secuencial una (o dos, una en cada extremo) cámaras de reacción donde se añade la muestra y el campo de detección donde se visualiza la reacción que estará formado por zonas o ventanas, en sentido horizontal, unas a continuación de otras divididas o no por tabiques. Entre la cámara para la muestra y las ventanas se colocará, un filtro para impedir el paso de los hematíes, de 0.25 um por ejemplo. Pueden sustituirse las dos cámaras de muestra por una sola pero con membranas diferentes, como si fueran dos o más taijetas en una.
Estuche o envase exterior El dispositivo se aloja en un contenedor adecuado que debe ser cómodo, de fácil manejo y seguro para proteger los materiales y reactivos de la fase sólida y evitar el vertido al ser usado. Debe ser de material inerte como cualquier variedad de plástico que pueda ser moldeado. Existen disponibles en el mercado gran variedad polietileno, polipropileno, poliacrilato, poliestireno y similares. Cualquier diseño es apropiado siempre que se puedan integrar y alinear adecuadamente los componentes. Las dimensiones no son críticas debiendo permitir el ensamblaje de los componentes y dejar aperturas para la muestra y la visualización. Puede tener una longitud aproximadamente de 2-5 cm. Soporte sólido o membrana. Consiste en un material adecuado para inmunocromatografía o inmunoanálisis en tarjeta como membranas o láminas de materiales inertes con afinidad adecuada y porosidad superficial suficiente para permitir la difusión pasiva en sentido lateral de los reactivos de la prueba. Se utiliza una membrana de material poroso en forma de tiras alargadas planas, delgadas, de color blanco opaco. El sustrato sólido preferido es un polímero de poliestireno o también un éster microporoso de celulosa especialmente éster nitrocelulosa de los que existen varios en el mercado. Se podrían utilizar también otros materiales microporosos y fibrosos como polímeros de hidratos de carbono naturales de gelatina, agar, agarosa, gomas, dextrano, almidones; polímeros sintéticos de nitrocelulosa, polietileno, polivinilo, poliésteres, poliamidas, poliacrilamidas, polimetacrilatos, geles hidratados, etc. Existen múltiples membranas disponibles comercialmente. Se ofrecen también con la superficie tratada, aptas para uniones biológicas como antígeno/anticuerpo. También se pueden preparar con un tratamiento a base de sustancias con grupos carboxilo y amino. Los materiales más usados, como el nitrato de celulosa, contienen cargas negativas en la superficie debido a los grupos nitrito, con lo que se consigue una unión más específica. El tamaño de los poros es importante para la adecuada interacción entre las moléculas reactivas. Se ofrecen en varios tamaños. La selección del tamaño del poro no es crítica, pudiendo variar ampliamente en un rango por ejemplo entre 1 y 10 nm. Estas membranas deben tener una capilaridad adecuada para soluciones acuosas, que a su vez depende del espesor. Cuanto mayor sea el espesor mayor es la disponibilidad del reactivo detector y de captura por tanto hay más sensibilidad pero un espesor excesivo enlentece el flujo. El espesor de la tira va a afectar a la cantidad de solución de anticuerpo que se necesita aplicar al sustrato. Puede ser de 0,5 a 1,0 mm. En el extremo de la tira se puede colocar una banda de acetato de celulosa, algodón u otro material para que se empape con el líquido sobrante de la reacción. La membrana se. corta en tiras y se montan en un soporte plástico utilizando un adhesivo adecuado. Como se indicó las dimensiones pueden modificarse dependiendo del diseño del dispositivo. El área expuesta se puede delimitar con material plástico hidrófobo o similar colocado y sellado con la membrana. Su extensión puede ser de unos 150 mm2 (4x4 mm), pero son aceptables otras medidas.
Inmovilización de los reactivos en la membrana . Se realiza por unión covalente o absorción, recubriendo la membrana o impregnándola. La unión covalente se realiza por medio de sustancias como el glutaraldehido. Pero es preferible usar máquinas impresoras que rocían directamente la membrana. Existen maquinas disponibles de este tipo que contienen diferentes anchuras de chorro para imprimir varias líneas. Para prevenir la unión no específica de los lugares antigénicos no ocupados se utiliza una proteína inerte o inmunológicamente no reactiva con otros componentes del ensayo como la albúmina y la caseína. Este tratamiento de de bloqueo se realiza después de inmovilizar el reactivo de captura y ensamblar el dispositivo. También se facilita la incorporación de reactivos, con el recubrimiento de la superficie con azucares para lo cual en la zona de detección se resolubiliza el reactivo indicador que impregna el espesor del material poroso. La movilidad del reactivo se facilita tetando la región en que se aplica el reactivo con m a solución acuosa de azúcar o de celulosa. Se prefiere la sucrosa pero pueden ser otros como la glucosa, lactosa o trehalosa. También se encuentran en el mercado membranas pretratadas. El formato de estos dispositivos es bien conocido en el sector. Los expertos en este campo conocen que se pueden modificar varios componentes como la porosidad, espesor o tipo de material, etc.
Reactivo buffer Se utiliza un buffer para diluir la muestra para resolubilizar el reactivo conjugado desecado así como para el transporte y lavado de reactivos. La resolubilización requiere un buffer fisiológico salino. Además debe llevar albúmina o gelatina para el bloqueo y lavado. Para reducir la tinción de fondo y las uniones inespecíficas se utilizan surfactactes, dispersantes y detergentes, así como un pH neutro y una sal iónica. También debe contener un estabilizador de pH, un presenvante y quelante del calcio. El pH puede estar entre 7- 10. Son aceptables detergentes no iónicos a una concentración de 0.01 -0.50 % (p/v). Se prefieren sales de CLNa a concentraciones de 0-300 mM, preferible 50- 200 mM. Como dispersantes se utilizan polímeros de alto peso molecular. Se prefiere la polivinil pirrolidona (PVP)-40 a concentración de 1.4 %. Como quelante del calcio se prefiere el ácido etilendíaminotetraacítico (EDTA) a mía concentración de 5-100 mM, preferiblemente 10-50 y mas
20 mM. Como estabilizador del pH se usa trizmahidroclorídrico a concentración de 20- 30 mM. Se puede utilizar un buffer convencional de fosfato, MES, BIS-TRIS, CLH-TRIS, buffer citrato, buffer borato con concentraciones de 5-100 mM, preferiblemente de 5-30 mM. Se prefiere un buffer de fosfato sódico monobásico y dibásico.
Reactivo indicador. El reactivo indicador preferido es el oro coloidal. Existen en el mercado soluciones de oro coloidal. Además la preparación de la partículas de oro coloidal es bien conocida ( puede verse en Frens, N ature 241, 20-1973). Se consigue de valias maneras y a través de la reducción del ácido tetraáurico al reaccionar el cloruro de oro con citrato sódico en agua produciéndose partículas de diversos tamaños. Se prefieren partículas de 15-20 nm. Estas partículas se conjugan o recubren con moléculas de anticuerpos o antígenos bien directamente o a través de un reactivo de unión intermedio como la proteína A o proteína G. La absorción a estas sustancias se consigue adecuando controlando las concentraciones, fuerza iónica y pH de la mezcla. Después se realiza una centrifugación diferencial o filtración para controlar el tamaño de las partículas. El método es bien conocido en el sector. Para preparar el coloide se deben tratar las superficies de vidrio con una solución al 2 % de dimetilclorosilane en cloroformo durante 30 min. Después lavar en etanol absoluto y agua destilada. Preparar 1 litro de una solución al 1 % de cloruro de oro en agua. Calentar a 100°, 10 minutos. Añadir ácido tánico hasta el 1 % y 50 mi de citrato trisódico. Hervir durante 5-10 minutos. Enfriar lentamente. Se forma un coloide de oro con partículas dispersas homogéneamente de tamaño entre
10-15 mm. Centrifugar la solución a 20.000 g durante 30 min y resuspender en buffer tris pH 8.2.
Añadir seroalbumina bovina al 1 % y azida sódica al 0.05 %. Centrifugar dos veces y resuspender en el mismo buffer hasta alcanzar una densidad óptica final de 1.5 a 540 nm. Para su conjugación a Proteína A (puede verse en Horisberger, 1979, Leuvering y otros), se ajusta la solución a un pH de 6.5 con C03K2, 0.1 M. Se prepara una dilución de 1 mg/ml de proteína A en CLNa 0.005 M. A cada litro de oro coloidal se añade PEG 20.000 hasta 1 %. Centrifugar en un gradiente de glicerol al 5 % durante 45 minutos a 30.000 g. Descartar el sobrenadante y repetir. Resuspender en un ratio de 1/10 de la dilución inicial. Filtrar en membrana de 0.45 um. Ajustar a una concentración final DO de 1 con longitud de onda 540 nm con buffer fosfato con seroalbumina bovina al 1 % y azida sódica al 0.05 %. Para su unión con anticuerpos se añade a un litro de oro coloidal a pH de 6, un gramo de seroalbumina bovina prediluida en 10 mi de agua destilada. Agitar 2 horas. Filtrar en membrana de 0.2 um. Centrifugar 45 minutos a 4° a 35.000 g. Descartar el sobrenadante. Repetir dos veces con agua destilada. Ajustar la concentración a una densidad óptica de 1 con una longitud de onda de 540 lira. Añadir a cada 100 mi glutaraldehido hasta el 1 %. Mezclar 2 horas. Incubar toda la noche a 2°- 5° con buffer de fosfato, pH 7.4 conteniendo 1 mg de anticuerpos policlonales purificados. Estabilizar los enlaces covalentes con 1 mg de borohidrado de sodio. Después de incubar 30 minutos en agitación, se añade solución de buffer con seroalbumina bovina-glicina a pH 8 y la mezcla se centrífuga a 5.000 g durante 45 min. Continuar con dos lavados con PBS 0.1 M apH 8. Resuspender el precipitado final en PBS conteniendo 0.05 M trietanolamina con 0.2 % de seroalbumina bovina y 0.1 % de azida sódica ajusfando a una DO de 5 con longitud de onda de 540 n. Guardar a 2-4°.
Antígenos. Los antígenos polipeptídicos y polisacáridos de estos grupos pueden sintetizarse químicamente duplicando los determinantes antigénicos característicos. Para este inmunoensayo se utilizarán sustancias de los grupos naturales o sintéticas asequibles comercialmente. Igualmente se pueden utilizar extactos de sustancias de los grupos también asequibles en el mercado. Por ota paite se pueden aislar extractos de estas sustancias de las membranas de los hematíes. Las sustancias se diluyen en lampón fosfato, borato o carbonatobicarbonato a pH 8-9, a una concentración de 10 ug/ul. Estas sustancias se depositan en el campo de reacción en la ventana de la muestra. Para fijarlas en la membrana se puede revestir el soporte con seroalbunina bovina con cloruro crómico u otros fijadores como fibrinogeno, polilisina, fitohemaglutinina, concanavalina A, anticuerpos, etc. Alternativamente se pueden añadir a la reacción en forma de viales. Un método sencillo es incubar durante toda la noche a temperatura ambiente y lavar con PBS-Tween 20. Son necesarios unos 40 ul de la solución de sustancias para cubrir el campo de reacción. También se puede incorporar por medio conocidos de dispositivos de impresión.
Anticuerpos Se utilizan anticuerpos anti-A, anti-B, anti- AB, de tipo IgG, IgM o ambos; pueden ser monoclonales o policlonales purificados y con especificidad para los determinantes de los grupos sanguíneos de manera que no reaccionen con otras sustancias o antígenos de otros grupos presentes en los hematíes. Estos anticuerpos se encuentran disponibles en el mercado. Además se pueden producir por técnicas de cultivos celulares y se purificar por afinidad empleando los correspondientes antígenos A, B y D. Existen metodologías disponibles para la purificación de los anticuerpos y para la producción de hibridomas. Se pueden diluir en diversos medios. Se prefieren tampones fosfatos o tampón de borato sódico 0.05 M a Ph 8. Las concentraciones de los anticuerpos pueden variar entre 100 y 150 ug por mi de solución. Usar preferiblemente 120 ug / mi. Se aplican al soporte poroso por contacto directo con tubos capilares, bolígrafos especiales, pipetas o jeringas automáticas o con pulverizadores propulsando gases o líquidos con un propulsor miniaturizado según procesos conocidos en litografía y microelectrónica. También se pueden usar plantillas o tiras impregnadas con el anticuerpo. Para depositar un anticuerpo en una línea de unos 10 mm y 0.5 de anchura se pueden necesitar unos 20 mu de anticuerpo monoclonal de ratón.
PROCEDIMIENTO La muestra se deposita a través de la apertura o reservorio destinada a tal efecto. Se utilizarán la menor cantidad de sangre posible, unas dos o tres gotas ( 180 uL). Para resolubilizar el reactivo indicador desecado se añade buffer. Son necesarias unas 10-15 gotas de buffer. Para incorporar el buffer se puede poner en el reservorio una marca que equivale a una determinada cantidad de buffer, pero es preferible añadirlo con una pipeta estéril. Al añadir las gotas al reservorio contactan con el anticuerpo redisolvible. La muestra libre de hematíes fluye lateralmente a través de la almohadilla absorbente contactando el antígeno libre se une con el anticuerpo mientras los componentes no esenciales difunden a la almohadilla absorbente situada debajo.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : tarjeta estándar con los compartimentos citados: una o dos cámaras de muestra y zonas o ventanas para visualizar la reacción separadas o no por tabiques. Figura 2: esquema que presenta la disposición de las sustancias antigénicas para formar la letra O. Los reactivos están inmovilizados en la ventanas y se presentan en trazos débiles que por supuesto no se ven. Figura 3: esquema que presenta la disposición de las sustancias antigénicas para formar las letras B y A con las letras superpuestas formando un gráfico ilegible en la parte izquierda, y separadas a la derecha. Figura 4: esquema del dispositivo con tres ventanas mostrando la disposición de las sustancias B y A para identificar los grupos A y B con el resultado esperado: una de las letras y un semicírculo. Figura 5: esquema del dispositivo con tres ventanas mostrando la disposición de las sustancias
B y A para identificar el grupo O con el resultado esperado: un gráfico ilegible y un círculo. Figura 6: esquema del dispositivo con tres ventanas mostrando la disposición de los anticuerpos para la detección de las sustancias de los grupos enn la parte izquierda. De esta manera se identifican los grupos
A, B y AB. En la derecha se muestra el esquema para la detección de aglutininas para identificar el grupo O. Figura 7: esquema del dispositivo que presenta la disposición de las sustancias A y B para identificar los grupos A, B y O por el método de la detección de aglutininas, mostrando los tramos comunes pregrabados de las letras A y B superpuestas.
FORMAS DE REALIZACIÓN Como ya se indicó, con este dispositivo se identifican las sustancias que definen el grupo
ABO por medio de la detección de los antígenos del grupo y de los anticuerpos o aglutininas de manera que lá reacción revele el grupo. Se proponen una forma de realización basada en la detección de los anticuerpos y ota basada en la detección de las sustancias. Como se indicó, es posible también identificar este grupo detectando las enzimas del grupo, enzimas A, B y H, utilizando anticuerpos anticuerpos anti-enzimas. En este caso la solución es igual que la propuesta para la detección de las sustancias o antígenos del grupo.
DETECCIÓN DE LAS AGLUTININAS DEL GRUPO ABO La reacción producirá las correspondientes letras en la presencia de las aglutininas del grupo. Este procedimiento tiene el inconveniente de que el grupo AB quedaría en blanco y el grupo O aparecerá como un AB. Para evitar esto se propone disponer de una tarjeta con dos ventanas una continuación de la otra en sentido lateral. Se propone dejar también en el estuche o soporte rígido una hendidura entre las dos ventanas para poder partir la tarjeta y desechar una parte. Opcionalmente se pueden utilizar dos tai etas, o taijetas con membranas separadas. Como se comentó, se utiliza como reactivo detector anti-Ig humana conjugada con oro coloidal que se incorpora redisolvible a la zona contigua a la cámara de muestra. Para identificar el grupo O se emplean sustancias A y B como reactivos de captura que se inmovilizan en gráficos complementarios para dibujar una paite de mía O con cada una de ellas. Estos gráficos pueden ser en forma líneas alternas, cuadrantes alternos o semicírculos en sentido vertical u horizontal, de forma que la positividad por separado de uno sólo de ellos, producirá un gráfico ilegible. Se prefieren semicírculos en sentido horizontal (Figura 2). Para producir el grupo A se fija en la ventana contigua, sustancia B en forma A preferiblemente con la paite superior redondeada (Figura 3). Para producir el grupo B se fija o inmoviliza sustancia A en forma de letra B sobre la letra
A de manera que las tres líneas trasversales vayan paralelas a diferentes alturas a la línea trasversal de la A (Figura 3); las líneas laterales van también paralelas a las de la A. Se prefiere redondear ligeramente el ángulo recto formado por las líneas trasversales y la línea lateral derecha. Como es indicó estos reactivos se inmovilizan en la membrana por medio de máquinas impresoras que rocían directamente la membrana. Existen maquinas disponibles de este tipo que contienen de diferentes anchuras de chorro para imprimir varias líneas. El resultado de la superposición de estas dos letras producirá un gráfico ilegible. Para evitar la interpretación o la intervención del factor humano, objetivos de la presente invención, puede ser válido cualquier otro diseño. Resultados esperados: el grupo O aparecerá como un círculo o redondel y una figura contigua ilegible. En este caso se puede separar la tarjeta por la hendidura y desechar la ventana con el gráfico ilegible. Los grupos A y B aparecerán con la correspondiente letra y con un semicfrculo o arco contiguo (Figura 4). Aunque estos dos grupos presenten un semicírculo no puede haber confusión y en todo caso el gráfico ilegible se puede tomar como un control más. Opcionalmente se puede también partir la tarjeta y desechar esta parte. El grupo AB se obtiene por exclusión. Alternativamente se puede realizar en tarjeta aparte por el método de la determinación de sustancias que se cita a continuación. Hay que tener en cuenta la frecuencia de este grupo suele ser inferior al 5 %. El gráfico ilegible producido por la superposición de las letras A y B tiene tramos comunes en las líneas laterales; por ello se propone también otro diseño que consiste en dejar pregrabadas estas líneas en la parte común, en un color lo más parecido posible al de la reacción. Estas líneas se pueden grabar por métodos de impresión o de serigrafía (Figura 7).
DETECCIÓN DE LAS SUSTANCIAS Y AGLUT1MΪMAS DEL GRUPO ABO Con este método el grupo O, al no tener sustancia A ni B, aparecerá en blanco, por lo que se propone disponer de una tarjeta o dispositivo con ventanas o zonas de visualización sucesivas unas a continuación de otras, destmadas a las letras A, B y O. Se propone también introducir en el estuche o soporte rígido una franja más débil entre la ventana para la letra B y el O, con el fin de poder partir la tarjeta y desechar una de las partes. Opcionalmente se pueden utilizar tarjetas con membranas separadas destinándose una para los grupos A, B y AB, y otra para el grupo O (Figura 6). Lógicamente el orden entre el último grupo y los anteriores se puede invertir. Los reactivos receptores se incorporan a la membrana absorbidos en forma redisolvible, en la zona contigua a la cámara de la muestra. Se utilizan anticuerpos preferentemente monoclonales anti-A y anti-B conjugados directamente con oro coloidal o a través de la proteína A. Se aplican por medio de pipetas o pulverizadores automáticos según se indicó anteriormente. Opcionalmente se pueden añadir liofilízados en viales o ampollas. En las zonas o ventanas de captura para visualizar el resultado, se inmovilizarán anticuerpos monoclonales o policlonales purificados, anti-A y anti-B, en forma de la correspondiente letra. Se incorporan a la membrana por medio máquinas impresoras como se comentó. Ambas ventanas deben estar contiguas una a continuación de otra. Con esta parte se identifican y expresan los grupos A, B y AB. El grupo O se realiza por medio de la detección de aglutininas, en la última ventana o en tarjeta aparte como" se indicó. Para ello se utiliza como reactivo detector anti-Ig humana conjugada con oro coloidal, que se incorpora redisolvible a la zona contigua a la cámara de muestra. Como reactivos de captura se inmovilizan sustancias A y B en gráficos complementarios para dibujar una parte de una O cada una de ellas. Estos gráficos pueden ser en forma líneas alternas, cuadrantes altemos o semicírculos en sentido vertical u horizontal, de forma que la positividad por separado de uno sólo de-ellos, producirá un gráfico ilegible. Se prefieren semicírculos en sentido horizontal (Figura 4). Resultados esperados: el grupo A producirá una A en la ventana para A y igualmente el B en la correspondiente ventana. En la parte destinada al grupo O los grupos A ó B producirán un gráfico ilegible en forma de semicírculo. El grupo AB quedará identificado por la unión de las dos letras A y B. Los expertos en la materia reconocerán que se admiten cambios, modificaciones o variaciones en la forma, detalles, método y dispositivo, pudiendo realizarse varias combinaciones, técnicas, adiciones u omisiones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por tanto tales modificaciones se incluyen en las reivindicaciones de la presente invención.
EJECUCIÓN DEL GRUPO ABO Y Rh POR MEDIO DE SIGNOS POSITIVO O NEGATIVO Se propone también la determinación de estos y otros grupos por medio de los signos más o menos (+ / - ). • Las letras estarían impresas en las ventanas adyacentes. El Rh.se identifica por la detección del antígeno D. La metodología sería similar a la descrita anteriormente pero se produce una línea vertical en lugar de una letra sobre una línea horizontal de control obtenida con el control.

Claims

RBENVTNDICACIONES
1- Un procedimiento y un dispositivo para determinar el grupo sanguíneo ABO basado en un inmunoensayo en tarjeta de tipo "lateral flow" para detectar las sustancias que identifican el grupo de forma que la misma determinación produzca las letras del grupo utilizando para ello cualquier diseño y combinación de reactivos. 2- Un procedimiento y un dispositivo para determinar el grupo sanguíneo ABO basado en un inmunoensayo según la primera reivindicación que utiliza un soporte poroso inmunocromatografico en forma de tira alargada con una o más cámaras para depositar la muestra de sangre u otros fluidos corporales y zonas o ventanas contiguas lateralmente para visualizar las letras del grupo. Contiene también un filtro para impedir el paso de glóbulos rojos, material absorbente para drenar los reactivos líquidos y otros elementos adecuados y necesarios para realizar un inmunoensayo por cromatografía incluido todo en un estuche o envase rígido. En el citado soporte se incorporan reactivos detectores de las sustancias que identifican el grupo sanguíneo conjugados con un marcador y reactivos de captura inmovilizados formando gráficos específicos. 3- Un procedimiento y un dispositivo para determinar el grupo sanguíneo ABO basado en un inmunoensayo según la primera reivindicación caracterizado porque el inmunoensayo se diseña para detectar las sustancias antigénicas de los grupos y sus anticuerpos específicos o aglutininas. 4- Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo detector se conjuga un reactivo indicador como el oro coloidal u otro marcador que permita la visualización de la prueba final a simple vista. 5- Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo detector se incorpora a la membrana desecado, redisolvible, liofilizado en ampollas o recubriendo partículas de látex. 6- Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo detector de las aglutininas, consiste en un anticuerpo específico anti-Ig humana conjugado con la proteína A marcada con oro coloidal o conjugada directamente con el marcador. 7- Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo detector de las sustancias del grupos ABO consiste en un anticuerpo específico anti-A y anti-B monoclonal o policlonal purificado, conjugado con oro coloidal directamente o a través de la Proteína A. 8- Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo de captura del complejo antígeno/anticuerpo para la identificación de las aglutininas de los grupos, consiste en sustancias de los grupos Ay B. 9- Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la anterior reivindicación caracterizado porque las sustancias utilizadas para la captura del complejo antígeno/anticuerpo se inmovilizan en ventanas específicas dibujando semicírculos o líneas complementarias para formar un círculo y gráficos en forma de letras B y A. 10- Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo de captura del complejo antígeno/anticuerpo para la identificación de los antígenos, consiste en un anticuerpo específico anti-A y anti-B monoclonal y policlonal purificado. 11- Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la anterior reivindicación caracterizado porque los anticuerpos anti-A y anti-B, utilizados para la captura del complejo antígeno/anticuerpo, se inmovilizan en zonas o ventanas en forma de las letras del grupo y el reactivo de captura para la identificación de aglutininas, se inmovilizarán en las ventanas sustancias dibujando semicírculos y un gráficos específicos. 12- Un procedimiento y un dispositivo basado en un inmunoensayo para determinar el grupo ABO según la primera reivindicación caracterizado porque la detección de los grupos A, B y O se realiza por medio de la detección de las aglutininas. El dispositivo contiene zonas o ventanas para la visualización del resultado dispuestas lateralmente, una al lado de la otra. Para capturar el complejo antígeno/anticuerpo se inmoviliza, en una ventana, la sustancia A en forma de semicfrculo en sentido horizontal, con la parte convexa hacia abajo y la sustancia B también en forma de semicfrculo completando el anterior para formar un círculo. Además para producir el grupo A se inmoviliza o fija en la ventana contigua sustancia B en forma A preferiblemente con la parte superior redondeada (Figura 3). Para producir el grupo B se fija o imnoviliza sustancia A en forma de letra B sobre la letra A de manera que las tres líneas trasversales vayan paralelas a diferentes alturas a la línea trasversal de la A; las líneas laterales van también paralelas a las de la A. Se prefiere redondear ligeramente el ángulo recto formado por las líneas transversales y la línea lateral derecha. Como se indicó, en la zona de detección se incorpora anti-IgG humana conjugada con el marcador. 13- Un procedimiento y un dispositivo basado en un inmunoensayo para determinar el grupo ABO según la reivindicación anterior caracterizado porque los tramos comunes del gráfico ilegible formado por la superposición de las letras A y B se dejan pregrabados en la membrana del dispositivo en un color similar al producido por la reacción en el resto del gráfico. 14 - Un procedimiento y un dispositivo basado en un inmunoensayo para determinar el grupo
ABO según la primera reivindicación caracterizado porque la detección de los grupos A, B y AB se realiza por medio de la detección de las sustancias del grupo ABO y del grupo O por detección de las aglutininas. El dispositivo contiene zonas o ventanas para la visualización del resultado dispuestas lateralmente, una al lado de la otra. Para capturar el complejo antígeno/anticuerpo se inmoviliza, en la ventana de la izquierda, un anticuerpo anti-A dibujando una letra A y en la ventana contigua un ventana contigua un anti-B en forma de B. En la ventana restante se disponen sustancias A y B en forma de semicfrculo según la reivindicación anterior. Én la zona de detección se incorpora anticuerpos anti-A, anti-B y anti-IgG humana conjugados con el marcador. 15- Un procedimiento y un dispositivo basado en un inmunoensayo para detenninar el grupo ABO según la primera reivindicación caracterizado porque el dispositivo puede contener tabiques de separación en una misma tarjeta varias cámaras de muestra o dos tarjetas separadas en una con un tabique de separación. Además puede contener hendiduras para poder desechar una parte de la tarjeta. 16- Un procedimiento y un dispositivo para determinar el grupo sanguíneo ABO basado en un inmurioensayo en tarjeta de tipo "lateral flow" para detectar las sustancias que identifican el grupo de forma por medio de signos más o menos (+/-)con letras preimpresas adyacentes adosadas. ' Para identificar el Rh el procedimiento sería similar a lo descrito anteriormente produciendo una línea vertical en lugar de una letra sobre una línea horizontal de control. La línea vertical se . consigue capturando con un anticuerpo anti-D el complejo antígeno-anticuerpo conjugado con el • reactivo indicador.
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