WO2005056778A1

WO2005056778A1 - 造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法

Info

Publication number: WO2005056778A1
Application number: PCT/JP2004/018860
Authority: WO
Inventors: Kazuo Todokoro; Hiroyuki Satofuka; Yoshikazu Kuwahara
Original assignee: Riken
Priority date: 2003-12-11
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2005-06-23
Also published as: JPWO2005056778A1

Abstract

本発明は、造血幹細胞を未分化に抑制又は増殖する方法、造血幹細胞の分化抑制又は増殖剤などを提供する。より具体的には、本発明は、造血幹細胞を、Ｗｎｔ２及びＷｎｔ５ａから選ばれる一種以上のタンパク質の存在下で培養することを特徴とする造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法；（ａ）フィーダー細胞、（ｂ）Ｗｎｔ２及びＷｎｔ５ａから選ばれる一種以上のタンパク質及び（ｃ）一種以上の造血因子又は細胞刺激因子を含み、かつ血清を含まないことを特徴とする造血幹細胞培養系；Ｗｎｔ２及びＷｎｔ５ａから選ばれる一種以上のタンパク質を含有する造血幹細胞分化抑制又は増殖剤などを提供する。

Description

明細書

造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法技術分野

本発明は、造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法、造血幹細胞の製造方法、その方法によって得られる造血幹細胞、その培養法で用いられる培養系、造血幹細胞の増殖または分化を調節する物質をスクリーニングする方法、造血幹細胞の分化抑制又は増殖剤などに関する。背景技術

最近では、 Wn tと称されるタンパク質が造血幹細胞との関係で盛んに研究されている。例えば、 We i s smanらは Wn tシグナルが幹細胞を増幅できる可能性があると報告している（N a t u r e, VOL. 423, 2003, p p 409— 414) 。この報告では、従来幹細胞の自己複製に必要であるとされていた Ho xB 4や分化抑制シグナルに必要な No t c hの発現も誘導できることから、幹細胞の増幅や維持における Wntフアミリ一の重要な役割が示された。また、 Ma t t h ewsらは、マウス胎児肝において Wn t 5 aと Wn t 10 bが発現していること、 Wn t 10 bは造血幹細胞も発現していること、 Wn t 5 aまたは Wn t 10 bを発現させた細胞の培養上清は 5倍程度に幹細胞を増幅したこと報告している（BLOOD, VOL. 89, 1997, p p 36 24— 3635) 。 Ho f f ma nらはヒト胎児骨髄に Wn t 2 b (これは Wn t 13に対応する）、 Wn t 5 a、 Wn t 10 bが発現しており、 Wn t 5 aはヒ卜造血幹細胞にも発現していると報告している（非特許文献 1 ； BLOOD, VOL. 92, No. 9， 1998, pp 3189— 3202) 。しかし、これらの Wn tは体外培養系で造血幹細胞の自己複製を促進するかどうかについては示されておらず、そもそも胎児の骨髄で造血は行なわれていない。 Bha t i aらは Wn t 5 aで造血幹細胞を体外では増幅できないが、 Wn t 5 aを含む培養上清をマウスに投与すると 3倍程度幹細胞が増幅したと報告している（非特許文献 2 ： PNAS, VOL. 100, No. 6, 2003, p p 342 2 - 3 4 2 7 ) 。この文献では、 Wn tによる幹細胞の体外での増幅効果は殆ど無いと報告されている。

また、 N u s s eらは Wn t 3 aを可溶性タンパク質として純化に成功し、 W n t 3 a単独で、造血幹細胞を約 6倍に増幅できたと報告している（N a t u r e , V O L . 4 2 3 , 2 0 0 3 , p p 4 4 8— 4 5 2 ) 。しかしな力 Sら、この実験では、幹細胞が分化してしまっており、純粋に幹細胞だけを増幅している訳でもない。また、増幅の程度は、約 1 . 7倍であり、実用化レベルではない。以上の報告からは、 Wn tが実際に単独で体性幹細胞の自己複製因子としての機能を持っているのか、 W n tが全ての体性幹細胞を自己複製させる能力があるのか否か、オートクラインで自己複製するとする矛盾をどう説明できるのか、また Wn tファミリ一のどのメンパーがどの体性幹細胞を制御しているのか（特異性）、などの疑問点は未だ解明されていない。

発明の開示

上記したように、造血幹細胞の増殖との関係で Wn tタンパク質は種々検討されてきたが、どの Wn tタンパク質が実際に実用的レベルの造血幹細胞の分化抑制能又は増殖能を有するかについては未だ究明されておらず、そのようなタンパク質を用いて造血幹細胞を未分化に抑制する方法あるいは増殖する方法は未だ知られていない。従って、造血幹細胞の分化抑制能又は増殖能を有するタンパク質を特定することができ、そのタンパク質を用いて造血幹細胞の分化を抑制し、又は増殖させることができれば、血液関連の種々の疾患の治療あるいは研究に有効である。

本発明者等は鋭意研究の結果、成体マウス骨髄ストローマ細胞には Wn t 2、 Wn t 5 aが発現しており、成体ヒト骨髄ストローマ細胞には Wn t 2、 Wn t 5 a及び Wn t 5 bが発現し、 Wn t 2が最も多く発現していることを見出した。本発明者等は、この新たな知見に基づいて研究を続けた結果、 Wn t 2または Wn t 5 aを用いることにより、造血幹細胞の分化を抑制し、あるいは増殖させることができることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、次のような、造血幹細胞の分化抑制及び Z又は増殖方法、その方法によって得られる造血幹細胞、造血幹細胞の製造方法、その培養法で用いられる培養系、造血幹細胞の増殖または分化を調節する物質をスクリーニングする方法、造血幹細胞の分化抑制又は増殖剤などを提供する。

(1) 造血幹細胞を、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質の存在下で培養することを特徴とする造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法。

(2) 一種以上の造血因子又は細胞刺激因子の存在下、かっ血清の非存在下で培養を行なう前記（1) に記載の方法。

(3) S CF及び TP 0から選ばれる一種以上の造血因子の存在下で培養を行なう前記（2) に記載の方法。

(4) Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質を培養系に添加し、あるいはそのタンパク質を発現させたフィーダ一細胞上で培養する前記

(3) に記載の方法。

(5) 前記（1) 〜（4) のいずれかの方法によって得られる造血幹細胞。

(6) 造血幹細胞を、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質の存在下で培養する工程を含んでなる、造血幹細胞の製造方法。

(7) (a) フィーダ一細胞、（b) Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質及び（c) 一種以上の造血因子又は細胞刺激因子を含み、かつ血清を含まないことを特徴とする造血幹細胞培養系。

(8) フィーダ一細胞として、無血清下で生存可能な C 127細胞を含む前記 (7) に記載の培養系。

(9) 無血清下で生存可能なフィーダ一細胞を用いることを特徴とし、（a) フィーダ一細胞および造血幹細胞を含み、かっ血清を含まないことを特徴とする培養系に試験物質を共存させる工程、（b) 試験物質が共存した培養系で造血幹細胞を培養する工程、及び（c) 試験物質非共存下の場合と比較して、試験物質共存下の場合における造血幹細胞の割合およびまたは数の変化を測定する工程を含む、造血幹細胞の増殖または分化を調節する物質をスクリーニングする方法。

(10) Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質を含有する造血幹細胞分化抑制又は増殖剤。 (11) さらに、造血因子又は細胞刺激因子を含む前記（10) に記載の造血幹細胞分化抑制又は増殖剤。

(12) 前記造血因子として、 S CF及び TP 0から選ばれる一種以上の造血因子を含む前記（11) に記載の造血幹細胞分化抑制又は増殖剤。

本発明の造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法を用いることにより、 in vitroZ ex vivoで造血幹細胞の培養、増殖等を行なうことができる。また、本発明の造血幹細胞の分化抑制又は増殖剤を用いることにより、造血幹細胞を未分化なまま、体内または体外で増殖させることができるので、放射線治療や制ガン剤等の化学療法剤による血球減少症の改善、リンパ球減少に起因する感染症の予防、骨髄形成不全症や骨髄抑制等の骨髄疾患の治療、白血病 ·高度腎障害 ·骨髄抑制等の骨髄疾患の治療、遺伝的疾患に由来する低血球症の治療、遺伝子治療時における組換え幹細胞の体外培養等に用いることができる。

また、本発明のスクリーニング法によれば、造血幹細胞の増殖または分化を調節する物質をスクリ一二ングすることができるので、造血幹細胞レベルの疾患の解明や新たな治療法 ·治療剤の開発に有用である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。 1. 造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法、および造血幹細胞の製造方法

本発明の第一の態様によれば、造血幹細胞を、 Wn t 2及び Wn t 5 aカら選ばれる一種以上の蛋白質の存在下で培養することを特徴とする造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法（以下、「培養法」ともいう）が提供される。ここで、「造血幹細胞」とは、顆粒球系細胞（mye 1 o i d) 、リンパ球系細胞（1 ymph o i d) , 赤血球系細胞（e r y t h r o i d) 、巨核球系細胞（me g a k a r y o c y t e ) 等を含む全ての血球細胞へ分化する能力を有し、且つ自己複製能を有する細胞をいう。造血幹細胞を体外で培養するためには、何らかの造血因子又は細胞刺激因子の共存が必要であり、このような因子の非存在下では造血幹細胞はすぐに死滅してしまう。一方、このような因子の存在下では造血幹細胞は容易に分化してしまう。造血幹細胞は分化してしまうと自己複製能を失う。造血幹細胞の分化を抑制するとは、通常であれば造血幹細胞の分化が進むような条件下で、自己複製能を保持した造血幹細胞の存在割合および/または数を高めることを意味する。造血幹細胞の増殖（または増幅とも言う）とは、自己複製能を保持した造血幹細胞が増えること即ち自己複製することを意味し、造血幹細胞から分化した細胞が増えることは造血幹細胞の増殖に該当しない。

本発明で用いる Wn t 2及び Wn t 5 aは公知の蛋白質であり、そのアミノ酸配列および該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は以下の配列データベースから入手できる。ヒト Wn t 2遺伝子及びヒト Wn t 5 a遺伝子は、 Ge nB an kに、それぞれ、 Ac c e s s i on No. NM— 003391及び A c c e s s i on No. NM— 003392として登録されている。ヒト Wn t 2夕ンパク質及びヒト Wn t 5 aタンパク質は、 NCB I En t r e z P r o t e i n Da t ab a s eに、それぞれ、 Ac c e s s i on No. NP— 0 03382及び Ac c e s s i on No. NP— 003383として登録されている。マウス Wn t 2遺伝子及びマウス Wn t 5 a遺伝子は、 Ge nB a n kに、それぞれ、 Ac c e s s i on No. BC026373及び A c c e s s i on No. BC 018425として登録されている。マウス Wn t 2夕ンパク質及びマウス Wn t 5 aタンパク質は、 NCB I En t r e z P r o t e i n Da t ab a s eに、それぞれ、 Ac c e s s i on No. P 21 552及び Ac c e s s i on No. A AH 18425として登録されている。本発明で用いる Wn t 2及び Wn t 5 aは、いずれの種由来のものでもよいが、好ましくはヒト由来である。また、ヒト Wn t 2及び Wn t 5 aと同等の活性を保持している限り、ヒト蛋白質のアミノ酸配列に対して欠失、置換、挿入、及び /または付加が生じたアミノ酸配列からなる変異蛋白質も Wn t 2及び Wn t 5 aと同様に使用しうる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質がヒト W n t 2及び Wn t 5 aと同等の活性を保持している限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内（例えば、 60アミノ酸以内）、好ましくは 10ァミノ酸以内、より好ましくは 1〜数個（例えば、 1〜6個）、さらに好ましくは 1〜3個、さらに好ましくは 1〜2個である。本発明で用いる Wn t 2及び Wn t 5 aは、該蛋白質を発現している細胞や組織から調製することができ、またべプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザ一 433 A型、アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。本発明で用いる Wn t 2及び Wn t 5 aは、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも使用することができ、また、蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、糖鎖修飾、脂質修飾等、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。

本発明において用いる造血幹細胞は、例えば、ヒト及びマウス等の哺乳動物の胎児肝臓、骨髄、末梢血、臍帯血等から採取できるが、造血幹細胞が含まれる限りその採取源を問うものではない。またその調製、単離は、目的とする造血幹細胞のマーカーを指標として通常の方法により行なうことができる。例えば、マウスでは、細胞分化抗原（L i n e g e) が陰性であり、かつ c- kitならびに Sea- 1陽性の細胞の内、 CD34抗原が陰性から弱陽性の性質を示す細胞に造血幹細胞の性質が見いだされている（Osawa, M.， Science, 27-3:242, 1996) 。ヒト造血幹細胞のマーカーとしては CD 34抗原が知られており、特により未分化なマーカーとして CD 34抗原陽性、 CD 38抗原陰性、細胞分化抗原陰性があることが知られている（Bha t i a e t a 1. , P r o c. Na t l . Ac a d. S c i. U. S. A. 94, 5320-5325, 1997) 。また、場合によっては、造血幹細胞を単離することなく、ヒト又はマウス骨髄由来等の有核細胞あるいは幹細胞分画をそのまま培養に供することもできる。例えば、マウス骨髄由来等の幹細胞分画として SP (s i de p opu l a t i on) 細胞分画（造血幹細胞を約半分弱含み、他の組織幹細胞も含むと考えられている）を用いることもできる。本発明によれば、上記のようにして採取した造血幹細胞または造血幹細胞分画を、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上の蛋白質の存在下で培養する。細胞の in vitro培養は、公知の細胞培養技術を用いて行なうことができる（例えば、新生化学実験講座 18 細胞培養技術（日本生化学会編、東京化学同人発行、 1989) 等参照）。造血幹細胞の培養は、培養用のシャーレ、フラスコ、あるいは培地組成、 pHなどを機械的に制御できるバイオリアクターにおいて適当な培地を用いて行なうことができる。培養に用いる適当な培地は、造血幹細胞の生存 ·増殖が阻害されない限り特に制限されないが、例えば、 SF—02培地（三光純薬）、〇p t i—MEM培地（G I BCO BRL) 、 MEM培地（G I B CO BRL) 、 DMEM培地（G I BCO BRL) 、 I MDM培地（G I B C

0 BRL) 、 PRM I 1640培地（G I BCO BRL) 、 RD培地（RPM

1 1640： DMEM = 1 : 1 [V/V 混合培地）等が挙げられる。培養系には、通常、添加される成分、例えば、インスリン、トランスフェリン、ラクトフエリン、 2—メルカプトエタノール、エタノールァミン、亜セレン酸ナトリウム、および HE PES、血清（例えば、ゥシ胎児血清、ヒト血清、ゥマ血清）、モノチォグリセロール、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビ夕ミン、各種アミノ酸、各種増殖因子が必要に応じて添加される。

本発明の培養法においては、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上の蛋白質に加え、造血因子又は細胞刺激因子、あるいはその両方を培養系に添加することによって、より有効に造血幹細胞の分化抑制および Zまたは自己複製を行なうことができる。ここで、「造血因子又は細胞刺激因子」とは、造血細胞に自己複製、増殖、分化、生存、遊走などの刺激を与える因子を広義に意味する。ここで用いられる造血因子又は細胞刺激因子は、造血幹細胞の生存 ·増殖を阻害しない限り特に限定されない。好ましく用いられる造血因子又は細胞刺激因子としては、例えば、 S CF (幹細胞成長因子； s t em c e l l f a c t o r) , ΤΡ〇（トロンポポェチン）、 I L— 3 (インターロイキン一 3) 、 I L一 11 (インタ一ロイキン一 1 1) 、 GM— CSF (顆粒球マクロファージ 'コロニー刺激因子； g r anu l o c y t e/mac r oph ag e c o l ony— s t imu l a t i ng f a c t o r) 、 G— CSF (顆粒球コロニー刺激因子； g r anu l o c y t e c o l ony— s t imu l a t i ng f ac t o r) 、 TGF-/3 (トランスフォーミング成長因子一 /3) 、 MI P— 1 α、 F 1 t 3/F 1 k 2— 1 i g and、 EPO (エリスロポエチン）、 No t c hリガンド（J agge dファミリー、 De l t aファミリ一）、 T i e 2リガンド (アンジオボェチン）、 BMP 4、 F 1 k 2/F 1 k 3リガンド、 FL、 b FG F、オンコス夕チン M、 I L 6/s I L 6R、 E G Fおよび L I F等が挙げられる。本発明で使用される造血因子又は細胞刺激因子は、遺伝子組換え技術、ぺプチド合成法、細胞培養法等により製造されたヒト、マウス等の哺乳動物由来の蛋白質を含む。さらにここで用いられる造血因子又は細胞刺激因子は、アミノ酸配列の 1部（例えば、 1〜数個（例えば、 1〜6個））、好ましくは 1〜 3個）が置換、挿入、付加及び/または欠失した変異蛋白質でも、活性を保持している限りにおいて使用しうる。または、各因子を発現させたフィーダ一細胞を用いてもよい。

培養系に添加される造血因子又は細胞刺激因子の量は、一般的には因子特異的であるが、因子は、造血幹細胞培養培地に、通常、約 1 n gZm 1〜約 100 n g/m 1の間の濃度で、好ましくは約 5 n g/m 1〜約 50 n g/m 1の濃度で、より好ましくは約 5 n gZm 1〜約 30 n gZm 1の間の濃度で添加される。本発明の培養方法においては、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質、および各種造血因子又は細胞刺激因子から選ばれる一種以上を培養系に添加することもできるが、それらタンパク質や因子を発現させたフィーダ一細胞上で造血幹細胞を共培養してもよい。ここで好ましく用いられるフィーダ一細胞としては、 X線処理等で増殖能を欠損させた骨髄細胞または骨髄ストローマ細胞、 A GM領域由来細胞、線維芽細胞、胎児肝臓由来細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、および前脂肪細胞等を用いることができる。本発明の特に好ましい態様によれば、培養系に血清を添加しない無血清培地で培養を行なう。無血清培地で特に好ましく用いられるフィーダ一細胞としては、 C 127細胞が挙げられる。なお、本発明で好ましく用いられる、無血清培地で生存、長期培養、および/または増殖できる C 127細胞は、例えば、次のようにして得ることができる。まず、 C 127細胞を、 1 %FC S + 5 %KS R入りの DMEMで 1ヶ月ほど掛けて生き残る細胞を選択し、更に 0. 1%FCS + 5%KSRを含むDME Mでも生き残る細胞を増殖する。次いで完全無血清の DMEM+ 5 %KSRで増幅する細胞を限界希釈法によってクローン化した細胞を、無血清培地で生存、長期培養、および Zまたは増殖可能な C 127細胞とする。

フィーダ一細胞に Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質や、各種造血因子又は細胞刺激因子を発現させるには、それらタンパク質や因子のァミノ酸配列をコードする D N Aを含んでなる組換えベクターを作製し、該組換えべクタ一をフィーダ一細胞に導入すればよい。

なお、培養は、例えば、 33〜39で（好ましくは 37°C) の温度で、 3〜 6 % C O 2 (好ましくは 5%) 下、 5〜50日間行なう。造血幹細胞の分化抑制および/または自己複製の結果は、 Herzenberg, L. A. rweir' s Handbook of Experimental Immunology, 5th editionj ， Blackwell Science Inc. 1997」、 Spangrude, G. J.， Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A., 87:7433-7437, 1990; Visser, J. M. W. , Flow cytometry in hematology] , Academic Press, p9-29, 1992等を参考に細胞表面抗原を指標に確認することができる。例えば、ヒト造血幹細胞のマーカーとしては、少なくとも CD 34抗原陽性、好ましくは CD 34抗原陽性、 CD 38抗原陰性、細胞分化抗原陰性であることをヒト造血幹細胞の指標として用いることができる。造血幹細胞の存在を ¾認する手段として放射線照射マウスを用いた移植実験系、または、 in vitro (インビトロ）のコロニー形成法 (Bradley, T. R. , J. Exp. Med., 44: 287-299, 1966)を用いることも可能である。放射線照射マウスを用いた移植実験系では、放射線照射し造血系に障害を与えたマウス (レシピエント) に、他のマウス（ドナ一）から分離した骨髄細胞や造血幹細胞含有画分を移植する。移植後、レシピエント由来とドナー由来の造血系細胞の割合（キメリズム）を指標に、長期骨髄再構築能を有する造血幹細胞の存在を確認する（Osawa, M. , Science, 273: 242-245, 1996, B h a t i a e t a 1. , P r o c. Na t l . Ac ad. S c i. U. S. A. 94, 5320— 5325, 1997)。コロニー形成法において、造血幹細胞を種々の血液細胞が出現できるように種々めサイ卜力インを添加した培地にて培養すると、分化方向の決定された造血前駆細胞は、小数あるいは、単一な分化系列の細胞しか含まないコロニーを形成するが、多分化能を持つ造血幹細胞は、複数の分化系列の血液細胞を含むコロニーを形成することができる。特に、赤血球を含む混合コロニ一 ( C F U - Em i x ) を形成することが、ヒトでは造血幹細胞の指標とされている。

本発明は、上述の本発明の培養方法を用いることを特徴とする、造血幹細胞の製造方法を提供する。本発明の製造方法は、（a ) 造血幹細胞を、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質の存在下で培養する工程を含んでなることを特徴とする。本発明の製造方法は、更に以下のような工程を含むことができるが、これらに限定されるものではなく、本発明の培養方法や培養系に準じた工程を適宜含み得る；（b ) —種以上の造血因子又は細胞刺激因子の存在下、かっ血清の非存在下で培養を行なう工程、（c ) 造血幹細胞をフィーダ一細胞と共培養する工程、（d ) フィーダ一細胞に Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質を発現させる工程。 2 . 上記培養方法によって得られた造血幹細胞

上記本発明の方法によって得られた造血幹細胞は、従来の骨髄移植や臍帯血移植に代わる造血幹細胞移植用に用いることができる。例えば、自己免疫疾患等の骨髄移植によってその改善の見られる疾患に対しては、自己あるいは非自己の幹細胞を増殖させるに際し、本発明による幹細胞増殖技術を利用することができる。具体的には、本発明の方法により得られた造血幹細胞は、様々な白血病に対する全身 X線療法や高度化学療法を行う際に、これらの治療と組み合わせて用いることができる。また、造血幹細胞は、例えば、固形癌患者の化学療法、放射線療法等の骨髄抑制が副作用として生じる治療を実施する際に、施術前に骨髄を採取しておき、造血幹細胞を試験管内で増幅し、施術後に患者に戻すことで、副作用による造血系の障害から早期に回復させることができ、より強力な化学療法を行えるようになる。

また、本発明を利用して、患者あるいは他人の造血幹細胞を各種血液細胞に分化させ、それらを患者の体内に移入することにより、各種血液細胞の形成が不十分な患者を治療することができる。また、本発明の培養方法によって得られる造血幹細胞は、再生不良性貧血などの貧血を呈する骨髄低形成に起因る造血不全症を改善することができる。その他、本発明の培養方法によって得られる造血幹細胞の移植が有効な疾患としては、慢性肉芽腫症、重複免疫不全症候群、無ガンマグロプリン血症、 Wi s ko t t— A l d r i c h症候群、後天性免疫不全症候群（AI DS) 等の免疫不全症候群、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、 Gau c h e r病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症、各種の癌または腫瘍等が挙げられる。

造血幹細胞の移植は、使用する細胞以外は、従来行われている骨髄移植や臍帯血移植と同様に行なうことができる。なお、本発明の移植片は、本発明の方法によって増殖した造血幹細胞を含む細胞成分の他に、緩衝液等を含む組成物として用いることもできる。

3. 細胞培養系及びこれを用いるスクリーニング方法

本発明の他の態様によれば、（a) フィーダ一細胞、（1:) 11セ 2及び\¥11 t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質及び（c) 一種以上の造血因子又は細胞刺激因子を含み、かっ血清を含まないことを特徴とする造血幹細胞培養系を提供する。このような無血清培養系においては、無血清下で少なくとも生存可能な、好ましくは長期培養、および/または増殖可能なフィーダ一細胞を用いる必要がある。好適なフィーダ一細胞は、無血清下で生存可能なように調製した C 127 細胞である。このような無血清培養系は、造血幹細胞の分化または増殖を調節する物質をスクリーニングする方法に利用することができる。すなわち、本発明の造血幹細胞の増殖または分化を調節する物質をスクリーニングする方法は、無血清下で生存可能なフィーダ一細胞を用いることを特徴とし、（a) フィーダ一細胞および造血幹細胞を含み、力つ血清を含まないことを特徴とする培養系に試験物質を共存させる（添加あるいはフィーダ一細胞に発現させる）工程、（b) 試験物質を共存させた（添加あるいはフィーダ一細胞に発現させた）培養系で造血幹細胞を培養する工程、及び（c) 試験物質非共存下（非添加または非発現）の場合と比較して、試験物質共存下（添加または発現）の場合における造血幹細胞の割合および/または数の変化を測定する工程を含む。本発明のスクリーニング方法において、例えば、造血幹細胞の増殖促進活性を有する物質を試験するに際しては、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質を培養系に含めておく（添加あるいはフィーダ一細胞に発現させる）ことにより、幹細胞の分化を抑制した状態で試験物質の増殖促進活性をより有効に試験することが可能である。また、必要に応じて造血因子又は細胞刺激因子の一種以上を培養系に含めてもよい。増殖または分化の調節とは、増殖抑制、増殖促進、分化抑制および分化促進の何れかのことであり、特に増殖促進が好ましい。

このスクリーニングにおいて用いる試験物質としては、細胞の培養上清、精製タンパク質若しくはペプチド、合成化合物、微生物や植物に由来する天然物、造血幹細胞の増殖あるいは分化を促進する因子を産生していることが予想される支持細胞により産生される蛋白質や生体物質などが挙げられる。試験物質の活性は、培養系において試験物質の存在下及び非存在下において、処理前後の細胞に含まれる造血幹細胞の割合および Zまたは数を算出することで測定することができる。細胞に含まれる造血幹細胞の割合および/または数は F A C Sによつて求めることができる。造血幹細胞の分化は、分化した細胞に特異的な抗原に対する抗体により、 F A C Sあるいは蛍光抗体法で測定することができる。たとえば、 B細胞の特異抗原として B 2 2 0、顆粒球の特異抗原として G r— 1、赤芽球系細胞の特異抗原として T E R 1 1 9が使用できる。また、 C F U— GM、 C F U— M i x、 C F U—S等のコロニーアツセィにより測定することができる。このようなスクリーニングの結果、有意な造血幹細胞の自己複製 ·増殖、分化抑制、または分化が検出されれば、スクリーニングに用いた試験物質は、造血幹細胞の増殖または分化を調節する因子であると判定される。このような因子は、特に血液系疾患の治療薬開発において有用である。 4. 造血幹細胞の分化抑又は増殖剤

本発明の他の態様によれば、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質を含有する造血幹細胞分化抑制又は増殖剤（以下、単に、「造血幹細胞増殖剤」ともいう）が提供される。本発明の増殖剤は、好ましくは、 Wn t 2 及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質に加えて、上記した造血因子又は細胞刺激因子の一種以上、例えば、 S C F、 T P Oまたはその両方を含有する。

本発明の造血幹細胞増殖剤は、造血幹細胞を未分化なまま、体内または体外で増殖させることができるので、上記した i n V i t r oにおける造血幹細胞の培養 ·増殖方法において用いることができる他、放射線治療や制ガン剤等の化学療法剤による血球減少症の改善、リンパ球減少に起因する感染症の予防、骨髄形成不全症や骨髄抑制などの骨髄疾患の治療、白血病、高度腎障害 ·骨髄抑制などの骨髄疾患の治療、遺伝的疾患に由来する低血球症の治療、遺伝子治療時における組換え幹細胞の体外培養等に用いることができる。

本発明の造血幹細胞増殖剤は、経口、非経口、骨髄等の局所その他の適当な経路で投与することができる。造血幹細胞増殖剤の望ましい投与量は、その有効成分（上記 Wn tタンパク質、及び必要に応じて造血因子又は細胞刺激因子それぞれを「有効成分」という）として、 1日あたり 1〜1 0 0 0 i GZ k g体重程度で、好ましくは 5〜5 0 0 ^ 71^ 8体重程度であるが、患者の体重および症状や個々の投与経路によって当然変動する。場合によっては前記範囲の下限より低い投与量が適当なこともあるし、前記範囲より投与量を多くしてもそれを 1日に何回にも分けて少量ずつ投与すれば有害な副作用を生じない場合もある。

本発明で用いられる上記有効成分は、前記 3つの投与経路のいずれをとつても単独または薬学的あるいは薬剤学的に許容される担体または希釈剤と共に投与することができ、またその投与は 1回または数回に分けて行うことができる。より具体的に述べると、本発明の増殖剤は様々な種類の投与形態で投与することができ、たとえば各種の薬剤学的に許容される不活性担体と併用して錠剤、カプセル、薬用ドロップ、トローチ、硬質キャンディ、粉末剤、噴霧剤、クリーム、膏薬、坐薬、ゼリー、ジエル、ペースト、ローション、軟膏、水性懸濁液、注射液、ェリキシル、シロップ等の形態とすることができる。これらの担体には、固体希釈剤または賦形剤、無菌水性媒体、各種の非毒性有機溶媒等が含まれる。実施例

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 (実施例 1 )

1 . マウス及びヒト成体骨髄ストローマ細胞で発現している Wnt遺伝子の同定 1 . 1 骨髄幹細胞の調製

非働化したゥシ胎児血清 (FCS)を 2%含むリン酸緩衝化生理食塩水 (PBS)を、 26 ゲージの針で骨髄腔に一気に注ぐことにより、マウス骨髄細胞を 8週令の C57BL/6マウス（Charles River)から調製した。 ¹成人ヒト骨髄細胞を、インフォ —ムドコンセントと、施設内倫理委員会の承認に基づいて正常ドナ一の後腸骨稜 (pos terior i l iac cres t)から得た。細胞懸濁液を Ly即 hop rep (Nycomed)上に置き、 800 gで 20分間遠心した。単核細胞を回収し、 2% の FCSを含む PBSで洗浄した。そして、接着細胞を 10% の FCSを含む IMD培養液 (Gibco- BRL)で 10日間培養した。全 RNAは AGPC法で単離した後、 degenerat ive RT- PCRで発現している W n tの種類を同定した。

1 . 2 Degenerat ive RT-PCR解析

逆転写ポリメ一ラーゼ連鎖反応 (RT- PCR)を以下のように行った。第一鎖 (f irs t s t rand) cDNAを Superscript I I (Gibco- BRL)を用いて合成した。 PCR の増幅は LA Tag polymerase (Takara)とデジエネレートプライマ一

5' - TG (C/T) AA (G/A) TGCCA (C/T) GG (G/C) -3' (配列番号 1 )

5 ' - (G/A) CAGCACCAGTGGAA-3 ' (配列番号 2 )

を用いて、 94° Cで 1 分を 1サイクル、 94° Cで 1 分、 54° Cで 30秒； 72° C で 45 秒を 60サイクル、そして 72° Cで 5 分を 1サイクル行った。精製した PCR産物を、 pBluescr iptにサブクローニングし、そして核酸配列を ABI 3700 ジェネティック ·アナライザ一（Appl ied Biosys tems)を用いて決定した。この方法によって、マウスでは Wn t 2、 Wn 1 5a, ヒトでは Wn t 2、 Wn t 5a、 W n 1 5bが発現していることを見いだした。両者とも Wn t 2が最も多く発現されていた。

2 . Wntを用いた幹細胞分画の増殖アツセィ

2 . 1 造血幹細胞の調製

有核細胞を 7- 8週令の lacZ トランスジエニックマウス（B6 ; S129- Gt (R0SA26) Sorの骨髄細胞から、 Lymphoprepを用いた遠心によって調製した。 2% FCSを含む PBS中に懸濁した細胞（1 X 10⁶細胞/ ml)を Hoechs t33342 (l.

と、 Rhodamme l23 (0. 1 g/ml)で染色した。造血幹細胞に富んだ分画である、 s ide populat ion (SP)細胞を FACS Vantage SEセルソ一ター (商標： Beckton Dickinson Bioscience)で単離した。一匹のマウスから約 4000個の SP細胞を単離した。 lacZ トランスジエニックマウスから、マウス骨髄造血幹細胞である Lin 陰性 c—Ki t陽性 Seal陽性 CD34陰性または lowの細胞分画を FACSを用いて単離した。一匹のマウスから約 10000個の細胞を単離した。

2 . 2 in vi troでの幹細胞の自己複製アツセィ

マウス又はヒ卜の全長 Wnt2及び Wnt5aの cDNAを K0D+ DNA polymeraseを用いた RT-PCRで単離し、 Wnt cDNAの完全な核酸配列がデ一夕べ一スに登録されている配列と同一であることを確認した。 PCDNA3. 1発現べクタ一にマウスまたはヒトの各 Wntの c D NAを組換え、 C127細胞に Lipofect Amine 2000 (invi trogen) を用いてトランスフエクトし、 G418 (l mg/ml)に耐性の安定発現細胞を無血清培地（DMEM+5%の KSR (Knockout serum replacement) (Gibco) ) 中に維持した。 Wnt の発現は RT- PCRでは確認済みであり、一部抗体が利用できる Wnt5aに関してはウェス夕ン解析で発現を確認した。

組み換え Wntを発現する C127 トランスフエクタントまたは組み換え Wnt非発現 C127細胞を 2 4穴プレートに播種した後、単離した lacZ トランスジエニックマウス由来骨髄造血幹細胞を 5 0 0 0個/ゥエルで植え込み、共培養した。培地は無血清培地または T P 0および S C F添加無血清培地を用いた。 2日おきに培地を交換し 6日目に細胞をトリプシン消化して回収し、 /3 - Gal 陽性細胞即ち lacZ トランスジエニックマウス由来の細胞を f luorescein di- jQ - galactopyranos ideを基質に用いて蛍光発色によって分画し、その中の Lin陰性 c一 Ki t陽性 Seal陽性細胞（造血幹細胞）の割合を算出した。

組み換え Wnt発現 C127 トランスフェクタントまたは組み換え Wnt非発現 C127 細胞と、マウス骨髄造血幹細胞の共培養において、 T P Oおよび S C Fを添加していない無血清培地で培養した場合、 3日後には lacZトランスジエニックマウス由来細胞は生存しておらず、造血幹細胞は維持も増幅もできなかった。組み換え Wnt非発現 C127細胞との共培養において、 T P〇および S C F添加無血清培地で培養した場合、回収した jS _Gal 陽性細胞のうち 8 8 %は i n陽性細胞であり分化した細胞であった。 1 2 %は Lin陰性 c -Ki t陽性 Seal陽性細胞であり幹細胞であると考えられた。これは従来の幹細胞のサイトカインを用いた増幅結果とほぼ一致したものである。一方、組み換え Wnt発現 C127 トランスフエクタントとの共培養において、 T P Oおよび S C F添加無血清培地で培養した場合、回収した ]3 - Gal 陽性細胞のうち 2 3 %〜2 7 % (マウス Wn t 2において 2 7 %、マウス Wn t 5 aにおいて 2 5 %、ヒト Wn t 5 aにおいて 2 3 %) は造血幹細胞であった。組み換え Wn t発現 C127 トランスフエクタントとの共培養の場合、共培養処理後生存している lacZ トランスジエニックマウス由来細胞における造血幹細胞の割合は、組み換え Wn t非発現 C127細胞との共培養の場合と比べて、マウス Wn t 2において 2 . 3倍、マウス Wn t 5 aにおいて 2 . 1 倍、ヒト Wn t 5 aにおいて 1 . 9倍を示した。即ち、 Wn t 2および Wn t 5 aは、 T P Oや S C Fのような造血幹細胞の分化を促す因子の在下において、造血幹細胞の分化を抑制し、未分化な状態を維持して生存させるのに有効であることが分かった。産業上の利用可能性

本発明の造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法、造血幹細胞の製造方法、並びに、本発明の造血幹細胞の分化抑制又は増殖剤を用いることにより、造血幹細胞を未分化なまま、体内または体外で増殖させることができるので、化学療法剤による血球減少症の改善、リンパ球減少に起因する感染症の予防、骨髄疾患の治療、白血病 ·高度腎障害 ·骨髄抑制等の骨髄疾患の治療などに用いることができる。また、本発明のスクリーニング法によれば、造血幹細胞の増殖または分化を調節する物質をスクリーニングすることができるので、造血幹細胞レベルの疾患の解明や新たな治療法 ·治療剤の開発に有用である。

Claims

請求の範囲

I. 造血幹細胞を、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質の存在下で培養することを特徴とする造血幹細胞の分化抑制又は増殖方法。

2. 一種以上の造血因子又は細胞刺激因子の存在下、かっ血清の非存在下で培養を行なう前記請求項 1に記載の方法。

3. SC F及び T P 0から選ばれる造血因子の一種以上の存在下で培養を行なう前記請求項 2に記載の方法。

4. Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質を培養系に添加し、あるいはそのタンパク質を発現させたフィーダ一細胞上で培養する前記請求項 3に記載の方法。

5. 前記請求項 1〜 4のいずれかの方法によって得られる造血幹細胞。

6. 造血幹細胞を、 Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質の存在下で培養する工程を含んでなる、造血幹細胞の製造方法。

7. (a) フィーダ一細胞、（b) Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質及び（c) 一種以上の造血因子又は細胞刺激因子を含み、かつ血清を含まないことを特徴とする造血幹細胞培養系。 ·

8. フィーダ一細胞として、無血清下で生存可能な C 127細胞を用いることを特徴とする前記請求項 7に記載の培養系。

9. 無血清下で生存可能なフィーダ一細胞を用いることを特徴とし、（a) フィーダ一細胞および造血幹細胞を含み、かっ血清を含まないことを特徴とする培養系に試験物質を共存させる工程、（b) 試験物質が共存した培養系で造血幹細胞を培養する工程、及び（c) 試験物質非共存下の場合と比較して、試験物質共存下の場合における造血幹細胞の割合および/または数の変化を測定する工程を含む、造血幹細胞の増殖または分化を調節する物質をスクリーニングする方法。

10. Wn t 2及び Wn t 5 aから選ばれる一種以上のタンパク質を含有する造血幹細胞分化抑制又は増殖剤。

I I. さらに、造血因子又は細胞刺激因子を含む前記請求項 10に記載の造血幹細胞分化抑制又は増殖剤。 O 2005/056778

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12. 前記造血因子として、 SCF及び TP 0から選ばれる一種以上の造血因子を含む前記請求項 11に記載の造血幹細胞分化抑制又は増殖剤。