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WO2004003181A2 - Procede de preparation de cellules souches adultes animales ou humaines et utilisation desdites cellules souches en therapie. - Google Patents

Procede de preparation de cellules souches adultes animales ou humaines et utilisation desdites cellules souches en therapie. Download PDF

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WO2004003181A2
WO2004003181A2 PCT/FR2003/002010 FR0302010W WO2004003181A2 WO 2004003181 A2 WO2004003181 A2 WO 2004003181A2 FR 0302010 W FR0302010 W FR 0302010W WO 2004003181 A2 WO2004003181 A2 WO 2004003181A2
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WO
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cells
cell
stem cells
tissue
animal
Prior art date
Application number
PCT/FR2003/002010
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English (en)
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WO2004003181A3 (fr
Inventor
Didier Montarras
Nicolas Borenstein
Christian Pinset
Original Assignee
Institut Pasteur
Celogos
Fondation De L'avenir
Centre National De La Recherche Scientifique
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Filing date
Publication date
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Priority to EP03761663A priority patent/EP1520009A2/fr
Priority to CA002491043A priority patent/CA2491043A1/fr
Priority to AU2003260637A priority patent/AU2003260637A1/en
Publication of WO2004003181A2 publication Critical patent/WO2004003181A2/fr
Publication of WO2004003181A3 publication Critical patent/WO2004003181A3/fr

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0652Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657Cardiomyocytes; Heart cells
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0607Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602Vertebrate cells
    • C12N5/0652Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662Stem cells
    • C12N5/0668Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to the field of tissue regeneration and repair by cell transplantation. More particularly, the present invention relates to a process for the preparation of adult stem cells which preserves the diversity and plasticity of these cells. The present invention also relates to the use of these stem cells obtained by the extraction process proposed in therapeutic applications, including gene and cell therapy.
  • the present invention provides a method of cell preparation meeting the need mentioned above. More particularly, the present invention relates to a cell preparation process capable of preserving the diversity and plasticity of vertebrate stem cells preferably originating from a tissue biopsy for their later use in the context of tissue regeneration or repair by transplantation. in an animal, like a human being.
  • the invention further relates to a defined culture medium, particularly useful during the implementation of the cell preparation process.
  • the present invention also relates to the cell preparation or the stem cells obtained by the method of preparation of the invention.
  • the present invention also relates to the use of these stem cells obtained by the preparation process proposed in therapeutic applications, including gene or cell therapy.
  • the present invention also relates to a cellular composition comprising human or animal stem cells obtained according to the method of preparation of the invention.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of stem cells capable of repairing or regenerating in vivo tissues or organs of a vertebrate.
  • the present invention also relates to a treatment method, characterized by the implantation of autologous or heterologous animal stem cells obtained according to the method of the invention in an animal.
  • the originality of the present invention relates to the fact that, unlike the cell preparation methods used in the field, the method of preparation of the present invention makes it possible: - to extract the cells under defined conditions without animal protein of origin extractive, therefore under sanitary conditions; to maintain cell viability through the use of antioxidant and anti-apoptotic molecules; - to preserve cellular diversity; to maintain the potential of cellular plasticity; maintain the potential for differentiation; improve implantation, colonization and differentiation of transplanted cells; and - to transplant the cells without having to go through an expansion step in in vitro culture.
  • Figures 1 to 5 are photomicrographs illustrating the detection of muscle cells grafted into the heart of sheep.
  • the cells were obtained by enzymatic dissociation of a skeletal muscle biopsy and then directly implanted, without expansion phase in in vitro culture, in the myocardium of the same sheep (autologous graft).
  • the presence of skeletal muscle cells is revealed using the antibody MY32 which specifically recognizes the heavy chain of skeletal myosin.
  • Figure 1 illustrates the detection of skeletal muscle cells grafted with the MY32 antibody by the presence, inside the wall of the myocardium, of massive grafting areas (2 to 9 mm in diameter) or of discrete foci (bar scale, 250 microns).
  • Figure 2 illustrates the immunodetection of skeletal muscle cells with the antibody MY32.
  • the fibers marked by the MY32 antibody are generally aligned with the network of native cardiomyocytes. Some fibers are intensely marked while others are only weakly marked; native cardiomyocytes are not marked (Scale bar, 500 microns).
  • Figure 3 shows grafted cells differentiating into muscle fibers and forming organized sarcomeres (Scale bar, 25 microns).
  • FIG. 4 illustrates the immunohistochemical specificity of the antibody MY32.
  • FIG. 5 illustrates the co-detection of grafted skeletal muscle cells and cardiomyocytes with the antibody MY32 and an antibody directed against connexin-43, a protein specific to “gap junctions” or communicating junctions (red dots). This test did not demonstrate the presence of connexin-43 inside the grafted cells or between the grafted cells and their microenvironment.
  • the present invention therefore relates to the development of a process for the preparation of animal or human stem cells which preserves the diversity and plasticity of these cells preferably originating from a tissue biopsy for their subsequent use in as part of tissue regeneration or repair by direct transplantation of cells, without expansion in in vitro culture, thus prepared in an animal or in humans.
  • the initial preparation from a tissue biopsy is heterogeneous; for example, that from a skeletal muscle biospy may contain myoblasts, fibroblasts, adipocytes, peripheral nerve cells, endothelial cells and smooth muscle cells, in addition to pluripotent stem cells.
  • stem cell is meant cells which have both the ability to self-renew and the ability to differentiate into different types of cell precursors.
  • stem cell diversity is meant stem cells which are classified according to their stage of development and their tissue origin. More particularly, we mean a classification of embryonic or adult stem cells according to their tissue origin, for example, skin or neuronal or muscle stem cells.
  • tissue of stem cells is meant the capacity for these cells to cross line boundaries, for example the capacity of hematopoietic cells to differentiate into hepatocytes.
  • tissue regeneration is meant the capacity to reform tissue either by activation of the tissue progenitor cells (for example tissue of the skin, liver, heart, bone or nervous tissue), or by direct transplantation , without expansion in in vitro culture, of these progenitor cells. More particularly, it is then a new tissue formation.
  • tissue repair is meant an operation which makes it possible to overcome a deficit without having to resort to a regeneration process. Tissue repair results in an exogenous supply of cells which may be different from the cells of the recipient tissue.
  • cell transplantation is meant an operation which is characterized by the supply of isolated cells. This transplantation can be carried out, for example, by direct injection, without expansion in in vitro culture, in the tissue or in the afferent circulation.
  • animal is meant any living organism which may be subject to cell transplantation, and this includes vertebrate beings such as in particular human beings, domestic and wild animals, in particular birds. ii) Method for preparing stem cells
  • a first aspect of the present invention relates to a process for the preparation of human or animal stem cells.
  • This process essentially consists of the following steps: a) cell extraction; b) mechanical dissociation; c) enzymatic dissociation; and maintaining the cells in a specific medium making it possible to preserve the diversity and the plasticity, said method excluding the cultivation of the cells, that is to say an expansion phase in in vitro culture.
  • tissue extraction is obtained first of all following a biopsy to provide a tissue fragment, such as a muscle, liver or skin fragment.
  • a tissue fragment such as a muscle, liver or skin fragment.
  • a muscle biopsy is performed under local anesthesia following an incision or even with a needle.
  • the tissue fragment thus obtained is then moistened in a defined medium, such as DME / 202 in the presence of protective factors and factors inhibiting cell differentiation (Pinset and Montarras), (1994) Cell Biology: A laboratory Handbook. Press Academy).
  • the medium defined is a medium hereinafter called DPM (Diversity Protecting Medium) and comprises at least: a basic nutritive medium buffered with buffers dependent or independent of the C0 2 concentration.
  • DPM Diversity Protecting Medium
  • the media used are, in most cases, made up of a mixture in a 1: 1 ratio of DME type and F12 type media.
  • a protective factor such as:
  • antioxidants ascorbic acid, N-acetyl cysteine
  • anti-caspases Dose: about 0.1 mU to 10 mU
  • hormones such as glucocorticoids, insulin, retinoic acid, thyroid hormone, mineralocorticoids, IGF1 or IGF2 at physiological doses preferably ranging from 10 "6 to 10 " 9 M.
  • FGF Fibroblast Growth Factors
  • factors in the FGF family three factors are particularly important and play a role. similar role, FGF-2, FGF-6 and FGF-10.
  • concentrations preferably ranging from 0.1 to 100 ⁇ g / ml.
  • EGF Epidermal Growth Factor
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • This DPM medium thus defined is used during the cell preparation process.
  • the samples from biopsies are kept either at room temperature, or stored, preferably, between 4 and 6 ° C in the DPM for a period preferably not exceeding 48 hours. It is clear that the precise composition of the DPM may vary depending on the type of tissue biopsy.
  • the tissue fragment maintained in the DPM medium is first minced until a cellular homogenate is obtained. This is preferably done using sterile surgical scissors but any other similar tool can be used. Thereafter, the homogeneous tissue extract or the tissue homogenate is preferably released from a portion of the erythrocytes and adipocytes by means of a washing and centrifugation step by gentle sedimentation of 1 to 10 g (Pinset and Montarras. 1994. Cell Biology: A Laboratory Handbook. Académie Press).
  • step c) of the process the tissue homogenate obtained in step b) is subjected to an enzymatic digestion to optimize cell dissociation.
  • proteolytic enzymes of bacterial origin such as collagenase and / or pronase, are preferably used.
  • trypsin produced by genetic engineering or any other acceptable enzyme.
  • These enzymes can be used alone or in combination at concentrations varying, preferably, from 0.1 to 0.5%.
  • step c) of the method the pellet of tissue fragments obtained in step b) is suspended in DPM medium supplemented with collagenase at a final concentration of 0.4 g per 100 ml.
  • the enzymatic digestion ranging from 5 to 20 minutes can be repeated several times.
  • the temperature of the enzymatic reaction is preferably between 20 ° C and 37 ° C with external agitation.
  • the enzymatic digestion preferably takes place in several stages, and this, up to five stages. At each stage, the fragments and the cells are separated by centrifugation at 10 g.
  • the fragment pellet is then resuspended in the DPM medium supplemented with proteolytic enzymes and then subjected to a new digestion step.
  • the cells present in the supernatant are harvested by centrifugation at 200 g and resuspended in DPM medium. This results in a cell suspension which adds the cells extracted from the different digestion stages.
  • the cell suspension is then filtered through a nylon filter, the pore diameter of which is preferably approximately 34 microns, to remove the tissue fragments.
  • a cell suspension resulting from a muscle biopsy which maintains its potential colonization and cellular plasticity.
  • a cell suspension resulting from a muscle biopsy which maintains its potential colonization and cellular plasticity.
  • 1 x 10 6 to 2 x 10 6 cells for one gram of tissue, it is possible to prepare from 1 x 10 6 to 2 x 10 6 cells.
  • the effectiveness of the methods for maintaining cell diversity and plasticity is evaluated by in vivo tests and ex vivo tests. In the former, the cell suspensions obtained are reintroduced into the animal after labeling.
  • a fluorescent molecule such as the Green Fluorescent Protein will be used.
  • Cell labeling makes it possible to follow the fate of cells injected into the body, to analyze their participation in the different tissue and the differentiation of the injected cells.
  • the injected cells participate in the neoformation of different tissues such as skeletal and cardiac muscle, vessels, tendons, cartilage, bone, hematopoietic tissue. This diversity and cellular plasticity is dependent on the injection site, emphasizing the importance of the environment in cell development.
  • Ex vivo tests also make it possible to measure cell diversity and cell plasticity. These are based on clonal analysis and on the response to different inducers of differentiation. Among these, mention may be made of: growth factors such as insulin and IGFs, TGFs, BMPs, VEGF; hormones such as retinoic acid derivatives, thyroid hormones, glucocorticoids; factors of the extracellular matrix; vitamins and agents for mineralization; components of the extracellular matrix.
  • growth factors such as insulin and IGFs, TGFs, BMPs, VEGF
  • hormones such as retinoic acid derivatives, thyroid hormones, glucocorticoids
  • factors of the extracellular matrix such as retinoic acid derivatives, thyroid hormones, glucocorticoids
  • factors of the extracellular matrix such as retinoic acid derivatives, thyroid hormones, glucocorticoids
  • factors of the extracellular matrix such as retinoic acid derivatives, thyroid hormones, glucocorticoids
  • Cell identification is done by immunoassays using specific staining and specific antibodies, which allow both identification and quantification, and by transcriptomic analysis.
  • Cells thus prepared without expansion in in vitro culture are a source of cells suitable for cell therapy and can either be reimplanted directly into an organism, or stored for later reimplantation.
  • the method of the present invention may include an additional step, namely a freezing step. This optional process step offers the following advantages: preservation of tissue samples; dissociation between biopsy preparation and cell reimplantation;
  • 10 6 to 2 x 10 6 cells from 1 gram of tissue are placed in the presence of DPM medium supplemented with cryopreservative agents, such as DMSO.
  • cryopreservative agents such as DMSO.
  • concentration used is preferably 10%.
  • the cells are maintained at 20 ° C. for a period of
  • P-Cam as an endothelial cell marker
  • N-Cam as a marker for neuronal and muscle cells
  • GFAP as a marker for glial cells
  • Myf5, Pax3, Pax7, C-met and M-cadherin as markers of muscle cells
  • This characterization can also be undertaken at the level of transcription by the use of biochips containing oligo- nucleotides encoding cellular genes (eg, specific transcription factors and factors in the cell cycle machinery) used to identify cells in the cell suspension.
  • biochips containing oligo- nucleotides encoding cellular genes eg, specific transcription factors and factors in the cell cycle machinery
  • said stem cells are animal or human stem cells chosen from the group consisting of progenitor stem cells from a tissue.
  • the tissue is chosen from the group consisting of the skin, the liver, the heart, the bone and the nervous tissues.
  • Therapeutic uses A second aspect of the present invention relates to the use of a cell suspension or of stem cells obtained by the process of the invention in therapeutic applications, including gene therapy, following a transplantation of these cells in a human being, for example. More particularly, the present invention proposes to use the cells prepared by the method of the invention in the context of tissue repair and / or regeneration by cell transplantation without expansion in in vitro culture. The cells thus prepared will also be used as vectors in gene therapy.
  • the adult stem cells obtained by the preparation process according to the invention can be used in the context of a repair of bone tissue.
  • it is a question of transplanting the cells directly, without expansion in in vitro culture, to a site of bone repair.
  • cells or some of them can adopt the bone phenotype and thus participate in the repair of damaged tissue.
  • the method of cell preparation of the present invention can also provide a suspension of adult mammalian stem cells which can be used in restoring the hematopoietic potential.
  • the capacity of muscle biopsy stem cells to colonize the bone marrow of irradiated mice and to contribute to all hematopoietic lines obliges to consider the repairing potential of muscle biopsy cells in the case, for example, of leukemias.
  • transplants of cultivated muscle cells in the muscle are ineffective and characterized by massive death of the reimplanted cells within hours of their injection. It is therefore proposed that the process for preparing stem cells according to the invention which does not include an expansion phase in in vitro culture can contribute to the repair of muscle tissue.
  • the cells contained in the suspension will be able to respond to micro-environments and thus restore functions or repair muscle tissue.
  • the subject of the invention is also the use of human or animal stem cells obtained according to the method according to the invention, for the preparation of a medicament intended for the treatment of diseases by cell therapy or gene therapy.
  • the present invention further relates to a stem cell obtained according to the method according to the invention.
  • the present invention also relates to a treatment method comprising a step of implanting autologous or heterologous animal stem cells obtained according to the method according to the invention in an animal or in humans.
  • the present invention also relates to a cellular composition comprising human or animal stem cells obtained according to the method according to the invention.
  • the stem cells have a colonization capacity and an capacity to allow functional recovery.
  • cardiac tissue does not have stem cells capable of repairing this tissue in the adult state after injury.
  • ischemia of the heart is always accompanied by insufficient contraction, which, if significant, leads to heart failure.
  • the objective of cell therapy in this indication is to restore the contraction function.
  • muscle cells amplified in culture This first step shows the feasibility of the approach, but also, certain limitations of the strategy adopted.
  • the amplification of a large number of muscle cells in environments comprising animal fluids such as fetal calf serum, and their transplantation into heterotypic tissue are operations that are both cumbersome and not without potential health danger (viral contaminants, prions , etc.).
  • the essential limitation of this process lies in the fact that the cells thus injected have a restricted plasticity which only give skeletal muscle cells.
  • the process for the preparation of stem cells of the present invention without an expansion phase in in vitro culture avoids the impoverishment of cell diversity by the culture.
  • Anesthetic protocol premedication with midazolam, induction using etomidate, tracheal intubation and positive pressure ventilation with isoflurane in 100% oxygen. Surveillance is ensured by electrocardioscopy, invasive blood pressure, capnography. Postoperative analgesia with bupivacaine (intercostal block during thoracotomy), morphine and flunixin meglumine.
  • Skeletal muscle biopsy A skeletal muscle biopsy (approximately 10 g) is explanted sterile from the left femoral biceps of each sheep. The tissue thus removed is kept in DMEM (SIGMA) or DPM, as defined above, at room temperature until mechanical or enzymatic digestion. The plague of the animal is closed in the usual way. The animals recover for about three hours, then are re-anesthetized when the cells are ready to be reimplanted.
  • SIGMA DMEM
  • DPM DPM
  • the supernatant containing the isolated cells is stored in 20% DMEM (V / V) of fetal calf serum or DPM.
  • the pellet undergoes up to four additional digestions (Pinset, C. and Montarras, D. Cell Systems for Ex-vivo Studies of Myogenesis: A Protocol for the Isolation of Stable muscle cell populations from newborn to adult mice in Cell Biology: A Laboratory Handbook; second edition e. JF Celis, Académie Press; 1998).
  • the extracted cells are then filtered on a nylon filter with pores of 250 ⁇ m in diameter (Polylabo SA).
  • the cells thus prepared do not undergo an expansion phase in in vitro culture.
  • the cells are resuspended in 10 mL of DMEM without serum containing 25 ⁇ g / mL of 4'-6-diamino-2-phenylindole (DAPI, SIGMA) for 10 minutes or of DPM in the same conditions.
  • the cells are rinsed four times in DMEM or DPM in order to remove the DAPI.
  • Mononucleated cells are counted with a counting cell under fluorescence microscopy.
  • the cell preparation is then resuspended in 1.2 ml of DMEM or DPM without serum and stored at 4 ° C. until implantation without undergoing an expansion phase in in vitro culture.
  • Cell transplant The sheep previously anesthetized according to the method described above are placed in the right lateral decubitus position for a left thoracotomy on the 5th intercostal space. After pericardiotomy and suspension of the pericardium, the cells in DMEM or DPM are injected (0.1 ml per site) using an insulin syringe connected to a 27 G epijet, on 10 zones of the left ventricle . Coronary vessel mapping is established to identify injection sites in the myocardium. Epicardial stitches of location are made for at least two injections. The chest is closed in the usual way and the animals recover under an analgesic regime (morphine at 0.5 mg / kg IM BID, flunixin 1 mg / kg IM once) overnight inclusive.
  • an analgesic regime morphine at 0.5 mg / kg IM BID, flunixin 1 mg / kg IM once
  • Control cell cultures In order to confirm the presence of muscle precursor cells in the cell preparation, a 100 ⁇ L sample of the cell suspension is seeded in a culture dish containing DMEM or DPM with fetal calf serum. The cells are maintained as a control in an atmosphere containing 5% of CO 2 . Three to seven days after seeding, the cells are used for immunodetection of the specific regulatory factor MyoD (DAKO) as described by Montarras, D. et al. (Cultured Myf5 Null and MyoD Null Muscle Precursor Cells Display Distinct Growth Defects. Biol Cell 2000; 92: 565-72). Results
  • the cell injection procedure has no serious effect on animals.
  • a ventricular arrhythmia occurs when the needle is inserted and when the cells are injected, but resolves when the needle is withdrawn.
  • the cell count makes it possible to determine the injection of 1.7 +/- 0.3 x 10 7 mononuclear cells labeled with DAPI.
  • Skeletal myosin heavy chain expression (MY32) is detected at 3 weeks post-implantation in 8 animals out of 8, which confirms cell survival and myogenic expression of the implanted cells.
  • Large graft surfaces (2 to 9 mm in diameter) or discrete foci are observed inside the wall of the myocardium ( Figure 1). Isolated cells are also found in the adipose tissue of the pericardium.
  • fibers that are positive for expression of MY32 are usually aligned with native cardiomyocytes. Some of these fibers are strongly labeled with the antibody directed against MY32, while others are only weakly labeled ( Figure 2). These fibers are not electro-mechanically coupled to each other or to native cardiomyocytes as demonstrated by Connexin-43 negative immunohistochemistry.
  • the implanted cells develop organized sarcomeres and have either an elongated morphology characteristic of fused multinucleic myotubes, or a morphology which remains mononuclear ( Figure 3). These skeletal muscle cells have nuclei observed at the periphery or in the center. Replacement fibrosis and regions with mononuclear cells of the inflammatory response are also observed. No DAPI labeling is observed in the explanting hearts. This may be due to active cell division resulting in a dilution of the DAPI. Indeed, in cell cultures serving as controls, the
  • DAPI becomes undetectable after 6 to 8 doubling of the cell population.

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Abstract

La présente invention se rapporte au domaine de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention vise un procédé de préparation de cellules souches adultes qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules. La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé d'extraction proposé dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique et cellulaire.Le procédé de préparation selon l'invention consiste essentiellement en : l'extraction cellulaire, la dissociation mécanique, la dissociation enzymatique, le maintien des cellules obtenues dans un milieu de culture spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité, ledit procédé excluant la mise en culture des cellules.

Description

PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE CELLULES SOUCHES ADULTES ANIMALES OU HUMAINES ET UTILISATION DESDITES CELLULES
SOUCHES EN THERAPIE.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention vise un procédé de préparation de cellules souches adultes qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules. La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé d'extraction proposé dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique et cellulaire.
DESCRIPTION DE L'ART ANTÉRIEUR Pour des raisons anatomiques et biologiques, le sang et ses dérivés ont été les premières cellules transplantées. Les greffes de cellules hématopoïétiques ont connu un chemin semblable. Depuis une vingtaine d'années, le transfert de cellules neuronales foetales est étudié comme approche thérapeutique dans les pathologies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson et plus récemment dans la chorée de Huntington. Les résultats cliniques sont cohérents et montrent une nette amélioration. La limitation majeure de cette dernière approche est la source de cellules transplantées. En effet, le recours à des cellules neuronales fœtales rend difficile la diffusion de ce type d'approches thérapeutiques. Les autogreffes de kératinocytes constituent une solution thérapeutique dans les cas de brûlures graves. Un avantage de ce système : la capacité des kératinocytes, principales cellules de l'épiderme, à être cultivées ex vivo. Dans le même ordre d'idée, des cartilages défectueux ont pu être reconstruits par des chondrocytes amplifiés en culture puis greffés sous arthroscopie. Des approches similaires encore très expérimentales sont aussi en cours pour des organes comme le pancréas et le foie.
Ces données, encore trop restreintes, démontrent le potentiel de la médecine régénératrice par thérapie cellulaire. Les limitations à l'extension de ces approches sont de plusieurs natures. Pour être capable de suppléer aux défaillances d'un tissu par thérapie cellulaire il faut disposer de sources cellulaires répondant aux caractéristiques suivantes : les cellules doivent être faciles à prélever ; - elles doivent survivre aux sites d'injection ; elles doivent présenter une bonne capacité de prolifération et de colonisation ; elles doivent être capables de se différencier pour obtenir un résultat fonctionnel. II existe donc un besoin pour de nouveaux procédés permettant d'obtenir des cellules souches aptes à être utilisées, entre autres, dans le cadre de la régénération et la réparation tissulaire par transplantation cellulaire.
SOMMAIRE DE L'INVENTION La présente invention propose un procédé de préparation cellulaire répondant au besoin mentionné précédemment. Plus particulièrement, la présente invention vise un procédé de préparation cellulaire capable de préserver la diversité et la plasticité des cellules souches de vertébrés provenant préférablement d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ulté- heure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par transplantation dans un animal, tel un être humain.
L'invention vise de plus un milieu de culture défini, particulièrement utile lors de la mise en oeuvre du procédé de préparation cellulaire.
La présente invention vise aussi la préparation cellulaire ou les cellules souches obtenues par le procédé de préparation de l'invention.
La présente invention vise également l'usage de ces cellules souches obtenues par le procédé de préparation proposé dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique ou cellulaire.
La présente invention vise aussi une composition cellulaire comprenant des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé de préparation de l'invention. La présente invention porte également sur un procédé de préparation de cellules souches capables de réparer ou de régénérer in vivo des tissus ou des organes d'un vertébré.
La présente invention porte aussi sur une méthode de traite- ment, caractérisée par l'implantation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé de l'invention chez un animal.
L'originalité de la présente invention porte sur le fait que, contrairement aux procédés de préparation cellulaire utilisés dans le domaine, le procédé de préparation de la présente invention permet : - d'extraire les cellules dans des conditions définies sans protéine animale d'origine extractive, donc dans des conditions sûres du point de vue sanitaire ; de maintenir la viabilité cellulaire par l'utilisation de molécules anti-oxydantes et anti-apoptotiques ; - de préserver la diversité cellulaire ; de maintenir le potentiel de plasticité cellulaire ; de maintenir le potentiel de différenciation ; d'améliorer l'implantation, la colonisation et la différenciation des cellules greffées ; et - de procéder à une transplantation des cellules sans avoir à passer par une étape d'expansion en culture in vitro.
Par exemple, dans le procédé de préparation cellulaire décrit dans l'article de Pouzet et al. (2000. Circulation. 102 : 1112210-5), il n'y a pas d'extraction ou d'isolement cellulaire selon un procédé de digestion enzy- matique. Alternativement, le tissu musculaire est haché. De plus, il n'y a pas d'étape de préparation de cellules telle qu'entendue au sens de la présente invention. La conclusion de cette étude est d'ailleurs à l'effet qu'il ne serait pas possible de courtcircuiter la phase d'expansion en culture in vitro, la récupération fonctionnelle telle que discutée dans l'article de Pouzet et al. dépendant plutôt du nombre de cellules. Selon le procédé de l'invention, le mode de préparation des cellules conduit avantageusement, sans expansion en culture in vitro, à une colonisation très importante ainsi qu'à une récupération fonctionnelle rapide de l'organe traité.
DESCRIPTION DES FIGURES
Les Figures 1 à 5 sont des microphotographies illustrant la mise en évidence de cellules de muscle greffées dans le cœur de brebis. Les cellules ont été obtenues par dissociation enzymatique d'une biopsie de muscle squelettique puis directement implantées, sans phase d'expansion en culture in vitro, dans le myocarde de la même brebis (greffe autologue). La présence de cellules de muscle squelettique est révélée à l'aide de l'anticorps MY32 qui reconnaît spécifiquement la chaîne lourde de myosine squelettique.
La Figure 1 illustre la détection de cellules de muscle squelettique greffées avec l'anticorps MY32 par la présence, à l'intérieur de la paroi du myocarde, de zones de greffes massives (2 à 9 mm de diamètre) ou de foyers discrets (barre d'échelle, 250 microns). La Figure 2 illustre l'immmunodétection de cellules de muscle squelettique avec l'anticorps MY32. Dans la paroi du myocarde, les fibres marquées par l'anticorps MY32 sont généralement alignées avec le réseau de cardiomyocytes natifs. Certaines fibres sont intensément marquées alors que d'autres ne sont que faiblement marquées; les cardiomyocytes natifs ne sont pas marqués (Barre d'échelle, 500 microns).
La Figure 3 montre des cellules greffées se différenciant en fibres musculaires et formant des sarcomères organisés (Barre d'échelle, 25 microns).
La Figure 4 illustre la spécificité immunohistochimique de l'anticorps MY32.
Coin supérieur gauche : détection immunohistochimique avec l'anticorps Y32 dans le muscle squelettique de brebis. On note les fibres intensément marquées (« fast twitch ») (en brun foncé) et les fibres faiblement marquées (« slow twitch ») caractéristiques d'une biopsie musclulaire (barre d'échelle, 25 microns). Coin supérieur droit : détection immunohistochimique avec l'anticorps MY32 dans le myocarde de brebis greffé avec des cellules n'ayant pas subi de mise en culture in vitro (barre d'échelle, 25 microns).
Coin inférieur gauche : témoin immunohistochimique négatif avec l'anticorps MY32 dans un cœur de brebis normal (barre d'échelle, 250 microns).
Coin inférieur droit : témoin immunohistochimique négatif avec l'anticorps MY32 dans un cœur de brebis injecté avec du milieu seul (barre d'échelle, 250 microns). La Figure 5 illustre la co-détection de cellules de muscle squelettique greffées et de cardiomyocytes avec l'anticorps MY32 et un anticorps dirigé contre la connexine-43, protéine spécifique aux « gap junctions » ou jonctions communicantes (points rouges). Cet essai n'a pas démontré la présence de connexine-43 à l'intérieur des cellules greffés ou entre les cellules greffées et leur microenvironnement.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION La présente invention porte donc sur la mise au point d'un procédé de préparation de cellules souches animales ou humaines qui préserve la diversité et la plasticité de ces cellules provenant préférablement d'une biopsie tissulaire pour leur utilisation ultérieure dans le cadre d'une régénération ou réparation tissulaire par transplantation directe des cellules, sans expansion en culture in vitro, ainsi préparées chez un animal ou chez l'homme.
Ainsi, il est entendu que la préparation initiale provenant d'une biopsie tissulaire est hétérogène ; par exemple, celle provenant d'une biospie de muscle squelettique peut contenir des myoblastes, fibroblastes, adipo- cytes, cellules nerveuses périphériques, cellules endothéliales et cellules de muscle lisse, en plus des cellules souches pluripotentes. i) Définitions Par « cellule souche », on entend les cellules qui ont à la fois la capacité de s'autorenouveler et la capacité de se différencier en différents types de précurseurs cellulaires. Par « diversité des cellules souches », on entend les cellules souches qui sont classées en fonction de leur stade de développement et de leur origine tissulaire. Plus particulièrement, on entend une classification de cellules souches embryonnaires ou adultes en fonction de leur origine tissu- laire, par exemple, les cellules souches de la peau ou neuronales ou du muscle.
Par « plasticité des cellules souches », on entend la capacité pour ces cellules de traverser les frontières de lignée, par exemple la capacité des cellules hématopoïétiques à se différencier en hépatocytes. Par « régénération tissulaire », on entend la capacité à reformer un tissu soit par activation des cellules progénitrices du tissu (par exemple tissu de la peau, du foie, du cœur, de l'os ou de tissus nerveux), soit par transplantation directe, sans expansion en culture in vitro, de ces cellules progénitrices. Plus particulièrement, il s'agit alors d'une néoformation tissu- laire.
Par « réparation tissulaire », on entend une opération qui permet de pallier un déficit sans avoir recours à un processus de régénération. La réparation tissulaire se traduit par un apport exogène de cellules qui peuvent être différentes des cellules du tissu receveur. Par « transplantation cellulaire », on entend une opération qui se caractérise par un apport de cellules isolées. Cette transplantation peut être effectuée, par exemple, par injection directement, sans expansion en culture in vitro, dans le tissu ou dans la circulation afférente.
Par « animal », on entend tout organisme vivant qui peut être sujet à une transplantation cellulaire, et ceci inclut les êtres vertébrés tels que notamment les êtres humains, les animaux domestiques et sauvages, notamment les oiseaux. ii) Procédé de préparation de cellules souches
Un premier aspect de la présente invention vise un procédé de préparation de cellules souches humaines ou animales. Ce procédé consiste essentiellement en les étapes suivantes : a) l'extraction cellulaire ; b) la dissociation mécanique ; c) la dissociation enzymatique ; et le maintien des cellules dans un milieu spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité, ledit procédé excluant la mise en culture des cellules, c'est-à-dire une phase d'expansion en culture in vitro.
Plus précisément, l'extraction cellulaire est obtenue tout d'abord suite à une biopsie pour fournir un fragment tissulaire, tel un fragment de muscle, de foie ou de peau. Par exemple, une biopsie musculaire est réalisée sous anesthésie locale suite à une incision ou encore à l'aiguille. Le fragment tissulaire ainsi obtenu est ensuite humidifié dans un milieu défini, tel le DME/202 en présence de facteurs protecteurs et de facteurs inhibant la différenciation cellulaire (Pinset et Montarras), (1994) Cell Biology : A labora- tory Handbook. Académie Press).
Préférablement, le milieu défini est un milieu ci-après nommé DPM (Diversity Protecting Médium) et comprend au moins : un milieu nutritif de base tamponné avec des tampons dépendants ou indépendants de la concentration en C02. Les milieux utilisés sont, dans la plupart des cas, constitués d'un mélange dans un rapport 1:1 de milieu de type DME et de type F12. Parmi ceux-ci on peut citer en exemple le mélange DME/ F12 et DME/MCDB 202; un facteur protecteur, tel :
> des anti-oxydants (acide ascorbique, N-acétyl cystéine) des anti-caspases (Dose : environ 0,1 mU à 10 mU)
> des protecteurs du métabolisme (L-Carnitine) des facteurs protecteurs des métaux (Transferrine)
(Dose : environ 0,1 μg/ml à 100 μg/ml) des hormones tels glucocorticoïdes, insuline, acide rétinoïque, hormone thyroïdienne, minéralocorticoïdes, IGF1 ou IGF2 aux doses physiologiques allant préférentiellement de 10"6 à 10"9 M. - des facteurs inhibant la différenciation, tels : les FGF (Fibroblast Growth Factors). Parmi les facteurs de la famille FGF, trois facteurs sont particulièrement importants et jouent un rôle similaire, soit FGF-2, FGF-6 et FGF-10. Chacun des facteurs de la famille FGF est employé à des concentrations allant préférentiellement de 0,1 à 100 μg/ml.
> l'EGF (Epidermal Growth Factor) (Dose : environ 0,1μg/ml à 100 μg/ml)
> le LIF (Leukemia Inhibitory Factor) (Dose : environ 0,1 μg/ml à 100 μg/ml) [fraction non cellulaire du sang après coagulation]
> le sérum est également un facteur inhibant la différenciation et peut être utilisé à une concentration variant de 0 à 100 %. Ce milieu DPM ainsi défini est utilisé lors du procédé de préparation cellulaire. L'absence de fluide animal dans le milieu défini, comme le sérum par exemple, permet de garantir une meilleure sécurité infectieuse contre des virus, prions, etc. et une meilleure reproductibilité du procédé de l'invention. Les prélèvements provenant de biopsies sont maintenus soit à température ambiante, soit conservés, préférablement, entre 4 et 6°C dans le DPM pendant une période n'excédant préférablement pas 48 heures. Il est clair que la composition précise du DPM pourra varier en fonction du type de biopsie tissulaire.
Lors de l'étape b) du procédé, le fragment tissulaire maintenu dans le milieu DPM est d'abord émincé jusqu'à l'obtention d'un homogénat cellulaire. Ceci est préférablement fait à l'aide de ciseaux chirurgicaux stériles mais tout autre outil semblable peut être utilisé. Par la suite, l'extrait tissulaire homogène ou l'homogénat tissulaire est préférablement libéré d'une partie des érythrocytes et des adipocytes grâce à une étape de lavage et de centri- fugation par sédimentation douce de 1 à 10 g (Pinset et Montarras. 1994. Cell Biology : A Laboratory Handbook. Académie Press).
À l'étape c) du procédé, l'homogénat tissulaire obtenu à l'étape b) est soumis à une digestion enzymatique pour optimiser la dissociation cellulaire. Lors de cette étape du procédé de l'invention, des enzymes protéolytiques d'origine bactérienne, comme la collagènase et/ou la pronase, sont préférablement utilisées. Toutefois, pour des raisons de sécurité sanitaire, on peut envisager l'utilisation de trypsine produite par génie génétique ou de toute autre enzyme acceptable. Ces enzymes peuvent être utilisées seules ou en combinaison à des concentrations variant, préférablement, de 0,1 à 0,5%.
À titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit, lors de la mise en œuvre de l'étape c) du procédé : le culot de fragments tissulaires obtenu à l'étape b) est suspendu dans du milieu DPM additionné de collagènase à une concentration finale de 0,4 g par 100 ml. La digestion enzymatique allant de 5 à 20 minutes peut être répétée plusieurs fois. La température de la réaction enzymatique se situe préférablement entre 20°C et 37°C avec agitation externe. La digestion enzymatique a lieu préférablement en plusieurs étapes, et ce, jusqu'à cinq étapes. À chaque étape, les fragments et les cellules sont séparés par centri- fugation ménagée à 10 g. Le culot de fragments est alors resuspendu dans le milieu DPM additionné d'enzymes protéolytiques puis soumis à une nouvelle étape de digestion. Les cellules présentes dans le surnageant sont récoltées par centrifugation à 200 g et resuspendues dans du milieu DPM. On aboutit ainsi à une suspension cellulaire qui additionne les cellules extraites des différentes étapes de digestion. La suspension cellulaire est ensuite filtrée sur filtre de nylon dont le diamètre des pores est préférablement d'environ 34 microns, pour éliminer les fragments tissulaires.
Ainsi, grâce au procédé de préparation de cellules souches selon la présente invention, il est possible, par exemple, de préparer de manière sûre et reproductible, sans expansion en culture in vitro, une suspension cellulaire issue d'une biopsie musculaire qui maintient son potentiel de colonisation et de plasticité cellulaire. Par exemple, pour un gramme de tissu, il est possible de préparer de 1 x 106 à 2 x 106 cellules. L'efficacité des procédés pour le maintien de la diversité et de la plasticité cellulaire est évaluée par des tests in vivo et des tests ex vivo. Dans les premiers, les suspensions cellulaires obtenues sont réintroduites dans l'animal après un marquage. À titre d'exemple une molécule fluorescente comme la Green Fluorescente Protein sera employée. Le marquage cellulaire permet de suivre le devenir des cellules injectées dans l'organisme, d'analyser leur participation aux diffé- rents tissus et la différenciation des cellules injectées. Dans les conditions où l'on maintient la diversité et la plasticité, les cellules injectées participent à la néoformation de différents tissus comme le muscle squelettique et cardiaque, les vaisseaux, les tendons, le cartilage, l'os, le tissu hématopoïétique. Cette diversité et cette plasticité cellulaire est dépendante du site d'injection soulignant l'importance de l'environnement dans le devenir cellulaire.
Les tests ex vivo (en culture) permettent aussi de mesurer la diversité cellulaire et la plasticité cellulaire. Ceux-ci sont basés sur l'analyse clonale et sur la réponse à différents inducteurs de la différenciation. Parmi ceux-ci on peut citer : des facteurs de croissance comme l'insuline et les IGFs, les TGFs, les BMPs, le VEGF ; des hormones comme les dérivés de l'acide rétinoïque, les hormones thyroïdiennes, les glucocorticoïdes ; des facteurs de la matrice extracellulaire ; des vitamines et agents permettant la minéralisation ; les composants de la matrice extracellulaire.
L'identification cellulaire est faite par des analyses immuno- logiques à l'aide de coloration spécifique et d'anticorps spécifiques, qui permettent à la fois l'identification et la quantification et par l'analyse transcriptomique.
Les approches complémentaires in vivo et ex vivo permettent de mesurer la diversité et la plasticité cellulaire qualitativement et quantitativement et d'ainsi valider les conditions permettant le maintien de la diversité cellulaire et de la plasticité cellulaire.
Les cellules ainsi préparées sans expansion en culture in vitro sont une source de cellules adéquates pour la thérapie cellulaire et peuvent être soit réimplantées directement dans un organisme, soit conservées pour réimplantation ultérieure. Le procédé de la présente invention peut comprendre une étape additionnelle, soit une étape de congélation. Cette étape optionnelle du procédé offre les avantages suivants : conservation des prélèvements tissulaires ; dissociation entre la préparation de la biopsie et la réimplantation cellulaire ;
s caractérisation biologique et sanitaire avant le réimplanta- tion cellulaire.
À titre d'exemple non limitatif, on peut procéder comme suit lors de cette étape de congélation :
106 à 2 x 106 cellules provenant de 1 gramme de tissu sont mises en présence de milieu DPM additionné d'agents cryopréservatifs, tel le DMSO. Pour le DMSO, la concentration utilisée est préférablement de 10%.
Dans ces conditions, les cellules sont maintenues à 20°C pour une période de
10 minutes puis la température est amenée lentement, en quelques heures, à moins 80°C. Finalement, les cellules sont transférées dans de l'azote liquide.
11 est important de noter que ces conditions de conservation ont l'avantage de ne pas modifier les caractéristiques cellulaires.
Avant de procéder à la transplantation cellulaire dans le cadre des futures applications cliniques, il peut être préférable de caractériser la suspension cellulaire obtenue par le procédé selon la présente invention.
Cette caractérisation peut être entreprise au niveau protéique grâce à l'utilisation de marqueurs cellulaires tels que :
P-Cam comme marqueur de cellule endothéliales ; N-Cam comme marqueur de cellule neuronales et musculaires;
Actine de muscle lisse comme marqueur de cellules du muscle lisse :
GFAP comme marqueur de cellules gliales ; Myf5, Pax3, Pax7, C-met et M-cadhérine comme marqueurs de cellules musculaires ;
Sca1+, C-Kit, CD45 et CD34 comme marqueurs de cellules souches.
Cette caractérisation peut également être entreprise au niveau de la transcription par l'utilisation de biopuces contenant des oligo- nucléotides codant pour des gènes cellulaires (par exemple, facteurs de transcription spécifiques et facteurs de la machinerie du cycle cellulaire) permettant d'identifier les cellules de la suspension cellulaire.
Conformément à l'invention, lesdites cellules souches sont des cellules souches animales ou humaines choisies dans le groupe constitué par des cellules souches progénitrices d'un tissu.
Egalement conformément à l'invention, le tissu est choisi dans le groupe constitué par la peau, le foie, le cœur, l'os et les tissus nerveux. iii) Utilisations thérapeutiques Un deuxième aspect de la présente invention vise l'usage d'une suspension cellulaire ou de cellules souches obtenues par le procédé de l'invention dans des applications thérapeutiques, dont la thérapie génique, suite à une transplantation de ces cellules chez un être humain, par exemple. Plus particulièrement, la présente invention propose d'utiliser les cellules préparées par le procédé de l'invention dans le cadre d'une réparation et/ou régénération tissulaire par transplantation cellulaire sans expansion en culture in vitro. Les cellules ainsi préparées seront également utilisées comme vecteurs en thérapie génique.
Par exemple, les cellules souches adultes obtenues par le procédé de préparation selon l'invention peuvent servir dans le cadre d'une réparation de tissu osseux. Dans le cas présent, il s'agit de transplanter directement, sans expansion en culture in vitro, les cellules sur un site de réparation osseuse. Dans ce micro-environnement particulier, les cellules ou certaines d'entre elles peuvent adopter le phénotype osseux et ainsi participer à la réparation du tissu endommagé.
Le procédé de préparation cellulaire de la présente invention peut également fournir une suspension de cellules souches adultes de mammifère pouvant être utilisée lors d'une restauration du potentiel hémato- poïétique. En effet, la capacité des cellules souches de biopsie musculaire à coloniser la moelle osseuse de souris irradiées et à contribuer à toutes les lignées hématopoïétiques, oblige à considérer le potentiel réparateur des cellules de biopsie musculaire dans le cas, par exemple, de leucémies. D'autre part, il est connu que les greffes de cellules musculaires cultivées, dans le muscle sont peu efficaces et caractérisées par une mort massive des cellules réimplantées dans les heures qui suivent leur injection. Il est par conséquent proposé que le procédé de préparation de cellules souches selon l'invention qui ne comporte pas de phase d'expansion en culture in vitro peut contribuer à la réparation du tissu musculaire. Les cellules contenues dans la suspension pourront répondre aux micro-environnements et ainsi restaurer des fonctions ou réparer le tissu musculaire.
En conséquence, l'invention a également pour objet l'utilisation des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies par thérapie cellulaire ou thérapie génique.
La présente invention a, en outre, pour objet, une cellule souche obtenue selon le procédé selon l'invention. La présente invention a également pour objet une méthode de traitement comprenant une étape d'implantation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé selon l'invention chez un animal ou chez l'homme.
La présente invention a également pour objet une composition cellulaire comprenant des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé selon l'invention.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux de ladite composition, les cellules souches ont une capacité de colonisation et une capacité à permettre une récupération fonctionnelle. EXEMPLE
L'exemple qui suit sert à illustrer l'étendue de l'utilisation de la présente invention et non à limiter sa portée. Des modifications et variations peuvent y être effectuées sans que l'on échappe à l'esprit et à la portée de l'invention. Bien que l'on puisse utiliser d'autres méthodes ou produits équi- valents à ceux que l'on retrouve ci-dessous pour tester ou réaliser la présente invention, le matériel et les méthodes préférés sont décrits. Exemple 1 : Réparation du tissu cardiaque Introduction
A la différence du muscle squelettique, le tissu cardiaque ne possède pas à l'état adulte de cellules souches capables de réparer ce tissu après une lésion. De ce fait, l'ischémie cardiaque est toujours accompagnée d'une insuffisance de contraction qui, si importante, conduit à l'insuffisance cardiaque. L'objectif de la thérapie cellulaire dans cette indication est de restaurer la fonction de contraction. Des expériences dans ce sens ont été conduites chez l'Homme avec comme source de cellules, des cellules musculaires amplifiées en culture. Cette première démarche montre la faisabilité de l'approche, mais aussi, certaines limitations de la stratégie adoptée. L'amplification d'un grand nombre de cellules musculaires dans des milieux comprenant des fluides animaux tel le sérum de veau fœtal, et leur transplantation dans un tissu hétérotypique sont des opérations à la fois lourdes et non sans danger sanitaire potentiel (contaminants viraux, prions, etc.). La limitation essentielle de ce procédé réside dans le fait que les cellules ainsi injectées ont une plasticité restreinte qui ne donnent que des cellules musculaires squelettiques. Le procédé de préparation de cellules souches de la présente invention sans phase d'expansion en culture in vitro évite l'appauvrissement de la diversité cellulaire par la culture.
Description de la transplantation cardiaque chez la brebis
Protocole anesthésigue : prémédication avec du midazolam, induction à l'aide d'étomidate, intubation trachéale et ventilation à pression positive avec de l'isoflurane dans 100% d'oxygène. La surveillance est assu- rée par electrocardioscopie, pression artérielle invasive, capnographie. Analgésie postopératoire avec de la bupivacaïne (bloc intercostal lors de thoracotomie), morphine et de la flunixine méglumine.
Biopsie du muscle squelettique : Une biopsie du muscle squelettique (approximativement 10 g) est explantée stérilement à partir des biceps fémoraux gauches de chaque brebis. Le tissu ainsi prélevé est maintenu dans du DMEM (SIGMA) ou du DPM, tel que défini ci-dessus, à température de la pièce jusqu'à digestion mécanique ou enzymatique. La plaie de l'animal est refermée de la façon habituelle. Les animaux récupèrent pendant environ trois heures, puis sont ré-anesthésiés lorsque les cellules sont prêtes à être réimplantées.
Extraction des cellules musculaires : Les explants de muscle squelettique sont pesés puis lavés dans du DMEM ou du DPM. Le tissu adipeux et fascia sont retirés et le muscle est émincé aux ciseaux jusqu'à l'obtention d'un homogénat tissulaire. Les fragments de muscle sont ensuite sédimentés dans du DMEM ou du DPM à 300 rpm pendant 2 minutes puis débarrassés du surnageant. Afin de libérer les cellules satellites, les fragments de muscle sont incubés à 37°C avec agitation dans 10 mL de DMEM ou de DPM additionné de 0,4% (P/V) de collagènase (Type IA, SIGMA) brute. Après 20 minutes, les fragments sont centrifugés à 300 rpm pendant 2 minutes.
Le surnageant contenant les cellules isolées est conservé dans du DMEM à 20 % (V/V) de sérum de veau fœtal ou du DPM. Le culot subit jusqu'à quatre digestions supplémentaires (Pinset, C. et Montarras, D. Cell Systems for Ex-vivo Studies of Myogenesis : A Protocol for the Isolation of Stable muscle cell populations from newborn to adult mice dans Cell Biology : A Laboratory Handbook ; deuxième édition e. J. F. Celis, Académie Press ; 1998).
Les cellules extraites sont ensuite filtrées sur un filtre de nylon avec pores de 250 μm de diamètre (Polylabo SA). Les cellules ainsi préparées ne subissent pas de phase d'expansion en culture in vitro.
Marquage des cellules : Afin de marquer leurs noyaux, les cellules sont resuspendues dans 10 mL de DMEM sans sérum contenant 25 μg/mL de 4'-6-diamino-2-phénylindole (DAPI, SIGMA) pendant 10 minutes ou du DPM dans les mêmes conditions. Les cellules sont rincées quatre fois dans du DMEM ou du DPM afin d'enlever le DAPI. Les cellules mono- nucléées sont dénombrées avec une cellule de numération sous microscopie à fluorescence. La préparation cellulaire est ensuite resuspendue dans 1,2 mL de DMEM ou de DPM sans sérum et conservée à 4°C jusqu'à l'implantation sans subir de phase d'expansion en culture in vitro. Greffe cellulaire : Les brebis préalablement anesthésiées selon la méthode décrite ci-dessus sont placées en décubitus latéral droit pour une thoracotomie gauche sur le 5ème espace intercostal. Après péri- cardiotomie et suspension du péricarde, les cellules dans du DMEM ou du DPM sont injectées (0,1 mL par site) à l'aide d'une seringue à insuline connectée à un épijet 27 G, sur 10 zones du ventricule gauche. Une cartographie des vaisseaux coronaires est établie pour repérer les sites d'injection dans le myocarde. Des points de sutures épicardiques de repérage sont réalisés pour au moins deux injections. Le thorax est refermé de la manière habi- tuelle et les animaux récupèrent sous régime analgésique (morphine à 0,5 mg/kg IM BID, flunixine 1 mg/kg IM une fois) jusqu'au lendemain inclusivement.
Cultures cellulaires témoins : Afin de confirmer la présence de cellules précurseurs du muscle dans la préparation cellulaire, un échantillon de 100 μL de la suspension cellulaire est ensemencé dans une boîte de culture contenant du DMEM ou du DPM avec sérum de veau fœtal. Les cellules sont maintenues à titre de témoin dans une atmosphère à 5% de C02. Trois à sept jours suivant l'ensemencement, les cellules servent à une immunodétection du facteur de régulation spécifique MyoD (DAKO) telle que décrite par Montarras, D. et al. (Cultured Myf5 Null and MyoD Null Muscle Precursor Cells Display Distinct Growth Defects. Biol Cell 2000 ;92 :565-72). Résultats
La procédure d'injection cellulaire n'a pas d'effet sérieux sur les animaux. Une arythmie ventriculaire survient lors de l'insertion de l'aiguille et lors de l'injection des cellules mais se résorbe lorsque l'aiguille est retirée. Le dénombrement des cellules permet de déterminer l'injection de 1.7 +/- 0.3 x 107 cellules mononucléées marquées au DAPI.
L'expression de la chaîne lourde de la myosine squelettique (MY32) est détectée à 3 semaines post-implantation dans 8 animaux sur 8, ce qui confirme la survie cellulaire et l'expression myogénique des cellules implantées. De larges surfaces de greffon (de 2 à 9 mm de diamètre) ou de discrets foyers sont observés à l'intérieur de la paroi du myocarde (Figure 1). Des cellules isolées sont aussi observées dans le tissu adipeux du péricarde. À l'intérieur de la paroi du myocarde, les fibres positives pour l'expression de MY32 sont généralement alignées avec des cardiomyocytes natifs. Certaines de ces fibres sont fortement marquées à l'anticorps dirigé contre MY32, alors que d'autres ne sont que faiblement marquées (Figure 2). Ces fibres ne sont pas couplées électro-mécaniquement entre elles ou avec les cardiomyocytes natifs tel que démontré par immunohistochimie négative à la connexine-43.
Les cellules implantées développent des sarcomères organisés et présentent soit une morphologie allongée caractéristique de myotubes multinuclees fusionnés, soit une morphologie qui demeure mononucléée (Figure 3). Ces cellules du muscle squelettique possèdent des noyaux observés en périphérie ou au centre. Une fibrose de remplacement et des régions présentant des cellules mononucléées de la réponse inflammatoire sont aussi observées. Aucun marquage au DAPI n'est observé dans les cœurs expiantes. Ceci peut être dû à une division cellulaire active entraînant une dilution du DAPI. En effet, dans les cultures cellulaires servant de témoins, le
DAPI devient indétectable après 6 à 8 doublements de population cellulaire.
Les boîtes de culture servant de témoins sont observées quotidiennement. L'immunodetection du facteur de régulation spécifique du muscle squelettique MyoD montrent qu'approximativement 50% des cellules en culture sont des cellules précurseurs du muscle squelettique. Quand on permet aux cellules de fusionner, toutes les cellules montrent de nombreux myotubes une semaine suivant l'ensemencement. Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en détails ci-dessus et illustrés dans les dessins annexés, l'invention n'est pas limitée à ces seuls modes de réalisation et plusieurs changements et modifications peuvent y être effectués par une personne du métier sans sortir du cadre ou de l'esprit de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Procédé de préparation de cellules souches humaines ou animales, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement en : l'extraction cellulaire - la dissociation mécanique la dissociation enzymatique le maintien des cellules obtenues dans un milieu de culture spécifique permettant de préserver la diversité et la plasticité, ledit procédé excluant la mise en culture des cellules. 2°) Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit milieu de culture spécifique comprend au moins : a) un milieu nutritif; b) un facteur protecteur; c) des hormones; d) des facteurs inhibant la différenciation.
3°) Procédé de préparation de cellules souches selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que lesdites cellules souches sont des cellules souches animales ou humaines choisies dans le groupe constitué par des cellules souches progénitrices d'un tissu. 4°) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le tissu est choisi dans le groupe constitué par la peau, le foie, le cœur, l'os et les tissus nerveux.
5°) Utilisation des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de maladies par thérapie cellulaire ou thérapie génique.
6°) Cellule souche obtenue selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7°) Méthode de traitement comprenant une étape d'implantation de cellules souches animales autologues ou hétérologues obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4 chez un animal. 8°) Composition cellulaire comprenant des cellules souches humaines ou animales obtenues selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 4.
9°) Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce que les cellules souches ont une capacité de colonisation et une capacité à permettre une récupération fonctionnelle.
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