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WO2002020036A1 - Arzneimittel mit einer für das rna-bindende koc-protein kodierenden dna-sequenz, einem koc-protein oder einer dna-sequenz des koc-promotors - Google Patents

Arzneimittel mit einer für das rna-bindende koc-protein kodierenden dna-sequenz, einem koc-protein oder einer dna-sequenz des koc-promotors Download PDF

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WO2002020036A1
WO2002020036A1 PCT/DE2001/002948 DE0102948W WO0220036A1 WO 2002020036 A1 WO2002020036 A1 WO 2002020036A1 DE 0102948 W DE0102948 W DE 0102948W WO 0220036 A1 WO0220036 A1 WO 0220036A1
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WO
WIPO (PCT)
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koc
cells
dna sequence
protein
promoter
Prior art date
Application number
PCT/DE2001/002948
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English (en)
French (fr)
Inventor
Friederike MÜLLER
Thomas Gress
Guido Adler
Original Assignee
Mueller Friederike
Thomas Gress
Guido Adler
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10106829A external-priority patent/DE10106829A1/de
Application filed by Mueller Friederike, Thomas Gress, Guido Adler filed Critical Mueller Friederike
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Priority to AU2001279581A priority patent/AU2001279581A1/en
Publication of WO2002020036A1 publication Critical patent/WO2002020036A1/de

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    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Definitions

  • the present invention relates to a medicament which contains an RNA-binding protein KOC or a DNA sequence coding for this protein, preferably inserted on a vector.
  • the present invention further relates to a diagnostic method with regard to malignant tumors associated with the expression of KOC and various uses of the medicament according to the invention, preferably for artificially inducing the pluripotency of body cells.
  • the present invention also relates to a DNA sequence of the KOC promoter, the KOC promoter being characterized in that it is activated only in embryonic tissues or malignant tumors, and various uses of the KOC promoter.
  • ES cells divisible, undifferentiated cells
  • ES cells can differentiate into mesenchymal cells by treatment with the "bone morphogenetic protein 4" (bmp4).
  • bmp4 bone morphogenetic protein 4
  • these cells can also be manipulated by defined culture conditions such that three-dimensional, tissue-like structures with organ-specific expression patterns be developed.
  • pluripotency of stem cells can be seen in the fact that it has been possible to implant neuronal stem cells in mice with destroyed bone marrow, which differentiate there into blood cells.
  • the invention is essentially based on the technical problem of providing means with which a differentiation of a mature cell type into an embryonic phenotype that is divisible but still has characteristics of the respective differentiated cell is made possible.
  • KOC KH domain containing protein overexpressed in cancer
  • RNA-binding proteins are highly conserved, functionally important structures of RNA-binding proteins that are responsible for direct mRNA binding. Studies have shown that RNA-binding proteins play a central role in the post-transcriptional regulation of gene expression. In this function, RNA-binding proteins are essential for the regulation of growth and development. Examples include patterning and cellular differentiation during embryonic development.
  • Two mechanisms of post-transcriptional gene regulation by proteins containing KH domains are the control of the mRNA stability and the specific subcellular localization of the mRNA. Although a number of proteins containing KH domains have already been identified, no KH protein has so far been shown to be able to reverse the phenotype of differentiated cells to a phenotype of immature, undifferentiated, divisible cells and thus to be possible therapeutic agent is suitable for the production of syngeneic stem cell populations which provide large numbers of divisible, specifically differentiable cells.
  • RNA-binding protein KOC RNA-binding protein KOC
  • a mature cell type can be dedifferentiated into an embryonic phenotype, but which still bears the characteristics of the differentiated cell, so that stem cells of any cell type can be generated in the same organism.
  • the KOC gene reverts the phenotype of differentiated cells into a phenotype of immature, undifferentiated, divisible cells.
  • the RNA-binding protein KOC is suitable as a possible therapeutic agent for the production of syngeneic stem cell populations that use large numbers of divisible, specifically differentiable cells Make available, which can then be used, for example, in the field of transplantation medicine and oncology up to the development of biologically functional replacement organs. Furthermore, the RNA-binding protein KOC can be used to influence physiological or physical aging-induced aging processes, for example human skin.
  • the pre B-cell model showed that, for example, the DNA synthesis of the KOC / p210 cells is significantly stronger compared to that of the p210 cells and that the KOC / p210 cells compared to the p210 cells have a large number of embryonic cells Up-regulate markers, or down-regulate markers that distinguish adult pre-B cells from fetal pre-B cells. Cells "re-differentiated" with the KOC gene are significantly less sensitive to cell death induced by radiation and dexamethasone than untreated cells.
  • KOC thus differs fundamentally from conventional growth factors used to date, which always only stimulate the proliferation of a differentiated cell type or transform a cell type into a malignant phenotype.
  • the properties mentioned result in numerous potential applications for KOC in transplantation medicine and cancer treatment.
  • the use of KOC is important for the development of new techniques for the restoration and regeneration of damaged organs (organ replacement), especially at the level of the generation of type-specific syngeneic stem cells and artificial tissue, such as in diseases such as Alzheimer's (neuronal stem cells), diabetes (pre- Beta cells), heart failure (precursor to cardiac muscle cells), liver (precursor to hepatocytes).
  • the use of KOC in the case of skin injuries, such as burns can in the future by inducing rapid extracorporeal multiplication of Skin cells may be important for transplant purposes.
  • results for KOC include following areas of application:
  • KOC itself or the gene encoding this protein
  • the possibility of inactivating KOC in diseases which are associated with an excessively high activity of KOC or an excessively high expression of the gene can also be therapeutically useful.
  • Such inactivation can take place at various levels, for example at the genetic level ("knock out", inhibition of translation by means of antisense RNAs, ribozymes or aptamers) or protein level (via inhibiting ligands, for example antibodies or antagonists, etc.).
  • the DNA sequence of the KOC promoter was also cloned and sequenced in the course of the investigations leading to the present invention, it being shown that this is only activated in embryonic tissue or malignant tumors.
  • the present invention thus relates to a DNA sequence of the KOC promoter which comprises the nucleic acid sequence shown in FIG. 9 or a nucleic acid sequence which deviates therefrom and whose biological function essentially corresponds to that of the KOC promoter.
  • a different nucleic acid sequence used in connection with the KOC promoter in the present invention refers to any nucleic acid sequence which differs from the nucleic acid sequence shown in FIG. 9 by the deletion, addition or substitution of bases, however the biological function of the Promotors is retained, ie to be able to control the transcription of a gene, the promoter being activated essentially only in embryonic tissue or malignant tumors.
  • the deviating nucleic acid sequences are preferably nucleic acid sequences which hybridize with the nucleic acid sequence shown in FIG. 9, reference being made to the definition below with regard to the term “hybridize”, or fragments of the nucleic acid sequence shown in FIG. 9.
  • the "different nucleic acid sequences" are 70%, more preferably 80% and most preferably 90% identical to the DNA sequence of Figure 9.
  • the present invention also relates to a medicament which contains a DNA sequence which codes for an RNA-binding protein KOC with the amino acid sequence shown in FIG. 1, or a DNA sequence which contains the nucleic acid sequence shown in FIG.
  • the DNA sequence is preferably cDNA.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition containing a DNA sequence of the promoter KOC according to the invention or a DNA Se acid sequence, the binding for a protein having the biological properties of an RNA encoding the protein KOC, wherein said DNA sequence of the DNA sequence of Figure 1 in the codon sequence due to the degeneration of genetic codes, hybridizes with the above DNA sequences or is a fragment, an allelic variant or another variant of the above DNA sequences.
  • hybridized used in the present invention refers to conventional hybridization conditions, preferably to hybridization conditions in which 6xSSC, 1% SDS, IxDenhardts solution is used and the hybridization temperatures between 35 ° C. and 70 ° C., preferably be at 45 ° C.
  • washing is preferably carried out with 2xSSC, 1% SDS or with 0.2xSSC (stringent conditions) at temperatures between 40 ° C. and 75 ° C., preferably at 50 ° C. (for the definition of SSC and Denhardts solution see Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)).
  • Stringent hybridization conditions are particularly preferred, as described, for example, in Sambrook et al., Supra, or Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.
  • variant or fragment used in the present invention encompass DNA sequences which differ from the sequences indicated in FIG. 1 by deletion (s), insertion (s), exchange (s) and / or others in the prior art Distinguish known modifications or comprise a fragment of the original nucleic acid molecule, the protein encoded by these DNA sequences still having the biological properties of the RNA-binding protein and being biologically active in mammals. This also includes allele variants.
  • Methods for generating the above changes in the DNA sequence are known to the person skilled in the art and are described in standard works in molecular biology, for example in Sambrook et al., Supra. The person skilled in the art is also able to determine whether a protein encoded by a DNA sequence modified in this way still has the biological properties of the RNA-binding protein KOC. Below are all these DNA sequences are generally referred to as "KOC DNA sequences”.
  • a further preferred embodiment of the present invention relates to antisense RNA which is characterized in that it is complementary to the above DNA sequences and can reduce or inhibit the synthesis of the protein encoded by these DNA sequences and a ribozyme which is characterized in that that it can specifically bind to and cleave part of the above DNA sequences and to the RNA transcribed from these DNA sequences, thereby reducing or inhibiting the synthesis of the protein encoded by these DNA sequences.
  • antisense RNAs and ribozymes are preferably complementary to a coding region of the mRNA.
  • the person skilled in the art is able to prepare and use suitable antisense RNAs based on the disclosed DNA sequences. Suitable procedures are described for example in EB-B1 0223399 or EP-A1 0458.
  • Ribozymes are RNA enzymes and consist of a single strand of RNA. These can intermolecularly cleave other RNAs, for example the mRNAs transcribed by the DNA sequences according to the invention.
  • these ribozymes must have two domains, (1) a catalytic domain and, (2) a domain that is complementary to the target RNA and can bind to it, which is a prerequisite for cleaving the target RNA.
  • a catalytic domain a domain that is complementary to the target RNA and can bind to it, which is a prerequisite for cleaving the target RNA.
  • the present invention thus also includes medicaments containing these vectors or expression vectors.
  • vector refers to a plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript, etc.), a virus or another suitable vehicle.
  • the DNA molecule according to the invention is furcally linked in the vector to regulatory elements which allow its expression in prokaryotic or eukaryotic host cells.
  • regulatory elements for example a promoter
  • such vectors typically contain an origin of replication and specific genes which allow the phenotypic selection of a transformed host cell.
  • the regulatory elements for expression in prokaryotes for example E.
  • coli include the lac, trp promoter or T7 promoter, and for expression in eukaryotes the AOX1 or GAL1 promoter in yeast and the CMV, SV40 , RSV, metallothione and polyhedrin promoter, CMV or SV40 enhancer for expression in animal cells.
  • Suitable regulatory sequences are also described in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Further examples of suitable promoters are the metallothionein I and the polyhedrin promoter.
  • Suitable expression vectors for E. coli include, for example, pGEMEX, pUC derivatives, pGEX-2T, pET3b and pQE-8.
  • Vectors suitable for expression in yeast include pY100 and Ycpadl, for expression in mammalian cells pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4, and of pcDNAI / amp, pcDNAI / neo, pRc / CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr Vectors derived from pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo and pHyg.
  • the expression vectors according to the invention also include vectors derived from bacuiovirus for expression in insect cells, for example pAcSGHisNT-A.
  • the KOC-DNA sequences described above which may also comprise a DNA sequence of the KOC promoter, are preferably inserted into a vector suitable for gene therapy, for example under the control of a tissue-specific promoter, and introduced into the cells.
  • the vector containing the DNA sequences described above is a virus, for example an adenovirus, vaccinia virus or retrovirus. Retroviruses are particularly preferred. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV. Vectors suitable for gene therapy are also disclosed in WO 93/04701, WO 92/22635, WO 92/20316, WO 92/19749 and WO 92/06180.
  • the KOC-DNA sequences described above can also be transported to the target cells in the form of colloidal dispersions. These include, for example, liposomes or lipoplexes (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Finally, the KOC-DNA sequences or the KOC protein can be administered locally, for example in the form of a cream, ointment, etc.
  • RNA-binding protein KOC RNA-binding protein
  • suitable control sequences include, for example, in vitro recombination techniques, synthetic methods and in vivo recombination methods, as are described, for example, in Sambrook et al., Supra.
  • the DNA sequences according to the invention can also be inserted in connection with a DNA coding for another protein or peptide, so that KOC can be expressed, for example, in the form of a fusion protein.
  • An essential goal in the diagnosis of malignant diseases is the specific and sensitive detection of early malignant changes.
  • more and more gene mutations that occur in the context of the adenoma-carcinoma sequence are used in epithelial tumors.
  • the disadvantage of these methods is that gene mutations sometimes occur in normal tissues, such as, for example, ki-ras in normal pancreatic tissues or in highly inflammatory tissues, which makes it impossible to distinguish between chronic, inflammatory or tumorous tissues, which are of great therapeutic importance .
  • the aim of the research is therefore to identify genes that are only expressed / upregulated in malignant degenerate cells and are therefore suitable for unambiguous tumor diagnosis.
  • KOC is expressed in pancreatic cancer, but not in normal pancreatic tissue or in chronic pancreatitis. This finding that KOC is only expressed in malignant tissues (organs or cells) but not in benign tissues has been confirmed in many different tissues and cancers. Please refer to Tab. 1.
  • KOC is therefore suitable for the differential diagnosis between malignancy and benignity, for example in the case of inflammation, of a tissue, preferably of the pancreas or colon.
  • KOC is particularly characterized by the fact that its expression can be detected very early in the development of cancer, long before any auto-antibodies against KOC can be formed.
  • KOC enables the differentiation of different stages of malignancy, especially in pancreatic and colon carcinoma.
  • the present invention also relates to diagnostic methods for the detection of a malignant tumor associated with the expression of KOC or its precursors, in which a sample with a probe suitable for specific hybridization with the mRNA transcribed from a KOC-DNA sequence or a primer or an antibody against the KOC protein or a fragment thereof and then directly or indirectly determines whether the concentration of KOC and / or the KOC mRNA in the sample differs from a control sample.
  • a sample with a probe suitable for specific hybridization with the mRNA transcribed from a KOC-DNA sequence or a primer or an antibody against the KOC protein or a fragment thereof then directly or indirectly determines whether the concentration of KOC and / or the KOC mRNA in the sample differs from a control sample.
  • the person skilled in the art knows methods for suitable sampling and also suitable control samples.
  • the control sample is preferably a tissue which corresponds to the same tissue as the tissue affected by the tumor, but comes from a healthy source.
  • An increased KOC expression compared to the control sample is a diagnostic sign of a tumor or a predisposition to a tumor.
  • the probes that can be used for this diagnostic method include primers based on the KOC-DNA sequences, for example for PCR, RT-PCR or aptamer diagnostics (SELEX method).
  • the probes (or primers) are oligonucleotides that comprise a nucleic acid region that hybridizes under stringent conditions with at least 10, preferably at least 15 consecutive nucleotides of the sequence of FIG. 1 or naturally occurring variants thereof.
  • the probe (or the primer) can also carry a label, for example a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme or an enzyme cofactor.
  • a label for example a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme or an enzyme cofactor.
  • the person skilled in the art is also familiar with conditions which allow that only the KOC mRNA is not amplified in the PCR etc. but not the KOC DNA or that a distinction can be made between DNA amplification products and mRNA amplification products, for example by treating the sample with DNAse or by using primers which also lead to the amplification of intron regions, so that a DNA amplificate is longer compared to the mRNA amplificate.
  • an oligo (dT) anchored primer for PCR, RT-PCR etc. can also be used.
  • the antibodies for the diagnostic method according to the invention can be monoclonal, polyclonal or synthetic antibodies or fragments thereof.
  • fragment means all parts of the monoclonal antibody (for example Fab, Fv or “single chain Fv” fragments) which have the same epitope specificity as the complete antibody. The production of such fragments is known to the person skilled in the art.
  • the antibodies according to the invention are preferably monoclonal antibodies. These antibodies can be produced according to standard procedures, the KOC protein or a (synthetic) fragment thereof preferably serving as an immunogen. Methods for obtaining monoclonal antibodies are known to the person skilled in the art.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention relates to the differential diagnosis between chronic pancreatitis and pancreatic carcinoma.
  • the present invention relates to a diagnostic kit for performing the diagnostic method according to the invention, which contains a probe suitable for specific hybridization with a mRNA transcribed from a KOC-DNA sequence or a primer and / or an anti-KOC antibody or a fragment thereof.
  • a probe suitable for specific hybridization with a mRNA transcribed from a KOC-DNA sequence or a primer and / or an anti-KOC antibody or a fragment thereof Depending on the configuration of the diagnostic kit, the sample or the probe or the primer or the antibody or the fragment thereof can be immobilized.
  • the antibodies can also be present in the liquid phase, for example in immunoassays.
  • the antibodies can be labeled in different ways. Suitable markers and labeling methods are known in the art. Examples of immunoassays are ELISA and RIA.
  • the medicament according to the invention allows a number of (therapeutic) measures to be carried out.
  • the medicament is preferably combined with a suitable carrier.
  • suitable carriers and the formulation such medicinal products are known to the person skilled in the art.
  • Suitable carriers include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions, etc.
  • the medicaments can be administered orally or parenterally. Methods for parenteral administration include topical, intraarterial, intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intravenous, intravenous, intraperitoneal, or intranasal administration.
  • the present invention thus relates to the use of the compounds described above (KOC-DNA sequences / KOC-protein) for artificially inducing the pluripotency of body cells. This is e.g. important for the development of replacement organs, especially for the production of artificial pancreatic, liver or nerve tissue.
  • the present invention also relates to the use of the above compounds for the production of tissues or organs via the differentiation of stem cell populations.
  • the present invention also relates to the use of the compounds described above (KOC DNA sequences / KOC protein) for improving the ex vivo expansion of hematopoietic stem cells, for example for autologous bone marrow transplants.
  • KOC DNA sequences / KOC protein for improving the ex vivo expansion of hematopoietic stem cells, for example for autologous bone marrow transplants.
  • syngeneic progenitor cells can be generated without "purging". This makes autologous transplants possible on a much larger scale than before.
  • the cells to be expanded can be clearly characterized beforehand in FACS (Fluorescence activated Cell Sorting), so that an expansion of malignant cells is excluded. Immunological problems, which often occur with allogeneic transplantation, are excluded.
  • the present invention also relates to the use of the above compounds for high dose chemotherapy.
  • KOC stem cells are less sensitive to chemotherapy or radiation therapy. That under therapy with expression of KOC, the number of re-infusions of expanding stem cells required is reduced. The subsequent shutdown of KOC can then restore the normal sensitivity of the cells to noxae / apoptotic stimuli after the completion of chemotherapy or radiation therapy.
  • the present invention thus also relates to the use of the above compounds for producing a prophylactic effect in chemotherapy or radiation therapy.
  • the present invention also relates to the use of the above compounds to produce a prophylactic effect on skin exposed to radiation.
  • the donor marrow can be transfected with KOC in an allogeneic bone marrow transplant.
  • a faster and less complicated engraftment is then to be expected after the transplant.
  • the present invention also relates to the use of the above compounds for the improvement of the engraftment in allogeneic bone marrow transplants.
  • KOC can also contribute to the slowing down or reversal of aging processes, the aging processes preferably being aging processes in the area of the vascular endothelium, neurons, keratinocytes and myocytes.
  • the present invention also relates to the use of the above compounds for slowing and / or reversing through physiological or physical pollutants induced aging processes, preferably aging processes, which are induced for example by pollutants, such as UV radiation and other environmental influences.
  • KOC gene or protein
  • a suitable carrier for example, as liposomes, lotions, plasters, plasters, bandages, injections, etc.
  • This use also includes a cosmetic application of KOC (gene or protein) on the skin to influence acid skin / wrinkles.
  • the present invention further relates to the use of the above compounds for the regeneration of skin defects or for accelerated wound healing.
  • This also includes the formation of granulation tissue, e.g. after trauma, burns or in the context of UIcera cruris of different origins.
  • the present invention thus relates to the use of the compounds described above (KOC-DNA sequences / KOC-protein) for immunizing an individual, for example an animal or a human, against malignant tumors associated with the expression of KOC and their precursors.
  • the present invention relates to a medicament suitable therefor which contains these compounds in an amount suitable for the immunization of an individual.
  • the KOC protein can be in wild-type or modified form.
  • the latter form includes changes in the amino acid sequence, such as additions, deletions, substitutions and / or inversions of one or more amino acids.
  • Fragments of the KOC proteins can also be present as such or in conjunction with carriers, the fragments having a wild-type or an altered amino acid sequence can.
  • the carriers do not act as immunogenic in the individual.
  • Such carriers can be individual's own proteins or foreign proteins or fragments thereof. Carriers such as serum albumin, fibrinogen or transferrin or a fragment thereof are preferred. It is particularly favorable if the fragments of the KOC proteins contain epitopes which are recognized by cytotoxic T cells, for example CD8 + T cells, and which can induce a cytotoxic immune response.
  • Such epitopes of the KOC proteins can be determined by methods known to the person skilled in the art, in particular by using a software of the NIH (NIH bioinform at ionse rv ice http: /bimas.dcrt.nih.gov.cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform) become. It can also be advantageous if different of the KOC proteins or fragments thereof, to which the above statements apply accordingly, are present at the same time. For the production of the KOC proteins or their fragments, in addition to the above statements, reference is made to Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989).
  • KOC-DNA sequence If used to immunize an individual, it must be in an expressible form, i.e. as such it can be present together with elements suitable for its expression or in connection with a vector. Reference is made to the above explanations.
  • malignant tumors and their precursors encompasses malignant tumors of any kind and origin, which are associated with the expression of KOC, and their precursors.
  • malignant tumors and their precursors can be carcinomas of epithelial origin, in particular pancreas, colon, breast, bronchial and anogenital carcinomas.
  • the term "amount suitable for immunization of an individual” includes any amount of the KOC protein to which the above statements apply, or an expressible KOC DNA sequence for which the above explanations apply accordingly, with which an individual can be immunized.
  • the amount depends on whether the KOC protein or the expressible KOC DNA sequence is used.
  • the amount also depends on whether the immunization of the individual aims more at induction of antibodies directed against the KOC protein or at stimulation of cytotoxic T cells directed against the KOC protein, eg CD8 + T cells. Both possibilities of immunization can be achieved by the present invention. Furthermore, the amount depends on whether the immunization is intended as a prophylactic or therapeutic treatment.
  • the age, gender, and weight of the individual speak a role in determining the amount. It is favorable if the individual is injected with 100 ⁇ g - 1 g of the KOC protein or 10 6 - 10 12 MOI of a recombinant virus containing an expressible KOC-DNA sequence.
  • the injection can take place intramuscularly, subcutaneously, intradermally or in any other form of application in several places of the individual.
  • the drug contains immunization adjuvants such as GM-CSF or Freund's adjuvant to immunize the individual.
  • a non-human mammal (“knock-out”) can be provided by conventional methods, the KOC gene of which is changed.
  • a method is favorable which comprises the following steps:
  • step (b) preparation of embryonic stem cells from a non-human mammal (preferably mouse); (c) transforming the embryonic stem cells from step (b) with the DNA fragment from step (a), the KOC gene in the embryonic stem cells being changed by homologous recombination with the DNA fragment from (a),
  • step (d) culturing the cells of step (c),
  • step (e) selection of the cultured cells from step (d) for the presence of the heterologous sequence, in particular the selectable marker,
  • step (f) Generating chimeric non-human mammals from the cells of step (e) by injecting these cells into mammalian blastocysts (preferably mouse blastocysts), transferring the blastocysts into pseudo-pregnant female mammals (preferably mouse) and analyzing the progeny obtained for a change in the KOC gene.
  • mammalian blastocysts preferably mouse blastocysts
  • pseudo-pregnant female mammals preferably mouse
  • step (c) the mechanism of homologous recombination (cf. R.M. Torres, R. Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997) is used to transfect embryonic stem cells.
  • the homologous recombination between the DNA sequences present in a chromosome and new, added cloned DNA sequences enables the insertion of a cloned gene into the genome of a living cell instead of the original gene.
  • embryonic germ cells can be used to obtain via chimeras animals that are homozygous for the desired gene or the desired gene part or the desired mutation.
  • embryonic stem cells refers to any embryonic stem cells from a non-human mammal that are suitable for mutating the KOC gene.
  • the embryonic stem cells are preferably from the mouse, in particular the cells E14 / 1 or 129 / SV.
  • vector encompasses any vector which, by recombination with the DNA of embryonic stem cells, alters the KOC gene. made possible.
  • the vector preferably has a marker which can be used to select for existing stem cells in which the desired recombination has taken place.
  • a marker is, for example, the loxP / tk neo-cassette, which can be removed from the genome again using the Cre / loxP system.
  • the present invention provides a non-human mammal whose KOC gene is altered.
  • This change can be a function deactivation.
  • the function of the KOC protein can be examined selectively. It is also possible to find substances, drugs and therapeutic approaches that can be used to selectively influence the function.
  • the present invention therefore provides a basis for acting on a wide variety of diseases. Such diseases are e.g. induction of cancer due to errors in the control of cell proliferation.
  • the mammal with altered KOC function enables studies to be carried out as to whether weakened, if not no, tumor development is observed in these animals through the application of various cancerogens. The animal represents a new disease model for the development of new therapeutic approaches.
  • the present invention also relates to the use of the DNA sequence of the KOC promoter shown in FIG. 9 or the nucleic acid sequence which deviates therefrom, the biological function of which essentially corresponds to that of the KOC promoter for the isolation and / or enrichment and / or selective multiplication of stem cells , preferably non-human embryonic stem cells.
  • Stem cells are the primary cells from which the individual tissues of an organism develop. Because all cell types in an organism consist of just one stem cell, the zygote (fertilized egg cell), all stem cells have precursors that have different abilities (potencies) to form new tissues depending on the development stage of the individual.
  • stem cells for example embryonic stem cells from the "mixed culture”.
  • Genetic manipulation makes it possible to introduce genetic selection markers into the cells whose gene products ensure selective survival of the stem cells under certain culture conditions.
  • a gene product can cause resistance to certain antibiotics. All cells that do not express this resistance gene can be eliminated by adding the respective antibiotic in the culture medium.
  • a crucial prerequisite for a selection of stem cells is that the respective selection marker is under the control of a promoter that is activated exclusively in the stem cells. Since the KOC promoter is only activated during this time, it can be used as a control unit for the selection of stem cells.
  • infection / transfection of a vector in which a selection marker is under the control of the KOC promoter gives the stem cells a selection advantage under conditioned culture conditions (eg addition of antibiotics) compared to cells that are no longer in the embryonic state or already differentiated a selection advantage.
  • suitable vectors and suitable selection markers for example the neo-gene / G418 system, are known to the person skilled in the art; see also the above explanations regarding the description of the non-human mammal.
  • the person skilled in the art is also familiar with suitable cultivation methods and media in order to be able to cultivate stem cells, for example embryonic stem cells; see, for example, DE 196 08 813 C2, EP-B1 0 695 351.
  • the "basic medium" which contains, for example, the antibiotic in a suitable concentration for selection, can be any medium which is usually used for the cultivation of mammalian cells.
  • the cells are grown in the above medium under suitable conditions, optionally with (partial) renewal of the medium at suitable time intervals. Suitable conditions, for example with regard to suitable containers, temperature, relative atmospheric humidity, 0 2 content and C0 2 content of the gas phase, are known to the person skilled in the art.
  • the cells are cultured in the medium under the following conditions: (a) 37 ° C, (b) 100% rel. Humidity, (c) 10% 0 2 and (d) 5% C0 2 .
  • the person skilled in the art can also monitor the desired inhibition of cell differentiation on the basis of customary criteria (morphological criteria, presence or absence of specific surface proteins, etc.).
  • the present invention also relates to the use of the DNA sequence of the KOC promoter shown in FIG. 9 or the nucleic acid sequence which deviates therefrom, the biological function of which essentially corresponds to that of the KOC promoter, for determining the degree of differentiation or dedifferentiation of a cell or a tissue.
  • it is favorable to combine the D NA sequence from FIG. 9 or the nucleic acid sequence deviating therefrom with a reporter gene and to introduce the construct into the cell or the tissue and to demonstrate the expression of the reporter gene, which provides information about gives the degree of differentiation or degree of differentiation.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit for carrying out the diagnostic method described above, which contains a probe or a primer suitable for specific hybridization with a DNA sequence of the KOC promoter.
  • the statements made above apply mutatis mutandis to the diagnostic kit relating to the KOC protein or KOC gene.
  • the inventors have characterized pairs of primers which are ideally suited for the purposes mentioned above, for example as a tumor indicator. These can be provided as part of the kit.
  • the preferred primers are:
  • primer pair combinations are very particularly preferred:
  • the conventional tumor markers used so far in the clinic are usually acute phase proteins, which increase in their measurable value in the course of a tumor disease, but also in numerous pathophysiological conditions, e.g. renal insufficiency, inflammation, etc., above the normal value in serum are to be found elevated.
  • These tumor markers only have their clinical significance if, firstly, they are significantly increased and secondly, their value changes in the course of a disease or therapy. This means that most of the common tumor markers are only suitable for course assessment or therapy evaluation. However, they are primarily of no diagnostic value.
  • KOC as a tumor indicator makes it possible for the first time to predict with accidental findings, e.g. in imaging procedures, with excellent specificity and sensitivity whether a lesion is a malignant or benign mass.
  • KOC provides this information with regard to any tissue and is therefore a universally applicable tumor indicator for confirming the diagnosis of Is mass. It is also noteworthy that KOC is not affected in its expression behavior by other pathophysiological conditions, such as inflammation, and thus guarantees 100% sensitivity and specificity. The importance of KOC as a tumor indicator also results from the fact that investigator-dependent influences can be ruled out absolutely. As a surrogate parameter, KOC can therefore significantly improve cytological diagnostic reliability. In addition, reference is made to the above explanations regarding the use of KOC as a tumor indicator.
  • TNF-alpha tumor necrosis factor
  • the TNF-alpha gene is packaged with the promoter sequence of the mdr-1 gene in a vector and treated Animals with this vector construct and with chemotherapeutic agents that act on the promoter sequences of the mdr-1 gene turn on the production of TNF alpha, prevent the formation of resistance and promote the destruction of the tumor cell by apoptosis.
  • chemotherapy which is stressful for the patient, must also be carried out.
  • therapy with cisplatin cis-diaminedichloroplatinum
  • cis-diaminedichloroplatinum is used as an active agent in a variety of malignant diseases as a chemotherapeutic agent.
  • the KOC promoter is activated during the malignant transformation of a cell (see below Example 6), this is excellently suitable as a control unit for a so-called "gene-directed enzyme pro drug (suicide gene) therapy" (GDEPT) for the treatment of a large number of malignant diseases.
  • GDEPT gene-directed enzyme pro drug
  • the HSV-TK gene in combination with the application of ganciclovir, which becomes toxic through phosphorylation via the HSV-TK
  • a tumor suppressor gene for example p53, p16, p21, DPC4, APC, etc.
  • an apoptosis-inducing gene for example bad, caspases, etc., functionally linked to the KOC promoter.
  • the present invention also relates to the use of the DNA sequence of the KOC promoter shown in FIG. 9 or the nucleic acid sequence which deviates therefrom, whose biological function essentially corresponds to that of the KOC promoter, for gene therapy cancer treatment.
  • the above explanations apply analogously with regard to the KOC-DNA sequences.
  • the present invention relates to a method for identifying compounds which bind to the DNA sequence of the KOC promoter according to the invention and modulate its activity, the method comprising the following steps: a) bringing a DNA sequence of the KOC promoter according to the invention into contact with a Test compound in a cellular assay; and b) determining the modulation of the activity of the KOC promoter, where modulation indicates that the test compound is active.
  • test compounds can be very different compounds, both naturally occurring and synthetic, organic and inorganic compounds, and also polymers, for example oligopeptides, polypeptides, oligonucleotides and polynucleotides, as well as small molecules, antibodies, sugars, fatty acids, nucleotides and nucleotide and Analogs, analogs of course occurring structures, for example peptide "imitators", nucleic acid analogs etc., and numerous other compounds. Transcription factors are particularly suitable as test compounds.
  • test compound When performing the cellular assay, it must be ensured that the test compound is brought into contact with the DNA sequence of the KOC promoter which controls the transcription of a reporter gene under such conditions that specific binding is made possible. Then it is preferably determined in the same test system whether the transcription of the promoter functionally linked to the reporter gene has been modulated by the presence of the test compound.
  • suitable reporter genes are GFP, Lacz, luciferase or CAT.
  • the values found in terms of the transcription rate are preferably compared with the values in a second test system that differs from the first only in the absence of the test compound.
  • suitable assay formats for the identification of compounds that affect the modulation of the activity of the KOC promoter are well known in the biotechnological and pharmaceutical industries and additional assays and variations of the assay provided above for illustration are obvious to the person skilled in the art.
  • Changes in promoter activity can be measured by any suitable method. Changes in expression level can be examined using methods well known to those skilled in the art. This includes monitoring the mRNA concentration, eg using suitable probes or primers, immunoassays for protein concentration, RNAse protection assays, amplification assays or any other means suitable for detection that is known in the art. Further detection methods regarding the activation of the promoter depend on the specific properties of the respective reporter gene.
  • the search for compounds which are effective for modulating the activity of the KOC promoter can also be carried out on a large scale, for example by screening a very large number of candidate compounds in substance libraries, the substance libraries being synthetic or natural molecules, eg cDNAs from expression libraries.
  • the test compound is part of a substance library.
  • a large number of potentially useful molecules can be screened in a single test. For example, if a field of 1000 compounds is to be screened, in principle all 1000 compounds can be placed in a microtiter plate well and tested simultaneously. If a promoter modulator is discovered, the pool of 1000 can then be divided into 10 pools of 100 and the process repeated until an individual modulator is identified. In any event, the production and simultaneous screening of large banks of synthetic molecules can be carried out using well known combinatorial chemistry techniques, see for example van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 and Lam, Anticancer Drug Des. j2 (1997), 145-167.
  • the method according to the invention can also be greatly accelerated as high throughput screening.
  • the assays regarding promoter modulation described here can be modified accordingly for use in such a method. It will be apparent to those skilled in the art that numerous methods are available for this purpose.
  • a large number of potentially useful promoter activity-modifying compounds can be screened in extracts from natural products as a starting material. Such extracts can come from a large number of sources, for example the species fungi, actinomycetes, algae, insects, protozoa, plants and bacteria.
  • the extracts that show modulation can then be analyzed to isolate the active molecule. See, for example, Turner, J. Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 39-43 and Suh, Anticancer Res. 15 (1995) 233-239.
  • the compounds found which modulate the activity of the KOC promoter can in many cases be used therapeutically, for example in the context of tumor therapy.
  • FIG. 1 DNA sequence of the gene coding for the RNA-binding protein KOC and amino acid sequence derived therefrom
  • Figure 2 Proliferation of cells that express KOC and p210 and cells that only express p210
  • Figure 3 Growth of cells expressing KOC and p210 and cells expressing only p210
  • Figure 4 Resistance of cells that express KOC and p210 and cells that only express p210. towards dexamethasone
  • Fig. 5 Overexpression of the embrvonal marker IGF-II in transgenic mice
  • Fig. 6 Use of KOC as a molecular biological tumor indicator
  • Fig. 9 DNA sequence of the KOC promoter
  • Example 1 Overexpression of KOC leads to apoptosis resistance in adult pre-B lines
  • Murine pre B cells were isolated from either adult bone marrow or fetal liver. The tibiae and femura of mice were isolated to isolate the adult bone marrow. Then they were sprayed with medium (DMEM, Life Technologies, Düsseldorf, Germany). To isolate the fetal progenitor cells, the liver was isolated from day 15 mouse embryos. This was then ground through a sterile cell culture sieve, releasing the individual blood precursor cells. 1 X 10 7 cells per 6 cm were cultivated from adult bone marrow and fetal liver. Both the adult cells and the fetal cells could be cultivated comparatively easily in vitro and thus analyzed for differences in gene expression and for functional differences. Different in vitro culture systems were available for both cell populations.
  • One system was to cultivate the cells on a stromal cell line in the presence of the growth factor Interleukin 7 (R&D Systems, Wiesbaden, Germany).
  • the current cell line ST2 was used in the present case.
  • the cells were expanded until they were approximately 80% confluent. Then they were irradiated with 3000 rad. Cells treated in this way were growth-inactive, but still had a metabolism for a few days.
  • Bone marrow or fetal liver cells were plated on this cell line with a cell density of 2 x 10 6 cells with a concentration of 10ng IL7 per ml. Under these conditions, only pre-B cells grew. The cells were plated onto fresh stromal cells twice a week.
  • the bone marrow or the fetal liver cells with the comparatively low tumorigenic oncogene p210 BCR-ABL transformed.
  • This is a fusion protein that is produced by a chromosomal translocation, with parts of the BCR (break point dark region) gene from chromosome 22 fused to c-ABL (tyrosine kinase) on chromosome 9 (Philadelphia chromosome), resulting in the kinase c-ABL is activated.
  • the translocation mentioned is associated with chronic myeloid leukemia. Retroviral infection was performed.
  • p210 BCR-ABL was cloned into the retroviral vector pBMNZ (available from Garry Nolan, Stanford; vector map: http://www.stanford.edu/group/nolan/pmaps.htmp).
  • 10 7 cells were incubated with 3 ml of retroviral supernatant in the presence of 8 mg / ml polybrene in 50 ml conical tubes for at least 3 hours. The cells were then plated with IL7 on stroma for 48 hours. After 48 hours, IL7 was washed out and the cells were plated without IL7.
  • BCR-ABL made the pre-B cells IL7 independent, only cells that had been infected with the retrovirus coding for BCR-ABL grew out (FIG. 3). A selection for eg G418 could therefore not be made.
  • the BCR-ABL transformed cells were initially IL7-independent and later also stroma-independent. However, the cells transformed in this way were still able to differentiate B cells that mature in vivo.
  • adult pre B cells differ from fetal ones by the expression of two genes: the terminal deoxynucleotide transferase (TdT) and the "myosin light chain 2" (PLRLC) are expressed in adult pre B cells, but not in fetal ones .
  • TdT terminal deoxynucleotide transferase
  • PLRLC myosin light chain 2
  • fetal pre B cells are resistant to steroids, while adult cells become apoptotic after steroid administration.
  • fetal pre B cells can be kept in culture indefinitely in vitro, while the adult cells die after a few months of passage.
  • KOC is expressed in fetal pre B cells but not in adult ones. With KOC there is a marker available to discriminate fetal pre B cells from adults.
  • Example 1 After the clear phenotypic differences between the two cell populations described in Example 1 could be observed, it seemed sensible to create a gene expression profile of these cells using the "Gene Chip” ® system from Affymetrix.
  • This is an oligonucleotide array that is hybridized with different fluorescence-labeled RNA of the respective cell population. The specificity of the hybridization is ensured by the presence of 20 nucleotide probes per gene with perfect sequence agreement and 20 nucleotide probes with a base mismatch.
  • numerous genes could be identified that are differentially expressed. For example, Cyclin DI and IGF-II were only detectable in the cells that also expressed KOC in addition to p210.
  • the coding cDNA of the human KOC gene was cloned in sense orientation directly behind the metallothionein promoter of the expression vector MT-LCR 2999B4 (Palmiter et al., 1993, Mol Cell Biol, 13, 5266-5275 ).
  • the DNA construct (Dral fragment containing the complete open reading frame of KOC was cloned into the Nrul site of the MT-LCR2999B4) was cut with the restriction endonuclease Sall (eg from Röche, Penzberg). The cut construct was injected into the female pronucleus according to the standard protocol using a microinjection system (standard protocol described in: "The Molecular Biology of the Gene", James D.
  • Transgenic Mice Mice with new germ line genes, p. 814 ff.). The cells were then transferred to a pseudopregnant female. The animals which integrated the transgenic construct were identified by means of PCR and Southern blot analysis of the genomic DNA from tail tips of the 1-2 month old mice. These founders were crossed with B6 mice. The lines that inherit the transgene were determined by renewed PCR analysis of the genomic DNA of the offspring of this F1 generation. 02/20036
  • the genomic DNA was isolated from mouse tails using the "Qiagen tissue Kit” and was carried out according to the manufacturer's protocol (Qiagen GmbH, Hilden).
  • Taq polymerase (5U / ⁇ l) O. ⁇ l ddH 2 O ad 50 ⁇ l
  • Transgenic mice were characterized by Western blot analysis of various organs to identify the transgenic mice that express KOC most strongly. Two of these lines were used for breeding.
  • the blots were incubated with the second anti-rabbit antibody coupled to peroxidase (from Amersham ) incubated for 1h at RT.
  • the detection was carried out after washing three times with TBS using the ECL Western blotting detection reagents (from Amersham).
  • Example 4 Differential diagnosis of malignant tumors compared to normal or inflammatory tissue 40
  • Tissue samples were used that were obtained from tissues / tumors of unclear dignity in the liver and lymph nodes using fine needle puncture. Control samples were taken from inflammatory areas of the colon. The biopsies were taken up in lysis buffer (either standard guanidinium buffer or RLT buffer from Qiagen, Hilden, Germany) and mechanically comminuted.
  • lysis buffer either standard guanidinium buffer or RLT buffer from Qiagen, Hilden, Germany
  • RNAeasy Kit from Qiagen, Hilden. This was followed by a DNase digestion.
  • An RT-PCR was carried out directly with the "One-Step RT-PCR Kit” (from Qiagen, Hilden): Primers used:
  • KOC primer 5'-TGCAGTTTCCGAGTCAGTGT-3 '
  • the KOC gene is located on chromosome 7 in the 7p11.5 region.
  • a chromosome 7 specific genomic library (vector Lawrist 4) was screened with a KOC probe.
  • the DNA of positive clones was digested with different restriction enzymes and separated by gel electrophoresis. The gel was blotted using standard procedures.
  • the DNA fixed on the nylon membrane was hybridized with a radioactively labeled 5'-KOC probe. 41
  • a positive 7 kb fragment was then cloned into the vector Bluescript KS (Pharmacia).
  • the clone was deposited on November 1 with the DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Braunschweig) under the entry number DSM 13810.
  • the clone was also sequenced.
  • the first 1946 bp upstream from the ATG are shown in FIG. 9.
  • the binding sites of transcription factors such as SP1, SRF, TFIID / TBF, AP1, AP2, BPV-E2, c-Myb, c / EBP, E1A-F, GATA-1, HNF-5, IBP- are located on this DNA sequence. 1, NF-IL6, NF-kB, SP1, T-antigen, TCF-1, v-Myb etc.
  • Example 6 The KOC promoter is only expressed in malignant tissues and tumor cell lines.
  • KOC promoter is only expressed in malignant tissues and tumor cell lines (eg colon and pancreas). No KOC transcripts could be detected in human and also murine adult tissues. 42
  • KOC expression is limited to the thymus and intestinal epithelium, with KOC mainly found in the intestinal crypts. KOC expression is completely switched off two days after birth. Due to the differential gene expression of KOC in pancreatic carcinoma, the expression of the protein was studied in human pancreatic development. For this purpose, poly (A) + RNA from human fetal pancreatic tissues from "The Genetics Institute", Boston, USA was used. This was separated by gel electrophoresis and blotted using standard methods. The Northern blot was then hybridized with a radiolabelled human KOC probe. It was shown that KOC is clearly expressed during the 12th week of pregnancy. The highest KOC expression was observed in the 18th week of pregnancy (FIG. 7b).
  • transcript detection was carried out by RT-PCR, which showed that the KOC promoter is activated only in pancreatic carcinoma tissue, but not in the pancreas in chronic pancreatitis or in healthy pancreas.
  • samples were taken from various tissues and in liquid nitrogen immediately after the surgical removal 43
  • RNA extraction from this human pancreatic tissue was carried out with the RNAeasy Midi Kit according to the manufacturer's protocol (Qiagen). After a DNase I digestion, the mRNA was rewritten directly into cDNA.
  • commercially available reverse transcriptases e.g. Superscript II RT, Gibco BRL
  • the primers of the acidic ribosomal phosphoprotein were used for an internal control PCR.
  • This protein is known to be present in normal, inflammatory and malignant pancreatic Tissue is expressed equally strongly (forward primer: 5'CTGGCTAAGTTGGT TGCTTT-3 '; reverse primer: 5'-GCAGCT-GATCAAGACTGGA-3'; attachment temperature 58 ° C; 18 cycles).
  • KOC primers were used for the actual KOC RT-PCR: Forward primer: 5'-TGCAGTTTCCGAGTCAGT-3 '; Reverse primer: 5'- ATATCGGAAACCTCAGCGAG-3 '; Annealing temperature 55 ° C; 35 cycles).
  • the amplified DNA fragments were visualized by gel electrophoretic separation in an ethidium bromide-stained agarose gel under UV light. The results are shown in Figure 8. The following findings were obtained for the individual tissue samples:
  • pancreatic tissue 0/6 positive; Chronic pancreatitis: 0/6 positive; Healthy colon tissue: 0/2 positive; Various tumors: 2/2 positive; Pancreatic carcinoma tissue: 7/7 positive. 44
  • Example 7 Regression of a tumor by administration of an adenovirus with a cDNA encoding TNF-alpha which is under the control of the KOC promoter
  • adenovirus was used as a vector to investigate the possible suitability of the KOC promoter for gene therapy treatment of a tumor.
  • the KOC promoter sequence was functionally cloned by homologous recombination into the adenoviral vector adenovirus type 5 (ATCC, VR-5), so that the E1A gene (which is essential for the replication of the adenovirus) was selectively only in KOC-positive cells is expressed (Ad.KOC-E1)
  • Ad.KOC-E1 adenoviral vector adenovirus type 5
  • the E1A gene which is essential for the replication of the adenovirus
  • the TNF-alpha cDNA was cloned into this construct under the control of the KOC promoter (Ad.KOC-E1 / KOC-TNF); this procedure is described in Kurihara et al. (J. Clin.
  • the virus was produced by infection in the human embryonic kidney cell line (HEK293, ATCC).
  • tumor cells panic carcinoma cells Panel or MiaPaCa2; available from the Amercican Type Culture Collection (ATCC)
  • ATCC Amercican Type Culture Collection
  • the tumors were grown to a size of 1 cm.
  • a clear regression of the tumor was observed after intratumoral injection of the Ad.KOC-E1 / KOC-TNF construct.
  • the antitumor effect of this adenoviral construct was confirmed in the histopathological analysis.
  • HSV-tk is under the control of the KOC promoter (Ad.KOC-tk, adenovirus type 5) is used to form the HSV-tk after infection with this virus in KOC-expressing tumor cells (see above) and with simultaneous administration of ganciclovir, this non-toxic substance was converted into a toxic substance by phosphorylation, as a result of which the tumor cells were destroyed.
  • Example 8 Use of KOC as a diagnostic tool to discriminate benign and malignant lesions from biopsy material
  • RNA lysis buffer 50 g guanidinium thiocyanate, 2.5 ml 1M sodium citrate pH 7.0, 0.5 g N-lauryl sarcosine, 0.7 ml 2-mercaptoethanol in 100 ml H 2 O.
  • the total RNA was isolated from the biopsies using the "RNAeasy Mini Kit” (Qiagen).
  • RT-PCR reaction was carried out using the "One-Step RT PCR Kit” (from Qiagen).
  • the PCR conditions were as follows:
  • KOC primers used reverse: 5'-TGCAGTTTCCGAGTCAGT-3 'forward: ⁇ '-ATATCGGAAACCTCAGCGAG-S' annealing temperature: 55 ° C, 35 cycles
  • the amplified DNA fragments are visualized by gel electrophoretic separation in an ethidium bromide-stained agarose gel under UV light.
  • Example 9 Stimulation of CD8 + T cells against the KOC protein and lysis of carcinoma cells expressing the KOC protein.
  • Peripheral mononuclear cells are obtained from a healthy donor and subjected to a so-called ELISPOT analysis.
  • the principle of this experiment is that lymphocytes in culture vessels are stimulated with specific antigens. If the lymphocytes are activated because they recognize the antigen, the activated lymphocytes release cytokines, which in turn bind to specific antibodies which are immobilized on the bottom surface of the culture vessels. After the lymphocytes have been washed out, the bound cytokines can then be detected in the culture vessels with the aid of a second antibody, which is made visible in a subsequent color reaction.
  • Peripheral blood lymphocytes were purified from an HLA-A0201 positive healthy subject by density centrifugation using a Ficoll Paque ® gradient. T-lymphocytes were obtained by separating the B-lymphocytes or the monocytes using antibody-coupled magneto beads (CD11, CD16, CD19, CD36 and CD56) (Pant T cell isolation kit * , Milteny, Bergisch Gladbach, Germany). About 2 x 10 7 T cells were obtained from 30 ml of blood.
  • HLA-A0201 restricted peptides of the KOC protein were identified using a software system from the NIH (NIH bioinformation Service [httpJbimas.dcrt.nih.gov.cgi- bin / molbio / ken_pa rker_comboform).
  • the peptides were as follows: 47
  • the isolated T cells were incubated with T2 cells which were (a) loaded with a mixture of the above 9mer peptides (10 ⁇ g / peptide) and (b) with a mixture of the above 10mer peptides (10 ⁇ g / peptide).
  • the T cells were restimulated weekly for 6 weeks. In each case 10 7 T cells were cocultivated with 2 ⁇ 10 6 peptide-loaded T2 cells in 24 perforated plates.
  • the reactivity to the peptide-loaded T2 cells was determined weekly, starting on day 0 of the experiment, by performing an IFN- ⁇ Elispot analysis. On day 28, reactivity was observed by the mixture of (a) (400 specific cells per million cells). The main reactivity was directed against the peptide 199 (1000 specific cells / 1,000,000 cells). Less activity was observed against the mixture of (b) (150 specific cells / 1,000,000 cells). Here the peptide 33 showed the highest reactivity (600 specific cells / 1,000,000 cells).
  • the activated CD8 + T cells were incubated with the HLA A0201 + pancreatic carcinoma cell panels, which express the KOC protein.
  • the kidney cells HEK293 were used as controls 48
  • Cytology poorly differentiated epithelial. neoplasia; PaCa metastasis

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Abstract

Beschrieben wird ein Arzneimittel, das ein RNA-bindendes Protein KOC oder eine dieses Protein kodierende DNA-Sequenz enthält. Beschrieben werden ferner ein Diagnoseverfahren hinsichtlich von mit Expression von KOC assozierten Tumoren sowie verschiedene Verwendungen des erfindungsgemäßen Arzneimittels, vorzugsweise zum künstlichen Herbeiführen der Pluripotenz von Körperzellen. Beschrieben wird auch eine DNA-Sequenz des KOC-Promotors, wobei der KOC-Promotor dadurch gekennzeichnet ist, daß er nur in embryonalen Geweben oder malignen Tumoren aktiviert wird, sowie verschiedene Verwendungen des KOC-Promotors.

Description

Arzneimittel mit einer für das RNA-bindende KOC-Protein kodierenden DNA-Sequenz, einem KOC-Protein oder einer DNA-Sequenz des KOC- Promotors
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel, das ein RNA-bindendes Protein KOC oder eine für dieses Protein kodierende DNA-Sequenz, vorzugsweise auf einem Vektor inseriert, enthält. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Diagnoseverfahren hinsichtlich von mit der Expression von KOC assoziierten malignen Tumoren sowie verschiedene Verwendungen des erfindungsgemäßen Arzneimittels, vorzugsweise zum künstlichen Herbeiführen der Pluripotenz von Körperzellen. Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch eine DNA-Sequenz des KOC-Promotors, wobei der KOC-Promotor dadurch gekennzeichnet ist, daß er nur in embryonalen Geweben oder malignen Tumoren aktiviert wird, sowie verschiedene Verwendungen des KOC-Promotors.
Der Ausfall einzelner Organe oder differenzierter Zellen innerhalb eines Organs ist Ursache vieler Erkrankungen, die bis heute kaum einer Therapie zugänglich sind. Trotz medizinisch-technischer Fortschritte in der Transplantationsmedizin ist etwa der Mangel an Spenderorganen Grund für das jährliche Sterben von Tausenden von Patienten. Darüber hinaus ist die Funktionsfähigkeit der trans- plantierten Organe nur durch eine kontinuierliche postoperative Immunsup- pression, die z.T. mit gravierenden Nebenwirkungen verbunden ist, zu gewährleisten.
Aus diesen Gründen ist die Entwicklung neuer Technologien zur Regeneration erkrankter Organe oder zur Rekonstitution von Organen zum Schwerpunkt in der medizinischen Forschung geworden. Dabei ist eine Nutzung körpereigener zellulärer Entwicklungs- und Differenzierungspotentiale für therapeutische Ansätze Ziel dieser neuen Behandlungsstrategien. Hierbei wird nach passenden Methoden gesucht, die zur Erlangung von Zelldifferenzierung und Proliferation unter Erhalt der Funktion des einzelnen Zelltyps führen, ohne ein transformierendes Potential zu besitzen. Damit könnte es zukünftig möglich sein, aus z.B. durch Biopsien gewonnenem, gesunden Zellmaterial von Patienten durch gezielte Manipulation und Kultivierung Stammzellpopulationen zu generieren, aus denen sich auf Grund ihres Proliferationspotentials spezifische und differenzierte Zellen entwickeln können. Dadurch könnten schließlich Engpässe an soliden Ersatzorganen in der Transplantationsmedizin behoben werden.
Der koordinierte Ablauf eines komplexen zellulären Differenzierungsprogramms, der letztendlich zur Entwicklung eines funktionsfähigen Organs führt, ist aber ein bislang weitgehend ungelöstes Problem (Lanza et al., Nature Medicine 5,. No. 9 (1999), 975-977; Vogel, G., Science 283 (1999), 1432-1434; Solter et al., Science 283 (1999), 1468-1470). Eine Verwirklichung dieses Konzeptes erscheint nur greifbar in Fällen, in denen eine differenzierte Einzelzelle letztlich Organfunktion" determiniert, wie z.B. die Insulin-produzierende Beta-Zelle der Bauchspeicheldrüse oder im Falle von Antikörper-produzierenden B-Zellen, sowie bei Vorläuferzellen des Knochenmarks, die durch spezifische Wachstumsfaktoren differenziert werden können.
Gegenstand intensiver Forschung ist somit die Erarbeitung neuer Methoden zur Entwicklung von funktionsfähigen Organen, Geweben und Stammzellen zu Transplantationszwecken. Dazu wurden bereits einzelne Gene identifiziert, die bei der Steuerung von Entwicklungsprozessen essentiell sind. Weiterhin ist es gelungen, teilungsfähige, nicht differenzierte Zellen (embryonale Stammzellen, ES-Zellen) zu isolieren, die durch einen Transfer bestimmter Gene gezielt differenziert werden können. Beispielsweise können durch die Behandlung mit dem "bone morphogenetic protein 4" (bmp4) ES-Zellen zu mesenchymalen Zellen differenzieren. Darüber hinaus können diese Zellen durch definierte Kulturbedingungen ebenfalls derart manipuliert werden, so dass dreidimensionale, gewebeähnliche Strukturen mit organspezifischem Expressionsmuster entwickelt werden. Ein weiteres Beispiel für die Pluripotenz von Stammzellen zeigt sich darin, dass es gelungen ist, neuronale Stammzellen in Mäuse mit zerstörtem Knochenmark zu implantieren, die dort zu Blutzellen ausdifferenzieren.
Bisher ist jedoch noch nicht eine kontrollierte Reprogrammierung adulter, ausdifferenzierter Zellen zu ES-Zellen so gelungen, dass dies medizinisch vertretbar ist, da beispielsweise ES-Zellen der Maus per se tumorigen sind und, wenn sie in adulte Mäuse injiziert werden, Teratokarzinome bilden können. Auf den humanen Bereich übertragen, ist dieses Prozedere außerdem nicht nur technisch sehr aufwendig, sondern berührt auch ethische Aspekte, da für dieses Verfahren humane Blastozysten oder Säugeroozyten benötigt werden ("Therapeutic Cloning").
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Mittel bereitzustellen, mit denen eine Dedifferenzierung eines ausgereiften Zelltyps in einen embryonalen Phänotyp, der teilungsfähig ist, aber noch Merkmale der jeweiligen differenzierten Zelle trägt, ermöglicht wird.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.
Im Rahmen einer Untersuchung der differentiellen Genexpression beim Pankreaskarzinom wurde ursprünglich ein Gen kloniert, welches für ein RNA-bin- dendes Protein der KH-Familie kodiert, daher erhielt es den Namen KOC (KH domain containing protein overexpressed in cancer) (Müller-Pillasch et al., Oncogene 14 (1997), 2729-2733). KOC wird nur im Pankreaskarzinom, nicht aber im normalen Pankreasgewebe oder bei der chronischen Pankreatitis exprimiert. Das Gen kodiert für ein 69 kDa Protein mit vier KH-Domänen ("hnRNP K homologous"); siehe Figur 1. Die Sequenz ist in der NCBI-Daten- bank unter der Accession No. U97188 hinterlegt. KH-Domänen sind hochkonservierte, funktioneli bedeutsame Strukturen RNA- bindender Proteine, die für eine direkte mRNA-Bindung verantwortlich sind. Untersuchungen konnten zeigen, daß RNA-bindende Proteine eine zentrale Rolle in der posttranskriptionellen Regulation der Genexpression spielen. In dieser Funktion sind RNA-bindende Proteine essentiell für Regulation von Wachstum und Entwicklung. Beispiele dafür sind Musterbildung und zelluläre Differenzierung während der embryonalen Entwicklung.
Zwei Mechanismen der posttranskriptionellen Genregulation durch KH-Domänen enthaltende Proteine sind die Kontrolle der mRNA-Stabilität und die spezifische subzelluläre Lokalisierung der mRNA. Obwohl bereits eine Anzahl von KH-Domänen enthaltenden Proteinen identifiziert worden sind, konnte bisher für kein KH-Protein gezeigt werden, dass dieses in der Lage ist, den Phänotyp differenzierter Zellen in einen Phänotyp unreifer, entdifferenzierter, teilungsfähiger Zellen zu revertieren und sich somit als mögliches Thera- peutikum zur Herstellung von syngenen Stammzellpopulationen eignet, die große Zahlen teilungsfähiger, spezifisch differenzierbarer Zellen zur Verfügung stellen.
Es konnte in der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, dass mit Hilfe des Gens, das für das RNA-bindende Protein KOC kodiert, die vorstehend beschriebenen Probleme gelöst werden können. Mit dem RNA-bindenden Protein KOC ist eine Dedifferenzierung eines ausgereiften Zelltyps in einen embryonalen Phänotyp, der aber noch Merkmale der jeweiligen differenzierten Zelle trägt, möglich, so dass eine Generierung von Stammzellen eines beliebigen Zelltyps im gleichen Organismus erzeugt werden kann. Dabei revertiert das KOC-Gen den Phänotyp differenzierter Zellen in einen Phänotyp unreifer, entdifferenzierter, teilungsfähiger Zellen. Somit eignet sich das RNA-bindende Protein KOC als mögliches Therapeutikum zur Herstellung von syngenen Stammzellpopulationen, die große Zahlen teilungsfähiger, spezifisch differenzierbarer Zellen zur Verfügung stellen, die dann z.B. im Bereich der Transplantationsmedizin und Onkologie, bis hin zur Entwicklung biologisch funktioneller Ersatzorgane, zum Einsatz kommen können. Weiterhin kann das RNA-bindende Protein KOC zur Beeinflussung von physiologischen oder durch physikalische Noxen induzierten Alterungsprozessen, z.B. der menschlichen Haut, eingesetzt werden.
Die Untersuchungen wurden an pre-B-Zellen durchgeführt und durch Genmanipulation dieser differenzierten Zellen mit KOC konnten diese in einen undiffe- renzierten Zustand, der einer früheren, embryonalen Vorläuferform oder Stammzellen dieser Zellen entspricht, überführt werden. So konnte am pre B-Zell-Modell gezeigt werden, dass beispielsweise die DNA-Synthese der KOC/p210 Zellen im Vergleich zu jener der p210 Zellen deutlich stärker ist und dass die KOC/p210 Zellen im Vergleich zu den p210 Zellen eine Vielzahl von embryonalen Markern hochregulieren, respektive Marker, die adulte pre-B-Zellen von fötalen pre-B-Zellen unterscheiden, herunterregulieren. Mit dem KOC-Gen "rückdifferenzierte" Zellen sind gegen durch Bestrahlung und Dexamethason induzierten Zelltod deutlich unempfindlicher als unbehandelte Zellen. Darüber hinaus treten diese Zellen wieder in den Zellzyklus ein und proliferieren. KOC unterscheidet sich damit fundamental von bisher verwendeten konventionellen Wachstumsfaktoren, die stets nur die Proliferation eines differenzierten Zelltyps anregen oder einen Zelltyp zu einem malignen Phänotyp transformieren. Aus den genannten Eigenschaften ergeben sich zahlreiche potentielle Anwendungen für KOC in der Transplantationsmedizin und Krebsbehandlung. Der Einsatz von KOC ist für die Entwicklung neuer Techniken zur Wiederherstellung und Regeneration geschädigter Organe von Bedeutung (Organersatz), insbesondere auf der Ebene der Generation typspezifischer syngener Stammzellen und künstlicher Gewebe, wie bei Erkrankungen, wie Alzheimer (neuronale Stammzellen), Diabetes (pre-Beta-Zellen), Herzinsuffizienz (Vorläufer von Herzmuskelzellen), Leber (Vorläufer von Hepatozyten). Weiterhin kann der Einsatz von KOC bei Hautverletzungen, wie z.B. Verbrennungen, in Zukunft durch die Induktion rascher extrakorporaler Vermehrung von Hautzellen zu Transplantationszwecken von Bedeutung sein.
Zusammengefaßt ergeben sich somit für KOC (entweder im Rahmen einer Gentherapie oder als Proteinverabreichung) u.a. folgende Einsatzbereiche:
(1) Erzielung einer Resistenz differenzierter Zellen gegen durch verschiedene Noxen induzierten Zelltod (z. B. Bestrahlung), und
(2) Überführung von Zellen von einem differenzierten, nicht proliferationsfähigen in einen undifferenzierten, proliferationsfähigen Vorläuferzustand, der aber noch deutliche Merkmale des differenzierten Phänotyps trägt, und damit nach Expansion der Zellpopulation durch Abschalten der KOC Expression die Rückdifferenzierung in den Ausgangszelltyp ermöglicht. Damit wird syngen, also im gleichen Organismus, die unbeschränkte Gewinnung von Stammzellen eines beliebigen Zelltyps und somit auch die unbeschränkte Gewinnung differenzierter, z.T. nicht oder nur sehr gering teilungsfähiger Zellen in jedem Lebensalter möglich.
Somit ist für die vorstehend beschriebenen Zwecke die Verabreichung von KOC selbst oder des für dieses Protein kodierenden Gens von Nutzen. Andererseits kann auch die Möglichkeit der Inaktivierung von KOC bei Erkrankungen, die mit einer zu hohen Aktivität von KOC oder einer zu hohen Expression des Gens einhergehen, therapeutisch sinnvoll sein. Eine solche Inaktivierung kann auf verschiedenen Ebenen erfolgen, beispielsweise auf genetischer Ebene ("Knock out", Hemmung der Translation durch Antisense-RNAs, Ribozyme oder Aptame- re) oder Proteinebene (über hemmende iganden, beispielsweise Antikörper oder Antagonisten etc).
Außerdem wurde im Rahmen der zu der vorliegenden Erfindung führenden Untersuchungen auch die DNA-Sequenz des KOC-Promotors kloniert und sequenziert, wobei es sich zeigte, daß dieser nur in embryonalem Gewebe oder malignen Tumoren aktiviert wird. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA-Sequenz des KOC- Promotors, die die in Figur 9 gezeigte Nucleinsauresequenz umfaßt oder eine davon abweichende Nucleinsauresequenz, deren biologische Funktion im wesentlichen der des KOC-Promotors entspricht.
Der in der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang mit dem KOC-Promotor verwendete Ausdruck "eine davon abweichende Nucleinsauresequenz" betrifft jede Nucleinsauresequenz, die sich von der in Figur 9 dargestellten Nucleinsauresequenz durch die Deletion, Addition oder Substitution von Basen unterscheidet, wobei jedoch die biologische Funktion des Promotors erhalten bleibt, d.h. die Transkription eines Gens steuern zu können, wobei der Promotor im wesentlichen nur in embryonalem Gewebe oder malignen Tumoren aktiviert wird. Vorzugsweise handelt es sich bei den abweichenden Nucleinsäuresequen- zen um mit der in Figur 9 gezeigten Nucleinsauresequenz hybridisierende Nucleinsäuresequenzen, wobei hinsichtlich des Begriffs "hybridisieren" auf die nachstehende Definiton verwiesen wird, oder Fragmente der in Figur 9 gezeigten Nucleinsauresequenz. Vorzugsweise sind die "abweichenden Nucleinsäuresequenzen" zu 70%, mehr bevorzugt zu 80% und am meisten bevorzugt zu 90% identisch mit der DNA-Sequenz von Figur 9.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Arzneimittel, das eine DNA-Sequenz enthält, die für ein RNA-bindendes Protein KOC mit der in Figur 1 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert, oder eine DNA-Sequenz, die die in Figur 1 gezeigte Nucleinsauresequenz enthält. Die DNA-Sequenz ist vorzugsweise cDNA.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Arzneimittel, das eine DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen KOC-Promotors enthält oder eine DNA-Se¬ quenz, die für ein Protein mit den biologischen Eigenschaften eines RNA- bindenden Proteins KOC kodiert, wobei sich diese DNA-Sequenz von der DNA- Sequenz von Figur 1 in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, mit den vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisiert oder die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der vorstehenden DNA-Sequenzen ist.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridisiert" bezieht sich auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisie- rungsbedingungen, bei denen als Lösung 6xSSC, 1% SDS, IxDenhardts- Lösung verwendet wird und die Hybridisierungstemperaturen zwischen 35°C und 70°C, vorzugsweise bei 45°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise mit 2xSSC, 1% SDS oder mit 0,2xSSC (stringente Bedingungen) bei Temperaturen zwischen 40°C und 75°C, vorzugsweise bei 50°C gewaschen (zur Definition von SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al ., supra, oder Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1 - 6.3.6 beschrieben sind.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "Variante" oder "Fragment" umfassen DNA-Sequenzen, die sich gegenüber den in Figur 1 angegebenen Sequenzen durch Deletion(en), lnsertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment des ursprünglichen Nucleinsäuremoleküls umfassen, wobei das durch diese DNA-Sequenzen kodierte Protein noch die biologischen Eigenschaften des RNA-bindenden Proteins aufweist und in Säugern biologisch aktiv ist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der DNA-Sequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten DNA-Sequenz kodiertes Protein noch über die biologischen Eigenschaften des RNA-bindenden Proteins KOC verfügt. Nachstehend werden alle diese DNA-Sequenzen allgemein mit dem Begriff "KOC-DNA-Sequenzen" bezeichnet.
Durch die Erniedrigung oder Hemmung der Expression der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, kann die Synthese der von diesen codierten Proteine verringert oder eliminiert werden, was beispielsweise bei bestimmten Krankheitszuständen wünschenswert ist. Daher betrifft eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Antisense-RNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie zu den vorstehenden DNA-Sequenzen komplementär ist und die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen codierten Proteins verringern oder hemmen kann und ein Ribozym, das dadurch gekennzeichnet, daß es zu einem Teil der vorstehenden DNA-Sequenzen und an die von diesen DNA-Sequenzen transkribierte RNA spezifisch binden und diese spalten kann, wodurch die Synthese des von diesen DNA-Sequenzen codierten Proteins verringert oder gehemmt wird. Vorzugsweise sind diese Antisense-RNAs und Ribozyme zu einer codierenden Region der mRNA komplementär. Der Fachmann ist in der Lage, ausgehend von den offenbarten DNA-Sequenzen, geeignete Antisense-RNAs herzustellen und anzuwenden. Geeignete Vorgehensweisen sind beispielsweise in EB-B1 0223399 oder EP-A1 0458 beschrieben. Ribozyme sind RNA-Enzyme und bestehen aus einem einzelnen RNA-Strang. Diese können andere RNAs intermolekular spalten, beispielsweise die von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen transkribierten mRNAs. Diese Ribozyme müssen prinzipiell über zwei Domänen verfügen, (1) eine katalytische Domäne und, (2) eine Domäne, die zu der Ziel-RNA komplementär ist und an diese binden kann, was die Voraussetzung für eine Spaltung der Ziel-RNA ist. Ausgehend von in der Literatur beschriebenen Vorgehensweisen ist es inzwischen möglich, spezifische Ribozyme zu konstruieren, die eine gewünschte RNA an einer bestimmten, vorgewählten Stelle schneiden (siehe beispielsweise Tanner et al., in: Antisense Research and Applications, CRC Press, Inc. (1993), 415- 426). Die das RNA-bindende Protein KOC bzw. das verwandte Protein kodierenden DNA-Sequenzen bzw. die für die vorstehend beschriebenen Antisense-RNAs oder Ribozyme codierenden DNAs können auch in einen Vektor, vorzugsweise Expressionsvektor, inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese Vektoren bzw. Expressionsvektoren enthaltende Arzneimittel. Die Bezeichnung "Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript etc.), auf ein Virus oder ein anderes geeignetes Vehikel. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße DNA-Molekül im Vektor mit regulatorischen Elementen furiktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryoten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-,trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryoten der AOX1- oder GAL1 -Promotor in Hefe und der CMV-,SV40-,RSV, Metallothioneinl- und Polyhedrin-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind außerdem beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor. Zu geeigneten Expressionsvektoren für E.coli zählen beispielsweise pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Zu den für die Expression in Hefe geeigneten Vektoren zählen pY100 und Ycpadl, für die Expression in Säugerzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 sowie von pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo und pHyg stammende Vektoren. Zu den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren zählen auch von Bacuiovirus abgeleitete Vektoren für die Expression in Insektenzellen, beispielsweise pAcSGHisNT-A. Vorzugsweise werden die vorstehend beschriebenen KOC-DNA-Sequenzen, die auch eine DNA-Sequenz des KOC-Promotors umfassen können, in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, und in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen DNA- Sequenzen enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Retrovirus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für die Gentherapie geeignete Vektoren sind außerdem in WO 93/04701, WO 92/22635, WO 92/20316, WO 92/19749 und WO 92/06180 offenbart. Für Zwecke der Gentherapie können die vorstehend beschriebenen KOC-DNA- Sequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682). Schließlich können die KOC- DNA-Sequenzen bzw. das KOC-Protein lokal z.B. in Form einer Creme, Salbe etc. verabreicht werden.
Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Expressionsvektoren, die für das RNA-bindende Protein KOC kodierende DNA-Sequenzen und/oder eine DNA-Sequenz des KOC-Promotors und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind. Die erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden, so daß KOC beispielsweise in Form eines Fusionsproteins exprimiert werden kann. Der Fachmann kennt auch Verfahren zur rekombinanten Herstellung von KOC, d.h. die Kultivierung geeigneter Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins (bzw. Fusionsproteins) erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen. Geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffinitätschromatographie, HPLC etc.) sind ebenfalls allgemein bekannt.
Ein wesentliches Ziel in der Diagnostik von malignen Erkrankungen ist die spezifische und sensitive Erkennung früher maligner Veränderungen. Dazu werden zum Beispiel in epithelialen Tumoren mehr und mehr Genmutationen, die im Rahmen der Adenom-Karzinom-Sequenz auftreten, herangezogen. Nachteil dieser Verfahren ist, daß teilweise Genmutationen in normalen Geweben auftreten, wie zum Beispiel bei ki-ras in normalen Pankreasgeweben oder in stark entzündlich veränderten Geweben, was eine Unterscheidung zwischen chronisch, entzündlichen oder tumorösen Geweben, die therapeutisch von größter Bedeutung sind, unmöglich macht. Ziel der Forschung ist deshalb, Gene zu identifizieren, die ausschließlich in malignen entarteten Zellen exprimiert/hochreguliert sind und sich damit zur zweifelsfreien Tumordiagnostik eignen.
Wie bereits vorstehend diskutiert, wird KOC im Pankreaskarzinom, nicht jedoch aber im normalen Pankreasgewebe oder bei chronischer Pankreatitis exprimiert. Dieser Befund, daß KOC nur in malignen Geweben (Organen bzw. Zellen) nicht aber in benignen Geweben exprimiert wird, hat sich vielfach bei den unterschiedlichsten Geweben bzw. Krebsarten bestätigt. Es wird auf Tab. 1 verwiesen. KOC eignet sich deshalb, um differentialdiagnostisch zwischen Malignität und Benignität, z.B. bei Entzündung, eines Gewebes, vorzugsweise von Pankreas oder Colon, unterscheiden zu können. Ganz besonders zeichnet sich KOC dadurch aus, daß seine Expression sehr früh in der Krebsentstehung nachweisbar ist, lange bevor noch irgendwelche Auto-Antikörper gegen KOC gebildet werden (können). Desweiteren ermöglicht KOC die Unterscheidung von verschiedenen Malignitäts-Stadien, insbesondere bei Pankreas- und Colonkarzinom. Hierbei hat sich gezeigt, daß die KOC-Expression mit der Schwere der Dysplasie zunimmt. KOC stellt somit einen universell einsetzbaren Tumorindikator dar. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch Diagnoseverfahren zum Nachweis eines mit der Expression von KOC assoziierten malignen Tumors bzw. seiner Vorstufen, bei denen man eine Probe mit einer zur spezifischen Hybridisierung mit der von einer KOC-DNA- Sequenz transkribierten mRNA geeigneten Sonde oder einem Primer oder einem Antikörper gegen das KOC Protein oder einem Fragment davon in Berührung bringt und sodann direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration von KOC und/oder der KOC-mRNA in der Probe im Vergleich zu einer Kontrollprobe unterscheiden. Der Fachmann kennt Verfahren zur geeigneten Probeentnahme und auch geeignete Kontrollproben. Vorzugsweise handelt es sich bei der Kontrollprobe um ein Gewebe, das dem gleichen Gewebe wie dem vom Tumor befallenen Gewebe entspricht, jedoch von einer gesunden Quelle stammt. Eine im Vergleich zu der Kontrollprobe erhöhte KOC-Expression ist ein diagnostisches Anzeichen für einen Tumor oder eine Prädisposition für einen Tumor. Die für dieses Diagnoseverfahren verwendbaren Sonden umfassen auf den KOC-DNA-Sequenzen basierende Primer, beispielsweise für eine PCR, RT- PCR oder eine Aptamerdiagnostik (SELEX-Verfahren). Vorzugsweise sind die Sonden (oder Primer) Oligonukleotide, die einen Nukleinsäure-Bereich umfassen, der unter stringenten Bedingungen mit mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15 aufeinanderfolgende Nucleotiden der Sequenz von Figur 1 oder natürlich vorkommenden Varianten davon hybridisiert. Die Sonde (bzw. der Primer) kann auch eine Markierung tragen, z.B. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Cofaktor. Der Fachmann kennt auch Bedingungen, die es erlauben, dass bei der PCR etc. nur die KOC-mRNA nicht jedoch die KOC-DNA amplifiziert wird bzw. zwischen DNA-Amplifikationsprodukten und mRNA-Amplifikationsprodukten unterschieden werden kann, z.B. durch Behandlung der Probe mit DNAse oder durch Verwendung von Primern, die auch zur Amplifikation von Intron-Bereichen führen, somit ein DNA-Amplifikat im Vergleich zum mRNA-Amplifikat länger ist. Alternativ kann auch ein oligo(dT)-verankerter Primer für PCR, RT-PCR etc. verwendet werden. Die Antikörper für das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren können monoklonale, polyklonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoklonalen Antikörpers (z.B. Fab-, Fv- oder "Single chain Fv"- Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoklonale Antikörper. Diese Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei vorzugsweise das KOC-Protein oder ein (synthetisches) Fragment davon als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Differentialdiagnose zwischen chronischer Pankreatitis und Pankreaskarzinom.
Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens, der eine zur spezifischen Hybridisierung mit einer von einer KOC-DNA-Sequenz transkribierten mRNA geeignete Sonde oder einen Primer und/oder einen anti- KOC-Antikörper oder ein Fragment davon enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können die Probe oder die Sonde bzw. der Primer bzw. der Antikörper oder das Fragment davon immobilisiert sein. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays auch in Flüssigphase vorliegen. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunoassays sind ELISA und RIA.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel erlaubt die Durchführung einer Reihe von (therapeutischen) Maßnahmen. Vorzugsweise ist das Arzneimittel mit einem geeigneten Träger kombiniert. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intraarterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, in- traventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Verbindungen (KOC-DNA-Sequenzen/KOC-Protein) zum künstlichen Herbeiführen der Pluripotenz von Körperzellen. Dies ist z.B. für die Entwicklung von Ersatzorganen von Bedeutung, insbesondere für die Erzeugung von künstlichem Pankreas-, Leber- oder Nervengewebe. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der vorstehenden Verbindungen für die Herstellung von Geweben oder Organen über die Differenzierung von Stammzellpopulationen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehend beschriebenen Verbindungen (KOC-DNA-Sequenzen/KOC-Protein) für die Verbesserung der ex-vivo-Expansion hamatopoetischer Stammzellen, z.B. für autologe Knochenmarktransplantationen. Insbesondere können syngene Vorläuferzellen ohne "Purging" erzeugt werden. Damit werden autologe Transplantationen in viel größerem Umfang als bisher möglich. Die zu expandierenden Zellen können vorher im FACS (Fluorescence activated Cell Sorting) eindeutig charakterisiert werden, so dass eine Expansion maligner Zellen ausgeschlossen ist. Immunologische Probleme, die bei allogener Transplantation vielfach auftreten, sind ausgeschlossen. Probleme und Komplikationen einer verzögerten Regeneration des Marks auf Grund einer zu geringen Zahl der reinfundierten Stammzellen, wie z.B. bei Sepsis oder lebensbedrohliche Pilzinfektionen, entfallen, da die Menge an Stammzellen, die zur Verfügung stehen, beliebig determinierbar ist. Somit wird aber auch eine weitere Dosis-Erhöhung bei der Chemotherapie möglich, da die endogene Stammzellpopulation nicht mehr ausschließlich für die Regeneration des Marks benötigt wird. Damit ist ein Einsatz des Verfahrens bei der Hochdosis- Chemotherapie mit wiederholter Gabe von Chemotherapie und Reinfusion von autologen Knochenmarksstammzellen von Nutzen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der vorstehenden Verbindungen zur Hochdosis-Chemotherapie.
Ein weiterer therapeutischer Effekt besteht in der Tatsache, dass KOC-Stammzellen, solange das Protein exprimiert wird, unempfindlicher gegen Chemo- oder Strahlentherapie sind. D.h. unter Therapie bei Expression von KOC wird die Zahl der erforderlichen Reinfusionen von expandierenden Stammzellen geringer. Die anschließende Abschaltung von KOC kann dann nach Abschluß der Chemotherapie oder Strahlentherapie die normale Empfindlichkeit der Zellen gegenüber Noxen/apoptotische Stimuli wieder herstellen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der vorstehenden Verbindungen zur Erzeugung eines prophylaktischen Effekts bei Chemo- oder Strahlentherapie.
Da es sich in Expressionsanalysen zeigte, dass nicht nur die mRNA von KOC auf Nukleinsäureebene sondern auch das Protein mittels eines spezifischen Antikörpers entsprechend nachgewiesen werden kann, kann davon ausgegangen werden, dass das Protein als solches seine spezifische Wirkung auf die jeweiligen Zellen entfaltet. Deshalb ist auch die Anwendung von KOC an Hautzellen, vorzugsweise durch in Cremes gelöstes Protein, vorteilhaft. Da insbesondere bei einer topischen Anwendung von KOC in Cremes oder Lotionen nur oberflächliche Hautschichten erreicht werden, ist nicht von einer nachhaltigen proliferationsfördemden (Neben-)Wirkung auf die gesamte Dermis auszugehen. Vielmehr wird ein nachhaltiger Effekt nur in den oberen Hautschichten erzielt, die durch Exposition gegenüber Umwelteinflüssen (UV) besonders geschädigt werden und maligne entarten können (Spinaliom, Basaliom). Damit ist ein therapeutisch-prophylaktischer Effekt von KOC bei strahlenexponierter Haut - auch im Rahmen therapeutischer Bestrahlungen von Körperregionen mit Gammastrahlem - gegeben.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der vorstehenden Verbindungen zur Erzeugung eines prophylaktischen Effekts bei strahlenexponierter Haut.
Desweiteren kann bei einer allogenen Knochenmarktransplantation das Donormark mit KOC transfiziert werden. Es ist dann nach der Transplantation mit einem schnelleren und komplikationsloseren Engraftment zu rechnen. Dies e r g i b t s i c h a u c h a u s d e n E r g e b n i s s e n v o n e r s t e n Knochenmarktransplantationen, die im Rahmen dieser Erfindung an Mäusen durchgeführt wurden. Mark, das mit KOC transfiziert wurde, zeigte ein deutlich schnelleres Engraftment.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der vorstehenden Verbindungen für die Verbesserung des Engraftments bei allogenen Knochenmarktransplantationen.
Darüberhinaus kann der Einsatz von KOC auch zu der Verlangsamung bzw. Umkehrung von Alterungsvorgängen beitragen, wobei es sich bei den Alterungsvorgängen vorzugsweise um Alterungsvorgänge im Bereich des Gefäßendothels, von Neuronen, Keratinozyten und Myozyten handelt.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der vorstehenden Verbindungen für die Verlangsamung und/oder Umkehrung von durch physiologische oder physikalische Noxen induzierten Alterungsprozessen, vorzugsweise Alterungsprozessen, die beispielsweise durch Noxen, wie UV- Strahlung und andere Umwelteinflüsse, induziert werden. Dabei wird KOC (Gen oder Protein) vorzugsweise topisch über einen geeigneten Träger (z.B. als in Creme gelöste Liposomen, Lotionen, Pflaster, Verbände, Injektionen etc.) auf die Haut aufgetragen bzw. in diese verabreicht. Diese Verwendung beinhaltet auch eine kosmetische Applikation von KOC (Gen oder Protein) auf der Haut zur Beeinflussung von Aitershaut/Falten.
Die vorliegende Erfindung betrifft femer die Verwendung der vorstehenden Verbindungen für die Regeneration von Hautdefekten oder zur beschleunigten Wundheilung. Dazu zählt auch die Bildung von Granulationsgewebe, z.B. nach Traumata, Verbrennungen oder im Rahmen von UIcera cruris unterschiedlicher Genese.
Desweiteren hat sich gezeigt, daß ein Individuum mittels KOC gegen mit der Expression von KOC assoziierten malignen Tumoren und ihre Vorstufen immunisiert werden kann.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Verbindungen (KOC-DNA-Sequenzen/KOC-Protein) zur Immunisierung eines Individuums, z.B. eines Tieres oder eines Menschen, gegen mit der Expression von KOC assoziierten malignen Tumoren und ihre Vorstufen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein hierfür geeignetes Arzneimittel, das diese Verbindungen in einer für die Immunisierung eines Individuums geeigneten Menge enthält. Das KOC-Protein kann in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen. Letztere Form umfaßt Veränderungen der Aminosäuresequenz, wie Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von einer oder mehreren Aminosäuren. Auch können Fragmente der KOC-Proteine als solche oder in Verbindung mit Trägern vorliegen, wobei die Fragmente eine Wildtyp- oder eine veränderte Aminosäuresequenz haben können. Günstig ist es, wenn die Träger im Individuum nicht als immunogen wirken. Solche Träger können Individuum-eigene oder -fremde Proteine bzw. Fragmente davon sein. Bevorzugt sind Träger, wie Serumalbumin, Fibrinogen oder Transferrin bzw. ein Fragment davon. Besonders günstig ist es, wenn die Fragmente der KOC-Proteine Epitope enthalten, die von cytotoxischen T-Zellen, z.B. CD8+ T-Zellen, erkannt werden und eine cytotoxische Immunantwort induzieren können. Solche Epitope der KOC-Proteine können durch dem Fachmann bekannte Verfahren, insbesondere durch Verwendung eines S oftw a r e syst e m s d e s N I H ( N I H b i o i n f o r m at i o n s e rv i c e http:/bimas.dcrt.nih.gov.cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform) ermittelt werden. Von Vorteil kann es ferner sein, wenn verschiedene der KOC-Proteine oder Fragmente davon, für die die vorstehenden Ausführungen entsprechend gelten, gleichzeitig vorliegen. Zur Herstellung der KOC-Proteine bzw. ihrer Fragmente wird ergänzend zu den vorstehenden Ausführungen auf Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) verwiesen.
Wird eine KOC-DNA-Sequenz zur Immunisierung eines Individuums verwendet, muß sie in einer exprimierbaren Form vorliegen, d.h. sie kann als solche zusammen mit für ihre Expression geeigneten Elementen oder in Verbindung mit einem Vektor vorliegen. Es wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.
Der Ausdruck "maligne Tumoren und ihre. Vorstufen" umfaßt maligne Tumoren jeglicher Art und Herkunft, die mit der Expression von KOC assoziiert sind, und ihre Vorstufen. Beispielsweise können es Karzinome epithelialen Ursprungs, insbesondere Pankreas-, Colon-, Mamma-, Bronchial- und Anogenitalkarzinome sein.
Der Ausdruck "für eine Immunisierung eines Individuums geeignete Menge" umfaßt jegliche Menge des KOC-Proteins, für das vorstehende Ausführungen entsprechend gelten, bzw. einer exprimierbaren KOC-DNA-Sequenz, für die vorstehende Ausführungen entsprechend gelten, mit der ein Individuum immunisiert werden kann. Die Menge hängt davon ab, ob das KOC-Protein oder die exprimierbare KOC-DNA-Sequenz verwendet wird. Auch hängt die Menge davon ab, ob die Immunisierung des Individuums mehr auf eine Induktion von gegen das KOC-Protein gerichteten Antikörpern oder auf eine Stimulierung von gegen das KOC-Protein gerichteten cytotoxischen T-Zellen, z.B. CD8+ T-Zellen, abzielt. Beide Möglichkeiten der Immunisierung können durch die vorliegende Erfindung erreicht werden. Desweiteren hängt die Menge davon ab, ob die Immunisierung als prophylaktische oder therapeutische Behandlung beabsichtigt ist. Darüber hinaus spricht das Alter, das Geschlecht und das Gewicht des Individuums eine Rolle für die Bestimmung der Menge. Günstig ist es, wenn dem Individuum 100μg - 1 g des KOC-Proteins bzw. 106 - 1012 MOI eines rekombinanten, eine exprimierbare KOC-DNA-Sequenz enthaltenden Virus injiziert werden. Die Injektion kann an mehreren Stellen des Individuums intramuskulär, subkutan, intradermal oder in jeder anderen Applikationsform erfolgen. Ferner kann es günstig sein, ein oder mehrere "Booster-Injektionen" mit ca. gleicher Menge durchzuführen, wobei es besonders günstig sein kann, in den einzelnen Injektionen verschiedene Fragmente des KOC-Proteins zu verwenden. Desweiteren ist es günsitg, wenn zur Immunisierung des Individuums das Arzneimittel Immunisierungs- Adjuvantien, wie GM-CSF oder Freund's Adjuvans, enthält.
Desweiteren kann ein nicht-menschliches Säugetier ("knock-out") durch übliche Verfahren bereitgestellt werden, dessen KOC-Gen verändert ist. Günstig ist ein Verfahren, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Herstellung eines DNA-Fragments, insbesondere eines Vektors, enthaltend ein verändertes KOC-Gen, wobei das Gen durch Insertion einer heterologen Sequenz, insbesondere eines selektierbaren Markers, verändert worden ist;
(b) Präparation embryonaler Stammzellen aus einem nicht-menschlichen Säuger (bevorzugt Maus); (c) Transformation der embryonalen Stammzellen von Schritt (b) mit dem DNA-Fragment von Schritt (a), wobei das KOC-Gen in den embryonalen Stammzellen durch homologe Rekombination mit dem DNA-Fragment von (a) verändert wird,
(d) Kultivieren der Zellen von Schritt (c),
(e) Selektion der kultivierten Zellen von Schritt (d) auf das Vorhandensein der heterologen Sequenz, insbesondere des selektierbaren Markers,
(f) Erzeugen chimerer nicht-menschlicher Säuger aus den Zellen von Schritt (e) durch Injektion dieser Zellen in Säuger-Blastozysten (bevorzugt Maus-Blastozysten), Übertragen der Blastozysten in pseudo-schwangere weibliche Säuger (bevorzugt Maus) und Analyse der erhaltenen Nachkommen auf eine Veränderung des KOC-Gens.
In Schritt (c) wird der Mechanismus der homologen Rekombination (vgl. R.M. Torres, R. Kühn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997) ausgenutzt, um embryonale Stammzellen zu trans- fizieren. Die homologe Rekombination zwischen den in einem Chromosom vorhandenen DNA-Sequenzen und neuen, hinzugefügten clonierten DNA-Sequenzen ermöglicht das Einfügen eines klonierten Gens in das Genom einer lebenden Zelle anstelle des ursprünglichen Gens. Mit dieser Methode können bei Verwendung embryonaler Keimzellen via Chimären Tiere erhalten werden, die für das gewünschte Gen oder den gewünschten Genteil oder die gewünschte Mutation homozygot sind.
Der Ausdruck "embryonale Stammzellen" betrifft jegliche embryonalen Stammzellen eines nicht-menschlichen Säugetiers, die sich zur Mutierung des KOC- Gens eignen. Vorzugsweise sind die embryonalen Stammzellen von der Maus, insbesondere die Zellen E14/1 oder 129/SV.
Der Ausdruck "Vektor" umfaßt jeglichen Vektor, der durch Rekombination mit der DNA von embryonalen Stammzellen eine Veränderung des KOC-Gens er- möglicht. Vorzugsweise weist der Vektor einen Marker auf, mit dem auf vorhandene Stammzellen selektioniert werden kann, in denen die gewünschte Rekombination erfolgt ist. Ein solcher Marker ist z.B. die loxP/tk neo-Cassette, die mit Hilfe des Cre/loxP-Systems wieder aus dem Genom entfernt werden kann.
Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen und Materialien, um die Schritte (a)-(f) durchzuführen.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein nicht-menschliches Säugetier bereitgestellt, dessen KOC-Gen verändert ist. Diese Veränderung kann ein Ausschalten der Funktion sein. Mit einem solchen Säugetier bzw. Zellen daraus kann selektiv die Funktion des KOC-Proteins untersucht werden. Ferner ist es hiermit möglich, Substanzen, Arzneimittel und Therapieansätze zu finden, mit denen selektiv auf die Funktion eingewirkt werden kann. Daher liefert die vorliegende Erfindung eine Basis, um auf die verschiedensten Erkrankungen einzuwirken. Solche Erkrankungen sind z.B. die Induktion von Krebs durch Fehler bei der Kontrolle der Zeilproliferation. Ferner ermöglicht das Säugetier mit veränderter KOC-Funktion Untersuchungen, ob man durch Applikation von diversen Cancerogenen eine abgeschwächte, wenn nicht sogar keine Tumorentwicklung in diesen Tieren beobachtet. Das Tier stellt ein neues Krankheitsmodell für die Entwicklung neuer Therapieansätze dar.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch die Verwendung der in Figur 9 gezeigten DNA-Sequenz des KOC-Promotors oder der davon abweichenden Nucleinsauresequenz, deren biologische Funktion im wesentlichen der des KOC-Promotors entspricht zur Isolierung und/oder Anreicherung und/oder selektiven Vermehrung von Stammzellen, vorzugsweise nicht-menschlichen embryonalen Stammzellen.
Stammzellen sind die Urzellen, aus denen sich die einzelnen Gewebe eines Organismus entwickeln. Weil alle Zelltypen eines Organismus aus nur einer einzigen Ausgangszelle, der Zygote (befruchtete Eizelle), entstehen, haben alle Stammzellen Vorläufer, die je nach Entwicklungsstadium des Individuums unterschiedliche Fähigkeiten (Potenzen) zur Bildung neuer Gewebe haben. So spricht man von toti-, pluri- und multipotenten Stammzellen. Die am frühesten auftretenden Stammzellen, die embryonalen Stammzellen, sind totipotent. Aus ihnen können jegliche Gewebe entstehen. Spätere Stammzellen verlieren diese Fähigkeit und sind dann nur noch in der Lage, einzelne Gewebe zu generieren. Werden Stammzellen für wissenschaftliche oder medizinische Zwecke benötigt, so muß bei der Stammzellgewinnung eine sorgfältige Trennung von anderen differenzierten Zellen gewährleistet sein, da diese unter Kulturbedingungen die embryonalen Stammzellen überwachsen können. Weiterhin wird durch eine kontinuierliche Präsenz bestimmter differenzierter Zellen die Differenzierung oder der programmierte Zelltod von Stammzellen induziert. Aus diesem Grund ist es wünschenswert, eine Selektion von Stammzellen, z.B. embryonalen Stammzellen aus der "Mischkultur" vornehmen zu können. Durch eine genetische Manipulation ist es möglich, genetische Selektionsmarker in die Zellen einzubringen, deren Genprodukte unter bestimmten Kulturbedingungen ein selektives Überleben der Stammzellen gewährleistet. So kann ein Genprodukt beispielsweise eine Resistenz gegen bestimmte Antibiotika hervorrufen. Alle Zellen, die dieses Resistenzgen nicht exprimieren, können durch Zusatz des jeweiligen Antibiotikums im Kulturmedium eliminiert werden. Eine entscheidende Voraussetzung für eine Selektion von Stammzellen ist, daß der jeweilige Selektionsmarker unter der Kontrolle eines Promoters steht, der ausschließlich in den Stammzellen aktiviert wird. Da der KOC-Promoter nur in dieser Zeit aktiviert wird, kann dieser als Steuereinheit für die Selektion von Stammzellen herangezogen werden. Dazu wird durch Infektion/Transfektion eines Vektors, bei dem ein Selektionsmarker unter der Kontrolle des KOC- Promoters steht, den Stammzellen ein Selektionsvorteil unter konditionierten Kulturbedingungen (z.B. Addition von Antibiotika) gegenüber Zellen, die sich nicht mehr im embryonalen Zustand befinden bzw. schon differenziert sind, ein Selektionsvorteil verschafft. Verfahren zur Infektion/Transfektion von Stammzellen, geeignete Vektoren und geeignete Selektionsmarker, z.B. das System neo-Gen/G418, sind dem Fachmann bekannt; siehe dazu auch die vorstehenden Ausführungen hinsichtlich der Beschreibung des nichtmenschlichen Säugetiers. Der Fachmann kennt auch geeignete Züchtungsverfahren und Medien, um Stammzellen, z.B. embryonale Stammzellen, kultivieren zu können; siehe z.B. DE 196 08 813 C2, EP-B1 0 695 351. Das "Grundmedium", das z.B. das Antibiotikum in geeigneter Konzentration zur Selektion enthält, kann jedes Medium sein, das üblicherweise für die Züchtung von Säugerzellen verwendet wird. Die Zellen werden in dem vorstehenden Medium unter geeigneten Bedingungen, gegebenenfalls unter (teilweiser) Erneuerung des Mediums in geeigneten Zeitabständen, gezüchtet. Geeignete Bedingungen, beispielsweise hinsichtlich geeigneter Behälter, Temperatur, relativer Luftfeuchte, 02-Gehalt und C02- Gehalt der Gasphase sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise werden die Zellen in dem Medium unter den folgenden Bedingungen kultiviert: (a) 37° C, (b) 100% rel. Luftfeuchte, (c) 10% 02 und (d) 5% C02. Der Fachmann kann auch die gewünschte Hemmung der Differenzierung der Zellen anhand üblicher Kriterien (morphologische Kriterien, Anwesenheit bzw. Abwesenheit spezifischer Oberflächenproteine etc.) überwachen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der in Figur 9 gezeigten DNA-Sequenz des KOC-Promotors oder der davon abweichenden Nucleinsauresequenz, deren biologische Funktion im wesentlichen der des KOC-Promotors entspricht, zur Ermittlung des Differenzierungsgrads oder Dedifferenzierungsgrads einer Zelle oder eines Gewebes. Hierzu ist es günstig, d ie D NA-Seq uenz von Figur 9 oder die davo n abweichende Nucleinsauresequenz mit einem Reporter-Gen zu verbinden und das Konstrukt in die Zelle oder das Gewebe einzuführen sowie die Expression des Reporter- Gens nachzuweisen, was Auskunft über den Differenzierungsgrad bzw. Dedifferzierungsgrad gibt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein diagnostischer Kit zu Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der eine zur spezifischen Hybridisierung mit einer DNA-Sequenz des KOC-Promotors geeignete Sonde oder einen Primer enthält. Bezüglich der Ausgestaltung des Kits gelten die vorstehend gemachten Ausführungen hinsichtlich des das KOC- Protein oder KOC-Gen betreffenden diagnostischen Kits sinngemäß. Von den Erfindern wurden Primerpaare charakterisiert, die sich für die oben genannten Zwecke, z.B. als Tumorindikator, bestens eignen. Diese können im Rahmen des Kits bereitgestellt werden. Die bevorzugten Primer sind:
Forward Primer:
ATG 14 5'-ATATCGGAAACCTCAGCGAG-3'
ATG 651 δ'-CATTCGGAACATCACCAAAC-S'
ATG 778 δ'-GGGGTATTAAACGTGCATTT-S1
ATG 1428 5'-CACTGTCATGAGCCTCACTA-3'
Reverse Primer:
ATG 98 5'-GTAGCCAGTCTTCACCAGGA-3'
ATG 341 δ'-TGCAGTTTCCGAGTCAGTGT-S'
ATG 757 5'-GACTTACAAGCCGCAGAGGT-3' ATG -217 5'-TGACAG TTTAAACCAGCA-3'
Ganz besonders bevorzugt sind die folgenden Primerpaar-Kombinationen:
ATG 14 - ATG 98 (1) ATG 651 - ATG 757 (2) ATG 14 - ATG 341 (6) 4. Fettfuar ~UUJ.
Figure imgf000028_0001
ATG ATG ATG ATG ATG ATG
Figure imgf000028_0002
AT ^G (D ATG 14 757
Bei den bislang in der Klinik verwendeten konventionellen Tumormarkem handelt es sich in der Regel um Akutphaseproteine, die zwar im Verlauf einer Tumorerkrankung in ihrem meßbaren Wert ansteigen, jedoch auch bei zahlreichen pathophysiologischen Zuständen, z.B. Niereninsuffizienz, Entzündungen, etc., über den Normalwert im Serum erhöht zu finden sind. Diese Tumormarker haben ihre klinische Bedeutung erst dann, wenn sie erstens deutlich erhöht vorliegen und zweitens im Verlauf einer Erkrankung oder Therapie sich in ihrem Wert verändern. Das heißt, die meisten gängigen Tumormarker eignen sich höchstens zur Verlaufsbeurteitung oder Therapieevaluation. Sie haben jedoch primär keinen diagnostischen Aussagewert. Durch Verwendung von KOC als Tumorindikator wird es erstmals möglich, aus Zufallsbefunden, z.B. bei bildgebenden Verfahren, mit exzellenter Spezifität und Sensitivität vorauszusagen, ob es sich bei einer Läsion um eine maligne oder benigne Raumforderung handelt. Dies ist insbesondere von Interesse, da KOC diese Information bzgl. jeglicher Gewebe leistet und somit ein universell einsetzbarer Tumorindikator zur Diagnosesicherung von Raumforderungen ist. Bemerkenswert ist ferner, daß KOC durch andere pathophysiologische Zustände, wie z.B. Entzündungen, in seinem Expressionsverhalten nicht beeinflußt wird und damit eine 100%ige Sensitivität und Spezifität gewährleistet. Die Bedeutung von KOC als Tumorindikator ergibt sich auch aus der Tatsache, daß untersucherabhängige Einflüsse absolut auszuschließen sind. Somit kann KOC als Surrogatparameter die zytologische Diagnosesicherheit erheblich verbessern. Ergänzend wird auf vorstehende Ausführungen hinsichtlich der Verwendung von KOC als Tumorindikator verwiesen.
Seit langem ist außerdem bekannt, daß bestimmte Chemotherapeutika beim Menschen anfänglich gut, aber nach einiger Zeit zunehmend weniger wirksam sind. Ursache dieser "Resistenz" ist ein Mechanismus, den Tumorzellen selbst in Gang bringen, da Chemotherapeutika das sogenannte Multi-Drug-Resistenz (md )-Gen aktivieren können. Das Genprodukt selber befindet sich auf der Zellmembran und ist für einen Transport fremder Substanzen aus der Zelle verantwortlich. Auf diese Weise werden die Medikamente unwirksam. Diese Resistenz kann z.B. über den Tumor-Nekrose Faktor (TNF-alpha) verhindert werden. Von außen zugeführt oder auch als Gen transferiert, hemmt TNF-alpha die Expression des MDR1-Gens und damit die Resistenzentwicklung.Verpackt man beispielsweise das TNF-alpha-Gen mit der Promotor-Sequenz des mdr-1- Gens in einen Vektor und behandelt ein Tier mit diesem Vektor-Konstrukt und mit Chemotherapeutika, die auf die Promotersequenzen des mdr-1-Gens einwirken, so schaltet sich die Produktion von TNF alpha an, verhindert die Resistenzbildung und fördert den Untergang der Tumorzelle durch Apoptose. Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß eine für den Patienten belastende Chemotherapie zusätzlich erfolgen muß. Ein weiteres Beispiel ist die Therapie mit Cisplatin (cis-diaminedichloroplatinum), welches als aktives Agens bei einer Vielzahl von malignen Erkrankungen als Chemotherapeutikum Verwendung findet. Da der KOC-Promoter während der malignen Transformation einer Zelle aktiviert wird (siehe das nachstehende Beispiel 6), eignet sich dieser ausgezeichnet als Kontrolleinheit für eine sog. "gene-directed enzyme pro drug (suicide gene) therapy" (GDEPT) zur Behandlung einer Vielzahl maligner Erkrankungen. Vorzugsweise ist für diese gentherapeutische Krebsbehandlung das HSV-TK-Gen (in Kombination mit der Applikation von Ganciclovir, das durch Phosphorylierung über die HSV-TK toxisch wird), ein Tumorsuppressor-Gen, z.B. p53, p16, p21, DPC4, APC, etc., oder ein Apoptose induzierendes Gen, z.B. bad, Caspasen, etc., mit dem KOC-Promoter funktionell verknüpft.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der in Figur 9 gezeigten DNA-Sequenz des KOC-Promotors oder der davon abweichenden Nucleinsauresequenz, deren biologische Funktion im wesentlichen der des KOC-Promotors entspricht, zur gentherapeutischen Krebsbehandlung. Bezüglich der Durchführung einer Gentherapie bzw. den dafür geeigneten Vektoren gelten die vorstehenden Ausführungen hinsichtlich der KOC-DNA-Sequenzen sinngemäß.
Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen KOC- Promotors binden und dessen Aktivität modulieren, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Inkontaktbringen einer DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen KOC- Promotors mit einer Testverbindung in einem zellulären Assay; und b) Bestimmung der Modulierung der Aktivität des KOC-Promotors, wobei eine Modulierung anzeigt, daß die Testverbindung wirksam ist.
Bei den Testverbindungen kann es sich um sehr unterschiedliche Verbindungen handeln, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, organische und anorganische Verbindungen, sowie Polymere, z.B. Oligopeptide, Polypeptide, Oligonucleotide und Polynucleotide, ferner kleine Moleküle, Antikörper, Zucker, Fettsäuren, Nucleotide und Nucleotid-Analoge, Analoge von natürlich vorkommenden Strukturen, z.B. Peptid-"lmitatoren", Nucleinsäureanaloge etc., und zahlreiche weitere Verbindungen. Besonders geeignet sind als Testverbindungen Transkriptionsfaktoren.
Bei der Durchführung des zellulären Assays muß gewährleistet sein, daß die Testverbindung mit der DNA-Sequenz des KOC-Promotors, der die Transkription eines Reportergens steuert, unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht wird, daß eine spezifische Bindung ermöglicht wird. Danach wird vorzugsweise im selben Testsystem bestimmt, ob eine Modulation der Transkription des mit dem Reportergen funktionell verknüpften Promotors durch Anwesenheit der Testverbindung stattgefunden hat. Beispiele für geeignete Reportergene sind GFP, Lacz, Luziferase oder CAT. Dabei werden die gefundenen Werte hinsichtlich der Transkriptionsrate vorzugsweise mit den Werten in einem zweiten Testsystem verglichen, daß sich von dem ersten nur durch die Abwesenheit der Testverbindung unterscheidet. Grundsätzlich geeignete Assay-Formate für die Identifizierung von Verbindungen, die die Modulation der Aktivität des KOC-Promotors beeinflussen, sind in der biotechnologischen und pharmazeutischen Industrie gut bekannt und für den Fachmann sind zusätzliche Assays und Variationen des vorstehend zur Veranschaulichung bereitgestellten Assays offensichtlich.
Veränderungen hinsichtlich der Promotoraktivität können durch jedes geeignete Verfahren gemessen werden. Änderungen im Expressionsspiegel können unter Verwendung von dem Fachmann gut bekannten Verfahren untersucht werden. Dazu zählt die Überwachung der mRNA-Konzentration, z.B. unter Verwendung geeigneter Sonden oder Primer, Immunoassays hinsichtlich der Proteinkonzentration, RNAse-Schutzassays, Amplifikationsassays oder jedes andere für einen Nachweis geeignete Mittel, das auf dem Fachgebiet bekannt ist. Weitere Nachweisverfahren hinsichtlich der Aktivierung des Promotors richten sich nach den spezifischen Eigenschaften des jeweiligen Reportergens. Das Suchen nach Verbindungen, die für eine Modulation der Aktivität des KOC- Promotors wirksam sind, kann auch in großem Maßstab erfolgen, beispielsweise dadurch, daß eine sehr hohe Anzahl von Kandidaten- Verbindungen in Substanzbibliotheken gescreent wird, wobei die Substanzbibliotheken synthetische oder natürliche Moleküle, z.B. cDNAs aus Expressionsbibliotheken, enthalten können. Somit ist in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Testverbindung Bestandteil einer Substanzbibliothek.
Das vorstehende erfindungsgemäße Verfahren kann anhand von Protokollen modifiziert werden, die in der wissenschaftlichen Literatur und der Patentliteratur beschrieben und auf dem Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Molekülen in einem einzigen Test gescreent werden. Beispielsweise können dann, wenn ein Feld von 1000 Verbindungen gescreent werden soll, im Prinzip alle 1000 Verbindungen in eine Mikrotiterplattenvertiefung gegeben und gleichzeitig getestet werden. Wenn ein Promotor-Modulator entdeckt wird, kann dann der Pool von 1000 in 10 Pools von 100 aufgeteilt werden und der Prozeß solange wiederholt werden, bis ein individueller Modulator identifiziert ist. Jedenfalls können die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken aus synthetischen Molekülen mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 und Lam, Anticancer Drug Des. j2 (1997), 145-167.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Screening mit hohem Durchsatz ("high throughput screening") stark beschleunigt werden. Die hier beschriebenen Assays hinsichtlich der Promotor-Modulation können zur Verwendung in einem solchen Verfahren entsprechend modifiziert werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß für diesen Zweck zahlreiche Verfahren zur Verfügung stehen. Darüber hinaus kann eine große Anzahl von möglicherweise nützlichen Promotoraktivität-modifizierenden Verbindungen in Extrakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial gescreent werden. Solche Extrakte können aus einer großen Anzahl von Quellen stammen, beispielsweise den Spezies Pilze, Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien. Die Extrakte, die Modulation zeigen, können dann zur Isolierung des aktiven Moleküls analysiert werden. Siehe beispielsweise Turner, J. Ethnopharmacol. 51 (1-3) (1996), 39-43 und Suh, Anticancer Res. 15 (1995) 233-239. Die gefundenen die Aktivität des KOC-Promotors modulierenden Verbindungen können vielfach therapeutisch, z.B. im Rahmen einer Tumortherapie, eingesetzt werden.
Kurze Beschreibung der Figuren:
Figur 1: DNA-Sequenz des für das RNA-bindende Protein KOC kodierenden Gens und davon abgeleitete Aminosäuresequenz
Figur 2: Proliferation von Zellen, die KOC und p210 exprimieren und Zellen, die nur p210 exprimieren
Zellen, die KOC und p210 exprimieren, proliferieren im Vergleich zu Zellen, die nur p210 exprimieren, 10-fach mehr.
Figur 3: Wachstum von Zellen, die KOC und p210 exprimieren und Zellen, die nur p210 exprimieren
Zellen, die KOC und p210 exprimieren, wachsen im Vergleich zu Zellen, die nur p210 exprimieren, stromaunabhängig
Figur 4: Resistenz von Zellen, die KOC und p210 exprimieren und Zellen, die nur p210 exprimieren. gegenüber Dexamethason
Zellen, die KOC und p210 exprimieren, sind im Vergleich zu Zellen, die nur p210 exprimieren, resistent gegenüber Dexamethason
Fig. 5: Überexpression des Embrvonalmarkers IGF-II in transgenen Mäusen
Fig. 6: Anwendung von KOC als molekularbiologischer Tumorindikator
Fig. 7: Nachweis der embryonalspezifischen Aktivierung des KOC-Promotors über Northem-Blot-Analysen
Northern-Blot-Analyse der KOC Expression in der Entwicklung muriner Embryonen. Jede Spur enthält 2 μg poly(A)+ RNA von Mäuseembryonen aus unterschielichen Entwicklungsstadien (Tag 7-17 postcoitum).(Fig. 7a)
KOC Expression während der humanen embryonalen Pankreasentwicklung. Jede Spur enthält 2μg poly(A)+ RNA von humanem embryonalen Pankreas zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die Hybridisierungssignale erscheinen als Schmier durch die leichte Degradation der mRNA. (Fig. 7b)
Fig. 8: Ergebnisse der RT-PCR von verschiedenen Geweben Ergebnis einer RT-PCR Analyse mit dem Primerpaar 6. Verwendet wurde die Gesamt-RNAvon sechs unterschiedlichen humanen gesunden Pankreasgewe- ben, sechs unterschiedlichen chronischen Pankreatitisgeweben, zwei gesunden Colongeweben, einem Colonkarzinomgewebe (1), einem Weichteilsarkomgewebe (2), einem Magenkarzinomgewebe (3) und elf Pankreaskarzinomgeweben.
Fig. 9: DNA-Sequenz des KOC-Promotors
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1: Die Überexpression von KOC führt in adulten pre-B-Zeilen zu Apoptose-Resistenz
Ein gut untersuchtes Modellsystem, um Entwicklungsprozesse zu studieren, sind murine pre B-Zellen. Murine pre B-Zellen wurden entweder aus adultem Knochenmark oder fötaler Leber isoliert. Zur Isolation des adulten Knochenmarks wurden die Tibiae und Femura von Mäusen isoliert. Anschließend wurden sie mit Medium (DMEM, Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland), ausgespritzt. Zur Isolation der fötalen Vorläuferzellen wurde jeweils die Leber von Tag 15 Mäuse-Embryonen isoliert. Diese wurde anschließend jeweils durch ein steriles Zellkultursieb zerrieben, wobei die einzelnen Blutvorläuferzellen freigesetzt werden. Von adultem Knochenmark und fötaler Leber wurden jeweils 1 X 107 Zellen pro 6 cm kultiviert. Sowohl die adulten Zellen als auch die fötalen Zellen konnten vergleichsweise einfach in vitro kultiviert werden und somit auf Unterschiede in der Genexpression und auf funktionelle Unterschiede hin analysiert werden. Für beide Zellpopulationen standen verschiedene in vitro Kultursysteme zur Verfügung.
Ein System bestand darin, die Zellen auf einer Stromazellline in Gegenwart des Wachstumsfaktors Interleukin 7 (R&D Systems, Wiesbaden, Germany) zu kultivieren. Vorliegend wurde die Stromazelllinie ST2 verwendet. Die Zellen wurden expandiert bis sie zu etwa 80% konfluent waren. Anschließend wurden sie mit 3000 rad bestrahlt. Auf diese Weise behandelte Zellen waren wachstumsinaktiv, besaßen jedoch noch für einige Tage einen Stoffwechsel. Knochenmark oder fötale Leberzellen wurden auf dieser Zelllinie mit einer Zelldichte von 2 x 106 Zellen mit einer Konzentration von 10ng IL7 pro ml plattiert. Unter diesen Bedingungen wuchsen ausschließlich pre-B Zellen. Die Zellen wurden 2x pro Woche auf frische Stromazellen ausplattiert.
In einem zweiten System wurden das Knochenmark oder die fötalen Leberzellen mit dem vergleichsweise gering tumorigenen Onkogen p210 BCR-ABL transformiert. Dieses ist ein Fusionsprotein, das durch eine chromosomale Translokation entstanden ist, wobei Teile des BCR (break point düster region) Gens von Chromosom 22 fusioniert mit c-ABL (Tyrosinkinase) auf Chromosom 9 (Philadelphia Chromosom) vorliegen, wodurch die Kinase c-ABL aktiviert wird. Die angesprochene Translokation ist mit chronischer myeloischer Leukämie vergesellschaftet. Es wurde eine retrovirale Infektion durchgeführt. Hierzu wurde p210 BCR-ABL in den retroviralen Vektor pBMNZ (erhältlich von Garry Nolan, Stanford; Vektormappe: http://www.stanford.edu/group/nolan/pmaps.htmp) kloniert. Jeweils 107 Zellen wurden mit 3ml retroviralem Überstand in Gegenwart von 8 mg/ml Polybrene in 50ml konischen Tubes für mindestens 3 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 48 Stunden mit IL7 auf Stroma plattiert. Nach 48 Stunden wurde IL7 ausgewaschen und die Zellen wurden ohne IL7 plattiert. Da BCR-ABL die pre-B Zellen IL7 unabhängig machte, wuchsen nur Zellen aus, die mit dem für BCR-ABL kodierenden Retrovirus infiziert worden waren (Fig. 3). Eine Selektion für z.B. G418 konnte daher unterbleiben. Wie erwähnt, waren die BCR-ABL transformierten Zellen zunächst IL7 unabhängig und später auch Stroma-unabhängig. Die derart transformierten Zellen waren jedoch noch in der Lage, in vivo zu reifen B-Zellen zu differenzieren.
Bisher war bekannt, daß sich adulte pre B-Zellen von fötalen durch die Expression zweier Gene unterscheiden: Die terminale Desoxynukleotidtransferase (TdT) und die "myosin light chain 2" (PLRLC) werden in adulten pre B-Zellen exprimiert, nicht aber in fötalen. Bekannte funktioneile Unterschiede bestehen darin, daß fötale pre B-Zellen resistent gegen Steroide sind, während adulte Zellen nach Steroidapplikation apoptotisch werden. Weiterhin können fötale pre B-Zellen in vitro zeitlich unbegrenzt in Kultur gehalten werden, während die adulten Zellen nach einigen Monaten Passage sterben. Wir konnten zeigen, daß KOC in fötalen pre B-Zellen nicht jedoch in adulten exprimiert wird. Damit steht mit KOC ein Marker zur Verfügung, um fötale pre B-Zellen von adulten zu diskriminieren. Um die funktioneilen Konsequenzen der KOC Expression zu studieren, wurden adulte pre B-Zellen, die mit p210 BCR-ABL transformiert worden waren, mit einem Retrovirus infiziert (pBMZ), das für KOC kodierte. Die Infektion wurde analog durchgeführt, wie oben für das BCR-ABL kodierende Retrovirus beschrieben. Auf diese Weise gelang eine KOC-Überexpression in den adulten pre B-Zellen. Im Vergleich zu nicht-KOC exprimierenden Zellen waren die exprimierenden Zellen deutlich resistenter gegen Apoptose, die durch unterschiedliche Stimuli ausgelöst wurde. Am eindruckvollsten war dabei die Resistenz gegenüber Steroiden. Während die KOC exprimierenden Zellen bei einer Konzentration von 10-6 M Dexamethason ungehemmt proliferierten, starben sämtliche Kontrollzellen. Außerdem konnte gezeigt werden, daß im Tymidin- einbau-Assay die DNA-Synthese der KOC/ρ210 Zellen im Vergleich zu den p210 Zellen deutlich stärker ist (Fig. 4).
Beispiel 2: Durch die Überexpression von KOC wird die fötale Genexpression reinduziert
Nachdem die in Beispiel 1 beschriebenen deutlichen phänotypischen Unterschiede der beiden Zellpopulationen beobachtet werden konnten, erschien es sinnvoll, ein Genexpressionsprofil dieser Zellen unter Verwendung des "Gene- Chip"®-Systems von Affymetrix zu erstellen. Dabei handelt es sich um einen Oligonukleotid-Array, der mit unterschiedlich fluoreszenzmarkierter RNA der jeweiligen Zellpopulation hybridisiert wird. Die Spezifität der Hybridisierung wird durch das Vorhandensein von 20 Nukleotidsonden pro Gen mit vollkommener Sequenzübereinstimmung und 20 Nukleotidsonden mit einer Basenfehlpaarung sichergestellt. Unter Verwendung dieser Methode konnten zahlreiche Gene identifiziert werden, die differenziell exprimiert werden. So waren beispielweise Cyclin DI und IGF-ll nur in den Zellen nachweisbar, die neben p210 auch KOC exprimierten. In dem hier beschriebenen Zusammenhang ist besonders erwähnenswert, daß in den KOC exprimierenden Zellen die Markergene für den adulten preB-Zell-Phänotyp TdT und PLRLC vollständig herabreguliert waren. Da, wie oben beschrieben, diese beiden Marker die einzig beschriebenen sind, die adulte preB-Zellen von fötalen unterscheiden, kann davon ausgegangen werden, daß durch die Überexpression von KOC eine fötale Genexpression reinduziert wird. Dabei ist noch besonders hervorzuheben, dass erstens der Grad der differentiellen Veränderung im Pankreas transgener Mäuse eindeutig von der Expressionsstärke von KOC abhängt und zweitens die embryonalen Marker infizierter preB-Zellen analog zur KOC-Expression hochreguiiert werden. Durch diese Tatsache wird es möglich, durch eine Gabe unterschiedlicher KOC Mengen entsprechende Dosiseffekte in den jeweiligen Organen zu erreichen.
Als Ergebnis der vorstehenden Experimente wird nachfolgend eine Auswahl von Genen angegeben, die durch KOC in den BCR-ABL exprimierenden Zellen differentiell exprimiert werden:
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Beispiel 3: Transgenes Mausmodell
Um die in vitro gezeigte Redifferenzierung hamatopoetischer Zellen auch in vivo an anderen Zelltypen zu bestätigen (z.B. an epithelialen Zellen) wurde die Auswirkung einer Überexpression von KOC in einem transgenen Mausmodell untersucht.
Für eine regelbare und ubiquitäre Überexpression wurde eine Mauslinie konstruiert, bei der die Expression von KOC unter der Kontrolle des Metallothio- nein-Promoters steht (Palmiter et al., Mol. Cell. Biol. 13(9) (1993), 5266-5275). Die Induktion der KOC-Transkription konnte so durch Zink-Applikation im Trinkwasser aktiviert und kontrolliert werden.
Um die transgenen Mäuse herzustellen, wurde die kodierende cDNA des h u m anen KOC-Gens in sense Orientierung di rekt hinter den Metallothionein-Promoter des Expressionsvektors MT-LCR 2999B4 kloniert (Palmiter et al., 1993, Mol Cell Biol, 13, 5266-5275). Das DNA-Konstrukt (Dral- Fragment, das den kompletten offenen Leserahmen von KOC enthält, wurde in die Nrul-Schnittstelle des MT-LCR2999B4 kloniert) wurde mit der Re- striktionsendonuklease Sall (z.B. Fa. Röche, Penzberg) geschnitten. Das geschnittene Konstrukt wurde mittels einer Mikroinjektionsanlage in den weiblichen Pronukleus nach Standardprotokoll injiziert (Standardprotokoll beschrieben in: "The Molecular Biology of the Gene", James D. Watson et al., 4th Ed., Trans- genic Mice: Mice with new germ line genes, S. 814 ff.). Anschließend wurden die Zellen in ein pseudoschwangeres Weibchen transferiert. Mittels PCR- und Southern Blot Analyse der genomischen DNA aus Schwanzspitzen der 1-2 Monate alten Mäuse wurden die Tiere identifiziert, die das transgene Konstrukt integriert haben. Diese Founder wurden mit B6 Mäusen gekreuzt. Durch erneute PCR-Analyse der genomischen DNA der Nachkommen dieser F1 Generation wurden die Linien ermittelt, die das Transgen vererben. 02/20036
38
Die Isolation der genomischen DNA aus Mäuseschwänzen erfolgte mit dem "Qiagen tissue Kit» und wurde nach Herstellerprotokoll durchgeführt (Qiagen GmbH, Hilden).
Die PCR-Reaktionen fanden unter folgenden Bedingungen statt:
PCR-Reaktion: Ausgangsmaterial 500ng genomische DNA bzw. 100ng cDNA
Primer je 100ng (20pmol)
5x Mg2+ freier Puffer, pH 9.5 10μl
10mM dNTPs 5μl
HotWax™ Kügelchen 2.5mM gCI 1 Stück
Taq Polymerase (5U/μl) O.δμl ddH2O ad 50μl
PCR-Bedingungen: Zeit Temperatur Zyklenzahl
Hot Start 2 Min 95°C 1x
Denaturierung 30 Sek 95°C
Annealing 30 Sek s.u. 35x
Extension 2 Min 72°C
Finale Extension 10 Min 72°C 1x
Primer: Koc2117for: 5'-GAGGACCAGGCAACTTTTG-3- (KOC-spezifisch) hGHIrev: 5'-ACTGGAGTGGCAACTTCC-3'(aus Sequenzabschnitt des humanen Wachstumshormons, dient zur Stabilität der mRNA)
HotWaxTM, Fa. Invitrogen, Groningen, Netherlands 39
Histologische Untersuchungen des Pankreas der Mäuse zeigten deutliche Veränderungen der Organstruktur. Tumore wurden auch bei Tieren, die KOC sehr stark exprimieren, in einem bislang einjährigen Beobachtungszeitraum (bei einem Gesamtlebensalter der Tiere von etwa zwei Jahren) nicht beobachtet. Auch hatte die ektopische KOC-Überexpression keinen Einfluß auf das Allgemeinbefinden/Verhalten der Mäuse. Schließlich wurde immunhistologisch überprüft, welche embryonalen Marker im Pankreas transgener Mäuse hochreguliert werden. Die RT-PCR Daten zeigten, dass neben anderen Genen IGF-ll, das normalerweise in Mäusen nur im Embryonalstadium exprimiert wird, auch in adulten transgenen Tieren wieder überexprimiert wird (Fig. 5).
Die Charakterisierung transgener Mäuse erfolgte im Western Blot durch Analyse verschiedener Organe zur Identifikation der transgenen Mäuse, die KOC am stärksten exprimieren. Zwei dieser Linien wurden zur Zucht weiter verwendet.
Herstellung von Westem-Blots: Die Proteine wurden in einem SDS-Polyacryla- midgel aufgetrennt und im Elektroblot-Verfahren (Sammy dry Schleicher & Schüll, Dassel) nach Angaben des Herstellers auf eine Nitrocellulosemembran (OPTITRAN BA-S83, Schleicher & Schüll, Dassel) transferiert. Um unspezifische Bindungen der Antikörper zu verhindern, wurden die Blots mit 5% Magermilchpulver in TBS 30Min bei 37°C inkubiert und anschließend dreimal mit TBS gewaschen. Die Inkubation mit dem Anti-KOC Kaninchen-Serum erfolgte für 2Std bei RT in TBS mit 0.2%BSA und 0.01%Tween 20. Nach dreimaligem Waschen mit TBS wurden die Blots mit dem zweiten, an Peroxidase gekoppelten anti-Kaninchen Antikörper (Fa. Amersham) für 1Std bei RT inkubiert. Der Nachweis erfolgte nach dreimaligem Waschen mit TBS unter Verwendung der ECL Western blotting detection reagents (Fa. Amersham).
Beispiel 4: Differentialdiagnose maligner Tumoren gegenüber normalem oder entzündlichem Gewebe 40
Verwendet wurden Gewebeproben, die mittels Feinnadeipunktionen aus Geweben/Tumoren unklarer Dignität in Leber und Lymphknoten gewonnen wurden. Kontrollproben wurden aus entzündlichen Bereichen des Colon entnommen. Die Biopsate wurden in Lysispuffer (entweder Standardguanidiniumpuffer oder RLT Puffer der Fa. Qiagen, Hilden, Germany) aufgenommen und mechanisch zerkleinert.
Die Gesamt-RNA wurde mittels des "RNAeasy-Kit" der Fa. Qiagen, Hilden extrahiert. Danach erfolgte ein DNase-Verdau. Mit dem "One-Step RT-PCR Kit" (Fa. Qiagen, Hilden) wurde direkt eine RT-PCR durchgeführt: Verwendete Primer:
KOC-Primer: 5'-TGCAGTTTCCGAGTCAGTGT-3'
5'-ATATCGGAAACCTCAGCGAG-3' Annealing Temperatur: 55° C, 35 Zyklen
5 ml des jeweiligen PCR-Ansatzes wurden auf ein 1% Agarosegel aufgetragen. Das Ergebnis ist in Fig. 6 gezeigt. Dabei ist zu beachten, daß in Spur 1 keine Bande zu erkennen ist, die auf ein tumoröses Geschehen hinweisen würde, sondern wegen Überladung der Spur einen "Schmier" darstellt. Nur in den Spuren 3 und 4 sind entsprechende KOC-Banden sichtbar, sodaß hier von dem Vorliegen eines Tumors auszugehen ist.
Beispiel 5: Identifizierung der DNA-Sequenz für den KOC-Promotor.
Das KOC-Gen liegt auf Chromosom 7 in der Region 7p11.5. Insofern wurde eine Chromosom 7 spezifische genomische Bibliothek (Vektor Lawrist 4) mit einer KOC-Sonde gescreent. Die DNA positiver Klone wurde jeweils mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen verdaut und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde nach Standardverfahren geblottet. Die auf der Nylonmembran fixierte DNA wurde mit einer radioaktiv markierten 5'-KOC-Sonde hybridisiert. 41
Ein positives 7kb großes Fragment wurde dann in den Vektor Bluescript KS (Pharmacia) kloniert. Der Klon wurde am 1. November bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig) unter der Eingangsnummer DSM 13810 hinterlegt. Ferner wurde der Klon sequenziert. Die ersten 1946 bp vom ATG stromaufwärts sind in Fig. 9 gezeigt. Auf dieser DNA-Sequenz liegen die Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren, wie SP1, SRF, TFIID/TBF, AP1, AP2, BPV-E2, c-Myb, c/EBP, E1A-F, GATA-1, HNF-5, IBP-1, NF-IL6, NF-kB, SP1, T-antigen, TCF-1, v-Myb usw.
Ein Sequenzvergleich der DNA-Sequenz von Fig. 9 mit einer internationalen genomischen Sequenzdatenbank (NCBI, National Center for Biotechnology Information) ergab, daß sich Sequenzhomologien von annähernd 98% auf Chromosom 4 und 7 befinden. Es ist anzunehmen, daß der KOC-Promoter auf Chromosom 7 als Duplikat auf Chromosom 4 liegt, wobei zahlreiche chromosomale in situ Hybridisierungen sowie das Vorhandensein klassischer Exon-Intron Strukturen belegten, daß sich das funktionelle KOC-Gen auf Chromosom 7 befindet. Ferner trugen Versuche mit Restriktionsendonukleasen bzw. gezielten Deletionen (z.B. mit dem Erase-a-base Kit der Firma Promega) und anschließender Subklonierung bzw. der Verbindung der erhaltenen Subfragmente mit Reporter-Genen, vgl. hierzu vorstehende Ausführungen, dazu bei, den gesamten hinterlegten Klon in seiner Struktur aufzuklären. Auch wurden hierbei DNA-Sequenzen ermittelt, die einen kleinstmög liehen KOC-Promotor-Bereich aufwiesen.
Beispiel 6: Der KOC-Promotor wird ausschließlich in malignen Geweben und Tumorzellinien exprimiert.
Es konnte gezeigt werden, daß der KOC-Promotor ausschließlich in malignen Geweben und Tumorzellinien (z.B. Colon und Pankreas) exprimiert wird. In humanen und auch murinen adulten Geweben konnten keine KOC-Transkripte nachgewiesen werden. 42
Aufgrund der Tatsache, daß einer Vielzahl von KH-Proteinen eine wesentliche Funktion während der Embryogenese zukommt, wurde davon ausgegangen, daß KOC ebenfalls eine Rolle während der Embryogenese spielen könnte. Eine Northern-Blot-Analyse mit poly A+-RNA von Mäuseembryonen aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien zeigte, daß am Tag 11 der murinen Enwicklung KOC am stärksten exprimiert wird (Figur 7a). Es zeigte sich, daß während fortgeschrittener Entwicklungsstadien die KOC-Expression rapide abnahm. Um erste Hinweise für die Funktion von KOC in der Organogenese zu erhalten, wurden außerdem in situ Hybridisierungen an Mäuseembryonen unterschiedlicher Stadien durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß KOC zum Zeitpunkt der Organogenese am stärksten exprimiert wird, und zwar in ZNS, Darm, Pankreas, Thymus, Niere und hämatopoetischen Organen. Während späterer Entwicklungsstadien der Maus ist die KOC-Expression auf den Thymus und das Darmepithel beschränkt, wobei KOC hauptsächlich in den intestinalen Krypten nachzuweisen ist. Zwei Tage nach der Geburt wird die KOC-Expression vollständig abgeschaltet. Aufgrund der differentiellen Genexpression von KOC im Pankreaskarzinom wurde die Expression des Proteins in der humanen Pan- kreasentwicklung studiert. Hierzu wurde poly(A)+ RNA von humanen fötalen Pankreasgeweben der Firma "The Genetics Institute", Boston, USA verwendet. Diese wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt und nach Standardverfahren geblottet. Der Northern-Blot wurde anschließend mit einer radioaktiv markierten humanen KOC-Sonde hybridisiert. Es zeigte sich, daß KOC während der 12. Schwangerschaftswoche deutlich exprimiert wird. Die stärkste KOC-Expression war in der 18. Woche der Schwangerschaft zu beobachten (Fig. 7b).
Schließlich wurde der Transkriptnachweis noch durch RT-PCR durchgeführt, wobei sich zeigte, daß der KOC-Promotor ausschließlich in Pankreaskarzinom- gewebe nicht jedoch im Pankreas bei chronischer Pankreatitis oder in gesundem Pankreas aktiviert wird. Dazu wurden Proben aus verschiedenen Geweben entnommen und direkt nach operativer Entnahme in flüssigem Stickstoff 43
schockgefroren und bei -70° C aufbewahrt. Für die Extraktion der Gesamt-RNA wurde das Gewebe in einem sterilen Mörser in flüssigem Stickstoff pulverisiert. Die RNA-Extraktion aus diesem humanen Pankreasgewebe erfolgte mit dem RNAeasy Midi Kit nach Herstellerprotokoll (Qiagen). Nach einem DNase I Verdau wurde die mRNA direkt in cDNA umgeschrieben. Dazu wurden komer- ziell erhältliche reverse Transkriptasen (z.B. Superscript II RT, Firma Gibco BRL) nach Herstellerprotokoll verwendet. Zur Einstellung der einzusetzenden cDNA-Menge wurden für eine interne Kontroll-PCR die Primer des sauren ribosomalen Phosphoproteins (GenBank (NCB) xs13, Acc.Nr.: Z36785 verwendet. Von diesem Protein ist bekannt, daß es in normalen, entzündlichen und malignen pankreatischen Geweben gleich stark exprimiert wird. (Forwärts- primer: 5'CTGGCTAAGTTGGT TGCTTT-3';Rückwärtsprimer: 5'-GCAGCT- GATCAAGACTGGA-3'; Anlagerungstemperatur 58° C; 18 Zyklen).
Für die eigentliche KOC RT-PCR wurden folgende KOC-Primer verwendet: Forward Primer: 5'-TGCAGTTTCCGAGTCAGTGT-3'; Reverse Primer: 5'- ATATCGGAAACCTCAGCGAG-3'; Anlagerungstemperatur 55°C; 35 Zyklen). Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden durch gelelektrophoretische Auftrennung in einem Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel unter UV-Licht sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in Figur 8 gezeigt. Für die einzelnen Gewebeproben ergaben sich folgende Befunde:
Normales Pankreasgewebe: 0/6 positiv; Chronische Pankreatitis: 0/6 positiv; Gesundes Dickdarmgewebe: 0/2 positiv; Diverse Tumoren: 2/2 positiv; Pankreaskarzinom gewebe: 7/7 positiv. 44
Beispiel 7: Regression eines Tumors durch Verabreichung eines Adeno- virus mit einer unter der Kontrolle des KOC-Promotors stehenden TNF-alpha kodierenden cDNA
Zur Untersuchung der möglichen Eignung des KOC-Promotors zur gentherapeutischen Behandlung eines Tumors wurde als Vektor ein Adenovirus verwendet. Dazu wurde die KOC-Promotor-Sequenz funktionell durch homologe Rekombination in den adenoviralen Vektor Adenovirus Typ 5(ATCC, VR-5) kloniert, so daß das E1A Gen (das für die Replikation des Adenovirus essentiell ist) selektiv nur in KOC-positiven Zellen exprimiert wird (Ad.KOC-E1) Zusätzlich wurde die TNF-alpha-cDNA unter der Kontrolle des KOC-Promoters in dieses Konstrukt kloniert(Ad.KOC-E1/KOC-TNF); diese Vorgehensweise ist in Kurihara et al. (J. Clin. Invest. 106:763-771, 2000) detailliert beschrieben. Das Virus wurde durch eine Infektion in die humane embryonale Nierenzellinie (HEK293, ATCC) hergestellt. Für die ersten Untersuchungen wurden Tumorzellen (Pan- kreaskarzinomzellen Panel oder MiaPaCa2; erhältlich von der Amercican Type Culture Collection (ATCC)) subkutan in die Flanken von athymischen Nacktmäusen (Stamm NMR nu/nu I) injiziiert. Die Tumoren wurden bis zu einer Größe von 1 cm wachsen gelassen. Nach intratumoraler Injektion des Kon- strukts Ad.KOC-E1/KOC-TNF wurde eine deutliche Regression des Tumors beobachtet. Der antitumorigene Effekt dieses adenoviralen Konstruktes bestätigte sich in der histopathologischen Analyse.
Diese Ergebnisse konnten in vitro ebenfalls bestätigt werden. Zellen, bei denen der KOC-Promoter nachweislich aktiv ist (Humane Pankreaskarzinom-Zellinie Panel und MiaPaCa2 (American Type Culture Collection, ATTC)), wurden mit dem oben beschriebenen Vektorkonstrukt infiziert. Diese Tumorzellen gingen im Vergleich zu Zellinien, die KOC nicht exprimieren (NIH 3T3 Fibroblasten, ATCC), in Apoptose.
Ferner wurde ein Adenovirus, bei dem die Herpes simplex Thymidinkinase 45
(HSV-tk) unter der Kontrolle des KOC-Promotors steht (Ad.KOC-tk, Adenovirus Typ 5) dazu verwendet, daß in KOC-exprimierenden Tumorzellen (vgl. vorstehend) nach Infektion mit diesem Virus die HSV-tk gebildet wurde und bei gleichzeitiger Gabe von Ganciclovir diese nicht toxische Substanz durch Phosphorylierung in eine toxische umgewandelt wurde, wodurch die Tumorzellen zerstört wurden.
Beispiel 8: Einsatz von KOC als Diagnostikum zur Diskriminierung benig- ner und maligner Läsionen aus Biopsatmaterial
Verschiedene Biopsatmaterialien (Gewebe/Zellen) wurden in RNA-Lysepuffer ( 50g Guanidiniumthiozyanat, 2,5ml 1M Natriumeitrat pH 7,0, 0,5g N-Laurylsarko- sin, 0,7ml 2-Mercaptoethanol in 100ml H20) direkt aufgenommen. Die Gesamt- RNA wurde mit dem "RNAeasy Mini Kit" (Fa. Qiagen) aus den Biopsaten isoliert. Die folgende RT-PCR-Reaktion wurde mit dem "One-Step RT PCR Kit" (Fa. Qiagen) ausgeführt. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt:
Verwendete KOC-Primer: reverse: 5'-TGCAGTTTCCGAGTCAGTGT-3' forward: δ'-ATATCGGAAACCTCAGCGAG-S'- Anlagerungstemperatur: 55° C, 35 Zyklen
Die amplifizierten DNA-Fragmente werden durch gelelektrophoretische Auftrennung in einem Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel unter UV-Licht sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. 46
Beispiel 9: Stimulierung von CD8+-T Zellen gegen das KOC-Protein und Lyse von das KOC-Protein exprimierenden Karzinom-Zellen.
(A) Stimulierung von CD8+-T Zellen gegen das KOC-Protein
Von einem gesunden Spender werden periphere mononukleäre Zellen gewonnen und einer sog. ELISPOT-Analyse unterzogen. Das Prinzip dieses Experimentes ist, daß Lymphozyten in Kulturgefäßen mit spezifischen Antigenen stimuliert werden. Kommt es zur Aktivierung der Lymphozyten, da diese das Antigen erkennen, setzen die aktivierten Lymphozyten Zytokine frei, die ihrerseits an spezifische Antikörper binden, welche auf der Bodenfläche der Kulturgefäße immobilisiert sind. Nach dem Auswaschen der Lymphozyten können dann die gebundenen Zytokine in den Kulturgefäßen mit Hilfe eines zweiten Antikörpers, der in einer nachgeschalteten Farbreaktion sichtbar gemacht wird, nachgewiesen werden.
Periphere Blutlymphozyten (PBL) wurden von einem HLA-A0201 positiven gesunden Probanden durch Dichtezentrifugation über einen Ficoll Paque®- Gradienten aufgereinigt. T-Lymphozyten wurden durch Abtrennung der B- Lymphozyten bzw. der Monozyten mit Hilfe Antikörper gekoppelter Magneto- beads (CD11 , CD16, CD19, CD36 und CD56) (Pant T cell isolation Kit* , Milteny, Bergisch Gladbach, Germany) gewonnen. Aus 30 ml Blut wurden etwa 2 x 107 T-Zellen gewonnen werden.
HLA-A0201 restringierte Peptide des KOC-Proteins wurden mittels eines Softwaresystems des NIH (NIH bioinformation Service [httpJbimas.dcrt.nih.gov.cgi- bin/molbio/ken_pa rker_comboform) identifiziert. Es handelte sich um die nachstehenden Peptide: 47
9mer Peptide: 10mer Peptide:
199 RLLVPTQFV 33 FLVKtGYAFV
280 KILAHNNFV 142 FQLEnFTLKV
552 KIQEILTQV 26 KIPVsGPFLV
Die isolierten T-Zellen wurden mit T2-Zellen inkubiert, die (a) mit einem Gemisch der vorstehenden 9mer Peptide (10μg/Peptid) und (b) mit einem Gemisch der vorstehenden 10mer Peptide (10μg/Peptid) beladen worden waren. Die T-Zellen wurden über 6-Wochen jeweils wöchentlich restimuliert. Jeweils 107 T-Zellen wurden mit 2 x 106 Peptid-beladenen T2-Zellen in 24 Lochplatten cokultiviert.
Die Reaktivität gegenüber den Peptid-beladenen T2-Zellen wurde wöchentlich bestimmt, beginnend am Tag 0 des Experiments, indem eine IFN-γ Elispot- analyse durchgeführt wurde. Am Tag 28 wurde eine Reaktivität durch das Gemisch von (a) (400 spezifische Zellen pro Million Zellen) beobachtet. Die Hauptreaktivität wurde dabei gegen das Peptid 199 (1000 spezifische Zellen / 1 000 000 Zellen) gerichtet. Eine schwächere Aktivität wurde gegen das Gemisch von (b) (150 spezifische Zellen / 1 000 000 Zellen) beobachtet. Hier zeigte das Peptid 33 die höchste Reaktivität (600 spezifische Zellen / 1 000 000 Zellen).
Somit wurde deutlich, daß gegen das KOC-Protein aktivierte CD8+-T Zellen stimuliert werden können.
(B) Lyse von das KOC-Protein exprimierenden Karzinom-Zellen
Nach einer weiteren Restimulierung wurden die aktivierten CD8+-T Zellen mit den HLA A0201 + Pankreaskarzinom-Zellen Panel, die das KOC-Protein exprimieren, inkubiert. Als Kontrollen wurden die Nierenzellen HEK293 verwen- 48
det, die das KOC-Protein nicht exprimieren. 106 Panel-Zellen wurden mit 51Cr (100μCi) für 1 h bei 37° C markiert und mit steigenden Zahlen an aktivierten CD8+-T Zellen für 3 Stunden kokultiviert. Die spezifische Lyse der Panel-Zellen wurde durch die Menge der freigesetzten Radioaktivität im Überstand bestimmt.
Es zeigte sich, daß Panel-Zellen durch die aktivierenden CD8+-T Zellen, nicht aber die Kontrollzellen HEK293 lysiert werden.
Patient- KOC-RT- Histo/ NR. PCR Cyto HISTO/CYTO ok lmmunhisto:CEEA pos, Cytoker18 pos, gering differenziertes Plattenepithelcarcinom ok Histologie: wenig differenziertes schleimbildendes Adenokarzinom wπ SVi-s Morbus Crohn ok Zytologie: maligne epitheliale Neoplasie ok Zytologie: maligne epitheliale Neoplasie
11 Zytologie: schlecht differenzierte epitheliale. Neoplasie; PaCa Metastase
12 ok Zytologie: maligne epitheliale Neoplasie
13 ++ ok Histo negativ,! Zyto: negativ, Laparaskopie-Histo:follikuläres. Lymphom
131! ok IHisto negativ,! Zyto: negativ, Laparaskopie-Histo:follikuläres. Lymphom
14 ok 1.Histo: unauffällig, Zytologie: dysplastisches Leberparenchym, HCC
Ψm. m keine maligne Auffälligkeit
16 TTT ok Qsophaguskarzinom
17 ok Zyto:unauffällig, CT gesteuerte Punktion:epithelialeNeoplasie in Leber, nekrotisch zerfallend keine maligne Auffälligkeit
19 ++ ok Rektumkarzinom
20 ok, s.B. Zyto:unauffällig, inoperables BronchialCA mit Leberraumforderung
21 ++ ok Zyto: maligne epitheliale Neoplasie, schleimbildendes AdenoCA
22 ok epithel maligne Neoplasie, ColoCA vereinbar, Metastase
23 +++ ok Kolonkarzinom
24 (+) _____ Hämogiom, stark blutiges Aspirat
25 ++ ok Zytologie: maligne epitheliale Neoplasie keine maligne Auffaelligkeit
27 ++ CEA stark positiv, Diagnose derzeit fragwürdig
28 ok Zyto: maligne epitheliale Neoplasie, wenig differenziert
29 ok 1. Histo:negativ, 2.Zyto: mittelgrad. differenziertes Adenokarzinom
Tabelle 1
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Tabelle 1 (Fortsetzung)

Claims

50Patentansprüche
1. DNA-Sequenz des KOC-Promotors, umfassend die in Figur 9 gezeigte Nucleinsauresequenz oder eine davon abweichende Nucleinsauresequenz, deren biologische Funktion im wesentlichen der des KOC-Promotors entspricht.
2. Arzneimittel, enthaltend die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder eine DNA-Sequenz, die für ein RNA-bindendes Protein KOC mit der in Figur 1 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.
3. Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei die DNA-Sequenz die in Figur 1 gezeigte Nucleinsauresequenz enthält.
4. Arzneimittel, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit den biologischen Eigenschaften eines von den DNA-Sequenzen nach Anspruch 2 oder 3 kodierten RNA-bindenden Proteins KOC kodiert:
(a) die sich von einer DNA-Sequenz von Anspruch 3 in der Codonse- quenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet;
(b) die mit einer DNA-Sequenz von Anspruch 3 oder 4(a) hybridisiert; oder
(c) die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante der DNA-Sequenz von Anspruch 3, 4(a) oder 4(b) ist.
5. Arzneimittel, enthaltend einen Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt.
6. Arzneimittel, enthaltend das RNA-bindende Protein KOC oder ein Protein 51
mit dessen biologischer Aktivität, das von der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4 kodiert wird.
7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 2 - 6, wobei das Protein und/oder die DNA-Sequenz in einer für die Immunisierung eines Individuums geeigneten Menge vorliegen.
8. Diagnoseverfahren zum Nachweis eines mit der Expression von KOC assoziierten Tumors, bei dem man eine Probe mit einer zur spezifischen Hybridisierung mit einer von der DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4 transkribierten mRNA geeigneten Sonde oder einem Primer oder einem KOC-Protein nach Anspruch 6 oder einem Antikörper gegen das in Anspruch 6 definierte KOC Protein oder einem Fragment davon in Berührung bringt und sodann direkt oder indirekt bestimmt, ob sich die Konzentration von KOC, KOC-mRNA, KOC-Protein und/oder anti-KOC-Antikörper in der Probe im Vergleich zu einer Kontrollprobe unterscheiden.
9. Diagnoseverfahren nach Anspruch 8 zur Differentialdiagnose zwischen chronischer Pankreatitis und Pankreaskarzinom.
10. Diagnoseverfahren nach Anspruch 8 zur Diagnose prämaligner Läsionen bei unklaren Raumforderungen.
11. Diagnoseverfahren nach Anspruch 8 zur Risikostratifizierung bei prämalignen Läsionen.
12. Diagnosverfahren nach Anspruch 8 zur Evaluierung von Therapieerfolgen. 52
13. Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 7 oder 8, der eine zur spezifischen Hybridisierung mit einer von der DNA- Sequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 4 transkribierten mRNA geeignete Sonde oder einen Primer oder ein KOC-Protein nach Anspruch 6 und/oder einen anti-KOC-Antikörper oder ein Fragment davon enthält.
14. Verwendung einer in einem der Ansprüche 2 bis 6 definierten Verbindung für das künstliche Herbeiführen der Pluripotenz von Körperzellen.
15. Verwendung einer in einem der Ansprüche 2 bis 6 definierten Verbindung für die Herstellung von Geweben oder Organen über die Differenzierung von Stammzellpopulationen.
16. Verwendung einer in einem der Ansprüche 2 bis 6 definierten Verbindung zur Hochdosis-Chemotherapie.
17. Verwendung einer in einem der Ansprüche 2 bis 6 definierten Verbindung für die Verbesserung der ex-vivo-Expansion hämotopoetischer Stammzellen.
18. Verwendung einer in einem der Ansprüche 2 bis 6 definierten Verbindung für die Verbesserung des Engraftments bei allogenen Knochenmarktransplantationen.
19. Verwendung einer in einem der Ansprüche 2 bis 6 definierten Verbindung für die Veriangsamung und/oder Umkehrung von durch physiologische oder physikalische Noxen induzierte Alterungsprozesse.
20. Verwendung einer in einem der Ansprüche 2 bis 6 definierten Verbindung zur Erzeugung eines prophylaktischen Effekts bei Chemo- oder 53
Strahlentherapie.
21. Verwendung nach Anspruch 20 zur Erzeugung eines prophylaktischen Effekts bei strahlenexponierter Haut.
22. Verwendung einer in einem der Ansprüche 2 bis 6 definierten Verbindung für die Regeneration von Hautdefekten, Hautkosmetik oder zur beschleunigten Wundheilung
23. Verwendung einer in einem der Ansprüche 2 bis 6 definierten Verbindung für die Immunisierung eines Individuums gegen maligne Tumoren und ihre Vorstufen.
24. Verwendung der DNA-Sequenz des KOC-Promotors oder einer davon abweichenden Nucleinsauresequenz nach Anspruch 1 zur Isolierung und/oder Anreicherung und/oder selektiven Vermehrung von Stammzellen.
25. Verwendung der DNA-Sequenz des KOC-Promotors oder einer davon abweichenden Sequenz nach Anspruch 1 zur Ermittlung des Differenzierungsgrads oder Dedifferenzierungsgrads einer Zelle oder eines Gewebes.
26. Verwendung der DNA-Sequenz des KOC-Promotors oder einer davon abweichenden Nucleinsauresequenz nach Anspruch 1 zur gentherapeutischen Krebsbehandlung.
27. Diagnostischer Kit zu einer Verwendung gemäß Anspruch 25, der eine zur spezifischen Hybridisierung mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 geeignete Sonde oder einen Primer enthält. 54
28. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an die DNA-Sequenz des KOC-Promotors gemäß Anspruch 1 binden und dessen Aktivität modulieren, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: a) Inkontaktbringen einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 mit einer Testverbindung in einem zellulären Assay; und b) Bestimmung der Modulierung der Aktivität des KOC-Promotors, wobei eine Modulierung anzeigt, daß die Testverbindung wirksam ist.
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