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WO1998002529A1 - Lignees d'encapsidation hautement productrices - Google Patents

Lignees d'encapsidation hautement productrices Download PDF

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WO1998002529A1
WO1998002529A1 PCT/FR1997/001250 FR9701250W WO9802529A1 WO 1998002529 A1 WO1998002529 A1 WO 1998002529A1 FR 9701250 W FR9701250 W FR 9701250W WO 9802529 A1 WO9802529 A1 WO 9802529A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
cells
packaging
cell
sequence
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/001250
Other languages
English (en)
Inventor
David Klatzmann
Jean-Loup Salzmann
Original Assignee
Universite Pierre Et Marie Curie (Paris Vi)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Pierre Et Marie Curie (Paris Vi) filed Critical Universite Pierre Et Marie Curie (Paris Vi)
Priority to JP10505665A priority Critical patent/JP2000514652A/ja
Priority to EP97932873A priority patent/EP0912723A1/fr
Priority to CA002262814A priority patent/CA2262814A1/fr
Publication of WO1998002529A1 publication Critical patent/WO1998002529A1/fr
Priority to US09/978,931 priority patent/US6872528B2/en

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the subject of the invention is new cell lines called packaging lines (packaging lines) producing high titer recombinant retroviruses and usable in humans in gene therapy.
  • the retroviral vectors used in these different situations are usually produced by lines called "packaging” or packaging or transcomplementation, these three terms having the same meaning; these lines are cells having been transduced with genetic constructs allowing the constitutive expression of the various proteins necessary for the manufacture of a retroviral particle containing the structural proteins and the enzymes necessary for their infectivity.
  • the object of the packaging line is to provide, by transcomplementation of the “helper” functions, in particular the genes coding for the gag, ⁇ pj and env proteins, which have been removed from the genomic vector carrying a transgene of which we are looking for. expression by use of a defective infectious virus.
  • Helper lacking the sequence ⁇ , are expressed in a stable manner in the transcomplementation cells after transfection of one or more plasmids containing them and whose RNA transcripts are not packaged in the viral particles following the deletion of the sequence aps packaging.
  • the viral gag proteins produced by the packaging cell can pack the retroviral vector carrying the transgene into viral particles which are then released into the environment, (for a review see Miller AD Gene Ther. 19901: 5-14).
  • different types of packaging lines have been produced and are widely used today. However, these lines are far from being optimized, in particular according to their use for a specific transgene or particular methods.
  • murine cells offers an additional degree of security in the event of contamination by an unknown transmissible infectious agent due to the restriction of species frequently observed in infectious pathology.
  • one of the defects of murine cells is due to the fact that the viruses produced by these cells, and the cells themselves, are most of the time quickly neutralized by the human complement.
  • a simple way to overcome this default is to produce packaging cells from human cells or another species but resistant to human complement.
  • Simian cells could be used like human cells for their property of making viral particles which would not be destroyed by the complement, but they have, in fact, the same defects as human cells concerning the possible presence of infectious agents.
  • They may be murine cells into which genes have been transferred, giving them greater resistance to complement and / or to human serum.
  • genes can in particular be CD46, CD55, the C-inhibitor (CilNH), the H protein, the soluble CR and in particular a multimeric form such as that described in patent FR 9508901.
  • the object of the present invention is to provide means for the preparation of new packaging lines at least partially remedying one or more of the problems described above and likely:
  • transduction of packaging cells is used by a single vector carrying the gene of interest and a so-called selection gene, or by two separate vectors.
  • selection gene a so-called selection gene
  • different types of modification can lead to the loss of expression of the therapeutic gene, even in the presence of this selection. This is particularly true when the transgene has a certain toxicity, thus conferring a selective advantage on the rare cells which have lost it.
  • the possible use of cells deficient in certain enzymes allowing their selection on this criterion would therefore be an additional advantage, especially when the gene of therapeutic interest complements the impairment.
  • the use as a selection gene instead of a gene for resistance to a toxic agent (an antibiotic in general), of a gene supplementing a genetic deficiency of the cell has numerous advantages including the one is the possibility of cultivating said cells in the absence of the toxic.
  • this gene is also the gene of interest, it is no longer possible to lose it during selection even when it confers a selective disadvantage.
  • This gene can also be a so-called “safety” or “suicide gene”, which means that the expression product of this gene in the presence of an exogenous substance leads to the specific destruction of the cell.
  • the subject of the invention is therefore eukaryotic packaging cells for the production of defective infectious viruses carrying a transgene, characterized in that they are deficient in a cellular function essential for their growth, in particular in the presence of a selection culture, said function being capable of being restored by the expression of an exogenous sequence introduced into the cell: either with a vector carrying the transcomplementing functions of packaging cells;
  • the invention also relates to packaging lines producing defective infectious viruses carrying a gene of therapeutic interest in which the gene of interest itself, carried by an appropriate vector, is used as a gene for selection of the line. packaging capable of producing defective recombinant viruses.
  • NIH-3T3 TK cells " a) murine NIH-3T3 cells which are currently widely used as packaging cells producing recombinant retroviruses used in clinical practice (Takahara et al. In Journal of Virology, (1992 June) 66 (6) 3725-32).
  • B) TK " lines have already been described, including NIH-3T3 TK ⁇ cells (F. Wagner et al., EMBO Journal (1985), Vol . 4 No. 3, pages 663-666); these cells can be killed when grown in selective culture media like HAT.
  • the thymidine kinase function for example those originating from the HSV1 -TK virus, they can then grow in a selective medium; such lines therefore offer the possibility of using the HSV1-TK gene as a selection gene.
  • the gene coding for the thymidine kinase of HSV1 or one of its functional derivatives is also widely used as a transgene as a prodrug transforming ganciclovir or acyclovir into a cytotoxic drug for the cell, thus finding its application in the selective destruction of cells, for example cancer cells (see for example WO 95/22617).
  • TK ⁇ cells can be derived by mutation from any cell capable of being used as a packaging cell, for example Vero cells.
  • a packaging cell deficient for thymidine kinase the selection of the packaging cell which has integrated the vector carrying the transgene is done on the therapeutic gene itself, thus making it possible to increase the productivity of the culture in defective recombinant viruses, the packaging cells which have not integrated the recombinant vector being ipso facto eliminated in selective medium.
  • the invention relates to packaging cells deficient in a cellular function essential to their growth and in which the transgene is capable of restoring the deficient cellular function.
  • the cell lines of the invention can advantageously be themselves resistant to complement and therefore preferably originate from human or simian cells and more particularly from Old World monkeys or modified human cells.
  • human or simian cells it is important to have cells whose origin is clear, namely non-carriers of infectious agents of unknown origin and capable of infecting humans.
  • the line 143 B TK " is a line of known human origin (Manservigi R.
  • Vero cells are also widely used in particular for the production of vaccines; they are cells simians which also produce viral particles resistant to neutralization by complement; the culture conditions of these lines are perfectly known and a line deficient in thymidine kinase can be obtained by conventional techniques and be advantageously used after transformation by the vectors allowing the construction of packaging, as packaging line having the characteristics of the lines of the invention.
  • the function of a retrovirus packaging cell line is to provide the transcomplementing functions which have been deleted from the recombinant vector carrying the transgene, these functions being essentially the genes coding for the proteins gag, ⁇ ol and env. These functions are expressed stably in the packaging cells from one or preferably two minus two distinct plasmids in order to greatly reduce the possibility of generating recombinant particles competent for replication.
  • Existing packaging lines have been produced from murine or avian retroviral proteins and are described in Miller AD, Hum Gene Ther, 1990 1: 5-14.
  • gag and JDOJ genes of murine retroviruses are usually synthesized by the same RNA which gives rise to gag precursors or gag / pol precursors by shifting the reading frame. These processes are well optimized in the Moloney type retro vira particle and the constructions intended to make the packaging cell of the invention will not affect the LTR gag / pol structure. with the exception of the deletion of ⁇ .
  • the choice of the gag / pol genes as well as the LTRs will be made according to the objective which is to have a high level of defective recombinant viral particles produced and therefore the strongest possible expression of these gag / pol genes is wanted.
  • the packaging cells are characterized in that they comprise:
  • a vector carrying an LTR itself characterized by good transcription efficiency for example the LTR of the Friend FB29 virus (see WO 96/17071); - a gag / pol region derived either from the Moloney virus, or from the Friend virus or from any other retrovirus as soon as the structure and expression of this function are optimized; c) a quantitative selection gene, that is to say such that when the selection pressure is increased, the number of transcripts synthesized is a priori increased.
  • the increase in the number of transcripts coding for the selection gene increases in the same way as the number of transcripts coding for gag and p_ol.
  • the selection gene is located either about a hundred base pairs from the gol stop codon, or under the control of a normal or mutated IRES sequence (for Internai Ribosome Entry
  • the mutation can consist in deleting the main ATG, the initiation then being on a less efficient ATG preexisting or generated by mutation.
  • the IRES sequences are sequences which have been used in retroviral constructs to control the translation of polycystronic RNA transcripts. IRES sequences can directly initiate translation into an initiation codon. Thus, the inclusion of such a sequence can make it possible to express several genes from the same promoter.
  • the other alternative which is to locate the selection gene at about a hundred bases of the stop codon of ⁇ ol also makes it possible to attenuate the translation of the selection gene compared to the translation of the oag / pol genes.
  • the selection gene can also be located on the vector carrying the env gene when the latter is distinct from that carrying gag / pol; finally, the two vectors for construction of the packaging cell can both carry a selection gene.
  • the selection genes can for example be genes of the BSR type, that is to say resistance to blasticidin S or a gene for resistance to zeomicine.
  • the blasticidin resistance gene is a selection gene for animal cells which has been described in particular by 1ZUMI M. et al in Experimental Cell Research (1991), 197: 229-233. This gene seems particularly effective since it has been used in particular as a selection marker to produce hybridomas producing human monoclonal antibodies with good yield (Journal of
  • FIG. 1 a An example of a vector particularly suitable for the construction of the packaging lines of the invention is shown in FIG. 1 a.
  • the second vector usable for the construction of the packaging cell carries genes coding for the envelopes of retroviruses. Most of the genes encoding the retrovirus envelopes could have some degree of toxicity to the cell; however, it is necessary to have sufficient quantities of envelope proteins which are synthesized so that the defective recombinant retroviral particles are indeed infectious.
  • the env sequences coding for the peptides derived from an envelope can be for example the envelope 4070a of the Moloney murine leukemia virus (MoMuLV).
  • MoMuLV Moloney murine leukemia virus
  • any type of gene coding for an envelope protein capable of being integrated into the cell membrane at the time of budding of the retrovirus is usable; the choice of the env protein can be guided by the nature of the receptor of the target cell which it is desired to transfect with the defective recombinant retroviral virus.
  • the env gene carried by the packaging cell construction plasmid is dependent on viral or non-viral transcription regulatory sequences.
  • strong promoters such as the cytomegalovirus (CMV) promoter in the context of genetic constructions such as preselection forces the cell to synthesize large quantities of envelopes.
  • CMV cytomegalovirus
  • strong promoter any nucleic acid sequence comprising the binding site of RNA polymerase as well as the binding sites of regulatory proteins and allowing a high rate of transcription of the sequence located under the control of said promoter.
  • inducible promoter can also be inducible promoters which would allow the absence or weak expression of envelopes which could then be transiently induced during the collection of the viral particles.
  • inducible promoter is meant a promoter sequence which can be activated at will by a given molecule; this type of promoter is used whenever it is desired to trigger on demand the expression of a given gene.
  • inducible promoters capable of being used in the construction of the packaging cells of the invention are the promoters inducible by tetracycline described by Bujard et al. in Mol. and Gen.
  • conditional inducible promoters such as the RAR- ⁇ promoter (Japanese Journal of Genetics, (1993 June) 68 (3) 175-84); the "conditional promoters” consist of a promoter sequence activated by one or more trans-regulatory factors specifically produced by a given tissue, but not necessarily identified, such as for example the promoter of insulin sensitive to strictly pancreatic factors.
  • These constructions can be applied to all conventional env genes of the 4070A type of the Moloney murine leukemia virus (MoMuLV) or to envelopes which could be used according to their particular properties, in particular resistance to the RD1 14 type complement.
  • MoMuLV Moloney murine leukemia virus
  • Envelopes of the HTLV1 type or derivatives of lenti virus such as foamy virus can also be used.
  • Envelope genes having a particular tropism for target cells capable of being transfected with defective recombinant viruses produced by packaging cells can be advantageously used, for example spumavirus envelope sequences having a particular tropism for human hematopoietic cells.
  • the vector carrying the env gene comprises at 3 ′ a polyadenylation sequence such as that derived from the SV40 virus.
  • An example of a vector carrying the env gene is shown in FIG. 1 b, in which ZeoR is the zeomycin resistance gene.
  • the two vectors which make up the packaging cell are obviously devoid of packaging sequences.
  • the recombinant packaging cells as described above with their various embodiments are capable of being transfected with a recombinant retroviral vector for the expression and / or integration within the genome of a target cell of a sequence of nucleotides chosen (transgene) for therapeutic interest.
  • This transgene can either be a sequence coding for a deficient function in the target cell and in which it is desired to restore said function, or to introduce a complementary and / or regulatory function in the target cell, or also and without being limiting, a sequence allowing to activate prodrugs as in the case of the thymidine kinase gene of the HSV1 virus transforming ganciclovir or acyclovir into a toxic and cell-destroying drug, or the cytosine desaminase gene transforming a fluorouracil precursor into an active drug; finally, it can be a transgene making it possible to induce or stimulate the immune system, either by manipulation of the tumor cells, or by manipulation of the cells of the immune system itself. even or on the contrary a transgene making it possible to specifically inhibit an immune response in the case for example of graft rejection or in the case of autoimmune diseases.
  • the general structure of a retroviral vector carrying the transgene requires the presence of two LTRs framing the gene or genes of interest or transgenes and carries the region allowing the encapsidation of the transcript in the pseudo-retroviral particle whose structural proteins are encoded. by the packaging cell of the invention.
  • LTRs used those derived from the Moloney strains will be preferred, such as those derived from the Mov strains.
  • the invention also relates to recombinant retroviral vectors carrying a heterologous gene whose expression is sought in a target cell, characterized in that they comprise:
  • nucleotide sequence Y whose expression complements the deficient function in the packaging cell
  • a safety gene Z whose expression in the presence of an exogenous substance leads to the destruction of the transfected or infected cell.
  • the transgene of therapeutic interest is a suicide gene, for example that coding for HSV1-TK or one of its functional derivatives
  • the sequences X and Y or Y and Z form only one and the same gene, and the use of such a vector makes it possible to select said packaging cells which have been transfected with said vector.
  • a good viral titer depends on the number of packaging transcripts produced by the packaging cell.
  • the invention also relates to the process for obtaining recombinant infectious viruses with high defect in cells as described above and comprising: a) infection or transfection of said cells with a recombinant vector carrying at least a gene of therapeutic interest X;
  • nucleotide sequence Y the expression of which complements the deficient function of the packaging cell if this deficiency remains after construction of said packaging cell by the vectors carrying the gai, pol and env genes;
  • the vector carrying the transgene will be a bicistronic vector allowing selection in the presence of a thymidine kinase gene from HSV1 or a functional derivative thereof.
  • a surprising property of the HSV1 -TK gene is that a high level of expression can cause toxicity to the cell, preventing a high number of transcripts from being obtained.
  • the vector of the invention capable of infecting or transfecting the packaging cells described above, will therefore be constructed in such a way that the production of the encapsidable transgene transcripts is high in comparison with the production of HSV1 -TK proteins.
  • a TK " packaging cell transfected with a bicistronic vector carrying, on the one hand, a transgene and, on the other hand, HSV1-TK or one of its derivatives can both be selected in the selective HAT medium and be a producer of high titer viral particles, while avoiding a counter-selection due to the toxic activity of HSV1-TK when the gene is actively translated. This therefore allows the production of packaging cells having high titer and which produce defective retroviruses encoding either for HSV1-TK alone or for a gene of interest and HSV1-TK.
  • transcripts of transgene X on the one hand, and of Y , on the other hand, is produced by the construction of recombinant vectors in which the nucleotide sequence Y, the expression of which complements the deficient function of the packaging cell, for example HSV1-TK, is located approximately one hundred pairs of codon bases stop of the transgene, either under the control of a normal or mutated IRES type sequence as described above in such a way that the initiation of the translation of the Y sequence is less effective than that of the X sequence.
  • the transgene is itself the gene allowing the selection of the packaging cells, that is to say in the case where X and Y are one and the same gene (for example HSV1 -TK), the gene of interest itself is used as the selection gene.
  • the gene Y can then also ensure a function of safety gene Z because it makes it possible if necessary to destroy the cells transfected with the therapeutic gene by treatment of the patient with a substance transforming the prodrug into a toxic drug.
  • FIG. 2 an exemplary embodiment of the recombinant vector of the invention is shown in FIG. 2.
  • the two vectors shown show the difference between the two embodiments allowing less expression of the HSV1-TK gene (Y and Z sequences combined), either by a certain distance from the stop codon of the X gene, or by the introduction of an IRES sequence.
  • the sequence represented by gag * means that the packaging sequence can comprise not only the genetic region necessary for packaging but also the part of the mutated gag gene which does not allow the reconstitution of the gag protein but which can increase the efficiency packaging.
  • HSV1-TK The properties of HSV1-TK are consistent with this design. In fact, very small quantities of TK are sufficient to be able to select, in the presence of a HAT selective medium, cell clones derived from TK negative cells; similarly, a very low expression of TK is sufficient to obtain good sensitivity to ganciclovir.
  • the three genes X, Y and Z can only represent one gene, for example, it is the HSV1 gene -
  • TK which plays the role of both a transgene, a selection gene and a safety gene.
  • a construct like this has the advantage of being able to add a second therapeutic gene to the vector, for example a gene which codes for cytokines when it is desired to eliminate cancer cells.
  • the TK gene when the TK gene is the therapeutic gene itself, can be characterized in that the Y gene can be a gene coding for another selection marker, for example the BSR gene mentioned more pump or another gene of therapeutic interest such as for example a cytokine gene.
  • the Y gene can be a gene coding for another selection marker, for example the BSR gene mentioned more pump or another gene of therapeutic interest such as for example a cytokine gene.
  • the latter can be placed under the control of a weak internal promoter which can itself be attenuated by a “read through” by the LTR of the retroviral vector.
  • the LTR 3 'of the vector may also contain a deletion of the amplifier so that this "read through” does not prevent expression after infection of the target cell by the recombinant viral particles.
  • the process for obtaining high defective recombinant viruses can relate to any transgene the absence of which induces a negative selection pressure for the packaging cell; a cell thus deleted from the gene coding for this transgene would then be “saved” by the retroviral vector which would simultaneously play the role of selection vector.
  • This would thus apply to any cell gene whose overexpression induces a negative selection pressure for the cell since only the packaging cells carrying and producing recombinant retroviruses will be selected positively even in the case where the expression of the gene of interest would tend to counter-select these cells.
  • the invention relates to the use of the packaging cells and the vectors described above in the preparation of a gene therapy medicament possessing the qualities of safety and efficacy required for this type of medicament, namely resistant to the complement and having the possibility of being destroyed in situ as necessary.
  • the invention relates to the use of packaging cells according to the invention and recombinant vectors carrying a gene of interest as described above for the transformation of target cells of the immune system such as hematopoietic stem cells, lymphocyte cells or cancer cells.
  • the invention also relates to the use of packaging cells as described above in a method of coculture of target cells of a defective infectious retrovirus carrying a gene of interest in gene therapy and produced by d cells.
  • packaging the latter must imperatively be destroyed before using said target cells thus transformed into medicaments. It is known, in fact, that certain indications require this in vitro coculture of the target cell and of the packaging cell, for example when the cell target is a cell of the lymphocyte system or hematopoietic stem cells.
  • the packaging cell must be eliminated before reintroducing the target cell thus transformed.
  • the packaging cell carries the HSV1-TK gene as a selection gene for example
  • the use of a culture medium containing HAT in the presence of ganciclovir and acyclovir can make it possible to selectively destroy the cells carrying the gene HSV1-TK and therefore the packaging cell for the benefit of the only target cells transfected by the retroviral virus produced by said packaging cells.
  • Another embodiment in the case of coculture can be carried out with packaging cells directly lacking the HSV1-TK gene and the selection of the cell mixture in the presence of the selective medium HAT while maintaining an adequate cell concentration also makes the cells disappear. packaging without altering target cells.

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Abstract

L'invention concerne une cellule eucaryote d'empaquetage pour la production de virus infectieux défectifs porteurs d'un transgène, caractérisée en ce qu'elle est déficient en une fonction cellulaire essentielle à sa croissance, notamment en présence d'un milieu de culture de sélection, ladite fonction étant susceptible d'être restaurée par l'expression d'une séquence exogène introduite dans la cellule: soit avec un vecteur porteur de fonctions transcomplémentantes des cellules d'empaquetage; soit avec un vecteur porteur du transgène, et permettant la sélection en milieu sélectif des cellules porteuses de ladite séquence exogène.

Description

LIGNEES D'ENCAPSIDATION HAUTEMENT PRODUCTRICES
L'invention a pour objet de nouvelles lignées cellulaires dites lignées d'encapsidation (lignées de packaging) productrices de rétrovirus recombinants à haut titre et utilisables chez l'homme en thérapie génique.
Le transfert de gènes par rétrovirus recombinants est actuellement largement utilisé aussi bien pour des travaux expérimentaux que dans le cadre d'essais thérapeutiques.
Les vecteurs rétroviraux utilisés dans ces différentes situations sont habituellement produits par des lignées dites « de packaging » ou d'empaquetage ou de transcomplémentation, ces trois termes ayant la même signification ; ces lignées sont des cellules ayant été transduites avec des constructions génétiques permettant l'expression constitutive des différentes protéines nécessaires à la fabrication d'une particule rétrovirale contenant les protéines de structures et les enzymes nécessaires à leur infectiosité. L'objet de lignée d'encapsidation est de fournir par transcomplémentation des fonctions « helper », en particulier les gènes codant pour les protéines gag, βpj et env, qui ont été enlevées du vecteur génomique porteur d'un transgène dont on recherche l'expression par utilisation d'un virus infectieux défectif. Ces fonctions
« helper », dépourvues de la séquence ψ, sont exprimées de façon stable dans les cellules de transcomplémentation après transfection d'un ou plusieurs plasmides les contenant et dont les transcrits RNA ne sont pas encapsidés dans les particules virales suite à la délétion de la séquence d'encapsidation Ψ. Quand ces cellules d'encapsidation sont ensuite transfectées par des vecteurs porteurs du transgène, les protéines virales gag produites par la cellule de packaging peuvent encapsider le vecteur rétroviral porteur du transgène dans des particules virales qui sont ensuite relarguées dans l'environnement, (pour une revue voir Miller AD Gène Ther. 19901 : 5-14). Sur ce principe général, différents types de lignées de packaging ont été réalisés et sont largement utilisés aujourd'hui. Cependant, ces lignées sont loin d'être optimisées, notamment en fonction de leur utilisation pour un transgène spécifique ou des modalités particulières. En particulier, il n'existe aucun moyen de faire disparaître les cellules transduites administrées aux patients si le transgène ou son produit d'expression induit des effets indésirables (par une expression inadéquate ou une insertion inappropriée). Un autre aspect pour lequel il est important de disposer de cellules d'empaquetage susceptibles d'être détruites en cas de besoin sont des problèmes strictement de sécurité, sachant que des recombinaisons pourraient conduire à la formation de virus infectieux à partir des lignées d'empaquetage.
Le choix des cellules de départ dans lesquelles peuvent être réalisées des lignées de packaging est extrêmement important au regard des propriétés attendues et de leur utilisation clinique potentielle. A ce jour, la plupart des lignées cellulaires utilisées en clinique sont toutes dérivées de fibroblastes d'origine murine, les cellules NIH-3T3. L'intérêt de ces cellules est qu'elles sont parfaitement caractérisées, qu'elles ne sont pas transformées (elles ne donnent pas de tumeur lorsqu'elles sont réinjectées in vivo), qu'elles proviennent d'animaux élevés depuis de nombreuses générations et dont on sait qu'ils ne présentent pas de pathologies particulières (de type neurodégénératif par exemple) qui permettraient de suspecter la présence d'un agent infectieux transmissible chez ces animaux, et donc potentiellement dans les cellules utilisées. De plus, l'utilisation de cellules murines offre un degré de sécurité supplémentaire en cas de contamination par un agent infectieux transmissible inconnu du fait de la restriction d'espèces fréquemment observée en pathologie infectieuse. Cependant, l'un des défauts dont souffrent les cellules murines est dû au fait que les virus produits par ces cellules, et les cellules elles-mêmes sont la plupart du temps rapidement neutralisées par le complément humain. Un moyen simple de palier ce défaut est de produire des cellules de packaging à partir de cellules humaines ou d'une autre espèce mais résistante au complément humain.
Cependant, dans le cas des cellules humaines, elles sont souvent transformées et ont donc un potentiel tumoral. De plus, on ne connaît évidemment pas de façon détaillée l'origine des cellules et leur contamination possible par des agents infectieux d'origine inconnue et capables d'infecter l'homme.
Les cellules simiennes pourraient être utilisées comme les cellules humaines pour leur propriété de faire des particules virales qui ne seraient pas détruites par le complément, mais elles ont, de fait, les mêmes défauts que les cellules humaines concernant la possible présence d'agents infectieux.
Ce peut être des cellules murines dans lesquelles ont été transférés des gènes leur conférant une plus grande résistance au complément et/ou au sérum humain.
Ces gènes peuvent être notamment le CD46, le CD55, le C- inhibiteur (CilNH), la protéine H, le CR- soluble et notamment une forme multimérique telle que celle décrite dans le brevet FR 9508901.
L'objet de la présente invention est de fournir des moyens pour la préparation de nouvelles lignées d'encapsidation remédiant au moins en partie à un ou plusieurs des problèmes précédemment décrits et susceptibles :
- de produire des rétrovirus recombinants à des titres élevés ;
- d'être bien tolérées ; - d'être résistantes au complément, tout en restant acceptables quant à leur sécurité ;
- d'être faciles à produire dans des conditions de bonne pratique de fabrication et ayant une stabilité dans leur expression au moins égale à 3 mois ; - de disposer d'un gène de sélection permettant une sélection positive de celles des cellules de sang qui ont incorporé le vecteur porteur du transgène ;
- de disposer d'un système de sécurité permettant de détruire les cellules en tant que de besoin.
Pour aboutir à ces différents prérequis, il est nécessaire d'optimiser, d'une part, le choix des lignées cellulaires de départ, ainsi que le choix de chacun des constituants nécessaires à l'obtention de la particule rétrovirale recombinante infectieuse défective, en particulier, le choix des vecteurs permettant de rendre la cellule de packaging productrice des protéines gag, pol et en du rétrovirus.
En ce qui concerne la production de ces cellules dans des cultures en masse réalisées en condition de bonne pratique de fabrication (GMP) pour la production de cellules ou de virus à usage clinique, il est nécessaire d'avoir des cellules dont les caractéristiques de croissance soient parfaitement connues, avec des temps de division brefs, poussant à haute densité, le cas échéant, en suspension.
Enfin, il est nécessaire de pouvoir sélectionner à partir des cellules utilisées des transfectants stables exprimant les différents transgènes d'intérêt. Actuellement, on utilise la transduction des cellules de packaging par un vecteur unique portant le gène d'intérêt et un gène dit de sélection, ou par deux vecteurs séparés. Lors de la culture ultérieure des cellules transduites, il est en général nécessaire de maintenir la sélection pour ne pas perdre le transgène d'intérêt. Cependant, il est connu que différents types de modification peuvent aboutir à la perte d'expression du gène thérapeutique, même en présence de cette sélection. Ceci est particulièrement vrai lorsque le transgène à une certaine toxicité conférant alors un avantage sélectif aux rares cellules l'ayant perdu. L'utilisation possible de cellules déficientes en certains enzymes permettant leur sélection sur ce critère serait donc un avantage supplémentaire, surtout lorsque le gène d'intérêt thérapeutique complémente la déficience. En d'autres termes, l'utilisation comme gène de sélection, au lieu d'un gène de résistance à un toxique (un antibiotique en général), d'un gène supplémentant une déficience génétique de la cellule présente de nombreux avantages dont l'un est la possibilité de cultiver iesdites cellules en l'absence du toxique. De plus, si ce gène est aussi le gène d'intérêt, il n'est plus possible de le perdre au cours de la sélection même lorsqu'il confère un désavantage sélectif. Ce gène peut aussi être un gène dit « de sécurité » ou « gène suicide » ce qui signifie que le produit d'expression de ce gène en présence d'une substance exogène conduit à la destruction spécifique de la cellule.
L'invention a donc pour objet des cellules eucaryotes d'empaquetage pour la production de virus infectieux défectifs porteurs d'un transgène caractérisée en ce qu'elles sont déficientes en une fonction cellulaire essentielle à leur croissance, notamment en présence d'un milieu de culture de sélection, ladite fonction étant susceptible d'être restaurée par l'expression d'une séquence exogène introduite dans la cellule : soit avec un vecteur porteur des fonctions transcomplémentantes des cellules d'empaquetage ;
- soit avec un vecteur porteur du transgène ; - l'expression de la séquence exogène ainsi introduite dans la cellule permettant la sélection en milieu sélectif des cellules porteuses de ladite séquence.
La cellule eucaryote d'empaquetage selon l'invention est caractérisée par le fait qu'elle vérifie l'un ou plusieurs des propriétés suivantes :
- elle est susceptible de produire des particules virales à un taux supérieur à 105 particules par ml ;
- elle est résistante au complément ou elle produit des particules virales résistantes au complément ; - elle a un temps de division inférieur à 30 heures ; - elle est stable au moins 3 mois dans un milieu de culture non sélectif ;
- elle est dépourvue de rétrovirus endogènes.
L'invention porte également sur des lignées d'empaquetage productrices de virus infectieux défectifs, porteurs d'un gène d'intérêt thérapeutique dans lequel le gène d'intérêt lui-même porté par un vecteur approprié est utilisé comme gène de sélection de la lignée d'empaquetage susceptible de produire les virus recombinants défectifs.
Sur cette base, plusieurs types de cellules peuvent être utilisés : des cellules NIH-3T3 TK", a) les cellules murines NIH-3T3 qui sont actuellement largement utilisées comme cellules de packaging productrices de rétrovirus recombinants utilisés en clinique (Takahara et al. dans Journal of Virology, (1992 juin) 66 (6) 3725-32). b) des lignées TK" ont déjà été décrites dont des cellules NIH-3T3 TK~ (F. Wagner et al., EMBO Journal (1985), Vol. 4 n° 3, pages 663-666) ; ces cellules peuvent être tuées lorsqu'elles sont cultivées dans des milieux de culture sélectifs comme le HAT. Alors que si elles sont complémentées pour la fonction thymidine kinase, par exemple celles provenant du virus HSV1 -TK, elles peuvent alors pousser en milieu sélectif ; de telles lignées offrent donc la possibilité d'utiliser le gène HSV1-TK comme gène de sélection. Le gène codant pour la thymidine kinase de HSV1 ou un de ses dérivés fonctionnels est aussi largement utilisé comme transgène à titre de prodrogue transformant le ganciclovir ou l'acyclovir en drogue cytotoxique pour la cellule, trouvant ainsi son application dans la destruction sélective de cellules, par exemple de cellules cancéreuses (voir par exemple WO 95/22617).
De manière plus générale, des cellules TK~ peuvent être dérivées par mutation de toute cellule susceptible d'être utilisée comme cellule d'empaquetage, par exemple les cellules Vero. Ainsi, lorsque le gène thérapeutique porté par un vecteur d'expression est introduit dans une cellule de packaging déficiente pour la thymidine kinase, la sélection de la cellule de packaging ayant intégré le vecteur porteur du transgène se fait sur le gène thérapeutique lui-même, permettant ainsi d'augmenter la productivité de la culture en virus recombinants défectifs, les cellules de packaging n'ayant pas intégré le vecteur recombinant étant ipso facto éliminées en milieu sélectif.
De manière plus générale, l'invention porte sur des cellules d'empaquetage déficientes en une fonction cellulaire essentielle à leur croissance et dans laquelle le transgène est susceptible de restaurer la fonction cellulaire déficiente.
II est important que les vecteurs défectifs infectieux recombinants porteurs d'un transgène soient résistants au complément ainsi qu'aux autres facteurs potentiellement destructeurs de virus ou de cellules dans le sang ou dans les fluides intersticiels ; pour ce faire, les lignées cellulaires de l'invention peuvent avantageusement être elles- mêmes résistantes au complément et donc préférentiellement être issues de cellules humaines ou simiennes et plus particulièrement de singes de l'Ancien Monde ou cellules humaines modifiées. Dans le cas de cellules humaines ou simiennes, il est important de disposer de cellules dont l'origine est claire, à savoir non porteuses d'agents infectieux d'origine inconnue et capables d'infecter l'homme. La lignée 143 B TK" est une lignée d'origine humaine connue (Manservigi R. et al dans Virology, (1988 Novembre) 167 (1 ) 284-8) ; elle a un temps de division bref c'est-à-dire d'environ dix-huit heures et elle produit des particules virales résistantes au complément. Elle peut donc avantageusement être utilisée comme cellule de packaging de l'invention. Les cellules Vero sont également largement utilisées notamment pour la production de vaccins ; ce sont des cellules simiennes qui produisent également des particules virales résistantes à la neutralisation par le complément ; les conditions de culture de ces lignées sont parfaitement connues et une lignée déficiente en thymidine kinase pourra être obtenue par les techniques classiques et être avantageusement utilisée après transformation par les vecteurs permettant la construction de packaging, comme lignée d'empaquetage ayant les caractéristiques des lignées de l'invention.
La fonction d'une lignée cellulaire d'empaquetage de rétrovirus est de fournir les fonctions transcomplémentantes qui ont été délétées du vecteur recombinant porteur du transgène, ces fonctions étant essentiellement les gènes codant pour les protéines gag, βol et env. Ces fonctions sont exprimées de façon stable dans les cellules de packaging à partir d'un ou de préférence deux moins deux plasmides distincts afin de réduire très fortement la possibilité de générer des particules recombinantes compétentes pour la réplication. Des lignées de packaging existantes ont été réalisées à partir de protéines rétrovirales murines ou aviaires et sont décrites dans Miller AD, Hum Gène Ther, 1990 1: 5-14.
Les gènes gag et JDOJ des rétrovirus murins sont synthétisés habituellement par le même ARN qui donne naissance à des précurseurs gag ou des précurseurs gag/pol par décalage du cadre de lecture. Ces processus sont bien optimisés dans la particule rétro vira le de type Moloney et les constructions destinées à faire la cellule d'empaquetage de l'invention ne toucheront pas à la structure LTR gag/pol. à l'exception de la délétion de Ψ. Le choix des gènes gag/pol ainsi que des LTR sera fait en fonction de l'objectif qui est d'avoir un taux élevé de particules virales recombinantes défectives produites élevé et par conséquent l'expression la plus forte possible de ces gènes gag/pol est recherchée.
Selon un mode de réalisation de l'invention, les cellules d'encapsidation sont caractérisées en ce qu'elles comprennent :
- un vecteur porteur d'un LTR lui-même caractérisé par une bonne efficacité de transcription par exemple le LTR du virus de Friend FB29 (voir WO 96/17071 ) ; - une région gag/pol issue, soit du virus de Moloney, soit du virus de Friend ou de tout autre rétrovirus à partir du moment où la structure et l'expression de cette fonction sont optimisées ; c) un gène de sélection quantitative c'est-à-dire tel que lorsque l'on augmente la pression de sélection, on augmente a priori le nombre de transcrits synthétisés.
Si le gène de sélection de type quantitatif est situé sur le même plasmide que le plasmide codant pour gag et QQ\, l'augmentation du nombre de transcrits codant pour le gène de sélection augmente de la même manière que le nombre de transcrits codant pour gag et p_ol.
L'optimisation sera encore améliorée si l'on fait en sorte que la traduction du gène de sélection soit plus faible que celle de gag/pol.
Pour ce faire, le gène de sélection est situé soit à environ une centaine de paires de bases du codon stop de gol, soit sous le contrôle d'une séquence IRES normale ou mutée (pour Internai Ribosome Entry
Sites) de telle façon que l'initiation de la traduction soit moins efficace que celle des gènes gag et βol. La mutation peut consister à supprimer l'ATG principal, l'initiation se faisant alors sur un ATG moins performant préexistant ou généré par mutation. Les séquences IRES sont des séquences qui ont été utilisées dans des constructions rétrovirales pour maîtriser la traduction des transcrits d'ARN polycystroniques. Les séquences IRES peuvent initier directement une traduction dans un codon d'initiation. Ainsi, l'inclusion d'une telle séquence peut permettre d'exprimer plusieurs gènes à partir du même promoteur.
L'autre alternative qui est de situer le gène de sélection à environ une centaine de bases du codon stop de βol permet également d'atténuer la traduction du gène de sélection par rapport à la traduction des gènes oag/pol. Le gène de sélection peut également être situé sur le vecteur porteur du gène env quand celui-ci est distinct de celui portant gag/pol ; enfin les deux vecteurs de construction de la cellule de packaging peuvent l'un et l'autre porter un gène de sélection.
Les gènes de sélection peuvent par exemple être des gènes de type BSR c'est-à-dire de résistance à la blasticidine S ou un gène de résistance à la zéomicine. Le gène de résistance à la blasticidine est un gène de sélection pour les cellules animales qui a été décrit notamment par 1ZUMI M. et al dans Expérimental Cell Research (1991 ), 197 : 229-233. Ce gène semble particulièrement efficace puisqu'il a été notamment utilisé comme marqueur de sélection pour produire des hybridomes producteurs d'anticorps monoclonaux humains avec un bon rendement (Journal of
Immunological methods, 1994, 177 : 17-22).
Un exemple de vecteur particulièrement approprié à la construction des lignées de packaging de l'invention est représenté dans la figure 1 a. Le deuxième vecteur utilisable pour la construction de la cellule d'empaquetage est porteur de gènes codants pour les enveloppes de rétrovirus. La plupart des gènes codant pour les enveloppes de rétrovirus pourraient avoir un certain degré de toxicité pour la cellule ; or, il est nécessaire d'avoir des quantités suffisante de protéines d'enveloppe qui soient synthétisées pour que les particules rétrovirales recombinantes défectives soient bien infectieuses.
Les séquences env codant pour les peptides dérivés d'une enveloppe, par exemple enphotrope peuvent être par exemple l'enveloppe 4070a du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMuLV). Mais, tout type de gène codant pour une protéine d'enveloppe susceptible d'être intégrée dans la membrane cellulaire au moment du bourgeonnement du rétrovirus est utilisable ; le choix de la protéine env peut être guidé par la nature du récepteur de la cellule cible que l'on souhaite transfecter par le virus rétroviral recombinant défectif. Le gène env porté par le plasmide de construction de la cellule d'empaquetage est sous la dépendance de séquences régulatrices de transcription virales ou non virales. II peut s'agir de promoteurs forts comme le promoteur du cytomegalovirus (CMV) dans le cadre de constructions génétiques telles que la présélection oblige la cellule à synthétiser des quantités importantes d'enveloppes. Par « promoteur fort », on entend toute séquence d'acide nucléique comportant le site de fixation de l'ARN polymèrase ainsi que les sites de fixation des protéines régulatrices et permettant un taux élevé de transcription de la séquence située sous le contrôle dudit promoteur.
II peut s'agir également de promoteurs inductibles qui permettraient une absence ou une expression faible d'enveloppes qui pourraient être ensuite induites de façon transitoire lors du recueil des particules virales. Par « promoteur inductible », on entend une séquence promotrice activable à volonté par une molécule donnée ; ce type de promoteur est utilisé chaque fois que l'on désire déclencher à la demande l'expression d'un gène donné. Des exemples de promoteurs inductibles susceptibles d'être utilisés dans la construction des cellules d'empaquetage de l'invention sont les promoteurs inductibles par la tétracycline décrit par Bujard et al. dans Mol. and Gen. Genetics, (1977 Dec 9) 157 (3):301-1 1 , ou les promoteurs inductibles conditionnels tel le promoteur RAR-β (Japanese Journal of Genetics, (1993 juin) 68 (3) 175-84) ; les « promoteurs conditionnels » sont constitués d'une séquence promotrice activée par un ou des facteurs trans-régulateurs spécifiquement produits par un tissu donné, mais non nécessairement identifiés, comme par exemple le promoteur de l'insuline sensible à des facteurs strictement pancréatiques. Ces constructions peuvent s'appliquer à tous les gènes env classiques de type 4070A du virus de la leucémie murine de Moloney (MoMuLV) ou à des enveloppes qui pourraient être utilisées en fonction de leurs propriétés particulières notamment la résistance au complément de type RD1 14. Des enveloppes de type HTLV1 ou dérivés de lenti virus tels que foamy virus peuvent également être utilisées. Des gènes d'enveloppe ayant un tropisme particulier pour des cellules cibles susceptibles d'être transfectées par des virus recombinants défectifs produits par les cellules d'empaquetage peuvent être avantageusement utilisés, par exemple des séquences d'enveloppe de spumavirus ayant un tropisme particulier pour les cellules hématopoïétiques humaines.
Enfin, dans le cadre d'un système inductible tel que décrit plus haut, il serait alors possible d'utiliser des enveloppes de type VSV-G. Le vecteur porteur du gène env comporte en 3' une séquence de polyadénylation telle celle issue du virus SV40. Un exemple de vecteur porteur du gène env est montré dans la figure 1 b, dans laquelle ZeoR est le gène de résistance à la zéomycine.
Les deux vecteurs permettant de constituer la cellule de packaging sont bien évidemment dépourvus de séquences d'encapsidation.
Les cellules d'empaquetage recombinantes telles que décrites ci-dessus avec leurs différents modes de réalisation sont susceptibles d'être transfectées par un vecteur rétroviral recombinant pour l'expression et/ou l'intégration au sein du génome d'une cellule cible d'une séquence de nucléotides choisis (transgène) pour un intérêt thérapeutique.
Ce transgène peut être, soit une séquence codant pour une fonction déficiente dans la cellule cible et dans laquelle on souhaite restaurer ladite fonction, ou pour introduire une fonction complémentaire et/ou régulatrice dans la cellule cible, ou encore et sans être limitatif une séquence permettant d'activer des prodrogues comme dans le cas du gène de la thymidine kinase du virus de HSV1 transformant le ganciclovir ou l'acyclovir en drogue toxique et destructrice des cellules, ou le gène de la cytosine desaminase transformant un précurseur 5 fluorouracile en drogue active ; cela peut être enfin un transgène permettant d'induire ou de stimuler le système immunitaire, soit par manipulation des cellules tumorales, soit par manipulation des cellules du système immunitaire lui- même ou au contraire un transgène permettant de spécifiquement inhiber une réponse immunitaire dans le cas par exemple du rejet de greffe ou dans le cas de maladies auto-immuπes.
La structure générale d'un vecteur rétroviral porteur du transgène nécessite la présence de deux LTR encadrant le ou les gènes d'intérêt ou transgènes et porte la région permettant l'encapsidation du transcrit dans la particule pseudo-rétrovirale dont les protéines de structure sont codées par la cellule d'empaquetage de l'invention.
En ce qui concerne les LTR utilisés, seront préférés, soit ceux dérivés des souches de Moloney, tels que ceux dérivés des souches Mov
(réf. Jaenish) pour leur plus grande capacité à s'exprimer dans des cellules peu ou non différenciées que sont entre autres les cellules tumorales et, décrits dans la demande de brevet EP n° 0674716 où les LTR dérivés des virus de Friend pour leur haut taux d'expression comme cela a été décrit ci-dessus.
L'invention porte également sur des vecteurs rétroviraux recombinants porteurs d'un gène hétérologue dont l'expression est recherchée dans une cellule cible, caractérisée en ce qu'ils comportent :
- un gène d'intérêt thérapeutique X, sous le contrôle d'un promoteur,
- une séquence nucléotidique Y dont l'expression complémente la fonction déficiente dans la cellule d'empaquetage,
- une séquence d'encapsidation Ψ,
- le cas échéant un gène de sécurité Z dont l'expression en présence d'une substance exogène conduit à la destruction de la cellule transfectée ou infectée.
Quand le transgène d'intérêt thérapeutique est un gène suicide par exemple celui codant pour HSV1-TK ou l'un de ses dérivés fonctionnels, les séquences X et Y ou Y et Z ne forment qu'un seul et même gène, et l'utilisation d'un tel vecteur permet de sélectionner lesdites cellules d'empaquetage qui ont été transfectées par ledit vecteur. Un bon titre viral dépend du nombre de transcrits encapsidables produits par la cellule d'empaquetage.
L'invention porte également sur le procédé d'obtention de virus recombinants infectieux défectifs à haut titre dans les cellules telles que décrites ci-dessus et comprenant : a) l'infection ou la transfection desdites cellules par un vecteur recombinant porteur au moins d'un gène d'intérêt thérapeutique X ;
- une séquence nucléotidique Y dont l'expression complémente la fonction déficiente de la cellule d'empaquetage si cette déficiente subsiste après construction de ladite cellule d'empaquetage par les vecteurs porteurs des gènes gai, pol et env ;
- une séquence d'encapsidation ψ ;
- et le cas échéant un gène de sécurité Z dont l'expression en présence d'une substance exogène conduit à la destruction de la cellule transfectée ou infectée ; b) la sélection desdites cellules dans un milieu de culture de sélection dans le cas où la cellule d'empaquetage est déficiente pour une fonction donnée et que le vecteur porteur du transgène supplée cette déficience. Quand les lignées d'empaquetage sont déficientes en thymidine kinase, le vecteur porteur du transgène sera un vecteur bicistronique permettant la sélection en présence d'un gène thymidine kinase de HSV1 ou un dérivé fonctionnel de celui-ci. Une propriété surprenante du gène HSV1 -TK est que un taux d'expression élevé peut entraîner une toxicité pour la cellule, empêchant d'obtenir un nombre élevé de transcrits. Dans ce cas de toxicité du gène, la sélection des cellules productrices aboutit à l'obtention de clones dans lesquels l'expression du gène est faible et donc le titre infectieux très bas. Le vecteur de l'invention, susceptible d'infecter ou de transfecter les cellules d'empaquetage décrites ci-dessus, sera donc construit de telle façon que la production des transcrits encapsidables du transgène soit élevée en comparaison avec la production des protéines HSV1 -TK. Ainsi, une cellule d'empaquetage TK" transfectée par un vecteur bicistronique porteur, d'une part, d'un transgène et, d'autre part, de HSV1-TK ou l'un de ses dérivés peut à la fois être sélectionnée dans le milieu sélectif HAT et être productrice de particules virales à haut titre, tout en évitant une contre-sélection due à l'activité toxique du HSV1-TK lorsque le gène est traduit activement. Ceci permet donc la réalisation de cellules d'empaquetage disposant d'un titre élevé et qui produisent des rétrovirus défectifs codant, soit pour HSV1-TK seul, soit pour un gène d'intérêt et HSV1-TK. Cette différence dans la production de transcrits du transgène X, d'une part, et de Y, d'autre part, est réalisée par la construction de vecteurs recombinants dans laquelle la séquence nucléotidique Y dont l'expression complémente la fonction déficiente de la cellule d'empaquetage, par exemple HSV1-TK, est située soit à environ une centaine de paire de bases du codon stop du transgène, soit sous le contrôle d'une séquence de type IRES normale ou mutée telle que décrite ci-dessus de telle façon que l'initiation de la traduction de la séquence Y soit moins efficace que celle de la séquence X.
Dans le cas où le transgène est lui-même le gène permettant la sélection des cellules d'empaquetage, c'est-à-dire dans le cas où X et Y sont un seul et même gène (par exemple HSV1 -TK), le gène d'intérêt lui- même est utilisé comme gène de sélection. Au contraire, quand le gène X et le gène Y sont différents, le gène Y peut alors assurer également une fonction de gène de sécurité Z car il permet le cas échéant de détruire les cellules transfectées avec le gène thérapeutique par traitement du malade avec une substance transformant la prodrogue en drogue toxique.
Dans le cas où la séquence Y et le cas échéant la séquence Z codent pour HSV1-TK, un exemple de réalisation du vecteur recombinant de l'invention est représenté sur la figure 2. Dans cette figure, les deux vecteurs représentés montrent la différence entre les deux modes de réalisation permettant une moindre expression du gène HSV1-TK (séquences Y et Z réunies), soit par une certaine distance du codon stop du gène X, soit par l'introduction d'une séquence IRES. La séquence représentée par gag* signifie que la séquence d'encapsidation peut comprendre non seulement la région génétique nécessaire à l'encapsidation mais également la partie du gène gag muté qui ne permet pas la reconstitution de la protéine gag mais qui peut augmenter l'efficacité d'encapsidation.
Les propriétés de HSV1-TK sont compatibles avec cette conception. En effet, de très faibles quantités de TK sont suffisantes pour pouvoir sélectionner en présence d'un milieu sélectif HAT des clones cellulaires dérivés de cellules TK négatives ; de la même manière, une très faible expression de TK est suffisante pour obtenir une bonne sensibilité au ganciclovir.
Dans certains cas, les trois gènes X, Y et Z ne peuvent représenter qu'un seul gène comme, par exemple, il s'agit du gène HSV1 -
TK qui joue à la fois le rôle de transgène, de gène de sélection, et de gène de sécurité. Une construction comme celle-ci présente l'avantage de pouvoir ajouter dans le vecteur un deuxième gène thérapeutique, par exemple un gène qui code pour des cytokines lorsque l'on souhaite éliminer des cellules cancéreuses.
Un autre mode de réalisation de l'invention, lorsque le gène TK est le gène thérapeutique lui-même, peut être caractérisé par le fait que le gène Y peut être un gène codant pour un autre marqueur de sélection par exemple le gène BSR cité plus haut ou un autre gène d'intérêt thérapeutique comme par exemple un gène de cytokine.
Pour une expression optimisée du gène Y, ce dernier peut être placé sous le contrôle d'un promoteur interne faible qui peut être lui- même atténué par un « read through » par le LTR du vecteur rétroviral. Dans cette condition le LTR 3' du vecteur peut également contenir une délétion de l'amplificateur de sorte que ce « read through » n'empêche pas l'expression après infection de la cellule cible par les particules virales recombinantes.
De manière générale, le procédé d'obtention de virus recombinants défectifs à haut titre peut porter sur tout transgène dont l'absence induit une pression de sélection négative pour la cellule d'empaquetage ; une cellule ainsi délétée du gène codant pour ce transgène serait alors « sauvée » par le vecteur rétroviral qui jouerait en même temps le rôle de vecteur de sélection. Ceci s'appliquerait ainsi à tout gène cellulaire dont la surexpression induit une pression de sélection négative pour la cellule puisque seules les cellules d'empaquetage porteuses et productrices de rétrovirus recombinants seront sélectionnées positivement même dans le cas où l'expression du gène d'intérêt aurait tendance à contre-sélectionner ces cellules.
L'invention porte sur l'utilisation des cellules d'empaquetage et des vecteurs décrits ci-dessus dans la préparation d'un médicament de thérapie génique possédant les qualités de sécurité, et d'efficacité requises pour ce type de médicament, à savoir résistants au complément et ayant la possibilité d'être détruits in situ en tant que de besoin.
L'invention porte sur l'utilisation des cellules d'empaquetage selon l'invention et des vecteur recombinants porteurs d'un gène d'intérêt tel que décrit ci-dessus à la transformation de cellules cibles du système immunitaire telles les cellules souches hématopoïétiques, des cellules lymphocytaires ou des cellules cancéreuses.
L'invention porte également sur l'utilisation des cellules d'empaquetage telle que décrite plus haut dans un procédé de coculture de cellules cibles d'un rétrovirus infectieux défectif porteur d'un gène d'intérêt en thérapie génique et produit par les cellules d'empaquetage, ces dernières devant être impérativement détruites avant utilisation desdites cellules cibles ainsi transformées en médicaments. II est connu en effet que certaines indications nécessitent cette coculture in vitro de la cellule cible et de la cellule d'empaquetage, par exemple quand la cellule cible est une cellule du système lymphocytaire ou des cellules souches hématopoïétiques. La cellule d'empaquetage doit impérativement être éliminée avant la réintroduction de la cellule cible ainsi transformée. Quand la cellule d'empaquetage est porteuse du gène HSV1-TK comme gène de sélection par exemple, l'utilisation d'un milieu de culture contenant du HAT en présence de ganciclovir et d'acyclovir peut permettre de détruire sélectivement les cellules portant le gène HSV1-TK et donc la cellule d'empaquetage au profit des seules cellules cibles transfectées par le virus rétroviral produit par lesdites cellules d'empaquetage. Un autre mode de réalisation dans le cas de coculture peut être réalisé avec des cellules d'empaquetage directement dépourvues du gène HSV1-TK et la sélection du mélange cellulaire en présence du milieu sélectif HAT en maintenant une concentration cellulaire adéquate fait également disparaître les cellules d'empaquetage sans altérer les cellules cibles.

Claims

REVENDICATIONS
1. Cellule eucaryote d'empaquetage pour la production de virus infectieux défectifs porteurs d'un transgène, caractérisée en ce qu'elle est déficiente en une fonction cellulaire essentielle à sa croissance, notamment en présence d'un milieu de culture de sélection, ladite fonction étant susceptible d'être restaurée par l'expression d'une séquence exogène introduite dans la cellule : soit avec un vecteur porteur de fonctions transcomplémentaπtes des cellules d'empaquetage ; - soit avec un vecteur porteur du transgène, et permettant la sélection en milieu sélectif des cellules porteuses de ladite séquence exogène.
2. Cellule eucaryote selon la revendication 1 caractérisée par le fait qu'elle vérifie l'une ou plusieurs des propriétés suivantes : - elle est susceptible de produire des particules virales à un taux supérieur à 105 particules par ml ;
- elle est résistante au complément ou elle produit des particules virales résistantes au complément ;
- elle a un temps de division inférieur à 30 heures ; - elle est stable au moins 3 mois dans un milieu de culture non sélectif ;
- elle est dépourvue de rétrovirus endogènes.
3. Cellule selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisée en ce qu'elle provient d'une cellule humaine ou simienne.
4. Cellule selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que le transgène lui-même est susceptible de restaurer la fonction cellulaire déficiente.
5. Cellule selon la revendication 4 caractérisée en ce que le transgène est le gène codant pour la thymidine kinase ou pour un dérivé fonctionnel de celle-ci.
6 Cellule selon l'une des revendications 3 à 5 issue de la lignée 143 B TK" ou d'une cellule Vero, 3T3-TK"
7 Cellule selon l'une quelconque des revendications précédentes, modifiée par transfection avec au moins deux vecteurs rétroviraux porteurs :
- pour le premier, des gènes oa /po , sous le contrôle d'un promoteur de type LTR, une séquence de polyadénylation, le cas échéant des signaux régulateurs de transcription de gag et pjgj ,
- pour le deuxième, un gène codant pour une protéine d'enveloppe, sous le contrôle d'un promoteur qui sera avantageusement choisi parmi les promoteurs forts de type pCMV ou parmi les promoteurs inductibles, une séquence de polyadénylation ;
- au moins un gène de sélection pour l'établissement de la cellule en lignée de packaging qui peut être situé sur le premier ou le deuxième vecteur ,
- les susdits premiers et deuxièmes vecteurs étant dépourvus de séquence d'encapsidation
8 Cellule d'empaquetage selon la revendication 7 caractérisée en ce que un gène de sélection est situé sur le premier vecteur et peut être notamment un gène de résistance à la Blasticidine S
(gène BSR) ou à la Zeomycine (gène ZeoR)
9. Cellule d'empaquetage selon la revendication 7 ou 8 caractérisée en ce que le gène de sélection est situé, soit à environ une centaine de paires de bases du codon stop de gol, soit sous le contrôle d'une séquence de type IRES, normale ou mutée, de telle façon que l'initiation de la traduction du gène de sélection soit moins efficace que celle des gènes gag et βol.
10 Cellule d'empaquetage selon l'une des revendications 7 à
9 caractérisée en ce que le promoteur contrôlant les gènes gag et ppj est le LTR du virus de Friend B29
11. Cellule d'empaquetage selon l'une des revendications 7 à 10 caractérisée en ce que le deuxième vecteur contient également un gène de sélection différent de celui situé sur le premier vecteur, ledit gène de sélection étant situé, soit à environ une centaine de paires de bases du codon stop de gol, soit sous le contrôle d'une séquence de type IRES, de telle façon que l'initiation de la traduction du gène de sélection soit moins efficace que celle des gènes gag et p_ol.
12. Vecteur rétroviral recombinant porteur d'un gène hétérologue X dont l'expression est recherchée dans une cellule cible et porteur d'une séquence ψ caractérisé en ce qu'il comprend :
- une séquence nucléotidique Y dont l'expression complémente la fonction déficiente dans la cellule d'empaquetage,
- le cas échéant un gène de sécurité Z dont l'expression en présence d'une substance exogène conduit à la destruction de la cellule transfectée ou infectée.
13. Vecteur selon la revendication 12 caractérisé en ce que X et Y ou Y et Z ou X, Y et Z ne représentent qu'un seul et même gène, et que ledit vecteur permet de sélectionner les cellules d'empaquetage qui contiennent le transgène d'intérêt X.
14. Procédé d'obtention de virus recombinants à haut titre dans des cellules d'empaquetage telles que définies dans l'une des revendications précédentes comprenant : a) l'infection ou la transfection desdites cellules par un vecteur recombinant porteur au moins de : - un gène d'intérêt thérapeutique X, sous le contrôle d'un promoteur,
- une séquence nucléotidique Y dont l'expression complémente la fonction déficiente dans la cellule d'empaquetage,
- une séquence d'encapsidation Ψ, - le cas échéant un gène de sécurité Z dont l'expression en présence d'une substance exogène conduit à la destruction de la cellule transfectée ou infectée, b) la sélection desdites cellules dans un milieu de culture comprenant une substance entraînant la mort de la cellule quand la séquence Y n'est pas exprimée.
15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que la séquence Y est située, soit à environ une centaine de paires de bases du codon stop de X, soit sous le contrôle d'une séquence de type IRES, de telle façon que l'initiation de la traduction de la séquence Y soit moins efficace que celle de la séquence X.
16. Procédé selon l'une des revendications 14 et 15 dans lequel les séquences Y et Z sont identiques.
17. Procédé selon l'une des revendications 14 et 16 dans lequel le gène d'intérêt thérapeutique X et la séquence Y sont identiques.
18. Procédé selon l'une des revendications 14 à 17 caractérisé en ce que la cellule est déficiente en thymidine kinase, telle par exemple les cellules issues de la lignée 143B TK", et la séquence Y est celle du gène de la thymidine kinase de HSV1 -TK ou l'un de ses dérivés fonctionnels, les cellules étant alors sélectionnées en milieu HAT, et susceptibles d'être détruites en cas de nécessité en présence de ganciclovir ou d'acyclovir.
19. Utilisation de cellules d'empaquetage selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dans un procédé de coculture de cellules cibles d'un rétrovirus infectieux défectif porteur d'un gène d'intérêt en thérapie génique et produit par lesdites cellules d'empaquetage, ces dernières devant être détruites avant utilisation desdites cellules cibles ainsi transformées en médicament.
20. Utilisation selon la revendication 19 où les cellules cibles sont les cellules du système immunitaire telles les cellules souches hématopoïétiques ou des cellules lymphocytaires.
21. Utilisation de cellules d'empaquetage selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dans la préparation d'un médicament de thérapie génique.
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