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WO1997044667A2 - Methodes d'utilisation de complexes peptide/complexe majeur d'histocompatibilite pour obtenir ou purifier des cellules t antigene-specifiques et pour stimuler des cellules t - Google Patents

Methodes d'utilisation de complexes peptide/complexe majeur d'histocompatibilite pour obtenir ou purifier des cellules t antigene-specifiques et pour stimuler des cellules t Download PDF

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WO1997044667A2
WO1997044667A2 PCT/FR1997/000892 FR9700892W WO9744667A2 WO 1997044667 A2 WO1997044667 A2 WO 1997044667A2 FR 9700892 W FR9700892 W FR 9700892W WO 9744667 A2 WO9744667 A2 WO 9744667A2
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WO
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peptide
cells
specific
mhc
antigen
Prior art date
Application number
PCT/FR1997/000892
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WO1997044667A3 (fr
Inventor
Pierre Langlade-Demoyen
Yu-Chun Lone
Philippe Kourilsky
Jean-Pierre Abastado
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Institut Pasteur
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Institut Pasteur
Priority to AU30365/97A priority Critical patent/AU3036597A/en
Publication of WO1997044667A2 publication Critical patent/WO1997044667A2/fr
Publication of WO1997044667A3 publication Critical patent/WO1997044667A3/fr

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention provides compositions comprising an antigen or molecule of the major histocompatibility complex (MHC) together with a peptide antigen and methods for using these compositions when linked to a solid support.
  • the invention provides methods for obtaining, purifying and / or multiplying a population of T lymphocytes which are specific for a particular peptide antigen. Various uses of the T cells obtained are also described.
  • the invention provides methods for inducing or stimulating T cells to respond to a specific antigen. Preferred embodiments include methods for purifying cytotoxic T lymphocytes and methods for activating or inducing the response of a cytotoxic T lymphocyte, thereby generating an antigen-specific cytotoxic T lymphocyte.
  • T lymphocytes recognize antigenic fragments carried by the surface of an antigen presenting cell in association with products of MHC class I or class II genes (1). Binding to T cell receptors is part of the recognition process. It is also known that the total population of T lymphocytes of a single animal can recognize several million different specificities, a single specificity being able to be defined as a peptide linked to a molecule of the MHC. The recognition of such a number of specificities is achieved by the random recombination of different gene segments, followed by clonal selection (2).
  • T-cell repertoire Due to the large T-cell repertoire and the limited total number of T-cells, only a small number of T-cells are directed against a given specificity. This number can be increased in repeatedly immunized animals, but it remains relatively low (3). Because of the small number of T lymphocytes directed against a particular antigen, it is difficult to identify effective means for purifying a T lymphocyte of a given specificity in vitro.
  • T cell repertoires were studied in an attempt to measure repertoire diversity and clonal expansion in healthy and clinical samples (for a review, see (4)).
  • T cell hybridomas 27, 28. Since the cloning and fusion efficiencies can vary from one T cell to another, significant biases can be generated during the cloning used in this method.
  • mAbs V ⁇ - and V ⁇ - specific monoclonal antibodies (mAbs) (29), allowing more reliable analyzes of the T lymphocyte repertoires in the absence of a in vitro expansion.
  • mAbs V ⁇ - and V ⁇ - specific monoclonal antibodies
  • T lymphocytes respond to peptide fragments of antigens linked to the cell surface of molecules of the major histocompatibility complex (MHC) on cells presenting antigens (APC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • APC antigens
  • tumor infiltrating lymphocytes have been isolated from patients and have been used for adoptive immunotherapy after in vitro culture (7-9). The results obtained were however disappointing. Most often, the reason is that only a very small percentage of the lymphocytes infiltrating the tumors is actually specific for the tumor. In addition, losses may occur in the tumor-specific T cell population during in vitro amplification or a loss of tumor activity in these T cells may occur due to anergic or regulatory mechanisms. These problems can be resolved by a method in which the tumor specific T cell population in an animal is isolated or purified based on binding to a tumor specific antigen. However, prior methods of limited dilution of T cell samples cannot identify T cells with enhanced tumor-antigen binding capabilities or justify the loss of T cells during amplification.
  • T lymphocytes respond to peptide fragments of antigens linked to the cell surface of molecules of the major histocompatibility complex (MHC) on cells with antigens (APC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • APC antigens
  • TCR-mediated arousal is generally ineffective unless accompanied by "co-stimulatory" signals.
  • These signals regulate the production of T lymphocytes by growth-stimulating cytokines, such as IL-2, and result from the interaction of multiple sets of complementary molecules on T lymphocytes and APCs, for example between CD28 on T lymphocytes. and B7 on APCs.
  • cytokines such as IL-2
  • APCs for example between CD28 on T lymphocytes. and B7 on APCs.
  • a large number of various molecules on APCs comprising for example B7.1, B7.2-ICAM and HSA, are known to express a co-stimulatory function under defined in vitro conditions. The most important molecules for co-stimulation have not yet been elucidated.
  • a protocol allowing to know the most important factors of co-stimulation uses transfector cells with genes of known co-simulator molecules and then tests the APC function of these cells.
  • a disadvantage of this approach is that virtually all cell types express at least a low level of certain co-stimulatory molecules. This background expression is less problematic when using an artificial APC for presentation. Consequently, it would be interesting in the art to have methods for stimulating or inducing a T lymphocyte response which is devoid of co-stimulatory signals, that is to say an artificial APC.
  • the invention includes various uses of MHC / peptide complexes.
  • a MHC / peptide complex designates an MHC molecule charged with specific antigens.
  • the MHC / antigen complexes can be used to obtain, isolate or purify specific T lymphocyte populations when they are linked to, or when they adhere to, a solid support.
  • MHC class I and II antigens or modified determinants are capable of functionally imitating natural gene products.
  • modified determinants of the MHC such as those described and presented by specific examples, can be used as well as the molecules coded by the MHC, natural or previously identified.
  • MHC / antigen complexes can also be used to stimulate T lymphocytes. To activate T lymphocytes, coated beads comprising the MHC / specific antigen complex can be used. It is' also possible to provoke T cells the formation of cytotoxic T lymphocytes that are directed against the specific antigen.
  • the general method which constitutes an aspect of the present invention allows the successful purification of T cells specific for an antigen or peptide for any antigen, including antigens associated with a tumor.
  • the method consists in using a solid substrate and in coupling a MHC determinant loaded with a peptide or antigen to the solid substrate.
  • the method uses magnetic beads coupled to a high density of MHC molecules which are loaded with a peptide.
  • This method purifies, isolates and quantifies tumor-specific T cells from samples containing T cells, for example tumor infiltrating lymphocytes (TIL) and samples of peritoneal exudate (PE).
  • TIL tumor infiltrating lymphocytes
  • PE peritoneal exudate
  • T cells purified from a solid support including MHC loaded with a tumor-specific antigen, exhibit enhanced antitumor activity.
  • the present invention is useful for all types of tumors, that is, it has proven to be effective not only in the treatment of solid tumors, but also in the treatment of leukemia, lymphomas, etc.
  • the methods related to tumor specific T cells are only one embodiment of the present invention.
  • virus specific antigens can be used in methods for purifying T lymphocytes which are specific for cells infected with a virus.
  • the present invention provides a powerful diagnostic tool for the detection of T cells having a specific TcR.
  • T cells can be used to detect the presence of T cells that respond to tumor cells in patients, in samples, or in animals.
  • the invention provides methods, kits and methods for analyzing and using human CTLs directed against a specific peptide.
  • the identification of peptides derived from tumor cells makes it possible, for example, to provoke anti-tumor CTL responses and provides important reagents for structuring antigen-specific immunotherapies and stimulating future research and development of immunotherapies.
  • Strategies for identifying these therapeutic peptides are based on the selection of MHC binders, having a high affinity, from antigens associated with a tumor.
  • the invention describes the successful production of a biologically active sSC-A2 molecule.
  • This SSC-A2 molecule is properly folded ( Figure 17) and specifically binds to A2-restricted antigenic peptides and does not bind to H-2.K b or H-2.K d -restricted mouse peptides ( Figure 18) .
  • the sSC-A2 / peptide complexes interact with the appropriate T cell receptor and elicit a proliferative response of CTL specific for a peptide ( Figure 19).
  • the invention shows that the sSC-A2 / peptide complexes, when applied as a high density coating on beads, can be used as artificial APCs to cause in vitro priming of specific sites of a PBL HLA A2.1 naive cell peptide from healthy donors.
  • this sSC-A2 molecule makes it possible to develop a sensitive and reliable MHC-peptide binding test. Such a test would be useful in identifying epitopes of T lymphocytes with high affinity from known tumor-associated antigens, which may be potentially immunogenic for CTL.
  • Various protocols have been recently described for the induction by peptides in vitro of primary CTL responses in mice (107-100) and in human systems (111-112). They indicate that the prerequisite for priming CTLs is the ability of APCs to exhibit a high density of peptide-MHC molecule complexes.
  • the results obtained in the murine system indicate that the sSCK d- peptide complexes, when applied with a high density as a coating of magnetic beads, can be used to purify and quantify peptide specific T lymphocytes, derived from an isolated peritoneal exudate lymphocyte (PEL), despite a fairly weak affinity interaction between their related TCR and the peptide / MHC molecules. This phenomenon underlies the important relationship between greed and apparent interaction affinity, which is in good correlation with the fact that dimeric peptide / MHC molecules bind to TCR with greater affinity than peptide / MHC monomers (117).
  • A2 / peptide when applied with high density to beads, can be used as artificial APCs to induce in vitro priming of peptide specific CTLs from PBL HLA A2.1 cells naive from healthy donors.
  • an important aspect of the present invention is the generation and use of artificial APCs.
  • the specific response presented may be the consequence of a direct interaction between the sSC-A2 / peptide complexes and the appropriate CTL receptor ( Figures 19 and 21).
  • CTL M58-66-specific is not the consequence of primary induction, but probably reactivation in vitro, since a precursor of CTL M58-66 of relatively high frequency has has been described for PBL cells from healthy donors (90).
  • One possible explanation is that the exposure to a prior viral attack of most healthy subjects and the requirement for initial sensitization or reactivation of memory cells are very different things.
  • a multiplication of CTL was obtained. specific for NA17-A peptides (Y. Guilloux, personal communication), a multiplication of CTL MAGE-3- and Melan-A- specific (P.
  • Bosso, personal communication a multiplication of CTLs specific for the MAGE-3 peptides and polyspecific for the VlH peptides, in addition, the CTLs which were primed with the beads MAGE-3 / SC-A2 peptide or VlH / SC-A2 peptide Pol proved to be effective in killing peptide activated T2 cells as well as MAGE-3 positive tumor cells or Jurkat cells transfected with Pol VlH.
  • APCs such as dendritic cells
  • co-stimulatory molecules such as B7.1 or B7.2 are not absolutely necessary for initial induction (86).
  • the absence of activity of co-stimulatory molecules can be partially compensated by the presence of exogenous cytokines in the culture medium.
  • natural killer cells natural killer, NK
  • the dimeric sSC-Kd has been shown to specifically inhibit the NK activity of NK cells (DBA / 2 H-2K d mice) (120).
  • NK cells 121, 122).
  • Activated NK cells produce large amounts of IL-4, interferon ⁇ (IFN- ⁇ ), IL-5 and IL-10 (see reference (123)), they also produce many other chemokines , such as MlP-la, MlP-1b, lymphotactin and TCA-3.
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • IL-5 interferon ⁇
  • IL-10 see reference (123)
  • chemokines such as MlP-la, MlP-1b, lymphotactin and TCA-3.
  • CTL subpopulations can be generated specifically for the same peptide epitope. It is interesting that these CTL subpopulations differ in terms of TCR affinity or TCR avidity.
  • the mechanisms that support the initial induction of CTLs, resulting in the emergence of peptide-specific CTLs, with different abilities to lyse peptide-activated target cells and / or tumor cells, may be equivalent to those operating in the thymus during the education of thymocytes. However, in the thymus, positive and negative selection processes form the repertoire of peripheral T cells.
  • Positive selection is mediated by epithelial cells of the cortical thymus (124, 125), while dendritic cells and macrophages are believed to be the main cell types involved in negative thymus selection (126).
  • epithelial cells of the cortical thymus 124, 125
  • dendritic cells and macrophages are believed to be the main cell types involved in negative thymus selection (126).
  • P. Kourilsky (127) and of PG Ashton-Rickardt and S. Tonegawa (128, 129) which shed light on the notion of global greed for interaction during the positive and negative selection processes.
  • This greed for interaction depends on several parameters comprising: i) the density of the peptide / MHC complexes on the selection cells; ii) the affinity of TCRs on the thymocyte towards positive (or negative) peptide / MHC complexes; iii) the density of TCRs on the thymocyte; iv) the density of adhesion molecules, co-receptors (CD4, CD8), co-stimulatory molecules (B7.1, B7.2, CD28 / CTLA-4) on the positive (or negative) selection and the selected cells. Additional study is needed to clarify the mechanism of activation of specific primary CTLs.
  • the present invention represents the first disclosure and is the first example of an in vitro induction of primary CTLs in the human system, using a synthetic peptide / sSC-A2 complex, resulting in effector cells which kill cells expressing a specific antigen, c that is, tumor cells.
  • CTLs with similar tumor specificity and reactivity are generated in the murine system also using beads of peptide / sSC-K complexes derived from naive H-2K cells of the spleen (I. Motta and YC Lone, unpublished study).
  • the invention comprising the synthetic SSC-A2 peptide as an APC artificial cell to generate specific CTLs from healthy donors.
  • the system is of high definition and reproducibility.
  • CTLs with the desired specificity can be selected for multiplication and potential clinical use, as is obvious to those of skill in the art.
  • Current research and development of T-cell therapies for human cancer is largely hampered by the absence of identifiable tumor antigens (69, 70).
  • Recent advances in the understanding of the interaction between natural peptides and MHC molecules allow the identification of similar immunogenic peptides in a protein sequence based on the presence of specific conserved residues (“anchors”) (71).
  • MHC class I binding peptides which generally have a length of 9-10 residues, generally contain in their sequence two anchor residues which interact with corresponding binding pockets in the MHC molecule (72, 74) .
  • the definition of specific MHC motifs makes it possible to predict peptides derived from antigens of viral or tumor origin which are potentially immunogenic for CTLs. These peptides generally bind with good affinity to the MHC molecule considered (75).
  • HLA-A2.1 single-stranded recombinant molecules have been produced which can be used in research and development for the treatment of human cancers.
  • the availability of these molecules allows the development of a rapid and sensitive test for the identification of T cell epitopes of potential interest.
  • the sSC-A2 structure was constructed by connecting the first three domains of the heavy chain A2.1 to human B2-microglobulin via a spacer having the length of 15 amino acids.
  • RBL basophilic rat cells
  • the molecule is folded correctly and specifically binds to A2-restricted antigenic peptides, but does not bind to murine peptides restricted by H-2K b or H-2K d .
  • sSC-A2 / peptide complexes specifically induce a proliferative CTL response.
  • the beads coated with a high density of sSC-A2 / peptide complexes are effective artificial APCs and elicit peptide-specific CTLs in vitro from naive PBL HLA-A2.1 from healthy donors. The potential utility of these sSC-A2 molecules is discussed.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the expression is used in the present description in a generic sense, to designate the set of gene products comprising the histocompatibility markers for an animal.
  • the MHC / peptide complexes of the present invention can be obtained from natural or previously isolated or characterized MHC genes or molecules.
  • modified MHC determinants can be used as part or all of the MHC molecule. The modified MHC determinants functionally mimic natural gene products.
  • MHC class I gene products are glycoproteins which are non-covalently linked to a peptide called ⁇ 2-microglobulin, abbreviated as " ⁇ 2 -m” or " ⁇ 2 -m”.
  • the class I component is designated as the heavy chain and ⁇ 2 - microglobulin, as the light chain.
  • the orientation of the MHC class I molecule of ⁇ 2-microglobulin in a cell membrane is illustrated in Figure 1.
  • the structure of the heavy chain is organized with 3 exposed domains, ⁇ 1 , ⁇ 2 and ⁇ 3 , which extend from the cell surface and are attached to a hydrophobic transmembrane domain 1 and to a segment short cytoplasmic anchor 2 inside the cell.
  • Two external domains ⁇ 2 and ⁇ 3 ) have connections intracatenary disulfide (forming loops with considerable homology with Ig).
  • the light chain ( ⁇ 2-microglobulin) represented in FIG. 1 has approximately the same size as the ⁇ domains of the heavy chain. Each domain is similar to immunoglobulin, and is constituted by a pleated ⁇ folded sheet, held together by a disulfide bond at the ends, giving a plane type surface.
  • the ⁇ 2 chain is folded over the ⁇ 3 domain of the heavy chain and the ⁇ 1 and ⁇ 2 domains are also paired.
  • the ⁇ 2 -microglobulin gene is located on a chromosome different from that containing the MHC class I gene product. Its structure is well preserved, while that of heavy chains varies greatly from one individual to another due to the differences in amino acid sequences of external domains.
  • the heavy chain polymorphism is mainly due to the ai domain and to a lesser extent to the ⁇ 2 domain.
  • Class II gene products are well characterized.
  • the class II gene product (IA) consists of two polypeptide chains ( ⁇ and ⁇ , Figure 2).
  • the ⁇ and ⁇ chains are divided into two external domains ( ⁇ 1 and ⁇ 2 or ⁇ 1 and ⁇ 2 ), the transmembrane domains 3 and 4 of FIG. 2 and the cytoplasmic domains 5 and 6.
  • the cysteine residues which participate in the formation of the disulfide bridges are designated by S in FIG. 2.
  • MHC class I and class II gene products can be glycosylated. However, they may not necessarily be glycosylated when used in the present invention.
  • Modified MHC class I and class II determinants The descriptions of US applications under review, serial numbers 08/487650, filed June 7, 1995 and 08/370476 filed January 9, 1995, provide methods for the production and use of modified MHC determinants as well. than a general discussion of MHC and MHC genes in mammals. Similarly, the US patent application under examination, serial number 07/801818, filed on December 5, 1991, describes the modified determinant of MHC and molecules and genes of MHC. The total content of these requests under consideration is incorporated here specifically for reference. Those skilled in the art can use the publication of applications under review to produce a variety of MHC / peptide complexes. The corresponding information is also given in (20), (21), (24), (76), (78) to (80), in particular in (76).
  • a modified MHC class I determinant is shown schematically in Figure 3A.
  • the ⁇ 3 domain of the heavy chain is linked to the microglobulin domain by means of a spacer (shown in dotted lines in FIG. 3A).
  • the resulting product which is shown in the form of a schemabloc in FIG. 3B, is the modified determinant of MHC class I and comprises the domains of a 1 , ⁇ 2 , ⁇ 3 and ⁇ 2 - microglobulin covalently linked, in sequence.
  • the ⁇ 3 domain of the heavy chain is devoid of the region closest to region 1 of the transmembrane domain of FIG. 1 until the carboxyl termination of the cytoplasmic segment 2.
  • the modified MHC class I determinants can be prepared by appropriate selection of the MHC locus coding for the domains ⁇ 1 , ⁇ 2 , ⁇ 3 , and a gene coding for the domain ⁇ 2-microglobulin, so that each of these domains goes retain its function either of activating cytotoxic T lymphocytes, or of presenting antigens to T cell receptors, or these two functions at the same time. Whether or not the particular molecule has one or both of these functions can be determined by routine experimentation known in the art. Expression of the polypeptide encoded by the MHC locus can be achieved by recombinant DNA techniques.
  • FIG. 4A A determinant of the MHC class II modified according to the invention is shown diagrammatically in FIG. 4A.
  • the amino terminus of the ⁇ 1 domain is linked to the carboxyl terminus of the ⁇ 1 domain, for example by means of a spacer (dotted line).
  • the carboxyl termination of the ⁇ 2 domain is linked to the amino termination of the ⁇ 2 domain, for example by means of another spacer (dotted line).
  • the resulting product is the modified CMH class II determinant according to the present invention, which can be represented by the block diagram shown in FIG. 4B.
  • the modified determinant comprises the domains ⁇ 2 , ⁇ 2 , ⁇ 1 and ⁇ 1 linked covalently, in sequence. As shown in FIG.
  • the modified determinant is devoid of the regions close to the transmembrane domains 3 and 4 of FIG. 2 extending up to the carboxyl termination of the cytoplasmic segments 5 and 6 which are normally attached to the chain ⁇ 1 , ⁇ 2 and to the chain ⁇ 1 , ⁇ 2 , respectively.
  • portions of the MHC loci are selected to retain the function of the domains in stimulating a cytotoxic response or in the presentation of antigens to T cell receptors, or both.
  • Any of the appropriate polypeptides of a major histocompatibility complex can be chosen and used to generate MHC / peptide complexes of the present invention.
  • Appropriate genetic loci corresponding to an MHC molecule can also be used in recombinant means to produce MHC in the MHC / peptide complexes of the present invention.
  • Those skilled in the art are familiar with many examples of MHC alleles of various species, each of which can be appropriately selected and used as described.
  • the domains of the modified MHC determinants correspond to domains coded by the natural MHC loci and their variants, which code for MHC products capable of producing a cytotoxic response by appropriate T lymphocytes or of inducing an immune response by lymphocytes .
  • the modified MHC class I and class II determinants used differ from natural mammalian MHC gene products in that the domains of the gene products are covalently linked, for example by means of a spacer.
  • the modified MHC class II determinant of the present invention consists of a polypeptide chain in which the ⁇ 2 - ⁇ 2 - ⁇ 1 - ⁇ 1 domains are covalently linked. These areas are never related in this way in nature.
  • the modified determinants of MHC classes I and II are also identical to the corresponding natural gene products of MHC.
  • the modified MHC determinants can be obtained from DNA structures encoding the MHC domains, so that there is transcriptional translation.
  • the DNA structure contains a DNA sequence coding for the domains ⁇ 1 , ⁇ 2 and ⁇ 3 linked to a DNA sequence coding for the ⁇ 2 m domain, so that there is a transcriptional translation from the 5 'end of the DNA coding for the ⁇ 3 domain to the 3' end of the DNA sequence coding for the domain ⁇ 2 m.
  • the modified determinants of MHC class II according to the invention can be obtained from DNA constructs in which there is a transcriptional translation of a DNA sequence coding for the domains ⁇ 2 - ⁇ 2 - ⁇ 1 - ⁇ 1 .
  • the MHC domains can be covalently linked by suitable spacers.
  • the spacers can function as hinges for the modified determinant. Any amino acid sequence containing the appropriate residues and having the suitable length which corresponds to what is known in the art as a hinge or hinge region can be used.
  • U.S. applications under review serial numbers 07/801818, 08/487650 and 08/370476 describe specific spacers and nucleotide and amino acid sequences that can be used.
  • the peptide which must be associated with the MHC molecule may possibly be linked to the region of the spacer.
  • the antigen or peptide to be loaded onto an appropriate MHC class I molecule, or onto a modified MHC determinant typically contains from about 5 to about 20 amino acid residues, preferably 8, 9 or 10 residues amino acids. Longer peptides can be used with the modified MHC class II determinants.
  • Natural peptides that bind to MHC gene products can be modified at one or more positions by substitution of other amino acids or by deletion of amino acids. In this way, a person skilled in the art can produce numerous peptide antigens which can be used with the present invention from a peptide which binds to MHC gene products.
  • the modified peptide will not necessarily have the same binding characteristics as the natural or unmodified peptide.
  • a person skilled in the art can observe and identify peptide motifs specific for an allele, capable of being presented by appropriate MHC determinants.
  • These peptide motifs typically contain two anchor positions occupied by an invariant amino acid residue or by one of a few conserved amino acid residues, with closely related side chains. The anchor positions are not always in the same location in the different patterns.
  • the structure of the modified peptide may correspond to characteristics of the groove linked to the peptide of the modified determinant of MHC.
  • the allele-specific pockets of the modified MHC determinants of the present invention and the side chains of the allele-specific anchor residues may preferably have complementary structures.
  • the tumor specific antigens which can be used in the present invention are typically the antigens which are expressed only on tumor cells and not on normal cells.
  • MHC class I-restricted tumor antigens include: P1A (testes), Connexin 37 (lungs), MAGE-1 (melanocytes), MAGE-3 (melanocytes), MARTl / Aa (melanocytes), gp100 (melanocytes ), p53 (breast and colon) and tyrosinase (melanocytes).
  • serial numbers 08/370476 and 08/487650 contain lists of antigens related to cells infected with HIV, influenza and other peptides, which can be used according to the present invention.
  • Preferred peptides for the tumor specific T cell appearance of the present invention include, but are not limited to, the following examples:
  • Neosystem Strasbourg, France
  • Hidde Ploegh Hidde Ploegh
  • the antigens described in the above tables are merely representative of antigens which can be presented to cellular receptors in association with the modified MHC determinants or the MHC derived molecules of the present invention. Other antigens which can form complexes with the determinants can also be used.
  • the use of both a direct peptide binding test (PBA) and the inhibition of the peptide binding test (IPBA), the physical interactions between HLA molecules and peptides can be analyzed. In particular, the tests can be carried out as follows. Direct peptide bond test (PBA).
  • Wells of microtiter plates are pretreated with 100 ⁇ l of 2.5% glutaraldehyde in distilled water for 2 hours at 20 ° C., they are washed with distilled water and coated for 16 hours at 4 ° C. with 100 ⁇ l of peptide diluted to 5 ⁇ g / ml, either in a carbonate-bicarbonate buffer, p H 9.6, or in PBS, p H 7.4 or p H 7.5. The remaining free sites are blocked by incubation for 2 hours at 20 ° C. with BSA diluted to 1% in PBS containing 0.05% Tween 20 (Tw) and 0.02% sodium azide. After washing, 125 molecules of purified I-HLA are added (100 ⁇ l containing 1.5 ⁇ 10 5 cpm, 10 ⁇ 9 M) diluted in PBS containing 1% of
  • IPBA Inhibition of the peptide binding test
  • Human anti-peptide CTLs are generated (37). Briefly, 6-8 x 10 7 PBMCs are stimulated with 100 ⁇ g of a synthetic peptide in 10 ml of culture medium (RPMI 1640 supplemented with 100 ⁇ g / ml of penicilin, 100 ⁇ g / ml of streptomycin,
  • T cell epitopes are recognized in association with only a few, if not just one, MHC restriction element.
  • certain peptides can be recognized in association with several molecules of H-2 or HLA.
  • a single peptide can be recognized by MHC-restricted T cells of both class I and class II. Since class I and class II molecules have a similar intended tertiary structure, comprising a single antigenic binding site, the interactions between the peptides and these two molecule sites are also included in the present invention.
  • the present invention encompasses the binding of antigens normally associated with MHC of a single species, such as H-2, to modified determinants of MHC of another species, such as HLA.
  • compositions comprising antigens linked to the modified MHC determinants according to the invention can be based on peptides known to be antigenic in diseases such as AIDS (proteins or peptides ga, nef, vif, rev, vpr or env ), multiple sclerosis (myelin-based proteins), toxic shock (bacteria) or snake venom (antigenic region for a particular snake venom, based on alkaloids and based on proteins; the usual treatment for snake bite is based on the administration of antibodies against a particular venom).
  • diseases such as AIDS (proteins or peptides ga, nef, vif, rev, vpr or env ), multiple sclerosis (myelin-based proteins), toxic shock (bacteria) or snake venom (antigenic region for a particular snake venom, based on alkaloids and based on proteins; the usual treatment for snake bite is based on the administration of antibodies against a particular venom).
  • compositions can be formulated so as to allow the potential for recognition of the target of a cell of an immune system to be redirected specifically to the antigen in presentation with the modified determinant of MHC.
  • libraries made up of different modified MHC determinants according to the invention and associated antigens can be prepared.
  • compositions comprising two or more than two members of the library in any combination or quantity, as if to target different receptors simultaneously or sequentially.
  • peptides combined with haptens in general can be used.
  • Peptides can be combined with metals such as nickel.
  • Peptides can also be combined with carbohydrates.
  • Some chemicals, such as p-benzoyl arsonate, also bind directly to the groove of MHC materials. Appropriate antigens are reviewed by P. Kourilsky and J.M. Claverie in "Advances in Immunology” (1989).
  • the modified MHC determinants of the invention can be loaded with conventional immunotoxins and directed against a T lymphocyte associated with an autoimmune disease in order to deactivate the T lymphocyte.
  • the diphtheria toxin or subsets of these ci and Pseudomonas A toxin are examples of suitable immunotoxins.
  • MHC in combination with a peptide antigen in combination with a peptide antigen
  • the level of peptide antigen loading of the modified MHC determinant is variable.
  • the modified MHC determinant is typically used in an amount of about 10 to about 1000 ⁇ g / ml and the peptide is used in an amount from about 10 to about 1000 ug / ml.
  • the ability of different peptides to inhibit the lytic activity of human antiviral cytolytic T lymphocytes from cells incubated with the corresponding target peptide can also be studied as a measure of the ability and efficiency of binding. antigen and presentation of the antigen. Binding of cells to the MHC / peptide complex
  • the present invention describes, for the first time, the quantification and purification of T lymphocytes from a complex cell population, according to their specificity (Table 1).
  • Table 1 The inventors have in fact shown that MHC / peptide complexes applied as a coating induce the adhesion of antigen-specific T lymphocytes. The use of this technique thus makes it possible to enrich a population of complex T cells with lymphocytes specific for an antigen.
  • the invention was used, in one of its embodiments, for the functional characterization of tumor-specific T lymphocytes, taken from a tumor site. Purified and multiplied T cells were also used to protect animals from tumor development under conditions which are normally lethal in animals.
  • T lymphocytes In a tumor model system (P815-Cw3), it is shown that between 1 and 2% of cells infiltrating the tumor are actually specific for the tumor. However, this small fraction has strong anti-tumor activity both in vitro and in vivo. Thus, once purified by adsorption on SC-Kd / Cw3 complexes and after amplification in vitro, the characteristics of the T lymphocytes provided by the present invention have clear advantages in therapeutic treatments. Likewise, important information in the analysis of the response of T cells to specific antigens in animals can be obtained from the T cells of the present invention. Those skilled in the art recognize the importance of these results in the field of therapeutic approaches to attack tumor development in an animal and diagnostic approaches to identify tumors present in an animal.
  • TILs tumor infiltrating lymphocytes
  • IL-2 tumor infiltrating lymphocytes
  • TIL TIL-like IL
  • Anergy could result from modulation of TCR or CD8, as demonstrated in the case of extrathymic tolerance to auto-antigens (42) and not self-antigens (43).
  • some cells may maintain normal levels of TCR and co-receptor expression, but they have a block in the signal transduction path (44).
  • the inventors demonstrate that it is possible to enrich TILs in T cells specific for a tumor and to increase their cytotoxic activity, even when these specific cells represent a small fraction of those which have infiltrated the tumor.
  • Sorting the specific lymphocytes of a peptide before and / or after amplification in vitro should make it possible to carry out adoptive immunotherapy better controlled in humans and in animals.
  • the soluble single-stranded molecule of HLA-A2 described below, makes it possible to carry out such immunotherapies, as indicated by the results and the data below.
  • the teaching of this publication as a whole can also be used to determine the antiviral responses and to purify specific T lymphocytes from infected cells. by a virus.
  • the isolation of T lymphocytes specific for a peptide by adsorption on MHC / peptide complexes should open new avenues for the analysis of T lymphocyte repertoires by coupling structural approaches and functional studies.
  • recombinant MHC / peptide complexes are used to purify and quantify T lymphocytes according to the specificity of their TCR.
  • P815-Cw3 the highly targeted T lymphocyte response to a P815 mastocytoma transfected with the human HLA-Cw3 gene (hereinafter called P815-Cw3) was studied in DBA / 2 mice (11-13). Since the TCR ⁇ sequences amplified in this response have a very limited diversity, specific T cells could be monitored independently by cytometry or using a PCR technique developed in our laboratory (12, 14). This approach has been extended to solid tumors. Tumor-specific T cells were isolated from a tumor site and analyzed for their structural and functional characteristics.
  • tumor-specific T lymphocytes represent only a small fraction of TIL. After purification by adsorption on specific MHC / peptide complexes, the tumor-specific TILs are reinjected into the recipient animal, where they deploy a powerful antitumor protection.
  • the present invention responds to a need in the art for an efficient method of purification and isolation, in large quantities, of T lymphocytes specific for an antigen.
  • PELs are purified on a percoll gradient and their expression of CD8, CD4 and V ⁇ 10 on the cell surface is analyzed by cytometry, before and after adsorption on SC-Kd / Cw3 complexes.
  • the total number of cells is determined before and after purification.
  • the percentage of the different cell subsets is calculated using version 1.2.1 of the CellQuest software (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalast, Belgium).
  • the absolute number of cells in each subset is obtained by multiplying the total number of cells by the percentage of the subset.
  • the enrichment is obtained by dividing the percentage of the subset of the total cell population after adsorption on SC-Kd / Cw3 by the percentage obtained before adsorption.
  • the yield percentage is obtained by dividing the absolute number of cells in the subset after adsorption of SC-Kd / Cw3 by this same number before adsorption, and multiplying the result by 100.
  • APC antigen presenting cells
  • the soluble single-stranded molecule of human HLA-A2.1 (SC-A2) is obtained by engineering, by connecting the first three domains of the heavy chain A2.I to human b-microglobulin via a spacer having a length of 15 amino acids, and it is secreted into the culture medium by basophilic rat cells (RBL). It can be purified by affinity chromatography using the anti-HLA-A2 monoclonal antibody W6.32 and has biological functions. Purified SC-A2 has been shown to bind specifically to A2-restricted antigenic peptides and does not bind to murine peptides restricted by H2-Kb or H2-Kd.
  • MHC / peptide complexes loaded with a high density on a solid support induce certain CD8 T lymphocytes to produce proliferative responses to produce cytokine (IL-2), and to exhibit cytotoxic activity with respect to peptide antigens defined in vitro.
  • SC-A2 loaded with peptides can induce in vitro primary cytotoxic T lymphocytes (CTL) specific for a peptide, derived from naive PBL HLA-A2.1 cells from healthy donors.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • the MHC / peptide coating complex also acts as APC to elicit primary responses to tumor specific antigens in mice.
  • SC-A2 thus presents characteristics similar to those of SC-Kd with regard to its structure and its function
  • the synthetic peptides that make up a CTL epitope can bind directly to the cell surface of MHC class I molecules. Hence, no intracellular event is involved or required.
  • the association of class I peptides on the cell surface essentially depends on the presence of class I molecules voids which carry poorly bound endogenous peptides. On most cell types, only a small fraction of the total cell surface of the class I molecule is empty. Therefore, charging the cell surface with class I binding peptides is ineffective in most cells.
  • SC-Kd The recombinant MHC class I molecule described above (SC-Kd) was produced and purified as a soluble single-stranded molecule. (See U.S. applications under review 07/801818, 08/487650 and / or 08/370476). Functional SC-Kd can be obtained in large quantities from appropriately transfected CHO cells loaded with the desired peptide.
  • CTLs were determined by analysis of the TCR- ⁇ chain, which revealed rearrangements very similar, and even identical, to those found in CTLs generated by immunization in vivo.
  • These primary CTLs are capable of recognizing an endogenous peptide on a syngeneic tumor cell in mice and of recognizing cells infected with VlH in humans. These CTLs are also used for adoptive cell transfer leading to rejection of tumors in vivo.
  • Co-stimulation is considered critical for optimal induction of T cell responses.
  • Signal 1 works through the antigen-specific TCR complex.
  • Signal 2 depends on an interaction between specialized molecules expressed on the surface of the T cell and their counterparts on the APC (signal 2).
  • the T cells do not need co-stimulation, in particular via the CD28 mediated pathway.
  • an experimental system devoid of cells, for the activation of T cells.
  • SC-Kd loaded with influenza virus HA peptide was used to stimulate highly purified CD8 + naive splenocytes from transgenic mice for a TCR specific for the HA peptide.
  • the results obtained have shown that such an acellular stimulus is sufficient to give rise to cells having an activated phenotype, in a dose-dependent manner.
  • These cells proliferate, secrete cytokines and exhibit cytotoxic activity in the absence of co-stimulation and exogenous IL-2.
  • the invention demonstrates that CD8 + splenocytes can be fully activated by their only TCR engagement.
  • the degree of purity of the CD8 + T cells obtained is very high, reaching 98.5% under the conditions of experimentation.
  • modified MHC class I and class II determinants according to the invention and the compositions comprising antigens linked to the modified determinants, are recognizable by the receptors on T lymphocytes.
  • the antigen and MHC recognition structure of T lymphocytes is here called the T cell receptor.
  • the T cell receptor involved in the recognition of antigens and MHC is characterized in Table 2. Variable regions of the chains a and b form the antigenic binding site and also determine the specificity of the MHC. In the presence of antigens and of MHC, the T lymphocyte is activated. This results in the phosphorylation of at least two subsets of the receptor complex, the chains ⁇ and ⁇ .
  • T4 and T 8 are associated with the recognition of the modified determinants of MHC class I or class II according to the invention, without interacting with the antigen.
  • These molecules can normally bind to non-polymorphic (constant) determinants on products class I or class II genes of the antigen-presenting cell.
  • These molecules can also be associated with the T cell receptor.
  • T helper cells and delayed hypersensitivity effector cells are restricted by MHC class II antigens and molecules; CTL activities are restricted by MHC class I or class II antigens and molecules. Deletion can be restricted by class I or unrestricted.
  • the surface phenotype CD4 or CD8 correlates essentially with the recognition of MHC class II (CD4) or class I (CD8 + ). If we consider the important regulatory role of inducing cells restricted by class II (including all are CD4 + ), it is not surprising that a virus such as the AIDS-related virus, which infects T cells through the CD4 marker and therefore selectively decreases the CD4 population, can cause immunosuppression and other abnormalities in lymphocyte growth seen in AIDS patients.
  • the present invention should make it possible to obtain T lymphocytes specific for cells infected with HIV and to use these cells in research and development relating to the treatment of AIDS.
  • the present invention should also make it possible to imitate the binding of antigens to the ⁇ and ⁇ chains or to theconces receptor chains of T cells. By cross-linking of the receptors with the modified determinant of the invention, the activation of T lymphocytes is facilitated. The present invention thus makes it possible to stimulate or strengthen the function of the immune system.
  • the invention therefore more specifically relates to methods, products and kits using MHC / peptide complexes. It thus relates to a method for detecting the presence or absence of an antigen-specific lymphocyte, comprising the steps consisting in providing a complex comprising a modified determinant of the major histocompatibility complex (MHC), in association with an antigen specific peptide; coupling said complex to a solid support;
  • MHC major histocompatibility complex
  • the determinant of the modified MHC used is advantageously present in the form of a dimer or of a higher order polymer, or of an aggregate.
  • the antigen is advantageously chosen from the group of antigens essentially formed by antigens associated with tumors, antigens derived from a parasite, antigens derived from bacteria and antigens derived from viruses such as VlH, influenza, CMV, HPV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis non-A non-B and Hepatitis C.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence or absence of a tumor-specific T lymphocyte, comprising the steps consisting in providing a complex comprising a modified molecule of the major histocompatibility complex, in association with a specific tumor antigen; coupling said complex to a solid support; incubating said complex coupled to a solid support with a biological sample; and detecting the presence or absence of a T cell linked to the complex coupled to a solid support.
  • the incubation further includes a period of about 3 hours at about 4 ° C, with or without gentle agitation, and detection further includes the use of a magnetic particle concentrator.
  • the method of obtaining, isolating or purifying an antigen-specific T lymphocyte also forms part of the invention.
  • This method includes the steps of providing a complex consisting essentially of a modified determinant of the major histocompatibility complex in association with a peptide antigen; coupling the complex to a solid support; incubating said complex coupled to the solid support with a biological sample, so that T cells can bind to the complex coupled to the solid support; and to separate bound T cells from other cells.
  • Also within the scope of the invention is a method of preparing an antigen-specific cytotoxic T cell, comprising the steps of providing a complex comprising a modified determinant of the major histocompatibility complex in association with an antigen; coupling the complex to a solid support; and contacting the complex coupled to a solid support with a primary lymphocyte.
  • the antigen used is advantageously chosen from the group of antigens essentially constituted by tumor specific antigens, antigens derived from HIV, antigens derived from influenza virus and an antigen derived from bacteria.
  • an antigen chosen from the group of antigens essentially constituted by antigens associated with tumors, antigens derived from a parasite, antigens derived from bacteria, and antigens derived from viruses such as VlH , influenza, CMV, HPV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis non-A non-B and Hepatitis C.
  • the invention also provides a method for killing a cell, containing a tumor specific antigen, comprising the step of contacting a cytotoxic T lymphocyte as obtained by the above method of preparing antigen-specific cytotoxic lymphocyte with a cell containing a tumor specific antigen under physiologically acceptable conditions.
  • the invention also relates to a method for introducing a cytotoxic T lymphocyte into an animal or to humans, comprising the step consisting in providing a cytotoxic T lymphocyte as obtained by the above method for preparing a lymphocyte antigen-specific cytotoxic and to inject the cytotoxic T lymphocyte into humans or animals, together with a physiologically acceptable solution, vehicle or excipents.
  • the invention also relates to a method of anergization of an antigen-specific T lymphocyte, comprising the step consisting in bringing the T lymphocyte into contact with a composition comprising a modified MHC determinant, in monomeric form in association with a peptide antigen. .
  • the invention also includes a method of eliminating an antigen-specific T cell population, comprising the steps of providing a complex comprising a modified MHC determinant, in association with a peptide antigen; coupling said complex to a solid support; and introducing said complex coupled to a solid support into a population of T lymphocytes.
  • the peptide antigen is advantageously covalently linked to the modified MHC determinant or to a spacer of the modified MHC determinant.
  • the modified MHC determinant is advantageously present in the form of a dimer or of a higher order polymer or of an aggregate.
  • the invention further comprises a recombinant MHC molecule, comprising SC-A2 or SC-Kd.
  • a recombinant MHC molecule biologically functional, having the activity of stimulating T lymphocytes and of antigen presentation of a natural HLA-A2 molecule, comprising one or more domains of the heavy chain of HLA-A2 linked, covalently or otherwise, to a ⁇ 2-microglobulin, or to a fragment of ⁇ 2-microglobulin, via a flexible spacer region.
  • the invention further relates to a diagnostic method for determining the concentration or the relative amount of soluble MHC class I or class II molecules in a sample, comprising the steps consisting in using a recombinant molecule, such as as defined above, as a standard reference, contacting the sample with antibodies specific to MHC or microglobulin, or both, and determining the amount of binding in the sample, compared to binding of the recombinant molecule.
  • a diagnostic method for determining the concentration or the relative amount of soluble MHC class I or class II molecules in a sample comprising the steps consisting in using a recombinant molecule, such as as defined above, as a standard reference, contacting the sample with antibodies specific to MHC or microglobulin, or both, and determining the amount of binding in the sample, compared to binding of the recombinant molecule.
  • the recombinant molecule is in monomeric or dimeric form or, preferably, as a polymer in aggregates of these forms.
  • the invention further relates to the use of such a molecule in a method for stimulating and selectively developing a specific CTL clone from a source of T lymphocytes, comprising the step of bringing the recombinant charged molecule into contact. of a specific peptide with a T lymphocyte
  • compositions comprising a recombinant molecule, as defined above, advantageously in the forms indicated, and a solid support are also targeted by the invention.
  • the solid support can be formed of magnetic beads.
  • a method of using a composition, as defined above, for inducing peptide-specific primary CTLs in vitro comprising the step consisting in incubating such a composition with a peptide, followed by the step consisting in bringing the composition into contact with a naive PBL.
  • This method advantageously comprises the addition of a stimulating cell, such as a peptide activated conA-blast.
  • the CTLs thus obtained are advantageously used to bind an antigen-carrying cell.
  • a method for producing specific anti-HLA antibodies comprising the step consisting in introducing a recombinant molecule, as defined above, into an animal and in isolating or purifying antibodies derived from the serum of the animal.
  • a method of producing an immunoglobulin producing cell by an animal comprising introducing a recombinant molecule, as defined above, into an animal and isolating or purifying the cell.
  • the invention also relates to a diagnostic kit intended to identify the presence or absence of a specific anti-HLA antibody in a sample, comprising a recombinant molecule, as defined above, and a detection means for detecting the binding antibodies specific to the recombinant molecule.
  • It also relates to a diagnostic method intended to identify peptides which can be presented by an A2 molecule to result in an immune response in a lymphocyte, comprising putting a recombinant molecule, as defined above, in association with a peptide , in contact with a lymphocyte and to seek an immune response.
  • the invention also relates to a method of using a recombinant molecule as defined above to stimulate a specific immune response ex vivo or for direct activation of lymphocytes in vivo by injection of the molecule in the form of any support coating.
  • Figure 1 shows the orientation of a MHC class I molecule and a ⁇ 2 ⁇ microglobulin in a cell membrane.
  • Figure 2 shows the orientation of the MHC class II molecule in a cell membrane.
  • FIG. 3A schematically represents a modified determinant of MHC class I.
  • FIG. 3B is a block diagram representing a modified determinant of MHC class I and a spacer covalently binding the MHC gene products to ⁇ 2 - microglobulin.
  • Figure 4A shows a modified MHC class II determinant.
  • Figure 4b is a block diagram showing the domains of a modified MHC class II determinant linked by spacers.
  • FIG. 5 Selective adsorption of T hybridoma cells to MHC / related peptide complexes.
  • the T 9.4 hybridoma cells (specific for K d / Cw3) are labeled by incorporation of [methyl- 3 H] -thymidine and are incubated with magnetic beads (in a ratio of the beads to the cells of 5: 1) coupled at SC-K d responsible for peptide indicated. Then, the cells are separated magnetically with a magnetic particle concentrator. The cell yield is determined by measuring the radioactivity associated with the beads. The mean and standard deviations of the experiments carried out in triplicate are shown.
  • FIG. 6 represents the selective purification of PEL expressing V ⁇ 10, by adsorption on SC-K d / Cw3.
  • the ELPs are purified by adsorption on SC-K d / Cw3 and the expression of V ⁇ 10 is analyzed by cytometry.
  • the solid line histogram corresponds to the ELPs adsorbed on SC-K d / Cw3.
  • the dashed profile corresponds to the ELPs before adsorption.
  • FIG. 7 represents the clonal expression and the purification of TIL specific for K d / Cw3, analyzed by PCR.
  • T cells specific for K d / Cw3, having the characteristic length of CDR3 ⁇ (6 amino acids) can already be identified before purification (panels c and d).
  • Splenocytes from naive DBA / 2 mice (panels a and b) are shown as examples of non-immune animals.
  • the TK d / Cw3-specific lymphocytes are purified efficiently and specifically (panels e and f).
  • FIG. 8 represents TILs purified by adsorption on related MHC / peptide complexes, exhibiting an increased CTL activity.
  • the CTL activity of purified (b and d) and non-purified TIL (a and c) is tested on P815 (white squares) and P815-Cw3 (black squares) before (a and b) or after (c and d) amplification for 10 days in vitro.
  • FIG. 9 represents TILs purified by adsorption on MHC / related peptide complexes, exhibiting an increased antitumor activity.
  • mice are injected subcutaneously with a lethal dose of P815-Cw3 (panel a), P815 (panel b) or P198 (panel c). After 6 days, the mice are administered intravenously 10 7 non-purified TILs (white squares), originating from an identical tumor, or the same number of TILs having been purified by adsorption (black squares) on either SC-
  • Figure 10 shows the nucleotide and amino acid sequence of SC-A2-15.
  • Figure 11A shows the gel (lanes 1-4) designating SC-A2 immunoprecipitate, the arrow indicating the size expected for SC-A2.
  • FIG. 11B represents a gel indicating the comparisons A and B of SC-A2 versus SC-Kd.
  • Figure 12 shows an A2.1 binding test.
  • a test intended to quantify binding peptides A2.1, based on the inhibition of standard F10V peptides labeled by radioactivity with SC-A2 molecules, as described in the section Testing for peptide bonds.
  • FIG. 13A represents the specificity of CTLs induced by primary induction in vitro using beads coated with SC-K d / Cw3 peptide complexes as antigen presenting cells (APC).
  • Figure 13B shows the specificity of CTL induced by primary induction in vitro using beads coated with peptide complexes SC-L d / P1A, as antigen presenting cells (APC).
  • the primary CTLs specific for P1A specifically lyse the P815 tumor cells which express the P1A gene (triangle) well, while there is very little non-specific lysis with P1204, which do not express the P1A gene (square).
  • Figure 14 The absence of macrophage cells has no influence on the primary in vitro induction of peptide specific CTL using beads coated with SC-A2 / Pol-VlH peptide complexes as cells artificial antigen presenting (APC).
  • APC artificial antigen presenting
  • MAGE-3 specific CTLs can be induced from naive HLA-A2 PBL cells ( square) as well as naive PBL HLA-A2 cells lacking macrophage cells. In both cases, a low non-specific lysis is obtained when using beads coated with only the MAGE-3 peptide but without SC-A2 molecules as APC (circle) of naive PBL HLA-A2 cells (triangle) naive PBL HLA-A2 depleted in macrophage cells.
  • Figure 16 Schematic representation of modified MHC molecules or determinants.
  • the nucleotide sequence of the DNA insert comprising the recombinant determinant of MHC SC-A2 with a spacer of 15 amino acids (the first three domains of A DNc of the heavy chain of HLA-A2.1 fused to the sequence encoding human ⁇ 2-microglobulin via a flexible linker of 15 amino acids).
  • Figure 17 Surface plasmon resonance of the SSC-A2 molecule using mAb BB7.2 (anti-HLA-A2, -A69) and B2C16.2 (human anti- ⁇ 2 -microglobulin). These results indicate that the molecule has both HLA-A2 and human ⁇ 2 -m serological determinants.
  • Figure 18A Binding of radiolabeled F10V molecules to sSC-A2.
  • the labeled peptide binds to the sSC-A2 sample (shaded bar) and does not bind to the control (in solid lines).
  • Figure 18B Competitive inhibition of the binding of peptides to SSC-A2 molecules.
  • Peptides restricted by HLA-A2 F10V, 19V and A9L
  • Figure 19 Direct incorporation of 3 H-thymidine or secretion of IL-2 by CTL NA17 221, showing the proliferative response of CTL to the appropriately restricted peptide. Specific stimulation is measured in terms of direct incorporation of H-thymidine by CTLNA 17221
  • Figures 20A and B cytotoxic activity on different T2 target cells loaded with peptide for CTL stimulated with SSC-A2 / M58-66 complexes. The results indicate specific lysis of cells carrying the appropriate peptide.
  • Figure 21 Analysis of the TCB VB17 and VB2 repertoires using very sensitive immunoscopy technology.
  • panels A and B a major peak is observed in the VB17 repertoire corresponding to a CDR3 of 8 amino acids long, indicating a dominant expansion of specific CTL in correlation with the specific lysis M58-66 shown in FIG. V ⁇ 2 of panels A and B present a polyclonal repertoire by its Gaussian profile.
  • the non-stimulated cell control, panel C also exhibits a Gauss type profile.
  • Figure 22 Specificity of a peptide binding assay restricted by HLA-A2.1.
  • 22A the binding of the radiolabelled F10V peptide to SC-A2 molecules has been shown and in 22B, the inhibition of competition of the binding of peptides to SC-A2 molecules
  • Figure 23 Direct incorporation of H-thymidine or IL-2 secretion by CTL NA 17221 showing a proliferative response of CTL to the appropriately restricted peptide
  • Figure 24 Induction of specific CTLs by SC-Kd / peptide complexes coupled to beads or dendritic cells
  • Figure 25 Induction of specific CTLs by SC-A2 / peptide complexes coupled to beads
  • Figure 26 TCR-BV10 directory of CTLs induced with SC-Kd / CW3 complexes coupled to beads and with CW3-activated dendritic cells
  • Figure 27 TCR BV17 and BV2 directories of CTL induced by SC-A2 / M 58-66 coupled on beads.
  • Figure 29 Dose-dependent, peptide-specific adhesion of hybridoma 9.4 on dKd-Cw3 plates
  • Figure 30 Partial inhibition of adhesion mediated by dKd-Cw3 of hybridoma 9.4, by protein kinase inhibitors
  • Figure 31 Selective purification of hybridoma 9.4 cells by dimerized MHC / peptide complexes applied as a coating
  • Figure 32 selective enrichment of naive T cells V ⁇ 8 +, CD8 +, specific with respect to Kd-HA complexes
  • Figure 33 Induction of proliferation of CD8 + cells purified by SC-Kd / HA complexes used in coating.
  • Figure 34 CD8 + cell proliferative responses, dependent on SC-Kd / HA stimulus, not requiring CD28 / B7 interaction.
  • Figure 35 Presence of an activated phenotype on CD8 + splenocytes after stimulation by SC-Kd / HA
  • Figure 36 Proliferative response to SC-Kd / HA proportional to the number of CD8 + splenocytes.
  • Figure 37 Obtaining a cytotoxic response with CD8 + splenocytes activated by SC-Kd / HLA.
  • Example 1 Detection, obtaining purification of antigen-specific T cells - Stimulation of T cells
  • Soluble single-stranded human HLA-A2.1 molecules are prepared by engineering by connecting the first three domains of the heavy chain A2.1 to human ⁇ 2-microglobulin via a spacer of 15 amino acids. , and they are transfected into rat basophil cells (RBL-2H3).
  • the secreted sSC-A2 is purified in the culture medium by affinity chromatography, using the anti-HLA-ABC monoclonal antibody W6.32, having biological functions.
  • the purified sSC-A2 molecules specifically bind to A2-restricted antigenic peptides.
  • the SSC-A2.1 peptide complexes interact with the appropriate T cell receptor and elicit a proliferative response from peptide-specific cytotoxic T cells.
  • peptide-loaded sSC-A2 complexes are applied with high density to beads and used as antigen-presenting artificial cells to obtain peptide-specific CTLs from naive PBL HLA-A2 cells. 1 from healthy donors.
  • These complexes prove to be very effective stimulators and induce peptide-specific CTLs exhibiting a powerful ability to kill, restricted by HLA-A2.1, cells activated by antigen.
  • the induced peptide-specific CTL T cell receptor uses the same, as peptide-specific CTLs derived from in vivo immunization. The evidence we see here indicates the usefulness of the modified MHC molecules at the functional level, i.e.
  • SSC-A2 molecules in: i) peptide bond intended to identify immunogenic peptides, based on the selection of MHC binders of high affinity from known antigens associated with a tumor, ii) the primary in vitro induction of CTL capable of killing tumor cells, thus allowing a detailed analysis of the repertoire of primary human CTLs, or the production of specific CTL effector cells for adoptive immunotherapy or the dissection of the cellular and molecular conditions required to prime naive human CTLs.
  • the SC-A2 construct which comprises the signal sequence and the first three domains of the HLA-A2.1 heavy chain cDNA, fused to the coding sequence of human ⁇ 2-microglobulin via a linker flexible 15 amino acid, is shown in Figure 16.
  • This construct is cloned into the mammalian expression vector pRc / CMV, under the control of the promoter of the immediate early gene of human cytomegalovirus, and then transfected into RBL cells -2H3. Stable transfectants are selected for their resistance to the antibiotic G418. Resistant clones are sorted by PCR for integrated gene construction. The production of sSC-A2 molecules by the clones having a high number of copies of integrated genes is analyzed.
  • the purified SC-A2 molecule has a correct conformation sSC-A2 secreted in the culture medium is purified by immunoaffinity chromatography, using anti-HLA-ABC mAb W6 / 32, and it is characterized by the plasmon resonance of surface, using mAb BB7.2 (anti-HLA-A2, -A69) and B2C16.2 (anti- ⁇ 2- human microglobulin).
  • the results presented in FIG. 17 show that the purified molecule has the two serological determinants that are HLA-A2 and that derived from human ⁇ 2-microglobulin.
  • a panel of seven antibodies is subjected to an ELISA test on purified sSC-A2.
  • This panel includes five mAbs specific HLA, namely W6 / 32 (anti-HLA monomorphic), BB7.2 (anti-HLA-A2, -A69), 5H7 (anti-HLA-A2, 3 rd domain), PA2. 1 (anti-HLA-A2) and two mAbs specific for human B2-m, B2C16.2 and BBM.l. All the mAbs tested react alone or in sandwich tests (anti-HLA-A2 / anti- ⁇ 2-human microglobulin) with the recombinant molecule, thus demonstrating that recombinant sSC-A2 is folded correctly.
  • SSC-A2 / peptide complexes can specifically activate related CTL cells.
  • the ability of the recombinant SSC-A2 molecule to act as an antigen presenting molecule is evaluated.
  • the purified sSC-A2 is loaded with a peptide NA17-A (a peptide located in an intron of the gene coding for N-acetylglucoseaminyltransferase V, expressed in the tumor cell line NA17-MEL derived from metastatic melanomas of patients NA17) (82).
  • SSC-A2 / NA17-A complexes are then used in their monomeric or dimeric form (the dimerization is carried out by incubation of SSC-A2 / NA17-A with the specific anti-human b2-m mAb, in a ratio of 2/1) and their capacity to stimulate a clone of CTL restricted by HLA-A2 (CTL NA17-221) specific for the peptide NA17-A (82) is tested.
  • the specific stimulation is measured by direct incorporation of 3 H-thymidine by the CTL NA17 221 (FIG. 19a) or by secretion of IL-2 (FIG. 19b).
  • peptide activated conAblasts are optionally used as stimulator cells.
  • the TCR V ⁇ repertoire was analyzed using the very sensitive immunoscopy technique (91, 92).
  • the repertoires of TCR V ⁇ 17 and V ⁇ 2 represented in the figures (21a and 21b) are those of a population of T lymphocytes for which the lytic activity is presented in the figures (20a and 20b).
  • the appearance of identical, unstimulated PBL control cultures is shown in Figure 21c.
  • the typically Gaussian shape indicating a polyclonal repertoire is observed in FIGS. 21a, 21b and 21c.
  • this Gaussian profile is greatly modified.
  • Murine single-stranded molecules K d are prepared by engineering by connecting residue 276 of the heavy chain K d to the first residue of ⁇ 2 - microglobulin via spacers of different lengths, and we carry out their intracellular expression in COS-1 monkey cells. It turns out that the labeled SC-K molecules react with several monoclonal antibodies which recognize the native K d molecules.
  • SC-K d -15 (with a del5 spacer) in more depth. It can be purified and has been shown to take up a structure of the native type after treatment with denaturing agents. The purified SC-K d -15 can bind to certain peptides qualitatively similar to K d . Plasmid constructs.
  • K d cDNA (Lalanne, J.-L., Delangle, C., Gachelin, G. and Kourilsky, P., Nucleic ⁇ cids Res., 1983, 11: 1567) is cut with Hind III (at residue 276) and fused in phase, by a linker coding for Gly-Gly, to the cDNA of ⁇ 2 -m (Daniel, F., Morello, D., LeBail, O. , Chambon, P., Cayre, Y. and Kourilsky, P., EMBO J. 1983.
  • COS-1 cells (about 3.5 x 10 6 cells on 60 mm plates) cultured in DMEM supplemented with 10% newborn serum, penicillin, streptomycin and L- are transfected glutamine, one day after spreading on the plates, with 0.5 ml of a calcium phosphate mixture containing 5 ⁇ g of plasmid DNA purified with CsCl.
  • the efficiency of the transfections is measured from time to time with the plasmid pCH110.
  • expressing the ⁇ -galactosidase of E. coli (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
  • BSA 10 mg / ml containing 20 mM iodoacetamide and 1 IU / ml of aprotinin.
  • the lysates are purified beforehand on protein A-Sepharose for 1 hour at 4 ° C and the culture supernatants (SN) are incubated for 18 hours at 4 ° C with either 30 ⁇ l of culture SN or 5 ⁇ l of purified mAb and protein A-Sepharose.
  • the beads are washed three times and the proteins are eluted in Laemmli buffer with 2-ME and analyzed by SDS-PAGE on 12% gels.
  • the gels are fixed, treated with Amplify (Amersham Int., Amersham, GB), dried and viewed by autoradiography using an XAR X-ray film from Kodak (Rochester, NY).
  • Amplify Amersham Int., Amersham, GB
  • XAR X-ray film from Kodak (Rochester, NY).
  • Endo H treatments with endoglycosidase H (Endo H)
  • the samples are balanced in 0.5% SDS, 2-ME 1 M, they are brought to the boil for 2 minutes, they are precipitated with trichloroacetic acid at 15%, they are rinsed with acetone and they are resuspended in 50 ⁇ l of 50 mM sodium citrate, 'p H 5.5, 0.1% SDS, 20 mM 2-ME.
  • Endo H (Boehringer Mannheim, Mannheim, RFA) is added to a final concentration of 150 mU / ml, the samples are incubated at 37 ° C for 24 hours and then analyzed by SDS-PAGE. Purification by immunoaffinity of the protein SC-K d -15. COS-1 cells are transfected (usually
  • the binding tests are carried out as described by Choppin, J., Martinon, F., Gomard, E., Bahraoui E., Connan F., Bouillot, F. and Levy, JP, in J. Exp. Med. , 1990, 172: 889.
  • the molecules of DR3, Drwl3 and K d are also purified and iodized as described by Choppin, J., Martinon, F., Gomard, E., Bahraoui E., Connan F., Bouillot, F. and Levy, JP, in J. Exp. Med. , 1990, 172: 889.
  • Gene constructs Gene constructs.
  • the C-terminal part of the heavy chain K d truncated in the hinge region is attached to the N-terminal part of ⁇ 2 -microglobulin with an appropriate spacer.
  • K d Prochnicka-Chalufour, J.-L., Casanova, J.-L., Kourilsky, P. and Claverie, J.-M., Re ⁇ . Immunol., 1989, 140: 133
  • HLA-A2 of Bjorkmann et al.
  • Bjorkmann, PJ, Saper, MA, Samraoui, B., Bennet, WS, Strominger, JL and Wiley, DC, Nature, 1987. 329: 506 the minimum length of a polyglycine-type spacer is estimated at 11 residues, starting from residue 276 in the amino acid sequence K (which allows the use of an appropriate restriction site in l 'CDNA of K d ).
  • Two full length cDNA clones encoding K are linked (Lalanne, J.-L., Delarbe, C., Gachelin, G. and Kourilsky, P., Nucleic idscids Res., 1983. 11: 1567) and b2-microglobulin (Daniel, F., Morello, D., LeBail, O., Chambon, P., Cayre, Y. and Kourilsky, P., EMBO J. 1983. 2: 1061) by synthetic oligonucleotides encoding for spacers. The latter have been designed in the form of several repeating patterns of glycine and serine (see the Plasmid Constructions section).
  • a series of cDNAs encoding pSC-K d is thus obtained with spacers of 2, 10, 13, 15, 17, 19 and 21 amino acid residues.
  • the verified sequences are represented in FIG. 5 of the US application under examination serial number 07/801 818.
  • Expression of SC-K d in transfected monkey COS-1 cells COS-1 cells (in which the recombinant plasmids can replicate) are temporarily transfected for 36 hours and labeled with 35S methionine for 4 hours. SC-K d molecules are not directly detectable by electrophoresis of SN or cell extracts.
  • mAb 34-1-2 can be used for immunoprecipitation.
  • FIG. 6B shows the bands of SC-K d -2 and SC-K d -15 precipitated by mAb 20-8-4.
  • the exact specificity of 97-G is not known, but it turns out that the epitope recognized by 20-
  • K d includes residues 82 and 89 belonging to the first domain of K d (Abastado, J.-P., Jaulin, C., Schutze, M.- P., Langlade-Demoyen, P., Plata, F., Ozato, K. and
  • the band of precipitated SC-K d -2 is always 5-10 times less intense than that obtained with the molecules of SC-K d comprising longer spacers.
  • the Gly-Gly spacer is not likely to allow a correct association of ⁇ 2 -microglobulin with the heavy chain.
  • a 12 kDa band, probably monkey ⁇ 2-microglobulin, is co-precipitated in relatively higher amounts with SC-K d -2 than with other SC-K d ( Figure 6D). This suggests that monkey ⁇ 2 -microglobulin may be better.
  • a solid phase matrix consisting of 34-1-
  • K d molecules isolated from the spleen of BALB / c mice are then purified and iodized. They are purified by affinity chromatography on a column of mAb 20-8-4 and the binding of peptides to this latter and to SC-K d -15 labeled with 35S in the test by Bouillot et al. (Bouillot, M., Choppin, F., Papo,
  • the peptide env 312-327 binds to the two molecules, but three peptides known to be immunogenic (HLA-A24 170-182, HLA-Cw3 170-182 and influenza NPR-147-158; (Maryanski, JL , Pala, P., Cerottini, J.-C. and Corradin, G., J. Exp. Med., 1988. 167: 1391 and Bodmer, HC, Pemberton, RM, Rothbard, JB, Askonas, BA, Cell, 1989. 52: 253), do not exhibit a detectable bond, either to SC-K or to the molecules of K d .
  • SC-K d -15 binds to peptides from VlH approx 312-327 and vpr 68-80 in one significant proportion, although somewhat less efficient than conventional K d (but the optimal conditions may be different for K d and for SC-K d - 15 and no effort has been made to optimize binding to SC -K d -15 at this stage).
  • this example demonstrates that the engineering of single-stranded K d molecules which exhibit the expected properties with regard to (a) reactivity with three mAbs, one of which identifies the correct association with ⁇ 2 -microglobulin and a other, an epitope belonging to the first domain, (b) efficient folding by treatment with 3M sodium thiocyanate or 6M urea, and (c) binding of certain peptides. Above approximately 10 residues, the length of the spacer between the heavy chain of K d and the murine ⁇ 2 -microglobulin does not seem decisive. All the experiments described were carried out with quantities infinitesimal of metabolically labeled SC-K d molecules. Production in large quantities should lead to material usable for studies on the binding of peptides and TcR.
  • a soluble H-2K d molecule, single-stranded MHC class I (SC-2K d ) molecule, was constructed by connecting the C termination of the ectodomain of the native H- 2K d molecule to the N termination of ⁇ 2 -microglobulin. murine via a spacer having a length of 15 amino acids [Mottez, 1991].
  • this chimeric molecule is soluble in the absence of detergent and it is homogeneous with respect to ⁇ 2-microglobulin of murine origin.
  • the T lymphocyte hybridoma 9.4 is obtained by fusion between the 58 hybridomas of ⁇ - ⁇ -T lymphocyte [Letourneur, 1989] and the CTL clone CW3 / 1.1 [Maryanski, 1986] specific for the Cw3 peptide presented by H-2K d .
  • the peptides Cw3, NP and PbCS have been described previously [Maryanski, 1991].
  • the monoclonal antibodies SF1-1.1.1 (ATCC HB159), 20-8-4 [Abastado, 1987], F23.1, H57 have been described previously and are specific for H-2K d , H-2K d , the V ⁇ 8 domains * and C ⁇ of TcR, respectively.
  • Fab and F (ab ') 2 fragments are prepared as described by Harlow, 1988.
  • the basophilic cell line RBL-2H3 is transfected as described by Engel et al., 1992.
  • the secretion of IL2 in the supernatant is measured by its ability to support proliferation of the IL-2 dependent CTLL cell line.
  • the proliferation of CTLL is measured by incorporation of 3 H-thymidine.
  • SC-K d single strand acts as an antigen presenting molecule.
  • load purified SC-K d with a peptide derived from HLA-Cw3 (hereinafter called Cw3), it is spread out on a microtiter plate and its ability to stimulate a hybridoma restricted by H-2K d specific for the Cw3 peptide is tested.
  • a specific stimulation is observed, detected by the secretion of IL2 in the culture medium. This activation is specific for the peptide, since SC-K d loaded with an unrelated peptide (PbCS) shows no activity.
  • SC-K d To act as an antigen presenting molecule, SC-K d must be at least dimer. Numerous in vitro studies, using anti-TcR antibodies as stimulators of T lymphocytes, indicate that a cross binding of TcR is necessary for the activation of T lymphocytes [Kolanus, 1993 # 690]. However, it is not clear if and how TcR aggregation occurs under more physiological conditions, especially when TcR recognize MHC / peptide complexes. The fact that thousands of different peptides are presented by the same APC [Engelhard, 1994] seems to exclude the formation of large and stable plaques of crosslinked TcRs.
  • SC-K d / Cw3 complexes are incubated with Fab or F (ab ') 2 fragments, prepared from MAb SFl-1.1.1, before addition to hybridoma cells 9.4. While the Fab fragments have no effect, the F (ab ') 2 fragments are as effective as the native immunoglobulin in stimulating the T cell hybridoma.
  • the SC-K / peptide complexes are first mixed with the mAb SFl-1.1.1 and then they are added to those of T hybridoma. In the other case, they are first incubated with the T cell hybridomas and then, the mAb SF1-1.1.1 is added.
  • the increase in the concentration of SC-Kd / PbCS leads to a progressive loss of activation of T lymphocytes. The loss of activation of T lymphocytes probably results from a reduction in the number of homodimers. from SC-K d / Cw3. After 3 hours, unbound SC-Kd is removed by careful but thorough washing.
  • the antibody SFl-1.1.1 is then added and the response of the T lymphocytes is measured after an additional incubation of 16 hours. As shown in Figure 5, even when the K d -specific antibody is added after removal of unbound SC-K d , the cells respond by secreting IL2 into the culture medium. This indicates that the dimerization of SC-K d is necessary for the action of T lymphocytes, and not for the binding of TcR. Single-stranded SC-K d molecules activate basophilic rat RBL cells transfected with TcR- ⁇ fusions. Since the affinity of TcR for MHC is quite low, it has been suggested that accessory molecules are necessary to stabilize the interaction.
  • such molecules could help T lymphocytes to search for antigen presenting cells of the appropriate type, to establish the primary cell conjugate and then, the MHC / peptide complex could transmit the activation signal via TcR. .
  • TcR TcR
  • purified MHC molecules have enabled the inventors to demonstrate that the SC-K d dimers loaded with a specific peptide interact with the TcRs in the absence of accessory or co-receptor molecules.
  • purified soluble MHC molecules are used, it is not possible to fully demonstrate the involvement of accessory molecules in the activation of the T lymphocyte hybridoma 9.4.
  • CD8 molecules can bind to the soluble single-stranded molecule and increase the apparent avidity of the MHC complex for the T lymphocyte hybridoma. Engel (1992) recently developed a cellular system in which the interaction of
  • MHC / peptide with TCR can be measured in the absence of accessory molecules.
  • the constructs obtained are transfected into the basophilic rat cell line RBL-2H3 and the transfectants are analyzed by flow cytometry using H57 anti-V ⁇ f b 10 antibodies. As shown in FIG. 6, high levels of expression on the cell surface are detected. This transfectant is used to test the ability of
  • the single-stranded molecule K d described here is fully functional and can activate an antigen-presenting molecule to stimulate T-cell hybridomas.
  • SC-K d dimerization, polymerization or aggregation of SC-K d or in general.
  • SC-K d is dimerized using the following protocol. Purified SC-K d (0.5 mg / ml) is incubated for 2 hours at 4 ° C. with Ab. Dimerization may be necessary for the activation of RBL cells transfected with TCR. Abastado et al., J. Exp. Med. flight. 182, p. 439, August 1995, show that this condition can also apply to hybridomas of T lymphocytes.
  • dimerization is a routine practice to carry out in vivo stimulation of T lymphocytes.
  • other means or forms of aggregation can also be attempted.
  • the same dimerization or aggregation procedures, or similar procedures, can be followed in order to transform the dimers into higher aggregates of modified MHC determinants or MHC molecules described in the present invention.
  • dimerized MHC determinants are incubated for approximately one hour at approximately room temperature with an equal amount of dimerization antibodies, but at a concentration of approximately 100 ⁇ g / ml or higher.
  • soluble Kd and Ld Preparation of soluble Kd and Ld.
  • a modified MHC determinant which can be used in the present invention, is the sequence SC-Kd of US application under examination serial number 07/801 818, filed December 5, 1991 (described above).
  • the SC-Kd sequence is cloned into an amplifiable expression vector pFRSV and transfected into Chinese hamster ovary (CHO) cells.
  • CHO Chinese hamster ovary
  • the Kd secreted in the culture supernatant is measured by ELISA on microtiter plates coated with SF1.1.1 and the plates are revealed with biotinylated 20-8-US and streptavidin labeled with horseradish peroxidase. (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Strong producing transfecting clones are cultivated in a roller bottle in an a-MEM medium supplemented with 2% SFV.
  • the SC-Kd molecules are purified by affinity chromatography on protein A-Sepharose coupled to the mAb SFl-1.1.1. Before use, the SC-Kd preparations are subjected to ultracentrifugation for 1 hour at 200,000 g to remove any aggregate.
  • the SC-Kd molecules are loaded with the antigenic peptide and dimerized using the mAb SFl-1.1.1. We operate so as to obtain a ratio of one for one.
  • the dimers are purified by filtration on high performance gel Superose GHR (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) with a flow rate of 0.135 ml per minute of PBS.
  • Soluble Ld is purified by affinity chromatography using mAb 30-5-7 from the culture supernatant of transfected Drosophila melangaster cells. Immediately after the purification, SC-Kd or Ld molecules are loaded with the peptides indicated in a molar ratio of 1 to 1. Coupling of MHC / peptide complexes to solid supports. The MHC / peptide complex thus obtained is coupled to an appropriate solid support.
  • supports such as plastic culture flasks or latex beads.
  • Various other supports known in the art can also be used, such as gel matrices, glass beads, beads coated with liposomes.
  • magnetic beads (Dynabeads M450 tosylactivated) (Dynal AS Oslo, Norway) are used. Coupling to magnetic beads and microtiter plates is described here in both cases, by way of example.
  • tocylated Activated Dynabeads M450 are coupled to AcM SFl-1.1.1 or 30-5-7, following the manufacturer's instructions. It is important to note that the beads can be activated effectively by other means. The important limitation is that the orientation of the MHC / peptide complex must facilitate the binding to T lymphocytes.
  • the antibodies are bound to the support before the binding of the MHC / peptide complex in order to increase the density of the MHC / peptide complexes on the beads and favor the orientation of the complex. Although antibodies have been used, their use is for illustrative purposes only. Other specific link partners, which preserve link efficiency and orientation, are also applicable. In short, 150 ⁇ g of purified antibody are incubated with
  • the magnetic beads coupled to SFl-1.1.1 are incubated with an excess of SC-Kd molecules loaded with a peptide of the PbCS type labeled with 125 I, with a specific activity of 2 ⁇ 10 12 Bq / mmol (16). After careful washing, the radioactivity associated with the beads is measured and used to calculate the amount of coupled SC-Kd.
  • the anti-Kd mAbs SF1-1.1.1 (HB159; American Type Culture Collection, Rockville, MD) and anti-Ld mAbs 30-5-7 on protein A-Sepharose are purified from the culture supernatant or ascites fluid, respectively.
  • Anti-V ⁇ 10 conjugated to PE and anti-CD8 conjugated to FITC antibodies are available from Pharmingen (San Diego, CA).
  • the AcM SFl-1.1.1 is specific for the ⁇ 3 domain of Kd.
  • T Lymphocytes including the antigen-specific T lymphocyte are known in the art and can be used. Generally, specific tissue is taken from animals known to have the antigen-specific T lymphocyte, by prior characterization or deliberate introduction of the antigen or vector associated with the antigen, or biopsies are done. Two examples, relating to PEL and TIL, will be described below.
  • Peritoneal exudate (ELP) lymphocytes can be prepared by any method known in the art.
  • 10 7 P815 tumor cells are injected intraperitoneally. A second injection is made 8 days later. Ten days after the second injection, the cells are collected in the peritoneal cavity and purified on a gradient of
  • Tumor infiltrating lymphocytes can be prepared by methods known in the art. For example, as in some of the procedures described, 3x10 6 P815 or 1.5x10 7 P815-Cw3 or 3x10 P198 are injected into the right shoulder of a mouse, subcutaneously, as indicated. When the tumors have reached 1 cm, they are removed and the cells are purified on a Percoll gradient.
  • the TILs are amplified for 10 days in RPMI 1640 (Gibco BRL, Eragny, France) supplemented with 10% FCS (Dutscher, Brumath, France), 10 U / ml of IL-2 and IL-7 (Immunogenex, Los Angeles, CA) in the presence of a 10-fold excess amount of irradiated syngeneic splenocytes.
  • Magnetic beads coupled to the MHC / peptide complex indicated are added to the cell suspension and the mixture is preferably incubated at a temperature which does not allow phagocytosis of a complex by a macrophage and which does not require the negative regulation of the receptor expression T cells
  • a temperature that can cause the least damage to cells can be determined by routine experimentation.
  • the cells are separated magnetically using a magnetic particle concentrator (Dynal) according to the manufacturer's instructions, they are carefully washed twice with cold culture medium and incubated for 1 hour to dissociate the beads from the T cells.
  • the recommended temperature is 37 ° C.
  • the time and temperature settings can be adjusted to achieve optimal results by routine experimentation. Incubation for 3 hours at 4 ° C has proven effective in some cases.
  • the process can be made optimal by gentle rotation in order to maximize the contact between the MHC / peptide complex and the T lymphocytes.
  • T cells can be dissociated from the carrier. These techniques vary depending on the nature of the support used in the process, but generally they include techniques such as “panning” (cell sorting procedure allowing their separation) and similar known techniques. When using magnetic beads or plastic bottles or plates, panning can be used.
  • TCR ⁇ repertoire is analyzed as described here. Briefly, total RNA is prepared by lysis in guanidium thiocyanate and ultracentrifugation on a CsCl gradient. Single strand cDNA synthesis is performed using the Boehringer Mannheim cDNA synthesis kit. 10 ⁇ g of total RNA are incubated for 10 minutes at 70 ° C. with (dT) 15 (5 ⁇ M) and each dNTP at 1 mM. After phenol extraction chloroform, the RNA is subjected to reverse transcription. The cDNA formed is amplified by PCR, using the specific primers V ⁇ 10 and C ⁇ .
  • Amplification begins with a denaturation step of 1 minute at 94 ° C, followed by 40 cycles consisting of 70 seconds at 94 ° C, 1 minute at 60 ° C and 4 minutes at 72 ° C (to minimize recombination intra-PCR), and finally, a 10-minute step at 72 ° C.
  • the amplification reaction products are subjected to a final elongation (run off or PCR amplification) using either a nested C ⁇ or a specific J ⁇ 1.2 primer, labeled with a fluorophore.
  • the labeled amplified products are passed over a sequencing gel to determine the size and intensity of fluorescence over a DNA sequencer 373A (Applied Biosystems).
  • the quantification of amplifiers is simplified by software created for this purpose, in particular the Immunoscope software. (4).
  • T cell hybridomas Specific adsorption of T cell hybridomas on their MHC-related peptide complex.
  • a single-molecule, recombinant, soluble MHC class I molecule, described above (SC-Kd)
  • SC-Kd single-molecule, recombinant, soluble MHC class I molecule, described above
  • Purified SC-Kd can be loaded with exogenous peptides by incubation with approximately 5 ⁇ M of peptide, the examples comprising Cw3 or PbCS, for 1 hour at 37 ° C. These can be dimerized using the AcM SFl-1.1.1.
  • the dimers can be purified by filtration on high performance gel Superose 6 HR (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) with a flow rate of 0.35 ml / min of PBS.
  • SC-Kd / peptide complexes are specifically recognized by related T cells (24).
  • the first used is the T lymphocyte hybridoma 9.4 (20), which is Kd-restricted and specific for a peptide derived from HLA-Cw3.
  • the magnetic beads are covalently coupled to the Kd-specific SF1-1.1.1 mAb and they are incubated with an excess of SC-Kd loaded either with the Cw3 peptide or with the unrelated PbCS peptide.
  • SC-Kd molecules loaded with a radioactive peptide it was determined that each bead is coupled to about 1.3x10 5 SC-Kd molecules (not shown).
  • the beads loaded with SC-Kd / Cw3 (3 ⁇ 10 6 ) are mixed with 5.5 ⁇ 10 5 cells 9.4 labeled with 3 H. After three washes carried out carefully, the magnetic beads are collected and the bound cells are recovered. The number of cells is determined by measuring the radioactivity associated with the beads.
  • T lymphocytes As shown in FIG. 5, 62 ⁇ 2.8% of T lymphocytes are recovered by adsorption on the specific SC-Kd / Cw3 complexes. On the other hand, 20 times fewer cells (3 ⁇ 0.3%) are recovered with the SC-Kd / PbCS complexes. This result indicates that the binding of T lymphocytes to magnetic beads is peptide-specific and suggests that populations of complex T lymphocytes can be enriched in T lymphocytes having a given specificity. Generally speaking, 60% to 80% of specific cells are recovered. It has been calculated that more than 10 5 Kd / peptide complexes are linked to each bead.
  • the Cw3 peptide was extracted from P815-Cw3 cells and some hundreds were collected per cell. Considering that the diameter of a P815 cell is three times that of a bead, the average density of the Kd / Cw3 complexes per unit area is at least 10 3 times, and maybe even 105 times higher on the beads only on P815-Cw3 cells. However, it could be objected that a high density of Kd / Cw3 complexes could also be obtained on the cell surface by redistribution of antigen after interaction with the TCR. In all cases, the results show that by using a solid support coupled with a high density of MHC / peptide complexes, it is possible to purify the T lymphocytes according to their specificity.
  • PEL peptide-specific peritoneal exudate lymphocytes
  • V ⁇ 10-specific primer When analyzing the TCR ⁇ repertoire of these cell populations by PCR, a characteristic peak corresponding to a length of CDR3 of 6 residues is detected, using a V ⁇ 10-specific primer. In addition, in all the mice subjected to the test, a variable, but significant fraction, of these V ⁇ 10 transcripts uses the segment J ⁇ 1.2 (unpublished observations JPL and FIG. 7). These characteristics enabled us to detect specific T lymphocytes and to regulate the enrichment in specific T lymphocytes by adsorption of MHC / peptide complexes.
  • FIG. 6 represents the shape of the expression of V ⁇ 10 by ELPs before and after adsorption on SC-Kd / Cw3 complexes. Before adsorption, a bimodal distribution is observed, while after adsorption, the cell population is homogeneous exclusively in the cells expressing V ⁇ l0. ELPs are also characterized before and after adsorption using other markers on the cell surface. The number and percentage of different cell subsets are indicated in Table 1.
  • the T lymphocytes expressing CD8 +, V ⁇ 10 represent 20.4% of the initial population which is essentially composed of non-T cells (residual P815-Cw3, macrophages and B lymphocytes). However, in adsorbed PELs, the T lymphocytes expressing CD8 + V ⁇ 10 represent 97% of the totality of the cells, which corresponds to an enrichment by a factor of five.
  • the absolute number of cells (Table 1) indicates that the vast majority of Kd / Cw3 specific T cells have been recovered.
  • the adsorbed population represents 79.3% of the cells expressing CD8 + V ⁇ 10 in the initial population of cells.
  • T lymphocytes expressing CD8 and V ⁇ 10 present in the ELPs of immunized DBA / 2 mice are specifically purified by adsorption on SC-Kd / Cw3 complexes.
  • TIL anti-tumor potential
  • Mice were injected subcutaneously with a lethal dose (10 7 ) of P815-Cw3 tumor cells.
  • P815-Cw3 cells When this mode of injection is used, P815-Cw3 cells generally proliferate, at least temporarily, as a solid tumor largely infiltrated with macrophages, B and T lymphocytes. After 10 days, the tumors are removed, dissociated and we analyze the TIL. A large fraction of the tumor infiltrate consists of P815-Cw3 cells (not shown). Only a small percentage of the lymphocytes infiltrating solid P8l5-Cw3 tumors are specific for the tumor.
  • T cells less than 5% express both CD8 and V ⁇ 10.
  • the lengths of the CDR3 region of the TCR-b chains are determined by PCR, using primers specific to either V ⁇ 10 and C ⁇ , or to V ⁇ 10 and J ⁇ 1.2 (FIG. 7).
  • As a control splenocytes from naive mice were analyzed (FIG. 7, panels a and b). We observe typically Gaussian gaits indicating a polyclonal repertoire.
  • 32% of the V ⁇ 10 transcripts have a CDR3 having the length of 6 amino acids compatible with the specificity Kd / Cw3. This clonal expansion can also be detected when the primer J ⁇ 1.2 is used in the final elongation ( Figure 7d).
  • TIL TIL expressing both CD8 and V ⁇ 10 and the analysis of TCR ⁇ indicate that a small fraction of TIL (between 1 and 2%) has the imprint of specific Kd / Cw3 lymphocytes.
  • TIL specific for a tumor can be purified by adsorption on the MHC / peptide antigen complex.
  • suspensions of individual cells obtained from dissociated tumors are incubated with magnetic beads coupled to SC-Kd / Cw3.
  • Selected cells are analyzed again by flow cytometry and PCR, as in the previous section. Very few tumor cells are detected by cytometry.
  • Cells expressing both V ⁇ 10 and CD8 represent 89% of the purified cells (not shown).
  • a single length (6 residues) is observed for the CDR3 region of the TCR ⁇ chain using primers specific for V ⁇ 10 and C ⁇ (FIG. 7e).
  • TILs purified on SC-Kd / Cw3 show increased cytotoxic activity in vitro.
  • One of the hypotheses put forward concerning the modest results of adoptive anti-tumor immunotherapy is that certain TIL specific for a tumor are anergic. Consequently, it was decided to directly verify their cytotoxic activity in vitro before and after adsorption on specific MHC / peptide complexes.
  • Figures 8a and 8b show their cytolytic activity tested on target cells P815 and P815-Cw3 labeled with 51 Cr. The lysis of target cells P815-Cw3 by non-adsorbed TILs is not significantly higher than that of P815s, as might be expected from the low frequency of cells expressing V ⁇ 10 + CD8.
  • TILs purified by adsorption on SC-Kd / Cw3 specifically lyse P815-Cw3. Purification has no only increased the specific activity of CTL, but it also decreased the non-specific lysis of P815.
  • Purified and unpurified TILs are multiplied in vitro using IL-2, IL-7 and irradiated syngeneic splenocytes. Other methods for expanding T cell cultures are known in the art. After 10 days of expansion in culture, the activity of CTL is tested again. As shown in FIG. 8d, a greater lysis of P815-Cw3 is observed without significant increase in the non-specific lysis of P815. On the other hand, the unpurified TILs show non-specific lysis of P815 and P815-Cw3 (FIG. 4c). These results demonstrate that the TILs purified by adsorption on specific MHC / peptide complexes exhibit a specific CTL activity which further increases by in vitro culture.
  • Purified TILs have potent anti-tumor activity in vivo.
  • the anti-tumor activity of the purified TILs was continued to be verified in vivo.
  • 10 7 TIL were administered to a group which had been purified by adsorption on SC-Kd / Cw3 and amplified in vitro, as described in the previous section.
  • the third group receives no TIL.
  • the tumor growth and the survival rate of the mice are measured daily.
  • Figure 9a shows that if 60% of the mice which received unpurified TIL died within 27 days, all mice that received purified TIL were protected. All the mice that received no TIL died within 24 days.
  • the immunogenicity of P815-Cw3 is increased by transfection of HLA-Cw3, resulting in reduced tumorigenic potential.
  • the immune response of DBA / 2 mice to P815-Cw3 is somewhat unusual, since the specific Kd / Cw3 lymphocytes all harbor a particular V ⁇ and a particular length of CDR3b.
  • the successful eradication of P815-Cw3 could therefore result from an exceptional affinity of anti-Cw3 TCRs for their ligand or from the low tumorigenic potential of this tumor.
  • two different tumors were analyzed using two different peptides and another MHC class I molecule.
  • the immune response to P815 in DBA / 2 mice is directed against at least 4 peptides, including a derivative of the P1A protein and is presented by Ld (25, 26).
  • the P198 tumor is a variant of P815, in which a single point mutation has generated a new epitope called P198 and presented by Kd (19).
  • the TILs were purified from these two tumors by adsorption on Ld P1A or SC-Kd / P198 complexes, amplified in vitro and reinjected into DBA / 2 mice to which a lethal dose (3 ⁇ 10 6 ) of cells had previously been administered.
  • P815 or P198 tumors respectively.
  • the survival rate of the mice is presented in FIG. 9, panels b and c.
  • mice that did not receive an injection die within 24 days 60% (b) and 20% (c) of the mice that received unpurified TIL survive.
  • injected purified TILs by adsorption on the relevant MHC / peptide complex 100% and 80%, respectively, of the mice are protected. This result indicates that tumor-specific TILs could be purified from other tumors as well, with enhanced anti-tumor activity in vivo.
  • the Hind III-Hind III fragment coding for SC-A2 is taken from p SC-A2, then it is subcloned at the Hind III cloning site of the plasmid p Rc / CMV (Invitrogen).
  • the transcriptional orientation under the control of the CMV promoter was first verified by restriction mapping, then by nucleotide sequencing.
  • Construction SC-A2 which comprises the signal sequence and the first three domains of the heavy chain cDNA of HLA-A2.1 fused to the coding sequence of human b2-microglobulin, via a linker or hinge flexible 15 amino acids, is shown in Figure 10 with the corresponding nucleotide sequence.
  • the anti-HLA-ABC mAb W6.32 and the human anti- ⁇ 2-microglobulin mAb FMC 16 were supplied by Valbiotech (France).
  • the basophilic rat cell line RBL-2H3 has been described previously and a person skilled in the art knows how to obtain it. immunoprecipitation of SC-A2 from the supernatant of rat basophil cells transfected with pCMV. SC-A2
  • RBL This stable RBL cell line, transfected with SC-A2 (10 7 cells), is washed twice and incubated in 4 ml of complete medium free of methionine, for 30 minutes, then added with 378 mCi of methionine 35S for 24 hours. At the end of the labeling, the cells and the culture medium are separated by centrifugation, the supernatant is subjected to immunoprecipitation using the mAb W6.32 or the mAb FMC 16 linked to magnetic beads (DYNAL), which react.
  • the immunoprecipitated SC-A2 molecules are separated in a magnetic particle concentrator (Dynal), they are washed twice with cold PBS and then analyzed by SDS-PAGE. Preparation of soluble SC-A2.
  • Purified single-stranded soluble SC-A2 is purified from the supernatant of RBL cells transfected with pCMV.SC-A2, using the immunoaffinity column covalently linked to mAb W6.32, as described previously for the purification of SC-Kd.
  • Peptide binding test Peptide binding to SC-A2 is measured by competition using radioactive marker F10V, as known in the art.
  • This peptide is labeled, as known in the art, with a specific activity of 43 mCi / mmol, using an iodization catalyzed by chloramine T.
  • the unbound peptide is removed by ultrafiltration using Microcon 30 (Amicon) and 7 washes with PBS.
  • the labeling is measured in the retained peptides using a g spectometer (Uammamatic, Kontron). Cul tures of lymphocytes.
  • the PBLs are isolated on a Ficoll-Hypaque gradient (Pharmacia, Uppsala, Sweden).
  • Primary human CTLs are produced in a 10-day culture, by mixing with beads (coated with 100 ⁇ g of MHC / peptide complex, as described). These cultures are carried out in the presence of IL-7 and IL-2.
  • Murine primary CTLs are generated in a culture of
  • Cytotoxicity test The cytotoxicity of lymphocyte suspensions is tested in a release test. 51 Cr standard, in 6 hours, known in the art. The percentage of specific lysis of 10 4 target cells labeled with 51 Cr in 200 ⁇ l is determined for various ratios of lymphocytes to target cells. The spontaneous release values of 51 Cr vary between 5 and 15% of the totality of the incorporated marker. See also
  • SC-A2 in transfected rat basophil cells (RBL).
  • RBL rat basophil cells
  • the stable SC-A2 transfected RBL cell line is labeled for 36 hours with 35S methionine. After immunoprecipitation from the supernatant using the mAb W6.32, which reacts with human ⁇ 2-microglobulin, and an mAb which reacts with
  • HLA-ABC HLA-ABC
  • SC-A2 molecules are detectable by SDS-PAGE, as shown in Figure 11A.
  • an immunoaffinity chromatography is used with a column provided with immobilized W6.32 mAbs.
  • the eluate from the affinity column has a main band which can be colored by Coomassie blue, of around 48 kDa (FIG. 11B).
  • This procedure regularly leads to the production of approximately 500 ⁇ g of SC-A2 per liter of culture supernatant.
  • the solubility of the MHC molecule does not affect the binding of the relevant peptides.
  • Soluble Class I can activate T cells and promote their proliferation. Beads coated with the Sc-Kd / Cw 3 complex are introduced into cultures of T lymphocytes of DBA / 2 mice. After 2 days of culture, a strong proliferation is observed, as strong as for the positive control after 4 days. A late proliferative response is associated with a strong and prolonged production of IL2.
  • the macrophages are removed from the primary culture using a column. Nylon-Wood. T cells are then co-cultured with beads and the ability of this culture to induce cytolytic activity compared to that of the culture not lacking in macrophages. No significant difference was observed between the cytolytic activities.
  • the fact that clearly demonstrates that the presentation and activation of specific CTLs is independent of natural APCs, including dendritic cells, macrophages and B lymphocytes, is that the suppression of these cells does not abrogate the induction of CTL.
  • the need for the presence of a molecule MHC here MHC class I, is demonstrated, since the beads coated with the peptide alone do not induce CTL.
  • the efficiency of peptide presentation by MHC / peptide coated beads is as good as presentation by dendritic cells.
  • Anti-tumor activity using primary CTLs induced by the MHC / peptide complex may be advantageous for generating effector cells against tumor-specific antigens.
  • the feasibility of this approach is tested by incubation of spleen cells not separated from DBA2 mice with Ld cells and a synthetic peptide of DBA2. After 10 days of culture, these cells are reintroduced into the mouse to which tumors have been grafted. Reintroduced cells successfully lead to the disappearance of tumors.
  • Specific primary CTLs have sufficiently high affinity to recognize an endogenous peptide. These primary CTLs are examined to see if they recognize an endogenous peptide in mice.
  • Specific P1A CTLs are capable of killing P815 cells. Appropriately induced CTLs kill influenza infected cells, human melanoma cells and HIV infected cells.
  • the CTLs generated by the methods according to the present invention can be used in immunotherapy techniques and they can be used in the research and development of immunotherapies such as adoptive immunotherapy protocols known in the art.
  • the peptides used are listed in Table 4 and come from Neosystem (Strasbourg France).
  • MAbs W6.32 anti-HLA-ABC
  • FMC 16 anti-human ⁇ 2-m
  • Valbiotech Valbiotech (Paris, France).
  • MAbs B2.62.2 human anti- ⁇ 2-m
  • anti-HLA-A2.1 mAbs BB7.2, MA2.1, PA2.1 and 5H7 have been described in McMichael et al, 1980 Human Immnology 1: 121 -129; Parham and Brodsky, 1981 Human Immunology 3: 277-299; Parham and Bodmer, 1978 Nature 276: 397-399; Smith et al, 1994 Journal of Immunology 153: 1054-1067.
  • the rat basophil cell line, RBL-2H3 has been described in Engel et al, 1992 Science 256: 1318-1321.
  • the 174CEM.T2 cell line (Celis et al, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91: 2105-2109), P815 cells (TIB 64, American Type Culture Collection, Rockville, MD) and P815 / HLA Cw3 transfectants (Maryanski et al, 1986, J. Immunol.
  • 136: 4340-4347) were cultured on RMPI-1640 supplemented with 10% SFV, 2 mM L-glutamine, 10 mM sodium pyruvate, 10 mM Hepes, 2-mercapto-ethanol 5 x 10 -5 M and antibiotics (complete SFV medium).
  • the HLA-A2.1 sequence is derived from a full length cDNA (Ennis et al, 1990, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87: 2833-2837).
  • a 410 bp fragment produced by digestion with Sali and Kpnl and coding for the first 113 residues of HLA-A2 was purified.
  • a 500 bp fragment coding for residues 114 to 274 of HLA-A2.1 was amplified by PCR and fused to a (Gly) 4 Ser motif using the following primers: .
  • This PCR product was digested with Kpnl and BamHI. The two fragments were fused together and cloned into M13mpl9 cleaved by Sali and BamHI, to give M13- ⁇ l ⁇ 2 ⁇ 3.
  • the Sali-BamHI 920 bp fragment of M13- ⁇ l ⁇ 2 ⁇ 3 encoding residues 1 to 274 of HLA-A2 fused to a flexible linker 5 residues long was then inserted into M13 / huB2m cleaved by BamHI and SalI, to give M13- SC-A2 (75).
  • RBL-2H3 cells (10 7 ) were transfected with 10 ⁇ g of DNA from the plasmid pCMV.SC-A2 linearized by Pvu I, using a Cellject electroporation system (Eurogentec, Sart Tilman, Belgium) set to single pulse, 250 V with a shunt resistance of 192 ohm and a capacity of 450 ⁇ F. After 24 hours, the cells were selected on a complete SFV culture medium containing 1 mg / ml of G418 (Gibco, Gaithersburg, MD). The selection was continued by increasing progress dose of antibiotic up to 4 mg / ml. Preparation of soluble SC-A2
  • SC-A2 was purified from the supernatant of RBL-2H3 cells transfected with pCMV.SC-A2 by affinity chromatography using the antibody W6.32.
  • the analyzes were carried out on a BIAcore (Pharmacia Biosensor), at 20 ° C using a flow of 5 ⁇ l / min.
  • the anti-HLA-A2 antibody BB7.2 was immobilized on a sensitive CM5 support previously activated with a 35 ⁇ l of NHS / EDC mixture, and the unreacted motifs were blocked with 1M ethanolamine, p H 8.5.
  • the CTL clone NA17-221 specific for the peptide NA17-A presented by HLA-A2.1, was cultured in 96-well plates, in 200 ⁇ l of complete FCS medium, in the presence of the indicated concentration of peptide / SC complexes -A2 dimerized by AcM FMC16.
  • the proliferation was measured after 48 hours by the incorporation of 3 H thymidine.
  • the IL-2 secretion was monitored at 24 hours by measuring the capacity of the culture supernatant to fuel the proliferation of the IL-2-dependent CTLL cell line. -2.
  • DBA / 2 male mice were obtained from the R. Janvier Breeding Center (Le Genest-Saint Isle, France) and were used at the age of 8 to 12 weeks.
  • the dendritic cells (CD) were prepared according to standard enrichment protocols by centrifugation of spleen cells on a 35% BSA solution (Sigma-Aldrich, Isle d'Abeau Chesnes, France) and by plastic adhesion of the fraction of low density spleen cells (Coligan et al, 1993, Current Protocols in Immunology. John Willey and Sons, Inc, Boston).
  • T cells enriched on nylon tissue were cultured either with 10 CDC pulsed 4 to 6 hours beforehand with 100 ⁇ g of CW3 or NP peptide, or with SC-Kd / peptide complexes coupled to beads (5 x 10 6 ).
  • the cultures were carried out in 5 ml of complete SFV medium supplemented with 20 ng / ml of mouse rIL6 (Immugenex Corp, Los Angeles, CA) and 0.5 ng / ml of mouse rIL12 (R & D Systems Europe Ltd. , UK) in 25cm 2 flasks kept at 37 ° C under atmosphere humidified containing 6% CO 2 .
  • human rIL2 (Immugenex) was added to the cultures so as to give a final concentration of 10 U / ml.
  • the cultures were re-stimulated on day 7 using irradiated spleen cells (1 x 10 7 ) (3000 rad) activated by 50 ⁇ g of peptide, on 2 ml of complete SFV medium containing 1 ng / ml of mouse rIL7 ( Immugenex) and 10 U / ml human rIL2.
  • Additional human ⁇ IL2 (ultimately 20 U / ml) was provided on day 10 and the cultures were tested for their cytolytic activities on day 12-14.
  • the cultures were re-stimulated by 10 7 autologous irradiated T blasts (3000 rad) activated by ConA pulsed by peptides or by 140 mM of monomeric peptide / SC-A2 complexes.
  • the cultures were maintained in complete AB medium containing 10 ng / ml of human rIL7 and 10 U / ml of rIL2.
  • Fresh medium with cytokines was added every 3 days. Cytotoxic activity was measured 8 days after restimulation.
  • Cytotoxicity test P815 cells (3-5 x 10 6 ) pulsed with 50 ⁇ g of Cw3 or NP peptide and P815 / HLA-Cw3 transfectants were radiolabeled with 51 Cr for 90 min at 37 ° C in RPMI-1640 medium. They were then washed three times in the same medium, resuspended in complete FCS medium and then added (5000) to effector cells.
  • the T2 cell line (3 ⁇ 10 6 cells) was drawn overnight by 200 ⁇ g of peptides in 2 ml of RPMI-1640 medium devoid of serum at 26 ° C. They were then radiolabeled with 51 Cr as indicated for the murine cell lines.
  • Cytolytic activity was determined by a standard 51 h 51 Cr release test using 96-well plates with U-bottom. The percentage of cytotoxicity was determined by the formula: 100 x (experimental release - spontaneous release ) / (maximum release - spontaneous release). Maximum release was determined by lysis of target cells using 1% triton X-100 (Sigma). The spontaneous release values of 51 Cr vary between 10 and 20% of the total labeling incorporated.
  • An SC-A2 construction has been carried out, it comprises the signal sequence and the first three domains of the heavy chain cDNA of HLA-A2.1 fused to the coding sequence of human ⁇ 2-m via a flexible linker of 15 amino acids.
  • This construct was transfected into RBL-2H3 cells. The stable transfectants were selected and screened by PCR according to the presence of the integrated gene construct.
  • the SC-A2 production of the positive clones was analyzed. One clone produced approximately 500 ⁇ g of SC-A2 per liter of culture supernatant and was selected for further analysis.
  • the secreted SC-A2 molecule was purified by immunoaffinity chromatography using mAb W6 / 32 (anti-HLA-ABC) and was characterized by surface resonance of plasmons using MAb BB7.22 (anti-HLA -A2, -A69) and B2.62.2 (anti-human b2-m).
  • the results presented in FIG. 17 demonstrate that it presents both the serological determinants derived from human ⁇ 2-m and from HLA-A2.
  • cell proliferation (cpm) is given as a function of the concentration of SC-A2 ( ⁇ g / ml); T cell proliferation was determined at 48 hours by the incorporation of 3 H thymidine.
  • the CTL clone NA17-221 specific for the peptide NA17-A presented by HLA-A2.1 was cultured with the indicated concentration of peptide / SC -A2 dimerized; in the two figures, the white circles represent the peptide NA17-A and the black squares represent the peptide MAGE-3.
  • the response obtained is specific peptide since SC-A2 loaded with an inappropriate peptide (MAGE-3) showed no activity.
  • the specific responses observed with the clone NA17-221 demonstrate that the SC-A2 / peptide complex interacts productively with the TCR which corresponds to it.
  • these data establish that the SC-A2 molecule has all the desired properties and has the same characteristics as its murine counterpart. The ability of these molecules to elicit specific CTL responses in vitro was then studied.
  • This number corresponds to a density of 1.7 x 10 15 molecules per m 2 , which represents at least 10 times more than the total density of MHC molecules on the surface of natural APCs.
  • a natural APC has on the order of 10 4 different peptides and that the maximum representation of a given peptide on the surface is 10%, it can be concluded that the density of a specific peptide / MHC complex on the surface of the beads is at least twice that of natural APCs.
  • the peptides used for the induction are CW3 for the graphs on the left and NP for the graphs on the right. Cytotoxic activity has was measured on P815 (white square), P815-CW3 (black square), P815 pulsed with NP (black circle) or with CW3 (white circle). These results show that a significant peptide-specific lytic activity was detected, whether the immunization stimulus used was dendric cells or beads loaded with peptide / SC-Kd. The cytotoxicity curves suggest that the two procedures have comparable CTL peptide / specific induction and expansion efficiencies.
  • CTLs induced in vitro show TCR rearrangements similar to those of CTLs initiated in vivo.
  • the results set out above show that the peptide / MHC complexes coupled on beads can generate CTLs in vitro in the absence of co-molecules. stimulation added.
  • the TCR repertoire of CTL populations isolated from DBA / 2 mice immunized with P815 transfectants - HLA-CW3 reflects the selective development of lymphocytes carrying BV10.
  • the profiles obtained for the TCR-BV10 of populations of DBA / 2 spleen cells stimulated in vitro by CW3 are represented in FIG. 26 which represents the rearrangements of the TCR- ⁇ chain of CTL induced in vitro. CTLs were induced by the indicated peptide.
  • CDR3 The amino acid size of CDR3 indicated is as defined by Chothia et al. 1988, EMBO J. 7: 3745-3755.
  • a major peak at 6 amino acids is the hallmark of CW3-specific CTLs.
  • RNA extracted from naive splenocytes or NP-specific CTLs is presented for comparison.
  • the CW3 peptide presented by dendritic cells or SC-Kd beads leads to the generation of T cell populations which have, for TCR-BV10, a major peak corresponding to a CDR3 long with 6 amino acids . Additional analyzes have revealed a predominant association of such a CDR3 with a BJ1S2 segment.
  • TCR-BV10 repertoire therefore has the same characteristics as that of CTL CW3-reagents generated by priming in vivo.
  • Figure 26 shows the TCR-BV10 profile obtained for T cells generated, in an experiment conducted in parallel, against the NP peptide.
  • the TCR-BV17 profiles of stimulated PBL therefore show a major peak corresponding to a CDR3 with a length of 8 amino acids, which suggests a specific development of the T cell population which has been involved in M58-66-specific lysis.
  • the control PBLs give a TCR BV17 profile of the Gaussian type, which indicates a polyclonal repertoire.
  • the TCR BV2 profiles present a Gaussian form for the control PBLs and the stimulated PBLs.
  • SC-A2 made it possible to have a recombinant single-stranded molecule, soluble. This purified molecule has been shown to be properly folded and specifically bound to antigenic peptides restricted by HLA-A2, which suggests that it selects the same peptide repertoire as the HLA-A2 molecule associated with the native cell surface. In addition, the work carried out has shown that the SC-A2 / peptide complexes stimulate the peptide-specific CTLs to make them proliferate and secrete IL-2, which clearly indicates that SC-A2 interacts with the appropriate T cell receptor.
  • These induced CTLs are capable of effectively killing T2 cells activated by the peptide.
  • Signal-1 comes from the ligation of TCR and its co-receptors with MHC / peptide complexes.
  • Signal-2 which is not antigen-specific, is generated by the interaction of co-stimulatory molecules expressed on APC and their related molecules on T cells.
  • the importance of the transduction signal via CD28 binding of T cells to B7.1 or B7.2 molecules on APCs in order to obtain optimal stimulation of non-sensitized T cells has been emphasized in several reports.
  • the MHC / peptide complexes coupled to the beads, used according to the invention do not provide the co-stimulation normally provided by the CD28-B7 interaction.
  • the high density of MHC / peptide complexes on the beads can thus make it possible to be freed from the need to have co-stimulatory molecules.
  • SC-MHC class I recombinant molecules are of great interest that can be used not only in a rapid, sensitive and reliable MHC / peptide binding assay to identify T cell epitopes binding to MHC with high affinity, but also in induction of primary CTLs to define, among the MHC binding agents, those of the peptides which are immunogenic.
  • mice DBA / 2 mice and clone 4 (135) mice are used.
  • CD8 + The purification of CD8 + was carried out according to the MiniMacs protocol (Myltenyi Biotec, Auburn, CA);
  • SC-Kd single-stranded Kd
  • SC-Kd single-strand recombinant is purified from a culture supernatant of transfected Chinese hamster ovary (CHO) cells as described in (21).
  • SC-Kd is loaded with the indicated peptides, in a molar ratio of 1/1, and dimerized using the antibody SF1.1.1 by carrying out an incubation for one hour at 4 ° C (SC-Kd / SFl .1.1 : molar ratio 3/1).
  • the dimerized complexes are applied to a 48W plate (Costar, Brumath, France) at a rate of 10 ⁇ g / ml, for approximately 14 h at 4 ° C. Unlinked sites are then saturated with RPMI 10% SVF.
  • the cells are added to the plates with the coatings, centrifuged at 600 rpm and incubated at 37 ° C for different periods of time.
  • the non-adherent cells are eliminated by 3 washes with PBS.
  • the remaining adherent cells are incubated with 150 ⁇ l of p-nitrophenyl-N-acetyl- ⁇ -D glucosaminide (Sigma, Paris, France) at 37 ° C for 2 to 5 hours.
  • 225 ⁇ l of 50 mM glycine buffer, p H 10.4, containing 5 mM EDTA are then added.
  • the OD optical density is measured at 405 nm on 100 ⁇ l of reaction mixture with an ELISA reader (Sanofi, Diagnostic Pasteur, France).
  • the fraction of adherent cells is estimated from a standard curve with a known number of cells. Alternatively, quantification is performed using cells labeled S-methionine (Amersham, UK).
  • quantification is performed by flow cytometry using VB-specific antibodies.
  • the T 9.4 hybridoma which recognizes a peptide derived from HLA-Cw3 presented by K d , is labeled by incorporation of S methionine and incubated for 90 min on plastic plates coated with SC-Kd-peptide complexes or SC-dimerized complexes.
  • Kd-peptides hereinafter called dKd-peptide
  • the cell recovery is determined by measuring the radioactivity of the adherent cells.
  • the adhesion is specific for a given peptide and increases with the amount of dimerized MHC / peptide complexes (Figure 29).
  • the T cells were pretreated for approximately 14 hours with the src-specific tyrosine kinase inhibitor, namely herbimycin A and / or with the inhibitor protein kinase C GF109203X (25 ⁇ m) or DMSO for 15 min at 37 ° C before the cell adhesion test.
  • the percentage of adherent cells is evaluated by the hexosaminidase technique. The results obtained are given on FIG. 30. In both cases, a significant inhibition of the specific adhesion of the T cells is observed. No additional effect is observed when the two inhibitors are used at the same time.
  • the adhesion of the 9.4 T hybridoma cells is specific for a peptide and depends on the temperature and the dose, increases when the MHC / peptide complexes are dimerized and is partially inhibited by the two inhibitors of protein kinase.
  • the MHC / dimerized peptide complexes applied as a coating, allow specific enrichment in T cells.
  • a mixture of two T cell hybridomas is prepared and incubated as described in the preceding paragraphs.
  • the enrichment in specific T cells and the yield of the experiments are evaluated (namely, the absolute number of specific T cells recovered compared to the number of specific cells of the initial mixture).
  • the hybridoma 9.4 (V ⁇ 10 +) specific to the Kd-Cw3 complex is mixed in a ratio of 45:55 with the hybridoma T B9.1 (V ⁇ 8 +) specific to the peptide 102-120 of HEL presented by IE d .
  • This mixture (10 4 cells) is subjected to incubation on surfaces coated with dKd-Cw3 or dKd-HA, the adherent cells are recovered and analyzed by flow cytometry using V ⁇ -specific antibodies.
  • MHC / peptide mediated adhesion it is possible to enrich specific T cells from complex populations made up of T hybridoma cells or CD8 + splenocytes.
  • Antibodies to surface markers have been shown to be useful in characterizing and quantifying lymphoid cells.
  • T cells were isolated according to their specificity and for this purpose recombinant SC-MHC / peptide complexes were dimerized and applied in the form of a coating on plastic supports.
  • TcRs usually have weak intrinsic affinities for their ligands.
  • MHCs purified from tissue or organ cultures are loaded with a large set of self-peptides.
  • the T 9.4 hybridoma strain was first used. It appeared that the adhesion of 9.4 was peptide-specific and that the dimerization of the MHC / peptide complex improved cell adhesion.
  • dimerization appears to favor a correct orientation of the MHC / peptide complex and / or to increase its avidity for TcR. Furthermore, it is known that dimerization is necessary for the activation of T cells, which can be critical for the adhesion of T cells. This interpretation is reinforced by two observations: 1) no adhesion at 4 ° C. under the experimental conditions, 2) the adhesion is reduced in the presence of protein kinase inhibitors. In addition, this interpretation agrees with previous studies showing that the triggering of TcR induces the activation of several adhesion molecules such as ⁇ 2 integrin, LFA-1, CD2, CD8 and ⁇ 1 integrin VLAs.
  • TcR The engagement of TcR by the antigenic complex applied as a low density coating according to the invention has been described as CD8-dependent (139).
  • CD8-dependent the 9.4 hybridoma strain used does not express CD8.
  • the antibody used with the dimerized MHC / peptide complexes masks the site of interaction with CD8 of K d .
  • the homogeneous loading of peptide according to a high density of dimerized SC-Kd can make it possible to avoid the requirement of a CD8 / MHC interaction.
  • the use of recombinant MHC molecules under conditions which induce the activation of T cells makes it possible to compensate for the low affinity of TcR for its ligand.
  • the use according to the invention of this adhesion system makes it possible to enrich specific T cells with respect to an antigen from a complex T cell population.
  • this technique makes it possible to identify the rearrangements of TcR associated with the recognition of a given antigenic complex. We will measure the importance of such information to monitor T cell responses during illness or to evaluate treatment protocols.
  • Transgenic mice for TCR clone 4 were fed and maintained at the Institut Pasteur.
  • transgenic mice clone 4 TCR / B6 the transgenic mice were crossed for 7 generations with C57BL / 6 mice and the presence of the trangene as well as of H- 2b was confirmed by FACS analysis.
  • peptides HA IYSTVASLL
  • CW3 RYLKNGKETL
  • the P815 cell line (H-2 d ; TIB64, American Type Culture Collection, Rockville, MD) was maintained on RPMI 1640 medium supplemented with 10% of heat-inactivated fetal calf serum.
  • the monoclonal antibody SF-1.1.1. (HB158) was obtained from American Type Culture Collection, Rockville, MD.
  • Antibodies used for FACS analyzes were purchased from PharMingen, San Diego, CA (anti-CD69, anti-B220 and anti-CD62L), CALTAG Labs, San Francisco, CA (anti-CD4 L3 / T4, anti-CD8 Ly-2, anti-CD25 receptor for IL-2, anti-CD44 and anti-V ⁇ 8.1 / 8.2) or from Serotec, Oxford, Great Britain (anti-macrophage F4 / 80).
  • the CTLA4-Ig fusion protein was provided by Dr. P. Linsley (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA).
  • SC-Kd K of single-chain was prepared and loaded with either HA or CW3 as previously described (21).
  • 96-well flat-bottomed plates TPP, Trasadingen, Switzerland
  • SC-Kd / HA or SC-Kd / CW3 was added for two hours at 37 ° C and the plates were finally washed twice before use .
  • CD8 + T cells Positive selection of CD8 + T cells from total splenocytes of transgenic mice was performed by indirect magnetic staining. Briefly, 10 8 splenocytes were rid of red blood cells, then treated with a purified anti6CD8 antibody (PharMingen, San Diego, CA) for 45 minutes at 4 ° C. After washing, anti-rat goat coupled magnetic microbeads (Myltenyi Biotec, Auburn, CA) were added for 15 minutes at 4 ° C. The splenocytes were again washed and finally separated by chromatography on a column attached to a magnetic. The purified population generally contains more than 98.5% of CD8 + splenocytes, as revealed by the FACS analysis.
  • T cell proliferation test The purified T cells from spleens of clone 4 transgenic mice (10 cells per well, unless otherwise indicated) were added to the wells coated with SC-Kd / HA or SC-Kd / CW3. Thymidine 3 H was added after 24 hours of culture and the radioactive incorporation was measured after another 16 hours.
  • IL-2 (recombinant human IL-2, Immugenex Corp., Los Angeles, CA) was added at the start of stimulation.
  • CD8 + splenocytes from spleens of clone 4 transgenic mice (3.10 cells) were added to the 96-well plates covered with 2 ⁇ g / ml of SC-Kd / HA and were incubated at 37 ° C. for three days in l absence of exogenous IL-2, and in the presence of the competing peptide CW3 at 50 ⁇ g / ml. The cells were then pooled and viable cells were counted by trypan blue exclusion. The cytotoxic activity of cells were tested on Cr-labeled P815 target cells pulsed with either HA or CW3 as previously described (142). Determination of cytokines
  • the culture supernatants are collected at different times after stimulation.
  • the production of TNF was measured by bioassay using the line WEHI-279 as an indicator.
  • the production of IFN- ⁇ , IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10 and GM-CSF was measured in the culture supernatants by ELISA test analyzed by cytometry.
  • a proliferative response is elicited by complexes coated with SC-Kd / HA alone.
  • SC-Kd molecules were loaded with the HA peptide and used to cover plastic plates by means of the K d -specific antibody SFl-1.1.1.
  • This antibody which recognizes an epitope in the ⁇ 3 domain, was previously used to generate dimers with a topology compatible with the activation of T cells.
  • the CD8 + T cells were purified from the total splenocytes of clone 4 transgenic mice using CD8-specific antibody and magnetic beads as described above. This procedure reproducibly gives a cell purity greater than 98.5% in CD8 + T cells.
  • FIG. 33 shows that the SC-Kd / HA coated complexes induce the proliferation of purified CD8 + cells.
  • Purified CD8 + splenocytes (10 5 / well) were incubated on plates covered with the indicated concentrations of SC-Kd / HA complexes in the presence (white square) or in the absence (black square) of 10
  • the cells were activated with 3 H thymidine for 16 hours. Also shown are the proliferations induced by a lectin (using Con A at 5 ⁇ g / ml, black circle) as well as a PMA / calcium ionophore (10 ng / ml and 250 ng / ml, white circle), or in response to 20 ⁇ g / ml of SC-Kd / CW3 (white triangle) in the absence of IL-2.
  • the data represent the average of three repetitions, and are representative of more than 8 experiments. Interestingly, the addition of exogenous IL-2 was not necessary and had no effect on the proliferation measured.
  • the purified CD8 + splenocytes also proliferated to a level comparable to that observed with the SC-Kd / HA complexes, in response to Con A or to an ionophore PMA / calcium mixture.
  • the concentration of SC-Kd / HA required for the T cell response to be 50% of its maximum was 0.5 to 0.6 ⁇ g / ml, whether exogenous IL-2 was present or absent.
  • This proliferation is peptide-specific since SC-Kd loaded with an inappropriate CW3 peptide failed to cause any proliferation of T cells.
  • FIG. 34A Figure 34 shows that the proliferative responses of CD8 + cells depend on an SC-Kd / HA stimulus and do not require a CD28 / B7 interaction.
  • the purified CD8 + splenocytes (10 5 / well of haplotype H-2 d or 2.5 X 10 5 / well of haplotype H-2 d ) were incubated on plates covered with the indicated compounds for 24 hours at 37 ° C in the absence of recombinant human IL-2.
  • the cells were pulsed with 3 H thymidine for the next 16 hours.
  • the data represent the average of three repetitions and are expressed as a percentage of lectin-induced proliferation (using ConA at 5 ⁇ g / ml).
  • the plates were covered with 2 ⁇ g / ml of SC-Kd / HA, 40 ng / ml of HA peptides, 20 ⁇ g / ml of SC-Kd / CW3, 2 ⁇ g / ml SFl-1.1.1, and the competitor (CW3 peptides) was added to 50 ⁇ g / ml.
  • coated MHC class I molecules are capable of inducing the proliferation of naive CD8 + splenocytes purified in a peptide-specific manner.
  • the purification procedure does not activate the CD8 + splenocytes.
  • the distribution of cell sizes and the expression of CD69, CD25, CD62L and CD44 were analyzed by flow cytometry after purification. The results are illustrated in FIG. 35 which shows that the CD8 + splenocytes have an activated phenotype after stimulation by SC-Kd / HA.
  • CD8 + splenocytes per well were incubated in plates with PBS for 16 hours (day O) or in plates covered with 20 ⁇ g / ml of SC-Kd / HA for three days (day 3) both absence of recombinant IL-2 and in the presence of competitors (see FIG. 34).
  • Living cells were chosen over CD8 + .
  • Cell size (forward dispersion) and cell surface phenotype were tested.
  • the expression of CD69, CD62L, CD25 and CD44 by the primed and non-primed CD8 splenocytes was measured by flow cytometry using the corresponding antibody. The results indicated are the results for a representative mouse from a minimum of 3. As shown in FIG.
  • the purified CD8 + splenocytes (10 / well of haplotype H-2d or 2.5 X 10 5 / well of haplotype H-2b) were incubated in plates covered with 2 ⁇ g / ml of SC-Kd / HA or 20 ⁇ g / ml of SC-Kd / CW3, for 24 hours at 37 ° C in the absence of recombinant human IL-2.
  • the cells were pulsed with 3 H thymidine for the next 16 hours.
  • the data represent the average of three repetitions and are expressed as a percentage of lectin-induced proliferation (using ConA at 5 ⁇ g / ml).
  • CD28 is the most powerful costimulatory molecule expressed on T cells.
  • CTLA4-Ig a fusion protein comprising the extracellular domain of the homologous CD28 CTLA-4 and the Fc portion of a human immunoglobulin, binds to B7.1 and B7.2 with high affinity (143) and has been used both in vivo and in vitro as a decoy to block the CD28 / B7 interaction (143, 145).
  • the proliferation test was carried out in the presence of 10 ⁇ g / ml of CTLA4 -Ig. (Preliminary experiments have indicated that, as previously reported (143), this concentration is sufficient to completely inhibit a reaction of primary allogenic mixed lymphocytes of 10 splenocytes of a C57BL / 6 mouse induced by 10 irradiated splenocytes of a DBA mouse / 2). The results are shown in Figure 34B.
  • the purified CD8 + splenocytes (10 5 / well of haplotype H-2 d or 2.5 X 10 5 / well of haplotype H-2 b ) were incubated on plates covered with 2 ⁇ g / ml of SC -Kd / Ha with or without CTLA4-Ig fusion protein (10 ⁇ g / ml), for 24 hours at 37 ° C. in the absence of recombinant human IL-2.
  • the cells were pulsed with 3 H thymidine for the next 16 hours.
  • the data represent the average of three repetitions and are expressed as a percentage of lectin-induced proliferation (using ConA at 5 ⁇ g / ml).
  • the SC-Kd / HA complexes are in fact the activating stimulus received by the CD8 clone 4 splenocytes.
  • Immunogenic peptides linked to MHC molecules generally have low rates of dissociation. It cannot however be completely excluded that during the incubation period, some peptides may dissociate from the coated SC-Kd and bind to empty K molecules expressed by CD8 + T cells.
  • SC-K d / HA complexes covered on plastic plates are in fact the activating stimulus received by the purified naive CD8 + clone 4 splenocytes, three additional experiments were carried out.
  • CD8 + clone 4 splenocytes stimulated by SC-Kd / HA complexes were analyzed by flow cytometry (see FIG. 35 ).
  • the CD8 + clone 4 splenocytes are CD69-, CD25-, weakly CD44, strongly CD62L and of small size, which indicates a naive phenotype (see FIG. 35, day 0).
  • the transformation into blasts was observed for 90% of the cells.
  • CD69 and CD25 were detected in 94% and 93% of the cells, respectively.
  • the expression of CD44 was regulated upstream from weak to strong and the expression of CD62L decreased in approximately 20% of the cells (see FIG. 35 day 3). In fact, 16 hours of stimulation were sufficient to observe upstream regulation of CD69 in 90% of the activated cells. Conversely, kinetic experiments indicated that eight days were necessary to observe a negative modulation of CD62-L in more than 80% of the cells.
  • cytokines The production of different cytokines was measured after stimulation using SC-Kd.HA complexes, without the addition of exogenous IL-2, and in the presence of an excess of CW3 peptides. The results are presented in the following table 11:
  • Naive CD8 + splenocytes did not produce detectable amounts of these cytokines (Table 1, day 0). It was not possible to detect any production of IL-2, IL-4, IL-6 or IL-10 in the supernatant of cells activated by SC-Kd / HA.
  • CD8 + clone 4 T cell blasts obtained after stimulation with coated SC-Kd / HA induces cytotoxic activity.
  • Purified CD8 + clone 4 splenocytes were activated for three days in the absence of exogenous IL-2 and in the presence of an excess of CW3. The activated cells were incubated for 6 hours with P815 cells labeled with 51 Cr pulsed with HA at different effector: target cell ratio. The results are presented in FIG. 37 (on the abscissa, effector ratio: target cell; on the ordinate, percentage of specific lysis).
  • Figure 37 illustrates that CD8 + splenocytes activated by SC-Kd / HA elicit a cytotoxic response.
  • Purified CD8 + splenocytes (3 X 10 6 ) were used immediately after purification (day 0) or were incubated in plates covered with 2 mg / ml of SC-Kd / HA for three days (day 3) at 37 ° C, in the absence of recombinant human IL-2 and in the presence of a competitor (see Figure 34).
  • P815 target cells pulsed black symbols
  • white symbols white symbols
  • FIG. 37 While no cytotoxic activity was detected immediately after purification (see FIG. 37, day 0), significant lysis was observed with the CD8 + clone 4 T cells activated for 3 days. This lysis was peptide-specific since the P815 cells pulsed by the inappropriate peptide CW3 were not lysed (see FIG. 37, day 0 and day 3, - HA).
  • the invention specifically includes, as described here and as it is clear to a person skilled in the art: recombinant molecules; recombinant molecules in combination with an appropriate peptide, or what is also called the MHC / peptide complex; MHC / peptide complexes in the monomer, dimer, polymer and aggregate forms; methods and methods for detecting and producing antigen-specific lymphocytes using any of the recombinant molecules mentioned above; diagnostic kits involving the use of the recombinant molecules mentioned above; methods using lymphocytes generated by contacting MHC / peptide complexes with various appropriate cells; and methods of influencing the activity or function of a lymphocyte by contacting it with an MHC / peptide complex in different forms.
  • the monomeric form of the MHC / peptide complex is particularly useful for anergizing lymphocytes and the dimeric form is particularly useful for generating a CTL.
  • T cell receptor genes in a series ofclass I major histocompatibility complex-restricted cytotoxic T lymphocyte clones Specifies for a Plasmodium berghei nonapeptide: implications for T cell allelic exclusion and
  • TIL tumor-in ⁇ ltrating lymphocyte
  • H-2-restricted CTL specifies for HLA display TcR limited diversity.
  • mastocytomaP815 after nearly complete rejection is due to antigen-loss variants rather than immunosuppression. J. Exp. Med. 157, no.3: 1040-52.
  • V alpha gene segment in mouse T-cell receptors for cytochrome c. Nature 324, no.6098: 679-82.
  • T cell receptor-MHC class I peptide interactions Affinity, Kinetics and Specificity. Science 265: 946: 949.
  • HLA-B27 structure of HLA-B27 reveals monamer self-peptides bound in an extended conformation. Nature (London) 353: 321-325.
  • T-cell directories in healthy and diseased human tissues anaiyzed by T-cell receptor beta-chain CDR3 size determination: evidence for oligoclonal expansions in tumors and inflammatory diseases.
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Abstract

La présente invention concerne des méthodes d'utilisation de complexes CMH/peptide. On décrit la purification réussie de lymphocytes T peptide-spécifiques par adsorption sur un support solide couplé à une densité élevée de molécules recombinantes du CMH, chargées d'un seul peptide. Cette méthode a permis d'isoler, purifier et quantifier des lymphocytes T spécifiques de tumeur, à partir d'échantillons d'exsudat péritonéal et de lymphocytes infiltrant des tumeurs. Ces populations de lymphocytes T purifiés peuvent être encore multipliées in vitro. Les cellules résultantes présentent une activité cytotoxique supérieure et une action anti-tumorale accrue par réinjection au porteur de la tumeur. Cette nouvelle approche est importante pour analyser le répertoire de lymphocytes T au niveau de la spécificité peptidique et pour améliorer de nouveaux traitements thérapeutiques basés sur l'immunothérapie adoptive à lymphocytes T. De plus, les complexes spécifiques CMH/peptide peuvent induire ou stimuler des lymphocytes T peptide-spécifiques. Ainsi, on décrit également des méthodes destinées à induire des lymphocytes T cytotoxiques (CTL). Ces CTL peuvent être utilisés à leur tour pour combattre la croissance des cellules tumorales in vitro ou in vivo. La molécule CMH recombinante chargée avec un seul peptide peut être utilisée avec efficacité sous forme polymère pour stimuler une réponse immune spécifique ex vivo ou in vivo après injection à l'homme ou l'animal.

Description

Méthodes d'utilisation de complexes peptide/complexe majeur d'histocompatibilite pour obtenir ou purifier
des cellules T antigène-spécifiques et pour stimuler des cellules T.
ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION
La présente invention fournit des compositions comprenant un antigène ou molécule du complexe majeur d'histocompatibilite (CMH) conjointement avec un antigène peptidique et des méthodes pour utiliser ces compositions lorsqu'elles sont liées à un support solide. Dans un mode de réalisation, l'invention fournit des méthodes pour obtenir, purifier et/ou multiplier une population de lymphocytes T qui sont spécifiques d'un antigène peptidique particulier. Diverses utilisations des lymphocytes T obtenus sont également décrites. Dans un autre mode de réalisation, l'invention fournit des méthodes pour induire ou stimuler des lymphocytes T pour répondre à un antigène spécifique. Les modes de réalisation préférés comprennent des méthodes pour purifier des lymphocytes T cytotoxiques et des méthodes pour activer ou induire la réponse d'un lymphocyte T cytotoxique, générant ainsi un lymphocyte T cytotoxique spécifique d'un antigène. Les principaux concepts de la reconnaissance des lymphocytes T et du répertoire des lymphocytes T fournissent un arrière-plan pour comprendre la présente invention et ses utilisations. On sait que les lymphocytes T reconnaissent des fragments antigéniques portés par la surface d'une cellule présentatrice d'antigène en association avec des produits des gènes du CMH de classe I ou de classe II (1). La liaison aux récepteurs de cellule T fait partie du processus de reconnaissance. On sait également que la population totale de lymphocytes T d'un seul animal peut reconnaître plusieurs millions de spécificités différentes, une seule spécificité pouvant être définie comme un peptide lié à une molécule du CMH. La reconnaissance d'un tel nombre de spécificités est réalisée par la recombinaison aléatoire de différents segments de gènes, suivie par la sélection clonale (2). En raison de l'étendue du répertoire des lymphocytes T et du nombre total limité de lymphocytes T, seul un petit nombre de lymphocytes T sont dirigés contre une spécificité donnée. Ce nombre peut être augmenté chez des animaux immunisés de façon répétée, mais il reste relativement faible (3). En raison du petit nombre de lymphocytes T dirigés contre un antigène particulier, il est difficile d'identifier des moyens efficaces pour purifier in vitro un lymphocyte T d'une spécificité donnée.
Les répertoires de lymphocytes T ont été étudiés afin de tenter de mesurer la diversité du répertoire et l'expansion clonale dans des échantillons sains et cliniques (pour une revue, voir (4)). Un certain progrès a été réalisé par le développement d'approches basées sur la biologie moléculaire, dans lesquelles on teste directement des arrangements géniques de récepteur des cellules T (TCR ou TcR). Toutefois, il arrive souvent que plusieurs différents arrangements géniques du TCR (c'est-à-dire des combinaisons de TCRβ et de TCRα) reconnaissent la même spécificité (5). Souvent, on ne peut pas établir de corrélation entre une spécificité donnée et une expansion clonale d'un arrangement ou séquence TCR particulier. Ainsi, on ne peut pas établir de corrélation entre la spécificité et un clone de lymphocytes T particulier.
L'analyse de la diversité du répertoire des lymphocytes T a utilisé essentiellement trois approches expérimentales différentes. La première implique l'établissement de clones de lymphocytes T ou d'hybridomes de lymphocytes T (27, 28). Etant donné que les efficacités de clonage et de fusion peuvent varier d'un lymphocyte T à un autre, des biais importants peuvent être générés pendant le clonage utilisé dans cette méthode. A partir des segments V et J du récepteur de cellules T, une seconde méthode utilise des anticorps monoclonaux (AcM) Vβ - et Vα- spécifiques (29), permettant des analyses plus fiables des répertoires de lymphocytes T en l'absence d'une expansion in vitro. Toutefois, tous les réactifs Vβ ou Vα ne sont pas disponibles et le pouvoir de résolution de cette technique n'atteint pas le niveau clonal.
Ces dernières années, le travail réalisé par les présents inventeurs (4, 14) et d'autres (30, 32) a consisté à analyser la diversité du répertoire des lymphocytes T par PCR, en utilisant des amorces V- ou J-spécifiques et, dans certains cas, le séquençage direct du TCR. Cette troisième approche comble les principales lacunes des techniques antérieures, étant donné qu'une amplification in vitro n'est pas exigée et que tous les différents segments V et J peuvent être analysés, du moins théoriquement. Une information supplémentaire fournie par la détermination de la taille de la région CDR3 du TCR peut permettre l'expansion clonale directe. Ces approches de la caractérisation de la diversité des lymphocytes T sont toutes centrées sur les caractéristiques structurelles du TCR. Les lymphocytes T répondent à des fragments peptidiques d'antigènes liés à la surface cellulaire de molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) sur des cellules présentant des antigènes (APC). Cela signifie que le TCR se lie à un antigène peptidique en association avec des molécules du CMH, que l'on appellera ici complexe CMH/peptide. Il a été difficile d'établir une corrélation entre l'utilisation de gène de TCR et la spécificité ainsi que la fonctionnalité du TCR pour une population de lymphocytes T particulière. Dans certains cas, on utilise de préférence un segment V ou longueur CDR3 particulier dans la réponse des lymphocytes T à un complexe CMH/peptide donné (pour une revue, voir (33)). Le plus souvent, la réponse est apparemment diverse en terme d'utilisation de segments V et J ou de longueurs CDR3 pour les deux chaînes α et β. Jusqu'à présent, on a observé seulement quelques réponses ciblées de lymphocytes T chez l'homme (4). Les méthodes destinées à obtenir des lymphocytes T spécifiques et à analyser la spécificité des lymphocytes T indépendamment des caractéristiques de structure du TCR ne devraient pas être soumises à ces limitations et d'autres, discutées dans les références citées. Ainsi, il serait utile de disposer de telles méthodes.
Le tri cellulaire utilisant des anticorps a été largement utilisé pour obtenir et caractériser des propriétés phénotypiques et fonctionnelles de sous-ensembles de cellules lymphoïdes (34). Le tri cellulaire à médiation par anticorps est basé sur la grande affinité de l'interaction anticorps/antigène. Etant donné la faible affinité du TCR pour son ligand (35), il peut être surprenant que la spécificité et l'efficacité du tri cellulaire se manifestent avec des anticorps. L'affinité intrinsèque du TCR pour son complexe CMH/peptide apparenté à été déterminée dans quelques cas et s'est avérée faible
-5 -7
(inférieure à 10 et 10 M) (36, 37). Toutefois, Dal Porto et al. (38) ont décrit qu'une fusion bivalente H-2Kb/IgG présente une grande avidité (de l' ordre du nM ) pour des lymphocytes T anti-Kb alloréactifs. La présente invention montre que l'on peut compenser la faible affinité du TCR pour son ligand apparenté en utilisant une densité élevée de complexes CMH/peptide, par exemple liés à un support solide. L'analyse de la réponse des lymphocytes T à des tumeurs chez des animaux à montré que divers facteurs peuvent contribuer à l' inaptitude de l'animal à répondre avec succès aux antigènes spécifiques d'une tumeur et donc à la tumeur. Par exemple, une population insuffisante de lymphocytes T spécifiques de la tumeur peut permettre aux cellules tumorales d'échapper aux effets cytotoxiques de la réponse des lymphocytes T (55).
De plus, des lymphocytes infiltrant les tumeurs ont été isolés à partir de patients et ont été utilisés pour l'immunothérapie adoptive après culture in vitro (7-9). Les résultats obtenus ont été toutefois décevants. Le plus souvent, la raison en est que seulement un très faible pourcentage des lymphocytes infiltrant les tumeurs est réellement spécifique de la tumeur. De plus, des pertes peuvent apparaître dans la population des lymphocytes T spécifiques à la tumeur pendant l'amplification in vitro ou une perte de l' activité tumorale de ces lymphocytes T peut apparaître en raison de mécanismes anergiques ou régulateurs. Ces problèmes peuvent être résolus par une méthode dans laquelle la population de lymphocytes T spécifiques d'une tumeur chez un animal est isolée ou purifiée en se basant sur la liaison à un antigène spécifique d'une tumeur. Toutefois, des méthodes antérieures de dilution limitée d'échantillons de lymphocytes T ne peuvent pas identifier des lymphocytes T ayant des capacités de liaison tumeur- antigène accrues ou justifient la perte de lymphocytes T pendant l'amplification. De plus, des limitations du tri cellulaire basé sur des anticorps ont été remarquées. Ainsi, il existe dans la technique une nécessité pour des méthodes nouvelles et améliorées, destinées à obtenir des cultures purifiées ou isolées de lymphocytes T spécifiques d'une tumeur. Les présents inventeurs ont comblé cette lacune par un aspect de l'invention divulguée. La présente description montre que des populations de lymphocytes T spécifiques peuvent être enrichies ou que des lymphocytes T spécifiques d'un antigène peuvent être purifiés selon leur spécificité en utilisant des complexes CMH/peptide couplés à un support solide.
Une autre approche destinée à obtenir ou purifier des populations de lymphocytes T spécifiques implique l'induction ou la stimulation de lymphocytes T. Les lymphocytes T répondent à des fragments peptidiques d'antigènes liés à la surface cellulaire de molécules du complexe majeur d'histocompatibilite (CMH) sur des cellules présentant des antigènes (APC). La liaison du TCR à des complexes CMH/peptide est favorisée par les co-récepteurs CD4 ou CD8 et conduit à la prolifération et la différenciation des lymphocytes T.
Toutefois, l'excitation médiée par TCR est généralement inefficace, sauf si elle est accompagnée par des signaux "co-stimulateurs". Ces signaux régulent la production de lymphocytes T par des cytokines stimulant la croissance, tels que IL-2, et résultent de l'interaction d'ensembles multiples de molécules complémentaires sur des lymphocytes T et des APC, par exemple entre CD28 sur des lymphocytes T et B7 sur des APC. Un grand nombre de diverses molécules sur les APC, comprenant par exemple B7.1, B7.2-ICAM et HSA, sont connues pour exprimer une fonction co-stimulatrice dans des conditions in vitro définies. Les molécules les plus importantes pour la co-stimulation ne sont pas encore élucidées.
Un protocole permettant de connaître les facteurs les plus importants de la co-stimulation utilise des cellules transfectrices avec des gènes de molécules co-simulatrices connues et ensuite, teste la fonction d'APC de ces cellules. Un inconvénient de cette approche est que pratiquement tous les types cellulaires expriment au moins un faible taux de certaines molécules co-stimulatrices. Cette expression d'arrière-plan pose moins de problème si l'on utilise une APC artificielle pour la présentation. Par conséquent, il serait intéressant dans la technique de disposer de méthodes pour stimuler ou induire une réponse de lymphocytes T qui serait dépourvue de signaux co-stimulateurs, c'est-à-dire une APC artificielle.
RESUME DE L'INVENTION L ' invention comprend diverses utilisations de complexes CMH/peptide. Un complexe CMH/peptide désigne une molécule du CMH chargée d'antigènes spécifiques. Les complexes CMH/antigène peuvent être utilisés pour obtenir, isoler ou purifier des populations de lymphocytes T spécifiques lorsqu'elles sont liées à, ou lorsqu'elles adhèrent à, un support solide. Des antigènes ou déterminants modifiés du CMH des classes I et II, sont capables d'imiter fonctionnellement les produits géniques naturels. Ainsi, des déterminants modifiés du CMH, tels que ceux décrits et présentés par des exemples spécifiques, peuvent être utilisés aussi bien que les molécules codées par le CMH, naturelles ou identifiées antérieurement. Des complexes CMH/antigène peuvent être également utilisés pour stimuler les lymphocytes T. Pour activer les lymphocytes T, on peut utiliser des billes enrobées comprenant le complexe CMH/antigène spécifique. Il est 'également possible de provoquer chez les lymphocytes T la formation de lymphocytes T cytotoxiques qui sont dirigés contre l'antigène spécifique.
La méthode générale qui constitue un aspect de la présente invention permet la purification réussie de lymphocytes T spécifiques d'un antigène ou d'un peptide pour tout antigène, y compris les antigènes associés à une tumeur. La méthode consiste à utiliser un substrat solide et à coupler un déterminant du CMH chargé d'un peptide ou antigène au substrat solide. Dans un mode de réalisation, la méthode utilise des billes magnétiques couplées à une haute densité de molécules du CMH qui sont chargées d'un peptide.
Cette méthode permet de purifier, isoler et quantifier des lymphocytes T spécifiques d'une tumeur à partir d'échantillons contenant des lymphocytes T, par exemple des lymphocytes infiltrant une tumeur (TIL) et des échantillons d' exsudât péritonéal (PE). De telles populations de lymphocytes T purifiés peuvent être encore multipliées in vitro et présentent une activité cytotoxique plus élevée et une action anti-tumorale accrue après réinjection à des animaux porteurs d'une tumeur. La nouvelle approche divulguée et revendiquée ici fournit des méthodes importantes pour analyser le répertoire de lymphocytes T au niveau de la spécificité peptidique et pour améliorer de nouveaux traitements thérapeutiques basés sur l'immunothérapie de lymphocytes T adoptifs.
Dans un cas, on a découvert avec surprise que les lymphocytes T, purifiés à partir d'un support solide comprenant le CMH chargé d'un antigène spécifique d'une tumeur, présentent une activité antitumorale renforcée. La présente invention est utile pour tous les types de tumeurs, c'est-à-dire qu'elle s'est avérée efficace non seulement dans le traitement de tumeurs solides, mais aussi dans le traitement de la leucémie, de lymphomes, etc. Toutefois, les méthodes liées à des lymphocytes T spécifiques d'une tumeur ne constituent qu'un mode de réalisation de la présente invention. D'une manière analogue par exemple, des antigènes spécifiques d'un virus peuvent être utilisés dans des méthodes destinées à purifier des lymphocytes T qui sont spécifiques de cellules infectées par un virus. Ainsi, 1 ' homme du métier peut utiliser l' invention décrite avec un antigène quelconque capable de produire, ou connu pour produire, une réponse dans des lymphocytes T afin d'obtenir des lymphocytes T spécifiques d'un antigène ayant une spécificité voulue.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention fournit un outil de diagnostic puissant pour la détection de lymphocytes T présentant un TcR spécifique. Par exemple, les lymphocytes T peuvent être utilisés pour détecter la présence de lymphocytes T qui répondent aux cellules tumorales chez des patients, dans des échantillons ou chez des animaux. Dans d'autres modes de réalisations, l'invention fournit des méthodes, des trousses et des procédés pour analyser et pour utiliser des CTL humains dirigés contre un peptide spécifique. L'identification de peptides dérivés de cellules tumorales permet par exemple de provoquer des réponses de CTL antitumoraux et fournit des réactifs importants pour structurer des immunothérapies antigène-spécifiques et stimuler la recherche et développement futurs d'immunothérapies. Des stratégies d'identification de ces peptides thérapeutiques sont basées sur la sélection de liants du CMH, ayant une affinité élevée, à partir d'antigènes associés à une tumeur. Divers tests de liaison utilisant des systèmes cellulaires (93, 94) ou basés sur des tests en phase solide (95, 101) peuvent être utilisés. D'autres systèmes de test sans cellules, basés sur l' aptitude de peptides concernés à stabiliser des molécules du CMH de classe I vides (102-105) ou à assembler les CMH de classe I à partir de ces sous-ensembles (106) ont été décrits, mais généralement, ils sont complexes du point de vue technique et grevés par le manque de reproductibilité. Une fois définie, l'aptitude des peptides potentiellement immunogènes à induire des CTL capables de tuer sélectivement des cellules tumorales humaines doit être testée. Le progrès accompli dans ce domaine est faible en raison des problèmes pratiques limitant l'utilisation de l'immunisation in vivo et l'absence de reproductibilité des méthodes d'amorçage in vitro.
L'invention décrit la production réussie d'une molécule sSC-A2 biologiquement active. Cette molécule SSC-A2 est repliée convenablement (figure 17) et se lie spécifiquement à des peptides antigéniques restreints par A2 et ne se lie pas à des peptides murins restreints H-2.Kb ou H-2.Kd (figure 18). De plus, les complexes sSC-A2/peptide entrent en interaction avec le récepteur de cellules T approprié et provoquent une réponse proliférative de CTL spécifiques d'un peptide (figure 19). De plus, l'invention montre que les complexes sSC-A2/peptide, lorsqu'ils sont appliqués sous forme d'enrobage de haute densité sur des billes, peuvent être utilisés en tant qu'APC artificielles pour provoquer l'amorçage in vitro de sites spécifiques d'un peptide de cellules naïves PBL HLA A2.1 de donneurs sains.
En possession de l'enseignement combiné issu de la définition des exigences strictes de taille pour les interactions CMH de classe I-peptide, et les motifs de liaison spécifiques du CMH, cette molécule sSC-A2 permet de développer un test de liaison CMH-peptide sensible et fiable. Un tel test serait utile pour identifier des épitopes de lymphocytes T ayant une affinité élevée à partir d'antigènes connus associés à une tumeur, qui peuvent être potentiellement immunogènes pour les CTL. On a décrit récemment divers protocoles pour l'induction par des peptides in vitro de réponses de CTL primaires chez la souris (107-100) et dans des systèmes humains (111-112). Ils indiquent que la condition préalable pour l'amorçage des CTL est la capacité des APC à présenter une densité élevée de complexes peptide-molécules du CMH. Les signaux costimulateurs exigés pour l'activation des lymphocytes T, B7.1 ou B7.2 intégrant avec CD28/CTLA-4 sur des lymphocytes T (113-116), peuvent être également impliqués, bien qu'une publication récente indique que l'interaction B7-CD28 ne soit pas essentielle pour l'amorçage des CTL (86). Les résultats obtenus dans le système murin indiquent que les complexes sSCKd -peptide, lorsqu'ils sont appliqués avec une haute densité comme revêtement de billes magnétiques, peuvent être utilisés pour purifier et quantifier des lymphocytes T spécifiques d'un peptide, issus d'un lymphocyte d'exsudât péritonéal (PEL) isolé, malgré une interaction d'affinité assez faible entre leur TCR apparenté et les molécules peptide/CMH. Ce phénomène sous-tend la relation importante entre l'avidité et l'affinité d'interaction apparente, qui est en bonne corrélation avec le fait que des molécules peptide/CMH dimères se lient au TCR avec une plus grande affinité que les molécules peptide/CMH monomères (117).
On montre ici également que les complexes sSC-
A2/peptide, lorsqu'ils sont appliqués avec une densité élevée sur des billes, peuvent être utilisés en tant qu'APC artificielles pour provoquer l'amorçage in vitro de CTL spécifiques d'un peptide à partir de cellules PBL HLA A2.1 naïves de donneurs sains. Ainsi, un important aspect de la présente invention est la génération et l'utilisation d'APC artificielles. La réponse spécifique présentée peut être la conséquence d'une interaction directe entre les complexes sSC-A2/peptide et le récepteur de CTL approprié ( figures 19 et 21).
Il est important de noter que, bien qu'il ait été décrit que la majorité des CTL spécifiques d'un peptide, générés par des techniques de simulation de peptides in vitro, n'a pas été capable à ce jour de lyser les cibles exprimant des épitopes traités naturellement (107, 111), en utilisant la présente invention, des CTL induits avec les billes peptide M58-66/SC-A2 se sont révélés efficaces pour tuer des lymphocytes T2 activés par peptide (figure 20b). Les CTL spécifiques multipliés utilisent d'une manière prédominante le TCR Vβ17 avec la région CDR3 ayant une longueur de 8 acides aminés, comme décrit pour les CTL spécifiques de M58-66, issus d'une infection virale in vivo (figure 21). Ces résultats indiquent que les CTL spécifiques amorcés par le protocole in vitro décrit tuent les cellules cibles infectées aussi bien que les lymphocytes T2 activés par peptide.
On pourrait objecter que la multiplication in vitro de CTL M58-66-spécifiques n'est pas la conséquence de l'induction primaire, mais probablement une réactivation in vitro, étant donné qu'un précurseur de CTL M58-66 de fréquence relativement élevée a été décrit pour des cellules PBL de donneurs sains (90). Une explication possible est que l'exposition à une attaque virale préalable de la plupart des sujets sains et l'exigence d'une sensibilisation initiale ou d'une réactivation des cellules de mémoire sont des choses très différentes. Toutefois, en utilisant le même protocole et la même méthode dans le laboratoire des présents inventeurs, on a obtenu une multiplication de CTL spécifiques des peptides NA17-A (Y. Guilloux, communication personnelle), une multiplication de CTL MAGE-3- et Melan-A- spécifiques (P. Bosso, communication personnelle) ; une multiplication de CTL spécifiques des peptides MAGE-3 et polyspécifiques des peptides VlH, de plus, les CTL qui ont été amorcés avec les billes peptide MAGE-3/SC-A2 ou peptide Pol VlH/SC-A2 se sont avérés efficaces pour tuer les lymphocytes T2 activés par peptide aussi bien que les cellules tumorales MAGE-3 positives ou les cellules de Jurkat transfectées par Pol VlH.
En utilisant dans le système murin la molécule sSC-Kd murine analogue, on obtient une amplification de CTL spécifique du peptide HLA CW3, spécifique du peptide NP (I. Motta, communication personnelle). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la condition d'induction in vitro est correcte. Ainsi, la différence observée par rapport à l'induction in vitro classique par peptide peut résider dans la différence entre la densité des complexes peptide/sSC-A2 sur des billes et celle des complexes peptide/CMH sur des cellules APC naturelles et/ou en l'absence de molécules co- stimulatrices sur les billes. Ces dernières sont fortement représentées sur des APC telles que des cellules dendritiques, toutefois, il est décrit que des molécules co- stimulatrices telles que les B7.1 ou B7.2 ne sont pas absolument nécessaires pour l'induction initiale (86). Dans le système des présents inventeurs, l'absence d'activité de molécules co-stimulatrices peut être compensée partiellement par la présence de cytokines exogènes dans le milieu de culture. Une référence récente décrit de façon intéressante que des cellules tueuses naturelles (natural killer, NK) sont nécessaires dans l'induction de lymphocytes T cytotoxiques (118-119). On a montré que sSC-Kd dimère peut inhiber d'une manière spécifique l'activité de NK de cellules NK (de souris DBA/2 H-2Kd) (120). Il est possible que des billes APC artificielles enrobées de complexes peptide-sSC-A2 puissent activer de telles cellules NK, car d'autres molécules HLA de classe I sont absentes sur les billes. L'absence de molécules du CMH elles-mêmes sur des cellules APC peut activer des cellules NK (121, 122). Des cellules NK activées produisent de grandes quantités d'IL-4, d'interféron γ (IFN-γ), d'IL-5 et d'IL-10 (voir référence (123)), elles produisent aussi de nombreux autres chemokines, tels que MlP-la, MlP-1b, la lymphotactine et TCA-3. La présence de ces cytokines et de diverses chemokines dans le milieu peut avoir une certaine influence positive sur l'induction d'une réponse immunitaire. Cette activité plausible de billes d'APC artificielles est actuellement à l'étude. Ainsi, en fonction de la méthode d'induction in vitro utilisée, différentes sous-populations de CTL peuvent être générées spécifiquement pour le même épitope peptidique. Que ces sous-populations de CTL diffèrent en terme d'affinité de TCR ou d'avidité de TCR présente de l'intérêt. Les mécanismes qui soutendent l'induction initiale des CTL, ayant comme résultat l'émergence de CTL spécifiques de peptides, avec différentes aptitudes à lyser des cellules cibles activées par peptide et/ou des cellules tumorales, peuvent être équivalents à ceux opérant dans le thymus pendant l' éducation des thymocytes. Toutefois, dans le thymus, des processus de sélection positives et négatives forment le répertoire des lymphocytes T périphériques. La sélection positive est médiée par les cellules épithéliales du thymus cortical (124, 125), tandis que les cellules dendritiques et les macrophages sont supposés être les principaux types cellulaires impliqués dans la sélection négative du thymus (126). Il faut également mentionner les modèles de P. Kourilsky (127) et de P. G. Ashton-Rickardt et S. Tonegawa (128, 129) qui éclairent la notion d'avidité globale d'interaction pendant les processus de sélection positive et négative. Cette avidité d'interaction dépend de plusieurs paramètres comprenant : i) la densité des complexes peptide/CMH sur les cellules de sélection ; ii) l'affinité des TCR sur le thymocyte envers les complexes peptide/CMH positifs (ou négatifs) ; iii) la densité des TCR sur le thymocyte ; iv) la densité de molécules d'adhérence, de co- récepteurs (CD4, CD8), de molécules co-stimulatrices (B7.1, B7.2, CD28/CTLA-4) sur la sélection positive (ou négative) et les cellules sélectionnées. Une étude supplémentaire est nécessaire pour clarifier le mécanisme d'activation de CTL primaires spécifiques.
La présente invention représente la première divulgation et constitue le premier exemple d'une induction in vitro de CTL primaires dans le système humain, utilisant un complexe synthétique peptide/sSC-A2, résultant en cellules effectrices qui tuent les cellules exprimant un antigène spécifique, c'est-à-dire les cellules tumorales. En plus de l'exemple d'induction des CTL présentés ici, les CTL de spécificité et de réactivité tumorale similaires sont générés dans le système murin en utilisant également des billes de complexes peptide/sSC-K issus de cellules naïves H-2K de la rate (I.Motta et YC Lone, étude non publiée).
Il existe de nombreux avantages à utiliser l'invention comprenant le peptide SSC-A2 synthétique en tant que cellule artificielle APC pour générer des CTL spécifiques à partir de donneurs sains. Tout d'abord, le système est d'une définition et d'une reproductibilité élevées. Deuxièmement, par définition, il est dépourvu d'organismes pathogènes viables et n ' exige pas des conditions de manipulation spéciales. Plus important encore, les CTL ayant la spécificité voulue peuvent être sélectionnés pour la multiplication et l'utilisation clinique potentielle, comme c'est évident pour l'homme du métier. La recherche et développement actuel des thérapies par lymphocytes T du cancer humain est entravée pour une grande partie par l'absence d'antigènes tumoraux identifiables (69, 70). Les récents progrès effectués dans la compréhension de l' interaction entre des peptides naturels et des molécules du CMH permettent l'identification de peptides immunogènes similaires dans une séquence de protéines basée sur la présence de résidus spécifiques conservés ("ancres") (71). Les peptides liants les CMH de classe I, qui présentent généralement une longueur de 9-10 résidus, contiennent généralement dans leur séquence deux résidus d'ancrage qui entrent en interaction avec des poches de liaison correspondantes dans la molécule de CMH (72, 74). La définition de motifs spécifiques du CMH permet de prévoir les peptides dérivés d'antigènes d'origine virale ou tumorale qui sont potentiellement immunogènes pour les CTL. Ces peptides se lient généralement avec une bonne affinité à la molécule du CMH considérée (75).
On a produit des molécules recombinantes monocaténaires HLA-A2.1 qui peuvent être utilisées dans la recherche et développement concernant le traitement de cancers humains. La disponibilité de ces molécules permet le développement d'un test rapide et sensible pour l'identification d'épitopes de lymphocytes T présentant un intérêt potentiel. On a construit la structure sSC-A2 en connectant les trois premiers domaines de la chaîne lourde A2.1 à la B2- microglobuline humaine par l'intermédiaire d'un espaceur ayant la longueur de 15 acides aminés. Par transfection dans des cellules basophiles de rats (RBL), la molécule sSC-A2 est sécrétée dans le milieu de culture à partir duquel il peut être purifié. La molécule est repliée correctement et se lie spécifiquement à des peptides antigéniques restreints par A2, mais ne se lie pas à des peptides murins restreints par H-2Kb ou H-2Kd. De plus, les complexes sSC-A2/peptide induisent spécifiquement une réponse proliférative de CTL apparentés et les billes enrobées avec une densité élevée de complexes sSC-A2/peptide sont des APC artificielles efficaces et élicitent in vitro les CTL peptide-spéficiques à partir de PBL HLA-A2.1 naïves de donneurs sains. L'utilitépotentielle de ces molécules sSC-A2 est discutée.
La molécule du CMH
L'expression "complexe majeur d'histocompatibilite", en abrégé "CMH", est connue dans la technique. L'expression est utilisée dans la présente description dans un sens générique, pour désigner l'ensemble de produits géniques comprenant les marqueurs d'histocompatibilite pour un animal. Les complexes CMH/peptide de la présente invention peuvent être obtenus à partir de gènes ou de molécules du CMH naturels ou isolés préalablement ou caractérisés. De plus, on peut utiliser des "déterminants modifiés du CMH" comme partie ou totalité de la molécule du CMH. Les déterminants CMH modifiés imitent fonctionnellement les produits géniques naturels.
Produits géniques du complexe majeur d 'histocompatibilite de classe I et classe II . Les produits géniques du CMH de classe I sont des glycoprotéines qui sont liées de façon non covalente à un peptide appelé β2-microglobuline, en abrégé "β2-m" ou "β2-m". Le composant de classe I est désigné comme la chaîne lourde et la β2- microglobuline, comme la chaîne légère. L'orientation de la molécule du CMH de classe I de la β2-microglobuline dans une membrane cellulaire est illustrée à la figure 1.
En se référant à la figure, la structure de la chaîne lourde est organisée avec 3 domaines exposés, α1, α2 et α3, qui s'étendent depuis la surface cellulaire et sont fixés à un domaine transmembranaire hydrophobe 1 et à un segment court d'ancrage cytoplasmique 2 à l'intérieur de la cellule. Deux domaines extérieurs (α2 et α3) présentent des liaisons disulfure intracaténaires (formant des boucles avec une homologie considérable avec Ig).
La chaîne légère (β2-microglobuline) représentée à la figure 1 présente à peu près la même taille que les domaines α de la chaîne lourde. Chaque domaine est similaire à l'immunoglobuline, et est constitué par un feuillet plissé plié β, maintenu ensemble par une liaison disulfure aux extrémités, donnant une surface de type plan. La chaîne β2 est repliée sur le domaine α3 de la chaîne lourde et les domaines α1 et α2 sont également appariés.
Le gène β2-microglobuline est situé sur un chromosome différent de celui contenant le produit génique du CMH de classe I. Sa structure est bien conservée, tandis que celle des chaînes lourdes varie fortement d'un individu à l'autre en raison des différences dans les séquences d'acides aminés des domaines extérieurs. Le polymorphisme de la chaîne lourde est dû principalement au domaine ai et à un moindre degré au domaine α2.
Les produits des gènes de classe II sont bien caractérisés. Chez la souris, le produit génique de classe II (IA) est constitué par deux chaînes polypeptidiques (α et β, figure 2). Les chaînes α et β sont divisées en deux domaines extérieurs (α1 et α2 ou β1 et β2), les domaines transmembranaires 3 et 4 de la figure 2 et les domaines cytoplasmiques 5 et 6. Les résidus cystéine qui participent à la formation des ponts disulfure sont désignés par S à la figure 2.
Les produits géniques du CMH de classe I et de classe II peuvent être glycosylés. Toutefois, ils peuvent ne pas être nécessairement glycosylés lorsqu'ils sont utilisés dans la présente invention. Déterminants modifiés du CMH de classe I et de classe II . Les descriptions des demandes U.S. en cours d'examen, n° de série 08/487650, déposée le 7 juin 1995 et 08/370476 déposée le 9 janvier 1995, fournissent les méthodes pour la production et l'utilisation de déterminants modifiés du CMH ainsi qu'une discussion générale sur les CMH et les gènes du CMH chez les mammifères. De même, la demande de brevet U.S. en cours d'examen, n° de série 07/801818, déposée le 5 décembre 1991, décrit le déterminant modifié du CMH et des molécules et gènes du CMH. Le contenu total de ces demandes en cours d'examen est incorporé ici spécifiquement à titre de référence. L'homme du métier peut utiliser la publication des demandes en cours d'examen pour produire une variété de complexes CMH/peptide. Les informations correspondantes sont également données dans (20), (21), (24), (76), (78) à (80), en particulier dans (76).
Toute référence dans ce qui suit aux demandes US ci-dessus équivant de manière implicite à une référence à au moins l'un de ces documents.
Un déterminant modifié du CMH de classe I est représenté schématiquement à la figure 3A. Le domaine α3 de la chaîne lourde est lié au domaine de microglobuline au moyen d'un espaceur (représenté en pointillé à la figure 3A). Le produit résultant, qui est représenté en forme de schémabloc à la figure 3B, est le déterminant modifié du CMH de classe I et comprend les domaines de a1, α2, α3 et β2- microglobuline liés par covalence, en séquence. Comme représenté à la figure 3A, le domaine α3 de la chaîne lourde est dépourvu de la région la plus proche de la région 1 du domaine transmembranaire de la figure 1 jusqu'à la terminaison carboxyle du segment cytoplasmique 2 . Les déterminants modifiés du CMH de classe I peuvent être préparés par une sélection appropriée du locus CMH codant pour les domaines α1, α2, α3, et un gène codant pour le domaine β2-microglobuline, de sorte que chacun de ces domaines va conserver sa fonction soit d ' activation des lymphocytes T cytotoxiques, soit de présentation d'antigènes à des récepteurs de cellules T, soit ces deux fonctions à la fois. Que la molécule particulière possède ou non l'une de ces fonctions, ou les deux, peut être déterminé par une expérimentation de routine connue dans la technique. L'expression du polypeptide codé par le locus CMH peut être réalisée par des techniques d'ADN recombinant.
Un déterminant du CMH de classe II modifié selon l'invention est représenté schématiquement à la figure 4A. A la figure 4A, la terminaison amino du domaine α1 est liée à la terminaison carboxyle du domaine β1, par exemple au moyen d'un espaceur (en pointillé). De même, la terminaison carboxyle du domaine α2 est liée à la terminaison amino du domaine β2, par exemple au moyen d'un autre espaceur (en pointillé). Le produit résultant est le déterminant modifié CMH de classe II selon la présente invention, qui peut être représenté par le schéma-bloc représenté à la figure 4B. Le déterminant modifié comprend les domaines β2, α2, α1 et β1 liés par covalence, en séquence. Comme représenté à la figure 4A, le déterminant modifié est dépourvu des régions voisines des domaines transmembranaires 3 et 4 de la figure 2 s'étendant jusqu'à la terminaison carboxyle des segments cytoplasmiques 5 et 6 qui sont normalement fixés à la chaîne α1, α2 et à la chaîne β1, β2, respectivement. Une fois encore, les portions des locus du CMH sont sélectionnées pour conserver la fonction des domaines dans la stimulation d'une réponse cytotoxique ou dans la présentation d'antigènes aux récepteurs de cellules T, ou les deux. L'un quelconque des polypeptides appropriés d'un complexe majeur d'histocompatibilite peut être choisi et utilisé pour générer des complexes CMH/peptide de la présente invention. Les locus génétiques appropriés correspondant à une molécule du CMH peuvent être également utilisés dans des moyens recombinants pour produire le CMH dans les complexes CMH/peptide de la présente invention. L'homme du métier est familier avec de nombreux exemples d'allèles de CMH de diverses espèces, dont chacun peut être sélectionné de manière appropriée et utilisé comme décrit.
Jonction des domaines polypeptidiqu.es du déterminant modifié du CMH . Les domaines des déterminants modifiés du CMH correspondent à des domaines codés par les locus naturels du CMH et leurs variantes, qui codent pour des produits du CMH capables de produire une réponse cytotoxique par des lymphocytes T appropriés ou d'induire une réponse immunitaire par des lymphocytes. Les déterminants modifiés du CMH de classe I et de classe II utilisés diffèrent des produits géniques naturels du CMH de mammifères par le fait que les domaines des produits géniques sont liés par covalence, par exemple au moyen d'un espaceur. De même, le déterminant modifié du CMH de classe II de la présente invention est constitué par une chaîne polypeptidique dans laquelle les domaines β2-α2-α1-β1 sont liés par covalence. Ces domaines ne sont jamais liés de cette façon dans la nature. Les déterminants modifiés du CMH de classes I et II sont identiques par ailleurs aux produits géniques naturels correspondants du CMH.
Les déterminants modifiés du CMH peuvent être obtenus à partir de structures d'ADN codant pour les domaines du CMH, de façon qu'il existe une traduction transcriptionnelle. Par exemple, dans le cas de déterminants du CMH de classe I, la structure d'ADN contient une séquence d'ADN codant pour les domaines α1, α2 et α3 liés à une séquence d'ADN codant pour le domaine β2m, de sorte qu'il existe une traduction transcriptionnelle à partir de l'extrémité 5' de l'ADN codant pour le domaine α3 jusqu'à l'extrémité 3' de la séquence d'ADN codant pour le domaine β2m. De même, les déterminants modifiés du CMH de classe II selon l'invention peuvent être obtenus à partir de constructions d'ADN dans lesquelles il existe une traduction transcriptionnelle d'une séquence d'ADN codant pour les domaines β2- α2-α1- β1.
Les domaines du CMH peuvent être liés par covalence par des espaceurs appropriés. Les espaceurs peuvent fonctionner en tant que charnières pour le déterminant modifié. Toute séquence d'acides aminés contenant les résidus appropriés et ayant la longueur convenable qui correspond à ce qui est connu dans la technique en tant que charnière ou région charnière peut être utilisée. Les demandes U.S. en cours d'examen n° de série 07/801818, 08/487650 et 08/370476 décrivent des espaceurs particuliers et des séquences nucléotidiques et d'acides aminés qui peuvent être utilisés.
De plus, le peptide qui doit être associé à la molécule du CMH peut être éventuellement lié à la région de l'espaceur.
L'antigène peptidique
L'antigène ou peptide qui doit être chargé sur une molécule du CMH de classe I appropriée, ou sur un déterminant modifié du CMH, contient typiquement d'environ 5 à environ 20 résidus d'acides aminés, de préférence 8, 9 ou 10 résidus d'acides aminés. On peut utiliser des peptides plus longs avec les déterminants modifiés du CMH de classe II.
Les peptides naturels qui se lient à des produits géniques du CMH peuvent être modifiés en une ou plusieurs positions par substitution d'autres acides aminés ou par délétion d'acides aminés. De cette façon, l'homme du métier peut produire de nombreux antigènes peptidiques pouvant être utilisés avec la présente invention à partir d'un peptide qui se lie à des produits géniques du CMH.
Le peptide modifié ne va pas nécessairement présenter les mêmes caractéristiques de liaison que le peptide naturel ou non modifié. Toutefois, l'homme du métier peut observer et identifier des motifs peptidiques spécifiques d'un allèle, capables d'être présentés par des déterminants appropriés du CMH. Ces motifs peptidiques contiennent typiquement deux positions d ' ancrage occupées par un résidu d'acide aminé invariant ou par l'un parmi quelques résidus d'acide aminé conservés, avec des chaînes latérales étroitement apparentées. Les positions d'ancrage ne sont pas toujours au même emplacement dans les différents motifs. La structure du peptide modifié peut correspondre à des caractéristiques du sillon lié au peptide du déterminant modifié du CMH. Ainsi, les poches allèle-spécifiques des déterminants modifiés du CMH de la présente invention et les chaînes latérales des résidus d'ancrage allèle-spécifiques peuvent présenter de préférence des structures complémentaires.
En particulier, les antigènes spécifiques d'une tumeur qui peuvent être utilisés dans la présente invention sont typiquement les antigènes qui sont exprimés uniquement sur des cellules tumorales et non sur des cellules normales. L'homme du métier connaît bien de nombreux antigènes spécifiques d'une tumeur qui peuvent être utilisés pour générer les peptides de la présente invention. Par exemple, des antigènes tumoraux restreints par le CMH de classe I comprennent : P1A (testicules), Connexin 37 (poumons), MAGE- 1 (mélanocytes), MAGE-3 (mélanocytes), MARTl/Aa (mélanocytes), gp100 (mélanocytes), p53 (sein et colon) et tyrosinase (mélanocytes). De nombreux autres exemples existent et peuvent être utilisés pour générer les peptides qui sont utilisables selon la présente invention. Voir (55), (57) et (58) pour des listes représentatives d'antigènes, de protéines ou de peptides. De plus, les demandes en cours d'examen n° de série 08/370476 et 08/487650 contiennent des listes d'antigènes apparentés à des cellules infectées par VlH, par la grippe et d'autres peptides, qui peuvent être utilisés selon la présente invention.
Les peptides préférés pour l'aspect lymphocyte T spécifique d'une tumeur de la présente invention comprennent, sans y être limités, les exemples suivants :
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Ces peptides sont connus dans la technique et peuvent être fournis par Neosystem (Strasbourg, France). Des librairies peptidiques peuvent être fournies par Hidde Ploegh (MIT).
Quelques directives pour sélectionner des combinaisons peptide/CMH. Généralement, l'homme du métier peut sélectionner des combinaisons appropriées de domaines du CMH pour les utiliser dans la génération de complexes CMH/peptide selon la présente invention. La connaissance de l' antigène peptidique voulu et de ses caractéristiques de réponse immunitaire chez un animal particulier peuvent être suffisantes en plus d'une expérimentation de routine. La présente description et celle des demandes U.S. en cours d'examen mentionnées ci-dessus fournissent de nombreux exemples de peptides ayant des éléments de restriction appropriés pour sélectionner des domaines du CMH. En plus des combinaisons énumérées, l'homme du métier peut utiliser la présente invention avec l'information concernant tout autre peptide et élément de restriction qui peut être indépendamment identifié ou devenir disponible. De plus, l'homme du métier peut déduire, à partir de la structure d'antigènes peptidiques connus, les domaines appropriés du CMH à utiliser avec un peptide particulier. La présente description et les références citées comprennent à la fois l'information concernant des antigènes peptidiques connus et la déduction des combinaisons CMH-peptide à sélectionner. On peut également utiliser l'information suivante : (a) Un peptide reconnu par des lymphocytes T humains peut se lier à plusieurs molécules HLA des classes I et II. Néanmoins, la liaison préférentielle de peptides à leurs molécules de restriction respectives est également observée. (b) La liaison de molécules HLA à des peptides reconnus par des lymphocytes T murins se produit moins fréquemment, mais se produit et de tels mécanismes sont prévus par la présente invention, (c) Il existe des peptides VlH-1 contenant des résidus agrétopiques qui permettent leur liaison à des molécules HLA et qui sont particulièrement intéressants dans le domaine de l'invention, (d) La cinétique de l'association HLA/peptide dépend du peptide testé et elle est plus rapide que, ou similaire à, celle pour des molécules la. (e) La liaison de la molécule peptide/HLA dépend souvent de la longueur, du nombre de charges positives et de la présence de résidus hydrophobes dans le peptide. (f) Une corrélation peut être observée entre l'effet inhibiteur du peptide dans l'inhibition du test de la liaison peptidique (IPBA) et son effet de blocage dans le test cytolytique.
D'autres exemples de peptides typiques qui peuvent être combinés à des déterminants modifiés du CMH utilisés dans la présente invention sont indiqués ci-après.
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Des exemples d'autres épitopes peptidiques qui peuvent être combinés à des déterminants modifiés du CMH utilisés dans la présente invention sont indiqués ci-après.
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Peptides spécifiques d'une tumeur et éléments de restriction de HLA correspondants
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Les antigènes décrits dans les tableaux ci-dessus sont simplement représentatifs d'antigènes qui peuvent être présentés à des récepteurs cellulaires en association avec les déterminants modifiés du CMH ou les molécules dérivées du CMH de la présente invention. D'autres antigènes pouvant former des complexes avec les déterminants peuvent être également utilisés. L'utilisation à la fois d'un test de liaison peptidique direct (PBA) et de l'inhibition du test de liaison peptidique (IPBA), les interactions physiques entre les molécules de HLA et les peptides peuvent être analysées. En particulier, les tests peuvent être réalisés comme suit. Test direct de liaisons peptidiques (PBA) . Des puits de plaques de microtitrage sont prétraités avec 100 μl de glutaraldéhyde à 2,5 % dans de l'eau distillée pendant 2 heures à 20°C, ils sont lavés avec de l'eau distillée et revêtus pendant 16 heures à 4°C avec 100 μl de peptide dilué à 5 μg/ml, soit dans un tampon carbonate-bicarbonate, pH 9,6, soit dans du PBS, pH 7,4 ou pH 7,5. Les sites libres restants sont bloqués par incubation pendant 2 heures à 20°C avec du BSA dilué à 1 % dans du PBS contenant du Tween 20 à 0,05 % (Tw) et 0,02 % d'azoture de sodium. Après lavage, on ajoute des molécules de 125I-HLA purifiées (100 μl contenant 1,5 x 105 cpm, 10-9 M) diluées dans du PBS contenant 1 % de
BSA, 0,05 % de Tw, 0,02 % d'azoture de sodium, 1 mM de PMSF et 10 μg/ml d'inhibiteur de trypsine et on incube pendant 20 heures à 20°C. Après lavage approfondi, on mesure par comptage la radioactivité de chaque puits.
Inhibition du test de liaison peptidique ( IPBA) . On incube des concentrations de 0,1-100 μm de peptides compétiteurs dans des tubes pendant 0-3 heures à 20°C avec 125I-HLA (10-9 M) dilué dans PBS-BSA-Tw contenant des inhibiteurs de protéases tels que mentionnés ci-dessus. Ensuite on introduit le mélange dans les puits de la plaque de microtitrage revêtu avec un peptide qui présente une liaison significative aux molécules de HLA dans le test direct et on incube la plaque pendant 20 heures à 20°C. Après lavage approfondi, on mesure par comptage la radioactivité de chaque puits et on calcule le pourcentage d' inhibition.
Compétition entre peptides dans un test lytique . On génère des CTL anti-peptide humains (37). Brièvement, on stimule 6-8 x 107 PBMC avec 100 μg d'un peptide synthétique dans 10 ml d'un milieu de culture (RPMI 1640 complémenté avec 100 μg/ml de péniciline, 100 μg/ml de streptomycine,
2 mM de L-glutamine, 2 mM d'acides aminés non essentiels, 1 mM de pyruvate de sodium, 10 mM de Hepes et 10 % d'un pool de sérum humain AB inactivé par la chaleur). Après incubation pendant 7 jours, on effectue une stimulation secondaire in vitro en mélangeant 5-7 x 106 cellules effectrices avec 2-3 x 107 PBMC irradiés (4000 rads) autologues dans 10 ml de milieu de culture contenant
50-100 μg de peptides.
Dans la plupart des cas, les épitopes de lymphocytes T sont reconnus en association avec seulement quelques éléments de restriction du CMH, sinon un seul de ces éléments. Au contraire, certains peptides peuvent être reconnus en association avec plusieurs molécules de H-2 ou HLA. De plus, un seul peptide peut être reconnu par les lymphocytes T restreints par les CMH à la fois de classe I et de classe II. Etant donné que les molécules de classe I et de classe II ont une structure tertiaire prévue similaire, comprenant un seul site de liaison antigénique, les interactions entre les peptides et ces deux sites de molécules sont également comprises dans la présente invention. De plus, il faut noter que la présente invention englobe la liaison d'antigènes normalement associés avec le CMH d'une seule espèce, telle que H-2, aux déterminants modifiés du CMH d'une autre espèce, telle que HLA.
La formation de compositions comprenant des' antigènes liés aux déterminants modifiés du CMH selon l'invention peut être basée sur des peptides connus pour être antigéniques dans des maladies telles que le SIDA (protéines ou peptides ga, nef, vif, rev, vpr ou env), la sclérose en plaques (protéines à base de myéline), le choc toxique (bactérie) ou le venin de serpent (région antigénique pour un venin de serpent particulier, à base d'alcaloïdes et à base de protéines ; le traitement habituel de la morsure de serpent est basé sur l'administration d'anticorps dirigés contre un venin particulier). Ces compositions peuvent être formulées de façon à permettre que le potentiel de reconnaissance de la cible d'une cellule d'un système immunitaire soit redirigé spécifiquement vers l'antigène en présentation avec le déterminant modifié du CMH. Il faut noter que des librairies constituées de différents déterminants modifiés du CMH selon l'invention et des antigènes associés peuvent être préparées. Ainsi, il est possible de formuler des compositions comprenant deux ou plus de deux membres de la librairie en une combinaison ou quantité quelconque, comme pour cibler différents récepteurs simultanément ou séquentiellement.
Alors que la présente invention a été décrite en se référant à l'utilisation de peptides pour lier des déterminants modifiés du CMH, il est également possible d'utiliser d'autres matériels antigéniques. Par exemple, des peptides combinés à des haptènes en général peuvent être utilisés. Les peptides peuvent être combinés à des métaux tels que le nickel. Des peptides peuvent être également combinés à des hydrates de carbone. Certains produits chimiques, tels que l'arsonate de p-benzoyle, se lient également directement au sillon des matériels du CMH. Des antigènes appropriés sont passés en revue par P. Kourilsky et J.M. Claverie dans "Advances in Immunology" (1989).
De même, les déterminants modifiés du CMH de l'invention peuvent être chargés d'immunotoxines classiques et dirigés contre un lymphocyte T associé à une maladie autoimmune afin de désactiver le lymphocyte T. La toxine de la diphtérie ou des sous-ensembles de celles-ci et la toxine de Pseudomonas A sont des exemples d'immunotoxines appropriées. CMH en association avec un antigène peptidigue
Le degré de charge d'antigène peptidique du déterminant modifié du CMH est variable. Le déterminant modifié du CMH est employé typiquement en une quantité d'environ 10 à environ 1 000 μg/ml et le peptide est utilisé en une quantité d'environ 10 à environ 1 000 ug/ml.
L'association physique de peptides antigéniques et de déterminants modifiés du CMH de classe I et de classe II, selon l'invention, ou de tout CMH utilisé dans la présente invention, peut être suivie en utilisant le test direct de liaison peptidique (PBA) en phase solide ou l'inhibition du test de liaison peptidique (IPBA) dans lequel le peptide compétiteur est présent dans une phase soluble. Ces deux tests sont connus dans la technique. D'autres tests mesurant les variations de fluorescence d'un peptide marqué approprié sous forme soluble lorsqu'il se lie à un CMH soluble ou à un déterminant modifié du CMH sont également disponibles et connus dans la technique. L'aptitude de différents peptides à inhiber l'activité lytique de lymphocytes T cytolytiques antiviraux humains vis-à-vis de cellules incubées avec le peptide cible correspondant peut être également étudiée comme une mesure de l'aptitude et de l'efficacité de la liaison antigénique et de la présentation de l'antigène. Liaison de cellules au complexe CMH/peptide
Dans un mode de réalisation, la présente invention décrit, pour la première fois, la quantification et la purification de lymphocytes T à partir d'une population cellulaire complexe, selon leur spécificité (tableau 1). Les inventeurs ont en effet montré que des complexes CMH/peptide appliqués en revêtement induisent l'adhésion de lymphocytes T antigène-spécifiques. L'utilisation de cette technique permet ainsi d'enrichir une population de cellules T complexe en lymphocytes spécifiques d'un antigène. On a utilisé l'invention, dans un de ses modes de réalisation, pour la caractérisation fonctionnelle de lymphocytes T spécifiques d'une tumeur, prélevés sur un site tumoral. On a également utilisé les lymphocytes T purifiés et multipliés pour protéger des animaux contre le développement tumoral dans des conditions qui sont normalement létales chez l'animal. Dans un système de modèle tumoral (P815-Cw3), il est montré qu'entre 1 et 2 % de cellules infiltrant la tumeur sont réellement spécifiques de la tumeur. Néanmoins, cette petite fraction présente une forte activité antitumorale à la fois in vitro et in vivo. Ainsi, une fois purifiés par adsorption sur des complexes SC-Kd/Cw3 et après amplification in vitro, les caractéristiques des lymphocytes T fournis par la présente invention présentent des avantages nets dans les traitements thérapeutiques. De même, une information importante dans l'analyse de la réponse des lymphocytes T à des antigènes spécifiques chez les animaux peut être obtenue à partir des lymphocytes T de la présente invention. L'homme du métier reconnaît l'importance de ces résultats dans le domaine des approches thérapeutiques pour attaquer le développement tumoral chez un animal et les approches de diagnostic pour identifier les tumeurs présentes chez un animal. De plus, on n'a pas observé de mortalité cellulaire massive pendant la purification (tableau 1). Lorsque des cellules purifiées sont amplifiées in vitro, on peut ajouter à la culture des cytokines et des splénocytes irradiés qui peuvent éviter l'induction de l'apoptose. Ainsi, les inventeurs ont également fourni des conditions de purification et de culture améliorées pour la multiplication des lymphocytes T, en particulier des populations de lymphocytes T spécifiques d'un antigène. Les modes opératoires décrits peuvent être également sélectionnés pour des lymphocytes T d'avidité élevée, exprimant un taux élevé de TCR et de CD8 et/ou de TCR ayant une grande affinité. L'identification et la caractérisation des lymphocytes T d ' avidité élevée peut fournir une information importante concernant l'immunogénicité de certains antigènes. Les méthodes et tests de diagnostic destinés à déterminer la présence de lymphocytes T d'avidité élevée peuvent être extrapolés par l'homme du métier à partir de la divulgation de la présente invention.
De nombreuses études ont montré que des lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) peuvent réagir in vitro avec des cellules cancéreuses autologues (6). Chez l'homme, des TIL ont été isolés à partir de patients et utilisés pour l'immunothérapie adoptive après amplification in vitro avec IL-2. Des réponses objectives ont été observées pour un faible pourcentage de patients traités. Plusieurs hypothèses non exclusives ont été proposées pour expliquer ces résultats décevants. Une d'entre elles est que seulement une petite fraction des TIL peut être réellement spécifique de la tumeur. Un autre facteur est l'anergie. Les tumeurs peuvent être souvent faiblement immunogéniques et ainsi, n'activent pas suffisamment la multiplication des lymphocytes T. L'absence de molécules co-stimulatrices telles que B7.1 ou B7.2, ou la présence de signaux inhibiteurs (56) ainsi que la sécrétion de facteurs immunosuppresseurs tels que TGF-b et IL-10 (40), ont été décrits comme influençant la réponse des lymphocytes T (pour une revue à ce sujet, voir (41)). De plus, l'amplification in vitro de TIL non purifiés a été décrite récemment comme réduisant l'activité anti-tumorale (45). En fait, on pourrait s'attendre à ce que l'occupation du TCR en l'absence de co-signal induise l'anergie ou même l'apoptose des lymphocytes T (46) plutôt que leur activation.
Le succès limité des études concernant l'injection de TIL pourrait être également dû à des cellules anergiques à l'intérieur de la tumeur. De tels TIL anergiques pourraient entrer en compétition pour des cytokines et pour accéder aux cellules cibles tumorales. L'anergie pourrait résulter de la modulation du TCR ou de CD8, comme démontré dans le cas de tolérance extrathymique à des auto-antigènes (42) et à des non auto-antigènes (43). De plus, certaines cellules pourraient maintenir un taux normal de TCR et d'expression de co-récepteur, mais elles présentent un bloc sur le trajet de transduction de signal (44). Les inventeurs démontrent qu'il est possible d'enrichir des TIL en lymphocytes T spécifiques d'une tumeur et d'augmenter leur activité cytotoxique, même lorsque ces cellules spécifiques représentent une petite fraction de celles ayant infiltré la tumeur. Le fait de trier les lymphocytes spécifiques d'un peptide avant et/ou après amplification in vitro devrait permettre de réaliser des immunothérapies adoptives mieux contrôlées chez l'homme et chez les animaux. La molécule monocaténaire soluble de HLA- A2, décrite ci-après, permet de réaliser de telles immunothérapies, comme l'indiquent les résultats et les données ci-après. Comme mentionné ci-dessus, bien que certains des peptides cités en exemple dans la présente description soient issus de tumeurs, l'enseignement de cette publication dans son ensemble peut être également utilisé pour déterminer les réponses antivirales et purifier des lymphocytes T spécifiques de cellules infectées par un virus. Enfin, l'isolement de lymphocytes T spécifiques d'un peptide par adsorption sur des complexes CMH/peptide devrait ouvrir de nouvelles voies pour l' analyse de répertoirs de lymphocytes T par couplage d'approches structurelles et d'études fonctionnelles.
Dans la description des modes de réalisation ci-après, on utilise des complexes recombinants CMH/peptide pour purifier et quantifier des lymphocytes T en fonction de la spécificité de leur TCR. Comme modèle, on a étudié sur des souris DBA/2 la réponse fortement ciblée des lymphocytes T à un mastocytome P815 transfecté avec le gène HLA-Cw3 humain (appelé ci-après P815-Cw3) (11-13). Etant donné que les séquences TCRβ amplifiées dans cette réponse présentent une diversité très limitée, les lymphocytes T spécifiques pourraient être suivis indépendamment par cytometrie ou en utilisant une technique de PCR développée dans notre laboratoire (12, 14). On a élargi cette approche à des tumeurs solides. On a isolé des lymphocytes T spécifiques d'une tumeur à partir d'un site tumoral et on a analysé leur caractéristiques structurelles et fonctionnelles. Il est montré que des lymphocytes T spécifiques d'une tumeur ne représentent qu'une petite fraction des TIL. Après purification par adsorption sur des complexes spécifiques CMH/peptide, on réinjecte les TIL spécifiques d'une tumeur à l'animal receveur, où ils déploient une protection antitumorale puissante. Ainsi, la présente invention répond à un besoin de la technique pour une méthode efficace de purification et d'isolement, en grandes quantités, de lymphocytes T spécifiques d'un antigène.
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Légende correspondant au tableau 1 :
Caractérisation phénotypique de PEL issus de souris
immunisées contre P815-Cw3 avant et après adsorption sur des complexes SC-Kd Cw3.
On purifie des PEL sur un gradient de percoll et on analyse leur expression de CD8, CD4 et Vβ10 à la surface cellulaire par cytometrie, avant et après adsorption sur des complexes SC-Kd/Cw3.
* Le nombre total de cellules est déterminé avant et après purification. Le pourcentage des différents sous-ensembles cellulaires est calculé en utilisant la version 1.2.1 du logiciel CellQuest (Becton Dickinson, Erembodegem-Aalast, Belgique). Le nombre absolu de cellules dans chaque sous- ensemble est obtenu par multiplication du nombre total de cellules par le pourcentage du sous-ensemble.
# L'enrichissement est obtenu en divisant le pourcentage du sous-ensemble de la population cellulaire totale après adsorption sur SC-Kd/Cw3 par le pourcentage obtenu avant adsorption. § Le pourcentage de rendement est obtenue en divisant le nombre absolu de cellules du sous-ensemble après adsorption du SC-Kd/Cw3 par ce même nombre avant adsorption, et multiplication du résultat par 100.
Induction de CTL primaires spécifiques utilisant des complexes CMH/peptide . La stimulation de lymphocytes T non sensibilisés est contrôlée par des cellules présentatrices d'antigènes spécialisées (APC) qui expriment des molécules du CMH et diverses molécules co-stimulatrices. Pour déterminer l'exigence minimale pour des lymphocytes T stimulateurs, on utilise des APC artificielles (billes) comprenant un complexe CMH/peptide choisi, de préférence avec une densité élevée de complexes CMH/peptide. La molécule monocaténaire soluble de HLA-A2.1 humaine (SC-A2) est obtenue par ingénierie, en connectant les trois premiers domaines de la chaîne lourde A2.I à la b-microglobuline humaine par l'intermédiaire d'un espaceur ayant une longueur de 15 acides aminés, et elle est sécrétée dans le milieu de culture par des cellules basophiles de rats (RBL). Elle peut être purifiée par chromatographie d'affinité en utilisant l'anticorps monoclonal W6.32 anti-HLA-A2 et présente des fonctions biologiques. On a montré que SC-A2 purifié se lie spécifiquement à des peptides antigéniques restreints par A2 et ne se lie pas à des peptides murins restreints par H2-Kb ou H2-Kd. Les complexes CMH/peptide chargés avec une haute densité sur un support solide induisent certains lymphocytes T CD8 à produire des réponses prolifératives pour produire de la cytokine (IL-2), et à présenter une activité cytotoxique vis-à-vis d'antigènes peptidiques définis in vitro. De plus, SC-A2 chargé en peptides peut induire in vitro des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) primaires spécifiques d'un peptide, issus de cellules naïves PBL HLA-A2.1 de donneurs sains. Le complexe CMH/peptide enrobant les billes agit également en tant qu'APC pour éliciter des réponses primaires à des antigènes spécifiques d'une tumeur, chez la souris. SC-A2 présente ainsi des caractéristiques similaires à celles de SC-Kd en ce qui concerne sa structure et sa fonction
Les peptides synthétiques qui constituent un épitope de CTL peuvent se lier directement à la surface cellulaire de molécules de CMH de classe I. Apparemment, aucun événement intracellulaire n'est impliqué ou requis. L'association de peptides de classe I à la surface cellulaire dépend essentiellement de la présence de molécules de classe I vides qui portent des peptides endogènes à liaison médiocre. Sur la plupart des types cellulaires, seule une petite fraction de la surface cellulaire totale de la molécule de classe I est vide. Par conséquent, charger la surface cellulaire de peptides liants de classe I est inefficace dans la plupart des cellules.
La molécule recombinante du CMH de classe I décrite précédemment (SC-Kd) a été produite et purifiée comme une molécule monocaténaire soluble. (Voir les demandes U.S. en cours d'examen 07/801818, 08/487650 et/ou 08/370476). SC-Kd fonctionnel peut être obtenu en grande quantité à partir de cellules CHO transfectées de manière appropriée et chargées avec le peptide voulu.
La disponibilité de ces deux structures (SC-A2 et SC- Kd), ou de toute autre structure produite selon la présente description, crée une source de molécules du CMH qui peuvent être chargées avec un antigène spécifique. Lorsqu'on utilise ces molécules de CMH chargées, couplées à un support solide, il est généré une APC artificielle qui peut imiter l'APC naturelle. Ainsi, on peut diriger toutes les fonctions connues d'APC vers un peptide ou antigène particulier. Les APC artificielles et les méthodes qui les utilisent pour obtenir des CTL spécifiques d'un antigène sont des aspects importants de la présente invention. Par exemple, ces molécules du CMH fonctionnent de façon à lier un peptide spécifique et peuvent induire des CTL spécifiques primaires. En outre, les caractéristiques structurales de ces CTL ont été déterminées par analyse de la chaîne TCR-β, qui a révélé des réarrangements très similaires, et même identiques, à ceux trouvés chez les CTL générés par immunisation in vivo. Ces CTL primaires sont capables de reconnaître un peptide endogène sur une cellule tumorale syngénique chez la souris et de reconnaître des cellules infectées par VlH chez l'homme. Ces CTL sont également utilisés pour le transfert adoptif cellulaire conduisant au rejet de tumeurs in vivo.
L'aptitude des complexes SC-Kd et SC-A2/peptide à activer des précurseurs de CTL peptide-spécifiques a été étudiée in vitro. On a ainsi mis en évidence qu'il est possible d'induire une expansion de CTL spécifiques de peptides de HLA-CW3 et du virus influenza dans des cultures de cellules naïves de rate de souris stimulées par des complexes SC-Kd/peptide couplés sur des billes. L'efficacité de ces derniers s'avère comparable à celles d'APC connues, comme les cellules dendritiques.
Rctivation totale de cellules T naïves CD8 + en l ' absence de co-stimulation
La co-stimulation est considérée comme critique pour obtenir une induction optimale des réponses des cellules T.
Les modèles courants suggèrent que l'activation des cellules T naïves est habituellement déterminée par une combinaison de 2 signaux.
Le signal 1 fonctionne à travers le complexe TCR antigène- spécifique. Le signal 2 dépend d'une interaction entre des molécules spécialisées exprimées à la surface de la cellule T et leurs contre-parties sur l'APC (signal 2).
Comme indiqué dans la présente description, dans certaines conditions, les cellules T n'ont pas besoin de co- stimulation, en particulier via la voie médiée par CD28.
Pour vérifier la délivrance possible de co-signaux par l'environnement cellulaire ou la possible contribution de molécules d'adhésion, un système expérimental, dépourvu de cellules, a été développé, selon l'invention, pour l'activation de cellules T. On a utilisé SC-Kd chargé avec le peptide HA du virus de l' influenza pour stimuler des splénocytes naïfs CD8+ très purifiés, provenant de souris transgéniques pour un TCR spécifique pour le peptide HA. Les résultats obtenus ont montré qu'un tel stimulus acellulaire est suffisant pour donner naissance à des cellules présentant un phénotype activé, d'une manière dose-dépendante. Ces cellules prolifèrent, sécrètent des cytokines et présentent une activité cytotoxique en l'absence d'une co-stimulation et d'IL-2 exogène. Ainsi, l'invention démontre que des splénocytes CD8+ peuvent être totalement activés par leur seul engagement TCR. Le degré de pureté des cellules T CD8+ obtenues est très élevé, atteignant 98,5% dans les conditions d'expérimentation.
Ces résultats débouchent sur des applications en immunothérapie et la compréhension des mécanismes de self - tolérance qui font également partie de l'invention. En particulier, dans la conception de vaccins basés sur des peptides, on tiendra compte de différences de besoin de co- stimulation pour les cellules CD4+ et celles CD8+ et de l'exigence de co-stimulation peptide-spécifique.
Liaison à des récepteurs cellulaires de lymphocytes . Les déterminants modifiés du CMH de classe I et de classe II selon l'invention, et les compositions comprenant des antigènes liés aux déterminants modifiés, sont reconnaissables par les récepteurs sur les lymphocytes T.
En particulier, la structure de reconnaissance d'antigène et de CMH des lymphocytes T est appelée ici récepteur de cellules T. Le récepteur de cellules T impliqué dans la reconnaissance d'antigènes et de CMH est caractérisé dans le tableau 2. Des régions variables des chaînes a et b forment le site de liaison antigénique et déterminent également la spécificité du CMH. En présence d'antigènes et de CMH, le lymphocyte T est activé. Il en résulte la phosphorylation d'au moins deux sous-ensembles du complexe récepteur, les chaines δ et ε.
Tableau 2. Structures de surface impliquées dans la reconnaissance d'antigène par des lymphocytes T humains
Figure imgf000048_0001
Deux autres chaînes à la surface des lymphocytes T, T4 (CD4) et T8 (CD8), sont associées à la reconnaissance des déterminants modifiés du CMH de classe I ou de classe II selon l'invention, sans entrer en interaction avec l'antigène. Ces molécules peuvent se lier normalement à des déterminants non-polymorphiques (constants) sur des produits géniques de classe I ou de classe II de la cellule présentant l'antigène. Ces molécules peuvent être également associées au récepteur de cellules T.
Un résumé de la relation entre les molécules du CMH de classe I et de classe II et le type de lymphocytes T immunoréactifs est indiqué dans le tableau 3.
Tableau 3. Restrictions de l' activation des cellules
lymphoïdes
Figure imgf000049_0001
L'activation de cellules auxiliaires T et des cellules effectrices à hypersensibilité retardée (DTH) sont restreintes par les antigènes et les molécules du CMH de classe II ; les activités du CTL sont restreintes par les antigènes et les molécules du CMH de classe I ou de classe II. La suppression peut être restreinte par la classe I ou non restreinte. Le phenotype de surface (CD4 ou CD8 ) est en corrélation essentiellement avec la reconnaissance de CMH de classe II (CD4 ) ou de classe I (CD8+). Si l'on considère le rôle régulateur important des cellules inductrices restreintes par la classe II (dont toutes sont CD4+), il n'est pas surprenant qu'un virus tel que le virus apparenté au SIDA, qui infecte les lymphocytes T par l'intermédiaire du marqueur CD4 et par conséquent, diminue sélectivement la population de CD4, peut causer l' immunosuppression sévère et d'autres anomalies de la croissance des lymphocytes observées chez les malades du SIDA. La présente invention devrait permettre d'obtenir des lymphocytes T spécifiques des cellules infectées par VlH et d'utiliser ces cellules dans la recherche et développement concernant le traitement du SIDA.
La présente invention devrait également permettre d'imiter la liaison d'antigènes aux chaînes α et β ou aux chaînes δ réceptrices de cellules T. Par liaison croisée des récepteurs avec le déterminant modifié de l'invention, on facilite l'activation des lymphocytes T. La présente invention permet ainsi de stimuler ou de renforcer la fonction du système immunitaire.
Ainsi qu'il a été largement exposé ci-dessus, l'invention vise donc plus spécialement des méthodes, produits et kits mettant en oeuvre des complexes CMH/peptide. Elle vise ainsi une méthode de détection de la présence ou de l'absence d'un lymphocyte antigène- spécifique, comprenant les étapes consistant à fournir un complexe comprenant un déterminant modifié du complexe majeur d'histocompatibilite (CMH), en association avec un antigène peptidique spécifique ; à coupler ledit complexe à un support solide ;
à incuber le complexe couplé à un support solide avec un échantillon biologique dans des conditions appropriées pour lier un lymphocyte à un antigène ou à une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité ; et à détecter la présence ou l'absence de lymphocytes liés au complexe couplé à un support solide.
Le déterminant du CMH modifié mis en oeuvre est avantageusement présent sous la forme d'un dimère ou d'un polymère d'ordre supérieur, ou d'un agrégat.
Dans cette méthode, l'antigène est choisi avec avantage dans le groupe d'antigènes essentiellement formé par les antigènes associés à des tumeurs, les antigènes dérivés d'un parasite, les antigènes dérivés de bactéries et les antigènes dérivés de virus tels que VlH, influenza, CMV, VPH, Hépatite A, Hépatite B, Hépatite non-A non-B et Hépatite C.
L'invention vise aussi une méthode de détection de la présence ou de l'absence d'un lymphocyte T spécifique d'une tumeur, comprenant les étapes consistant à fournir un complexe comprenant une molécule modifiée du complexe majeur d'histocompatibilite, en association avec un antigène spécique de tumeur ; à coupler ledit complexe à un support solide ; à incuber ledit complexe couplé à un support solide avec un échantillon biologique ; et à détecter la présence ou l'absence d'un lymphocyte T lié au complexe couplé à un support solide.
Dans les méthodes ci-dessus l'incubation comprend en outre une période d'environ 3 heures à environ 4°C, avec ou sans agitation douce, et la détection comprend en outre l'utilisation d'un concentrateur de particules magnétiques.
La méthode d'obtention, d'isolement ou de purification d'un lymphocyte T antigène-spécifique, fait également partie de l'invention. Cette méthode comprend les étapes consistant à fournir un complexe constitué essentiellement par un déterminant modifié du complexe majeur d'histocompatibilite en association avec un antigène peptidique ; à coupler le complexe à un support solide ; à incuber ledit complexe couplé au support solide avec un échantillon biologique, de sorte que les lymphocytes T puissent se lier au complexe couplé au support solide ; et à séparer des autres cellules les lymphocytes T liés.
Entre également dans le champ de l'invention, une méthode de préparation d'un lymphocyte T cytotoxique antigène-spécifique, comprenant les étapes consistant à fournir un complexe comprenant un déterminant modifié du complexe majeur d'histocompatibilite en association avec un antigène ; à coupler le complexe à un support solide ; et à mettre en contact le complexe couplé à un support solide avec un lymphocyte primaire.
L'antigène mis en oeuvre est avantageusement choisi dans le groupe d'antigènes essentiellement constitué par des antigènes spécifiques de tumeur, des antigènes dérivés du VlH, des antigènes dérivés du virus influenza et un antigène dérivé de bactéries.
Il s'agit en particulier d'un antigène choisi dans le groupe d'antigènes essentiellement constitué par des antigènes associés à des tumeurs, des antigènes dérivés d'un parasite, des antigènes dérivés de bactéries, et des antigènes dérivés de virus tels que VlH, influenza, CMV, VPH, Hépatite A, Hépatite B, Hépatite non-A non-B et Hépatite C. L'invention vise également une méthode destinée à tuer une cellule, contenant un antigène spécifique de tumeur, comprenant l'étape consistant à mettre en contact un lymphocyte T cytotoxique tel qu'obtenu par la méthode ci- dessus de préparation de lymphocyte cytotoxique antigènespécifique avec une cellule contenant un antigène spécifique de tumeur dans des conditions physiologiquement acceptables.
L'invention vise encore une méthode d'introduction d'un lymphocyte T cytotoxique dans un animal ou chez l'homme, comprenant l'étape consistant à fournir un lymphocyte T cytotoxique tel qu'obtenu par la méthode ci-dessus de préparation de lymphocyte cytotoxique antigène-spécifique et à injecter le lymphocyte T cytotoxique à l'homme ou à l'animal, conjointement avec une solution, un véhicule ou des excipents physiologiquement acceptables.
L'invention vise également une méthode d'anergisation d'un lymphocyte T antigène-spécifique, comprenant l'étape consistant à mettre en contact le lymphocyte T avec une composition comprenant un déterminant modifié du CMH, sous forme monomère en association avec un antigène peptidique.
L'invention comprend également une méthode d'élimination d'une population de lymphocytes T antigène-spécifiques, comprenant les étapes consistant à fournir un complexe comprenant un déterminant modifié du CMH, en association avec un antigène peptidique ; à coupler ledit complexe à un support solide ; et à introduire ledit complexe couplé à un support solide dans une population de lymphocytes T.
Dans ces différentes méthodes, mis à part la méthode destinée à tuer une cellule et celle d'introduction d'un lymphocyte T cytotoxique cchez l'homme ou l'animal, l'antigène peptidique est avantageusement lié par covalence au déterminant modifié du CMH ou à un espaceur du déterminant modifié du CMH.
Le déterminant modifié du CMH est avantageusement présent sous la forme d'un dimère ou d'un polymère d'ordre supérieur ou d'un agrégat.
L'invention comprend en outre une molécule recombinante du CMH, comprenant SC-A2 ou SC-Kd.
Elle vise en particulier une molécule recombinante du CMH, biologiquement fonctionnelle, possédant l'activité de stimulation des lymphocytes T et de présentation d'antigène d'une molécule HLA-A2 naturelle, comprenant un ou plusieurs domaines de la chaîne lourde de HLA-A2 liés, par covalence ou autrement, à une β2-microglobuline, ou à un fragment de β2-microglobuline, par l'intermédiaire d'une région d'espaceur flexible.
Comme exposé plus haut, l'invention vise en outre, une méthode de diagnostic pour déterminer la concentration ou la quantité relative de molécules solubles du CMH de classe I ou classe II dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à utiliser une molécule recombinante, telle que définie ci-dessus, en tant que référence standard, à mettre en contact l'échantillon avec des anticorps spécifiques du CMH ou de la microglobuline, ou des deux, et à déterminer la quantité de liaison dans l'échantillon, comparée à la liaison de la molécule recombinante.
Elle vise aussi un kit de diagnostic servant à identifier des peptides antigéniques capables d'être présentés par une molécule A2 comprenant une molécule recombinante, telle que définie ci-dessus, et un peptide marqué, qui est capable de se lier à la molécule recombinante. Avantageusement, la molécule recombinante se présente sous forme monomère ou sous forme dimère ou, de préférence, en tant que polymère en agrégats de ces formes.
L'invention vise en outre l'utilisation d'une telle molécule dans une méthode pour stimuler et développer sélectivement un clone de CTL spécifique à partir d'une source de lymphocytes T, comprenant l'étape consistant à mettre en contact la molécule recombinante chargée d'un peptide spécifique avec un lymphocyte T.
Les compositions comprenant une molécule recombinante, telle que définie ci-dessus, avantageusement sous les formes indiquées, et un support solide sont également visées par l'invention. Dans ces compositions, le support solide peut être formé de billes magnétiques.
D'autres méthodes entrent dans le champ de l'invention, à savoir
- une méthode d'utilisation d'une composition, telle que définie ci-dessus, pour induire in vitro des CTL primaires peptide-spécifiques, comprenant l'étape consistant à incuber une telle composition avec un peptide, suivie de l'étape consistant à mettre en contact la composition avec un PBL naïf. Cette méthode comprend avantageusement l'addition d'une cellule stimulatrice, telle qu'un conA-blast activé par peptide.
Les CTL ainsi obtenus sont avantageusement utilisés pour lier une cellule porteuse d'antigène. - une méthode de production d'anticorps spécifiques anti-HLA, comprenant l'étape consistant à introduire une molécule recombinante, telle que définie plus haut, dans un animal et à isoler ou purifier des anticorps issus du sérum de l'animal. une méthode de production d'une cellule productrice d'immunoglobuline par un animal, comprenant le fait d'introduire une molécule recombinante, telle que définie plus haut, dans un animal et à isoler ou purifier la cellule.
L'invention vise aussi un kit de diagnostic destiné à identifier la présence ou l'absence d'un anticorps spécifique anti-HLA dans un échantillon, comprenant une molécule recombinante, telle que définie plus haut, et un moyen de détection pour détecter la liaison d'anticorps spécifiques à la molécule recombinante.
Elle vise également une méthode de diagnostic destinée à identifier des peptides qui peuvent être présentés par une molécule A2 pour résulter en une réponse immunitaire dans un lymphocyte, comprenant le fait de mettre une molécule recombinante, telle que définie plus haut, en association avec un peptide, en contact avec un lymphocyte et à rechercher une réponse immunitaire.
L'invention vise aussi une méthode d'utilisation d'une molécule recombinante telle que définie plus haut pour stimuler une réponse immune spécifique ex vivo ou pour une activation directe de lymphocytes in vivo par injection de la molécule sous forme de revêtement de support quelconque.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 représente l'orientation d'une molécule du CMH de classe I et d'une β2~microglobuline dans une membrane cellulaire.
La figure 2 représente l'orientation de la molécule du CMH de classe II dans une membrane cellulaire.
La figure 3A représente schématiquement un déterminant modifié du CMH de classe I. La figure 3B est un schéma-bloc représentant un déterminant modifié du CMH de classe I et un espaceur liant par covalence les produits géniques du CMH à la β2- microglobuline.
La figure 4A représente un déterminant modifié du CMH de classe II.
La figure 4b est un schéma-bloc représentant les domaines d'un déterminant modifié du CMH de classe II lié par des espaceurs.
Figure 5 : adsorption sélective de cellules d'hybridomes T à des complexes CMH/peptide apparentés.
On marque les cellules d'hybridomes T 9.4 (spécifiques de Kd/Cw3) par incorporation de [méthyl-3H]-thymidine et on les incube avec des billes magnétiques (dans un rapport des billes aux cellules de 5:1) couplées à SC-Kd chargé du peptide indiqué. Ensuite, on sépare les cellules magnétiquement avec un concentrateur de particules magnétique. Le rendement en cellules est déterminé en mesurant la radioactivité associée aux billes. Les déviations moyennes et standards des expériences effectuées en triple sont représentées.
La figure 6 représente la purification sélective de PEL exprimant Vβ10, par adsorption sur SC-Kd/Cw3.
Les PEL sont purifiés par adsorption sur SC-Kd/Cw3 et l'expression de Vβ10 est analysée par cytometrie.
L'histogramme en traits pleins correspond aux PEL adsorbés sur SC-Kd/Cw3. Le profil en tireté correspond aux PEL avant adsorption.
La figure 7 représente l'expression clonale et la purification de TIL spécifiques de Kd/Cw3, analysées par PCR.
Les différentes populations cellulaires sont analysées comme décrit dans la section Matériels et Méthodes en utilisant une technique de PCR avec les couples d'amorces indiqués. Des lymphocytes T spécifiques de Kd/Cw3, présentant la longueur caractéristique de CDR3β (6 acides aminés) peuvent être déjà identifiés avant purification (panneaux c et d). Des splénocytes issus de souris naïves DBA/2 (panneaux a et b) sont représentés comme exemples d'animaux non immuns. Les lymphocytes T Kd/Cw3-spécifiques sont purifiés efficacement et spécifiquement (panneaux e et f).
La figure 8 représente des TIL purifiés par adsorption sur des complexes CMH/peptide apparentés, présentant une activité de CTL accrue. L'activité de CTL de TIL purifiés (b et d) et non purifiés (a et c) est testée sur P815 (carrés blancs) et P815-Cw3 (carrés noirs) avant (a et b) ou après (c et d) amplification pendant 10 jours in vitro. La figure 9 représente des TIL purifiés par adsorption sur des complexes CMH/peptide apparentés, présentant une activité antitumorale accrue.
On injecte par voie sous-cutanée à des souris une dose létale de P815-Cw3 (panneau a), de P815 (panneau b) ou de P198 (panneau c). Après 6 jours, on administre aux souris par voie intraveineuse 107 TIL non purifiés (carrés blancs), issus d'une tumeur identique, ou le même nombre de TIL ayant été purifiés par adsorption (carrés noirs) sur soit SC-
Kd/Cw3 (panneau a), soit Ld /P1A (panneau b), soit SC-Kd/P198 (panneau c). Les souris témoins (cercles blancs) ne reçoivent que des cellules tumorales.
La figure 10 représente la séquence nucléotidique et d'acides aminés de SC-A2-15.
La figure 11A représente le gel (pistes 1-4) désignant SC-A2 immunoprécipité, la flèche indiquant la taille prévue pour SC-A2.
La figure 11B représente un gel indiquant les comparaisons A et B de SC-A2 versus SC-Kd.
La figure 12 représente un test de liaison A2.1. Un test destiné à quantifer des peptides liants A2.1, basé sur l'inhibition de peptides F10V standards marqués par radioactivité à des molécules SC-A2, comme décrit dans la section Test de liaisons peptidiques.
La figure 13A représente la spécificité de CTL induits par induction primaire in vitro en utilisant des billes revêtues avec des complexes peptidiques SC-Kd/Cw3 en tant que cellules présentatrices d'antigène (APC).
Les CTL primaires spécifiques de Cw3 lysent -spécifiquement les cellules tumorales P815-Cw3 (triangle), alors qu'il existe très peu de lyse non spécifique avec les cellules P815, qui n'expriment pas le gène HLA-Cw3 (cercle).
La figure 13B représente la spécificité de CTL induits par induction primaire in vitro en utilisant des billes revêtues avec des complexes peptidiques SC-Ld/P1A, en tant que cellules présentatrices d'antigène (APC).
Les CTL primaires spécifiques de P1A lysent spécifiquement les cellules tumorales P815 qui expriment bien le gène P1A (triangle), alors qu'il existe très peu de lyse non spécifique avec les P1204, qui n'expriment pas le gène P1A (carré).
Figure 14 : L'absence de cellules macrophages n'a pas d'influence sur l'induction primaire in vitro de CTL spécifiques d'un peptide en utilisant des billes revêtues avec des complexes peptidiques SC-A2/Pol-VlH en tant que cellules artificielles présentatrices d'antigènes (APC).
En utilisant des billes revêtues avec des complexes peptidiques SC-A2/Pol-VlH en tant que cellules présentatrices d'antigènes (APC), des CTL spécifiques de Pol-VlH peuvent être induites à partir de cellules naïves PBL HLA-A2 (carré) ainsi que de cellules naïves PBL HLA-A2 (carré), et PBL HLA-A2 naïves dépourvues de cellules macrophage. Dans toutes ces situations, on obtient une faible lyse non spécifique lorsqu'on utilise des billes revêtues avec simplement le peptide Pol-VlH, mais sans molécules SC-A2 en tant qu'APC (cercle) de cellules naïves PBL HLA-A2 (triangle) de PBL HLA-A2 naïves épuisées en cellules macrophage. Figure 15 : L'absence de cellules macrophages n'a pas d'influence sur l'induction primaire in vitro du CTL spécifique d'un peptide, utilisant des billes revêtues avec des complexes peptidiques SC-A2/MAGE3 en tant que cellules artificielles présentatrices d'antigènes (APC).
Lorsqu'on utilise des billes revêtues avec des complexes peptidiques SC-A2/MAGE-3 en tant que cellules présentatrices d'antigènes (APC), les CTL spécifiques de MAGE-3 peuvent être induites à partir de cellules naïves HLA-A2 PBL (carré) ainsi que de cellules naïves PBL HLA-A2 dépourvues de cellules macrophage. Dans les deux cas, on obtient une faible lyse non spécifique lorsqu'on utilise des billes revêtues avec seulement le peptide MAGE-3 mais sans molécules SC-A2 en tant qu'APC (cercle) de cellules naïves PBL HLA-A2 (triangle) de PBL HLA-A2 naïves épuisées en cellules macrophages.
Figure 16 : Représentation schématique de molécules ou déterminants modifiés du CMH. La séquence nucléotidique de l'insert d'ADN comprenant le déterminant recombinant du CMH SC-A2 avec un espaceur de 15 acides aminés (les trois premiers domaines de l'A DNc de la chaîne lourde de HLA-A2.1 fusionnés à la séquence codante de la β2-microglobuline humaine par l'intermédiaire d'un linker flexible de 15 acides aminés). Figure 17 : Résonance plasmonique de surface de la molécule SSC-A2 utilisant des AcM BB7.2 (anti-HLA-A2,-A69) et B2C16.2 (anti-β2-microglobuline humaine). Ces résultats indiquent que la molécule présente à la fois HLA-A2 et des déterminants sérologiques β2-m humains. Figure 18A : Liaison de molécules F10V, radiomarquées, à sSC-A2. Le peptide marqué se lie à l'échantillon sSC-A2 (barre hachurée) et ne se lie pas au témoin (en traits pleins). Figure 18B : Inhibition compétitive de la liaison de peptides à des molécules SSC-A2. Les peptides restreints par HLA-A2 (F10V, 19V et A9L) présentent une inhibition pratiquement complète du peptide marqué, tandis que les peptides restreints par H-2Kb (R8L OVA) et H-2Kd (Cw3 Y8I) ne présentent pas cette caractéristique. Figure 19 : Incorporation directe de 3H-thymidine ou sécrétion d'IL-2 par CTL NA17 221, présentant la réponse proliférative des CTL au peptide restreint de manière appropriée. La stimulation spécifique est mesurée en termes d'incorporation directe de H-thymidine par CTLNA 17221
(panneau A) ou sécrétion d'IL-2 (panneau B)
Figures 20A et B : activité cytotoxique sur différentes cellules cibles T2 chargées en peptide pour le CTL stimulé avec des complexes SSC-A2/M58-66. Les résultats indiquent une lyse spécifique des cellules portant le peptide approprié.
Figure 21 : Analyse des répertoires de TCR VB17 et VB2 en utilisant la technologie d' immunoscopie très sensible. Dans les panneaux A et B, on observe un pic majeur dans le répertoire VB17 correspondant à un CDR3 de 8 acides aminés de long, indiquant une expansion dominante de CTL spécifique en corrélation avec la lyse spécifique M58-66 montrée dans la figure 20. Les Vβ2 des panneaux A et B présentent un répertoire polyclonal par son profil Gaussien.
Le témoin des cellules non stimulées, panneau C, exhibe également un profil de type de Gauss.
Figure 22 : Spécificité d'un essai de liaison de peptide restreint par HLA-A2.1. Dans 22A, on a représenté la liaison du peptide F10V radiomarqué à des molécules SC-A2 et dans 22B, l'inhibition de compétition de la liaison des peptides aux molécules SC-A2 Figure 23 : Incorporation directe de H-thymidine ou de sécrétion de IL-2 par CTL NA 17221 montrant une réponse proliférative du CTL au peptide restreint de manière appropriée Figure 24 : Induction de CTL spécifiques par des complexes SC-Kd/peptide couplés à des billes ou à des cellules dendritiques
Figure 25 : Induction de CTL spécifiques par des complexes SC-A2/peptide couplés à des billes Figure 26 : Répertoire TCR-BV10 de CTL induits avec des complexes SC-Kd/CW3 couplés à des billes et avec des cellules dendritiques activées par CW3
Les CTL ont été induits comme décrit en rapport avec la figure 24. L'ARN total a été extrait et l'ADNc amplifié en utilisant des amorces BV10 et BC-spécifiques. Après marquage avec une amorce fluorescente BC-spécifique, la distribution de taille du produit a été résolu dans un gel acrylamide dénaturant dans un séquenceur.
Figure 27 : Répertoires TCR BV17 et BV2 de CTL induits par SC-A2/M 58-66 couplé sur des billes.
Figure 28 : Adhésion sélective de cellules T d'hybridome sur des surfaces revêtues de complexes CMH/peptide
Figure 29 : Adhésion dose-dépendante, peptide-spécifique de l'hybridome 9.4 sur des plaques de dKd-Cw3 Figure 30 : Inhibition partielle de l'adhésion médiée par dKd-Cw3 de l'hybridome 9.4, par des inhibiteurs de protéine kinase Figure 31 : Purification sélective des cellules d'hybridome 9.4 par des complexes dimérisés CMH/peptide appliqués en revêtement
Figure 32 : enrichissement sélectif de cellules T naïves Vβ8 +, CD8+, spécifiques vis-à-vis de complexes Kd-HA
Figure 33 : Induction de la prolifération de cellules CD8 + purifiées par des complexes SC-Kd/HA utilisés en revêtement.
Figure 34 : Réponses prolifératives de cellules CD8+, dépendantes de stimulus SC-Kd/HA, ne nécessitant pas d'interaction CD28/B7.
Figure 35 : Présence d'un phenotype activé sur les splénocytes CD8+ après stimulation par SC-Kd/HA
Figure 36 : Réponse proliférative à SC-Kd/HA proportionnelle au nombre de splénocytes CD8+. Figure 37 : Obtention d'une réponse cytotoxique avec des splénocytes CD8+ activés par SC-Kd/HLA.
DESCRIPTION DES MODES DE RÉALISATION PRÉFÉRÉS
Exemple 1 : Détection, obtention purification de cellules T antigène-spécifiques- Stimulation de cellules T
On prépare par ingénierie des molécules monocaténaires solubles HLA-A2.1 humaines (SSC-A2) en reliant les trois premiers domaines de la chaîne lourde A2.1 à la β2-microglobuline humaine par l'intermédiaire d'un espaceur de 15 acides aminés, et on les transfecte dans des cellules basophiles de rat (RBL-2H3). On purifie le sSC-A2 sécrété dans le milieu de culture par chromatographie d'affinité, à l'aide de l'anticorps monoclonal W6.32 anti-HLA-A.B.C, présentant des fonctions biologiques. Les molécules de sSC-A2 purifiées se lient spécifiquement à des peptides antigéniques restreints par A2. Les complexes peptidiques SSC-A2.1 interagissent avec le récepteur de lymphocytes T approprié et provoquent une réponse proliférative des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'un peptide. En outre, on applique avec une densité élevée des complexes sSC-A2 chargés en peptide sur des billes et on les utilise en tant que cellules artificielles présentatrices d'antigène pour obtenir des CTL peptide-spécifiques à partir de cellules naïves PBL HLA-A2.1 de donneurs sains. Ces complexes s'avèrent des stimulateurs très efficaces et induisent des CTL peptide- spécifiques présentant une puissante aptitude à tuer, restreinte par HLA-A2.1, des cellules activées par antigène. De plus, le récepteur de cellules T de CTL peptide-spécifiques induits utilise les mêmes, en tant que CTL peptide-spécifiques issus d'une immunisation in vivo. L'évidence que l'on constate ici indique l'utilité des molécules modifiées du CMH au niveau fonctionnel, c'est-à-dire des molécules SSC-A2, dans : i) des tests de liaison peptidique destinés à identifier des peptides immunogéniques, basés sur la sélection de liants du CMH de grande affinité à partir d'antigènes connus associés à une tumeur, ii) l'induction primaire in vitro de CTL capables de tuer des cellules tumorales, permettant ainsi une analyse détaillée du répertoire de CTL humains primaires, ou la production de cellules effectrices de CTL spécifiques pour l'immunothérapie adoptive ou la dissection des conditions cellulaires et moléculaires requises pour amorcer des CTL naïfs humains.
Expression de la construction génique de la molécule sSC- A2 issue de Cellule Basophile de Rat transfectée stable (RBL-2H3)
La construction SC-A2, qui comprend la séquence signal et les trois premiers domaines de l'ADNc de la chaîne lourde de HLA-A2.1, fusionnée à la séquence codante de la β2-microglobuline humaine par l'intermédiaire d'un linker flexible de 15 acides aminés, est représentée à la figure 16. Cette construction est clonée dans le vecteur d'expression de mammifère pRc/CMV, sous le contrôle du promoteur du gène précoce immédiat du cytomégalovirus humain, et ensuite, transfectée dans des cellules RBL-2H3. Des transfectants stables sont sélectionnés pour leur résistance à l'antibiotique G418. Les clones résistants sont triés par PCR pour la construction génique intégrée. On analyse la production de molécules sSC-A2 par les clones présentant un nombre élevé de copies de gènes intégrés. On poursuit la sélection en sélectionnant les clones produisant environ 500 mg de molécules sSC-A2 par litre de surnageant de culture. La molécule SC-A2 purifiée présente une conformation correcte sSC-A2 sécrété dans le milieu de culture est purifié par chromatographie d' immunoaffinité, en utilisant l'AcM W6/32 anti-HLA-A.B.C, et il est caractérisé par la résonance plasmonique de surface, en utilisant les AcM BB7.2 (anti-HLA-A2, -A69) et B2C16.2 (anti-β2- microglobuline humaine). Les résultats présentés à la figure 17 montrent que la molécule purifiée présente les deux déterminants sérologiques que sont HLA-A2 et celui dérivé de la β2-microglobuline humaine. Afin de s'assurer que les molécules sSC-A2 présentent une conformation correcte, on soumet un panel de sept anticorps à un test ELISA sur sSC-A2 purifié. Ce panel comprend 5 AcM HLA- spécifiques, à savoir W6/32 (anti-HLA monomorphique), BB7.2 (anti-HLA-A2, -A69), 5H7 (anti-HLA-A2, 3ème domaine), PA2.1 (anti-HLA-A2) et deux AcM spécifiques de la B2-m humaine, B2C16.2 et BBM.l. Tous les AcM testés réagissent seuls ou dans des tests sandwich (anti-HLA- A2/anti-β2-microglobuline humaine) avec la molécule recombinante, démontrant ainsi que sSC-A2 recombinant est replié correctement.
Liaison spécifique de peptides synthétiques à des molécules sSC-A2 purifiées Pour savoir si des molécules sSC-A2 peuvent se lier à des peptides restreints par HLA-A2, on utilise un peptide synthétique dérivé du virus de l'hépatite B (HBV)(FLPSDYFPSV=F10V)(81), qui est connu pour se lier à HLA-A2 comme peptide de liaison standard. Ce peptide F10V est marqué avec un marqueur radioactif et sa capacité de liaison à sSC-A2 est testée. Le peptide non lié est éliminé par ultrafiltration. Le peptide radioactif associé à SSC-A2 est mesuré comme décrit. On observe une liaison significative (figure 18a). De plus, lorsqu'on utilise un panel de peptides synthétiques en excès en tant que compétiteurs, la liaison du peptide à marqueur radioactif est inhibée par trois peptides restreints par HLA-A2 ( F10V, I9V, A9V ) , mais n ' est pas inhibée par deux peptides restreints par H.2K (R8L OVA) ou deux peptides restreints par H.2K (CW3 Y8I) (figure 18b). Pris ensemble, ces résultats indiquent que la molécule sSC-A2 recombinante se lie à des peptides synthétiques et présente la même spécificité que la surface de la cellule native associée à la molécule HLA-A2.
Des complexes sSC-A2/peptide peuvent activer spécifiquement des cellules CTL apparentées Ensuite, on évalue l'aptitude de la molécule SSC-A2 recombinante à agir en tant que molécule présentatrice d'antigène. On charge sSC-A2 purifié avec un peptide NA17-A (un peptide situé dans un intron du gène codant pour la N-acétylglucoseaminyltransférase V, exprimée dans la lignée cellulaire tumorale NA17-MEL issue de mélanomes métastatiques de patients NA17) (82). On utilise ensuite ces complexes SSC-A2/NA17-A sous leur forme monomère ou dimère (la dimérisation est réalisée par incubation de SSC-A2/NA17-A avec l'AcM spécifique BBM.1 anti-b2-m humaine, dans un rapport de 2/1) et on teste leur capacité à stimuler un clone de CTL restreint par HLA-A2 (CTL NA17-221) spécifique du peptide NA17-A (82). On mesure la stimulation spécifique par incorporation directe de 3H-thymidine par les CTL NA17 221 (figure 19a) ou par sécrétion de IL-2 ( figur 19b). Dans les deux tests, la réponse proliférative est peptide-spécifique, étant donné que sSC-A2 chargé avec un peptide non apparenté (MAGE 3) (83) ne présente pas d'activité. Ces résultats indiquent que la réponse spécifique peut être la conséquence de l'interaction directe des complexes sSC-A2/peptide et du récepteur de CTL approprié. Induction in vitro de CTL peptide-spécifiques issus de donneurs naïfs
Des études récentes ont utilisé des complexes CMH/peptide pour provoquer la réponse in vitro de CTL (84-86). On incube des cellules naïves PBL HLA-A2 de donneurs sains avec des billes revêtues de complexes de sSC-A2 chargé avec le peptide matriciel de l' influenza A M58-60 (87, 88) pendant une durée appropriée (jours). On restimule les cultures une fois avec soit les conA-blasts activés par le peptide MS 8-66, soit la forme monomère de complexes sSC-A2/M58-66 pendant une durée appropriée (jours) et ensuite, on teste leur activité cytotoxique vis-à-vis de cellules cibles T2 chargées de peptide. On observe sur les figures 20a et 20b une lyse spécifique significative. Lorsque les conA-blasts activés par le peptide MS 8-66 sont utilisés pour une troisième stimulation, on obtient une lyse CTL plus spécifique qu'avec les complexes SSC-A2/M58-66 seuls. Ces résultats suggèrent que la seule présence des complexes SSC-A2/M58- 66 n'amplifie pas de façon efficace certains CTL, et que la présence de cellules de remplissage augmente le succès de la multiplication à long terme. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, on utilise éventuellement des conA- blasts activés par peptide en tant que cellules stimulatrices.
Analyse moléculaire du répertoire du TCR Vβ de CTL peptide-spécifiques induits in vitro, à l'aide de billes revêtues avec une densité élevée de complexe sSC-A2/peptide Il a été signalé qu'après une infection par l' influenza A, on peut détecter une réponse de CTL spécifique du peptide M58-66 chez la plupart des sujets HLA-A2.1. Il est intéressant de noter que les clones de CTL M58-66-spécifiques présentent des segments de gène TCR α et β conservés (89). De plus, un rapport récent désigne le TCR Vβ17 comme le segment Vβ dominant utilisé, comme déterminé à partir des lignées de CTL M58-66- spécifiques, issues de 21 individus HLA-A2 non apparentés . La multiplication de CD8 Vβl7 est en corrélation avec la lyse M58-66-spécifique (90). L'analyse de séquence de 38 transcrits Vβl7 M58-66- spécifiques issus de 13 sujets révèle la conservation importante d'un motif arginine-sérine dans la région CDR3, ayant une longueur de 8 acides aminés. En tenant compte de ces caractéristiques particulières de la réponse immunitaire humaine naturelle à l'infection par l' influenza A, on a déterminé les conditions d'induction in vitro de CTL selon l'invention, avec des billes revêtues avec une densité élevée de complexes sSC- A2/peptide en tant qu'APC artificielles, peuvent provoquer une réponse de CTL spécifique similaire à celle observée in vivo.
On a analysé le répertoire du TCR Vβ en utilisant la technique d'immunoscopie très sensible (91, 92). Les répertoires de TCR Vβ17 et Vβ2 représentés sur les figures (21a et 21b) sont ceux d'une population de lymphocytes T pour laquelle l'activité lytique est présentée sur les figures (20a et 20b). L'allure des cultures témoins de PBL identiques, non stimulés, est représentée à la figure 21c. On peut noter que pour le TCR VB2, l'allure typiquement gaussienne indiquant un répertoire polyclonal est observée sur les figures 21a, 21b et 21c. Toutefois, pour le répertoire de TCR Vβ17, ce profile gaussien est fortement modifié. Comme on peut le voir sur les figures 21a et 21b, un pic principal correspondant à un CDR3 ayant une longueur de 8 acides aminés indique une expansion dominante de CTL spécifiques qui peut être en corrélation avec la lyse M58-66- spécifique représentée sur les figures 20a et 20b. Alors que le répertoire de TCR Vβ17 pour le contrôle des PBL présente toujours l'allure typiquement gaussienne (figure 21c). Ces résultats indiquent que le protocole d'induction in vitro de l'invention peut activer des CTL spécifiques ayant des caractéristiques très similaires à celles des CTL induits par infection in vivo.
Ingénierie, préparation et utilisation de CMH modifiés par SC-Kd
On prépare par ingénierie des molécules monocaténaires Kd murines (SC-Kd) en reliant le résidu 276 de la chaîne lourde Kd au premier résidu de la β2- microglobuline par l'intermédiaire d'espaceurs de différentes longueurs, et on réalise leur expression intracellulaire dans des cellules de singe COS-1. Il s'avère que les molécules SC-K marquées réagissent avec plusieurs anticorps monoclonaux qui reconnaissent les molécules Kd natives. On étudie SC-Kd-15 (avec un espaceur del5 résidus) de manière plus approfondie. Il peut être purifié et on a montré qu'il reprend une structure du type natif après traitement avec des agents dénaturants. Le SC-Kd-15 purifié peut se lier à acertains peptides de manière qualitativement similaire à Kd. Constructions plasmidiques . Un ADNc de Kd de longueur totale (Lalanne, J.-L., Delarbre, C., Gachelin, G. et Kourilsky, P., Nucleic Αcids Res . , 1983, 11:1567) est coupé par Hind III (au niveau du résidu 276) et fusionné en phase, par un linker codant pour Gly-Gly, à l'ADNc de β2-m (Daniel, F., Morello, D., LeBail, O., Chambon, P., Cayre, Y. et Kourilsky, P., EMBO J. 1983. 2:1061) dans lequel un site Eam, HI recouvrant le premier codon Ile de β2-m mature a été introduit par mutagénèse dirigée sur le site. Le bloc est clone dans un vecteur d'expression de mammifère pKC3, qui contient le promoteur SV40 et l'origine de la réplication, ce qui produit pSC- Kd-2 (représenté dans la discussion concernant les constructions géniques, figure 5A). Des linkers synthétiques de différentes longueurs sont ligaturés au site Bam HI de pSC-Kd-2 (figure 5b). Par exemple, le linker SC-Kd-15 est le :
5' GATCGGATCCGGAGGCGGTGGATCCGGTGGCGGCGGTTC 3'
(SEQ ID NO: )
3' CCTAGGCCTCCGCCACCTAGGCCACCGCCGCCAAG CTAG 5'
(SEQIDNO: )
La digestion par Bam HI de pSC- Kd-10. et la religature produisent pSC- Kd-10. pSC- Kd-10. -17, -19 et - 21 sont obtenus par clonage de linkers appropriés au site
Bam HI de pSC-Kd-10. Tous les espaceurs et toutes les jonctions sont séquences.
Transfection et immunoprécipitation . On transfecte des cellules COS-1 (environ 3,5 x 106 cellules sur des plaques de 60 mm) cultivées dans du DMEM complémenté avec 10 % de sérum de nouveau-né, de la pénicilline, de la streptomycine et de la L-glutamine, un jour après étalement sur les plaques, avec 0,5 ml d'un mélange de phosphate de calcium contenant 5 μg d'ADN plasmidique purifié avec CsCl. L'efficacité des transfections est mesurée de temps en temps avec le plasmide pCH110 exprimant la β-galactosidase d'E. coli (Pharmacia, Uppsala, Suède). Trente-six heures après la transfection, les cellules sont radiomarquees à l'aide de methionine [ 35S] (45 mCi/plaque=1, 67 m de Bq/plaque) pendant 4 heures à 37°C, puis on les lave une fois dans du PBS et on les recueille dans 1 ml de tampon de lyse (Tris-HCl
10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, NP40 à 1 % p/v,
BSA 10 mg/ml) contenant 20 mM d ' iodoacétamide et 1 Ul/ml d'aprotinine. Les lysats sont purifiés préalablement sur protéine A-Sepharose pendant 1 heure à 4°C et les surnageants de culture (SN) sont incubés pendant 18 heures à 4°C avec soit 30 μl de SN de culture, soit 5 μl d'AcM purifé et protéine A-Sepharose. On lave les billes trois fois et on élue les protéines dans un tampon de Laemmli avec 2-ME et on les analyse par SDS-PAGE sur des gels à 12 %. Les gels sont fixés, traités avec de l'Amplify (Amersham Int., Amersham, GB), séchés et visualisés par autoradiographie à l'aide d'une pellicule XAR à rayons X de Kodak (Rochester, NY). Pour les traitements par endoglycosidase H (Endo H), on équilibre les échantillons dans SDS à 0,5 %, 2-ME 1 M, on les porte à l'ébullition pendant 2 minutes, on les fait précipiter avec de l'acide trichloracétique à 15 %, on les rince avec de l'acétone et on les remet en suspension dans 50 μl de citrate de sodium 50 mM,' pH 5,5, SDS à 0,1 %, 2-ME 20 mM. On ajoute du Endo H (Boehringer Mannheim, Mannheim, RFA) jusqu'à une concentration finale de 150 mU/ml, on incube les échantillons à 37°C pendant 24 heures et ensuite, on les analyse par SDS-PAGE. Purification par immunoaffinité de la protéine SC- Kd-15. On transfecte des cellules COS-1 (généralement
107 cellules) par l'ADN du pSC-Kd-15, on les marque et les lyse comme ci-dessus. On purifie préalablement les SN avec de la protéine A-Sepharose pendant 1 heure à 4°C avec 100 μl d'AcM 34.1.2 lié par covalence à des billes de protéine A. Après le lavage final dans du PBS, on élue SC-Kd-15 de la matrice avec un volume égal de thiocyanate 3 M pendant 10 minutes sur de la glace. Après dialyse jusqu'au lendemain dans du PBS contenant 0,1 % de NP40, 0,05 % de Tween et 0,2 % de BSA, on utilise SC-Kd-15 dans le test de liaison direct comme ci-dessous. Sa pureté est évaluée par SDS-PAGE. Peptides et Tests de Liaisons Peptidiques . Les peptides utilisés dans cette étude sont décrits par Choppin et al. (Choppin, J., Martinon, F., Gomard, E., Bahraoui E., Connan F., Bouillot, F. et Levy, J.P., J. Exp. Med ., 1990, 172:889 et les références qui y sont mentionnées), sauf pour HLA-Cw3 et HLA-A24, décrits par Maryanski, J.Ll., Pala, P., Cerottini, J.-C. et Corradin, G., J. Exp. Med. , 1988, 167:1391. Les tests de liaison sont effectués comme décrit par Choppin, J., Martinon, F., Gomard, E., Bahraoui E., Connan F., Bouillot, F. et Levy, J.P., dans J. Exp. Med. , 1990, 172:889. Les molécules de DR3, Drwl3 et Kd sont également purifiées et iodées comme décrit par Choppin, J., Martinon, F., Gomard, E., Bahraoui E., Connan F., Bouillot, F. et Levy, J.P., dans J. Exp. Med. , 1990, 172:889. Constructions géniques . La partie C-terminale de la chaîne lourde Kd tronquée dans la région charnière est accrochée à la partie N-terminale de la β2-microglobuline avec un espaceur approprié. A partir de la structure 3-D de Kd (Prochnicka-Chalufour, J.-L., Casanova, J.-L., Kourilsky, P. et Claverie, J.-M., Reε . Immunol ., 1989, 140:133) dont le modèle est la structure HLA-A2, de Bjorkmann et al. (Bjorkmann, P.J., Saper, M.A., Samraoui, B., Bennet, W.S., Strominger, J.L. et Wiley, D.C., Nature, 1987. 329:506), la longueur minimale d'un espaceur de type polyglycine est estimée à 11 résidus, partant du résidu 276 dans la séquence d'acides aminés K (qui permet d'utiliser un site de restriction approprié dans l'ADNc de Kd).
On relie deux clones d'ADNc de longueur totale codant pour K (Lalanne, J.-L., Delarbe, C., Gachelin, G. et Kourilsky, P., Nucleic Αcids Res . , 1983. 11:1567) et de la b2-microglobuline (Daniel, F., Morello, D., LeBail, O., Chambon, P., Cayre, Y. et Kourilsky, P., EMBO J. 1983. 2:1061) par des oligonucléotides de synthèse codant pour les espaceurs. Ces derniers ont été conçus sous forme de plusieurs motifs répétitifs de glycine et de serine (voir la section Constructions Plasmidiques). On obtient ainsi une série d'ADNc codant pour pSC-Kd avec des espaceurs de 2, 10, 13, 15, 17, 19 et 21 résidus d'acides aminés. Les séquences vérifiées sont représentées à la figure 5 de la demande US en cours d'examen n° de série 07/801 818. Expression de SC-Kd dans des cellules COS-1 de singe transfectées . On transfecte temporairement des cellules COS-1 (dans lesquelles les plasmides recombinants peuvent se répliquer) pendant 36 heures et on les marque avec de la 35S methionine pendant 4 heures. Les molécules de SC- Kd ne sont pas détectables directement par électrophorèse du SN ou d'extraits cellulaires. Pour l'immunoprécipitation, on peut utiliser l'AcM 34-1-2
(Ozato, L., Mayer, N. et Sachs, D.H., Transplantation,
1982. 34:113), qui réagit avec Kd et Dd natifs. Le SN contient 20-50 fois moins de matériel immunoprécipitable que les extraits cellulaires. Ce fait n'est pas inattendu, étant donné que la chaîne lourde Kd tronquée au niveau du site Hind III n'est pas sécrétée par les cellules COS-1 (Chambon, P., Thèse de D.E.A., Université de Paris, 1987). Dans les extraits cellulaires, des bandes correspondant à des protéines ayant une masse moléculaire apparente d'environ 52 kDa sont précipitées spécifiquement, et leur mobilité décroît légèrement lorsque la longueur de l'espaceur augmente (les figures 6A-D se référant à cela et la page suivante de la demande US en cours d'examen n° de série 07/801 818, SC-Kd-2, -10, -13, -17, -19, -21 ; pour SC- K -15, voir figure 6B). On n'observe pas de bande avec des cellules transfectées à blanc et 34-1-2 (figure 6A, pistes NT et pKC), ni avec des cellules transfectées et un anticorps non pertinent (F23, 1 ; figure 6B). Après les résultats de Townsend et al. (Townsend, A., Ohlen, C., Bastin, J., Ljunggren, H. -G., Foster, L. et Karre, K., Nature, 1989. 340:443) avec la lignée cellulaire mutante RMA-S, on a étudié l'addition de grandes quantités de peptide immunogénique (influenza NPR) qui s'est avéré sans effet (figures 6A et 6B). Dans la plus grande partie du travail ci-après, SC-Kd-15 a été choisi arbitrairement comme le prototype de la molécule SC-Kd .
Dans des études séparées utilisant des vecteurs baculovirus, on a vérifié que 34-1-2 réagit de façon très médiocre avec la chaîne lourde Kd, exprimée 'dans des cellules d'insectes en l'absence de β2-microglobuline murine (environ 20 à 50 fois moins que Kd associé à la β2-micro-globuline). La réactivité avec 34-1-2 constitue donc une forte indication de ce que la chaîne lourde Kd est associée correctement à la β2-micro-globuline. Afin de tester d'autres parties de la molécule de Kd, on a utilisé d'autres AcM Kd-spécifiques, 97-G et 20-8-4 (Ozato, L., Mayer, N. et Sachs, D.H., Transplantation, 1982. 34:113 et Rebai, N., Mercier, P., Kristensen, T.,
Devaux, C., Malissen, B., Mawas, C. et Pierres, M.,
Immunogenetics, 1983. 17:57) et on a obtenu des résultats identiques. A titre d'exemple, on a représenté à la figure 6B les bandes de SC-Kd-2 et SC-Kd-15 précipités par l'AcM 20-8-4. La spécificité exacte de 97-G n'est pas connue, mais il s'est avéré que l'épitope reconnu par 20-
8-4 comprend les résidus 82 et 89 appartenant au premier domaine de Kd (Abastado, J.-P., Jaulin, C., Schutze, M.- P., Langlade-Demoyen, P., Plata, F., Ozato, K. et
Kourilsky, P., J. Exp. Med., 1987. 166:327). Ainsi, cet épitope est replié correctement dans SC-Kd-2 et SC-Kd-
15 ; ainsi que dans d'autres molécules SC-Kd.
Le stade de glycosylation de SC-Kd-15 intracellulaire est testé par traitement avec Endo H. La molécule se révèle complètement sensible à End H (figure 6C) et, après traitement, sa masse moléculaire apparente est d'environ 45 kDa, ce qui correspond à la masse moléculaire attendue pour SC-Kd-15 non glycosylé, sans son peptide signal (390 acides aminés). Ces résultats suggèrent que la plupart des molécules SC-Kd-15 se trouvent dans le réticulum endoplasmique sous la forme mannose supérieur.
Pour les trois AcM, la bande de SC-Kd-2 précipité est toujours 5-10 fois moins intense que celle obtenue avec les molécules de SC-Kd comprenant des espaceurs plus longs. Toutefois, l'espaceur Gly-Gly n'est pas susceptible de permettre une association correcte de la β2-microglobuline avec la chaîne lourde. Une bande de 12 kDa, probablement la β2-microglobuline de singe, est co-précipitée en des quantités relativement plus élevées avec SC-Kd-2 qu'avec d'autres SC-Kd (figure 6D). Cela suggère que la β2-microglobuline de singe pourrait mieux s'associer à SC-Kd-2 qu'à d'autres SC-Kd où l'espaceur plus long permet le reploiement correct de la β2-microglobuline murine sur la chaîne lourde Kd, ce qui pourrait expliquer la détection de certaines molécules de SC-Kd-2. De toute façon, la β2-microglobuline de singe ne joue pas un rôle obligatoire dans le reploiement de SC- Kd-15, étant donné qu'il est possible de produire du SC- Kd-15 immunoprécipitable dans des cellules d'insectes infectées par un baculovirus recombinant. Purification et liaison peptidique . La réactivité de molécules de SC-Kd vis-à-vis de trois AcM distincts fournit l'évidence de leur caractère de type naïf. Néanmoins, la purification de ces molécules est nécessaire, afin de vérifier leur aptitude à se replier après des traitements qui séparent la chaîne lourde de β2-m, et enfin, pour voir si elles sont capables de se lier à des peptides.
Une matrice en phase solide, constituée par du 34-1-
2 couplé à des billes de protéine A, est utilisée pour purifier des SC-Kd-15 marqués par 35S à partir de lysats de cellules COS-1 transfectées de manière transitoire. Le traitement avec du thiocyanate de sodium 3M élue la protéine avec un rendement raisonnable ( environ 70 % ) comme le confirme une seconde immunoprécipitation avec 34-1-2. Après électrophorèse, le matériel purifié se présente comme une simple bande de 52 kDa. Cela confirme que la réactivité avec 34-1-2 peut être récupérée en l'absence de β2-microglobuline de singe détectable. Ce traitement de dilution devrait normalement dissocier la chaîne lourde de la β2-microglobuline (Elliott, T. et Eisen, H.N., Proc. Natl . Rcad . Sci ., USA 1990. 87:5213). De l'urée 6M est également utilisée avec des résultats similaires (non représenté). Des molécules Kd isolées à partir de la rate de souris BALB/c sont ensuite purifiées et iodées. Elles sont purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne d'AcM 20-8-4 et on compare la liaison de peptides à cette dernière et à SC-Kd-15 marqué par 35S dans le test de Bouillot et al. (Bouillot, M., Choppin, F., Papo,
T., Gomard, E., Fournie-Zaluski, M.-C. et Levey, J.-P.,
Nature 1989. 339:473 et Choppin, J., Martinon, F.,
Gomard, E., Bahraoui, E., Connan, F., Bouillot, F. et Levy, J.-P., J. Exp. Med., 1990. 172:889).
Deux peptides parmi les protéines virales de VlH (env 312-327 et vpr 68-80), connus pour se lier fortement à plusieurs molécules de CMH (Choppin, J . , Martinon, F . , Gomard, E . , Bahraoui , E . , Connan, F., Bouillot, F. et Levy, J.-P., J. Exp. Med., 1990. 172:889), se lient dans une mesure significative à SC-Kd-15 aussi bien qu'au témoin positif HLA-DR3 ou DR213 (tableau 10 ; résultats présentés en double). Dans une expérience séparée, on compare la liaison de SC-Kd-15 à celle du Kd classique (tableau 10). Comme ci-dessus, le peptide env 312-327 se lie aux deux molécules, mais trois peptides connus pour être immunogéniques (HLA-A24 170-182, HLA-Cw3 170-182 et influenza NPR-147-158 ; (Maryanski, J.L., Pala, P., Cerottini, J.-C. et Corradin, G., J. Exp. Med., 1988. 167:1391 et Bodmer, H.C., Pemberton, R.M., Rothbard, J.B., Askonas, B.A., Cell, 1989. 52:253), ne présentent pas de liaison détectable, ni à SC-K ni aux molécules de Kd. Dans une expérience de compétition où le peptide env 312-327 est lié à une matière plastique, on voit que le peptide vpr 68-80 est un compétiteur efficace, tandis que le peptide Cw3 170-182 (qui ne se lie pas dans l'essai direct) ne l'est pas. En résumé, SC-Kd-15 se lie aux peptides de VlH env 312-327 et vpr 68-80 dans une proportion significative, bien que de manière quelque peu moins efficace que Kd classique (mais les conditions optimales peuvent être différentes pour Kd et pour SC-Kd- 15 et on n'a pas fait d'efforts pour optimiser la liaison à SC-Kd-15 à ce stade).
Il n'y a pas de liaison détectable de trois peptides immunogéniques ni à SC-Kd-15, ni à Kd. Il est possible que ces peptides se lient de façon bien moins efficace que les deux peptides de VlH décrits plus haut, et que le test, tel que réalisé, n'est pas suffisamment sensible pour détecter la liaison. Des observations similaires ont déjà été faites (Choppin, J., Martinon, F., Gomard, E., Bahraoui, E., Connan, F., Bouillot, F. et Levy, J.-P., J. Exp. Med., 1990. 172:889). En conclusion, n'ignorant pas les difficultés associées à l' interprétation de telles expériences de liaison peptidique, cet exemple démontre que le comportement de SC-Kd-15 est qualitativement similaire à celui du K classique. SC-Kd-15 est capable de se lier à des peptides de manière similaire à celle de Kd.
En conclusion, cet exemple démontre que l'ingénierie de molécules Kd monocaténaires qui présentent les propriétés attendues en ce qui concerne (a) la réactivité avec trois AcM, dont l'un repère l'association correcte avec la β2-microglobuline et un autre, un épitope appartenant au premier domaine, (b) un reploiement efficace par traitement avec du thiocyanate de sodium 3M ou de l'urée 6M, et (c) liaison de certains peptides. Audessus de 10 résidus environ, la longueur de l'espaceur entre la chaîne lourde de Kd et la β2-microglobuline murine ne semble pas décisive. Toutes les expériences décrites ont été réalisées avec des quantités infinitésimales de molécules SC-Kd marquées de façon metabolitique. La production en grandes quantités devrait conduire à un matériel utilisable pour des études sur la liaison de peptides et de TcR.
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Sc-Kd en tant que molécule présentatrice d'antigène. Comme ce sera discuté ci-après de manière plus approfondie, les expériences réalisées dans le laboratoire des inventeurs ont montré qu ' une molécule H- 2Kd soluble, monocaténaire, recombinante, du CMH de classe I, est capable d'agir en tant que molécule présentatrice d'antigène, stimulant ainsi un hybridome restreint par H-2Kd restreint pour l'antigène. Ces résultats seront discutés ci-après, après un résumé des matériels et méthodes utilisés dans les expériences.
On a construit une molécule H-2Kd soluble, monocaténaire du CMH de classe I (SC-2Kd) en reliant la terminaison C de l'ectodomaine de la molécule native H- 2Kd à la terminaison N de la β2-microglobuline murine par l'intermédiaire d'un espaceur ayant une longueur de 15 acides aminés [Mottez, 1991]. Contrairement aux molécules natives du CMH, purifiées à partir de cellules, cette molécule chimérique est soluble en l'absence de détergent et elle est homogène par rapport à la β2-microglobuline d'origine murine. Elle est produite en grandes quantités en utilisant des cellules d'insectes infectées par baculovirus, des levures ou des cellules ovariennes d'hamster chinois et elle se lie à des peptides synthétiques avec la même spécificité que H-2Kd natif, associé à la surface cellulaire [Godeau, 1992 ; Ojcius, 1993 ; Abastado, 1993].
Nous démontrons que cette molécule H-2Kd recombinante monocaténaire est capable d'activer spécifiquement un hybridome de lymphocyte T et un basophile de rat transfecté par son TCR apparenté. De plus, on a montré que si SC-Kd monovalent se lie à la cellule d'hybridome T, la dimérisation de SC-Kd est nécessaire pour transmettre le signal d'activation. Ainsi, les déterminants modifiés du CMH ou les complexes CMH/peptide selon l'invention peuvent être utilisés sous forme dimérisée. Des méthodes de dimérisation seront décrites plus loin et sont évidentes pour l'homme du métier.
L'hybridome de lymphocyte T 9.4 est obtenu par fusion entre les 58 hybridomes de lymphocyte α-β-T [Letourneur, 1989] et le clone de CTL CW3/1.1 [Maryanski, 1986] spécifique du peptide Cw3 présenté par H-2Kd. Les peptides Cw3, NP et PbCS ont été décrits antérieurement [Maryanski, 1991].
Les anticorps monoclonaux SF1-1.1.1 (ATCC HB159), 20-8-4 [Abastado, 1987], F23.1, H57 ont été décrits antérieurement et sont spécifiques de H-2Kd, H-2Kd, les domaines Vβ8* et Cβ du TcR, respectivement. Des fragments Fab et F(ab')2 sont préparés comme décrit par Harlow, 1988. La lignée cellulaire basophile RBL-2H3 est transfectée comme décrit par Engel et al., 1992. La sécrétion d'IL2 dans le surnageant est mesurée par sa capacité à soutenir la prolifération de la lignée cellulaire CTLL dépendante d'IL-2. La prolifération des CTLL est mesurée par incorporation de 3H-thymidine.
SC-Kd monocaténaire agit comme une molécule présentatrice d'antigène. Pour tester l'aptitude de la molécule SC-Kd recombinante à agir comme une molécule présentatrice d'antigène, on charge SC-Kd purifié avec un peptide dérivé de HLA-Cw3 (appelé ci-après Cw3), on l'étalé sur une plaque de microtitrage et on teste son aptitude à stimuler un hybridome restreint par H-2Kd spécifique du peptide Cw3. On observe une stimulation spécifique détectée par la sécrétion d'IL2 dans le milieu de culture. Cette activation est spécifique du peptide, étant donné que SC-Kd chargé avec un peptide non apparenté (PbCS) ne présente pas d'activité.
Pour agir comme une molécule présentatrice d'antigène, SC-Kd doit être au moins dimère. De nombreuses études in vitro, utilisant des anticorps anti- TcR en tant que stimulateurs de lymphocytes T, indiquent qu'une liaison croisée du TcR est nécessaire pour l'activation des lymphocytes T [Kolanus, 1993 #690]. Toutefois, il n'est pas clairement élucidé si et comment l'agrégation des TcR se produit dans des conditions plus physiologiques, en particulier quand les TcR reconnaissent les complexes CMH/peptide. Le fait que des milliers de peptides différents soient présentés par le même APC [Engelhard, 1994] semble exclure la formation de plages étendues et stables de TcR réticulés. D'autres modèles ont été proposés où le contact entre les TcR et les complexes CMH/peptide provoque une transformation conformationnelle chez les TcR, qui à leur tour transmettent le signal à l'intérieur de la cellule (discuté chez Karjalainen, 1994). Dans les expériences précédentes, on a étalé sur des plaques du SC-Kd recombinant, imitant ainsi la surface cellulaire présentatrice d'antigène.
La disponibilité de molécules monomères solubles du CMH permet de tester les conditions de multivalence nécessaires pour que la molécule du CMH puisse activer les hybridomes de lymphocytes T. On transforme SC-K monovalent monocaténaire, chargé avec le peptide Cw3, en dimère par incubation avec un anticorps monoclonal spécifique de H-2Kd (SF1-1.1.1), reconnaissant un épitope dans le domaine α3. On ajoute ensuite cette préparation aux lymphocytes T et on mesure l'activation par la sécrétion d'IL2. Les SC-Kd dimères sont capables de stimuler les hybridomes de lymphocytes T 9.4 de manière dépendante de la dose. Cet effet est spécifique du peptide, étant donné que des dimères formés à partir de molécules de SC-Kd chargées avec des peptides non apparentés (PbCS ou T9V) ne stimulent pas les lymphocytes T.
Lorsqu'on omet l'anticorps spécifique de Kd, lorsqu'on le remplace par l'anticorps 20-8-4S reconnaissant un épitope dans le domaine α1-α2 de Kd [Abastado, 1987 #519] ou lorsqu'on utilise un anticorps non apparenté du même isotype (F23.1), on n'observe pas de stimulation. De plus, lorsqu'on utilise un excès de l'anticorps anti-α1-α2 (20-8-4S) en plus de l'anticorps anti-α3 (SF1-1.1.1), la stimulation des lymphocytes T est perdue, un excès de l'anticorps non apparenté n'ayant pas d'effet.
Afin de prouver encore que la dimérisation est nécessaire pour l'activation des hybridomes de lymphocytes T dans ce cas, on incube des complexes SC-Kd/Cw3 avec des fragments Fab ou F(ab')2, préparés à partir de l'AcM SFl-1.1.1, avant l'addition aux cellules hybridomes 9.4. Alors que les fragments Fab n'ont pas d'effet, les fragments F(ab')2 sont aussi efficaces que l'immunoglobuline native pour stimuler l'hybridome de lymphocyte T.
Dans ce cas, la dimérisation des molécules CMH est nécessaire pour la transmission de signal, et non pour la liaison. Deux études indiquent que l'affinité de TcR pour son complexe CMH/peptide apparenté est très faible, KD=10-4 à 10-5 M [Weber, 1992 ; Matsui, 1991]. Etant donné que la concentration utilisée dans le test est d'environ 10-7, on pourrait objecter que l'anticorps anti-Kd est nécessaire pour stimuler l'hybridome de lymphocyte T, parce que la dimérisation augmente l'avidité apparente du complexe pour le TcR.
Pour étayer cette interprétation, on a élaboré l'expérience suivante. On profite du taux de dissociation lente de l'AcM SFl-1.1.1. Par conséquent, une fois que les complexes Kd-peptide se sont liés à cet AcM, ils se dissocient très lentement. Des molécules SC-Kd sont chargées soit avec le peptide Cw3, soit avec le peptide PcCS non apparenté (non stimulateur). Tout en maintenant la concentration de SC-Kd /Cw3 constante, on ajoute des concentrations croissantes de SC-Kd/PbCS et d'AcM SFl- 1.1.1 aux cellules d ' hybridome 9.4. Dans un cas, on mélange d'abord les complexes SC-K /peptide avec l'AcM SFl-1.1.1 et ensuite, on les ajoute à celles d'hybridome T. Dans l'autre cas, on les incube d'abord avec les hybridomes de lymphocytes T et ensuite, on ajoute l'AcM SF1-1.1.1. Dans le premier cas, l'augmentation de la concentration de SC-Kd/PbCS conduit à une perte progressive de l'activation des lymphocytes T. La perte de l'activation des lymphocytes T résulte probablement d'une diminution du nombre d'homodimères de SC-Kd /Cw3. Après 3 heures, on élimine SC-Kd non lié par lavage précautionneux, mais approfondi. On ajoute ensuite l'anticorps SFl-1.1.1 et on mesure la réponse des lymphocytes T après une incubation supplémentaire de 16 heures. Comme représenté à la figure 5, même lorsque l'anticorps Kd-spécifique est ajouté après élimination de SC-Kd non lié, les cellules répondent par sécrétion d'IL2 dans le milieu de culture. Cela indique que la dimérisation de SC-Kd est nécessaire pour l'action des lymphocytes T, et non pour la liaison de TcR. Des molécules monocaténaires SC-Kd activent des cellules RBL basophiles de rat, transfectées avec des fusions TcR-ζ. Etant donné que l'affinité des TcR pour les CMH est assez faible, il a été suggéré que des molécules accessoires sont nécessaires pour stabiliser l'interaction. Eventuellement, de telles molécules pourraient aider les lymphocytes T à rechercher des cellules présentatrices d'antigène de type approprié, à établir le conjugué de cellule primaire et ensuite, le complexe CMH/peptide pourrait transmettre le signal d'activation par l'intermédiaire du TcR. Tout un réseau de molécules exprimées à la surface à la fois des APC et des lymphocytes T est ainsi impliqué.
Le fait d'utiliser des molécules du CMH purifiées a permis aux inventeurs de démontrer que les dimères SC-Kd chargés avec un peptide spécifique entrent en interaction avec les TcR en l'absence de molécules accessoires ou co- récepteurs. Bien que l'on utilise des molécules CMH solubles purifiées, il n'est pas possible de démontrer complètement l'implication de molécules accessoires dans l'activation de l'hybridome de lymphocytes T 9.4. En particulier, des molécules CD8 peuvent se lier à la molécule monocaténaire soluble et augmenter l'avidité apparente du complexe de CMH pour l'hybridome de lymphocytes T. Engel (1992) a développé récemment un système cellulaire dans lequel l'interaction de
CMH/peptide avec TCR peut être mesurée en l'absence de molécules accessoires.
Les ectodomaines (V+C) des chaînes α et β des TcR exprimés par le clone de CTL CW3.1/1 sont fusionnés par
PCR à la transmembrane et aux domaines cytoplasmiques de la chaîne ζ de CD3. Les constructions obtenues sont transfectées dans la lignée cellulaire basophile de rat RBL-2H3 et les transfectants sont analysés par cytométrie de flux à l'aide d'anticorps H57 anti-Vβfb10. Comme représenté à la figure 6, on détecte des niveaux élevés d'expression à la surface cellulaire. Ce transfectant est utilisé pour tester la capacité d
de SC-K monocaténaire soluble à présenter le peptide Cw3 et à induire l'activation cellulaire telle que mesurée par exocytose de sérotonine. Comme représenté à la figure 7, alors que SC-Kd seul chargé avec Cw3 ne produit pas d'effet, SC-Kd chargé avec Cw3 et complexé avec l'anticorps SF1-1.1.1 anti-α3 anti-Kd active spécifiquement les transfectants RBL-2H3. Cette activation est peptide-spécifique puisque SC-Kd chargé avec un peptide non apparenté ne produit pas d'effet. Etant donné que la lignée cellulaire RBL-2H3 basophile de rat n'exprime pas CD4 ou CD8, ce résultat démontre que la réticulation provoquée par SC-Kd de la molécule chimère TCR-ζ est suffisante pour l'activation cellulaire.
La molécule Kd monocaténaire décrite ici est complètement fonctionnelle et peut activer une molécule présentatrice d'antigène pour stimuler des hybridomes de lymphocytes T. Ces résultats mettent en évidence l'importance de l'agrégation des TcR provoquée par l'anticorps anti-CMH. Toutefois, le basophile RBL-2H3 et l'hybridome de lymphocytes T 9.4 expriment le récepteur de Fcg et on pourrait objecter que l'activation se produit par l'intermédiaire de ce récepteur, et pas seulement par l'intermédiaire des TcR. Cette hypothèse peut être exclue dans la mesure où les expériences initiales ont été réalisées sur des molécules SC-K étalées sur des plaques, en l'absence de tout anticorps anti-CMH. De plus, lorsqu'on utilise des concentrations élevées de SC-Kd chargé avec Cw3, on observe une agrégation spontanée. Ces préparations agrégées de SC-Kd pourraient stimuler les hybridomes de lymphocytes T en l'absence d'anticorps anti-CMH (données non représentées). Dimérisation, polymérisation ou agrégation de SC-Kd ou en général . SC-Kd est dimérisé en utilisant le protocole suivant. On incube SC-Kd purifié (0,5 mg/ml) pendant 2 heures à 4°C avec Ab. La dimérisation peut être nécessaire pour l' activation de cellules RBL transfectées par TCR. Abastado et al., J. Exp. Med. vol. 182, p. 439, août 1995, montrent que cette condition peut également s'appliquer à des hybridomes de lymphocytes T. Par conséquent, il est possible également que la dimérisation soit une pratique de routine pour réaliser la stimulation in vivo des lymphocytes T. Cependant, d'autres moyens ou formes d'agrégation peuvent être tentés également. Les mêmes procédures de dimérisation ou d'agrégation, ou des procédures similaires, peuvent être suivies afin de transformer les dimères en agrégats supérieurs de déterminants modifiés du CMH ou de molécules du CMH décrits dans la présente invention. Pour la dimérisation, on incube des déterminants dimérisés du CMH pendant environ une heure à environ la température ambiante avec une quantité égale d'anticorps de dimérisation, mais à une concentratin d'environ 100 μg/ml ou supérieure.
Préparation de Kd et Ld solubles . Un mode de réalisation d'un déterminant modifié du CMH, qui peut être utilisé dans la présente invention, est la séquence SC-Kd de la demande US en cours d'examen n° de série 07/801 818, déposée le 5 décembre 1991 (décrite ci- dessus). La séquence SC-Kd est clonée dans un vecteur d'expression amplifiable pFRSV et transfectée dans des cellules ovariennes d'hamster chinois (CHO). On sélectionne des clones résistant à du methotrexate à 0,5 μm et on les soumet à des augmentations par paliers de la concentration de methotrexate de 1 à 500 μm. On mesure par ELISA le Kd sécrété dans le surnageant de culture, sur des plaques de microtitrage revêtues avec SFl-1.1.1 et on révèle les plaques avec 20-8-US biotinylé et de la streptavidine marquée à la peroxydase de raifort. (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). On cultive des clones transfectants forts producteurs dans un flacon rouleur dans un milieu a-MEM complémenté avec 2 % SFV. On purifie les molécules SC-Kd par chromatographie d'affinité sur protéine A-Sepharose couplé à l'AcM SFl- 1.1.1. Avant utilisation, on soumet les préparations SC- Kd à une ultracentrifugation pendant 1 heure à 200 000 g pour éliminer tout agrégat.
On charge les molécules SC-Kd avec le peptide antigénique et on le dimérise à l'aide de l'AcM SFl- 1.1.1. On opère de manière à obtenir un rapport de un pour un. Dans certaines expériences, les dimères sont purifiés par filtration sur gel haute performance Superose GHR (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) avec un débit de 0,135 ml par minute de PBS.
On purifie du Ld soluble par chromatographie d'affinité à l'aide de l'AcM 30-5-7 à partir du surnageant de culture de cellules de Drosophila melangaster transfectées. Immédiatement après la purification, on charge des molécules SC-Kd ou Ld avec les peptides indiqués dans un rapport molaire de 1 pour 1. Couplage de complexes CMH/peptide à des supports solides. On couple le complexe CMH/peptide ainsi obtenu à un support solide approprié. On peut utiliser des supports tels que des flacons de culture en matière plastique ou des billes de latex. On peut également utiliser divers autres supports connus dans la technique, tels que des matrices de gel, des billes de verre, des billes revêtues de liposomes. Dans un mode de réalisation préféré, on utilise des billes magnétiques (Dynabeads M450 tosylactivés) (Dynal A. S. Oslo, Norvège). Le couplage à des billes magnétiques et à des plaques de microtitrage est décrit ici dans les deux cas, à titre d'exemple.
On couple d'abord à l'AcM SFl-1.1.1 ou 30-5-7 des Dynabeads M450 tosylactivés, en suivant les instructions du fabricant. Il est important de noter que les billes peuvent être activées de manière efficace par d'autres moyens. La limitation importante est que l'orientation du complexe CMH/peptide doit faciliter la liaison aux lymphocytes T. Les anticorps sont liés au support avant la fixation du complexe CMH/peptide afin d'augmenter la densité des complexes CMH/peptide sur les billes et favoriser l'orientation du complexe. Bien que l'on ait utilisé des anticorps, leur utilisation est indiquée à titre purement illustratif. D'autres partenaires de liaisons spécifiques, qui préservent l'efficacité de la liaison et l'orientation, sont également applicables. En bref, on incube 150 μg d'anticorps purifié avec
15 mg (2x108) de billes dans 1 ml d'une solution de borate 0,25 M, pH 9,5, pendant 24 heures à 22°C. Les billes sont lavées soigneusement dans du PBS contenant 0,1 % de BSA pour éliminer l'anticorps en excès et saturer les sites libres avec BSA. On incube les billes pendant 0,5 heure à 4°C avec 150 μg de complexes CMH/peptide et on les relave dans le même tampon (généralement, on utilise un excès 100 fois supérieur du complexe pour saturer tous les sites de fixation des anticorps). Afin de déterminer l'efficacité du couplage, les billes magnétiques couplées au SFl-1.1.1 sont incubées avec un excès de molécules SC-Kd chargées avec un peptide de type PbCS marqué avec 125I, avec une activité spécifique de 2x1012 Bq/mmole (16). Après lavage soigné, on mesure la radioactivité associée aux billes et on l'utilise pour calculer la quantité de SC-Kd couplé.
On purifie les AcM SFl-1.1.1 anti-Kd (HB159 ; American Type Culture Collection, Rockville, MD) et les AcM 30-5-7 anti-Ld (17) sur protéine A-Sepharose à partir du surnageant de culture ou de fluide ascitique, respectivement. Des anticorps anti-Vβ10 conjugués à PE et anti-CD8 conjugués à FITC sont fournis par Pharmingen (San Diego, CA). Le AcM SFl-1.1.1 est spécifique pour le domaine α3 de Kd.
Les lignées de cellules tumorales P815 (TIB64 ;
American Type Culture Collection, Rockville, MD), P815-
Cw3 (18), P198 (19), et la lignée de cellules hybridomes 9.4 T (20) ont été déjà décrites ailleurs. Les cellules
9.4 à croissance exponentielle sont marquées pendant
16 heures à l ' aide de la [méthyl-3H]-thymidine (Amersham-
France, Les Ulis, France) à une activité spécifique de
3
2x10 Bq par cellule. Source de lymphocytes T. On connaît dans la technique diverses méthodes pour recueillir des lymphocytes T comprenant le lymphocyte T antigène- spécifique et on peut les utiliser. Généralement, on prélève du tissu spécifique chez des animaux que l'on sait posséder le lymphocyte T antigène-spécifique, au moyen d'une caractérisation préalable ou d'une introduction délibérée de l'antigène ou du vecteur associé à l'antigène, ou on effectue des biopsies. Deux exemples, concernant des PEL et TIL, seront décrits ci- après.
Des lymphocytes d'exsudât péritonéal (PEL) peuvent être préparés par toute méthode connue dans la technique.
Par exemple, comme dans certains des modes opératoires spécifiques décrits, on injecte par voie intrapéritonéale à des souris 107 cellules tumorales P815. On effectue une seconde injection 8 jours plus tard. Dix jours après la seconde injection, on recueille les cellules dans la cavité péritonéale et on les purifie sur un gradient de
Percoll (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suède).
Des lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) peuvent être préparés par des méthodes connues dans la technique. Par exemple, comme dans certains des modes opératoires décrits, on injecte dans l'épaule droite de souris, par voie sous-cutanée, 3x106 P815 ou 1,5x107 P815-Cw3 ou 3x10 P198, comme indiqué. Lorsque les tumeurs ont atteint 1 cm, on les prélève et on purifie les cellules sur un gradient de Percoll. Dans certains essais, les TIL sont amplifiés pendant 10 jours dans du RPMI 1640 (Gibco BRL, Eragny, France) complémenté avec 10 % de FCS (Dutscher, Brumath, France), 10 U/ml de IL-2 et de IL-7 ( Immunogenex, Los Angeles, CA) en présence d'une quantité 10 fois en excès de splénocytes syngéniques irradiés.
Purification de lymphocytes T par adsorption sur des complexes CMH/peptide . On ajoute à la suspension cellulaire des billes magnétiques couplées au complexe CMH/peptide indiqué et on incube le mélange de préférence à une température qui ne permet pas la phagocytose d'un complexe par un macrophage et qui ne nécessite pas la régulation négative de l'expression des récepteurs de lymphocytes T. Une température pouvant provoquer le moindre dommage aux cellules peut être déterminée par expérimentation de routine. Les cellules sont séparées par voie magnétique à l'aide d'un concentrateur de particules magnétiques (Dynal) suivant les instructions du fabricant, elles sont lavées avec précaution deux fois avec du milieu de culture froid et incubées pendant 1 heure pour dissocier les billes des lymphocytes T. La température recommandée est de 37°C. Les réglages de temps et de température peuvent être ajustés de façon à obtenir des résultats optimaux par expérimentation de routine. Une incubation pendant 3 heures à 4°C s'est avérée efficace dans certains cas. Le procédé peut être rendu optimal par rotation douce afin de maximaliser le contact entre le complexe CMH/peptide et les lymphocytes T.
On peut utiliser diverses techniques pour dissocier les lymphocytes T du support. Ces techniques varient en fonction de la nature du support utilisé dans le procédé, mais généralement, elles comprennent des techniques telles que le " panning " (procédure de triage de cellules permettant leur séparation) et des techniques similaires connues. Lorsqu'on utilise des billes magnétiques ou des flacons ou plaques en matières plastique, on peut employer le panning.
Analyse du répertoire du TCRβ. Le répertoire du TCRβ est analysé comme décrit ici. En bref, on prépare de l'ARN total par lyse dans du thiocyanate de guanidium et ultracentrifugation sur un gradient de CsCl. On effectue la synthèse d'ADNc simple brin en utilisant le kit de synthèse d'ADNc de Boehringer Mannheim. On incube 10 μg d'ARN total pendant 10 minutes à 70°C avec du (dT)15 (5 μM) et chaque dNTP à 1 mM. Après extraction au phénol- chloroforme, on soumet l'ARN à une transcription inverse. On amplifie l'ADNc formé par PCR, à l'aide des amorces spécifiques Vβl0 et Cβ. Un mélange contenant KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,2), MgCl2 1,5 mM, 0,01 % de gélatine, dNTP 200 μM, 0,01 % de Triton X-100, l'ADNc nouvellement synthétisé (ou de l'eau dans les témoins négatifs), la Taq polymérase (Promega) (2 unités/100 μl) et 0,25 μM d'amorce Cβ est réparti dans 23 tubes (47 μl par tube), contenant chacun 2,5 μl d'huile minérale. L'amplification est effectuée dans un thermocycleur Perkin-Elmer ou LEP. L'amplification commence par une étape de dénaturâtion de 1 minute à 94°C, suivie par 40 cycles constitués par 70 secondes à 94°C, 1 minute à 60°C et 4 minutes à 72°C (pour réduire au minimum la recombinaison intra-PCR), et enfin, une étape de 10 minutes à 72°C. Les produits de la réaction d'amplification sont soumis à un allongement final (run off ou amplification par PCR) en utilisant soit un Cβ emboîté, soit une amorce Jβ1.2 spécifique, marquée par un fluorophore. On fait passer les produits amplifiés marqués sur un gel de séquençage pour déterminer la taille et l'intensité de fluorescence sur un séquenceur d'ADN 373A (Applied Biosystems). La quantification des amplifiés est simplifiée par un logiciel créé à cet effet, en particulier le logiciel Immunoscope. (4).
Adsorption spécifique d 'hybridomes de lymphocytes T sur leur complexe CMH-peptide apparenté . Afin de déterminer si les lymphocytes T peuvent être purifiés spécifiquement par adsorption sur des complexes CMH/peptide, on utilise une molécule monocaténaire, recombinante, soluble du CMH de classe I, décrite précédemment (SC-Kd). SC-Kd purifié peut être chargé avec des peptides exogènes par incubation avec environ 5 μM de peptide, les exemples comprenant Cw3 ou PbCS, pendant 1 heure à 37°C. Ces derniers peuvent être dimérisés à l'aide de l'AcM SFl-1.1.1. Les dimères peuvent être purifiés par filtration sur gel haute performance Superose 6 HR (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.) avec un débit de 0,35 ml/min de PBS. De tels complexes SC- Kd/peptide sont reconnus spécifiquement par les lymphocytes T apparentés (24). Le premier utilisé est l'hybridome de lymphocytes T 9.4 (20), qui est restreint pas Kd et spécifique d'un peptide dérivé de HLA-Cw3.
Les billes magnétiques sont couplées par covalence à l'AcM Kd-spécifique SFl-1.1.1 et elles sont incubées avec un excès de SC-Kd chargé soit avec le peptide Cw3, soit avec le peptide PbCS non apparenté. Dans des expériences parallèles utilisant des molécules SC-Kd chargées avec un peptide radioactif, on a déterminé que chaque bille est couplée à environ 1,3x105 molécules SC-Kd (non représenté). Les billes chargées avec SC-Kd/Cw3 (3x106) sont mélangées avec 5,5x105 cellules 9.4 marquées avec 3H. Après trois lavages effectués avec précaution, on recueille les billes magnétiques et on récupère les cellules liées. On détermine le nombre de cellules en mesurant la radioactivité associée aux billes.
Comme le montre la figure 5, 62±2,8 % de lymphocytes T sont récupérés par adsorption sur les complexes SC-Kd/Cw3 spécifiques. D'un autre côté, on récupère 20 fois moins de cellules (3±0,3 %) avec les complexes SC-Kd/PbCS. Ce résultat indique que la liaison des lymphocytes T aux billes magnétiques est peptide- spécifique et suggère que des populations de lymphocytes T complexes peuvent être enrichies en lymphocytes T ayant une spécificité donnée. D'une manière générale, on récupère de 60 % à 80 % de cellules spécifiques. On a calculé que plus de 105 complexes Kd/peptide sont liés à chaque bille. Dans une étude antérieure (39), on a extrait le peptide Cw3 à partir des cellules P815-Cw3 et on en a recueilli quelque centaines par cellule. En considérant que le diamètre d'une cellule P815 est trois fois celui d'une bille, la densité moyenne des complexes Kd/Cw3 par unité de surface est d'au moins 10 3 fois, et peut-être même 105 fois plus élevée sur les billes que sur les cellules P815-Cw3. Toutefois, on pourrait objecter qu'une densité élevée de complexes Kd/Cw3 pourrait être également obtenue à la surface cellulaire par redistribution d'antigène après l'interaction avec le TCR. Dans tous les cas, les résultats montrent qu'en utilisant un support solide couplé à une densité élevée de complexes CMH/peptide, on peut purifier les lymphocytes T selon leur spécificité.
Purification de lymphocytes d ' exsudat péritonéal peptide-spécifiques (PEL ) . Pour déterminer si les lymphocytes T peptide-spéciques peuvent être purifés à partir de populations cellulaires complexes, on prépare des PEL de souris DBA/2 (H-2d) immunisées contre P815- Cw3, étant donné que J. Maryanski et ses collaborateurs ont montré que cette réponse immunitaire est caractérisée par une expansion excessive des lymphocytes T spécifiques. Le mastocytome P815 d'origine DBA/2 n'est pas très immunogène. Son immunogénicité peut être améliorée par transfection avec divers antigènes, tels que l'antigène du CMH de classe I humain HLA-Cw3 donnant naissance à P815-Cw3, qui est plus immunogène et par conséquent, généralement rejeté (18). La réponse immunitaire à P815-Cw3 chez des souris DBA/2 est dirigée principalement contre le peptide Cw3 présenté par H-2Kd. De plus, lorsque ces auteurs ont analysé un panel de 23 clones de lymphocytes T indépendants, spécifiques de P815-Cw3, ils ont trouvé que tous les clones reconnaissaient le peptide Cw3 présenté par Kd et utilisaient le même segment Vβ (Vβ10). De plus, il y avait un biais significatif (12/23) en faveur du segment Jβ1.2 et toutes les régions CDR3 des chaînes β analysées avaient la même longueur (6 acides aminés). Ces caractéristiques ont également été observées lors de l'analyse directe de PBL, PEL ou TIL par cytometrie sans expansion in vitro (11). Lorsqu'on analyse par PCR le répertoire de TCRβ de ces populations cellulaires, on détecte un pic caractéristique correspondant à une longueur de CDR3 de 6 résidus, en utilisant une amorce Vβ10-spécifique. De plus, chez toutes les souris soumises au test, une fraction variable, mais significative, de ces transcrits Vβ10 utilise le segment Jβ1.2 (observations non publiées JPL et figure 7). Ces caractéristiques nous ont permis de détecter des lymphocytes T spécifiques et de régler l'enrichissement en lymphocytes T spécifiques par adsorption de complexes CMH/peptide.
Des PEL de souris DBA/2 immunisées avec P815-Cw3 sont adsorbés sur des billes couplées à SC-Kd/Cw3, lavés et analysés par cytometrie de flux. La 'figure 6 représente l'allure de l'expression de Vβ10 par des PEL avant et après adsorption sur des complexes SC-Kd/Cw3. Avant adsorption, on observe une distribution bimodale, tandis qu'après adsorption, la population cellulaire est homogène exclusivement dans les cellules exprimant Vβl0. Les PEL sont également caractérisés avant et après adsorption en utilisant d'autres marqueurs de la surface cellulaire. Le nombre et le pourcentage des différents sous-ensembles cellulaires sont indiqués dans le Tableau 1. Les lymphocytes T exprimant CD8+,Vβ10 représentent 20,4 % de la population initiale qui est essentiellement composée de cellules non-T (P815-Cw3 résiduels, macrophages et lymphocytes B). Toutefois, dans les PEL adsorbés, les lymphocytes T exprimant CD8+Vβl0 représentent 97 % de la totalité des cellules, ce qui correspond à un enrichissement d'un facteur de cinq. Le nombre absolu des cellules (Tableau 1) indique que la vaste majorité des lymphocytes T spécifiques à Kd/Cw3 a été récupérée. La population adsorbée représente 79,3 % des cellules exprimant CD8+Vβ10 dans la population initiale des cellules. Etant donné que l'on ne s ' attendait pas à ce que toutes les cellules exprimant CD8+Vβ10 dans la population initiale soient spécifiques vis-à-vis de Kd/Cw3, 79,3 % est une estimation minimale du rendement réel. Lorsque des PEL sont adsorbés sur SC- Kd chargé avec un peptide non pertinent, on récupère moins de 0,02 % des cellules.
Ainsi, cette analyse indique que les lymphocytes T exprimant CD8 et Vβ10 présents dans les PEL de souris DBA/2 immunisées sont purifiés spécifiquement par adsorption sur des complexes SC-Kd/Cw3.
Afin de mieux comprendre le faible potentiel anti- tumoral des TIL, il a été décidé d'analyser et de purifier des TIL en fonction de leur spécificité. On a injecté par voie sous-cutanée à des souris une dose létale (107) de cellules tumorales P815-Cw3. Lorsqu'on utilise ce mode d'injection, les cellules P815-Cw3 prolifèrent généralement, au moins temporairement, comme une tumeur solide largement infiltrée de macrophages, de lymphocytes B et T. Après 10 jours, on prélève les tumeurs, on les dissocie et on analyse les TIL. Une fraction importante de l' infiltrat tumoral est constituée par des cellules P815-Cw3 (non représenté). Seul, un faible pourcentage des lymphocytes infiltrant les tumeurs P8l5-Cw3 solides sont spécifiques de la tumeur. Parmi les lymphocytes T, moins de 5 % expriment à la fois CD8 et Vβ10. Les longueurs de la région CDR3 des chaînes TCR-b sont déterminées par PCR, en utilisant des amorces spécifiques soit à Vβ10 et Cβ, soit à Vβ10 et Jβ 1.2 (figure 7). A titre de témoin, on a analysé des splénocytes de souris naïves (figure 7, panneaux a et b). On observe des allures typiquement gaussiennes indiquant un répertoire polyclonal. Dans les TIL d'animaux immunisés (figure 7, panneaux c et d), 32 % des transcrits Vβl0 présentent un CDR3 ayant la longueur de 6 acides aminés compatible avec la spécificité Kd/Cw3. Cette expansion clonale peut être également détectée lorsque l'amorce Jβ1.2 est utilisée dans l'allongement final (figure 7d).
Pris ensemble, le faible pourcentage des TIL exprimant à la fois CD8 et Vβ10 et l'analyse du TCRβ indiquent qu'une petite fraction des TIL (entre 1 et 2 %) présente l'empreinte de lymphocytes spécifiques de Kd/Cw3
(CD8, Vβ10 et un CDR3 de 6 acides aminés).
Des TIL spécifiques d ' une tumeur peuvent être purifiés par adsorption sur le complexe antigénique CMH/peptide . Afin de purifier des TIL spécifiques à P815- Cw3, on incube des suspensions de cellules individuelles obtenues à partir de tumeurs dissociées avec des billes magnétiques couplées à SC-Kd/Cw3. Des cellules sélectionnées sont analysées à nouveau par cytometrie de flux et PCR, comme dans la section précédente. On détecte très peu de cellules tumorales par cytometrie. Les cellules exprimant à la fois Vβ10 et CD8 représentent 89 % des cellules purifiées (non représenté). On observe une seule longueur (6 résidus) pour la région de CDR3 de la chaîne TCRβ en utilisant des amorces spécifiques de V β10 et Cβ (figure 7e). Ce pic est également observé lorsque l'on utilise l'amorce Jβ1.2 pour l'allongement final (figure 7f). A titre de témoin, on fait adsorber une fraction des TIL non purifiés sur SC-Kd/PbCS. Très peu de cellules sont récupérées sur des billes couplées à ce complexe non pertinent. Pris ensemble, ces résultats indiquent que, si des lymphocytes T spécifiques de Kd/Cw3 constituent une très petite fraction des TIL, ils peuvent être purifiés de façon efficace et spécifique sur un support solide, par exemple des billes magnétiques. La population purifiée est homogène et elle est composée exclusivement de lymphocytes T exprimant Vβ10 et CD8 avec un CDR3 de 6 acides aminés.
Les TIL purifiés sur SC-Kd/Cw3 présentent une activité cytotoxique in vitro accrue . Une des hypothèses avancées concernant les résultats modestes de l'immunothérapie adoptive anti-tumorale est que certains TIL spécifiques d'une tumeur sont anergiques. Par conséquent, on a décidé de vérifier directement leur activité cytotoxique in vitro avant et après adsorption sur des complexes CMH/peptide spécifiques. Les figures 8a et 8b montrent leur activité cytolytique testée sur des cellules cibles P815 et P815-Cw3 marquées au 51Cr. La lyse des cellules cibles P815-Cw3 par des TIL non adsorbés n'est pas significativement plus élevée que celle des P815, comme pouvait le laisser prévoir la faible fréquence des cellules exprimant Vβ10 + CD8. Au contraire, les TIL purifiés par adsorption sur SC-Kd/Cw3 lysent spécifiquement P815-Cw3. La purification a non seulement augmenté l'activité spécifique de CTL, mais elle a également diminué la lyse non spécifique de P815.
Des TIL purifiés et non purifiés sont multipliés in vitro en utilisant IL-2, IL-7 et des splénocytes syngéniques irradiés. D'autres méthodes destinées à l' expansion de cultures de lymphocytes T sont connues dans la technique. Après 10 jours d'expansion en culture, on teste à nouveau l'activité de CTL. Comme représenté à la figure 8d, on observe une lyse plus importante de P815-Cw3 sans augmentation significative de la lyse non spécifique de P815. D'un autre côté, les TIL non purifiés présentent une lyse non spécifique de P815 et de P815-Cw3 (figure 4c). Ces résultats démontrent que les TIL purifiés par adsorption sur des complexes CMH/peptide spécifiques présentent une activité de CTL spécifique qui augmente encore par culture in vitro.
Des TIL purifiés présentent une puissante activité anti- tumorale in vivo.
On a continué à vérifier l'activité anti-tumorale des TIL purifiés in vivo. On a injecté à trois groupes composés chacun de cinq souris, par voie sous-cutanée, 107 cellules P815-Cw3. Six jours après injection, on administre à un groupe 107 TIL qui ont été purifiés par adsorption sur SC-Kd/Cw3 et amplifiés in vitro, comme décrit dans la section précédente. A un autre groupe, on administre le même nombre de TIL, mais non purifiés in vitro avant amplification. Le troisième groupe ne reçoit aucun TIL. On mesure chaque jour la croissance tumorale et le taux de survie des souris. La figure 9a montre que si 60 % des souris qui ont reçu des TIL non purifiés sont mortes dans les 27 jours, toutes les souris qui ont reçu des TIL purifiés ont été protégées. Toutes les souris qui n'ont reçu aucun TIL sont mortes dans les 24 jours. Ces résultats confirment la spécificité des TIL purifiés. Ils indiquent également l'importance des populations purifiées, en développement, des lymphocytes T, comme décrit ici, dans la fourniture d'une activité anti-tumorale in vivo renforcée.
Comme mentionnée ci-dessus, l'immunogénicité de P815-Cw3 est augmentée par transfection de HLA-Cw3, résultant en un potentiel tumorigène réduit. De plus, la réponse immunitaire de souris DBA/2 à P815-Cw3 est quelque peu inhabituelle, du fait que les lymphocytes spécifiques de Kd/Cw3 abritent tous un Vβ particulier et une longueur de CDR3b particulière. L'éradication réussie de P815-Cw3 pourrait donc résulter d'une affinité exceptionnelle des TCR anti-Cw3 pour leur ligand ou du faible potentiel tumorigène de cette tumeur. Afin de tester la généralité de la présente approche, on a analysé deux différentes tumeurs en utilisant deux différents peptides et une autre molécule du CMH de classe I.
La réponse immunitaire à P815 chez des souris DBA/2 est dirigée contre au moins 4 peptides, dont un dérive de la protéine P1A et est présentée par Ld (25, 26). La tumeur P198 est une variante de P815, dans laquelle une mutation en un seul point a généré un nouvel épitope appelé P198 et présenté par Kd (19). Les TIL ont été purifiés à partir de ces deux tumeurs par adsorption sur des complexes Ld P1A ou SC-Kd/P198, amplifiés in vitro et réinjectés à des souris DBA/2 auxquelles on avait administré précédemment une dose létale (3x106) de cellules tumorales P815 ou P198, respectivement. Le taux de survie des souris est présenté à la figure 9, panneaux b et c. Alors que toutes les souris n'ayant pas reçu d'injection meurent dans les 24 jours, 60 % (b) et 20 % (c) des souris ayant reçu des TIL non purifiés survivent. Lorsqu'on injecte des TIL purifiés par adsorption sur le complexe CMH/peptide pertinent, 100 % et 80 %, respectivement, des souris sont protégées. Ce résultat indique que les TIL spécifiques d'une tumeur pourraient être aussi bien purifiés à partir d'autres tumeurs, avec une activité anti-tumorale in vivo renforcée.
Ingénierie, préparation et utilisation de SC-A2 humain monocaténaire
Construction de plasmide. On prélève à partir de pSC-A2 le fragment Hind III-Hind III codant pour SC-A2, puis on le sous-clone au site de clonage de Hind III du plasmide p Rc/CMV ( Invitrogen). L'orientation transcriptionnelle sous le contrôle du promoteur CMV a été d'abord vérifiée par cartographie de restriction, puis par séquençage nucléotidique.
La construction SC-A2, qui comprend la séquence signal et les trois premiers domaines de l'ADNc chaîne lourde de HLA-A2.1 fusionnés à la séquence codante de la b2-microglobuline humaine, par l'intermédiaire d'un linker ou charnière flexible de 15 acides aminés, est présentée à la figure 10 avec la séquence nucléotidique correspondante.
Transfection de cellules basophiles. On transfecte 107 cellules RBL-2H3 avec 10 mg d'ADN plasmidique pCMV.SC-A2 linéarisé par Pvu I, en utilisant un système d'électroporation (Eurogentec, Sart Tilman, Belgique) réglé à une impulsion simple, 250 V avec une résistance de shunt de 192 ohm et une capacité de 450 mF. Après 24 heures, on sélectionne d'abord les cellules dans un milieu de culture complet contenant 1 mg/ml de G418 (Gibco, Gaithersbourg, MD), puis on augmente lentement à 4 mg/ml.
Les peptides utilisés dans cette étude (FIOV, I9V, A9L, R8L, Ova, CW3=RYLKNGKETL et Y8I) ont été décrits antérieurement (15, 16) et ont été fournis par Neosystem (Strasbourg, France).
AcM. L'AcM W6.32 anti-HLA-ABC et l'AcM FMC 16 anti- β2-microglobuline humaine ont été fournis par Valbiotech (France).
Lignée cellulaire . La lignée cellulaire basophile de rat RBL-2H3 a été décrite antérieurement et l'homme du métier sait se la procurer. immunoprécipitation de SC-A2 à partir du surnageant de cellules basophiles de rat transfectées par pCMV. SC-A2
(RBL ). Cette lignée cellulaire RBL stable, transfectée par SC-A2 (107 cellules), est lavée 2 fois et incubée dans 4 ml de milieu complet exempt de methionine, pendant 30 minutes, puis additionnée de 378 mCi de methionine 35S pendant 24 heures. A la fin du marquage, on sépare les cellules et le milieu de culture par centrifugation, on soumet le surnageant à une immunoprécipitation en utilisant l'AcM W6.32 ou l'AcM FMC 16 lié à des billes magnétiques (DYNAL), qui réagissent respectivement avec HLA-ABC et la β2-microglobuline humaine, on sépare les molécules SC-A2 immunoprécipitées dans un concentrateur de particules magnétiques (Dynal), on les lave deux fois avec du PBS froid puis on les analyse par SDS-PAGE. Préparation de SC-A2 soluble . On purifie SC-A2 soluble monocaténaire en une étape à partir du surnageant de cellules RBL transfectées par pCMV.SC-A2, en utilisant la colonne d ' immunoaffinité liée par covalence à l'AcM W6.32, comme décrit préalablement pour la purification de SC-Kd.
Test de liaison peptidique . La liaison peptidique à SC-A2 est mesurée par compétition à l'aide de F10V à marqueur radioactif, comme connu dans la technique. Ce peptide est marqué, comme connu dans la technique, à une activité spécifique de 43 mCi/mmole, en utilisant une iodation catalysée par la chloramine T. On incube CS-A2 (7 μg) pendant 2 heures à la température ambiante avec 4,5 μM de F10V marqué, en présence d'un excès 60 fois molaire du peptide compétiteur. On élimine le peptide non lié par ultrafiltration en utilisant du Microcon 30 (Amicon) et 7 lavages avec du PBS. Le marquage est mesuré dans les peptides retenus à l'aide d'un spectomètre g (Uammamatic, Kontron). Cul tures de lymphocytes . On isole les PBL sur un gradient Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suède). On produit des CTL humains primaires dans une culture de 10 jours, par mélange avec des billes (revêtues avec 100 μg de complexe CMH/peptide, comme décrit). Ces cultures sont conduites en présence d'IL-7 et IL-2. Des CTL primaires murins sont générés dans une culture de
7
10 jours. 106 cellules spléniques sont mélangées à 10 billes revêtues avec 100 μg de complexe CMH/peptide. L'activité cytolytique des cellules lymphoïdes est alors testée.
Test de la cytotoxicité . On teste la cytotoxicité de suspensions de lymphocytes dans un test de libération de 51Cr standard, en 6 heures, connu dans la technique. Le pourcentage de lyse spécifique de 104 cellules cibles marquées au 51Cr dans 200 μl est déterminé pour divers rapports des lymphocytes aux cellules cibles. Les valeurs de libération spontanée de 51Cr varient entre 5 et 15 % de la totalité du marqueur incorporé. Voir également
(68).
Expression de SC-A2 dans des cellules basophiles de rat transfectées (RBL ) . La lignée cellulaire RBL transfectées SC-A2 stable est marquée pour 36 heures avec la methionine 35S. Après immunoprécipitation à partir du surnageant à l'aide de l'AcM W6.32, qui réagit avec la β2-microglobuline humaine, et d'un AcM qui réagit avec
HLA-ABC, les molécules SC-A2 sont détectables par SDS- PAGE, comme le montre la figure 11A. Pour que la composition soit enrichie en cette molécule, dans un mode opératoire de purification en une étape, on utilise une chromatographie d'immunoaffinité avec une colonne munie d'AcM W6.32 immobilisés. L'éluat de la colonne d'affinité présente une bande principale qui peut être colorée par le bleu de Coomassie, d'environ 48 kDa (figure 11B). Ce mode opératoire conduit régulièrement à l'obtention d'environ 500 μg de SC-A2 par litre de surnageant de culture. La solubilité de la molécule du CMH n ' affecte pas la liaison des peptides pertinents . Après la production et la purification de la molécule du CMH, on a examiné si la molécule SC-A2 purifiée a conservé sa fonctionnalité. La liaison est effectuée au moyen d'un test par compétition, représenté à la figure 12. Trois peptides (F10V, 19V, A9L), dont on sait qu'ils se lient fortement à HLA-A2, inhibent la liaison de F10V marqué par radioactivité à SC-A2, alors que des peptides connus pour se lier à H-2Kb (R8L, Ova) ou à H-2Kd (Cw3, Y8I) n'ont pas d'action inhibitrice. Dans ce test, la liaison de Fl0V, marqué par radioactivité, à la molécule de SC-A2, permet d'évaluer que dans cette préparation, il y a 1/7 de molécule fonctionnelle. Du point de vue biochimique, ces molécules sont fonctionnelles et leur fonction d'importance physiologique peut être alors vérifiée.
La Classe I soluble peut activer les lymphocytes T et favoriser leur prolifération. Des billes revêtues avec le complexe Sc-Kd/Cw3 sont introduites dans des cultures de lymphocytes T de souris DBA/2. Après 2 jours de culture, on observe une forte prolifération, aussi forte que pour le témoin positif après 4 jours. Une réponse proliférative tardive est associée à une production forte et prolongée d'IL2.
Induction de CTL primaires spécifiques chez la souris . Afin d'examiner si une densité élevée d'un seul complexe peut induire des CTL primaires, indépendamment de molécules co-stimulatrices, on tente de générer des CTL primaires chez la souris, contre deux peptides connus pour se lier respectivement à des molécules Kd et Ld, à savoir CW3 et P1A. On lie ces molécules complexées à des billes et ensuite, on les ajoute à des splénocytes cultivés naïfs de souris DBA2, complémentés avec de l'interleukine exogène. Après 15 jours de culture, on recueille les cellules lymphoïdes et on examine leur activité cytolytique au moyen d'un test classique au Cr (68), comme présenté à la figure 13A-B. On observe une forte activité cytolytique dirigée contre les deux peptides (figure 13A-B). On détermine que ces cellules sont restreintes par H2 et ont un phenotype CD8. En utilisant deux différents peptides et deux différentes molécules de classe I, on peut provoquer une réponse de CTL primaire. Ces CTL ont une affinité suffisamment élevée pour reconnaître un peptide endogène exprimé sur les cellules tumorales P815 et P815-HLA CW3.
Induction de lymphocytes T cytotoxiques peptide- spécifiques chez l 'homme . On suit la même voie en utilisant une molécule HLA A2 soluble. On lie le complexe CMH/peptide à des billes et on utilise ces dernières en tant qu'APC dans des co-cultures primaires avec des PBL de donneurs sains. Après trois cycles de stimulation, on est capable de détecter une activité cytotoxique spécifique à chacun des deux différents peptides utilisés : l'un issu de la tumeur mélanome (mage3) ; le second peptide, de la protéine polymérase (pol) de VlH. Les résultats sont présentés sur les figures 14-15. L ' induction de CTL spécifiques primaires utilisant une densité élevée de complexe CMH/peptide est indépendante de la présence d 'APC professionnelles . Afin de voir si la présentation du peptide aux lymphocytes T est due à la reconnaissance directe du complexe CMH/peptide sur les billes ou au traitement du complexe par des macrophages, on supprime les macrophages de la culture primaire à l'aide d'une colonne Nylon-Wood. On co-cultive alors des lymphocytes T avec des billes et on compare l'aptitude de cette culture à induire une activité cytolytique à celle de la culture non dépourvue de macrophages. On n'observe pas de différence significative entre les activités cytolytiques. Le fait qui démontre clairement que la présentation et l'activation de CTL spécifiques sont indépendantes des APC naturelles, notamment des cellules dendritiques, des macrophages et des lymphocytes B, c'est que la suppression de ces cellules n'abroge pas l'induction des CTL. De plus, la nécessité de la présence d'une molécule du CMH, ici du CMH de classe I, est démontrée, étant donné que les billes revêtues avec le peptide seul n'induisent pas les CTL.
L ' efficacité de la présentation de peptide par des billes revêtues avec CMH/peptide est aussi bonne que la présentation par des cellules dendritiques . Pour évaluer l'efficacité de billes à présenter un antigène peptidique à des lymphocytes T naïfs, ce qui conduit par la suite à l'activation de ces derniers, on compare parallèlement l'aptitude de différentes APC à activer in vitro les CTL primaires. Trois différentes APC sont comparées à des cellules dendritiques, des lymphocytes B après élimination des peptides (comme déjà décrit) revêtus avec le peptide CW3, en utilisant les mêmes conditions de culture. Dans ces conditions, on observe après induction le même ordre de grandeur de l'activité cytolytique dans la culture après 10 jours, ce qui démontre que la densité élevée de CMH peut compenser l'absence d'antigènes co- stimulateurs, connus pour être sur-exprimés sur les cellules dendritiques.
Activité anti-tumorale utilisant des CTL primaires induits par le complexe CMH/peptide. Une dose élevée de peptides exogènes, sans la compétition de peptides internes, peut être avantageuse pour générer des, cellules effectrices contre des antigènes spécifiques d'une tumeur. La faisabilité de cette approche est testée par incubation de cellules spléniques non séparées de souris DBA2 avec des cellules Ld et un peptide synthétique de DBA2. Après 10 jours de culture, on réintroduit ces cellules dans la souris à laquelle on a greffé des tumeurs. Les cellules réintroduites conduisent avec succès à la disparition des tumeurs. Des CTL primaires spécifiques ont une affinité suffisamment élevée pour reconnaître un peptide endogène. On examine ces CTL primaires pour savoir s'ils reconnaissent un peptide endogène chez la souris. Des CTL P1A spécifiques sont capables de tuer des cellules P815. Des CTL induits de manière appropriée tuent des cellules infectées par la grippe, des cellules de mélanome humain et des cellules infectées par VlH.
Ainsi, les CTL générés par les méthodes selon la présente invention peuvent être utilisés dans des techniques d'immunothérapie et ils peuvent être utilisés dans la recherche et le développement d ' immunothérapies telles que les protocoles d ' immunothérapie adoptive connus dans la technique.
EXEMPLE 2 : Induction in vitro de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques en utilisant des complexes peptide/molécule monocaténaire du CMH de classe I recombinante
MATERIELS ET METHODES
Peptides et réactifs sérologiques
Les peptides utilisés sont listés dans le tableau 4 et proviennent de Neosystem (Strasbourg France). Les AcM W6.32 (anti-HLA-ABC) et FMC 16 (anti-β2-m humain) : Valbiotech (Paris, France). Les AcM B2.62.2 (anti-β2-m humaine) et les AcM anti-HLA-A2.1 BB7.2, MA2.1, PA2.1 et 5H7 ont été décrits dans McMichael et al, 1980 Human Immnology 1:121-129; Parham et Brodsky, 1981 Human Immunology 3:277-299; Parham et Bodmer, 1978 Nature 276:397-399; Smith et al, 1994 Journal of Immunology 153:1054-1067.
Lignées cellulaires
La lignée cellulaire de basophiles de rat, RBL-2H3 a été décrite dans Engel et al, 1992 Science 256:1318-1321. La lignée cellulaire 174CEM.T2 (Celis et al, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:2105-2109), les cellules P815 (TIB 64, American Type Culture Collection, Rockville, MD) et les transfectants P815/HLA Cw3 (Maryanski et al, 1986, J. Immunol. 136: 4340-4347) ont été cultivés sur RMPI-1640 complémenté avec SFV 10%, L-glutamine 2 mM, pyruvate de sodium 10 mM, Hepes 10 mM, 2-mercapto-éthanol 5 x 10-5M et des antibiotiques (milieu SFV complet).
Construction des plasmides et transfections des cellules basophiles La séquence β2-m humaine ( Suggs et al, 1981 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6613-6617) a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces suivantes :
et
Figure imgf000114_0001
Après digestion par BamHI and HindIII, le fragment amplifié de 350 pb a été clone dans M13mpl8, pour donner M13/huβ2m. La séquence HLA-A2.1 est dérivée d'un ADNc longueur totale (Ennis et al, 1990, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87:2833-2837). Tout d'abord, un fragment de 410 pb produit par digestion avec Sali and Kpnl et codant pour les 113 premiers résidus de HLA-A2 a été purifié. Ensuite, un fragment de 500 pb codant pour les résidus 114 à 274 de HLA-A2.1 a été amplifié par PCR et fusionné à un motif (Gly)4Ser en utilisant les amorces suivantes : .
Figure imgf000115_0001
Ce produit PCR a été digéré par Kpnl et BamHI . Les deux fragments ont été fusionnés ensembles et clones dans M13mpl9 clivé par Sali et BamHI, pour donner M13-αlα2α3. Le Sali-BamHI fragment de 920 pb de M13-αlα2α3 codant pour les résidus 1 à 274 de HLA-A2 fusionné à un linker flexible long de 5 résidus a ensuite été inséré dans M13/huB2m clivé par BamHI et Sali, pour donner M13-SC-A2 (75).Dix résidus additionnels Ser(GLy)4Ser(Gly)4 ont été subséquemment insérés dans le linker en clonant les
Figure imgf000115_0002
3-SC-A2 ((Sette et al, 1994, J. Immunol. 153:5586-5592). Le phage résultant appelé M13-SC-A2 (Houbiers et al, 1993, Eur. J. Immunol. 23:2072-2077) a été séquence. Le fragment HindIII de 1300 pb contenant l'insert complet a ensuite été sous-cloné dans pRc/CMV (Invitrogen, Leek, Pays-Bas) au site HindIII, pour donner pCMV.SC-A2. L'orientation de transcription sous le contrôle du promoteur CMV a d'abord été vérifiée par carte de restriction et séquençage nucléotidique. Les cellules RBL-2H3 (107) ont été transfectées par 10 μg d'ADN du plasmide pCMV.SC-A2 linéarisé par Pvu I, en utilisant un système d'électroporation Cellject (Eurogentec, Sart Tilman, Belgique) réglé à impulsion simple, 250 V avec une résistance de shunt de 192 ohm et une capacité de 450 μF. Après 24 heures, les cellules ont été sélectionnées sur un milieu de culture SFV complet contenant 1 mg/ml de G418 (Gibco, Gaithersburg, MD). La sélection a été poursuivie par augmentation progressive de la dose d'antibiotique jusqu'à 4 mg/ml. Préparation de SC-A2 soluble
SC-A2 a été purifiée à partir du surnageant de cellules RBL-2H3 transfectées par pCMV.SC-A2 par chromatographie d'affinité en utilisant l'anticorps W6.32.
Résonance de surface de plasmons
Les analyses ont été conduites sur un BIAcore (Pharmacia Biosensor), à 20°C en utilisant un flux de 5 μl/min. L'anticorps anti-HLA-A2 BB7.2 a été immobilisé sur un support sensible CM5 préalablement activé par un 35 μl de mélange NHS/EDC, et les motifs n'ayant pas réagi ont été bloqués avec de l'éthanolamine 1M, pH8,5.
Test de liaison de peptides
La liaison des peptides à SC-A2 a été testé par compétition en utilisant le peptide radiomarqué Fl0V
(Ruppert et al, 1993 Cell 74:9229-937). Ce peptide a été marqué de manière à présenter une activité spécifique de
43 mCi/mmole en utilisant la ioduration catalysée par la chloramine T (Hunter et Greenwood, 1962, Nature 194:495- 496). SC-A2 (7 μg) a été incubé pendant 2 heures à température ambiante avec 4,5 μM de Fl0V marqué en présence d'un excès molaire d'un facteur de 60 du peptide compétiteur. Les peptides non liés ont été éliminés par ultrafiltration en utilisant Microcon 30 (Amicon Inc, Beverly, MA) et des lavages au PBS. La radioactivité dans la fraction retenue a été mesurée sur un spectromètre γ (Gammamatic, Kontron). Prolifération et sécrétion IL-2
Le clone CTL NA17-221, spécifique du peptide NA17-A présenté par HLA-A2.1, a été cultivé dans des plaques à 96 puits, dans 200 μl de milieu FCS complet, en présence de la concentration indiquée de complexes peptide/SC-A2 dimérisés par AcM FMC16. La prolifération a été mesurée après 48 heures par l'incorporation de thymidine 3H. La sécrétion IL-2 a été suivie à 24 heures en mesurant la capacité du surnageant de culture à alimenter la prolifération de la lignée cellulaire IL-2-dépendante CTLL-2.
Induction de CTL in vitro
Des souris mâles DBA/2 ont été obtenues auprès du Centre d'Elevage R. Janvier (Le Genest-Saint Isle, France) et ont été utilisées à l'âge de 8 à 12 semaines. Les cellules dendritiques (CD) ont été préparées selon les protocoles standards d'enrichissement par centrifugation de cellules spléniques sur une solution de BSA à 35% ( Sigma-Aldrich, l'Isle d'Abeau Chesnes, France) et par adhérence plastique de la fraction de cellules spléniques à faible densité (Coligan et al, 1993, Current Protocols in Immunology. John Willey and Sons, Inc, Boston). Des cellules T enrichies sur tissu de nylon (1,5 x 107) ont été cultivées soit avec 10 CDC puisées 4 à 6 heures au préalable par 100 μg de peptide CW3 ou NP, ou avec des complexes SC-Kd/peptide couplés sur des billes (5 x 106). Les cultures ont été réalisées dans 5 ml de milieu SFV complet complémenté avec 20 ng/ml de rIL6 de souris ( Immugenex Corp, Los Angeles, CA) et 0,5 ng/ml de rIL12 de souris (R & D Systems Europe Ltd., UK ) dans des flacons de 25cm2 maintenus à 37°C sous atmosphère humidifiée contenant 6% de CO2. Trois et cinq jours après le début de la culture, rIL2 humain (Immugenex) a été ajouté aux cultures de manière à donner une concentration finale de 10 U/ml. Les cultures ont été re-stimulées le jour 7 en utilisant des cellules spléniques (1 x 107) irradiées (3000 rad ) activées par 50 μg de peptide, sur 2 ml de milieu SFV complet contenant 1 ng/ml de rIL7 de souris (Immugenex) et 10 U/ml de rIL2 humain. De l'αIL2 humaine additionnelle (en final 20 U/ml) a été fournie le jour 10 et les cultures ont été testées quant à leurs activités cytolytiques au jour 12-14.
Les réponses CTL in vitro ont été obtenues sur des PBMC issues de volontaires normaux sains HLA-A2.1 en utilisant des complexes SC-A2/peptide couplés sur des billes. Brièvement, des PBMC (3 x 107) purifiées au Ficoll ont été cultivées avec des complexes SC-A2/peptide couplés sur des billes (107). Les cultures ont été maintenues sur du RPMI-1640 complet complémenté avec 10% de sérum humain AB inactivé par la chaleur (milieu AB complet) et avec 10 ng/ml de tIL-7 (Genzyme S.A., Paris, France), 2 ng/ml de rIL-12 (Genzyme), à 37°C dans un incubateur à 5% de CO2. Le milieu de culture avec cytokines a été réapprovisionné tous les 3 jours. Au jour 10, les cultures ont été re-stimulées par 107 blasts T autologues irradiés (3000 rad) activés par ConA puisés par des peptides ou par 140 mM de complexes peptide/SC-A2 monomérique. Les cultures ont été maintenues dans du milieu AB complet contenant 10 ng/ml de rIL7 humain et 10 U/ml de rIL2. Du milieu frais avec des cytokines a été ajouté tous les 3 jours. L'activité cytotoxique a été mesurée 8 jours après la restimulation.
Test de cytotoxicité Des cellules P815 (3-5 x 106) puisées par 50 μg de peptide Cw3 ou NP et des transfectants P815/HLA-Cw3 ont été radiomarquees par 51Cr pendant 90 min à 37°C dans du milieu RPMI-1640. Elles ont ensuite été lavées trois fois dans le même milieu, remises en suspension dans du milieu FCS complet et ensuite ajoutées (5000) à des cellules effectrices. La lignée cellulaire T2 (3 x 106 cellules) a été puisée durant toute la nuit par 200 μg de peptides dans 2 ml de milieu RPMI-1640 dépourvu de sérum à 26°C. Elles ont ensuite été radiomarquees par 51Cr comme indiqué pour les lignées cellulaires murines. L'activité cytolytique a été déterminée par un test standard de libération de 51Cr de 4 h en utilisant des plaques à 96 puits à fonds en U. Le pourcentage de cytotoxicité a été déterminé par la formule: 100 x (libération expérimentale - libération spontanée)/(libération maximale - libération spontanée). La libération maximale a été déterminée par lyse des cellules cibles à l'aide de 1% de triton X-100 (Sigma). Les valeurs de libération spontanée de 51Cr varient entre 10 et 20% du marquage total incorporé.
Analyse du répertoire Les analyses des TCR-β humain et de souris ont été réalisées telles que décrites dans (92) et (93). Brièvement, l'ARN total a été extrait et soumis à transcription inverse et PCR en utilisant des amorces spécifiques de TCR-BC et TCR-BV. Les produits PCR ont été marqués par une amorce fluorescente spécifique de TCR-BC et ont été séparés selon les tailles dans un séquenceur à ADN automatique 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les analyses ont ensuite été réalisées à l'aide du logiciel Immunoscope. Résultats
Caractérisation structurelle des molécules monocaténaires du CMH de classe I
Une construction SC-A2 a été réalisée, elle comprend la séquence signal et les trois premiers domaines de l'ADNc de la chaîne lourde de HLA-A2.1 fusionnés à la séquence codante de la β2-m humaine par l'intermédiaire d'un linker flexible de 15 acides aminés. Cette construction a été transfectée dans des cellules RBL-2H3. Les transfectants stables ont été sélectionnés et criblés par PCR en fonction de la présence de la construction génique intégrée. La production SC-A2 des clones positifs a été analysée. Un clone a produit environ 500 μg de SC-A2 par litre de surnageant de culture et a été sélectionné pour de plus amples analyses. La molécule SC-A2 sécrétée a été purifiée par chromatographie d'immunoaffinité en utilisant l'AcM W6/32 (anti-HLA-A.B.C) et a été caractérisée par résonnance de surface de plasmons en utilisant les AcM BB7.22 (anti- HLA-A2, -A69) et B2.62.2 (anti-b2-m humaine). Les résultats présentés en figure 17 démontrent qu'elle présente à la fois les déterminants sérologiques dérivés de la β2-m humaine et de HLA-A2. Des tests ELISA réalisés avec un panel d'AcM comprenant W6/32, BB7.2, 5H7 (anti- 3ème domaine de HLA-A2), PA2.1 (anti-HLA-A2), B2.62.2 et BBM.l (anti-B2-m humaine) ont permis de vérifier que la molécule SC-A2 recombinante est correctement repliée. Tous les AcM testés ont réagi seuls ou en sandwich (anti- HLA-A2 )/anti-β2-m humaine) avec la molécule recombinante ce qui suggère que celle-ci présente la conformation correcte.
Caractérisation fonctionnelle des molécules monocaténaires du CMH de classe I
Il a tout d'abord été vérifié que SC-A2 se lie spécifiquement aux peptides restreints par HLA-A2. Un peptide synthétique, Fl0V, dérivé du virus de l'hepatitis B et connu pour se lier à HLA-A2, a été utilisé comme étalon pour les expériences de compétition. Le peptide Fl0V radiomarqué a été mélangé à SC-A2 tel que décrit ci- dessus. Les peptides non liés ont été éliminés par ultrafiltration et la radioactivité associée à SC-A2 a été mesurée. Une liaison significative à SC-A2 a été observée : les résultats illustrant la liaison du peptide Fl0V radiomarqué a des molécules SC-A2 sont présentés en figure 22A (où sont portées les mesures en cpm x 10- de peptides liés radiomarqués en présence ou en l' absence de SC-A2). A partir de l'activité spécifique du peptide radiomarqué, on a calculé que plus de 50% des protéines SC-A2 sont actives pour la liaison aux peptides. Cette liaison est peptide-spécifique puisqu'elle est inhibée d'une manière dose-dépendante par des peptides restreints par HLA-A2 non marqués (Fl0V, HIV pol, M58-66, Mage-3, NA17A, Melan-A/MART-1) mais pas par des peptides restreints par H-2Kd (CW3, HA) ajoutés en excès en tant que compétiteurs. Ces résultats sont illustrés par la figure 20B où sont portées en abscisse la concentration de peptides compétiteurs en micromolaire et en ordonnées la liaison de peptides marqués (cpm x 10- 5). Les peptides restreints par HLA-A2.1 (Fl0V, I9V et A9L) donnent une inhibition presque complète de la liaison du peptide marqué, contrairement à ce qui est observé avec les peptides restreints par H-2Kb (R8L, OVA) et les peptides restreints par H-2Kd (CW3, Y8I). Ces résultats indiquent que la molécule SC-A2 recombinante se lie aux peptides synthétiques et présente la même spécificité que la molécule HLA-A2 associée à la surface de cellule native.
La capacité de SC-A2 recombinante à agir comme une molécule présentatrice d'antigène a ensuite été évaluée. La SC-A2 purifiée a été chargée avec le peptide de mélanome NA17-A, dimérisée en utilisant un anticorps anti-β2m et utilisée pour stimuler le clone CTL NA17-221. Les résultats sont illustrés par les figures 23A et 23B. En figure 23A, on donne la sécrétion d'IL-2 (cpm) en fonction de la concentration en SC-A2 ( μg/ml) ; la teneur en IL-2 a été mesurée à 24 heures par la prolifération de CTLL-2. En figure 23B, on donne la prolifération cellulaire (cpm) en fonction de la concentration en SC-A2 (μg/ml) ; la prolifération des cellules T a été déterminée à 48 heures par l'incorporation de thymidine 3H. Le clone CTL NA17-221 spécifique du peptide NA17-A présenté par HLA-A2.1 a été cultivé avec la concentration indiquée de peptide/SC-A2 dimérisé ; dans les deux figures, les cercles blancs représentent le peptide NA17-A et les carrés noirs le peptide MAGE-3. Dans les deux essais de prolifération (figure 23A) et de sécrétion d'IL2 (figure 23B), la réponse obtenue est peptide spécifique puisque SC-A2 chargée avec un peptide non approprié (MAGE-3) n'a présenté aucune activité. Le peptide NA17-A seul n'a eu aucun effet sur le clone CTL NA17-221. Les réponses spécifiques observées avec le clone NA17-221 démontrent que le complexe SC-A2/peptide interagit de manière productive avec le TCR qui lui correspond. Prises ensembles, ces données établissent que la molécule SC-A2 présente toutes les propriétés voulues et présentent les mêmes caractéristiques que sa contrepartie murine. La capacité de ces molécules à provoquer des réponses CTL spécifiques in vitro a ensuite été étudiée.
Couplage des complexes peptide-CMH recombinants à des billes On a cherché à déterminer si des CTL spécifiques pouvaient être induits in vitro par des molécules SC-CMH chargées avec un peptide antigénique. Pour maximiser la densité des complexes peptide/SC-CMH, on a préparé des billes auxquelles un grand nombre de complexes a été lié par l'intermédiaire d'un anticorps spécifique soit du domaine α-3 de SC-Kd soit du domaine β2-m de SC-A2.
Pour évaluer l'efficacité de couplage de SC-A2 sur les billes, l'expérience suivante a été réalisée. Le peptide Fl0V radiomarqué a été incubé avec SC-A2 purifié. Les peptides non liés ont été éliminés par ultrafiltration et le complexe peptide/CMH radioactif a été incubé avec des billes Dynabeads tosyl-activées couplées avec un anticorps anti-β2-m humaine. Après lavage approfondi, la radioactivité associée aux billes a été mesurée et utilisée pour évaluer la quantité de SC-A2 couplée aux billes. En l'absence de SC-A2, 100 fois moins de radioactivité associée aux billes a été trouvée. Environ 10 molécules SC-A2 étaient ainsi couplées sur chaque bille. Ce nombre correspond à une densité de 1,7 x 1015 molécules par m2, ce qui représente au moins 10 fois plus que la densité totale de molécules CMH à la surface d'APC naturelles. De plus, en considérant qu'une APC naturelle présente de l'ordre de 104 peptides différents et que la représentation maximale d'un peptide donné à la surface est de 10%, il peut être conclu que la densité d'un complexe peptide/CMH spécifique à la surface des billes est au moins deux fois supérieure à celle d'APC naturelles.
Induction in vitro de CTL spécifiques par des complexes de peptide-CMH couplés à des billes La capacité des billes à stimuler des CTL in vitro a été évaluée chez des systèmes humain et de souris. SC-Kd a été chargé avec le peptide CW3 (170-179) restreint par Kd dérivé de HLA-CW3 ou le peptide NP( 147-155) dérivé de la nucléoprotéine du virus influenza (130). De tels complexes peptide/SC-Kd ont alors été couplés à des billes tel qu'indiqué ci-avant et ajoutés à des splénocytes de souris DBA/2 non-adhérents au tissu de nylon. Pour permettre une comparaison avec un témoin positif, des stimulations ont aussi été réalisées avec des cellules dendritiques puisées par des peptides (109, Nair et al, 1993, J. virol. 67:4062-4069; 108). Sept jours plus tard, toutes les cultures ont été re-stimulées avec des cellules spléniques puisées par des peptides CW3 ou NP irradiées. Cinq à six jours plus tard, l'activité cytotoxique a été mesurée sur des transfectants P815/HLA- CW3 et P815 ou sur des cellules cibles P815 puisées par des peptides CW3 et NP. Les résultats sont représentés en figures 24A et B (en abscisse, ratio effecteurs : cible ; en ordonnée pourcentage de lyse spécifique). Des CTL ont été induits par des cellules dendritiques puisées par des peptides (figure 24A) ou par des complexes peptide/SC-Kd couplés à des billes (figure 24B). Les peptides utilisés pour l'induction sont CW3 pour les graphes de gauche et NP pour les graphes de droite. L'activité cytotoxique a été mesurée sur P815 (carré blanc), P815-CW3 (carré noir), P815 puisée avec NP (cercle noir) ou avec CW3 (cercle blanc). Ces résultats montrent qu'une activité lytique peptide-spécifique significative a été détectée, que le stimulus d'immunisation utilisé ait été des cellules denditriques ou des billes chargées de peptide/SC-Kd. Les courbes de cytotoxicité suggèrent que les deux procédures présentent des efficacités d'induction et d'expansion de CTL peptide/spécifique comparables.
Une étude similaire a été menée chez l'homme en utilisant des PBL de donneurs HLA-A2 naïfs. De tels PBL ont été cultivés pendant 10 jours avec des billes couplées avec des complexes SC-A2/peptide M58-66 de la protéine matrice d' influenza A (131, 132). Les cultures ont été re- stimulées une fois avec soit des ConA-blasts puisés par des peptides M58-66 ou des complexes SC-A2/peptide M58-66 pendant huit jours et leur activité cytotoxique a ensuite été mesurée sur des cellules cibles T2 chargées de peptide. Les résultats sont illustrés par les figures 25A et B (en abscisse, ratio effecteur : cible; en ordonnée, pourcentage de lyse spécifique). Les cultures CTL induites avec les complexes SC-A2/M58-66 couplés aux billes ont été re-stimulées avec des blasts ConA activés, puisés par des peptides (figure 25A) ou avec 140 mM M58- 66/SC-A2 monomérique (figure 25B). L'activité cytotoxique a été mesurée sur des cellules T2 (carré blanc) ou sur des cellules T2 puisées par M58-66 (carré noir) ou sur des cellules T2 puisées par MAGE-3 (triangle noir). Comme illustré par les figures 25A et B, une lyse spécifique significative est observée. La même observation a pu être réalisée en utilisant un second peptide restreint par HLA-A2 dérivé de l'antigène Melan A/Mart 1. Ces résultats montrent que les complexes peptide/CMH couplés sur des billes sont à peu près aussi efficaces pour induire des CTL primaires in vitro que des APC professionnels telles que les cellules dendritiques.
Les CTL induits in vitro présentent des réarrangements du TCR similaires à ceux des CTL amorcés in vivo Les résultats exposés ci-dessus montrent que les complexes peptide/CMH couplés sur des billes peuvent générer des CTL in vitro en l'absence de molécules de co- stimulation ajoutées. Pour déterminer la pertinence de tels CTL par rapport à ceux obtenus par suite d'une immunisation in vivo, on s'est basé sur l'observation que, dans certaines circonstances, les réponses de cellules T à des antigènes donnés présentent des réarrangements publics, c'est-à-dire des réarrangements qui émergent de manière récurrente après immunisation d'individus distincts. Les réarrangements publics TCR-BV dans la réponse contre le peptide CW3 restreint par Kd sont particulièrement bien connus de l'homme du métier (Casanova et al, 1992, J Exp Med 176:439-447; MacDonald et al, 1993, J Exp Med 177:1487-1492; Maryanski et al, 1996, Immunity 4: 47-55; Walker et al, 1995, J Immunol 155:3443-3452). On a donc comparé les réponses CTL in vitro et in vivo à ces deux peptides en utilisant la technologie Immunoscope (déjà évoquée (4, 92). Le répertoire TCR de populations de CTL isolées à partir de souris DBA/2 immunisées par des transfectants P815- HLA-CW3 reflète le développement sélectif de lymphocytes portant BV10. De plus, après analyse de 23 clones CW3- spécifiques, tous BV10+, seulement cinq segments BJ ont été trouvés, le BJ1S2 étant dominant, et tous présentent des boucles CDR3 de 6 acides aminés (11). Les profils obtenus pour les TCR-BV10 de populations de cellules spléniques DBA/2 stimulées in vitro par CW3 sont représentés sur la Figure 26 qui représente les réarrangements de la chaîne TCR-β de CTL induits in vitro. Les CTL ont été induits par le peptide indiqué. La taille en acides aminés du CDR3 indiquée est telle que définie par Chothia et al. 1988, EMBO J. 7: 3745-3755. Un pic majeur à 6 acides aminés est la marque de CTL CW3- spécifiques. L'ARN extrait de splénocytes naïfs ou de CTL NP-spécifiques est présenté pour comparaison. Comme il peut être observé, le peptide CW3 présenté par des cellules dendritiques ou des billes SC-Kd conduit à la génération de populations de cellules T qui présentent, pour le TCR-BV10, un pic majeur correspondant à un CDR3 long de 6 acides aminés. Des analyses additionnelles ont mis en évidence une association prédominante d'un tel CDR3 avec un segment BJ1S2. Ce répertoire TCR-BV10 présente donc les mêmes caractéristiques que celui de CTL CW3-réactifs générés par amorçage in vivo. A titre de comparaison, la Figure 26 présente le profil TCR-BV10 obtenu pour des cellules T générées, dans une expérience conduite en parallèle, contre le peptide NP.
II a été reporté que chez la plupart des sujets HLA- A2.1, une réponse CTL M58-66-spécifique est détectable après une infection par influenza A. De manière intéressante, les lignées CTL M58-66-spécifiques dérivées de 21 individus HLA-A2 non apparentés présentent TCR-BV17 comme segment BV dominant utilisé. Le développement de cellules CD8+BV17+ est corrélé avec la lyse M58-66- spécifique (89, 90). De plus, l'analyse des séquences de 38 transcrits BV17 M58-66-spécifiques issus de 13 sujets a mis en évidence une grande conservation dans la région CDR3 de 8 acides aminés. Les profils TCR-BV17 obtenus pour des PBL témoins non stimulés et pour des PBL stimulés par des billes couvertes par des complexes SC- A2/M58-66 sont illustrés sur les Figures 27A et B (profils d'intensités de fluorescence). Les CTL générés par SC-A2/M58-66 couplé sur des billes ont été restimulés par des blastes ConA puisés par des peptides (Figure 27A) ou par des complexes M58-66/SC-A2 monomérique (Figure 27B) comme en Figure 25. L 'ARN total a été analysé en utilisant des amorces BV17-spécifiques (graphes du bas) ou BV2-spécifiques (graphes du haut). Le pic majeur observé avec les amorces BV17 correspondant à un CDR3 long de 8 acides aminés est la marque de CTL M58- 66-spécifiques. Les répertoires BV2 et ceux de PBL non stimulés sont montrés à titre de comparaison. Les profils TCR-BV17 de PBL stimulés montrent donc un pic majeur correspondant à un CDR3 d'une longueur de 8 acides aminés, ce qui suggère un développement spécifique de la population de cellules T qui a été impliquée dans la lyse M58-66-spécifique. Par contraste, les PBL témoins donnent un profil TCR BV17 de type Gaussien, ce qui indique un répertoire polyclonal. A titre de comparaison, les profils TCR BV2 présentent une forme Gaussienne pour les PBL témoins et les PBL stimulés.
Ces résultats indiquent que les protocoles in vitro d'induction utilisant des billes permettent de développer des populations de cellules T présentant des caractéristiques de structure similaires à celles générées par une immunisation in vivo.
La construction de SC-A2 a permis de disposer d'une molécule recombinante monocaténaire, soluble. Cette molécule purifiée a montré qu'elle était correctement repliée et se liait spécifiquement aux peptides antigéniques restreints par HLA-A2, ce qui suggère qu'elle sélectionne le même répertoire peptidique que la molécule HLA-A2 associée à la surface cellulaire native. De plus, les travaux réalisés ont montré que les complexes SC-A2/peptide stimulent les CTL peptide- spécifiques pour les faire proliférer et sécréter IL-2, ce qui indique bien que SC-A2 interagit avec le récepteur cellulaire T approprié.
La capacité des complexes SC-Kd et SC-A2/peptide à activer les précurseurs de CTL peptide-spécifiques in vitro a également été étudiée.
Les résultats obtenus ont montré qu'il est possible d'induire une expansion de CTL spécifiques vis-à-vis de peptide de HLA-Cw3 et du virus NP de l' influenza dans des cultures de cellules naïves de rate de souris stimulées par des complexes SC-Kd/peptide couplés sur des billes. Leur efficacité , comme déjà souligné, s'est révélée comparable à celle d'APC connues, comme les cellules dendritiques.
En ce qui concerne le peptide HLA-Cw3, on a constaté que les CTL générés par l'un quelconque des modes de présentation d'antigène étaient capables de lyser les transfectants P815/HLA-Cw3, ce qui indique une reconnaissance par ces CTL d'épitopes formés par voie endogène. Cette observation revêt une grande importance puisqu'il a été rapporté, dans certains cas, que les CTL générés in vitro n'étaient pas capables de tuer des cibles exprimant un antigène formé naturellement et que la reconnaissance d'un antigène exprimé par voie endogène est considérée comme un élément indicateur pertinent in vivo.
L'analyse du répertoire TCR-β de populations cellulaires T stimulées in vitro par CD activé par Cw3 ou SC- Kd/peptide Cw3 apporte la preuve d'une expansion significative et spécifique de lymphocytes BV10+ avec un CDR3 de 6 acides aminés associés avec un segment prédominant BJ1S2.
On a pu constater que les CTL générés à partir d'une immunisation in vivo avec HLA-Cw3 présentent les mêmes caractéristiques.
De la même manière, une réponse CTL spécifique du peptide M58-66 de l'influenza A et de Melan A/Mart 1 a été provoquée dans PBL à partir de donneurs sains HLA-A2.1, en utilisant des billes couplées à SC-A2/peptide, comme agent de stimulation de l'immunisation.
Ces CTL induits sont capables de tuer efficacement des cellules T2 activées par le peptide.
Dans le cas de CTL influenza-spécifiques ( pour lesquelles une réponse a déjà été décrite), l'analyse de leur répertoire TCR-βV indique l'expansion spécifique de populations cellulaires utilisant de manière prédominante TCR-BV17 avec une région CDR3 de 8 acides aminés, comme décrit pour les CTL, présentent une spécificité vis-à-vis du peptide M58-66 généré après une infection par le virus de l'influenza in vivo.
La nécessité de 2 signaux pour les cellules T non sensibilisées correspond à une notion largement admise. Le signal-1 provient de la ligation du TCR et de ses co- récepteurs avec les complexes CMH/peptide. Le signal-2, qui n'est pas antigène-spécifique, est généré par l'interaction de molécules co-stimulatrices exprimées sur les APC et leurs molécules apparentées sur les cellules T. L'importance du signal de transduction via la liaison de CD28 de cellules T aux molécules B7.1 ou B7.2 sur les APC afin d'obtenir une stimulation optimale des cellules T non sensibilisées a été souligné dans de plusieurs rapports. Or , il apparaît que les complexes CMH/peptide couplés aux billes, utilisés selon l'invention, ne fournissent pas la co-stimulation normalement procurée par l'interaction CD28-B7. La forte densité de complexes CMH/peptide sur les billes peut ainsi permettre de se libérer de la nécessité d'avoir des molécules co- stimulatrices.
La contribution possible de macrophages ou d'autres cellules possédant des propriétés de phagocytose vis-à- vis de la sensibilisation de CTL via la prise de complexes CMH/peptide/billes et de re-présentation de peptide.
La disponibilité des molécules recombinantes SC-CMH de classe I revêt unggrand intérêtpeuvent être utilisées non seulement dans un essai de liaison CMH/peptide rapide, sensible et fiable pour identifier des épitopes de cellules T se liant au CMH avec une affinité élevée, mais également dans une induction de CTL primaires pour définir, parmi les agents de liaison au CMH, ceux des peptides qui sont immunogènes.
Les résultats exposés ci-dessus établissent que des molécules de classe I biologiquement actives, recombinantes, murines et humaines, peuvent être utilisées pour induire in vitro des CTL primaires peptide-spécifiques et que les CTL générés sont qualitativement similaires à ceux obtenus in vivo .
On mesurera l'intérêt d'un tel système qui permet de procéder à des analyses détaillées de répertoires de CTL humains et murins et d'élucider les mécanismes de sensibilisation des CTL.
Ce système est également utilisable pour la production in vitro de cellules effectrices de CTL spécifiques en clinique. Exemple 3 :
Etude de la médiation de l'adhésion par des complexes CMH/peptide permettant l'enrichissement en lymphocytes T spécifiques d'un antigène.
Matériel et méthodes
- Souris et lignées cellulaires
On utilise des souris DBA/2 et la souris clone 4 (135).
Les hybridomes T 9.4 et B9.1 ont été décrits dans (20) et (136).
La purification de CD8+ a été effectuée selon le protocole MiniMacs (Myltenyi Biotec, Auburn, CA);
- Réactifs et anticorps
Herbimycine A et bioindolylmaléimide IGF
109203X : Calbiochem (Meudon, France)
- anticorps anti-Kd SF1.1.1, anti-CD8, anti-Vβ8 et anti-Vβl0 :Pharmingen (San Diego CA).
- peptides (Cw3 = RYLKNGKETL, HA=IYSTVASSL et T9V = TYQRTRALV) : décrits dans (130), (137), (138)
(Neosystem, Strasbourg, France).
- Préparation de la dimérisation de Kd (SC-Kd) monocaténaire et revêtement. On purifie SC-Kd recombinant monocaténaire à partir d'un surnageant de culture de celllules transfectées d'ovaires de hamster chinois (CHO) comme décrit dans (21).
On charge SC-Kd avec les peptides indiqués, selon un rapport molaire de 1/1, et on dimérise en utilisant l'anticorps SF1.1.1 en effectuant une incubation d'une heure à 4°C ( SC-Kd/SFl .1.1 : rapport molaire 3/1).
Dans la plupart des cas, les complexes dimérisés sont appliqués sur une plaque 48W (Costar, Brumath, France) à raison de 10 μg/ml, pendant environ 14 h à 4°C. Les sites non liés sont alors saturés avec RPMI 10 % SVF.
- Quantification des cellules adhérentes.
Les cellules sont ajoutées dans les plaques avec les revêtements, centrifugées à 600 tpm et incubées à 37* C pour différentes périodes de temps. Les cellules non adhérentes sont éliminées par 3 lavages avec PBS. Les cellules adhérentes restantes sont incubées avec 150 μl de p-nitrophényl-N-acétyl-β-D glucosaminide (Sigma, Paris, France) à 37°C pendant 2 à 5 heures.
On ajoute ensuite 225 μl de tampon glycine 50 mM, pH 10,4, contenant 5mM de EDTA. On mesure la densité optique DO à 405 nm sur 100 μl de mélange réactionnel avec un lecteur ELISA (Sanofi, Diagnostic Pasteur, France). On estime la fraction de cellules adhérentes à partir d'une courbe standard avec un nombre connu de cellules. En variante, on procède à la quantification en utilisant des cellules marquées S- methionine (Amersham, UK). Les cellules adhérentes sont lysées dans du Triton® 1 % et on mesure la radioactivité en utilisant la formule : pourcentage de cellules adhérentes = cpm de cellules adhérentes/cpm de cellules totales.
Dans quelques expériences, la quantification est effectuée par cytometrie de flux en utilisant des anticorps VB-spécifique.
Résultats
Induction d ' une adhésion spécifique de cellules T par les complexes CMH/peptide dimérisés.
L'hybridome T 9.4, qui reconnaît un peptide dérivé de HLA-Cw3 présenté par Kd, est marqué par incorporation de S methionine et incubé 90 min sur des plaques en plastique revêtues de complexes SC-Kd-peptide ou de complexes dimérisés SC-Kd-peptides (appelés ci- après dKd-peptide), à raison de 10 μg/ml du peptide indiqué. Après une étape de lavage, on détermine la récupération de cellules en mesurant la radioactivité des cellules adhérentes.
Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 28 (abscisse:dimérisation de complexes Kd-peptide, ordonnées : % de cellules adhérentes). On constate que 5 % des cellules 9.4 adhèrent sur la surface revêtue de Kd-Cw3. Cette adhésion est faible mais spécifique vis-à- vis du peptide. Lorsque la molécule Kd est dimérisée, on observe jusqu'à 25 % de cellules T ayant adhéré à la surface.
Pour étudier le caractère dose-dépendant de l'adhésion spécifique vis-à-vis du peptide de la souche d'hybridomes 9.4, on procède comme suit :
- on ajoute les cellules 9.4 (5 x 105 ) en triplica dans des puits de microtitration p48 revêtus de différentes quantités de dKd-Cw3 (voir figure 29, courbe avec carrés) ou pKd-T9V (voir figure 29, courbe avec cercles). Après 30 min d'incubation à 37° C, on évalue les cellules non adhérentes par la technique à l'hexosaminidase telle que décrite dans la partie matériels et méthodes.
On constate que l'adhésion est spécifique pour un peptide donné et augmente avec la quantité de complexes CMH/peptide dimérisés (figure 29). Pour savoir si un signal de transduction est nécessaire pour l'adhésion cellulaire, les cellules T ont été prétraitées pendant environ 14 heures avec l'inhibiteur de tyrosine kinase src-spécifique, à savoir de l'herbimycine A et/ou avec l'inhibiteur de protéine kinase C GF109203X (25 μm) ou du DMSO pendant 15 min à 37°C avant l'essai d'adhésion cellulaire. Le pourcentage de cellules adhérentes est évalué par la technique à l'hexosaminidase. Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 30. On constate dans les deux cas une inhibition significative de l'adhésion spécifique des cellules T. On n'observe aucun effet supplémentaire lorsqu'on utilise les deux inhibiteurs en même temps. Ces observations suggèrent que l'adhésion induite requiert une voie signal impliquant des tyrosines kinases et PKC.
Il apparaît donc que l'adhésion des cellules de l'hybridome 9.4 T est spécifique d'un peptide et dépend de la température et de la dose, augmente lorsque les complexes CMH/peptides sont dimérisés et se trouve partiellement inhibée par les deux inhibiteurs de protéine kinase.
Les complexes CMH/peptides dimérisés, appliqués en revêtement permettent l'enrichissement spécifique en cellules T.
Les résultats donnés ci-après concernent l'étude de l'utilisation de l'adhésion par l'intermédiaire de CMH-peptide pour purifier des cellules T selon leur spécificité.
On prépare un mélange de deux hybridomes de cellules T et on les soumet à incubation comme décrit dans les paragraphes précédents. On évalue l'enrichissement en cellules T spécifiques et le rendement des expériences (à savoir, le nombre absolu de cellules T spécifiques récupérées comparé au nombre de cellules spécifiques du mélange initial).
Etant donné la possibilité, tout au moins théorique, de multiplier les cellules récupérées par voie polyclonale, l'enrichissement a été privilégié par rapport au rendement et des conditions de lavage stringentes ont été utilisées.
On mélange l'hybridome 9.4 (Vβ10+) spécifique vis-à-vis du complexe Kd-Cw3 selon un rapport de 45 : 55 avec l'hybridome T B9.1 (Vβ8+) spécifique vis-à-vis du peptide 102-120 de HEL présenté par I-Ed. Ce mélange (104 cellules) est soumis à incubation sur des surfaces revêtues de dKd-Cw3 ou dKd-HA, on récupère les cellules adhérentes et on les analyse par cytometrie de flux en utilisant des anticorps Vβ-spécifique.
Les résultats obtenus sont donnés sur la figure 31. On constate que plus de 88 % des cellules récupérées à partir de la surface dKd-Cw3 expriment Vβl0 et sont donc des cellules d' hybridome 9.4 Cw3-spécifiques. Moins de 15 cellules sont récupérées sur la surface Kd-HA. Ce procédé a été répété en utilisant un mélange 6:1 constitué par des splénocytes CD8+ purifiés à partir de souris naïves DBA/2 et de splénocytes CD8+ purifiés à partir d'une souris transgénique clone 4 pour un TcR (Vβ8+) spécifique pour le complexe Kd-HA. Dans la population de départ, 32 % des cellules expriment Vβ8 et 14 % sont HA-spécifiques (ceci étant dû à la contribution des cellules VB8 provenant de la rate de DBA/2)
Après 14 heures environ d'incubation de ce mélange (10 cellules) sur une surface revêtue de dKd-Cw3 ou dKd-HA, les cellules adhérentes sont analysées par cytometrie de flux. Le pourcentage de cellules T HA- spécifiques (contribution de la souris clone 4) estimé par le rapport du mélange est indiqué entre parenthèses sur la figure 32 qui donne les résultats. Plus de 80 % des cellules récupérées sont VB8 + alors qu'on n'observe aucun enrichissement dans la population récupérée à partir de la surface dKd-Cw3. L'enrichissement obtenu est donc supérieur à 470 %
Ainsi, en utilisant l'adhésion avec médiation de CMH/peptide, il est possible d'enrichir des cellules T spécifiques à partir de populations complexes constituées de cellules d'hybridomes T ou de splénocytes CD8+.
Discussion Les anticorps dirigés vers les marqueurs de surface se sont révélés utiles pour caractériser et quantifier les cellules lymphoïdes.
En utilisant les anticorps immobilisés, un grand nombre de cellules ont été purifiées. Selon l'invention, on a isolé des cellules T selon leur spécificité et à cet effet des complexes recombinants SC- CMH/peptide ont été dimérisés et appliqués sous forme de revêtement sur des supports en plastique.
Plusieurs difficultés sont inhérentes à cette stratégie. Tout d'abord les TcR présentent habituellement de faibles affinités intrinsèques pour leurs ligands. De plus, les CMH purifiés à partir de cultures de tissus ou d'organes sont chargés avec un large jeu de self- peptides.
L'utilisation de SC-CMH recombinant, qui peut être produit en grande quantité, et chargé de manière homogène avec un peptide synthétique, permet de résoudre ces difficultés. En outre, conformément à l'invention, les complexes dimérisés SC-CMH/peptide ont été appliqués comme revêtement suivant de fortes densités.
Pour déterminer si une cellule T pouvait engager son TcR sur une telle surface, la souche d'hybridome T 9.4 a tout d'abord été utilisée. Il est apparu que l'adhésion de 9.4 était peptide-spécifique et que la dimérisation du complexe CMH/peptide améliorait l'adhésion cellulaire.
De manière avantageuse, la dimérisation apparaît favoriser une orientation correcte du complexe CMH/peptide et/ou augmenter son avidité pour le TcR. En outre, on sait que la dimérisation est nécessaire pour l'activation de cellules T, ce qui peut être critique pour l'adhésion des cellules T. Cette interprétation est renforcée par deux observations : 1) on n'observe aucune adhésion à 4°C dans les conditions d'expérimentation, 2) l'adhésion est réduite en présence d'inhibiteurs de protéine kinase. De plus, cette interprétation concorde avec des études antérieures montrant que le déclenchement du TcR induit l'activation de plusieurs molécules d'adhésion telles que la β2 intégrine, LFA-1, CD2, CD8 et les β1 intégrine VLAs.
L'engagement du TcR par le complexe antigénique appliqué comme revêtement à faible densité conformément à l'invention a été décrit comme étant CD8-dépendant (139). Cependant la souche d'hybridomes 9.4 utilisée n'exprime pas CD8. En outre, l'anticorps utilisé avec les complexes dimérisés CMH/peptide masque le site d'interaction avec CD8 de Kd.
Le chargement en peptide, de manière homogène, selon une forte densité de SC-Kd dimérisé peut permettre d'éviter l'exigence d'une interaction CD8/CMH.
En conclusion, l'utilisation de molécules CMH recombinantes dans des conditions qui induisent l'activation de cellules T permet de compenser la faible affinité de TcR pour son ligand. L'utilisation selon l'invention de ce système d'adhésion permet d'enrichir des cellules T spécifiques vis-à-vis d'un antigène à partir d'une population cellulaire T complexe.
L'enrichissement spécifique est obtenu aussi bien pour les cellules d'hybridomes T que pour les splénocytes CD8+.
Cette technique permet un enrichissement rapide parmi des millions de cellules et offre donc de nombreuses applications.
Couplé avec l'analyse du répertoire de cellules T, cette technique permet d'identifier les réarrangements de TcR associé à la reconnaissance d'un complexe antigénique donné. On mesurera l'importance d'une telle information pour contrôler les réponses des cellules T durant une maladie ou pour évaluer des protocoles thérapeutiques.
La purification des lymphocytes spécifiques vis-à-vis d'un antigène avant et/ou après une amplification in vitro permet également selon un aspect de grand intérêt de mieux contrôler des immuno-thérapies chez l'homme. EXEMPLE 4 : ACTIVATION COMPLÈTE DE CELLULES T CD8+ NAÏVES EN L'ABSENCE DE CO-STIMULATION
MATERIEL ET METHODES Souris
Des souris transgéniques pour le TCR clone 4 ont été nourries et entretenues à l'Institut Pasteur. Pour les expériences témoin qui ont utilisé des souris transgéniques pour le TCR clone 4 dans un contexte H-2b (souris transgéniques clone 4 TCR/B6), les souris transgéniques ont été re-croisées pendant 7 générations avec des souris C57BL/6 et la présence du trangène ainsi que de H-2b a été confirmée par analyse FACS.
Peptides
Les peptides HA (IYSTVASLL) et CW3 (RYLKNGKETL) ont été décrits précédemment (140, 141) et ont été obtenus auprès de Neosystem SA (Strasbourg, France). Lignée cellulaire et anticorps monoclonaux.
La lignée cellulaire P815 (H-2d ; TIB64, American Type Culture Collection, Rockville, MD) a été maintenue sur un milieu RPMI 1640 complémenté avec 10% de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur. L'anticorps monoclonal SF-1.1.1. (HB158) a été obtenu auprès de American Type Culture Collection, Rockville, MD. Les anticorps utilisés pour les analyses FACS ont été achetés auprès de PharMingen, San Diego, CA (anti-CD69, anti-B220 et anti- CD62L), CALTAG Labs, San Francisco, CA (anti-CD4 L3/T4, anti-CD8 Ly-2, anti-CD25 récepteur de IL-2, anti-CD44 et anti-Vβ8.1/8.2) ou auprès de Serotec, Oxford, Grande- Bretagne (anti-macrophage F4/80). La protéine de fusion CTLA4-Ig a été fournie par Dr. P. Linsley (Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle, WA).
Revêtement de SC-Kd Kd simple chaîne (SC-Kd) a été préparé et chargé avec soit HA, soit CW3 comme décrit précédemment (21). Des plaques à 96 puits à fond plat (TPP, Trasadingen, Suisse) ont été couvertes pendant 2 h à 37°C avec différentes concentrations d'anticorps SFl-1.1.1, lavées deux fois, saturées dans du SFV à 50% et lavées deux fois. SC-Kd/HA ou SC-Kd/CW3 (en une quantité égale à deux fois la quantité stoechiométrique de SFl-1.1.1) a été ajouté pendant deux heures à 37°C et les plaques ont été finalement lavées deux fois avant utilisation.
Purification de splénocytes CD8+
La sélection positive de cellules T CD8+ à partir des splénocytes totaux de souris transgéniques a été réalisée par coloration magnétique indirecte. Brièvement, 108 splénocytes ont été débarassés des globules rouges, puis traitées avec un anticorps anti6CD8 purifié (PharMingen, San Diego, CA) pendant 45 minutes à 4°C. Après lavage, des microbilles magnétiques couplées chèvre anti-rat (Myltenyi Biotec, Auburn, CA) ont été ajoutées pendant 15 minutes à 4°C. Les splénocytes ont été à nouveau lavés et finalement séparés par chromatographie sur une colonne attachée à un magnétique. La population purifiée contient en général plus de 98,5% de splénocytes CD8+, comme le révèle l'analyse FACS .
Test de prolifération des cellules T. Les cellules T purifiées issues de rates de souris transgéniques clone 4 (10 cellules par puits, sauf mention contraire) ont été ajoutées aux puits revêtus par SC-Kd/HA ou SC-Kd/CW3. De la thymidine 3H a été ajoutée après 24 heures de culture et l' incorporation radioactive a été mesurée après 16 autres heures. Dans certaines expériences, de l'IL-2 (IL-2 recombinante humaine, Immugenex Corp., Los Angeles, CA) a été ajoutée au début de la stimulation. Induction de CTL
Des splénocytes CD8+ purifiés issus de rates de souris transgéniques clone 4 (3.10 cellules) ont été ajoutées aux plaques à 96 puits couvertes par 2 μg/ml de SC-Kd/HA et ont été incubés à 37'C pendant trois jours en l'absence d'IL-2 exogène, et en présence du peptide compétiteur CW3 à 50 μg/ml. Les cellules ont alors été rassemblées et les cellules viables ont été comptées par exclusion au bleu trypan. L'activité cytotoxique des cellules a été testée sur des cellules cible P815 marquées au Cr puisées avec soit HA, soit CW3 tel que décrit précédemment (142). Détermination de cytokines
Des splénocytes purifiés CD8+ (10 puits) ont été ajoutés à des plaques à 96 puits revêtus de 2 μg/ml de SC-Kd/HA en présence de peptide compétiteur CW3 (50 μg/ml), ou de 20 μg/ml de SC-Kd/CW3 Dans les 2 cas, on n'ajoute pas de IL-2 exogène
Les surnageants de culture sont collectés à différents moments après stimulation La production de TNF a été mesurée par bioessai en utilisant la lignée WEHI- 279 comme indicateur. On a mesuré la production de IFN-γ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10 et GM-CSF dans les surnageants de culture par test ELISA analysé par cytometrie
105 splénocytes CD8+ purifiés/puits ont été colorés avec différents anticorps conjugués, pendant 30 min sur de la glace en tampon FACS (2% SVF, 0,01 % azoture de Na dans PBS). Les cellules mortes ont été colorées avec de l' iodure de propidium (Sigma Chemical Co - St Louis, MO). Les données sur les cellules viables ont été obtenues et analysées sur FACScan en utilisant le logiciel Cellgnest (Becton Dickinson, San José, CA)
RESULTATS
Une réponse proliférative est élicitée par des complexes recouverts SC-Kd/HA seuls.
Des molécules SC-Kd ont été chargées avec le peptide HA et utilisées pour couvrir des plaques plastiques par l'intermédiaire de l'anticorps Kd-spécifique SFl-1.1.1. Cet anticorps, qui reconnaît un épitope dans le domaine α3, a été précédemment utilisé pour générer des diméres avec une topologie compatible avec l'activation de cellules T. Les cellules T CD8+ ont été purifiées à partir des splénocytes totaux de souris transgéniques clone 4 en utilisant un anticorps CD8-spécifique et des billes magnétiques comme décrit ci-dessus. Cette procédure donne de manière reproductible une pureté de cellules supérieure à 98,5% en cellules T CD8+ .
En réponse aux complexes recouverts SC-Kd/HA, les splénocytes CD8+ clone 4 purifiés prolifèrent d'une manière dose-dépendante. Les résultats sont illustrés par la figure 33 (en abscisse, SC-Kd/HA recouverts en microgrammes/ml ; en ordonnée, prolifération des cellules T en cpm X 10-3). La figure 33 montre que les complexes recouverts SC-Kd/HA induisent la prolifération de cellules CD8+ purifiées. Des splénocytes CD8+ purifiés (105 / puits) ont été incubés sur des plaques couvertes par les concentrations indiquées de complexes SC-Kd/HA en présence (carré blanc) ou en absence (carré noir) de 10
U / ml de IL-2 recombinante humaine. Après 24 heures à
37°C, les cellules ont été activées avec de la thymidine 3 H pendant 16 heures. Sont également représentées les proliférations induites par une lectine (en utilisant Con A à 5 μg/ml, cercle noir) ainsi qu'une ionophore PMA/calcium (10 ng/ml et 250 ng/ml, cercle blanc), ou en réponse à 20 μg/ml de SC-Kd/CW3 ( triangle blanc) en l'absence de IL-2. Les données représentent la moyenne de trois répétitions, et sont représentatives de plus de 8 expériences. De manière intéressante, l'addition d'IL-2 exogène n'a pas été nécessaire et n'a eu aucun effet sur la prolifération mesurée. Les splénocytes CD8+ purifiés ont également proliféré à un niveau comparable à celui observé avec les complexes SC-Kd/HA, en réponse à la Con A ou à un mélange ionophore PMA/calcium. La concentration de SC-Kd/HA requise pour que la réponse des cellules T soit à 50% de son maximum a été de 0,5 à 0,6 μg/ml, que l'IL-2 exogène soit présente ou absente. Cette prolifération est peptide-spécifique puisque SC-Kd chargé avec un peptide inapproprié CW3 n'a réussi à provoquer aucune prolifération de cellules T. Les résultats sont présentés en figure 34A. La figure 34 montre que les réponses prolifératives de cellules CD8+ dépendent d'un stimulus SC-Kd/HA et ne nécessitent pas une interaction CD28/B7. Les splénocytes CD8+ purifiés (105/ puits de l'haplotype H-2d ou 2,5 X 105 / puits de l'haplotype H-2d) ont été incubés sur des plaques couvertes avec les composés indiqués pendant 24 heures à 37°C en l'absence d'IL-2 humaine recombinante. Les cellules ont été puisées avec de la thymidine 3H pendant les 16 heures suivantes. Les données représentent la moyenne de trois répétitions et sont exprimées en pourcentage de prolifération induite par lectine (en utilisant ConA à 5 μg/ml). En figure 34A, les plaques ont été recouvertes par 2μg/ml de SC-Kd/HA, 40 ng/ml de peptides HA, 20 μg/ml de SC-Kd/CW3, 2 μg/ml SFl-1.1.1, et le compétiteur (peptides CW3) a été ajouté à 50 μg/ml.
Ces données indiquent que les molécules du CMH de classe I recouvertes sont capables d'induire la prolifération de splénocytes CD8+ naïfs purifiés d'une manière peptide- spécifique. La procédure de purification n'active pas les splénocytes CD8+ De manière à vérifier que les splénocytes CD8+ clone 4 purifiés présentent un phenotype naïf, la distribution des tailles cellulaires et l'expression de CD69, CD25, CD62L et CD44 ont été analysées par cytometrie de flux après purification. Les résultats sont illustrés par la figure 35 qui montre que les splénocytes CD8+ présentent un phenotype activé après stimulation par SC-Kd/HA. 105 splénocytes CD8+ par puits ont été incubés dans des plaques avec du PBS pendant 16 heures (jour O) ou dans des plaques couvertes par 20 μg/ml de SC-Kd/HA pendant trois jours (jour 3) à la fois en absence d'IL-2 recombinante et en présence de compétiteurs (voir figure 34). Les cellules vivantes ont été choisies par rapport à CD8+ . La taille des cellules (dispersion avant) et le phenotype de surface des cellules ont été testés. L'expression de CD69, CD62L, CD25 et CD44 par les splénocytes CD8 amorcés et non amorcés a été mesurée par cytometrie de flux en utilisant l'anticorps correspondant. Les résultats indiqués sont les résultats pour une souris représentative parmi un minimum de 3. Comme le montre la figure 35 (jour 0), plus de 85% des cellules T purifiées sont petites, CD69- , CD62 L+ CD25- et faiblement CD44. Ces figures ne peuvent être différenciées de celles des splénocytes clone 4 non purifiés qui ont indiqué que la procédure de purification ne modifie pas le niveau d'activation des cellules T.
De manière à confirmer que la procédure de purification choisie n'intervenait pas dans la prolifération subséquente induite avec SC-Kd/HA, on a purifié « négativement » des cellules T CD8+ clone 4 en utilisant des anticorps dirigés contre des cellules B (B220), CD4+ (L3T4) et macrophages (F4/80) pour éliminer ces cellules des splénocytes transgéniques. Il faut noter que cette procédure ne peut pas modifier les cellules purifiées puisqu 'aucun des anticorps utilisés ne réagissent avec les cellules T CD8+. Ces splénocytes clone 4 purifiés « négativement » ont alors été utilisés dans le même test de prolifération et il a été trouvé qu'ils sont stimulés d'une manière similaire à leurs contreparties purifiées « positivement ». Les résultats sont présentés en figure 34C. Les splénocytes CD8+ purifiés (10 /puits de l'haplotype H-2d ou 2,5 X 105/puits de l'haplotype H-2b) ont été incubés dans des plaques couvertes avec 2 μg/ml de SC-Kd/HA ou 20 μg/ml de SC-Kd/CW3, pendant 24 heures à 37'C en absence d'IL-2 humaine recombinante. Les cellules ont été puisées avec de la thymidine 3H pendant les 16 heures suivantes. Les données représentent la moyenne de trois répétitions et sont exprimées en pourcentage de prolifération induite par lectine (en utilisant ConA à 5 μg/ml). Les expériences impliquant une activation par SC- Kd/HA ont été réalisées en présence du peptide compétiteur CW3 (50 μg/ml). Cependant, comme le niveau de pureté et le rendement ont été plus faibles que ceux obtenus pour les cellules T sélectionnées « positivement », la purification « positive » a été choisie pour les expériences suivantes.
La prolifération induite par SC-Kd/HA ne requiert pas l'interaction CD28/B7
Les cellules T CD8+ utilisées dans ces expériences ont été hautement purifiées. De manière à exclure le fait qu'un petit nombre de molécules contaminantes APC ou B7 potentiellement exprimées sur les cellules T puisse fournir une co-stimulation, les expériences additionnelles suivantes ont été réalisées. CD28 est la molécule costimulatrice la plus puissante exprimée sur les cellules T. CTLA4-Ig, une protéine de fusion comprenant le domaine extracellulaire de l'homologue CD28 CTLA-4 et la portion Fc d'une immunoglobuline humaine, se lie à B7.1 et B7.2 avec une haute affinité (143) et a été utilisée à la fois in vivo et in vitro en tant que leurre pour bloquer l'interaction CD28/B7 (143, 145). Pour déterminer si l'interaction CD28/B7 joue un rôle dans la prolifération de splénocytes CD8+ clone 4 naïfs purifiés par l'intermédiaire de SC-Kd/HA, le test de prolifération a été réalisé en présence de 10 μg/ml de CTLA4-Ig. (Des expériences préliminaires ont indiqué que, tel que reporté précédemment (143), cette concentration est suffisante pour inhiber complètement une réaction de lymphocytes mixtes allogéniques primaires de 10 splénocytes d'une souris C57BL/6 induite par 10 splénocytes irradiés d'une souris DBA/2). Les résultats sont présentés en figure 34B. Les splénocytes CD8+ purifiés (105/ puits de l'haplotype H-2d ou 2,5 X 105 / puits de l'haplotype H-2b) ont été incubés sur des plaques couvertes avec 2 μg/ml de SC-Kd/Ha avec ou sans protéine de fusion CTLA4-Ig (10 μg/ml), pendant 24 heures à 37°C en l'absence d'IL-2 humaine recombinante. Les cellules ont été puisées avec de la thymidine 3H pendant les 16 heures suivantes. Les données représentent la moyenne de trois répétitions et sont exprimées en pourcentage de prolifération induite par lectine (en utilisant ConA à 5 μg/ml). Les expériences impliquant une activation par SC-Kd/HA ont été réalisées en présence du peptide compétiteur CW3 (50 μg/ml). Comme le montre la figure 34B et comme il est attendu lorsque le seul stimulus fourni aux cellules T est des complexes SC- Kd/HA, CTLA4-Ig n'a eu aucun effet sur la prolifération des splénocytes CD8+ clone 4. La prolifération induite par SC-Kd/HA ne requiert pas une interaction de cellule à cellule.
De manière à mieux déterminer le rôle des interactions de cellule à cellule dans la prolifération de splénocytes CD8+ clone 4 naïfs, l'effet d'une diminution de la densité cellulaire tout en maintenant la concentration de SC-Kd/HA constante a été étudié. Des complexes SC-Kd/HA (20 μg/ml) ont été couverts et des dilutions en série de splénocytes CD8+ clone 4 purifiés ont été inoculés à raison de 1,5 X 103 à 1,5 X 105 cellules par ml. Les résultats sont présentés en figure 36 (en abscisse, nombre de cellules X 10 -4 ; en ordonnée, la prolifération des cellules T en cpm X 10-3) qui montre que la réponse proliférative à SC-Kd/HA est proportionnelle au nombre de splénocytes CD8+. De 1,5 X 103 à 1,5 X 105 splénocytes CD8+ par ml ont été ajoutés à des plaques couvertes avec 20 μg/ml de SC-Kd/HA, en absence d'IL-2 humaine recombinante, et en présence de compétiteurs (voir figure 34). Après 24 heures à 37°C, les cellules ont été puisées avec la thymidine H pendant 16 heures. Les données représentent la réponse moyenne de trois répétitions. Comme le montre la figure 36, une relation parfaitement linéaire est observée entre le nombre de cellules T inoculées et la prolifération mesurée sur toute la gamme, ce qui suggère qu'aucune interaction de cellule à cellule n'est requise pour que les cellules T prolifèrent.
Les complexes SC-Kd/HA sont en effet le stimulus activateur reçu par les splénocytes CD8 clone 4. Des peptides immunogeniques liés à des molécules du CMH présentent généralement de faibles taux de dissociation. On ne peut cependant pas complètement exclure que durant la période d'incubation, quelques peptides puissent se dissocier du SC-Kd recouvert et se lier à des molécules K vides exprimées par des cellules T CD8+. De manière à démontrer que les complexes SC-Kd /HA recouverts sur des plaques plastiques sont en fait le stimulus activateur reçu par les splénocytes CD8+ clone 4 naïfs purifiés, trois expériences additionnelles ont été réalisées.
Tout d'abord, la réponse de cellules T purifiées au peptide seul a été examiné. Les résultats sont illustrés sur la figure 34A (voir ci-dessus). Il a été trouvé que les splénocytes CD8+ clone 4 purifiés ne prolifèrent pas lorsque 40 ng de peptides sont ajoutés, ce qui correspond à la quantité totale de peptides contenus dans environ 2 μg de complexes SC-Kd/HA. Ce résultat indique que même si tous les SC-Kd/HA recouverts se dissociaient et si les peptides relâchés se liaient aux molécules Kd exprimés à la surface cellulaire, ceci ne serait pas suffisant pour expliquer la prolifération observée de splénocytes CD8+ clone 4 purifiés.
Deuxièmement, alors que les splénocytes clone 4 non purifiés ont proliféré en réponse au peptide seul du fait de la présence d'APC professionnelles dans la population brute de splénocytes, cette prolifération a été bloquée par un excès de peptide inapproprié. Nous avons donc cherché à déterminer si le même excès de peptide inapproprié avait un quelconque effet sur la prolifération de splénocytes CD8+ clone 4 purifiés induite par SC-Kd/HA. Comme illustré par la figure 34A, un excès dans un facteur de 1 250 du peptide inapproprié CW3, qui inhibait la prolifération de splénocytes non purifiés induite par 40 ng/ml de HA, n'a aucun effet sur la prolifération de splénocytes CD8+ clone 4 purifiés induite par SC-Kd/HA recouvert. Toutes les expériences ont donc été réalisées en présence de 50 μg/ml de peptide CW3.
Enfin, la souris transgénique clone 4 a été croisée sur un haplotype H-2b , comme décrit dans la section Matériel et Méthodes de cet exemple. De manière intéressante, bien que le TCR transgénique clone 4 soit restreint par Kd, quelques cellules T HA-réactives ont été positivement sélectionnées dans le contexte H-2. Des splénocytes CD8+ issus de ces souris ont été purifiés et leur prolifération induite par SC-Kd/HA recouvert a été testée comme décrit ci-dessus. Comme illustré par la figure 34C, ces splénocytes transgéniques CD8+ H-2b ont proliféré en réponse à SC-Kd/HA recouvert, bien que le niveau de prolifération ait été quelque peu inférieur à celui obtenu avec des cellules purifiées à partir de souris transgéniques clone 4 H-2d . Cette plus faible prolifération reflète le fait que seulement une fraction des cellules a répondu au stimulus puisque une régulation amont de CD69 n'a été détectée que sur 10% des splénocytes CD8+ H-2b à 24 heures. La prolifération de splénocytes transgéniques clone 4 H-2b était peptide- spécifique puisque SC-Kd/CW3 n'a pas induit de prolifération (voir figure 34C).
Pris ensemble, ces résultats indiquent que la prolifération observée n'était pas due à la libération du peptide HA à partir des complexes SC-Kd/HA recouvert et à sa liaison à des molécules K exprimées sur des cellules. Ce sont en effet les complexes SC-Kd/HA qui sont le stimulus activateur reçu pas les splénocytes CD8+ clone 4. Les splénocytes CD8+ clone 4 stimulés par des complexes SC-Kd/HA présentent un phenotype activé.
De manière à déterminer si la prolifération de splénocytes CD8+ clone 4 stimulée par des complexes SC- Kd/HA est associée à un phenotype activé, l'expression de plusieurs marqueurs d'activation a été analysée par cytometrie de flux (voir la figure 35). Comme mentionné ci-avant, après purification, les splénocytes CD8+ clone 4 sont CD69-, CD25-, faiblement CD44, fortement CD62L et de petite taille, ce qui indique un phenotype naïf (voir figure 35, jour 0). Après que les cellules aient été stimulées pendant trois jours par des complexes SC-Kd HA recouverts en l'absence d'IL-2 ajouté, la transformation en blastes a été observée pour 90% des cellules. L'expression de CD69 et CD25 a été détectée dans respectivement 94% et 93% des cellules. L'expression de CD44 était régulée en amont de faible à fort et l'expression de CD62L a diminué dans environ 20% des cellules (voir figure 35 jour 3). En fait, 16 heures de stimulation furent suffisantes pour observer une régulation amont de CD69 dans 90% des cellules activées. Inversement, les expériences de cinétique ont indiqué que huit jours étaient nécessaires pour observer une modulation négative de CD62-L dans plus de 80% des cellules. Ces résultats démontrent que (i) après purification les splénocytes CD8+ clone 4 présentent un phenotype naïf, (ii) les complexes SC-Kd/HA recouverts stimulent la grande majorité des cellules pour présenter un phenotype complètement activé. Les splénocytes CD8 clone 4 stimulés par des complexes SC-Kd/HA recouverts sécrètent des cytokines. Nous avons ensuite déterminé si la prolifération et l' activation de splénocytes CD8+ clone 4 étaient associées à une différenciation en effecteurs. La production de différentes cytokines a été mesurée après stimulation à l'aide de complexes SC-Kd.HA, sans addition d'IL-2 exogène, et en présence d'un excès de peptides CW3. Les résultats sont présentés dans le tableau 11 suivant :
TABLEAU 11:
Production de cytokines par des splénocytes CD8+ activés par SC-Kd/HA
Figure imgf000153_0001
* Moyenne (déviation standard) de la concentration en cytokine dans le surnageant de 10 splénocytes CD8+ purifiés activés avec le complexe SC-Kd/peptide indiqué. Les productions de IFN-γ et de IL-3 ont toutes deux été détectées après 24 heures et ont augmenté au jour 3 (voir tableau 1, lignes 2 et 3), alors que celles de GM-CSF et de TNF étaient plus précoces ; et également augmentaient au cours du temps (voir tableau 1, lignes 1 et 4). La production de cytokines était peptide-spécifique puisque il n'y a pas eu de cytokines détectées lorsque les cellules ont été incubées en présence de SC-Kd chargé avec un peptide inapproprié (voir tableau 3 colonne relative à CW3). Des splénocytes CD8+ naïfs (immédiatement après purification) n'ont pas produit de quantités détectables de ces cytokines (tableau 1, jour 0). Il n'a pas été possible de détecter une quelconque production d'IL-2, IL-4, IL-6 ou IL-10 dans le surnageant de cellules activées par SC-Kd/HA.
La stimulation de CD8+ par des complexes SC-Kd/HA recouverts induit une activité cytotoxique. De manière à mieux caractériser les blastes de cellules T CD8+ clone 4 obtenus après stimulation par SC-Kd/HA recouvert, l'activité cytotoxique a été mesurée. Des splénocytes CD8+ clone 4 purifiés ont été activés pendant trois jours en l'absence d'IL-2 exogène et en présence d'un excès de CW3. Les cellules activées ont été incubées pendant 6 heures avec des cellules P815 marquées au 51Cr puisées avec HA à différents ratio effecteur : cellule cible. Les résultats sont présentés en figure 37 (en abscisse, ratio effecteur : cellule cible ; en ordonnée, pourcentage de lyse spécifique).
La figure 37 illustre le fait que les splénocytes CD8+ activés par SC-Kd/HA élicitent une réponse cytotoxique. Des splénocytes CD8+ purifiés (3 X 10 6) ont été utilisés immédiatement après purification (jour 0) ou ont été incubés dans des plaques couvertes avec 2 mg/ml de SC- Kd/HA pendant trois jours (jour 3) à 37°C, en l'absence d'IL-2 humaine recombinante et en présence de compétiteur (voir figure 34). L'activité cytotoxique primaire (mesurée par test de libération de Cr comme décrit dans la section Matériel et Méthode de cet exemple ) a été testée sur des cellules cibles P815 puisées (symboles noirs) et non puisées (symboles blancs) par le peptide HA (jour 0, symbole = cercle ; jour 3, symbole = carré). Comme illustré par la figure 37, alors qu'aucune activité cytotoxique n'a été détectée immédiatement après purification (voir figure 37, jour 0), une lyse significative a été observée avec les cellules T CD8+ clone 4 activées pendant 3 jours. Cette lyse était peptide-spécifique puisque les cellules P815 puisées par le peptide inapproprié CW3 n'ont pas été lysées (voir figure 37, jour 0 et jour 3, - HA).
La présente invention n'est d'aucune manière limitée aux exemples spécifiques contenus dans le présent mémoire descriptif. Les revendications annexés, dont l'objet peut être obtenu et utilisé par l'homme du métier en se basant sur la présente description, fournit d'autres exemples de l'objet considéré par l'invention. D'autres modes de réalisation peuvent être déduits du contenu de la présente description, conjointement avec la compréhension de l'homme du métier, par exemple les enseignements que l'on trouve dans les documents référencés ci-après. L'invention comprend spécifiquement, comme décrit ici et comme il apparaît clairement à l'homme du métier : les molécules recombinantes ; les molécules recombinantes en association avec un peptide approprié, ou ce qu'on appelle également le complexe CMH/peptide ; les complexes CMH/peptide sous les formes monomère, dimère, polymère et en agrégats ; les méthodes et procédés destinés à détecter et produire des lymphocytes antigène-spécifiques utilisant l'une quelconque des molécules recombinantes mentionnées ci-dessus ; des kits de diagnostic impliquant l'utilisation des molécules recombinantes mentionnées ci- dessus ; des méthodes utilisant des lymphocytes générés par mise en contact des complexes CMH/peptide avec diverses cellules appropriées ; et des méthodes permettant d'influencer l'activité ou la fonction d'un lymphocyte en le mettant en contact avec un complexe CMH/peptide sous différentes formes. La forme monomère du complexe CMH/peptide est particulièrement utile pour anergiser des lymphocytes et la forme dimère est particulièrement utile pour générer un CTL.
Ces résultats montrent donc que des molécules CMH recombinantes, monocaténaires, couplées, à densité élevée, sur des billes, sont capables d'activer de manière efficace des CTL primaires et que ces CTL, lorsque la comparaison est possible, des caractéristiques similaires à celles des CTL produits in vivo par immunisation.
L'homme du métier peut consulter les documents suivants pour mettre en pratique l'invention ou mieux comprendre le contexte. Ces documents sont également pertinents dans leurs enseignements spécifiques auxquels il est fait référence dans la description.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de détection de la présence ou de l'absence d'un lymphocyte antigène-spécifique, comprenant les étapes consistant à fournir un complexe comprenant un déterminant modifié du complexe majeur d'histocompatibilite (CMH), en association avec un antigène peptidique spécifique ; à coupler ledit complexe à un support solide ; à incuber le complexe couplé à un support solide avec un échantillon biologique dans des conditions appropriées pour lier un lymphocyte à un antigène ou à une molécule du complexe majeur d'histocompatibilite ; et à détecter la présence ou l'absence de lymphocytes liés au complexe couplé à un support solide.
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisé en ce que le déterminant du CMH modifié est présent sous la forme d'un dimère ou d'un polymère d'ordre supérieur, ou d'un agrégat.
3. Méthode selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle l'antigène est choisi dans le groupe d'antigènes essentiellement formé par les antigènes associés à des tumeurs, les antigènes dérivés d'un parasite, les antigènes dérivés de bactéries et les antigènes dérivés de virus tels que VlH, influenza, CMV, VPH, Hépatite A, Hépatite B, Hépatite non-A non-B et Hépatite C.
4. Méthode de détection de la présence ou de l'absence d'un lymphocyte T spécifique d'une tumeur, comprenant les étapes consistant à fournir un complexe comprenant une molécule modifiée du complexe majeur d'histocompatibilite, en association avec un antigène spécique de tumeur ; à coupler ledit complexe à un support solide ; à incuber ledit complexe couplé à un support solide avec un échantillon biologique ; et à détecter la présence ou l'absence d'un lymphocyte T lié au complexe couplé à un support solide.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-4, caractérisée en ce que l'incubation comprend en outre une période d'environ 3 heures à environ 4°C, avec ou sans agitation douce, et en ce que la détection comprend en outre l'utilisation d'un concentrateur de particules magnétiques.
6. Méthode d'obtention, d'isolement ou de purification d'un lymphocyte T antigène-spécifique, comprenant les étapes consistant à fournir un complexe constitué essentiellement par un déterminant modifié du complexe majeur d'histocompatibilite en association avec un antigène peptidique ; à coupler le complexe à un support solide ; à incuber ledit complexe couplé au support solide avec un échantillon biologique, de sorte que les lymphocytes T puissent se lier au complexe couplé au support solide ; et à séparer des autres cellules les lymphocytes T liés.
7. Méthode de préparation d'un lymphocyte T cytotoxique antigène-spécifique, comprenant les étapes consistant à fournir un complexe comprenant un déterminant modifié du complexe majeur d'histocompatibilite en association avec un antigène ; à coupler le complexe à un support solide ; et à mettre en contact le complexe couplé à un support solide avec un lymphocyte primaire.
8. Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'antigène est choisi dans le groupe d'antigènes essentiellement constitué par des antigènes spécifiques de tumeur, des antigènes dérivés du VlH, des antigènes dérivés du virus influenza et un antigène dérivé de bactéries.
9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce que l'antigène est choisi dans le groupe d'antigènes essentiellement constitué par des antigènes associés à des tumeurs, des antigènes dérivés d'un parasite, des antigènes dérivés de bactéries, et des antigènes dérivés de virus tels que VlH, influenza, CMV, VPH, Hépatite A, Hépatite B, Hépatite non-A non-B et Hépatite C.
10. Méthode destinée à tuer une cellule, contenant un antigène spécifique de tumeur, comprenant l'étape consistant à mettre en contact un lymphocyte T cytotoxique tel qu'obtenu par la méthode selon la revendication 7 avec une cellule contenant un antigène spécifique de tumeur dans des conditions physiologiquement acceptables.
11. Méthode d'introduction d'un lymphocyte T cytotoxique dans un animal ou chez l'homme, comprenant l'étape consistant à fournir un lymphocyte T cytotoxique comme revendiqué à la revendication 7 et à injecter le lymphocyte T cytotoxique à l'homme ou à l'animal, conjointement avec une solution, un véhicule ou des excipents physiologiquement acceptables.
12. Méthode d' anergisation d'un lymphocyte T antigène-spécifique, comprenant l'étape consistant à mettre en contact le lymphocyte T avec une composition comprenant un décerminant modifié du CMH, sous forme monomère en association avec un antigène peptidique.
13. Méthode d'élimination d'une population de lymphocytes T antigène-spécifiques, comprenant les étapes consistant à fournir un complexe comprenant un déterminant modifié du CMH, en association avec un antigène peptidique ; à coupler ledit complexe à un support solide ; et à introduire ledit complexe couplé à un support solide dans une population de lymphocytes T.
14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-9, 12 ou 13, caractérisée en ce que l' antigène peptidique est lié par covalence au déterminant modifié du CMH.
15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1-9, 12 ou 13, caractérisée en ce que l'antigène peptidique est lié par covalence à un espaceur du déterminant modifié du CMH.
16. Méthode selon l'une quelconque des revendications 3-9, 12 ou 13, caractérisée en ce que le déterminant modifié du CMH est présent sous la forme d'un dimère ou d'un polymère d'ordre supérieur ou d'un agrégat.
17. Molécule recombinante du CMH, comprenant SC-A2 ou SC-Kd.
18. Molécule recombinante du CMH, biologiquement fonctionnelle, possédant l'activité de stimulation des lymphocytes T et de présentation d ' antigène d'une molécule HLA-A2 naturelle, comprenant un ou plusieurs domaines de la chaîne lourde de HLA-A2 liés, par covalence ou autrement, à une b2-microglobuline, ou à un fragment de b2-microglobuline, par l'intermédiaire d'une région d'espaceur flexible.
19. Méthode de diagnostic pour déterminer la concentration ou la quantité relative de molécules solubles du CMH de classe I ou classe II dans un échantillon, comprenant les étapes consistant à utiliser une molécule recombinante, telle que revendiquée à la revendication 18, en tant que référence standard, à mettre en contact l'échantillon avec des anticorps spécifiques du CMH ou de la microglobuline, ou des deux, et à déterminer la quantité de liaison dans l'échantillon, comparée à la liaison de la molécule recombinante.
20. Kit de diagnostic servant à identifier des peptides antigéniques capables d'être présentés par une molécule A2 comprenant une molécule recombinante, telle que revendiquée à la revendication 18, et un peptide marqué, qui est capable de se lier à la molécule recombinante.
21. Molécule recombinante, selon la revendication 18, présente sous forme monomère ou sous forme dimère ou, de préférence, en tant que polymère ou agrégat de ces formes.
22. Méthode d'utilisation d'une molécule recombinante, telle que revendiquée à la revendication 21, destinée à stimuler et développer sélectivement un clone de CTL spécifique à partir d'une source de lymphocytes T, comprenant l'étape consistant à mettre en contact la molécule recombinante chargée d'un peptide spécifique avec un lymphocyte T.
23. Composition comprenant une molécule recombinante, selon l'une quelconque des revendications 18 ou 21, et un support solide.
24. Composition selon la revendication 23, caractérisée en ce que le support solide est une bille magnétique.
25. Méthode d'utilisation d'une composition, telle que revendiquée à la revendication 24, pour induire in vitro des CTL primaires peptide-spécifiques, comprenant l' étape consistant à incuber la composition selon la revendication 24 avec un peptide, suivie de l'étape consistant à mettre en contact la composition avec un PBL naïf.
26. Méthode d'utilisation d'un CTL selon la revendication 25, pour lier un CTL à une cellule porteuse d'antigène, comprenant le fait de mettre en contact le CTL avec la cellule porteuse d'antigène.
27. Méthode de production d'anticorps spécifiques anti-HLA, comprenant l'étape consistant à introduire une molécule recombinante, selon l'une quelconque des revendications 18 ou 21, dans un animal et à isoler ou purifier des anticorps issus du sérum de l'animal.
28. Méthode de production d'une cellule productrice d ' immunoglobuline par un animal, comprenant le fait d'introduire une molécule recombinante, selon l'une quelconque des revendications 18 ou 21, dans un animal et à isoler ou purifier la cellule.
29. Kit de diagnostic destiné à identifier la présence ou l'absence d'un anticorps spécifique anti-HLA dans un échantillon, comprenant une molécule recombinante, selon la revendication 18, et un moyen de détection pour détecter la liaison d'anticorps spécifiques à la molécule recombinante.
30. Méthode de diagnostic destinée à identifier des peptides qui peuvent être présentés par une molécule A2 pour résulter en une réponse immunitaire dans un lymphocyte, comprenant le fait de mettre une molécule recombinante, selon la revendication 18, en association avec un peptide, en contact avec un lymphocyte et à rechercher une réponse immunitaire.
31. Méthode selon la revendication 25, comprenant en outre l'addition d'une cellule stimulatrice, telle qu'un conA-blast activé par peptide.
32. Méthode d'utilisation d'une molécule recombinante telle que revendiquée dans les revendications 18 et 21, pour stimuler une réponse immune spécifique ex vivo ou pour une activation directe de lymphocytes in vivo par injection de la molécule sous forme de revêtement de support quelconque.
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