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WO1996008564A1 - Humanised antibody to integrin chain beta-1 - Google Patents

Humanised antibody to integrin chain beta-1 Download PDF

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Publication number
WO1996008564A1
WO1996008564A1 PCT/FR1995/001167 FR9501167W WO9608564A1 WO 1996008564 A1 WO1996008564 A1 WO 1996008564A1 FR 9501167 W FR9501167 W FR 9501167W WO 9608564 A1 WO9608564 A1 WO 9608564A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
baculovirus
sequence
region
promoter
Prior art date
Application number
PCT/FR1995/001167
Other languages
French (fr)
Inventor
Christelle Margaritte
Marie-Alix Poul
Marie-Paule Lefranc
Florence Cervoni Mary
Alain Bernard
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Proteine Performance S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm), Proteine Performance S.A. filed Critical Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Priority to EP95930574A priority Critical patent/EP0781337A1/en
Publication of WO1996008564A1 publication Critical patent/WO1996008564A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C07K16/2842—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to obtaining, in insect cells, a humanized recombinant monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody K20 is a murine antibody which recognizes the ⁇ 1 (CD29) subunit of integrins.
  • K20 can inhibit the activation and proliferation of peripheral T lymphocytes induced by an anti-CD3 antibody [GROUX et al., Nature, 339, 152-154 (1989); TICCHIONI et al., J. Immunol. , 151, 119-127 (1993)]. It could therefore be considered using this antibody as part of immunosuppressive therapy.
  • humanized antibodies the sequences of the variable parts of which are not directly involved in the recognition of the antigen are replaced by sequences of human origin.
  • the humanization of a non-human antibody therefore involves determining with the greatest precision possible what are the amino acid residues of the non-human antibody which are involved in the recognition of the antigen (and which must be preserved in the humanized antibody), and which ones can, on the contrary, be replaced to reproduce the sequences of a human antibody, without affecting or affecting as little as possible, the recognition of the antigen.
  • CDR region determining the complementarity
  • the aim of the present invention is to humanize the murine antibody K20, and to express the humanized antibody thus obtained in an appropriate vector / host system.
  • the amino acid sequence of the VJJ and V L variable regions of this antibody was first determined, which makes it possible to locate the CDRs.
  • the humanization of an antibody is carried out by grafting its CDRs in place of the CDRs of a human antibody.
  • the inventors have had the idea of determining in addition, from the sequence of the variable regions of K20, the type of canonical structure of the hypervariable loops L1, L2, L3, H1 and H2.
  • the canonical structures which have been observed for most of the hypervariable loops (with the exception of the H3 loop), and which are conserved between different species, are determined by a small number of key residues from the FR regions and the CDRs: different types of canonical structures were defined, according to the size of the loop, and the nature of amino acid residues it comprises [CHOTIA and LESK, J. Mol.
  • the inventors then selected human V H and V L regions whose amino acid sequence has a high homology (preferably between 74 and 95% homology) with the sequence of the Vfj and VL regions of the murine antibody K20, and whose hypervariable loops L1, L2, L3, Hl and H2 have the same type of canonical structure as the corresponding hypervariable loops of said murine antibody.
  • the inventors then replaced the CDRs with the corresponding CDRs of the murine antibody K20, in order to obtain the VH and VL regions of the humanized antibody.
  • the process described above can be generalized to the humanization of the variable regions of any monoclonal antibody of non-human origin, in particular of murine origin.
  • the subject of the present invention is a method for humanizing the variable region Vy and / or the variable region V j _, of a non-human immunoglobulin, which method is characterized in that it comprises at least the following steps :
  • the process according to the invention can be completed by the point mutation (replacement, addition or deletion of a codon) of one or more oligonucleotide sequences coding for one or more amino acids located in the FRs of the VJJ or V L region. .
  • Such a mutation can for example be carried out in the case where the amino acid sequence of the V H region or of the human V L region which has been selected for its homology with the non-human VJJ or VL region, present, at a determined position, an "unusual" amino acid for the variability subgroup to which it belongs. It may then be appropriate to replace this amino acid with a more representative amino acid. In general, we will try to get as close as possible to the consensus sequences of the FRs of the most homologous human subgroup, in order to further reduce the immunogenicity of the humanized antibody.
  • the present invention also relates to a DNA fragment, coding for the variable region V H or for the variable region VL of a humanized antibody, and characterized in that it is capable of being obtained by the method according to the invention, as defined above.
  • a DNA fragment coding for the V H variable region or for the VL variable region of a humanized antibody according to the invention can then be fused with a DNA fragment coding for the constant region of an H or L chain. human, in order to express the complete H and L chains obtained in this way.
  • said humanized antibody is obtained from the murine antibody K20.
  • a humanized antibody obtained by the process according to the invention will be designated by the abbreviation Hu-Ac, and more particularly, the humanized antibody derived from the antibody K20, by the abbreviation Hu-K20.
  • the present invention relates to a DNA fragment, characterized in that it is chosen from the group consisting of:
  • a sequence coding for the variable domain of the light chain of the Hu-Ac antibody fused to a sequence coding for the constant domain of the light chain of a human immunoglobulin; or - a sequence coding for the variable domain of the heavy chain of the Hu-Ac antibody, fused to a sequence coding for the constant domain of the heavy chain of a human immunoglobulin.
  • a humanized antibody in accordance with the invention, use will preferably be made of an expression system which has also been developed by the inventors, which uses an expression vector derived from a baculovirus, and makes it possible to produce both the heavy chain (H) and the light chain (L) of a given antibody in an insect cell.
  • the present invention also relates to an expression cassette comprising a recombinant DNA sequence constituted by a sequence coding for the variable region of the light chain of the Hu-Ac antibody fused to a sequence coding for the constant domain of the light chain of a human immunoglobulin; or by a sequence coding for the variable region of the heavy chain of the Hu-Ac antibody fused to a sequence coding for the constant domain of the light chain of a human immunoglobulin, which recombinant DNA sequence is placed under transcriptional control. an appropriate promoter.
  • said promoter is a baculovirus promoter.
  • baculovirus promoters which can be used for the implementation of the present invention, mention will be made of polyhedrin and P10 baculovirus promoters AcMNPV or S1MNPV, or derivatives of baculovirus promoters, constituted by synthetic promoters or recombinants, obtained from a baculovirus promoter, and functional in insect cells, such as for example that described by WANG et al, [Gene, 100, 131-137, (1991)].
  • An expression cassette according to this embodiment comprises for example.
  • baculovirus promoter as defined above; a sequence coding for a secretory signal peptide
  • sequences coding for signal peptides functional in insect cells can be used for the implementation of the present Invention.
  • Each of the cassettes according to the invention allows the expression, either of the light chain or of the heavy chain, of an Hu-Ac antibody, having the specificity of the parental monoclonal antibody.
  • the sequence coding for the constant domain of the light chain can be chosen from the sequences coding for the constant domains of the light chains kappa (K) and lambda ( ⁇ ).
  • the sequence coding for the constant domain of the heavy chain can be chosen from the sequences coding for the constant domains of the heavy chains ⁇ l, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4, ⁇ , ⁇ , and ⁇ . It is thus possible to obtain a recombinant antibody belonging to the immunoglobulin class (IgG1, lgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM) which is desired.
  • the present invention also relates to recombinant vectors, carrying at least one expression cassette as defined above, - in this context, the present invention includes in particular recombinant baculoviruses allowing the expression of the antibody Hu- Ac, as well as transfer plasmids allowing the construction of said recombinant baculoviruses.
  • the transfer plasmids in accordance with the invention carry an insert comprising: an expression cassette as defined above, and on either side of this cassette, baculovirus sequences homologous to those of the regions flanking the portion of the viral genome to replace which one wishes to insert said cassette.
  • said baculovirus sequences are homologous to those of the regions flanking the p10O gene, or homologous to those of the regions flanking the polyhedrin gene.
  • the expression cassette containing the gene coding for the light chain of the Hu-Ac antibody is flanked by the regions surrounding the polyhedrin gene in wild baculovirus, and the cassette d
  • the expression carrying the gene coding for the heavy chain of the Hu-Ac antibody is flanked by the regions surrounding the PlO gene in the wild baculovirus.
  • the construction of the transfer plasmids in accordance with the invention is done by inserting into a plasmid capable of replicating in a bacterial host (in general E. coli), the region of the baculovirus gene (for example plO or polyhedrin, or any other baculovirus locus) in place of which it is desired to insert the genes coding for the H or L chains of immunoglobulin.
  • the coding sequence of the baculovirus gene (and possibly the promoter sequence of said gene) is replaced by the sequence coding for the immunoglobulin chain to be expressed (and optionally by the promoter sequence under whose control it is desired to express this chain.
  • immunoglobulin if it is for example a "derivative" promoter).
  • the transfer plasmid thus obtained therefore contains an insert comprising a heterologous sequence (sequence of a chain of the Hu-Ac antibody) flanked by baculovirus sequences.
  • the inventors inserted the two cassettes on the same expression vector. They thus obtained a recombinant double baculovirus in which the coding sequence of each of the H and L chains is under the control of a strong promoter.
  • a recombinant baculovirus in accordance with the invention allowing the expression of the Hu-Ac antibody, can be constructed according to the following principle:
  • the insect cells are then cotransfected with the DNA of the transfer vectors thus produced and the DNA of the baculovirus. This cotransfection is carried out in two stages:
  • the transfer plasmid containing the expression cassette for the light chain gene flanked by the regions surrounding the polyhedrin gene in wild baculovirus is used, with the wild baculovirus DNA AcMNPV, to cotransfect insect cells in culture.
  • the light chain coding sequences of the recombinant immunoglobulin are transferred into the viral genome.
  • the recombinant baculoviruses which have integrated the light chain sequence of the recombinant immunoglobulin are selected. These recombinant baculoviruses are selected according to two criteria: their inability to produce polyhedra and their capacity to express the light chain.
  • the cells are cotransfected with the DNA of the recombinant baculovirus obtained at the end of the first step, and with that of the transfer plasmid containing the expression cassette. carrying the gene coding for the heavy chain of the recombinant Hu-Ac antibody flanked by the regions surrounding the PlO gene of baculovirus.
  • the heavy chain gene is transferred into the viral DNA.
  • the detection of the heavy chain and the light chain of immunoglobulin is carried out by ELISA.
  • the subject of the present invention is a recombinant baculovirus, characterized in that it comprises at least one expression cassette, as defined above, comprising a sequence coding all or part of the H chain or a sequence coding for all or part of the L chain of the Hu-Ac antibody, which sequence is placed under transcriptional control of a strong baculovirus promoter.
  • a recombinant baculovirus according to the invention, it comprises an expression cassette comprising the sequence coding for the H chain and an expression cassette comprising the sequence coding for the L chain, of the antibody Hu -Ac.
  • the promoter controlling the transcription of the sequence coding for the L chain of the Hu-Ac antibody, and the promoter controlling the transcription of the sequence coding for the H chain of the Hu antibody -Ac are two different promoters.
  • one of said promoters is located at the location occupied in the wild baculovirus, by the polyhedrin promoter and the other is located at the location occupied in the wild baculovirus, by the promoter of PlO.
  • one of the promoters is the promoter of polyhedrin or one of its derivatives, and the other is the promoter of plO or one of its derivatives.
  • the promoter controlling the transcription of the sequence encoding the light chain of the Hu-Ac antibody is the promoter of polyhedrin or one of its derivatives
  • the promoter controlling the transcription of the sequence encoding the heavy chain of the Hu-Ac antibody is the promoter of PlO or one of its derivatives.
  • sequence coding for the signal peptide associated with the L chain of the Hu-Ac antibody and the sequence coding for the signal peptide associated with the H chain of the Hu-Ac antibody , are two different sequences.
  • a recombinant baculovirus conforming to the invention was deposited on September 9, 1994, with the C.N.C.M. (National Collection of Cultures of Microorganisms, held by the Institut Pasteur, 25 rue du Dondel ROUX, Paris), under the number 1-1476.
  • the present invention also encompasses insect cells infected with a recombinant baculovirus according to the invention.
  • the expression and production of the recombinant monoclonal antibody Hu-Ac is obtained in vitro in insect cells according to the invention.
  • Infection of the cells with a double recombinant baculovirus in accordance with the invention results in the simultaneous production of the H and L chains. These chains come together to reconstitute the Hu-Ac antibody which is subsequently secreted in the culture medium. .
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a humanized recombinant antibody, characterized in that it comprises a step at during which insect cells infected with a recombinant baculovirus according to the invention are cultivated, and a step during which said antibody is obtained from the culture medium.
  • a humanized recombinant antibody in accordance with the invention can be used for diagnosis, or for therapy.
  • a particularly advantageous use, in the case of the humanized antibody K20, relates to obtaining immunosuppressive drugs.
  • MAb K20 is a murine antibody produced by a hybridoma. It is directed against the ⁇ subunit of the CD29 receptor of lymphocytes [BOUMSELL et al. , J. Exp. Med. 152, p. 229 (1980)].
  • the total RNA of the hybridoma producing the monoclonal antibody K20 was extracted using the "RNA extraction Kit” from PHARMACIA.
  • the cDNA is synthesized from 10 ⁇ g of RNA by reverse transcription (First-Strand cDNA Synthesis kit; PHARMACIA).
  • variable parts of the heavy chains (VJJ) and light chains (VL) are amplified by PCR (polymerase chain amplification) from 1 ⁇ g of single-stranded cDNA, using Taq DNA polymerase.
  • the amplification products are purified by electrophoresis on 1.2% agarose gel to separate them. oligonucleotides; the band corresponding to the desired product is excised from the gel, and the DNA is eluted by centrifugation (microcentrifuge SPIN-X, COSTAR, Cambridge, MA), then extracted with phenol / chloroform and precipitated with ethanol,
  • This primer is complementary to the consensus sequence at the 3 'end of the VK variable region of the murine genes, and has a BglII site (underlined).
  • the cDNA obtained was amplified by PCR using on the one hand the primer VKIFOR above, and on the other hand the primer VKIBAC: * VK1BAC (SEQ ID NO: 2): 5'- GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA -3 * (PvuII site underlined).
  • the amplification product was recovered by electrophoresis on agarose gel, extraction with phenol / chloroform and precipitation with ethanol, then digested with PvuII and BglII. and the fragment obtained was cloned into phage M13VKPCR1 (ORLANDI et al., cited above), previously digested with PvuII and Bell, to give phage M13VK.K20PCR1 (FIG. 1A).
  • 2- Clonacre of the variable region of the heavy chain yl of K20 2- Clonacre of the variable region of the heavy chain yl of K20:
  • VH1BAC 5'-AG GT (C / G) (A / C) A (A / G) CTG CAG (C / G) AG TC (A / T) GG-3 '( Pstl site underlined).
  • the amplification product was purified as described above, then digested with BstEII and Pstl. and the fragment obtained was cloned into phage M13VHPCR1
  • FIG. 1A represents the stages of the cloning of the V ⁇ and V H sequences of K20. Phages M13VK.K20PCR1 and
  • M13VHK20PCR1 include, in addition to the K20 sequences, an Ig H chain promoter (P), and the leader sequence
  • the sequence of the insert coding for the variable region V ⁇ of the light chain of the antibody K20 is represented in FIG. 2 A, and identified on the list of sequences in the appendix under the number SEQ ID NO: 5.
  • the sequence of the insert coding for the VJJ variable region of the heavy chain of the antibody K20 is represented in FIG. 2B, and identified on the list of sequences in the appendix under the number SEQ ID NO .- 6.
  • the locations CDRs, as well as those of the primers which have been used, and those of the restriction sites which have allowed cloning are indicated in these Figures 2A and 2B.
  • FIG. 1B represents the stages of humanization of the variable regions V ⁇ and Vg of K20. 1. Humanization of the variable region of the light chain K of K20:
  • M13VKPCR1 contains a V ⁇ gene of mouse, which comprises the framework regions (FRs) of the K protein REI human myeloma, and the complementarity determining regions (CDRs) of the mouse monoclonal antibody D1.3 [Verhoeyen et al. , Science, 239, p 1534
  • VKMUTCDR1 The framework regions of this V s rine gene were used to humanize the V ⁇ gene of K20.
  • VKMUTCDR3 corresponding respectively to CDRs 1, 2, and 3 of the chain V ⁇ of K20 were built, in order to replace the CDRs V ⁇ of D1.3.
  • These 3 oligonucleotides also include 12 additional nucleotides at the 5 'end and at least 12 additional nucleotides at the 3' end, including a C or G terminal, and complementary to the immediate vicinity of the CDR to be replaced.
  • M13HuVKK20PCRl The phage resulting from the replacement in M13VKPCR1, of CDRs V ⁇ of D1.3 by the CDRs of V ⁇ of K20, is called M13HuVKK20PCRl
  • the framework regions of the human V H gene F1 were used to humanize the VJJ gene of K20.
  • the Vg FI gene was amplified by PCR from the vector M13mpl8VHFlRF. [MILILI et al., Mol. Immunol. , 28, p 753 (1991)], using the primers VH1BAK and VH1FOR described above.
  • the amplification product was purified as described above, then digested with BstEII and Pstl. and the fragment obtained was cloned into phage M13VHPCR1.
  • VHMUTCDR1, VHMUTCDR2, and VHMUTCDR3, corresponding respectively to CDRs 1, 2, and 3 of the VJJ chain of K20, were constructed, in order to replace the CDRs V H of F1 by those of K20.
  • nucleotides corresponding to the CDRs of the humanized genes are underlined; the nucleotides initially existing in the VKREI / D1.3 gene and in the VHF1 gene are in capital letters; nucleotides changed by mutagenesis are in lowercase letters; the locations of the nucleotides deleted by mutagenesis of the initial genes are represented by dashes.
  • This vector is derived from the plasmid pGmAcll5T [ROYER et al., J. Virol., 66, 3230-3235, (1992)], itself derived from the plasmid pAcl [CHAABIHI et al. , J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)] containing the EcoRI-I fragment of the autographa californica nuclear polyhedrosis baculovirus (AcMNPV), and therefore the polyhedrin gene, and the sequences flanking said gene.
  • AcMNPV autographa californica nuclear polyhedrosis baculovirus
  • the plasmid pGmAcllST was deleted from a 1900 bp fragment going from an EcoRI site located upstream of the polyhedrin gene to an Xhol site located 1900 bp downstream of this E ⁇ RI site.
  • Competent E. coli bacteria have been transformed by part of the ligation mixture; the screening of the colonies resulting from this transformation has allowed to select the plasmid pGmAcll6T.
  • This plasmid contains a BglII site downstream of the polyhedrin promoter.
  • b- Signal peptide The coding sequence of this peptide is that of the signal peptide of a mouse V H gene [NEUBERGER MS, EMBO J., 2, 1373-1378, (1983)].
  • This sequence was chemically synthesized in the form of two complementary oligonucleotides having ends allowing the insertion of the duplex into a BglII site.
  • 15 ⁇ g of each of the two oligonucleotides are incubated in 50 ⁇ l of buffer (1 mM Tris pH 7.5, 0.1 mM EDTA), for 5 minutes in a water bath at 70 ° C. The bath is then left to cool to room temperature (22 to 25 ° C).
  • the pairing product is used directly in the ligation reactions with the plasmid pGmAcll6T previously cut with BglII.
  • the ligation conditions are as follows:
  • Human lymphocytes (approximately 5 ⁇ 10 8 ) were prepared from 200 ml of blood using HISTOPAQUE® (SIGMA). Total RNA was extracted from these lymphocytes using a PHARMACIA kit (RNA extraction kit). The first strand of cDNA was prepared from total RNA using the "First-Strand cDNA synthesis kit" from PHARMACIA.
  • the primers used to amplify the cDNA CK are the following: * HuCKBAC (SEQ ID NO: 13): 5 '-AG CTC GAG ATC AAA CGG-3' (the Xhol site is underlined).
  • This primer corresponds to a consensus sequence in 3 ′ of the sequences coding for the variable domains of the light chains of mouse immunoglobulins (JK), and contains a site of cleavage by Xhol.
  • HuCKFOR SEQ ID NO: 14: 5 '-GAA GAT CTA ACA CTC TCC GCG GTT GAA G-3 * (the BglII site is underlined). This primer is complementary to the end
  • Amplification with the primers HUCKBAC and HUCKFOR made it possible to obtain a fragment of approximately 340 bp containing the entire CK region framed by the Xhol and BglII sites.
  • the amplification product was digested with B ⁇ lII and Xhol before being cloned into the Xhol-BglII sites of the plasmid pGmAc carrying the sequence coding for the signal peptide.
  • composition of the ligation mixture is as follows: l ⁇ g of the plasmid pGmAc cut with Xhol and
  • Incubation is carried out at 22 ° C for 2 hours; the ligation product is used to transform competent E. coli bacteria.
  • the plasmid obtained is called pBOc.
  • the humanized V ⁇ region of K20 was amplified by PCR using: as template, the DNA of the phage M13HuVKK20PCRl described in Example 2 above, - - an OPP-SoVK primer (3 '), the sequence of which is the next one:
  • VKK20Hu 5 '
  • VKK20Hu 5 ' (SEQ ID NO: 16): 5' - GAC ATC GAG CTC ACC CAG- 3 '(Sacl site underlined)
  • Amplification was performed in 30 successive incubation cycles at 95 ° C for 30 seconds, 40 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, then was followed by incubation at 72 ° C for 10 seconds. minutes.
  • the plasmid DNA of the selected clone is prepared, digested with Sac1 and Xhol, and the Sacl-Xhol fragment of 303 bp is purified.
  • the SacI-Xhol fragment is introduced into pBCK.
  • the composition of the ligation mixture is as follows:
  • the incubation is carried out at 16 ° C for 8 hours then the ligation product is used to transform competent E. coli bacteria.
  • a clone containing the plasmid pBCK-V ⁇ K20hu is selected, which will be used as a transfer vector.
  • 651-654 is derived from a plasmid into which the EcoRI-P fragment of the baculovirus AcMNPV containing the plO gene has been cloned. Almost all of the coding sequence has been deleted and replaced by a BglII site allowing the insertion of sequences to be expressed under the control of the p10 promoter.
  • b- Signal peptide The coding sequence of this peptide is that of a mouse V H gene (NEUBERGER MS., 1983. EMBO J, 2, 1373-1378). It has been chemically synthesized in the form of complementary strands, so that it can be inserted into a BglII site.
  • c- Human constant regions (C ⁇ l): The cDNA of the coding sequence of the human C ⁇ l region was amplified by PCR using the following primers: * HuC ⁇ lBAC (SEQ ID NO: 17):
  • This primer includes a Kpnl site.
  • HuC ⁇ lFOR SEQ ID NO: 18: 5 '-GAAGATC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA G-3' (BglII site underlined).
  • the primer makes it possible to reconstitute, after amplification, a BglII site downstream of the stop codon.
  • the template used to amplify the human C ⁇ l region is the same mixture of cDNAs as that used for the amplification of the CK sequences.
  • the amplification product was sequenced and cloned into the transfer vector pGml6 carrying the sequence coding for the signal peptide.
  • the construction obtained was called pBC ⁇ l.
  • the humanized VJJ variable region of K20 was amplified by PCR using:
  • the VHFOR primer differs from the VH1FOR primer in that a C has been replaced by an A to create a site
  • a Pstl-Kpnl digestion of the amplification fragment obtained was carried out and the fragment obtained was inserted between the Pstl and Kpnl sites of the plasmid pBLUESCRIPT IIKS; the ligation product is used to transform competent E. coli bacteria.
  • the plasmid DNA of the selected clone is prepared, digested with Pstl and Kpn11. and the Pstl- fragment
  • Kpnl of 327 bp is purified.
  • the loaded plasmid pBC ⁇ i-VHK20hu was used in cotransfection with the DNA of a modified baculovirus called AcSLplO [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664-2671
  • the cotransfection conditions are as follows: 500 ng of viral DNA are mixed with 5 ⁇ g of plasmid DNA and 40 ⁇ l of DOTAP solution (BOEHRINGER) in 3 ml of culture medium without serum for insect cells. This mixture is used to cover 4 x 10 6 Sf9 cells (ATCC35CRL 1711); after 4 hours of contact, the cotransfection mixture is replaced with 4 ml of complete medium and the incubation is carried out at 27 ° C. for 5 days.
  • the virus producing the heavy chain of the humanized K20 antibody under the control of the PlO promoter was purified by the lysis plaque technique. This virus was called bPPl- HK20hu. b- Insertion of the light chain:
  • the loaded plasmid pBC ⁇ -V ⁇ K20hu was used in cotransfection with the DNA of the modified baculovirus bPPl-HK20hu.
  • the double recombinants were selected by the technique of limiting dilution, associated with ELISA.
  • 33LK20hu (III) was amplified by a series of passages on cultured insect cells. The viral stock was then used to infect a culture shaken in a spinner (500 ml of culture with 10 6 cells per ml).
  • the culture After 72 hours of infection, the culture is harvested and centrifuged at 1000 g to clarify the supernatant. The latter was concentrated to 1/3 of its initial volume by centrifugation through a membrane having a cutoff threshold of 30 kDa (CENTRIPEP 30, Amicon) (1st centrifugation: 1000g, 20 ° C, 30 minutes; elimination of the filtrate; 2nd centrifugation: 1000g, 20 ° C, 20 minutes).
  • the solution was equilibrated in a protein A binding buffer, by dilution in this buffer followed by a new concentration by centrifugation (dilution buffer: Glycine 1.5M, 3M NaCl; pH 8.9).
  • the balanced solution is then passed through a protein A column, which is itself balanced in the same buffer as the Hu-K20 solution.
  • the antibody is eluted with an elution buffer (0.1M acetate, 0.5M NaCl; pH3).
  • the elution is followed by measuring the OD at 280 nm.
  • the fractions containing the antibody were mixed and concentrated by centrifugation through a membrane having a cutoff threshold of 10 kDa
  • the concentrated solution is diluted with PBS and then reconcentrated in the same way.
  • the antibody solution obtained is stored at + 4 ° C in PBS (137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na 2 HPO 4 -7H 2 0; 1.4 mM KH 2 P0 4 .
  • the quality of the antibody was checked by polyacrylamide-SDS gel electrophoresis, using a commercial human IgG1 (SIGMA) as control. This experiment showed that the antibody unreduced chimera (intact disulfide bridges) migrates at the same level as the control human antibody.
  • DTT dithiotreitol
  • the proteins of the fractions comprising the antibody were transferred onto a nitrocellulose membrane, and the H and L chains were detected by antibodies specific for the human C ⁇ l and CK region.
  • the selected virus AclOHK20hu-33LK20hu (lll) is multiplied on Sf9 insect cells in TGV2 medium
  • the concentration of antibody produced and secreted is evaluated by ELISA; it is approximately 10 mg / l.
  • CD29 receptor located on the surface of lymphocytes.
  • K20 The binding of K20 to the CD29 molecule inhibits the proliferation of activated human T4 lymphocytes [GROUX et al., Nature, 339, 152-154, (1989)].
  • the suppressive effect of K20 on T cell proliferation makes it possible to envisage the use of this antibody in the prevention of transplant rejection.
  • CD29 were fixed on a glass slide and then incubated in the presence of Hu-K20 produced in accordance with the invention, parental murine K20, or buffer alone.
  • the cell lines used are:
  • the lymphocytes come from healthy voluntary donors (ARNAUD TZANCK Blood Transfusion Center, Saint Laurent du Var). The mononuclear cells are recovered after centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient (EUROBIO, France). Monocytes are removed by two one hour adhesion cycles on plastic at 37 ° C. Among the non-adherent cells thus obtained, residual monocytes, NK cells and B lymphocytes are eliminated by immunomagnetic selection using monoclonal antibodies directed against specific surface markers of these cell types and magnetic beads covered with goat anti-mouse immunoglobulin antibody (DYNABEADS, DYNAL, Norway). Lymphocyte purity is checked by checking the phenotype.
  • erythrocytes are obtained from the thymus of children (4 months to 5 years) undergoing cardiological interventions at the Cardio-thoracic Center of Monaco.
  • the residual erythrocytes are optionally removed by centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient.
  • the cells (1x10 e ) are washed twice in PBS (140 mM NaCl, 3 mM KC1, Na 2 HP ⁇ 4 6 M, KH P ⁇ 4 l M, pH 7.4) 0.1% BSA (fraction V, BOEHRINGER), 0 , 1% NaN3. They are then incubated with a first antibody in a final volume of 100 ⁇ l for 30 min. at 4 ° C. After two washes, the cells are incubated in the same way with the second antibody, then at again washed twice. The cells are then fixed at the final concentration of 1x10 6 , in 500 ⁇ l of PBS 1% formaldehyde. II. RESULTS 1. Determination of dose-response curves in flow cytometry and tissue distribution.
  • JURKAT E6-1, HPB-A11, RAJI, 88/66, thymocytes and human peripheral T lymphocytes cells are incubated with increasing concentrations (0.01 to 30 ⁇ g / ml) of each of the two murine and humanized K20 antibodies .
  • RAM-FITC fluorescein conjugated F (ab ') 2 fragment of rabbit immunoglobulin to mouse immunoglobulin (DAKOPATTS, Denmark) at a dilution of 1/100 or RAHu- FITC (Fluorescein conjugated rabbit immunoglobulin to human IgA, IgG, IgM, DAKOPATTS, Denmark) or GAHu-FITC (fluorescein conjugated F (ab ') 2 fragment of goat immunoglobulin to human immunoglobulin (TEBU, France) diluted to 1/100.
  • RAM-FITC fluorescein conjugated F (ab ') 2 fragment of rabbit immunoglobulin to mouse immunoglobulin (DAKOPATTS, Denmark) at a dilution of 1/100
  • RAHu- FITC Fluorescein conjugated rabbit immunoglobulin to human IgA, IgG, IgM, DAKOPATTS, Denmark
  • GAHu-FITC fluorescein conjugated F (ab
  • the two antibodies Mu-K20 and Hu-K20 bind to all the cell types tested with a saturating concentration close to 0.3 ⁇ g / ml, except on the line B 88/66 which does not express ⁇ l-integrin.
  • the labeling observed only in the case of the humanized K20 antibody on the 88/66 cells is due to the fixation of GAHu-FITC which recognizes the surface immunoglobulins constitutively present on the surface of these B cells. This fixation is not observed in the case of Raji cells, since these were presaturated before labeling with rabbit immunoglobulins anti-human immunoglobulins. 2. Locking of the fixing of the murine K20.
  • JURKAT E6-1 cells are incubated with increasing concentrations (from 0.01 to 30 ⁇ g / ml), murine (Mu-K20) or humanized (Hu-K20) antibody K20, or human IgG1 immunoglobulins (SIGMA, France). After washing, the cells are incubated with a saturated concentration of K20-FITC (IMMUNOTECH, France) of 8 ⁇ l in a final volume of 100 ⁇ l.
  • K20-FITC IMMUNOTECH, France
  • Humanized K20 clearly recognizes the same epitopes as murine K20 since it specifically blocks the fixation of murine K20.
  • For each of the two antibodies Mu-K20 and Hu-K20 when the cells are incubated with a concentration of l ⁇ g / ml, it is noted that there are no longer any sites available for the fixation of the murine K20 coupled to the FITC. This is correlated with the value of the saturation concentration determined previously.
  • Jurkat E6-1 cells are incubated with a saturated concentration of K20-FITC (IMMUNOTECH, France) in a final volume of 100 ⁇ l. After washing, the cells are incubated with increasing concentrations (0.01 to 30 ⁇ g / ml) of each of the murine (Mu-K20) or humanized (Hu-K20) or human immunoglobulin IgG1 antibodies (SIGMA, France) .
  • FIG. 6 shows that the murine and humanized K20 monoclonal antibodies displace the binding of the murine K20 coupled to the FITC, which is not observed for human immunoglobulins of the same subclass as the humanized antibody. . 50% of the displacement is reached for a concentration of Mu-K20 or Hu-K20 antibodies of the order of 30 ⁇ g / ml.
  • Peripheral blood T cells come from healthy voluntary donors (ARNAUD TZANCK Blood Transfusion Center, Saint Laurent du Var). The mononuclear cells are recovered after centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient (EUROBIO, France). Monocytes are removed by two one hour adhesion cycles on plastic at 37 ° C. Among the non-adherent cells thus obtained, the residual monocytes, NK cells and B lymphocytes are eliminated by immunomagnetic selection using different monoclonal antibodies and magnetic beads coated with goat anti-mouse immunoglobulin antibody (DYNABEADS , DYNAL, Norway). Lymphocyte purity is controlled by phenotyping.
  • a CD3 monoclonal antibody (10 ⁇ g / ml) (X35, Dr MARTIN, Rennes) is immobilized on plastic in 96-well plates in which T lymphocytes are cultured at the rate of 50,000 cells per well in a final volume of 200 ⁇ l of RPMI 1640 , 10% SVF.
  • Interleukin 2 (10 ng / ml) (R AND D SYSTEM, GB) and various dilutions of antibodies Mu-K20, Hu-K20 and human Ig controls are added to the wells. After 96 hours of culture at 37 ° C., 1 mCi of [ 3 H] thymidine is added per well.
  • Fibronectin and bovine albumin 50 ⁇ g / ml (SIGMA) are immobilized in 96-well plates, where JURKAT cells are incubated beforehand loaded with a fluorescent probe, BCECF
  • the region of residues 207 to 218 of the integrin ⁇ i chain is critical for the binding of the antibody 4B4; This region is located between the two putative ligand binding sites (residues 120-182 and 220-231).
  • the murine K20 antibody recognizes the carboxy-terminal region of ⁇ 1 (residues 426-587) (TAKADA and PUZON, 1993, J. Biol. Chem. 17597-17601). 3. Measurement of the cytotoxicity induced by the complement.
  • the cells After labeling with one or other of the two antibodies Mu-K20 or Hu-K20, the cells are incubated with rabbit complement for 50 min. at room temperature. After washing, the number of dead cells / number of living cells after staining with Trypan Blue is determined.
  • the murine antibody D66 (CD2) is used as a positive control.

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Abstract

Variable domains of a non-human immunoglobulin are humanised by selecting DNA sequences coding for the variable domains of a human immunoglobulin wherein the amino acid sequence of the framework regions of variable domains VH and VL is 70-95 % homologous with the amino acid sequence of the framework regions of variable domains VH and VL of non-human immunoglobulin, and wherein hypervariable loops H1 and H2 or L1, L2 and L3 have the same kind of canonical structure as hypervariable loops H1 and H2 or L1, L2 and L3, respectively, of non-human immunoglobulin, and by replacing the oligonucleotide sequences coding for the CDRs of human immunoglobulin with oligonucleotide sequences coding for the corresponding CDRs of non-human immunoglobulin. The cloning, in a baculovirus, of DNA fragments that code for said humanised variable domains, and the expression of the resulting humanised recombinant antibody, are also disclosed. Murine monoclonal antibody K20 has thus been humanised and expressed according to the Invention.

Description

ANTICORPS HUMANISE DIRIGE CONTRE LA CHAINE BETA 1 DES INTEGRINES HUMANIZED ANTIBODIES DIRECTED AGAINST THE BETA 1 CHAIN OF INTEGRINS
La présente Invention est relative à l'obtention en cellules d'insecte, d'un anticorps monoclonal recombinant humanisé.The present invention relates to obtaining, in insect cells, a humanized recombinant monoclonal antibody.
L'anticorps monoclonal K20 est un anticorps murin qui reconnaît la sous-unité βl (CD29) des intégrines. Des expérimentations in vi tro ont montré que K20 pouvait inhiber l'activation et la prolifération des lymphocytes T périphériques induite par un anticorps anti-CD3 [GROUX et al., Nature, 339, 152-154 (1989) ; TICCHIONI et al., J.Immunol . , 151, 119-127 (1993)] . Il pourrait donc être envisagé d'utiliser cet anticorps dans le cadre d'une thérapeutique immunosuppressive.The monoclonal antibody K20 is a murine antibody which recognizes the β1 (CD29) subunit of integrins. In vi tro experiments have shown that K20 can inhibit the activation and proliferation of peripheral T lymphocytes induced by an anti-CD3 antibody [GROUX et al., Nature, 339, 152-154 (1989); TICCHIONI et al., J. Immunol. , 151, 119-127 (1993)]. It could therefore be considered using this antibody as part of immunosuppressive therapy.
Cependant, l'utilisation d'anticorps murins en thérapeutique humaine est très limitée, car les injections répétées d'anticorps non-humains induisent chez les patients une réponse immune qui empêche un traitement au long cours.However, the use of murine antibodies in human therapy is very limited, since repeated injections of non-human antibodies induce in patients an immune response which prevents long-term treatment.
Afin d'éviter cet inconvénient il a été proposé de fabriquer par génie génétique des anticorps recombinants, dans lesquelles la plus grande partie possible de la molécule est dérivée d'un gène d'origine humaine.In order to avoid this drawback, it has been proposed to make recombinant antibodies by genetic engineering, in which as much of the molecule as possible is derived from a gene of human origin.
Il a ainsi été obtenu des anticorps dits chimériques, dans lesquels seuls les parties variables sont d'origine non-humaine.So-called chimeric antibodies were obtained in which only the variable parts are of non-human origin.
Pour réduire encore les risques de réponse immune, on cherche actuellement de plus en plus à obtenir des anticorps dits humanisés, dont les séquences des parties variables non directement impliquées dans la reconnaissance de l'antigène sont remplacées par des séquences d'origine humaine. L'humanisation d'un anticorps non-humain implique donc de déterminer avec le plus de précision possible quels sont les résidus d'acides aminés de l'anticorps non-humain qui sont impliqués dans la reconnaissance de l'antigène (et qui doivent être conservés dans l'anticorps humanisé) , et quels sont ceux qui au contraire, peuvent être remplacés pour reproduire les séquences d'un anticorps humain, sans affecter ou en affectant le moins possible, la reconnaissance de 1 'antigène.To further reduce the risks of immune response, there is an increasing search at present for obtaining so-called humanized antibodies, the sequences of the variable parts of which are not directly involved in the recognition of the antigen are replaced by sequences of human origin. The humanization of a non-human antibody therefore involves determining with the greatest precision possible what are the amino acid residues of the non-human antibody which are involved in the recognition of the antigen (and which must be preserved in the humanized antibody), and which ones can, on the contrary, be replaced to reproduce the sequences of a human antibody, without affecting or affecting as little as possible, the recognition of the antigen.
La reconnaissance de l'antigène implique en particulier les régions des parties variables dénommées CDR (régions déterminant la complémentarité) , mais il a également été constaté que le positionnement de certains résidus d'acides aminés des régions de charpente (régions FR) pouvaient également influencer la conformation du site antigénique.The recognition of the antigen involves in particular the regions of the variable parts called CDR (regions determining the complementarity), but it was also noted that the positioning of certain amino acid residues of the framework regions (FR regions) could also influence conformation of the antigenic site.
La présente Invention a pour but l'humanisation de l'anticorps murin K20, et l'expression de l'anticorps humanisé ainsi obtenu dans un système vecteur/hôte approprié. Pour humaniser l'anticorps K20, la séquence en acides aminés des régions variables VJJ et VL de cet anticorps a tout d'abord été déterminée, ce qui permet de localiser les CDR. Classiquement, en effet, l'humanisation d'un anticorps s'effectue en greffant ses CDR à la place des CDR d'un anticorps humain.The aim of the present invention is to humanize the murine antibody K20, and to express the humanized antibody thus obtained in an appropriate vector / host system. To humanize the antibody K20, the amino acid sequence of the VJJ and V L variable regions of this antibody was first determined, which makes it possible to locate the CDRs. Conventionally, in fact, the humanization of an antibody is carried out by grafting its CDRs in place of the CDRs of a human antibody.
Les Inventeurs ont eu 1 ' idée de déterminer en outre, à partir de la séquence des régions variables de K20, le type de structure canonique des boucles hypervariables Ll, L2, L3, Hl et H2. Les structures canoniques, qui ont été observées pour la plupart des boucles hypervariables (à l'exception de la boucle H3) , et qui sont conservées entre différentes espèces, sont déterminées par un petit nombre de résidus clés des régions FR et des CDR : différents types de structures canoniques ont été définis, selon la taille de la boucle, et la nature des résidus acides aminés qu'elle comprend [CHOTIA et LESK, J. Mol. Biol., 196(4), p 901, (1987) ; CHOTIA et al., Nature, 342, p 877, (1989) ,• CHOTIA et al., J. Mol. Biol. ,227(3) , p799, (1992)] . Les Inventeurs ont ensuite sélectionné des régions VH et VL humaines dont la séquence en acides aminés présente une forte homologie (de préférence entre 74 et 95 % d'homologie) avec la séquence des régions Vfj et VL de l'anticorps murin K20, et dont les boucles hypervariables Ll, L2, L3, Hl et H2 présentent le même type de structure canonique que les boucles hypervariables correspondantes dudit anticorps murin.The inventors have had the idea of determining in addition, from the sequence of the variable regions of K20, the type of canonical structure of the hypervariable loops L1, L2, L3, H1 and H2. The canonical structures, which have been observed for most of the hypervariable loops (with the exception of the H3 loop), and which are conserved between different species, are determined by a small number of key residues from the FR regions and the CDRs: different types of canonical structures were defined, according to the size of the loop, and the nature of amino acid residues it comprises [CHOTIA and LESK, J. Mol. Biol., 196 (4), p 901, (1987); CHOTIA et al., Nature, 342, p 877, (1989), • CHOTIA et al., J. Mol. Biol. , 227 (3), p799, (1992)]. The inventors then selected human V H and V L regions whose amino acid sequence has a high homology (preferably between 74 and 95% homology) with the sequence of the Vfj and VL regions of the murine antibody K20, and whose hypervariable loops L1, L2, L3, Hl and H2 have the same type of canonical structure as the corresponding hypervariable loops of said murine antibody.
Dans les régions Vg et V humaines ainsi sélectionnées, les Inventeurs ont alors procédé au remplacement des CDR par les CDR correspondantes de l'anticorps murin K20, afin d'obtenir les régions VH et VL de l'anticorps humanisé.In the human Vg and V regions thus selected, the inventors then replaced the CDRs with the corresponding CDRs of the murine antibody K20, in order to obtain the VH and VL regions of the humanized antibody.
Le procédé décrit ci-dessus peut être généralisé à l'humanisation des régions variables de tout anticorps monoclonal d'origine non-humaine, en particulier d'origine murine.The process described above can be generalized to the humanization of the variable regions of any monoclonal antibody of non-human origin, in particular of murine origin.
La présente Invention a pour objet un procédé d'humanisation de la région variable Vy et/ou de la région variable Vj_, d'une immunoglobuline non-humaine, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :The subject of the present invention is a method for humanizing the variable region Vy and / or the variable region V j _, of a non-human immunoglobulin, which method is characterized in that it comprises at least the following steps :
- une étape où l'on sélectionne une séquence d'ADN codant pour la région variable V∑j ou pour la région variable VL d'une immunoglobuline humaine, la séquence en acides aminés des régions FR de ladite région VJJ ou de ladite région VL humaine présentant respectivement entre 70 et 95 % d'homologie avec la séquence en acides aminés des régions FR de la région Vpj ou de la région VL de l'immunoglobuline non-humaine, et les boucles hypervariables Hl et H2 de ladite région VH humaine ou les boucles hypervariables Ll, L2 et L3 de ladite région VL humaine présentant respectivement le même type de structure canonique que les boucles hypervariables Hl et H2 de la région VH ou les boucles hypervariables Ll, L2 et L3 de la région VL de l'immunoglobuline non-humaine - une étape où l'on procède au remplacement des séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR de ladite région Vβ ou VL humaine, par les séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR correspondantes de la région VJJ ou VL de l'immunoglobuline non-humaine. A l'issue de cette étape, on obtient une séquence codant pour la région Vy ou VL de l' immunoglobuline humanisée.a step in which a DNA sequence coding for the variable region V ∑ j or for the variable region V L of a human immunoglobulin is selected, the amino acid sequence of the FR regions of said VJJ region or of said region Human VL having respectively between 70 and 95% homology with the amino acid sequence of the FR regions of the Vpj region or of the V L region of the non-human immunoglobulin, and the hypervariable loops Hl and H2 of said region V Human H or the hypervariable loops L1, L2 and L3 of said region Human VL with the same type of canonical structure as the H1 and H2 hypervariable loops of the V H region or the L1, L2 and L3 hypervariable loops of the V L region of non-human immunoglobulin, respectively - a step where proceeds to replace the oligonucleotide sequences coding for the CDRs of said human Vβ or V L region , by the oligonucleotide sequences coding for the corresponding CDRs of the VJJ or VL region of non-human immunoglobulin. At the end of this step, a sequence coding for the Vy or VL region of humanized immunoglobulin is obtained.
Le procédé conforme à l' Invention peut être complété par la mutation ponctuelle (remplacement, addition ou délétion d'un codon) d'une ou plusieurs séquences oligonucléotidiques codant pour un ou plusieurs acides aminés situés dans les FR de la région VJJ ou VL.The process according to the invention can be completed by the point mutation (replacement, addition or deletion of a codon) of one or more oligonucleotide sequences coding for one or more amino acids located in the FRs of the VJJ or V L region. .
Une telle mutation peut par exemple être effectuée dans le cas où la séquence en acides aminés de la région VH ou de la région VL humaine qui a été sélectionnée pour son homologie avec la région VJJ ou VL non-humaine, présente, à une position déterminée, un acide aminé "inhabituel" pour le sous-groupe de variabilité auquel elle appartient. Il peut être alors opportun de remplacer cet acide aminé par un acide aminé plus représentatif. De manière générale, on cherchera à se rapprocher autant que possible des séquences consensus des FRs du sous-groupe humain le plus homologue, afin de réduire encore l' immunogénicité de l'anticorps humanisé.Such a mutation can for example be carried out in the case where the amino acid sequence of the V H region or of the human V L region which has been selected for its homology with the non-human VJJ or VL region, present, at a determined position, an "unusual" amino acid for the variability subgroup to which it belongs. It may then be appropriate to replace this amino acid with a more representative amino acid. In general, we will try to get as close as possible to the consensus sequences of the FRs of the most homologous human subgroup, in order to further reduce the immunogenicity of the humanized antibody.
Il peut également être indiqué de procéder à une telle mutation lorsque l'on souhaite augmenter l'affinité de l'anticorps humanisé pour l'antigène ,- on cherchera dans ce cas là à se rapprocher de la structure canonique des boucles hypervariables de l'immunoglobuline non-humaine parentale. La présente Invention a également pour objet un fragment d'ADN, codant pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'un anticorps humanisé, et caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé conforme à l'invention, tel que défini ci- dessus. Un fragment d'ADN codant pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'un anticorps humanisé conformément à l' invention peut ensuite être fusionné avec un fragment d'ADN codant pour la région constante d'une chaîne H ou L humaine, en vue d'exprimer les chaînes H et L complètes obtenues de la sorte.It may also be advisable to carry out such a mutation when it is desired to increase the affinity of the humanized antibody for the antigen, - in this case we will seek to approximate the canonical structure of the hypervariable loops of the parental non-human immunoglobulin. The present invention also relates to a DNA fragment, coding for the variable region V H or for the variable region VL of a humanized antibody, and characterized in that it is capable of being obtained by the method according to the invention, as defined above. A DNA fragment coding for the V H variable region or for the VL variable region of a humanized antibody according to the invention can then be fused with a DNA fragment coding for the constant region of an H or L chain. human, in order to express the complete H and L chains obtained in this way.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit anticorps humanisé est obtenu à partir de l'anticorps murin K20. Dans ce qui suit, on désignera un anticorps humanisé obtenu par le procédé conforme à l'Invention par l'abréviation Hu-Ac, et plus particulièrement, l'anticorps humanisé dérivé de l'anticorps K20, par l'abréviation Hu-K20.According to a preferred embodiment of the present invention, said humanized antibody is obtained from the murine antibody K20. In the following, a humanized antibody obtained by the process according to the invention will be designated by the abbreviation Hu-Ac, and more particularly, the humanized antibody derived from the antibody K20, by the abbreviation Hu-K20.
La présente Invention a pour objet un fragment d'ADN, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par :The present invention relates to a DNA fragment, characterized in that it is chosen from the group consisting of:
- une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac, fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine ; ou - une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac, fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine.a sequence coding for the variable domain of the light chain of the Hu-Ac antibody, fused to a sequence coding for the constant domain of the light chain of a human immunoglobulin; or - a sequence coding for the variable domain of the heavy chain of the Hu-Ac antibody, fused to a sequence coding for the constant domain of the heavy chain of a human immunoglobulin.
Pour exprimer un anticorps humanisé conforme à l'Invention, on utilisera de préférence un système d'expression qui a également été mis au point par les Inventeurs, qui utilise un vecteur d'expression dérivé d'un baculovirus, et permet de produire à la fois la chaîne lourde (H) et la chaîne légère (L) d'un anticorps donné dans une cellule d'insecte. La présente Invention a également pour objet une cassette d'expression comprenant une séquence d'ADN recombinant constituée par une séquence codant pour la région variable de la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine ; ou par une séquence codant pour la région variable de la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac fusionnée à une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine, laquelle séquence d'ADN recombinant est placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.To express a humanized antibody in accordance with the invention, use will preferably be made of an expression system which has also been developed by the inventors, which uses an expression vector derived from a baculovirus, and makes it possible to produce both the heavy chain (H) and the light chain (L) of a given antibody in an insect cell. The present invention also relates to an expression cassette comprising a recombinant DNA sequence constituted by a sequence coding for the variable region of the light chain of the Hu-Ac antibody fused to a sequence coding for the constant domain of the light chain of a human immunoglobulin; or by a sequence coding for the variable region of the heavy chain of the Hu-Ac antibody fused to a sequence coding for the constant domain of the light chain of a human immunoglobulin, which recombinant DNA sequence is placed under transcriptional control. an appropriate promoter.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, ledit promoteur est un promoteur de baculovirus .According to a preferred embodiment of the present invention, said promoter is a baculovirus promoter.
A titre d'exemple de promoteurs de baculovirus utilisables pour la mise en oeuvre de la présente Invention, on citera les promoteurs de la polyédrine et de P10 des baculovirus AcMNPV ou S1MNPV, ou des dérivés de promoteurs de baculovirus, constitués par des promoteurs synthétiques ou recombinants, obtenus à partir d'un promoteur de baculovirus, et fonctionnels en cellules d'insectes, tel que par exemple celui décrit par WANG et al, [Gène, 100, 131-137, (1991)] . Une cassette d'expression conforme à ce mode de réalisation comprend par exemple.By way of example of baculovirus promoters which can be used for the implementation of the present invention, mention will be made of polyhedrin and P10 baculovirus promoters AcMNPV or S1MNPV, or derivatives of baculovirus promoters, constituted by synthetic promoters or recombinants, obtained from a baculovirus promoter, and functional in insect cells, such as for example that described by WANG et al, [Gene, 100, 131-137, (1991)]. An expression cassette according to this embodiment comprises for example.
- un promoteur de baculovirus, tel que défini ci-dessus ; une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion- a baculovirus promoter, as defined above; a sequence coding for a secretory signal peptide
- une séquence d'ADN codant pour la chaîne H ou la chaîne L d'un anticorps HU-Ac, tel que défini ci- dessus.a DNA sequence coding for the H chain or the L chain of an HU-Ac antibody, as defined above.
Un grand nombre de séquences codant pour des peptides signal fonctionnels en cellules d'insecte sont utilisables pour la mise en oeuvre de la présente Invention. A titre d'exemple non limitatif, on citera les séquences codant pour les peptides signal de 1 ' acétylcholinestérase de Drosophile, de la trophoblastine ovine, ainsi que les séquences codant pour les peptides signal des chaînes H et L d' immunoglobulines murines ou humaines, etc ..A large number of sequences coding for signal peptides functional in insect cells can be used for the implementation of the present Invention. By way of nonlimiting example, mention will be made of the sequences coding for the signal peptides of Drosophila acetylcholinesterase, of ovine trophoblastin, as well as the sequences coding for the signal peptides of the H and L chains of murine or human immunoglobulins, etc.
Chacune des cassettes conformes à 1 ' invention permet l'expression, soit de la chaîne légère, soit de la chaîne lourde, d'un anticorps Hu-Ac, possédant la spécificité de 1 ' anticorps monoclonal parental .Each of the cassettes according to the invention allows the expression, either of the light chain or of the heavy chain, of an Hu-Ac antibody, having the specificity of the parental monoclonal antibody.
On peut choisir la séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère parmi les séquences codant pour les domaines constants des chaînes légères kappa (K) et lambda (λ) . On peut choisir la séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde parmi les séquences codant pour les domaines constants des chaînes lourdes γl, γ2, γ3, γ4, α, ε, etμ. On peut ainsi obtenir un anticorps recombinant appartenant à la classe d' immunoglobuline (IgGl, lgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM) que l'on souhaite.The sequence coding for the constant domain of the light chain can be chosen from the sequences coding for the constant domains of the light chains kappa (K) and lambda (λ). The sequence coding for the constant domain of the heavy chain can be chosen from the sequences coding for the constant domains of the heavy chains γl, γ2, γ3, γ4, α, ε, andμ. It is thus possible to obtain a recombinant antibody belonging to the immunoglobulin class (IgG1, lgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM) which is desired.
La présente Invention a également pour objet des vecteurs recombinants, portant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus ,- dans ce cadre, la présente Invention englobe en particulier des baculovirus recombinants permettant l'expression de l'anticorps Hu-Ac, ainsi que des plasmides de transfert permettant la construction desdits baculovirus recombinants . Les plasmides de transfert conformes à l'invention portent un insert comprenant : une cassette d'expression telle que définie ci-dessus, et de part et d'autre de cette cassette, des séquences de baculovirus homologues de celles des régions flanquant la portion du génome viral en remplacement de laquelle on souhaite insérer ladite cassette. gThe present invention also relates to recombinant vectors, carrying at least one expression cassette as defined above, - in this context, the present invention includes in particular recombinant baculoviruses allowing the expression of the antibody Hu- Ac, as well as transfer plasmids allowing the construction of said recombinant baculoviruses. The transfer plasmids in accordance with the invention carry an insert comprising: an expression cassette as defined above, and on either side of this cassette, baculovirus sequences homologous to those of the regions flanking the portion of the viral genome to replace which one wishes to insert said cassette. g
Selon un mode de réalisation préféré des plasmides de transfert conformes à la présente Invention, lesdites séquences de baculovirus sont homologues de celles des régions flanquant le gène de la plO, ou homologues de celles des régions flanquant le gène de la polyédrine.According to a preferred embodiment of the transfer plasmids in accordance with the present invention, said baculovirus sequences are homologous to those of the regions flanking the p10O gene, or homologous to those of the regions flanking the polyhedrin gene.
Selon une disposition particulièrement avantageuse de ce mode de réalisation, la cassette d'expression contenant le gène codant pour la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac est flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, et la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac est flanquée des régions entourant le gène PlO dans le baculovirus sauvage.According to a particularly advantageous arrangement of this embodiment, the expression cassette containing the gene coding for the light chain of the Hu-Ac antibody is flanked by the regions surrounding the polyhedrin gene in wild baculovirus, and the cassette d The expression carrying the gene coding for the heavy chain of the Hu-Ac antibody is flanked by the regions surrounding the PlO gene in the wild baculovirus.
Schématiquement, la construction des plasmides de transfert conformes à l'invention se fait en insérant dans un plasmide capable de se répliquer chez un hôte bactérien (en général E. coli ) , la région du gène de baculovirus (par exemple plO ou polyédrine, ou tout autre locus du baculovirus) à la place duquel on souhaite insérer les gènes codant pour les chaînes H ou L d'immunoglobuline. Dans cette région, la séquence codante du gène de baculovirus (et éventuellement la séquence promoteur dudit gène) est remplacée par la séquence codant pour la chaîne d'immunoglobuline à exprimer (et éventuellement par la séquence du promoteur sous contrôle duquel on souhaite exprimer cette chaîne d' immunoglobuline, s'il s'agit par exemple d'un promoteur "dérivé") . Le plasmide de transfert ainsi obtenu contient donc un insert comprenant une séquence hétérologue (séquence d'une chaîne de l'anticorps Hu-Ac) flanquée de séquences de baculovirus.Schematically, the construction of the transfer plasmids in accordance with the invention is done by inserting into a plasmid capable of replicating in a bacterial host (in general E. coli), the region of the baculovirus gene (for example plO or polyhedrin, or any other baculovirus locus) in place of which it is desired to insert the genes coding for the H or L chains of immunoglobulin. In this region, the coding sequence of the baculovirus gene (and possibly the promoter sequence of said gene) is replaced by the sequence coding for the immunoglobulin chain to be expressed (and optionally by the promoter sequence under whose control it is desired to express this chain. immunoglobulin, if it is for example a "derivative" promoter). The transfer plasmid thus obtained therefore contains an insert comprising a heterologous sequence (sequence of a chain of the Hu-Ac antibody) flanked by baculovirus sequences.
Pour permettre l'expression simultanée de la chaîne lourde (chaîne H) et de la chaîne légère (chaîne L) et leur réassociation pour former la molécule d'anticorps recombinant, les Inventeurs ont inséré les deux cassettes sur un même vecteur d'expression. Ils ont ainsi obtenu un baculovirus double recombinant dans lequel la séquence codante de chacune des chaînes H et L est sous le contrôle d'un promoteur fort.To allow the simultaneous expression of the heavy chain (H chain) and the light chain (L chain) and their reassociation to form the molecule of recombinant antibodies, the inventors inserted the two cassettes on the same expression vector. They thus obtained a recombinant double baculovirus in which the coding sequence of each of the H and L chains is under the control of a strong promoter.
Un baculovirus recombinant conforme à l'Invention, permettant l'expression de l'anticorps Hu- Ac, peut être construit selon le principe suivant :A recombinant baculovirus in accordance with the invention, allowing the expression of the Hu-Ac antibody, can be constructed according to the following principle:
- 1 ' on prépare séparément deux plasmides de transfert, tels que définis ci-dessus : un pour la chaîne H, et un pour la chaîne L.- One prepares separately two transfer plasmids, as defined above: one for the H chain, and one for the L chain.
On cotransfecte ensuite les cellules d'insecte avec 1 'ADN des vecteurs de transfert ainsi réalisés et l 'ADN du baculovirus. Cette cotransfection est effectuée en deux étapes :The insect cells are then cotransfected with the DNA of the transfer vectors thus produced and the DNA of the baculovirus. This cotransfection is carried out in two stages:
Le plasmide de transfert contenant la cassette d'expression pour le gène de la chaîne légère flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, est utilisé, avec l'ADN de baculovirus sauvage AcMNPV, pour cotransfecter des cellules d'insecte en culture.The transfer plasmid containing the expression cassette for the light chain gene flanked by the regions surrounding the polyhedrin gene in wild baculovirus, is used, with the wild baculovirus DNA AcMNPV, to cotransfect insect cells in culture.
Par recombinaison homologue entre l'ADN viral et le plasmide, les séquences codantes de la chaîne légère de 1 ' immunoglobuline recombinante sont transférées dans le génome viral .By homologous recombination between the viral DNA and the plasmid, the light chain coding sequences of the recombinant immunoglobulin are transferred into the viral genome.
Après réplication de l'ADN viral dans les cellules transfectées, l'on procède à la sélection des baculovirus recombinants ayant intégré la séquence de la chaîne légère de 1 ' immunoglobuline recombinante. Ces baculovirus recombinants sont sélectionnés selon deux critères : leur incapacité à produire des polyèdres et leur capacité à exprimer la chaîne légère.After replication of the viral DNA in the transfected cells, the recombinant baculoviruses which have integrated the light chain sequence of the recombinant immunoglobulin are selected. These recombinant baculoviruses are selected according to two criteria: their inability to produce polyhedra and their capacity to express the light chain.
Dans une deuxième étape, les cellules sont cotransfectées avec l'ADN du baculovirus recombinant obtenu à l'issue de la première étape, et avec celui du plasmide de transfert contenant la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de 1 ' anticorps recombinant Hu-Ac flanquée des régions entourant le gène PlO du baculovirus. Par recombinaison homologue, comme précédemment, le gène de la chaîne lourde est transféré dans l'ADN viral.In a second step, the cells are cotransfected with the DNA of the recombinant baculovirus obtained at the end of the first step, and with that of the transfer plasmid containing the expression cassette. carrying the gene coding for the heavy chain of the recombinant Hu-Ac antibody flanked by the regions surrounding the PlO gene of baculovirus. By homologous recombination, as before, the heavy chain gene is transferred into the viral DNA.
L'on sélectionne alors les virus double- recombinants qui sont capables de produire simultanément une chaîne lourde et une chaîne légère d' immunoglobuline. La détection de la chaîne lourde et de la chaîne légère d' immunoglobuline est effectuée par ELISA.One then selects the double-recombinant viruses which are capable of simultaneously producing a heavy chain and a light chain of immunoglobulin. The detection of the heavy chain and the light chain of immunoglobulin is carried out by ELISA.
La présente Invention a pour objet un baculovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression, telle que définie ci-dessus, comprenant une séquence codant tout ou partie de la chaîne H ou une séquence codant pour tout ou partie de la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, laquelle séquence est placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fort de baculovirus.The subject of the present invention is a recombinant baculovirus, characterized in that it comprises at least one expression cassette, as defined above, comprising a sequence coding all or part of the H chain or a sequence coding for all or part of the L chain of the Hu-Ac antibody, which sequence is placed under transcriptional control of a strong baculovirus promoter.
Selon un mode de réalisation d'un baculovirus recombinant conforme à 1 ' invention il comprend une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne H et une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne L, de l'anticorps Hu-Ac.According to one embodiment of a recombinant baculovirus according to the invention, it comprises an expression cassette comprising the sequence coding for the H chain and an expression cassette comprising the sequence coding for the L chain, of the antibody Hu -Ac.
Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, et le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, sont deux promoteurs différents. Selon une modalité avantageuse de cette disposition, l'un desdits promoteurs est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la polyédrine et 1 ' autre est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la PlO . Selon encore une autre modalité avantageuse de cette disposition, l'un des promoteurs est le promoteur de la polyédrine ou l'un de ses dérivés, et l'autre est le promoteur de la plO ou l'un de ses dérivés. Avantageusement, le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac est le promoteur de la polyédrine ou l'un de ses dérivés, et le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac est le promoteur de la PlO ou l'un de ses dérivés.According to a preferred arrangement of this embodiment, the promoter controlling the transcription of the sequence coding for the L chain of the Hu-Ac antibody, and the promoter controlling the transcription of the sequence coding for the H chain of the Hu antibody -Ac, are two different promoters. According to an advantageous modality of this provision, one of said promoters is located at the location occupied in the wild baculovirus, by the polyhedrin promoter and the other is located at the location occupied in the wild baculovirus, by the promoter of PlO. According to yet another advantageous modality of this arrangement, one of the promoters is the promoter of polyhedrin or one of its derivatives, and the other is the promoter of plO or one of its derivatives. Advantageously, the promoter controlling the transcription of the sequence encoding the light chain of the Hu-Ac antibody is the promoter of polyhedrin or one of its derivatives, and the promoter controlling the transcription of the sequence encoding the heavy chain of the Hu-Ac antibody is the promoter of PlO or one of its derivatives.
Selon une autre disposition de ce mode de réalisation, la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, et la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, sont deux séquences différentes.According to another arrangement of this embodiment, the sequence coding for the signal peptide associated with the L chain of the Hu-Ac antibody, and the sequence coding for the signal peptide associated with the H chain of the Hu-Ac antibody , are two different sequences.
Un baculovirus recombinant conforme à l'Invention, a été déposé le 9 septembre 1994, auprès de la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Micro¬ organismes, tenue par l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur ROUX, Paris), sous le numéro 1-1476.A recombinant baculovirus conforming to the invention was deposited on September 9, 1994, with the C.N.C.M. (National Collection of Cultures of Microorganisms, held by the Institut Pasteur, 25 rue du Docteur ROUX, Paris), under the number 1-1476.
La présente Invention englobe également des cellules d'insecte infectées avec un baculovirus recombinant conforme à l'invention.The present invention also encompasses insect cells infected with a recombinant baculovirus according to the invention.
L'expression et la production de l'anticorps monoclonal recombinant Hu-Ac est obtenue in vi tro dans des cellules d'insecte conformes à l'invention.The expression and production of the recombinant monoclonal antibody Hu-Ac is obtained in vitro in insect cells according to the invention.
L'infection des cellules par un baculovirus double recombinant conforme à l'Invention résulte dans la production simultanée des chaînes H et L. Ces chaînes s'assemblent pour reconstituer l'anticorps Hu-Ac qui est par la suite sécrété dans le milieu de culture.Infection of the cells with a double recombinant baculovirus in accordance with the invention results in the simultaneous production of the H and L chains. These chains come together to reconstitute the Hu-Ac antibody which is subsequently secreted in the culture medium. .
La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un anticorps recombinant humanisé, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on cultive des cellules d'insecte infectées avec un baculovirus recombinant conforme à l'invention, et une étape au cours de laquelle l'on obtient ledit anticorps à partir du milieu de culture. Un anticorps recombinant humanisé conforme à l'Invention peut être utilisé pour le diagnostic, ou pour la thérapeutique. Une utilisation particulièrement intéressante, dans le cas de l'anticorps humanisé K20 concerne l'obtention de médicaments immunosuppresseurs . La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention, conformément à l'Invention, de l'anticorps recombinant humanisé Hu-K20, conforme dans un baculovirus recombinant. II doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Exemple 1. Clonage et séquenςage des parties variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'anticorps K20.The present invention also relates to a process for the preparation of a humanized recombinant antibody, characterized in that it comprises a step at during which insect cells infected with a recombinant baculovirus according to the invention are cultivated, and a step during which said antibody is obtained from the culture medium. A humanized recombinant antibody in accordance with the invention can be used for diagnosis, or for therapy. A particularly advantageous use, in the case of the humanized antibody K20, relates to obtaining immunosuppressive drugs. The present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to examples of obtaining, in accordance with the invention, the humanized recombinant antibody Hu-K20, conforming in a recombinant baculovirus. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the subject of the invention of which they do not in any way constitute a limitation. Example 1. Cloning and sequencing of the variable parts of the heavy chain and of the light chain of the antibody K20.
Le MAb K20 est un anticorps murin produit par un hybridome. Il est dirigé contre la sous-unité β des récepteurs CD29 des lymphocytes [BOUMSELL et al . , J. Exp. Med. 152, p. 229 (1980) ] .MAb K20 is a murine antibody produced by a hybridoma. It is directed against the β subunit of the CD29 receptor of lymphocytes [BOUMSELL et al. , J. Exp. Med. 152, p. 229 (1980)].
L'ARN total de l'hybridome produisant l'anticorps monoclonal K20 a été extrait à l'aide du kit "RNA extraction Kit" de PHARMACIA. L'ADNc est synthétisé à partir de 10 μg d'ARN par transcription inverse (First- Strand cDNA Synthesis kit ; PHARMACIA) .The total RNA of the hybridoma producing the monoclonal antibody K20 was extracted using the "RNA extraction Kit" from PHARMACIA. The cDNA is synthesized from 10 μg of RNA by reverse transcription (First-Strand cDNA Synthesis kit; PHARMACIA).
Les parties variables des chaînes lourdes (VJJ) et légères (VL) sont amplifiées par ACP (amplification en chaîne par polymérase) à partir de 1 μg d'ADNc simple brin, en utilisant la Taq DNA polymérase. Les produits d'amplification sont purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 1,2% pour les séparer des oligonucléotides ; la bande correspondant au produit recherché est excisée du gel, et l'ADN est élue par centrifugation (microcentrifugeuse SPIN-X, COSTAR, Cambridge, MA) , puis extrait au phénol/chloroforme et précipité à l'éthanol,The variable parts of the heavy chains (VJJ) and light chains (VL) are amplified by PCR (polymerase chain amplification) from 1 μg of single-stranded cDNA, using Taq DNA polymerase. The amplification products are purified by electrophoresis on 1.2% agarose gel to separate them. oligonucleotides; the band corresponding to the desired product is excised from the gel, and the DNA is eluted by centrifugation (microcentrifuge SPIN-X, COSTAR, Cambridge, MA), then extracted with phenol / chloroform and precipitated with ethanol,
1. Clonage de la région variable de la chaîne légère K de K20 :1. Cloning of the variable region of the light chain K of K20:
La transcription inverse a été réalisée en utilisant l'amorce VKIFOR : *VK1F0R (SEQ ID NO : l) :The reverse transcription was carried out using the primer VKIFOR: * VK1F0R (SEQ ID NO: 1):
5 ' - GGT AGA TCT CAG CTT GGT CCC 3 '5 '- GGT AGA TCT CAG CTT GGT CCC 3'
Cette amorce est complémentaire de la séquence consensus à 1 ' extrémité 3 ' de la région variable VK des gènes murins, et comporte un site BglII (souligné) . L'ADNc obtenu a été amplifié par ACP en utilisant d'une part l'amorce VKIFOR ci-dessus, et d' autre part 1 ' amorce VKIBAC: *VK1BAC (SEQ ID NO : 2) : 5'- GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA -3* (site PvuII souligné) .This primer is complementary to the consensus sequence at the 3 'end of the VK variable region of the murine genes, and has a BglII site (underlined). The cDNA obtained was amplified by PCR using on the one hand the primer VKIFOR above, and on the other hand the primer VKIBAC: * VK1BAC (SEQ ID NO: 2): 5'- GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA -3 * (PvuII site underlined).
Ces amorces ont été décrites par ORLANDI et al . [ Proc . Natl. Acad. Sci. USA, 86, p 3833, (1989)] .These primers have been described by ORLANDI et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, p 3833, (1989)].
Le produit d'amplification a été récupéré par électrophorèse sur gel d'agarose, extraction au phénol/chloroforme et précipitation à l'éthanol, puis digéré par PvuII et BglII. et le fragment obtenu a été clone dans le phage M13VKPCR1 (ORLANDI et al., publication précitée) , préalablement digéré par PvuII et Bell, pour donner le phage M13VK.K20PCR1 (figure 1A) . 2- Clonacre de la région variable de la chaîne lourde yl de K20 :The amplification product was recovered by electrophoresis on agarose gel, extraction with phenol / chloroform and precipitation with ethanol, then digested with PvuII and BglII. and the fragment obtained was cloned into phage M13VKPCR1 (ORLANDI et al., cited above), previously digested with PvuII and Bell, to give phage M13VK.K20PCR1 (FIG. 1A). 2- Clonacre of the variable region of the heavy chain yl of K20:
La transcription inverse sur l'ARN total extrait de l'hybridome producteur de K20 a été réalisée en utilisant l'amorce VH1FOR. Cette même amorce, et l'amorce VH1BAC ont par la suite servi à amplifier la région V^ à partir de l'ADNc : *VH1F0R ( SEQ ID NO : 3 ) :Reverse transcription on the total RNA extracted from the K20-producing hybridoma was carried out using the primer VH1FOR. This same primer, and the primer VH1BAC were subsequently used to amplify the V ^ region from the cDNA: * VH1F0R (SEQ ID NO: 3):
5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3' (Site BstEII souligné) . *VH1BAC (SEQ ID NO : 4) : 5'-AG GT(C/G) (A/C)A(A/G) CTG CAG (C/G) AG TC(A/T) GG-3 ' (Site Pstl souligné) .5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G-3 '(BstEII site underlined). * VH1BAC (SEQ ID NO: 4): 5'-AG GT (C / G) (A / C) A (A / G) CTG CAG (C / G) AG TC (A / T) GG-3 '( Pstl site underlined).
Ces amorces ont été décrites par ORLANDI et al. (publication précitée) .These primers have been described by ORLANDI et al. (publication cited above).
Le produit d'amplification a été purifié comme décrit ci-dessus, puis digéré par BstEII et Pstl. et le fragment obtenu a été clone dans le phage M13VHPCR1The amplification product was purified as described above, then digested with BstEII and Pstl. and the fragment obtained was cloned into phage M13VHPCR1
(ORLANDI et al., publication précitée) , préalablement digéré par BstEII et Pstl. pour donner le phage(ORLANDI et al., Publication cited above), previously digested with BstEII and Pstl. to give phage
M13VHK20PCR1. La figure 1A représente les étapes du clonage des séquences Vκ et VH de K20. Les phages M13VK.K20PCR1 etM13VHK20PCR1. FIG. 1A represents the stages of the cloning of the V κ and V H sequences of K20. Phages M13VK.K20PCR1 and
M13VHK20PCR1 comprennent, outre les séquences de K20, un promoteur (P) de chaîne H d'Ig, et la séquence de têteM13VHK20PCR1 include, in addition to the K20 sequences, an Ig H chain promoter (P), and the leader sequence
(L) du gène VH V47 de souris. La séquence nucléotidique des inserts K20 des phages M13VKK20PCR1 et M13VHK20PCR1 a été déterminée.(L) of the mouse V H V47 gene. The nucleotide sequence of the K20 inserts of phages M13VKK20PCR1 and M13VHK20PCR1 has been determined.
La séquence de 1 ' insert codant pour la région variable Vκ de la chaîne légère de l'anticorps K20 est représentée à la figure 2 A, et identifiée sur la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 5.The sequence of the insert coding for the variable region V κ of the light chain of the antibody K20 is represented in FIG. 2 A, and identified on the list of sequences in the appendix under the number SEQ ID NO: 5.
La séquence de 1 ' insert codant pour la région variable VJJ de la chaîne lourde de l'anticorps K20 est représentée à la figure 2 B, et identifiée sur la liste des séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO .- 6. Les emplacements des CDR, ainsi que ceux des amorces qui ont été utilisées, et ceux des sites de restriction ayant permis le clonage sont indiqués sur ces figures 2A et 2B. Exem le 2. Humanisation des parties variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère de l'anticorps K20.The sequence of the insert coding for the VJJ variable region of the heavy chain of the antibody K20 is represented in FIG. 2B, and identified on the list of sequences in the appendix under the number SEQ ID NO .- 6. The locations CDRs, as well as those of the primers which have been used, and those of the restriction sites which have allowed cloning are indicated in these Figures 2A and 2B. Example 2. Humanization of the variable parts of the heavy chain and the light chain of the antibody K20.
La figure 1B représente les étapes de l'humanisation des régions variables Vκ et Vg de K20. 1. Humanisation de la région variable de la chaîne légère K de K20 :FIG. 1B represents the stages of humanization of the variable regions V κ and Vg of K20. 1. Humanization of the variable region of the light chain K of K20:
M13VKPCR1 contient un gène Vκ de souris, qui comprend les régions charpente (FRs) de la protéine K de myélome humain REI, et les régions déterminant la complémentarité (CDRs) de l'anticorps monoclonal de souris D1.3 [VERHOEYEN et al., Science, 239, p 1534M13VKPCR1 contains a V κ gene of mouse, which comprises the framework regions (FRs) of the K protein REI human myeloma, and the complementarity determining regions (CDRs) of the mouse monoclonal antibody D1.3 [Verhoeyen et al. , Science, 239, p 1534
(1988)] .(1988)].
Les régions charpente de ce gène Vκ ont été utilisées pour humaniser le gène Vκ de K20. 3 oligonucléotides, VKMUTCDR1, VKMUTCDR2, etThe framework regions of this V gène gene were used to humanize the V κ gene of K20. 3 oligonucleotides, VKMUTCDR1, VKMUTCDR2, and
VKMUTCDR3, correspondant respectivement aux CDRs 1, 2, et 3 de la chaîne Vκ de K20 ont été construits, afin de remplacer les CDRs Vκ de D1.3. Ces 3 oligonucléotides comprennent également 12 nucléotides supplémentaires à 1'extrémité 5' et au moins 12 nucléotides supplémentaires à l'extrémité 3' , incluant un C ou un G terminal, et complémentaires du voisinage immédiat du CDR à remplacer.VKMUTCDR3, corresponding respectively to CDRs 1, 2, and 3 of the chain V κ of K20 were built, in order to replace the CDRs V κ of D1.3. These 3 oligonucleotides also include 12 additional nucleotides at the 5 'end and at least 12 additional nucleotides at the 3' end, including a C or G terminal, and complementary to the immediate vicinity of the CDR to be replaced.
La mutagenèse a été effectuée selon le protocole préconisé par KUNDLE [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, p 488 (1985)]The mutagenesis was carried out according to the protocol recommended by KUNDLE [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, p 488 (1985)]
Le phage résultant du remplacement dans M13VKPCR1, des CDRs Vκ de D1.3 par les CDRs de Vκ de K20, est dénommé M13HuVKK20PCRlThe phage resulting from the replacement in M13VKPCR1, of CDRs V κ of D1.3 by the CDRs of V κ of K20, is called M13HuVKK20PCRl
2. Humanisation de la région variable de la chaîne lourde de K20 :2. Humanization of the variable region of the heavy chain of K20:
Les régions charpente du gène VH humain Fl (numéro d'accès EMBL X17675) ont été utilisées pour humaniser le gène VJJ de K20. Le gène Vg FI a été amplifié par ACP à partir du vecteur M13mpl8VHFlRF. [MILILI et al., Mol. Immunol. , 28, p 753 (1991)], en utilisant les amorces VH1BAK et VH1FOR décrites ci-dessus. Le produit d'amplification a été purifié comme décrit ci-dessus, puis digéré par BstEII et Pstl. et le fragment obtenu a été clone dans le phage M13VHPCR1.The framework regions of the human V H gene F1 (EMBL accession number X17675) were used to humanize the VJJ gene of K20. The Vg FI gene was amplified by PCR from the vector M13mpl8VHFlRF. [MILILI et al., Mol. Immunol. , 28, p 753 (1991)], using the primers VH1BAK and VH1FOR described above. The amplification product was purified as described above, then digested with BstEII and Pstl. and the fragment obtained was cloned into phage M13VHPCR1.
3 oligonucléotides, VHMUTCDR1, VHMUTCDR2, et VHMUTCDR3, correspondant respectivement aux CDRs l, 2, et 3 de la chaîne VJJ de K20 ont été construits, afin de remplacer les CDRs VH de Fl par ceux de K20.3 oligonucleotides, VHMUTCDR1, VHMUTCDR2, and VHMUTCDR3, corresponding respectively to CDRs 1, 2, and 3 of the VJJ chain of K20, were constructed, in order to replace the CDRs V H of F1 by those of K20.
La mutagenèse a été effectuée comme décrit ci- dessus, et le phage résultant est dénommé M13HuVHK20PCRl. Les séquences complémentaires inverses de celles des oligonucléotides VKMUTCDRl, VKMUTCDR2, VKMUTCDR3, VHMUTCDR1, VHMUTCDR2, et VHMUTCDR3, utilisés pour l'humanisation des régions variables des chaînes lourdes et légères sont représentées à la figure 3, et sont également identifiées dans la liste des séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, et SEQ ID NO : 12.Mutagenesis was carried out as described above, and the resulting phage is named M13HuVHK20PCR1. The reverse complementary sequences to those of the oligonucleotides VKMUTCDR1, VKMUTCDR2, VKMUTCDR3, VHMUTCDR1, VHMUTCDR2, and VHMUTCDR3, used for humanization of the variable regions of the heavy and light chains are represented in FIG. 3, and are also identified in the sequence list attached under the respective numbers SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12.
Dans la figure 3, les nucléotides correspondant aux CDRs des gènes humanisés sont soulignés ; les nucléotides existant initialement dans le gène VKREI/D1.3 et dans le gène VHFl sont en lettres capitales ; les nucléotides changés par mutagenèse sont en lettres minuscules ; les emplacements des nucléotides délétés par mutagenèse des gènes initiaux sont représentés par des tirets. Exemple 3 : Construction de plasmides de transfert portant les séquences variables humanisées de K20In FIG. 3, the nucleotides corresponding to the CDRs of the humanized genes are underlined; the nucleotides initially existing in the VKREI / D1.3 gene and in the VHF1 gene are in capital letters; nucleotides changed by mutagenesis are in lowercase letters; the locations of the nucleotides deleted by mutagenesis of the initial genes are represented by dashes. Example 3 Construction of Transfer Plasmids Carrying Humanized Variable K20 Sequences
A) PLASMIDE DE TRANSFERT POUR LA CHAINE LEGERE KAPPA : 1) Obtention du plasmide pBO a- Plasmide pGmAcll6T :A) TRANSFER PLASMID FOR THE KAPPA LIGHT CHAIN: 1) Obtaining the plasmid pBO a- Plasmid pGmAcll6T:
Ce vecteur est dérivé du plasmide pGmAcll5T [ROYER et al., J. Virol., 66, 3230-3235, (1992)], lui- même dérivé du plasmide pAcl [CHAABIHI et al. , J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)] contenant le fragment EcoRI-I du baculovirus de la polyédrose nucléaire d ' Autographa californica (AcMNPV) , et donc le gène polyédrine, et les séquences flanquant ledit gène. Pour obtenir pGmAcll6T, le plasmide pGmAcllST a été délété d'un fragment de 1900pb allant d'un site EcoRI situé en amont du gène polyédrine à un site Xhol situé 1900pb en aval de ce site E≤≤RI.This vector is derived from the plasmid pGmAcll5T [ROYER et al., J. Virol., 66, 3230-3235, (1992)], itself derived from the plasmid pAcl [CHAABIHI et al. , J. Virol., 67, 2664-2671 (1993)] containing the EcoRI-I fragment of the autographa californica nuclear polyhedrosis baculovirus (AcMNPV), and therefore the polyhedrin gene, and the sequences flanking said gene. To obtain pGmAcll6T, the plasmid pGmAcllST was deleted from a 1900 bp fragment going from an EcoRI site located upstream of the polyhedrin gene to an Xhol site located 1900 bp downstream of this E≤≤RI site.
5 μg du plasmide pGmAcllST ont été digérés pendant 2 heures à 37°C par 15 unités d'enzyme Xhol (BOEHRINGER) , dans un volume réactionnel de 50 μl et dans les conditions préconisées par le fournisseur. Après extraction au phénol/chloroforme, l'ADN plasmidique a été précipité à l'alcool. Cet ADN a été ensuite partiellement coupé par EcoRI (BOEHRINGER) dans un volume réactionnel de 50 μl en présence de 0,5 unité d'enzyme. L'incubation a été faite à 37°C pendant 20 minutes. Après une nouvelle extraction au phénol/chloroforme, les extrémités générées par les coupures Xhol et EcoRI ont été rendues franches par l'enzyme de Klenow (BIOLABS) en présence des 4 dNTPs, selon le protocole préconisé par le fournisseur. L'ADN plasmidique a enfin été précipité à l'alcool et incubé avec la ligase du phage T4 (BOEHRINGER) dans les conditions préconisées par le fournisseur.5 μg of the plasmid pGmAcllST were digested for 2 hours at 37 ° C. with 15 units of Xhol enzyme (BOEHRINGER), in a reaction volume of 50 μl and under the conditions recommended by the supplier. After extraction with phenol / chloroform, the plasmid DNA was precipitated with alcohol. This DNA was then partially cut by EcoRI (BOEHRINGER) in a reaction volume of 50 μl in the presence of 0.5 unit of enzyme. The incubation was carried out at 37 ° C for 20 minutes. After a new phenol / chloroform extraction, the ends generated by the Xhol and EcoRI cleavages were made blunt by the Klenow enzyme (BIOLABS) in the presence of the 4 dNTPs, according to the protocol recommended by the supplier. The plasmid DNA was finally precipitated with alcohol and incubated with the ligase of phage T4 (BOEHRINGER) under the conditions recommended by the supplier.
Des bactéries E. coli compétentes ont été transformées par une partie du mélange de ligation ; le criblage des colonies issues de cette transformation a permis de sélectionner le plasmide pGmAcll6T. Ce plasmide contient un site BglII en aval du promoteur de la polyédrine. b- Peptide signal : La séquence codante de ce peptide est celle du peptide signal d'un gène VH de souris [NEUBERGER M.S., EMBO J.,2, 1373-1378, (1983)] .Competent E. coli bacteria have been transformed by part of the ligation mixture; the screening of the colonies resulting from this transformation has allowed to select the plasmid pGmAcll6T. This plasmid contains a BglII site downstream of the polyhedrin promoter. b- Signal peptide: The coding sequence of this peptide is that of the signal peptide of a mouse V H gene [NEUBERGER MS, EMBO J., 2, 1373-1378, (1983)].
Cette séquence a été synthétisée chimiquement sous forme de deux oligonucléotides complémentaires ayant des extrémités permettant l'insertion du duplex dans un site BglII. Pour l'appariement, 15 μg de chacun des deux oligonucléotides sont incubés dans 50 μl de tampon (Tris 1 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM) , pendant 5 minutes dans un bain marie à 70°C. Le bain est ensuite laissé refroidir jusqu'à température ambiante (22 à 25°C) . Le produit d'appariement est utilisé directement dans les réactions de ligation avec le plasmide pGmAcll6T préalablement coupé par BglII.This sequence was chemically synthesized in the form of two complementary oligonucleotides having ends allowing the insertion of the duplex into a BglII site. For pairing, 15 μg of each of the two oligonucleotides are incubated in 50 μl of buffer (1 mM Tris pH 7.5, 0.1 mM EDTA), for 5 minutes in a water bath at 70 ° C. The bath is then left to cool to room temperature (22 to 25 ° C). The pairing product is used directly in the ligation reactions with the plasmid pGmAcll6T previously cut with BglII.
Les conditions de ligation sont les suivantes :The ligation conditions are as follows:
1 μg du plasmide pGmAcll6T coupé par BglII ; l μg de l'oligonucleotide bicaténaire portant la séquence codant pour le peptide signal ; 2 μl de tampon ligase 10X (BOEHRINGER) ; eau distillée q.s.p. 19 μl ; 1 unité (îμl) de ligase (BOEHRINGER) . L'incubation est effectuée à 22°C pendant 2 heures ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes, c- Région constante CK : La séquence codante de la région constante de la chaîne légère K humaine a été amplifiée par ACP en utilisant comme matrice de l'ADNc de lymphocytes B humains. Les lymphocytes humains (environ 5xl08) ont été préparés à partir de 200 ml de sang en utilisant HISTOPAQUE® (SIGMA) . L'ARN total a été extrait de ces lymphocytes en utilisant un kit PHARMACIA (RNA extraction kit) . Le premier brin d'ADNc a été préparé à partir de l'ARN total à l'aide du kit "First-Strand cDNA synthesis kit" de PHARMACIA.1 μg of the plasmid pGmAcll6T cut with BglII; 1 μg of the double-stranded oligonucleotide carrying the sequence coding for the signal peptide; 2 μl of 10X ligase buffer (BOEHRINGER); distilled water qs 19 μl; 1 unit (Îμl) of ligase (BOEHRINGER). Incubation is carried out at 22 ° C for 2 hours; the ligation product is used to transform competent E. coli bacteria, c- CK constant region: The coding sequence of the constant region of the human light chain K was amplified by PCR using as template B cell lymphocyte cDNA humans. Human lymphocytes (approximately 5 × 10 8 ) were prepared from 200 ml of blood using HISTOPAQUE® (SIGMA). Total RNA was extracted from these lymphocytes using a PHARMACIA kit (RNA extraction kit). The first strand of cDNA was prepared from total RNA using the "First-Strand cDNA synthesis kit" from PHARMACIA.
Les amorces utilisées pour amplifier le cDNA CK sont les suivantes : * HuCKBAC (SEQ ID NO : 13 ) : 5' -AG CTC GAG ATC AAA CGG-3' (le site Xhol est souligné) .The primers used to amplify the cDNA CK are the following: * HuCKBAC (SEQ ID NO: 13): 5 '-AG CTC GAG ATC AAA CGG-3' (the Xhol site is underlined).
Cette amorce correspond a une séquence consensus en 3' des séquences codant pour les domaines variables des chaînes légères d'immunoglobulines de souris (JK) , et contient un site de coupure par Xhol. * HuCKFOR (SEQ ID NO : 14 ) : 5' -GAA GAT CTA ACA CTC TCC GCG GTT GAA G-3* (le site BglII est souligné) . Cette amorce est complémentaire de l'extrémitéThis primer corresponds to a consensus sequence in 3 ′ of the sequences coding for the variable domains of the light chains of mouse immunoglobulins (JK), and contains a site of cleavage by Xhol. * HuCKFOR (SEQ ID NO: 14): 5 '-GAA GAT CTA ACA CTC TCC GCG GTT GAA G-3 * (the BglII site is underlined). This primer is complementary to the end
3' des gènes CK humains et apporte un site BglII en aval du codon stop TAG.3 ′ of the human CK genes and provides a BglII site downstream of the TAG stop codon.
L'amplification avec les amorces HUCKBAC et HUCKFOR a permis d'obtenir un fragment d'environ 340 pb contenant la totalité de la région CK encadrée des sites Xhol et BglII.Amplification with the primers HUCKBAC and HUCKFOR made it possible to obtain a fragment of approximately 340 bp containing the entire CK region framed by the Xhol and BglII sites.
Le produit de l'amplification a été digéré par BσlII et Xhol avant d'être clone dans les sites Xhol- BglII du plasmide pGmAc portant la séquence codant pour le peptide signal.The amplification product was digested with BσlII and Xhol before being cloned into the Xhol-BglII sites of the plasmid pGmAc carrying the sequence coding for the signal peptide.
La composition du mélange de ligation est la suivante : l μg du plasmide pGmAc coupé par Xhol etThe composition of the ligation mixture is as follows: l μg of the plasmid pGmAc cut with Xhol and
BglII ,- 200 ng du fragment CK amplifié et digéré par BglII et Xhol, 2 μl de tampon ligase 10X (BOEHRINGER), eau distillée q.s.p. 19 μl, 1 unité (lμl) de ligaseBglII, - 200 ng of the CK fragment amplified and digested with BglII and Xhol, 2 μl of 10X ligase buffer (BOEHRINGER), distilled water q.s.p. 19 μl, 1 unit (lμl) of ligase
(BOEHRINGER) .(BOEHRINGER).
L'incubation est effectuée à 22°C pendant 2 heures ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.Incubation is carried out at 22 ° C for 2 hours; the ligation product is used to transform competent E. coli bacteria.
Le plasmide obtenu est dénommé pBOc. 2) Clonage de la région variable humanisée de la chaîne K de K20The plasmid obtained is called pBOc. 2) Cloning of the humanized variable region of the K chain of K20
Le clonage de la région variable humanisée de la chaîne légère K de K20 a été réalisé de la manière suivante :The cloning of the humanized variable region of the light chain K of K20 was carried out as follows:
La région Vκ humanisée de K20 a été amplifiée par ACP en utilisant : comme matrice, l'ADN du phage M13HuVKK20PCRl décrit à l'exemple 2 ci-dessus ,- - une amorce OPP-SoVK(3 ' ) , dont la séquence est la suivante:The humanized V κ region of K20 was amplified by PCR using: as template, the DNA of the phage M13HuVKK20PCRl described in Example 2 above, - - an OPP-SoVK primer (3 '), the sequence of which is the next one:
* OPP-SθVK(3') (SEQ ID NO : 15 ) :* OPP-SθVK (3 ') (SEQ ID NO: 15):
5' -ACG TTT CTC GAG CYT GGT SCC - 3 ' (site Xhol souligné) Y représente C ou T, et S représente C ou G5 '-ACG TTT CTC GAG CYT GGT SCC - 3' (Xhol site underlined) Y represents C or T, and S represents C or G
- une amorce VKK20Hu(5'), dont la séquence est la suivante:- a primer VKK20Hu (5 '), the sequence of which is as follows:
* VKK20Hu(5') (SEQ ID NO : 16) : 5' - GAC ATC GAG CTC ACC CAG- 3' (site Sacl souligné)* VKK20Hu (5 ') (SEQ ID NO: 16): 5' - GAC ATC GAG CTC ACC CAG- 3 '(Sacl site underlined)
Ces amorces apportent respectivement les sites de restriction Xhol et Ssâ-£l .These primers provide the Xhol and Ssal £ restriction sites respectively.
L'amplification a été réalisée en 30 cycles successifs d'incubation à 95°C pendant 30 secondes, 40°C pendant 30 secondes, et 72°C pendant 30 secondes, puis a été suivie d'une incubation à 72°C pendant 10 minutes.Amplification was performed in 30 successive incubation cycles at 95 ° C for 30 seconds, 40 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds, then was followed by incubation at 72 ° C for 10 seconds. minutes.
Après amplification de la région Vκ, une digestion par les enzymes Sacl et Xhol du produit d'amplification a été réalisée et le fragment obtenu a été inséré entre les sites Sacl et Xhol du plasmide pBLUESCRIPT IIKS ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.After amplification of the V κ region, digestion with the Sacl and Xhol enzymes of the amplification product was carried out and the fragment obtained was inserted between the Sacl and Xhol sites of the plasmid pBLUESCRIPT IIKS; the ligation product is used to transform competent E. coli bacteria.
Quelques clones sont sélectionnés, et séquences pour vérification. L'ADN plasmidique du clone sélectionné est préparé, digéré par Sacl et Xhol, et le fragment Sacl- Xhol de 303 pb est purifié.A few clones are selected, and sequenced for verification. The plasmid DNA of the selected clone is prepared, digested with Sac1 and Xhol, and the Sacl-Xhol fragment of 303 bp is purified.
Le fragment Sacl-Xhol est introduit dans pBCK. La composition du mélange de ligation est la suivante :The SacI-Xhol fragment is introduced into pBCK. The composition of the ligation mixture is as follows:
2 μl de tampon 10X pour la T4-DNA ligase (BOEHRINGER) ; 100 ng du fragment Sacl-Xhol. 1 μl du plasmide pBO coupé par Sacl et Xhol ; 1 μl de ligase (1 unité) , et eau distillée q.s.p. 20 μl.2 μl of 10X buffer for T4-DNA ligase (BOEHRINGER); 100 ng of the SacI-Xhol fragment. 1 μl of the plasmid pBO cut with Sacl and Xhol; 1 μl of ligase (1 unit), and distilled water q.s.p. 20 μl.
L'incubation est effectuée à 16°C pendant 8 heures puis le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.The incubation is carried out at 16 ° C for 8 hours then the ligation product is used to transform competent E. coli bacteria.
On sélectionne un clone contenant le plasmide pBCK-VκK20hu, qui sera utilisé comme vecteur de transfert .A clone containing the plasmid pBCK-VκK20hu is selected, which will be used as a transfer vector.
B) PLASMIDE DE TRANSFERT POUR LA CHAINE LOURDEB) TRANSFER PLASMID FOR HEAVY CHAIN
1) Obtention du plasmide pBCvl a- Plasmide de transfert : Le plasmide pGml6 [BLANC et al, Virology, 192,1) Obtaining the plasmid pBCvl a- Transfer plasmid: The plasmid pGml6 [BLANC et al, Virology, 192,
651-654, (1993)] dérive d'un plasmide dans lequel a été clone le fragment EcoRI-P du baculovirus AcMNPV contenant le gène plO. La quasi-totalité de la séquence codante a été délétée et remplacée par un site BglII permettant 1 ' insertion de séquences à exprimer sous le contrôle du promoteur plO . b- Peptide signal : La séquence codante de ce peptide est celle d'un gène VH de souris (NEUBERGER M.S . , 1983. EMBO J,2, 1373-1378) . Elle a été synthétisée chimiquement sous forme de brins complémentaires, de manière à ce qu'elle puisse être insérée dans un site BglII . Les conditions d' appariement et de ligation sont identiques à celles utilisées pour la chaîne légère. c- Régions constantes humaines (Cγl) : Le cDNA de la séquence codante de la région Cγl humaine a été amplifié par ACP en utilisant les amorces suivantes : *HuCγlBAC (SEQ ID NO : 17) :651-654, (1993)] is derived from a plasmid into which the EcoRI-P fragment of the baculovirus AcMNPV containing the plO gene has been cloned. Almost all of the coding sequence has been deleted and replaced by a BglII site allowing the insertion of sequences to be expressed under the control of the p10 promoter. b- Signal peptide: The coding sequence of this peptide is that of a mouse V H gene (NEUBERGER MS., 1983. EMBO J, 2, 1373-1378). It has been chemically synthesized in the form of complementary strands, so that it can be inserted into a BglII site. The pairing and ligation conditions are identical to those used for the light chain. c- Human constant regions (Cγl): The cDNA of the coding sequence of the human Cγl region was amplified by PCR using the following primers: * HuCγlBAC (SEQ ID NO: 17):
5 ' CAA GGT ACC ACG GTC ACC GTC TCC - 3 ' (site Kpnl souligné) .5 'CAA GGT ACC ACG GTC ACC GTC TCC - 3' (Kpnl site underlined).
Cette amorce comprend un site Kpnl . *HuCγlFOR (SEQ ID NO : 18) : 5 ' -GAAGATC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA G-3' (site BglII souligné) .This primer includes a Kpnl site. * HuCγlFOR (SEQ ID NO: 18): 5 '-GAAGATC TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA G-3' (BglII site underlined).
L'amorce permet de reconstituer après amplification un site BglII en aval du codon stop.The primer makes it possible to reconstitute, after amplification, a BglII site downstream of the stop codon.
La matrice utilisée pour amplifier la région Cγl humaine est le même mélange d'ADNc que celui utilisé pour 1 ' amplification des séquences CKThe template used to amplify the human Cγl region is the same mixture of cDNAs as that used for the amplification of the CK sequences.
Le produit d'amplification a été séquence et clone dans le vecteur de transfert pGml6 portant la séquence codant pour le peptide signal. La construction obtenue a été appelée pBCγl .The amplification product was sequenced and cloned into the transfer vector pGml6 carrying the sequence coding for the signal peptide. The construction obtained was called pBCγl.
2) Clonage de la région variable humanisée de la chaîne lourde de K202) Cloning of the humanized variable region of the heavy chain of K20
Le clonage de la région VJJ humanisée de la chaîne lourde de K20 a été réalisé de la manière suivante :The cloning of the humanized VJJ region of the heavy chain of K20 was carried out as follows:
La région variable VJJ humanisée de K20 a été amplifiée par ACP en utilisant :The humanized VJJ variable region of K20 was amplified by PCR using:
- comme matrice l'ADN du phage M13HuVHK20PCRl décrit à l'exemple 2 ci-dessus ; - l'amorce VH1BAC ci-dessous (SEQ ID NO : 19)- As a template, the DNA of phage M13HuVHK20PCRl described in Example 2 above; - the primer VH1BAC below (SEQ ID NO: 19)
5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT WCG GG-3' (Site Pstl souligné)5'-AGG TSM ARC TGC AGS AGT WCG GG-3 '(Pstl site underlined)
S = C OU G ; M = A OU C ; R = A OU G ; W = A OU T - l'amorce VHFOR ci-dessous (SEQ ID NO : 20) :S = C OR G; M = A OR C; R = A OR G; W = A OR T - the VHFOR primer below (SEQ ID NO: 20):
5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT ACC TTG GCC CCA G-3' (Sites Bs_£EII et Kpnl soulignés) .5'-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT ACC TTG GCC CCA G-3 ' (Bs_ £ EII and Kpnl sites underlined).
L'amorce VHFOR diffère de l'amorce VH1FOR en ce qu'un C a été remplacé par un A pour créer un siteThe VHFOR primer differs from the VH1FOR primer in that a C has been replaced by an A to create a site
Kpnl. Ces amorces apportent respectivement les sites de restriction enzymatiques Pstl et Kpnl.Kpnl. These primers provide the Pstl and Kpnl enzyme restriction sites respectively.
Après amplification, une digestion Pstl-Kpnl du fragment d'amplification obtenu a été réalisée et le fragment obtenu a été inséré entre les sites Pstl et Kpnl du plasmide pBLUESCRIPT IIKS ; le produit de ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli compétentes.After amplification, a Pstl-Kpnl digestion of the amplification fragment obtained was carried out and the fragment obtained was inserted between the Pstl and Kpnl sites of the plasmid pBLUESCRIPT IIKS; the ligation product is used to transform competent E. coli bacteria.
Quelques clones sont sélectionnés, et vérifiés par séquencage. L'ADN plasmidique du clone sélectionné est préparé, digéré par Pstl et Kpnll. et le fragment Pstl-A few clones are selected, and verified by sequencing. The plasmid DNA of the selected clone is prepared, digested with Pstl and Kpn11. and the Pstl- fragment
Kpnl de 327 pb est purifié.Kpnl of 327 bp is purified.
Le fragment Pstl-Kpnl est introduit dans pBCγl pour donner le plasmide chargé pBCγi-VHK20hu. Exemple 4 : Construction d'un baculovirus recombinant produisant l'anticorps K20 humanisé a- Insertion de la chaîne lourde :The Pstl-Kpnl fragment is introduced into pBCγl to give the loaded plasmid pBCγi-VHK20hu. Example 4: Construction of a recombinant baculovirus producing the humanized K20 antibody a- Insertion of the heavy chain:
Le plasmide chargé pBCγi-VHK20hu a été utilisé en cotransfection avec l'ADN d'un baculovirus modifié appelé AcSLplO [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664-2671The loaded plasmid pBCγi-VHK20hu was used in cotransfection with the DNA of a modified baculovirus called AcSLplO [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664-2671
(1993)], qui est dépourvu du gène polyédrine(1993)], which lacks the polyhedrin gene
(promoteur+séquence codante) , mais porte la séquence codante de la polyédrine sous contrôle du promoteur PlO, dans le locus naturel PlO. Ce virus produisant des polyèdres dans les cellules infectées, la recombinaison au niveau du locus PlO peut ainsi être facilement détectée. Les conditions de cotransfection sont les suivantes : 500 ng d'ADN viral sont mélangés avec 5 μg d'ADN plasmidique et 40 μl de solution DOTAP (BOEHRINGER) dans 3 ml de milieu de culture sans sérum pour cellules d'insectes. Ce mélange est utilisé pour recouvrir 4 x 106 cellules Sf9 (ATCC35CRL 1711) ; après 4 heures de contact, le mélange de cotransfection est remplacé par 4 ml de milieu complet et l'incubation est faite à 27°C pendant 5 jours. A la suite de la cotransfection, le virus produisant la chaîne lourde de l'anticorps K20 humanisé sous le contrôle du promoteur PlO a été purifié par la technique des plages de lyse. Ce virus a été appelé bPPl- HK20hu. b- Insertion de la chaîne légère :(promoter + coding sequence), but carries the coding sequence of the polyhedrin under the control of the PlO promoter, in the natural PlO locus. As this virus produces polyhedra in infected cells, recombination at the PlO locus can thus be easily detected. The cotransfection conditions are as follows: 500 ng of viral DNA are mixed with 5 μg of plasmid DNA and 40 μl of DOTAP solution (BOEHRINGER) in 3 ml of culture medium without serum for insect cells. This mixture is used to cover 4 x 10 6 Sf9 cells (ATCC35CRL 1711); after 4 hours of contact, the cotransfection mixture is replaced with 4 ml of complete medium and the incubation is carried out at 27 ° C. for 5 days. Following the cotransfection, the virus producing the heavy chain of the humanized K20 antibody under the control of the PlO promoter was purified by the lysis plaque technique. This virus was called bPPl- HK20hu. b- Insertion of the light chain:
Le plasmide chargé pBCκ-VκK20hu a été utilisé en cotransfection avec l'ADN du baculovirus modifié bPPl- HK20hu.The loaded plasmid pBCκ-VκK20hu was used in cotransfection with the DNA of the modified baculovirus bPPl-HK20hu.
Les doubles recombinants ont été sélectionnés par la technique de la dilution limite, associée à l'ELISA.The double recombinants were selected by the technique of limiting dilution, associated with ELISA.
Après la cotransfection, on effectue une gamme de dilutions du surnageant infectieux, et chaque dilution est utilisée pour l'infection de cellules d'insectes. Trois jours après l'infection, les surnageants sont testés en ELISA pour rechercher la présence d'anticorps de type humain correctement assemblés. Les surnageants des puits les plus positifs pour les dilutions les plus importantes sont à leur tour dilués et utilisés pour infecter d'autres cultures ; après quelques cycles dilution/infection, les surnageants enrichis en baculovirus produisant l'anticorps entier sont étalés sur un tapis cellulaire, et clones par la méthode des plages de lyse. Un clone dénommé Acl0HK20hu-33LK20hu (111) a été sélectionné. Ce clone a été déposé auprès de la CNCM, le 9 septembre 1994, sous le numéro 1-1476. Exemple 5 - Production et purification de l'anticorps K20 huma isé (Hu-K20) :After cotransfection, a range of dilutions of the infectious supernatant is made, and each dilution is used for infection of insect cells. Three days after infection, the supernatants are tested by ELISA to find the presence of correctly assembled human-type antibodies. The supernatants from the most positive wells for the highest dilutions are in turn diluted and used to infect other cultures; after a few dilution / infection cycles, the supernatants enriched in baculovirus producing the whole antibody are spread on a cell carpet, and cloned by the lysis plaque method. A clone named Acl0HK20hu-33LK20hu (111) was selected. This clone was deposited with the CNCM, on September 9, 1994, under the number 1-1476. Example 5 - Production and purification of the humanized antibody K20 (Hu-K20):
Le virus double reco binant AclOHK20hu-The double reco hiding virus AclOHK20hu-
33LK20hu(lll) a été amplifié par une série de passages sur des cellules d'insecte en culture. Le stock viral a été ensuite utilisé pour infecter une culture agitée en spinner (500 ml de culture à 106 cellules par ml) .33LK20hu (III) was amplified by a series of passages on cultured insect cells. The viral stock was then used to infect a culture shaken in a spinner (500 ml of culture with 10 6 cells per ml).
Après 72 heures d'infection, la culture est récoltée et centrifugée à 1000 g pour clarifier le surnageant. Ce dernier a été concentré jusqu'au 1/3 de son volume initial par centrifugation à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 30 kDa (CENTRIPEP 30, Amicon) (1ère centrifugation : 1000g, 20°C, 30 minutes ; élimination du filtrat ; 2ème centrifugation : 1000g, 20°C, 20 minutes) .After 72 hours of infection, the culture is harvested and centrifuged at 1000 g to clarify the supernatant. The latter was concentrated to 1/3 of its initial volume by centrifugation through a membrane having a cutoff threshold of 30 kDa (CENTRIPEP 30, Amicon) (1st centrifugation: 1000g, 20 ° C, 30 minutes; elimination of the filtrate; 2nd centrifugation: 1000g, 20 ° C, 20 minutes).
La solution a été équilibrée dans un tampon de fixation sur protéine A, par dilution dans ce tampon suivie d'une nouvelle concentration par centrifugation (tampon de dilution : Glycine 1,5M, NaCl 3M; pH 8,9) . La solution équilibrée est ensuite passée dans une colonne de protéine A, elle même équilibrée dans le même tampon que la solution de Hu-K20. Après rinçage de la colonne, l'anticorps est élue par un tampon d'élution (Acétate 0,1M, NaCl 0,5M; pH3) . L'élution est suivie en mesurant la DO à 280 nm. Les fractions contenant l'anticorps ont été mélangées et concentrées par centrifugation à travers une membrane ayant un seuil de coupure de 10 kDaThe solution was equilibrated in a protein A binding buffer, by dilution in this buffer followed by a new concentration by centrifugation (dilution buffer: Glycine 1.5M, 3M NaCl; pH 8.9). The balanced solution is then passed through a protein A column, which is itself balanced in the same buffer as the Hu-K20 solution. After rinsing the column, the antibody is eluted with an elution buffer (0.1M acetate, 0.5M NaCl; pH3). The elution is followed by measuring the OD at 280 nm. The fractions containing the antibody were mixed and concentrated by centrifugation through a membrane having a cutoff threshold of 10 kDa
(CENTRIPEP 10, AMICON) . La solution concentrée est diluée avec du PBS puis reconcentrée de la même manière. La solution d'anticorps obtenue est conservée à +4°C dans le PBS (137 mM NaCl ; 2, 7 mM KC1 ; 4, 3 mM Na2HPO4-7H20; 1,4 mM KH2P04.(CENTRIPEP 10, AMICON). The concentrated solution is diluted with PBS and then reconcentrated in the same way. The antibody solution obtained is stored at + 4 ° C in PBS (137 mM NaCl; 2.7 mM KC1; 4.3 mM Na 2 HPO 4 -7H 2 0; 1.4 mM KH 2 P0 4 .
La qualité de l'anticorps a été contrôlée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS, en utilisant comme témoin une IgGl humaine du commerce (SIGMA) . Cette expérience a montré que l'anticorps chimère non-réduit (ponts disulfure intacts) migre au même niveau que l'anticorps humain témoin.The quality of the antibody was checked by polyacrylamide-SDS gel electrophoresis, using a commercial human IgG1 (SIGMA) as control. This experiment showed that the antibody unreduced chimera (intact disulfide bridges) migrates at the same level as the control human antibody.
Après traitement par le dithiotréitol (DTT) , on observe 1 ' apparition de deux bandes correspondant aux chaînes lourdes et légères, et migrant au même niveau que les chaînes de l'anticorps humain témoin également réduit au DTT.After treatment with dithiotreitol (DTT), the appearance of two bands corresponding to the heavy and light chains is observed, and migrating at the same level as the chains of the control human antibody also reduced to DTT.
Pour confirmer les résultats précédents, les protéines des fractions comprenant l'anticorps ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose, et les chaînes H et L ont été détectées par des anticorps spécifiques des région Cγl et CK humaines.To confirm the previous results, the proteins of the fractions comprising the antibody were transferred onto a nitrocellulose membrane, and the H and L chains were detected by antibodies specific for the human Cγl and CK region.
Cette expérience démontre que l'anticorps produit par les cellules d'insectes est bien constitué de chaînes H et L, et que les parties constantes de ces chaînes sont reconnues par des anticorps spécifiques .This experiment demonstrates that the antibody produced by insect cells is indeed made up of H and L chains, and that the constant parts of these chains are recognized by specific antibodies.
Le virus sélectionné AclOHK20hu-33LK20hu (lll) est multiplié sur cellules d'insectes Sf9 en milieu TGV2The selected virus AclOHK20hu-33LK20hu (lll) is multiplied on Sf9 insect cells in TGV2 medium
(2% de sérum de veau foetal) . La concentration d'anticorps produit et sécrété est évaluée par ELISA ; elle est d'environ I0mg/1.(2% fetal calf serum). The concentration of antibody produced and secreted is evaluated by ELISA; it is approximately 10 mg / l.
Exemple 6 - Vérification par immunofluorescence de la spécificité du Hu-K20 produit par les cellules d'insectes : L'anticorps monoclonal parental K20 est dirigé contre la sous-unité βl des intégrines humainesEXAMPLE 6 Immunofluorescence verification of the specificity of Hu-K20 produced by insect cells: The parental monoclonal antibody K20 is directed against the β1 subunit of human integrins
(récepteur CD29) localisée à la surface des lymphocytes.(CD29 receptor) located on the surface of lymphocytes.
La fixation de K20 sur la molécule CD29 inhibe la prolifération des lymphocytes T4 humains activés [GROUX et al., Nature, 339, 152-154, (1989)] . L'effet suppressif de K20 sur la prolifération cellulaire T permet d'envisager l'utilisation de cet anticorps dans la prévention des rejets de greffes.The binding of K20 to the CD29 molecule inhibits the proliferation of activated human T4 lymphocytes [GROUX et al., Nature, 339, 152-154, (1989)]. The suppressive effect of K20 on T cell proliferation makes it possible to envisage the use of this antibody in the prevention of transplant rejection.
La fixation de l'anticorps Hu-K20 produit conformément à l'invention, sur la molécule CD29 a été vérifiée par immunofluorescence. Les protocoles expérimentaux suivis ont été précédemment décrits [GROUX et al. Nature 339, 152-154 (1989) ; TICCHIONI et al. Journal of Immunology 151, 119-127 (1993)] . Expériences d' imunofluorescence : Des lymphocytes humains portant le récepteurThe binding of the antibody Hu-K20 produced in accordance with the invention, to the molecule CD29 was checked by immunofluorescence. Protocols experimental studies have been previously described [GROUX et al. Nature 339, 152-154 (1989); TICCHIONI et al. Journal of Immunology 151, 119-127 (1993)]. Immunofluorescence experiments: Human lymphocytes carrying the receptor
CD29 ont été fixés sur lame de verre puis incubés en présence du Hu-K20 produit conformément à l'Invention, du K20 murin parental, ou du tampon seul.CD29 were fixed on a glass slide and then incubated in the presence of Hu-K20 produced in accordance with the invention, parental murine K20, or buffer alone.
Après une série de rinçages, on rajoute ou bien un anticorps secondaire fluorescent spécifique du Hu-K20 produit conformément à l'Invention, ou bien un anticorps secondaire fluorescent spécifique du K20 murin parental.After a series of rinses, either a fluorescent secondary antibody specific for Hu-K20 produced in accordance with the invention, or a fluorescent secondary antibody specific for parental murine K20, is added.
Après un nouveau rinçage, les préparations ont été observées au microscope pour visualiser la fluorescence. Ceci montre que le Hu-K20 produit conformément à l' Invention se fixe de manière spécifique sur les lymphocytes portant le CD29, tout comme le témoin positif K20 murin parental ; aucune fluorescence n'a été détectée en l'absence des anticorps K20, ou sur des cellules lymphocytaires B ne portant pas l'antigène CD29. Exemple 7 - Comparaison de la spécificité du Hu-K20 produit par les cellules d'insectes , par rapport à celle du Mu-K20 initial: MATERIEL et METHODESAfter a further rinse, the preparations were observed under a microscope to visualize the fluorescence. This shows that the Hu-K20 produced in accordance with the invention binds specifically to the lymphocytes carrying the CD29, as does the parental murine K20 positive control; no fluorescence was detected in the absence of the K20 antibodies, or on B lymphocyte cells not carrying the CD29 antigen. Example 7 Comparison of the Specificity of the Hu-K20 Produced by the Insect Cells, Compared to that of the Initial Mu-K20: MATERIAL and METHODS
Les lignées cellulaires utilisées sont:The cell lines used are:
- la lignée lymphocytaire T JURKAT clone E6-1 provenant de l'American Tissue Cell Collection (ATCC) ,- the T JURKAT T6 E6-1 lymphocyte line from the American Tissue Cell Collection (ATCC),
- la lignée HPB-A11 (don de C. ROZENFELD, Paris) la lignée B RAJI (lymphome de Burkitt) provenant de l'American Tissue Cell Collection (ATCC),- the line HPB-A11 (donation from C. ROZENFELD, Paris) line B RAJI (Burkitt's lymphoma) from the American Tissue Cell Collection (ATCC),
- la lignée B 88/66 (don de C. ROZENFELD, Paris) Ces lignées sont cultivées en milieu RPMI 1640- line B 88/66 (gift from C. ROZENFELD, Paris) These lines are cultivated in RPMI 1640 medium
(AXCELL, France) complémenté par 2 mM de L-glutamine (TECHGEN, France) , 1 mM de sodium pyruvate (TECHGEN) , 50 mUI/ml de pénicilline et 50 μg/ml de streptomycine(AXCELL, France) supplemented with 2 mM L-glutamine (TECHGEN, France), 1 mM sodium pyruvate (TECHGEN), 50 mII / ml of penicillin and 50 μg / ml of streptomycin
(TECHGEN) , et 5% de sérum de veau foetal (GIBCO, Grande(TECHGEN), and 5% fetal calf serum (GIBCO, Grande
Bretagne) décomplémenté par 30 minutes de chauffage à 56°C. Les cellules sont maintenues dans un incubateur humidifié à 37°C et à 5% de CO2.Brittany) decomplemented by 30 minutes of heating at 56 ° C. The cells are kept in a humidified incubator at 37 ° C and 5% CO2.
2. Lymphocytes T du sang périphérique.2. T cells from peripheral blood.
Les lymphocytes proviennent de donneurs volontaires sains (Centre de Transfusion sanguine ARNAUD TZANCK, Saint Laurent du Var) . Les cellules mononucléées sont récupérées après centrifugation sur gradient de Ficoll-Hypaque (EUROBIO, France) . Les monocytes sont éliminés par deux cycles d'adhérence d'une heure sur plastique à 37°C. Parmi les cellules non-adhérentes ainsi obtenues, les monocytes résiduels, les cellules NK et les lymphocytes B sont éliminés par sélection immunomagnétique à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre des marqueurs de surface spécifiques de ces types cellulaires et de billes magnétiques recouvertes d'anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de souris (DYNABEADS, DYNAL, Norvège) . La pureté lymphocytaire est contrôlée par vérification du phénotype.The lymphocytes come from healthy voluntary donors (ARNAUD TZANCK Blood Transfusion Center, Saint Laurent du Var). The mononuclear cells are recovered after centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient (EUROBIO, France). Monocytes are removed by two one hour adhesion cycles on plastic at 37 ° C. Among the non-adherent cells thus obtained, residual monocytes, NK cells and B lymphocytes are eliminated by immunomagnetic selection using monoclonal antibodies directed against specific surface markers of these cell types and magnetic beads covered with goat anti-mouse immunoglobulin antibody (DYNABEADS, DYNAL, Norway). Lymphocyte purity is checked by checking the phenotype.
3. Les thymocytes.3. Thymocytes.
Ils sont obtenus à partir de thymus d'enfants (4 mois à 5 ans) subissant des interventions cardiologiques au Centre Cardio-thoracique de Monaco. Les érythrocytes résiduels sont éventuellement éliminés par centrifugation sur gradient de Ficoll-Hypaque.They are obtained from the thymus of children (4 months to 5 years) undergoing cardiological interventions at the Cardio-thoracic Center of Monaco. The residual erythrocytes are optionally removed by centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient.
4. Marquage immunofluorescent et cytométrie de flux. Les cellules (1x10e) sont lavées deux fois dans du PBS (NaCl 140 mM, KC1 3mM, Na2HPθ4 6 M, KH Pθ4 l M, pH 7,4) 0,1% BSA (fraction V, BOEHRINGER) , 0,1% NaN3. Elles sont ensuite incubées avec un premier anticorps dans un volume final de 100 μl pendant 30 min. à 4°C. Après deux lavages, les cellules sont incubées de la même manière avec le deuxième anticorps, puis à nouveau lavées deux fois. Les cellules sont ensuite fixées à la concentration finale de lxlO6, dans 500 μl de PBS 1% formaldéhyde. II. RESULTATS 1. Détermination des courbes dose-réponse en cvtometrie de flux et distribution tissulaire.4. Immunofluorescent labeling and flow cytometry. The cells (1x10 e ) are washed twice in PBS (140 mM NaCl, 3 mM KC1, Na 2 HPθ4 6 M, KH Pθ4 l M, pH 7.4) 0.1% BSA (fraction V, BOEHRINGER), 0 , 1% NaN3. They are then incubated with a first antibody in a final volume of 100 μl for 30 min. at 4 ° C. After two washes, the cells are incubated in the same way with the second antibody, then at again washed twice. The cells are then fixed at the final concentration of 1x10 6 , in 500 μl of PBS 1% formaldehyde. II. RESULTS 1. Determination of dose-response curves in flow cytometry and tissue distribution.
Les cellules JURKAT E6-1, HPB-A11, RAJI, 88/66, des thymocytes et des lymphocytes T périphériques humains sont incubés avec des concentrations croissantes (0,01 à 30 μg/ml) de chacun des deux anticorps K20 murin et humanisé. Après deux lavages, les cellules sont incubées avec du RAM-FITC (fluorescein conjugated F(ab')2 fragment of rabbit immunoglobulin to mouse immunoglobulin (DAKOPATTS, Danemark) à la dilution de 1/100 ou du RAHu- FITC (Fluorescein conjugated rabbit immunoglobulin to human IgA, IgG, IgM, DAKOPATTS, Danemark) ou du GAHu-FITC (fluorescein conjugated F(ab')2 fragment of goat immunoglobulin to human immunoglobulin (TEBU, France) dilués au 1/100. Les résultats, qui sont illustrés par laJURKAT E6-1, HPB-A11, RAJI, 88/66, thymocytes and human peripheral T lymphocytes cells are incubated with increasing concentrations (0.01 to 30 μg / ml) of each of the two murine and humanized K20 antibodies . After two washes, the cells are incubated with RAM-FITC (fluorescein conjugated F (ab ') 2 fragment of rabbit immunoglobulin to mouse immunoglobulin (DAKOPATTS, Denmark) at a dilution of 1/100 or RAHu- FITC (Fluorescein conjugated rabbit immunoglobulin to human IgA, IgG, IgM, DAKOPATTS, Denmark) or GAHu-FITC (fluorescein conjugated F (ab ') 2 fragment of goat immunoglobulin to human immunoglobulin (TEBU, France) diluted to 1/100. The results, which are illustrated by the
Figure 4 (4A à 4G) , sont les suivants :Figure 4 (4A to 4G), are as follows:
Les deux anticorps Mu-K20 et Hu-K20 se fixent sur tous les types cellulaires testés avec une concentration saturante proche de 0,3 μg/ml , excepté sur la lignée B 88/66 qui n'exprime pas la βl-intégrine. Le marquage observé seulement dans le cas de l'anticorps K20 humanisé sur les cellules 88/66 est dû à la fixation de GAHu-FITC qui reconnaît les immunoglobulines de surface constitutivement présentes à la surface de ces cellules B. Cette fixation n'est pas observée dans le cas des cellules Raji, car celles-ci ont été présaturées avant le marquage par des immunoglobulines de lapin anti- immunoglobulines humaines. 2. Blocage de la fixation du K20 murin. Les cellules JURKAT E6-1 sont incubées avec des concentrations croissantes, (de 0,01 à 30 μg/ml) , d'anticorps K20 murin (Mu-K20) ou humanisé (Hu-K20) , ou bien d'immunoglobulines humaines IgGl (SIGMA, France). Après lavage, les cellules sont incubées avec une concentration saturante de K20-FITC (IMMUNOTECH, France) de 8 μl dans un volume final de 100 μl.The two antibodies Mu-K20 and Hu-K20 bind to all the cell types tested with a saturating concentration close to 0.3 μg / ml, except on the line B 88/66 which does not express βl-integrin. The labeling observed only in the case of the humanized K20 antibody on the 88/66 cells is due to the fixation of GAHu-FITC which recognizes the surface immunoglobulins constitutively present on the surface of these B cells. This fixation is not observed in the case of Raji cells, since these were presaturated before labeling with rabbit immunoglobulins anti-human immunoglobulins. 2. Locking of the fixing of the murine K20. JURKAT E6-1 cells are incubated with increasing concentrations (from 0.01 to 30 μg / ml), murine (Mu-K20) or humanized (Hu-K20) antibody K20, or human IgG1 immunoglobulins (SIGMA, France). After washing, the cells are incubated with a saturated concentration of K20-FITC (IMMUNOTECH, France) of 8 μl in a final volume of 100 μl.
Les résultats sont illustrés par la Figure 5, qui montre que :The results are illustrated in Figure 5, which shows that:
K20 humanisé reconnaît bien les mêmes épitopes que K20 murin puisqu'il bloque spécifiquement la fixation de K20 murin. Pour chacun des deux anticorps Mu-K20 et Hu-K20, lorsque les cellules sont incubées avec une concentration de l μg/ml, on constate qu'il n'y a plus de sites disponibles pour la fixation du K20 murin couplé au FITC. Ceci est en corrélation avec la valeur de la concentration saturante déterminée précédemment.Humanized K20 clearly recognizes the same epitopes as murine K20 since it specifically blocks the fixation of murine K20. For each of the two antibodies Mu-K20 and Hu-K20, when the cells are incubated with a concentration of l μg / ml, it is noted that there are no longer any sites available for the fixation of the murine K20 coupled to the FITC. This is correlated with the value of the saturation concentration determined previously.
3. Déplacement du K20 murin.3. Relocation of the murine K20.
Les cellules Jurkat E6-1 sont incubées avec une concentration saturante de K20-FITC (IMMUNOTECH, France) dans un volume final de 100 μl. Après lavage, les cellules sont incubées avec des concentrations croissantes (0,01 à 30 μg/ml) de chacun des anticorps K20 murin (Mu-K20) ou humanisé (Hu-K20) ou d'immunoglobulines humaines IgGl (SIGMA, France) .Jurkat E6-1 cells are incubated with a saturated concentration of K20-FITC (IMMUNOTECH, France) in a final volume of 100 μl. After washing, the cells are incubated with increasing concentrations (0.01 to 30 μg / ml) of each of the murine (Mu-K20) or humanized (Hu-K20) or human immunoglobulin IgG1 antibodies (SIGMA, France) .
Les résultats sont illustrés par la Figure 6, qui montre que les anticorps monoclonaux K20 murin et humanisé déplacent la fixation du K20 murin couplé au FITC, ce qui n'est pas observé pour des immunoglobulines humaines de même sous-classe que l'anticorps humanisé. 50% du déplacement est atteint pour une concentration d'anticorps Mu-K20 ou Hu-K20 de l'ordre de 30 μg/ml.The results are illustrated in FIG. 6, which shows that the murine and humanized K20 monoclonal antibodies displace the binding of the murine K20 coupled to the FITC, which is not observed for human immunoglobulins of the same subclass as the humanized antibody. . 50% of the displacement is reached for a concentration of Mu-K20 or Hu-K20 antibodies of the order of 30 μg / ml.
4. Compétition des anticorps Mu-K20 et Hu-K20 avec l'anticorps Mu-K20 couplé au FITC.4. Competition of the Mu-K20 and Hu-K20 antibodies with the Mu-K20 antibody coupled to the FITC.
Les cellules Jurkat E6-1 sont incubées avecJurkat E6-1 cells are incubated with
8 μl de K20-FITC à une concentration saturante (IMMUNOTECH, France) , et des concentrations croissantes8 μl of K20-FITC at a saturated concentration (IMMUNOTECH, France), and increasing concentrations
(0,01 à 30 μg/ml) des anticorps K20 murin ou humanisé ainsi que des immunoglobulines humaines IgGl (Sigma, France) . Les résultats sont illustrés par la Figure 7, qui montre que les courbes de compétition observées pour chacun des anticorps sont superposables. La valeur de 50% de compétition est atteinte pour des concentrations d'anticorps comprises entre 0,3 et 1 μg/ml. L'anticorps IgGl utilisé comme témoin n'exerce aucune compétition avec K20-FITC même à la plus forte concentration de 30 μg/ml. Exemple 8 - Comparaison des activités biologiques du Mu- K20 et du Hu-K20: 1.Action sur la prolifération des lymphocytes T.(0.01 to 30 μg / ml) of murine or humanized K20 antibodies as well as human IgG1 immunoglobulins (Sigma, France). The results are illustrated in Figure 7, which shows that the competition curves observed for each of the antibodies are superimposable. The value of 50% competition is reached for antibody concentrations between 0.3 and 1 μg / ml. The IgGl antibody used as a control does not compete with K20-FITC even at the highest concentration of 30 μg / ml. Example 8 - Comparison of the biological activities of Mu-K20 and Hu-K20: 1. Action on the proliferation of T lymphocytes
Les lymphocytes T du sang périphérique.proviennent de donneurs volontaires sains (Centre de Transfusion sanguine ARNAUD TZANCK, Saint Laurent du Var) . Les cellules mononucléées sont récupérées après centrifugation sur gradient de Ficoll- Hypaque (EUROBIO, France) . Les monocytes sont éliminés par deux cycles d'adhérence d'une heure sur plastique à 37°C. Parmi les cellules non-adhérentes ainsi obtenues, les monocytes résiduels, les cellules NK et les lymphocytes B sont éliminés par sélection immunomagnétique à l'aide de différents anticorps monoclonaux et de billes magnétiques recouvertes d'anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de souris (DYNABEADS, DYNAL, Norvège) . La pureté lymphocytaire est contrôlée par phénotypage.Peripheral blood T cells come from healthy voluntary donors (ARNAUD TZANCK Blood Transfusion Center, Saint Laurent du Var). The mononuclear cells are recovered after centrifugation on a Ficoll-Hypaque gradient (EUROBIO, France). Monocytes are removed by two one hour adhesion cycles on plastic at 37 ° C. Among the non-adherent cells thus obtained, the residual monocytes, NK cells and B lymphocytes are eliminated by immunomagnetic selection using different monoclonal antibodies and magnetic beads coated with goat anti-mouse immunoglobulin antibody (DYNABEADS , DYNAL, Norway). Lymphocyte purity is controlled by phenotyping.
Un anticorps monoclonal CD3 (10 μg/ml) (X35, Dr MARTIN, Rennes) est immobilisé sur plastique dans des plaques 96 puits où sont cultivés les lymphocytes T à raison de 50000 cellules par puits dans un volume final de 200 μl de RPMI 1640, 10% SVF. L' interleukine 2 (10 ng/ml) (R AND D SYSTEM, GB) et différentes dilutions d'anticorps Mu-K20, Hu-K20 et d'Ig humaines contrôle sont rajoutés dans les puits. Au bout de 96 heures de culture à 37°C, 1 mCi de [3H] thymidine est ajoutée par puits. Après 18 heures d'incubation , l'ADN cellulaire est piégé sur papier filtre grâce à un préleveur semi-automatique. L'incorporation est mesurée en coups par minute par comptage en scintillation liquide. Les résultats sont illustrés par la Figure 8, qui montre que les deux anticorps Mu-K20 et Hu-K20 inhibent la prolifération des lymphocytes T à partir d'une concentration faible de 1 ng/ml . Pour des concentrations supérieures à 0,1 μg/ml qui est la concentration saturante de l'anticorps, on constate que l'inhibition peut diminuer. 2. Mesure de l'adhésion à la fibronectine.A CD3 monoclonal antibody (10 μg / ml) (X35, Dr MARTIN, Rennes) is immobilized on plastic in 96-well plates in which T lymphocytes are cultured at the rate of 50,000 cells per well in a final volume of 200 μl of RPMI 1640 , 10% SVF. Interleukin 2 (10 ng / ml) (R AND D SYSTEM, GB) and various dilutions of antibodies Mu-K20, Hu-K20 and human Ig controls are added to the wells. After 96 hours of culture at 37 ° C., 1 mCi of [ 3 H] thymidine is added per well. After 18 hours of incubation, the cellular DNA is trapped on filter paper using a semi-automatic sampler. The incorporation is measured in counts per minute by counting in liquid scintillation. The results are illustrated in Figure 8, which shows that the two antibodies Mu-K20 and Hu-K20 inhibit the proliferation of T lymphocytes from a low concentration of 1 ng / ml. For concentrations greater than 0.1 μg / ml which is the saturating concentration of the antibody, it is noted that the inhibition can decrease. 2. Measurement of adhesion to fibronectin.
La fibronectine et de l'albumine bovine (50 μg/ml) (SIGMA) sont immobilisées dans des plaques à 96 puits, où sont incubées des cellules JURKAT préalablement chargées avec une sonde fluorescente, le BCECFFibronectin and bovine albumin (50 μg / ml) (SIGMA) are immobilized in 96-well plates, where JURKAT cells are incubated beforehand loaded with a fluorescent probe, BCECF
(Boehringer) , et marquées à l'aide des anticorps K20 (10 μg/ml) et de l'anticorps 4B4 (COULTER CLONE) , qui est un anti-VLA4. Après incubation 2 heures à 37°C, les plaques sont lavées 3 fois avec du PBS, et la fluorescence mesurée sur CITYFLUOR (MILLIPORE) . L'adhésion spécifique est calculée en tenant compte du nombre de cellules déposées initialement dans le puits (150000) et de la fixation non spécifique sur l'albumine. Les résultats sont illustrés par la Figure 9, qui montre que les deux anticorps Mu-K20 et Hu-K20 n'inhibent pas la fixation à la fibronectine, contrairement à l'anticorps 4B4.(Boehringer), and labeled using K20 antibodies (10 μg / ml) and 4B4 antibody (COULTER CLONE), which is an anti-VLA4. After incubation for 2 hours at 37 ° C., the plates are washed 3 times with PBS, and the fluorescence measured on CITYFLUOR (MILLIPORE). The specific adhesion is calculated by taking into account the number of cells initially deposited in the well (150,000) and the non-specific binding to albumin. The results are illustrated in FIG. 9, which shows that the two antibodies Mu-K20 and Hu-K20 do not inhibit the binding to fibronectin, unlike the antibody 4B4.
La région des résidus 207 à 218 de la chaîne βi des intégrines est critique pour la liaison de l'anticorps 4B4; Cette région est localisée entre les deux sites putatifs de liaison des ligands (résidus 120- 182 et 220-231) . De son côté, l'anticorps K20 murin reconnaît la région carboxy-terminale de la βl (résidus 426-587) (TAKADA et PUZON, 1993, J. Biol. Chem. 17597- 17601) . 3. Mesure de la cytotoxicité induite par le complément.The region of residues 207 to 218 of the integrin βi chain is critical for the binding of the antibody 4B4; This region is located between the two putative ligand binding sites (residues 120-182 and 220-231). For its part, the murine K20 antibody recognizes the carboxy-terminal region of β1 (residues 426-587) (TAKADA and PUZON, 1993, J. Biol. Chem. 17597-17601). 3. Measurement of the cytotoxicity induced by the complement.
Après marquage par l'un ou l'autre des deux anticorps Mu-K20 ou Hu-K20, les cellules sont incubées avec du complément de lapin pendant 50 min. à température ambiante. Après lavage on détermine le rapport nombre de cellules mortes/nombre de cellules vivantes après coloration au Bleu Trypan. L'anticorps murin D66 (CD2) est utilisé comme contrôle positif.After labeling with one or other of the two antibodies Mu-K20 or Hu-K20, the cells are incubated with rabbit complement for 50 min. at room temperature. After washing, the number of dead cells / number of living cells after staining with Trypan Blue is determined. The murine antibody D66 (CD2) is used as a positive control.
Cette expérimentation, dont les résultats sont illustrés par la figure 10, montre que les anticorps Mu- K20 et Hu-K20 n'induisent pas la lyse des cellules en présence de complément. This experiment, the results of which are illustrated in FIG. 10, shows that the antibodies Mu-K20 and Hu-K20 do not induce the lysis of the cells in the presence of complement.
LISTE DE SEQUENCESLIST OF SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:(1) GENERAL INFORMATION:
(i) DEPOSANT: (A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)(i) APPLICANT: (A) NAME: NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH AND MEDICAL RESEARCH (INSERM)
(B RUE: 101, rue de Tolbiac (C VILLE: PARIS (D ETAT OU PROVINCE: FRANCE (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 75654 CEDEX 13(B RUE: 101, rue de Tolbiac (C CITY: PARIS (D STATE OR PROVINCE: FRANCE (E COUNTRY: FRANCE (F POSTAL CODE: 75654 CEDEX 13
(A NOM: PROTEINE PERFORMANCE SOCIETE ANONYME (B RUE: ROUTE D'ALES (C VILLE: SAINT CHRISTOL-LES-ALES (D ETAT OU PROVINCE: FRANCE (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 30380(A NAME: PROTEINE PERFORMANCE SOCIETE ANONYME (B RUE: ROUTE D'ALES (CITY: SAINT CHRISTOL-LES-ALES (D STATE OR PROVINCE: FRANCE (E COUNTRY: FRANCE (F POSTAL CODE: 30380
(A NOM: MARGARITTE Christelle (B RUE: RESIDENCE COLBERT - BAT. E, 16, RUE DU(A NOM: MARGARITTE Christelle (B RUE: RESIDENCE COLBERT - BAT. E, 16, RUE DU
GENERAL DE GAULLEGENERAL DE GAULLE
(C VILLE: CHATENAY MALABRY (D ETAT OU PROVINCE: FRANCE (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 92290(C TOWN: CHATENAY MALABRY (D STATE OR PROVINCE: FRANCE (E COUNTRY: FRANCE (F POSTAL CODE: 92290
(A NOM: POUL Marie-Alix(NAME: POUL Marie-Alix
(B: RUE: 10, RUE DU DOCTEUR ROUX(B: STREET: 10, RUE DU DOCTEUR ROUX
(C. VILLE: MONTPELLIER (D ETAT OU PROVINCE: FRANCE (E. PAYS: FRANCE(C. CITY: MONTPELLIER (D STATE OR PROVINCE: FRANCE (E. COUNTRY: FRANCE)
(F CODE POSTAL: 34000(F POSTAL CODE: 34000
(A NOM: LEFRANC Marie-Paule (B RUE: 4, RUE DU VALLON (C VILLE: CLAPIERS (D ETAT OU PROVINCE: FRANCE (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 34830(A NAME: LEFRANC Marie-Paule (B RUE: 4, RUE DU VALLON (C CITY: CLAPIERS (D STATE OR PROVINCE: FRANCE (E COUNTRY: FRANCE (F POSTAL CODE: 34830
(A NOM: CERVONY MARY Florence (B RUE: 15, AVENUE ANTONIA AUGUSTA (C VILLE: NICE (D ETAT OU PROVINCE: FRANCE (E PAYS: FRANCE (F CODE POSTAL: 06000(A NAME: CERVONY MARY Florence (B RUE: 15, AVENUE ANTONIA AUGUSTA (C CITY: NICE (D STATE OR PROVINCE: FRANCE (E COUNTRY: FRANCE (F POSTAL CODE: 06000
(A NOM: BERNARD Alain (B RUE: - (C VILLE: - (D ETAT OU PROVINCE: - (E PAYS: - (F) CODE POSTAL: -(A NAME: BERNARD Alain (B RUE: - (C CITY: - (D STATE OR PROVINCE: - (E COUNTRY: - (F) POSTAL CODE: -
(ii) TITRE DE L' INVENTION: OBTENTION D'UN ANTICORPS MONOCLONAL RECOMBINANT HUMANISE A PARTIR D'UN ANTICORPS MONOCLONAL MURIN, SA PRODUCTION EN CELLULES D'INSECTE, ET SES UTILISATIONS.(ii) TITLE OF THE INVENTION: OBTAINING A HUMANIZED RECOMBINANT MONOCLONAL ANTIBODY FROM A MURIN MONOCLONAL ANTIBODY, ITS PRODUCTION IN INSECT CELLS, AND ITS USES.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 20(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 20
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:(iv) COMPUTER-DETACHABLE FORM:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (OEB)(D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GGTAGATCTC AGCTTGGTCC C 21(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GGTAGATCTC AGCTTGGTCC C 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases(A) LENGTH: 24 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCA 24(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: GACATTCAGC TGACCCAGTC TCCA 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases(A) LENGTH: 34 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC CCAG 34(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TGAGGAGACG GTGACCGTGG TCCCTTGGCC CCAG 34
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 22 paires de bases(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AGGTSMARCT GCAGSAGTCW GG 22(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: AGGTSMARCT GCAGSAGTCW GG 22
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 325 paires de bases(A) LENGTH: 325 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ix) CARACTERISTIQUE:(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NOM/CLE: CDS(A) NAME / KEY: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..325(B) LOCATION:! .. 325
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
GACATCCAGC TGACCCAGTC TCCATCCTCA CTGTCTGCAT CTCTGGGAGG CAAAGTCACC 60GACATCCAGC TGACCCAGTC TCCATCCTCA CTGTCTGCAT CTCTGGGAGG CAAAGTCACC 60
ATCACTTGCA AGGCAAGCCA AGACATTAAC AAGTATATAG CTTGGTACCA ACACGAGCCT 120ATCACTTGCA AGGCAAGCCA AGACATTAAC AAGTATATAG CTTGGTACCA ACACGAGCCT 120
GGAAAAGGTC CTAGGCTGCT CATACGTTAC ACATCAAAAC TAGAGTCAGG CATCCCATCA 180GGAAAAGGTC CTAGGCTGCT CATACGTTAC ACATCAAAAC TAGAGTCAGG CATCCCATCA 180
AGGTTCAGTG GAAGTGGGTC TGGGAGAGAT TATTCCTTCA GCATCAGCAA CCTGGAGCCT 240AGGTTCAGTG GAAGTGGGTC TGGGAGAGAT TATTCCTTCA GCATCAGCAA CCTGGAGCCT 240
GAAGATATTG CAACTTATTA CTGTCTACAG TATTATAATC TTTGGACGTT CGGTGGAGGG 300 ACCAAGCTGG AGATCAAACG TAAGT 325GAAGATATTG CAACTTATTA CTGTCTACAG TATTATAATC TTTGGACGTT CGGTGGAGGG 300 ACCAAGCTGG AGATCAAACG TAAGT 325
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 349 paires de bases(A) LENGTH: 349 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(ix) CARACTERISTIQUE:(ix) CHARACTERISTIC:
(A) NOM/CLE: CDS(A) NAME / KEY: CDS
(B) EMPLACEMENT:!..349 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:(B) LOCATION:! .. 349 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CAGGTCCAAC TGCAGGAGTC TGGGACTGAG CTCGTGAGGC CTGGGGCTTC AGTGAAGTTG 60CAGGTCCAAC TGCAGGAGTC TGGGACTGAG CTCGTGAGGC CTGGGGCTTC AGTGAAGTTG 60
TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CACTTTCACT GACTACTATA TAAGCTGGGT GAAACAGAGG 120TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CACTTTCACT GACTACTATA TAAGCTGGGT GAAACAGAGG 120
CCTGGACAGG GACTTGAGTG GATTGCAAGG ATTTATCCTG GAAGTGGTAA TACTTTCTAC 180CCTGGACAGG GACTTGAGTG GATTGCAAGG ATTTATCCTG GAAGTGGTAA TACTTTCTAC 180
AATGAGAAAT TCAAGGGCAA GGCCACACTG ACTGCAGAAA CGTCCTCCAA CACTGCCTAC 240AATGAGAAAT TCAAGGGCAA GGCCACACTG ACTGCAGAAA CGTCCTCCAA CACTGCCTAC 240
ATGCAGCTCA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCTGTCT ATTTCTGTGC AATTTACTAC 300ATGCAGCTCA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCTGTCT ATTTCTGTGC AATTTACTAC 300
GGTAGTGGTG ACTACTGGGG CCAAGGGACC ACGGTCACCG TCTCCTCAG 349 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:GGTAGTGGTG ACTACTGGGG CCAAGGGACC ACGGTCACCG TCTCCTCAG 349 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 53 paires de bases(A) LENGTH: 53 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: CCATCACCTG GAAGGCAAGC CAGGACATTA ACAAGTATAT AGCTTGGTAC CAG 53(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: CCATCACCTG GAAGGCAAGC CAGGACATTA ACAAGTATAT AGCTTGGTAC CAG 53
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8 :(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 47 paires de bases(A) LENGTH: 47 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: CAAAGCTGAT CCGTTACACA TCAAAACTAG AGTCAGGTGT GCCAAGC 47(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: CAAAGCTGAT CCGTTACACA TCAAAACTAG AGTCAGGTGT GCCAAGC 47
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 45 paires de bases(A) LENGTH: 45 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
CCTACTACTG CCTACAGTAT TATAATCTTT GGACGTTCGG CCAAG 45CCTACTACTG CCTACAGTAT TATAATCTTT GGACGTTCGG CCAAG 45
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 41 paires de bases (B) TYPE: nucléotide(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE: (A) LENGTH: 41 base pairs (B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GATACACCTT CACTGACTAC TATATAAGCT GGGTGCGCCA G 41(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: GATACACCTT CACTGACTAC TATATAAGCT GGGTGCGCCA G 41
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 72 paires de bases(A) LENGTH: 72 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: GAGTGGATGG GAAGGATTTA TCCTGGAAGT GGTAATACTT TCTACAATGA GAAATTCAAG 60 GGCAGAGTCA CC 72(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: GAGTGGATGG GAAGGATTTA TCCTGGAAGT GGTAATACTT TCTACAATGA GAAATTCAAG 60 GGCAGAGTCA CC 72
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 42 paires de bases(A) LENGTH: 42 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: TATTACTGTG CGATTTACTA CGGTAGTGGT GACTACTGGG GC 42(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: TATTACTGTG CGATTTACTA CGGTAGTGGT GACTACTGGG GC 42
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases(A) LENGTH: 17 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: AGCTCGAGAT CAAACGG 17(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: AGCTCGAGAT CAAACGG 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 28 paires de bases(A) LENGTH: 28 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: GAAGATCTAA CACTCTCCGC GGTTGAAG 28(D) CONFIGURATION: linear (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 14: GAAGATCTAA CACTCTCCGC GGTTGAAG 28
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: ACGTTTCTCG AGCYTGGTSC C 21(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: ACGTTTCTCG AGCYTGGTSC C 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: GACATCGAGC TCACCCAG 18(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: GACATCGAGC TCACCCAG 18
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases(A) LENGTH: 24 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: CAAGGTACCA CGGTCACCGT CTCC 24(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: CAAGGTACCA CGGTCACCGT CTCC 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases(A) LENGTH: 29 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: GAAGATCTCA TTTACCCGGA GACAGGGAG 29(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 18: GAAGATCTCA TTTACCCGGA GACAGGGAG 29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19: (i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases(A) LENGTH: 23 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple(C) NUMBER OF STRANDS: single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: AGGTSMARCT GCAGSAGT C GGG 23(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 19: AGGTSMARCT GCAGSAGT C GGG 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 34 paires de bases(A) LENGTH: 34 base pairs
(B) TYPE: nucléotide(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: Simple(C) NUMBER OF STRANDS: Single
(D) CONFIGURATION: linéaire(D) CONFIGURATION: linear
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: TGAGGAGACG GTGACCGTGG TACCTTGGCC CCAG 34 (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 20: TGAGGAGACG GTGACCGTGG TACCTTGGCC CCAG 34

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé d'humanisation de la région variable VJJ et/ou de la région variable VL d'une immunoglobuline non-humaine, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :1) Method for humanizing the VJJ variable region and / or the VL variable region of a non-human immunoglobulin, which method is characterized in that it comprises at least the following steps:
- une étape où l 'on sélectionne une séquence d'ADN codant pour la région variable VH ou pour la région variable VL d'une immunoglobuline humaine, la séquence en acides aminés des régions FR de ladite région VJJ ou de ladite région VL humaine présentant respectivement entre 70 et 95 % d'homologie avec la séquence en acides aminés des régions FR de la région VJJ ou de la région VL de 1 ' immunoglobuline non-humaine, et les boucles hypervariables Hl et H2 de ladite région VH humaine ou les boucles hypervariables Ll, L2 et L3 de ladite région VL humaine présentant respectivement le même type de structure canonique que les boucles hypervariables Hl et H2 de la région VJJ ou les boucles hypervariables Ll, L2 et L3 de la région VL de 1 ' immunoglobuline non-humainea step in which a DNA sequence coding for the variable region V H or for the variable region V L of a human immunoglobulin is selected, the amino acid sequence of the FR regions of said VJJ region or of said VL region human having respectively between 70 and 95% homology with the amino acid sequence of the FR regions of the VJJ region or of the V L region of the non-human immunoglobulin, and the hypervariable loops Hl and H2 of said V H region human or the hypervariable loops L1, L2 and L3 of said region V L human having respectively the same type of canonical structure as the hypervariable loops Hl and H2 of the region VJJ or the hypervariable loops Ll, L2 and L3 of the region VL of 1 non-human immunoglobulin
- une étape où 1 ' on procède au remplacement des séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR de ladite région VJJ ou VL humaine, par les séquences oligonucléotidiques codant pour les CDR correspondantes de la région Vy ou VL de 1 ' immunoglobuline non-humaine.a step in which the oligonucleotide sequences coding for the CDRs of said human VJJ or VL region are replaced by the oligonucleotide sequences coding for the corresponding CDRs of the Vy or VL region of the non-human immunoglobulin.
2) Fragment d'ADN codant pour la région variable VJJ ou pour la région variable VL d'un anticorps humanisé Hu-Ac, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication l. 3) Fragment d'ADN selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu à partir de l'anticorps murin K20, et code pour la région variable VJJ ou pour la région variable VL d'un anticorps humanisé dénommé Hu-K20. 4) Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'ADN selon une quelconque des revendications 2 ou 3, placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. 5) Cassette d'expression selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments permettant l'expression de la chaîne lourde ou de la chaîne légère d'un anticorps recombinant Hu-Ac, lesdits éléments étant constitués par : - un promoteur de baculovirus, sous contrôle transcriptionnel duquel sont placés :2) DNA fragment coding for the VJJ variable region or for the VL variable region of a humanized Hu-Ac antibody, characterized in that it is capable of being obtained by the method according to claim l. 3) DNA fragment according to claim 2, characterized in that it is capable of being obtained from the murine antibody K20, and code for the variable region VJJ or for the variable region VL of a humanized antibody referred to as Hu-K20. 4) Expression cassette characterized in that it comprises at least one DNA fragment according to any one of claims 2 or 3, placed under transcriptional control of an appropriate promoter. 5) Expression cassette according to claim 4, characterized in that it comprises the elements allowing the expression of the heavy chain or the light chain of a recombinant Hu-Ac antibody, said elements being constituted by: - a baculovirus promoter, under transcriptional control of which are placed:
- une séquence codant pour un peptide signal de sécrétion ,• et- a sequence coding for a secretion signal peptide, • and
- une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac et une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne légère d'une immunoglobuline humaine ; ou biena sequence coding for the variable domain of the light chain of the Hu-Ac antibody and a sequence coding for the constant domain of the light chain of a human immunoglobulin; or
- une séquence codant pour le domaine variable de la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac et une séquence codant pour le domaine constant de la chaîne lourde d'une immunoglobuline humaine.a sequence coding for the variable domain of the heavy chain of the Hu-Ac antibody and a sequence coding for the constant domain of the heavy chain of a human immunoglobulin.
6) Cassette d'expression selon une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce que le promoteur de baculovirus est le promoteur de la polyédrine ou l'un de ses dérivés, ou bien le promoteur de la plO ou l'un de ses dérivés.6) Expression cassette according to any one of claims 4 or 5, characterized in that the baculovirus promoter is the promoter of polyhedrin or one of its derivatives, or else the promoter of plO or one of its derivatives.
7) Vecteur recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un fragment d'ADN selon une quelconque des revendications 2 ou 3. 8) Vecteur recombinant selon la revendication7) Recombinant vector, characterized in that it comprises at least one DNA fragment according to any one of claims 2 or 3. 8) Recombinant vector according to claim
7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 4 à 6. 9) Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il constitue un vecteur de transfert, portant un insert comprenant : une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 4 à 6, et de part et d'autre de cette cassette, des séquences de baculovirus homologues de celles des régions flanquant la portion du génome de baculovirus en remplacement de laquelle on souhaite insérer ladite cassette.7, characterized in that it comprises at least one expression cassette according to any one of claims 4 to 6. 9) Recombinant vector according to claim 8, characterized in that it constitutes a transfer vector, carrying an insert comprising: an expression cassette according to any one of claims 4 to 6, and on either side of this cassette , baculovirus sequences homologous to those of the regions flanking the portion of the baculovirus genome in replacement of which it is desired to insert said cassette.
10) Vecteur de transfert selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdites séquences de baculovirus sont homologues de celles des régions flanquant le gène de la plO, ou homologues de celles des régions flanquant le gène de la polyédrine.10) Transfer vector according to claim 9, characterized in that said baculovirus sequences are homologous to those of the regions flanking the p10O gene, or homologous to those of the regions flanking the polyedrine gene.
11) Vecteur de transfert selon la revendication 10, caractérisé en ce que la cassette d'expression contenant le gène codant pour la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac est flanquée des régions entourant le gène de la polyédrine dans le baculovirus sauvage, et la cassette d'expression portant le gène codant pour la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac est flanquée des régions entourant le gène PlO dans le baculovirus sauvage.11) Transfer vector according to claim 10, characterized in that the expression cassette containing the gene coding for the light chain of the antibody Hu-Ac is flanked by the regions surrounding the polyhedrin gene in wild baculovirus, and the expression cassette carrying the gene coding for the heavy chain of the Hu-Ac antibody is flanked by the regions surrounding the PlO gene in the wild baculovirus.
12) Baculovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 4 à 6.12) Recombinant baculovirus characterized in that it comprises at least one expression cassette according to any one of claims 4 to 6.
13) Baculovirus recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, et une cassette d'expression comprenant la séquence codant pour la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac.13) Recombinant baculovirus according to claim 12, characterized in that it comprises an expression cassette comprising the sequence coding for the H chain of the Hu-Ac antibody, and an expression cassette comprising the sequence coding for the chain L of the antibody Hu-Ac.
14) Baculovirus recombinant selon la revendication 13, caractérisé en ce que le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, et le promoteur contrôlant la transcription de la séquence codant pour la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, sont deux promoteurs différents.14) Recombinant baculovirus according to claim 13, characterized in that the promoter controlling the transcription of the sequence coding for the L chain of the Hu-Ac antibody, and the promoter controlling the transcription of the sequence coding for the H chain of the Hu-Ac antibody, are two different promoters.
15) Baculovirus recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'un desdits promoteurs est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la polyédrine et l'autre est situé à l'emplacement occupé chez le baculovirus sauvage, par le promoteur de la PlO.15) Recombinant baculovirus according to claim 14, characterized in that one of said promoters is located at the location occupied in the wild baculovirus, by the polyhedrin promoter and the other is located at the location occupied in the baculovirus wild, by the promoter of PlO.
16) Baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que la transcription de la séquence codant pour la chaîne légère de l'anticorps Hu-Ac est sous contrôle du promoteur de la polyédrine ou de l'un de ses dérivés, et la transcription de la séquence codant pour la chaîne lourde de l'anticorps Hu-Ac est sous contrôle du promoteur de la PlO ou de l'un de ses dérivés.16) Recombinant baculovirus according to any one of claims 12 to 15, characterized in that the transcription of the sequence coding for the light chain of the Hu-Ac antibody is under the control of the promoter of the polyhedrin or of one of its derivatives , and the transcription of the sequence encoding the heavy chain of the Hu-Ac antibody is under the control of the promoter of PlO or one of its derivatives.
17) Baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce que la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne L de l'anticorps Hu-Ac, et la séquence codant pour le peptide signal associé à la chaîne H de l'anticorps Hu-Ac, sont deux séquences différentes.17) Recombinant baculovirus according to any one of claims 12 to 16, characterized in that the sequence coding for the signal peptide associated with the L chain of the Hu-Ac antibody, and the sequence coding for the signal peptide associated with the H chain of the Hu-Ac antibody, are two different sequences.
18) Baculovirus recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il s'agit du baculovirus recombinant AclOHK20hu-33LK20hu(lll) , déposé le 9 septembre 1994, auprès de la C.N.C.M., sous le numéro 1-1476.18) Recombinant baculovirus according to claim 12, characterized in that it is the recombinant baculovirus AclOHK20hu-33LK20hu (III), deposited on September 9, 1994, with the C.N.C.M., under the number 1-1476.
19) Cellules d'insecte infectées avec un baculovirus recombinant selon une quelconque des revendications 12 à 18.19) Insect cells infected with a recombinant baculovirus according to any one of claims 12 to 18.
20) Procédé de préparation d'un anticorps recombinant humanisé, caractérisé en ce qu'il comprend une étape au cours de laquelle l'on cultive des cellules d'insecte selon la revendication 19, et une étape au cours de laquelle l'on obtient ledit anticorps à partir du milieu de culture. 20) A method of preparing a humanized recombinant antibody, characterized in that it comprises a step during which insect cells are cultivated according to claim 19, and a step during which one obtains said antibody from the culture medium.
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