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WO1994005788A1 - Neurotrophic peptide - Google Patents

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WO1994005788A1
WO1994005788A1 PCT/JP1993/001214 JP9301214W WO9405788A1 WO 1994005788 A1 WO1994005788 A1 WO 1994005788A1 JP 9301214 W JP9301214 W JP 9301214W WO 9405788 A1 WO9405788 A1 WO 9405788A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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ser
leu
pro
lys
asp
Prior art date
Application number
PCT/JP1993/001214
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Naoki Tohdoh
Shin-Ichiro Tojo
Kosei Ojika
Shin-Ichi Kojima
Nobuyuki Fukushima
Tsunemasa Irie
Keiichi Ono
Hideo Agui
Yasuyuki Ueki
Toshio Nishihara
Yumiko Kamikawa
Mutsuo Taiji
Original Assignee
Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Yamamoto, Masahiko
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited, Yamamoto, Masahiko filed Critical Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Publication of WO1994005788A1 publication Critical patent/WO1994005788A1/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to neurotrophic factor-related polypeptides, their genes and their pharmaceutical uses. More specifically, it relates to a neurotrophic peptide derivative and gene. That is, human or rat-derived neurotrophic peptides and their derivatives useful as pharmaceuticals, their precursors, their precursor polypeptides, genes encoding them, and recombinant expression containing the genes
  • the present invention relates to a transformant containing a vector, and a therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a neurotrophic peptide or a derivative thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to novel neurotrophic peptides, It consists of a neurotrophic peptide having a human-derived neurotrophic factor activity corresponding to a neurotrophic factor having a neurotrophic factor activity derived from a rat hippocampus, or a partial amino acid sequence thereof.
  • the present invention relates to a neurotrophic peptide derivative or a neurotrophic peptide derivative whose terminal has been modified. It also relates to precursor polypeptides, including neurotrophic peptides derived from rat hippocampus or human.
  • genes encoding neurotrophic peptides derived from rat hippocampus or human, or their precursor polypeptides, and recombinant expression vectors incorporating those genes are characterized. It relates to a transformed bacterium, yeast or mammalian cell. Further, the present invention relates to a therapeutic agent for a neurodegenerative disease containing the neurotrophic peptide of the present invention or a derivative thereof as an active ingredient, a method for treating a neurodegenerative disease using the peptide, and a pharmaceutical use of the peptide.
  • Hippocampal cholinergic neurotrophic peptide was isolated from the hippocampal tissue of juvenile rat B3 ⁇ 4 by Oka et al.
  • a neurotrophic peptide consisting of one amino acid residue that promotes acetylcholine production against acetylcholinergic neurons in rat brain septal nucleus tissue (Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-72499), and Oka et al.
  • HCNP derivative having a lower molecular weight EP-A-0 390 602
  • Nerve growth is a proteinaceous factor that has been isolated and whose primary structure has been elucidated.
  • Nerve growth factor (NGF) (Angel e 11 i and Bradshow: Pro Natl. Acad. Sci. USA, 68, 2417, 1971) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (J Le ib 1 ock eta 1 .: Nature, 341, 149, 1989)
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • Ciliary neurotrophic factor (CNTF) (F. Collins eta 1 .: Science, 246, 1023, 1989) is there.
  • NT-3 Neurotrophin-3
  • NT-3 Neurotrophin-3
  • NGF neurotrophic factor
  • HCNP obtained from the rat is a 11-residue peptide factor, and its derivative is a low molecular weight compound as described above. It is considered that these problems can be solved.
  • HCNP obtained conventionally is a factor derived from rat brain, it is more expensive than humans.
  • neurotrophic peptides, especially human-derived HCNP, and derivatives thereof having the same pharmacological action, but useful compounds have not yet been obtained. Is the actual situation.
  • the present invention is to solve the above-mentioned conventional problems.
  • an object of the present invention is to provide a novel neurotrophic peptide having a neurotrophic effect on acetylcholinergic neuron (hereinafter sometimes abbreviated as HCNP in the present specification). Or a derivative thereof.
  • HCNP acetylcholinergic neuron
  • Another object of the present invention is to provide a gene encoding the aforementioned neurotrophic peptide.
  • Still another object of the present invention is to provide a transformant containing an expression vector containing the above gene.
  • Still another object of the present invention is to provide a novel therapeutic agent for a neurodegenerative disease.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating a neurodegenerative disease.
  • Yet another object of the present invention is to provide a pharmaceutical use of a novel neurotrophic peptide or derivative thereof. Disclosure of the invention
  • the present inventors have determined that the amino acid sequence of human-derived HCNP corresponding to rat brain-derived HCNP contains rat brain-derived HCNP. Cloning of genes encoding body proteins was performed.
  • a search for a gene encoding a precursor protein was carried out from a cDNA library prepared using mRNA prepared from rat hippocampal tissue as described in the above-mentioned 11 amino acids. This was performed using a polyclonal antibody against rat HCNP composed of an acid.
  • a precursor gene containing rat HCNP was successfully isolated from all genes working in hippocampal tissue cells of the immature rat brain, and the present invention was completed. It is.
  • a gene encoding a human precursor polypeptide was successfully isolated from a gene encoding a rat precursor polypeptide described above. Furthermore, a human-type peptide consisting of 11-amino acid corresponding to a rat neurotrophic peptide was found to have neurotrophic factor activity, leading to the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a neurotrophic peptide derivative having a neurotrophic effect in which the N-terminus and the Z- or C-terminus of the neurotrophic peptide or the neurotrophic peptide derivative according to the above (5) are modified; (7) SEQ ID NO: A precursor polypeptide represented by 3; (8) a precursor polypeptide represented by SEQ ID NO: 14; (9) y-P at the C-terminal site of a human-derived neurotrophic peptide a neurotrophic peptide derivative containing a ro-Leu sequence (10) a bacterium, yeast or mammalian cell transformed with a recombinant expression vector containing said gene;
  • a therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising the above-mentioned neurotrophic peptide or neurotrophic peptide derivative as an active ingredient
  • a method for treating a neurodegenerative disease comprising administering the above-mentioned peptide
  • FIG. 1 is a diagram showing the sequence of an oligonucleotide probe used for screening a clone.
  • the probe region used in the nucleotide sequence deduced from the amino acid sequence of the neurotrophic peptide derived from the rat hippocampus is shown in the figure.
  • the C-terminal probe is a mixed probe consisting of 16 bases consisting of 256 kinds.
  • FIG. 2 is a diagram showing a restriction enzyme map of a neurotrophic peptide precursor gene derived from the rat hippocampus and a strategy for sequencing.
  • A61cDNA The pattern of cleavage of the precursor gene clone (A61cDNA) by the restriction enzyme is shown in the figure.
  • A61cDNA (EcoRI about 1 Kb fragment) had HinclI, SacII, PstI, and SmaI cleavage sites. Clones were subcloned using these cleavage sites, and the nucleotide sequence of the region indicated by the wavy line was determined. The bold line in AG lc DNA indicates the result of nucleotide sequence determination. Represents an open reading frame.
  • FIG. 3 shows the entire nucleotide sequence of clone A61c DNA containing the neurotrophic peptide precursor gene from rat hippocampus together with FIG.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence is also shown. There is an amino acid sequence having neurotrophic factor activity from the N-terminus of the open reading frame, and the number of amino acids constituting the open reading frame is 1 It was 8 6.
  • the underline in the figure indicates the poly (A) addition signal.
  • the ATG sequence which is a translation initiation code is not included in the open reading frame.
  • FIG. 4 shows together with FIG. 3 the entire nucleotide sequence of clone A61c DNA containing the neurotrophic peptide precursor gene from rat hippocampus.
  • FIG. 5 shows the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequences shown in FIGS. 3 and 4. This amino acid sequence does not contain a translation initiation codon.
  • FIG. 6 is a diagram showing a step of inserting a rat and human-derived neurotrophic peptide precursor gene into an Escherichia coli expression vector pKK233-3-2 derivative.
  • FIG. 7 is a diagram showing a step of introducing a rat and human hippocampus-derived neurotrophic peptide precursor gene into a eukaryotic cell expression vector.
  • the following procedure was used to construct the expression vector to be introduced. After digesting pMDSGDNA containing MMT V—LTR with HindI I I, the DNA fragment containing MMT V—LTR 1.4 Kb is treated with DNA polymerase I (Klenow fragment) and smoothed. An XbaI linker was added to insert into the XbaI site of pBluescript II. After SV40 DNA was digested with BcII-EcoRI, the 1 Kb DNA fragment having a poly (A) addition signal was similarly blunted, and after adding Xh0I linker, pBluescri It was inserted into the XhoI site of ptII. In addition, a 2.6 Kb Bam HI fragment containing the neomycin resistance gene contained in pMAN-neo was previously inserted into the SmaI site.
  • the gene encoding the rat precursor polypeptide of the present invention is a juvenile rat hippocampus 12 days after birth in which the presence of a rat trophic neuron-derived neurotrophic peptide is recognized. After preparing mRNA from the tissue, it is converted to double-stranded cDNA by a known method, and the protein encoded in the cDNA is synthesized in E. coli, and a rat hippocampus-derived neurotrophic peptide is synthesized. It can be obtained by isolating clones that are reactive with antibodies to sulfide.
  • the adjustment of the total RNA of the juvenile rat hippocampus tissue may be performed by a conventional method which has already been used for the cloning of some bioactive proteins.
  • a method for degrading cells by treating the cells in the presence of a surfactant or phenol such as SDS, NP-40, Triton-X100, etc. (J. Sambrook et al .: "Molecular Cloning-A laboratory manual, 2nd ed.”, Cold
  • mRNA was designated as type II, and the oligo (dT) primer (U. Gubler and BJ Hoffman: Gene, 25. 263, 1983; and Shneider et al .: Nature, 311, 675, 1984) ) Or random primers consisting of 6 bases (H. Haymer 1e et a 1 .: Nuc 1. Acid. Res., 14, 8615, 1986; and S. Koike et al .: Nucl. Acid. Res., 15, 2499, 1987), reverse transcriptase (tri myeloblasts) in the presence of dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
  • dT oligo primer
  • random primers consisting of 6 bases (H. Haymer 1e et a 1 .: Nuc 1. Acid. Res., 14, 8615, 1986; and S. Koike et al .: Nucl. Acid. Res., 15, 2499, 1987), reverse transcriptase (tri myeloblasts)
  • Synthetic single-stranded cDNA complementary to mRNA is synthesized by AML virus (derived from AMV or mouse leukemia virus; derived from M0-MLV). Next, the mRNA is degraded by performing an alkali treatment, and then the single-stranded cDNA is converted into type II, and the two strands are subjected to reverse transcriptase or DNA polymerase. Synthesize strand cDNA.
  • double-stranded cDNA can be synthesized by directly using RNaseH and E. coli DNA polymerase I (U. Gubler and BJ).
  • pBR322 As vectors for incorporating the double-stranded cDNA thus obtained, pBR322, pUC19, pSC101, ColEl, and Honjo vectors are used. EK1 type plasmid vectors such as IGT10, ⁇ gt11, ⁇ gtWES, ⁇ zap, etc. are frequently used. When double-stranded cDNA is introduced into these vectors, the vector can be ligated by activating T4DNA ligase in the presence of ATP.
  • E. coli (AG-1, HB101, JM109, DH5, C600, Y109, LE39) (2 strains) can be transformed to obtain a DNA group of the transformed strain (hereinafter, referred to as cDNA library).
  • Escherichia coli harboring a precursor gene containing a gene encoding a rat hippocampus-derived neurotrophic peptide can be selected after transformation using one of the following two methods. You.
  • the nucleotide sequence is inferred, and this nucleotide sequence is chemically synthesized and used as a probe.
  • the region having the least combination of nucleotide sequences should be used as the oligonucleotide probe. Is desirable.
  • Transformants can be selected using the colony or plaque-hybridization method (J. Sambrook et al.). a 1.: "Molecular Cloning-A laboratory manual, 2nd. et"., Cold Spring Harbor Lab, New York, 1989;
  • SEQ ID NO: 17 Oligopeptide is chemically synthesized based on the amino acid sequence of 17, and the amino acid sequence is tanno such as serum albumin. The synthesized oligopeptide is allowed to bind to the protein, and the antibody to the resulting complex protein is prepared using a heron.
  • proteins such as ⁇ -galactosidase can be inserted into the gene encoding the protein to encode the protein into cD ⁇ ⁇ .
  • Quality / 3-expressed in a form fused with proteins such as galactosidase. Therefore, the recombinant expression vector in which the cDNA is incorporated is introduced into host E. coli to obtain a transformant, and the protein produced in the transformant is subjected to membrane blotting by the ⁇ ⁇ stanblotting method or the like.
  • a simple method for detecting the target transformant is to detect a rabbit antibody that binds to the protein immobilized on the membrane filter. ⁇ ⁇ The following methods can be used to detect the heron antibody.
  • React protein A protein which has high binding ability to Ig antibody, with a rabbit antibody that binds to the target protein.
  • protein A is labeled with a radioactive substance in advance
  • the target transformant can be detected by taking an autoradiogram (TV Huyn et a 1 .: " DNA Cloning-A practical approach, I RL press, Oxford, 1985) 0
  • Either method can be used to detect the target transformant, but method 1) has the lowest background and high sensitivity.
  • the rat precursor gene containing the rat hippocampus-derived neurotrophic peptide of the present invention can be cloned as described above, and is an amino acid represented by SEQ ID NO: 3.
  • a gene encoding the acid sequence is obtained.
  • the position 134 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 indicates Glu, but this site may be Lys.
  • Such a gene includes, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the protein corresponding to the obtained precursor gene showed extremely high homology with the phosphophosphidylethanolamine binding protein of E. coli (84.4%) (F.
  • the rat hippocampus-derived neurotrophic peptide was present at the N-terminus of the precursor protein. Rat hippocampus-derived neurotrophic peptides and their lower molecular weight derivatives are disclosed in JP-A-3-72499 and EP-A-0 039 602 as described above. Although the structure has already been clarified, no gene has been reported. The present inventors have described the above By clarifying the precursor gene as described above, the gene encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) of the rat hippocampus-derived neurotrophic peptide was identified. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was found.
  • rat precursor gene cDNA containing rat hippocampus-derived neurotrophic peptide thus obtained as a probe, a human cDNA gene corresponding to the rat gene Cloning is possible.
  • these cDNA libraries are phage particles in which the cDNA is incorporated into a phage vector such as ⁇ gt10, ⁇ gt11 or Izap. Purchased as These phage libraries can be infected with appropriate E. coli (C600, Y1088, ⁇ 109, XL1- -1 ⁇ e, etc.) to transform E. coli. It is possible. Escherichia coli, which has a human cDNA gene corresponding to a precursor gene containing a gene encoding a rat hippocampus-derived neurotrophic peptide, is radiolabeled with a rat precursor gene cDNA fragment. A simple method is to use this as a probe to select by the plaque hybridization method. Preparation of the probe involves the rat precursor gene. After purifying the DNA fragment, the DNA fragment may be labeled with 32 P using the nickel translation method or the random primer labeling method.
  • E. coli C600, Y1088, ⁇ 109, XL1- -1 ⁇
  • the present inventors have succeeded in isolating and determining the structure of a human precursor gene from the above-mentioned rat precursor gene.
  • the human precursor gene of the present invention encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and such a gene is represented by SEQ ID NO: 1. The ones shown in 3 are listed.
  • the human HCNP has the following amino acid sequence structure (SEQ ID NO: 15). It was estimated that the peptide was very different from rat-type HCNP.
  • a gene shown in SEQ ID NO: 16 is exemplified as a gene encoding such a human HCNP.
  • H-Pro-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH hereinafter referred to as HCNP peptide derived from human
  • the neurotrophic effect also referred to as neurotrophic factor activity
  • the neurotrophic effect refers to, for example, an effect of regulating the differentiation and maturation of nerve cells, that is, acetylcholine synthesis of cells of the central septum nucleus, which is a cholinergic cell. And the like.
  • a vector incorporating the gene of interest a plasmid vector having replicon and regulatory sequences obtained from a species compatible with the host cell is useful.
  • Plasmid vectors usually contain a replication initiation site (Ori) and marker genes such as drug resistance genes that allow phenotypic selectivity of the transformed cells.
  • strains such as HB101 and JM109 derived from E. coli K12 strain have been transformed into pBR322 or derivatives thereof constructed from R factor obtained from E. coli. Thus, it can be transformed. Since pBR322 has ampicillin and tetracycline resistance genes, transformants that have acquired drug resistance can be easily detected (F. Boliver et al. : Gene, 2, 95, 1977) 0
  • the promoters used for the expression of the genes in bacterial host cells include the E. coli -lactamase and lactose gene promoters and the tributaphan gene promoter.
  • Motor K. I takura et al .: Science, 198, 1056, 1977; DV Goeddel et al .: Nature, 281, 544, 1979; DV Goeddel et al .: Nucl. Acid. Res., 8, 4057, 1980; DV Goeddel et al .: Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 76, 106, 1979; and DV Goeddel et al .: Nature, 287, 411, 1980).
  • Offspring promoters can also be used to express precursor proteins containing rat hippocampus-derived neurotrophic peptides of the present invention.
  • yeast In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms such as yeast can be used as host cells. Saccharomyces
  • cerevisiae is the most commonly used eukaryotic microorganism, other strains can be used.
  • Plasmid YR p7 is most often used for gene expression in yeast (J. Yochem and B. Byers: J. Mol. Biol., 195, 233, 1987; Karin et al. : Proc.
  • This plasmid contains the trp1 gene, which allows for phenotypic selectivity, and has lost the ability to proliferate in the presence of tributphan.
  • a yeast mutant PEP4-1 or the like is used as a host, it is possible to identify a transformant.
  • a poly (A) sequence is added to the 3 ′ end of mRNA transcribed from a gene with some exceptions.
  • NJ Ptofoot and CG Brownlee Nature, 263, 211, 1976
  • these cells When expressing genes in cells derived from eukaryotic multicellular organisms, these cells may be derived from vertebrates such as mammals, invertebrates such as insects, or plant-derived cells. Is also possible. However, for the purpose of the expression of genes expressed in mammals as in the present invention, it is often advantageous to use vertebrate-derived cells as hosts.
  • the vertebrate-derived cells used for gene expression may be either primary cultured cells obtained from animal tissues or cultured cells that have been passaged, but the latter is easier to handle. It is considered a more preferable expression system.
  • examples of host cell lines that are frequently used for expression experiments of various genes are Nama 1 wa cells derived from human kita lymphoma and Vero cells derived from kidney cells derived from African primordial kidney.
  • Examples include 3Y1 cells derived from fibroblasts, but there is basically no limitation on the cell line used as long as the promoter that expresses the gene is compatible with the host cell.
  • a vector for expressing a gene in various types of cultured cell lines requires a promoter for transcription and a signal sequence for addition of poly (A) in the 5 'upstream region of the expressed gene. Including.
  • a replication origin for enabling autonomous growth in eukaryotic cells and an Enhizer region which is a transcriptional activator that acts on transgenic cells are included.
  • a promoter derived from a virus and a promoter derived from a certain chromosome compatible with the cell into which the gene is to be introduced are used as the expression vector promoter.
  • virus-derived promoters include monkey-derived viruses such as SV40, Herpes simple virus, Polio-maurus, and Adenovirus.
  • retro-in-nores rack Long-term repeats (LTRs), which are promoters derived from sarcoma virus RSV, mouse leukemia virus MLV, mouse breast cancer virus MM TV, etc., are also frequently used. .
  • a target gene has been introduced into a vector derived from retrovirus, and virus particles containing the target gene have been produced in the presence of a retrovirus serving as a helper.
  • the gene of interest has been integrated into the host chromosome by virus infection, and the desired gene has been expressed (RG Hawley et al .: Pro Nat 1. Acad. Sci. USA, 84 , 2406, 1987).
  • exogenous viruses derived from viruses such as SV40, poliooma, adeno, and ⁇ papilloma are used, and are not integrated into the host cell chromosome. It is used for the purpose of transiently expressing a gene.
  • viruses such as SV40, poliooma, adeno, and ⁇ papilloma
  • a gene is introduced into a eukaryotic cell, those that do not contain the exogenous origin described above cannot replicate autonomously and are integrated into the host chromosome and are subject to the host chromosome replication mechanism. It will be.
  • Cells transformed with the gene of interest may be identified using as an index the phenotypic selectivity of the transformed cells, such as drug resistance and the ability to grow on a selective medium.
  • Genes that serve as these markers may be contained in the expression vector into which the gene of interest has been introduced, or may be contained in other vectors containing only the marl gene. . In the latter case, It is introduced into the host cell simultaneously with the expression vector containing the target gene.
  • Neomycin resistance gene is often used as a resistance gene that serves as a marker for phenotypic selectivity, and cells that show resistance to neomycin (dienetin); It is identified as a transformed cell (G. Brady et al .: The EBO J., 4, 2583, 1985).
  • the phenotypic selectivity for the selection medium is a marker for hypoxanthine Z guanine phosphorolibosyltransferase (HPRT) deficient or thymidine kinase (TK) deficient mutant cell lines.
  • HPRT hypoxanthine Z guanine phosphorolibosyltransferase
  • TK thymidine kinase
  • HAT hypoxanthine, aminopterin or amethopterin (also known as methotrexate), or thymidine) medium
  • Aminopterin inhibits the biosynthesis of princpyrimidine, so these defective strains cannot grow in HAT medium, but when the chromosome carrying HPRT or TK is retained. Will be able to multiply.
  • E. coli xanthine-guanine phosphoribosinolate transfonase (Eco ⁇ gpt) can be used as a marker gene (G. Ringold et al .: J. Mol.
  • Transfection of genes into mammalian cells is generally performed by DNA-calcium phosphate co-precipitation.
  • the human-derived neurotrophic peptide (hHCNP) of the present invention has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 15) represented by the following formula (I), and is a derivative thereof. Consists of part of the amino acid sequence and at least the sequence-Lys-
  • Neurotrophic peptides with neurotrophic effects including T rp- Derivatives and N-terminal and / or C-terminal modified human-derived neurotrophic peptide derivatives.
  • the human-derived neurotrophic peptide derivative of the present invention is obtained by fragmenting the human-type neurotrophic peptide represented by the formula (I), or by modifying the N-terminus and Z-terminal. Or the derivatization method of C-terminal modification used alone or in combination to modify or convert the structure of the parent compound, a neurotrophic peptide. Derivative means.
  • X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group
  • Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group
  • Z represents at least one sequence Lys-Trp-. Contains the partial amino acid sequence of hHCNP or the entire amino acid sequence of hHCNP.
  • Is a terminal modifying group X for example, ⁇ sill group, sulfonyl Le group, C, ⁇ (: 4 alkyl group, A Mi di- amino group, urea with ⁇ Mi amino group of ⁇ Mi acid residue that binds Residues forming a skeleton or a urethane skeleton may be mentioned.
  • alkoxy group examples include an alkanol group, an aryl group, and a substituent in which a carbonyl group is bonded to a heterocyclic ring.
  • the inole group and the hetero ring are It may be substituted with at least one substituent.
  • the alkanol group includes, for example, a C, to C, 6 linear or branched alkanol group, and specific examples include formyl, acetyl, and propanol. , Butanoyl, 2-methylprononore, pentanole, 3-mechirubinonore, pinokinore, hexanoinole, oktanoyl, Decanoinole, Raouloi, Myristoinore, No. Lumi toile etc.
  • aryl group examples include a 1 to 3 cyclic aryl group, and specific examples thereof include benzoyl, naphthyl, antrilcanoleponyl, and phenyl. Enantolino force Norebonil etc. are listed.
  • Examples of a substituent in which a carbonyl group is bonded to a heterocycle include a saturated or unsaturated 3- to 8-membered monocyclic or 8- to 10-membered bicyclic heterocyclic carbonyl group. And a substituent to which is bonded.
  • Examples of the sulfonyl group include alkylsulfonyl, arylsulfonyl and the like, and the alkylsulfonyl and arylsulfonyl may be substituted with at least one substituent.
  • alkyl of the alkylsulfonyl examples include a C, to C, 6 linear or branched alkyl.
  • a Specific examples of the alkylsulfonyl include methylsulfonyl, ethylsulfonyl, propylsulfonyl, isopropylsulfonyl, butylsulfonyl, pentylsulfonyl, isopentylsulfonyl, hexylsulfonyl, Octylsulfonyl, decylsulfonyl, raurilsulfonyl, myristylsulfonyl, no. Lumitylsulfonyl and the like.
  • aryls of arylsulfonyl for example, one to three-cyclic aryls can be mentioned.
  • Specific examples of arylsulfonyl include phenylsulfonyl, naphthylsulfonyl, anthrinolesulfonyl, and phenanthrylsulfonyl.
  • the residue forming the urea skeleton together with the amino group of the amino acid residue to be bound is, for example, substituted with one or two alkyls or aryls. And more specific examples include, for example, force lubamoyl, 1 or 2 ⁇ (: 4 alkyl or 1-3 cyclic aryries) And aryl may be substituted with at least one substituent, specifically, for example, olevamoyl, N — Nil, N-N-Nil-Nil, N-Etilka, L-Moir, N-Propirka, L-Moir, N-Isop N—Butyl Carol M, N—Ethyl N—Butyl Power Mole, N—Fenino ⁇ ⁇ N N N N N N N N N N N N N N ⁇ —, — N N ⁇ ⁇ — — — — — — — — — — Etch force Lubamo
  • Examples of the residue that forms a urethane skeleton together with the amino group of the amino acid residue to be bound include alkyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl, etc., and include alkyl or alkyloxycarbonyl.
  • the aryl may be substituted with at least one substituent.
  • the alkyl of the alkyloxycarbonyl includes, for example, a C, to C, 6 linear or branched alkyl.
  • Alkyloxycarbonyl is, specifically, methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, butoxycarbonyl, pentyloxycarbonyl, isopentyloxycarbonyl. Examples include ruvonil, hexyloxy carbonyl, octyloxy carbonyl, decyloxy carbonyl, rauri luxica carbonyl, myristyl oxycarbonyl, palmitoxy carbonyl and the like.
  • aryloxycarbonyl aryls include, for example, one- to three-cyclic aryls. Specific examples of aryloxycarbonyl include phenyloxycarbonyl, naphthyloxycarbonyl, antennary carbonyl, phenyloxycarbonyl, and the like. It is.
  • Alkanoyl group aryl group, hetero ring, alkyls
  • substituent for the rufonyyl group, arylsulfonyl group, N-arylcarbamoyl group, alkyloxycarbonyl group or aryloxycarbonyl group include C, -C8 alkyl and amino.
  • R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or C! C alkyl.
  • R 19 and A— are as defined above. And the like.
  • R 1 is a hydrogen atom, unsubstituted or substituted alkyl, hydroxyl, carboxyl, unsubstituted or substituted aryl, C! ⁇ (:. 4 alkoxy down, halo gain down atoms, - C 0 NR 4 R 5 (R 4 and R 5 represent the and Ru synonymous der) or unsubstituted or substituted heterocycle
  • R 2 is hydrogen atom, an unsubstituted or substituted alkyl, or by table halo gain down atoms
  • R 3 represents a hydrogen atom, C, ⁇ C 4 ⁇ alkyl or halogen atom.
  • R 6 represents a hydrogen atom, -C 4 alkyl, or an unsubstituted or substituted aryl
  • R 7 represents a hydrogen atom, or C -C 4 alkyl
  • R 8 —0-CO— wherein R 8 represents unsubstituted or substituted alkyl, or unsubstituted or substituted aryl
  • R 9 -CO-[wherein, R 3 represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted aryl, or an unsubstituted or substituted heterocyclic ring.
  • R 3 represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted aryl, or an unsubstituted or substituted heterocyclic ring.
  • R 1 -[wherein, R ′ 1 represents C 1 , to C 4 alkyl. ] Or
  • R 12 represents C, to (: 4 alkyl, provided that the nitrogen atom to which R 12 is bonded represents an N-terminal amino group.
  • Examples of the C-terminal modifying group of Y include a residue in which a carboxyl group of an amino acid residue to be bound forms an ester skeleton or an amide skeleton.
  • the C-terminal modifying group the following can be mentioned as specific examples. -N-R 14
  • R 14 is a hydrogen atom, unsubstituted or substituted alkyl, unsubstituted or substituted cycloalkyl, bridged cyclic hydrocarbon group, hydroxyl, unsubstituted or substituted aryl, or unsubstituted aryl.
  • R 15 represents a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted alkyl; Or
  • R 16 represents a hydrogen atom, an unsubstituted or replacement alkyl, unsubstituted or substituted ⁇ Li Lumpur, or unsubstituted or substituted heterocycle.
  • R 16 represents a hydrogen atom, an unsubstituted or replacement alkyl, unsubstituted or substituted ⁇ Li Lumpur, or unsubstituted or substituted heterocycle.
  • R 17 and R 1 8 was unsubstituted or together with the nitrogen atom represent a nitrogen-containing heterocycle substituted. ] And so on.
  • alkyl refers to a C, to C, 8 linear or branched alkyl, and includes, for example, methyl, ethyl, propyl pill, isopropyl, butyl, pentyl, and isopropyl. Examples include pentyl, hexyl, octyl, decyl, laurenole, myristyl, and palmityl.
  • the sheet click b alkyl in the present invention, C 3 ⁇ (: Represents the sheet click Roarukiru of 8, for example, click b propyl, shea click b Bed Chinore, shea click Rope Nchinore, hexyl shea click furnace and click Petit to b Le, shea click b O click chill and the like. substituted with the sheet click b a alkyl, alkyl, ⁇ Mi Roh, C, ⁇ C 4 Arukirua Mi Bruno, di C!
  • the crosslinked cyclic hydrocarbon group in the present invention was bicyclic or to display the tricyclic C 7 ⁇ C, 4 saturated hydrocarbon group, for example, ⁇ lumps pentyl, bicyclo click b [3. 2. .0] heptyl and bicyclo [4.4.0] decyl.
  • C, to C 4 alkoxy refers to C, to
  • the halogen atom represents fluorine, chlorine, bromine or iodine.
  • the aryl means a one- to three-cyclic aryl, and examples thereof include phenyl, naphthyl, anthryl, and phenanthryl.
  • the replaced aryl is
  • heterocycle means a saturated heterocycle or an unsaturated heterocycle.
  • a saturated heterocyclic ring is a saturated 3- to 8-membered monocyclic or 8- to 10-membered group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom. Represents a cyclic group.
  • saturated heterocyclic groups include, for example, pyrrolidinyl, piperidyl, piperidino, homopyridyl, heptamethyleniminyl, piperazinyl, Examples include homopiperazinyl, morpholinyl, morpholino, thiolanyl, thiomorpholinyl, thiomorpholinyl in which a sulfur atom has been oxidized, and tetrahydrofuryl.
  • Substituted saturated heterocycle is hydroxyl, hydroxyl C! ⁇ C 4 alkyl, mosquitoes Ruboki sills, mosquito carboxyl C i ⁇ C 8 alkyl, ⁇ Re Nore, ⁇ Li one Honoré C, ⁇ C 4 alkyl,
  • the term "unsaturated heterocyclic ring” refers to a saturated 5- to 8-membered cyclic group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom or an 8- to 10-membered ring. Represents a cyclic group.
  • unsaturated heterocyclic groups include pyrrole, pyridyl, pyrazinyl, imidazole, virazolinole, furinole, oxazolyl, chenyl, and thiazolyl. Nore, indril, quinolyl, and isoquinolyl.
  • a substituted unsaturated heterocyclic ring is a group consisting of trifluoromethyl, C 1 to C 4 alkyl, C, to C 4 phenol, nitrogen atom, and the like. Represents an unsaturated heterocyclic ring substituted with a selected group.
  • nitrogen-containing hetero ring means a saturated hetero ring or an unsaturated hetero ring containing at least one nitrogen atom.
  • nitrogen-containing heterocyclic groups include pyrrolidinyl, piperidino, homopiperidino, heptamethyleniminyl, piperazinyl, homopiperazinyl, i Soin Dolino, morpholino, thiomorpholino, thiomorpholino in which a sulfur atom is oxidized, and the like can be given.
  • a substituted nitrogen-containing heterocyclic ring refers to a substituted saturated heterocyclic ring or unsaturated heterocyclic ring containing at least one nitrogen atom.
  • a nitrogen atom or a sulfur atom When a nitrogen atom or a sulfur atom is present in the hetero ring, it may be oxidized. When a nitrogen atom is present in the hetero ring, it may be quaternized.
  • examples of the negative ion represented by A- in the above formula include an inorganic negative ion and an organic negative ion.
  • examples of the inorganic negative ion include chlorine ion, bromine ion, sulfate ion, and perchlorate ion.
  • Organic negative ions include, for example, acetate, benzoate, malate, benzene sulfonate, evening tray, hemit evening tray, etc. Are mentioned. '
  • C 4 alkyl represents a substituent substituted on the nitrogen atom of guanidino, but may be substituted on any nitrogen atom.
  • Di C, to (: 4 alkylguanidino represents a substituent in which two C, to (4 alkyls have been substituted by nitrogen atoms of guanidino, but may be substituted by any nitrogen atom.
  • - is a 4 alkylamine Mi Bruno CI-C 8 alkyl, for example main Chirua Mi Bruno methylation, 2 - E Chirua Mi Bruno Echiru, 3 - Buchirua Mi Bruno Ichipe pentyl, 2 rumen S-propylamino hexyl, 6—ethylamino 2—methylhexyl, 3—butylaminopropyl 4-methylaminobutyl, 4-ethylaminobutynole, 4-propynoleaminobutyl, 4-butylaminobutyl, 6-methylaminohexyl, 6-ethylaminobutyl --Hexyl, 6--propylaminohexyl, 6--butylaminohexyl, 8--methylaminooctyl, 8--ethylaminooctyl, 8-- Propylaminooctyl, 8
  • di C, to (: 4 alkylamino C, to C8 alkyl include, for example, dimethylaminomethyl, 2-dimethylaminoethyl, 3— (N-ethynole N — Propylamino) 1-propyl, 4-diisopropylaminobutyl, 4-dimethylaminobutyl, 4 — dimethylaminobutyl, 4-dipropylaminobutyl, 4 1 dibutyltinaminobutyl, 6—dimethylaminohexyl, 6—dimethylaminohexyl, 6—dipropylamino monohexyl, 6—dibutinoreaminoxyl Xyl, 8-dimethylaminooctyl, 8—diethylaminooctyl, 8—dipropylaminooctyl, 8—dibutylaminooctyl, etc.
  • examples of C, to ( 4- alkylguanidino to C8 alkyl) include methylguanidinomethyl, 2-methyl guanidinoethyl, 4-methylguanidinobutyl, and 4-methylguanidinobutyl.
  • di C! ⁇ C 4 alkylguanidino C, ⁇ (: 8 alkyls include, for example, dimethyl guanidinomethyl, 2 — getylguanidinobutyl, 4-dimethyl guanidinobutyl, 4 — dimethylguanidinobutyl 1-butyl, 4—Jetylguanidino—butyl, 4—Dipropylguanidinobutyl, 4—Dibutylguanidino monobutyl, 6 1-Methylguanidino monohexyl, 6—Jetylguanidinohexyl, 6 — Dipropyruguanidino 1-hexyl, 6 — Dibutylguanidino — Hexyl, 8 — Dimethylpyrguanidino 1-year-old chill, 8 — Jetirguanidino octyl, 8 — Dipropylguanidino — octyl, 8 — Jetir
  • R 1 9 is Ru as defined above der.
  • R 1 9 is Ru as defined above der.
  • R 1 9 is Ru as defined above der.
  • trimethylammonium triethylammonium, tripropylammonium, tributylammonium, and the like.
  • Z represents fragmentation in which amino acid residues are reduced from the N-terminal side of the amino acid sequence of hHCNP (SEQ ID NO: 15), and amino acid is located from the C-terminal side.
  • Z 1 - Lys-Trp-Z 2 CZ 1 is Pro- Va Bok Asp- Leu- Ser, Va Bok Asp- Leu- Ser, Asp- Leu- represents Ser, teeth
  • Z 2 Represents Ser-G-Pro-Leu, Ser-Gly-Pro, Ser-G, Ser or a single bond.
  • Neurotrophic peptide derivatives described above have the general formula (IK) X - Z 1 - L ys - T rp - Z 2 - Y (I)
  • Z 1 represents Pro-Vap Asp-Leu-Ser, Vapor Asp-Leu-Ser, Asp-Leu-Ser, Leu-Ser, Ser or a single bond
  • Z 2 represents Ser-Gly -Pro-Leu, Ser-Gly-Pro, Ser-Gly.
  • X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group
  • Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.
  • Preferred neurotrophic peptide derivatives include the following formula (IV) A 1 -Lys-Trp-A 2 (IV) wherein A 1 and A 2 are represented by the following (i) or ( ⁇ ⁇ ⁇ ) Hibiki.
  • D-Ser-Gly-Pro-Leu-Y where X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.
  • a 4 — S er (A 4 is one to three
  • a 2 represents L eu substituted with alkyl or L eu substituted with an amidino group
  • X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group
  • Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group
  • neurotrophic peptide derivatives of the general formula (IV) or salts thereof are also preferred: o
  • a 1 is X
  • a 2 is D—Ser—Y, D—Ser—G ⁇ y—Y, D-Ser-Gy-Pro—Y or D—S er — G ⁇ y — Pro — Le eu — Y neurotrophic peptide derivative or salt thereof;
  • a ' is X - L eu - S er
  • a 2 is D - S er - Y, D - S er - G iy - Y D -.
  • S er - G ⁇ y - P ro - Y Or a neurotrophic peptide derivative or salt thereof that is D—Ser-G £ y—Pro—Leu—Y;
  • a 1 is M e L eu - S er neurotrophic peptide derivatives or the salts are; and Oite the equation (17), A 1 is M e L eu - S er, A 2 is D—Ser-Y, D—Ser—Gy— ⁇ , D-Ser-Gy- ⁇ r ⁇ — ⁇ or D—Ser-Gy-Pr ⁇ —Leu— ⁇ ⁇ Neurotrophic peptide derivatives or salts thereof.
  • Preferred examples of such compounds include the following: It is.
  • MeLeu-Ser-Lys- Trp-Ser- NH (CH 2) 2 NH 2 ( SEQ ID NO: 2 3) MeLeu-Ser- Lys-Trp-Ser-NH (CH 2) 3 NH 2 ( SEQ ID NO:
  • a neurotrophic peptide derivative containing a G ⁇ y-Pro_Leu sequence at the 9- to 11-position of the C-terminal portion of hHCNP may be mentioned as a preferred one. it can.
  • Such compounds include:
  • X Pro Val Asp then eu—Ser then ys_Trp—B where B is Ser, D—Ser or A_ia.
  • X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group
  • Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.
  • C represents Ser or D—Ser
  • B represents Ser, D-Ser or A ⁇ a
  • D represents D—Ser or A_g a
  • X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group.
  • Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.
  • neurotrophic peptide derivatives of the formulas (Va) and (V) are mentioned as preferred.
  • Preferred compounds of the neurotrophic peptide derivative of the formula (Va) include the following: o
  • Preferred examples of the neurotrophic peptide derivative having the sequence include the following formula (VI) X-Aa-G ⁇ y-Pro-Leu-Y (VI)
  • Preferred examples of such compounds include the following compounds.
  • the above-described neurotrophic peptide precursor polypeptide of the present invention is derived from a human or a rat. included.
  • the precursor polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is derived from rat, and the precursor polypeptide represented by SEQ ID NO: 14 is derived from human.
  • the pharmaceutically acceptable salt of the above-mentioned human-derived neurotrophic peptide or a derivative thereof according to the present invention includes a conventional non-toxic salt or a quaternary amino acid of these peptides.
  • Pumium salts are formed, for example, from inorganic or organic acids or bases.
  • acid addition salts include acetic, butyric, citric, lactic, tartaric, oxalic, maleic, succinic, fumaric, hydrochloric, and bromide.
  • Hydrogen and sulfuric acid salts are available.
  • Base salts include alkaline metal salts, such as ammonium salts, sodium and potassium salts, and alkaline metals, such as calcium and magnesium salts. Salts and salts with amino acids such as arginine and lysine.
  • Such a salt can be easily produced by a method known per se. For example, in the case of acetate, the neurotrophic peptide or a derivative thereof is produced by dissolving water and adding a necessary amount of acetic acid.
  • the human-derived neurotrophic peptide and the neurotrophic peptide derivative of the present invention can be synthesized according to a method used in ordinary peptide chemistry.
  • Examples of the known method include literature (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins ;, Vol 2, Academic Press Inc., ew York, 1976; Peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basics and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Biochemistry experiment course ⁇ Protein chemistry IV, edited by the Biochemical Society of Japan, 197 7).
  • the synthesis can be performed by selecting either the liquid phase method or the solid phase method depending on the structure of the C-terminal site. More specifically, in the case of peptides having a partial structure of —COOH or 1 CONH 2 at the C-terminal site, they can be obtained by either the liquid phase method or the solid phase method. Yes, but otherwise, the liquid phase method is preferred.
  • the C-terminal amino acid in which the amino group is protected
  • the C-terminal modifying group which can be either a hydroxyl group, an amino group or a hydroxyl group
  • the amino group, which is protected is first bound to the insoluble carrier via its carboxyl group.
  • the chloromethyl group is present in the insoluble carrier
  • the bond with the insoluble carrier is reacted with the C-terminal amino acid or the C-terminal modifying group in the presence of a base, or the C-terminal amino group is reacted.
  • the reaction can be carried out by reacting the amino acid or the base-added salt of the C-terminal modifying group as it is.
  • the C-terminal amino acid or a C-terminal modifying group may be bound by the carpoimide method or the active ester method. Can be.
  • the protecting group is removed, and the amino group or amino acid whose amino group is protected is removed according to the amino acid sequence of the target peptide.
  • the protecting group of the amino group is removed, and the same reaction is repeated to synthesize the entire sequence.
  • N end The terminal modifying groups are condensed.
  • the peptide is removed from the insoluble carrier, and the protecting group is removed.
  • a method for cleaving the peptide from the insoluble carrier a method of treating with an acid such as HF, HBr / TFA, TFA, trifluormethane sulfonic acid, or a method of treating with a base such as ammonia is used. Method and the like. Further, if necessary, the desired peptide can be obtained by condensing an N-terminal modifying group or a C-terminal modifying group and removing the protecting group.
  • a C-terminal amino acid (protected with a carboxyl group) or a C-terminal modified group (having a free amino group or a hydroxyl group and having a carboxyl group). If present, the protected amino acid) is converted to an amino-protected amino acid or an amino-acid-protected derivative according to the amino acid sequence of the target peptide.
  • the reaction is performed to remove the amino group-protecting group, and the same reaction is repeated to synthesize the entire sequence. Thereafter, the desired peptide can be obtained by removing the protecting group, condensing the N-terminal modifying group or the C-terminal modifying group and, if necessary, removing the protecting group.
  • the synthesis can be carried out not by binding the amino acids one by one but by binding the peptide fragments.
  • amino-protecting group examples include benzyloxy. Carbonil, t-butyloxycarbonyl, p — methoxybensiloxycanolevonil, 2 — chlorobensiloxycanoleponil, p — tonorenence norolefonyl, trifluoro Acetinole, fuenorinore, honoreminore, 0—dinitrophenylnorethenyl, 3—nitro12—pyridinylphenyl, diphenylphosphino Thioyl group and the like.
  • introduction of t-butyloxycarbonyl group can be carried out by reacting di-t-butyldicarbonate in the presence of a base such as triethylamine, and its removal can be carried out by using trifluoroacetic acid or the like. It can be carried out by reacting the acid.
  • Ca carboxyl is a protecting group of the groups, for example, main Ji Le, E chill, t - butyl of which C, ⁇ C 4 alkyl esters, base down Jinoreesuteru, p - two preparative Robe down succinimidyl ester, p - main switch Norenbenzinoles Tenore, cyclohexinole esters, cyclopentyl esters, and the like.
  • introduction of a methyl ester can be carried out by reacting thionyl chloride in methanol, and its removal can be carried out by hydrolysis with sodium hydroxide or the like. Can be implemented.
  • an indyl group such as T rp may be protected with, for example, formyl, pendinoreoxycanolevonyl, 2,4-dichloronorbenzyloxycarbonyl group. It is also possible.
  • the guanidino group can serve as a protecting group when protonated with hydrochloric acid or the like, but it can be used if necessary. For example, ⁇ -toluenesulfonyl, nitro, It can be protected by benzyloxycarbonyl, p-methoxybenzenesulfonyl, mesitylene-2—sulfonyl group, etc.
  • the introduction of a p-toluenesulfonyl group can be carried out by reacting p-toluenesulfonyl chloride in the presence of sodium hydroxide or the like, and its removal can be carried out by HF It can be carried out by reacting an acid such as trifluoromethansulfonate.
  • the method for forming a peptide bond and the method for condensing an N-terminal modifying group and a C-terminal modifying group include, for example, dicyclohexyl carbodiimide, 1-ethyl-13 — (3 — dimethylaminopropyl) Method using carbodiimides such as carbodiimide, symmetric acid anhydride method, mixed acid anhydride method, azide method, active ester method, acid Redox method, diphenylphosphoryl azide method, carbodiimide-type condensing agent + additive (1-hydroxyhydrazolylazole, N-hydroxyimidic acid imid etc.) method And known methods such as an acid halide method.
  • the introduction of a sulfonyl group can be carried out by reacting a halogenated sulfonyl compound in the presence of a base.
  • introduction of a p-toluenesulfonyl group involves reacting p-toluenesulfonyl chloride in the presence of a base such as triethylamine. You can do it by doing it.
  • introduction of a residue that forms a urea skeleton together with the amino group of the amino acid residue to be bonded it can be introduced by reacting an isocyanate.
  • N-phenylcarbamoyl can be introduced by reacting with phenylsilane.
  • the introduction can be carried out using the corresponding halide or anhydride.
  • a benzyloxycarbonyl group can be introduced by reacting benzyloxycarbonyl chloride in the presence of a base such as sodium hydroxide.
  • N-monoalkylated peptide derivatives of N-terminal amino acids see the literature (Canadian Journal of Chemistry, Canada). J. Cem.) 55, 90 (1977)), the N-moiety of the N-terminal amino acid protected with an amino group in advance.
  • the compound can be synthesized by preparing a monoalkyl compound, forming a peptide bond by a calposimid method or the like, and then removing the protecting group of the amino group.
  • the peptide derivative is subjected to a reductive alkylation reaction with the corresponding aldehyde. Can be synthesized.
  • N, N-dimethyl form it can be synthesized by reacting cyanoborohydride in aqueous formalin solution.
  • N, N, N Trial of N-terminal amino acid
  • the N, N, N-trimethyl form can be synthesized by reacting pseudomethane in the presence of a base such as triethylamine.
  • a base such as triethylamine.
  • N-terminal amino acid-protected amidino form can be converted to N- (methylmethylcaptochloromethylene) -1p-to-N in the presence of a base such as, for example, triethylamine. It can be synthesized by reacting lensulfonimide with an N-terminal amino acid, followed by reaction with ammonia water.
  • Methods for removing protecting groups include, for example, the trifluoroacetic acid method, the methansulphonic acid method, the trifluoromethansulphonic acid method, the hydrogen fluoride method, and the liquid ammonium sodium method.
  • Well-known methods such as the method, contact reduction method, and alkaline saponification method.
  • the human-derived neurotrophic peptide and neurotrophic peptide derivative of the present invention have an action of regulating the differentiation and maturation of nerve cells. That is, it promotes acetylcholine synthesis in tissues of the central septum, which is a cholinergic nerve.
  • the biological activity can be measured by the method of Yukio Ogika et al. (Drugs, Mind, and Behavior, 7,447 (1989)).
  • the human-derived neurotrophic peptide and the neurotrophic peptide derivative of the present invention comprise the above-mentioned human-derived neurotrophic peptide, neurotrophic peptide derivative or salt thereof as an active ingredient. It is useful as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases and an anti-dementia agent.
  • a neurodegenerative disease is a disease in which nerve cells atrophy or fall off. For example, Alzheimer's disease, Alzheimer's senile dementia, amyotrophic lateral sclerosis, and Parkinson Disease and the like.
  • dementia examples include Alzheimer's dementia, Parkinson's dementia, and cerebrovascular dementia.
  • the animals to which the compound of the present invention is administered are not particularly limited, and include not only humans but also mice, rats, dogs, puppies, puppies, goats, sheep, puppies, etc. Various mammals are targeted.
  • Administration to these animals and humans can be via the usual routes of administration, for example, oral, intramuscular, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal and intracerebral administration.
  • the dose and frequency of administration vary depending on the animal species, administration route, degree of symptoms, body weight, etc., and are not particularly limited.
  • About g / g to 1 g / day is administered once or more times a day.
  • Examples of the dosage form include powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suppositories, injections, nasal drops and the like.
  • it is manufactured by a usual method using a usual formulation carrier.
  • an excipient and, if necessary, a binder disintegrant, a lubricant, a coloring agent, and the like are added to the active substance, and then tablets and tablets are prepared in a conventional manner. Granules, powders, capsules, etc.
  • a pH adjuster, a buffer, a stabilizing agent, a solubilizing agent, etc. are added as needed, and the injection is prepared by an ordinary method.
  • amino acids protecting groups, active groups, solvents, and the like may be indicated by abbreviations based on IUPAC-IUB and commonly used abbreviations in the relevant field. It is as follows.
  • amino acid residues specified herein without the prefix L correspond to the naturally occurring absolute configuration.
  • the experimental method is described below (Kazuo Ogawa, et al .: “Technology of tissue cytochemistry, hormons and neurotransmitters”, Asakura Shoten, 1989.)
  • Synthetic oligopeptide consisting of the amino acid sequence of 17 and 10 ⁇ m of serum serum albumin were added to 0.1 Solvent was added to ammonium acetate (pH 7.0), and 1.3 M glutaraldehyde was added, followed by stirring at room temperature for 5 hours. After the solution was dialyzed overnight against H 2 0, it was recovered complex protein of about 1 0 mg and lyophilized.
  • 1.5 mg of the complex protein was dissolved in 1.5 physiological saline, and 1.57 3 ⁇ 4 of Freund's complete ad juvant was removed to obtain an emulsion.
  • Asp--Ie--Ser--Gn--Trp--Six amino acids in the center of the amino acid sequence of the rat HCNP consisting of 1 amino acid 17 consecutive oligonucleotides were synthesized based on the amino acid sequence (Fig. 1). The synthesis was divided into three types of probes at the Ser residue site so that the number of probe combinations was 24 each. did. In the sequence shown in FIG. 1, the nucleotide at position 6 from the 5 'end of the probe is a mixture containing equal amounts of dT and dC.
  • nucleotide sequence of the probe shown in FIG. 1 has a sequence opposite to that of the nucleotide sequence predicted from the amino acid sequence. All of the oligonucleotides were synthesized using a DNA synthesizer (DNA Synthesizer Mode 1381A) manufactured by Applied Biosystems. The purified DNA was purified using a PC cartridge (available from Applied Biosystems).
  • Oligonucleotide labeling with 32 P was 67 mM MTris-HC (pH 8.0), 17 mM MyS—mercaptoethanol, lO mM M g C reaction composition solution 1 2 0 ⁇ l in ⁇ g synthetic Oh Li Gore j click Reochi de of, 5 0 ⁇ C i [gamma - 32 P] ATP (flax sheet catcher arm Ltd., PB 1 0 (2,18, lOmCim, 50,000Ci / mmo) and lO units T4 After incubating at 37 ° C for 30 minutes with addition of polynucleotide kinase The reaction was stopped by heating at 65 ° C for 10 minutes, and the TE solution (10 mM T Use a Pharmacia PD-10 equilibrated with ris-HC ⁇ (pH 7.5), 1mM EDTA), gel filtration, and use excess nucleotides for gel filtration. Was removed. Pro - The
  • Example 1 As shown in Example 1, three kinds of antibodies against rat HCNP consisting of 11-amino acid were prepared. Therefore, proteins showing reactivity with these antibodies were detected by the Western protein- ing method.
  • the test was carried out by applying a voltage of 70 V for 4 hours using a buffer for tinting.
  • the filter is washed with TBS (20 m Tris-HC (pH 7.5), 150 mN aC ⁇ ) and incubated with 3% gelatin-TBS solution for 1 hour at room temperature.
  • the membrane surface on which the protein was not adsorbed was blocked with gelatin.
  • the primary antibody 500-fold dilution
  • diluted with 1% gelatin-TBS and the protein adsorbed on the filter are reacted at room temperature for 4 hours.
  • the plate was washed three times with one PBS (0.05% Tween 20, TBS) for 5 minutes each.
  • the filter was added to a 1% gelatin-TBS solution containing a 2000-fold diluted peroxidase-labeled secondary antibody (manufactured by Amersham), and the mixture was incubated at room temperature for 2 hours. Wash with T-TBS three times for 10 minutes, and finally dissolve 60 mg 4 — Chole mouth 11-naphthorn paste in a 20-m methanol-drain, and then add 10 TBS solution. The membrane was immersed in a peroxidase color developing solution to which H202 was added so that the concentration became 0.01%. Tinting Method, Soft Science, Inc., 197 8). As a result, a protein with a molecular weight of 23 kilodaltons present in rat brain reacted with an antibody against rat HCNP.
  • Isolation of mRNA from hippocampal tissue (30 rat hippocampus; wet weight of about 2 g) extracted from the immature rat was performed in accordance with a standard method. 2 mg of frozen tissue in the presence of 4 M guanidine solution (4 M guanidine thionate, 100 mM MT ris-HC (pH 7.5), 1% yS—mercaptoethanol) Crushed quickly at room temperature using a homogenizer. Next, inhalation and ejection were repeated 10 times using a syringe equipped with an 18 G injection needle in order to physically destroy the high molecular chromosomal DNA.
  • 4 M guanidine solution 4 M guanidine thionate, 100 mM MT ris-HC (pH 7.5), 1% yS—mercaptoethanol
  • RNA solution 3 M sodiumacetate was added in an amount of lZ10 O, 2.2 volumes of ethanol was added, and the total RNA was precipitated at ⁇ 20 ° C. Purification by several ethanol precipitations yielded approximately 2 nig total RNA.
  • the procedure for purifying poly (A) mRNA from total RNA using oligo (dT) cellulose column is as follows. 1.5 mg of the total RNA purified by ethanol precipitation was dissolved in a TE solution of 2, heated at 70 ° C for 5 minutes, rapidly cooled, and then cooled to 10 mM Tris-HC ( ⁇ H7. 4), 1m MEDT A. 3 MNaC was added to 5 volumes of 1Z, and 10 mM Tris-HC (pH 7.4), 1 mM
  • EDT A Layered on Oligo (dT) Celluloscalam (5 ⁇ ; Oligo (dT) Cellulose Type 7) equilibrated with 0.5 MNaC ⁇ did. The sample is allowed to flow under gravity, and the poly (A) sequence is used to absorb the poly (A) sequence on the oligo (d T).
  • (A) mRNA molecules were collected in cellulosic columns. As a precautionary measure, the solution that passed through the column was heated again as described above, quenched, and then applied to the same column. 10 times the column capacity 10 m MT ris-HC (pH 7.4), 1 Wash the column with 0.5 M NaDTA, 0.5 M NaDTA, then add 6 volumes of 1 Om MT ris-HC £ (pH 7.4), 1 mM MEDTA, 0.1 mM NaC. The column was further washed with ⁇ , and the poly (A) mRNA was eluted with a TE solution kept at 0 ° C.
  • the eluate was heated again at 70 for 10 minutes, and chromatographed with a second oligo (dT) cellulose column (2) according to the above column operation. I did it.
  • the amount of poly (A) mRNA finally obtained was 103 ⁇ g.
  • cDNA is prepared from the poly (A) mRNA purified as described above, an oligo (dT) primer and a library are prepared. The synthesis was performed using a random primer. Since there are some differences in the method of synthesizing single-stranded cDNA using the two types of primers, each experimental method will be described in detail.
  • cDNA synthesis using the oligo (dT) primer was performed by the following procedure. 2 0 ⁇ ⁇ of H 2 0 which was inactivated by Ri RN ase the rat hippocampal tissue-derived Po Li (A) m RNA 8 g, which is prepared rather than the above-mentioned ⁇ to Jechiru pyro mosquito Bone door processing The solution was heated at 70 ° C for 10 minutes, and then cooled on ice.
  • the 10 XRTB buffer of 10 ⁇ _ ⁇ (2 50 m MTris-C ⁇ (pH 7.5), 37.5 mMKC £, 15 mmMgC ⁇ 2 ), and added a 4 ⁇ human placenta ribonuclease inhibitor ( 2 0 ⁇ nits /
  • oligo (dT) primer 8 g of poly (A) mRNA dissolved in 8 ⁇ ⁇ of H 2 ⁇ was heat-treated and then treated with 5 x First Strand. Buffer (25 Om MT ris — HC (pH 8.3), 5 Om MM g C 2 , 5 OmM dithiothreitol) was added to 16 ⁇ and 8 OmM pyrroline.
  • the single-stranded cDMA synthesized as described above was subjected to 20 mM MTris—HC (pH 7.5), 5 mm MM g C 2 , 10 mM (HN 4 ) 2 SO 4 , 10 0 m MKC £. 0.15 m My5-AD .50 m MBSA, 40 / z M d NTP, 8.5 units ZO E. coli ribonuclease H, 230 ⁇ nits ⁇ E. coli DNA A buffer solution and an enzyme were added so as to obtain polymerase I, and the mixture was reacted at 12 ° C for 60 minutes, and then reacted for 22 minutes and 60 minutes. In addition, 70 was added to inactivate the added enzyme.
  • the purification method of DNA using Qiagen column is as follows. 0.4 M Na C, 50 m M M O P S
  • the ligation was carried out in a 100 ⁇ l reaction mixture containing 6.7 mm Mg C 2 , 1 mM MATP and 500 units T4 DNA ligase. Next, purification was again performed using Qiagen column to remove the excess Ec0RI adapter, and then 67 mM Tris-HC £ (pH 8.0), 1
  • Phosphorylation of the 5 'end of the EcoRI adapter was performed with T4'polynucleotide kinase of MgC ⁇ 2 , 1 mM MATP, and 200 units Z ⁇ .
  • the cDNA purified in this way was further purified and concentrated by phenol micro-hole form treatment and ethanol precipitation to obtain a final cDNA library. .
  • the final amounts of cDNA obtained by the oligo (dT) primer and the random primer were 20 g and 1.3 g, respectively.
  • 1Z3 of the recombinant DNA obtained above was used for invitrono, manufactured by Stratagene.
  • packaging was performed to obtain phage particles.
  • the number of transformants obtained using these phage particles was the number of cDNAs synthesized using oligo (dT) primers and random primers.
  • g per Ri each 8. 8 1 0 7 plaque forming units (pfu) and 2 5 x 1 0 7 piu was Tsu der.
  • a filter is added to a 500-fold dilution of TBS-1% BSA solution containing a monoclonal antibody (Ab-1) against rat HCNP (SEQ ID NO: 17).
  • Ab-1 a monoclonal antibody against rat HCNP
  • Room temperature Shaking gently allowed the primary antibody to react with the protein immobilized on the filter.
  • the filter was washed three times for 5 minutes and placed in a 1% BSA solution containing 200 g of a biotinylated anti-peacock 1 g donkey antibody (Amersham).
  • the color was developed by immersing the filter in NaC ⁇ ) at room temperature for 30 minutes.
  • 12 and 1 positive positive clones were obtained from cDNA libraries synthesized using oligo (dT) and random primers, respectively.
  • a loan was obtained.
  • Each clone was unified by the same primary antibody (Ab-1) and detection method as described above.
  • Ab-1 primary antibody
  • detection method In order to examine the reactivity of each unified clone with the three types of polyclonal antibodies shown in Example 1, several tens of plaques should appear each time. Dilute the diluted solution of each clone 1 ⁇ ⁇ to each of the three plates. The reactivity of the protein produced from clones with the three antibodies was examined using the same detection system as described above. As a result, proteins derived from the three clones showed significant reactivity with the three antibodies. Of these three clones, two (A61, A62) are oligo (dT) primers and one (R4) is a random primer. It was obtained from a cDNA primer synthesized using the above method.
  • coli Y1088 as a host, as described in section ffi) above, several tens of clones were selected from each of a total of 13 types selected using the antibody (Ab-1). Spot the diluted solution of the phage at a rate of 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ so that plaques appear, and incubate at 42 ° C for 2 hours and then at 37 ° C for 4 hours. Was transferred to the Nitro Senororose Membrane Filter. The filter was treated with a 0.5 N NaOH, 1.5 M NaC solution for 5 minutes to denature the DNA, and then 1 MTris —
  • the DNA was fixed to the fizz letter by treating with C £ ( ⁇ ⁇ 7.5) and 3 M NaC for 10 minutes. After washing with 2 X SSC (0.3 M NaC £, 0.3 M sodium citrate) for 5 minutes, heat at 80 ° C for 2 hours.
  • rat nano-precursors of rat HCNP obtained in Example 5 above, three types of clones (A61, A62, R4) which may encode proteins. After preparing the phage DNA, the inserted DNA fragment was subcloned and the nucleotide sequence was determined.
  • Preparation of phage DNA was performed according to the following procedure. Incubate the unified phage clone so that it appears on the entire surface of the plate, and incubate at 37 ° C.
  • the pellet was transferred to 100 mM MTris-HC ⁇ (pH 7.5) of 3771, 100 mM NaC £ .25 mMEDTA. After suspending, 4% SDS was added and heated at 70 ° C for 20 minutes. Next, 3 m of 2.551 V [potassium acetate ( ⁇ 4.8 4.8) was added to the suspension, and after stirring, centrifuged at 1700 rpm for 30 minutes at 4 ° C. Qing was applied to a glass filter to remove impurities.
  • the filtrate was applied to Qiagen 1 pack 100 (manufactured by Diagen) equilibrated with 75 mM MNaC 50 m MMOPS (pH 7.0), 15% ethanol, and then used as a 4: 1 Wash the column with 0.5 M Na C ⁇ , 50 m MMOPS (pH 7.0), 15% ethanol, and add 4 M ⁇ 1.2 M
  • DNA was eluted with NaC, 50 mM M-PS (pH 8.0), and 15% ethanol. 0.8 volume of isopropanol was added to the eluate, left on ice for 15 minutes, and then centrifuged at 1700 rpm for 30 minutes. Dissolve the pellet in 0.3 M sodium acetate (pH 4.5), add 2.5 volumes of ethanol, and cool at 180 to 15 minutes. Centrifuge
  • the DNA was collected.
  • FIG. 1 shows the restriction enzyme map of clone A61 DNA, which has the longest inserted cDNA among clones A61, A62, and R4, and the strategy for sequencing.
  • a single-stranded phage DNA was prepared from a transformant having the cloned cDNA fragment of clone A61, and a DNA sequencing kit (united dostaino chemicals, Inc.) was prepared. The nucleotide sequence was determined using Sequenase Version 2.0).
  • the determined nucleotide sequence of clone A61 had one large open reading frame.
  • the open reading frame included in the insert of this cDNA was found to be 1886 from the 5 'end of the cDNA, although the ATG sequence serving as a translation initiation sequence in eukaryotes was not found. It consisted of amino acids.
  • a poly (A) sequence present at the 3 'end of the mRNA is found at the 3' end of the cDNA, and a 6-base poly (ordinarily found in most eukaryotic mRNAs).
  • FIGS. 3 and 4 show the DNA sequence and open reading frame of the cDNA insert whose nucleotide sequence was determined.
  • the amino acid sequence encoded by this cDNA can be deduced as shown in Fig. 5, and its polypeptide is composed of 186 amino acid, and its molecular weight is 206 699 It was calculated to be 1 dalton.
  • the rat HCNP of SEQ ID NO: 17 showing neurotrophic activity in the rat is the first N-terminal of the polypeptide shown in Fig. 5. It is located in the region from the amino acid residue to the first amino acid residue.
  • the nucleotide sequence corresponding to the amino acid region is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the cDNA insert contained in clone A62 includes the downstream region of the second amino acid in the amino acid sequence shown in FIG. In amino acid R4, the same amino acid end as in A61 was detected.
  • H in c I I consisting of about 190 bp shown in the restriction enzyme cleavage map in FIG. 2 —
  • the Hin II fragment is labeled with 32 P by using a random primer labeling kit (manufactured by Amersham) and used as a probe.
  • a random primer labeling kit manufactured by Amersham
  • cDNA clones extended to the 5 'upstream region of the translation initiation codon were selected, and their nucleotide sequences were determined.
  • Escherichia coli Y1088 was used as a host to incorporate cDNA synthesized from an oligo (dT) primer.
  • Gt gt11 One phage library was prepared by plating 10 pieces of 150,000 pieces per agar medium having a diameter of 150 ⁇ in the same manner as in Example 5.
  • the phage DNA is fixed to a two-throat cellulose membrane filter by 50% formamide, 6XSSC, 5 ⁇ Denhardt solution, 0.1% Prehybridization was performed at 42 ° C for 6 hours using a hybridization solution having a composition of% SDS.
  • the 4 2 ° C De ⁇ hive Li Daize tion hive Li da I peptidase one sheet Yo emissions solution (1 X 1 0 6 cpm) containing the labeled Hincl I- Hincl I fragment Continued.
  • the selection was performed again using a DNA fragment of about 90 bp up to the HincII cleavage site as a probe.
  • the clone contained cDNA extended to the upstream of the Hincl I cleavage site.
  • the DNA of these six A-diclones was prepared by the liquid culture method described in Example 6, cut with EcoRI, and Subcloning was performed at the Ec0RI site of M13mp19 which had been previously treated with alkaline phosphorous phosphatase, and the nucleotide sequence was determined.
  • SEQ ID NO: 2 the nucleotide sequence of the cDNA insert contained in clone A010-12 has a neurotrophic factor activity derived from rat hippocampus.
  • An ATG sequence, which is a translation initiation codon was present immediately before the rat HCNP sequence.
  • SEQ ID NO: 3 shows the result of deducing the amino acid sequence encoded by the cDNA of clone AO10-12.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 does not contain the ATG sequence which is a translation initiation codon.
  • Pre-protein containing rat HCN_P (degraded by p-lysylendopeptidase and amino acid sequence of constituent peptides)
  • Example 3 the amino acid sequence of the 23-kilodalton protein present in rat hippocampal brain, which is reactive with rat HCNP, is determined. Therefore, oligopeptide produced by decomposition by lysylendopeptidase was purified.
  • Oligopeptides produced by the reaction of degradation of proteins having a molecular weight of 23 kilodaltons by lysylendopeptidase are subjected to high-performance liquid chromatography, and each is subjected to high-performance liquid chromatography. The fragments were separated and purified. RP with 0.1% trifluoroacetic acid-acetonitrile solvent—304 columns (4.6 mm diameter x 250 mm diameter; manufactured by Biorad) The oligopeptide was fractionated by using the enzyme. Nine kinds of eluted fractions (500 £ each) were applied to 477 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (Applied Biochemicals) to analyze the sequential sequencing of the amino acid sequence of the constituent peptides.
  • this constituent peptide was used to determine the amino acid sequence of the residue of a 38 amino acid residue blocked N-terminally blocked amino acid residue.
  • the remaining N-terminal fragment was digested with chymotoribine, and the amino acid sequence of the C-terminal peptide from 8 to 25 residues was determined.
  • the N-terminal peptide was degraded using acylamino acid releasing enzyme, and the sequence from 2 to 6 amino acid residues was determined.
  • N-terminus of rat HCNP is acylated.
  • the N-terminus is already present at the precursor polypeptide stage. It has become clear that it has been acylated.
  • the molecular weight of precursor protein expressed in rat brain was 23 kilodaltons from the results of wet evening blotting. It was estimated to be a ton but different from the molecular weight (21 kilodaltons) calculated from the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the determined gene. . This difference in molecular weight has also been observed in the case of the phosphophosphidylethanolamine-binding protein of E. coli (F. Schoentaen et al .: Eur. J. Biochem., 166, 333, 1987), tanno in polyacrylamide gel electrophoresis, depending on the three-dimensional structure of the protein. It is estimated that the mobility of the material has changed.
  • a human fetal brain cDNA library and a human placenta cDNA library (both from Clontech) was screened using a rat HCNP precursor cDNA clone as a probe.
  • the full ⁇ chromatography di including c DNA la Lee bra rie from the human tissue is respectively into E. coli Y 1 0 9 0, 1 0 sheets containing LB medium off ⁇ chromatography di 1 X 1 0 6 pfu The plate.
  • the phage particles are transferred onto Nitrocellulose Finest (Yuichi Scheicher & Schuell) and denatured
  • the sample was immersed in 0.03 M sodium citrate) and dried and fixed at 80 for 3 hours.
  • the base sequence of the cDNA subcloned into the pBluescript] 1 vector was determined according to the method of Example 6.
  • pi-3 contained an open reading frame starting at ATG, the eukaryotic initiation codon, but was identical to the AATAAA sequence, which is a poly (A) addition signal. It became clear that the sequence and the poly (A) sequence were not included.
  • the nucleotide sequence of the cDNA containing the open reading frame is shown in SEQ ID NO: 13. did.
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 is shown in SEQ ID NO: 14. The amino acid sequence described does not include the methionine encoded by the start codon ATG.
  • the deducible amino acid sequence is composed of 1886 amino acids, and the oligopeptide described in SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14. This corresponds to the region from the first amino acid (proline) power of the polypeptide to the first amino acid (loisin).
  • the nucleotide sequence encoding the human-derived neurotrophic peptide is also shown in SEQ ID NO: 16.
  • trp-lac fusion promoter Induced by a trp-lac fusion promoter to express proteins encoded by precursor genes containing rat hippocampus-derived and human-derived neurotrophic peptides.
  • Expression vector p KK233-3-2 (manufactured by Clontech) containing a strong trc promoter (E. Amann and J. Broslus: Gene, 40, 183, 1985; and D. Straus and W.
  • the reaction conditions were 100 ⁇ 1, 67 mm MT ris — HC ⁇ (H7.4), 6.7 mm MM g C £ 2 , lm M 2 — melcaptoethanol, each ImMd ATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0.5 g DNA, 0.25 ⁇ nits DNA polymerase I Mix Klenow fragment and incubate at 37 ° C for 30 minutes did. After the sample was treated with phenol mono-cloth form, it was purified and concentrated by ethanol precipitation.
  • the cDNA end-treated as described above was digested with Ncol in advance, and then Mung Bean Nuclease (Mung Bean Nuclease)
  • the gene was introduced into the expression vector PKK23-3—2DNA into which a new Smal site was inserted.
  • the method for constructing the expression vector is as follows.
  • Recombinant vectors were constructed by inserting the blunt-ended rat hippocampus-derived and human-derived precursor genes into the expression vector treated as described above.
  • the reaction conditions for the construction of the recombinant vector are as follows.
  • the colonies that appeared were inoculated one by one into the lattice of a nit ⁇ -cellulose membrane filter with a grid, and were placed on an agar medium containing ampicillin. After culturing, colonies were formed again. In the evening, plasmid DNA was immobilized in the same manner as in the screening of the phage used in Example 7, and colony was probed with R4c DNA as a probe.
  • the desired clones (pKK233-2-A01012, pkk233 -2 -p13) were obtained by the hybridization method. (See Fig. 6)
  • the clone AO 10 —12 and p13 EcoRI cDNA fragments were introduced into the Ec0RI cleavage site of the expression vector constructed as described above, and Similarly, using R4 cDNA as a probe, the desired clone was obtained by the colony hybridization method.
  • the resulting clones were named pMMTV-LTR-AO102 and pMMTV-LTR-p13 (Fig. 7).
  • the resulting transformant containing the recombinant vector was cultured in a liquid medium 3 containing 2 mM isopropyl-13-D-thiogalactopyranoside ( ⁇ PTG) until late logarithmic growth.
  • the transformed E. coli was collected by centrifugation.
  • the protein is solubilized by resuspending in ⁇ and heating at 100 ° C for 4 minutes. Perform 20% polyacrylamide gel electrophoresis containing 1% of 303 using 20 ⁇ ⁇ , 1Z3 of the sample.
  • Rat and human cDNA according to the method for detecting a precursor protein using a monoclonal antibody against rat HCNP described in Example 3). The target protein produced by the transformant having the gene was detected.
  • Recombinant DNA was prepared from a transformant of Escherichia coli harboring the recombinant vector in which the precursor protein was obtained in cultured mammalian cells, and 30 ⁇ g of the recombinant DNA was converted to DNA. Transfection was performed using a transfection kit (manufactured by Fanoremasia). The cells used were NIH / 3T3 cells derived from mouse fetal fibroblasts were seeded at 1 ⁇ 10 6 cells per dish with a diameter of 10 cm and subjected to DNA-calcium phosphate co-precipitation. More gene transfer was done. The procedure for gene transfer was performed according to the method of Pharmacia.
  • Transformants exhibiting phenotypic selectivity for neomycin resistance were expressed in DMEM medium containing 10% bovine serum containing 400 / g Z neomycin (diegenicin: G418). Obtained by continuing weekly culture. After the cells adhered to one plate were detached with a 0.25% trypsin solution, they were re-plated on seven plates, and the culture was continued for another two weeks to obtain a single clone. Each clone was further cultured, and chromosomal DNA was prepared from neomycin-resistant cells (J. Sambrook et al .:
  • the obtained chromosomal DNA was cut with EcoRI, separated by 0.7% agarose gel electrophoresis, and subjected to Southern hybridization using R4c DNA as a probe (J. Sambrook et a. 1 .: "Molecular C 1 on ng-A laboratory manual, 2nd. Ed.”, Cold Spring Harbor Lab., New York, 1989). As a result, it was confirmed that transformed NIH / 3T3 and PC-12 cells having the desired rat and human precursor genes were obtained.
  • the resulting transformed cells were cultured in a medium containing 1 M glucocorticoid (dexamethasone) for 12 hours. After promoting the transcription from the promoter present in the LTR sequence, the cells were collected and examined for the expression of the precursor protein. As described in this section I), the proteins of the transformed cells are solubilized, and then subjected to polyacryl gel electrophoresis. The protein was adsorbed on a PVDF filter, and the target protein was detected with a polyclonal antibody against rat HCNP.
  • the target rat and human precursor proteins were detected from transformants derived from cultured mammalian cells, and it was confirmed that the expression vector was functioning normally. .
  • the resin used is a polymethylene vinylbenzene resin with a particle size of 100 to 200 mesh and a mouth opening (crosslinked with 1% divinylbenzene, 1 g resin) It contains 0.64 millimoles of chloride.)
  • ethyl alcohol 45 ⁇ ⁇ and 15 m of water
  • cesium carbonate 20 g
  • a chloromethylated resin was added.
  • Boc—Leu— ⁇ —resin was filtered, washed sequentially with 90% DMF, DMF, and ethyl alcohol, and dried. Yield 21.8 g. 6 g of the Boc-Leu-O-resin was placed in a solid-phase synthesis reactor, and according to Schedule 1 described below.
  • the obtained hHCNP (1-11) was prepared using reversed-phase packing material YC-A303 (S-5) — ODS column (4.6 ⁇ X250mm).
  • a retention time of 31.0 minutes was shown in a linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 50%.
  • the amino acid analysis values were consistent with the theoretical values.
  • HCNP (2-7) (SEQ ID NO: 18)
  • the resin used was a 100-200 mesh mesh, methylated polystyrene vinylbenzene. Resin (crosslinked with 1% divinylbenzene, containing 0.66 millimoles of chloride per gram of resin).
  • Boc—Trp— ⁇ H was dissolved in ethyl alcohol (10 Qm) and water (347Q), and 20% carbon dioxide was dissolved. The solution was adjusted to pH 7 with an aqueous solution of sodium, concentrated under reduced pressure, and dried.
  • the obtained crude peptide is dissolved in water 250, and a reversed-phase packing material YM C—R355-15 / 30—ODS column previously equilibrated with 0.1% TFA water (500 x 500 mm), and the column was washed with 0.1% TFA water. After that, the acetate ditolyl concentration was increased to 15% in 180 minutes and then to 3%. It was increased to 35% in 00 min and eluted at a flow rate of 15 Zmin. The eluate was monitored at A220 nm, the fractions containing the target compound were collected, and lyophilized to obtain 2.054 g of hHCNP (2-7).
  • the obtained hHCNP (2-7) is a reversed-phase packing material YMC-AM303 (S-5) ODS column (4.6 ⁇ Retention time 13.2 min in linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA up to 50% with 50% The amino acid analysis value was consistent with the theoretical value.
  • This HCNP (6-11) peptide resin 9.46 g To the mixture was added anifur 1 Hethyl methylsulfide 2.4 ⁇ anhydrous hydrogen fluoride 100, and the mixture was reacted at 120 for 60 minutes and at 0 ° C for 70 minutes. After concentration under reduced pressure, getyl ether 10 was added, and the mixture was stirred for 30 minutes, filtered, and washed with getyl ether 150 and black hole form 150. 1N aqueous acetic acid (100) was added to the residue on the filter, and the mixture was stirred for 30 minutes. After freeze-drying the filtrate, 2.82 g of crude peptide was obtained.
  • the obtained crude peptide was dissolved in water 200, and the reversed-phase packing material Y M C — previously equilibrated with 0.1% TFA water was used.
  • R 355-150 3 30-Inject into ODS column (500 x 500 mm), wash the column with 0.1% TFA water, and adjust the acetonitrile concentration. Elution was performed at a flow rate of 15 Zmin., Increasing to 7% at 180 minutes and to 15% at 300 minutes. The eluate was monitored by A22Onm, and the fractions containing the desired product were collected and freeze-dried to obtain 1.194 g of hHCNP (6-11).
  • hHCNP (6-11) was prepared using reversed-phase packing material YMC—AM303 (S—5) — ⁇ DS column (4.6 ⁇ 250mm). , was. Analysis by linear gradient elution of acetonitrile containing 0,1% TFA up to 35% with 20% strength showed a retention time of 14.0 minutes and the amino acid Analytical values were consistent with the theoretical values. Amino acid analysis
  • the resin used was 1 ⁇ 811 A resin with a particle size of 100-200 mesh (crosslinked with 1% divinylbenzene, 0.76 millimoles of resin per gram of resin). ). 3.95 g of this resin was placed in a solid-state synthesis reaction vessel, and synthesis was started from step 3 according to schedule 1 described in Example 12 to obtain B 0 c -S er ( B z) One OH, B oc-T rp-0 H, B oc-Lys (C £ Z)-OH, B oc —
  • the obtained crude peptide was dissolved in water 200, and the reversed-phase packing material Y M C — previously equilibrated with 0.1% TFA water was used.
  • h HCNP (4 — 8) NH 2 is a reversed-phase packing material YMC — AM 3 0 3 (S-5) ⁇ DS column
  • Amino acid sequence H—Pro—Va1-Asp-Le-Pin-Ser-Lys-Trp-D-Ser-G1y
  • the obtained crude peptide was dissolved in 10% aqueous acetic acid, and reverse phase sorbent was equilibrated with 0.1% aqueous TFA.
  • the eluate monitored one and in A 2 8 0 nm, fractions containing the desired product were lyophilized to give - - (1 1 l) 7 6 8 0 mg [D S er 8] h HCNP. .
  • TEA 76.9 g was added.
  • Boc—Lys (Z) -0H75.90 g.H0Bt26.966 g and EDC30.997 g were sequentially added, and the mixture was cooled to room temperature. After stirring for an hour, the mixture was left overnight.
  • the reaction solution was poured into 7 liters of water and 2 liters of Ac0Et2, and the organic layer was washed with a 5% aqueous solution of citric acid, water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, and water in this order. The solvent was distilled off under reduced pressure. Add getyl ether to the residue, collect by filtration, wash, and dry.
  • B oc-Lys (Z)-T rp (CH ⁇ )-Ser (z £)-OM e 78.5 9 g is suspended in acetonitrile 250, and ice-cooled. The lower methanesulphonic acid 96.5 lg was added dropwise. After stirring for 2.5 hours, NMP500, TEA9.17 g, and DMF500 were added. To this solution, add B0c-Ser (z £)-0H3 1.01 g, HOBt 14.19 g, and EDC 16.3 g in that order, and return to room temperature for 2 hours After stirring, EDC ⁇ HC £ 1.97 g was added. After standing overnight, the reaction solution was poured into 20 liters of water and stirred at room temperature for 15 minutes.
  • the deposited precipitate was collected by filtration, washed successively with water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, water, and ethyl ether, dried, and dried to obtain Boc—Ser (Bz £) -Lys (Z) -T. rp (CHO) -Ser (Bz £) -OMe92.26 g was obtained.
  • Lys (Z) -Trp-Ser (Bzi)-0 H1.048 g, H ⁇ BtO.142 g, EDC * HC0.21 g are added sequentially and dissolved. Then, the mixture was returned to room temperature and stirred overnight. The reaction solution was added dropwise to water, and the deposited precipitate was collected by filtration, washed with water, dried and dried. Boc—MeLeu—Ser (Bz) -Lys (Z) -Trp-Ser (Bz) £) one
  • S er - NH (CH 2) 2 NH 2 is reverse phase packing material YM C-AM3 0 3 (S-5) — ODS column (4.6% x 0.15% aqueous solution of 16% acetonitrile in water with 0.1% TFA)
  • the retention time was 6.8 minutes in the analysis by the elution method, and the amino acid analysis value (however, Me Leu and T rp were not detected) and the mass analysis value agreed with the theoretical value. .
  • the obtained M e Leu — Ser — Lys — T rp — Ser — NH (CH 2 ) 3 NH 2 is a reversed-phase packing material YM C — AM 3 0 3 (S—5) — ⁇ 16% with 0.1% TFA using DS column (4.60 x 250mm)
  • the retention time was 6.18 minutes in the analysis by the elution method using an aqueous solution of acetonitrile, and the amino acid analysis value (however, eLeu and Trp were not detected) and mass spectrometry The value was consistent with the theoretical value.
  • Boc—Leu—0—resin, Boc—Pro—OH, Boc—Gy—OH, Boc—D-Ser (z £) — ⁇ H, Boc—Trp-OH, Boc—LysCC £ Z) H—Lys-T by successively coupling, deprotecting, and purifying 100H.
  • rp-D-Ser—Gy—Pro—Leu—OH was synthesized.
  • Gy-OEt25.Og was dissolved in DMF300, 1 NNa0H210 was added dropwise under ice cooling, and the mixture was stirred for 1 hour. 15 g of citric acid was added to the reaction solution, and the solvent was distilled off under reduced pressure. A c0Et1 liter was added and washed with saturated saline. After drying over magnesium sulfate, the magnesium sulfate was filtered off and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Boc—Trp—Ser (Bz) -G ⁇ y-OH3 1.72 g. Was.
  • Aqueous acetic acid was added to the residue, and a reversed-phase filler YMC—R355 (S-15/30) ODS force column (50%) equilibrated with 0.1% TFA water in advance After washing the column with 0.1% TFA water, the concentration of acetonitrile was increased to 30% in 240 minutes, and the flow rate was 1 S Zmin. Eluted with.
  • the eluate was monitored at A280 nm, and the fractions containing the target compound were collected, freeze-dried, and H-Trp-Ser-G ⁇ y-Pro-Leu-OHl 52.43. got nig.
  • L e u — ⁇ H is a reversed phase filler YM C— A M 3 0 3
  • Boc—Pro—Leu-0 Bz ⁇ 23.887 g was dissolved in acetonitrile 100, and ice-cooled ⁇ —toluenesulfonate monohydrate 29 .0 g was added. After stirring for 3.5 hours, the solvent was distilled off under reduced pressure. Out of 49.79 g of this residue, 17.6.6 g was dissolved in DMF 50 and neutralized with 4.02 g of TEA under ice-cooling. this In solution, Boc — Ser (z £)-G1y-0H7.0Og DMF (50) solution, EDC'HC ⁇ 3.808g, TEA2.01g, DMF 5 was added sequentially, and the mixture was stirred overnight.
  • H-Ser-Gy-Pro- is a reversed-phase packing material YM C-AM303 (S-5) -0 DS column (4.6 ° retention time in linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 50% using x250mm). It showed 80 minutes, and its amino acid analysis value and mass analysis value agreed with the theoretical values.
  • a c —T rp —Ser-G ⁇ y-Pro-L eu —OH is a reversed-phase packing material YMC—AM 3 O 3 (S—5) —ODS column (4.6 Retention time for analysis by linear gradient elution of acetonitrile containing 0.1% TFA up to 50% with a concentration of 20% using ⁇ x250mm). It showed 76 minutes, and its amino acid analysis value (however, T rp was not detected) and mass analysis value were consistent with the theoretical values.
  • Boc-D-Ser (Bz) -Gy-0Et10.6 g was suspended in acetonitrile 100, and methansulfonate 14.4 g was added dropwise. did. After stirring for 1 hour, the mixture was neutralized with 15.18 g of TEA. To a solution of this Z- T rp - OH 1 0. 1 5 g, H_ ⁇ B t 4. 0 5 g, EDC -. HC ⁇ 5 7 5 g, added sequentially CH 2 C £ 2 5 0, 2 hours Stirred.
  • Boc—Pro—OHIO.Og was dissolved in THF, and after cooling to ⁇ 20 ° C., 4.6 mm of NMM was added, 6.34 g of IBCTF was added dropwise, and the mixture was stirred for 5 minutes. Separately, after dissolving T0s0H ⁇ H-Leu-OBz ⁇ 18.27g in DMF, neutralize with NMM4.69g under ice-cooling to prepare a solution. Added to After stirring for 2 hours, water was added, the mixture was cooled to room temperature, extracted with AcOEt, and washed with water. The organic layer was dried with magnesium sulfate, and the magnesium sulfate was filtered off. The solvent was distilled off under reduced pressure, and Boc—Pro—Leu—OBz.
  • H—T rp —D—Ser—G ⁇ y—Pro-Leu—OH is a reversed-phase packing material YM C—AM303 (S—5) —ODS column ( Retention time of 20% to 50% of 0.1% TFA containing 0.1% TFA was analyzed using a linear gradient elution method. Indicates 7 to 8 minutes, and its amino acid value analysis value (However, T rp was not detected) and the mass spectrometry value agreed with the theoretical value.
  • TFA was distilled off under reduced pressure, ether 300 was added to precipitate, filtered and dried.
  • H — T rp — Ser — G y — Pro — Le — NH -NH 2 is a reversed-phase packing material YMC — AM 303 (S — 5) — ODS column (4.6 Retention times for linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 40% using 0x250mm).
  • Boc—Leu—0—resin was placed in a solid-phase synthesis reaction vessel, and Boc-Pro—OH, Boc-Gy-OH.B according to Schedule 1 described below.
  • B oc-T rp — OH was sequentially coupled. A part of the resin is removed and H-T rp — A a — G £ y — Pro — L eu — OH peptide resin 1.05 g was obtained.
  • H—TrP-Aa-Gy-Pro-Leu-OH is a reversed-phase packing material YMC—AM303 (S—5) — ⁇ DS column (4.6 Retention time in linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 50% using 0x250mm).
  • the amino acid analysis value was in agreement with the theoretical value.
  • the resin used was a methylated polystyrene vinylbenzene resin with a particle size of 100-200 mesh mouth (crosslinked with 1% divinylbenzene, resin 1 g 0.668 per milliliter of chloride is included).
  • Synthesize polypeptide To this end, 3.05 g of Boc—Leu— ⁇ H was dissolved in ethyl alcohol 2Q ⁇ and water 7 and ⁇ 7 was dissolved in a 20% aqueous solution of cesium carbonate. The mixture was concentrated under reduced pressure, and dried. To this, DMF12 was added, and 15 g of a chloromethylated resin was added, followed by stirring at 50 ° C for 12 hours and further at room temperature for 12 hours, followed by esterification. The obtained B0c—Leu—0—resin was filtered, washed sequentially with DMF, 90% DMF, DMF, and ethyl alcohol, and dried. The yield is 16.9 g.
  • This HCNP (8-11) peptide resin was converted to lg / sol 3 and ethyl methyl sulfide 0.5 ⁇ ⁇ anhydrous hydrogen fluoride 20? ⁇ was added, and the reaction was carried out at ⁇ 20 ° C. for 60 minutes and at 0 for 60 minutes. After concentration under reduced pressure, dimethyl ether 200 was added, the mixture was stirred for 30 minutes, filtered, and washed with dimethyl ether 100. To the filtered product was added 100% aqueous 5% acetic acid, and the mixture was stirred for 30 minutes. Then, the resin was filtered and washed with 10% aqueous 10Q ⁇ .
  • the HCNP (8-11) obtained was purified from 10% to 50% using a reversed-phase packing material YMC-A211-one ODS column (4.60 x 250 mm). Analysis of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid up to 14.7 min by linear gradient elution showed a retention time of 14.7 minutes. Matched value.
  • the biological activity was measured according to the method of Yukio Oka et al. [Drugs, Psychological-Action, Vol. 7, pp. 447-451 (19987)]. That is, after the central septum nucleus removed from the rat brain on the 16th day of fetal gestation was minced, it was placed in a Falcon 35 mm plastic culture dish containing 1% FCS. Using a modified N 2 culture solution such as Bottenstein, the cells were cultured under the conditions of 7% carbon dioxide mixed air and 36 ° C.
  • the following table shows an example of the characteristic biological activity of some representative examples of the neurotrophic peptide derivatives of the present invention.
  • the AC h production ability is a value obtained by setting the control group to 100%.
  • a novel human-derived neurotrophic peptide and an derivative thereof which have an action of increasing the ability of cholinergic nerves to synthesize acetylcholine, and a novel treatment for a neurodegenerative disease.
  • Agent can be provided.
  • the present invention also provides a gene encoding a human-derived neurotrophic peptide and its precursor polypeptide, a recombinant expression vector containing the gene, and a transformant containing the same. This has made it possible to produce human-derived neurotrophic peptides by genetic engineering.
  • Sequence type nucleic acid

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Abstract

A neurotrophic peptide derived from man or rat or a derivative thereof, useful as a medicine; a peptide comprising a precursor thereof or a part thereof; a gene coding for these; a transformant containing a recombinant expression vector containing said gene; and a remedy for nervous degeneration containing as the active ingredient the neurotrophic peptide, the derivative thereof, or the peptide comprising a precursor thereof or a part thereof.

Description

明 細 書 神経栄養べプチ ド 関連出願との関係  Description Neurotrophic peptides Relationship with related applications
本件出願は、 指定国の一つである米国においては、 1 9 9 2 年 4 月 2 7 日 に出願された米国出願番号 0 7 8 7 3 , 7 6 4 及び 1 9 9 1 年 9 月 1 2 日 に出願された米 国出願番号 0 7 / 7 5 8 , 0 4 3 の一部継続出願であ り 本件明細書中にこれら米国出願の明細書の内容を全て引 用する。 尚、 米国出願番号 0 7 / 7 5 8 , 0 4 3 は、 1 9 9 0 年 3 月 2 9 日 に出願された米国出願番号 0 7 5 0 1 , 2 1 7 の一部継続出願であ り、 米国出願番号 0 7 / 5 0 1 , 2 1 7 は既に放棄されている。  This application is filed in the United States, one of the designated countries, with U.S. application numbers 078773, 7664, and September 1, 1991 filed on April 27, 1992. It is a continuation-in-part application of U.S. application No. 07 / 758,043 filed on the 2nd, and the entire contents of the specification of these U.S. applications are cited in the present specification. U.S. application number 07 / 758,043 is a continuation-in-part of U.S. application number 075001,2177 filed on March 29, 1990. U.S. application Ser. No. 07/501, 217 has already been abandoned.
技術分野 Technical field
本発明は、 神経栄養因子関連ポ リ ペプチ ド、 それらの 遺伝子及びそれらの薬学的用途に関する。 具体的には神 経栄養ペプチ ドその誘導体及び遺伝子に関する。 即ち、 医薬と して有用な ヒ ト またはラ ッ ト 由来の神経栄養ぺプ チ ドおよびその誘導体、 その前駆体ポ リ ペプチ ド、 それ らをコ一 ドする遺伝子、 該遺伝子を含む組換え発現べク ターを含有する形質転換体、 及びそれらの神経栄養ぺプ チ ドまたはその誘導体を有効成分とする神経変性疾患治 療剤に関する ものである。  The present invention relates to neurotrophic factor-related polypeptides, their genes and their pharmaceutical uses. More specifically, it relates to a neurotrophic peptide derivative and gene. That is, human or rat-derived neurotrophic peptides and their derivatives useful as pharmaceuticals, their precursors, their precursor polypeptides, genes encoding them, and recombinant expression containing the genes The present invention relates to a transformant containing a vector, and a therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising a neurotrophic peptide or a derivative thereof as an active ingredient.
更に詳し く は、 本発明は新規な神経栄養ペプチ ド、 即 ちラ ッ ト海馬由来の神経栄養因子活性を有する神経栄養 ぺプチ ドに対応する ヒ ト 由来の神経栄養因子活性を有す る神経栄養べプチ ドまたはその一部のァ ミ ノ 酸配列から なる神経栄養ペプチ ド誘導体、 またはそれらの末端を修 飾した神経栄養ペプチ ド誘導体に関する。 また、 ラ ッ ト 海馬由来または ヒ ト由来の神経栄養べプチ ドを含む前駆 体ポ リ ペプチ ド関する。 更に、 ラ ッ ト海馬由来または ヒ ト 由来の神経栄養ペプチ ド、 またはそれらの前駆体ポ リ ペプチ ドをコー ドする遺伝子、 及びそれらの遺伝子を組 み込んだ組換え発現べク タ一で形質転換された細菌、 酵 母または哺乳動物細胞に関する。 更に本発明の神経栄養 ぺプチ ドまたはその誘導体を有効成分とする神経変性疾 患治療剤、 それらペプチ ドを用いた神経変性疾患の治療 法、 及びそれらペプチ ドの薬学的使用に関する。 More specifically, the present invention relates to novel neurotrophic peptides, It consists of a neurotrophic peptide having a human-derived neurotrophic factor activity corresponding to a neurotrophic factor having a neurotrophic factor activity derived from a rat hippocampus, or a partial amino acid sequence thereof. The present invention relates to a neurotrophic peptide derivative or a neurotrophic peptide derivative whose terminal has been modified. It also relates to precursor polypeptides, including neurotrophic peptides derived from rat hippocampus or human. In addition, genes encoding neurotrophic peptides derived from rat hippocampus or human, or their precursor polypeptides, and recombinant expression vectors incorporating those genes are characterized. It relates to a transformed bacterium, yeast or mammalian cell. Further, the present invention relates to a therapeutic agent for a neurodegenerative disease containing the neurotrophic peptide of the present invention or a derivative thereof as an active ingredient, a method for treating a neurodegenerative disease using the peptide, and a pharmaceutical use of the peptide.
背景技術 Background art
従来よ り神経栄養因子については種々 の報告がなされ ている力 、 なカヽでも H C N P (Hippocampal cholinergic neurotrophic peptide) は小鹿らによ り、 幼若ラ ッ ト B¾ の海馬組織よ り単離された 1 1 残基のア ミ ノ 酸よ りなる 神経栄養ペプチ ドであ り、 ラ ッ 卜脳中隔核組織のァセチ ルコ リ ン作動性ニュ ー ロ ンに対 してァセチルコ リ ンの産 生を促進する作用を有する （特開平 3 — 7 2 4 9 9号） , さ らに小鹿らは、 よ り低分子量の H C N P誘導体を開示 している （ E P — A— 0 3 9 0 6 0 2 ) 。 単離され一次 構造が明 らかにされている蛋白性因子と しては神経成長 因子 (Nerve growth factor, NGF) (Angel e 11 i and Bradshow ： Pro Natl. Acad. Sci. USA, 68, 2417， 1971) と脳由来神経栄養因子 （Brain-derived neurotro phi c factor, BDNF) ( J . Le i b 1 ock e t a 1. ： Nature, 341, 149, 1989) さ らに毛様体神経栄養因子 （Ciliary neurotrophic factor, CNTF) (F. Collins e t a 1. ： Science, 246, 1023, 1989) がある。 また、 近年、 N G F と B D N F と高い類似性を有するニュ ー ロ ト ロ ピン 3 ( Neurotrophin-3, NT-3) と称される因子の ク ローニ ン グが行われている （A. Hohn et al. ： Nature, 344. Various reports have been made on neurotrophic factors.Hippocampal cholinergic neurotrophic peptide (HCNP) was isolated from the hippocampal tissue of juvenile rat B¾ by Oka et al. A neurotrophic peptide consisting of one amino acid residue that promotes acetylcholine production against acetylcholinergic neurons in rat brain septal nucleus tissue (Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-72499), and Oka et al. Disclose a HCNP derivative having a lower molecular weight (EP-A-0 390 602). Nerve growth is a proteinaceous factor that has been isolated and whose primary structure has been elucidated. Nerve growth factor (NGF) (Angel e 11 i and Bradshow: Pro Natl. Acad. Sci. USA, 68, 2417, 1971) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (J Le ib 1 ock eta 1 .: Nature, 341, 149, 1989) In addition, Ciliary neurotrophic factor (CNTF) (F. Collins eta 1 .: Science, 246, 1023, 1989) is there. In recent years, a factor called Neurotrophin-3 (NT-3), which has high similarity to NGF and BDNF, has been cloned (A. Hohn et al. For Nature, 344.
339, 1990； P. Maisonpierre et al. ： Sience, 247， 1446, 1990； 及び Y. Kaisho et al. ： FEBS Letters, 266, 187, 1990) 。  339, 1990; P. Maisonpierre et al .: Sience, 247, 1446, 1990; and Y. Kaisho et al .: FEBS Letters, 266, 187, 1990).
N G F , B D N F及び C N T F はそれぞれ分子量 1 3 2 5 9 , 1 3 5 1 1 , 2 2 6 6 0 の蛋白性因子であ り、 ク ロ一ニン グされた N T— 3 ( N G F — 2 ) もア ミ ノ 酸 の総数 1 1 9 個の蛋白質である こ とから、 これらを神経 変性疾患治療剤と して使用する場合、 バイオアベイ ラ ビ リ テ ィ や製造面での問題が考え られる。 こ の点に於いて、 ラ ッ ト よ り得られた H C N P は 1 1 残基のペプチ ド性因 子であ り、 さ らにその誘導体は前記のよ う によ り低分子 量の化合物である こ と よ り これらの問題点は解決可能で ある と考え られる。  NGF, BDNF and CNTF are proteinaceous factors with molecular weights of 13259, 13511 and 22660, respectively, and also cloned NT-3 (NGF-2). Since these proteins are a total of 119 amino acids, their use as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases may have problems in bioavailability and production. In this regard, HCNP obtained from the rat is a 11-residue peptide factor, and its derivative is a low molecular weight compound as described above. It is considered that these problems can be solved.
しか しながら、 従来よ り得られている H C N P はラ ッ 卜の脳由来の因子である こ と よ り、 ヒ ト等のよ り高等な 哺乳類の神経変性疾患治療剤と して使用する場合、 対応 する動物種由来の因子を使用する こ とが望ま しい。 こ の よ う に神経栄養ペプチ ドと して、 特に ヒ ト 由来の H C N P さ らに同様の薬理作用を有するその誘導体の開発が強 く 望まれているが、 有用な ものは未だ得られていないの が実情である。 However, since HCNP obtained conventionally is a factor derived from rat brain, it is more expensive than humans. When used as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases in mammals, it is desirable to use factors derived from the corresponding animal species. As described above, there is a strong demand for the development of neurotrophic peptides, especially human-derived HCNP, and derivatives thereof having the same pharmacological action, but useful compounds have not yet been obtained. Is the actual situation.
本発明は上記従来の課題を解決する ものである。  The present invention is to solve the above-mentioned conventional problems.
即ち、 本発明の目的は、 アセチルコ リ ン作動性ニ ュ ー ロ ン に対して神経栄養作用を有する、 新規な神経栄養べ プチ ド （以下、 本明細書においては H C N P と略す場合 がある） ま たはその誘導体を提供する こ とにある。  That is, an object of the present invention is to provide a novel neurotrophic peptide having a neurotrophic effect on acetylcholinergic neuron (hereinafter sometimes abbreviated as HCNP in the present specification). Or a derivative thereof.
本発明の他の目的は前記の神経栄養べプチ ドをコ一 ド する遺伝子を提供する こ とにある。  Another object of the present invention is to provide a gene encoding the aforementioned neurotrophic peptide.
本発明の更に他の目的は前記の遺伝子を含む発現べク 夕一を含有する形質転換体を提供する こ とにある。  Still another object of the present invention is to provide a transformant containing an expression vector containing the above gene.
本発明の更に他の目的は新規な神経変性疾患治療剤を 提供する こ とにある。  Still another object of the present invention is to provide a novel therapeutic agent for a neurodegenerative disease.
本発明の更に他の目的は神経変性疾患の治療法を提供 する こ とにある。  Still another object of the present invention is to provide a method for treating a neurodegenerative disease.
本発明の更に他の目的は、 新規な神経栄養べプチ ドま たはその誘導体の薬学的使用を提供する こ とにある。 発明の開示  Yet another object of the present invention is to provide a pharmaceutical use of a novel neurotrophic peptide or derivative thereof. Disclosure of the invention
本発明者等は、 前記課題を解決するためにラ ッ ト脳由 来 H C N P に対応する ヒ ト由来の H C N Pのア ミ ノ 酸配 列を決定する 目的で、 ラ ッ ト脳由来 H C N Pを含 前駆 体タ ンパク質をコー ドする遺伝子の ク ローニ ン グを行つ た。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have determined that the amino acid sequence of human-derived HCNP corresponding to rat brain-derived HCNP contains rat brain-derived HCNP. Cloning of genes encoding body proteins was performed.
これは、 上記 H C N Pを含む前駆体タ ンパク質の遺伝 子の発現及び産生されたタ ンパク質のプロセ ッ シ ン グ機 構を明 らかにする こ とは極めて重要な課題と考え られ、 こ の点から も前駆体タ ンパク質をコ ー ドする遺伝子の ク ローニン グが要求されたからである。  This is considered to be a very important task to clarify the expression of the precursor protein gene including HCNP and the processing mechanism of the produced protein. In view of this, the cloning of the gene encoding the precursor protein was required.
具体的にはラ ッ ト海馬組織よ り調整した m R N Aを用 いて作製された c D N A ライ ブラ リ ーよ り前駆体タ ンパ ク質をコー ドする遺伝子の検索を前記の 1 1 ア ミ ノ 酸か ら成る ラ ッ ト H C N P に対するポ リ ク ロ一ナル抗体を用 いて行った。  Specifically, a search for a gene encoding a precursor protein was carried out from a cDNA library prepared using mRNA prepared from rat hippocampal tissue as described in the above-mentioned 11 amino acids. This was performed using a polyclonal antibody against rat HCNP composed of an acid.
その結果、 幼若ラ ッ ト脳の海馬組織の細胞で働いてい る全遺伝子の中から、 ラ ッ ト H C N Pを含む前駆体遺伝 子の単離に成功 し、 本発明を完成する に至った ものであ る。  As a result, a precursor gene containing rat HCNP was successfully isolated from all genes working in hippocampal tissue cells of the immature rat brain, and the present invention was completed. It is.
また、 上記ラ ッ ト型の前駆体ポ リ ペプチ ドをコー ドす る遺伝子よ り ヒ ト型の前駆体ポ リ ペプチ ドをコー ドする 遺伝子を単離する こ とに成功した。 更に、 ラ ッ トの神経 栄養ペプチ ドに対応する 1 1 ア ミ ノ 酸よ りなる ヒ ト型の ペプチ ドに神経栄養因子活性が認め られ、 本発明に至つ た ものである。  In addition, a gene encoding a human precursor polypeptide was successfully isolated from a gene encoding a rat precursor polypeptide described above. Furthermore, a human-type peptide consisting of 11-amino acid corresponding to a rat neurotrophic peptide was found to have neurotrophic factor activity, leading to the present invention.
更には、 H C N Pの部分ペプチ ド及び H C N Pの C末 端部位のァ ミ ノ 酸配列を含むぺプチ ドがコ リ ン系神経の アセチルコ リ ン合成能増大活性を有する こ とを見出 し、 本発明を完成するに至った ものである。 Furthermore, they have found that a partial peptide of HCNP and a peptide containing an amino acid sequence at the C-terminal end of HCNP have an activity to increase acetylcholine synthesis ability of cholinergic nerves, The present invention has been completed.
即ち、 本発明の要旨は以下の通りである。  That is, the gist of the present invention is as follows.
( 1 ) 配列番号 ： 1 7 で表される神経栄養ペプチ ドをコ 一 卜する ia  (1) Coats the neurotrophic peptide represented by SEQ ID NO: 17 ia
( 2 ) 配列番号 1 5 で表される神経栄養ペプチ ドをコ 一 卜する退 is  (2) A method for collecting the neurotrophic peptide represented by SEQ ID NO: 15
( 3 ) 配列番号 3 で表されるポ リ べプチ ドをコ一 ドす る遺伝子、  (3) a gene encoding the polypeptide represented by SEQ ID NO: 3,
( 4 ) 配列番号 1 4 で表されるポ リ ペプチ ドをコー する退 I 十、  (4) coding for the polypeptide represented by SEQ ID NO: 14;
( 5 ) 配列番号 1 5 で表されるア ミ ノ酸配列を有する 神経栄養べプチ ドまたは該ァ ミ ノ 酸配列の一部からな り 少な く と も配列一 L y s — T r p を含む神経栄養作用を 有する神経栄養べプチ ド誘導体、  (5) a neurotrophic peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 or a nerve comprising at least a part of the amino acid sequence Lys-Trp; Neurotrophic peptide derivatives with trophic effects,
( 6 ) 前記 （ 5 ) 記載の神経栄養ペプチ ドまたは神経栄 養べプチ ド誘導体の N末端および Zまたは C末端を修飾 した神経栄養作用を有する神経栄養べプチ ド誘導体、 ( 7 ) 配列番号 ： 3 で表される前駆体ポ リ ペプチ ド、 ( 8 ) 配列番号 ： 1 4 で表される前駆体ポ リ ペプチ ド、 ( 9 ) ヒ ト 由来の神経栄養ペプチ ドの C末端部位の y - P r o - L e u配列を含む神経栄養べプチ ド誘導体 ( 1 0 ) 前記の遺伝子を含む組換え発現べク タ一で形質 転換された細菌、 酵母または哺乳動物細胞、  (6) a neurotrophic peptide derivative having a neurotrophic effect in which the N-terminus and the Z- or C-terminus of the neurotrophic peptide or the neurotrophic peptide derivative according to the above (5) are modified; (7) SEQ ID NO: A precursor polypeptide represented by 3; (8) a precursor polypeptide represented by SEQ ID NO: 14; (9) y-P at the C-terminal site of a human-derived neurotrophic peptide a neurotrophic peptide derivative containing a ro-Leu sequence (10) a bacterium, yeast or mammalian cell transformed with a recombinant expression vector containing said gene;
( 1 1 ) 前記の神経栄養ペプチ ドまたは神経栄養べプチ ド誘導体を有効成分とする神経変性疾患治療剤、 ( 1 2 ) 前記のペプチ ドを投与する こ とを含む神経変性 疾患の治療法、 並びに (11) A therapeutic agent for a neurodegenerative disease comprising the above-mentioned neurotrophic peptide or neurotrophic peptide derivative as an active ingredient, (12) A method for treating a neurodegenerative disease comprising administering the above-mentioned peptide, and
( 1 3 ) 前記のペプチ ドの薬学的使用。  (13) Pharmaceutical use of the peptide.
図面の簡単な説明 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
第 1 図は ク ロ ー ンのス ク リ ーニ ン グに使用 されたオ リ ゴ ヌ ク レオチ ドプロ ーブの配列を示す図である。  FIG. 1 is a diagram showing the sequence of an oligonucleotide probe used for screening a clone.
ラ ッ ト海馬由来の神経栄養べプチ ドのァ ミ ノ 酸配列よ り類推された塩基配列の内、 使用されたプローブ領域に ついて図示した。  The probe region used in the nucleotide sequence deduced from the amino acid sequence of the neurotrophic peptide derived from the rat hippocampus is shown in the figure.
1 ) 塩基配列の中央部に存在する 7 2通り のプロ ーブを 合成した。 こ の際、 中央部プローブと して表記された 2 4通り の組み合わせよ り なる 1 7塩基からなるプローブ 群を 3種合成し、 等モル数を混合 してプローブと した。 2 ) C末端のプローブは 2 5 6通りからなる 1 6塩基か らなる混合プローブである。  1) Seventy-two probes existing in the center of the nucleotide sequence were synthesized. At this time, three kinds of probe groups each consisting of 17 bases consisting of 24 combinations shown as a central probe were synthesized, and equimolar numbers were mixed to obtain a probe. 2) The C-terminal probe is a mixed probe consisting of 16 bases consisting of 256 kinds.
第 2図はラ ッ ト海馬由来の神経栄養ペプチ ド前駆体遺 伝子の制限酵素地図及び塩基配列決定のス ト ラテジーを 示す図である。  FIG. 2 is a diagram showing a restriction enzyme map of a neurotrophic peptide precursor gene derived from the rat hippocampus and a strategy for sequencing.
図中に前駆体遺伝子ク ロー ン （ A 6 1 c D N A ) の制 限酵素による切断パタ ー ンを示 した。 A 6 1 c D N A ( E c o R I 約 1 K b断片） には H i n c l I 、 S a c I I 、 P s t I 、 S m a I 切断部位が存在した。 これ ら の切断部位を用いて ク ロー ンのサブク ロー ン化を行い、 波線で示される領域の塩基配列の決定を行っ た。 なお、 A G l c D N A中の太線は塩基配列の決定の結果見出さ れたオープン リ 一ディ ン グフ レームを表す。 The pattern of cleavage of the precursor gene clone (A61cDNA) by the restriction enzyme is shown in the figure. A61cDNA (EcoRI about 1 Kb fragment) had HinclI, SacII, PstI, and SmaI cleavage sites. Clones were subcloned using these cleavage sites, and the nucleotide sequence of the region indicated by the wavy line was determined. The bold line in AG lc DNA indicates the result of nucleotide sequence determination. Represents an open reading frame.
第 3 図は第 4 図と と もにラ ッ ト海馬由来の神経栄養べ プチ ド前駆体遺伝子を含むク ロー ン A 6 1 c D N Aの全 塩基配列を示す。  FIG. 3 shows the entire nucleotide sequence of clone A61c DNA containing the neurotrophic peptide precursor gene from rat hippocampus together with FIG.
塩基配列よ り推定されるア ミ ノ 酸配列を並記した。 ォ 一プン リ 一ディ ン グフ レ ームの N末端よ り神経栄養因子 活性を有する 1 1 ア ミ ノ 酸配列が存在し、 オープン リ ー デイ ン グフ レームを構成するア ミ ノ 酸数は 1 8 6 であつ た。 また、 図中の下線はポ リ （ A ) 付加シグナルを示し ている。 なお、 翻訳開始コ ド ンである A T G配列はォ一 プン リ 一ディ ングフ レ ームに含まれていない。  The amino acid sequence deduced from the base sequence is also shown. There is an amino acid sequence having neurotrophic factor activity from the N-terminus of the open reading frame, and the number of amino acids constituting the open reading frame is 1 It was 8 6. The underline in the figure indicates the poly (A) addition signal. The ATG sequence which is a translation initiation code is not included in the open reading frame.
第 4 図は第 3 図 と と もにラ ッ ト海馬由来の神経栄養べ プチ ド前駆体遺伝子を含むク ロー ン A 6 1 c D N Aの全 塩基配列を示す。  FIG. 4 shows together with FIG. 3 the entire nucleotide sequence of clone A61c DNA containing the neurotrophic peptide precursor gene from rat hippocampus.
第 5 図は第 3 図および第 4 図に記された塩基配列よ り 演繹されたア ミ ノ 酸配列を示す。 こ のア ミ ノ 酸配列には 翻訳開始コ ドンが含まれていない。  FIG. 5 shows the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequences shown in FIGS. 3 and 4. This amino acid sequence does not contain a translation initiation codon.
第 6 図はラ ッ ト及びヒ ト由来の神経栄養ペプチ ド前駆 体遺伝子を大腸菌発現ベク ター p K K 2 3 3 — 2 誘導体 へ挿入する工程を示す図である。  FIG. 6 is a diagram showing a step of inserting a rat and human-derived neurotrophic peptide precursor gene into an Escherichia coli expression vector pKK233-3-2 derivative.
ラ ッ ト海馬由来の神経栄養べプチ ド前駆体遺伝子 （ A 0 1 0 — 1 2 c D N A ) 及びその ヒ ト型遺伝子 （ p 1 — 3 c D N A ) の E c o R I 末端を D N Aポ リ メ ラーゼ I ( Klenow fragment)で平滑化し、 大腸菌発現ベク ター p K K 2 3 3 — 2 への導入を図 った。 大腸菌発現べク タ 一 p K K 2 3 3 — 2 は N c o I で切断後、 マ ン グ ビー ン ヌ ク レアーゼ （Mung Bean Nuclease) で処理する こ とによ つて平滑化 し、 S m a I リ ン カ 一を導入する。 構築され たベク タ ーを S m a I で切断後フ ォ スフ ァ タ ーゼ処理を 行い上記前駆体遺伝子を導入する。 ク ローニ ン グされた 組換えベク タ ーを P K K 2 3 3 — 2 — A 0 1 0 — 1 2及 び p K K 2 3 3 - 2 - p 1 3 と命名 した。 The EcoRI terminal of the neurotrophic peptide precursor gene (A010-122cDNA) and its human gene (p1-3cDNA) from the rat hippocampus was ligated to DNA polymerase. It was blunted with I (Klenow fragment) and introduced into the E. coli expression vector pKK233-3-2. E. coli expression vector pKK2 3 3 —2 is cut with NcoI, smoothed by treatment with Mung Bean Nuclease, and SmaI linker is introduced. . After digesting the constructed vector with SmaI, it is subjected to phosphorylation to introduce the precursor gene. The cloned recombinant vectors were designated as PKK233—2—A010—12 and pKK233-2-2-p13.
第 7図はラ ッ ト及びヒ ト海馬由来の神経栄養べプチ ド 前駆体遺伝子を真核細胞発現ベク ター へ導入する工程を 示す図である。  FIG. 7 is a diagram showing a step of introducing a rat and human hippocampus-derived neurotrophic peptide precursor gene into a eukaryotic cell expression vector.
導入する発現べク ターの構築は以下の手順に従った。 MMT V— L T Rを含む p M D S G D N Aを H i n d I I I で分解後、 MMT V— L T Rを含む D N A断片 1. 4 K bを D N Aポ リ メ ラ一ゼ I ( Klenow fragment)で 処理し平滑化する。 X b a I リ ン カ 一を付加 し、 pBluescri pt I I の X b a I 部位へ揷入 した。 また、 S V 4 0 D N Aを B c I I 一 E c o R I で分解後ポ リ ( A ) 付加シグナルを有する 1 K bの D N A断片を同様 に平滑化し、 X h 0 I リ ンカ 一を付加後、 pBluescri pt I I の X h o I 部位へ挿入 した。 また、 p MA N— n e o に含まれる ネオマ イ シ ン耐性遺伝子を有する 2. 6 K b B a m H I 断片を、 予め S m a I 部位に  The following procedure was used to construct the expression vector to be introduced. After digesting pMDSGDNA containing MMT V—LTR with HindI I I, the DNA fragment containing MMT V—LTR 1.4 Kb is treated with DNA polymerase I (Klenow fragment) and smoothed. An XbaI linker was added to insert into the XbaI site of pBluescript II. After SV40 DNA was digested with BcII-EcoRI, the 1 Kb DNA fragment having a poly (A) addition signal was similarly blunted, and after adding Xh0I linker, pBluescri It was inserted into the XhoI site of ptII. In addition, a 2.6 Kb Bam HI fragment containing the neomycin resistance gene contained in pMAN-neo was previously inserted into the SmaI site.
K P n I リ ン カ 一を挿入 した p U C 1 9 の B a m H I 部 位に導入 した。 次に、 2. 6 K bの K p n I 断片を上記 発現ベク タ ーに導入 した。 上記構築発現ベク タ ーの E c o R I 部位に A 〇 1 0 — 1 2 及び p 1 — 3 遺伝子を 導入 し、 ク ローニン グされた組換えベク ターを p MM T V - L T R - A O 1 0 1 2 及び p MM T V — L T R — p 1 3 と命名 した。 It was introduced at the BamHI site of pUC19 into which the KP nI linker was inserted. Next, a 2.6 Kb KpnI fragment was introduced into the expression vector. Of the above expression vector The A〇10—12 and p1—3 genes were introduced into the EcoRI site, and the cloned recombinant vector was transformed into pMMTV-LTR-AO102 and pMMTV—LTR— It was named p13.
発明を実施するための最良の形態 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
本発明のラ ッ ト型の前駆体ポ リ べプチ ドをコ一 ドする 遺伝子は、 ラ ッ ト海馬由来神経栄養ペプチ ドの存在が認 められる生後 1 2 日合の幼若ラ ッ ト海馬組織から m R N Aを調整した後、 既知の方法によ り 2 本鎖 c D N Aに変 換し、 大腸菌内で c D N Aにコー ドされる タ ンパク質を 合成させ、 ラ ッ ト海馬由来神経栄養ペプチ ドに対する抗 体に反応性を示すク ロー ンを単離する事によ って得られ る。  The gene encoding the rat precursor polypeptide of the present invention is a juvenile rat hippocampus 12 days after birth in which the presence of a rat trophic neuron-derived neurotrophic peptide is recognized. After preparing mRNA from the tissue, it is converted to double-stranded cDNA by a known method, and the protein encoded in the cDNA is synthesized in E. coli, and a rat hippocampus-derived neurotrophic peptide is synthesized. It can be obtained by isolating clones that are reactive with antibodies to sulfide.
上記幼若ラ ッ ト海馬組織全 R N Aの調整は、 既にい く つかの生理活性タ ンパク質のク ロー ン化において用い ら れた常法によ って行えば良い。 例えば、 S D S、 N P - 4 0 、 Tri ton-X 1 0 0 等の界面活性剤も し く はフ エ ノ ー ル存在下で細胞を処理する こ とによ って細胞を分解する 方法力 挙げられる ( J. Sambrook et al . ： "Molecular Cloning - A laboratory manual , 2nd. e d . " , Cold The adjustment of the total RNA of the juvenile rat hippocampus tissue may be performed by a conventional method which has already been used for the cloning of some bioactive proteins. For example, a method for degrading cells by treating the cells in the presence of a surfactant or phenol such as SDS, NP-40, Triton-X100, etc. (J. Sambrook et al .: "Molecular Cloning-A laboratory manual, 2nd ed.", Cold
Spring Harbor Lab. , New York, 1989; 及び J. Favaloro et al. ： Methods in Enzymoに 65， 718, 1980)。 こ の 場合、 RNase による R N Aの分解を防 ぐためバナジウム 複合体、 へノ、。 リ ン、 ベン ト ナイ ト、 ジェチル ピロカーボ ネー ト等の RNase 阻害剤を添加 してお く こ とが望ま しい。 また、 その他にホモゲナイザー等の物理的方法によ って 細胞を破砕し、 グァニジ ンチオシァネー トで細胞を処理 した後、 塩化セ シ ウ ム密度勾配遠心によ って全 R N Aを 沈澱化させる こ とが出来る （J. Sambrook et al. ： "Molecular Cloning - A laboratory monua 1 , 2nd. ed Cold Spring Harbor Lab. , New York, 1989 ； V.Glisin et al.： Biochem. , 13, 2633， 1974;及び A.Ullrich et al. ： Scince, 196, 1313, 1977) 。 次に上記方法のいずれかに よ って得られた細胞の全 R N Aからポ リ アデニル化され た m R N Aを精製するには、 オ リ ゴ （ d T ) — セ ルロー ス、 ポ リ Uを結合 したポ リ U—セフ ァ ロ一スな どのァフ ィ ニティ 一カ ラムを用いる力、 （M. Edmonds et al. ： Pro Natl. Acad. Sci. USA, 68， 1336, 1971； 及び H. Aviv and P. し eder ： Proc. Natl. Spring Harbor Lab., New York, 1989; and J. Favaloro et al .: Methods in Enzymo 65, 718, 1980). In this case, a vanadium complex, heno, etc. to prevent RNA degradation by RNase. It is desirable to add RNase inhibitors such as phosphorus, bentonite, and getyl pyrocarbonate. In addition, it is also possible to disrupt cells by a physical method such as a homogenizer, treat the cells with guanidinium thiosinate, and then precipitate total RNA by cesium chloride density gradient centrifugation. Yes (J. Sambrook et al .: "Molecular Cloning-A laboratory monua 1, 2nd. Ed Cold Spring Harbor Lab., New York, 1989; V. Glisin et al .: Biochem., 13, 2633, 1974; and A Ullrich et al .: Scince, 196, 1313, 1977. Next, to purify polyadenylated mRNA from total RNA of cells obtained by any of the above methods, use the following procedure. Go (d T)-Cellulose, Poly-U combined with Poly-U-Force using affinity column such as Sepharose, (M. Edmonds et al .: Pro Natl. Acad Sci. USA, 68, 1336, 1971; and H. Aviv and P. eder: Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 69， 1408, 1972) m R N Aの長さが判 明 している場合 も し く は更に m R N Aの長さ に基づいて 分画した場合には、 シ ョ 糖密度勾配遠心法 (Acad. Sci. USA, 69, 1408, 1972) If the mRNA length is known or if fractionation is based on mRNA length, sucrose gradient centrifugation Law
( . F. Schleif and P. Wensink ： "Practical Methods in Molecular Biology ， Spring - Ver lag, Ne w York, 1981) 、 ァガロースゲル電気泳動、 カ ラムによ るゲルろ過法等を用いる こ とが可能である。 上記の如 く して得られた po 1 y ( A ) m R A Nが目的のタ ンパク質を コ一 ドするかを確認するためには下記のい く つかの方法 を用いれば良い。  (. F. Schleif and P. Wensink: "Practical Methods in Molecular Biology, Spring-Verlag, New York, 1981"), agarose gel electrophoresis, column gel filtration, etc. To confirm whether the po 1 y (A) m RAN obtained as described above encodes the target protein, any of the following methods may be used.
1 ) 調整された m R N Aを直接タ ンパク質に翻訳させ、 産生さ れたタ ンパ ク質の生理活性を調べる。 こ の場合、 ァ フ リ カ ツ メ ガエルの卵母細胞に m R N Aを導入する力、 ( J. B. Gurdon et al. ： Nature, 233， 177, 1972; 及 び J. B. Gurdon ： "The control of gene expcess i on in animal development", Oxford University Press, 1974) も く しはゥサギ網状赤血球や小麦胚の抽出液を用 いて試験管内で夕 ンパク質を合成させる方法 1) Translate the prepared mRNA directly into protein, Investigate the physiological activity of the produced protein. In this case, the ability to introduce mRNA into oocytes of African frogs, (JB Gurdon et al .: Nature, 233, 177, 1972; and JB Gurdon: "The control of gene expcess i on in animal development ", Oxford University Press, 1974) A method of synthesizing protein in vitro using extracts of reticulocytes or wheat germ of egrets
( R. F. Schleif and P. に Wensink ： "Practical Methods in olecular Biology , Spring - Ver lag, New York, 1981 ) がよ く 用い られる。  (Wesink: "Practical Methods in olecular Biology, Spring-Verlag, New York, 1981" is used frequently by R. F. Schleif and P.)
2 ) m R N Aを铸型 と して一本鎖 c D N Aを合成 し、 次 いで二本鎖 c D N Aを合成 して適当なベク タ ーに組み込 んで大腸菌 も し く は真核細胞等の宿主に組換えベク タ ー を導入する。 ベク タ 一 と して発現べク タ 一を用いた場合、 c D N Aに コ ー ドさ れる タ ンパ ク質を導入 した宿主内で 発現させ、 目 的のタ ンパ ク質に対する抗体等を用いて 目 的の ク ロ ー ンの選別を行う こ とが出来る。 ま た、 予め調 整されたタ ンパク質の部分的なァ ミ ノ 酸配列の決定を行 いオ リ ゴ ヌ ク レオチ ドを合成 し こ れをプロ ーブと して 目 的の ク ロ ー ンを選別する こ とが出来る。  2) Synthesize single-stranded cDNA using mRNA as type II, and then synthesize double-stranded cDNA and integrate it into an appropriate vector to host Escherichia coli or eukaryotic cells. Introduce recombinant vectors into When an expression vector is used as a vector, the protein encoded in the cDNA is expressed in a host into which the protein has been introduced, and then expressed using an antibody against the target protein. The target clone can be selected. In addition, the partial amino acid sequence of a protein prepared in advance is determined, and an oligonucleotide is synthesized, and this is used as a probe to obtain a desired clone. Can be sorted out.
まず、 m R N Aを铸型 と し、 オ リ ゴ （ d T ) プラ イ マ 一 ( U. Gubler and B. J. Hoffman ： Gene, 25. 263, 1983； 及び Shneider et al. ： Nature, 311, 675, 1984) も し く は 6 塩基か らな る ラ ン ダムプラ イマーを用 いて ( H. Haymer 1 e et a 1. ： Nuc 1. Acid. Res. , 14， 8615, 1986; 及び S. Koike et al. ： Nucl. Acid. Res.， 15, 2499, 1987) 、 d A T P、 d G T P、 d C T P、 d T T Pの存在下で逆転写酵素 （ ト リ 骨髄芽球性白血病 ウ ィ ルス ； A M V由来または、 マ ウ ス白血病ウ ィ ルス ； M 0 — M L V由来） によ り m R N A と相補的な一本鎖 c D N Aを合成する。 次いで、 アルカ リ 処理を行う こ と によ って m R N Aを分解 した後、 一本鎖 c D N Aを铸型 と して逆転写酵素も し く は D N Aポ リ メ ラ ーゼによ り二 本鎖 c D N Aを合成する。 また、 二本鎖 c D N Aの合成 は、 直接 RNaseH及び大腸菌 D N Aポ リ メ ラ一ゼ I を働か せる こ とによ つて も行い得る （ U. Gubler and B. J. First, mRNA was designated as type II, and the oligo (dT) primer (U. Gubler and BJ Hoffman: Gene, 25. 263, 1983; and Shneider et al .: Nature, 311, 675, 1984) ) Or random primers consisting of 6 bases (H. Haymer 1e et a 1 .: Nuc 1. Acid. Res., 14, 8615, 1986; and S. Koike et al .: Nucl. Acid. Res., 15, 2499, 1987), reverse transcriptase (tri myeloblasts) in the presence of dATP, dGTP, dCTP, dTTP. Synthetic single-stranded cDNA complementary to mRNA is synthesized by AML virus (derived from AMV or mouse leukemia virus; derived from M0-MLV). Next, the mRNA is degraded by performing an alkali treatment, and then the single-stranded cDNA is converted into type II, and the two strands are subjected to reverse transcriptase or DNA polymerase. Synthesize strand cDNA. Alternatively, double-stranded cDNA can be synthesized by directly using RNaseH and E. coli DNA polymerase I (U. Gubler and BJ).
Hoffman ： Gene, 25， 263, 1983)。 その後、 いずれの方 法において も、 S I ヌ ク レアーゼ、 T 4 D N Aポ リ メ ラ ーゼも し く は大腸菌 D N Aポ リ メ ラ 一ゼ I ( Klenow断 片） 等の酵素のいずれかを用いる こ とによ って合成され た二本鎖 c D N Aの両末端を平滑化する。 得られた平滑 末端化された二本鎖 c D N Aは適当なベク ターに挿入す る為に、 リ ンカ一やアダプタ一等の化学合成 D N Aの付 加 ( S. Koike et al. ： Nucl. Acid. Res. , 15， 2499, 1987; T. V. Huynh et al. ： "DNA Cloning - A pract i ca 1 approach", I RL press, Oxford, 1985; G. Schere et al. ： Devel. Biol. , 86, 438, 1981； R. A. Young and R. W. Davis ： Science, 222, 778, 1983； R. A. Young and R. W. Davis ： Proc. Natl. Acad. Sc i . USA, 80， 1194, 1983： K. I takura et al. ： Science, 198, 1056, 1977; J. H. Mi Her and W. S. Peznikof f ： "The 0 p e r o n " . Cold Spring Harbor Lab. , New York, 1978； 及び D. W. Mount ： Ann. Rew. Genet. , 14, 279, 1980) も し く は d G、 d C鎖をデォキシター ミ ナル ト ラ ンスフ エ ラーゼによ って付加 し末端修飾を行う （A. Ef stratia d i s and L. Villa - Komaroff ： " I n Genetic Engineering , Plenum press, New York, 1979； 及び Chen and H. Okayama ： Mol. Cell. Biol. , 7, 2745, 1987)。 Hoffman: Gene, 25, 263, 1983). Then, in either method, use of enzymes such as SI nuclease, T4 DNA polymerase or Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment). The two ends of the double-stranded cDNA synthesized as described above are blunted. The resulting blunt-ended double-stranded cDNA was added with chemically synthesized DNA such as linker and adapter (S. Koike et al .: Nucl. Acid) to insert it into an appropriate vector. Res., 15, 2499, 1987; TV Huynh et al .: "DNA Cloning-A pract i ca 1 approach", IRL press, Oxford, 1985; G. Schere et al .: Devel. Biol., 86, 438, 1981; RA Young and RW Davis: Science, 222, 778, 1983; RA Young and RW Davis: Proc. Natl. Acad. Sc. USA, 80, 1194, 1983: K. I takura et al .: Science , 198, 1056, 1977; JH Mi Her and WS Peznikof f: "The 0 peron". Cold Spring Harbor Lab., New York, 1978; and DW Mount: Ann. Rew. Genet., 14, 279, 1980) or dG and dC chains are added by deoxy-terminal trans-transferase to perform terminal modification (A. Ef stratia dis and L. Villa-Komaroff: "In Genetic Engineering, Plenum press, New York, 1979; and Chen and H. Okayama: Mol. Cell. Biol., 7, 2745, 1987).
このよ う に して得られた二本鎖 c D N Aを組み込むた めのベク ター と して p B R 3 2 2、 p U C 1 9、 p S C 1 0 1 、 C o l E l 、 H o n j oベク ター等の E K 1 系 プラス ミ ドベク ターや ； I g t 1 0、 λ g t 1 1 、 λ g t W E S、 λ z a p等のラムダフ ァ ー ジベク ターが多用 さ れている。 これらのベク タ一に二本鎖 c D N Aを揷入す る場合、 A T Pの存在下で T 4 D N A リ ガーゼを働か せる こ とによ ってベク ター と連結するこ とが出来る。  As vectors for incorporating the double-stranded cDNA thus obtained, pBR322, pUC19, pSC101, ColEl, and Honjo vectors are used. EK1 type plasmid vectors such as IGT10, λgt11, λgtWES, λzap, etc. are frequently used. When double-stranded cDNA is introduced into these vectors, the vector can be ligated by activating T4DNA ligase in the presence of ATP.
上記の適当なベク ターに二本鎖 c D N Aを組み込んだ 後、 大腸菌 （ A G - 1 、 H B 1 0 1 、 J M 1 0 9、 D H 5、 C 6 0 0、 Y 1 0 9 0、 L E 3 9 2 株等） を形質転 換して形質転換株の D N A群 （以下、 c D N A ライ ブラ リ ー と呼ぶ） を得る こ とが出来る。  After incorporating the double-stranded cDNA into the appropriate vector as described above, E. coli (AG-1, HB101, JM109, DH5, C600, Y109, LE39) (2 strains) can be transformed to obtain a DNA group of the transformed strain (hereinafter, referred to as cDNA library).
プラス ミ ドベク タ一に二本鎖 c D N Aを組み込み宿主 大腸菌を形質転換する際、 こ の D N Aを取り込むこ との 出来る コ ン ビテン 卜細胞の対数増殖期における細胞を集 め、 Hanahan が詳細に報告 している方法、 即ち、 C a C " や M g C ^ 2 も し く は R b C を共存させる こ とに よ って、 形質転換させる こ とが可能である （D. Hanahan ： J. Mol. Biol. , 166, 557, 1983; 及び D. Hanahan' ： "DNA Cloning - A practical approach , I RL press, Oxford, 1985) 。 又、 フ ァ ー ジベク タ一に二本鎖 c D N Aを組み込み宿主大腸菌を形質転換させる場合、 T 4 D N A リ ガーゼによ って連結された D N Aを i n v i t r oパ ッ ケージン グによ り フ ァ ー ジ粒子内に導入 し、 これを宿 主大腸菌に感染させる こ とによ って実施する こ とが出来 る J. Sambrook e t a 1. ： "Molecular Cloning 一 A laboratory manual, 2nd. e t " . , Cold Spring Harbor Lab. , New York, 1989) 。 Incorporating double-stranded cDNA into plasmid vector, transforming host Escherichia coli, gathering cells in the logarithmic growth phase of competent cells that can take up this DNA, Hanahan reports in detail The way you do, ie C a C It is possible to perform transformation by coexisting with MgC ^ 2 or RbC (D. Hanahan: J. Mol. Biol., 166, 557, 1983). And D. Hanahan ': "DNA Cloning-A practical approach, IRL press, Oxford, 1985). In addition, when a double-stranded cDNA is incorporated into a phage vector to transform host E. coli, the DNA ligated by T4 DNA ligase is phaged by in vitro packaging. J. Sambrook eta 1 .: "Molecular Cloning-A laboratory manual, 2nd. Et.", Cold Spring Harbor Lab., New York, 1989).
ラ ッ ト海馬由来神経栄養べプチ ドをコ一 ドする遺伝子 を含む前駆体遺伝子を保有する大腸菌は、 次の二つの方 法の何れかを用いて形質転換後選別する こ とが可能であ る。  Escherichia coli harboring a precursor gene containing a gene encoding a rat hippocampus-derived neurotrophic peptide can be selected after transformation using one of the following two methods. You.
1 ) 配列番号 ： 1 7 のア ミ ノ 酸配列を基に塩基配列を類 推し、 こ の塩基配列を化学合成しプローブと して用いる。 ただしこ の場合、 一つのア ミ ノ 酸に対応する コ ドンが一 つとは限らないので （wobbling) 、 最も塩基配列の組み 合わせの少ない領域をォ リ ゴヌ ク レオチ ドプローブと し て用いる こ とが望ま しい。 又、 オ リ ゴヌ ク レオチ ドプロ ーブと して用いる領域は複数箇所である こ とが望ま しい。 形質転換体の選別は、 コ ロニー或いはプラ ー クハイプ リ ダイゼー シ ヨ ン法な どを用いれば良い （J. Sambrook et a 1. ： "Molecular Cloning - A laboratory manual, 2nd. e t " . , Cold Spring Harbor Lab, New York, 1989 ;1) Based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, the nucleotide sequence is inferred, and this nucleotide sequence is chemically synthesized and used as a probe. However, in this case, since the codon corresponding to one amino acid is not always one (wobbling), the region having the least combination of nucleotide sequences should be used as the oligonucleotide probe. Is desirable. In addition, it is desirable that a plurality of regions be used as an oligonucleotide probe. Transformants can be selected using the colony or plaque-hybridization method (J. Sambrook et al.). a 1.: "Molecular Cloning-A laboratory manual, 2nd. et"., Cold Spring Harbor Lab, New York, 1989;
T. V. Huynh et al. ： "DNA Cloning - A practical approach" , IRL press, Oxford, 1985； 及び Schere et al. ： Devel. Biol. , 86， 438, 1981) 。 T. V. Huynh et al .: "DNA Cloning-A practical approach", IRL press, Oxford, 1985; and Schere et al .: Devel. Biol., 86, 438, 1981).
2 ) 配列番号 ： 1 7 のア ミ ノ 酸配列に基づいて化学的に オ リ ゴペプチ ドを合成し、 ゥ シ血清アルブ ミ ン等のタ ン ノ、。ク質に合成されたオ リ ゴペプチ ドを結合させ、 得られ た複合体夕 ンパク質に対する抗体をゥサギよ り調整する。  2) SEQ ID NO: 17 Oligopeptide is chemically synthesized based on the amino acid sequence of 17, and the amino acid sequence is tanno such as serum albumin. The synthesized oligopeptide is allowed to bind to the protein, and the antibody to the resulting complex protein is prepared using a heron.
二本鎖 c D N A断片をベク ターに組み込む際に、 β — ガラ ク ト シダーゼ等の夕 ンパク質をコ一 ドする遺伝子内 に挿入 しておけば c D Ν Αにコ一 ドされる タ ンパク質力 /3 — ガラ ク ト シダーゼ等のタ ンパク質と融合された形で 発現されて く る。 それ故、 c D N Aの組み込まれた組換 え発現ベク ターを宿主大腸菌に導入 し形質転換体を得、 形質転換体内で産生される 夕 ンパク質をゥ エスタ ンブロ ッ ティ ング法等でメ ンブレ ン フ ィ ルタ一等に固定化して おけば、 抗体を用いて目的の遺伝子を有する形質転換体 を分離する こ とが可能である （T. V. Huynh et al. ： "DNA Cloning - A practical approach , IRL press, Oxford, 1985； R. A. Young and R. W. Davis ： Science, 222， 778， 1983; R. A. Young and R. W. Davis ： Proc. When a double-stranded cDNA fragment is inserted into a vector, proteins such as β-galactosidase can be inserted into the gene encoding the protein to encode the protein into cD Ν ば. Quality / 3-expressed in a form fused with proteins such as galactosidase. Therefore, the recombinant expression vector in which the cDNA is incorporated is introduced into host E. coli to obtain a transformant, and the protein produced in the transformant is subjected to membrane blotting by the ス タ stanblotting method or the like. If immobilized on a filter or the like, it is possible to isolate a transformant having the target gene using an antibody (TV Huynh et al .: "DNA Cloning-A practical approach, IRL press , Oxford, 1985; RA Young and RW Davis: Science, 222, 778, 1983; RA Young and RW Davis: Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 80， 1194， 1983; K. Itakura et al. ： Science, 198, 1056, 1977; J. H. Miller an d W. S. Peznikof f ： "The Operon" , Cold Spring Harb or Lab. , New York, 1978;及び D. W. Mount ： Ann. Rev. Genet.， 14, 279， 1980) 0 Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1194, 1983; K. Itakura et al .: Science, 198, 1056, 1977; JH Miller and WS Peznikof f: "The Operon", Cold Spring Harb or Lab., New York, 1978; and DW Mount: Ann. Rev. Genet., 14, 279, 1980) 0
目的の形質転換体の検出はメ ンブレ ン フ ィ ルターに固定 された夕 ンパク質に結合 したゥサギ抗体を検出する方法 が簡便である。 ゥサギ抗体の検出には下記のい く つの方 法を用いれば良い。 A simple method for detecting the target transformant is to detect a rabbit antibody that binds to the protein immobilized on the membrane filter.に は The following methods can be used to detect the heron antibody.
1 ) ピオチ ン化した抗ゥサギ I g抗体とタ ンパク質に結 合 したゥサギ抗体を反応させる。 次に、 ピオチ ン と高い 結合性を有するア ビジ ン又はス ト レプ ト ア ビジ ンを結合 させる。 ア ビジ ン及びス ト レプ トア ビジ ンは予めペルォ キシダ一ゼ等の酵素.を結合 しておけば、 その酵素反応よ り 目的の形質転換体を得る こ とが可能となる（J. L. Gue sden e t a 1. ： J. Histochem. Cy t ochem. , 27, 1131, 1 979;及び Bonnard e t a 1. ： "Immunolabelling for e 1 ec t ron microscopy", Elseiver Scientific Publisher s, Amsterdam, 1984) 0 1) React the piotinylated anti-Egret Ig antibody with the protein-bound Egat antibody. Next, avidin or streptavidin having a high binding property to piotin is bound. If avidin and streptavidin are preliminarily conjugated with an enzyme such as peroxidase, the desired transformant can be obtained from the enzyme reaction (JL Guesden et al.). 1.: J. Histochem. Cytochem., 27, 1131, 1 979; and Bonnard eta 1.: "Immunolabelling for e 1 ectron microscopy", Elseiver Scientific Publishers, Amsterdam, 1984) 0
2 ) I g抗体と高い結合性を有するプロテイ ン Aタ ンパ ク質と 目的のタ ンパク質に結合 したゥサギ抗体を反応さ せる。 この場合、 プロテイ ン Aを予め放射性物質で標識 しておけば、 オー ト ラ ジオグラムをとる こ とによ って目 的の形質転換体の検出が可能となる （T. V. Huyn et a 1. ： "DNA Cloning - A practical approach , I RL press, Oxford, 1985) 0 2) React protein A protein, which has high binding ability to Ig antibody, with a rabbit antibody that binds to the target protein. In this case, if protein A is labeled with a radioactive substance in advance, the target transformant can be detected by taking an autoradiogram (TV Huyn et a 1 .: " DNA Cloning-A practical approach, I RL press, Oxford, 1985) 0
3 ) ペルォキシダーゼ等の酵素を結合 した抗ゥサギ I g 抗体と タ ンパク質に結合 したゥサギ抗体を反応させれば、 その酵素反応よ り 目的の形質転換体を得る こ と可能とな る ( J. J. Leary e t a 1 - ： Pro Natl. Acad. Sc i . 3) By reacting an anti-Peagle Ig antibody conjugated with an enzyme such as peroxidase and a Pagi antibody conjugated to a protein, The enzymatic reaction makes it possible to obtain the desired transformant (JJ Leary eta 1-: Pro Natl. Acad.
USA, 80， 4045, 1983； D. M. Helfman et al. ： Pro Natl. Acad. Sci. USA, 80, 31， 1983; 及び M. S. USA, 80, 4045, 1983; D. M. Helfman et al .: Pro Natl. Acad. Sci. USA, 80, 31, 1983; and M. S.
Blake et al. ： Anal. Biochem. , 136, 176, 1984)0 Blake et al .: Anal. Biochem., 136, 176, 1984) 0
いずれの方法を用いて も 目的の形質転換体の検出は可 能であるが、 1 ) の方法が最もバッ ク グラ ウ ン ドが低 く 、 感度が高い。  Either method can be used to detect the target transformant, but method 1) has the lowest background and high sensitivity.
本発明のラ ッ ト海馬由来神経栄養べプチ ドを含むラ ッ 卜前駆体遺伝子は、 上記の如 く してク ロー ン化する こ と ができ、 配列番号 ： 3 で表されるア ミ ノ 酸配列をコー ド する遺伝子が得られる。 なお、 配列番号 ： 3 で表される ア ミ ノ 酸配列の 1 3 4 位は G l u を表示しているが、 こ の部位は L y s であって も よい。 このよ う な遺伝子と し ては、 例えば配列番号 ： 2 に示される塩基配列が挙げら れる。 得られた前駆体遺伝子に対応する タ ンパク質は、 ゥ シのフ ォ スフ ァ チジルエタ ノ ールア ミ ン結合タ ンパク 質と極めて高い相同性を示 した （ 8 4 . 4 % ) (F.  The rat precursor gene containing the rat hippocampus-derived neurotrophic peptide of the present invention can be cloned as described above, and is an amino acid represented by SEQ ID NO: 3. A gene encoding the acid sequence is obtained. In addition, the position 134 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 indicates Glu, but this site may be Lys. Such a gene includes, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. The protein corresponding to the obtained precursor gene showed extremely high homology with the phosphophosphidylethanolamine binding protein of E. coli (84.4%) (F.
Schoentgen et al. ： Eur. J. Biochem. , 166, 333, 1987) 。 なお、 ラ ッ ト海馬由来神経栄養ペプチ ドは前駆 体タ ンパク質の N末端に存在した。 ラ ッ ト海馬由来神経 栄養ペプチ ドおよびそのよ り低分子量の誘導体は、 前記 のよ う に特開平 3 — 7 2 4 9 9 号及び E P — A — 0 3 9 0 6 0 2 によ り、 すでに構造が明 らかにされている も遺 伝子については報告されていない。 本発明者らは、 上記 のよ う に前駆体遺伝子を明 らかにする こ とによ り、 ラ ッ 卜海馬由来神経栄養ペプチ ドのア ミ ノ 酸配列 （配列番 号 ： 1 7 ) をコー ドする遺伝子と して、 配列番号 ： 1 に 示される塩基配列を見出 した。 Schoentgen et al .: Eur. J. Biochem., 166, 333, 1987). The rat hippocampus-derived neurotrophic peptide was present at the N-terminus of the precursor protein. Rat hippocampus-derived neurotrophic peptides and their lower molecular weight derivatives are disclosed in JP-A-3-72499 and EP-A-0 039 602 as described above. Although the structure has already been clarified, no gene has been reported. The present inventors have described the above By clarifying the precursor gene as described above, the gene encoding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) of the rat hippocampus-derived neurotrophic peptide was identified. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was found.
こ のよ う に して得られたラ ッ ト海馬由来神経栄養ぺプ チ ドを含むラ ッ ト前駆体遺伝子 c D N Aをプローブと し てラ ッ ト遺伝子に相応する ヒ ト型の c D N A遺伝子の ク ローニン グが可能である。  Using the rat precursor gene cDNA containing rat hippocampus-derived neurotrophic peptide thus obtained as a probe, a human cDNA gene corresponding to the rat gene Cloning is possible.
ヒ ト型 c D N A遺伝子を検索するためには、 ヒ ト胎児 脳、 成人脳も し く は胎盤等の各種臓器由来の c. D N Aラ イ ブラ リ ーの何れかを作製する必要がある。 これらの ヒ ト組織を入手する事は困難であるが、 現在では、 c D N Aライブラ リ ーを購入する事が可能である。  In order to search for the human cDNA gene, it is necessary to prepare any of the c.DNA libraries derived from various organs such as a human fetal brain, an adult brain, or a placenta. Although it is difficult to obtain these human organizations, it is now possible to purchase the cdna library.
これらの c D N Aライ ブラ リ ーは殆どの場合、 λ g t 1 0、 λ g t 1 1 も し く は ； I z a p等の フ ァ ー ジべク ターに c D N Aが組込まれたフ ァ ー ジ粒子と して購入さ れる。 これらのフ ァ ー ジライブラ リ 一を適当な大腸菌 ( C 6 0 0、 Y 1 0 8 8、 Υ 1 0 9 0、 X L 1 - Β 1 υ e等） に感染させ、 大腸菌を形質転換させる事が可能で ある。 ラ ッ ト海馬由来神経栄養ペプチ ドをコー ドする遺 伝子を含む前駆体遺伝子に相応する ヒ ト型 c D N A遺伝 子を保有する大腸菌は、 ラ ッ トの前駆体遺伝子 c D N A断片を放射標識し、 これをプローブと してプラー クハ イ ブ リ ダイ ゼ一 シ ョ ン法によ って選別する方法が簡便で ある。 プローブの作製は、 ラ ッ ト前駆体遺伝子を含む c D N A断片を精製後、 ニ ッ ク ト ラ ン ス レ ー シ ョ ン法も し く はラ ンダムプラ イ ムラベ リ ン グ法を用いて 32 Pで標識 すれば良い。 In most cases, these cDNA libraries are phage particles in which the cDNA is incorporated into a phage vector such as λgt10, λgt11 or Izap. Purchased as These phage libraries can be infected with appropriate E. coli (C600, Y1088, Υ109, XL1- -1υe, etc.) to transform E. coli. It is possible. Escherichia coli, which has a human cDNA gene corresponding to a precursor gene containing a gene encoding a rat hippocampus-derived neurotrophic peptide, is radiolabeled with a rat precursor gene cDNA fragment. A simple method is to use this as a probe to select by the plaque hybridization method. Preparation of the probe involves the rat precursor gene. After purifying the DNA fragment, the DNA fragment may be labeled with 32 P using the nickel translation method or the random primer labeling method.
上記の如 く して得られた ヒ ト型 c D N A遺伝子の配列 と ラ ッ ト の前駆体 c D N A遺伝子との相同性の検討よ り ラ ッ ト に於いて神経栄養べプチ ドが存在する領域に相応 する ヒ ト型の神経栄養べプチ ド配列を決定する事が可能 となる。  Examination of the homology between the human cDNA gene sequence obtained as described above and the rat precursor cDNA gene revealed that the region where the neurotrophic peptide is present in the rat. It is possible to determine the human neurotrophic peptide sequence corresponding to the above.
本発明者等は、 上記のラ ッ ト型前駆体遺伝子よ り ヒ ト 型の前駆体遺伝子の単離 · 構造決定に成功した。 本発明 の ヒ ト型の前駆体遺伝子と しては配列番号 ： 1 4で表さ れるア ミ ノ 酸配列をコー ドする ものであ り、 このよ う な 遺伝子と しては配列番号 ： 1 3 に示される ものが挙げら れる。 また、 ラ ッ ト型前駆体遺伝子と ヒ ト型前駆体遺伝 子の相同性の検討によ り、 ヒ ト型の H C N Pは以下のァ ミ ノ 酸配列構造 （配列番号 ： 1 5 ) であ り ラ ツ ト型の H C N P とは非常に異なるぺプチ ドである こ とが推定され た。 また、 このよ う な ヒ ト型の H C N Pをコ ー ドする遺 伝子と して配列番号 ： 1 6 に示される ものが挙げられる。 H-Pro-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH [以下、 こ の ヒ ト由来の H C N Pペプチ ドを hHCNP  The present inventors have succeeded in isolating and determining the structure of a human precursor gene from the above-mentioned rat precursor gene. The human precursor gene of the present invention encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and such a gene is represented by SEQ ID NO: 1. The ones shown in 3 are listed. In addition, by examining the homology between the rat precursor gene and the human precursor gene, the human HCNP has the following amino acid sequence structure (SEQ ID NO: 15). It was estimated that the peptide was very different from rat-type HCNP. Further, a gene shown in SEQ ID NO: 16 is exemplified as a gene encoding such a human HCNP. H-Pro-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH (hereinafter referred to as HCNP peptide derived from human
(Human derived Hi ppocampal cholinergic neurotrophic peptide)と略称する場合がある。 ] (Human derived Hippocampal cholinergic neurotrophic peptide). ]
実際に こ のペプチ ドにラ ッ 卜 由来の H C N P と同様の神 経栄養作用が認められ、 本発明を完成 した。 . 本明細書において用い られる神経栄養作用 （神経栄養 因子活性と もいう ） とは、 例えば神経細胞の分化成熟を 調節する作用すなわち コ リ ン系細胞である中隔中心核の 細胞のァセチルコ リ ン合成を促進する作用等が挙げられ 。 Actually, the same neurotrophic effect as that of rat-derived HCNP was recognized in this peptide, and the present invention was completed. . The neurotrophic effect (also referred to as neurotrophic factor activity) as used herein refers to, for example, an effect of regulating the differentiation and maturation of nerve cells, that is, acetylcholine synthesis of cells of the central septum nucleus, which is a cholinergic cell. And the like.
上記の如 く して ク ロー ン化されたラ ッ 卜海馬由来も し く は ヒ ト 由来神経栄養べプチ ドを含む前駆体ポ リ べプチ ドをコー ドする遺伝子を含有する D N A断片を、 それぞ れ適当なベク ターに組み込むこ とによ り、 大腸菌ゃ枯草 菌等の原核生物を形質転換させる こ とが出来る。 目的と する遺伝子を組み込むベク タ ーは、 一般には、 宿主細胞 と適合 し得る種よ り得られた レプ リ コ ン及び調節配列を 有するプラス ミ ドベク ターが有用である。 プラス ミ ドべ ク タ一は、 通常、 複製開始部位 （ O r i ) 及び形質転換 細胞の表現型選択性を可能とする薬剤耐性遺伝子等のマ —カー遺伝子が含まれている。  A DNA fragment containing a gene encoding a precursor polypeptide, including a neurotrophic peptide derived from rat hippocampus or human, cloned as described above, Prokaryotic organisms such as Escherichia coli and Bacillus subtilis can be transformed by incorporating them into appropriate vectors. In general, as a vector incorporating the gene of interest, a plasmid vector having replicon and regulatory sequences obtained from a species compatible with the host cell is useful. Plasmid vectors usually contain a replication initiation site (Ori) and marker genes such as drug resistance genes that allow phenotypic selectivity of the transformed cells.
例えば、 E. coli K 1 2株由来の H B 1 0 1 , J M 1 0 9等の菌株は、 E. coli から得られた R因子から構築 された p B R 3 2 2 も し く はその誘導体によ って形質転 換する こ とが出来る。 p B R 3 2 2 は、 ア ン ピシ リ ン及 びテ ト ラサイ ク リ ン耐性遺伝子を有する為、 薬剤耐性能 を獲得した形質転換体を容易に検出する こ とが出来る ( F. Boliver et al. ： Gene, 2， 95, 1977)0 For example, strains such as HB101 and JM109 derived from E. coli K12 strain have been transformed into pBR322 or derivatives thereof constructed from R factor obtained from E. coli. Thus, it can be transformed. Since pBR322 has ampicillin and tetracycline resistance genes, transformants that have acquired drug resistance can be easily detected (F. Boliver et al. : Gene, 2, 95, 1977) 0
更に、 これらの組換えベク タ ーに適当なプロモーター 及び遺伝子の発現に関与する配列を挿入する こ とによ り、 細菌、 酵母及び哺乳細胞等の宿主細胞に於いて、 組換え D N A断片にコ ー ドされる前駆体ポ リ ベプチ ドを発現さ せる こ とが可能である。 Furthermore, by inserting appropriate promoters and sequences involved in gene expression into these recombinant vectors, In a host cell such as a bacterium, yeast, or a mammalian cell, it is possible to express a precursor polypeptide that is encoded by a recombinant DNA fragment.
細菌の宿主細胞に於ける遺伝子の発現に用い られるプ 口モー ター と しては、 大腸菌の — ラ ク 夕マーゼ及びラ ク ト ース遺伝子のプロモータ 一、 ト リ ブ ト フ ァ ン遺伝子 のプロ モー タ ー等 ( K. I takura et al . ： Science, 198, 1056, 1977; D. V. Goeddel et al. ： Nature, 281, 544, 1979； D. V. Goeddel et al. ： Nucl. Acid. Res. , 8， 4057, 1980; D. V. Goeddel et al. ： Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 76, 106， 1979;及び D. V. Goeddel et al. ： Nature, 287, 411, 1980)が挙げられ、 何れの遺 伝子のプロモーター も本発明のラ ッ ト海馬由来神経栄養 ぺプチ ドを含む前駆体夕 ンパク質の発現に用いる こ とが 出来得る。  The promoters used for the expression of the genes in bacterial host cells include the E. coli -lactamase and lactose gene promoters and the tributaphan gene promoter. Motor (K. I takura et al .: Science, 198, 1056, 1977; DV Goeddel et al .: Nature, 281, 544, 1979; DV Goeddel et al .: Nucl. Acid. Res., 8, 4057, 1980; DV Goeddel et al .: Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 76, 106, 1979; and DV Goeddel et al .: Nature, 287, 411, 1980). Offspring promoters can also be used to express precursor proteins containing rat hippocampus-derived neurotrophic peptides of the present invention.
原核生物以外に、 酵母の如き真核微生物を宿主細胞と して用いる こ とが可能である。 Saccharomyces  In addition to prokaryotes, eukaryotic microorganisms such as yeast can be used as host cells. Saccharomyces
cerevisiaeが最も よ く 使用される真核微生物であるが、 その他の菌株も使用可能である。 Although cerevisiae is the most commonly used eukaryotic microorganism, other strains can be used.
酵母での遺伝子発現にはプラス ミ ド Y R p 7 が最も よ く 用レ、 られている （ J. Yochem and B. Byers ： J. Mol. Biol. , 195, 233, 1987; . Karin et al. ： Proc.  Plasmid YR p7 is most often used for gene expression in yeast (J. Yochem and B. Byers: J. Mol. Biol., 195, 233, 1987; Karin et al. : Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 81， 337， 1984)。 こ のプラス ミ ドには表現型選択性を可能とする t r p 1 遺伝子が含ま れてお り、 ト リ ブ ト フ ァ ン存在下での増殖能を消失した 酵母の突然変異株 PEP4- 1等を宿主と して用いる場合形質 転換体の同定が可能となる。 Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337, 1984). This plasmid contains the trp1 gene, which allows for phenotypic selectivity, and has lost the ability to proliferate in the presence of tributphan. When a yeast mutant PEP4-1 or the like is used as a host, it is possible to identify a transformant.
酵母に於ける遺伝子発現に必要と される酵母適合性プ 口 モー タ 一 と して 3 — ホスホ グ リ セ レ 一 ト キナーゼ  3—Phosphoglycerate kinase as a yeast-compatible promoter required for gene expression in yeast
(R. A. Hi tzeman et al. ： J. Biol. C em. , 255, 2073, 1980) も し く は他の解糖系酵素の遺伝子等の数多 く の遺 伝子のプロ モー タ ー （V. M. Williamson et al. ： Mol. Cell. Biol. , 3, 20， 1983;及び M. J. Hoi land et al. ： J. Biol. Chem. , 256, 1385, 1981 ) が挙げられる。 又、 真核生物では遺伝子よ り転写された m R N Aの 3 ' 末端には、 一部の例外を除いてポ リ （ A ) 配列が付加さ れている。 こ のポ リ （ A ) 配列を付加する シグナルを有 する D N A断片 （N. J. Ptoudf oot and C. G. Brownlee ： Nature, 263, 211, 1976)を発現させる遺伝子の 3 ' 末端に挿入する こ とによ って転写を終結させる。 (RA Hitzeman et al .: J. Biol. Cem., 255, 2073, 1980) or promoters of many genes such as genes for other glycolytic enzymes (VMs). Williamson et al .: Mol. Cell. Biol., 3, 20, 1983; and MJ Hoiland et al .: J. Biol. Chem., 256, 1385, 1981). In eukaryotes, a poly (A) sequence is added to the 3 ′ end of mRNA transcribed from a gene with some exceptions. By inserting the DNA fragment (NJ Ptofoot and CG Brownlee: Nature, 263, 211, 1976) having a signal that adds the poly (A) sequence into the 3 ′ end of the gene that expresses it. Terminate transcription.
真核多細胞生物から誘導された細胞中で遺伝子を発現 させる場合、 これらの細胞は哺乳類等の脊椎動物、 昆虫 等の無脊椎動物または植物由来の細胞を宿主と して用い る こ とは何れも可能である。 しかしながら、 本発明のご と く 哺乳動物で発現される遺伝子の形質発現の目的には 脊椎動物由来の細胞を宿主と して用いる方が有利な点が 多い。 遺伝子発現に用いられる脊椎動物由来の細胞は、 動物組織よ り得られた初代培養細胞でも永代化された培 養細胞の何れを用いて も良いが、 後者の方が取り扱いも 容易であ り、 よ り好ま しい発現系 と考え られる。 現在、 種々 の遺伝子の発現実験に多用される宿主細胞 株の例と して、 ヒ トバーキ ッ ト リ ンパ腫由来の Nama 1 wa 細胞、 ア フ リ カ ミ ド リ ザル腎由来細胞の Vero紬胞及び C V - 1 細胞、 ア フ リ カ ミ ド リ ザル腎細胞由来 S V 4 0 形 質転換細胞の C O S — 1 及び C O S — 7 細胞、 チ ヤ ィニ ーズハムスター卵巣細胞由来の C H O細胞、 シ リ ア ンハ ムスター仔腎細胞の B H K細胞、 ィ ヌ腎細胞由来の M D C K ( N B L - 2 ) 細胞、 マウ ス胎児繊維芽細胞由来の N I H Z 3 T 3 及び B a 1 b Z 3 T 3 細胞並びにラ ッ ト 胎児織維芽細胞由来の 3 Y 1 細胞等が挙げられるが、 基 本的には、 遺伝子を発現させるプロモーターが宿主細胞 に適合性を示す限り用いる細胞株に限定はない。 When expressing genes in cells derived from eukaryotic multicellular organisms, these cells may be derived from vertebrates such as mammals, invertebrates such as insects, or plant-derived cells. Is also possible. However, for the purpose of the expression of genes expressed in mammals as in the present invention, it is often advantageous to use vertebrate-derived cells as hosts. The vertebrate-derived cells used for gene expression may be either primary cultured cells obtained from animal tissues or cultured cells that have been passaged, but the latter is easier to handle. It is considered a more preferable expression system. Currently, examples of host cell lines that are frequently used for expression experiments of various genes are Nama 1 wa cells derived from human kita lymphoma and Vero cells derived from kidney cells derived from African primordial kidney. And CV-1 cells, COS-1 and COS-7 cells of SV40 transformed cells derived from African monkey kidney cells, CHO cells derived from Chinese hamster ovary cells, BHK cells of murine kidney cells, MDCK (NBL-2) cells derived from canine kidney cells, NIHZ3T3 and Ba1bZ3T3 cells derived from mouse fetal fibroblasts, and rat fetal tissues Examples include 3Y1 cells derived from fibroblasts, but there is basically no limitation on the cell line used as long as the promoter that expresses the gene is compatible with the host cell.
こ の様に多種類の培養細胞株の中で遺伝子を発現させ るためのベク タ一には、 発現する遺伝子の 5 ' 上流領域 に転写のプロモータ ー、 ポ リ （ A ) 付加のシグナル配列 を含む。 又、 必要に応じて、 真核細胞で自立増殖し得る ための複製開始点や ト ラ ンスに働 く 転写活性化因子であ るェンハイザー領域が含まれる。  Thus, a vector for expressing a gene in various types of cultured cell lines requires a promoter for transcription and a signal sequence for addition of poly (A) in the 5 'upstream region of the expressed gene. Including. In addition, if necessary, a replication origin for enabling autonomous growth in eukaryotic cells and an Enhizer region which is a transcriptional activator that acts on transgenic cells are included.
哺乳動物細胞中で遺伝子を発現させる場合、 発現べク 夕一のプロモーター と して、 ウ ィ ルス由来のプロモータ 一及び遺伝子を導入する細胞に適合する或る種の染色体 由来の遺伝子のプロモーターが用い られる。 ゥ ィ ルス由 来のプロモーター と して、 サル由来ウ ィ ルスの S V 4 0 、 ヘルぺス単純ウ ィ ルス、 ポ リ オ一マウ ィ ルス、 アデノ ウ イ ノレスの ものが挙げられる。 又、 レ ト ロ ウ イ ノレス （ラ ッ ト肉腫ウ ィ ルス R S V、 マ ウ ス白血病ウ ィ ルス M L V、. マウ ス乳癌ウ ィ ルス MM T V等） 由来のプロ モー タ ーで ある繰り返 し配列 （ long terminal repeat; L T R ) も 多用 される。 When expressing a gene in mammalian cells, a promoter derived from a virus and a promoter derived from a certain chromosome compatible with the cell into which the gene is to be introduced are used as the expression vector promoter. Can be Examples of virus-derived promoters include monkey-derived viruses such as SV40, Herpes simple virus, Polio-maurus, and Adenovirus. In addition, retro-in-nores (rack Long-term repeats (LTRs), which are promoters derived from sarcoma virus RSV, mouse leukemia virus MLV, mouse breast cancer virus MM TV, etc., are also frequently used. .
近年、 レ ト ロ ウ イ ノレス由来のベク ターに目的の遺伝子 を導入 し、 ヘルパー となる レ ト ロ ウ イ ルス存在下で目的 の遺伝子を含むウ ィ ルス粒子を産生させ、 宿主細胞にゥ ィ ルス感染させる こ とによ って遺伝子を宿主染色体に取 り込ませ、 目的の遺伝子を発現させる こ と も行われてい る ( R. G. Hawley et al. ： Pro Nat 1. Acad. Sci . USA, 84, 2406, 1987)。  In recent years, a target gene has been introduced into a vector derived from retrovirus, and virus particles containing the target gene have been produced in the presence of a retrovirus serving as a helper. In addition, the gene of interest has been integrated into the host chromosome by virus infection, and the desired gene has been expressed (RG Hawley et al .: Pro Nat 1. Acad. Sci. USA, 84 , 2406, 1987).
複製のオ リ ジン と して、 S V 4 0、 ポ リ オ一マ、 アデ ノ 、 ゥ シパピローマ等のウ ィ ルス由来の外来性オ リ ジン が用いられ、 宿主細胞の染色体に組み込まれない状態で 遺伝子を一過的に発現させる 目的に用いられる。 一般に、 真核生物細胞に遺伝子を導入 した場合上記の外来性ォ リ ジ ンをベク ターに含まないものは自立複製できず、 宿主 の染色体に組み込まれて宿主染色体の複製メ カニズムの 支配を受ける よ う になる。  As the replication origin, exogenous viruses derived from viruses such as SV40, poliooma, adeno, and ゥ papilloma are used, and are not integrated into the host cell chromosome. It is used for the purpose of transiently expressing a gene. In general, when a gene is introduced into a eukaryotic cell, those that do not contain the exogenous origin described above cannot replicate autonomously and are integrated into the host chromosome and are subject to the host chromosome replication mechanism. It will be.
目的の遺伝子によ って形質転換した細胞は、 薬剤耐性 及び選択培地での増殖能等の形質転換細胞の表現型選択 性の獲得を指標に して同定すれば良い。 こ れ らのマーカ 一 となる遺伝子は目的の遺伝子の導入された発現べク タ 一中に含まれている場合と、 マー力一遺伝子のみを含む 他のベク ターに含まれている場合がある。 後者の場合、 目的の遺伝子の含まれる発現べク タ 一 と同時に宿主細胞 に導入さ れる。 Cells transformed with the gene of interest may be identified using as an index the phenotypic selectivity of the transformed cells, such as drug resistance and the ability to grow on a selective medium. Genes that serve as these markers may be contained in the expression vector into which the gene of interest has been introduced, or may be contained in other vectors containing only the marl gene. . In the latter case, It is introduced into the host cell simultaneously with the expression vector containing the target gene.
表現型選択性のマーカ ー とな る耐性遺伝子と してネオ マイ シ ン耐性遺伝子が多 く 用い られ、 ネオマイ シ ン （ ジ エ ネテ ィ シ ン ； G 4 1 8 ) に抵抗性を示す細胞が形質転 換細胞と して同定さ れる （G. Brady et al. ： The E BO J.， 4, 2583, 1985) 。 選択培地に対する表現型の選択 性は、 ヒ ポキサ ンチ ン Zグァニ ン ホスホ リ ボシル ト ラ ンス フ ェ ラ 一ゼ （ H P R T) 欠損或いはチ ミ ジ ンキナー ゼ （ T K ) 欠損突然変異培養細胞株へのマーカ ー と して H P R T (F. Lee et al. ： Nature, 294, 228, 1981； 及び Ringold et al. ： J. Mol. Applied Genet. , 1, Neomycin resistance gene is often used as a resistance gene that serves as a marker for phenotypic selectivity, and cells that show resistance to neomycin (dienetin); It is identified as a transformed cell (G. Brady et al .: The EBO J., 4, 2583, 1985). The phenotypic selectivity for the selection medium is a marker for hypoxanthine Z guanine phosphorolibosyltransferase (HPRT) deficient or thymidine kinase (TK) deficient mutant cell lines. HPRT (F. Lee et al .: Nature, 294, 228, 1981; and Ringold et al .: J. Mol. Applied Genet., 1,
165， 1981) 或いは T K遺伝子 （M. Wigler et al. ： Cell, 14， 725, 1978;及び M. Corsano and M. L. 165, 1981) or the TK gene (M. Wigler et al .: Cell, 14, 725, 1978; and M. Corsano and M.L.
Pearson ： Somat. Cell Genet. 7， 603, 1981 )の導入に よ り 行われる。 選択培地と して H A T ( ヒ ポキサ ンチ ン、 ア ミ ノ プテ リ ン ま たはァ メ ソ プテ リ ン （別名 メ ト ト レキ セー ト） 、 チ ミ ジ ンを含む） 培地を用いる。 ア ミ ノ プテ リ ンはプ リ ンゃ ピ リ ミ ジ ンの生合成を阻害するので、 こ れ らの欠損株は H A T培地で増殖できないが、 H P R T や T Kを担う 染色体が保持された場合には増殖でき る よ う になる。 ま た、 大腸菌のキサ ンチ ン ー グァニ ンホスホ リ ボシノレ ト ラ ンス フ ェ ラ 一ゼ （ E c o · g p t ) をマ ー 力 一遺伝子と して用いる こ と もでき る （G. Ringold et al. ： J. Mol. Applied Geret. , 1， 165， 1981) 。 マイ コ フ ノ 一ル酸は動物細胞の G M P合成を阻害し細胞を 死滅させる。 E c o · g p t は、 培地中のキサンチ ンよ り G M Pを合成するが、 動物細胞はキサンチ ンを利用で きないため、 E c 0 · g p t 遺伝子の導入された形質転 換体のみがマイ コ フ ノ ール酸処理後 も選択的に増殖で き る よ う になる。 Pearson: Performed by the introduction of Somat. Cell Genet. 7, 603, 1981). Use a HAT (hypoxanthine, aminopterin or amethopterin (also known as methotrexate), or thymidine) medium as the selection medium. Aminopterin inhibits the biosynthesis of princpyrimidine, so these defective strains cannot grow in HAT medium, but when the chromosome carrying HPRT or TK is retained. Will be able to multiply. In addition, E. coli xanthine-guanine phosphoribosinolate transfonase (Eco · gpt) can be used as a marker gene (G. Ringold et al .: J. Mol. Applied Geret., 1, 165, 1981). My Cofunic acid inhibits GMP synthesis in animal cells and kills the cells. Ecogpt synthesizes GMP from xanthine in the culture medium, but since animal cells cannot use xanthin, only transformants in which the Ec0gpt gene has been introduced are mycofungal. It becomes possible to grow selectively after the treatment with oleic acid.
哺乳類動物細胞への遺伝子の ト ラ ンスフ ク シ ョ ンは、 一般には、 D N A — リ ン酸カルシウム共沈澱法  Transfection of genes into mammalian cells is generally performed by DNA-calcium phosphate co-precipitation.
(M. Wigler et al. ： Cell, 14, 725, 1978; 及び F. L. Graham and A. J. van der Eb ： Virology, 52, 456, 1973) 、 及びポ リ エチ レ ン グ リ コールを用いたプロ ト プ ラ ス 卜融合法 ( . Rassoulzadegon ： Nature, 295， 257, (M. Wigler et al .: Cell, 14, 725, 1978; and FL Graham and AJ van der Eb: Virology, 52, 456, 1973), and prototyping using polyethylene glycol. Rassoulzadegon: Nature, 295, 257,
1982)等の方法が用いられる。 又、 電気パルスを用いて 電気的に遺伝子を宿主細胞に導入する方法 （H. Potter et al. ： Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 81， 7161， 198 4;及び G. Chu et al. ： Nucl. Acid. Res. 15, 1311, 1987) や、 マイ ク ロマニュ ピユ レ一夕一を用いて直接細 胞に遺伝子を物理的に導入する方法 （K. Thomas: "Trans genie Animal" , Butterworth-Heinemann, 1991) 等も使 用 し得る。 1982). Also, a method of electrically introducing a gene into a host cell using an electric pulse (H. Potter et al .: Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 81, 7161, 1984; and G. Chu et al. : Nucl. Acid. Res. 15, 1311, 1987) and a method of physically introducing genes directly into cells using Micromanu-Piure (K. Thomas: "Trans genie Animal"). , Butterworth-Heinemann, 1991) can also be used.
本発明の ヒ ト由来神経栄養ペプチ ド （ h H C N P ) は、 下記の式 （ I ) で表されるア ミ ノ 酸配列 （配列番号 ： 1 5 ) を有する ものであ り、 その誘導体と しては該ァ ミ ノ 酸配列の一部からな り、 少な く と も配列— L y s —  The human-derived neurotrophic peptide (hHCNP) of the present invention has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 15) represented by the following formula (I), and is a derivative thereof. Consists of part of the amino acid sequence and at least the sequence-Lys-
T r p -を含む神経栄養作用を有する神経栄養ペプチ ド 誘導体、 及びそれ らの N末端及び 又は C末端を修飾 し た ヒ ト 由来神経栄養べプチ ド誘導体が挙げられる。 Neurotrophic peptides with neurotrophic effects including T rp- Derivatives and N-terminal and / or C-terminal modified human-derived neurotrophic peptide derivatives.
Pro— Val— Asp—し eu— Ser—し ys— Trp— Ser— Gly— Pro—し eu ( I ) 以下、 本発明の ヒ ト 由来神経栄養ペプチ ド誘導体につ いてさ らに詳細に説明する。 本発明の ヒ 卜 由来神経栄養 ペプチ ド誘導体 と は、 式 （ I ) で表さ れる ヒ ト型の神経 栄養ペプチ ドを断片化 した も の、 あ る いは N末端の修飾 およ び Zま たは C末端の修飾 とい う 誘導化方法を単独で あ る いは組み合わせて用いる こ と によ り 、 親化合物であ る神経栄養ペプチ ドの構造を修飾ある いは変換 したぺプ チ ド性誘導体を意味する。 Pro—Val—Asp—Eu—Ser—Ey—Ser—Trp—Ser—Gly—Pro—Ey (I) Hereinafter, the human-derived neurotrophic peptide derivative of the present invention will be described in further detail. . The human-derived neurotrophic peptide derivative of the present invention is obtained by fragmenting the human-type neurotrophic peptide represented by the formula (I), or by modifying the N-terminus and Z-terminal. Or the derivatization method of C-terminal modification used alone or in combination to modify or convert the structure of the parent compound, a neurotrophic peptide. Derivative means.
さ らに詳細には、 下記の一般式 （ I ) で表される直鎖 のペプチ ド性誘導体を意味する。  More specifically, it means a linear peptide derivative represented by the following general formula (I).
X - Z - Y ( I )  X-Z-Y (I)
〔式中、 Xは水素原子ま たは N末端修飾基を表わ し、 Y は水酸基ま たは C末端修飾基を表わ し、 Zは少な く と も 配列一 L y s — T r p -を含む h H C N Pの部分ア ミ ノ 酸配列ま たは h H C N Pの全ァ ミ ノ 酸配列を表わす〕  [In the formula, X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group, and Z represents at least one sequence Lys-Trp-. Contains the partial amino acid sequence of hHCNP or the entire amino acid sequence of hHCNP.)
Xの末端修飾基 と しては、 例えばァ シル基、 スルホ二 ル基、 C , 〜（： 4 アルキル基、 ア ミ ジ ノ 基、 結合するァ ミ ノ 酸残基のァ ミ ノ 基 と共に尿素骨格あるいはウ レ タ ン 骨格を形成する残基が挙げられる。 Is a terminal modifying group X, for example, § sill group, sulfonyl Le group, C, ~ (: 4 alkyl group, A Mi di- amino group, urea with § Mi amino group of § Mi acid residue that binds Residues forming a skeleton or a urethane skeleton may be mentioned.
ァ シル基 と しては、 例えばアルカ ノ ィ ル基、 ァ ロ イ ル 基、 およ びへテロ環にカ ルボニル基が結合 した置換基等 が挙げ られ、 ア ルカ ノ ィ ル基、 ァ ロ イ ノレ基、 ヘテ ロ環は、 少な く と も 1 個の置換基で置換さ れていて も よい。 Examples of the alkoxy group include an alkanol group, an aryl group, and a substituent in which a carbonyl group is bonded to a heterocyclic ring. The inole group and the hetero ring are It may be substituted with at least one substituent.
アルカ ノ ィ ル基 と しては、 例えば C , 〜 C , 6の直鎖ま たは分枝鎖のアルカ ノ ィ ル基等が挙げ られ、 具体的には ホル ミ ル、 ァセチル、 プロパノ ィ ノレ、 ブタ ノ ィ ル、 2 — メ チルプロ ノ ノ ィ ノレ、 ペ ン タ ノ ィ ル、 3 — メ チルブ夕 ノ ィ ノレ 、 ピ ノく ロ イ ノレ 、 へキサノ ィ ノレ 、 ォ ク タ ノ ィ ル 、 デカ ノ ィ ノレ、 ラ ウ ロ イ ル、 ミ リ ス ト イ ノレ、 ノ、。ル ミ ト イ ル等力 挙げ られる。 The alkanol group includes, for example, a C, to C, 6 linear or branched alkanol group, and specific examples include formyl, acetyl, and propanol. , Butanoyl, 2-methylprononore, pentanole, 3-mechirubinonore, pinokinore, hexanoinole, oktanoyl, Decanoinole, Raouloi, Myristoinore, No. Lumi toile etc.
ァ ロ イ ル基 と しては、 例えば 1 〜 3 環式のァ ロ イ ル基 等が挙げ られ、 具体的にはべ ン ゾィ ル、 ナフ ト イ ル、 ァ ン ト リ ルカ ノレポニル、 フ エ ナ ン ト リ ノレ力 ノレボニル等力 挙 げ られる。  Examples of the aryl group include a 1 to 3 cyclic aryl group, and specific examples thereof include benzoyl, naphthyl, antrilcanoleponyl, and phenyl. Enantolino force Norebonil etc. are listed.
ヘテロ環にカ ルボニル基が結合 した置換基 と しては、 例えば飽和ま たは不飽和の 3 〜 8 員 1 環式ま たは 8 〜 1 0 員 2 環式のへテロ環にカ ルボニル基が結合 した置換基 が挙げ られる。 具体的にはフ ロ イ ル、 テ ノ ィ ル、 ニコ チ ニル、 イ ソニコチニル、 キ ノ リ ルカ ルボニル、 イ ソキノ リ ルカ ノレボニル、 ピロ リ ルカ ノレボニル、 イ ン ド リ ル力 ル ボニル、 ピペ リ ジルカ ルボニル等が挙げられる。  Examples of a substituent in which a carbonyl group is bonded to a heterocycle include a saturated or unsaturated 3- to 8-membered monocyclic or 8- to 10-membered bicyclic heterocyclic carbonyl group. And a substituent to which is bonded. Specifically, foil, tenyl, nicotinyl, isonicotinyl, quinolyl carbonyl, isokinolylka norebonyl, pyrrolyl norebonyl, indolinyl levonyl, piperi zirca Rubonyl and the like.
スルホニル基と しては、 例えばアルキルスルホニル、 ァ リ ールスルホニル等が挙げ られ、 アルキルスルホニル、 ァ リ 一ルスルホニルは少な く と も 1 個の置換基で置換さ れて も よい。  Examples of the sulfonyl group include alkylsulfonyl, arylsulfonyl and the like, and the alkylsulfonyl and arylsulfonyl may be substituted with at least one substituent.
アルキルスルホニルのアルキル と しては、 例えば C , 〜 C , 6の直鎖ま たは分枝鎖のアルキルが挙げ られる。 ァ ルキルスルホニル と しては、 具体的には メ チルスルホ二 ル、 ェチルスルホニル、 プロ ピルスルホニル、 イ ソ プロ ピルスルホニル、 ブチルスルホニル、 ペ ンチルスルホ二 ル、 イ ソペ ンチルスルホニル、 へキ シルスルホニル、 ォ ク チルスルホニル、 デシルスルホニル、 ラ ウ リ ルスルホ ニル、 ミ リ スチルスルホニル、 ノ、。ル ミ チルスルホ二ル等 が挙げ られる。 Examples of the alkyl of the alkylsulfonyl include a C, to C, 6 linear or branched alkyl. A Specific examples of the alkylsulfonyl include methylsulfonyl, ethylsulfonyl, propylsulfonyl, isopropylsulfonyl, butylsulfonyl, pentylsulfonyl, isopentylsulfonyl, hexylsulfonyl, Octylsulfonyl, decylsulfonyl, raurilsulfonyl, myristylsulfonyl, no. Lumitylsulfonyl and the like.
ァ リ ールスルホニルのァ リ ール と しては、 例えば 1 〜 3 環式のァ リ ールが挙げ られる。 ァ リ 一ルスルホニル と しては、 具体的には フ エニルスルホニル、 ナフチルスル ホニル、 ア ン ト リ ノレスルホニル、 フ エ ナ ン ト リ ルスルホ ニル等が挙げ られる。  As aryls of arylsulfonyl, for example, one to three-cyclic aryls can be mentioned. Specific examples of arylsulfonyl include phenylsulfonyl, naphthylsulfonyl, anthrinolesulfonyl, and phenanthrylsulfonyl.
結合するァ ミ ノ 酸残基のァ ミ ノ 基と共に尿素骨格を形 成する残基 と しては、 例えば力 ルバモ イ ル、 1 ま たは 2 個のアルキルま たはァ リ ールで置換さ れた力 ルバモ イ ル 等が挙げ られ、 さ らに詳 し く は、 例えば力 ルバモ イ ル、 1 ま たは 2 個の 〜（： 4 アルキルま たは 1 〜 3 環式の ァ リ ールで置換された力 ルバモイ ル等が挙げ られ、 ァ リ ールは、 少な く と も 1 個の置換基で置換されていて も よ い。 具体的には、 例えば力 ルバモ イ ル、 N — メ チルカ ル ノ モイ ル、 N， N — ジ メ チルカ ルバモイ ル、 N —ェチル カ ルノく モ イ ル、 N — プロ ピルカ ルノく モ イ ル、 N — イ ソ プ 口 ピルカ ルノく モ イ ル、 N — ブチルカ ル ノく モ イ ル、 N —ェ チルー N — ブチル力 ノレノくモィ ゾレ、 N — フ エ二ノレ力 ノレノく モ ィ ル、 N — ナフ チルカ ル ノくモイ ノレ、 N — ア ン ト -リ ル力 ノレ ノくモ イ ル、 N — ナ フ チ ル 一 N — メ チ ル カ ノレノくモ イ ノレ、 N 一 フ エ ナ ン 卜 リ ノレ カ ノレノくモ イ ノレ、 N — フ エ ニ ノレ ー N — ェ チル力 ルバモ イ ル等が挙げ られる。 The residue forming the urea skeleton together with the amino group of the amino acid residue to be bound is, for example, substituted with one or two alkyls or aryls. And more specific examples include, for example, force lubamoyl, 1 or 2 ~ (: 4 alkyl or 1-3 cyclic aryries) And aryl may be substituted with at least one substituent, specifically, for example, olevamoyl, N — Nil, N-N-Nil-Nil, N-Etilka, L-Moir, N-Propirka, L-Moir, N-Isop N—Butyl Carol M, N—Ethyl N—Butyl Power Mole, N—Fenino力 力 N N N N N N N N N N N N ナモ —, — N N モ モ — — — — モ モ — — — — — — — — — — — — Etch force Lubamoyl and the like.
結合する ア ミ ノ 酸残基のア ミ ノ 基 と共にウ レ タ ン骨格 を形成する残基 と しては、 例えばアルキルォキ シカ ルボ ニル、 ァ リ ールォキ シカ ルボニル等が挙げ られ、 アルキ ルま たはァ リ ールは、 少な く と も 1 個の置換基で置換さ れていて も よい。  Examples of the residue that forms a urethane skeleton together with the amino group of the amino acid residue to be bound include alkyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl, etc., and include alkyl or alkyloxycarbonyl. The aryl may be substituted with at least one substituent.
アルキルォキ シカ ルボニルのアルキル と しては、 例え ば C , 〜 C , 6の直鎖ま たは分枝鎖のアルキルが挙げ られ る。 ア ルキルォキ シカ ルボニル と しては、 具体的には メ ト キシカ ルボニル、 エ ト キシカ ルボニル、 プロ ボキシカ ルボニル、 イ ソ プロ ポキ シカ ルボニル、 ブ ト キ シカ ルボ ニル、 ペ ンチルォキ シカ ルボニル、 イ ソペンチルォキ シ カ ルボニル、 へキ シルォキ シカ ルボニル、 ォ ク チルォキ シカ ルボニル、 デシルォキ シカ ルボニル、 ラ ウ リ ルォキ シカ ルボニル、 ミ リ スチルォキ シカ ルボニル、 パル ミ チ ルォキシカ ルボニル等が挙げ られる。 The alkyl of the alkyloxycarbonyl includes, for example, a C, to C, 6 linear or branched alkyl. Alkyloxycarbonyl is, specifically, methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, propoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, butoxycarbonyl, pentyloxycarbonyl, isopentyloxycarbonyl. Examples include ruvonil, hexyloxy carbonyl, octyloxy carbonyl, decyloxy carbonyl, rauri luxica carbonyl, myristyl oxycarbonyl, palmitoxy carbonyl and the like.
ァ リ ールォキシカ ルボ二ルのァ リ ール と しては、 例え ば 1 〜 3 環式のァ リ ールが挙げ られる。 ァ リ ールォキシ カ ルボニル と しては、 具体的にはフ エ ニルォキ シカ ルボ ニル、 ナ フ チルォキ シカ ルボニル、 ア ン ト リ ルォキ シ力 ルポニル、 フ ヱ ナ ン ト リ ルォキシカ ルボ二ル等が挙げ ら れる。  Examples of aryloxycarbonyl aryls include, for example, one- to three-cyclic aryls. Specific examples of aryloxycarbonyl include phenyloxycarbonyl, naphthyloxycarbonyl, antennary carbonyl, phenyloxycarbonyl, and the like. It is.
アルカ ノ ィ ル基、 ァ ロ イ ル基、 ヘテ ロ環、 アルキルス ルホニル基、 ァ リ ールスルホニル基、 N—ァ リ ールカ ル バモイ ル基、 アルキルォキ シカ ルボニル基ま たはァ リ 一 ルォキ シカ ルボニル基の置換基 と しては、 例えば C , 〜 C 8 アルキル、 ァ ミ ノ 、 C , 〜 C 4 アルキルァ ミ ノ 、 ジ C 1 〜 C 4 アルキルァ ミ ノ 、 ア ミ ノ C 】 〜 C 8 アルキル、 C 1 〜（： 4 アルキルア ミ ノ じ , 〜 C 8 アルキル、 ジ 〇 , 〜（： 4 アルキルア ミ ノ C , 〜 C 8 アルキル、 グァニジノ 、 C 1 〜 C 4 アルキルグァニジ ノ 、 ジ C , 〜 C 4 アルキル グァニジ ノ 、 グァニジ ノ C , 〜（： 8 アルキル、 C , 〜 C 4 アルキルグァニジ ノ C , 〜 C 8 アルキル、 ジ C , 〜 C 4 アルキルグァニジ ノ C , 〜 C 8 アルキル、 ヒ ドロキ シル、 ヒ ドロ キ シル C ！ 〜 C 8 アルキル、 C i 〜（： 4 ァ ルコキ シ、 ハロ ゲ ン原子、 カ ノレボキ シル、 力 ノレボキシルAlkanoyl group, aryl group, hetero ring, alkyls Examples of the substituent for the rufonyyl group, arylsulfonyl group, N-arylcarbamoyl group, alkyloxycarbonyl group or aryloxycarbonyl group include C, -C8 alkyl and amino. Roh, C, ~ C 4 Arukirua Mi Roh, di-C 1 ~ C 4 Arukirua Mi Roh, A Mi Roh C] ~ C 8 alkyl, C 1 ~ (: Ji 4 alkylamine Mi Bruno, ~ C 8 alkyl, di 〇, ~ (: 4 alkylamine Mi Bruno C, - C 8 alkyl, Guanijino, C 1 - C 4 Arukiruguaniji Bruno, di C, ~ C 4 alkyl Guaniji Bruno, Guaniji Bruno C, ~ (: 8 alkyl, C, - C 4 Arukiruguaniji ! Bruno C, ~ C 8 alkyl, di-C, ~ C 4 Arukiruguaniji Bruno C, ~ C 8 alkyl, human Doroki sill, human mud key sill C ~ C 8 alkyl, C i ~ (: 4 § Rukoki death, halo gain Atom, cane box Norevoxil
C ！ 〜 C 8 アルキル、 ニ ト ロ、 ヘテロ環、 ァ リ ール、 了 リ ーノレ C 】 〜 C 4 アルキル、 少な く と も 1 個のハロ ゲ ン 原子で置換された C , 〜（： 4 アルキル、 C! C 8 alkyl, nitro, heterocycle, aryl, aryl C] to C 4 alkyl, C, to (: 4 alkyl, substituted by at least one halogen atom
- C 0 N R 4 R 5 〔 R 4 およ び R 5 は、 各々 独立に水素 原子ま たは C ! C アルキルを表す。 〕 、 -C 0 NR 4 R 5 [R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or C! C alkyl. ]
- N + ( R 19) 3 、 A— 〔尺 1 9は （： 1 〜（： 4 ァルキルを 表 し、 A— は負イ オ ンを表す。 〕 、 A― 、 - N + (R 19) 3 , A- [scale 1 9 (:. 1 - (- 4 display the Arukiru, A- represents a blowing on-], A-,
( R 1 9 ) 3 N + - C ！ 〜 C 8 アルキル ！： R 1 9およ び A— は、 前記と同義である。 〕 等が挙げ られる。 (R 1 9) 3 N + - C! ~ C 8 alkyl! : R 19 and A— are as defined above. And the like.
N末端修飾基について、 さ らに具体的に代表的な も の を例示する と以下の ものが挙げ られる。 R 1 As the N-terminal modifying group, more specific representative ones are exemplified as follows. R 1
I  I
R 2 一 C 一 C 〇 一 R 2 1 C 1 C C 1
I  I
R 3 R 3
〔式中、 R 1 は水素原子、 無置換または置換したアルキ ル、 ヒ ドロキシル、 カルボキシル、 無置換または置換し たァ リ ール、 C ！ 〜（： 4 アルコキ ン、 ハロ ゲ ン原子、 - C 0 N R 4 R 5 ( R 4 および R 5 は、 前記と同義であ る。 ） または無置換または置換したヘテロ環を表し、 R 2 は水素原子、 無置換または置換したアルキル、 また はハロ ゲ ン原子を表 し、 R 3 は水素原子、 C , 〜 C 4 ァ ルキル、 またはハロゲン原子を表す。 〕 または、 [In the formula, R 1 is a hydrogen atom, unsubstituted or substituted alkyl, hydroxyl, carboxyl, unsubstituted or substituted aryl, C! ~ (:. 4 alkoxy down, halo gain down atoms, - C 0 NR 4 R 5 (R 4 and R 5 represent the and Ru synonymous der) or unsubstituted or substituted heterocycle, R 2 is hydrogen atom, an unsubstituted or substituted alkyl, or by table halo gain down atoms, R 3 represents a hydrogen atom, C, ~ C 4 § alkyl or halogen atom.] or,
R 6 - N - C 0 -R 6 -N-C 0-
I I
R 7 R 7
〔式中、 R 6 は水素原子、 〜 C 4 アルキル、 または 無置換または置換したァ リ ールを表し、 R 7 は水素原子、 または C 〜 C 4 アルキルを,表す。 〕 または、 R 8 — 0 - C O - 〔式中、 R 8 は無置換または置換したアルキル、 または無置換または置換したァ リ ールを表す。 〕 または、 R 9 - C O - 〔式中、 R 3 は水素原子、 無置換または 置換したァ リ ール、 または無置換または置換したヘテロ 環を表す。 〕 または、 [In the formula, R 6 represents a hydrogen atom, -C 4 alkyl, or an unsubstituted or substituted aryl, and R 7 represents a hydrogen atom, or C -C 4 alkyl. Or R 8 —0-CO— wherein R 8 represents unsubstituted or substituted alkyl, or unsubstituted or substituted aryl. Or R 9 -CO-[wherein, R 3 represents a hydrogen atom, an unsubstituted or substituted aryl, or an unsubstituted or substituted heterocyclic ring. Or
R 10 - S 02 - 〔式中、 R l flは無置換または置換した アルキル、 または無置換または置換したァ リ ールを表す。 〕 ま たは、 R 10 -S 02-[wherein, Rl fl represents unsubstituted or substituted alkyl, or unsubstituted or substituted aryl. Or
R 1 ] - 〔式中、 R ' 1は C , 〜 C 4 アルキルを表す。 〕 または、 R 1] -[wherein, R ′ 1 represents C 1 , to C 4 alkyl. ] Or
( R 12) 2 N - 〔式中、 R 12は C , 〜（： 4 アルキルを 表す。 但し、 R 12が結合 している窒素原子は N末端ア ミ ノ 基を表す。 〕 または、 (R 12 ) 2 N-[wherein, R 12 represents C, to (: 4 alkyl, provided that the nitrogen atom to which R 12 is bonded represents an N-terminal amino group.] Or
A― 、 （ R 13) 3 N+ — 〔式中、 A— は前記と同義で あ り、 R 13は 〜 C 4 アルキルを表す。 但し、 R 13が 結合 している窒素原子は N末端ア ミ ノ 基を表す。 〕 また は、 A—, (R 13 ) 3 N + — wherein A— has the same meaning as described above, and R 13 represents —C 4 alkyl. However, the nitrogen atom to which R 13 is bonded represents an N-terminal amino group. Or
ァ ミ ジノ 基等が挙げられる。  And an amidino group.
Yの C末端修飾基と しては、 例えば結合するア ミ ノ酸 残基のカルボキシル基が、 エステル骨格あるいはア ミ ド 骨格を形成する残基等が挙げられる。 C末端修飾基につ いて、 さ らに具体的に代表的な ものを例示する と以下の ものが挙げられる。 - N - R 14 Examples of the C-terminal modifying group of Y include a residue in which a carboxyl group of an amino acid residue to be bound forms an ester skeleton or an amide skeleton. As the C-terminal modifying group, the following can be mentioned as specific examples. -N-R 14
I  I
R 15 R 15
〔式中、 R 14は水素原子、 無置換または置換したア ルキ ル、 無置換または置換したシク ロアルキル、 架橋環式炭 化水素基、 ヒ ドロキシル、 無置換または置換したァ リ ー ル、 または無置換または置換したヘテロ環を表し、 R 15 は水素原子、 または無置換または置換したアルキルを表 す。 〕 または、 (In the formula, R 14 is a hydrogen atom, unsubstituted or substituted alkyl, unsubstituted or substituted cycloalkyl, bridged cyclic hydrocarbon group, hydroxyl, unsubstituted or substituted aryl, or unsubstituted aryl. R 15 represents a hydrogen atom or an unsubstituted or substituted alkyl; Or
- 0 - R 1 6 〔式中、 R 16は水素原子、 無置換または置 換したアルキル、 無置換または置換したァ リ ール、 また は無置換または置換 したヘテロ環を表す。 〕 または、 一 N— R 17 - 0 - R 1 6 wherein, R 16 represents a hydrogen atom, an unsubstituted or replacement alkyl, unsubstituted or substituted § Li Lumpur, or unsubstituted or substituted heterocycle. Or One N—R 17
I  I
R 1 8 R 1 8
〔式中、 R 17およ び R 1 8は窒素原子 と共に無置換ま たは 置換 した含窒素へテロ環を表す。 〕 な どが挙げ られる。 Wherein, R 17 and R 1 8 was unsubstituted or together with the nitrogen atom represent a nitrogen-containing heterocycle substituted. ] And so on.
本発明においてアルキル と は、 C , 〜 C , 8の直鎖ま た は分枝鎖のアルキルを表 し、 例えば メ チル、 ェチル、 プ 口 ピル、 イ ソ プロ ピル、 プチル、 ペ ンチル、 イ ソペ ンチ ル、 へキ シル、 ォ ク チル、 デシル、 ラ ウ リ ノレ、 ミ リ スチ ル、 パル ミ チル等が挙げ られる。 置換 したアルキル と は、 ァ ミ ノ 、 C ! 〜 C 4 アルキルァ ミ ノ 、 ジ じ , 〜 C 4 アル キルァ ミ ノ 、 ヒ ドロキ シル、 カ ノレボキ シル、 グァニジノ 、 C 1 〜 C 4 アルキルグァニジ ノ 、 ジ C , 〜（： 4 アルキル グァニジ ノ 、 ァ リ ール、 じ , 〜 C 4 アル コ キ シ、 ノヽロ ゲ ン原子、 — N + ( R 1 9) 3 A - 〔 R 1 9およ び A— は、 前記 と同義である。 〕 、 一 C 〇 N R 4 R 5 〔 R 4 およ び R 5 は、 前記と同義であ る。 〕 およ びへテロ環か らなる 群よ り選択される基で置換されたアルキルを表す。 In the present invention, alkyl refers to a C, to C, 8 linear or branched alkyl, and includes, for example, methyl, ethyl, propyl pill, isopropyl, butyl, pentyl, and isopropyl. Examples include pentyl, hexyl, octyl, decyl, laurenole, myristyl, and palmityl. The substituted alkyl, § Mi Roh, C! ~ C 4 Arukirua Mi Roh, Ji di, ~ C 4 Al Kirua Mi Roh, human Doroki sills, mosquito Noreboki sill, Guanijino, C 1 ~ C 4 Arukiruguaniji Roh, di-C , ~ (: 4 alkylguanidino, aryl,,, ~ C 4 alkoxy, nitrogen atom, — N + (R 19 ) 3 A-[R 19 and A— Has the same meaning as defined above.], And C 1 NR 4 R 5 [R 4 and R 5 have the same meanings as defined above.] And a heterocyclic ring Represents an alkyl substituted with a group.
本発明において シ ク ロ アルキル と は、 C 3 〜（： 8 の シ ク ロアルキルを表 し、 例えばシ ク ロ プロ ピル、 シ ク ロ ブ チノレ、 シ ク ロペ ンチノレ、 シ ク ロへキシル、 シ ク ロへプチ ル、 シ ク ロ ォ ク チル等が挙げ られる。 置換 した シ ク ロ ア ルキル と は、 アルキル、 ァ ミ ノ 、 C , 〜 C 4 アルキルァ ミ ノ 、 ジ C ！ 〜 C 4 アルキルァ ミ ノ 、 ヒ ドロ キシル、 力 ルボキ シル、 グァニジ ノ 、 C , 〜（： 4 アルキルグァニジ ノ 、 ジ C i 〜 C 4 アルキル グァニ ジ ノ 、 ァ リ ール、 C 】 〜 C 4 アルコキシ、 ノヽロ ゲ ン原子、 一 N + ( R 1 9) 3 、 A— 〔 R 1 9およ び A— は、 前記 と同義であ る。 〕 、 _ C 0 N R 4 R 5 〔 R 4 およ び R 5 は、 前記と同義である。 〕 およ びへテ ロ環か らな る群よ り選択される基で置換さ れ た シ ク ロ アルキルを表す。 The sheet click b alkyl in the present invention, C 3 ~ (: Represents the sheet click Roarukiru of 8, for example, click b propyl, shea click b Bed Chinore, shea click Rope Nchinore, hexyl shea click furnace and click Petit to b Le, shea click b O click chill and the like. substituted with the sheet click b a alkyl, alkyl, § Mi Roh, C, ~ C 4 Arukirua Mi Bruno, di C! ~ C 4 Arukirua Mi Bruno , human mud hexyl, force Ruboki sill, Guaniji Roh, C, ~ (: 4 Arukiruguaniji Roh, di-C i ~ C 4 alkyl Guani di Bruno, § Li Lumpur, C] To C 4 alkoxy, a nitrogen atom, one N + (R 19 ) 3 , A— [R 19 and A— are as defined above. ], _ C 0 NR 4 R 5 [R 4 and R 5 have the same meanings as described above. And cycloalkyl substituted with a group selected from the group consisting of heterocycles.
本発明において架橋環式炭化水素基 とは、 2 環式ま た は 3 環式の C 7 〜 C , 4の飽和炭化水素基を表 し、 例えば ァ ダマ ンチル、 ビシ ク ロ 〔 3 . 2 . .0 〕 ヘプチル、 ビシ ク ロ 〔 4 . 4 . 0 〕 デシル等が挙げられる。 The crosslinked cyclic hydrocarbon group in the present invention, was bicyclic or to display the tricyclic C 7 ~ C, 4 saturated hydrocarbon group, for example, § lumps pentyl, bicyclo click b [3. 2. .0] heptyl and bicyclo [4.4.0] decyl.
本発明において C , 〜 C 4 アルコ キシ とは、 C , 〜 In the present invention, C, to C 4 alkoxy refers to C, to
C 4 の直鎖ま たは分技鎖のアルコ キ シを表 し、 例えばメ ト キ シ、 エ ト キ シ、 プロ ボキ シ、 イ ソ プロ ボキシ、 ブ ト キ シ等が挙げ られる。 Represents a C 4 linear or branched chain alkoxy, for example, methoxy, ethoxy, proboxy, isopropoxy, butoxy, and the like.
本発明においてハロ ゲ ン原子と は、 フ ッ素、 塩素、 臭 素ま たはヨ ウ素を表す。  In the present invention, the halogen atom represents fluorine, chlorine, bromine or iodine.
本発明においてァ リ ール とは、 1 〜 3 環式のァ リ ール を表 し、 例えばフ エニル、 ナフチル、 ア ン ト リ ル、 フ エ ナ ン ト リ ル等があげ られる。 置換 したァ リ ール とは、 In the present invention, the aryl means a one- to three-cyclic aryl, and examples thereof include phenyl, naphthyl, anthryl, and phenanthryl. The replaced aryl is
C , 〜 C 8 アルキル、 ァ ミ ノ 、 〜 C 4 アルキルア ミ ノ 、 ジ 〇 , 〜 C 4 アルキルァ ミ ノ 、 ア ミ ノ じ , 〜 C 8 ァ ルキル、 C , 〜（： 4 アルキルア ミ ノ C , 〜 C 8 アルキル、 ジ C , 〜（： 4 アルキルア ミ ノ C , 〜 C 8 アルキル、 グァ 二ジ ノ 、 C , 〜 C 4 アルキルグァニジノ 、 ジ C , 〜（： 4 アルキル グァニジ ノ 、 グァニジ ノ C , 〜 C 8 アルキル、 C 1 〜（： 4 アルキル グァニジ ノ C , 〜 C 8 アルキル、 ジ C 】 〜（： 4 アルキルグァニジ ノ C I 〜 C 8 ア ルキル、 ヒ ドロ キ シル、 ヒ ドロ キ シノレ C ！ 〜 C 8 アルキル、 C ： 〜 C 4 ァノレ コキ シ、 ノヽロ ゲ ン原子、 カ ノレボキ シル、 カ ルボ キ シル C , 〜 C 8 アルキル、 ニ ト ロ、 少な く と も 1 個の ハロ ゲ ン原子で置換さ れた C ^ 〜 C 4 アルキル、 C, ~ C 8 alkyl, § Mi Roh, ~ C 4 alkylamine Mi Roh, di 〇, ~ C 4 Arukirua Mi Roh, Ji A Mi Bruno, ~ C 8 § alkyl, C, ~ (: 4 alkylamine Mi Roh C, ~ C 8 alkyl, di-C, ~ (: 4 alkylamine Mi Bruno C, ~ C 8 alkyl, Guadalmedina rainbow Roh, C, ~ C 4 alkyl Guadalmedina Niji Roh, di-C, ~ (: 4 alkyl Guaniji Roh, Guaniji Roh C, ~ C 8 alkyl, C 1 ~ (: 4 alkyl Guaniji Bruno C, ~ C 8 alkyl, di C] - (:! 4 Arukiruguaniji Roh CI ~ C 8 A alkyl, human mud key sill, human mud key Shinore C ~ C 8 alkyl, C: - C 4 Anore Jobs death, Nono Russia gain down atom, mosquito Noreboki sill, Ca Rubo key sills C, ~ C 8 alkyl, two collected by filtration, substituted in one halo gain down atoms least for the C ^ ~ C 4 alkyl,
- C 0 N R R 5 C R 4 およ び R 5 は、 前記と同義であ る。 〕 の群よ り独立 して選択される少な く と も 1 個の基 で置換されたァ リ ールを表す。 -C 0 NRR 5 CR 4 and R 5 are as defined above. Represents an aryl substituted with at least one group independently selected from the group of
本発明においてへテロ環 と は、 飽和へテロ環ま たは不 飽和へテロ環を表す。 飽和へテロ環と は、 窒素原子、 硫 黄原子およ び酸素原子よ り 選ばれた原子を少な く と も 1 個含む飽和な 3 〜 8 員 1 環式基ま たは 8 〜 1 0 員 2 環式 基を表す。 こ のよ う な飽和へテロ環基の例 と しては、 例 えば ピロ リ ジニル、 ピぺ リ ジル、 ピペ リ ジ ノ 、 ホモ ピぺ リ ジル、 ヘプタ メ チ レ ンイ ミ ニル、 ピペラ ジニル、 ホモ ピペラ ジニル、 モルホ リ ニル、 モルホ リ ノ 、 チオラニル、 チオモルホ リ ニル、 硫黄原子が酸化さ れたチォモルホ リ ニル、 テ ト ラ ヒ ドロ フ リ ル等が挙げ られる。 置換 した飽 和へテロ環 と は、 ヒ ドロ キシル、 ヒ ドロ キシル C ！ 〜 C 4 アルキル、 カ ルボキ シル、 カ ルボキシル C i 〜 C 8 アルキル、 ァ リ ーノレ、 ァ リ 一ノレ C , 〜 C 4 アルキル、In the present invention, the term “heterocycle” means a saturated heterocycle or an unsaturated heterocycle. A saturated heterocyclic ring is a saturated 3- to 8-membered monocyclic or 8- to 10-membered group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom. Represents a cyclic group. Examples of such saturated heterocyclic groups include, for example, pyrrolidinyl, piperidyl, piperidino, homopyridyl, heptamethyleniminyl, piperazinyl, Examples include homopiperazinyl, morpholinyl, morpholino, thiolanyl, thiomorpholinyl, thiomorpholinyl in which a sulfur atom has been oxidized, and tetrahydrofuryl. Substituted saturated heterocycle is hydroxyl, hydroxyl C! ~ C 4 alkyl, mosquitoes Ruboki sills, mosquito carboxyl C i ~ C 8 alkyl, § Re Nore, § Li one Honoré C, ~ C 4 alkyl,
C 1 〜 C 4 アルキル、 ァ ミ ノ 、 〜 C 4 ア ルキルア ミ ノ 、 ジ C 】 〜 C 4 アルキルァ ミ ノ 、 ァ ミ ノ C に 〜 C 8 ァ ルキル、 C i 〜（： 4 アルキルア ミ ノ C , 〜 C 8 アルキル、 ジ C , 〜 C 4 ァノレキルア ミ ノ C , 〜 C 8 ア ルキル、 グァ 二 ジ ノ 、 C , 〜 C 4 ア ルキル グァ ニ ジ ノ 、 ジ C , 〜 C 4 ア ルキル グァ ニ ジ ノ 、 グァニ ジ ノ C I 〜 C 8 ア ルキル、 C ！ 〜 C 4 ア ルキル グァニ ジ ノ C , 〜 （： 8 ア ルキル、 ジ C , 〜 C 4 ア ルキル グァニ ジ ノ C , 〜 C 8 ア ルキ ル、 — N + ( R 1 9 ) 3 、 A— 〔 R ' 9および A は、 前記と同 義である。 〕 、 A— 、 ( R 1 9 ) 3 N + - C , 〜 C 8 アル キル 〔 R 1 9および A は、 前記と同義である。 〕 の群よ り独立して選択される少な く と も 1 個の基で置換された 飽和へテ口環を表す。 C 1 ~ C 4 alkyl, § Mi Roh, ~ C 4 A Rukirua Mi Roh, di-C] ~ C 4 Arukirua Mi Roh, § Mi Roh C to ~ C 8 § alkyl, C i ~ (: 4 alkylamine Mi Roh C , ~ C 8 alkyl, di-C, ~ C 4 Anorekirua Mi Bruno C, ~ C 8 A alkyl, Guadalmedina Two di Bruno, C, ~ C 4 A alkyl Guadalmedina two di Bruno, di-C, ~ C 4 A alkyl Guadalmedina two di Bruno, Guani di Bruno CI ~ C 8 A alkyl, C! ~ C 4 A alkyl Guani di Bruno C, ~ (: 8 A alkyl, di-C, ~ C 4 A alkyl Guani di Bruno C, ~ C 8 A Ruki le, - N + (R 1 9 ) 3, A- [ R '9 and a are the a is synonymous], A-, (R 1 9) 3 N + -. C, ~ C 8 aralkyl kill [R 1 9 and a has the same meaning as defined above]. Represents a saturated heterocyclic ring substituted by at least one group independently selected from the group
本発明において不飽和へテロ環とは、 窒素原子、 硫黄 原子および酸素原子よ り選ばれた原子を少な く と も 1 個 含む飽和な 5 〜 8 員 1 環式基または 8 〜 1 0 員 2 環式基 を表す。 このよ う な不飽和へテロ環基の例と しては、 ピ ロイ ル、 ピ リ ジル、 ピラ ジニル、 イ ミ ダゾィ ル、 ビラ ゾ ィ ノレ、 フ リ ノレ、 ォキサゾ リ ル、 チェニル、 チアゾ リ ノレ、 イ ン ド リ ル、 キノ リ ル、 イ ソキノ リ ル等が挙げられる。 置換された不飽和へテ ロ 環 と は、 ト リ フ ルォ ロ メ チ ル、 C 1 〜 C 4 ア ルキル、 C , 〜 C 4 ァ ノレ コ キ シ、 ノヽロ ゲ ン 原子等からなる群よ り選択される基で置換された不飽和 へテ口環を表す。 In the present invention, the term "unsaturated heterocyclic ring" refers to a saturated 5- to 8-membered cyclic group containing at least one atom selected from a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom or an 8- to 10-membered ring. Represents a cyclic group. Examples of such unsaturated heterocyclic groups include pyrrole, pyridyl, pyrazinyl, imidazole, virazolinole, furinole, oxazolyl, chenyl, and thiazolyl. Nore, indril, quinolyl, and isoquinolyl. A substituted unsaturated heterocyclic ring is a group consisting of trifluoromethyl, C 1 to C 4 alkyl, C, to C 4 phenol, nitrogen atom, and the like. Represents an unsaturated heterocyclic ring substituted with a selected group.
本発明において含窒素へテロ環とは、 少な く と も 1 個 の窒素原子を含む飽和へテロ環または不飽和へテロ環を 表す。 この様な含窒素へテロ環基の例と しては、 ピロ リ ジニル、 ピペ リ ジ ノ 、 ホモ ピペ リ ジ ノ 、 ヘプタ メ チ レ ン イ ミ ニル、 ピペ ラ ジニル、 ホモ ピペ ラ ジニル、 イ ソ イ ン ド リ ノ 、 モ ルホ リ ノ 、 チォモルホ リ ノ 、 硫黄原子が酸化 さ れたチオモルホ リ ノ 等が挙げ られる。 置換 した含窒素 ヘテ ロ環 と は、 少な く と も 1 個の窒素原子を含む置換 し た飽和へテ ロ環ま たは不飽和へテロ環を表す。 In the present invention, the term "nitrogen-containing hetero ring" means a saturated hetero ring or an unsaturated hetero ring containing at least one nitrogen atom. Examples of such nitrogen-containing heterocyclic groups include pyrrolidinyl, piperidino, homopiperidino, heptamethyleniminyl, piperazinyl, homopiperazinyl, i Soin Dolino, morpholino, thiomorpholino, thiomorpholino in which a sulfur atom is oxidized, and the like can be given. A substituted nitrogen-containing heterocyclic ring refers to a substituted saturated heterocyclic ring or unsaturated heterocyclic ring containing at least one nitrogen atom.
ヘテ ロ環に窒素原子あ る いは硫黄原子が存在する場合、 酸化さ れて も よい。 ヘテロ環に窒素原子が存在する場合、 四級化さ れて も よ い。  When a nitrogen atom or a sulfur atom is present in the hetero ring, it may be oxidized. When a nitrogen atom is present in the hetero ring, it may be quaternized.
本発明において前記の式中 A— で表される負イ オ ン と しては、 無機負イ オ ン ま たは有機負イ オ ンが挙げ られる。 無機負イ オ ン と しては、 例えば塩素イ オ ン、 臭素イ オ ン、 硫酸イ オ ン、 過塩素酸イ オ ン等が挙げ られる。 有機負ィ オ ン と しては、 例えばアセテー ト、 ベ ン ゾエー ト、 マ レ ェ一 ト 、 ベ ン ゼ ン ス ルホ ネー ト、 夕 一 ト レ ー ト 、 へ ミ 夕 一 ト レ 一 ト等が挙げ られる。 '  In the present invention, examples of the negative ion represented by A- in the above formula include an inorganic negative ion and an organic negative ion. Examples of the inorganic negative ion include chlorine ion, bromine ion, sulfate ion, and perchlorate ion. Organic negative ions include, for example, acetate, benzoate, malate, benzene sulfonate, evening tray, hemit evening tray, etc. Are mentioned. '
本発明において （： 〗 〜 C 4 アルキルグァニジ ノ とは、In the present invention, (: 〜 to C 4 alkylguanidino)
C ！ 〜 C 4 アルキルがグァニジ ノ の窒素原子に置換 した 置換基を表すが、 いずれの窒素原子に置換 して も よい。 ジ C , 〜（： 4 アルキルグァニジ ノ と は、 C , 〜（ 4 アル キルが 2 個 グァニジ ノ の窒素原子に置換 した置換基を表 すが、 いずれの窒素原子に置換 して も よい。 C! To C 4 alkyl represents a substituent substituted on the nitrogen atom of guanidino, but may be substituted on any nitrogen atom. Di C, to (: 4 alkylguanidino represents a substituent in which two C, to (4 alkyls have been substituted by nitrogen atoms of guanidino, but may be substituted by any nitrogen atom.
本発明において C , 〜（： 4 アルキルア ミ ノ C I 〜 C 8 アルキル と しては、 例えばメ チルア ミ ノ メ チル、 2 — ェ チルア ミ ノ ーェチル、 3 — ブチルァ ミ ノ 一ペ ンチル、 2 一 イ ソ プロ ピルア ミ ノ ー へキシル、 6 — ェチルア ミ ノ ー 2 — メ チルへキ シル、 3 — ブチルア ミ ノ ー プロ ピル、 4 一 メ チルア ノ ー ブチル、 4 一ェチルア ミ ノ ー ブチノレ、 4 — プロ ピノレア ミ ノ ー ブチノレ、 4 — ブチルア ミ ノ ー ブチ ル、 6 — メ チルア ミ ノ ーへキ シル、 6 —ェチノレア ミ ノ ー へキ シル、 6 — プロ ピルア ミ ノ ーへキ シル、 6 — ブチル ア ミ ノ ーへキ シル、 8 — メ チルア ミ ノ ー ォ ク チル、 8 — ェチルア ミ ノ 一 ォ ク チル、 8 — プロ ピルア ミ ノ ー ォ ク チ ル、 8 — ブチルア ミ ノ ー ォ ク チル等が挙げ られる。 C In the present invention, - (: is a 4 alkylamine Mi Bruno CI-C 8 alkyl, for example main Chirua Mi Bruno methylation, 2 - E Chirua Mi Bruno Echiru, 3 - Buchirua Mi Bruno Ichipe pentyl, 2 rumen S-propylamino hexyl, 6—ethylamino 2—methylhexyl, 3—butylaminopropyl 4-methylaminobutyl, 4-ethylaminobutynole, 4-propynoleaminobutyl, 4-butylaminobutyl, 6-methylaminohexyl, 6-ethylaminobutyl --Hexyl, 6--propylaminohexyl, 6--butylaminohexyl, 8--methylaminooctyl, 8--ethylaminooctyl, 8-- Propylaminooctyl, 8-butyraminooctyl and the like.
本発明において ジ C , 〜（： 4 アルキルア ミ ノ C , 〜 C 8 アルキル と しては、 例えばジ メ チルア ミ ノ メ チル、 2 — ジ メ チルア ミ ノ ー ェチル、 3 — ( N —ェチノレー N— プロ ピルァ ミ ノ ） 一 プロ ピル、 4 ー ジイ ソ プロ ピルア ミ ノ ー ブチル、 4 ー ジ メ チルア ミ ノ ー ブチル、 4 — ジェチ ルア ミ ノ ー ブチル、 4 ー ジプロ ピルア ミ ノ ー ブチル、 4 一 ジブチノレ'ァ ミ ノ ー ブチル、 6 — ジ メ チルア ミ ノ ーへキ シル、 6 — ジェチノレア ミ ノ ーへキ シル、 6 — ジプロ ピル ァ ミ ノ 一へキ シル、 6 — ジブチノレア ミ ノ ーへキ シル、 8 ー ジ メ チルア ミ ノ ー ォ ク チル、 8 — ジェチルア ミ ノ ー ォ ク チル、 8 — ジプロ ピルア ミ ノ ー ォ ク チル、 8 — ジブチ ルァ ミ ノ — ォ ク チル等が挙げ られる。 In the present invention, di C, to (: 4 alkylamino C, to C8 alkyl include, for example, dimethylaminomethyl, 2-dimethylaminoethyl, 3— (N-ethynole N — Propylamino) 1-propyl, 4-diisopropylaminobutyl, 4-dimethylaminobutyl, 4 — dimethylaminobutyl, 4-dipropylaminobutyl, 4 1 dibutyltinaminobutyl, 6—dimethylaminohexyl, 6—dimethylaminohexyl, 6—dipropylamino monohexyl, 6—dibutinoreaminoxyl Xyl, 8-dimethylaminooctyl, 8—diethylaminooctyl, 8—dipropylaminooctyl, 8—dibutylaminooctyl, etc. .
本発明において C , 〜（ 4 アルキルグァニジノ 〜 C 8 アルキル と しては、 例えばメ チルグァニジノ メ チル、 2 — メ チルグァニジ ノ 一ェチル、 4 ー メ チルグァニジ ノ ー ブチル、 4 — メ チルグァニジ ノ ー ブチル、 4 —ェチル グァニジノ — ブチル、 4 一 プロ ピルグァニジ ノ — ブチル、 4 - ブチル グァニ ジ ノ ー ブチル、 6 — メ チノレグァニジ ノ 一へキシノレ 、 6 — ェチノレグァニジノ 一へキ シル、 6 — プ 口 ピル グァニ ジノ ー へキ シル、 6 — ブチノレグァニジ ノ 一 へキ シル、 8 — メ チノレグァニジ ノ ー ォ ク チル、 8 — ェチ ル グァニジ ノ 一 ォク チル、 8 _ プロ ピルグァニジ ノ 一 才 ク チル、 8 — ブチル グァニジ ノ — ォ ク チル等が挙げ られ る 0 In the present invention, examples of C, to ( 4- alkylguanidino to C8 alkyl) include methylguanidinomethyl, 2-methyl guanidinoethyl, 4-methylguanidinobutyl, and 4-methylguanidinobutyl. , 4-ethyl guanidino-butyl, 4-propylguanidino-butyl, 4-butyl guanidino-butyl, 6-methinoreguanidino Hexinole, 6 — echinolegguanidino 1 hexyl, 6 — pill pill guanidino hexyl, 6 — butylin guanidino 1 hexyl, 8 — methinoreguanidino octyl, 8 — Ethyl guanidino octyl, 8_ propyl guanidino octyl, 8-butyl guanidino-octyl, etc. 0
本発明において ジ C ！ 〜 C 4 アルキルグァニジノ C , 〜（： 8 アルキル と しては、 例えばジ メ チルグァ二ジノ メ チル、 2 — ジェチルグァニジ ノ ーェチル、 4 ー ジ メ チル グァニジ ノ ー ブチル、 4 — ジ メ チルグァニジ ノ 一 ブチル、 4 — ジェチル グァニジ ノ — ブチル、 4 — ジプロ ピルグ Ύ ニジノ ー ブチル、 4 — ジブチルグァニジノ 一 ブチル、 6 一 ジ メ チルグァニジノ 一へキ シル、 6 — ジェチルグァ二 ジ ノ 一へキシル、 6 — ジプロ ピルグァニジ ノ 一へキシル、 6 — ジブチルグァニジ ノ —へキシル、 8 — ジ メ チルグァ ニジノ 一 才 ク チル、 8 — ジェチルグァニジ ノ ー ォ ク チル、 8 — ジプロ ピルグァニジノ — ォ ク チル、 8 — ジブチルグ ァニジノ ー ォ ク チル等が挙げ られる。  In the present invention, di C! ~ C 4 alkylguanidino C, ~ (: 8 alkyls include, for example, dimethyl guanidinomethyl, 2 — getylguanidinobutyl, 4-dimethyl guanidinobutyl, 4 — dimethylguanidinobutyl 1-butyl, 4—Jetylguanidino—butyl, 4—Dipropylguanidinobutyl, 4—Dibutylguanidino monobutyl, 6 1-Methylguanidino monohexyl, 6—Jetylguanidinohexyl, 6 — Dipropyruguanidino 1-hexyl, 6 — Dibutylguanidino — Hexyl, 8 — Dimethylpyrguanidino 1-year-old chill, 8 — Jetirguanidino octyl, 8 — Dipropylguanidino — octyl, 8 — Dibutylguanidino Octyl and the like.
- N + ( R 1 9 ) 3 〔 R 1 9は前記と同義であ る。 〕 と し ては、 例えば ト リ メ チルア ンモニゥ ミ ル、 ト リ ェチルァ ンモニゥ ミ ル、 ト リ プロ ピルア ンモニゥ ミ ノレ、 ト リ ブチ ルア ンモニゥ ミ ル等が挙げ られる。 - N + (R 1 9) 3 [R 1 9 is Ru as defined above der. And the like, for example, trimethylammonium, triethylammonium, tripropylammonium, tributylammonium, and the like.
前記 した一般式 （ H ) において Z は、 h H C N P のァ ミ ノ 酸配列 （配列番号 ： 1 5 ) の N末端側よ り ア ミ ノ 酸 残基を減ずる断片化、 C末端側よ り ア ミ ノ 酸残基を減ず る断片化あるいは N末端側、 C末端側の両側よ り ァ ミ ノ 酸残基を減ずる断片化のいずれかによ り得られる少な く と も配列— L y s - T r p —を含む h H C N Pの部分ァ ミ ノ 酸配列 も し く は、 h H C N Pの全ア ミ ノ 酸配列であ る。 よ り詳細には、 一般式 In the above-mentioned general formula (H), Z represents fragmentation in which amino acid residues are reduced from the N-terminal side of the amino acid sequence of hHCNP (SEQ ID NO: 15), and amino acid is located from the C-terminal side. No acid residues H HCNP containing at least the sequence—Lys-Trp—obtained by either fragmentation or fragmentation that reduces amino acid residues from both the N- and C-terminal sides. It is a partial amino acid sequence or the entire amino acid sequence of hHCNP. More specifically, the general formula
Z 1 - Lys-Trp-Z 2 C Z 1 は Pro- Va卜 Asp- Leu- Ser, Va卜 Asp— Leu— Ser， Asp— Leu— Ser，し eu— Ser, Ser または単結合を 表し、 Z 2 は Ser-G - Pro-Leu， Ser- Gly- Pro, Ser-G ， Ser または単結合を表す。 〕 で表されるア ミ ノ酸配列で ある。 さ らに特に好ま しい配列部分の代表例を列挙する と以下の通りである。 Z 1 - Lys-Trp-Z 2 CZ 1 is Pro- Va Bok Asp- Leu- Ser, Va Bok Asp- Leu- Ser, Asp- Leu- represents Ser, teeth The eu Ser, Ser or a single bond, Z 2 Represents Ser-G-Pro-Leu, Ser-Gly-Pro, Ser-G, Ser or a single bond. ] Is an amino acid sequence represented by Representative examples of particularly preferred sequence portions are as follows.
Pro - Val - Asp - Leu- Ser - Lys - Trp - Ser - Gly - Pro - Leu;  Pro-Val-Asp-Leu- Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu;
Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp; Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp;
し eu— Ser—し ys— Trp— Ser; Eu— Ser— ys— Trp— Ser;
し ys— Trp— Ser— Gly— Pro—し eu； Ys— Trp— Ser— Gly— Pro— eu;
Lys-Trp Lys-Trp
上記した神経栄養ペプチ ド誘導体は、 一般式 （ IK ) X - Z 1 - L y s - T r p - Z 2 - Y ( I )Neurotrophic peptide derivatives described above have the general formula (IK) X - Z 1 - L ys - T rp - Z 2 - Y (I)
〔式中、 Z 1 は Pro - Va卜 Asp - Leu - Ser, Va卜 Asp - Leu - Ser， Asp- Leu- Ser, Leu- Ser, Ser または単結合を表わ し、 Z 2 は Ser- Gly-Pro-Leu, Ser- Gly- Pro, Ser- Gly. Ser または単 結合を表わ し、 Xは水素原子または N末端修飾基を表わ し、 Yは水酸基または C末端修飾基を表わす〕 で示すこ とができ る。 [Wherein, Z 1 represents Pro-Vap Asp-Leu-Ser, Vapor Asp-Leu-Ser, Asp-Leu-Ser, Leu-Ser, Ser or a single bond, and Z 2 represents Ser-Gly -Pro-Leu, Ser-Gly-Pro, Ser-Gly. Represents a Ser or single bond, X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group. Can be shown.
また、 h H C N Pの 6 — 7 位の L y s — T r p を含む 好ま しい神経栄養ペプチ ド誘導体と して、 下記式 （IV) A 1 - L y s - T r p - A 2 (IV) 〔式中、 A 1 および A 2 は以下の （ i ) または （ ϋ ) で 疋 れ 。 Also includes Lys at position 6 — 7 of HCNP — T rp Preferred neurotrophic peptide derivatives include the following formula (IV) A 1 -Lys-Trp-A 2 (IV) wherein A 1 and A 2 are represented by the following (i) or (ま た は) Hibiki.
( i ) A 1 は、 (I) A 1 is,
X-、  X-,
X-Ser 、  X-Ser,
X-Leu-Ser 、  X-Leu-Ser,
X - Asp - Leu - Ser 、  X-Asp-Leu-Ser,
X- Val-Asp- Leu-Ser または  X- Val-Asp- Leu-Ser or
X-Pro-Val-Asp-Leu-Ser を表わ し、  X-Pro-Val-Asp-Leu-Ser,
A 2 は、 A 2
D-Ser-Y 、  D-Ser-Y,
D-Ser-Gly-Y 、  D-Ser-Gly-Y,
D-Ser-Gly-Pro-Y ま たは  D-Ser-Gly-Pro-Y or
D-Ser-Gly-Pro-Leu-Y を表わ し、 こ こで Xは水素原子または N末端修飾基を表わ し、 Y は水酸基または C末端修飾基を表わす。  It represents D-Ser-Gly-Pro-Leu-Y, where X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.
( ii ) A 1 は、 (Ii) A 1 is
A 4 — S e r ( A 4 は、 1 〜 3個の A 4 — S er (A 4 is one to three
4 アルキルで置換された L e u またはア ミ ジ ノ 基で置換された L e uを表す） を表わ し、 A 2 は、 4 represents L eu substituted with alkyl or L eu substituted with an amidino group), and A 2 represents
Ser-Y 、  Ser-Y,
Ser-Gly-Y 、 - Ser - Gly-Pro - Y ま たは Ser-Gly-Y,- Ser-Gly-Pro-Y or
Ser - Gly - Pro -し eu - Υ ·を表わ し、  Ser-Gly-Pro-eu-Υ
こ こ で X は水素原子ま たは N末端修飾基を表わ し、 Y は水酸基ま たは C末端修飾基を表わす〕  Where X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.)
で示さ れる神経栄養べプチ ド誘導体ま たはその塩を挙げ る こ とができ る。 Or a salt thereof.
一般式 （ IV) の神経栄養ペプチ ド誘導体ま たはその塩 のなかで も、 以下の化合物が好ま しい もの と して挙げ ら れる o  Among the neurotrophic peptide derivatives of the general formula (IV) or salts thereof, the following compounds are also preferred: o
式 （ IV ) において、 A 1 が X、 A 2 が D — S e r — Y、 D — S e r — G ^ y — Y、 D - S e r - G y - P r o — Y ま たは D — S e r — G ^ y — P r o — L e u — Yで あ る神経栄養べプチ ド誘導体ま たはその塩 ； In the formula (IV), A 1 is X, A 2 is D—Ser—Y, D—Ser—G ^ y—Y, D-Ser-Gy-Pro—Y or D—S er — G ^ y — Pro — Le eu — Y neurotrophic peptide derivative or salt thereof;
式 （ 17) において、 A ' が X — L e u — S e r、 A 2 が D — S e r — Y、 D - S e r - G i y - Y . D - S e r - G ^ y - P r o — Y ま たは D — S e r - G £ y — P r o — L e u — Yである神経栄養ペプチ ド誘導体ま たはその塩 ； In the formula (17), A 'is X - L eu - S er, A 2 is D - S er - Y, D - S er - G iy - Y D -. S er - G ^ y - P ro - Y Or a neurotrophic peptide derivative or salt thereof that is D—Ser-G £ y—Pro—Leu—Y;
式 （ IV ) において、 A 1 が M e L e u — S e r である 神経栄養ペプチ ド誘導体ま たはその塩 ； 及び式 （ 17 ) に おいて、 A 1 が M e L e u — S e r、 A 2 が D — S e r 一 Y、 D — S e r — G y — Υ、 D - S e r - G y - Ρ r ο — Υ ま たは D — S e r - G y - P r ο — L e u — Υであ る神経栄養べプチ ド誘導体ま たはその塩。 In formula (IV), A 1 is M e L eu - S er neurotrophic peptide derivatives or the salts are; and Oite the equation (17), A 1 is M e L eu - S er, A 2 is D—Ser-Y, D—Ser—Gy—Υ, D-Ser-Gy-Ρrο—Υ or D—Ser-Gy-Prο—Leu—神 経 Neurotrophic peptide derivatives or salts thereof.
こ のよ う な化合物の好ま しい具体例を挙げれば次の通 りである。 Preferred examples of such compounds include the following: It is.
MeLeu-Ser-Lys- Trp-Ser- NH(CH2)2NH2(配列番号 ： 2 3 ) MeLeu-Ser-Lys-Trp-Ser-NH(CH2) 3NH2 (配列番号 ：MeLeu-Ser-Lys- Trp-Ser- NH (CH 2) 2 NH 2 ( SEQ ID NO: 2 3) MeLeu-Ser- Lys-Trp-Ser-NH (CH 2) 3 NH 2 ( SEQ ID NO:
2 4 ) twenty four )
MeLeu- Ser-Lys- Trp-Ser- NH(CH2)4NH2 (配列番号 ：MeLeu- Ser-Lys- Trp-Ser- NH (CH 2 ) 4 NH 2 (SEQ ID NO:
2 5 ) twenty five )
MeLeu-Ser-Lys-Trp-Ser-NH(CH2) 8NH2 (配列番号 ： 2 6 ) MeLeu-Ser-Lys-Trp-Ser-NH (CH 2 ) 8 NH 2 (SEQ ID NO: 26)
Meし eu-Ser - Lys - Trp - D - Ser - OH (配列番号 : 2 1 )  Me shi eu-Ser-Lys-Trp-D-Ser-OH (SEQ ID NO: 21)
また、 本発明においては、 h H C N Pの C末端部位の 9 — 1 1 位の G ^ y — P r o _ L e u配列を含む神経栄 養べプチ ド誘導体を好ま しい もの と して挙げる こ とがで き る。 かかる化合物と しては、  Further, in the present invention, a neurotrophic peptide derivative containing a G ^ y-Pro_Leu sequence at the 9- to 11-position of the C-terminal portion of hHCNP may be mentioned as a preferred one. it can. Such compounds include:
一般式 （ V a ) General formula (V a)
A 5 - G i y - P r o - L e u - Y ( V a )A 5 -G iy-Pro-L eu-Y (V a)
〔式中、 A 5 は、 (Where A 5 is
X - B 、  X-B,
X-Trp-B 、  X-Trp-B,
X-Lys-Trp-B 、  X-Lys-Trp-B,
X - Ser -し ys - Trp - B 、  X-Ser-ys-Trp-B,
X-Leu-Ser-Lys-Trp-B 、  X-Leu-Ser-Lys-Trp-B,
X-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-B 、  X-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-B,
X - Val - Asp— Leu - Ser— Lys - Trp - B または、  X-Val-Asp—Leu-Ser— Lys-Trp-B or
X— Pro Val Asp し eu— Ser し ys_Trp— B を表わ し、 こ こで B は S e r 、 D — S e r または A _i a を表わ し Xは水素原子または N末端修飾基を表わ し、 X—Pro Val Asp then eu—Ser then ys_Trp—B where B is Ser, D—Ser or A_ia. X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group,
Yは水酸基または C末端修飾基を表わす。 〕 で表わされ る神経栄養べプチ ド誘導体またはその塩 ； または、 一般式 （ V ) Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group. A neurotrophic peptide derivative or a salt thereof represented by the formula: or a general formula (V)
A 3 - G £ y - P r o — L e u — f ( V ) 〔式中、 A 3 は、 A 3 -G £ y-P ro — L eu — f (V) [where A 3 is
X-C 、  X-C,
X-Trp-B 、  X-Trp-B,
X-Lys-Trp-D 、  X-Lys-Trp-D,
X-Ser-Lys-Trp- D 、  X-Ser-Lys-Trp-D,
X-Leu-Ser-Ly s- Trp-D 、  X-Leu-Ser-Lys-Trp-D,
X - A s p -し e u - S e r - Lys-Trp-D 、  X-A s p-then e u-S er-Lys-Trp-D,
X - Val - Asp - Leu - Ser - Lys - Trp— D または、  X-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp— D or
X-Pro-Val-Asp- Leu-Ser-Lys-Trp-D を表わ し、 こ こ で C は S e r または D — S e r を表わ し、 B は S e r 、 D - S e r または A ^ a を表わ し、 Dは D — S e r または A _g a を表わし、 Xは水素原子または N末 端修飾基を表わ し  X-Pro-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-D, where C represents Ser or D—Ser, and B represents Ser, D-Ser or A ^ a, D represents D—Ser or A_g a, X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group.
Yは水酸基または C末端修飾基を表わす。 〕  Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group. ]
で表わされる神経栄養べプチ ド誘導体またはその塩が挙 げられる。 Or a salt thereof.
こ のよ う な式 （ V a ) 及び （ V ) の神経栄養ペプチ ド 誘導体のなかでも、 以下の化合物が好ま しい もの と して 挙げられる。  Among the neurotrophic peptide derivatives of the formulas (Va) and (V), the following compounds are mentioned as preferred.
( a ) 式 （ V a ) あるいは （ V ) において、 A 5 ある いは A 3 が X— S e r、 X— D— S e r、 X— T r p _ S e r、 X— T r p — D— S e r または X— T r p — A £ aである神経栄養べプチ ド誘導体またはその塩 ； ( b ) 式 （V a ) あるいは （V) において、 A 5 ある いは A 3 が、 (A) In the formula (V a) or (V), there A 5 There is A 3 is X- S er, X- D- S er , X- T rp _ S er, X- T rp - D- S er or X- T rp - A £ neurotrophic base petit de is a (B) In the formula (V a) or (V), A 5 or A 3 is
X-Lys-Trp-D-Ser 、  X-Lys-Trp-D-Ser,
X-Ser-Lys-Trp-D-Ser 、  X-Ser-Lys-Trp-D-Ser,
X-Leu-Ser- Lys-Trp-D- Ser 、  X-Leu-Ser- Lys-Trp-D- Ser,
X - Asp - Leu - Ser - Lys - Trp - D - Ser 、  X-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-D-Ser,
X - Vaト Asp - Leu - Ser_Lys - Trp - D - Ser ま.たは X - Pro - Vaト ASP - Leu - Ser -し ys - Trp - D - Ser である 神経栄養べプチ ド誘導体またはその塩。  X-Va Asp-Leu-Ser_Lys-Trp-D-Ser or X-Pro-Va ASP-Leu-Ser-ys-Trp-D-Ser Neurotrophic peptide derivative or salt thereof .
このよ う な化合物の好ま しい具体例を挙げれば次の通 りである。 Preferred specific examples of such compounds are as follows.
O en o cn O en o cn
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000050_0001
IND OO  IND OO
) a Θ ) a Θ
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000051_0001
GO GO -JGO GO -J
CD O CD O
ISO enISO en
n yp(rseyIrHsTGNClpuH HLroLe-,-，--- pyy LDGlsTrser(干proLeHCHuN------ln yp (rseyIrHsTGNClpuH HLroLe-,-, --- pyy LDGlsTrser (dry proLeHCHuN ------ l
pyyDrseGlp(sTrroL HLeCHuo---l---- r*  pyyDrseGlp (sTrroL HLeCHuo --- l ---- r *
I  I
II
II
II
CO CO
( >  (>
*-t  * -t
I  I
cr o  cr o
I 0  I 0
I I
CD CD
c:  c:
I  I
I  I
'Ό  'Ό
I  I
-o O  -o O
I  I
Z 2： c Z 2: c
y yps BOTruseCLrG ruでoLe-----ll- ypyD fTrse rLio¾ ZGlul --f-l  y yps BOTruseCLrG ru oLe ----- ll- ypyD fTrse rLio¾ ZGlul --f-l
py(2oLGC丄 css reu HNCHoLTrerD- -- -l--l--
Figure imgf000052_0001
yps", C CCO MH L+GLeeNTrsuFser OiI-- py2 y(seueNCHLTrspro MDrGlLe T---l--- yp(C MH LeNHsT Γ eruDΟ--l—IΙpy (2oLGC 丄 css reu HNCHoLTrerD---l--l--
Figure imgf000052_0001
yps ", C CCO MH L + GLeeNTrsuFser OiI-- py2 y (seueNCHLTrspro MDrGlLe T --- l --- yp (C MH LeNHsT Γ eruDΟ--l—IΙ
ypO CLTrDse-— I- y p( C2NO HCDLsGiuerproe---l-- ypO CLTrDse-— I- y p (C2NO HCDLsGiuerproe --- l--
PyyD LssTGrerprlouLe—I---- ypy HsTsLreD Glpr Lo u--，-irlPyyD LssTGrerprlouLe—I ---- ypy HsTsLreD Glpr Lo u--, -irl
pyyprovslL Ha.eerI sTrsGproeuu,Der 22-—l—-,>.>l—- ) f ^b Θ また、 式 （V a ) の神経栄養ペプチ ド誘導体の好ま し い化合物と して以下の もの も具体的に挙げる こ とができ る o pyyprovslL Ha.eerI sTrsGproeuu, Der 22-—l —-,>.> l—-) f ^ b Θ Preferred compounds of the neurotrophic peptide derivative of the formula (Va) include the following: o
H-Pro-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH H-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH H-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH H—し eu— Ser— Lys— Trp— Ser— Gly— Pro—し eu— OH H-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH H-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH また、 本発明においては、 h H C N Pの C末端部位の 9 一 1 1 位の G y — P r o — L e u配列を含む神経栄 養ペプチ ド誘導体の好ま しい例と して、 下記式 （VI) X - A a - G ^ y - P r o - L e u - Y ( VI) 〔式中、 Xは水素原子または N末端修飾基を表わ し、 Y は水酸基または C末端修飾基を表わす〕  H-Pro-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH H-Val-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH H- Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH H—Eu—Ser—Lys—Trp—Ser—Gly—Pro—Eu—OH H-Ser-Lys-Trp-Ser- Gly-Pro-Leu-OH H-Lys-Trp-Ser-Gly-Pro-Leu-OH In the present invention, G y —P ro —L eu at the 911 position of the C-terminal site of h HCNP Preferred examples of the neurotrophic peptide derivative having the sequence include the following formula (VI) X-Aa-G ^ y-Pro-Leu-Y (VI) wherein X is a hydrogen atom or Represents an N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.)
で示される神経栄養べプチ ド誘導体またはその塩を挙げ る こ とができ る。 このよ う な化合物の好ま しい具体例と しては次の化合物が挙げられる。 Or a salt thereof. Preferred examples of such compounds include the following compounds.
H - A ^ a - G ^ y - P r o - L e u — O H 一方、 前記した本発明の神経栄養ペプチ ド前駆体ポ リ ぺプチ ドは、 ヒ ト由来の ものラ ッ ト由来の ものいずれも 含まれる。 ラ ッ ト由来の もの と しては配列番号 ： 3 で表 されるア ミ ノ 酸配列を有する前駆体ポ リ ペプチ ドが、 ヒ ト 由来の もの と しては配列番号 ： 1 4 で表されるァ ミ ノ 酸配列を有する前駆体ポ リ ペプチ ドが挙げられる。 本発明の前記した ヒ ト 由来神経栄養べプチ ドまたはそ の誘導体の薬学的に許容 しう る塩と しては、 これらのぺ プチ ド類の慣用的無毒性塩または四級ア ン 乇ニ ゥ ム塩が あるが、 これらは例えば無機または有機酸あるいは塩基 から形成される。 こ のよ う な酸付加塩の例と しては、 酢 酸、 酪酸、 ク ェ ン酸、 乳酸、 酒石酸、 シユ ウ酸、 マ レ イ ン酸、 コハ ク酸、 フマール酸、 塩酸、 臭化水素酸、 硫酸 の塩がある。 塩基の塩と しては、 ア ンモニゥム塩、 ナ ト リ ゥ厶および力 リ ゥ厶塩のよ う なアル力 リ 金属塩、 カル シゥムおよびマグネ シウム塩のよ う なアル力 リ.土類金属 塩、 アルギニ ン、 リ ジ ンのよ う なア ミ ノ酸との塩等があ る。 かかる塩は自体既知の手段によ って容易に製造する こ とができ る。 例えば、 酢酸塩の場合は、 当該神経栄養 ペプチ ドまたはその誘導体を水を溶かし、 必要量の酢酸 を加える こ とによ って製造される。 H-A ^ a-G ^ y-Pro-Leu-OH On the other hand, the above-described neurotrophic peptide precursor polypeptide of the present invention is derived from a human or a rat. included. The precursor polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is derived from rat, and the precursor polypeptide represented by SEQ ID NO: 14 is derived from human. And precursor polypeptides having an amino acid sequence. The pharmaceutically acceptable salt of the above-mentioned human-derived neurotrophic peptide or a derivative thereof according to the present invention includes a conventional non-toxic salt or a quaternary amino acid of these peptides. Pumium salts are formed, for example, from inorganic or organic acids or bases. Examples of such acid addition salts include acetic, butyric, citric, lactic, tartaric, oxalic, maleic, succinic, fumaric, hydrochloric, and bromide. Hydrogen and sulfuric acid salts are available. Base salts include alkaline metal salts, such as ammonium salts, sodium and potassium salts, and alkaline metals, such as calcium and magnesium salts. Salts and salts with amino acids such as arginine and lysine. Such a salt can be easily produced by a method known per se. For example, in the case of acetate, the neurotrophic peptide or a derivative thereof is produced by dissolving water and adding a necessary amount of acetic acid.
本発明の ヒ ト由来神経栄養べプチ ド及び神経栄養ぺプ チ ド誘導体は、 通常のペプチ ド化学において用いられる 方法に準じて合成する こ とができ る。 該公知方法と して は文献 （ぺプタイ ド · シ ン セ シス （Peptide Synthesis), Intersci ence, New York, 1 9 6 6 ； ザ · プロティ ンズ ( The Proteins;, Vol 2 , Academic Press Inc. , ew York, 1 9 7 6 ； ペプチ ド合成、 丸善 （株） 、 1 9 7 5 ； ペプチ ド合成の基礎と実験、 丸善 （株） 、 1 9 8 5 ； 生化学実験講座 · タ ンパク質の化学 IV、 日本生化学会編、 1 9 7 7 ) な どに記載されている方法が挙げられる。 す なわち、 C末端部位の構造等によ り液相法、 固相法のい ずれかを選択 して合成する こ とができ る。 よ り詳細には、 C末端部位に— C O O Hあるいは一 C O N H 2 の部分構 造があるペプチ ド類の場合には、 液相法、 固相法のいず れによ って も得る こ とができ るが、 それ以外の場合には 液相法が望ま しい。 The human-derived neurotrophic peptide and the neurotrophic peptide derivative of the present invention can be synthesized according to a method used in ordinary peptide chemistry. Examples of the known method include literature (Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins ;, Vol 2, Academic Press Inc., ew York, 1976; Peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basics and experiments of peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Biochemistry experiment course · Protein chemistry IV, edited by the Biochemical Society of Japan, 197 7). In other words, the synthesis can be performed by selecting either the liquid phase method or the solid phase method depending on the structure of the C-terminal site. More specifically, in the case of peptides having a partial structure of —COOH or 1 CONH 2 at the C-terminal site, they can be obtained by either the liquid phase method or the solid phase method. Yes, but otherwise, the liquid phase method is preferred.
例えば固相法によ り合成を行う場合、 C末端ア ミ ノ 酸 (ア ミ ノ 基を保護 した もの） あるいは C末端修飾基 （力 ルポキシル基と、 ア ミ ノ 基あるいは水酸基の どち らか一 方を有し、 ァ ミ ノ 基が存在する場合にはそれを保護した もの） をそのカルボキシル基によ って、 まず不溶性担体 に結合させる。 その不溶性担体との結合は、 不溶性担体 内にク ロ ロ メ チル基がある場合は、 その C末端ア ミ ノ 酸 あるいは C末端修飾基を塩基存在下反応させるか、 ある いはその C末端ア ミ ノ 酸あるいは C末端修飾基の塩基付 加塩をそのま ま反応させる こ とで実施する こ とができ る。 また、 不溶性担体内に ヒ ドロキシメ チル基、 ォキシ厶ぁ るいはァ ミ ノ基がある場合は、 カルポジイ ミ ド法ゃ活性 エステル法でその C末端ァ ミ ノ酸あるいは C末端修飾基 を結合させる こ とが出来る。 次いで、 ァ ミ ノ 基が保護さ れている場合は、 保護基を除去した後、 目的ペプチ ドの ア ミ ノ酸配列に従い、 ア ミ ノ 基を保護したア ミ ノ 酸ある いはア ミ ノ 基を保護 したア ミ ノ 酸誘導体を反応させ、 ァ ミ ノ 基の保護基を除去し、 さ らに同様の反応を繰り返す こ とで、 全配列を合成する。 その後、 必要であ 'れば N末 端修飾基を縮合させる。 次にペプチ ドを不溶性担体から はずすと と もに保護基を除去する。 不溶性担体からのぺ プチ ドの切断方法と しては、 H F、 H B r / T F A、 T F A、 ト リ フルォロ メ タ ンスルホ ン酸等の酸で処理す る方法、 あるいはア ンモニア等の塩基で処理する方法等 が挙げられる。 さ らに、 こ こで必要であれば N末端修飾 基あるいは C末端修飾基を縮合させ、 保護基を除去する こ とによ り 目的のペプチ ドを得る こ とができ る。 For example, when the synthesis is carried out by the solid phase method, the C-terminal amino acid (in which the amino group is protected) or the C-terminal modifying group (which can be either a hydroxyl group, an amino group or a hydroxyl group) The amino group, which is protected (if an amino group is present), is first bound to the insoluble carrier via its carboxyl group. When the chloromethyl group is present in the insoluble carrier, the bond with the insoluble carrier is reacted with the C-terminal amino acid or the C-terminal modifying group in the presence of a base, or the C-terminal amino group is reacted. The reaction can be carried out by reacting the amino acid or the base-added salt of the C-terminal modifying group as it is. When a hydroxymethyl group, oxime or amino group is present in the insoluble carrier, the C-terminal amino acid or a C-terminal modifying group may be bound by the carpoimide method or the active ester method. Can be. Next, when the amino group is protected, the protecting group is removed, and the amino group or amino acid whose amino group is protected is removed according to the amino acid sequence of the target peptide. By reacting an amino acid derivative having a protected group, the protecting group of the amino group is removed, and the same reaction is repeated to synthesize the entire sequence. Then, if necessary, N end The terminal modifying groups are condensed. Next, the peptide is removed from the insoluble carrier, and the protecting group is removed. As a method for cleaving the peptide from the insoluble carrier, a method of treating with an acid such as HF, HBr / TFA, TFA, trifluormethane sulfonic acid, or a method of treating with a base such as ammonia is used. Method and the like. Further, if necessary, the desired peptide can be obtained by condensing an N-terminal modifying group or a C-terminal modifying group and removing the protecting group.
また液相法によ り合成を行う場合には、 C末端ア ミ ノ 酸 （カルボキシル基 保護した もの） あるいは C末端修 飾基 （遊離のア ミ ノ 基あるいは水酸基を有し、 カルボキ シル基が存在する場合にはそれを保護した もの） を、 目 的ペプチ ドのア ミ ノ 酸配列に従い、 ア ミ ノ 基を保護した ァ ミ ノ 酸あるいはァ ミ ノ 基を保護したァ ミ ノ 酸誘導体を 反応させ、 ァ ミ ノ 基の保護基を除去し、 さ らに同様の反 応を繰り返すこ とで、 全配列を合成する。 その後保護基 を除去し N末端修飾基あるいは C末端修飾基を縮合させ、 さ らに必要であれば保護基を除去する こ とによ り、 目的 のペプチ ドを得る こ とができ る。 なお液相法によ り合成 を行う場合は、 ァ ミ ノ 酸を 1 個ずつ順次結合させるので はな く 、 ペプチ ドフ ラ グメ ン ト同志を結合させて も合成 する こ とができ る。  When the synthesis is carried out by the liquid phase method, a C-terminal amino acid (protected with a carboxyl group) or a C-terminal modified group (having a free amino group or a hydroxyl group and having a carboxyl group). If present, the protected amino acid) is converted to an amino-protected amino acid or an amino-acid-protected derivative according to the amino acid sequence of the target peptide. The reaction is performed to remove the amino group-protecting group, and the same reaction is repeated to synthesize the entire sequence. Thereafter, the desired peptide can be obtained by removing the protecting group, condensing the N-terminal modifying group or the C-terminal modifying group and, if necessary, removing the protecting group. When the synthesis is carried out by the liquid phase method, the synthesis can be carried out not by binding the amino acids one by one but by binding the peptide fragments.
上記各種方法において、 反応性の官能基は保護してお く こ とが好ま しい。  In the various methods described above, it is preferable to protect the reactive functional group.
ァ ミ ノ 基の保護基と しては、 例えば、 ベン ジルォキシ カ ルボニル、 t 一 ブチ ルォキ シ カ ル ボニル、 p — メ ト キ シベ ン ジルォキ シ カ ノレボニル、 2 — ク ロ ルべ ン ジルォキ シ カ ノレポニル、 p — ト ノレエ ン ス ノレ ホニル、 ト リ フ ルォ ロ ァ セ チ ノレ、 フ 夕 リ ノレ、 ホノレ ミ ノレ、 0 — 二 ト ロ フ エ ニルス ノレ フ エ ニル、 3 — ニ ト ロ 一 2 — ピ リ ジ ン ス ル フ エ ニル、 ジフ エニルホス フ イ ノ チオイ ル基な どが挙げ られる。 例 えば t 一 ブチルォキシカ ルボニル基の導入は、 ジー t 一 プチルジカ ルボナ一 ト を ト リ エチルァ ミ ン等の塩基存在 下に作用 させる こ と によ り 実施でき、 その除去は ト リ フ ルォ ロ酢酸等の酸を作用 させる こ とで実施でき る。 Examples of the amino-protecting group include benzyloxy. Carbonil, t-butyloxycarbonyl, p — methoxybensiloxycanolevonil, 2 — chlorobensiloxycanoleponil, p — tonorenence norolefonyl, trifluoro Acetinole, fuenorinore, honoreminore, 0—dinitrophenylnorethenyl, 3—nitro12—pyridinylphenyl, diphenylphosphino Thioyl group and the like. For example, introduction of t-butyloxycarbonyl group can be carried out by reacting di-t-butyldicarbonate in the presence of a base such as triethylamine, and its removal can be carried out by using trifluoroacetic acid or the like. It can be carried out by reacting the acid.
カ ルボキシル基の保護基と しては、 例えばメ チ ル、 ェ チル、 t — ブチルな どの C , 〜 C 4 アルキルエステル、 ベ ン ジノレエステル、 p —二 ト ロべ ン ジルエステル、 p — メ チ ノレべ ン ジノレエス テノレ、 シ ク ロ へキ シノレエステル、 シ ク ロペ ンチルエステルな どが挙げ られる。 例えばメ チル エステルの導入は、 メ タ ノ ール中で塩化チォニルを反応 させる こ と によ り 実施でき、 その除去は水酸化ナ ト リ ウ 厶等によ る ア リ カ リ 加水分解によ り 実施でき る。 Ca carboxyl is a protecting group of the groups, for example, main Ji Le, E chill, t - butyl of which C, ~ C 4 alkyl esters, base down Jinoreesuteru, p - two preparative Robe down succinimidyl ester, p - main switch Norenbenzinoles Tenore, cyclohexinole esters, cyclopentyl esters, and the like. For example, introduction of a methyl ester can be carried out by reacting thionyl chloride in methanol, and its removal can be carried out by hydrolysis with sodium hydroxide or the like. Can be implemented.
S e r 等の水酸基は必ず し も保護する必要はないが、 必要であれば、 例えば、 ベ ン ジル、 2， 6 — ジ ク ロ ルべ ン ジル、 t — ブチル、 ベ ン ジルォキ シカ ルボニル、 ァセ チル基な どで保護する こ とができ る。  It is not always necessary to protect hydroxyl groups such as Ser, but if necessary, for example, benzyl, 2,6-dichlorobenzyl, t-butyl, benzyloxycarbonyl, a It can be protected with a cetyl group.
T r p 等のィ ン ド リ ル基は必要であれば、 ホル ミ ル、 ペ ン ジノレオキ シ カ ノレボニル、 2 ， 4 — ジ ク ロ ノレべン ジル ォキ シカ ルボニル基な どで保護する こ と も可能で る。 グァニジノ 基は塩酸等でプロ ト ン化させた状態で、 保 護基 と しての役目 を もたせる こ とができ るが、 必要であ れぱ、 例えば ρ — ト ルエ ンスルホニル、 ニ ト ロ、 ベ ン ジ ルォキシカ ルボニル、 p — メ ト キ シベ ンゼンスルホニル、 メ シチ レ ン — 2 — スルホニル基等で保護する こ とができ る。 例えば p — ト ルエ ンスルホニル基の導入は、 水酸化 ナ ト リ ゥ 厶等のアル力 リ 存在下に塩化 p - ト ルエ ンスル ホニルを作用 させる こ と によ り 実施でき、 その除去は H Fゃ ト リ フ ルォ ロ メ タ ンスルホ ン酸等の酸を作用 させる こ とで実施でき る。 If necessary, an indyl group such as T rp may be protected with, for example, formyl, pendinoreoxycanolevonyl, 2,4-dichloronorbenzyloxycarbonyl group. It is also possible. The guanidino group can serve as a protecting group when protonated with hydrochloric acid or the like, but it can be used if necessary. For example, ρ-toluenesulfonyl, nitro, It can be protected by benzyloxycarbonyl, p-methoxybenzenesulfonyl, mesitylene-2—sulfonyl group, etc. For example, the introduction of a p-toluenesulfonyl group can be carried out by reacting p-toluenesulfonyl chloride in the presence of sodium hydroxide or the like, and its removal can be carried out by HF It can be carried out by reacting an acid such as trifluoromethansulfonate.
上記各種方法において、 ペプチ ド結合を形成させる方 法およ び N末端修飾基、 C末端修飾基の縮合方法と して は、 例えばジシ ク ロへキシルカ ルポジイ ミ ド、 1 —ェチ ル一 3 — ( 3 — ジ メ チルァ ミ ノ プロ ピル） カ ルポジイ ミ ドな どのカ ルボジィ ミ ド類を用いる方法、 対称型酸無水 物法、 混合酸無水物法、 ア ジ ド法、 活性エステル法、 酸 化還元法、 ジフ ヱニルホスホ リ ルア ジ ド法、 カ ルボジィ ミ ド型縮合剤 +添加物 （ 1 ー ヒ ドロキシベン ゾ ト リ ア ゾ ール、 N — ヒ ドロキ シコノヽ ク酸イ ミ ドな ど） 法、 酸ハロ ゲ ン化物法な ど既知の手法が挙げ られる。  In the various methods described above, the method for forming a peptide bond and the method for condensing an N-terminal modifying group and a C-terminal modifying group include, for example, dicyclohexyl carbodiimide, 1-ethyl-13 — (3 — dimethylaminopropyl) Method using carbodiimides such as carbodiimide, symmetric acid anhydride method, mixed acid anhydride method, azide method, active ester method, acid Redox method, diphenylphosphoryl azide method, carbodiimide-type condensing agent + additive (1-hydroxyhydrazolylazole, N-hydroxyimidic acid imid etc.) method And known methods such as an acid halide method.
その他の N末端修飾基の導入に関 しては、 スルホニル 基の導入は、 ハロ ゲ ン化スルホニル化合物を塩基存在下 で反応させる こ と によ り導入する こ とが出来る。 例えば、 p - ト ルエ ンスルホニル基の導入は、 塩化 p — ト ルエ ン スルホ二ルを ト リ エチルァ ミ ン等の塩基存在下で反応さ せる こ とによ り行う こ とが出来る。 結合するア ミ ノ 酸残 基のァ ミ ノ 基と共に尿素骨格を形成する残基の導入に関 しては、 イ ソ シアナ一 ト を反応させる こ とで導入する こ とが出来る。 例えば、 フ エ二ルイ ソ シアナー トを作用さ せる こ とによ り、 N— フ エ二ルカルバモイ ルを導入する こ とが出来る。 結合するア ミ ノ 酸残基のア ミ ノ 基と共に ウ レ タ ン骨格を形成する残基の導入に関 しては、 対応す るハロゲ ン化物あるいは無水物を用いて導入する こ とが 出来る。 例えば、 ベン ジルォキシカルボニル基の導入は、 塩化べン ジルォキシカルボニルを水酸化ナ ト リ ゥム等の 塩基存在下に作用 させる こ とによ り行う こ とが出来る。 Regarding the introduction of other N-terminal modifying groups, the introduction of a sulfonyl group can be carried out by reacting a halogenated sulfonyl compound in the presence of a base. For example, introduction of a p-toluenesulfonyl group involves reacting p-toluenesulfonyl chloride in the presence of a base such as triethylamine. You can do it by doing it. Regarding the introduction of a residue that forms a urea skeleton together with the amino group of the amino acid residue to be bonded, it can be introduced by reacting an isocyanate. For example, N-phenylcarbamoyl can be introduced by reacting with phenylsilane. Regarding the introduction of a residue that forms a urethane skeleton together with the amino group of the amino acid residue to be bound, the introduction can be carried out using the corresponding halide or anhydride. . For example, a benzyloxycarbonyl group can be introduced by reacting benzyloxycarbonyl chloride in the presence of a base such as sodium hydroxide.
N末端ァ ミ ノ 酸の N — モ ノ アルキル化されたぺプチ ド 誘導体の合成に関 しては、 文献 （カナディ ア ン · ジ ャ ー ナル · ォブ · ケ ミ ス ト リ 一 （ C a n . J . C em. ) 5 5 , 9 0 6 ( 1 9 7 7 ) ) に記載の方法によ り、 あ らか じめァ ミ ノ 基で保護した N末端ァ ミ ノ 酸の N — モ ノ アルキル体を調 製しておき、 カルポジイ ミ ド法等によ ってペプチ ド結合 を形成させ、 つづいてァ ミ ノ 基の保護基を除去する こ と で合成でき る。 N末端ア ミ ノ 酸の N， N— ジアルキル化 されたペプチ ド誘導体の合成に関 しては、 ペプチ ド誘導 体に対して、 対応するアルデヒ ドとの還元的アルキル化 反応を行う こ とで合成する こ とが出来る。 例えば、 N， N — ジメ チル体の場合、 ホルマ リ ン水溶液中で水素化シ ァ ノ ホウ素ナ ト リ ゥムを作用 させる こ とで合成する こ と が可能である。 N末端ア ミ ノ 酸の N , N , N — ト リ アル キル化されたペプチ ド誘導体の合成に関 しては、 ハロ ゲ ン化アルキルを塩基存在下で反応させる こ と によ り 合成 する こ とが出来る。 例えば、 N， N， N — ト リ メ チル体 は、 ョ ー ド メ タ ンを ト リ エチルァ ミ ン等の塩基存在下に 作用 させる こ と によ り 合成する こ とが出来る。 N末端ァ ミ ノ 酸の N — ァ ミ ジ ノ 化されたぺプチ ド誘導体の合成に 関 しては、 あ らか じめ N末端ア ミ ノ 酸の保護さ れたア ミ ジ ノ 体を調製 しておき、 カ ルポジイ ミ ド法等によ ってべ プチ ド結合を形成させ、 つづいて保護基を除去する こ と で合成する こ とが出来る。 N —末端ア ミ ノ 酸の保護され たア ミ ジノ 体は、 例えば ト リ ェチルァ ミ ン等の塩基存在 下、 N — ( メ チル メ ルカ プ ト ク ロ ロ メ チ レ ン） 一 p — ト ルエ ンスルホ ンイ ミ ド と N末端ア ミ ノ 酸を反応させ、 つ づいてア ンモニア水 と反応させる こ と によ り 合成する こ とができ る。 For the synthesis of N-monoalkylated peptide derivatives of N-terminal amino acids, see the literature (Canadian Journal of Chemistry, Canada). J. Cem.) 55, 90 (1977)), the N-moiety of the N-terminal amino acid protected with an amino group in advance. The compound can be synthesized by preparing a monoalkyl compound, forming a peptide bond by a calposimid method or the like, and then removing the protecting group of the amino group. Regarding the synthesis of N, N-dialkylated peptide derivatives of the N-terminal amino acid, the peptide derivative is subjected to a reductive alkylation reaction with the corresponding aldehyde. Can be synthesized. For example, in the case of N, N-dimethyl form, it can be synthesized by reacting cyanoborohydride in aqueous formalin solution. N, N, N — Trial of N-terminal amino acid Regarding the synthesis of a killed peptide derivative, it can be synthesized by reacting an alkyl halide in the presence of a base. For example, the N, N, N-trimethyl form can be synthesized by reacting pseudomethane in the presence of a base such as triethylamine. For the synthesis of N-amidinolated peptide derivatives of N-terminal amino acid, the protected amidino form of N-terminal amino acid was first prepared. It can be synthesized by preparing the peptide, forming a peptide bond by a calposimid method, and then removing the protecting group. The N-terminal amino acid-protected amidino form can be converted to N- (methylmethylcaptochloromethylene) -1p-to-N in the presence of a base such as, for example, triethylamine. It can be synthesized by reacting lensulfonimide with an N-terminal amino acid, followed by reaction with ammonia water.
保護基の除去法と しては、 例えば、 ト リ フ ルォロ酢酸 法、 メ タ ンスルホ ン酸法、 ト リ フルォ ロ メ タ ンスルホ ン 酸法、 フ ッ 化水素法、 液体ア ンモニアナ ト リ ウ ム法、 接 触還元法、 アルカ リ けん化法な ど既知の手法が挙げ られ る  Methods for removing protecting groups include, for example, the trifluoroacetic acid method, the methansulphonic acid method, the trifluoromethansulphonic acid method, the hydrogen fluoride method, and the liquid ammonium sodium method. Well-known methods such as the method, contact reduction method, and alkaline saponification method.
本発明によ って製造さ れるペプチ ド類の精製は、 例え ばイ オ ン交換樹脂、 分配ク ロマ ト グラ フ ィ ー、 ゲル ク ロ マ ト グラ フ ィ 一、 逆相型液体ク ロマ ト グラ フ ィ ーな どの ベプチ ド化学の分野で通常用い られる方法を単独にま た は組み合わせて用いる こ と によ り 行う こ とができ る。 本発明の ヒ ト 由来神経栄養べプチ ド及び神経栄養ぺプ チ ド誘導体は神経細胞の分化成熟を調節する作用を有す る。 すなわち、 コ リ ン系神経である中隔中心核の組織の アセチル コ リ ン合成を促進する。 生物学的活性の測定は 小鹿幸生ら （薬物 · 精神 ， 行動、 7， 4 4 7 ( 1 9 8 7 ) ) の方法によ り、 行う こ とができ る。 Purification of the peptides produced according to the present invention can be performed, for example, by ion exchange resin, distribution chromatography, gel chromatography, reversed-phase liquid chromatography. It can be carried out by using methods commonly used in the field of peptide chemistry such as graphite, alone or in combination. The human-derived neurotrophic peptide and neurotrophic peptide derivative of the present invention have an action of regulating the differentiation and maturation of nerve cells. That is, it promotes acetylcholine synthesis in tissues of the central septum, which is a cholinergic nerve. The biological activity can be measured by the method of Yukio Ogika et al. (Drugs, Mind, and Behavior, 7,447 (1989)).
本発明の ヒ ト由来神経栄養べプチ ド及び神経栄養ぺプ チ ド誘導体は、 前記のよ う な ヒ ト由来神経栄養べプチ ド、 神経栄養べプチ ド誘導体またはその塩を有効成分とする ものであ り、 神経変性疾患治療剤、 抗痴呆剤 と して有用 である。 こ こ で神経変性疾患とは、 神経細胞が萎縮ある いは脱落する病気であ り、 た とえばアルツハイマー病、 アルツハイマー型老年痴呆症、 筋萎縮性側索硬化症、 パ —キ ン ソ ン氏病等が挙げられる。  The human-derived neurotrophic peptide and the neurotrophic peptide derivative of the present invention comprise the above-mentioned human-derived neurotrophic peptide, neurotrophic peptide derivative or salt thereof as an active ingredient. It is useful as a therapeutic agent for neurodegenerative diseases and an anti-dementia agent. Here, a neurodegenerative disease is a disease in which nerve cells atrophy or fall off. For example, Alzheimer's disease, Alzheimer's senile dementia, amyotrophic lateral sclerosis, and Parkinson Disease and the like.
また痴呆と しては、 アルツハイ マー型痴呆、 パーキン ソ ン痴呆、 脳血管性痴呆等が挙げられる。  Examples of dementia include Alzheimer's dementia, Parkinson's dementia, and cerebrovascular dementia.
本発明化合物を投与される動物は と く に制限されず、 ヒ トのみな らず、 例えばマウス、 ラ ッ ト、 ィ ヌ、 ゥ シ、 ゥマ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥサギ、 ブ夕等の各種哺乳動物が 対象となる。  The animals to which the compound of the present invention is administered are not particularly limited, and include not only humans but also mice, rats, dogs, puppies, puppies, goats, sheep, puppies, etc. Various mammals are targeted.
これらの動物およびヒ 卜への投与は通常の投与経路、 例えば経口、 筋肉内、 静脈内、 皮下、 腹腔内、 鼻腔内お よび脳内投与によ り行う こ とができ る。 投与量および投 与回数は動物種、 投与経路、 症状の程度、 体重等によ つ て異な り特に限定されないが、 ヒ ト においては、 通常成 人 1 日 あた り約 ト // g〜 1 gを 1 日 1 回 も し く はそれ以 上の回数で投与される。 投与剤形と しては、 例えば散剤 細粒剤、 顆粒剤、 錠剤、 カ プセ ル剤、 坐剤、 注射剤、 経 鼻剤な どが挙げられる。 製剤化の際は、 通常の製剤担体 を用い、 常法によ り製造する。 即ち、 経口用製剤を調製 する場合は、 主薬に賦形剤、 さ らに必要に応じて結合剤 崩壊剤、 滑沢剤、 着色剤な どを加えた後、 常法によ り錠 剤、 顆粒剤、 散剤、 カ プセ ル剤な どとする。 注射剤を調 製する場合は、 必要によ り p H調整剤、 緩衝剤、 安定化 剤、 可溶化剤な どを添加 し、 常法によ り注射剤とする。 Administration to these animals and humans can be via the usual routes of administration, for example, oral, intramuscular, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal and intracerebral administration. The dose and frequency of administration vary depending on the animal species, administration route, degree of symptoms, body weight, etc., and are not particularly limited. About g / g to 1 g / day is administered once or more times a day. Examples of the dosage form include powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suppositories, injections, nasal drops and the like. At the time of formulation, it is manufactured by a usual method using a usual formulation carrier. That is, when preparing an oral preparation, an excipient and, if necessary, a binder disintegrant, a lubricant, a coloring agent, and the like are added to the active substance, and then tablets and tablets are prepared in a conventional manner. Granules, powders, capsules, etc. When preparing an injection, a pH adjuster, a buffer, a stabilizing agent, a solubilizing agent, etc. are added as needed, and the injection is prepared by an ordinary method.
本明細書においては、 ア ミ ノ酸、 保護基、 活性基、 溶 媒等について、 I U P A C — I U B に基づ く 略号および 当該分野における慣用略号で表示する場合があ り、 それ らを例示する と次の通りである。  In the present specification, amino acids, protecting groups, active groups, solvents, and the like may be indicated by abbreviations based on IUPAC-IUB and commonly used abbreviations in the relevant field. It is as follows.
ァ ミ ノ 酸残基に対する略号は以下の通りである。  Abbreviations for amino acid residues are as follows.
略号 名称  Abbreviation Name
A s p ァ スパラギン酸  A sp a Spartic acid
G £ y グ リ シ ン  G £ y Glycine
L y s リ ジ ン  Lys resin
L e u ロ イ シ ン  Leu Loisin
P r o プ ロ リ ン  P ro Prolin
S e r セ リ ン  Ser Serine
V a β バ リ ン  V a β valine
T r p ト リ ブ ト フ ァ ン  Trp Trib fan
A £ a ァ ラ ニ ン A s x ァルノ、。ラ ギ ン ま たはアルノ、。ラギン酸A £ a A sx Arno ,. Lagin or Arno. Laginic acid
G β x グルタ ミ ン ま たは グル夕 ミ ン酸G β x Glutamin or Glutamate
M e L e u N— メ チノレロ イ シ ン MeLeuN—Metinoreroisin
M e 2 L e u N , N— ジ メ チノレロ イ シ ン  M e 2 L e u N, N—
M e 3 L e u N , N , N— ト リ メ チルロ イ シ ン M e 3 L e u N, N, N— Trimethylylloisine
A L e υ N—ア ミ ジノ ロ イ シ ン A Le υ N—Amidinoloisine
M e 2 S e r N， N — ジ メ チルセ リ ン  Me2SerN, N — dimethylserine
M e 3 S e r N , N , N— ト リ メ チルセ リ ン Me 3 Ser N, N, N—trimethylseline
A c - S e r N—ァセチルセ リ ン A c-S er N—Acetylserine
特に断らない限 り、 本明細書で接頭辞 L無 しで命合さ れている ァ ミ ノ 酸残基は天然に生ずる絶対立体配置 に 該当する。  Unless otherwise specified, amino acid residues specified herein without the prefix L correspond to the naturally occurring absolute configuration.
他の略号は次の通 り であ る。  Other abbreviations are as follows:
略号 名称  Abbreviation Name
B 0 c t 一 ブチルォキシカ ルボニル  B 0 ct i-Butyloxycarbonyl
0 c H e X シ ク ロへキシルエステル  0 c He X Cyclohexyl ester
z £ ベ ン ジル  z £ Benzil
D C C ジ シ ク ロへキシルカ ルボジィ ミ ド D M F ジ メ チルホルムア ミ ド  D C C Dicyclohexylka rubodiimide DMF Dimethylformamide
T F A ト リ フ ルォ ロ酢酸  TFA Trifluoroacetic acid
T E A ト リ ェチルァ ミ ン  T E A Triethylamine
H 0 B t 1 ー ヒ ドロキシベン ゾ ト リ ァ ゾ一ル P T C フ エ ニノレチォカ ルノく ミ ル  H 0 B t 1 ー Hydroxybenzotriazole PTC C
( B o c ) 2 〇 ジ t 一 プチルジカ ルボナー ト  (B o c) 2 〇
B z ベ ン ゾィ ル A d a m ァ ダマ ンチル B z Benzol A dam ダ
Z ベ ン ジルォキ シカ ルボ二ル  Z Ben Ziroki Shika Reborn
C £ Z 4 — ク ロ 口べ ン ジルォキ シカ ルボ二 ル  C £ Z 4 — Black lip
E D C 1 ーェチノレ 一 3 — ( 3 — ジ メ チルァ ミ ノ プロ ピル） 一 カ ルボジイ ミ ド E D C 1-1-3-(3-dimethylaminopropyl) 1 carbodiimide
N M P 1 — メ チノレ一 2 — ピロ リ ジノ ン N M N — メ チルモルホ リ ン N M P 1 — Methinol 2 — Pyrrolidinone N M N — Methyl morpholine
M e 0 H メ タ ノ ール  M e 0 H Metanor
E t 0 H エタ ノ ール  E t 0 H Ethanol
A c 0 E t 酢酸ェチル  A c 0 E t Ethyl acetate
I B C F イ ソ ブチル ク ロ 口 ホー メ ー ト 以下、 実施例を挙げて本発明をさ らに詳細に説明する が、 本発明はこ れらの実施例に よ り なん ら限定される も のではない  The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, which should not be construed as limiting the scope of the present invention. Absent
実施例 1 Example 1
ラ ッ ト海馬由来神経栄養べプチ ドに対する ゥサギポ リ ク ロ ーナル抗体の調製  Preparation of Persian Polyclonal Antibodies to Rat Hippocampus-Derived Neurotrophins
配列番号 ： 1 7 のア ミ ノ 酸配列か らなる ラ ッ ト H C N P に対する ゥサギポ リ ク ロ ーナル抗体を作製 した。 以下 にその実験方法について記述する （小川 和朗等 ： " 組 織細胞化学の技術、 ホルモ ン と神経伝達物質 " 、 朝倉書 店、 1 9 8 6 . ) o  A Persian polyclonal antibody against rat HCNP consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 was prepared. The experimental method is described below (Kazuo Ogawa, et al .: “Technology of tissue cytochemistry, hormons and neurotransmitters”, Asakura Shoten, 1989.)
配列番号 ： 1 7 のア ミ ノ 酸配列か らなる合成オ リ ゴぺ プチ ド 3 m と ゥ シ血清アルブ ミ ン 1 0 m を 2 の 0 . 1 M酢酸ア ンモニゥ 厶 （ p H 7 . 0 ) に溶力、 し、 0 . 0 2 Mのグルタルアルデヒ ドを 1 . 3 加え、 室温で 5 時間 撹拌する。 溶液を H 2 0に対して一晩透析した後、 凍結 乾燥を行い約 1 0 mgの複合体タ ンパク質を回収した。 SEQ ID NO: 3 Synthetic oligopeptide consisting of the amino acid sequence of 17 and 10 μm of serum serum albumin were added to 0.1 Solvent was added to ammonium acetate (pH 7.0), and 1.3 M glutaraldehyde was added, followed by stirring at room temperature for 5 hours. After the solution was dialyzed overnight against H 2 0, it was recovered complex protein of about 1 0 mg and lyophilized.
1 . 5 mgの複合体タ ンパク質を 1 . 5 の生理食塩水 に溶カヽし、 1 . 5 7¾ の Freundの complete ad juvant をカ卩 え、 ェマルジ ヨ ン と した。  1.5 mg of the complex protein was dissolved in 1.5 physiological saline, and 1.57 ¾ of Freund's complete ad juvant was removed to obtain an emulsion.
3 羽のゥサギを用いて、 1 羽当た り 0 . 2 5 — 0 . 5 mgの複合体夕 ンパク質を含むァ ジュバン トで感作 した。 感作方法は、 ゥサギ背部皮下 （ 1 0 cm X 1 0 cm ) 当た り 約 5 0 ケ所にアジュバン トを分散させ、 2 週間毎に感作 を繰り返した。 5 回の感作が終了 した後、 1 0 日後に頸 動脈よ り採血し、 4 °Cでー晚放置して血べいを沈降させ、 3 0 0 0 r p mで遠心を行う こ とに よ っ て、 上清を回収 し抗体溶液と した。 3 羽のゥサギよ り得られた各々 の抗 体を A b — 1 、 2 及び 3 と した。 何れの抗体も同様の力 価を有していた （実施例 3 ) 。  Three puppies were sensitized with an adjuvant containing 0.25-0.5 mg of complex protein per bird. The sensitization was performed by dispersing an adjuvant at approximately 50 places per subcutaneous (10 cm x 10 cm) on the back of the egret, and sensitization was repeated every two weeks. After 5 sensitizations, 10 days later, blood is collected from the carotid artery, left at 4 ° C to sediment the blood cave, and centrifuged at 300 rpm. Thus, the supernatant was recovered and used as an antibody solution. The antibodies obtained from the three egrets were designated Ab-1, 2, and 3, respectively. All antibodies had similar titers (Example 3).
実施例 2 Example 2
プローブの作製  Fabrication of probe
1 1 ア ミ ノ 酸よ り成る ラ ッ ト H C N Pのア ミ ノ 酸配列 のう ち、 A s p — I e — S e r — G n — T r p — A £ a で示される中央部の 6 個のァ ミ ノ 酸配列に基づいて 1 7個連続するオ リ ゴ ヌ ク レオチ ドを合成した （第 1 図） 。 合成は S e r残基の部位で 3 種のプローブに分け プローブの組み合わせ数が各々 2 4 通 り にな り る よ う に した。 なお、 第 1 図の配列に於いて、 プロ ーブの 5 ' 末 端か ら 6位の ヌ ク レ オチ ドは d Tおよび d Cを等量含む 混合物であ る こ とを示す。 Asp--Ie--Ser--Gn--Trp--Six amino acids in the center of the amino acid sequence of the rat HCNP consisting of 1 amino acid 17 consecutive oligonucleotides were synthesized based on the amino acid sequence (Fig. 1). The synthesis was divided into three types of probes at the Ser residue site so that the number of probe combinations was 24 each. did. In the sequence shown in FIG. 1, the nucleotide at position 6 from the 5 'end of the probe is a mixture containing equal amounts of dT and dC.
次に、 上記ラ ッ ト H C N Pのア ミ ノ 酸配列の C末端側 のプロ ーブを合成する為、 G n — T r p — A ^ a — G £ y - P r o — L e uで示さ れる C末側の 6個のア ミ ノ 酸配列に基づいて 1 6個の連続するオ リ ゴ ヌ ク レオチ ド を合成 した。 C末端側のプロ ーブは 2 5 6通 り の組み合 わせか らな る 1 種類を合成 した （第 1 図） 。 .  Next, in order to synthesize a probe at the C-terminal side of the amino acid sequence of the above-mentioned rat HCNP, Gn-Trp-A ^ a-G £ y-Pro-Leu Based on the terminal six amino acid sequences, 16 consecutive oligonucleotides were synthesized. One C-terminal probe consisting of 256 combinations was synthesized (Fig. 1). .
なお、 第 1 図に示されたプロ ーブの塩基配列はァ ミ ノ 酸配列か ら予想された ヌ ク レオチ ド配列の逆鎖の配列を 有する。 何れのオ リ ゴ ヌ ク レオチ ド もアプラ イ ドバイ オ システムズ社製の D N A合成機 （DNA Synthesizer Mode 1 3 8 1 A ) を用いて合成さ れた。 又、 合成 D N Aの精 製は〇 P Cカ ー ト リ ッ ジ （アプラ イ ドバイ オ システムズ 社製） を用いて行っ た。  In addition, the nucleotide sequence of the probe shown in FIG. 1 has a sequence opposite to that of the nucleotide sequence predicted from the amino acid sequence. All of the oligonucleotides were synthesized using a DNA synthesizer (DNA Synthesizer Mode 1381A) manufactured by Applied Biosystems. The purified DNA was purified using a PC cartridge (available from Applied Biosystems).
オ リ ゴヌ ク レオチ ドの 32 Pに よ る標識は、 6 7 m M T r i s - H C ( p H 8. 0 ) 、 1 7 m M yS— メ ル カ プ トエタ ノ ール、 l O mM M g C 2 の反応組成液 1 0 〃 の中に l 〃 gの合成オ リ ゴ ヌ ク レオチ ド、 5 0 〃 C i の 〔 γ — 32P〕 A T P (アマ シ ャ ム社製、 P B 1 0 2 1 8、 l O m C i ム 、 5 0 0 0 C i /mm o ) 及び l O u n i t s T 4 ポ リ ヌ ク レオチ ドキナーゼを 加えて 3 7 °Cで 3 0分間イ ンキ ュ ベー ト後、 6 5 °Cで 1 0分間加熱 して反応を停止 し、 T E溶液 （ 1 0 mM T r i s - H C ^ ( p H 7 . 5 ) 、 1 m M E D T A ) で 平衡化 した フ ア ルマ シア社製の P D — 1 0 カ ラ ムを用レ、 てゲル濾過を行い余剰の ヌ ク レ オチ ドを除去 した。 プロ —ブの比活性は、 約 2 X 1 0 7 c p m / / g であ っ た。 実施例 3 Oligonucleotide labeling with 32 P was 67 mM MTris-HC (pH 8.0), 17 mM MyS—mercaptoethanol, lO mM M g C reaction composition solution 1 2 0 〃 l in 〃 g synthetic Oh Li Gore j click Reochi de of, 5 0 〃 C i [gamma - 32 P] ATP (flax sheet catcher arm Ltd., PB 1 0 (2,18, lOmCim, 50,000Ci / mmo) and lO units T4 After incubating at 37 ° C for 30 minutes with addition of polynucleotide kinase The reaction was stopped by heating at 65 ° C for 10 minutes, and the TE solution (10 mM T Use a Pharmacia PD-10 equilibrated with ris-HC ^ (pH 7.5), 1mM EDTA), gel filtration, and use excess nucleotides for gel filtration. Was removed. Pro - The specific activity of the probe is about 2 X 1 0 7 cpm / / g was Tsu der. Example 3
ラ ッ ト H C N P の前駆体タ ンパ ク質の検出 と精製  Detection and purification of rat HCNP precursor protein
実施例 1 で示された よ う に 1 1 ア ミ ノ 酸よ り な る ラ ッ ト H C N P に対する 3 種の抗体を作製 した。 そ こ でこ れ ら抗体に対 して反応性を示す夕 ンパ ク質の検出をウ ェ ス タ ンプロ テ ィ ン グ法によ り 行っ た。  As shown in Example 1, three kinds of antibodies against rat HCNP consisting of 11-amino acid were prepared. Therefore, proteins showing reactivity with these antibodies were detected by the Western protein- ing method.
ラ ッ ト脳に氷冷 した P B S ( p H 7 . 2 ) 溶液を加え、 ホモゲナイ ズ した後、 1 0 0 0 0 X g で 3 0 分間遠心 し た後上清を集め 1 4 も し く は 1 6 %の S D S —ポ リ ア ク リ ルァ ミ ドゲル電気泳動を行っ た （ U. K. Laemmli： Nature, 2 2 7 ， 6 8 0 ， 1 9 7 0 ) 。 ィ モ ビ ロ ン P V D F フ ィ ル 夕 一 （ ミ リ ポア社製） に泳動 されたタ ンパク質を電気 的に転写させた （ T. Manabe et al. ： Anal . Bi ochem. , 1 4 3 ， 3 9 ， 1 9 8 4 ) 。 転写条件は 2 5 m M T r i s - H C £ ( p H 8 . 3 ) 、 1 9 2 m Mグ リ シ ン、 0 . 0 2 % S D S Zメ タ ノ ール （ 8 0 / 2 0 ) のブロ ッ テ イ ン グ用緩衝液を用い、 7 0 V、 4 時間通電 して行っ た。 フ ィ ルタ ーを T B S ( 2 0 m T r i s - H C ( p H 7 . 5 ) 、 1 5 0 m N a C ^ ) で洗浄 し、 3 %ゲラ チ ン一 T B S溶液で室温 1 時間イ ンキ ュ ベー ト してタ ン パ ク質の吸着 していない膜面をゲラ チ ンでブロ ッ ク した。 T B Sで振と う 洗浄 した後、 1 %ゲラチ ン一 T B Sで希 釈 した一次抗体 （ 5 0 0 倍希釈） と フ ィ ル タ ー に吸着 し たタ ンパク質を室温で 4 時間反応させ、 T一 P B S ( 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 , T B S ) で 5 分間ずつ、 3 回振 と う洗浄した。 After adding ice-cold PBS (pH 7.2) solution to the rat brain, homogenizing, centrifuging at 100,000 Xg for 30 minutes, collecting the supernatant, or adding 14 or 16% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis was performed (UK Laemmli: Nature, 227, 680, 1970). The proteins electrophoresed on the immobilon PVDF file Yuichi (Millipore) were electrically transferred (T. Manabe et al .: Anal. Biochem., 144, 39, 1984). The transfer conditions were 25 mM MT ris-HC £ (pH 8.3), 192 mM Glycine, and 0.02% SDSZ methanol (80/20) blot. The test was carried out by applying a voltage of 70 V for 4 hours using a buffer for tinting. The filter is washed with TBS (20 m Tris-HC (pH 7.5), 150 mN aC ^) and incubated with 3% gelatin-TBS solution for 1 hour at room temperature. The membrane surface on which the protein was not adsorbed was blocked with gelatin. After shaking and washing with TBS, the primary antibody (500-fold dilution) diluted with 1% gelatin-TBS and the protein adsorbed on the filter are reacted at room temperature for 4 hours. The plate was washed three times with one PBS (0.05% Tween 20, TBS) for 5 minutes each.
2 0 0 0 倍希釈 したペルォキシダーゼ標識二次抗体 (アマシ ャ ム社製） を含む 1 %ゲラチ ン一 T B S溶液に フ ィ ルタ一を入れ室温で 2 時間イ ンキュベー ト した。 T 一 T B Sで 1 0 分間 3 回洗浄し、 最後に 2 0 m の メ タ ノ — ノレに 6 0 mg 4 — ク ロ 口 一 1 一 ナ フ ト ー ノレを溶カヽ し、 1 0 の T B S溶液に混合 し、 0 . 0 1 % となる よ う に H 2 02 を加えたペルォキシダーゼ発色液に膜を浸潰 し 発色させた （櫻林 郁之介等 ： " 遺伝子 ， タ ンパク質 実験操作プロ ッ ティ ン グ法" 、 ソ フ トサイ エ ン ス社、 1 9 7 8 ) 。 その結果、 ラ ッ ト脳に存在する分子量 2 3 キロ ダル ト ン のタ ンノ ク質がラ ッ ト H C N P に対する抗 体と反応した。  The filter was added to a 1% gelatin-TBS solution containing a 2000-fold diluted peroxidase-labeled secondary antibody (manufactured by Amersham), and the mixture was incubated at room temperature for 2 hours. Wash with T-TBS three times for 10 minutes, and finally dissolve 60 mg 4 — Chole mouth 11-naphthorn paste in a 20-m methanol-drain, and then add 10 TBS solution. The membrane was immersed in a peroxidase color developing solution to which H202 was added so that the concentration became 0.01%. Tinting Method, Soft Science, Inc., 197 8). As a result, a protein with a molecular weight of 23 kilodaltons present in rat brain reacted with an antibody against rat HCNP.
又、 実施例 1 で示された 3 種のポ リ ク ローナル抗体は、 何れも同様の希釈率で夕 ンパク質の検出が可能であった。  In addition, all three types of polyclonal antibodies shown in Example 1 were able to detect protein at the same dilution ratio.
そこでこ のタ ンパク質のア ミ ノ酸配列を決定する為に、 タ ンパク質の精製を行う こ とに した。 2 0 匹分のラ ッ ト 脳に氷冷した P B S ( p H 7 . 2 ) を加え、 ホモゲナイ ズした後、 遠心上清 3 3 m£の內 2 0 をセフ ア デッ ク ス G — 1 5 0 フ ァ イ ン カ ラ ム （直径 6 cm X 8 4 cm) を用い て 2 0 m M H E P E S緩衝液 （ p H 7 . 2 ) でゲル濾 過を行い、 S D S — ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動に よる ゥ ヱ スタ ンプロ ッ テ イ ン グによ って抗体と反応するTherefore, in order to determine the amino acid sequence of this protein, it was decided to purify the protein. Ice-cold PBS (pH 7.2) was added to 20 rat brains, homogenized, and then centrifuged supernatant was centrifuged at a volume of 33 mL for about 20 μL in Sephadex G—15. Gel filtration with 20 m MHEPES buffer (pH 7.2) using a fine column (diameter 6 cm x 84 cm). SDS—Polyacrylamide gel electrophoresis 反 応 反 応 Reacts with antibody by stamping
5 よ り なる分画を集めた。 その内 1 を高速液体 ク ロマ ト グラ フ ィ 一にかけタ ンパク質の精製を行った。 ノくィ ォラ ッ ド社製の R P — 3 0 4 (直径 4 . 6 mm X 2 5 0 mm) のカ ラ ムを用い、 0 . 1 % ト リ フルォロ酢酸 （ T F A ) —ァセ トニ ト リ ル系の溶媒でク ロマ ト グラ フ ィ ー を行った と こ ろ、 約 3 8 〜 4 0 のァセ トニ ト リ ル濃度 で目的の夕 ンパク質は溶出された。 Five more fractions were collected. One of them was subjected to high-performance liquid chromatography to purify the protein. 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) -acetonitn using a RP-304 (4.6 mm diameter x 250 mm diameter) column manufactured by Noradrad. When chromatographing was carried out with a lilyl-based solvent, the desired protein was eluted at an acetonitrile concentration of about 38 to 40.
実施例 4 Example 4
ラ ッ ト海馬 c D N Aライ ブラ リ 一の構築  Rat hippocampus c DNA Library construction
I ) m R N Aの調製  I) Preparation of mRNA
幼若ラ ッ 卜 よ り摘出された海馬組織 （ 3 0 匹分のラ ッ ト海馬 ； 湿重量約 2 g ) からの m R N Aの単離は基本的 に常法に従った。 2 mgの凍結組織を 4 Mグァニジ ン溶液 ( 4 Mグァニジ ンチオシァ ネー ト、 1 0 0 m M T r i s - H C ( p H 7. 5 ) 、 1 % yS— メ ルカプ トエタ ノ ール） の存在下でホモゲナイザーを用いて室温で速や かに破砕 した。 次いで、 高分子染色体 D N Aを物理的に 破壊するために 1 8 Gの注射針を装填した注射器を用い 1 0 回吸入排出を繰り返 した。 上記の如 く 処理された懸 濁液に最終的に 0 . 5 % となる よ う に 1 0 %ザルコ シル 硫酸ナ ト リ ウム溶液を加え、 室温で 2 0 0 0 r p m、 5 分間遠心し上清を集め、 細胞に由来する残渣を除いた。 ベッ クマ ン S W 6 5 T i ロ ータ ー用の予め の 5. 7 M塩化セ シウム、 4 mM E D T Aを入れたポ リ ア ロマ —製のチュ ーブに上記グァニジ ン溶液 3 を静かに重層 し、 4 5 0 0 0 r p mで 1 1 時間、 2 0 °Cで遠心した後、 ペ レ ッ トを 1 0 mM T r i s — H C ^ ( ρ H 7. 5 ) 、 5 m M E D T A. 1 % S D Sに溶解した。 R N A溶液 に 3 M s o d i u m a c e t a t e を l Z l O容量 加え、 2. 2倍容量のエタ ノ ールを加え、 — 2 0 °Cで全 R N Aを沈澱せしめた。 数回のエタ ノ ール沈澱によ って 精製 し、 約 2 nigの全 R N Aが得られた。 Isolation of mRNA from hippocampal tissue (30 rat hippocampus; wet weight of about 2 g) extracted from the immature rat was performed in accordance with a standard method. 2 mg of frozen tissue in the presence of 4 M guanidine solution (4 M guanidine thionate, 100 mM MT ris-HC (pH 7.5), 1% yS—mercaptoethanol) Crushed quickly at room temperature using a homogenizer. Next, inhalation and ejection were repeated 10 times using a syringe equipped with an 18 G injection needle in order to physically destroy the high molecular chromosomal DNA. To the suspension treated as above, add 10% sodium sarcosyl sulfate solution to a final concentration of 0.5%, and centrifuge at room temperature at 200 rpm for 5 minutes. The supernatant was collected to remove cell-derived residues. Preliminary 5.7 for Beckman SW 65 Ti rotor The above guanidine solution 3 is gently overlaid on a poly-L-tube containing M cesium chloride and 4 mM EDTA, and centrifuged at 450 rpm for 11 hours at 20 ° C. After that, the pellet was dissolved in 10 mM Tris-HC ^ (ρH7.5), 5 mM MEDT A. 1% SDS. To the RNA solution, 3 M sodiumacetate was added in an amount of lZ10 O, 2.2 volumes of ethanol was added, and the total RNA was precipitated at −20 ° C. Purification by several ethanol precipitations yielded approximately 2 nig total RNA.
全 R N Aからポ リ （A ) m R N Aをオ リ ゴ （ d T) セ ルロースカ ラムを用いて精製する手順は以下の通りであ る。 上記エタ ノ ール沈澱で純化された全 R N A 1 . 5 mg を 2 の T E溶液に溶かし、 7 0 °Cで 5分間加熱後、 急 冷 し、 1 0 mM T r i s — H C ( ρ H 7. 4 ) 、 1· m M E D T A. 3 M N a C を 1 Z 5容量加え、 予 め 1 0 mM T r i s - H C ( p H 7. 4 ) 、 1 m M The procedure for purifying poly (A) mRNA from total RNA using oligo (dT) cellulose column is as follows. 1.5 mg of the total RNA purified by ethanol precipitation was dissolved in a TE solution of 2, heated at 70 ° C for 5 minutes, rapidly cooled, and then cooled to 10 mM Tris-HC (ρH7. 4), 1m MEDT A. 3 MNaC was added to 5 volumes of 1Z, and 10 mM Tris-HC (pH 7.4), 1 mM
E D T A. 0. 5 M N a C ^ で平衡化したオ リ ゴ ( d T) セルロ ースカ ラ ム （ 5 ^ ; フ ア ルマ シア社製、 オ リ ゴ （ d T) セルロース T y p e 7 ) に重層 した。 重 力下でサンプルを流し、 ポ リ （ A ) 配列を持った m R N Aがオ リ ゴ （ d T ) に吸着する こ とを利用 してポ リ EDT A. Layered on Oligo (dT) Celluloscalam (5 ^; Oligo (dT) Cellulose Type 7) equilibrated with 0.5 MNaC ^ did. The sample is allowed to flow under gravity, and the poly (A) sequence is used to absorb the poly (A) sequence on the oligo (d T).
( A ) m R N A分子をセルロ ースカ ラムへ集めた。 念の ため、 カ ラ ムを通過した溶液を再度上記のよ う に加熱し 急冷後、 同 じカ ラ ムにアプラ イ した。 カ ラ ム容量の 1 0 倍容の 1 0 m M T r i s - H C ( p H 7. 4 ) 、 1 m M E D T A、 0 . 5 M N a C でカ ラ ムを洗浄し た後、 6 倍容の 1 O m M T r i s - H C £ ( p H 7 . 4 ) 、 1 m M E D T A、 0 . 1 m M N a C ^ で更に カ ラムを洗浄し、 ： 0 °Cで保温した T E溶液でポ リ （ A ) m R N Aを溶出 した。 こ の溶出液を再度 7 0 でで 1 0 分間加熱し、 上記のカ ラム操作に準じて 2 回目 のオ リ ゴ （ d T ) セルロースカ ラ ム （ 2 ) によ り ク ロマ ト グ ラ フ ィ ーを行った。 最終的に得られたポ リ （ A ) m R N A量は、 1 0 3 〃 gであった。 (A) mRNA molecules were collected in cellulosic columns. As a precautionary measure, the solution that passed through the column was heated again as described above, quenched, and then applied to the same column. 10 times the column capacity 10 m MT ris-HC (pH 7.4), 1 Wash the column with 0.5 M NaDTA, 0.5 M NaDTA, then add 6 volumes of 1 Om MT ris-HC £ (pH 7.4), 1 mM MEDTA, 0.1 mM NaC. The column was further washed with ^, and the poly (A) mRNA was eluted with a TE solution kept at 0 ° C. The eluate was heated again at 70 for 10 minutes, and chromatographed with a second oligo (dT) cellulose column (2) according to the above column operation. I did it. The amount of poly (A) mRNA finally obtained was 103 μg.
I ) ラ ッ ト海馬組織由来 c D N Aライブラ リ ーの作製 上記のよ う に精製されたポ リ （ A ) m R N Aから c D N Aを調製する際には、 オ リ ゴ （ d T ) プライマー及び ラ ンダムプライマ ーを用いて合成を行った。 2 種類のプ ライマーを用いた各々 の一本鎖 c D N Aの合成法には幾 分の違いがみられるので、 それぞれの実験方法について 詳細に述べる こ とにする。  I) Preparation of rat hippocampal tissue-derived cDNA library When cDNA is prepared from the poly (A) mRNA purified as described above, an oligo (dT) primer and a library are prepared. The synthesis was performed using a random primer. Since there are some differences in the method of synthesizing single-stranded cDNA using the two types of primers, each experimental method will be described in detail.
( 1 ) オ リ ゴ （ d T ) プラ イマ ーを用いた一本鎖 c D N Aの合  (1) Synthesis of single-stranded cDNA using oligo (dT) primer
先ず、 オ リ ゴ （ d T ) プライマ 一を用いた c D N Aの 合成に関 しては次の緒操作によ って行った。 上記の如 く して調製されたラ ッ ト海馬組織由来ポ リ （ A ) m R N A 8 gをジェチル ピロ カ ーボネー ト処理によ り R N a s e を失活させた 2 0 〃 ^ の H 2 0に溶力、 し、 7 0 °Cで 1 0 分間加熱後、 氷中にて冷却 した。 First, cDNA synthesis using the oligo (dT) primer was performed by the following procedure. 2 0 〃 ^ of H 2 0 which was inactivated by Ri RN ase the rat hippocampal tissue-derived Po Li (A) m RNA 8 g, which is prepared rather than the above-mentioned如to Jechiru pyro mosquito Bone door processing The solution was heated at 70 ° C for 10 minutes, and then cooled on ice.
次に、 1 0 〃 _ί の 5 X R T B u f f e r ( 2 5 0 m M T r i s - C β ( p H 7 . 5 ) 、 3 7 5 m M K C £ , 1 5 m M M g C ^ 2 ) を加え、 4 〃 の ヒ ト胎 盤 リ ボ ヌ ク レ アーゼイ ン ヒ ビタ ー （ 2 0 υ n i t s / Next, the 10 XRTB buffer of 10 〃 _ί (2 50 m MTris-Cβ (pH 7.5), 37.5 mMKC £, 15 mmMgC ^ 2 ), and added a 4〃 human placenta ribonuclease inhibitor ( 2 0 υ nits /
、 アマ シ ャ ム社製） 、 2 . 5 ί _β の ヌ ク レ オチ ド溶液 , Amersham), 2.5） _β nucleotide solution
(各 1 O m Mの d A T P、 d G T P、 d T T P及び d C T P を含む溶液） 、 オ リ ゴ （ d T ) 1 2-1 8 ( 1 0 0 u g を 5 〃 ^ 加え、 撹拌する。 更に、 5 z C i ( 5 i ) の 〔 一 32 P 〕 d C T P (アマ シ ャ ム社製、 P B(D ATP for each 1 O m M, d GTP, a solution containing d TTP and d CTP), Oh Li Gore (d T) 1 2 -. 1 8 a (1 0 0 ug 5 〃 ^ added and stirred further , 5 z C i (5 i ) of [one 32 P] d CTP (flax sheet catcher arm Ltd., PB
1 0 2 0 5 、 1 0 m C i / mi , 3 0 0 0 C i /m m o ) 及び 2 5 O m Mジチオス レ ィ ト ールを 1 〃 加え、 最終 的に H 2 0で 4 9 と した。 最後に逆転写酵素 1 0 2 0 5, 1 0 m C i / mi, 3 0 0 0 C i / mmo) and 2 5 O m M Jichiosu Le I preparative Lumpur 1 〃 added, and finally H 2 0 at 4 9 did. Finally, reverse transcriptase
( M o — M L V由来、 2 0 0 u n i t s / ιι £ ^ べセス ダ · リ サーチ · ラ ボラ ト リ ーズ社製） を 1 〃 加え、 3 7 °Cで 1 時間加温後、 反応チ ュ ーブを氷中に戻 し一本鎖 c D N Aの合成を終了 した。  (Mo-MLV-derived, 200 units / ιι £ ^ manufactured by Bethesda Research Laboratories, Inc.), add 1 〃, heat at 37 ° C for 1 hour, and react. The tube was returned to ice to complete the synthesis of single-stranded cDNA.
( 2 ) ラ ン ダムプラ イ マ -を た一本 c D N Aの 合成  (2) Synthesis of random DNA-produced cDNA
上記のオ リ ゴ （ d T ) プラ イ マーを用いた場合 と同様 に 8 〃 ^ の H 2 〇 に溶か したポ リ （ A ) m R N A 8 g を加熱処理後、 5 x F i r s t S t r a n d B u f f e r ( 2 5 O m M T r i s — H C ( p H 8 . 3 ) 、 5 O m M M g C 2 、 5 O m Mジチオス レ ィ ト ール） を 1 6 〃 、 8 O m M ピロ リ ン酸ナ ト リ ウ ム溶液を 4 〃 アマ シ ャ ム社製の 2 0 u n i t s / / ^ の ヒ ト胎盤 リ ボ ヌ ク レ ア ーゼイ ン ヒ ビタ ーを 4 〃 _ί 、 各 1 O m Mの d A T P、 d G T P、 d T T P及び d C T P を含むデォ キ シ ヌ ク レ オチ ド三 リ ン酸混液を 5 、 0 . 0 2 0 D 〃 のラ ン ダムへキサ ヌ ク レオチ ドプラ イ マ一を 4 a £ ヽ 5 / C i ( 5 〃 _β ) の 〔 一 32 P〕 d C T P (アマ シ ャ ム社製、 P B 1 0 2 0 5 、 1 0 m C i / m&^ 3 0 0 O C i Zm m o ^ ) を加え、 H 2 0で最終的に 7 2 z と した。 最後に逆転写酵素 （ A M V由来、 2 0 As in the case of using the above-mentioned oligo (dT) primer, 8 g of poly (A) mRNA dissolved in 8 〃 ^ of H 2加熱 was heat-treated and then treated with 5 x First Strand. Buffer (25 Om MT ris — HC (pH 8.3), 5 Om MM g C 2 , 5 OmM dithiothreitol) was added to 16〃 and 8 OmM pyrroline. Acidic sodium solution 4 を Amersham 20 units / / ^ human placenta ribonuclease inhibitor 4 ί_ί, 1 OmM each A mixture of deoxynucleotide triphosphates containing dATP, dGTP, dTTP and dCTP was added to a 5,0,200 D〃 random hexanucleotide primer. the 4 a £ヽ5 / C i (5 〃 _Beta) of [one 32 P] d CTP (flax sheet catcher arm Ltd., PB 1 0 2 0 5, 1 0 m C i / m & ^ 3 0 0 OC i Zm mo ^) was added, and the final value was 72 z with H 20 . Finally, reverse transcriptase (from AMV, 20
υ n i t s / Ά 、 アマ シ ャ ム社製） を 8 〃 ^加え、 4 2 °Cで一時間加温後、 反応チ ュ ーブを氷中に戻し一本鎖 c D N Aの合成を終了 した。 υnits / Ά, manufactured by Amersham) was added for 8 〃 ^, and the mixture was heated at 42 ° C for 1 hour. Then, the reaction tube was returned to ice to terminate the synthesis of single-stranded cDNA.
( 3 ) 二本鎖 c D N Aの合成  (3) Synthesis of double-stranded cDNA
上記のよ う に合成された 1 本鎖 c D M Aを 2 0 m M T r i s — H C （ p H 7 . 5 ) 、 5 m M M g C 2 , 1 0 m M ( H N 4 ) 2 S O 4 、 1 0 0 m M K C £ . 0 . 1 5 m M y5 - A D . 5 0 m M B S A、 4 0 /z M d N T P、 8 . 5 u n i t sゾ 大腸菌 リ ボヌ ク レア一 ゼ H、 2 3 0 υ n i t s ^大腸菌 D N Aポ リ メ ラーゼ I となる様に緩衝液及び酵素を加え、 1 2 °C、 6 0 分間、 次いで 2 2 て、 6 0 分間反応した。 更に、 加えた酵素を 失活させる為、 7 0 。C、 1 0 分間加温 し、 氷中に戻 した。 反応液に 2 u n i t s の大腸菌 D N Aポ リ メ ラ一ゼ I Klenow Fragment を加え、 3 7 °Cで 3 0 分反応後、 続い て 1 6 u n i t s の T 4 D N Aポ リ メ ラ 一ゼを加え、 3 7 DC、 1 5 分間反応させ、 二本鎖 c D N Aの両末端を平 滑化させた。 反応液 1 0 0 当た り、 4 ^ の 0 . 2 5 M E D T A ( p H 7 . 5 ) を加え反応を停止した。 用いた m R N Aから合成された二本鎖 c D N Aの合成率 は、 オ リ ゴ （ d T ) プライ マ一及びラ ンダムプライマ一 を用いた場合、 各々 3 0 %及び 6 5 %であった。 次に合 成された c D N Aをダイ ァゲン社製のキアゲンカ ラムで 精製 した。 The single-stranded cDMA synthesized as described above was subjected to 20 mM MTris—HC (pH 7.5), 5 mm MM g C 2 , 10 mM (HN 4 ) 2 SO 4 , 10 0 m MKC £. 0.15 m My5-AD .50 m MBSA, 40 / z M d NTP, 8.5 units ZO E. coli ribonuclease H, 230 υ nits ^ E. coli DNA A buffer solution and an enzyme were added so as to obtain polymerase I, and the mixture was reacted at 12 ° C for 60 minutes, and then reacted for 22 minutes and 60 minutes. In addition, 70 was added to inactivate the added enzyme. C, Heated for 10 minutes and returned to ice. Add 2 units of E. coli DNA polymerase I Klenow Fragment to the reaction mixture, react at 37 ° C for 30 minutes, and then add 16 units of T4 DNA polymerase and add 3 units. 7 D C, and reacted for 15 minutes, was flat smoothing both ends of the double stranded c DNA. 0.2% of 4 ^ per 100 of the reaction solution 5 MEDTA (pH 7.5) was added to stop the reaction. The synthesis rates of double-stranded cDNA synthesized from the used mRNA were 30% and 65% when Oligo (dT) primer and random primer were used, respectively. Next, the synthesized cDNA was purified using Qiagen column manufactured by Diagen.
キアゲンカ ラムを用いた D N Aの精製法は以下の通 り である。 0 . 4 M N a C 、 5 0 m M M O P S  The purification method of DNA using Qiagen column is as follows. 0.4 M Na C, 50 m M M O P S
( P H 7 . 0 ) 、 1 5 %エタ ノ ールで平衡化したキアゲ ンカ ラ ムに、 予め 0 . 5 M N a C ^、 5 0 m M  (PH 7.0), Qiagen column equilibrated with 15% ethanol was added in advance with 0.5 M NaC ^, 50 mM
M O P S ( p H 7 . 0 ) の濃度に調整された c D N A溶 液をアプライ し、 カ ラムの 1 0 倍容以上の 1 . 0 M  Apply a DNA solution adjusted to the concentration of M O P S (pH 7.0), and apply 10 M or more of 10 M column.
N a C 5 0 m M M O P S ( p H 7 . 0 ) 、 1 5 % エタ ノ ール溶液で洗浄し、 1 . 5 M N a C 、 5 0 m M M O P S ( p H 7 . 5 ) 、 1 5 %エタ ノ ールで D N Aを溶出 した。 溶出液からカ ラムに充填された樹脂を完 全に除去するため、 フ ヱ ノ ールー ク ロ ロホルム処理及び ク ロ 口ホルム処理を行った後、 0 . 8 倍容のイ ソプロ ノく ノ ールを加え、 氷中にて 1 5 分間放置後、 1 5 0 0 0 r p mで 3 0 分間遠心を行っ た。 得られたペレ ツ ト を 0 . 3 M酢酸ナ ト リ ウム溶液に溶解後、 2 . 5 倍容のェタ ノ —ルを加え、 一 8 0 °Cで 1 5 分間放置した。 次いで、 1 5 0 0 0 r p mで 1 0 分間遠心し、 D N Aを回収した。 上記の様に して両末端を平滑化され、 精製された二本 鎖 c D N Aに過剰量の E c o R I ア ダプタ 一 （フ ア ルマ シァ社製及び宝酒造社製） を 2 O mM T r i s — Wash with NaC 50m MMOPS (pH 7.0), 15% ethanol solution, 1.5M NaC, 50m MMOPS (pH 7.5), 15% ethanol The DNA was eluted with Knoll. In order to completely remove the resin filled in the column from the eluate, the solution was subjected to a monochloroform treatment and a black hole form treatment, and then 0.8 times the volume of isopro phenol. Was added and left on ice for 15 minutes, followed by centrifugation at 1500 rpm for 30 minutes. The obtained pellet was dissolved in a 0.3 M sodium acetate solution, 2.5 volumes of ethanol were added, and the mixture was allowed to stand at 180 ° C for 15 minutes. Then, the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to collect DNA. Excessive amounts of EcoRI adapter (Pharma) were added to the purified double-stranded cDNA whose both ends were blunted as described above. 2mM Tris — from Shia and Takara Shuzo
H C _i ( p H 7 ,' 6 ) 、 6 . 7 mMジチオス レ イ ト 一ル、H C _i (pH 7, '6), 6.7 mM dithiothrate,
6 . 7 m M M g C 2 、 1 m M A T P及び 5 0 0 u n i t s T 4 D N A リ ガ一ゼを含む 1 0 0 〃 の反応液で連結させた。 次に、 余剰の E c 0 R I ァ ダプ 夕 一を除 く ため再度キアゲ ン カ ラ ムに よ って精製を行つ た後、 6 7 mM T r i s - H C £ ( p H 8 . 0 ) 、 1The ligation was carried out in a 100 μl reaction mixture containing 6.7 mm Mg C 2 , 1 mM MATP and 500 units T4 DNA ligase. Next, purification was again performed using Qiagen column to remove the excess Ec0RI adapter, and then 67 mM Tris-HC £ (pH 8.0), 1
7 m /3 — メ ゾレカ プ ト エタ ノ ーノレ、 1 0 mM 7 m / 3 — mesocaptoethanol, 10 mM
M g C ^ 2 、 1 m M A T P、 2 0 0 u n i t s Z^の T 4'ポ リ ヌ ク レ オチ ドキナーゼで E c o R I ア ダプタ ー の 5 ' 末端の リ ン酸化を行つ た。 Phosphorylation of the 5 'end of the EcoRI adapter was performed with T4'polynucleotide kinase of MgC ^ 2 , 1 mM MATP, and 200 units Z ^.
得 られた D N Aか ら余剰の A T Pを除き、 又、 長さ の 短い合成 c D N Aを除去する 目的で、 再度キアゲ ン カ ラ ムを用いる こ と に した。 1 . 3 M N a C 、 5 0 m M M O P S ( p H 7. 0 ) 、 1 5 %エタ ノ ールでカ ラ ムを 洗浄する こ と以外、 前述のカ ラ ム操作と同様である。 ς の洗浄条件を用いる こ と に よ って、 余剰の Α Τ Ρ及び約 7 0 0 b p以下の短い c D N Aを除去する こ とが可能で あ Φ 0 In order to remove excess ATP from the obtained DNA and to remove synthetic cDNA having a short length, Qiangen column was used again. Same as the column operation described above, except that the column is washed with 1.3 MNaC, 50 mM MOPS (pH 7.0), and 15% ethanol. I'm on the this using wash conditions of S, Oh enables the arc to remove excess Alpha T [rho and about 7 0 0 bp following short c DNA [Phi 0
こ の様に して精製され.た c D N Aを更に フ エ ノ ールー ク ロ 口 ホルム処理及びエタ ノ ール沈澱に よ って精製濃縮 した後、 最終的な c D N Aラ イ ブラ リ 一 と した。 オ リ ゴ ( d T ) プラ イ マ一及びラ ン ダムプラ イ マーに よ って得 られた c D N A量は、 最終的に各々 2 〃 g及び 1 . 3 g であ つ 十：。 実施例 5 The cDNA purified in this way was further purified and concentrated by phenol micro-hole form treatment and ethanol precipitation to obtain a final cDNA library. . The final amounts of cDNA obtained by the oligo (dT) primer and the random primer were 20 g and 1.3 g, respectively. Example 5
ス ク―リ 一二 ン グ  Schooling
I ) 二本鎖 c'D N Aと ； g t 1 1 ベ ク タ 一 D N Aの連 上記の様に E c 0 R I ア ダプタ 一の付加さ れたニ本鎮 c D N Aを ； I g t 1 1 の E c o R I 切断部位に挿入する ため、 T 4 D N A リ ガーゼによ って連結反応を行っ た。 連結反応の条件は以下の通 りであ る。  I) A sequence of double-stranded c'DNA and gt11 vector-DNA. As described above, the Ec0RI adapter-added double-primed cDNA; Ligation was performed with T4 DNA ligase for insertion into the coRI cleavage site. The conditions of the ligation reaction are as follows.
予め E c o R I で切断後、 大腸菌アルカ リ 性ホス フ ァ ク ーゼで 5 ' 末端の リ ン酸基をはず した ； I g t 1 1 べ ク タ ー D N A ( 2 g ； 6 6 ί m 0 £ ) と二本鎖 c D N A ( 1 6 0 n g ; 約 l O O f m o ) を混合 し、 2 0 mM T r i s — H C ^ ( p H 7. 6 ) 、 6. 7 m M  After cleavage with EcoRI in advance, the 5'-terminal phosphate group was removed with E. coli alkaline phosphatase; Igt11 vector DNA (2 g; 66 ίm 0 £ ) And double-stranded cDNA (160 ng; about 100 fmo) were mixed, and 20 mM Tris—HC ^ (pH 7.6), 6.7 mM
M g C 2 , 6 . 7 m Mジチオス レ イ ト 一ル、 I mM A T P、 5 1 11 1 1 5 の丁 4 D N A リ ガーゼの反応組 成液 （最終容量 ； 1 0 ^ ) で 1 2 °C、 1 晚反応させた。 In a reaction mixture of DNA ligase (final volume: 10 ^) of MgC2, 6.7 mM dithiothreitol, ImM ATP, 5 11 11 15 C, 1 晚 reacted.
I ) イ ン ビ ト ロ ノ、。 ッ ケー ジ ン グ  I) Invitrono. Packaging
上記で得 られた組換え D NAの 1 Z 3 をス ト ラ タ ジ一 ン社製のイ ン ビ ト ロ ノ、。 ッ ケー ジ ン グキ ッ ト （ギガノ、。 ッ ク Iゴ一ル ド） を用いて、 パ ッ ケ ー ジ ン グ し、 フ ァ ー ジ粒 子を得た。 こ れ らの フ ァ ー ジ粒子を用いて得 られる形質 転換体数は、 オ リ ゴ （ d T ) プラ イ マー及びラ ン ダ厶プ ラ イ マ一を用いて合成さ れた c D N A 1 g当た り各々 8 . 8 1 0 7 plaque forming units ( p f u ) 及び 2 5 x 1 0 7 p i uであ っ た。 I ) ラ ッ ト H C N Pに対するポ リ ク ローナル抗体によ る g t 1 1 プ ア—ー ジラ イ ブラ リ 一のス ク リ ーニ ン グ 1Z3 of the recombinant DNA obtained above was used for invitrono, manufactured by Stratagene. Using a packaging kit (Gigano, I. Gold), packaging was performed to obtain phage particles. The number of transformants obtained using these phage particles was the number of cDNAs synthesized using oligo (dT) primers and random primers. g per Ri each 8. 8 1 0 7 plaque forming units (pfu) and 2 5 x 1 0 7 piu was Tsu der. I) Screening of gt11 pooled library with polyclonal antibody against rat HCNP
大腸菌 Y 1 0 9 0宿主と して上記 c D N Aを含むフ ァ — ジラ イ ブラ リ ーを感染させ、 直径 1 5 0腿の寒天培地 のプレー ト 1 0枚に 1 X 1 0 6 個のプラ ー クが出現する よ う にオ リ ゴ （ d T ) 及びラ ンダムプラ イマ ーを用いて 合成された c D N A ク ロー ンを各々 まいた。 プレー トを 4 2 °Cで 2時間培養後、 3 7 °Cで 1 . 5時間培養した。 次に、 予め 2 0 mMイ ソプロ ピル - yS — D—チォガラ ク ト ピラ ノ シ ドで処理したニ ト ロ セルロ ース メ ンブ レ ン フ ィ ルター （ B A 8 5 ； Scheic er & Schuell社製） を形 質転換体をまいた寒天培地上に乗せ、 更に 3 7 °Cで 3. 5時間培養を続けた。 フ ィ ルタ ーを寒天培地よ り静かに はがし、 T— T B S溶液 （ 6 0 mM T r i s - H C £ ( p H 7. 5 ) 、 1 5 0 m M N a C 0 . 0 5 % T w e e n — 2 0 ) でフ ィ ルタ 一を 5分間、 5回洗浄し、 次に T B S — 1 % B S A溶液 （ 6 0 mM T r i s — H C £ ( p H 7. 5 ) 、 1 5 0 m M N a C ^、 1 %ゥ シ血清アルブ ミ ン） にフ ィ ル夕 一を移 し換え、 抗体を反 応させた場合のバ ッ ク グラ ウ ン ドを下げる 目的で、 室温 で 3時間ゆっ く り と振と う し、 フ ィ ルタ ーにゥ シ血清ァ ルブ ミ ンを付着させておいた。 Infect E. coli Y1090 host with the above-mentioned cDNA library containing the above cDNA, and add 1 × 10 6 plates to 10 plates of agar medium with a diameter of 150 thighs. CDNA clones synthesized using Oligo (dT) and random primers were respectively spread so that a mark appeared. The plate was cultured at 42 ° C for 2 hours and then at 37 ° C for 1.5 hours. Next, a nitrulocellulose membrane filter (BA85; manufactured by Scheicer & Schuell) previously treated with 20 mM iso-propyl-yS-D-thiogalactopyranoside Was placed on an agar medium plated with the transformant, and the culture was continued at 37 ° C. for 3.5 hours. Peel the filter gently from the agar medium, and add T-TBS solution (60 mM Tris-HC £ (pH 7.5), 150 mM NaC 0.05% Tween — 2). Wash the filter five times with 0) for 5 minutes, then wash with TBS- 1% BSA solution (60 mM Tris-HC £ (pH 7.5), 150 mM MNaCl, 1% に serum albumin) and shake slowly at room temperature for 3 hours in order to lower the background level when the antibody is reacted. Then, the serum albumin was adhered to the filter.
次に、 5 0 0 倍希釈のラ ッ ト H C N P (配列番号 ： 1 7 ) に対する ポ リ ク ロ一ナル抗体 （ A b — 1 ) を含む T B S — 1 % B S A溶液の中にフ ィ ルターをいれ、 室温 でー晚穏やかに振と う し、 一次抗体と フ ィ ルタ一に固定 されたタ ンパク質を反応させた。 フ ィ ル夕 一を 5 分間 3 回洗浄し、 2 0 0 倍した ピオチ ン化抗ゥサギ 1 g ロバ抗 体 （アマシ ャ ム社製） を含む T B S — 1 % B S A溶液に 入れた。 二次抗体をフ ィ ル夕 一に固定されたタ ンパク質 に結合 した一次抗体と室温で 2 時間反応させ、 T 一 T B Sで 5 分間 3 回洗浄 した後、 2 0 0 倍希釈のス ト レプ ト ア ビジ ン一 ピオチ ン化ペルォキシダーゼ複合体 （アマシ ャ 厶社製） を含む T B S — 1 % B S A溶液に入れ、 室温 で 1 時間反応させた。 第二抗体に結合 したペルォキシダ —ゼ複合体の検出は、 3 mgZOT の 4 一 ク ロ ロ ー 1 一ナフ ト ールを 4 0 、 H 2 0 2 を ί τη 、 1 Μイ ミ ダゾ一ルを 1 に加えた 2 0 0 7 ^の T B S溶液 （ 6 0 m Μ Next, a filter is added to a 500-fold dilution of TBS-1% BSA solution containing a monoclonal antibody (Ab-1) against rat HCNP (SEQ ID NO: 17). , Room temperature Shaking gently allowed the primary antibody to react with the protein immobilized on the filter. The filter was washed three times for 5 minutes and placed in a 1% BSA solution containing 200 g of a biotinylated anti-peacock 1 g donkey antibody (Amersham). After reacting the secondary antibody with the primary antibody bound to the protein immobilized in the filter overnight at room temperature for 2 hours, washing with T-TBS three times for 5 minutes, and then diluting it to a 1: 200 dilution step It was placed in a 1% BSA solution of TBS containing toavidin-piotinylated peroxidase complex (manufactured by Amersham) and reacted at room temperature for 1 hour. The detection of peroxidase-conjugate bound to the second antibody was performed by using 40 mg of 4 mg / mL of NaCl at 3 mgZ OT , ττη for H 2 O 2, ττη, and 1 mg of imidazole. Of 0.007 ^ in TBS (60 m Μ
T r i s - H C ( p H 7 . 5 ) 、 1 5 0 m M T ris-H C (pH 7.5), 150 mm
N a C ^ ) の中にフ ィ ルターを室温で 3 0 分浸すこ とに よ って、 発色させた。 抗体を用いたス ク リ ーニン グの結 果、 オ リ ゴ （ d T ) 及びラ ンダムプライマーを用いて合 成された c D N A ラ イ ブラ リ ーよ り各々 1 2 種及び 1 種 のポジティ ブク ロー ンが得られた。 The color was developed by immersing the filter in NaC ^) at room temperature for 30 minutes. As a result of screening using the antibodies, 12 and 1 positive positive clones were obtained from cDNA libraries synthesized using oligo (dT) and random primers, respectively. A loan was obtained.
各ク ロー ンは、 上記と同様の一次抗体 （ A b — 1 ) 及 び検出法によ って単一化された。 単一化された各ク ロー ンを実施例 1 に示された 3種のポ リ ク ローナル抗体との 反応性を検討するため、 1 当た り数十個のプラ ー ク が出現するよ う に適当に希釈し、 3 枚のプレー ト にそれ ぞれの ク ロー ンの希釈溶液を 1 〃 ^ ずつスポ ッ ト し、 各 ク ロ ー ンか ら産生さ れる タ ンパク質と 3種の抗体との反 応性を上記 と同様の検出系を用いて検討 した。 その結果、 3種の ク ロ ー ンに由来する タ ンパ ク質が、 有意に 3種の 抗体 との反応性を示 した。 こ れ ら 3種の ク ロ ー ンの う ち、 2種 （ A 6 1 、 A 6 2 ) はオ リ ゴ （ d T ) プラ イ マー、 1 種 （ R 4 ) はラ ン ダムプラ イ マーを用いて合成さ れた c D N Aプラ イ マ一 よ り 得られた。 Each clone was unified by the same primary antibody (Ab-1) and detection method as described above. In order to examine the reactivity of each unified clone with the three types of polyclonal antibodies shown in Example 1, several tens of plaques should appear each time. Dilute the diluted solution of each clone 1 〃 ^ to each of the three plates. The reactivity of the protein produced from clones with the three antibodies was examined using the same detection system as described above. As a result, proteins derived from the three clones showed significant reactivity with the three antibodies. Of these three clones, two (A61, A62) are oligo (dT) primers and one (R4) is a random primer. It was obtained from a cDNA primer synthesized using the above method.
W ) ラ ッ ト H C N Pのア ミ ノ 酸配列よ り推定された塩 基配列 よ り 作製 したオ リ ゴ ヌ ク レ—ォチ ドプロ 一ブに る Λ g t 1 1 フ ァ ー _ジラ イ ブラ リ ーのス ク リ ーニ ン グ  W) Oligonucleotide probe prepared from the base sequence deduced from the amino acid sequence of rat HCNP. Gtgt11 Far _ library Screening
上記単一化された各ク ロ ー ン に含ま れる挿入 c D N A 配列中に配列番号 ： 1 7 の ラ ッ ト H C N Pか ら類推さ れ る塩基配列が含ま れているかを検討するため、 オ リ ゴ ヌ ク レオチ ドプロ ーブを用いたプラ ー クハイ ブ リ ダイ ゼー シ ヨ ンを行っ た ( J. Sambrook et al.： "Molecular  In order to examine whether or not the inserted cDNA sequence contained in each of the above unified clones contains a base sequence inferred from the rat HCNP of SEQ ID NO: 17 A plaque hybridization reaction using a nucleonucleotide probe was performed (J. Sambrook et al .: "Molecular
Cloning - A laboratory manual, 2nd. ed. ", Cold Spring Harbor Lab. , Ne York, 1 9 8 9. ) 。 第 1 図に示され た 2種類のオ リ ゴ ヌ ク レオチ ドプロ ーブを 32 Pを用いて、 実施例 2 に示された方法で標識し、 2 0 τηβの β X S S C ( 0. 9 M N a C ^、 0. 0 9 Mク ェ ン酸ナ ト リ ウ 厶） 、 5 x D e n h a r d t ( 0 . 1 %フ ィ コ 一 ノレ、 0 . 1 %ポ リ ビニー ノレ ピ Π3 リ ド ン、 0 . 1 %ゥ シ血清ア ルブ ミ ン） 、 0 . 1 % S D Sの組成のノヽイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン溶液で希釈 し、 1 X 1 0 6 c p mノ ττι のプロ ーブ溶液 を作製 した。 大腸菌 Y l 0 8 8 を宿主と して、 上記 ffi ) の項で述べ たよ う に、 抗体 （ A b — 1 ) を用いて選別された合計 1 3 種の各ク ロー ン当た り数十個のプラ ー クが出現する よ う にフ ァ ー ジ希釈溶液を 1 〃 _ί ずつスポッ ト し、 4 2 °C で 2 時間、 続けて 3 7 °Cで 4 時間を培養後、 フ ァ ージを ニ ト ロ セ ノレ ロ ー ス メ ン ブ レ ン フ ィ ゾレ タ ー に移 した。 フ ィ ル タ ー は、 0 . 5 N N a O H、 1 . 5 M N a C 溶 液で 5 分間処理し D N Aを変性後、 1 M T r i s — Cloning -.... A laboratory manual, 2nd ed ", Cold Spring Harbor Lab, Ne York, 1 9 8 9.) 2 types shown in Figure 1 Oh Li Gore j click Reochi Dopuro over blanking the 32 P And labeled using the method described in Example 2 to give 20 X τηβ β XSSC (0.9 MNa C ^, 0.09 M sodium citrate), 5 x D enhardt (0.1% phyco-nore, 0.1% polyvinyl lipoline, 0.1% sera albumin), 0.1% SDS composition The resulting solution was diluted with a redistribution solution to prepare a 1 × 10 6 cpm no ττι probe solution. Using E. coli Y1088 as a host, as described in section ffi) above, several tens of clones were selected from each of a total of 13 types selected using the antibody (Ab-1). Spot the diluted solution of the phage at a rate of 1 〃 ί ず つ so that plaques appear, and incubate at 42 ° C for 2 hours and then at 37 ° C for 4 hours. Was transferred to the Nitro Senororose Membrane Filter. The filter was treated with a 0.5 N NaOH, 1.5 M NaC solution for 5 minutes to denature the DNA, and then 1 MTris —
C £ ( ρ Η 7 . 5 ) 、 3 M N a C で 1 0 分間処理 する こ とによ って D N Aをフ ィ ゾレターに固定した。 2 X S S C ( 0 . 3 M N a C £ , 0 . 0 3 M ク ェ ン酸ナ ト リ ウム） で 5 分間洗浄後、 8 0 °Cで 2 時間加熱して  The DNA was fixed to the fizz letter by treating with C £ (ρ Η 7.5) and 3 M NaC for 10 minutes. After washing with 2 X SSC (0.3 M NaC £, 0.3 M sodium citrate) for 5 minutes, heat at 80 ° C for 2 hours.
D N Aを焼き付けた。 D NA was baked.
上記のフ ィ ルタ一を再度 2 x S S Cで湿らせ、 プロ一 ブを含まないハイブ リ ダイゼー シ ョ ン溶液で 3 4 °Cで 6 時間プレハイプ リ ダイ ゼーシ ョ ンを行い、 上記のプロ一 ブ溶液で 3 4 °Cでー晚ハイ ブ リ ダィゼーシ ヨ ンを続けた。  Re-wet the above filter with 2 x SSC, prehybridize at 34 ° C for 6 hours in a probe-free hybridization solution, and perform the above probe. The solution was kept at 34 ° C. for a long time.
フ イ ノレターを室温下に 2 X S S C . 0 . 1 % S D Sで 1 5 分間洗浄し、 次いで 4 2 °Cで 2 X S S C， 0 . 1 % S D Sで 3 0 分間 4 回洗浄した後、 オー ト ラ ジオグラ フ ィ 一で 2種類のプローブと相同性を有する ク ロー ン の検 出を行った。  After washing the final letter at room temperature with 2 XSSC 0.1% SDS for 15 minutes, then at 42 ° C for 4 times with 2 XSSC and 0.1% SDS for 30 minutes, the autoradiograph was washed. Clones having homology with the two types of probes were detected in the field.
その結果、 上記 m) の項で示された 3 種のポ リ ク ロ一 ナル抗体と同様の反応性を示した 3 種の ク ロー ン （ A 6 1 , A 6 2 , R 4 ) のみ力 2 種のオ リ ゴヌ ク レオチ ドプ ロ ーブと相同性を有する領域を含むこ とが明かとなった。 実施例 6 As a result, only the three clones (A61, A62, R4) that showed the same reactivity as the three polyclonal antibodies shown in the above section m) were active. Two species of oligonucleo dop It was found to contain a region with homology to the lobe. Example 6
ラ ッ ト H C N Pを含む前駆体タ ンパク質をコー ドする 遺伝子の塩基配列の決定  Determining the nucleotide sequence of the gene encoding the precursor protein including rat HCNP
上記実施例 5 で得られたラ ッ ト H C N Pの前駆体タ ン ノ、 °ク質をコー ドする可能性のある 3種の ク ロー ン （A 6 1 , A 6 2 , R 4 ) よ り フ ァ ー ジ D N Aを調整後、 挿入 D N A断片をサブク ロー ン化し、 塩基配列の決定を行つ た。  From the rat nano-precursors of rat HCNP obtained in Example 5 above, three types of clones (A61, A62, R4) which may encode proteins. After preparing the phage DNA, the inserted DNA fragment was subcloned and the nucleotide sequence was determined.
フ ァ ー ジ D N Aの調製は、 以下の手順に従って行っ た。 単一化されたフ ァ ー ジ ク ロー ンをプレー ト全面に出現す る よ う にま き、 3 7 °Cでー晚培養した後、 λ希釈液  Preparation of phage DNA was performed according to the following procedure. Incubate the unified phage clone so that it appears on the entire surface of the plate, and incubate at 37 ° C.
( 1 0 m M T r i s — H C ^ ( p H 7. 5 )， 1 0 m M M g C 2 , 0 . 1 m M E D T A ) を 5 τη 寒天 培地の上に注ぎプレ一 ト ラ イセ一 トを行い、 フ ァ ー ジ粒 子の増幅を図った。 得られたフ ァ ー ジ粒子を用いて液体 培養によ り フ ァ ー ジの大量調製を行った。 1 0 0 の液 体培地に大腸菌 Y 1 0 8 8 の 前培養及び多重度  (10 mM MT ris — HC ^ (pH 7.5), 10 mM MM g C 2, 0.1 mM MEDTA) was poured on 5 τη agar medium and pre-plated. The phage particles were amplified. Using the obtained phage particles, a large amount of phage was prepared by liquid culture. Preculture and multiplicity of Escherichia coli Y1088 in 100 liquid media
(multiplicity of infect ion ； moi ) = 0. 0 5 の フ ァ ー ジ粒子を加え、 大腸菌が溶菌する まで三角 フ ラ ス コ を激し く 振と う した。 溶菌後、 1 のク ロ 口ホルムを加 え、 大腸菌を完全に溶菌させた。 得られたフ ァ ージ溶液 を 9 0 0 0 r p mで 1 0 分間遠心し、 大腸菌の残渣を除 いた後、 上清に 1 0 〃 g Z m こなる よ う に D N a s e I 、 R N a s e Aを加え、 3 7 °Cで 1 時間保温した。 その後、 3 0 %ポ リ エチ レ ン グ リ コ ール、 3 M N a C 溶液を 1 5倍量加え、 氷中にて 1 時間冷却 した。 9 0 0 0 r p m、 1 0分間遠心後、 ペ レ ツ トを 3771 の 1 0 0 m M T r i s - H C ^ ( p H 7. 5 )、 1 0 0 mM N a C £ . 2 5 m M E D T Aに懸濁 し、 の 4 % S D Sを 加え 7 0 °C、 2 0分間加熱した。 次いで、 懸濁液に 3 m の 2. 5 51V [酢酸カ リ ウ ム （ ρ Η 4.8)を加え、 攪拌後、 1 7 0 0 0 r p m、 3 0分間 4 °Cで遠心を行い、 その上 清をグラスフ ィ ルターにかけ不純物を除いた。 濾液を 7 5 0 m M N a C 5 0 m M M O P S (p H 7. 0 )、 1 5 %エタ ノ ールで平衡化されたキアゲン一 p a c k 1 0 0 (ダイ ァゲン社製） にかけ、 4 の 1 . 0 M N a C ^、 5 0 m M M O P S ( p H 7. 0 ) 、 1 5 % エタ ノ ールでカ ラムを洗浄し、 4 ?^の 1 . 2 M Phage particles (multiplicity of infection; moi) = 0.05 were added, and the triangular flask was vigorously shaken until E. coli was lysed. After lysis, Escherichia coli was completely lysed by adding 1-pore form. The obtained phage solution is centrifuged at 900 rpm for 10 minutes to remove E. coli residues, and then DNase I and RNase A are added to the supernatant so that the concentration is 10 μg Zm. And kept at 37 ° C for 1 hour. afterwards, 30% Polyethylene glycol, 15 times the amount of 3 M NaC solution was added, and the mixture was cooled in ice for 1 hour. After centrifugation at 900 rpm for 10 minutes, the pellet was transferred to 100 mM MTris-HC ^ (pH 7.5) of 3771, 100 mM NaC £ .25 mMEDTA. After suspending, 4% SDS was added and heated at 70 ° C for 20 minutes. Next, 3 m of 2.551 V [potassium acetate (ρ 4.8 4.8) was added to the suspension, and after stirring, centrifuged at 1700 rpm for 30 minutes at 4 ° C. Qing was applied to a glass filter to remove impurities. The filtrate was applied to Qiagen 1 pack 100 (manufactured by Diagen) equilibrated with 75 mM MNaC 50 m MMOPS (pH 7.0), 15% ethanol, and then used as a 4: 1 Wash the column with 0.5 M Na C ^, 50 m MMOPS (pH 7.0), 15% ethanol, and add 4 M ^ 1.2 M
N a C 、 5 0 mM M〇 P S ( p H 8. 0 )、 1 5 %ェ 夕 ノ ールで D N Aを溶出 した。 溶出液に 0. 8倍量のィ ソプロパノ ールを加え、 氷中で 1 5分間放置後、 1 7 0 0 0 r p mで 3 0分間遠心した。 ペレ ツ トを 0. 3 M酢 酸ナ ト リ ウ ム （ p H 4 . 5 ) に溶解し、 2. 5倍量のェ 夕 ノ ールを加え、 一 8 0でで 1 5分間冷却後遠心を行いDNA was eluted with NaC, 50 mM M-PS (pH 8.0), and 15% ethanol. 0.8 volume of isopropanol was added to the eluate, left on ice for 15 minutes, and then centrifuged at 1700 rpm for 30 minutes. Dissolve the pellet in 0.3 M sodium acetate (pH 4.5), add 2.5 volumes of ethanol, and cool at 180 to 15 minutes. Centrifuge
D N Aを回収 した。 The DNA was collected.
制限酵素で切断後大腸菌アル力 リ 性フ ォ スフ ァ ターゼ 処理された M l 3 m p 1 9 も し く は M l 3 m p 1 8 フ ァ — ジベク ターに適当な制限酵素でフ ァ ージ ク D — ン D N A ( 1 g ) を切断し精製 した挿入 c D N A断片を 導入 した。 ク ロー ン A 6 1 ， A 6 2 , R 4 の内で最も長 い挿入 c D N Aを有する ク ロー ン A 6 1 D N Aの制限酵 素地図及び塩基配列決定のス ト ラテジーを第 2 図に示す。 ク ロー ン A 6 1 の挿入 c D N A断片を有する形質転換体 よ り一本鎖フ ァ ー ジ D N Aを調製 し、 D N A シー クェ ン シ ングキ ッ ト （ュナイ テ ツ ドステーッノくィ ォケ ミ カルズ 社製 ； Sequenase Version 2 . 0 ) を用いて塩基配列の 決定を行った。 Ml3mp19 or Ml3mp18F digested with Escherichia coli alkaline phosphatase after digestion with restriction enzymes—Fasque with restriction enzymes appropriate for the vector D -DNA (1 g) was digested and purified. Introduced. Figure 2 shows the restriction enzyme map of clone A61 DNA, which has the longest inserted cDNA among clones A61, A62, and R4, and the strategy for sequencing. . A single-stranded phage DNA was prepared from a transformant having the cloned cDNA fragment of clone A61, and a DNA sequencing kit (united dostaino chemicals, Inc.) was prepared. The nucleotide sequence was determined using Sequenase Version 2.0).
ク ロー ン A 6 1 の決定された塩基配列は一つの大きな オープン リ ーティ ン グフ レ ームを保有していた。 本 c D N Aのイ ンサ一 卜 に含まれるオープン リ ーディ ン グフ レ ームは、 真核生物の翻訳開始配列 となる A T G配列は見 あた らない ものの c D N Aの 5 ' 末端よ り 1 8 6 ァ ミ ノ 酸からな っていた。 m R N Aの 3 ' 末端に存在するポ リ ( A ) 配列が本 c D N Aの 3 ' 末端に見い出され、 通常 真核生物の m R N Aのほ とんどに見い出される 6 塩基か らなるポ リ （ A ) 付加シグナルである AATAAA配列と同一 の配列が先に位置していた。 塩基配列の決定された c D N Aイ ンサ一 トの D N A配列及びオープン リ ーディ ン グ フ レームを第 3 図および第 4 図に示す。  The determined nucleotide sequence of clone A61 had one large open reading frame. The open reading frame included in the insert of this cDNA was found to be 1886 from the 5 'end of the cDNA, although the ATG sequence serving as a translation initiation sequence in eukaryotes was not found. It consisted of amino acids. A poly (A) sequence present at the 3 'end of the mRNA is found at the 3' end of the cDNA, and a 6-base poly (ordinarily found in most eukaryotic mRNAs). A) The sequence identical to the additional signal, AATAAA sequence, was located first. FIGS. 3 and 4 show the DNA sequence and open reading frame of the cDNA insert whose nucleotide sequence was determined.
本 c D N Aにコ一 ドされるア ミ ノ 酸配列は第 5 図の如 く 演繹でき、 そのポ リ ペプチ ドは 1 8 6 ア ミ ノ 酸よ り な り、 その分子量は 2 0 6 6 9 . 1 ダル ト ン と計算された。 ラ ッ ト に於いて神経栄養活性を示す配列番号 ： 1 7 のラ ッ ト H C N P は第 5 図のポ リ ペプチ ドの N末端の一番目 のア ミ ノ 酸残基よ り 1 1 番目 のア ミ ノ 酸残基までの領域 に位置 している。 そのア ミ ノ 酸領域に対応する塩基配列 を配列番号 ： 1 に示す。 なお、 ク ロ ー ン A 6 2 に含ま れ る c D N Aイ ンサー ト は第 5 図に示されるア ミ ノ 酸配列 の 2番 目 のア ミ ノ 酸よ り下流域を含み、 一方 ク ロ ー ン R 4 では A 6 1 と同 じア ミ ノ 酸末端が検出 さ れた。 The amino acid sequence encoded by this cDNA can be deduced as shown in Fig. 5, and its polypeptide is composed of 186 amino acid, and its molecular weight is 206 699 It was calculated to be 1 dalton. The rat HCNP of SEQ ID NO: 17 showing neurotrophic activity in the rat is the first N-terminal of the polypeptide shown in Fig. 5. It is located in the region from the amino acid residue to the first amino acid residue. The nucleotide sequence corresponding to the amino acid region is shown in SEQ ID NO: 1. The cDNA insert contained in clone A62 includes the downstream region of the second amino acid in the amino acid sequence shown in FIG. In amino acid R4, the same amino acid end as in A61 was detected.
実施例 7 Example 7
完全長の c D N Aを有する ク ロ ー ンの選択及び挿入 D N A断片の塩基配列の決定  Selection of clones with full-length cDNA and determination of the nucleotide sequence of the inserted DNA fragment
上記 A 6 1 ク ロ ー ン c D N Aは、 翻訳の開始コ ド ン ま で伸長されてお らず、 該ポ リ ペプチ ドの本来の N末端の 解析を行えなかっ た。 そ こ で第 2図の制限酵素切断地図 に示される約 1 9 0 b pか らなる H i n c I I —  The A61 clone cDNA was not extended to the translation initiation codon, and the original N-terminal of the polypeptide could not be analyzed. Therefore, H in c I I — consisting of about 190 bp shown in the restriction enzyme cleavage map in FIG. 2 —
H i n e I I 断片をラ ン ダムプラ イ ム ラべ リ ン グキ ッ ト (アマ シ ャ ム社製） を用いる こ とによ り 32 Pで標識化 し、 プロ ーブと して用いる こ とによ って翻訳開始コ ド ンの 5 ' 上流域まで伸長された c D N Aク ロ ー ンの選別を行 い、 その塩基配列の決定を試みた。 The Hin II fragment is labeled with 32 P by using a random primer labeling kit (manufactured by Amersham) and used as a probe. As a result, cDNA clones extended to the 5 'upstream region of the translation initiation codon were selected, and their nucleotide sequences were determined.
大腸菌 Y 1 0 8 8 を宿主 と して、 オ リ ゴ （ d T) ブラ イ マ一に よ り 合成さ れた c D N Aを組み込んだ  Escherichia coli Y1088 was used as a host to incorporate cDNA synthesized from an oligo (dT) primer.
Λ g t 1 1 フ ァ ー ジ 'ラ イ ブラ リ 一を直径 1 5 0随の寒天 培地当た り 1 5万個ずつ 1 0枚プ レ ーテ ィ ン グ し、 実施 例 5 と同様の方法によ っ てフ ァ ー ジ D N Aを二 ト ロセル ロ ース メ ンブ レ ン フ イ ノレタ ーに固定 し、 5 0 %ホルムァ ミ ド、 6 X S S C , 5 x D e n h a r d t 溶液、 0 . 1 % S D Sの組成のハイブ リ ダィ ゼー シ ョ ン溶液で 4 2 °C で 6 時間、 プレハイ ブ リ ダイゼ一 シ ヨ ンを行った。 次に、 上記標識化された Hincl I- Hincl I 断片を含むハイブ リ ダ ィ ゼ一 シ ヨ ン溶液 （ 1 X 1 0 6 c p m ) で 4 2 °Cでー晚 ハイ ブ リ ダイゼー シ ョ ンを続けた。 Gt gt11 One phage library was prepared by plating 10 pieces of 150,000 pieces per agar medium having a diameter of 150 随 in the same manner as in Example 5. The phage DNA is fixed to a two-throat cellulose membrane filter by 50% formamide, 6XSSC, 5 × Denhardt solution, 0.1% Prehybridization was performed at 42 ° C for 6 hours using a hybridization solution having a composition of% SDS. Next, the 4 2 ° C De晚hive Li Daize tion hive Li da I peptidase one sheet Yo emissions solution (1 X 1 0 6 cpm) containing the labeled Hincl I- Hincl I fragment Continued.
フ ィ ルタ 一を室温下に 2 x SSC 、 0. 1 % S D Sで 1 5 分間洗浄し、 6 5 °Cで 3 0分間 3回洗浄した後、 ォー ト ラ ジオグラ フ ィ ーでク ロー ンを選別 した。 得られた 9 種の ク ロー ンを二次及び三次ス ク リ ーニングで単一化し、 フ ァ ー ジ溶液を得た。  Wash the filter at room temperature with 2 x SSC, 0.1% SDS for 15 minutes, wash at 65 ° C three times for 30 minutes, and then clone with autoradiography. Was selected. The obtained 9 types of clones were unified by secondary and tertiary screening to obtain a phage solution.
上記のよ う に して選別された ク ロー ン群の中から更に m R N Aの 5 ' 末端まで伸長した c D N Aク ロー ンを得 える 目的で、 第 2図の A 6 1 ク ロー ン c D N Aの制限酵 素地図に示された E c 0 R I アダプタ一配列から  In order to obtain a cDNA clone further extended to the 5 'end of the mRNA from the clone group selected as described above, A61 clone cDNA in FIG. 2 was obtained. From the Ec0RI adapter sequence shown in the restriction enzyme map
H i n c I I 切断部位までの約 9 0 b pの D N A断片を プローブと して再度選別を行った。 The selection was performed again using a DNA fragment of about 90 bp up to the HincII cleavage site as a probe.
寒天培地上に各ク ロー ン当た り数十個のプラー クが出 現する よ う にフ ァ ー ジ溶液をスポ ッ ティ ン グし、 上記の ス ク リ ーニン グ法に準じてハイ ブ リ ダイゼ一シ ョ ンを行 つた。 その結果、 9個の ク ロー ンの内 6個の ク ロ ー ンが 少な く と も第 2図の制限酵素地図にある 5 ' 末側の  Spot the phage solution so that dozens of plaques per clone appear on the agar medium, and hybridize according to the screening method described above. Redidation was conducted. As a result, at least 6 of the 9 clones had at least the 5'-end in the restriction map in Fig. 2.
H i n c l I 切断部位よ り上流まで伸長 した c D N Aを 含むク ロ ー ンである こ とが明かとなった。 これら 6種の A フ ァ — ジ ク ロー ンの D N Aを実施例 6 に記された液体 培養法によ って調製 し、 E c o R I で切断後、 M 1 3 m p 1 9 の予めアルカ リ 性フ ォ ス フ ァ タ 一ゼ処理 した E c 0 R I 部位にサブ ク ロ ーニ ン グ し、 塩基配列の 決定を行っ た。 その結果、 配列番号 ： 2 に示すよ う に、 ク ロ ー ン A 0 1 0 - 1 2 に含ま れる c D N Aイ ンサー ト の塩基配列にはラ ッ ト海馬由来の神経栄養因子活性を有 する ラ ッ ト H C N P配列の直前に翻訳開始コ ド ンであ る A T G配列が存在 した。 ク ロ ー ン A O 1 0 — 1 2 の c D N Aに コ ー ドさ れる ァ ミ ノ 酸配列を演繹 した結果を 配列番号 ： 3 に示す。 なお、 配列番号 ： 3 に記載された ァ ミ ノ 酸配列は翻訳開始コ ド ンである A T G配列を含ん でいない。 It was clarified that the clone contained cDNA extended to the upstream of the Hincl I cleavage site. The DNA of these six A-diclones was prepared by the liquid culture method described in Example 6, cut with EcoRI, and Subcloning was performed at the Ec0RI site of M13mp19 which had been previously treated with alkaline phosphorous phosphatase, and the nucleotide sequence was determined. As a result, as shown in SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence of the cDNA insert contained in clone A010-12 has a neurotrophic factor activity derived from rat hippocampus. An ATG sequence, which is a translation initiation codon, was present immediately before the rat HCNP sequence. SEQ ID NO: 3 shows the result of deducing the amino acid sequence encoded by the cDNA of clone AO10-12. The amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 does not contain the ATG sequence which is a translation initiation codon.
c D N Aに コ 一 ドされるァ ミ ノ 酸配列に基づいてデー 夕ベース解析を行った と こ ろ、 8 4 . 4 %の高いホモ口 ジ一を有する ゥ シの フ ォ ス フ ァ チ ジルエタ ノ ールア ミ ン 結合タ ンパ ク質のア ミ ノ 酸配列が検索さ れた。 （F. Schoentgen et al . ： Eur. J. Biochem. , 166, 333, 1987. )o ま た、 第 2 図の制限酵素地図にある 5 ' 末端側 の H i n c I I 切断部位よ り上流まで伸長 した ク ロ ー ン の一つである A O 1 一 1 では翻訳開始コ ド ン と推定され る メ チォニ ン残基よ り数えて 1 3 5 ア ミ ノ 酸残基めが リ ジ ン残基とな っていた （ ク ロ ー ン A 6 1 , R 4 及び A 〇 1 0 — 1 2 ではグルタ ミ ン酸残基） 。 こ れは、 塩基配列 力 ク ロ ー ン A 6 1 ， R 4 おおび A 0 1 0 - 1 2 では G A G ( G u ) であ るのに対 して A 0 1 — 1 では A A G ( L y s ) とな っている事に起因する。 実施例 8 c) Based on the amino acid sequence encoded in the DNA, a database analysis revealed that a phosphoric acid ethyate having a high homologue of 84.4% was obtained. The amino acid sequence of the noramine binding protein was searched. (F. Schoentgen et al .: Eur. J. Biochem., 166, 333, 1987.) Also, it extends upstream from the 5 'terminal HincII cleavage site in the restriction map in Fig. 2. One of the clones, AO111, has 135 amino acid residues, counted as methionine residues, which are presumed to be translation initiation codons. (Glutamate residue in clones A61, R4 and A〇10-12). This is because GAG (Gu) in the base sequence clones A61, R4 and A010-12, whereas AAG (Lys) in A01-1. ). Example 8
ラ ッ ト H C N_ P を含む前 1 体 ン パ ク— 質 （p リ ジルェ ン ドぺプチダーゼによ る分解及び構成べプチ ドのァ ミ ノ 酸 配列  Pre-protein containing rat HCN_P (degraded by p-lysylendopeptidase and amino acid sequence of constituent peptides)
実施例 3 に示されたよ う にラ ッ ト H C N P に対する抗 体と反応性を示すラ ッ ト海馬脳に存在する分子量 2 3 キ 口 ダル ト ンの夕 ンパク質のァ ミ ノ酸配列を決定するため、 リ ジルェン ドぺプチダーゼによ って分解されて生じるォ リ ゴペプチ ドの精製を行った。  As shown in Example 3, the amino acid sequence of the 23-kilodalton protein present in rat hippocampal brain, which is reactive with rat HCNP, is determined. Therefore, oligopeptide produced by decomposition by lysylendopeptidase was purified.
リ ジルエン ドべプチダ一ゼによる 2 3 キロ ダル ト ンの 分子量を持つ夕 ンパク質の分解の反応によ って生じたォ リ ゴぺプチ ドを高速液体ク ロマ ト グラ フ ィ ーにかけ、 各 断片の分離 · 精製を行った。 0 . 1 % ト リ フ ロ ロ酢酸一 ァセ トニ ト リ ル系の溶媒によ る R P — 3 0 4 カ ラム （直 径 4 . 6 mm x 2 5 0 mm ; バイ オラ ッ ド社製） を用いる こ とによ って、 オ リ ゴペプチ ドを分画した。 9 種の溶出画 分 （各 5 0 0 £ を 4 7 7 Αセー クェンサ一 （ァプラ イ ドバイオケ ミ カルズ社製） にかけ構成ペプチ ドのア ミ ノ 酸配列の逐次シー クェン シン グの解析を行った。 その 結果、 8 種の溶出画分のポ リ ペプチ ドのア ミ ノ 酸配列が 決定された。 各々 の断片のァ ミ ノ 酸配列決定の結果を配 列番号 ： 5〜 1 2 に示す。 構造決定の為されなかったォ リ ゴぺプチ ドは、 その Ν末端がブロ ッ ク されている と考 えられ、 2 3 キロ ダル ト ンの Ν末端に位置する もの と考 え られる。 上記ア ミ ノ 酸配列の決定された構成ペプチ ド のア ミ ノ酸配列は、 何れも配列番号 ： 3 に演繹されたァ ミ ノ 酸配列上に位置付ける こ とが出来た。 こ の結果は、 分子量 2 3 キロ ダル ト ンのタ ンパク質と実施例 6 及び 7 で決定された遺伝子のコ ー ドする タ ンパク質が同一の も のである こ とを強 く 示唆する ものである。 Oligopeptides produced by the reaction of degradation of proteins having a molecular weight of 23 kilodaltons by lysylendopeptidase are subjected to high-performance liquid chromatography, and each is subjected to high-performance liquid chromatography. The fragments were separated and purified. RP with 0.1% trifluoroacetic acid-acetonitrile solvent—304 columns (4.6 mm diameter x 250 mm diameter; manufactured by Biorad) The oligopeptide was fractionated by using the enzyme. Nine kinds of eluted fractions (500 £ each) were applied to 477 Α Α ェ 製 (Applied Biochemicals) to analyze the sequential sequencing of the amino acid sequence of the constituent peptides. As a result, the amino acid sequences of the polypeptides of the eight elution fractions were determined, and the results of the amino acid sequencing of each fragment are shown in SEQ ID NOs: 5 to 12. Oligopeptides for which the structure has not been determined are considered to be blocked at the Ν end, and are considered to be located at the 2 end of 23 kilodaltons. The determined constituent peptide of the amino acid sequence All of the amino acid sequences were able to be located on the amino acid sequence deduced as SEQ ID NO: 3. This result strongly suggests that the protein having a molecular weight of 23 kilodaltons and the protein encoded by the genes determined in Examples 6 and 7 are the same. is there.
実施例 9 Example 9
リ ジルェン _ドぺプチダ一ゼ分解によ って得られた前駆 体夕 ンパク質の N末端ァ ミ ノ 酸配列の決定  Determination of N-terminal amino acid sequence of precursor protein obtained by lysylene-dopeptidase degradation
実施例 8 に示されたよ う に N末端のブロ ッ ク された 3 8 ァ ミ ノ 酸残基の リ ジルェ ン ドぺプチダ一ゼ断片のァ ミ ノ 酸配列を決定するため、 本構成ペプチ ドを ト リ プシ ン 分解によ って更に断片化し、 C末端側の 2 6 から 3 8 残 基までのア ミ ノ 酸配列を決定した。 次に、 残った N末端 側の断片をキモ ト リ ブシ ンで分解し、 C末端側の 8 から 2 5 残基までのぺプチ ドのァ ミ ノ 酸配列の決定を行った。 続いて N末端べプチ ドをァ シルァ ミ ノ酸遊離酵素を用い て分解し、 2 から 6 ア ミ ノ 酸残基までの配列の決定を行 つた。 その結果、 ブロ ッ ク された N末端 リ ジルエン ドべ プチダーゼ断片の内、 ァ シル化された N末端のア ミ ノ酸 残基及び 7 番目のア ミ ノ 酸残基以外の全てのア ミ ノ 酸配 列が決定された。 決定されたァ ミ ノ酸配列を配列番号 ： 4 に示す。 なお、 塩基配列の決定によ り類推された配列 番号 ： 4 に表記の配列は N末端および 7 番目のア ミ ノ 酸 残基を含んでいる。 得られたア ミ ノ 酸配列の解析の結果、 上記断片を実施例 6 及び 7 の遺伝子の塩基配列の決定に よ り 類推さ れた前駆体遺伝子に コ 一 ドさ れる ア ミ ノ 酸配 列の N末端に存在する神経栄養因子活性を有する ォ リ ゴ ぺプチ ド配列を含む領域に位置付け られた。 As shown in Example 8, this constituent peptide was used to determine the amino acid sequence of the residue of a 38 amino acid residue blocked N-terminally blocked amino acid residue. Was further fragmented by trypsin digestion, and the amino acid sequence from the C-terminal 26 to 38 residues was determined. Next, the remaining N-terminal fragment was digested with chymotoribine, and the amino acid sequence of the C-terminal peptide from 8 to 25 residues was determined. Subsequently, the N-terminal peptide was degraded using acylamino acid releasing enzyme, and the sequence from 2 to 6 amino acid residues was determined. As a result, of the blocked N-terminal lysyl endopeptidase fragments, all amino acids other than the acylated N-terminal amino acid residue and the seventh amino acid residue were used. The acid sequence was determined. The determined amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4. The sequence described in SEQ ID NO: 4 deduced from the determination of the nucleotide sequence contains the N-terminal and the seventh amino acid residue. As a result of analyzing the obtained amino acid sequence, the above fragment was used for determination of the nucleotide sequence of the genes of Examples 6 and 7. It was located in the region containing the oligopeptide sequence having neurotrophic factor activity present at the N-terminus of the amino acid sequence encoded by a more analogous precursor gene.
近年、 ラ ッ ト H C N Pの N末端のほ とん どがァ シル化 されている こ とが認め られているが、 本発明によ り 該前 駆体ポ リ べプチ ドの段階で既に N末端がァ シル化さ れて いる こ とが明か とな つ た。  In recent years, it has been recognized that most of the N-terminus of rat HCNP is acylated. However, according to the present invention, the N-terminus is already present at the precursor polypeptide stage. It has become clear that it has been acylated.
なお、 実施例 3 で記述された よ う に、 ラ ッ ト脳で発現 の認め られた前駆体夕 ンパク質の分子量はウ ェ ス夕 ンブ ロ ッ テ ィ ン グの結果か ら 2 3 キロ ダル ト ン と推定さ れた が、 決定された遺伝子の塩基配列 よ り類推さ れたァ ミ ノ 酸配列 よ り計算された分子量 （ 2 1 キロ ダル ト ン） と異 な る も のであ っ た。 こ の分子量の違いは、 ゥ シのフ ォ ス フ ァ チ ジルエタ ノ ールア ミ ン結合タ ンノ ク質の場合で も 認め られてお り （F. Schoentaen et al. ： Eur. J. Biochem. , 166, 333, 1987) 、 タ ンパ ク質の立体構造等 によ り、 ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動でのタ ンノ、。 ク 質の移動度が変化した も の と推定される。  As described in Example 3, the molecular weight of precursor protein expressed in rat brain was 23 kilodaltons from the results of wet evening blotting. It was estimated to be a ton but different from the molecular weight (21 kilodaltons) calculated from the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of the determined gene. . This difference in molecular weight has also been observed in the case of the phosphophosphidylethanolamine-binding protein of E. coli (F. Schoentaen et al .: Eur. J. Biochem., 166, 333, 1987), tanno in polyacrylamide gel electrophoresis, depending on the three-dimensional structure of the protein. It is estimated that the mobility of the material has changed.
実施例 1 0 Example 10
ラ ッ ト H C N P を含む前駆体遺伝子に相応する ヒ ト型 Human type corresponding to the precursor gene containing rat HCNP
_c_D N A遺伝子のス ク リ ーニ ン グ _c_D NA screening of gene
ヒ ト c D N A ク ロ ー ンを単離する ために ヒ ト胎児脳 c D N Aラ イ ブラ リ 一、 及び、 ヒ ト 胎盤 c D N Aラ イ ブラ リ ー （ と も に ク ロ ンテ ッ ク社製） を、 ラ ッ ト H C N P前 駆体 c D N A ク ロ ー ンをプロ 一ブ と してス ク リ ー ン した 上記ヒ ト組織由来の c D N Aラ イ ブラ リ ーを含むフ ァ ー ジをそれぞれ大腸菌 Y 1 0 9 0 に感染させ、 1 X 1 0 6 p f u のフ ァ ージを L B培地を含む 1 0 枚のプレー ト に ま いた。 フ ァ ー ジ粒子をニ ト ロ セ ル ロ ー ス フ ィ ノレ 夕一 ( Scheicher & Schuell 社製） 上へ移 し、 変性溶液 To isolate human cDNA clones, a human fetal brain cDNA library and a human placenta cDNA library (both from Clontech) Was screened using a rat HCNP precursor cDNA clone as a probe. The full § chromatography di including c DNA la Lee bra rie from the human tissue is respectively into E. coli Y 1 0 9 0, 1 0 sheets containing LB medium off § chromatography di 1 X 1 0 6 pfu The plate. The phage particles are transferred onto Nitrocellulose Finest (Yuichi Scheicher & Schuell) and denatured
( 0 . 1 N N a 0 H , 1 M N a C ^ ) 中で 5 分間、 2 回、 次いで中和溶液 （ 3 M N a C £ , 1 M  (0.1 NNa0H, 1 M NaC ^) twice for 5 minutes, then neutralization solution (3 M NaC £, 1 M
T r i s - H C (p H 7 . 5 ) 中で 5 分間、 2 回処理 した後、 2 X S S C 液 （ 0 . 3 M N a C £ , After treating twice in Tris-H C (pH 7.5) for 5 minutes, a 2 × S S C solution (0.3 M Na C £,
0 . 0 3 Mクェン酸ナ ト リ ウム） に浸し、 更に 8 0 で 3 時間乾燥固定した。 The sample was immersed in 0.03 M sodium citrate) and dried and fixed at 80 for 3 hours.
ラ ッ ト H C N P前駆体 c D N A ク ロ ー ン （ R 4 ) に含 まれる約 1 K b の E c o R I 断片 （実施例 6 記載） を、 ラ ンダムプラ イムラべ リ ン グキ ッ ト （アマシ ャ ム社製） によ り 32 Pで放射線標識し、 9 5 でで 1 0 分間加熱変性 させた後プローブと して用いた。 フ ァ ージを固定した二 ト ロ セ ノレ ロ ー ス フ ィ ル タ 一 は、 5 0 %ホルム ア ミ ド、 5 x S S C , 1 % S D S , 0 . 2 % フ イ コ ー ル、 0 . 2 % ポ リ ビニル ピロ リ ドン、 0 . 2 %牛血清アルブ ミ ンを含 む溶液中で 4 時間、 3 7 °Cプレハイ ブ リ ダイ ズした後、 更に上記のプローブを含む伺様の溶液中で 1 晚振と う し、 ハィ ブ リ ダィ ズさせた。 An approximately 1 Kb EcoRI fragment (described in Example 6) contained in the rat HCNP precursor cDNA clone (R4) was ligated to a random primer kit (Amersham). The product was radiolabeled with 32 P, and denatured by heating with 95 for 10 minutes before use as a probe. The fixed two-fourth phenolic cellulose filter is 50% formamide, 5x SSC, 1% SDS, 0.2% figure, 0. After prehybridizing at 37 ° C for 4 hours in a solution containing 2% polyvinylpyrrolidone and 0.2% bovine serum albumin, the solution containing the above-mentioned probe is added to the sample solution. And shaked it for a while.
フ ィ ルタ一の洗浄は 2 x S S C中で 3 0 分間、 室温で 行った後、 更に 2 X S S C , 1 % S D S中で 2 時間、 5 0 °Cで行った。 フ ィ ルタ 一を乾燥後、 オー ト ラ ジオグラ フ ィ 一を行った。 その結果、 1 X 1 0 5 p f uあた り約 1 0 個のポジテ ィ ブプラー クが得られ、 これらの操作を 3サイ ク ル繰り返す事によ り、 それぞれの ク ロー ンの単 —化を行った。 これらのポジティ ブプラ ー クの内、 特に そのシグナルの強い ものを、 それぞれ ヒ ト胎児脳 c D N Aラ イブラ リ ーから 1 5 ク ロ ー ン （ f b — 1 〜 ： f b — 1 5 ) 、 ヒ ト胎盤 c D N Aライ ブラ リ ーから 4 ク ロー ン ( p i — 1 、 3、 4 、 5 ) 選択 した。 これら合計 1 9 の フ ァ ー ジク ロー ン よ り実施例 6 に示された手順に従って 調製した D N Aを E c 0 R I によ り消化し、 c D N Aィ ンサ一 トの長さを調べた。 このう ち最長の c D N Aィ ン サー ト （ 1 . 4 K b ) を有する ク ロー ン （ p 1 — 3 ) の E c o R I 断片を、 pBluescript IIベク ター （ス ト ラ タ ジー ン社製） の E c 0 R I サイ ドにサブク ロー ン した。 実施例 1 1 The filter was washed in 2 × SSC for 30 minutes at room temperature, and then further in 2 × SSC, 1% SDS for 2 hours at 50 ° C. After drying the filter, I went to the Philippines. Performing reduction - result, 1 X 1 0 5 pfu per Ri about 1 0 of Pojite I Bupura click is obtained, Ri by the repeating these operations a 3 rhino click le, single respective click loans Was. Of these positive plaques, those with particularly strong signals were obtained from the human fetal brain cDNA library by 15 clones (fb-1 to fb-15) and human placenta, respectively. c Four clones (pi-1, 3, 4, 5) were selected from the DNA library. DNA prepared according to the procedure described in Example 6 from these 19 phage clones was digested with Ec0RI, and the length of the cDNA insert was examined. Of these, the EcoRI fragment of the clone (p1-3) having the longest cDNA insert (1.4 Kb) was converted into a pBluescript II vector (Stratagene). Subclone to the Ec0RI side. Example 1 1
ラ ッ ト H C N Pを含む前駆体遺伝子に相応する ヒ ト型 c D N A遺伝子の塩基配列の決定  Determination of the nucleotide sequence of the human cDNA DNA gene corresponding to the precursor gene containing rat HCNP
上記実施例 1 0 の如 く pBluescript ]1ベク ターにサブ ク 口一ン した c D N Aの塩基配列を実施例 6 の方法に従 つて決定した。 この結果、 p i — 3 には真核生物の開始 コ ドンである A T Gに始ま るオープン リ ーディ ン グフ レ 一厶が含まれていたが、 ポ リ （ A ) 付加シグナルである AATAAA配列に一致する配列及びポ リ （ A ) 配列は含まれ ていない事が明かとな った。 オープン リ ーディ ン グフ レ ームを含む c D N Aの塩基配列を配列番号 ： 1 3 に記載 した。 ま た、 配列番号 ： 1 3 に記載の塩基配列 よ り 演繹 されたア ミ ノ 酸配列を配列番号 ： 1 4 に記載 した。 なお、 記載さ れたア ミ ノ 酸配列には開始コ ド ン A T Gに よ り コ ― ドさ れる メ チォニ ンは含ま れていない。 推定 し得る ァ ミ ノ 酸配列は 1 8 6 ア ミ ノ 酸よ り な り 、 こ の う ち配列番 号 ： 1 5 に記載のオ リ ゴぺプチ ドは配列番号 ： 1 4 に記 載のポ リ ペプチ ドの 1 番目 のア ミ ノ 酸 （プロ リ ン） 力、 ら 1 1 番 目 のア ミ ノ 酸 （ ロ イ シ ン） までの領域に相当する。 ヒ ト 由来神経栄養べプチ ドをコ一 ドする塩基配列を配列 番号 ： 1 6 に併せて記載 した。 As in Example 10 above, the base sequence of the cDNA subcloned into the pBluescript] 1 vector was determined according to the method of Example 6. As a result, pi-3 contained an open reading frame starting at ATG, the eukaryotic initiation codon, but was identical to the AATAAA sequence, which is a poly (A) addition signal. It became clear that the sequence and the poly (A) sequence were not included. The nucleotide sequence of the cDNA containing the open reading frame is shown in SEQ ID NO: 13. did. In addition, the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13 is shown in SEQ ID NO: 14. The amino acid sequence described does not include the methionine encoded by the start codon ATG. The deducible amino acid sequence is composed of 1886 amino acids, and the oligopeptide described in SEQ ID NO: 15 is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14. This corresponds to the region from the first amino acid (proline) power of the polypeptide to the first amino acid (loisin). The nucleotide sequence encoding the human-derived neurotrophic peptide is also shown in SEQ ID NO: 16.
実施例 1 2 Example 1 2
組換えべク 夕 一の構築  Construction of recombination vector
I ) 大腸菌で発現する組換えべ ク タ ーの構築  I) Construction of recombinant vector expressed in Escherichia coli
ラ ッ ト海馬由来及び ヒ ト 由来の神経栄養べプチ ドを含 む前駆体遺伝子に コ ー ドさ れる 夕 ンパ ク質を発現させる ため、 trp- lac の融合プロ モー タ ー よ り 誘導さ れた強力 な trc プロ モータ 一を含む発現ベク タ ー p K K 2 3 3 - 2 ( ク ロ ンテ ッ ク社製） （E. Amann and J. Broslus ： Gene, 40, 183, 1985; 及び D. Straus and W.  Induced by a trp-lac fusion promoter to express proteins encoded by precursor genes containing rat hippocampus-derived and human-derived neurotrophic peptides. Expression vector p KK233-3-2 (manufactured by Clontech) containing a strong trc promoter (E. Amann and J. Broslus: Gene, 40, 183, 1985; and D. Straus and W.
Gilbert ： Pro Natl. Acad. Sci. USA, 82, 2914, 1985) に c D N A遺伝子を導入する こ と に した。 こ の発 現ベク タ ーは、 ユニー ク な制限酵素部位 Ncol (CCATGG) に翻訳開始コ ド ンであ る ATG 配列を有 し、 その上流域に 原核生物の リ ボゾーム結合部位を併せ持つ ている。 又、 強力な原核生物の転写終結シ グナルであ る T1T2タ ー ミ ネ 一夕 一を持っている。 こ の発現べク タ 一に c D N Aを導 入 し組換えベク タ ーの構築を行う際は、 図 6 に示される 手順に従っ た。 まず、 ク ロー ン A 0 1 0 — 1 2 及び p 1 ― 3 c D N Aを E c o R I で切断し、 大腸菌 D N Aポ リ メ ラ ーゼ I Kl enow Fragment によ つて末端を平滑化する。 反応条件は 1 0 0 〃 1 の 6 7 m M T r i s — H C ^ ( H 7 . 4 ), 6 . 7 m M M g C £ 2 , l m M 2 — メ ルカプ トエタ ノ ール、 各 I m M d A T P , d G T P , d C T P， d T T P , 0 . 5 g D N A , 0 . 2 5 υ n i t s の D N Aポ リ メ ラ ーゼ I Klenow fragment を混 合 し、 3 7 °Cで 3 0 分間イ ンキュベー ト した。 サンプル をフ エ ノ ール一 ク ロ 口ホルム処理した後、 エタ ノ ール沈 澱によ って精製濃縮した。 Gilbert: Pro Natl. Acad. Sci. USA, 82, 2914, 1985) decided to introduce a cDNA gene. This expression vector has an ATG sequence which is a translation initiation codon at a unique restriction enzyme site Ncol (CCATGG), and also has a prokaryotic ribosome binding site upstream thereof. T1T2 terminal, a powerful prokaryotic transcription termination signal I have one night. When a cDNA was introduced into this expression vector to construct a recombinant vector, the procedure shown in FIG. 6 was followed. First, the clones A 0 10-12 and p 1-3 cDNA are cut with Eco RI, and the ends are blunt-ended with E. coli DNA polymerase I K F enow Fragment. The reaction conditions were 100 〃 1, 67 mm MT ris — HC ^ (H7.4), 6.7 mm MM g C £ 2 , lm M 2 — melcaptoethanol, each ImMd ATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0.5 g DNA, 0.25 υ nits DNA polymerase I Mix Klenow fragment and incubate at 37 ° C for 30 minutes did. After the sample was treated with phenol mono-cloth form, it was purified and concentrated by ethanol precipitation.
上記の如 く して末端処理された c D N Aを、 予め Ncol で分解後、 マ ン グビー ン ヌ ク レアーゼ （Mung Bean  The cDNA end-treated as described above was digested with Ncol in advance, and then Mung Bean Nuclease (Mung Bean Nuclease)
Nuclease) によ って平滑末端化処理後、 新たに Smal部位 を挿入した発現べク タ一 P K K 2 3 3 — 2 D N Aへ導入 した。 発現ベク ターの構築方法は、 以下の通りである。  After blunt-end treatment with Nuclease), the gene was introduced into the expression vector PKK23-3—2DNA into which a new Smal site was inserted. The method for constructing the expression vector is as follows.
3 0 m Μ 酢酸ナ ト リ ウ ム （ p H 4 . 6 ) , 5 0 m M N a C ^ , I m M酢酸亜鉛， 5 % グ リ セ ロ ール，  30mΜ sodium acetate (pH 4.6), 50mM NaC ^, ImM zinc acetate, 5% glycerol,
5 uni ts// 1 Mung Bean Nucleaseの組成カヽらなる 1 (D 予め N c o ^ で切断された p K K 2 3 3 — 2 D N Aを含 む 5 0 ζ 1 の反応溶液を、 3 7 °Cで 3 0 分間保温 し、 末 端を平滑化する。 次いで、 5 ' 末端を リ ン酸化した Sma I リ ン カ 一 （東洋紡社製） を付加 した。 リ ンカ一付加反 応の条件は以下の通 りである。 0 . 5 gの c D N Aを 含む 1 0 0 〃 _g の反応液 （ 2 0 m M T r i s - H C β ( P H 7 . 6 ， 6 . 7 m M M g C ^ 2 ， 6.7 m M ジ チ オ ス レ イ ト 一フレ， I m M A T P , l O O p m o 5 uni ts // 1 Mung Bean Nuclease composition 1 (D 50 ζ 1 reaction solution containing pKK2 3 3 — 2 DNA previously cut with Nco ^ was incubated at 37 ° C. Incubate for 30 minutes to smooth the end, and then add Sma I linker (Toyobo) with phosphorylated 5 'end. The corresponding conditions are as follows. A 100 __g reaction solution containing 0.5 g of cDNA (20 mM MTris-HCβ (PH 7.6, 6.7 mm Mg C ^ 2 , 6.7 mM dithiothre) It is free, Im MATP, l OO pmo
S m a I リ ン カ一一 5 0 0 un i t s の T 4 D N A リ ガ一 ゼ） で 1 2 °C、 ー晚イ ン キ ュ ベー ト した後 6 5 °Cで 1 0 分間加熱する こ とによ り酵素を失活させた。 その後、 大 腸菌 J M 1 0 9 に上記の如 く 処理した発現ベク ターを導 入 し、 形質転換体を得、 新たに Smal部位の付加された発 現ベク ター D N Aを保有する形質転換体を選別 した。 求 める形質転換体よ り プラス ミ ド D N Aを回収し、 SmaI Linker (T4 DNA ligase of 500 un its) at 12 ° C, heat incubate at 65 ° C for 10 minutes after incubating. Deactivated the enzyme. Thereafter, the expression vector treated as described above was introduced into E. coli JM109, a transformant was obtained, and a transformant having the expression vector DNA to which a Smal site was newly added was obtained. Sorted out. Recover plasmid DNA from the desired transformant,
S m a I で切断後、 大腸菌アルカ リ 性フ ォ スフ ァ ターゼ で処理した。 After digestion with SmaI, it was treated with E. coli alkaline phosphatase.
上記の如 く 処理した発現べク ターに平滑末端化処理し たラ ッ ト海馬由来及びヒ ト由来の前駆体遺伝子を挿入 し、 組換えベク ターを構築 した。 組換えベク ターの構築の反 応条件は以下の通りである。  Recombinant vectors were constructed by inserting the blunt-ended rat hippocampus-derived and human-derived precursor genes into the expression vector treated as described above. The reaction conditions for the construction of the recombinant vector are as follows.
2 0 m M Tris-HCl ( H 7 . 6 ), 6 . 7 m M  20 mM Tris-HCl (H7.6), 6.7 mM
M g C 2 , 6 . 7 m Mジチオス レィ ト ール， I m M A T P , 0 . ベク タ 一 D N A， 0.5 W g c D N A 及び 5 u n i t s の T 4 D N A リ ガーゼを含む 1 0 〃 ^ の反応溶液で 1 2 ° (：、 ー晚イ ンキュベー ト し、 その内 4 〃 ^ を用いて大腸菌 J M 1 0 9 コ ン ビテ ン ト セ ル （東 洋紡社製） に D N Aの導入を図った。 発現ベク ターには、 ア ン ピシ リ ン耐性遺伝子が含まれているので、 5 0 〃 g のア ン ピシ リ ンを含む寒天培地にコ ン ビテ ン トセルをプ レ 一テ ィ ン グ し形質転換体を得た。 出現したコ ロニーを 格子付き のニ ト πセ ルロ ース メ ンブ レ ン フ ィ ルタ ーの格 子に一ク ロー ンずつ植菌 しー晚ア ン ピシ リ ンの入った寒 天培地上で培養 し、 再度コ ロニーを形成させた。 フ ィ ル 夕一に実施例 7で用いたフ ァ ー ジのス ク リ 一ニン グと同 様の方法でプラス ミ ド D NAを固定し、 R 4 c D NAを プローブと してコ ロニーノヽイ ブ リ ダイゼー シ ョ ン法によ り 目的の ク ロ ー ン （ pKK233- 2- A01012, pkk233 - 2 - p 13)を 得た。 （第 6図参照） In a 10 含 む ^ reaction solution containing Mg C 2, 6.7 mM dithiothreitol, Im MATP, 0.5 vector DNA, 0.5 W gc DNA and 5 units of T4 DNA ligase. After incubating at 12 ° (: ：), the DNA was introduced into Escherichia coli JM109 combinant cells (manufactured by Toyobo) using 4〃 ^ of them. Contains 50 μg of ampicillin resistance gene The transformant was obtained by plating the combinant cells on an agar medium containing ampicillin. The colonies that appeared were inoculated one by one into the lattice of a nit π-cellulose membrane filter with a grid, and were placed on an agar medium containing ampicillin. After culturing, colonies were formed again. In the evening, plasmid DNA was immobilized in the same manner as in the screening of the phage used in Example 7, and colony was probed with R4c DNA as a probe. The desired clones (pKK233-2-A01012, pkk233 -2 -p13) were obtained by the hybridization method. (See Fig. 6)
I ) 哺乳動物培養細胞系で発現する組換えベク ターの 構築  I) Construction of recombinant vector expressed in mammalian cell line
ラ ッ ト海馬由来及びヒ ト 由来神経栄養べプチ ドを含む 前駆体タ ンパク質を哺乳動物由来の培養細胞に於いて発 現させるため、 実施例 7で得られた配列番号 ： 2に記載 された塩基配列を有する ラ ッ ト c D N Aク ロ ー ン A O 1 0 - 1 2及び実施例 1 1 で得られた配列番号 ： 1 3に記 載された塩基配列を有する ヒ ト c D N Aク ロー ン p 1 - 3を発現ベク ターに組み込んで大腸菌形質転換体を得た 用いられた発現ベク ターは以下のよ う に構築 した。  In order to express a precursor protein containing rat hippocampus-derived and human-derived neurotrophic peptides in cultured cells derived from mammals, it is described in SEQ ID NO: 2 obtained in Example 7. Human cDNA clone having the nucleotide sequence described in Rat cDNA clone AO10-12 obtained in Example 11 and SEQ ID NO: 13 obtained in Example 11 An Escherichia coli transformant was obtained by incorporating p 1-3 into an expression vector. The expression vector used was constructed as follows.
pBluescript E (ス ト ラ タ ジー ン社製） の X b a I切断 部位に p MD S Gに含まれる MMTV由来の L T R配列 を有する 1 . 4 K b H i n d i!断片の末端を、 本項 I ) に記載された方法に準じて処理して挿入 した。 次い で、 上記プロモー タ ー配列を有する組換えべク 夕一の X h o I の切断部位に S V 4 0 の T抗原のポ リ （ A ) 付 加シグナルを有する B e I I — E c o R I 断片 （ 1 K b ) を導入 した。 更に、 p MA N— n e o ( ク ロ ンテ ッ ク 社製） に含まれる ネオマイ シ ン耐性遺伝子を有する 2. 6 K b B a m H I 断片を、 予め S m a I 部位に K p n I リ ンカ一を導入 した p U C l 9 の B a n H I 部位に挿 入 した。 得られた ク ロー ン D N Aよ り 2. 6 K b K p η I 断片を切り 出 し、 組み換え発現ベク ターの K p n I 部位に導入 し、 これを発現ベク ター と した （第 7図） 。 The end of the 1.4 Kb H indi! fragment having the MMTV-derived LTR sequence contained in pMDSG at the XbaI cleavage site of pBluescript E (Stratagene) Inserted after processing according to the method described. Next, the recombinant vector having the above promoter sequence A BeII-EcoRI fragment (1 Kb) having a poly (A) addition signal of the SV40 T antigen was introduced into the XhoI cleavage site. Furthermore, a 2.6 Kb Bam HI fragment having a neomycin resistance gene contained in pMAN-neo (manufactured by Clontech) was previously added with a KpnI linker at the SmaI site. It was inserted into the BanHI site of the introduced pUC19. A 2.6 Kb Kp η I fragment was excised from the obtained cloned DNA and introduced into the Kpn I site of the recombinant expression vector, which was used as an expression vector (Fig. 7).
上記のよ う に構築された発現ベク ターの E c 0 R I 切 断部位に ク ロー ン A O 1 0 — 1 2及び p 1 一 3 の E c o R I c D N A断片を導入し、 本項 I ) と同様に R 4 c D N Aをブローブと してコ ロ ニーハイブ リ ダィゼーシ ョ ン法によ り 目的のク ロ ー ンを得た。  The clone AO 10 —12 and p13 EcoRI cDNA fragments were introduced into the Ec0RI cleavage site of the expression vector constructed as described above, and Similarly, using R4 cDNA as a probe, the desired clone was obtained by the colony hybridization method.
得られた ク ロー ンを p MM T V— L T R— A O 1 0 1 2及び p MMT V— L T R— p 1 3 と命名 した （第 7 図）  The resulting clones were named pMMTV-LTR-AO102 and pMMTV-LTR-p13 (Fig. 7).
実施例 1 3 Example 13
形質転換体の調製と培養、 発現  Preparation, culture and expression of transformants
I ) 大腸菌に於ける前駆体夕 ンパク質の発現  I) Expression of precursor protein in E. coli
得られた組換えベク ターを保有する形質転換体を 2 m Mイ ソプロ ピル一 3— D—チォガラ ク ト ピラ ノ シ ド （ ί P TG) を含む液体培地 3 で後期対数増殖期まで培養し、 遠心によ って形質転換 した大腸菌を集めた。 S D Sを含 むサンプルノく ッ フ ァ ー （ 5 0 m M T r i s - C £ ( ρ H 6 . 8 ), 1 0 O mMジチ オ ス レ ィ ト ー ル， 2 % S D S , 0. 1 %ブロ モ フ エ ノ ー ノレブル一 （ B P B ) , 1 0 % グ リ セロール） 6 0 〃 に懸濁 し、 1 0 0 °Cで 4 分 間加熱する こ と に よ っ て、 タ ンパク質を可溶化する。 サ ンプルの 1 Z 3 にあたる 2 0 〃 ^ を用ぃて 1 %の 303 を含む 1 2 %ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動を行いThe resulting transformant containing the recombinant vector was cultured in a liquid medium 3 containing 2 mM isopropyl-13-D-thiogalactopyranoside (ίPTG) until late logarithmic growth. The transformed E. coli was collected by centrifugation. Sample buffer containing SDS (50 m MT ris-C £ (ρH 6.8), 10 OmM dithiothreitol, 2% SDS, 0.1% bromoeno-noreble (BPB), 10% glycerol) 60 The protein is solubilized by resuspending in 〃 and heating at 100 ° C for 4 minutes. Perform 20% polyacrylamide gel electrophoresis containing 1% of 303 using 20 〃 ^, 1Z3 of the sample.
( U . K . L a e mm i ： N a t u r e , 2 2 7 , 6 8 0 , 1 9 7 0 ) 、 その後 ミ リ ポア社製のィ モ ビ ロ ン P V D F ト ラ ン ス フ ァ 一 メ ン ブ レ ン に タ ンノ、。ク質を転写し(U.K.Laemmi: Nature, 222, 680, 1970), followed by a Millipore immobilon PVDF transfection member. Tanno in Ren. Transfer the material
(T. Manabe et al. ： Anal. Bi ochem. , 1 4 3， 3 9，(T. Manabe et al .: Anal. Biochem., 144, 39,
1 9 8 4 ) 、 実施例 3 に記述されたラ ッ ト H C N Pに対 するポ リ ク ロ一ナル抗体を用いた前駆体タ ンパク質の検 出方法に準じてラ ッ ト及びヒ ト c D N A遺伝子を有する 形質転換体の産生する 目的のタ ンパク質の検出を行ったRat and human cDNA according to the method for detecting a precursor protein using a monoclonal antibody against rat HCNP described in Example 3). The target protein produced by the transformant having the gene was detected.
(櫻林郁之介等 ： "遺伝子 · タ ンパク質実験操作プロ ッ テ ィ ン グ法 " ， ソ フ ト サイ エ ン ス社， 1 9 8 7 ) 。 そ の 結果、 形質転換体が産生したラ ッ ト及びヒ ト の前駆体夕 ンパク質が検出され、 組換えべク タ一が期待通り に発現 の機能を果た している こ とが確認された。 (Ikunosuke Sakurabayashi, et al .: "Gene / protein experimental manipulation method", Soft Science Inc., 1987). As a result, rat and human precursor proteins produced by the transformants were detected, and it was confirmed that the recombinant vector was performing the function of expression as expected. Was.
I ) 哺乳動物培養細胞に於ける前駆体タ ンパク質の発 得られた組換えベク ターを保有する大腸菌の形質転換 体よ り組換え D N Aを調製し、 3 0 〃 gの組換え D N A を D N A ト ラ ンスフ エ ク シ ヨ ンキ ッ ト （ フ ァ ノレマシア社 製） を用いて ト ラ ンスフ エ ク シ ヨ ン した。 用いた細胞は、 マウ ス胎児繊維芽細胞由来 N I H / 3 T 3細胞であ り、 直径 1 0 cmのディ ッ シュ当た り 1 X 1 0 6 個の細胞を撒 いて、 D N A— リ ン酸カルシウム共沈澱法によ り遺伝子 の導入が為された。 遺伝子導入の手順はフ ア ルマ シア社 の方法に準じて行った。 ネオマイ シ ン耐性の表現型選択 性を示す形質転換体は、 4 0 0 / g Z のネオマイ シ ン (ジエ ネティ シ ン ： G 4 1 8 ) を含む 1 0 %牛血清入り D M E M培地での 2週間培養を続ける こ とによ って得ら れた。 1 枚のプレー ト に接着した細胞を 0. 2 5 % ト リ プシ ン溶液ではがした後、 7枚のプレー ト に撒き直し、 更に 2週間培養を続け単一の ク ロー ンを得た。 各々 の ク ロー ンを更に培養し、 ネオマイ シ ン耐性細胞よ り染色体 D N Aの調製を行った （J. Sambrook et al. ： I) Recombinant DNA was prepared from a transformant of Escherichia coli harboring the recombinant vector in which the precursor protein was obtained in cultured mammalian cells, and 30 μg of the recombinant DNA was converted to DNA. Transfection was performed using a transfection kit (manufactured by Fanoremasia). The cells used were NIH / 3T3 cells derived from mouse fetal fibroblasts were seeded at 1 × 10 6 cells per dish with a diameter of 10 cm and subjected to DNA-calcium phosphate co-precipitation. More gene transfer was done. The procedure for gene transfer was performed according to the method of Pharmacia. Transformants exhibiting phenotypic selectivity for neomycin resistance were expressed in DMEM medium containing 10% bovine serum containing 400 / g Z neomycin (diegenicin: G418). Obtained by continuing weekly culture. After the cells adhered to one plate were detached with a 0.25% trypsin solution, they were re-plated on seven plates, and the culture was continued for another two weeks to obtain a single clone. Each clone was further cultured, and chromosomal DNA was prepared from neomycin-resistant cells (J. Sambrook et al .:
Molecular Cloning - A laboratory manual , 2nd. e d . " , Cold Spring Harbor Lab. , New York, 1989) 0 Molecular Cloning-A laboratory manual, 2nd.ed. ", Cold Spring Harbor Lab., New York, 1989) 0
得られた染色体 D N Aを E c o R I で切断後、 0. 7 %ァガロースゲル電気泳動で分離し、 R 4 c D N Aをプ ローブと してサザン · ハイブ リ ダイゼーシ ョ ンを行った (J. Sambrook et a 1. ： "Molecular C 1 on i ng-A laboratory manual, 2nd. ed."， Cold Spring Harbor Lab. , New York, 1989) 。 その結果、 目的のラ ッ ト及び ヒ ト の前駆体遺伝子を有する形質転換 N I H/ 3 T 3及 び P C— 1 2細胞の取得が確認された。  The obtained chromosomal DNA was cut with EcoRI, separated by 0.7% agarose gel electrophoresis, and subjected to Southern hybridization using R4c DNA as a probe (J. Sambrook et a. 1 .: "Molecular C 1 on ng-A laboratory manual, 2nd. Ed.", Cold Spring Harbor Lab., New York, 1989). As a result, it was confirmed that transformed NIH / 3T3 and PC-12 cells having the desired rat and human precursor genes were obtained.
得られた形質転換細胞を 1 Mのグルコ コルチコィ ド (デキサ メ タ ゾン） を含む培地で 1 2時間培養し、 MMTV の LTR 配列に存在するプロモー夕一からの転写を促進さ せた後、 細胞を集め、 前駆体タ ンパク質の発現を検討し た。 本項 I ) で記述 した様に、 形質転換細胞のタ ンパク 質を可溶化した後、 ポ リ ア ク リ ルゲル電気泳動にかけゥ エ スタ ンブロティ ン グ法によ り タ ンノ ク質をィモ ビロ ン P V D F フ ィ ルターに吸着させ、 ラ ッ ト H C N P に対す るポ リ ク ロ一ナル抗体で目的のタ ンパク質の検出を行つ た。 The resulting transformed cells were cultured in a medium containing 1 M glucocorticoid (dexamethasone) for 12 hours. After promoting the transcription from the promoter present in the LTR sequence, the cells were collected and examined for the expression of the precursor protein. As described in this section I), the proteins of the transformed cells are solubilized, and then subjected to polyacryl gel electrophoresis. The protein was adsorbed on a PVDF filter, and the target protein was detected with a polyclonal antibody against rat HCNP.
その結果、 目的のラ ッ ト及び ヒ トの前駆体タ ンパク質 が哺乳動物培養細胞由来の形質転換体よ り検出され、 発 現べク タ一が正常に機能 している事が確認された。  As a result, the target rat and human precursor proteins were detected from transformants derived from cultured mammalian cells, and it was confirmed that the expression vector was functioning normally. .
実施例 1 4 Example 14
hHCNP (1-11) (配列番号 ： 1 5 ) の合成  Synthesis of hHCNP (1-11) (SEQ ID NO: 15)
使用 した樹脂は粒径 1 0 0 — 2 0 0 メ ッ シュの ク ロ 口 チ メ ル化されたポ リ スチ レ ン ビニルベンゼン樹脂である ( 1 % ジ ビニルベ ンゼ ンで架橋、 樹脂 1 g当た り 0 . 6 4 ミ ルモルの ク ロ ラ イ ドを含有） 。 ポ リ ペプチ ドを合成 するに当た り 4 . 7 9 gの B o c — L e u — 〇 Hをェチ ルアルコ ール 4 5 ιηβ、 水 1 5 m へ溶解し、 2 0 %炭酸セ シゥム水溶液にて P H 7 と し、 減圧濃縮し、 乾燥させた これに D M F 2 0 0 を加え、 2 0 gの ク ロ ロ メ チル化 樹脂を加え、 5 0 °Cにて 2 4 時間攪拌し、 エステル化し た。 得られた B o c — L e u — 〇 —樹脂を濾過 し、 9 0 % D M F , D M F , エチルアルコールにて順次洗浄 し、 かつ乾燥 した。 収量 2 1 . 8 g。 こ の B o c - L e u — O—樹脂 6 gを固相合成反応容 器に入れ、 後記スケ ジュ ール 1 に従って、 The resin used is a polymethylene vinylbenzene resin with a particle size of 100 to 200 mesh and a mouth opening (crosslinked with 1% divinylbenzene, 1 g resin) It contains 0.64 millimoles of chloride.) To synthesize the polypeptide, 4.79 g of Boc—Leu—〇H was dissolved in ethyl alcohol 45 ェ ιηβ and 15 m of water, and a 20% aqueous solution of cesium carbonate was dissolved. The mixture was concentrated to a pH of 7, and concentrated under reduced pressure, and dried. DMF 200 was added thereto, and 20 g of a chloromethylated resin was added. Was converted. The obtained Boc—Leu—〇—resin was filtered, washed sequentially with 90% DMF, DMF, and ethyl alcohol, and dried. Yield 21.8 g. 6 g of the Boc-Leu-O-resin was placed in a solid-phase synthesis reactor, and according to Schedule 1 described below.
B o c - P r o - O H, B o c - G ^ y - O H, B o c - S e r ( B z ) - O H, B o c - T r p - O H, B o c - L y s ( C ^ Z ) 一 O H, B o c - S e r ( B z £ ) - O H, B o c — L e u — 〇 H， B o c — A s p ( 0 c H e x ) - O H, B o c - V a - O H, B o c - P r o — 0 Hを順次カ ッ プ リ ン グさせた。 その結果、 h H C N P ( 1 — 1 1 ) ペプチ ド樹脂 1 に 9 gが得ら れた。 Boc-Pro-OH, Boc-G ^ y-OH, Boc-Ser (Bz) -OH, Boc-Trp-OH, Boc-Lys (C ^ Z) -OH, Boc-Ser (Bz £) -OH, Boc—Leu—〇H, Boc—Asp (0cHex) -OH, Boc-Va-OH, Boc-Pro— 0 H was sequentially coupled. As a result, 9 g of hHCNP (1-111) peptide resin 1 was obtained.
こ の h H C N P C l — 1 1 ) ペプチ ド樹脂 6. 0 0 g にァニ ソ 一 ル 9 、 ェチノレ メ チ ルス ル フ イ ド 1 . 5 τηβ、 無水フ ッ 化水素 6 077ζ を加え、 — 2 0 °C 6 0分間、 0 °C 6 0分間反応させた。 減圧濃縮後、 ジェチルエーテル 2 0 0 を加え 3 0分間攪拌し、 濾過しジェチルエーテル 1 0 0 で洗浄した。 濾上物に 5 %酢酸水 2 0 0 を加 えて 3 0分間攪拌後、 樹脂を濾別 し、 5 %酢酸水 1 0 0 で洗浄した。 濾洗液を凍結乾燥後、 得られた粗ぺプチ ドを 0 . 1 % T F A水 l O O m に溶解し、 予め 0. 1 % T F A水で平衡化させた逆相系充塡剤  This hHCNPCl — 11 1) To 6.0 g of the peptide resin, add anisol 9, ethyl methyl sulfide 1.5 τηβ, and anhydrous hydrogen fluoride 6077ζ, and then add —2 The reaction was performed at 0 ° C for 60 minutes and at 0 ° C for 60 minutes. After concentration under reduced pressure, dimethyl ether 200 was added, the mixture was stirred for 30 minutes, filtered, and washed with dimethyl ether 100. To the filtered product was added 5% aqueous acetic acid (200), and the mixture was stirred for 30 minutes. Then, the resin was separated by filtration and washed with 5% aqueous acetic acid (100). After freeze-drying the filtrate, the obtained crude peptide was dissolved in 0.1% TFA water lOOm, and the reversed-phase packing material was equilibrated with 0.1% TFA water in advance.
Y M C - A 3 6 3 ( S - 5 ) O D Sカ ラム （3 0 0 x 2 5 0 mm) に注入 し、 カ ラムを 0 . 1 % T F A水で洗浄後、 ァセ トニ ト リ ル濃度を 4 8 0分で 2 6 %まで増加させ、 流速 6 . 0 / m i nで溶出 した。 溶出液を A 2 8 0 n mでモニター し、 目的物を含む画分を集め、 凍結乾燥 し、 h H C N P ( 1 - 1 1 ) 4 7 1 . l mgを得た。 Inject YMC-A366 (S-5) ODS column (300 x 250 mm), wash the column with 0.1% TFA water, and adjust the acetonitrile concentration to 4 It was increased to 26% in 80 minutes and eluted at a flow rate of 6.0 / min. Monitor the eluate at A280 nm, collect fractions containing the target compound, and freeze-dry Then, h HCNP (1-11) 47 1 .1 mg was obtained.
得られた h H C N P ( 1 - 1 1 ) は、 逆相系充塡剤 Y C - A 3 0 3 ( S — 5 ) — O D S カ ラ ム （ 4 . 6 φ X 2 5 0 mm ) を用レ、た、 1 0 %カ、ら 5 0 %までの 0 . 1 % TFA を含むァセ トニ ト リ ルの直線濃度勾配溶出法によ る分析において保持時間 3 1 . 0 分を示 し、 そのア ミ ノ 酸分析値は理論値と一致した。  The obtained hHCNP (1-11) was prepared using reversed-phase packing material YC-A303 (S-5) — ODS column (4.6φX250mm). In addition, a retention time of 31.0 minutes was shown in a linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 50%. The amino acid analysis values were consistent with the theoretical values.
ア ミ ノ酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 4 N メ タ ンスルホ ン酸— 2 % ト リ プ夕 ミ ン、 Hydrolysis: 4 N methansulphonic acid—2% tripmine,
1 1 0 °C , 2 4 時間  1 10 ° C, 24 hours
分析方法 ： PICO— TAG ( 逆相 - PTC ア ミ ノ 酸） 法 Analysis method: PICO-TAG (reverse phase-PTC amino acid) method
*基準ア ミ ノ 酸 （ ） 内理論値 * Reference amino acid () Theoretical value
A s X ： 1 . 1 2 ( 1 )  As X: 1.1 2 (1)
S e r ： 2 . 2 4 ( 2 )  S er: 2.2 4 (2)
G 1 y ： 1 . 1 9 ( 1 )  G1y: 1.19 (1)
P r 0 ： 2 . 1 1 ( 2 )  Pr 0: 2.1 1 (2)
V a £ ： I . 0 7 ( 1 )  V a £: I. 07 (1)
* L e u : 2 . 0 0 ( 2 ) * Leu: 2.0 .0 0 (2)
T r p ： 0 . 9 7 ( 1 )  Trp: 0.97 (1)
L y s ： 0 . 8 2 ( 1 )  Lys: 0.82 (1)
(スケ ジ ュ ール 1 )  (Schedule 1)
工程 時間 （分） X処理回数 Process time (min) X Number of treatments
1 . (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 x 31. (Washing) Methylene chloride 2 x 3
2 . (脱保護） 50 % TFA -5%エタ ン ジチオール 3 x 1 — 45%塩化メ チ レ ン （V/V)60 . 20 X 1 3. (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 X 22. (deprotection) 50% TFA -5% ethanedithiol 3 x 1 — 45% methylene chloride (V / V) 60.20 X 1 3. (Washing) Methylene chloride 2 X 2
4 . (洗浄） メ タ ノ ー ル 2 X 2 5 . (中和） 10% ト リ ェチルァ ミ ン 4. (Washing) Methanol 2 X 25. (Neutralization) 10% Triethylamine
- 90%塩化メ チ レ ン （V/V)60 1 X 1 6. (洗浄） メ タ ノ ー ル 2 X 1 7. ( 中和） 10% ト リ ェチ ルァ ミ ン  -90% methylene chloride (V / V) 60 1 X 1 6. (washing) methanol 2 X 1 7. (neutralization) 10% triethylamine
一 90%塩化 メ チ レ ン （V/V)60 1 X 1 8 . (洗浄） メ タ ノ ー ル 2 X 2 9. (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 X 3 10. ( カ ッ プ リ ン グ）  1 90% methylene chloride (V / V) 60 1 x 18 8. (washing) methanol 2 x 2 9. (washing) methylene chloride 2 x 3 10. (coupling) Ling)
各ァ ミ ノ 基保護ア ミ ノ 酸 （ 6 ミ リ モル） 、 添加剤 （HOBtま たは HONp) 、  Each amino group-protected amino acid (6 mmol), additive (HOBt or HONp),
50 DMF-50%塩化メ チ レ ン （V/V)30 5 x 1 DCC( 6 ミ リ モル） の塩化メ チ レ ン溶液  50 DMF-50% methylene chloride (V / V) 30 5 x 1 DCC (6 mmol) in methylene chloride
120X 1 120X 1
11. (洗浄） 50%DMF-50%塩化メ チ レ ン （V/V)60 τηβ 11. (washing) 50% DMF-50% methylene chloride (V / V) 60 τηβ
2 X 2 2 X 2
12. (洗浄） メ タ ノ ー ル 2 X 112. (Washing) Metal 2 X 1
13. (中和） 10% ト リ ェチ ルァ ミ ン 13. (Neutralized) 10% Triethylamine
— 90%塩化メ チ レ ン （V/V)60 1 X 1 — 90% methylene chloride (V / V) 60 1 X 1
14. (洗浄） メ タ ノ ール 2 X 214. (Washing) Metanole 2 X 2
15. (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 X 215. (Washing) Methylene chloride 2 X 2
16. (ァセ チ ル化） 25%無水酢酸 16. (Acetylated) 25% acetic anhydride
— 75%塩化メ チ レ ン （V/V)60w 15X 1 17. (洗浄） 塩化 メ チ レ ン 2 X 2 18. (洗浄） メ タ ノ ール 2 X 2 但 し、 工程 10のカ ッ プ リ ン グ反応後、 少量の樹脂を二 ン ヒ ド リ ンで試験 し、 陽性青色 とな っ た場合には、 力 ッ プ リ ン グ不完全である と して同一の保護形ァ ミ ノ 酸を用 い反応を繰 り返 した。 そ して 2 回 目以降のカ ッ プ リ ン グ の場合には、 5 0 % D M F — 5 0 %塩化メ チ レ ン （ V Z V ) の代わ り に D M F、 ま たは 1 一 メ チル一 2 — ピロ リ ジ ノ ンを用い反応時間を最大 1 2 時間 まで延長 した。 — 75% methylene chloride (V / V) 60w 15X 1 17. (Washing) Methylene chloride 2 X 2 18. (Washing) Methanol 2 X 2 However, if a small amount of resin is tested with dihydrin after the coupling reaction in step 10 and turns positive blue, Repeated the reaction using the same protected amino acid, assuming incomplete coupling. For the second and subsequent couplings, 50% DMF — 50% methylene chloride (VZV) is replaced by DMF or 1-methyl- 1 2 — The reaction time was extended to a maximum of 12 hours using pyrrolidinone.
実施例 1 5 Example 15
h H C N P ( 2 - 7 ) (配列番号 ： 1 8 ) の合成 使用 した樹脂は粒径 1 0 0 — 2 0 0 メ ッ シュ の ク ロ 口 メ チル化さ れたポ リ スチ レ ン ビニルベ ンゼ ン樹脂である ( 1 % ジ ビニルベ ンゼンで架橋、 樹脂 1 g当た り 0 . 6 6 ミ リ モルの ク ロ ラ イ ドを含有） 。 ポ リ ペプチ ドを合成 する に当た り 9 . 6 4 gの B o c — T r p — 〇 Hをェチ ルアルコ ール 1 0 Q m 、 水 3 4 7 ^に溶解 し、 2 0 %炭酸 セ シウム水溶液にて p H 7 と し、 減圧濃縮 し、 乾燥させ た。 こ れに D M F 2 4 0 を加え、 4 0 . 1 6 gの ク ロ ロ メ チル化樹脂を加え、 5 0 °Cにて 1 4 時間、 さ らに室 温にて 1 4 時間攪拌 し、 エステル化した。 得 られた B 0 c 一 T r p — 0 —樹脂を濾過 し、 9 0 % D M F、 D M F、 エチルアルコ ールにて順次洗浄 し、 かつ乾燥 した。 収量 4 6 . 8 g o  h Synthesis of HCNP (2-7) (SEQ ID NO: 18) The resin used was a 100-200 mesh mesh, methylated polystyrene vinylbenzene. Resin (crosslinked with 1% divinylbenzene, containing 0.66 millimoles of chloride per gram of resin). In synthesizing the polypeptide, 9.64 g of Boc—Trp—〇H was dissolved in ethyl alcohol (10 Qm) and water (347Q), and 20% carbon dioxide was dissolved. The solution was adjusted to pH 7 with an aqueous solution of sodium, concentrated under reduced pressure, and dried. To this was added DMF240, 40.16 g of the chloromethylated resin was added, and the mixture was stirred at 50 ° C for 14 hours and further at room temperature for 14 hours. Esterified. The obtained B0c-Trp — 0—resin was filtered, washed sequentially with 90% DMF, DMF, and ethyl alcohol, and dried. Yield 46.8 g o
こ の B o c - T r p - 〇 一樹脂 6 gを固相合成反応容 器に入れ、 後記スケ ジ ュ ー ル 1 に従って、 B 0 c — L y s ( C Z ) - O H. B o c — S e r ( z £ ) 一 〇 H、 B o c — L e u - O H、 B o c - A s p 6 g of the Boc-Trp-III resin is placed in a solid-phase synthesis reaction vessel, and B0c— according to the schedule 1 described below. L ys (CZ)-O H. B oc — Ser (z £) 100 H, B oc — L eu-OH, B oc-A sp
( O c H e x ) - O H. B o c — V a 一 〇 Hを順次力 ッ プ リ ン グさせた。 その結果、 h H C N P ( 2 — 7 ) ぺ プチ ド樹脂 8. 8 3 gが得られた。  (O c He x)-O H. B o c — V a As a result, 8.83 g of hHCNP (2-7) peptide resin was obtained.
こ の h H C N P ( 2 — 7 ) ペプチ ド樹脂 8 . 8 3 gに ァニツ ール 1 4 OT 、 ェチルメ チルスルフ ィ ド 2. 2 τηβ、 無水フ ッ化水素 1 0 0 を加え、 一 2 0 °C 9 0分間、 0 °C 7 0分間反応させた。 減圧濃縮後、 ジェチルエーテル 1 0 を加え 3 0分間攪拌し、 濾過しジェチルエーテ ル 3 0 0 と ク ロ 口 ホルム 3 0 0 で洗浄した。 濾上物 に 1 N酢酸 1 0 0 に加えて 3 0分間攪拌後、 樹脂を濾 別 し、 1 N酢酸水 4 0 で洗浄した。 濾洗液を凍結乾燥 後、 粗ペプチ ド 2. 3 8 gが得られた。  To 8.83 g of this HCNP (2-7) peptide resin, add aniitol 14 OT, ethyl methyl sulfide 2.2 τηβ, and anhydrous hydrogen fluoride 100, and add the solution at 120 ° C. The reaction was performed for 90 minutes at 0 ° C. for 70 minutes. After concentration under reduced pressure, getyl ether 10 was added, the mixture was stirred for 30 minutes, filtered, and washed with getyl ether 300 and black hole form 300. The 1N acetic acid 100 was added to the filtered product, and the mixture was stirred for 30 minutes. After freeze-drying the filtrate, 2.38 g of crude peptide was obtained.
得られた粗ペプチ ドを水 2 5 0 に溶解し、 予め 0. 1 % T F A水で平衡化させた逆相系充塡剤 YM C— R 3 5 5 - 1 5 / 3 0 — O D Sカ ラム （ 5 0 0 x 5 0 0 mm) に注入し、 カ ラムを 0. 1 % T F A水で洗浄後、 ァセ ト 二 ト リ ル濃度を 1 8 0分で 1 5 %まで、 さ らに 3 0 0分 で 3 5 %まで増加させ、 流速 1 5 Zm i n . で溶出 し た。 溶出液を A 2 2 0 n mでモニタ ー し、 目的物を含む 画分を集め、 凍結乾燥し、 h H C N P ( 2 - 7 ) 2. 0 5 4 gを得た。  The obtained crude peptide is dissolved in water 250, and a reversed-phase packing material YM C—R355-15 / 30—ODS column previously equilibrated with 0.1% TFA water (500 x 500 mm), and the column was washed with 0.1% TFA water. After that, the acetate ditolyl concentration was increased to 15% in 180 minutes and then to 3%. It was increased to 35% in 00 min and eluted at a flow rate of 15 Zmin. The eluate was monitored at A220 nm, the fractions containing the target compound were collected, and lyophilized to obtain 2.054 g of hHCNP (2-7).
得られた h H C N P ( 2 — 7 ) は、 逆相系充塡剤 Y M C— AM 3 0 3 ( S— 5 ) O D Sカ ラ ム （ 4. 6 φ X 2 5 0 ram) を用いた、 2 0 %カヽら 5 0 % までの 0 . 1 % T F Aを含むァセ トニ ト リ ルの直線濃度勾配溶出法に よる分析において保持時間 1 3 . 2 分を示 し、 そのア ミ ノ 酸分析値は理論値と一致 した。 The obtained hHCNP (2-7) is a reversed-phase packing material YMC-AM303 (S-5) ODS column (4.6φ Retention time 13.2 min in linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA up to 50% with 50% The amino acid analysis value was consistent with the theoretical value.
ア ミ ノ 酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 4 N メ タ ンスルホ ン酸一 2 % ト リ プタ ミ ン  Hydrolysis: 4 N methansulphonic acid-2% triptamin
1 1 0 で、 2 4 時間  1 1 0 for 24 hours
分析方法 ： PICO-TAG (逆相— PTCア ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PICO-TAG (reverse phase—PTC amino acid) method
*基準ァ ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Standard amino acids (in theory)
A s X ： 1 . 1 3 ( 1 )  As X: 1.1 3 (1)
S e r ： 1 . 0 5 ( 1 )  S er: 1.05 (1)
V a £ ： 1 . 0 7 ( 1 )  V a £: 1.0 7 (1)
* L e υ ： 1 . 0 0 ( 1 ) * L e υ: 1.0 0 (1)
T r ρ ： 0 . 8 0 ( 1 )  T r ρ: 0.80 (1)
L y s ： 0 . 9 4 ( 1 )  Lys: 0.94 (1)
実施例 1 6 Example 16
h H C N P ( 6 - 1 1 ) (配列番号 ： 1 9 ) の合成 実施例 1 4 に記載の B o c - L e u - 0 -樹脂 6 gを 固相合成反応容器に入れ、 実施例 1 4 に記載のスケ ジュ —ル 1 に従っ て、 B o c — P r o — 〇 H、 B o c — G y — O H、 B o c — S e r ( B z ) — 〇 H、 B o c - T r p — O H、 B o c - L y s ( C β Z ) ― 0 Hを順次カ ッ プ リ ン グさせた。 その結果、 h H C N P ( 6 — 1 1 ) ペプチ ド樹脂 9 . 4 6 gが得られた。  h Synthesis of HCNP (6-11) (SEQ ID NO: 19) 6 g of Boc-Leu-0-resin described in Example 14 was placed in a solid-phase synthesis reaction vessel, and described in Example 14 According to the schedule 1, B oc — P ro — 〇 H, B oc — G y — OH, B oc — Ser (B z) — 〇 H, B oc -T rp — OH, B oc -Lys (CβZ) -0H was sequentially coupled. As a result, 9.46 g of hHCNP (6-11) peptide resin was obtained.
こ の h H C N P ( 6 — 1 1 ) ペプチ ド樹脂 9 . 4 6 g にァニフ ール 1 H ェチル メ チルスルフ ィ ド 2 . 4 τηβ 無水フ ッ 化水素 1 0 0 を加え、 一 2 0 で 6 0 分間、 0 °C 7 0 分間反応させた。 減圧濃縮後、 ジェチルエーテル 1 0 を加え 3 0 分間攪拌し、 濾過しジェチルェ一テ ル 1 5 0 と ク ロ 口ホルム 1 5 0 で洗浄した。 濾上物 に 1 N酢酸水 1 0 0 を加えて 3 0 分間攪拌後、 樹脂を 濾別 し、 1 N酢酸水 5 0 で洗浄した。 濾洗液を凍結乾 燥後、 粗ペプチ ド 2 . 8 2 gが得られた。 This HCNP (6-11) peptide resin 9.46 g To the mixture was added anifur 1 Hethyl methylsulfide 2.4 τηβ anhydrous hydrogen fluoride 100, and the mixture was reacted at 120 for 60 minutes and at 0 ° C for 70 minutes. After concentration under reduced pressure, getyl ether 10 was added, and the mixture was stirred for 30 minutes, filtered, and washed with getyl ether 150 and black hole form 150. 1N aqueous acetic acid (100) was added to the residue on the filter, and the mixture was stirred for 30 minutes. After freeze-drying the filtrate, 2.82 g of crude peptide was obtained.
得られた粗ペプチ ドを水 2 0 0 に溶解し、 予め 0 . 1 % T F A水で平衡化させた逆相系充塡剤 Y M C —  The obtained crude peptide was dissolved in water 200, and the reversed-phase packing material Y M C — previously equilibrated with 0.1% TFA water was used.
R 3 5 5 - 1 5 ノ 3 0 — O D S カ ラ ム （ 5 0 0 x 5 0 0 mm) に注入 し、 カ ラムを 0 . 1 % T F A水で洗浄後、 ァ セ トニ ト リ ル濃度を 1 8 0 分で 7 % まで、 さ らに 3 0 0 分で 1 5 % まで増加させ、 流速 1 5 Z m i n . で溶出 した。 溶出液を A 2 2 O n mでモニター し、 目的物を含 む画分を集め、 凍結乾燥し、 h H C N P ( 6 - 1 1 ) 1 . 1 9 4 g を得た。  R 355-150 3 30-Inject into ODS column (500 x 500 mm), wash the column with 0.1% TFA water, and adjust the acetonitrile concentration. Elution was performed at a flow rate of 15 Zmin., Increasing to 7% at 180 minutes and to 15% at 300 minutes. The eluate was monitored by A22Onm, and the fractions containing the desired product were collected and freeze-dried to obtain 1.194 g of hHCNP (6-11).
得られた h H C N P ( 6 - 1 1 ) は、 逆相系充塡剤 Y M C — A M 3 0 3 ( S — 5 ) — 〇 D S カ ラ ム （ 4 . 6 φ Χ 2 5 0 mm) を用レ、た。 2 0 %力、ら 3 5 %までの 0 , 1 % T F Aを含むァセ トニ ト リ ルの直線濃度勾配溶出法に よ る分析において保持時間 1 4 . 0 分を示し、 そのア ミ ノ酸分析値は理論値と一致した。 ア ミ ノ 酸分析 The obtained hHCNP (6-11) was prepared using reversed-phase packing material YMC—AM303 (S—5) —〇DS column (4.6φΧ250mm). , Was. Analysis by linear gradient elution of acetonitrile containing 0,1% TFA up to 35% with 20% strength showed a retention time of 14.0 minutes and the amino acid Analytical values were consistent with the theoretical values. Amino acid analysis
加水分解 ： 4 Nメ タ：ンスルホ ン酸一 2 % ト リ プ夕 ン  Hydrolysis: 4 N meta: 2% sodium sulfonate
1 1 0で、 2 4 時間  1 1 0, 24 hours
分析方法 ： PIC0-TAG (逆相— PTCア ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PIC0-TAG (reverse phase—PTC amino acid) method
*基準ァ ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Standard amino acids (in theory)
S e r ： 1 . 1 1 ( 1 )  S er: 1.1 1 (1)
G ： 1 2 5 ( 1 )  G: 1 2 5 (1)
P r o : 1 0 6 ( 1 )  P ro: 1 0 6 (1)
* L e υ ： 1 0 0 ( 1 )  * L e υ: 1 0 0 (1)
T r ρ ： 0 7 6 ( 1 )  T r ρ: 0 7 6 (1)
L y s ： 0 9 7 ( 1 )  L y s: 0 9 7 (1)
実施例 1 7 Example 17
h H C N P ( 4 - 8 ) N H 2 の合成 h Synthesis of HCNP (4-8) NH 2
使用 した樹脂は粒径 1 0 0 — 2 0 0 メ ッ シ ュ の1^ 811 A樹脂である （ 1 % ジ ビニルベ ンゼンで架橋、 樹脂 1 g 当た り 0. 7 6 ミ リ モルのア ミ ノ 基を含有） 。 こ の樹脂 3. 9 5 gを固枏合成反応容器に入れ、 実施例 1 2 に記 載のスケ ジ ユ ール 1 に従つて工程 3 よ り合成を開始し、 B 0 c - S e r ( B z ) 一 O H、 B o c - T r p - 0 H、 B o c - L y s ( C £ Z ) - O H, B o c — The resin used was 1 ^ 811 A resin with a particle size of 100-200 mesh (crosslinked with 1% divinylbenzene, 0.76 millimoles of resin per gram of resin). ). 3.95 g of this resin was placed in a solid-state synthesis reaction vessel, and synthesis was started from step 3 according to schedule 1 described in Example 12 to obtain B 0 c -S er ( B z) One OH, B oc-T rp-0 H, B oc-Lys (C £ Z)-OH, B oc —
5 e r ( B z H ) - O H. B o c — L e u - O Hを順次 力 ッ プ リ ン グさせた。 その結果、 h H C N P ( 4 - 8 ) N H 2 ぺプチ ド樹脂 6. 3 6 gが得られた。 5 er (BzH)-OH. Boc-Leu-OH were sequentially coupled. As a result, 6.36 g of hHCNP (4-8) NH2 peptide resin was obtained.
こ の h H C N P ( 4 - 8 ) N H 2 ペプチ ド樹脂 6 . 3 This h H C N P (4-8) N H 2 peptide resin 6.3
6 gにァニソ 一ル 1 0 mi！、 ェチル メ チルスルフ ィ ド 1 . S τηβ 無水フ ッ 化水素 8 0 を加え、 一 2 0 °C 6 0 分間、 0 °C 7 0 分間反応させた。 減圧濃縮後、 ジェチルェ一テ ル 1 0 0 を加え 3 0 分間攪拌 し、 濾過しジェチルェ一 テル 1 5 0 τπ と ク ロ 口 ホルム 1 5 0 で洗浄した。 濾上 物に 1 Ν酢酸水 1 0 0 を加えて 3 0 分間攪拌後、 樹脂 を濾別 し、 1 Ν酢酸水 5 0 で洗浄した。 濾洗液を凍結 乾燥後、 粗ペプチ ド 1 . 9 8 gが得られた。 Aniso per 6 g 1 0 mi! , Ethyl methyl sulfide 1. S τηβ Anhydrous hydrogen fluoride (80) was added and reacted at 120 ° C for 60 minutes and at 0 ° C for 70 minutes. After concentration under reduced pressure, 100 mL of Jethyl ester was added, and the mixture was stirred for 30 minutes, filtered, and washed with 150 mL of Jethyl alcohol and 150 mL of black hole. 100 mL of aqueous acetic acid solution was added to the filtered product, and the mixture was stirred for 30 minutes. Then, the resin was separated by filtration and washed with 50% aqueous acetic acid solution. After freeze-drying the filtrate, 1.98 g of crude peptide was obtained.
得られた粗ペプチ ドを水 2 0 0 に溶解し、 予め 0 . 1 % T F A水で平衡化させた逆相系充塡剤 Y M C —  The obtained crude peptide was dissolved in water 200, and the reversed-phase packing material Y M C — previously equilibrated with 0.1% TFA water was used.
R 3 5 5 — 1 5 Z 3 0 — 〇 D S カ ラム （ 5 0 0 x 5 0 0 mm) に注入 し、 カ ラ厶を 0 . 1 % T F A水で洗浄後、 ァ セ トニ ト リ ル濃度を 1 8 0 分で 1 1 %まで、 さ らに 3 6 0 分で 3 0 %まで増加させ、 流速 1 5 Z m i n . で溶 出 した。 溶出液を A 2 2 0 n mでモニタ 一 し、 目的物を 含む画分を集め、 凍結乾燥 し、 h H C N P ( 4 — 8 ) N H 2 0 . 7 1 5 g を得た。 R 3 5 5 — 1 5 Z 3 0 — 〇 Inject into DS column (500 x 500 mm), wash column with 0.1% TFA water, and then adjust acetonitrile concentration Was increased to 11% at 180 minutes and further to 30% at 360 minutes, and eluted at a flow rate of 15 Z min. The eluate was monitored at A220 nm, and the fractions containing the target substance were collected and freeze-dried to obtain hHCNP (4-8) NH20.715 g.
得られた h H C N P ( 4 — 8 ) N H 2 は、 逆相系充塡 剤 Y M C — A M 3 0 3 ( S - 5 ) 一 〇 D S カ ラ ム The obtained h HCNP (4 — 8) NH 2 is a reversed-phase packing material YMC — AM 3 0 3 (S-5) 〇 DS column
( 4 . 6 0 X 2 5 0 mm) を用いた、 1 0 %から 2 5 %ま での 0 . 1 % T F Aを含むァセ トニ ト リ ルの直線濃度勾 配溶出法による分析において保持時間 1 8 . 8 分を示 し、 そのァ ミ ノ 酸分析値は理論値と一致した。 ア ミ ノ 酸分析 Retention time in linear concentration gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 25% using (4.60x250mm) It showed 18.8 minutes, and the amino acid analysis value was consistent with the theoretical value. Amino acid analysis
加水分解 ： 4 Nメ タ ンスルホ ン酸一 2 %  Hydrolysis: 4 N methanesulfonate-2%
1 1 0 °C , 2 4 時間  1 10 ° C, 24 hours
分析方法 ： PICO- TAG (逆相 - PTC ァ ノ 酸） 法  Analysis method: PICO-TAG (reverse phase-PTC anoic acid) method
* 基準ア ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Reference amino acid () Theoretical value
S e r ： 2. 0 9 ( 2 )  S er: 2.09 (2)
* L e υ ： 1 . 0 0 ( 1 )  * L e υ: 1.0 0 (1)
T r ρ ： 0 . 5 2 ( 1 )  T r ρ: 0.5 2 (1)
L y s : 1 . 0 5 ( 1 )  L y s: 1.05 (1)
実施例 1 8 Example 18
H - P r o - V a l - A s p - L e u - S e L y s H-Pro-Val-Asp-Leu-SeLys
T r p - D - S e r - G l y — P r o — L e u — O HT r p-D-S e r-G l y — P ro — L e u — O H
( C D - S e r 8 〕 h H C N P ( 1 1 1 ) ) (配列 (CD - S er 8] h HCNP (1 1 1)) ( SEQ
. I  . I
番号 ： 2 2 ) の合成 No .: Synthesis of 2 2)
ア ミ ノ 酸配列 ： H— P r o — V a 1 - A s p - L e υ ン - S e r - L y s - T r p - D - S e r - G 1 y 一  Amino acid sequence: H—Pro—Va1-Asp-Le-Pin-Ser-Lys-Trp-D-Ser-G1y
P r o - L e u — O H ( 以下、 [D - S e r 8 ] h H C N P ( 1 - 1 1 ) と略す） を以下の通 り 合成 した 使用 した樹脂は粒径 1 0 0 — 2 0 0 メ ッ シ ュ の ク ロ 口 メ チル化されたポ リ スチ レ ン ビニルベ ンゼ ン樹脂である ( 1 % ジ ビニルベンゼ ンで架橋、 樹脂 1 g当た り 0 . 6 6 ミ リ モルの ク ロ ラ イ ドを含有） 。 ポ リ ぺプチ ドを合成 する に当た り 9 . 9 4 gの B o c — L e u —〇 Hをェチ ルアルコ 一ル 8 0 、 水 3 6 へ溶解 し、 2 0 %炭酸セ シゥ 厶水溶液にて ρ Η 7 と し、 減圧濃縮 した後、 乾燥さ せた。 こォ" Lに D M F 2 0 0 π を加え、 4 0 gのク ロ ロ メ チル化樹脂を加え、 5 0 °Cにて 1 2時間攪拌し、 エステ ル化した。 得られた B 0 c _ L e u — 0—樹脂を濾過し、P ro - L eu - OH (hereinafter, [D - S er 8] h HCNP (1 - 1 1) and abbreviated) resin used was synthesized Ri following through the particle size 1 0 0 - 2 0 0 menu Tsu SH CLOSE Methylated polystyrene vinyl benzene resin (crosslinked with 1% divinyl benzene, 0.66 millimoles of chloride per g of resin) Containing). In synthesizing the polypeptide, 9.94 g of Boc—Leu—〇H was dissolved in 80 ethyl alcohol and 36 water, and a 20% aqueous solution of cesium carbonate was dissolved. Ρ Η 7 and concentrate under reduced pressure. I let you. To this L, DMF 200 π was added, 40 g of a chloromethylated resin was added, and the mixture was stirred at 50 ° C for 12 hours to give an ester. The obtained B0c _ L eu — 0—filter the resin,
9 0 % D M F . D M F、 エチルアル コ ールにて順次洗浄 した後、 乾燥 した。 その収量は 4 4 . 2 5 gであった。 Washed sequentially with 90% DMF, DMF and ethyl alcohol, and dried. The yield was 44.25 g.
こ の B o c — L e u — 〇 一樹脂 8 . 5 7 gを固相合成 反応容器に入れ、 後記スケジュ ール 1 に従って、 B 0 c 一 P r o — O H、 B o c - G y - O H. B o c — D— S e r ( z £ ) — 0 H、 B o c - T r p — 0 H、  8.57 g of the Boc—Leu— — resin is placed in a solid-phase synthesis reaction vessel, and B0c—Pro—OH, Boc-Gy-OH. According to Schedule 1 described below. B oc — D— Ser (z £) — 0 H, B oc-T rp — 0 H,
B o c — L y s i C £ Z 一 〇 H、 B o c — S. e r B o c — L y s i C £ Z 〇 H, B o c — S. e r
( B z ） - O H. B o c — L e u — O H、 B o c — A s p ( O c H e x ) - O H、 B o c - V a ト 0 H、 B o c — P r o —〇 Hを順次カ ッ プ リ ン グさせた。 その 結果、 [ D— S e r 8 ] h H C N P ( l — 1 1 ) ぺプチ ド樹脂 1 5 . 0 4 gが得られた。 (B z)-O H. B oc —L eu —OH, B oc —A sp (O c H ex) -OH, B oc —V a The coupling was made. As a result, 15.4 g of [D—Ser 8 ] h HCNP (l—11) peptide resin was obtained.
こ の [ D— S e r 8 ] h H C N P ( 1 — 1 1 ) ぺプチ ド樹脂 8 . 0 gにァニ ソ ール 1 2 τη 、 ェチル メ チルスル フ ィ ド 2 m£、 無水フ ッ 化水素 8 0 を加え、 一 2 0 °C 6 0分間、 0 °C 6 0分間反応させた。 減圧濃縮後、 ジェチ ルエーテル 1 0 0 を加え 3 0分間攪拌し、 濾過しジェ チルエーテル 5 0 η で洗浄した。 濾上物に 2 0 %酢酸水This [D—Ser 8 ] h HCNP (1-11) peptide resin 8.0 g in anisol 12 τη, ethyl methyl sulfide 2 m £, anhydrous hydrogen fluoride 80 ° C. was added, and the mixture was reacted at 20 ° C. for 60 minutes and 0 ° C. for 60 minutes. After concentration under reduced pressure, 100 ml of methyl ether was added, the mixture was stirred for 30 minutes, filtered, and washed with 50 η of methyl ether. 20% aqueous acetic acid
1 0 0 を加え、 目的物を溶解し、 樹脂を濾別 した。 濾 液を凍結乾燥し、 粗ペプチ ド 3. 5 0 gを得た。 100 was added to dissolve the target substance, and the resin was separated by filtration. The filtrate was freeze-dried to obtain 3.5 g of crude peptide.
得られた粗ペプチ ドを 1 0 %酢酸水に溶解し、 あ ら力、 じめ 0. 1 % T F A水で平衡化させた逆相系充塡剤 Y M C - R 3 5 5 ( S - 1 5 / 3 0 ) O D S カ ラム （ 5 0 0 x 5 0 0 mm) に注入 し、 カ ラムを 0 . 1 % T F A水 で洗浄後、 ァセ トニ ト リ ル濃度を 3 6 0 分で 3 5 % まで 増加させ、 流速 1 4 m i n . で溶出 した。 溶出液を A 2 8 0 n mでモニタ 一 し、 目的物を含む画分を集め、 凍結乾燥 し、 [ D — S e r 8 ] h H C N P ( l — 1 1 ) 7 6 8 . 0 mgを得た。 The obtained crude peptide was dissolved in 10% aqueous acetic acid, and reverse phase sorbent was equilibrated with 0.1% aqueous TFA. Inject YMC-R355 (S-15 / 30) ODS column (500 x 500 mm), wash the column with 0.1% TFA water, The concentration was increased to 35% in 360 minutes and eluted at a flow rate of 14 min. The eluate monitored one and in A 2 8 0 nm, fractions containing the desired product were lyophilized to give - - (1 1 l) 7 6 8 0 mg [D S er 8] h HCNP. .
得られた [ D — S e r 8 ] h H C N P ( 1 — 1 1 ) は、 逆相系充塡剤 Y M C — A M 3 0 3 ( S - 5 ) 一 O D S 力 ラム （ 4 . 6 0 X 2 5 0 mm) を用いた、 1 0 %カヽら 5 0 %までの 0 . 1 % T F Aを含むァセ トニ ト リ ルの直線濃 度勾配溶出法によ る分析において保持時間 2 8 . 2 4 分 を示 し、 そのア ミ ノ 酸分析値 （但 し、 T r p は検出せず） および質量分析値は理論値と一致した。 The obtained [D — Ser 8 ] h HCNP (1 — 11 1) was converted to a reversed-phase packing material YMC — AM 3 0 3 (S-5) ODS column (4.60 X 250 analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA up to 50% with a linear concentration gradient elution method using a linear gradient elution method with a retention time of 28.24 minutes. The amino acid analysis value (Trp was not detected) and the mass analysis value were consistent with the theoretical values.
ア ミ ノ 酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸一 1 % フ ヱ ノ ー ル、  Hydrolysis: 6 N hydrochloric acid-1% phenol,
1 1 0 °C、 2 4 時間  1 10 ° C, 24 hours
分析方法 ： PIC0-TAG (逆相一 PTCア ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PIC0-TAG (reverse phase-one PTC amino acid) method
*基準ア ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Reference amino acid () Theoretical value
A s X ： 1 . 0 8 ( 1 )  As X: 1.08 (1)
S e r ： 2 . 0 9 ( 2 )  S er: 2.09 (2)
G £ y ： 1 . 0 0 ( 1 )  G £ y: 1.0 0 (1)
P r o : 2 . 2 5 ( 2 )  Pro: 2.2.5 (2)
V a £ ： I . 0 5 ( 1 ) V a £: I. 0 5 (1)
* L e u : 2 . 0 0 ( 2 ) . L y s ： 1 . 0 2 ( 1 ) * Leu: 2.0. 0 0 (2). Lys: 1.02 (1)
質量分析 （ S I M S ) Mass spectrometry (SIMS)
〔 M + H〕 * : 1 1 9 9  (M + H) *: 1 1 9 9
(スケ ジ ュ ー ル）  (Schedule)
工程 時間 （分） X処理回数 Process time (min) X Number of treatments
1 . (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 x 3 2 . (脱保護） 50% TFA -5%ェ夕 ン ジチオール 3 x 1 — 45%塩化メ チ レ ン (V/V)60^ 20 X 11. (washing) methylene chloride 2 x 3 2. (deprotection) 50% TFA -5% amine dithiol 3 x 1 — 45% methylene chloride (V / V) 60 ^ 20 X 1
3 . (洗浄） 塩化メ チ レ ン 60m 2 X 23. (Washing) Methylene chloride 60m 2 X 2
4 . (洗浄） メ タ ノ ール 2 x 24. (Washing) Metanole 2 x 2
5 . (中和） 10% ト リ ェチルア ミ ン 5. (Neutralized) 10% Triethylamine
- 90%塩化メ チ レ ン (V/V)60^ 1 X 1 -90% methylene chloride (V / V) 60 ^ 1 X 1
6 . (洗浄） メ タ ノ ール 2 X 16. (Washing) Metanole 2 X 1
7 . (中和） 10% ト リ ェチルア ミ ン 7. (Neutralized) 10% Triethylamine
一 90%塩化メ チ レ ン (V/V)60 1 X 1 One 90% methylene chloride (V / V) 60 1 X 1
8 . (洗浄） メ タ ノ ール 2 X 28. (washing) Metanole 2 X 2
9 . (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 X 3 10. (カ ッ プ リ ン グ） 9. (washing) Methylene chloride 2 X 3 10. (coupling)
各ァ ミ ノ 基保護ア ミ ノ 酸 ( 6 ミ リ モル） 添加剤 （HOBt) 、  Each amino group-protected amino acid (6 millimol) additive (HOBt),
50% DMF-50%塩化メ チ レ ン（V/V)30 m£ 5 X 1 DCC( 6 ミ リ モル） の塩化メ チ レ ン 溶液 12m  50% DMF-50% methylene chloride (V / V) 30 m £ 5 x 1 DCC (6 mmol) methylene chloride solution 12 m
120 X 1 120 x 1
11. (洗浄） 50% DMF - 50%塩化メ チ レ ン（V/V)60 H 11. (wash) 50% DMF-50% methylene chloride (V / V) 60 H
2 X 2 12. (洗浄） メ タ ノ ー ル 2 x 12 X 2 12. (Washing) Metal 2 x 1
13. ( 中和） 10% ト リ ェチ ルァ ミ ン 13. (Neutralization) 10% Triethylamine
— 90%塩化メ チ レ ン （V/V)60 1 X 1 — 90% methylene chloride (V / V) 60 1 X 1
14. (洗浄） メ タ ノ ー ル 2 X 214. (Wash) Metal 2 x 2
15. (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 X 215. (Washing) Methylene chloride 2 X 2
16. ( ァ セ チ ル化） 25%無水酢酸 16. (Acetylated) 25% acetic anhydride
- 75%塩化メ チ レ ン （V/V)60 15x 1 -75% methylene chloride (V / V) 60 15x1
17. (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 X 217. (Washing) Methylene chloride 2 X 2
18. (洗浄） メ タ ノ ー ル 60τηβ 2 X 2 実施例 1 9 18. (Washing) Metanole 60τηβ 2 X 2 Example 19
M e L e u - S e r - L y s - T r p - S e r - N H ( C H 2 ) 2 N H 2 ( 配列番号 ： 2 3 ) の合成  Synthesis of MeLeu-Ser-Lys-Trp-Ser-NH (CH2) 2NH2 (SEQ ID NO: 23)
( l ) H C l - H - S e r ( B z l ) 0 M eの合成 一 1 0 °Cに冷却 した M e 〇 H 5 0 0 に、 S 0 C £ 2 1 3 0 を 2時間かけて滴下した。 さ らに 1 0 分間攪拌 後、 B o c — S e r ( B z £ ) 一 〇 H 1 4 8 gを加え、 室温に も ど して一夜攪拌した。 溶媒を減圧留去後、 メ タ ノ ールノジェチルェ一テルから再結晶 して H C ^ · H - S e r ( B z ^ ) - O M e l l 5 . 3 gを得た。 (l) HC l-H-Ser (Bzl) Synthesis of 0 Me 1 drop of S 0 C £ 2 130 over 2 hours to Me 〇 H 500 cooled to 10 ° C did. After further stirring for 10 minutes, 48 g of Boc—Ser (Bz £) was added, and the mixture was returned to room temperature and stirred overnight. After evaporating the solvent under reduced pressure, recrystallization from methanol was performed to obtain 5.3 g of HC ^ H-Ser (Bz ^)-OMell.
( 2 ) B o c - T r p ( C H 0 ) - S e r ( B z 1 ) - 0 M e の合成  (2) Synthesis of Boc-Trp (CH0)-Ser (Bz1)-0Me
H C ^ - H - S e r ( B z £ ) - O M e 4 9. 1 4 g と B o c — T r p ( C H〇） - O H 6 6 . 4 7 gを D M F 8 0 0 に溶解 し、 氷冷下 H 0 B t 2 8 . 3 8 g と E D C 3 2. 6 O gを加え、 室温に も ど して 4 . ' 5 時 間攪拌した。 反応液に水 4 リ ッ トルを加え、 A c 〇 E t 2 リ ッ ト ルで抽出後 1 0 % ク ェ ン酸水溶液、 飽和食塩水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウ ム水、 飽和食塩水の順に洗浄 し、 硫酸マ グネ シ ウ ム にて乾燥した。 硫酸マ グネ シ ウ ムを濾 別後、 溶媒を減圧留去し、 ジェチルエーテル 3 0 Q m n —へキサン 1 5 0 0 を加えて結晶化させた。 生 じた 結晶を濾過、 洗浄、 乾燥して B o c — T r p ( C H〇） 一 S e r ( B z ^ ) — O M e l O l . 8 4 gを得た。 HC ^ -H-Ser (Bz £) -OMe 49.14 g and Boc-Trp (CH〇) -OH 66.47 g were dissolved in DMF800 and cooled with ice. Lower H 0 Bt 28.38 g and EDC 32.6 Og were added, and the temperature was returned to room temperature. While stirring. After adding 4 liters of water to the reaction solution and extracting with 2 liters of Ac〇Et, 10% aqueous solution of citric acid, saturated saline, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, and saturated saline Washed in this order and dried with magnesium sulfate. After magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure, and crystallization was performed by adding dimethyl ether 30 Q mn -hexane 1500. The generated crystals were filtered, washed and dried to obtain 84 g of Boc-Trp (CH〇) -Ser (Bz ^)-OMelOl.
( 3 ) B o c — L y s ( Z ) - T r p ( C H O ) - S e r ( B— z 1 _) - 0 M e © ^ β¾  (3) Boc — Lys (Z)-Trp (CHO)-Ser (B — z1_)-0 Me © ^ β¾
B o c — T r p ( C H O ) — S e r ( B z £ ) 一  B o c — T r p (C H O) — S e r (B z £)
0 M e 9 9 . 4 8 gをァセ トニ ト リ ノレ 9 9 5 m に懸濁 し、 氷冷下メ タ ンスルホ ン酸 9 1 . 3 gを滴下した。 室温に も ど し 1 時間攪拌後、 再び氷冷 し D M F 9 9 5 md^ 9Me.48 g of 0 Me was suspended in 995 m of acetonitrile, and 91.3 g of methansulfonate was added dropwise under ice cooling. After returning to room temperature and stirring for 1 hour, cool again with ice and DMF 995 md ^
T E A 7 6 . 9 gを加えた。 こ の溶液に B o c — L y s ( Z ) - 0 H 7 5 . 9 0 g . H 0 B t 2 6 . 9 6 g、 E D C 3 0 . 9 7 gを順次加え、 室温に も ど し 3 時間攪 拌後、 一夜放置した。 反応液を水 7 リ ッ ト ル、 A c 0 E t 2 リ ッ トル中に注入 し、 有機層を 5 % クェン酸水溶液、 水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウ ム水、 水の順に洗浄し、 溶媒 に減圧下留去した。 残渣にジェチルエーテルを加えて濾 取、 洗浄、 乾燥 して B o c — L y s ( Z ) - T r p TEA 76.9 g was added. To this solution, Boc—Lys (Z) -0H75.90 g.H0Bt26.966 g and EDC30.997 g were sequentially added, and the mixture was cooled to room temperature. After stirring for an hour, the mixture was left overnight. The reaction solution was poured into 7 liters of water and 2 liters of Ac0Et2, and the organic layer was washed with a 5% aqueous solution of citric acid, water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, and water in this order. The solvent was distilled off under reduced pressure. Add getyl ether to the residue, collect by filtration, wash, and dry. Boc — Lys (Z) -Trp
( C H O ) - S e r ( B z ^ ) - O M e 1 3 8 . 6 6 g を得た。  (CHO) -Ser (Bz ^)-OMe138.66.6 g was obtained.
( 4 ) B o c - S e r ( B z l ) - L y s ( Z ) - T r p ( C H 0 ) 一 S e r ( B z 1 ) _ 〇 M e の 合成 (4) B oc -S er (B zl) -L ys (Z)- Synthesis of T rp (CH 0) One Ser (B z 1) _ 〇 Me
B o c - L y s ( Z ) 一 T r p ( C H〇） - S e r ( z £ ) - O M e 7 8 . 5 9 gをァセ ト ニ ト リ ル 2 5 0 0 に懸濁 し、 氷冷下メ タ ンスルホ ン酸 9 6 . l g を 滴下した。 2 . 5 時間攪拌後、 N M P 5 0 0 、 T E A 9 1 . 0 7 g、 D M F 5 0 0 を加えた。 こ の溶液に B 0 c - S e r ( z £ ) - 0 H 3 1 . 0 1 g、 H O B t 1 4 . 1 9 g、 E D C 1 6 . 3 gを順次加え、 室温に も ど し 2 時間攪拌後、 E D C · H C £ 1 . 9 7 g を追 加 した。 一夜放置した後、 反応液を水 2 0 リ ッ トル中に 注入 し、 室温で 1 5 分間攪拌した。 析出 した沈澱を濾取 し、 水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウ ム水、 水、 ジェチルェ一 テルで順次洗浄し乾燥して B o c — S e r ( B z £ ) 一 L y s ( Z ) - T r p ( C H O ) - S e r ( B z £ ) - O M e 9 2 . 2 6 gを得た。  B oc-Lys (Z)-T rp (CH〇)-Ser (z £)-OM e 78.5 9 g is suspended in acetonitrile 250, and ice-cooled. The lower methanesulphonic acid 96.5 lg was added dropwise. After stirring for 2.5 hours, NMP500, TEA9.17 g, and DMF500 were added. To this solution, add B0c-Ser (z £)-0H3 1.01 g, HOBt 14.19 g, and EDC 16.3 g in that order, and return to room temperature for 2 hours After stirring, EDC · HC £ 1.97 g was added. After standing overnight, the reaction solution was poured into 20 liters of water and stirred at room temperature for 15 minutes. The deposited precipitate was collected by filtration, washed successively with water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, water, and ethyl ether, dried, and dried to obtain Boc—Ser (Bz £) -Lys (Z) -T. rp (CHO) -Ser (Bz £) -OMe92.26 g was obtained.
( 5 ) B_o c - M e L e_u - S e r ( B z l ) - L y s  (5) B_o c-M e L e_u-S er (B z l)-L ys
( Z ) - T r ( C H O ) — S e r ( B z 1 ) - 0 M e の合成  (Z)-T r (C H O) — Synthesis of S er (B z 1)-0 Me
B o c — S e r ( B z £ ) - L y s ( Z ) - T r p B o c — S e r (B z £)-Lys (Z)-T r p
( C H O ) - S e r ( B z £ ) - 0 M e 8 . 6 7 gをァ セ トニ ト リ ル 2 0 0 milに懸濁 し、 氷冷下メ タ ンスルホ ン 酸 1 0 . 3 8 g を滴下した。 室温に も どし 2 時間攪拌後、 D M F 1 0 0 を加え、 氷冷下 T E A 1 0 . 0 2 gで中 和 した。 こ の溶液に B o c — M e L e u — O H 2 . 4 3 g、 H〇 B t l . 4 0 g . E D C - H C ^ l . 9 8 g、 T E A 1 . 0 5 gを順次加え、 室温に も ど し 4 時間攪拌 した。 反応液を水 1 . 5 リ ッ ト ル中に滴下し、 室温で 1 時間攪拌した。 析出 した沈澱を濾取 し、 水、 飽和炭酸水 素ナ ト リ ウ ム水、 水、 ジェチルエーテルで順次洗浄し乾 燥して B o c — M e L e u — S e r ( B z ） 一 L y s ( Z ) 一 T r p ( C H 〇） - S e r ( B z £ ) - 0 M e 8 . 8 8 gを得た。 (CHO) -Ser (Bz £) -0Me8.67g was suspended in 200 mil of acetonitrile, and methansulphonic acid 10.38g under ice cooling Was added dropwise. After returning to room temperature and stirring for 2 hours, DMF100 was added and neutralized with TEA10.02 g under ice-cooling. Boc—MeLeu—OH2.43 g, H〇Btl. 40 g. EDC-HC ^ l. 98 g, and TEA 1.05 g were sequentially added, and the mixture was returned to room temperature and stirred for 4 hours. The reaction solution was dropped into 1.5 liters of water, and stirred at room temperature for 1 hour. The deposited precipitate was collected by filtration, washed successively with water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, water, and getyl ether, and dried. One liter of Boc—MeLeu—Ser (Bz) ys (Z) I-Trp (CH〇) -Ser (Bz £) -0Me 8.88 g was obtained.
( 6 ) B o c - M e L e υ_- S e r ( B z 1 ) - L y s  (6) Boc-MeLe υ_- Ser (Bz1)-Lys
( Z ) - T r p - S e r ( B z 1_) — O Hの合成 (Z)-T r p-S er (B z 1_) — Synthesis of O H
B o c - M e L e u - S e r ( B z ) - L y s ( Z ) - T r ( C H 0 ) — S e r ( B z £ ) - 0 M e 8 . 7 2 gを D M F 1 4 0 に溶解し、 氷冷下 1 N N a 0 H 6 を滴下し 1 0 分間攪拌した。 反応液を 1 0 % クェン酸水溶液中に注ぎ、 1 時間攪拌 した。 析出 し た沈澱を濾取、 水洗後乾燥 して B 0 c - M e L e u — S e r ( B z ) - L y s ( Z ) - T r p - S e r ( B z £ ) - 0 H 8 . 0 8 gを得た。 Boc-MeLeu-Ser (Bz) -Lys (Z) -Tr (CH0)-Ser (Bz £) -0Me8.72g to DMF140 After dissolving, 1NNa0H6 was added dropwise under ice cooling, and the mixture was stirred for 10 minutes. The reaction solution was poured into a 10% aqueous solution of citrate and stirred for 1 hour. The precipitated precipitate was collected by filtration, washed with water and dried, and then B0c-MeLeu—Ser (Bz) -Lys (Z) -Trp-Ser (Bz £) -0H8. 0.8 g was obtained.
( 7 ) K C £ - H 2 N ( C H 2 _) 2 N H - Zの合成  (7) Synthesis of K C £-H 2 N (C H 2 _) 2 N H-Z
C £ ( C H 2 ) 2 N H 2 · H C £ I 1 . 6 0 g、 炭酸 水素ナ ト リ ウ ム水 3 3 . 6 gを水 2 0 0 TO 、 ジェチルェ 一テル 5 に溶解し、 Z — 1 7 . 0 6 g を滴下し た。 室温で 1 時間攪拌後、 Z — C _β 5 . 1 2 g、 炭酸水 素ナ ト リ ウ ム 7 . 5 6 g を追加 し、 さ らに 2 時間攪拌し た。 反応液にジェチルエーテルを加え、 飽和食塩水で洗 浄後、 有機層を減圧濃縮した。 残渣をシ リ カ ゲルカ ラ ム ク ロマ ト グラ フ ィ ー （溶離液 ： 塩化メ チ レ ン） にて精製 し、 Si ( C H 2 ) 2 N H - Z 1 9 . 4 0 g を得た。 フ タ ルイ ミ ドカ リ ウム 1 6 . 8 1 gの D M F 1.6 g of C £ (CH 2) 2 NH 2 · HC £ I, 33.6 g of sodium bicarbonate water are dissolved in 200 TO of water and Jet ジ ェ r ェ tel 5 and Z — 1 7.06 g was added dropwise. After stirring at room temperature for 1 hour, 5.12 g of Z—C_β and 7.56 g of sodium hydrogen carbonate were added, and the mixture was further stirred for 2 hours. Add getyl ether to the reaction solution and wash with saturated saline After purification, the organic layer was concentrated under reduced pressure. The residue was purified by silica gel chromatography (eluent: methylene chloride) to obtain Si (CH 2) 2 NH-Z 19.40 g. 16.8 1 g DMF
( 1 1 0 m 懸濁液中に、 C £ ( C H 2 ) 2 N H - Z 1 9 . 4 0 の 01^1 ? ( 6 0 7^) 溶液を加ぇ、 8 0〜 1 0 0 °Cに加熱して 2 時間攪拌した。 反応液を水に注入 し、 A c O E t で抽出 した。 有機層を飽和食塩水、 水で洗浄 後、 減圧濃縮した。 残渣にジェチルエーテルを加えて析 出 した結晶を濾過、 洗浄、 乾燥し、 C 6 H 4 (In a 110 m suspension, add a solution of C £ (CH 2) 2 NH-Z 19.40 in 01 ^ 1? (6 7 ^), 80 ~ 100 ° C The reaction mixture was poured into water and extracted with AcOEt The organic layer was washed with saturated saline and water, concentrated under reduced pressure, and dimethyl ether was added to the residue. The resulting crystals are filtered, washed and dried, and C 6 H 4
( C O ) 2 N ( C H 2 ) 2 N H - Z 2 0 . 9 3 gを得た。 C 6 H 4 ( C O ) 2 N ( C H 2 ) 2 N H - Z 3 . 2 4 g を E t O H 2 0 に懸濁し、 H 2 N N 2 H · H 2 〇 (CO) 2 N (CH 2 ) 2 NH - give the Z 2 0 9 3 g.. 3.24 g of C 6 H 4 (CO) 2 N (CH 2 ) 2 NH-Z were suspended in EtOH 20 and H 2 NN 2 H.H 2 〇
0 . 5 5 gの E t O H ( 1 0 mS ) 溶液を加えて室温で一 夜攪拌した。 反応液に I N H C £ 2 を加え、 さ ら に 2 時間攪拌後、 A c O E t 2 0 0 τη 水 5 0 を加え て分液した。 生成した不溶物を濾別後、 さ らに A c O E t 層を水で抽出 （ 1 5 ^ x 2 ) した。 水層に食塩を加え、 ジェチルエーテルで抽出 し、 硫酸マグネ シウムで乾燥し た。 溶媒を減圧留去後、 残渣をジェチルエーテル 1 0 0 に溶解し、 塩化水素 Zジェチルエーテルを加えて、 析 出 した結晶を濾取、 洗浄、 乾燥して H C · H 2 N 0.55 g of an EtOH (10 mS) solution was added, and the mixture was stirred at room temperature overnight. INHC £ 2 was added to the reaction solution, and the mixture was further stirred for 2 hours, followed by addition of AcOEt200tτη water 50, and liquid separation was performed. After filtering off the generated insoluble matter, the AcOEt layer was further extracted with water (15 ^ x2). Salt was added to the aqueous layer, extracted with getyl ether, and dried over magnesium sulfate. After distilling off the solvent under reduced pressure, the residue was dissolved in dimethyl ether 100, hydrogen chloride Z dimethyl ether was added, and the precipitated crystals were collected by filtration, washed and dried to give HC · H 2 N
( C H 2 ) 2 N H— Z 1 . 0 0 gを得た。 (CH 2 ) 2 NH—Z 1.0 g was obtained.
( 8 ) B o c - M e L e u - S e r ( B z l ) - L y s  (8) Boc-MeLeu-Ser (Bzl)-Lys
( Z ) T r p - S e r ( B z l ) N H ( C H 2) 2 N H - Zの合成 (Z) T rp-S er (B zl) NH (CH 2) 2 NH - Z Synthesis of
K C £ · Η 2 N ( C H 2 ) 2 N H - Z O . 2 4 2 g を D M F 1 に懸濁 し、 氷冷下 T E A O . 1 0 6 gで中 和 した。 B o c — M e L e u — S e r ( B z £ ) 一 KC £ · Η 2 N (CH 2) 2 NH -. ZO the 2 4 2 g was suspended in DMF 1, and neutralize under ice-cooling TEAO 1 0 6 g.. B oc — Me L eu — S er (B z £) one
L y s ( Z ) - T r p - S e r ( B z i ) - 0 H 1 . 0 4 8 g、 H 〇 B t O . 1 4 2 g、 E D C * H C 0 . 2 0 1 gを順次加えて溶解し、 室温に も ど し一夜攪拌した。 反応液を水中に滴下し、 析出 した沈澱を濾取 し、 水洗後 乾燥 して B o c — M e L e u — S e r ( B z ) 一 L y s ( Z ) - T r p - S e r ( B z £ ) 一 Lys (Z) -Trp-Ser (Bzi)-0 H1.048 g, H〇BtO.142 g, EDC * HC0.21 g are added sequentially and dissolved. Then, the mixture was returned to room temperature and stirred overnight. The reaction solution was added dropwise to water, and the deposited precipitate was collected by filtration, washed with water, dried and dried. Boc—MeLeu—Ser (Bz) -Lys (Z) -Trp-Ser (Bz) £) one
N H ( C H 2 ) 2 N H - Z 1 . 1 7 3 gを得た。 NH (CH 2 ) 2 NH-Z 1.17.3 g was obtained.
( 9 ) T E A - H - e L e u - S e r ( B z 1 ) 一  (9) T E A-H-e L e u-S e r (B z 1)
L y s ( Z ) - T r p - S e r ( B z l )  L y s (Z)-T r p-S e r (B z l)
— N H ( C H 2) 2 N H - Zの合成 — Synthesis of NH (CH 2 ) 2 NH-Z
B o c - M e L e u - S e r { B z £ ) - L y s ( Z ) - T r p - S e r ( B z £ ) 一  Boc-MeLeu-Ser (Bz £)-Lys (Z)-Trp-Ser (Bz £)
N H ( C H 2 ) 2 N H - Z 1 . 1 0 2 gを氷冷下、 T F A 1 4 mi, ァニソール 3 . 4 ？ ^に溶解 し、 1 時間攪拌後 ジェチルエーテル 1 4 に注入 して沈澱と し、 濾過、 乾燥して T F A ' H — M e L e u — S e r ( B z £ ) ― L y s ( Z ) - T r p - S e r ( B z £ ) 一 NH (CH 2 ) 2 NH-Z 1.10.2 g under ice cooling, TFA 14 mi, anisol 3.4? ^, Stirred for 1 hour, poured into getyl ether 14 to precipitate, filtered, dried and TFA'H-MeLeu-Ser (Bz £) -Lys (Z)- T rp-Ser (B z £) one
N H ( C H 2 ) 2 N H - Z 1 . 0 6 8 g を得た。 NH (CH 2 ) 2 NH-Z 1.068 g was obtained.
( 1 0 ) A c 〇 Η · Η— M e L e u - S e r - L y s  (1 0) A c 〇 Η · Η— M e L e u-S e r-L y s
- T r p - S e r - N H ( C Hj_ ) 2 N Hク の 合成 T F A - H - M e L e u - S e r ( B z ) 一 -T rp -Ser -NH (C Hj_) 2 NH TFA-H-M e L eu-S er (B z)
L y s ( Z ) - T r p - S e r ( B z ) 一 L y s (Z)-T r p-S e r (B z)
N H ( C H 2 ) 2 N H - Z 1 . 0 4 gを 5 0 %酢酸水 5 0 mi, M e 0 H 3 Ο τ^に溶解し、 1 0 % P d Z C 5 0 0 mgを加え、 水素雰囲気下、 室温で 2 1 時間攪拌した。 触 媒を濾別後、 5 0 %M e O H水で洗浄し、 濾洗液を集め て減圧濃縮 した。 残渣に水を加え、 凍結乾燥して、 NH (CH 2) 2 NH-Z 1.04 g was dissolved in 50% acetic acid aqueous solution 50 mi, Me 0 H 3 Ο τ ^, 10% Pd ZC 500 mg was added, and hydrogen was added. The mixture was stirred at room temperature for 21 hours under an atmosphere. After filtering off the catalyst, the mixture was washed with 50% MeOH water, and the filtrate was collected and concentrated under reduced pressure. Add water to the residue, freeze-dry and
A c O H - H - M e L e u - S e r - L y s - T r p - S e r - N H ( C H 2 ) 2 N H 2 9 4 O mgを得た。 A c OH - H - M e L eu - S er - L ys - T rp - give the NH (CH 2) 2 NH 2 9 4 O mg - S er.
( 1 1 ) M e L e u - S e r - L y s - T r p - S e r (1 1) M e Leu u-S e r-L y s-T r p-S e r
— N H ( C H 2 ) 2 N H 2 の合成 — Synthesis of NH (CH 2 ) 2 NH 2
A c O H - H - M e L e u - S e r - L y s - T r p ー S e r - N H ( C H 2 ) 2 NH 2 9 4 0 Ingを l M N H 4 H C 03 水溶液 1 5 に溶解し、 室温で 3時間攪拌 後、 酢酸で p H 4 と し水 1 3 5 で希釈した。 あ らか じ め 0. 1 % T F A水で平衡化させた逆相系充塡剤 YM C 一 （ S— 1 5 / 3 0 ) O D Sカ ラム （ 2 0 0 x 5 0 0腿） に注入し、 カ ラムを 0. 1 % T F Aで洗浄後、 ァセ トニ ト リ ル濃度を 1 2 0分で 1 2 %まで増加させ、 流速 9. 9 wi/rn i n . で溶出 した。 溶出液を A 2 2 0 n mでモ 二ター し、 目的物を含む画分を集め、 凍結乾燥 し、 M e L e u — S e r - L y s - T r p - S e r - N H A c OH - H - M e L eu - S er - L ys - T rp over S er - NH (CH 2) a 2 NH 2 9 4 0 Ing dissolved in l MNH 4 HC 03 aqueous 1 5, at room temperature After stirring for 3 hours, the mixture was adjusted to pH 4 with acetic acid and diluted with water 135. The reverse phase filler YM C- (S—15 / 30) ODS column (200 × 500 thigh) equilibrated with 0.1% TFA water was injected in advance. After washing the column with 0.1% TFA, the acetonitrile concentration was increased to 12% in 120 minutes, and the column was eluted at a flow rate of 9.9 wi / rn in. The eluate was monitored at A220 nm, fractions containing the target compound were collected, freeze-dried, and MeLeu—Ser-Lys-Trp-Ser-NH
( C H 2 ) 2 N H 2 3 2 0 mgを得た。 (CH 2) 2 NH 2 320 mg was obtained.
得られた M e L e u— S e r — L y s — T r p—  The obtained M e L e u— S E r — L y s — T r p—
S e r - N H ( C H 2 ) 2 N H 2 は、 逆相系充填剤 YM C 一 AM 3 0 3 ( S — 5 ) — O D Sカ ラ ム （ 4 . 6 Φ x 2 5 01«11 を用ぃた、 0. 1 % T F Aを含む 1 6 %ァセ トニ ト リ ル水溶液によ る溶出法による分析において保持 時間 6. 8 2分を示し、 そのア ミ ノ 酸分析値 （但し、 M e L e u、 T r p は検出せず） および質量分析値は理 論値と一致した。 S er - NH (CH 2) 2 NH 2 is reverse phase packing material YM C-AM3 0 3 (S-5) — ODS column (4.6% x 0.15% aqueous solution of 16% acetonitrile in water with 0.1% TFA) The retention time was 6.8 minutes in the analysis by the elution method, and the amino acid analysis value (however, Me Leu and T rp were not detected) and the mass analysis value agreed with the theoretical value. .
ァ ミ ノ 酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸— 1 %フ ノ ール、  Hydrolysis: 6 N hydrochloric acid-1% phenol,
1 1 0で、 2 4 時間  1 1 0, 24 hours
分析方法 ： PICO-TAG (逆相一 PTCア ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PICO-TAG (reverse-phase PTC amino acid) method
*基準ア ミ ノ 酸 （： ） 内理論値  * Reference amino acid (:) Theoretical value
S e r ： 1 . 9 1 ( 2 )  Ser: 1.9 1 (2)
* L y s ： 1 . 0 0 ( 1 ) * Lys: 1.00 (1)
質量分析 （ S I M S ) Mass spectrometry (SIMS)
〔 M + H〕 + : 6 7 6  (M + H) +: 6 7 6
実施例 2 0 Example 20
M e L e υ - S e r - L y s - T r p - S e r - N H ( C H 2 ) 3 N H 2 (配列番号 ： 2 4 ) の合成  Synthesis of M e Le υ -S er -L ys -T rp -S er -N H (CH 2) 3 N H 2 (SEQ ID NO: 24)
実施例 1 9 と同様に して合成をおこない、 M e L e u - S e r - L y s - T r p - S e r - N H ( C H 2 ) 3 N H 2 7 0 mgを得た。 Performed synthesized analogously to Example 1 9, M e L eu - S er - L ys - T rp - give the NH (CH 2) 3 NH 2 7 0 mg - S er.
得られた M e L e u — S e r — L y s — T r p — S e r - N H ( C H 2 ) 3 N H 2 は、 逆相系充塡剤 YM C — A M 3 0 3 ( S — 5 ) —〇 D Sカ ラ ム （ 4 . 6 0 X 2 5 0 mm) を用いた、 0 . 1 % T F Aを含む 1 6 % ァセ トニ ト リ ル水溶液によ る溶出法による分析において 保持時間 6 . 1 8分を示し、 そのア ミ ノ 酸分析値 （但 し、 e L e u , T r p は検出せず） および質量分析値は理 論値と一致した。 The obtained M e Leu — Ser — Lys — T rp — Ser — NH (CH 2 ) 3 NH 2 is a reversed-phase packing material YM C — AM 3 0 3 (S—5) —〇 16% with 0.1% TFA using DS column (4.60 x 250mm) The retention time was 6.18 minutes in the analysis by the elution method using an aqueous solution of acetonitrile, and the amino acid analysis value (however, eLeu and Trp were not detected) and mass spectrometry The value was consistent with the theoretical value.
ア ミ ノ 酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸— 1 %フ ヱ ノ ール、  Hydrolysis: 6 N hydrochloric acid-1% phenol,
1 1 0 で、 2 4 時間  1 1 0 for 24 hours
分析方法 ： PICO - TAG (逆相— PTCァ ミ ノ 酸） 法 .  Analysis method: PICO-TAG (reversed phase-PTC amino acid) method.
*基準ア ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Reference amino acid () Theoretical value
S e r ： 1 . 8 0 ( 2 )  Ser: 1.80 (2)
* L y s ： 1 . 0 0 ( 1 ) * Lys: 1.00 (1)
質量分析 （ S I M S ) Mass spectrometry (SIMS)
C M + H ) + : 6 9 0 CM + H) + : 6 9 0
実施例 2 1 Example 2 1
M e L e u - S e L_ L y s - T r p - S e r - N H ( C H 2 ) 4 N H 2 (配列番号 ： 2 5 ) の合成  Synthesis of MeLeu-SeL_Lys-Trp-Ser-NH (CH2) 4NH2 (SEQ ID NO: 25)
実施例 1 9 と同様に して合成をおこない、 M e L e u - S e r - L y s - T r p - S e r - N H ( C H 2 ) 4 N H 2 9 6 mgを得た。 Performed synthesized analogously to Example 1 9, M e L eu - S er - L ys - T rp - give the NH (CH 2) 4 NH 2 9 6 mg - S er.
得られた M e L e u — S e r - L y s - T r p - S e r - N H ( C H 2 ) 4 N H 2 は、 逆相系充塡剤 YM C一 A M 3 0 3 ( S — 5 ) — O D Sカ ラ ム （ 4 . 6 ø x 2 5 0 mm) を用いた、 0. 1 % T F Aを含む 1 5 %ァセ トニ ト リ ル水溶液によ る溶出法によ る分析において保持 時間 9 . 3 2分を示 し、 そのア ミ ノ 酸分析値 （但し、 M e L e u、 T r pは検出せず） および質量分析値は理論 値と一致 した。 The resulting M e L eu - S er - L ys - T rp - S er - NH (CH 2) 4 NH 2 is reverse phase charge塡剤YM C one AM 3 0 3 (S - 5 ) - ODS Retention time in a column (4.6 x x 250 mm) analysis by elution with a 15% aqueous solution of acetonitrile containing 0.1% TFA 9.3 2 minutes, and the amino acid analysis value (however, M e Leu and T rp were not detected) and mass spectrometry values were consistent with the theoretical values.
ア ミ ノ 酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸一 1 %フ ノ ー ル、  Hydrolysis: 6% hydrochloric acid-1% folnol,
1 1 0 で、 2 4 時間  1 1 0 for 24 hours
分析方法 ： PICO - TAG (逆相— PTCア ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PICO-TAG (reverse phase—PTC amino acid) method
*基準ア ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Reference amino acid () Theoretical value
S e r ： 1 . 8 9 ( 2 )  Ser: 1.89 (2)
* L y s ： 1 . 0 0 ( 1 ) * Lys: 1.00 (1)
質量分析 （ S I M S ) Mass spectrometry (SIMS)
〔 M + H〕 + : 7 0 4 (M + H) + : 7 0 4
実施例 2 2 Example 22
M e L e u - S e r - L y s - T r p - S e r - N H M e L e u-S e r-L y s-T r p-S e r-N H
( C H 2 ) 8 N H 2 (配列番号 ： 2 6 ) の合成 Synthesis of (CH 2) 8 NH 2 (SEQ ID NO: 26)
実施例 1 9 と同様に して合成をおこない、 M e L e υ The synthesis was performed in the same manner as in Example 19, and M e L e υ
- S e r - L y s - T r p - S e r - N H ( C H 2 ) 8 N H 2 3 6 7 mgを得た。 - S er - L ys - T rp - give the NH (CH 2) 8 NH 2 3 6 7 mg - S er.
得られた M e L e u — S e r — L y s — T r p — S e r - N H ( C H 2 ) 8 N H 2 は、 逆相系充填剤 YMThe obtained M e Leu — Ser — Lys — T rp — Ser — NH (CH 2 ) 8 NH 2 is a reversed-phase filler YM
C一 A M 3 0 3 ( S — 5 ) — O D Sカ ラ ム （ 4 . 6 ø x 2 5 0 111111) を用ぃた、 0 . 1 % T F Aを含む 2 1 %ァ セ トニ 卜 リ ル水溶液による溶出法によ る分析において保持 時間 7. 9 4 分を示し、 そのア ミ ノ 酸分析値 （但し、 ] VI e L e u、 T r p は検出せず） および質量分析値は理論 値と一致 した。 ア ミ ノ 酸分析 C-AM3O3 (S-5) — ODS column (4.6 øx2501111111), using a 21% aqueous solution of 0.1% TFA containing 0.1% TFA The retention time was 7.94 minutes in the analysis by the elution method, and the amino acid analysis value (however, VI e Leu and T rp were not detected) and the mass analysis value were consistent with the theoretical values. . Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸— 1 %フ ノ ール、  Hydrolysis: 6 N hydrochloric acid-1% phenol,
1 1 0 °C、 2 4 時間  1 10 ° C, 24 hours
分析方法 ： PICO-TAG (逆相 - PTCァ ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PICO-TAG (reverse phase-PTC amino acid) method
* 基準ア ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Reference amino acid () Theoretical value
S e r ： 1 . 9 7 ( 2 )  S er: 1.97 (2)
* L y s ： 1 . 0 0 ( 1 ) * Lys: 1.00 (1)
質量分析 （ S I M S ) Mass spectrometry (SIMS)
実施例 2 3 Example 23
H - L y s - T r p - D - S e r - G l y - P r o - H-Lys-Trp-D-Ser-Gly-Pro-
L e u — O H (配列番号 ： 2 0 ) の合成 Synthesis of L e u — O H (SEQ ID NO: 20)
実施例 1 8 と同様に して、 B o c — L e u — 0—樹脂 に、 B o c — P r o — O H、 B o c — G y — O H、 B o c - D - S e r ( z £ ) — 〇 H、 B o c — T r p 一 O H、 B o c — L y s C C £ Z ) 一 〇 H、 を順次カ ツ プ リ ン グさせ、 脱保護 し、 精製する こ とによ り H— L y s - T r p - D - S e r — G y — P r o — L e u — O Hを合成 した。  In the same manner as in Example 18, Boc—Leu—0—resin, Boc—Pro—OH, Boc—Gy—OH, Boc—D-Ser (z £) —〇 H, Boc—Trp-OH, Boc—LysCC £ Z) H—Lys-T by successively coupling, deprotecting, and purifying 100H. rp-D-Ser—Gy—Pro—Leu—OH was synthesized.
実施例 2 4 Example 2 4
M e L e u - S e r 一 L y s - T r p - D — S e— r — O H (配列番号 ： 2 1 ) の合成  Synthesis of MeLeu-Ser-Lys-Trp-D-Se-r-OH (SEQ ID NO: 21)
実施例 1 8 と同様に して、 B o c — D — S e r  In the same manner as in Example 18, Boc—D—Ser
( B z ) — 0—樹脂に、 B o c — T r p — O H、 B o c — L y s ( C Z ) 一 O H、 B o c — S e r ( z β ) — 〇 H、 B o c — M e L e u — 〇 Hを順次力 ッ プ リ ン グさせ、 脱保護 し、 精製する こ とによ り M e L e υ - S e r - L y s - T r p - D - S e r —〇 Hを合 成した。 (B z) — 0—In the resin, B oc — T rp — OH, B oc — Lys (CZ) -OH, B oc — Ser (z β) — 〇 H, B oc — Me L eu — 〇 H sequentially By coupling, deprotecting and purifying, MeL eII-Ser-Lys-Trp-D-Ser—ΔH was synthesized.
実施例 2 5 Example 2 5
H - T r p - S e r - G_l y—— P r— o - L e u -〇 H (配列番号 ： 2 7 ) の合成  Synthesis of H-Trp-Ser-G_ly——Pr—o-Leu-〇H (SEQ ID NO: 27)
( 1 ) B 0 c - S e r ( B z l ) — G l y — O E t の合  (1) B 0 c-S er (B z l) — G ly — O E t
B o c — S e r ( B z ） 一 〇 H 2 0 . 0 g、 B o c — S e r (B z) H 20.0 g,
H C - H - G y - O E t 9. 4 4 g、 H〇 B t 9. 1 4 gを D M F 2 0 0 に溶解し、 E D C · H C 1 4 . 2 8 g と T E A 7. 5 3 gを加え、 一夜攪拌した。 A c O E t を加え、 1 0 %ク ェ ン酸水溶液、 飽和食塩水、 飽 和炭酸水素ナ ト リ ウム水、 飽和食塩水の順に洗浄し、 硫 酸マ グネ シウ ムにて乾燥した。 硫酸マ グネ シウ ムを濾別 後、 溶媒を減圧留去して B o c — S e r ( B z ) — G y - 0 E t 2 7. 8 2 gを得た。 Dissolve 9.44 g of HC-H-Gy-OEt and 9.14 g of H〇Bt in DMF200, and add 14.28 g of EDCHC and 7.53 g of TEA. In addition, the mixture was stirred overnight. AcOEt was added, and the mixture was washed with a 10% aqueous solution of citric acid, a saturated saline solution, a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate, and a saturated saline solution in that order, and dried over magnesium sulfate. After magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Boc—Ser (Bz) —Gy-0Et27.82 g.
( 2 ) B o c - T r p ( C H 0 ) 一 S e r ( B z l ) 一  (2) Boc-Trp (CH0) One Ser (Bzl) One
G 1 y -〇 E t の合 ^  G 1 y -〇 E t sum ^
B o c — S e r ( B z ) - G ^ y - O E t 2 7. 8 B o c — S e r (B z)-G ^ y-O E t 2 7. 8
2 gをァセ トニ ト リ ル 5 0 に懸濁 し、 メ タ ンスルホ ン 酸 2 1 . 0 8 gを滴下 した。 1 時間攪拌後、 T E A 2 2. 1 9 gで中和 した。 こ の溶液に B o c — T r p 2 g was suspended in acetonitrile 50 and 21.08 g of methansulfonate was added dropwise. After stirring for 1 hour, the mixture was neutralized with 2.19 g of TEA2. B o c — T r p
( C H 0 ) - 0 H 2 6 . 7 3 g、 H O B t l O . 8 7 g、 E D C · H C 1 5 . 4 2 gを順次加え、 一夜攪拌した。 反応液に A c O E t を加え、 1 0 % クェン酸水溶液、 飽 和食塩水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウム水、 飽和食塩水の順 に洗浄し、 硫酸マグネ シウムにて乾燥した。 硫酸マグネ シゥムを濾別後、 溶媒を減圧留去し、 へキサ ンを加えて 析出 した結晶を濾過、 洗浄、 乾燥し B o c — T r p (CH0) -0H26.73 g, HOBtlO.87 g, EDCHC15.42 g were sequentially added, and the mixture was stirred overnight. AcOEt was added to the reaction solution, and the mixture was washed with a 10% aqueous solution of citric acid, a saturated saline solution, a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate, and a saturated saline solution in that order, and dried over magnesium sulfate. After magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure, and hexane was added. The precipitated crystals were filtered, washed and dried, and Boc — T rp
( C H O ) — S e r ( B z ) - G y - O E t 4 2 . 6 1 g を得た。  (CHO) -Se (Bz) -Gy-OEt 42.6 1 g was obtained.
( 3 ) B o c - T r p - S e r ( B z l ) - G l y — O Hの合成  (3) Synthesis of Boc-Trp-Ser (Bzl) -Gly-OH
B o c — T r p ( C H O ) - S e r ( B z £ ―  B o c — T r p (C H O)-S e r (B z £ ―
G y - O E t 2 5 . O g を D M F 3 0 0 に溶解し、 氷冷下 1 N N a 0 H 2 1 0 を滴下し 1 時間攪拌した。 反応液に クェン酸 1 5 gを加え、 溶媒を減圧留去した。 A c 0 E t 1 リ ッ ト ルを加え、 飽和食塩水で洗浄した。 硫酸マグネ シウムにて乾燥した後、 硫酸マグネ シウムを 濾別 し、 溶媒を減圧留去して B o c — T r p — S e r ( B z ) - G ^ y - O H 3 1 . 7 2 gを得た。  Gy-OEt25.Og was dissolved in DMF300, 1 NNa0H210 was added dropwise under ice cooling, and the mixture was stirred for 1 hour. 15 g of citric acid was added to the reaction solution, and the solvent was distilled off under reduced pressure. A c0Et1 liter was added and washed with saturated saline. After drying over magnesium sulfate, the magnesium sulfate was filtered off and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Boc—Trp—Ser (Bz) -G ^ y-OH3 1.72 g. Was.
( 4 ) B o c - P r o ： L e—u — O B z の舍成  (4) Boc-Pro: Le-u-O-Bz
B o c - P r o - O H I O . O g . T o s O H - H - L e u - O B z ^ 1 8 . 2 7 gを D M F 1 0 0 に溶解 し、 E D C ' H C 8 , 9 0 g と T E A 4 . 7 0 gを加 え、 一夜攪拌した。 A c O E t を加え、 1 0 % クェ ン酸 水溶液、 飽和食塩水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウム水、 飽和 食塩水の順に洗浄し、 硫酸マ グネ シウムに して乾燥した。 硫酸マ グネ シウムを濾別後、 溶媒を減圧留去して B 0 c — P r o — L e u — 0 Β ζ ^ 1 2 . 2 4 gを得た。 Boc-Pro-OHIO.Og.Tos OH-H-Leu-OBz ^ 18.27 g was dissolved in DMF100, and EDC'HC8, 90 g and TEA4. 70 g was added and the mixture was stirred overnight. AcOEt was added, and the mixture was washed with a 10% aqueous solution of citric acid, a saturated saline solution, a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate and a saturated saline solution in that order, and dried over magnesium sulfate. After filtering off magnesium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure and B 0 c — Pro — Leu — 0 Β ζ ^ 12.2 24 g was obtained.
( 5 ) B o c - T r p - S e r ( B z ) - G -g y - P r o — L e u — O B z ^ の合成  (5) Synthesis of Boc-Trp-Ser (Bz) -G-gy-Pro-Leu-OBz ^
B o c - P r o - L e u - 0 B z £ 1 2 . 2 4 gをァ セ ト ニ ト リ ノレ 5 0 に懸濁し、 メ タ ンスルホ ン酸 8 . 4 3 g を滴下した。 1 . 5 時間攪拌後、 T E A 8 . 8 8 g で中和 した。 こ の溶液に B o c — T r p — S e r  Boc-Pro-Leu-0Bz £ 12.24 g was suspended in acetonitrile 50 and 8.43 g of methansulfonate was added dropwise. After stirring for 1.5 hours, the mixture was neutralized with 8.8 g of TEA. B o c — T r p — S e r
( B z ) - G y - O H 2 0 . 4 9 g、 H 0 B t 5 . 1 4 g , E D C - H C ^ 7 . 2 9 g、 D M F 1 0 0 を 順次加え、 一夜攪拌した。 反応液に A c O E t を加え、 1 0 % ク ェ ン酸水溶液、 飽和食塩水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウム水、 飽和食塩水の順に洗浄し、 硫酸マグネ シウム にて乾燥 した。 硫酸マ グネ シウムを濾別後、 溶媒を減圧 留去し、 B o c — T r p — S e r ( B z £ ) - G £ γ - P r o — L e u — O B z 2 8 . 4 3 gを得た。  (Bz) -Gy-OH20.4 g, H0Bt5.14g, EDC-HC ^ 7.29g and DMF100 were sequentially added, and the mixture was stirred overnight. AcOEt was added to the reaction solution, and the mixture was washed with a 10% aqueous solution of citric acid, a saturated saline solution, a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate, and a saturated saline solution in that order, and dried over magnesium sulfate. After filtering off magnesium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Boc—Trp—Ser (Bz £) -G £ γ-Pro—Leu—OBz28.43 g. Was.
( 6 ) T F A - H - T r p - S e r ( B z ） - G 2 y 一 P r o — L e u — 〇 B z の合成  (6) Synthesis of TFA-H-Trp-Ser (Bz) -G2y-Pro-Leu- uBz
B o c - T r p - S e r ( B z ^ ) — G £ y — P r o - L e u - O B z i 2 8 . 4 3 gを氷冷下、 T F A 9 0 τηβ、 ァニ ソ 一ル 1 0 に溶解し、 2 0 分間攪拌した。 Τ F Aを減圧留去し、 へキサ ンを加えて沈澱と し、 濾過、 乾燥 して T F A ' H— T r p — S e r ( Β ζ β ) ―  Boc-Trp-Ser (Bz ^) — G £ y — Pro-Leu-OBzi 28.4 3 g under ice cooling to TFA 90 τηβ and anisol 10 Dissolve and stir for 20 minutes. ΤF A is distilled off under reduced pressure, hexane is added to the precipitate to form a precipitate, which is filtered, dried and dried.
G ^ y — P r o — L e u — Ο Β ζ 2 8 . 2 2 gを得た。 ( 7 ) H— T r p — S e r - G — P r o - L e u - 0 Hの合成 T F A - H - T r p - S e r ( B z ) - G ^ y - P r o — L e u —〇 B z 1 0. O gを M e O H l 0 0 に溶解し、 A C O H 5 OT 、 1 0 % P d Z C l gを加え、 水素雰囲気下、 室温で 3 8 時間攪拌した。 触媒を濾別後、 水洗し、 濾洗液を集めて減圧濃縮した。 残渣に酢酸水を 加え、 あ らかじめ 0 . 1 % T F A水で平衡化させた逆相 系充塡剤 Y M C— R 3 5 5 ( S - 1 5 / 3 0 ) O D S力 ラ ム （ 5 0 0 X 5 0 0 mm) に注入 し、 カ ラ ムを 0. 1 % T F A水で洗浄後、 ァセ トニ ト リ ル濃度を 2 4 0分で 3 0 %まで増加させ、 流速 1 S Zm i n . で溶出 した。 溶出液を A 2 8 0 n mでモニター し、 目的物を含む画分 を集め、 凍結乾燥し、 H— T r p — S e r — G ^ y — P r o - L e u - O H l 5 2. 4 3 nigを得た。 G ^ y — Pro — Le eu — Ο Β ζ 28.22 g was obtained. (7) Synthesis of H—T rp —Ser-G—Pro-Leu-0H TFA-H-Trp-Ser (Bz) -G ^ y-Pro-Leu-〇Bz10.Og is dissolved in MeOH10, and ACOH5OT, 10% PdZClg was added, and the mixture was stirred under a hydrogen atmosphere at room temperature for 38 hours. After the catalyst was separated by filtration, the catalyst was washed with water, and the filtrate was collected and concentrated under reduced pressure. Aqueous acetic acid was added to the residue, and a reversed-phase filler YMC—R355 (S-15/30) ODS force column (50%) equilibrated with 0.1% TFA water in advance After washing the column with 0.1% TFA water, the concentration of acetonitrile was increased to 30% in 240 minutes, and the flow rate was 1 S Zmin. Eluted with. The eluate was monitored at A280 nm, and the fractions containing the target compound were collected, freeze-dried, and H-Trp-Ser-G ^ y-Pro-Leu-OHl 52.43. got nig.
得られた H— T r p — S e r — G y — P r o —  The resulting H—T r p—S er—G y—P ro—
L e u —〇 Hは、 逆相系充塡剤 YM C— A M 3 0 3 L e u —〇 H is a reversed phase filler YM C— A M 3 0 3
( S — 5 ) — O D Sカ ラム （ 4 . 6 0 X 2 5 0 mm) を用 いた、 1 0 %から 5 0 %までの 0 . 1 % T F Aを含むァ セ トニ ト リ ルの直線濃度勾配溶出法による分析において 保持時間 2 4 . 5 7分を示し、 そのア ミ ノ酸分析値 （但 し、 T r pは検出せず） および質量分析値は理論値と一 致した。 ア ミ ノ 酸分析 (S — 5) — Linear concentration gradient of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 50% using ODS column (4.60 x 250 mm) The retention time was 24.57 minutes in the analysis by the elution method. The amino acid analysis value (Trp was not detected) and the mass analysis value were consistent with the theoretical values. Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸— 1 % フ エ ノ ール、  Hydrolysis: 6 N hydrochloric acid-1% phenol,
1 1 0 °C、 2 4 時間  1 10 ° C, 24 hours
分析方法 ： PIC0-TAG (逆相— PTCア ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PIC0-TAG (reverse phase—PTC amino acid) method
*基準ァ ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Standard amino acids (in theory)
S e r ： 1 . 0 0 ( 1 )  S er: 1.00 (1)
G £ y に 0 3 ( 1 )  G £ y at 0 3 (1)
P r o : に 0 5 ( 1 )  Pro: 0 5 (1)
* L e υ ： 1 . 0 0 ( 1 )  * L e υ: 1.0 0 (1)
質量分析 ( S I M S )  Mass spectrometry (S I M S)
CM + H〕 + : 5 5 9  CM + H) +: 5 5 9
実施例 2 6 Example 26
H - S e r 一 G y — P r o — L e u — 〇 H ( h H C H-S e r one G y — P ro — L e u — 〇 H (h H C
N P ( 8 - 1 1 ) ) (配列番号 ： 2 8 ) の合成 Synthesis of N P (8-11)) (SEQ ID NO: 28)
( 1 ) B o c — S e r ( B z l ) — G l y — O E t の合  (1) B o c — S e r (B z l) — G l y — O E t
B o c — S e r z £ ) - 0 H 3 0 . 0 g、 H C £ • H - G ^ y - 0 E t 1 4 . 1 7 g , H 0 B t 1 3 . 7B o c — S er z £)-0 H 30.0 g, H C £ • H-G ^ y-0 E t 14 .17 g, H 0 B t 1 3.7
2 gを D M F 1 5 に溶解 し、 E D C · H C £ 2 1 . 4 2 g と T E A 1 1 . 3 O gを加え、 一夜攪拌した。 A c 0 E t 5 0 0 を加え、 1 0 % ク ェ ン酸水溶液、 飽 和食塩水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ゥ ム水、 飽和食塩水の順 に洗浄 し、 硫酸マ グネ シウ ムにて乾燥した。 硫酸マグネ シヴ厶を濾別後、 溶媒を減圧留去して B o c — S e r ( B z £ ) — G ^ y — 〇 E t 4 1 . 7 8 gを得た。 ( 2 ) B_o c - S e r ( B z ) — G ^ y — O Hの合成 B o c - S e r ( z £ ) - G ^ y - O E t 1 5 . 0 gを M e O H 2 0 に溶解 し、 氷冷下 I N N a 0 H2 g was dissolved in DMF 15, EDC · HC £ 21.42 g and TEA 11.3 Og were added, and the mixture was stirred overnight. Add Ac0Et500 and wash with 10% aqueous solution of citric acid, saturated saline, saturated sodium bicarbonate, and saturated saline in this order, and then use magnesium sulfate. Dried. After filtering off magnesium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Boc—Ser (Bz £) —G ^ y—〇Et41.78 g. (2) Synthesis of B_oc-Ser (Bz) -G ^ y-OH Boc-Ser (z £) -G ^ y-OEt15.0 g was dissolved in MeOH20. , Under ice cooling INN a 0 H
4 3 . 4 を滴下し 1 時間攪拌した。 溶媒を減圧留去後、 クェ ン酸を加え、 p H 3 に調整した。 A c O E t を加え、 1 0 % クェン酸水で洗浄 した後、 硫酸マ グネ シウ ムにて 乾燥 した。 硫酸マグネ シウムを濾別 し、 溶媒を減圧留去 して B o c - S e r ( z £ - G ^ y - O H l 4 . 443.4 was added dropwise and stirred for 1 hour. After evaporating the solvent under reduced pressure, citric acid was added to adjust the pH to 3. After adding AcOEt, the mixture was washed with 10% aqueous solution of citric acid, and then dried with magnesium sulfate. Magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure, and Boc-Ser (z £ -G ^ y-OHl 4.4
5 g を得た。 5 g were obtained.
( 3 ) B o c - S e r ( B z l ) — G l y — P r o —  (3) Boc-Ser (Bzl) — Gly — Pro —
L e υ - 0 B z 1 の合成  Synthesis of L e υ-0 B z 1
B o c - P r o — O H I O . 9 4 g . T o s O H - H - L e u - O B z i 2 0 . 0 g、 H 〇 B t 6 . 8 6 gを D M F 5 に溶解し、 E D C ■ H C £ 1 0 . 7 1 と T E A 5 . 1 4 gを加え、 一夜攪拌した。 A c O E t 5 0 を加え、 1 0 % ク ェ ン酸水溶液、 飽和食塩水、 飽 和炭酸水素ナ ト リ ウム水、 飽和食塩水の順に洗浄し、 硫 酸マグネ シウムにて乾燥 した。 硫酸マグネ シゥムを濾別 後、 溶媒を減圧留去して B o c — P r o - L e u - 0 B z 2 3 . 8 7 gを得た。 B o c — P r o — L e u - 0 B z ^ 2 3 . 8 7 g をァセ トニ ト リ ル 1 0 0 に溶 解し、 氷冷下 ρ — ト ルエ ンスルホ ン酸 1 水和物 2 9 . 0 gを加えた。 3 . 5 時間攪拌後、 溶媒を減圧留去した。 この残渣 4 9 . 7 9 g のう ち 1 7 . 6 6 gを D M F 5 0 に溶解し、 氷冷下 T E A 4 . 0 2 gで中和 した.。 こ の 溶液に B o c — S e r ( z £ ) - G 1 y - 0 H 7 . 0 O gの D M F ( 5 0 ) 溶液、 E D C ' H C ^ 3 . 8 0 8 g、 T E A 2 . 0 1 g、 D M F 5 を順次加え、 一 夜攪拌した。 反応液に A c 〇 E t 5 0 0 を加え、 1 0 % ク ェ ン酸水溶液、 飽和食塩水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウ ム水、 飽和食塩水の順に洗浄し、 硫酸マグネ シウムにて 乾燥 した。 硫酸マ グネ シ ウ ムを濾別後、 溶媒を減圧留去 して B o c — S e r ( B z £ ) - G y - P r o - L e u - 0 B z 1 0 . 9 0 gを得た。 Boc-Pro—OHIO.94 g. Tos OH-H-Leu-OBzi20.0 g, H〇Bt6.86 g dissolved in DMF5, EDC ■ HC £ 1 0.71 and 5.14 g of TEA were added and stirred overnight. AcOEt50 was added, and the mixture was washed with a 10% aqueous solution of citric acid, a saturated saline solution, a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate and a saturated saline solution in that order, and dried over magnesium sulfate. After magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Boc—Pro-Leu-0Bz23.87 g. Boc—Pro—Leu-0 Bz ^ 23.887 g was dissolved in acetonitrile 100, and ice-cooled ρ—toluenesulfonate monohydrate 29 .0 g was added. After stirring for 3.5 hours, the solvent was distilled off under reduced pressure. Out of 49.79 g of this residue, 17.6.6 g was dissolved in DMF 50 and neutralized with 4.02 g of TEA under ice-cooling. this In solution, Boc — Ser (z £)-G1y-0H7.0Og DMF (50) solution, EDC'HC ^ 3.808g, TEA2.01g, DMF 5 was added sequentially, and the mixture was stirred overnight. Add Ac cEt500 to the reaction mixture, wash with 10% aqueous solution of citric acid, saturated saline, saturated sodium bicarbonate, and saturated saline in this order, and use magnesium sulfate. It was dry. After magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Boc—Ser (Bz £) -Gy-Pro-Leu-0Bz10.9 g. .
( 4 ) T F A - H - S e r - G ^ y - P r o - L e u - (4) TFA-H-Ser-G ^ y-Pro-Leu-
〇 Hの合^ 〇 H's ^
B o c — S e r ( z £ ) - G y - P r o - L e u - 0 B z £ 1 0 . 9 O gを氷冷下、 T F A 5 0 τηβ、 ァニ ソ ー ル 5 に溶解し、 1 時間攪拌した。 T F Aを減圧留 去し、 へキサ ンを加えて沈澱と し、 デカ ンテーシ ヨ ンで 上澄みを除いた。 残渣を M e 〇 H 5 0 ? ^に溶解し、 1 0 % P d / C 2 . 0 gを加え、 水素雰囲気下、 室温で 8 時 間攪拌した。 水を加えた後、 触媒を濾別、 水洗し、 濾洗 液を集めて減圧濃縮した。 残渣を水に溶解し凍結乾燥し た。 得られた粗 T F A . H— S e r — G y — P r o — L e u — O Hを水に溶解し、 あ らか じめ 0 . 1 % T F A 水で平衡化させた逆相系充塡剤 Y M C — A 3 6 3 ( S - 5 ) O D S カ ラ ム （ 3 0 0 X 2 5 0 mm) に注入 し、 0 . 1 % T F A水で溶出 した。 溶出液を A 2 3 0 n mで モニター し、 目的物を含む画分を集め、 凍結乾燥し、 H - S e r - G y - P r o - L e u - O H 8 5. 5 mgを 得た。 B oc — Ser (z £)-G y-Pro-Leu-0 B z £ 10.9 Og is dissolved in TFA 50 τηβ and anisol 5 under ice-cooling, and 1 Stirred for hours. TFA was distilled off under reduced pressure, hexane was added to precipitate, and the supernatant was removed by decantation. The residue was dissolved in Me〇H50?, 2.0 g of 10% Pd / C was added, and the mixture was stirred under a hydrogen atmosphere at room temperature for 8 hours. After adding water, the catalyst was separated by filtration, washed with water, and the filtrate was collected and concentrated under reduced pressure. The residue was dissolved in water and freeze-dried. The obtained crude TFA.H—Ser—Gy—Pro—Leu—OH is dissolved in water, and the reversed-phase packing material YMC is equilibrated with 0.1% TFA water in advance. — Injected into an A366 (S-5) ODS column (300 x 250 mm) and eluted with 0.1% TFA water. Monitor the eluate at A 230 nm, collect the fractions containing the desired product, freeze-dry -5.5 mg of -Ser-Gy-Pro-Leu-OH 8 was obtained.
得 られた H一 S e r - G y - P r o -： L e u - O H は、 逆相系充塡剤 YM C - A M 3 0 3 ( S - 5 ) - 0 D S カ ラ ム （ 4 . 6 ø x 2 5 0 mm) を用いた、 1 0 %から 5 0 %ま での 0 . 1 % T F Aを含むァセ トニ ト リ ルの直 線濃度勾配溶出法によ る分析において保持時間 1 1 . 8 0分を示し、 そのァ ミ ノ 酸分析値および質量分析値は理 論値と一致した。  The obtained H-Ser-Gy-Pro-: Leu-OH is a reversed-phase packing material YM C-AM303 (S-5) -0 DS column (4.6 ° retention time in linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 50% using x250mm). It showed 80 minutes, and its amino acid analysis value and mass analysis value agreed with the theoretical values.
ア ミ ノ 酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸一 1 %フ ヱ ノ ール、  Hydrolysis: 6% hydrochloric acid-1% phenol,
1 1 0で、 2 4時間  1 1 0, 24 hours
分析方法 ： PICO-TAG (逆相— PTCア ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PICO-TAG (reverse phase—PTC amino acid) method
*基準ァ ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Standard amino acids (in theory)
S e r ： 1 . 0 3 ( 1 )  S er: 1.0 3 (1)
G y ： 1 . 0 8 ( 1 )  Gy: 1.08 (1)
P r o ： 1 . 1 1 ( 1 )  Pro: 1.1 1 (1)
* L e u ： 1 . 0 0 ( 1 ) * Leu: 1.00 (1)
質量分析 （ S I S ) Mass spectrometry (SIS)
〔M + H〕 + ： 3 7 3 [M + H] + : 3 7 3
実施例 2 7 Example 2 7
A c - T r P S e r - G l y - P r o - L e u - A c-T r P S e r-G l y-P ro-L e u-
O H (配列番号 ： 3 0 ) の合成 Synthesis of O H (SEQ ID NO: 30)
( 1 ) A c - T r p - S e r ( B z l ) - G l y  (1) A c-T r p-S e r (B z l)-G l y
P r o — L e u — 〇 B z l の合成 実施例 2 5 に記載の T F A · H - T r ρ - S e r Synthesis of P ro — L eu — 〇 B zl TFA · H-T r ρ-S er described in Example 25
( z £ ) - G y - P r o - L e u - O B z l . 0 O gを D M F 1 0 に溶解し、 氷冷下 T E A O . 3 3 3 τηβ、 A c 2 0 0 . 1 1 3 を加えて 1 時間攪拌した。 反 応液に水を加え、 A c 〇 E t で抽出後、 1 0 % クェン酸 水溶液、 飽和食塩水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウ ム水、 飽和 食塩水の順に洗浄し、 硫酸マグネ シウムにて乾燥した。 硫酸マ グネ シウ ムを濾別後、 溶媒を減圧留去し、 A c — T r p — S e r ( B z ) 一 G ^ y — P r o — L e u — 0 B z 0 . 9 9 mgを得た。  (z £)-G y-Pro-Leu-OB zl .0 Og is dissolved in DMF 10, and TEAO .33 3 τηβ and A c 20 .0.13 are added under ice cooling. Stir for 1 hour. After adding water to the reaction solution and extracting with Ac cEt, the mixture was washed with a 10% aqueous solution of citric acid, saturated saline, saturated sodium bicarbonate, and saturated saline in this order, and washed with magnesium sulfate. And dried. After filtering off magnesium sulfate, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Ac-Trp-Ser (Bz) -G ^ y-Pro-Leu-0Bz0.99 mg. Was.
( 2 ) A c — T r p — S e r — G l y — P r o — L e u (2) A c — T r p — S e r — G l y — P ro — L e u
- O Hの合^ -O H
A c — T r p — S e r ( B z £ ) — G — P r o - L e u - O B z ^ 0 . 4 9 を？^ 6 〇 11 1 0 7^、 八 （ 0 H 1 0 m に溶解 し、 1 0 % P d Z C 0 . 3 0 gを加え、 水素雰囲気下、 室温で 7 時間攪拌した。 触媒を濾別、 水 洗し.、 濾洗液を集めて減圧濃縮した。 残渣を水に溶解し 凍結乾燥した。 得られた粗 A c — T r p — S e r — G y — P r o — L e u — O Hを酢酸 1 . 5 τπ に溶解し、 0 . 1 % T F A水 6 OT で希釈してチ ャ ー ジ液と した。 あ ら力、 じめ 0 . 1 % T F A水で平衡化させた逆相系充塡剤 Y M C - A 3 6 3 ( S - 5 ) 〇 D S カ ラ ム （ 3 0 0 X 2 5 0 mm) に注入 し、 カ ラ ムを 0 . 1 % T F A水で洗浄後、 ァ セ トニ ト リ ル濃度を 2 4 0 分で 4 0 %まで増加させ、 流 速 1 0 /m i n . で溶出 した。 溶出液を A 2 8 0 n m でモニタ一 し、 目的物を含む画分を集め、 凍結乾燥し、 A c - T r p - S e r - G ^ y - P r o - L e u — O H 3 5 . 3 m を得た。 A c — T rp — Ser (B z £) — G — Pro-Le eu-OB z ^ 0.49? ^ 6 〇 11 107 ^, 8 (Dissolved in 0H10m, added 0.30g of 10% PdZC, stirred under hydrogen atmosphere at room temperature for 7 hours. The residue was dissolved in water and freeze-dried The obtained crude Ac-Trp-Ser-Gy-Pro-Leu-OH was converted to acetic acid. Dissolved in 1.5 τπ and diluted with 0.1% TFA water (6 OT) to make a charge solution Reverse-phase filling equilibrated with 0.1% TFA water YMC-A366 (S-5) 〇 Inject into DS column (300 x 250 mm), wash column with 0.1% TFA water, and mix with acetone The eluate was eluted at a flow rate of 10 / min. The fractions containing the target substance were collected and freeze-dried to obtain Ac-Trp-Ser-G ^ y-Pro-Leu-OH35.3 m.
得られた A c — T r p — S e r - G ^ y - P r o - L e u — O Hは、 逆相系充塡剤 Y M C — A M 3 0 3 ( S — 5 ) — O D S カ ラム （ 4 . 6 ø x 2 5 0 mm) を用いた 2 0 %カヽら 5 0 %までの 0 . 1 % T F Aを含むァセ トニ ト リ ルの直線濃度勾配溶出法によ る分析において保持時 間 1 5 . 7 6 分を示し、 そのア ミ ノ 酸分析値 （但し、 T r p は検出せず） および質量分析値は理論値と一致し た。  The obtained A c —T rp —Ser-G ^ y-Pro-L eu —OH is a reversed-phase packing material YMC—AM 3 O 3 (S—5) —ODS column (4.6 Retention time for analysis by linear gradient elution of acetonitrile containing 0.1% TFA up to 50% with a concentration of 20% using øx250mm). It showed 76 minutes, and its amino acid analysis value (however, T rp was not detected) and mass analysis value were consistent with the theoretical values.
ア ミ ノ 酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸一 1 % フ エ ノ ール、  Hydrolysis: 6 N hydrochloric acid-1% phenol,
1 1 0 。C、 2 4 時間  1 1 0. C, 24 hours
分析方法 ： PICO- TAG (逆相一 PTCァ ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PICO-TAG (reverse-phase PTC amino acid) method
*基準ァ ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Standard amino acids (in theory)
S e r ： 1 . 1 3 ( 1 )  S er: 1.1 3 (1)
G £ y 1 . 0 2 ( 1 )  G £ y 1.02 (1)
P r o : 1 . 1 5 ( 1 )  Pro: 1.1.5 (1)
* L e υ ： 1 . 0 0 ( 1 ) * L e υ: 1.0 0 (1)
質量分析 （ S I M S ) Mass spectrometry (SIMS)
〔 M + H〕ノ : 6 0 1  (M + H) NO: 6 0 1
実施例 2 8 Example 2 8
H - T r - D - S e r - G J^ - P r o - L e u 0 H (配列番号 ： 2 9 ) の合成 ( 1 ) B o c - D - S e r ( B z 1 ) - G 1 y -〇 E t の合成 Synthesis of H-Tr-D-Ser-GJ ^ -Pro-Leu0H (SEQ ID NO: 29) (1) Synthesis of Boc-D-Ser (Bz1) -G1y-〇Et
B o c - D - S e r ( B z £ ) - 0 H 8. 0 6 g、 H C - H - G y - O E t 4 . 1 9 g , H 0 B t 4 . 0 5 gを C H 2 C £ 2 に溶解し、 E D C ' H C 5. 7 5 g と T E A 3. 0 4 gを加え、 一夜攪拌した。 C H 2 C £ 2 を加え、 水、 5 % K H S 04 水溶液、 5 %炭酸水 素ナ ト リ ウ ム水、 飽和食塩水の順に洗浄し、 硫酸マグネ シゥ厶にて乾燥した。 硫酸マグネ シウムを濾別後、 溶媒 を減圧留去して B o c — D— S e r ( B z ) 一 G y - 0 E t 1 0. 6 gを得た。 B oc - D - S er ( B z £) - 0 H 8. 0 6 g, HC - H - G y -.. OE t 4 1 9 g, H 0 B t 4 0 5 g of CH 2 C £ Then, 5.75 g of EDC'HC and 3.04 g of TEA were added, and the mixture was stirred overnight. CH 2 C £ 2 was added and the aqueous, 5% KHS 0 4 solution, 5% carbonated water Motona Application Benefits U arm water, then with saturated brine and dried over sulfate magnetic Information & Technology厶. After magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Boc—D—Ser (Bz) -Gy-0Et10.6 g.
( 2 ) Z - T r p - D - S e r ( B z l ) - G l y - 0 Hの合成  (2) Synthesis of Z-Trp-D-Ser (Bzl) -Gly-0H
B o c - D - S e r ( B z ) - G y - 0 E t 1 0 . 6 gをァセ トニ ト リ ノレ 1 0 0 に懸濁 し、 メ タ ンスルホ ン酸 1 4 . 4 gを滴下した。 1 時間攪拌後、 T E A 1 5 . 1 8 gで中和 した。 こ の溶液に Z— T r p — O H 1 0. 1 5 g、 H〇 B t 4. 0 5 g , E D C - H C ^ 5 . 7 5 g、 C H 2 C £ 2 5 0 を順次加え、 2時間攪拌した。 反応液に C H 2 C £ 2 を加え、 水、 5 % K H S 04 水溶 液、 5 %炭酸水素ナ ト リ ウ ム水、 飽和食塩水の順に洗浄 し、 溶媒を減圧留去した。 残渣を M e O H 4 0 0 m :溶 解し、 氷冷下 I N N a O H 6 07 ^を滴下した。 5 0 で で 1 時間攪拌後、 2 日間放置した。 溶媒を減圧留去後、 ，水を加えてジェチルェ一テルで洗浄し、 K H S ひ 4 にて 酸性に した。 A c O E t で抽出後、 溶媒を減圧留去し、 ァセ 卜 二 ト リ ノレ一ベ ンゼン 一 ジェチルエーテル力、ら再沈 澱し、 ジェチル i一テルで洗浄、 乾燥して Z — T r p — D — S e r ( B z £ ) - G i y - O H l . 3 gを得た。 ( 3 ) c - P_ r o - L e u_- 0 _B _z 1 の合成 Boc-D-Ser (Bz) -Gy-0Et10.6 g was suspended in acetonitrile 100, and methansulfonate 14.4 g was added dropwise. did. After stirring for 1 hour, the mixture was neutralized with 15.18 g of TEA. To a solution of this Z- T rp - OH 1 0. 1 5 g, H_〇 B t 4. 0 5 g, EDC -. HC ^ 5 7 5 g, added sequentially CH 2 C £ 2 5 0, 2 hours Stirred. The CH 2 C £ 2 was added to the reaction solution, water, 5% KHS 0 4 aqueous solution, 5% sodium hydrogen na Application Benefits U arm water, then with saturated brine, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in MeOH 400 m :, and INNAOH 607 ^ was added dropwise under ice cooling. After stirring at 50 for 1 hour, the mixture was left for 2 days. The solvent was evaporated under reduced pressure, water was washed with Jechirue one ether added at KHS monument 4 Acidified. After extraction with AcOEt, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the precipitate was reprecipitated with acetone, benzene, benzene and getyl ether. rp — D — Ser (B z £)-G iy-OH l. 3 g was obtained. (3) Synthesis of c-P_ ro-Le u_- 0 _B _z 1
B o c — P r o — O H I O . O gを T H F に溶解し、 — 2 0 °Cに冷却後 N MM 4 . 6 9 gを加え、 I B C F 6 . 3 4 gを滴下して、 5 分間攪拌した。 別に T 0 s 0 H · H - L e u - O B z ^ 1 8 . 2 7 gを D M F に溶解後、 氷冷下 N MM 4 . 6 9 gで中和 した溶液を調製 し、 先の 反応液へ加えた。 2 時間攪拌後、 水を加えて、 室温まで も ど し A c O E t で抽出後、 水洗した。 有機層を硫酸マ グネ シゥ ムにて乾燥し、 硫酸マグネ シゥムを濾別後、 溶 媒を減圧留去し、 B o c — P r o — L e u — O B z  Boc—Pro—OHIO.Og was dissolved in THF, and after cooling to −20 ° C., 4.6 mm of NMM was added, 6.34 g of IBCTF was added dropwise, and the mixture was stirred for 5 minutes. Separately, after dissolving T0s0H ・ H-Leu-OBz ^ 18.27g in DMF, neutralize with NMM4.69g under ice-cooling to prepare a solution. Added to After stirring for 2 hours, water was added, the mixture was cooled to room temperature, extracted with AcOEt, and washed with water. The organic layer was dried with magnesium sulfate, and the magnesium sulfate was filtered off. The solvent was distilled off under reduced pressure, and Boc—Pro—Leu—OBz.
2 2 . 0 1 gを得た。 22.01 g was obtained.
( 4 ) Z - T r p - D - S e r ( B z l ) - G l y - P r q - L e u - O B z 1 の合成  (4) Synthesis of Z-Trp-D-Ser (Bzl) -Gly-Prq-Leu-OBz1
B o c — P r o — L e u — O B z 1 . 5 0 gをァセ トニ ト リ ルに懸濁 し、 メ タ ンスルホ ン酸 1 . 7 2 gを滴 下した。 1 時間攪拌後、 T E A 1 . 8 1 gで中和 した。 こ の溶液に Z — T r p — D — S e r ( B z ) - G £ y - 0 H 3 . 2 6 g、 H 0 B t 0 . 4 4 g、 E D C · H C £ 0 . 6 2 g、 C H 2 C i 2 を順次加え、 2 時間攪拌し た。 反応液に C H 2 C £ 2 を加え、 水、 5 % K H S 04 、 水溶液、 5 %炭酸水素ナ ト リ ウ ム水、 飽和食塩水の順に 洗浄し、 硫酸マ グネ シウ ムにて乾燥した。 硫酸マ グネ シ ゥ厶を濾別後、 溶媒を減圧留去し、 Z— T r p — D— S e r ( B z ) — G y — P r o — L e u — 〇 B z ^ 2. 9 6 gを得た。 1.5 g of Boc—Pro—Leu—OBz was suspended in acetonitrile, and 1.72 g of methansulfonate was added dropwise. After stirring for 1 hour, the mixture was neutralized with 1.8 g of TEA. In this solution, Z — T rp — D — Ser (B z)-G £ y-0 H 3.26 g, H 0 Bt 0.44 g, EDC · HC £ 0.62 g, CH 2 Ci 2 was sequentially added, and the mixture was stirred for 2 hours. The CH 2 C £ 2 was added to the reaction solution, water, 5% KHS 0 4, aqueous, 5% sodium hydrogen na Application Benefits U arm water, saturated saline in this order It was washed and dried with magnesium sulfate. After magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure, and Z—T rp —D—Ser (B z) —G y —Pro—L eu — 〇B z ^ 2.96 g I got
( 5 ) H - T r p - D - S e r - G y - P r o - L e_ u — Q H 合成  (5) H-Trp-D-Ser-Gy-Pro-Le_u — QH synthesis
Z - T r p - D - S e r ( B z ) — G y — P r o - L e u - O B z 2. 6 9 gをM e O H 1
Figure imgf000136_0001
、 A c 〇 H I 5 に溶解 し、 1 0 % P d Z C 3. O gを加え、 水素雰囲気下、 室温で 9 時間攪拌した。 水を加えた後、 触媒を濾別、 水洗し、 濾洗液を集めて減圧濃縮した。 残 渣を水に溶解し、 あ らかじめ 0. 1 % T F A水で平衡化 させた逆相系充塡剤 Y M C— A 3 6 3 ( S - 5 ) O D S カ ラ ム （ 3 0 0 X 2 5 0 mm) に注入 し、 カ ラ ムを 0. 1 % T F A水で洗浄後、 ァセ トニ ト リ ル濃度を 3 6 0分で 3 5 %まで増加させ、 流速 7 Zm i n . で溶出 した。 溶出液を A 2 8 0 n mでモニタ ー し、 目的物を含む画分 を集め、 凍結乾燥し、 H— T r p — D— S e r - G ^ y — P r o — L e u — O H 7 5 5 mgを得た。 Z-Trp-D-Ser (Bz) — Gy — Pro-Leu-OBz 2.69 g to MeOH 1
Figure imgf000136_0001
Was dissolved in Ac〇HI5, 10% PdZC3.Og was added, and the mixture was stirred at room temperature for 9 hours under a hydrogen atmosphere. After adding water, the catalyst was separated by filtration, washed with water, and the filtrate was collected and concentrated under reduced pressure. Dissolve the residue in water and reverse-phase packing YMC—A366 (S-5) ODS column (300 X 2) equilibrated with 0.1% TFA water in advance. After washing the column with 0.1% TFA water, the concentration of acetonitrile was increased to 35% in 360 minutes and eluted at a flow rate of 7 Zmin. . The eluate was monitored at A280 nm, the fractions containing the target compound were collected, freeze-dried, and H-Trp-D-Ser-G ^ y-Pro-Leu-OH755 mg was obtained.
得られた H— T r p — D— S e r — G ^ y — P r o 一 L e u — O Hは、 逆相系充塡剤 YM C— A M 3 0 3 ( S — 5 ) — O D Sカ ラ ム （ 4 ， 6 0 x 2 5 0 mm) を用 いた、 1 0 %から 5 0 %までの 0. 1 % T F Aを含む了 セ トニ ト リ ルの直線濃度勾配溶出法による分析において 保持時間 2 0 . 7 8 分を示 し、 そのア ミ ノ 酸値分析値 (但し、 T r p は検出せず） および質量分析値は理論値 と一致した。 The obtained H—T rp —D—Ser—G ^ y—Pro-Leu—OH is a reversed-phase packing material YM C—AM303 (S—5) —ODS column ( Retention time of 20% to 50% of 0.1% TFA containing 0.1% TFA was analyzed using a linear gradient elution method. Indicates 7 to 8 minutes, and its amino acid value analysis value (However, T rp was not detected) and the mass spectrometry value agreed with the theoretical value.
ア ミ ノ 酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸— 1 %フ ヱ ノ ー ル、  Hydrolysis: 6 N hydrochloric acid-1% phenol,
1 1 0 °C、 2 4 時間  1 10 ° C, 24 hours
分析方法 ： PICO-TAG (逆相一 PTCア ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PICO-TAG (reverse-phase PTC amino acid) method
*基準ア ミ ノ 酸 （： ） 内理論値  * Reference amino acid (:) Theoretical value
S e r ： 1 . 0 3 ( 1 )  S er: 1.0 3 (1)
G ll y ： 1 . 0 1 ( 1 )  G ll y: 1.0 1 (1)
P r o : 1 . 1 4 ( 1 )  Pro: 1.1.4 (1)
* L e υ ： 1 . 0 0 ( 1 ) * L e υ: 1.0 0 (1)
質量分析 （ S I M S ) Mass spectrometry (SIMS)
〔M + H〕 + ： 5 5 9  [M + H] +: 5 5 9
実施例 2 9 Example 2 9
H - T r p - S e r - G y - P r o - L e u - H-T r p-S e r-G y-P ro-L e u-
N H 2 ( h H C N P ( 7 - 1 1 ) N H 2 ) (配列番号 ： 3 1 ) の合成 Synthesis of NH 2 (h HCNP (7-11) NH 2 ) (SEQ ID NO: 31)
( 1 ) B o c - T r p - S e r ( B z 1 ) - G 1 y - P r o - 0 B z 1 の合成  (1) Boc-Trp-Ser (Bz1)-G1y-Pro-0 Bz1
実施例 2 5 に記載の B o c — T r p — S e r  Boc—Trp—Ser described in Example 25
( B z ) - G £ y - 0 H 1 1 . 2 3 gを D M F 1 0 0 に溶解後、 H C ' H— P r o — O B z ^ 3 . 8 7 8 g、 H O B t 2 . 8 1 g、 E D C ' H C ^ 3 . 9 9 g と T E A 1 . 6 2 gを加え、 一夜攪拌した。 その後、 H C ^ - H - P r o - O B z ^ 1 . 9 3 g、 E D C · H C £ 1 . 5 3 g と T E A O . 8 1 g を追加 し、 攪拌を 続けた。 A c O E t を加え、 1 0 % ク ェン酸水溶液、 飽 和食塩水、 飽和炭酸水素ナ ト リ ウ ム水、 飽和食塩水の順 に洗浄し、 硫酸マグネ シウムにて乾燥した。 硫酸マグネ シゥムを濾別後、 溶媒を減圧留去して B o c — T r p — S e r ( B z ） - G y - P r o - O B z l 1 . After dissolving (B z)-G £ y-0 H1 1.23 g in DMF100, HC 'H-Pro-OBz ^ 3.878 g, HOB t 2.8 1 g Then, EDC'HC ^ 3.999 g and TEA 1.62 g were added and stirred overnight. Then, HC ^ -H-Pro-OB z ^ 1.93 g, EDC HC 1.53 g and TEAO 8.1 g were added and stirring was continued. AcOEt was added, and the mixture was washed with a 10% aqueous citric acid solution, a saturated saline solution, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and a saturated saline solution in that order, and dried over magnesium sulfate. After magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure and Boc—Trp—Ser (Bz) -Gy-Pro-OBzl 1.
8 6 gを得た。  86 g were obtained.
( 2 ) B o c - J r p - S e r - G l y - P r o - O H の合成  (2) Synthesis of Boc-Jrp-Ser-Gly-Pro-OH
B o c — T r p — S e r ( B z ) 一 G ^ y.— P r o - 0 B z 4 . O O gを M e O H 5 0 に溶解し、 1 0 % ? ά / C A . O gを加え、 水素雰囲気下、 室温で 4 時 間攪拌した。 触媒を濾別、 M e 0 Hで洗浄後、 濾洗液を 集めて減圧濃縮し B o c — T r p — S e r — G y — P r o - 0 H 2 . 9 0 g を得た。  B oc — T rp — Ser (B z) -G ^ y.— Pro-0 B z 4. Dissolve OO g in MeOH 50 and add 10% ά / CA. O g The mixture was stirred at room temperature for 4 hours under a hydrogen atmosphere. After filtering off the catalyst and washing with Me0H, the filtrate was collected and concentrated under reduced pressure to obtain Boc-Trp-Ser-Gy-Pro-0H2.90 g.
( 3 ) B o c - L e u — N H 2 の合成 (3) B oc - L eu - Synthesis of NH 2
B o c - L e u - Ο Η · Η 2 0 9 . 9 7 g を T H F 1 0 に溶解し、 N M M 4 . 0 5 gを加え、 一 1 5 でに 冷却後 I B C F 5 . 4 6 gを滴下して、 1 0 分間攪拌し た。 濃ア ンモニア水 1 1 . 7 g を加え、 3 0 分間攪拌後、 溶媒を減圧留去し、 A c O E t を加えた。 水、 5 % K H S 〇 4 水溶液、 5 %炭酸水素ナ ト リ ウ ム水、 飽和食塩水 の順に洗浄し、 硫酸マ グネ シウ ムにて乾燥した。 硫酸マ グネ シゥ厶を濾別後、 溶媒を減圧留去し、 B o c — B oc - L eu -.. Ο Η · Η 2 0 9 a 9 7 g was dissolved in THF 1 0, NMM 4 0 5 g was added dropwise after cooling IBCF 5 4 6 g in one 1 5. And stirred for 10 minutes. 11.7 g of concentrated ammonia water was added, and after stirring for 30 minutes, the solvent was distilled off under reduced pressure and AcOEt was added. Washed with water, 5% KHS- 4 aqueous solution, 5% aqueous sodium hydrogencarbonate, and saturated saline in that order, and dried over magnesium sulfate. After magnesium sulfate was filtered off, the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain Boc —
L e u - N H 2 8 . 3 1 gを得た。 ( 4 ) H C 1 · Η — L e u — N H 2 の合成 L eu - give the NH 2 8 3 1 g.. (4) Synthesis of HC 1 · Η — L eu — NH 2
B o c - L e u - N H 2 8 . 3 1 gを、 4 N K C Zジォキサン 1 5 0 に加え、 室温で 3 0 分間攪拌した。 ジォキサンを減圧留去し、 ジェチルエーテルを加えて沈 澱と し、 濾取、 洗浄 して、 H C ' H — L e u — N H 2 B oc - L eu -. The NH 2 8 3 1 g, was added to 4 NKCZ Jiokisan 1 5 0, and stirred for 30 minutes at room temperature. The Jiokisan was distilled off under reduced pressure, and precipitation lees added to oxygenate chill ether, collected by filtration, washed, HC 'H - L eu - NH 2
5 . 9 3 g を得た。 5.9 g were obtained.
( 5 ) B o c - T r p - S e r - G l y - P r o - L e υ - N H 2 の合成  (5) Synthesis of Boc-Trp-Ser-Gly-Pro-Leυ-NH2
B o c - T r p - S e r - G i y - P r o - O H l . 5 0 g . H C ^ - H - L e u - N H 2 4 9 5 mg. H O B t 4 0 1 mgを C H 2 C £ 2 に溶解 し、 E D C ' H C 5B oc - T rp - S er - G iy - P ro - OH l 5 0 g HC ^ -.. H - L eu -. NH 2 4 9 5 mg to HOB t 4 0 1 mg to CH 2 C £ 2 Dissolve and EDC 'HC 5
6 9 mg、 T E A 3 0 l mgを加えた。 一夜攪拌後、 T E A69 mg and 30 mg of TEA were added. After stirring overnight, T E A
3 0 0 mgを追加 し 2 日間放置した。 C H 2 C £ 2 を加え、 5 % K H S 0 4 水溶液、 5 %炭酸水素ナ ト リ ウム水、 飽 和食塩水の順に洗浄し、 硫酸マグネ シウムにて乾燥 した。 硫酸マグネ シウムを濾別後、 溶媒を減圧留去して B o c - T r p - S e r - G i y - P r o - L e u - N H 2 1 . 5 9 gを得た。 After adding 300 mg, the mixture was left for 2 days. CH 2 C £ 2 was added, and the mixture was washed with a 5% KHS04 aqueous solution, a 5% aqueous sodium hydrogencarbonate solution, and a saturated saline solution in that order, and dried over magnesium sulfate. After filtering off the magnesium sulfate, B oc the solvent was distilled off under reduced pressure - T rp - S er - G iy - P ro - L eu - give the NH 2 1 5 9 g..
( 6 ) H - T r p - S e r - G y - P j o_- L e υ - N_H 2 の合成 (6) H - T rp - S er - G y - P j o_- L e υ - Synthesis of N_H 2
B o c - T r p - S e r - G ^ y - P r o - L e u - N H 2 1 . 5 9 を丁 ？八 2 0 ^、 ァニソ一ゾレ 5 ?^、 ェ タ ン ジチオール 0 . 5 に溶解 し、 1 時間攪拌 した。  Boc-Trp-Ser-G ^ y-Pro-Leu-NH21.59? Dissolved in 20 ^^, anisol monosol 5 ^^, and ethanedithiol 0.5, and stirred for 1 hour.
T F Aを減圧留去し、 エーテル 3 0 0 を加えて沈澱と し、 濾過、 乾燥 した。 得られた粗 T F A · H — T. r p — S e r - G y - P r o - L e u - N H 2 を 0 . 1 % T F A水に溶解し、 あ らかじめ 0 . 1 % T F A水で平衡化 させた逆相系充塡剤 Y M C — A 3 6 3 ( S - 5 ) 0 D S カ ラム （ 3 0 0 X 2 5 0 mm) に注入 し、 カ ラムを 0 . 1 % T F A水で洗浄後、 ァセ トニ ト リ ル濃度を 2 4 0 分で 3 0 %まで増加させ、 流速 7 Zm i n . で溶出 した。 溶出液を A 2 8 0 n mでモニター し、 目的物を含む画分 を集め、 凍結乾燥し、 H — T r p — S e r — G y — P r o — L e u — N H 2 5 7 mgを得た。 TFA was distilled off under reduced pressure, ether 300 was added to precipitate, filtered and dried. The obtained crude TFA · H — T. rp — S er - G y - P ro - L eu -.. NH 2 a 0 1% TFA was dissolved in water, nitrous et beforehand 0 1% TFA reverse phase equilibrated with water charge塡剤YMC - A 3 6 3 (S-5) 0 Inject into DS column (300 x 250 mm), wash the column with 0.1% TFA water, and adjust the acetonitrile concentration to 240 minutes. And eluted at a flow rate of 7 Zmin. The eluate was monitored at A 2 8 0 nm, fractions containing the desired product were freeze-dried, H - T rp - S er - G y - P ro - give the NH 2 5 7 mg - L eu .
得られた H — T r p — S e r — G y — P r o — L e υ - N H 2 は、 逆相系充塡剤 Y M C — A M 3 0 3 ( S — 5 ) — O D S カ ラム （ 4 . 6 0 X 2 5 0 mm) を用いた、 1 0 %から 4 0 %までの 0 . 1 % T F Aを含むァセ トニ ト リ ルの直線濃度勾配溶出法による分析において保持時 間 2 1 . 2 1 分を示し、 そのア ミ ノ 酸分析値 （但し、 T r p は検出せず） および質量分析値は理論値と一致し た。  The obtained H — T rp — Ser — G y — Pro — Le — NH -NH 2 is a reversed-phase packing material YMC — AM 303 (S — 5) — ODS column (4.6 Retention times for linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 40% using 0x250mm). The amino acid analysis value (T rp was not detected) and the mass analysis value agreed with the theoretical value.
ア ミ ノ 酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 6 N塩酸一 1 % フ ヱ ノ ール、  Hydrolysis: 6% hydrochloric acid-1% phenol,
1 1 0 °C、 2 4 時間  1 10 ° C, 24 hours
分析方法 ： PIC0-TAG (逆相一 PTCア ミ ノ 酸） 法  Analysis method: PIC0-TAG (reverse phase-one PTC amino acid) method
*基準ア ミ ノ酸 （ ） 内理論値  * Standard amino acid (in theory)
S e r ： 1 . 0 2 ( 1 )  S er: 1.0 2 (1)
G £ y 1 . 0 6 ( 1 )  G £ y 1.06 (1)
P r o : 1 . 1 1 ( 1 ) 氺 L e u : l . 0 0 ( 1 ) Pro: 1. 1 1 (1) 氺 L eu: l. 0 0 (1)
質量分析 （ S I M S ) Mass spectrometry (SIMS)
〔 M + H〕 + : 5 5 8 (M + H) + : 5 5 8
実施例 3 0 Example 30
H - T r p - A l a - G l y - P r o - L e u - 0 H ( h H C N P ( 7 - 1 1 ) ) (配列番号 ： 3 2 ) の合成 使用 した樹脂は粒径 1 0 0 — 2 0 0 メ ッ シュのク ロ 口 メ チル化されたポ リ スチ レ ン ビニルベンゼン樹脂である ( 1 % ジ ビニルベンゼンで架橋、 樹脂 1 g当た り 0 . 6 8 ミ リ モルのク ロ ライ ドを含有） 。 ポ リ ペプチ ドを合成 するに当た り 4 . 0 7 gの B o c — L e u — O Hをェチ ルアル コ ール 3 0 τ^、 水 へ溶解し、 2 0 %炭酸セ シゥ厶水溶液にて Ρ Η 7 と し、 減圧濃縮した後、 乾燥さ せた。 これに D M F 1 6 0 を加え、 2 0 gの ク ロ ロ メ チル化樹脂を加え、 5 0 °Cにて 1 2時間、 さ らに室温に て 1 2時間攪拌し、 エステル化した。 得られた B 0 c — L e u _ 0—樹脂を濾過し、 D M F、 9 0 % D M F、 D M F、 エチルアルコールにて順次洗浄し、 かつ乾燥 し た。 収量は 2 3. 4 gであった。  Synthesis of H-Trp-Ala-Gly-Pro-Leu-0H (hHCNP (7-11-1)) (SEQ ID NO: 32) The resin used has a particle size of 100-200. 0 Mesh black mouth A methylated polystyrene vinylbenzene resin (crosslinked with 1% divinylbenzene, 0.68 millimoles of chloride per gram of resin) Containing). In synthesizing the polypeptide, 4.07 g of Boc—Leu—OH was dissolved in ethyl alcohol 30 τ ^ in water and dissolved in a 20% aqueous solution of cesium carbonate. The mixture was concentrated under reduced pressure, and dried. To this, DMF16O was added, and 20 g of a chloromethylated resin was added, followed by stirring at 50 ° C for 12 hours and further at room temperature for 12 hours to perform esterification. The obtained B0c-Leu_0-resin was filtered, washed sequentially with DMF, 90% DMF, DMF, and ethyl alcohol, and dried. The yield was 23.4 g.
こ の B o c — L e u — 0—樹脂 2 0 . 0 gを固相合成 反応容器に入れ、 後記スケジュ ール 1 に従って、 B o c 一 P r o — O H、 B o c - G y - O H. B o c — A £ a - O H. B o c 一 T r p — O Hを順次カ ツ プ リ ン グさせた。 一部の樹脂を取り 出 し、 H— T r p — A a — G £ y — P r o — L e u — O Hペプチ ド樹脂 1 . 0 5 gが得られた。 20.0 g of this Boc—Leu—0—resin was placed in a solid-phase synthesis reaction vessel, and Boc-Pro—OH, Boc-Gy-OH.B according to Schedule 1 described below. oc — A £ a-O H. B oc-T rp — OH was sequentially coupled. A part of the resin is removed and H-T rp — A a — G £ y — Pro — L eu — OH peptide resin 1.05 g was obtained.
こ の H— T r p — A a — G ^ y — P r o — L e u — 〇 Hペプチ ド樹脂 0 . 5 0 g にァニソール 3 、 ェチル メ チルスノレフ ィ ド 0 . 5 τηβ、 無水フ ッ化水素 2 0 を加 え、 一 2 0 °C 6 0 分間、 0 °C 6 0 分間反応させた。 減圧 濃縮後、 ジェチルエーテル 2 0 0 を加え 3 0 分間攪拌 し、 濾過しジェチルエーテル 1 0 0 で洗浄した。 濾上 物に 5 %酢酸水 1 0 0 7^を加えて 3 0 分間攪拌後、 樹脂 を濾別 し、 5 %酢酸水 1 0 0 で洗浄した。 濾洗液を凍 結乾燥後、 得られた粗ペプチ ドを 1 0 %酢酸水 5 0 に 溶解し、 あ らかじめ 0 . 1 % T F A水で平衡化させた逆 相系充塡剤 Y M C — A 3 6 3 ( S - 5 ) O D S カ ラ ム ( 3 0 0 X 2 5 0 mm) に注入し、 カ ラ ムを 0 . 1 % T F A水で洗浄後、 ァセ トニ ト リ ル濃度を 1 8 0 分で 2 8 % まで増加させ、 流速 7 . 0 Z m i n . で溶出 した。 溶 出液を A 2 8 0 n mでモニター し、 目的物を含む画分を 集め、 凍結乾燥し、 H— T r p — A a — G £ y —  This H—T rp—Aa—G ^ y—Pro—Leu—〇H peptide resin 0.5 g to anisol 3, ethyl methylsolenolide 0.5 τηβ, anhydrous hydrogen fluoride 2 After adding 0, the reaction was carried out at 120 ° C for 60 minutes and at 0 ° C for 60 minutes. After concentration under reduced pressure, dimethyl ether 200 was added, and the mixture was stirred for 30 minutes, filtered, and washed with dimethyl ether 100. To the filtrate was added 10% aqueous 5% acetic acid, and after stirring for 30 minutes, the resin was separated by filtration and washed with 100% aqueous 5% acetic acid. After freeze-drying the filtrate, the obtained crude peptide was dissolved in 10% aqueous acetic acid 50, and the reversed-phase packing material YMC was equilibrated with 0.1% TFA water in advance. A363 (S-5) Inject into ODS column (300 x 250 mm), wash the column with 0.1% TFA water, and adjust the concentration of acetonitrile to 1 It was increased to 28% in 80 minutes and eluted at a flow rate of 7.0 Z min. The eluate is monitored at A280 nm, the fractions containing the target compound are collected, lyophilized, and H—Trp—Aa—G £ y—
P r o — L e u — O H 4 4 . 8 2 mgを得た。 Pro-Leu-OH44.8 2 mg was obtained.
得られた H— T r P - A a - G y - P r o - L e u - O Hは、 逆相系充塡剤 Y M C — A M 3 0 3 ( S — 5 ) — 〇 D S カ ラム （ 4 . 6 0 x 2 5 0 mm) を用いた、 1 0 %から 5 0 %までの 0 . 1 % T F Aを含むァセ トニ ト リ ルの直線濃度勾配溶出法による分析において保持時 間 2 4 . 3 9 分を示 し、 そのア ミ ノ 酸分析値は理論値と 一致した。 ア ミ ノ酸分析 The obtained H—TrP-Aa-Gy-Pro-Leu-OH is a reversed-phase packing material YMC—AM303 (S—5) —〇DS column (4.6 Retention time in linear gradient elution analysis of acetonitrile containing 0.1% TFA from 10% to 50% using 0x250mm). The amino acid analysis value was in agreement with the theoretical value. Amino acid analysis
加水分解 ： 4 N メ タ ン ス ノレホ ン酸一 2 % ト リ プ夕 ン  Hydrolysis: 4N methanophoric acid 2% tripon
1 1 0 て、 2 4 時間  1 1 0, 24 hours
分析方法 ： PICO-TAG (逆相— PTCァ ミ ノ 酸法）  Analysis method: PICO-TAG (reverse phase—PTC amino acid method)
*基準ァ ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Standard amino acids (in theory)
A a . 9 5 ( 1 )  A a. 9 5 (1)
G £ y . 0 5 ( 1 )  G £ y. 0 5 (1)
P r o . 9 6 ( 1 )  P ro. 9 6 (1)
* L e υ . 0 0 ( 1 ) * Le υ. 0 0 (1)
T r p . 6 2 ( 1 )  T r p. 6 2 (1)
( ス ケ ジ ユ ー ル 1 )  (Schedule module 1)
工程 時間 （分） X処理回数 Process time (min) X Number of treatments
1 . (洗浄） 塩化 メ チ レ ン 200 2 X 31. (Washing) Methylene chloride 200 2 X 3
2 . (脱保護 ) 50% TFA -5%エ タ ン ジチオー ル 3 X 1 一 45%塩化 メ チ レ ン （V/V)200 20 X 12. (Deprotection) 50% TFA -5% ethane dithiol 3 X 1 45% methylene chloride (V / V) 200 20 X 1
3 . (洗浄） 塩化メ チ レ ン 200 m 2 X 23. (Washing) Methylene chloride 200 m 2 X 2
4 . (洗浄） メ タ ノ ー ル 200 '2 X 24. (Washing) Metal 200'2 X 2
5 . (中和） 10% ト リ ェチ ルァ ミ ン 5. (Neutralization) 10% Triethylamine
一 90%塩化メ チ レ ン （V/V)200 1 X 1 One 90% methylene chloride (V / V) 200 1 X 1
6 (洗浄） メ タ ノ ー ル 200 TO 2 X 1 7 (中和） 10% ト リ エチ ルァ ミ ン 6 (washing) methanol 200 TO 2 X 17 (neutralization) 10% triethylamine
- 90%塩化メ チ レ ン （V/V)200 1 X 1 -90% methylene chloride (V / V) 200 1 X 1
8 . (洗浄） メ タ ノ ー ル 200 2 x 28. (Washing) Metal 200 2 x 2
9 . (洗浄） 塩化メ チ レ ン 200 nH 2 X 3 10. (カ ッ プ リ ン グ） 各ァ ミ ノ 基保護ア ミ ノ 酸 （ 20ミ リ モル） 、 添加剤 （HOBt) 、 9. (washing) Methylene chloride 200 nH 2 X 3 10. (coupling) Each amino group-protected amino acid (20 mmol), additive (HOBt),
50% DMF-50%塩化メ チ レ ン （V/V)100 5 x 1 DCC(20ミ リ モ ル） の塩化メ チ レ ン溶液  50% DMF-50% methylene chloride (V / V) 100 5 x 1 DCC (20mM) in methylene chloride
120 X 1 120 x 1
11. (洗浄） 50% DMF-50%塩化メ チ レ ン （V/V)200 11. (Washing) 50% DMF-50% Methylene chloride (V / V) 200
2 X 2 2 X 2
12. (洗浄） メ タ ノ ール 200 2 X 112. (Washing) Metanole 200 2 X 1
13. (中和） 10% ト リ ェチルァ ミ ン 13. (neutralized) 10% triethylamine
— 90%塩化メ チ レ ン （V/V)200 1 X 1 — 90% methylene chloride (V / V) 200 1 X 1
14. (洗浄） メ タ ノ ール 200 2 X 214. (Washing) Metanole 200 2 X 2
15. (洗浄） 塩化メ チ レ ン 200 2 X 215. (Washing) Methylene chloride 200 2 X 2
16. ( ァ セ チル化） 25%無水酢酸 16. (Acetylated) 25% acetic anhydride
一 75%塩化メ チ レ ン （V/V)200 15x 1 17. (洗浄） 塩化メ チ レ ン 200 2 X 2 18. (洗浄） メ タ ノ ール 200 2 X 2 実施例 3 1  One 75% methylene chloride (V / V) 200 15x 1 17. (washing) Methylene chloride 200 2 X 2 18. (washing) Methanol 200 2 X 2 Example 3 1
H - A 1 a - G_ 1 y — P r o — L e u — O Hの合成 H — A ^ a - G y — P r o — L e u — O H (以後、 H C N P ( 8 — 1 1 ) とい う ） を以下のよ う に して合成 した。  H-A 1 a-G_ 1 y — P ro — L eu — OH synthesis H — A ^ a-G y — P ro — L eu — OH (hereafter HCNP (8 — 11)) It was synthesized as follows.
使用 した樹脂は粒径 1 0 0 - 2 0 0 メ ッ シ ュ の ク ロ 口 メ チル化されたポ リ スチ レ ン ビニルベ ンゼン樹脂である ( 1 % ジ ビニルベ ン ゼ ンで架橋、 樹脂 1 g 当た り 0 . 6 8 ミ リ モ ルの ク ロ ラ イ ドを含有） 。 ポ リ ペプチ ドを合成 するに当た り 3 . 0 5 gの B o c — L e u — 〇 Hをェチ ルアルコ ール 2 Q τηβ、 水 7 へ溶解し、 2 0 %炭酸セ シ ゥ厶水溶液にて ρ Η 7 と し、 減圧濃縮し、 乾燥させた。 これに D M F 1 2 を加え、 1 5 gの ク ロ ロ メ チル化 樹脂を加え、 5 0 °Cにて 1 2 時間、 さ らに室温にて 1 2 時間攪拌し、 エステル化した。 得られた B 0 c — L e u — 0 —樹脂を濾過 し、 D M F、 9 0 % D M F、 D M F , エチルアルコールにて順次洗浄し、 かつ乾燥した。 収量 は 1 6 . 9 g。 The resin used was a methylated polystyrene vinylbenzene resin with a particle size of 100-200 mesh mouth (crosslinked with 1% divinylbenzene, resin 1 g 0.668 per milliliter of chloride is included). Synthesize polypeptide To this end, 3.05 g of Boc—Leu—〇H was dissolved in ethyl alcohol 2Q τηβ and water 7 and ρΗ7 was dissolved in a 20% aqueous solution of cesium carbonate. The mixture was concentrated under reduced pressure, and dried. To this, DMF12 was added, and 15 g of a chloromethylated resin was added, followed by stirring at 50 ° C for 12 hours and further at room temperature for 12 hours, followed by esterification. The obtained B0c—Leu—0—resin was filtered, washed sequentially with DMF, 90% DMF, DMF, and ethyl alcohol, and dried. The yield is 16.9 g.
こ の B o c — L e u — 0 —樹脂 6 gを固相合成反応容 器に入れ後記スケジュール 1 に従って B 0 c — P r 0 — 〇 H、 B o c - G i y - O H , B o c — A a — 〇 H、 を順次カ ッ プリ ン グさせた。 その結果、 H C N P ( 8 — 1 1 ) ペプチ ド樹脂 6 . 7 gが得られた。  Put 6 g of this B oc —L eu —0 —resin into a solid-phase synthesis reactor and follow the schedule 1 below. B 0 c —P r 0 — —H, B oc -G iy -OH, B oc —A a — 〇 H, were sequentially coupled. As a result, 6.7 g of HCNP (8-11) peptide resin was obtained.
こ の H C N P ( 8 — 1 1 ) ペプチ ド樹脂 し l g にァ 二 ソ ール 3 、 ェチル メ チルスルフ ィ ド 0 . 5 τηβゝ 無水 フ ッ 化水素 2 0 ？ ^を加え、 - 2 0 °C 6 0 分間、 0 で 6 0 分間反応させた。 減圧濃縮後、 ジェチルエーテル 2 0 0 を加え 3 0 分間攪拌し、 濾過 しジェチルエーテル 1 0 0 で洗浄した。 濾上物に 5 %酢酸水 1 0 0 を加えて 3 0 分間攪拌後、 樹脂を濾過 し、 5 %酢酸水 1 0 Q τηβで 洗浄した。 濾洗液を凍結乾燥後、 得られた粗ペプチ ドを 水に溶解し、 予め 0 . 1 % ト リ フ ルォロ酢酸水で平衡化 させた逆相系充塡剤 Y M C — A 3 6 3 ( S - 5 ) 0 D S カ ラ ム （ 3 0 0 x 2 5 0 mra) に注入 し、 カ ラ ムを 0 . 1 % ト リ フルォロ酢酸水で洗浄後、 ァセ トニ ト リ ル濃度を 1 8 %まで増加させ、 流速 7 . 0 Z分で溶出 した。 溶 出液を A 2 3 0 n mでモニター し、 目的物を含む画分を 集め、 凍結乾燥し、 H C N P ( 8 - 1 1 ) : 1 8 2 . 3 mgを得た。 This HCNP (8-11) peptide resin was converted to lg / sol 3 and ethyl methyl sulfide 0.5 τηβ ゝ anhydrous hydrogen fluoride 20? ^ Was added, and the reaction was carried out at −20 ° C. for 60 minutes and at 0 for 60 minutes. After concentration under reduced pressure, dimethyl ether 200 was added, the mixture was stirred for 30 minutes, filtered, and washed with dimethyl ether 100. To the filtered product was added 100% aqueous 5% acetic acid, and the mixture was stirred for 30 minutes. Then, the resin was filtered and washed with 10% aqueous 10Q τηβ. After freeze-drying the filtrate, the obtained crude peptide was dissolved in water, and a reversed-phase packing material YMC-A363 (S) previously equilibrated with 0.1% aqueous trifluoroacetic acid was used. -5) Inject into 0 DS column (300 x 250 mra) and set 0.1 column After washing with an aqueous solution of trifluoroacetic acid, the concentration of acetonitrile was increased to 18%, and elution was performed at a flow rate of 7.0 Z minutes. The eluate was monitored at A230 nm, and the fractions containing the desired compound were collected and freeze-dried to obtain HCNP (8-11): 182.3 mg.
得られた H C N P ( 8 - 1 1 ) は、 逆相系充塡剤 Y M C - A 2 1 1 一 O D S カ ラム （ 4 . 6 0 x 2 5 0 mm ) を用いた、 1 0 %から 5 0 %までの 0 . 1 % ト リ フル ォロ酢酸を含むァセ トニ ト リ ルの直線濃度勾配溶出法に よ る分析において保持時間 1 4 . 7 分を示し、 そのア ミ ノ酸分析値は理論値と一致した。  The HCNP (8-11) obtained was purified from 10% to 50% using a reversed-phase packing material YMC-A211-one ODS column (4.60 x 250 mm). Analysis of acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid up to 14.7 min by linear gradient elution showed a retention time of 14.7 minutes. Matched value.
ア ミ ノ酸分析  Amino acid analysis
加水分解 ： 4 Nメ タ ン スルホ ン酸 2 % ト リ プ夕 ミ ン、  Hydrolysis: 4 N methane sulphonic acid 2% tripnin,
1 1 0 °C、 2 4 時間  1 10 ° C, 24 hours
分析方法 ： PICO- TAG (逆相一 PTCァ ノ酸法）  Analysis method: PICO-TAG (Reverse-phase PTC anoic acid method)
*基準ア ミ ノ 酸 （ ） 内理論値  * Reference amino acid () Theoretical value
G y ： 1 . 0 0 ( 1 )  Gy: 1.00 (1)
A a ： 0 . 9 0 ( 1 )  Aa: 0.90 (1)
P r 0 ： 0 . 9 5 ( 1 )  Pr0: 0.95 (1)
* L e u : l . 0 0 ( 1 ) * L e u: l. 0 0 (1)
ス ケ ジ ュ ー ル 1 Schedule 1
工程 時間 （分） X処理回数 Process time (min) X Number of treatments
1 . (洗浄） 塩化メ チ レ ン βθτηβ 2 X 3 2 . (脱保護） 50% TFA -5%エタ ン ジチオール 3 X 1 — 45%塩化メ チ レ ン （V/V)60 20 X 1 3 (洗浄） 塩化メ チ レ ン 60^ 2 X 2 4 (洗浄） メ タ ノ 一ゾレ 60OT 2 X 2 5 (中和） 10 % ト リ ェチルァ ミ ン 1. (Washing) methylene chloride βθτηβ 2 X 3 2. (deprotection) 50% TFA -5% ethanedithiol 3 X 1 — 45% methylene chloride (V / V) 60 20 X 1 3 (washing) methylene chloride 60 ^ 2 X2 4 (washing) methanol monosol 60OT 2 X25 (neutralization) 10% triethylamine
一 90%塩化メ チ レ ン (V/V)60^ 1 X 1 One 90% methylene chloride (V / V) 60 ^ 1 X 1
6 (洗浄） メ タ ノ ーゾレ 60τηβ 2 X 1 7 (中和） 10 % ト リ ェチルァ ミ ン 6 (Washing) Metanosol 60τηβ 2 X 17 (Neutralization) 10% Triethylamine
一 90%塩化メ チ レ ン (V/V)60^ 1 X 1 One 90% methylene chloride (V / V) 60 ^ 1 X 1
8 . (洗浄） メ タ ノ ーノレ 60m 2 X 28. (Washing) Meta-nore 60m 2 X 2
9 , (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 X 3 10. (カ ツ プ リ ン グ） 9, (washing) Methylene chloride 2 X 3 10. (coupling)
各ア ミ ノ 基保護ア ミ ノ 酸 ( 6 ミ リ モ ル） 、 50% DMF-50%塩化メ チ レ ン （V/V)30 τηβ、 5 x 1 DCC( 6 ミ リ モル） の塩化メ チ レ ン溶液 12m£  Each amino group-protected amino acid (6 mimol), 50% DMF-50% methylene chloride (V / V) 30 τηβ, 5 x 1 DCC (6 mimol) chloride 12m £
120 X 1 11 (洗浄） 50% DMF50 %塩化メ チ レ ン（V/V)60 rnd  120 X 1 11 (wash) 50% DMF 50% methylene chloride (V / V) 60 rnd
2 X 2 2 X 2
12. (洗浄） メ タ ノ ール 60^ 2 X 1 13. (中和） 10% ト リ ェチルァ ミ ン 12. (wash) methanol 60 ^ 2 X 1 13. (neutralize) 10% triethylamine
— 90%塩化メ チ レ ン （V/V)60 1 X 1 — 90% methylene chloride (V / V) 60 1 X 1
14. (洗浄） メ タ ノ ール 2 X 2 15, (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 X 2 16, (ァセチル化） 25%無水酢酸 14. (washing) methanol 2 X 2 15, (washing) methylene chloride 2 X 2 16, (acetylated) 25% acetic anhydride
— 75%塩化メ チ レ ン (V/V)60^ 15x 1 — 75% methylene chloride (V / V) 60 ^ 15x 1
17. (洗浄） 塩化メ チ レ ン 2 X 2 18. (洗浄） メ タ ノ ール 2 X 2 但し、 工程 1 0 のカ ッ プ リ ン グ反応後、 少量の樹脂を ニ ン ヒ ド リ ンで試験 し、 陽性青色とな った場合にはカ ツ プ リ ン グ不完全である と して同一の保護形ァ ミ ノ 酸を用 い反応を繰り返した。 そ して 2 回目以降のカ ッ プリ ン グ の場合には、 5 0 % D M F — 5 0 %塩化メ チ レ ン （ V Z V ) の代わ り に D M F、 または 1 — メ チル— 2 — ピロ リ ジ ノ ンを用い、 反応時間を最大 1 2 時間まで延長した。 実施例 3 2 17. (washing) methylene chloride 2 x 2 18. (washing) methanol 2 x 2 However, after the coupling reaction in step 10, a small amount of resin is tested with ninhydrin, and if it turns positive blue, it is considered that the coupling is incomplete. The reaction was repeated using the same protected amino acid. For the second and subsequent couplings, 50% DMF — 50% methylene chloride (VZV) is replaced with DMF or 1-methyl-2-pyrrolidine. The reaction time was extended to a maximum of 12 hours using non-acid. Example 3 2
生物学的活性の測定  Measurement of biological activity
生物学的活性の測定法は、 小鹿幸生ら 〔薬物 ' 精神 - 行動、 7 巻、 4 4 7〜 4 5 1 頁 （ 1 9 8 7 ) 〕 の方法に 準じて行った。 即ち、 胎令 1 6 日 目 のラ ッ ト脳から摘出 した中隔中心核を細切後、 フ ァ ルコ ン社製 3 5 mmプラス チ ッ ク製培養皿中で、 1 % F C S を含むボッ テ ンシュ 夕 イ ン （ Bottenstein)等の改変 N 2培養液を用いて、 7 % 炭酸ガス混合空気、 3 6 °Cの条件下で培養した。 培養 3 日 目 よ り、 検体と して神経栄養ペプチ ド誘導体を培養系 に添加 し （対照群は無添加） 、 培養 9 日 目に培養組織の アセチルコ リ ン （ A C h ) 産生能を測定し、 生物学的活 性と した。 A C h産生能は培養組織を ト リ ス塩酸 （ p H 7 . 4 ) を緩衝系 とする タイ ロー ド液にてプレイ ンキュ ベーシ ヨ ン した後、 1 O O n M 〔 3 H〕 コ リ ン ク 口 ライ ド （ 1 5 C i Zm m o ) を含む緩衝液で 3 7 °C、 3 0 分イ ンキュベー ト後、 フ リ ーの 〔 3 H〕 コ リ ンを洗浄除 去後、 1 Nギ酸 Zアセ ト ン （ 1 5 ： 8 5 ) 溶液で組織を 溶解し、 フ リ ー 〔 3 H〕 コ リ ンをコ リ ンキナーゼ （ 0 . 1 ユニ ッ ト ^ ) でフ ォ ス フ ォ コ リ ンに転換、 〔 3 H〕 A C hをテ ト ラ フ ェニルボロ ン （ 5 mg ^ァセ トニ ト リ ル） で抽出 し、 培養組織の A C h産生能を検討した。 培 養組織の A C h産生能は単位培養組織片当た り の A C h 量の対照群に対する変化量で表現した。 The biological activity was measured according to the method of Yukio Oka et al. [Drugs, Psychological-Action, Vol. 7, pp. 447-451 (19987)]. That is, after the central septum nucleus removed from the rat brain on the 16th day of fetal gestation was minced, it was placed in a Falcon 35 mm plastic culture dish containing 1% FCS. Using a modified N 2 culture solution such as Bottenstein, the cells were cultured under the conditions of 7% carbon dioxide mixed air and 36 ° C. From day 3 of culture, a neurotrophic peptide derivative was added as a sample to the culture system (the control group was not added), and on day 9 of culture, the ability of the cultured tissue to produce acetylcholine (ACh) was measured. , And biological activity. AC h Sanseino cultured tissue Application Benefits scan hydrochloride (p H 7. 4) after playing Nkyu Beshi Yo down the at tie loading solution to buffer system, 1 OO n M [3 H] U Li down click mouth Lai de (1 5 C i Zm mo) in buffer containing 3 7 ° C, 3 0 minutes Lee Nkyube bets after the full rie [3 H] U Li down the wash removal Sanochi, 1 N formic acid Z Tissues in Acetone (15:85) solution Dissolved, full re-chromatography [3 H] co-Li down the co-Li Nkinaze (0.1 Uni-Tsu door ^) in a non-O scan off O co-transformed into Li down, [3 H] hand AC h door La off Eniruboro (5 mg ^ acetonitrile), and the ACh-producing ability of the cultured tissue was examined. The ACh-producing ability of the cultured tissue was expressed as a change in the ACh amount per unit cultured tissue piece from the control group.
以下の表に、 本発明の神経栄養ペプチ ド誘導体のい く つかの代表例について、 特徴的な生物学的活性の一例を 示す。 但し、 A C h産生能は対照群を 1 0 0 % と した値 である。 The following table shows an example of the characteristic biological activity of some representative examples of the neurotrophic peptide derivatives of the present invention. However, the AC h production ability is a value obtained by setting the control group to 100%.
表 ラット中隔中心核培赛系における AC h産生能に対する作用 SS (pg/m 1 ) Table Effect on AC h-producing ability in rat septate nucleus culture system SS (pg / m 1)
化 « ―  «―
A Ch產生能（96〉 hflCNP(6-10 10 15 20 30 50 100 150 300  A Ch 產 ability (96) hflCNP (6-10 10 15 20 30 50 100 150 300
100 141 159 82100 141 159 82
66 96 194 124 66 96 194 124
113 145  113 145
129 169 hBCNP(7-ll) 10 25 50  129 169 hBCNP (7-ll) 10 25 50
J7 135 165 hBCPC8-ll) 5 15 45 J7 135 165 hBCPC8-ll) 5 15 45
67 177 196 hBOiP(7-ll)NB, 5 15 45 67 177 196 hBOiP (7-ll) NB, 5 15 45
95 181 188 95 181 188
[D-Ser1] 10 25 50 [D-Ser 1 ] 10 25 50
hHCNPCl-ll)  hHCNPCl-ll)
169 179 171 産業上の利用可能性 169 179 171 Industrial applicability
本発明によ り、 コ リ ン系神経のアセチルコ リ ン合成能 増大作用を有する、 新規な ヒ ト由来の神経栄養ペプチ ド 及びその誘導体を提供する と と も に、 新規な神経変性疾 患治療剤を提供する こ とが可能となつた。  According to the present invention, there is provided a novel human-derived neurotrophic peptide and an derivative thereof, which have an action of increasing the ability of cholinergic nerves to synthesize acetylcholine, and a novel treatment for a neurodegenerative disease. Agent can be provided.
更には、 ヒ ト由来の神経栄養ペプチ ド及びその前駆体 ポ リ ペプチ ドをコー ドする遺伝子、 該遺伝子を含む組換 え発現ベク ター及びそれを含有する形質転換体も本発明 によ り提供され、 ヒ ト由来の神経栄養ペプチ ドの遺伝子 工学技術による製造も可能となった。 Furthermore, the present invention also provides a gene encoding a human-derived neurotrophic peptide and its precursor polypeptide, a recombinant expression vector containing the gene, and a transformant containing the same. This has made it possible to produce human-derived neurotrophic peptides by genetic engineering.
配 列 Arrangement
配列番号 ： 1 SEQ ID NO: 1
配列の長さ ： 3 3 Array length: 3 3
配列の型 ： 核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数 ： 二本鎖 Number of chains: double strand
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： c D N A t o m R N A Sequence type: c D N A t o m R N A
ハイ ポセテ ィ カル配列 ： N o Hypothetical sequence: No
ア ン チセ ン ス ： N o Antisense: No
起源 Origin
生物名 ： ラ ッ 卜 （Rattus norvegicus)  Organism name: Rat (Rattus norvegicus)
株名 ： W i s t a r  Stock name: W i s t a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
直接の起源 Immediate origin
ク ロー ン名 ： A 〇 1 0 - 1 2  Clone name: A〇1 0-1 2
配列の特徴 Array features
特徵を表す記号 ： C D S  Symbol indicating special features: CDS
存在位置 ： 1 . . 3 3  Location: 1.. 3 3
特徴を決定した方法 ： E 配列  Method used to determine features: E-array
GCCGCCGACA TCAGCCAGTG GGCCGGGCCG CTG 33 配列番号 ： 2  GCCGCCGACA TCAGCCAGTG GGCCGGGCCG CTG 33 SEQ ID NO: 2
配列の長さ ： 1 0 4 7 配列の型 ： 核酸 Array length: 1 0 4 7 Sequence type: nucleic acid
鎖の数 ： 二本鎖 Number of chains: double strand
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： c D N A t o m R N A ハイ ポセティ カ ル配列 ： N o Type of sequence: c DN Atom R NA Hypothetical sequence: No
ア ン チ セ ン ス ： N o Antisense: No
起源 Origin
生物名 ： ラ ッ 卜 (Rattus norvegicus) 株名 ： W i s t a r  Organism name: Rat (Rattus norvegicus) Strain name: Wist a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
直接の起源 Immediate origin
ク ロー ン名 ： A O 1 0 - 1 2 配列の特徴  Clone name: AO10-12 sequence features
特徴を表す記号 ： C D S  Characteristic symbol: CDS
存在位置 ： 1 . . 1 0 4 7  Location: 1.. 1 0 4 7
配列を決定した方法 ： E 特徴を表す記号 ： 5 ' U T R  Method used to determine the sequence: E Characteristic symbol: 5 'UTR
存在位置 ： 1 . . 2 5  Location: 1.. 2 5
配列を決定した方法 ： P 特徴を表す記号 ： p e p t i d e 存在位置 ： 2 6 . . 5 8 6  Method of determining the sequence: P Symbol representing the feature: pe pti d e Location of occurrence: 26.5.886
配列を決定した方法 ： P 特徴を表す記号 ： 3 ' U T R How the sequence was determined: P Characteristic symbol: 3 'UTR
存在位置 ： 5 8 7. . 1 0 4 Location: 5 8 7. 1 0 4
配列を決定した方法 ： P 特徴を表す記号 ： p o ^ y A s i g n a l 存在位置 ： 9 8 7. . 9 9 2 Method of determining the sequence: P Symbol representing the feature: p o ^ y A sig n a l Location: 9 8 7. 9 9 2
配列を決定した方法 ： S 特徴を表す記号 ： p o £ y A s i t e 存在位置 ： 1 0 0 8. . 1 0 4 7 Method of determining the sequence: S Symbol representing the feature: p o £ y Asite Location of occurrence: 100.8.1047
配列を決定した方法 ： S How the sequence was determined: S
ΟΟΪ 06 ηΙ9 J3S nan Ι¾Λ JlU f>\ S Jag 3i j dsy usy Ai9 s usy ] ( WO 331 313 319 13V 399 19V 30V IIV 3V0 3W 330 OVV OIV 3VV 319 ΟΟΪ 06 ηΙ9 J3S nan Ι¾Λ Jl U f> \ S Jag 3i j dsy usy Ai9 s usy] (WO 331 313 319 13V 399 19V 30V IIV 3V0 3W 330 OVV OIV 3VV 319
08 .  08.
Μ nsq and SIH SIH dJi nio 3jy aij(j sAつ oj(j dsy sAq 3JV S 0Jd 262 91D 013 OIL 3V3 0V3 031 9VD OOV Oil WV 333 3V0 QW 90V 30V 333 Μ nsq and SIH SIH dJi nio 3jy aij (j sA oj (j dsy sAq 3JV S 0J d 262 91D 013 OIL 3V3 0V3 031 9VD OOV Oil WV 333 3V0 QW 90V 30V 333
01 09 91 01 09 91
^IV dsv OJd dsv Jill naq nsq m Ui naq s π A13 OJJ dsy na m 139 m 033 3V0 V3V 313 319 913 33V 3VJ, 313 9VV ODO 133 J.V9 113 ^ IV dsv OJd dsv Jill naq nsq m Ui naq s π A13 OJJ dsy na m 139 m 033 3V0 V3V 313 319 913 33V 3VJ, 313 9VV ODO 133 J.V9 113
09  09
A 13 dsy dJ丄 J3S an J9S ^ OJd V usv l¾A "19 J¾ OJd 丄 961 390 1V9 001 VDI ILV 30V 30V V33 VOV IVV D1V 310 9V3 33V 333 93V 01  A 13 dsy dJ 丄 J3S an J9S ^ OJd V usv l¾A "19 J¾ OJd 丄 961 390 1V9 001 VDI ILV 30V 30V V33 VOV IVV D1V 310 9V3 33V 333 93V 01
0 OS  0 OS
n9q i sA] /19 ng dsy m ^io ^ι dsv m SJV n9q i sA] / 19 ng dsy m ^ io ^ ι dsv m SJV
8M 913 010 VW W 913 OVO 3V3 910 93V VIO V09 399 3V1 3V9 010 03V 8M 913 010 VW W 913 OVO 3V3 910 93V VIO V09 399 3V1 3V9 010 03V
02 01  02 01
nsi BIV SIH ui oj<j OJd nio dsv m "19 "Ϊ9 n3l J8S η3Ί 0Jd 3 001 013 039 3V3 OVD 000 ODO OVO IVD 010 OVO OVD V13 V31 913 D33 309 nsi BIV SIH ui oj <j OJd nio dsv m "19" Ϊ9 n3 l J8 S η3 Ί 0J d 3 001 013 039 3V3 OVD 000 ODO OVO IVD 010 OVO OVD V13 V31 913 D33 309
Ϊ  Ϊ
¾iV dJj, uio J9S 911 dsv B]y ¾IV  ¾iV dJj, uio J9S 911 dsv B] y ¾IV
ZS 333 391 0V3 30V 31V 3V0 039 030 OIV 31001 V331013110 1019101033  ZS 333 391 0V3 30V 31V 3V0 039 030 OIV 31001 V331013110 1019101033
891 891
f lO/£6df/JDd 88 S0/fr6 O tN3 f lO / £ 6df / JDd 88 S0 / fr6 O tN3
O o  O o
一 One
Figure imgf000156_0001
Figure imgf000156_0001
C CO CO oo cn  C CO CO oo cn
^ O O n c oo ^ OO nc oo
配列番号 ： 3 SEQ ID NO: 3
配列の長さ ： 1 8 6 Array length: 1 8 6
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ペプチ ド Sequence type: Peptide
起源 Origin
生物名 ： ラ ッ 卜 （Rattus norvegi cus)  Organism name: Rat (Rattus norvegi cus)
株名 ： W i s t a r  Stock name: W i s t a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
配列の特徵 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
存在位置 ： 1 . . 1 8 6  Location: 1.. 1 8 6
配列を決定した方法 ： P  How the sequence was determined: P
配列  Array
Ala Ala Asp lie Ser Gin Trp Ala Gly Pro Leu Ser Leu Gin Glu Val 1 10  Ala Ala Asp lie Ser Gin Trp Ala Gly Pro Leu Ser Leu Gin Glu Val 1 10
Asp Glu Pro Pro Gin His Ala Leu Arg Val Asp Tyr Gly Gly Val Thr  Asp Glu Pro Pro Gin His Ala Leu Arg Val Asp Tyr Gly Gly Val Thr
20 30  20 30
Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gin Val Met Asn Arg  Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gin Val Met Asn Arg
40  40
Pro Ser Ser lie Ser Trp Asp Cly Leu Asp Pro Gly Lys Leu Tyr Thr Pro Ser Ser lie Ser Trp Asp Cly Leu Asp Pro Gly Lys Leu Tyr Thr
50 60 50 60
Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys Phe  Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys Phe
70 80 ^ © 2i 92 ュ B S ! 丛 ： ¾ 70 80 ^ © 2i 92 BS BS! 丛: ¾
(sno 139Λ JOU snn¾a ) '· ¾^ ^  (sno 139Λ JOU snn¾a) '
m  m
4 べ ^ ¾车 N : 514 ^ 乙 03  4 ^ ^ ¾ 车 N: 514 ^ Otsu 03
,Η -^ ^ : m co rn , Η-^ ^ : m co rn
^ m : - ^ α 0ψ ^ m r ^ ourn ^ m : -^ α 0 ψ ^ mr ^ ourn
2 2 ■ ^ o  2 2 ■ ^ o
081 081
sx λιο ¾iv ngq uig dsy SIH nsq sAq OJJ  sx λιο ¾iv ngq uig dsy SIH nsq sAq OJJ
O I  O I
J3S dsv dsy dJi nio ¾IV «103Md s リ丄 {0 ¾IV 0Jd ¾IV Ql J3S dsv dsy dJi nio ¾IV «103Md s Li丄{0 ¾IV 0Jd ¾IV Ql
091 09ΐ091 09ΐ
3 Π31 SIH JXl sxq s 3jy sqd J3S njQ s q aqj sXq
Figure imgf000158_0001
8jy 3 Π31 SIH JXl sxq s 3jy sqd J3S njQ sq aqj sXq
Figure imgf000158_0001
8jy
Οδϊ  Οδϊ
usy dsy Xio J3S sXq usy Jas ng 9ij OJJ nio dsy SXQ usy na OJJ  usy dsy Xio J3S sXq usy Jas ng 9ij OJJ nio dsy SXQ usy na OJJ
021  021
uiO "19 "ΐθ "ΐθ J Η3Ί dJi m J i 3JV S!H na Xio dsy 3 uiO "19" ΐθ "ΐθ J Η 3Ί dJi m J i 3JV S! H na Xio dsy 3
0Π 001  0Π 001
s i o ojd xi jas io m J nio nsi  s i o ojd xi jas io m J nio nsi
06  06
311 dsv usy 3 sAi }3W usy〗ΒΛ nsq 9i^ S!H S!H nio Sjy  311 dsv usy 3 sAi} 3W usy〗 ΒΛ nsq 9i ^ S! H S! H nio Sjy
991 991
flZlO/€6df/JDd 88.S0/^6 O 特徴を表す記号 ： p e p t i d e flZlO / € 6df / JDd 88.S0 / ^ 6 O Characteristic symbol: peptide
存在位置 ： 1 . . 3 8  Location: 1.. 3 8
配列を決定した方法 ： E  How the sequence was determined: E
配列  Array
Ala Ala Asp He Ser Gin Trp Ala Gly Pro Leu Ser Leu Gin Glu VaiAla Ala Asp He Ser Gin Trp Ala Gly Pro Leu Ser Leu Gin Glu Vai
1 10 1 10
Asp Glu Pro Pro Gin His Ala Leu Arg Val Asp Tyr Gly Gly Val Thr  Asp Glu Pro Pro Gin His Ala Leu Arg Val Asp Tyr Gly Gly Val Thr
20 30  20 30
Val Asp Glu Leu Gly Lys 配列番号 ： 5  Val Asp Glu Leu Gly Lys SEQ ID NO: 5
配列の長さ ： 2 3 Array length: 2 3
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
フ ラ グ メ ン ト型 ： 中間部フ ラ グ メ ン ト Fragment type: Intermediate part Fragment
起源 Origin
生物名 ： ラ ッ 卜 （Rattus norvegi cus)  Organism name: Rat (Rattus norvegi cus)
株名 ： W i s t a r  Stock name: W i s t a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
存在位置 ： 1 . . 2 3  Location: 1.. 2 3
配列を決定した方法 ： E 配列 How the sequence was determined: E Array
Val Leu Thr Pro Thr Gin Val Met Asn Arg Pro Ser Ser He Ser TrpVal Leu Thr Pro Thr Gin Val Met Asn Arg Pro Ser Ser He Ser Trp
1 10 1 10
Asp Gly Leu Asp Pro Gly Lys Asp Gly Leu Asp Pro Gly Lys
20 配列番号 ： 6  20 SEQ ID NO: 6
配列の長さ ： 1 5 Array length: 1 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポ ロ ジ ー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
フ ラ グ メ ン ト 型 ： 中間部フ ラ グ メ ン ト Fragment type: middle part
起源 Origin
生物名 ： ラ ッ 卜 （Rattus norvegicus)  Organism name: Rat (Rattus norvegicus)
株名 ： W i s t a r  Stock name: W i s t a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
配列の特徵 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
存在位置 ： 1 . . 1 5  Location: 1... 15
配列を決定した方法 ： E  How the sequence was determined: E
配列  Array
Leu Tyr Thr Leu Val  Leu Tyr Thr Leu Val
1 10 配列番号 ： 7 1 10 SEQ ID NO: 7
配列の長さ ： 1 3  Array length: 1 3
配列の型 ： ア ミ ノ 酸  Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド  Sequence type: peptide
フ ラ グメ ン ト型 ： 中間部フ ラ グメ ン ト  Fragment type: middle part
起源  Origin
生物名 ： ラ ッ 卜 （ Rattus norvegi cus)  Organism name: Rat (Rattus norvegicus)
株名 ： W i s t a r  Stock name: W i s t a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
配列の特徴  Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
存在位置 ： 1 . . 1 3  Location: 1... 1 3
配列を決定した方法 ： E  How the sequence was determined: E
配列  Array
Phe Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys 1 10 配列番号 ： 8  Phe Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys 1 10 SEQ ID NO: 8
配列の長さ ： 2 0  Array length: 20
配列の型 ： ア ミ ノ 酸  Sequence type: amino acid
ト ポロ ジ一 ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド  Sequence type: peptide
フ ラ グメ ン ト型 ： 中間部フ ラ グメ ン ト 起源 Fragment type: middle part origin
生物名 ： ラ ッ 卜 （Rattus norveg i cus)  Organism name: Rat (Rattus norveg icus)
株名 ： W i s t a r  Stock name: W i s t a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
存在位置 ： 1 . . 2 0  Location: 1.. 20
配列を決定した方法 ： E  How the sequence was determined: E
配列  Array
Cly Asn Asp lie Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Clu Tyr Val Gly SerCly Asn Asp lie Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Clu Tyr Val Gly Ser
1 10 1 10
Giy Pro Pro Lys Giy Pro Pro Lys
20 配列番号 ： 9  20 SEQ ID NO: 9
配列の長さ ： 2 8 Array length: 2 8
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポ ロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
フ ラ グ メ ン ト 型 ： 中間部フ ラ グ メ ン ト Fragment type: middle part
起源 Origin
生物名 ： ラ ッ ト （Rattus norveg i cus)  Organism name: Rat (Rattus norveg icus)
株名 ： W i s t a r  Stock name: W i s t a r
組織の種類 ： 脳海馬組織 配列の特徴 Tissue type: Brain hippocampus tissue Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
存在位置 ： 1 . . 2 8  Location: 1.. 2 8
配列を決定した方法 ： E  How the sequence was determined: E
配列 Array
Asp Thr.Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gin Glu GinAsp Thr.Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gin Glu Gin
1 10 1 10
Pro Leu Asn Cys Asp Glu Pro tie Leu Ser Asn Lys  Pro Leu Asn Cys Asp Glu Pro tie Leu Ser Asn Lys
20 配列番号 ： 1 0  20 SEQ ID NO: 10
配列の長さ ： 6 Array length: 6
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
フ ラ グ メ ン ト 型 ： 中間部フ ラ グ メ ン ト Fragment type: middle part
起源 Origin
生物名 ： ラ ッ. ト (Rattus norveg i cus)  Organism Name: Rat (Rattus norveg icus)
株名 ： W i s t a r  Stock name: W i s t a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
存在位置 ： 1 . . 6  Location: 1.. 6
配列を決定した方法 ： E 配列 How the sequence was determined: E Array
Val Glu Ser Phe Arg Lys  Val Glu Ser Phe Arg Lys
1 5 配列番号 ： 1 1  1 5 SEQ ID NO: 1 1
配列の長さ ： 2 2 Array length: 2 2
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
フ ラ グ メ ン ト 型 ： 中間部フ ラ グ メ ン ト Fragment type: middle part
起源 Origin
生物名 ： ラ ッ 卜 （Rattus norveg i cus)  Organism name: Rat (Rattus norveg icus)
株名 ： " W i s t a r  Stock name: "Wist a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
配列の特徵 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
存在位置 ： 1 . . 2 2  Location: 1.. 2 2
配列を決定した方法 ： E  How the sequence was determined: E
配列 Array
Tyr His Leu Gly Ala Pro Vai Ala Gly Thr Cys Phe Gin Ala Glu TrpTyr His Leu Gly Ala Pro Vai Ala Gly Thr Cys Phe Gin Ala Glu Trp
1 ' 10 1 '10
Asp Asp Ser Val Pro Lys  Asp Asp Ser Val Pro Lys
20 配列番号 ： 1 2 20 SEQ ID NO: 1 2
配列の長さ ： 8 Array length: 8
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
フ ラ グ メ ン ト 型 ： C末端フ ラ グ メ ン ト 起源 Fragment type: C-terminal fragment origin
生物名 ： ラ ッ ト (Rattus norveg i cus) 株名 ： W i s t a r  Organism name: Rat (Rattus norveg icus) Strain name: Wistar
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e 存在位置 ： 1 . . 8  Symbol indicating characteristics: pe pti d e Location: 1..
配列を決定した方法 ： E  How the sequence was determined: E
配列 Array
Leu His Asp Gin Leu Ala Gl y Ly s  Leu His Asp Gin Leu Ala Gl y Ly s
1 5 配列番号 ： 1 3  1 5 SEQ ID NO: 1 3
配列の長さ ： 1 4 4 7 Array length: 1 4 4 7
配列の型 ： 核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数 ： 二本鎖 Number of chains: double strand
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： c D N A t 0 m R N A ハイ ポセティ カ ル配列 N 0 ア ン チセ ン ス ： N o Sequence type: cDNA t0 mRNA RNA hypothetical sequence N0 Antisense: No
起源 Origin
生物名 ： ヒ 卜 （Homo sa iens)  Organism name: Human (Homo sa iens)
組織の種類 ·. 胎盤組織  Tissue type · Placental tissue
直接の起源 Immediate origin
ク ロー ン名 ： p i — 3  Clone name: p i — 3
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： C D S  Characteristic symbol: CDS
存在位置 ： 1 . . 1 4 4 7  Location: 1... 1 4 4 7
配列を決定した方法 ： E 特徴を表す記号 ： 5 ' U T R  Method used to determine the sequence: E Characteristic symbol: 5 'UTR
存在位置 ： 1 . . 1 1 9  Location: 1... 1 1 9
配列を決定した方法 ： P 特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Method used to determine the sequence: P Symbol representing the feature: p e p t i d e
存在位置 ： 1 2 0. . 6 8 0  Location: 1 2 0.. 6 8 0
配列を決定した方法 ： P 特徴を表す記号 ： 3 ' U T R  How the sequence was determined: P Symbol representing the feature: 3 'UTR
存在位置 ： 6 8 1 . . 1 4 4 7  Location: 6 8 1.. 1 4 4 7
配列を決定した方法 ： P  How the sequence was determined: P
配列 Array
GAATTCGGGG GGGGGTCTGC GTCTTCCCGA CCCAGTGTGC TGAGCTCTCC GCGTCGCCTC 60 TGTCGCCCGC CCCTGGCCTA CCGCGGCACT CCCGCCTGCA CGCTCTGCTT GGCCTCGCC 119 9 GAATTCGGGG GGGGGTCTGC GTCTTCCCGA CCCAGTGTGC TGAGCTCTCC GCGTCGCCTC 60 TGTCGCCCGC CCCTGGCCTA CCGCGGCACT CCCGCCTGCA CGCTCTGCTT GGCCTCGCC 119 9
OH οει  OH οει
dsv ΑΙ9 J3S 3JV usy η9Ί al l OJJ n]g ds SAQ sXq naq oJd 3jy 159 0V9 VOO 131 V33 OVV 30V 313 31V 330 OVO 3V9 101 OVV V13 333 99V dsv ΑΙ9 J3S 3JV usy η9 Ί al l OJJ n] g ds SAQ sXq naq oJd 3jy 159 0V9 VOO 131 V33 OVV 30V 313 31V 330 OVO 3V9 101 OVV V13 333 99V
OZI  OZI
dsv uio nio J 丄 Ι ¾Λ ngq dJ丄 J 3jy S !H naq JQ J¾ s £09 3V9 OVO OVO OVl 119 013 901 319 IVl 393 3V3 313 ODD VOV 399 9W 02  dsv uio nio J 丄 Ι ng ngq dJ 丄 J 3jy S! H naq JQ J¾ s £ 09 3V9 OVO OVO OVl 119 013 901 319 IVl 393 3V3 313 ODD VOV 399 9W 02
Oil 001 Oil 001
0J<J OJd <iI9 s λιο i JAl dsy J8S naq 〗 J i λιο JSS J3S 9ΪΙ SSi' 3D3 103 009 931 300 010 IVl IV9 001 013 310 V3V 300 J^OV 30V 3IV  0J <J OJd <iI9 s λιο i JAl dsy J8S naq〗 J i λιο JSS J3S 9ΪΙ SSi '3D3 103 009 931 300 010 IVl IV9 001 013 310 V3V 300 J ^ OV 30V 3IV
06  06
dsv usy ^ID s i9}i| usy d S IH S IH dJi nto 3jy JAi  dsv usy ^ ID s i9} i | usy d S IH S IH dJi nto 3jy JAi
9 ΐ 丄 0 3V3 1W 300 9W 91V OVV 010 010 013 OIL 1V3 1V3 001 VV9 V9V OVl  9 ΐ 丄 0 3V3 1W 300 9W 91V OVV 010 010 013 OIL 1V3 1V3 001 VV9 V9V OVl
08 OA  08 OA
sAq OJJ dsy sA 8J\f Jas ¾IV dsv OJ^ dsy J¾ naq naq J¾ sAq OJJ dsy sA 8J \ f Jas ¾IV dsv OJ ^ dsy J¾ naq naq J¾
692 WV 033 IVO 9W OOV 3DV 303 133 IVO 933 OVO VOV 313 019 OU OOV 692 WV 033 IVO 9W OOV 3DV 303 133 IVO 933 OVO VOV 313 019 OU OOV
09 09  09 09
' J J, na s J9S dsy ns dsy dJj, s m jas Jq丄 OJJ 3jy 0 1  'J J, na s J9S dsy ns dsy dJj, s m jas Jq 丄 OJJ 3jy 0 1
IIS . OVl 313 9W 309 VOL 1V9 JI3 103 1V9 991 931 LLV 33V 33V 333 VOV IIS .OVl 313 9W 309 VOL 1V9 JI3 103 1V9 991 931 LLV 33V 33V 333 VOV
0  0
usv sxq Ι¾Λ uio J¾ ojj m naq Λ sAq 19 naq ni9 dsy l¾ ¾IV S9Z IVV OVV 110 0V3 33V 333 OOV 013 910 VVV 3D3 010 9V0 0V9 319 330  usv sxq Ι¾Λ uio J¾ ojj m naq Λ sAq 19 naq ni9 dsy l¾ ¾IV S9Z IVV OVV 110 0V3 33V 333 OOV 013 910 VVV 3D3 010 9V0 0V9 319 330
OS OZ  OS OZ
¾IV XlO ¾IV J J¾ Λ SIH SIH U IQ 0 nio dsy 八 ¾IV XlO ¾IV J J¾ Λ SIH SIH U IQ 0 nio dsy
512 009 D09 OOD OVl -OOV 319 丄 V3 910 033 0V3 OVO 030 0V3 OVO OVO 919 512 009 D09 OOD OVl -OOV 319 丄 V3 910 033 0V3 OVO 030 0V3 OVO OVO 919
01 I  01 I
ni uio naq J9S na OJ^ X]Q -ias 丄 sXq jas naq dsy 0Jd ?3W i9I W9 WO 013 30V Oil OOD 000 D31 001 OVV 30V 313 0V9 010 933 91V ni uio naq J9S na OJ ^ X] Q-ias 丄 sXq jas naq dsy 0J d? 3 W i9I W9 WO 013 30V Oil OOD 000 D31 001 OVV 30V 313 0V9 010 933 91V
99 1 99 1
PlZlO/£6dC/lDd 88Z.S0/f6 OM CAC CGT GGC AAA TTC AAG GTG GCG TCC TTC CGT AAA MG TAT GAG CTC PlZlO / £ 6dC / lDd 88Z.S0 / f6 OM CAC CGT GGC AAA TTC AAG GTG GCG TCC TTC CGT AAA MG TAT GAG CTC
His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr Glu Leu  His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr Glu Leu
150 160  150 160
ACG GCC CCG GTC GCT GGC ACC TGT TAC CAG GCC GAG TGG GAT GAC TAT 647 ACG GCC CCG GTC GCT GGC ACC TGT TAC CAG GCC GAG TGG GAT GAC TAT 647
Arg Ala Pro Val Ala Cly Thr Cys Tyr Gin Ala Clu Trp Asp Asp Tyr Arg Ala Pro Val Ala Cly Thr Cys Tyr Gin Ala Clu Trp Asp Asp Tyr
170  170
GTG CCC AAA CTG TAC GAG CAG CTG TCT GGG AAG TAGGGCCTT AGCTTCGGGA 699 Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gin Leu Ser Gly Lys  GTG CCC AAA CTG TAC GAG CAG CTG TCT GGG AAG TAGGGCCTT AGCTTCGGGA 699 Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gin Leu Ser Gly Lys
180  180
CCTCAACTGT CCTGGAGGCC CCAAGCCATG HCCCCAGn CAGTGHGCA TGTATAATAG 759 CCTCAACTGT CCTGGAGGCC CCAAGCCATG HCCCCAGn CAGTGHGCA TGTATAATAG 759
ATTTCTCCTC HCCTGCCCC CCTTGGCATG GGTGAGACCT GACCACTCAG ATGGTAGTTG 819ATTTCTCCTC HCCTGCCCC CCTTGGCATG GGTGAGACCT GACCACTCAG ATGGTAGTTG 819
AGGGTGACIT HCCTGCTGC CTGCCCTTTA TAATTITACT CACTCACTCT GATHATGH 879AGGGTGACIT HCCTGCTGC CTGCCCTTTA TAATTITACT CACTCACTCT GATHATGH 879
HGATCAAAT HGAACHCA TTTTGGGGGG TATnTGGTA CTGTGATGGG GTCATCAAAT 939HGATCAAAT HGAACHCA TTTTGGGGGG TATnTGGTA CTGTGATGGG GTCATCAAAT 939
TAHAATCTG AAAATAGCAA CCCAGAATGT AAAAAAGAAA AAACTGGGGG GAAAAAGACC 999TAHAATCTG AAAATAGCAA CCCAGAATGT AAAAAAGAAA AAACTGGGGG GAAAAAGACC 999
AGGTCTACAG TGATAGAGCA AAGCATCAAA GMTCTTTAA GGGAGGTTTA AAAAAAAAAA 1059AGGTCTACAG TGATAGAGCA AAGCATCAAA GMTCTTTAA GGGAGGTTTA AAAAAAAAAA 1059
AAAAAAAAAA GAnCGTTGC CTCTGCCriT CTGATCCTGA GTCCAGAATG GTACACAATG 1119AAAAAAAAAA GAnCGTTGC CTCTGCCriT CTGATCCTGA GTCCAGAATG GTACACAATG 1119
TGATTTTATG GTGATGTCAC TCACCTAGAC AACCAGAGGC TGGCAHGAG GCTAACCTCC 1179TGATTTTATG GTGATGTCAC TCACCTAGAC AACCAGAGGC TGGCAHGAG GCTAACCTCC 1179
AACACAGTGC ATCTCAGATG CCTCAGTAGG CATCAGTATG TCACTCTGCT CCCHTAAAC 1239AACACAGTGC ATCTCAGATG CCTCAGTAGG CATCAGTATG TCACTCTGCT CCCHTAAAC 1239
AGCAATCCTG GAAGAAGCAG GAGGGAGGCT GGCTTTGCTC而腦 C ATGGCAATCT 1299AGCAATCCTG GAAGAAGCAG GAGGGAGGCT GGCTTTGCTC Physiological C ATGGCAATCT 1299
AGACCGGTAS CAGCGCCTCG CTCACAGCH GGGAGGAAAC CTGAGATCTG TCTTTTTTAA 1359 ATTGATCGH CTOTGGGG GTAAGAAAAG CTGGTCTGGA GnCCTGAAT GTOCATOA 1419 GTGCTGTT TGCHGTACT TGAATCCC 1447 AGACCGGTAS CAGCGCCTCG CTCACAGCH GGGAGGAAAC CTGAGATCTG TCTTTTTTAA 1359 ATTGATCGH CTOTGGGG GTAAGAAAAG CTGGTCTGGA GnCCTGAAT GTOCATOA 1419 GTGCTGTT TGCHGTACT TGAATCCC 1447
配列番号 ： 1 4 SEQ ID NO: 1 4
配列の長さ ： 1 8 6 Array length: 1 8 6
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 ト ポロ ジー ： 直鎖状 Sequence type: amino acid Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト (Homo sapiens) 組織の種類 ： 胎盤組織  Organism name: Human (Homo sapiens) Tissue type: Placental tissue
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e 存在位置 ： 1 . . 1 8 6  Symbol indicating the feature: pe pti d e Location: 1.. 18 6
配列を決定した方法 ： P How the sequence was determined: P
081 081
sxq XIO J3S ngq J naq s q OJJ  sxq XIO J3S ngq J naq s q OJJ
1ΒΛ JAl dsy dsy dJi nyo BIV "10 sXo J¾ XIO BIV o d ¾IV 1ΒΛ JAl dsy dsy dJi nyo BIV "10 sXo J¾ XIO BIV o d ¾IV
091 091  091 091
3JV na ni9 J I sAq sAq 3JV aqd aas ¾IV Ι¾Λ 3 d sAq 13 3jy 3JV na ni9 JI sAq sAq 3JV aqd aas ¾IV Ι¾Λ 3 d sAq 13 3jy
OH οει  OH οει
s?H dsy Xio J8S 3jy usy J&s nsq 9] ] OJJ nyg dsy sXo sAq naq OJJ  s? H dsy Xio J8S 3jy usy J & s nsq 9]] OJJ nyg dsy sXo sAq naq OJJ
021  021
3JV dsv nio J v S!H ^i AIO S I  3JV dsv nio J v S! H ^ i AIO S I
Oil 001  Oil 001
sXi OJd OJd io J3S io m J dsy J3S naq m J¾ J3S Jas  sXi OJd OJd io J3S io m J dsy J3S naq m J¾ J3S Jas
06  06
91】 dsv usy ^19 つ 18W usv S!H 丄 3jy 91】 dsv usy ^ 19 one 18 W usv S ! H 丄 3jy
08 01  08 01
O t O t
JXl sAq OJJ dsy sx 3J J8S。· ¾1V dsv OJJ dsv J¾ naq〗BA na JXl sAq OJJ dsy sx 3J J8S. · ¾1V dsv OJJ dsv J¾ naq〗 BA na
09 OS '  09 OS ''
J¾ JXl naq sAq XjQ J9S dsy na-] A] dsy dJ丄 J9S m m OJd  J¾ JXl naq sAq XjQ J9S dsy na-] A] dsy dJ 丄 J9S m m OJd
8JV usv SAH Ι¾Λ «10 JM1 oJd J 1 "91 s AI3 na nio dsv 1¾Λ 8JV usv SAH Ι¾Λ «10 J M1 o J d J 1" 91 s AI3 na nio dsv 1¾Λ
OS . 02 s OS. 02 s
¾IV BIV ^iO BIV J J¾ Ι^Λ SIH na 。 SIH U\ OJJ UIQ nio dsy ¾IV BIV ^ iO BIV J J¾ Ι ^ Λ SIH na. SIH U \ OJJ UIQ nio dsy
0Ϊ ' Ϊ  0Ϊ 'Ϊ
Ι¾Λ "10 "10 nai Jas naq OJd Jas dJi sA J9S n^] dsy Ι¾Λ oJd Ι¾Λ "10" 10 nai J as naq OJd Jas dJi sA J9S n ^] dsy Ι¾Λ o J d
89 1 89 1
frlZlO/£6df/J3d O 配列番号 ： 1 5 frlZlO / £ 6df / J3d O SEQ ID NO: 1 5
配列の長さ ： 1 i ' Array length: 1 i '
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
起源 Origin
生物名 ： ヒ ト （Homo sapiens)  Organism name: Human (Homo sapiens)
組織の種類 ： 胎盤組織  Tissue type: Placental tissue
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
存在位置 ： 1 . . 1 1  Location: 1... 1 1
配列を決定した方法 ： P  How the sequence was determined: P
配列 Array
Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu 1 10 配列番号 ： 1 6  Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu 1 10 SEQ ID NO: 1 6
配列の長さ ： 3 3 Array length: 3 3
配列の型 ： 核酸 Sequence type: nucleic acid
鎖の数 ： 二本鎖 Number of chains: double strand
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： c D N A t o m R N A Sequence type: c D N A t o m R N A
ノヽイ ボセティ カル配列 N o Noisy Bossical Array No
ア ンチセ ンス ： N o 起源 Antisense: No origin
生物名 ： ヒ ト （Homo sapiens)  Organism name: Human (Homo sapiens)
組織の種類 ： 胎盤組織  Tissue type: Placental tissue
直接の起源 Immediate origin
ク ロー ン名 ： p i — 3  Clone name: p i — 3
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： C D S  Characteristic symbol: CDS
存在位置 ： 1 . . 3 3  Location: 1.. 3 3
配列を決定した方法 ： E  How the sequence was determined: E
配列 Array
CCGGTGGACC TCAGCAAGTG GTCCGGGCCC TTG 33 配列番号 ： 1 7  CCGGTGGACC TCAGCAAGTG GTCCGGGCCC TTG 33 SEQ ID NO: 17
配列の長さ ： 1 1 Array length: 1 1
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
起源 Origin
生物名 ： ラ ッ 卜 （Rattus norvegi eus)  Organism name: Rat (Rattus norvegi eus)
株名 ： W i s t a r  Stock name: W i s t a r
組織の種類 ： 脳海馬組織  Tissue type: Brain hippocampus tissue
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： p e p t i d e  Characteristic symbol: p e p t i d e
配列を決定した方法 ： E 配列 How the sequence was determined: E Array
Ala Ala ASP He Ser Gin Trn Ala Gly Pro leu  Ala Ala ASP He Ser Gin Trn Ala Gly Pro leu
10 配列番号 ： 1 8  10 SEQ ID NO: 1 8
配列の長さ ： 6 Array length: 6
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列 Array
Val Asp Leu Ser し ys Tr p  Val Asp Leu Ser ys Tr p
1 5 配列番号 . · 1 9  1 5 SEQ ID No.
配列の長さ ： 6 Array length: 6
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列 Array
Lys Trp Ser Gly Pro Leu Lys Trp Ser Gly Pro Leu
1 5 配列番号 ： 2 0  1 5 SEQ ID NO: 20
配列の長さ ： 6 Array length: 6
配列の型 ： ア ミ ノ ^ トポロ ジー ： 直鎖状 Array type: Amino ^ Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列の特徴 Array features
特徵を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 3  Symbol indicating special feature: modified site Location: 3
他の情報 ： D— S e r  Other information: D—S e r
配列 Array
Lys Trp Xaa Gl y Pro Leu  Lys Trp Xaa Gly Pro Leu
1 5 配列番号 ： 2 1  1 5 SEQ ID NO: 2 1
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列の特徴 Array features
特徵を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 1  Symbol indicating special feature: modified site Location: 1
他の情報 ： M e L e u 特徴を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 5  Other information: M e Leu Symbol for characteristic: modified site Location: 5
他の情報 ： D - S e r 配列 Other information: D-Ser Array
Xaa Ser Ly s Tr p Xaa  Xaa Ser Ly s Tr p Xaa
1 5 配列番号 ： 2 2  1 5 SEQ ID NO: 2 2
配列の長さ ： 1 1 Array length: 1 1
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： modified site  Characteristic symbol: modified site
存在位置 ： 8  Location: 8
他の情報 ： D— S e r  Other information: D—S e r
配列 Array
Pro Val Asp Leu Ser し ys Tr p Xaa Gl Pro Leu 1 5 10 配列番号 ： 2 3  Pro Val Asp Leu Ser ys Tr p Xaa Gl Pro Leu 1 5 10 SEQ ID NO: 2 3
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
トポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： modified site  Characteristic symbol: modified site
存在位置 ： 1 他の情報 ： M e L e u 特徴を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 5 Location: 1 Other information: MeLeu characteristic symbol: modified site Location: 5
他の情報 ： Ser-NH(CH2)2NH2 配列 Other information: Ser-NH (CH 2 ) 2 NH 2 sequence
Xaa Ser Ly s Trp Xaa  Xaa Ser Ly s Trp Xaa
1 5 配列番号 ： 2 4  1 5 SEQ ID NO: 2 4
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列の特徴 Array features
特徵を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 1  Symbol indicating special feature: modified site Location: 1
他の情報 ： M e L e u 特徴を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 5  Other information: M e Leu Symbol for characteristic: modified site Location: 5
他の情報 ： Ser- NH(CH2)3NH2 配列 Other information: Ser-NH (CH 2 ) 3 NH 2 sequence
Xaa Ser Lys Trp Xaa  Xaa Ser Lys Trp Xaa
1 5 配列番号 ： 2 5 1 5 SEQ ID NO: 25
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ペプチ ド Sequence type: Peptide
配列の特徴 Array features
特徵を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 1  Symbol indicating special feature: modified site Location: 1
他の情報 ： M e L e u 特徴を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 5  Other information: M e Leu Symbol for characteristic: modified site Location: 5
他の情報 ： Ser- NH(CH2)4NH2 配列 Other information: Ser-NH (CH 2 ) 4 NH 2 sequence
Xaa Ser Ly s Trp Xaa  Xaa Ser Ly s Trp Xaa
1 5 配列番号 ： 2 6  1 5 SEQ ID NO: 2 6
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 1 他の情報 ： M e L e u 特徴を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 5 Symbol indicating characteristics: modified site Location: 1 Other information: MeLeu characteristic symbol: modified site Location: 5
他の情報 ： Ser-NH(CH2)8NH2 配列 Other information: Ser-NH (CH 2 ) 8 NH 2 sequence
Xaa Ser し ys Tr p Xaa  Xaa Ser then ys Tr p Xaa
1 5 配列番号 ： 2 7  1 5 SEQ ID NO: 2 7
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ペプチ ド Sequence type: Peptide
配列 Array
Trp Ser Gly Pro Leu  Trp Ser Gly Pro Leu
1 5 配列番号 ： 2 8  1 5 SEQ ID NO: 2 8
配列の長さ ： 4 Array length: 4
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド 配列 Sequence type: peptide Array
Ser Gly Pro Leu  Ser Gly Pro Leu
1 配列番号 ： 2 9  1 SEQ ID NO: 2 9
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 2  Symbol indicating characteristics: modified site Location: 2
他の情報 ： D - S e r  Other information: D-Ser
配列 Array
Trp Xaa Gly Pro Leu Trp Xaa Gly Pro Leu
1 5 配列番号 ： 3 0  1 5 SEQ ID NO: 30
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ペプチ ド Sequence type: Peptide
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 1 他の情報 ： A c — T r p Symbol indicating characteristics: modified site Location: 1 Other information: A c — T rp
配列 Array
Xaa Ser G 1 y Pro Leu  Xaa Ser G 1 y Pro Leu
1 5 配列番号 ： 3 1  1 5 SEQ ID NO: 3 1
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ペプチ ド Sequence type: Peptide
配列の特徴 Array features
特徴を表す記号 ： modified site 存在位置 ： 5  Symbol indicating characteristics: modified site Location: 5
他の情報 ： L e u — N H 2 配列 Other information: L eu — NH 2 sequence
Trp Ser Gly Pro Xaa  Trp Ser Gly Pro Xaa
1 5 配列番号 ： 3 2  1 5 SEQ ID NO: 3 2
配列の長さ ： 5 Array length: 5
配列の型 ： ア ミ ノ 酸 Sequence type: amino acid
ト ポロ ジー ： 直鎖状  Topology: linear
配列の種類 ： ぺプチ ド Sequence type: peptide
9 ϊ9 ϊ
Figure imgf000181_0001
Figure imgf000181_0001
6 I 6 I
flZlO/£6df/JDd 88ム SO 6 OM flZlO / £ 6df / JDd 88m SO 6 OM

Claims

請求の範囲  The scope of the claims
1 . 下記のア ミ ノ酸配列 （配列番号 ： 1 7 ) で表され る神経栄養べプチ ドをコ一 ドする遺伝子。 1. A gene encoding a neurotrophic peptide represented by the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 17).
Ala Ala Asp lie Ser Gin Trp Ala Gly Pro Leu  Ala Ala Asp lie Ser Gin Trp Ala Gly Pro Leu
2 . 下記のア ミ ノ 酸配列 （配列番号 ： 1 5 ) で表され る神経栄養べプチ ドをコ一 ドする遺伝子。  2. A gene encoding a neurotrophic peptide represented by the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 15).
Pro Val ASP Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu  Pro Val ASP Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu
3 . 下記のア ミ ノ酸配列 （配列番号 ： 3 ) で表される ポ リ ペプチ ドをコー ドする遺伝子。  3. A gene encoding a polypeptide represented by the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 3).
( et)Ala Ala Asp lie Ser Gin Trp Ala Gly Pro Leu Ser Leu Gin Glu Val Asp Glu Pro Pro Gin His Aia Leu Arg Val Asp Tyr Gly Gly Val Thr Vaい Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gin Val Met Asn Arg Pro Ser Ser lie Ser Trp Asp Gly Leu Asp Pro Gly Lys Leu Tyr Thr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys Phe Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys Gly Asn Asp lie Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Glu Tyr Val Gly Ser Gly Pro Pro Lys Asp Thr Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gin Glu Gin Pro Leu Asn Cys Asp X Pro lie Leu Ser Asn Lys Ser Gly Asp Asn Arg Gly Lys Phe Lys Val Glu Ser Phe Arg Lys Lys Tyr His Leu Gly Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Phe Gin Ala Glu Trp Asp Asp Ser Val Pro Lys Leu His Asp Gin Leu Ala Gly Lys (但し、 Xは Glu またはし ys を表す） (et) Ala Ala Asp lie Ser Gin Trp Ala Gly Pro Leu Ser Leu Gin Glu Val Asp Glu Pro Pro Gin His Aia Leu Arg Val Asp Tyr Gly Gly Val Thr Va I Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gin Val Met Asn Arg Pro Ser Ser lie Ser Trp Asp Gly Lys Leu Asp Pro Gly Lys Leu Tyr Thr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys Phe Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys Gly Asn Asp lie Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Glu Tyr Val Gly Ser Gly Pro Pro Lys Asp Thr Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gin Glu Gin Pro Leu Asn Cys Asp X Pro lie Leu Ser Asn Lys Ser Gly Asp Asn Arg Gly Lys Phe Lys Val Glu Ser Phe Arg Lys Lys Tyr His Leu Gly Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Phe Gin Ala Glu Trp Asp Asp Ser Val Pro Lys Leu His Asp Gin Leu Ala Gly Lys (where X is Glu or ys) Represent)
4 . 下記のア ミ ノ 酸配列 （配列番号 ： 1 4 ) で表され るボ リ べプチ ドをコ一 ドする遺伝子。 4. A gene encoding a polypeptide represented by the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 14).
( et)Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu Ser Leu Gin Glu Val Asp Glu Gin Pro Gin His Pro Leu His Val Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gin Val Lys Asn Arg Pro Thr Ser He Ser Trp Asp Gly Leu Asp Ser Gly Lys Leu Tyr(et) Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu Ser Leu Gin Glu Val Asp Glu Gin Pro Gin His Pro Leu His Val Thr Tyr Ala Gly Ala Ala Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gin Val Lys Asn Arg Pro Thr Ser He Ser Trp Asp Gly Leu Asp Ser Gly Lys Leu Tyr
Thr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro LysThr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys
Tyr Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys Gly Asn AspTyr Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys Gly Asn Asp
He Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Asp Tyr Val Gly Ser Gly Pro ProHe Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Asp Tyr Val Gly Ser Gly Pro Pro
Lys Gly Thr Gly Leu Hi s Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gin AspLys Gly Thr Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gin Asp
Arg Pro Leu Lys Cys Asp Glu Pro lie Leu Ser Asn Arg Ser Gly AspArg Pro Leu Lys Cys Asp Glu Pro lie Leu Ser Asn Arg Ser Gly Asp
His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr Glu LeuHis Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr Glu Leu
Arg Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Tyr Gin Ala Glu Trp Asp Asp Tyr Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gin Leu Ser Glv Lvs Arg Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Tyr Gin Ala Glu Trp Asp Asp Tyr Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gin Leu Ser Glv Lvs
5 . 請求項 2 記載のア ミ ノ酸配列 （配列番号 ： 1 5 ) を有する神経栄養べプチ ドまたは該ァ ミ ノ 酸配列の一部 からな り、 少な く と も配列— L y s — T r p —を含む神 経栄養作用を有する神経栄養べプチ ド誘導体。 5. A neurotrophic peptide having the amino acid sequence according to claim 2 (SEQ ID NO: 15) or a part of the amino acid sequence, and at least the sequence-Lys—T Neurotrophic peptide derivatives with neurotrophic effects, including rp.
6 . 請求項 5 記載の神経栄養ペプチ ドまたは神経栄養 ぺプチ ド誘導体の N末端および /または C末端を修飾し た神経栄養作用を有する神経栄養べプチ ド誘導体。  6. A neurotrophic peptide derivative having a neurotrophic action, wherein the N-terminal and / or C-terminal of the neurotrophic peptide or neurotrophic peptide derivative according to claim 5 is modified.
7 . 請求項 3 記載のア ミ ノ 酸配列 （配列番号 ： 3 ) で 表される神経栄養べプチ ドの前駆体ポ リ べプチ ド。  7. Polypeptide, a precursor of a neurotrophic peptide represented by the amino acid sequence according to claim 3 (SEQ ID NO: 3).
8 . 請求項 4 記載のア ミ ノ 酸配列 （配列番号 ： 1 4 ) で表される神経栄養べプチ ドの前駆体ポ リ べプチ ド。 8. The amino acid sequence according to claim 4 (SEQ ID NO: 14) Is a precursor of the neurotrophic peptide represented by
9 . 一般式 （ m )  9. General formula (m)
X - Z 1 - L y s - T r p - Z 2 - Y ( I )X-Z 1- Lys-T rp-Z 2 -Y (I)
〔式中、 Z 1 は P r o — V a ^ — A s p - L e u — S e r、 V a 1 — A s p — L e u — S e r、 A s p — L e u — S e r、 L e u — S e r、 S e r または単結合を表わ し、 Z 2 は S e r — G ^ y — P r o — L e u、 S e r — G £ y — P r o、 S e r - G ^ y、 S e r または単結合 を表わ し、 Xは水素原子または N末端修飾基を表わ し、 Yは水酸基または C末端修飾基を表わす〕 Wherein, Z 1 is P ro - V a ^ - A sp - L eu - S er, V a 1 - A sp - L eu - S er, A sp - L eu - S er, L eu - S er , Ser or a single bond, and Z 2 represents Ser — G ^ y — Pro — Le eu, Ser — G £ y — Pro, Ser-G ^ y, Ser or a single bond. X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.)
で表される神経栄養べプチ ド誘導体またはその塩である 請求項 7 記載の神経栄養べプチ ド誘導体。 The neurotrophic peptide derivative according to claim 7, which is a neurotrophic peptide derivative represented by the formula or a salt thereof.
1 0 . 下記式 （ IV )  10. The following formula (IV)
A 1 - L y s - T r p - A 2 (IV) 〔式中、 A 1 および A 2 は以下の （ i ) または （ ϋ ) で 定義される。 A 1 -Lys-Trp-A 2 (IV) wherein A 1 and A 2 are defined by the following (i) or (ϋ).
( i ) A 1 は、 (I) A 1 is,
X 、  X,
X- Ser 、  X- Ser,
X -し en - Ser 、  X-Sh en-Ser,
X - As p - Leu - Ser 、  X-As p-Leu-Ser,
X-Va £ —Asp-Leu - Serまたは  X-Va £ —Asp-Leu-Ser or
X - Pro - Va -ASP - Leu - Serを表わ し、  X-Pro-Va -ASP-Leu-Ser
A 2 は、 A 2
D-Ser-Y 、 D-Ser-G y-Y 、 D-Ser-Y, D-Ser-G yY,
D-Ser-G £ y-Pro-Y または  D-Ser-G £ y-Pro-Y or
D-Ser-G £ y-Pro-Leu-Y を表わ し、 こ こ で Xは水素原子または N末端修飾基を表わ し、 Y 5 は水酸基または C末端修飾基を表わす。  D-Ser-Gy-Pro-Leu-Y, wherein X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, and Y 5 represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.
( ii ) A 1 は、 (Ii) A 1 is
A 一 S e r ( A 4 は、 1 〜 3個の〇 1 〜 C 4 アルキルで置換された L e u ま たはア ミ ジノ 基 で置換された L e uを表わす） を表わ し、 A represents a Ser (A 4 represents L eu substituted with 1 to 3 〇 1 -C 4 alkyl or L eu substituted with an amidino group),
10 A 2 は、 10 A 2 is
Ser-Y 、  Ser-Y,
Ser-Gly-Y 、  Ser-Gly-Y,
Ser-Gly - Pro- Y ま たは  Ser-Gly-Pro-Y or
Ser - Gly - Pro - Leu - Υ を表わ し、  Ser-Gly-Pro-Leu-Υ
15 こ こで Xは水素原子または N末端修飾基を表わ し、 Y は水酸基または C末端修飾基を表わす〕 15 where X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.)
で示される神経栄養べプチ ド誘導体またはその塩。  A neurotrophic peptide derivative represented by or a salt thereof.
1 1 . 式 （ W ) において、 A 1 が X、 A 2 が D - S e r - Y, D - S e r - G i y - Y. D - S e r -1 1. In the formula (W), A 1 is X, A 2 is D-Ser-Y, D-Ser-Giy-Y. D-Ser-
20 G ^ y — P r o — Yまたは D— S e r — G ^ y — P r o — L e u — Yである請求項 1 0 の神経栄養ペプチ ド誘導 体またはその塩。 20. The neurotrophic peptide derivative or a salt thereof according to claim 10, which is 20 G ^ y—Pro—Y or D—Ser—G ^ y—Pro—Leu—Y.
1 2. 式 （IV) において、 A 1 が X— L e u - S e r、 A 2 が D - S e r — Y、 D— S e r — G y - Y、 D—In 1 2. Formula (IV), A 1 is X- L eu - S er, A 2 is D - S er - Y, D- S er - G y - Y, D-
25. S e r — G y — P r o — Yま たは D— S e r — G ^ y 一 P r o — L e u — Yである請求項 1 0 の神経栄養ぺプ チ ド誘導体またはその塩。 25. S er — G y — Pro — Y or D—S er — G ^ y The neurotrophic peptide derivative or a salt thereof according to claim 10, which is one of Pro-Leu-Y.
1 3 . 式 （ IV) において、 A 1 が M e L e u — S e r である請求項 1 0 の神経栄養べプチ ド誘導体またはその 13. The neurotrophic peptide derivative or the derivative thereof according to claim 10 , wherein in the formula (IV), A 1 is Me Leu — Ser.
1 4 . 式 （IV) において、 A 1 が M e L e u — S e r 、 A 2 が D — S e r — Y、 D - S e r - G i y - Y , D - S e r - G ^ y - P r o _ Yまたは D — S e v - G £ y 一 P r o — L e u — Yである請求項 1 0 の神経栄養ぺプ チ ド誘導体またはその塩。 1 4 In the formula (IV), A 1 is M e L eu -. S er , A 2 is D - S er - Y, D - S er - G iy - Y, D - S er - G ^ y - P 10. The neurotrophic peptide derivative or salt thereof according to claim 10, which is ro_Y or D—Sev-G £ y—Pro—Leu—Y.
1 5 . 一般式 （ V a )  1 5. General formula (V a)
A 5 - G 一 P r o - L e u — Y ( V a ) 〔式中、 A 5 は、 A 5 -G i Pro-L eu — Y (V a) where A 5 is
X-B 、  X-B,
X-Trp-B 、  X-Trp-B,
X-Lys-Trp-B 、  X-Lys-Trp-B,
X-Ser-Lys-Trp-B 、  X-Ser-Lys-Trp-B,
X-Leu-Ser-Lys-Trp-B 、  X-Leu-Ser-Lys-Trp-B,
X-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-B 、  X-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-B,
X-Va -Asp-Leu - Ser-Lys-Trp - Bま たは、  X-Va -Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-B or
X-Pro-Va £ - Asp - Leu - Ser - Ly s - Trp - Bを表わ し、  X-Pro-Va £-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-B
こ こで B は S e r 、 D — S e r または A a を表わ し、 Xは水素原子または N末端修飾基を表わ し、 Yは水 酸基または C末端修飾基を表わす。 〕 で表わされる神経 栄養ペプチ ドまたはその塩。 Here, B represents Ser, D—Ser or Aa, X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group. ] A neurotrophic peptide or a salt thereof represented by
1 6 . 下記式 （ V ) 1 6. The following formula (V)
A 3 - G ^ y - P r o - L e u - Y ( V )A 3 -G ^ y-Pro-L eu-Y (V)
〔式中、 A 3 は、 (Where A 3 is
X-C 、  X-C,
X-Trp-B 、  X-Trp-B,
X-Lys-Trp-D 、  X-Lys-Trp-D,
X-Ser-Lys-Trp-D 、  X-Ser-Lys-Trp-D,
X—し eu— Ser—し ys— Trp— D 、  X—Sheu—Ser—Shys—Trp—D,
X - Asp -し eu - Ser - Lys - Trp - D 、  X-Asp-eu-Ser-Lys-Trp-D,
X-Va £ -Asp— Leu— Ser し ys— Trp— Dまたは、  X-Va £ -Asp— Leu— Ser and ys— Trp— D or
X-Pro-Va £ - Asp - Leu - Ser - Lys-Trp-D  X-Pro-Va £-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-D
を表わ し、 Represents
こ こで C は S e r または D — S e r を表わ し、 Bは S e r 、 D — S e r または A a を表わし、 Dは D — S e r または A ^ a を表わ し、  Where C represents S er or D — S er, B represents S er, D — S er or A a, D represents D — S er or A ^ a,
Xは水素原子または N末端修飾基を表わし、 Yは水酸 基または C末端修飾基を表わす〕  X represents a hydrogen atom or a N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group.)
で示される神経栄養べプチ ド誘導体またはその塩。 A neurotrophic peptide derivative represented by or a salt thereof.
1 7 . 式 （ V ) において、 A 3 が X — S e r、 X - D — S e r、 X - T r p — S e r、 X - T r p - D -17. In the formula (V), A 3 is X—S er, X—D—S er, X—T rp—S er, X—T rp—D—
S e r または X — T r p - A a である請求項 1 6 の神 経栄養べプチ ド誘導体またはその塩。 17. The neurotrophic peptide derivative or a salt thereof according to claim 16, which is S er or X—T rp -A a.
1 8 . 式 （ V ) において、 A 3 が、 1 8. In the formula (V), A 3 is
X-Lys-Trp-D-Ser 、  X-Lys-Trp-D-Ser,
X-Ser-Lys-Trp-D-Ser 、 X-Leu-Ser-Lys-Trp-D-Ser 、 X-Ser-Lys-Trp-D-Ser, X-Leu-Ser-Lys-Trp-D-Ser,
X-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-D-Ser 、  X-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-D-Ser,
X-Va £ -Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-D-Ser または  X-Va £ -Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-D-Ser or
X-Pro-Va -Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-D-Ser ¾ ¾ H 項 1 6 の神経栄養ペプチ ド誘導体またはその塩。  X-Pro-Va-Asp-Leu-Ser-Lys-Trp-D-Ser A neurotrophic peptide derivative of Item H16 or a salt thereof.
1 9. 下記式 （ VI )  1 9. The following formula (VI)
X - A i a - G y - P r o - L e u - Y (VI) 〔式中、 Xは水素原子または N末端修飾基を表わ し、 Yは水酸基または C末端修飾基を表わす〕  X-Aia-Gy-Pro-Leu-Y (VI) (wherein, X represents a hydrogen atom or an N-terminal modifying group, and Y represents a hydroxyl group or a C-terminal modifying group)
で示される神経栄養ペプチ ド誘導体またはその塩。 A neurotrophic peptide derivative represented by or a salt thereof.
2 0 . 下記式  2 0. The following formula
H - A i a - G y - P r o — L e u — O H で示される請求項 1 9 の神経栄養ペプチ ド誘導体また はその塩。  The neurotrophic peptide derivative or a salt thereof according to claim 19, which is represented by H-Aia-Gy-Pro-Leu-OH.
2 1 . 請求項 3記載の遺伝子を含む組換え発現べク タ 一で形質転換された細菌、 酵母または哺乳動物細胞。  21. A bacterium, yeast or mammalian cell transformed with the recombinant expression vector containing the gene of claim 3.
2 2. 請求項 4記載の遺伝子を含む組換え発現べク タ —で形質転換された細菌、 酵母または哺乳動物細胞。  2 2. A bacterium, yeast or mammalian cell transformed with the recombinant expression vector containing the gene according to claim 4.
2 3. 請求項 5〜 2 0 のいずれか記載のペプチ ドを有 効成分とする神経変性疾患治療剤。  23. A therapeutic agent for a neurodegenerative disease, comprising the peptide according to any one of claims 5 to 20 as an active ingredient.
2 4 . 請求項 5〜 2 0 のいずれか記載のペプチ ドの有 効量を哺乳動物に投与する こ とを含む神経変性疾患の治 療法。  24. A method for treating a neurodegenerative disease, comprising administering an effective amount of the peptide according to any one of claims 5 to 20 to a mammal.
2 5. 請求項 5〜 2 0 のいずれか記載のペプチ ドの、 治療剤の有効成分と しての使用。 25. Use of the peptide according to any one of claims 5 to 20 as an active ingredient of a therapeutic agent.
2 6 . 請求項 5 〜 2 0 のいずれか記載のペプチ ドを 有効成分とする神経変性疾患治療剤を製造するための該 ぺプチ ドの使用。 26. Use of a peptide according to any one of claims 5 to 20 for producing a therapeutic agent for a neurodegenerative disease, comprising the peptide as an active ingredient.
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