UA123821C2 - Композиція для експансії лімфоцитів in vitro - Google Patents

Abstract

Винахід стосується композиції для експансії лімфоцитів in vitro, яка містить інтерлейкін 2 (IL-2), інтерлейкін 15 (IL-15) та інтерлейкін 21 (IL-21), де композиція знаходиться в рідкій формі, концентрація IL-2 в рідкій композиції знаходиться в діапазоні від 500 до 2000 МО/мл, концентрація IL-15 знаходиться в діапазоні від 0,1 до 100 нг/мл, і де концентрація IL-21 знаходиться в діапазоні від 0,1 до 100 нг/мл. Винахід також належить до способу одержання популяції клінічно релевантних лімфоцитів та популяції лімфоцитів, одержаної таким способом.

Description

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

Даний винахід стосується активної клітинної імунотерапії, включаючи спосіб одержання популяції клінічно релевантних лімфоцитів з використанням композиції попередньо визначених цитокінів. Винахід додатково стосується композиції цитокінів та згенерованих клінічно релевантних лімфоцитів.

ВІДОМИЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Рак залишається однією з найбільш поширених причин смерті в розвинутих країнах.

Приклад, в США та Німеччині він є другою за поширеністю причиною смерті зі смертністю 560000 (2009) та 218000 (2010), відповідно. Коефіцієнти виживаності залишаються низькими для багатьох раків незважаючи на поліпшення здатності детектувати та лікувати цю групу хвороб.

З онкологічних хвороб, рак підшлункової залози є четвертою за значенням причиною смерті від раку в США та Швеції без ознак поліпшення. К моменту постановки діагнозу раку підшлункової залози більшість пацієнтів є невиліковними, причому локально поширений рак або метастазуюча пухлина дозволяють проводити лише паліативне лікування. Середня виживаність становить приблизно шість місяців. Лише у приблизно 15-20 95 пацієнтів мають операбельну пухлину і, отже, потенційно виліковну хворобу. Як і більшість раків, рак підшлункової залози є системною хворобою, яка потребує раннього та системного втручання. У порівнянні з багатььма іншими типами раку, рак підшлункової залози є високорезистентним до хіміотерапії та резистентним до опромінювання. Для досягнення значних досягнень в поліпшенні несприятливого проогнозу при раку підшлункової залози необхідно знайти нові альтернативи та більш ефективні концепції лікування. Біологія раку підшлункової залози пов'язана з як місцевою, так і з системною імуносупресією, яка дозволяє пухлині прогресувати та метастазувати.

Схожа ситуація існує з гліобластомою, яка є найбільш поширеною та прогресуючою гліомою з частотою випадків 2-3/100000 в США. Гліобластома складає до 12-15 95 випадків усіх внутрішньочерепних та 50-60 905 гістіоцитарних пухлин. Нові схеми лікування підвищили середню загальну виживаність (14,6 місяців при променевій терапії плюс темозоломід у порівнянні з 12,1 місяців при одній лише променевій терапії). Досі спроби розробити надійні та клінічно ефективні імунотерапевтичні протоколи були невтішними для пацієнтів з гліобластомою або пацієнтів з раком підшлункової залози. Один з підходів до лікування таких раків полягає в подоланні індукованого пухлиною пригнічення та/або в індукуванні націлених на пухлину клітин та гуморальних імунних відповідей.

Одним з найбільш перспективних досягнень є новий терапевтичний клас, називаний активною клітинною імунотерапією (АСІ). Ракові імунотерапії можуть бути або пасивними, або активними. Пасивна терапія основана на адоптивному перенесенні імуномодуляторів, включаючи цитокіни, пухлиноспецифічні антитіла або імунні клітини. Ці речовини або клітини потім вводять пацієнту для ініціювання протипухлинної дії. Загалом, ці терапії не створюють імунологічної памяті і тому потребують лікування на основі хронічної інфузії. Активні імунотерапії, з іншого боку, стимулюють імунну систему пацієнта з метою промотування антигенспецифічного протипухлинного ефекту з використанням власних імунних клітин організму. На додаток, активні імунотерапії намагаються створити довготривалу протипухлинну відповідь, яка може захищати від мінімальної залишкової хвороби та рецидивів пухлини.

Клінічно релевантна та довготермінова ремісія з використанням Т-клітин, спрямованих проти пухлин (пухлина-реактивні Т-клітини) була досягнута у пацієнтів з меланомою (2, 3). У принципово важливій статті нещодавно було показано, що найкраща та довготривала відповідь при лікуванні раку досягається, коли власні Т-клітини пацієнта будуть спрямовані проти власних пухлинних клітин пацієнта, тобто, власних "індивідуальних" мутацій пацієнта (4). Такі багатонадійні результати були також отримані для пацієнтів з епітеліальними пухлинами, тобто, шляхом адаптивного перенесення Т-клітин, націлених на мутантні епітопи, при епітеліальному раку (5). Ці підходи звичайно основані на збиранні лімфоцитів, що проникають в пухлину (ТІ), з пухлинних уражень, або Т-клітин з периферичної крові.

Недавній звіт Підкомітету з адаптивної клітинної терапії Програми оцінки протиракової терапії (СТЕР БЗирсоттійеє оп Адаріїме Се! Тпегару) підсумував протоколи експансії пухлинореактивних Т-клітин з периферичної крові та ТІ...

Ці дослідження склали дорожну карту для використання терапії ТІЇ або терапії на основі Т- клітин з конкретним фокусом на стабільності продукту та ефективному виході Т-клітинних продуктів. Як стабільність, так і вихід націлених на меланому Т-клітин, очевидно, є досяжними при використанні сучасних методик, які дозволять ввести стратегії на основі Т-клітин в основний напрямок лікування раку, разом з біологічними засобами, тобто, терапіями, націленими проти (510) С0О40І або РО-1.

Мінімально культивовані ТІЇ, очевидно, забезпечують найбільш ефективний фенотип та профіль для клінічного застосування (11). Найбільш успішний на сьогодні підхід полягає у використанні аутологічних ех мімо активованих Т-клітин, вирощуваних у 24-лункових планшетів, тестуванні на імунні ефекторні функції та, додатково, експансії з використанням 1-2, алогенних живильних клітин та ОКТЗ (9, 12, 13).

Т-клітини, націлені на СО4: або СО8: пухлинний антиген (ТАА), були одержані в умовах

СМР (сумлінна виробнича практика) з периферичної крові та використані для складання композицій для подальшого лікування пацієнтів. Це робили з аутологічними СО4- Т-клітинами (14-16) або СО8: Т-клітинами (17), деякі з яких були націлені на антиген МУ-ЕБО-1 (18), який є також можливим в мононуклеарних клітинах периферичної крові (МНКПК) здорових пацієнтів без раку, оскільки достатня кількість прекурсорів Т-клітин присутня в периферичній циркуляції.

Були описані різні методи експансії Т-клітин для генерування СЮО8: клонів Т-клітин для спрямованої таргетної терапії (19). Це становить великий інтерес, оскільки було показано, що клональна репопуляція імунної системи пацієнта протипухлинними лімфоцитами індукує регресію раку, але також і аутоіїмунітет (20).

Рецептура композиції живильного середовища також може бути важливою для успішної активної імунотерапії. Дослідження показали, що голодування впливає на медійовані Т- клітинами імунні відповіді та може індукувати голодування-індуковану імуносупресію, але також і експансію певних підгруп Т-клітин. Цей механізм, напевно, медіюється лептином (21), який також модулює розвиток В-клітин та подальші В-клітинні відповіді (22). Це привело до відкриття шляхів сенсора живильних речовин (тобто, 3СМ2 у дендритних клітинах), які підсилюють презентацію антигена (23). Недавні дослідження дослідження показали, що спричинювана цитокінами експансія Т-клітин (таких як при ех мімо експансії ТІЇ або АСТ) є залежною від екзогенних амінокислот, і що цитокіни, тобто, 1-7, здійснюють підвищувальну регуляцію генів, асоційованих з експресією транспортера амінокислоти. Адаптація вимог до живильного середовища буде тому визначатися відповідним використовуваним цитокіновим коктейлем для експансії Т-клітин (24), а також амінокислотами у середовищі; обидва фактори будуть впливати на дозрівання Т-клітин та диференціацію, що є клінічно значущим.

Клінічна (протипухлинна) ефективність, напевно, є медійованою СО8: та центральною пам'яттю клітини, визначуваною СЮО45КА-ССВ?7", як було визначено ех мімо для пацієнтів, що відкливаються на трапію на основі Т-клітин. Фенотип таких Т-клітин визначається популяцією підданих експансії ех мімо Т-клітин, а також факторами, пов'язаними з хазяїном, після адоптивного перенесення. Різноманітна популяція Т-клітин, націлених на ракові клітини, може бути кращою для забезпечення ефективної імунної відповіді, включаючи Т-клітини довготермінової пам'яті, а також Т-клітини, що можуть негайно реагувати на (ракові) клітини- мішені та продукувати протипухлинні імунні відповіді, включаючи термінально диференційовані

Т-клітини, що експресують цитолітичні молекули, такі як гранзим та перфорин (25, 26).

Довготермінова імунна пам'ять частково визначається підвищеними потенціалом проліферації та періодом напівжиття, які можуть бути виміряні за довжиною теломерів (27, 28).

Відносно небагато відомо про то, які стадії (меланома)-специфічних ТІЇ. або клонів Т-клітина є кращими для іп мімо перенесення, внаслідок розбіжностей генної експресія іп міїго та іп мімо, а також відмінностей цитокінового середовища у індивідуальних пацієнтів. Не лише індивідуальний фенотип, але також і досить різні фенотипи, асоційовані зі швидкою доставкою імунних ефекторних функцій (термінально диференційованих СО45КАЖССК7-) Т-клітин, разом із забезпеченням довготермінової імунологічної пам'яті Т-клітин центральної пам'яті, які будуть поповнювати пул диференційованих Т-клітин, можуть бути гарним вибором для експансії Т- клітин.

Аналогічно релевантною, очевидно, є експресія маркерів активації/виснаження, тобто, І Ас-

З, РО-1 та або 4-188 на Т-клітинах, які можуть вказувати на більшу зміну для виснаження та втрати функції Т-клітин, а також збагачення специфічних до пухлинного антигена Т-клітин (які мають тенденцію бути РОТ к, та/або І АО-3, 4-188В-- (29)).

Було відомо, що МУ-Е5О-1 є придатною мішенню для специфічних до пухлинного антигена

Т-клітин. МУ-Е5О-1 є антигеном, що використовується в тестах на рак (36, 37), та експресується у великій кількості пухлин. Наприклад, у Кагоїїп5Ка (Кагоїїп5Ка Іпзійшеї, БіосКпоЇт, Зу/едеп) 50 гліобластомні ураження були піддані скринінгу на експресію білка ММ-ЕБО-1, і було знайдено, що 35 95 гліобластом (ЗВ) З та 4 ступенів є позитивними щодо МУ-ЕБО-1. Скринінг уражень раку підшлункової залози показав меншу кількість білок ММ-ЕБО-1ж-4 ракових уражень, в діапазоні нижче 20 95, особливо для метастазуючих уражень. Націлювання на МУ-Е5О-1 для експансії пухлина-реактивних Т-клітин з периферичної крові, очевидно, є "надійним вибором" 60 мішені, оскільки ММ-Е5О-1, напевно, експресується лише в злоякісних клітинах та яєчку без явної неспецифічної реактивності у націлених на МУ-Е5О-1 Т-клітинах (36). Це є дуже цікавим, оскільки було продемонстровано, що клональна репопуляція імунної системи пацієнтів протипухлинними лімфоцитами індукує регресію раку та аутоїмунітет (20), потенційний ризик.

МУЕ5О-1 проходив тестування у ряді досліджень як потенційна мішень при гліобластомі (СВ), а також в оВ-стовбурових клітинах (38), разом з використання агентів метилування ДНК для підвищення реактивності МУ-ЕБО-1 (39, 40).

Враховуючи відомий рівень техніки, метою даного винаходу є створення удосконалених способів імунотерапії.

СУТЬ ВИНАХОДУ

Даний винахід оснований, поміж іншого. на відкритті того, що композиція, яка містить цитокіни інтерлейкін-2 (ІІ/-2), інтерлейкін-15 (1-15) та/або інтерлейкін-21 (ІІЇ-21), забезпечує кращу стимуляцію та експансію лімфоцитів, зокрема, клінічно релевантних лімфоцитів.

Процедура експансії та стимуляції сумішшю цитокінів є високочутливою та дозволяє одержувати популяцію клінічно релевантних лімфоцитів, навіть якщо вихідна концентрація у зразку є дуже низькою.

Таким чином, згідно з перши аспектом, винахід передбачає композицію для експансії лімфоцитів, яка містить принаймні два типи цитокінів, вибраних з інтерлейкіну 2 (ІІ -2), інтерлейкіну 15 (1--15) та інтерлейкіну 21 (1--21).

З цією композицією цитокінів автори винаходу змогли визначити новий спосіб одержання популяції відредагованих за допомогою антигенів лімфоцитів. Отже, згідно з другим аспектом, даний винахід передбачає спосіб одержання популяції клінічно релевантних лімфоцитів, який включає стадії: - одержання зразка з організму ссавця, зокрема, зразка тканини або зразка рідини організму, що містить принаймні один лімфоцит та, необов'язково, виділення клітин у зразку з організму, - культивації зразка з організму іп міо для експансії талабо стимулювання лімфоцитів у зразку, причому культивація включає використання І! 2, ІІ -15 та/або ІІ -21, - необов'язково, визначення присутності клінічно релевантного лімфоцита у культивованому зразку.

Спосіб відповідно до другого аспекту винаходу приводить до утворення популяції

Зо лімфоцитів, яка включає популяцію клінічно релевантних лімфоцитів.

Згідно з третім аспектом, винахід передбачає клінічно релевантний лімфоцит, одержаний способом згідно з другим аспектом, де клінічно релевантний лімфоцит вибирають з В-клітини, природної клітини-вбивці (МК) та Т-клітини.

Згідно з четвертим аспектом, даний винахід передбачає популяцію лімфоцитів, одержаних відповідно до другого аспекту винаходу, що включає популяцію клінічно релевантних лімфоцитів.

Популяція клінічно релевантних лімфоцитів, одержана способом згідно з другим аспектом винаходу, є, зокрема, кращою для клітинної імунотерапії.

Згідно з п'ятим аспектом, винахід передбачає імунотерапію для лікування або профілактики онкологічної хвороби, інфекційної хвороби або аутоїмунної хвороби у ссавця, який включає стадії генерування популяції клінічно релевантних лімфоцитів згідно з другим аспектом винаходу, у якій зразок з організму одержують від зазначеного ссавця, та введення популяції клінічно релевантних лімфоцитів зазначеному ссавцю.

Згідно з шостим аспектом, винахід передбачає композицію згідно з першим аспектом винаходу, призначену для використання у консервативному лікування, зокрема, для лікування та профілактики інфекційної хвороби, аутоімунної хвороби або онкологічної хвороби.

Отже, згідно із сьомим аспектом, винахід передбачає набір для використання у консервативному лікуванні, зокрема, для лікування або профілактики інфекційної хвороби, аутоїмунної хвороби або онкологічної хвороби, де набір включає 1-2, ІЇ/-15 та І--21, та, необов'язково, принаймні один з компонентів, що стимулюють ТСК, зокрема, ОКТЗ, костимулюючі молекули, живильні клітини та пептид, що містить амінокислотну послідовність принаймні клінічно релевантного антигену.

ФІГУРИ

Фіг. 1 зображує три графіки, на яких представлені результати аналізу методом протокової цитометрії зразків, одержаних при експансії МНКПК з цитокіновим коктейлем ІІ--2, 1-15 та ІС-21 в комбінації із золедроновою кислотою. Зразки брали в різні моменти часу, як вказано над графіками. Виміряні сигнали є сигналом СОЗ в напрямку осі у, та сигналом ТОК гамма-дельта в напрямку осі х. Гамма-дельта Т-клітини обведені прямокутником. Зображення, які в оригіналі були кольоровими, показують інтенсивності перекривних сигналів за шкалою сірих тонів. бо Процентна частка клітин у прямокутній ділянці вказана зверху.

Фіг. 2 зображує результат аналізу методом протокової цитометрії лімфоцитів з МНКПК, підданих експансії із цитокіновим коктейлем в присутності пептидів РКОМ2. Більша за розміром ліва панель зображує результати для зразка на початку експансії лімфоцитів, права панель - результати для зразка після 18 днів стимуляції. Клітинні сигнали розділяли на основі маркерів сра/сор8. Маленькі панелі справа показують селекцію (дайіпод) лімфоцитів та СОЗ» клітин.

Фіг. З зображує аналіз методом протокової цитометрії тих самих зразків, що й на фіг. 2.

Розділення клітинних сигналів здійснювали за допомогою маркера ІЕМ-у та за розміром (протокова цитометрія з бічним світлорозсіюванням (5554)).

Фіг. 4 зображує результати протокової цитометрії для зразків, одержаних експансією МНКПК із цитокіновим коктейлем і стимуляцією ІМО8ОЕ та ОСНІЗ. Гейтували клітинні сигнали лімфоцитів (4а2), СОЗ- (45) і потім розділяли на основі сигналів СО8 та СА (4с).

Фі. 5 зображує продукування ІЕМ-у на подвійно негативній та СО8: популяції після стимуляції ІМОВ8ОЕ або ОСНІ 3.

Фіг. 6 зображує аналіз клітин МНКПК, підданих експансії із цитокіновим коктейлем та пептидами ІМО8ОЕ і ОСНІ 3. Клітини, стимульовані ІМО8ОЕ, аналізували на продукування цитокінів СО107а (ба), СО127 (бе) та СЮО117 (60).

Фіг. 7Та-7ї зображують результати експансії МНКПК із цитокіновим коктейлем та стимуляцією

СМУррб5.

Фіг. 8 зображує результати аналізу ІЕМ-у після стимуляції підданих експансії клітин МУ-ЕБО- 1: Фіг. ва та вс - без стимуляції в день 0 та день 18, відповідно. Фіг. 86 та ва - стимульовані МУ-

Е5О-1 в день 0 та день 18, відповідно.

Фіг. 9 зображує продукування цитокінів для клітин, підданих експансії з МНКПК, одержаних від пацієнта з гліобластомою при стимуляції сурвівіном, знов в день 0 та день 18. Вимірюваними цитокінами є І--2, ІЕМ-у та ТМЕ-а. Фіг. За зображує результати для підгрупи СО4 «Т-клітин, Фіг. 9р - для підгрупи подвійно негативних Т-клітин, і Фіг. 9с - для підгрупи СО8--Т-клітин.

Фіг. 10 зображує аналіз лімфоцитів фенотипів СО45КА та ССК7 з використанням протокової цитометрії. Знов, лімфоцити вимірювали в день 0 та після 18 днів експансії із цитокіновим коктейлем.

Фіг. 11 зображує аналіз ефекту експансії на фенотипи СО4- клітин (ТНІ1/ТН2) та СОвТ-

Зо клітин.

Фіг. 12 зображує аналіз експресії цитокінів СО107а клітинами, підданими експансії з периферичної крові пацієнта з НРМ (папіломавірус людини). Фіг. 12а зображує експресію

СОр107а при стимуляції пептидом 1 НРУ, Фіг. 1265 - позитивний контроль, і Фіг. 12с показує результат без стимуляції (середовище). Процес селекції СО8" Т-клітин зображений на Фіг. 12а- 121.

Фіг. 13 зображує два графіки, які показують продукування ІЕМ-у лімфоцитів, підданих експансії без цитокіну, з 1І--2, 11-15, ІІ -21 або 1-7 та 1-2, і стимуляцією за допомогою МУ-ЕБО-1 або сурвівіну.

Фіг. 14 зображує три графіки, які показують продукування ІЕМ-у лімфоцитів, підданих експансії без цитокіну, з 1-2, 1-15, 1-21 або 1-7 та І -2, та стимуляцією за допомогою ЕВМА-1,

ЕВМА-За, або СММррб5.

Фіг. 15 зображує аналіз методом протокової цитометрії з визначення Тед (регуляторних Т- клітин), які ідентифікували до та після експансії Т-клітин із цитокіновим коктейлем. Зліва направо: Т-клітини гейтували на СО4-Т-клітини і потім на СО25підпй, що означає високу експресію рецептора 1-2 на активованих Т-клітинах. Потім клітини гейтували на клітини 1І-2А (високий СО125) і тестували на експресію рецептор 1-7 (СО127) та Еохр3 (внутрішньоклітинно).

Фіг. 16 зображує аналіз методом протокової цитометрії для визначення проццентної частки

РО-1-4Т-клітин у підгрупі Сов.

Фіг. 17 зображує специфічний лізис аутологічних В-клітин, імпульсно оброблених (риїзей м/йй) та імпульсно оброблених пептидами 1-12, підданими експансії лімфоцитами.

Фіг. 18 зображує аналіз методом протокової цитометрії МНКПК до ініційованої ІІ -2/І -15/ЛІІ - 21 експансії в присутності пухлина-асоційованого антигена МУ-Е5О-1. По-перше, гейтують СОЗ3-

Т-клітини, потім СОЗ» Т-клітини гейтують на СОВА: та СО8: Т-клітини.

Фіг. 19 зображує аналіз методом протокової цитометрії МНКПК до ініційованої ІІ -2/І -15/ЛІІ - 21 експансії в присутності пухлина-асоційованого антигена МУ-Е5О-1. По-перше, гейтують

СОЗ--Т-клітини, потім СОЮЗ» Т-клітини гейтують на СО4- та СО8- Т-клітини.

Фіг. 20 зображує інфільтрацію пухлини, культивованої іп міїго з цитокінами ІІ--2, 1-15 та І -21 культури лімфоцитів після одного тижня інкубації.

Фіг. 21 зображує загальну функціональну схему аналізу цитотоксичності підданих експансії бо лімфоцитів проти аутологічних пухлинних клітин з використанням (радіоактивного) мічення (Сг

51) та вивільнення радіоактивності.

Фіг. 22 зображує результати аналізу методом протокової цитометрії лімфоцитів, підданих експансії з ТІЇ, одержаних від пацієнтів з гліобластомою. Фігура З(А) зображує розподіл фенотипів Т-клітин у підданих експансії ТІЇ з 16 ТІЇ на конкретні фенотипи: прекурсорні (С0458АзССВІ), центральної пам'яті (СО45КА-ССВА7), периферичної пам'яті (СО45КА-ССВ7: ), та диференційованого ефектора (СО45КАЖССК7) Т-клітини, окремо для базових фенотипів

СО8: (ліва панель), СО4: (права панель) та подвійно негативних Т-клітин (права панель).

Окремі точки даних позначають процентну частку конкретного фенотипу порівняно з базовим фенотипом. Дані показують, що 1-2, І/-15 та І/-21 приводять до експансії ТІЇ з фенотипом довготермінової пам'яті, а також прекурсорів Т-клітин - які можуть забезпечувати довготерміновий імунний захист.

Фіг. 22(8В) зображує експресію маркерів активації та виснаження Т-клітин. Результати згруповані, як і на (А), за базовими фенотипами СО8: (ліва панель), СО4- (права панель) та подвійно негативних Т-клітин (права панель). Окремі точки даних позначають процентну частку клітин, що експресують маркер, вказаний на осі Х, порівняно з базовим фенотипом. СО117 (с-

КО є маркером, асоційованим зі стовбуровими клітинами, і позначає Т-клітини з довготерміновою пам'яттю, СО107а позначає маркер недавньої дегрануляції Т-клітин. Дані показують, що ТІЇ, піддані експансії в 1-2, 1-15 та І/-21, експресують маркери (наприклад, с-

Кі), які забезпечують для них можливість довготермінової імунної клітинної пам'яті та імунний нагляд.

Фіг. 23 зображує результати аналізу методом протокової цитометрії лімфоцитів (ТІМ), підданих експансії з пухлинної тканини пацієнтів з раком підшлункової залози. Ліва панель зображує розподіл СО4: Т-клітини на прекурсори (С0О45КАЖССК7ю), центральну пам'ять (С045В8А-ССН7, периферичну пам'ять (СО45КА-ССН7) та диференційований ефектор (С0458АзССВ7-). Права панель - розподіл СО8" клітин. Дані показують, що ІІ -2, 1-15 та І -21 забезпечують експансію ТІЇ з фенотипом довготермінової пам'яті, а також прекурсорів Т-клітин - які можуть забезпечувати довготерміновий імунний захист.

Фіг. 24 зображує результати аналізу методом протокової цитометрії лімфоцитів (ТІМ), підданих експансії з пухлинної тканини пацієнтів 3 раком підшлункової залози, на маркери

Зо активації та виснаження Т-клітин (4-188, І АС-3, ТІМ-3 та ін.). Результати згрупован згідно з браубО8: фенотипами СО4- (верхня панель), СО8" (середня панель), ОМ (нижня панель).

Індивідуальні точки даних позначають процентну частку клітин, що експресують маркер вказаний на осі Х, порівняно з базовим фенотипом. Дані показують, що ТІЇ експресують широкий спектр маркерів, що свідчать про сільні протипухлинні відповіді та недавню експозицію антигену. Молекула СО127 (І--7К) медіює сильні фактори виживання Т-клітин.

Фіг. 25 зображує розподіл довжин ТОК Т-клітин, підданих експансії з пухлинної тканини пацієнтів з раком підшлункової залози, визначений на основьі методу ПЛР.

Фіг. 26 зображує результати аналізу внутрішньоклітинного продукування цитокінів в СО4»,

СсО8 або ОМ Т-клітинах у підданих експансії лімфоцитах з гліобластомного ураження. Графіки на Фіг. 7В показують процентну частку Т-клітин, продукуючих цитокіни ІЕМу та ТМЕа після стимуляції. Фіг. 12А зображує максимальну стимуляцію РМАЛономіцином (позитивний контроль) та фонове значення для самого лише середовища. Фіг. 7В зображує результати стимуляції синтетичними пептидами, виділеними з пухлина-асоційованих антигенів, а саме, ЕСЕмМп, МУ-

Е5О-1 або сурвівіном. Дані показують, що піддані експансії з використанням ІІ -2, ІІ -15 та І -21

ТІЇ пацієнтів з гліобластомою містять Т-клітини, які реагують з низькою частотою зі звичайно використовуваними пухлина-асоційованими антигенами.

Фіг. 27 зображує результати аналізу внутрішньоклітинного продукування цитокінів в СО4-,

СО8 або ОМ Т-клітинах у підданих експансії лімфоцитах з ракового ураження підшлункової залози. Графіки на Фіг. ВА показують процентну частку Т-клітин, продукуючих цитокіни ІЄМу (верхня панель) та ТМЕа (нижня панель) після стимуляції пухлина-асоційованими антигенами, а саме, мезотеліном, МУ-Е5О-1 або сурвівіном (з5зигміміпу) в підгрупах СО4: (зліва), СО8- (посередині) та ОМ (справа). Фіг. 88 зображує приклади протоково-цитометричного аналізу зі стимуляцією МУ-ЕБО-1. Т-клітини, гейтовані на СОЮЗ» і потім на СО8»-, (аналізували) з бічним розсіюванням (5552) порівняно з продукуванням ІЕМу (у верхній рамці) або ТМЕРа (в нижній рамці). (Результати) показують, що піддані експансії з використанням І--2, 1-15 та ІС-21 ТІЇ. від пацієнтів з раком підшлункової залози демонструють сильну реактивність по відношенню до звичайно використовуваних пухлинних антигенів, наприклад, МУ-ЕБО-1.

Фіг. 28 зображує результати аналізу внутрішньоклітинн продукування цитокінів в СО4-, СОВ8 або ОМ Т-клітинах у підданих експансії лімфоцитах з гліобластомного ураження після стимуляції бо аутологічними пухлинними клітинами. Графіки на Фіг. 9А показують процентну частку Т-клітин,

продукуючих цитокіни ІЕМу та ТМЕРа для СО4- (ліва панель), СО8: (середня панель) та ОМ Т- клітин (права панель) після стимуляції аутологічними пухлинними клітинами. Фіг. 9В показує приклади протоково-цитометричного аналізу клітин, стимульованих аутологічними пухлинними клітинами. Т-клітини, гейтовані на СОЗ: і потім на СО4- (у верхній рамці) або СО8- (в нижній рамці), (аналізують) з бічним розсіюванням (5552) порівняно з продукуванням ІЕМу (у верхній рамці) або ТМЕа (в нижній рамці). (Результати) показують, що піддані експансії з використанням

І/-2, 1-15 та 1-21 ТІЇ від пацієнтів з гліобластомою демонструють сильну реактивність по відношенню до аутологічних пухлинних клітин.

Фіг. 29 зображує результати аналізу внутрішньоклітинного продукування цитокінів (шляхом) вимірювання продукування ТМЕс лімфоцитів, підданих експансії із цитокіновим коктейлем ІЇ/--2,

І/-15 та ІС-21. Верхня панель зображує позитивний контроль (максимальна стимуляція).

Середня панель зображує результати продукування цитокінів для СО4" гейтованих підданих експансії Т-клітин у відповідь на аутологічні пухлинні клітини (зліва: усі ТІЇ, справа: ТІ, гейтовані на МВ2-Т-клітини). Нижня панель: фоновий рівень продукування в популяції ТІЇ. в цілому (зліва) та іп Же МВ2 «ТІЇ (справа). Дані показують, що, переважно, піддані експансії з використанням ТСК МВ сімейств в 1-2, ІЇ/-15, 11-21 ТІЇ (в даному документі ТСК МВ2) спрямовані проти аутологічних пухлинних клітин.

Фіг. 30 зображує рівень ІМЕу у лімфоцитах, підданих експансії з панкреатичних пухлинних тканин після стимуляції. ТІ пухлина позначає стимуляцію підданих експансії лімфоцитів аутологічними пухлинними клітинами. ТІ--ОКТЗ позначає стимуляцію лімфоцитів антитілом

СО3. Муб/32 є антитіло, що блокує СО8-«ТІЇ.. Антитіло І 243 блокує СО4--ТІЇ.. Дані показують, що піддані експансії з використанням 1-2, І/-15 та І/-21 ТІЇ є специфічними проти аутологічної пухлини пацієнта.

Фіг. 31 зображує результат аналізу цитолітичної відповіді підданих експансії з використанням аутологічних пухлинних клітин ТІЇ. від пацієнтів з гліобластомою. Числа на осі Х позначають співвідношення ТІЇ. до пухлинних клітин. Процентна частка на осі У позначає число вбитих пухлинних клітин після 4 год. обробки підданими експансії ТІЇ, виміряне за вивільненням радіоактивності.

Фі. 32 зображує результат аналізу цитолітичної відповіді підданих експансії моноклональних Т-клітин та/або, краще, підданих експансії ТІЇ. від пацієнтів з гліобластомою, проти аутологічних пухлинних клітин. Числа на осі Х позначають співвідношення ТІЇ до пухлинних клітин. Процентна частка на осі М позначає число вбитих пухлинних клітин після 4 год. обробки підданими експансії ТІЇ, виміряне за вивільненням радіоактивності.

Фіг. 33 зображує результат аналізу цитолітичної відповіді підданих експансії ТІЇ. від пацієнтів з раком підшлункової залози проти аутологічних пухлинних клітин. Числа на осі Х позначають співвідношення ТІЇ до пухлинних клітин. Процентна частка на осі У позначає число вбитих пухлинних клітин після 4 год. обробки підданими експансії ТІЇ, виміряне за вивільненням радіоактивності. Ці піддані експансії з використанням 1-2, 1-15 та 1-21 ТІЇ продемонстрували дуже сфокусований репертуар ТСК та виявляють сильну цитотоксичну відповідь проти аутологічних пухлинних клітин.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Автори винаходу знайшли, що комбінація інтерлейкінів ІІ -2, ІІ -15 та І-21 забезпечує значні поліпшення імунотерапії з використанням лімфоцитів. Однією важливою перевагою є те, що експансія та стимуляція лімфоцитів, отриманих від пацієнта, з композицією, що складається з комбінації принаймні двох типів цитокінів, вибраних з 1І/-2, 1/-15 та І/-21, особливо сприяє генеруванню лімфоцитів, зокрема, Т-клітин, які є клінічно релевантними.

Згідно з винаходом, "клінічно релевантні лімфоцити" є специфічними до та взаємодіють з клінічно релевантними антигени. Існує три групи клінічно релевантних лімфоцитів, а саме, пухлина-реактивні лімфоцити, реактивні щодо інфекційної хвороби лімфоцити та реактивні щодо аутоімунної хвороби лімфоцити. "Клінічно релевантні лімфоцити" також називаються антиген-відредагованими лімфоцитами.

Термін клінічно релевантний також використовується для підгруп лімфоцитів. Особливо кращими клінічно релевантними лімфоцитами є клінічно релевантні Т-клітини або антиген- відредаговані Т-клітини. "Клінічно релевантні антигени" згідно з винаходом є антигенами, залученими до хвороби.

Відповідно, клінічно релевантні антигени можуть бути пухлина-асоційованими антигенами ТАА, патоген-асоційованими антигенами (РАА) або аутоантигенами. Пухлина-реактивні лімфоцити є специфічни до та взаємодіють з ТАА. Реактивні щодо інфекційної хвороби лімфоцити є специфічними до та взаємодіють з РАА, і реактивні щодо аутоїмунної хвороби лімфоцити є бо специфічними до та взаємодіють з аутоантигенами.

Згідно з винаходом, "антиген" (Ад) є будь-якою структурною речовиною, яка служить мішенню для рецепторів адаптивної імунної відповіді, ТСЕК або антитіла, відповідно. Антигени є, зокрема, білками, полісахаридами, ліпідами та їх субструктурами, такими як пептиди. Ліпіди та нуклеїнові кислоти є, зокрема, антигенними в комбінації з білками або полісахаридами. "Патоген-асоційовані антигени" (РАА) стосуються частин, таких як капсули, клітинні стінки, джгутики та токсини патогенів, таких як бактерії, віруси та інші міукроорганізми. "Аутоантигени" є звичайно пептидами, олігопептидами, поліпептидами або комплексами білків індивідуума, які розпізнаються імунниою системою цього самого індивідуума. Цей ефект звичайно призводить до аутоімунної хвороби. "Пухлина-асоційовані антигени" або "ТАА", згідно 3 винаходом, є антигенами, які презентуються молекулами МНС І або МН ІІ або некласичними молекулами МНС на поверхні пухлинних клітин. У використовуваному в даному документі значенні, ТАА включає "пухлина- специфічні антигени", які є присутніми тільки на поверхні пухлинних клітин, але не на поверхні нормальних клітин.

За допомогою комбінації ІІ -2, 1-15 та ІЇ/-21 можливо специфічно індукувати проліферацію клінічно релевантних лімфоцитів у зразку з організму, одержаному від пацієнта, як показано у прикладах. Спосіб згідно з винаходом передбачає простий протокол для експансії клінічно релевантних лімфоцитів. Він, зокрема, є кращим у порівнянні з протоколами відомого рівня техніки, оскільки не потребує дендритних клітин. Крім того, автори винаходу змогли показати, що популяція лімфоцитів, одержана після експансії із цитокіновим коктейлем, що складається з комбінації принаймні двох типів цитокінів, вибраних з ІІ-2, 1/-15 та 1/-21, містить композиція лімфоцитів, яка є кращою для клінічного застосування. Наприклад, композиція має високу процентну частку Тні хелперних Т-клітин і майже не містить Тнг хелперних Т-клітин. Додатковою перевагою є те, що не відбувається значної експансії регуляторних Т-клітин, які можуть спричинити пригнічення терапевтичної дії підданої експансії популяції лімфоцитів.

Таким чином, згідно з першим аспектом, винахід передбачає композицію для експансії лімфоцитів, що містить принаймні два типи цитокінів, вибраних з інтерлейкіну 2 (ІІ -2), інтерлейкіну 15 (1--15) та інтерлейкіну 21 (1--21).

І -2, ІС-15 та 1-21 є членами сімейства цитокінів, кожен з яких має клубок з чотирьох альфа-

Зо спіралей. І/-2 відіграє ключову роль в ключових функціях імунної системи, переносності та імунітеті, переважно завдяки його прямому впливу на Т-клітини. 1-2 індукує проліферацію та диференціацію Т-клітин в ефекторні та Т-клітини пам'яті.

І/-15 є цитокіном, який є структурно схожим з ІЇ-2. Як і 1-2, І/-15 зв'язується з та передає сигнали через комплекс, що складається з бета-ланцюга рецептора ІІ -2/І-15. 1-15 індукує активацію та проліферацію Т-клітин, зокрема, СО8--Т-клітин (30), а також забезпечує сигнали виживання для підтримання клітин пам'яті за відсутності антигенів, кращих СО8--Т-клітин, та активує моноцити. ІІ -15, очевидно, запускає проліферацію імунних ефекторних Т-клітин, разом із захистом від інгібування пухлина-асоційованою імуносупресією (31).

І/-21 є цитокіном, який виявляє сильні регуляторні ефекти на клітини імунної системи, включаючи природні клітини-вбивці (МК) та цитотоксичні Т-клітини. ІІ -21 збагачує Т-клітини типу центральної пам'яті фенотипом СОр2г8-00127пі СОр45АО- та підвищую цитотоксичність цитотоксичних Т-клітин. І1Ї/-21 може підтримувати Т-клітини на ранній фазі їх диференціації та дозріванні (35).

Згідно з винаходом, композиція, що складається з комбінації принаймні двох типів цитокінів, вибраних з ЇЇ -2, ІІ -15 та ІС-21, також називається "цитокіновим коктейлем".

У використовуваному в даному документі значенні, "інтерлейкін 2" або "І/-2" стосується людського І/-2, як визначено у 5ЕО ІЮО МО: 1, та його функціональними еквівалентами.

Функціональні еквіваленти 1-2 включають релевантні субструктури або гібридні білки ІІ-2, які зберігають функції 1-2. Відповідно, визначення ІЇ/-2 охоплює будь-який білок з ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ МО: 1 принаймні 80 95, краще, принаймні 90 95, ще краще, принаймні 95 95, найкраще, принаймні 98 95. Рекомбінантний людський ІЇ-2, продукований в Е. соїї у вигляді окремого, неглікозильованого поліпептидного ланцюга з 134 амінокислот, який має молекулярну масу 15 кДа, є комерційно доступним в ліофілізованій формі від фірми Ргозрес під назвою СУТ-209.

У використовуваному в даному документі значенні, "інтерлейкін 15" або "І -15" стосуються людського 1-15 та його функціональних еквівалентів. Функціональні еквіваленти 1-15 включають релевантні субструктури або гібридні білки ІЇ-15, які зберігають функції 11-15.

Відповідно, визначення 1-15 охоплює будь-який білок з ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ

МО: 2 принаймні 80 95, краще, принаймні 90 95, ще краще, принаймні 95 95, найкраще, принаймні 60 9895. Рекомбінантний людський 1-15, продукований в Е. соїї у вигляді окремого,

неглікозильованого поліпептидного ланцюга зі 114 амінокислот (та М-кінцевого метіоніну), який має молекулярну масу 12,8 кДа, є комерційно доступним в ліофілізованій формі від фірми

Ргозрес під назвою СУТ-230.

У використовуваному в даному документі значенні, "інтерлейкін 21" або "1-21" стосуються людського 1-21 та його функціональних еквівалентів. Функціональні еквіваленти 1-21 включають релевантні субструктури або гібридні білки 1І/-21, які зберігають функції 1-21.

Відповідно, визначення 1-21 охоплює будь-який білок з ідентичністю послідовностей з 5ЕО ІЮ

МО: З принаймні 80 95, краще, принаймні 90 95, ще краще, принаймні 95 95, найкраще, принаймні 9895. Рекомбінантний людський 1-21, продукований в Е. соЇїї у вигляді окремого неглікозильованого поліпептидного ланцюга з 132 амінокислот, який має молекулярну масу 15 кДа, є комерційно доступним в ліофілізованій формі від фірми Ргозрес під назвою СУТ-408. "Пептид", у використовуваному в даному документі значенні, може складатися з будь-якого числа амінокислот будь-якого типу, краще, природних амінокислот, які, краще, з'єднані пептидними зв'язками. Зокрема, пептид включає принаймні З амінокислоти, краще, принаймні 5, принаймні 7, принаймні 9, принаймні 12, або принаймні 15 амінокислот. Крім того, верхньої межі довжини пептиду немає. Однак, краще, довжина пептиду згідно з винаходом не перевищує 500 амінокислот, ще краще, вона не перевищує 300 амінокислот; і ще краще, вона становить не більше 250 амінокислот.

Таким чином, термін "пептид" включає "олігопептиди", що звичайно стосується пептидів з довжиною від 2 до 10 амінокислот, і "поліпептиди", що звичайно стосується пептидів з довжиною більш ніж 10 амінокислот.

Термін "білок" стосується пептиду з принаймні 60, принаймні 80, краще, принаймні 100 амінокислотами.

Термін "гібридний білок", згідно з винаходом, стосується білків, створених шляхом з'єднання двох чи більше генів, КДНК або послідовністей, які первісно кодували окремі білки/пептиди. Гени можуть бути природними та належати одному й тому самому організму або різним організмам, або можуть (бути) синтетичними полінуклеотидами.

Спорідненість між двома амінокислотними послідовностями або між двома нуклеотидними послідовностями описується параметром "ідентичність послідовностей". В цілях даного винаходу, ступінь ідентичності послідовностей між двома амінокислотними послідовностями визначається з використанням алгоритму Нідлмана-Вунша (Мееаіетап апа Ууип5сй, 1970, у.

Мої. Віої. 48: 443-453), реалізованого в програмі Меедіе пакета ЕМВО55 (ЕМВО5З5: Те

Ейгтореап Моїесшіаг Віоїсду Ореп боймаге Бийе, Вісе єї а!., 2000, Ттепа5 Сепеї. 16: 276-277), краще, версії 3.0.0 чи пізнішої. Використовуваними необов'язковими параметрами є штраф за відкриття пробелу 10, штраф за подовження пробелу 0,5, та матриця заміщення ЕВ О5ОМб2 (варіант ВГОБОМ62 для ЕМВО55). Вихідний параметр МеейіІє, називаний "найдовша ідентичність" (одержаний з використанням опції -побгіеї), використовується як процент ідентичності та обчислюється у такий спосіб: (Число іденнтичних залишківх 100)/Довжина вирівнювання - Загальне число пробелів у вирівнюванні)

Перехідний термін "що містить", синонімами якого є "що включає", "що вміщує", або "який характеризується", є включним або необмежувальним та не виключає додаткові неназвані елементи або стадії способу. Перехідна фраза "що складається з" виключає будь-який елемент, стадію, або інгредієнт, не вказані в пункті формули, за винятком домішок, які звичайно асоційовані з ним. Якщо фраза "що складається з" використовується в умові до тіла пункта формули (сіаизе ої Ше броду ої а сіаїт), а не негайно після вводної частини, то вона обмежує лише елемент, вказаний в цій умові; інші елементи не виключаються з пункта формули в цілому. Перехідна фраза "що складається по суті з" обмежує обсяг домогань зазначеними матеріалами або стадіями "та такими, що істотно не впливають на основну та нову характеристику (характеристики) винаходу, що заявляється. Формулювання домогання "що складається по суті з" займає проміжне положення між замкненими пунктами формули, складеними в форматі "що складається з", та повністю відкритими пунктами формули, складеними в форматі "що містить". "Експансія" або "клональна експансія", у використовуваному в даному документі значенні, означає продукування дочірніх клітин, які усі походять від однієї клітини. При клональній експансії лімфоцитів, усе потомство має одну й ту саму антигенну специфічність.

Згідно з одним варіантом втілення винаходу, композиція згідно з першим аспектом охоплює два або три типи цитокінів. Додаткові цитокіни можуть впливати на результати експансії, забезпечувані композицією згідно з винаходом. 60 Альтернативно, інші цитокіни, використовувані на додаток до комбінації ІІ -2, 1-15 та І--21,

можуть позитивно впливати на популяцію лімфоцитів. Таким чином, композиція за першим аспектом винаходу може містити більше цитокінів на додаток до ЇІ--2, ІІ -15 та І--21. Прикладами є ІС-Треїа, 1-4, ЯМ-С5Е, 11-12, 11-68, 11-17, ТМЕа, І--32. І/-18 є залученим до приміювання, диференціації в ефекторні В-клітини або Т-клітини при першому контакті зі специфічним антигеном. ІІ -4 та ЗМ-С5Е залучені до стимуляції та/або приміювання дендритних клітин. 1-12 залучений до відповіді Тні. І -18 стимулює уб-Т-клітини. І--17 та ТМЕс виявляють прозапальну дію. І/-32 також виявляє прозапальну дію, сприяючи довготерміновим захисним імунним відповідям.

Згідно з одним варіантом втілення першого аспекту, композиція включає 1/-2 та 1-15.

Композиція може також включати ІІ -2 та І/-21. Альтернативно, композиція може включати 1-15 та І/-21. Хоча вже двох з цитокінів ІЇ/-2, /-15 та 1-21 може бути досить для одержання популяції клінічно релевантних лімфоцитів, в композиції краще використовують усі три цитокіни.

Згідно з додатковим варіантом втілення, композиція за першим аспектом має рідку форму.

Зокрема, композиція є середовищем клітинної культури. Згідно з винаходом, будь-яке відому середовище клітинної культури є можливим. Необмежувальними прикладами середовищ клітинних культур є синтетичне середовище, середовище, одержане із сироватки, плазми або цільної крові, або будь-яка їх комбінація.

Згідно з додатковим варіантом втілення, концентрація 1-2 в рідкій композиції має значення в діапазоні від 10 до 6000 МО/мл. Міжнародна одиниця (МО, 0) є стандартною мірою для кількості (ог) І--2. Вона визначається як здатність індукувати проліферацію клітин СТ -2.

Концентрація нижче 10 МО/мл є занадто низькою для досягнення скільки-небудь значного ефекту. Концентрація вище 6000 МО/мл може мати цитотоксичний ефект. Концентрація 1-2, краще, має значення в діапазоні від 500 до 2000 МО/мл. Ще краще, концентрація 1-2 має значення в діапазоні від 800 до 1100 МО/мл. Як показано у прикладах, оптимальні результатий були досягнуті при концентрації приблизно 1000 МО/мл.

Згідно з додатковим варіантом втілення першого аспекту, концентрація 1-15 має значення в діапазоні від 0,1 до 100 нг/мл. Діапазон концентрацій визначається за такими саме принципами, як ії для ІЇ/-2. Концентрація нижче 0,1 нг/мл вважається такою. що не має скільки-небудь значного ефекту на клітини. Концентрація вище 100 нг/мл може мати цитотоксичний ефект.

Краще, концентрація ІІ -15 має значення в діапазоні від 2 до 50 нг/мл, ще краще, в діапазоні від 5 до 20 нг/мл. Найкраща концентрація становить приблизно 10 нг/мл.

В додатковому варіанті втілення, концентрація ІІ -21 має значення в діапазоні від 0,1 нг/мл, краще, в діапазоні від 2 до 50 нг/мл, ще краще, в діапазоні від 5 до 20 нг/мл.

Слід розуміти, що, згідно з винаходом, будь-який з цих діапазонів концентрацій одного з цитокінів може бути скомбінованим з будь-яким з діапазонів концентрацій інших цитокінів.

Згідно з одним варіантом втілення, комбінація включає суміш 1-15 та І/-21. Суміш включає, краще, кожен з 1-15 та І/-21 в діапазоні значень від 10 до 100 нг/мл. 1-15 та І/-21 можуть забезпечувати синергічні ефекти, особливо, на підгрупи лімфоцитів в популяціях прекурсорів, пам'яті та ефекторів.

Згідно з одним варіантом втілення першого аспекту, комбінація включає ІІ -2 в концентрації від 800 до 1000 Мо/мл та 1І--15 і 11-21 в концентрації від 5 до 20 нг/мл. Згідно з іншим варіантом втілення, композиція включає ІЇ-2 в концентрації приблизно 1000 Мо/мл і 1І/-15 та 1-21 в концентрації приблизно 10 нг/мл.

Композиція 1-2, 1/-15 та ІС-21, зокрема, є корисною для промотування експансії клінічно релевантних лімфоцитів в композиції лімфоцитів, зокрема, в зразку від пацієнта. Як показано у прикладах, автори винаходу розробили спосіб одержання специфічних клінічно релевантних лімфоцитів із зразка від пацієнта.

Композиція 1-2, 1/-15 та ІС-21, зокрема, є корисною для промотування експансії клінічно релевантних лімфоцитів в композиції лімфоцитів, зокрема, у зразку від пацієнта. Як показано у прикладах, автори винаходу розробили спосіб, що зменшує частоту РО1 та ГАСЗаТ-клітин, у якому експресія РО1 та/або ГАЗ служить маркером г виснаження Т-клітин, а не маркером "навчених" антигеном Т-клітин.

Композиція 1-2, 1/-15 та ІС-21, зокрема, є корисною для промотування експансії клінічно релевантних лімфоцитів в композиції лімфоцитів, зокрема, в зразку від пацієнта. Як показано у прикладах, автори винаходу розробили спосіб, який підвищує частоту експресії 4-188 як маркер "навчених" антигеном Т-клітин.

Таким чином, згідно з другим аспектом, винахід передбачає спосіб одержання популяції клінічно релевантних лімфоцитів, який включає стадії: одержання зразка з організму ссавця, зокрема, зразка тканини або зразка рідини організму, бо що містить принаймні один лімфоцит та, необов'язково, виділення клітин в зразку з організму,

культивації зразка з організму іп міго для експансії та/або стимуляції лімфоцитів у зразку, причому культивація включає використання принаймні двох типів цитокінів, вибраних з ЇЇ -2, ЇЇ - 15 та 1ІС-21, і, необов'язково, визначення присутності клінічно релевантного лімфоцита у культивованому зразку.

Принаймні два типи цитокінів, вибраних з 1-2, ІЇ/-15 та І/-21, краще, використовують в концентраціях, визначених вище. краще, усі аїІ три цитокіни 1-2, 1-15 та І--21 використовують разом.

Як показано у прикладах, спосіб може бути використаний для генерування популяції пухлина-реактивних лімфоцитів, реактивних щодо аутоїмунної хвороби лімфоцитів або реактивних щодо інфекційної хвороби лімфоцитів. Краще, популяція лімфоцитів, згенерована способом за другим аспектом, є популяцією пухлина-реактивних лімфоцитів.

Лімфоцити загалом будуть включати різноманітні лімфоцити. Поміж цих лімфоцитів можуть бути присутні лімфоцити, які мають рецептор, необхідний для взаємодії з клінічно релевантним антигеном, зокрема, пухлина-асоційованим антигеном, антигеном, асоційованим з інфекційною хворобою або антигеном, асоційованим з аутоїмунною хворобою. За допомогою способу за винаходом, цей клінічно релевантний лімфоцит, зокрема, в сильному ступені піддають експансії. Однак, інші лімфоцити, які не мають специфічності до клінічно релевантного антигена, також піддають експансії у способі згідно з винаходом.

Таким чином, результат культивації клітин із зразка з організму з композицією, що містить І- 2, 1-15 та/або 1-21, приводить до утворення популяції лімфоцитів, яка включає популяцію клінічно релевантних лімфоцитів. Визначення присутності клінічно релевантних лімфоцитів у культивованому зразку є можливою, але не обов'язковою стадією способу згідно з другим аспектом винаходу. Стадії, придатні для перевірки популяції підданих експансії лімфоцитів, насправді можуть бути використані як терапевтичні.

Зразок з організму може бути взятий з будь-якої частиин тіла, що містить лімфоцити.

Прикладами зразків з організму є периферична кров, пуповинна кров, кістковий мозок, лімфатичні вузли, печінка() плевральний випіт, грудна клітина, черевна порожнина, синовіальна рідина, очеревина, ретроперитонеальний простір, вилочкова залоза та пухлина.

Зразок лімфоцитів, виділений з пухлини, також називається інфільтруючими пухлину

Зо лімфоцитами (ТІМ). "ТІ", у використовуваному в даному документі значенні, є скороченням від "Інфільтруючі пухлину лімфоцити" (Шштог іп'кгаєйпуд Іутрпосуїе5). ТІ є будь-яким видом лімфоцитів, які розташовані в, на або навколо пухлини. ТІЇ є будь-яким видом лімфоцитів, розташованих в та навколо пухлини.

Через свою локалізацію в пухлині, ТІЇ. можуть мати "навчені" пухлина-асоційовані антигени.

Відповідно, клінічно релевантні лімфоцити, зокрема, пухлина-реактивні лімфоцити, можуть бути піддані експансії з використанням способу за винаходом без експансії антигена.

Зразок з периферичної крові також називається мононуклеарними клітинами периферичної крові (МНКПК). В залежності від типу хвороби, кращими можуть бути різні зразки з організму.

У використовуваному в даному документі значенні, термін "ссавець" стосується будь-якого ссавця, включаючи, без обмежень, ссавців з ряду гризунів, таких як миші та хом'ячки, та ссавців з ряду зайцеподібних, таких як кролики. Краще, ссавці належать до ряду хижих, включаючи котячих (кішок) та собачих (собак). Ще краще, ссавці належать до ряду парнокопитих, включаючи бичачих (велика рогата худоба) та свиней (свині) або до ряду непарнокопитих, включаючи конячих (коні). Найкраще, ссавці належать до ряду приматів, широконосих мавп, або вузьконосих мавп (мартишки) або до ряду людиноподьібних (люді та людиноподібні мавпи).

Особливо краще, ссавець є людиною.

Згідно з одним варіантом втілення другого аспекту, ссавець від якого отримують зразок з організму, є людиною. Ссавець може мати онкологічну хворобу, або мати ризик розвитку онкологічної хвороби. Ризик розвитку онкологічної хвороби включає високий ризик, помірний ризик та низький ризик. Ссавець в такому передпухлинному стані, наприклад, має передпухлинне ушкодження, яке є морфологічно атиповою тканиною, яка виглядає аномальною при мікроскопічних дослідженнях, та у якій виникнення раку є більш імовірним, ніж в її очевидно нормальному аналозі.

Крім того, ссавець може мати інфекційну хворобу або мати ризик розвитку інфекційної хвороби. Ризик розвитку інфекційної хвороби включає високий ризик, помірний ризик та низький ризик. Ссавець може також мати аутоїмунну хворобу або мати ризик розвитку аутоімунної хвороби. Ризик розвитку аутоімунної хвороби включає високий ризик, помірний ризик та низький ризик. Наприклад, високий ризик розвитку внутрішньоклітинних інфекцій (цитомегаловірус (СММ), вірус Епштейна-Барр (ЕВУМ), туберкульоз (ТВ), папіломавірус людини (НРМ)) (існує) при бо певних генетичних мутаціях у хазяїна (дефекти рецептора ІЄМу, або набуті антитіла, спрямовані проти цитокінів, наприклад, І/-12 або ІБМУу) Проміжним ризиком буде імуносупресія з використанням кортикостероїдів або лікування пацієнтів з використанням реагентів, спрямованих проти ТМЕа (фактор некрозу пухлини с) або рецептора ТМЕа. Низький ризик може бути коінфекція іншими патогенами або тимчасове зниження імунокомпетентності під час "великої" операції. Аналогічними прикладами є різні клінічні прояви - у поєднанні з генетичними маркерами - розсіяного склерозу, рідких неврологічних хвороб, наприклад, нарколепгсії, ревматоїдного артриту, а також хронічних аутоїмунних хвороб, асоційованих із шлунково- кишковою системою.

Якщо ссавець має онкологічну хворобу або має високий ризик розвитку онкологічної хвороби, кращим зразок з організму є периферична кров або сама пухлина. Як показано у прикладах, лімфоцити з периферичної (крові) та пухлини можуть бути оброблені у спосіб за винаходом для розвинення сильних протипухлинних властивостей. Якщо хвороба є аутоїмунною хворобою, кращим зразком з організму є периферична кров. Крім того, коли хвороба є інфекційною хворобою, кращим зразком з організму є також периферична кров. Як показано у прикладах, клінічно релевантні лімфоцити можуть бути піддані експансії з периферичної крові в цих випадках. Без обмеження теорією, вважається, що периферична кров містить лімфоцити, які перебували в контакті з клінічно релевантним антигеном, наприклад, у пухлині або при інфекції.

Культивація зразка з організму іп міго для експансії та/"або стимулювання лімфоцитів може включати одну чи декілька підстадій. Відповідно, в одному варіанті втілення, іп міго культивація включає першу стадію експансії, яка включає інкубацію в культуральному середовищі, що містить ІІ--2, І -15 та 1-21, поки лімфоцити не стануть детектованими. "Детектовані", згідно з винаходом, означає, що лімфоцити, наприклад, стають видимими, зокрема, шляхом мікроскопії. Лімфоцити звичайно стають детектованими з використанням стандартно світлової мікроскопії після досягнення концентрації 5х103 клітин/мл.

Детектування лімфоцитів може включати будь-який спосіб, відомий фахівцям, який є придатним для детектування присутності лімфоцитів вище певного порогового значення. Метою першої стадії експансії є м'яке індукування проліферації клітин разом зі стимуляцією клітини цитокіновим коктейлем.

Час інкубації першої стадії експансії має значення в діапазоні від б годин до 180 днів.

Великий діапазон часів інкубації, насамперед, пояснюється тим, що зразки від різних донорів можуть поводитися дуже по-різному. Також було показано, що лімфоцити з різних зразків з організму мають дуже різні швидкості росту. Наприклад, лімфоцити, одержані безпосередньо з пухлини гліобластоми або раку підшлункової залози ростуть дуже по-різному. Лімфоцити, одержані з раку підшлункової залози, стають детектованими вже через два-п'ять днів.

Лімфоцити, одержані з гліобластоми, детектуються лише через один-два тижня. Відповідно, лімфоцити з інших зразків з організму можуть потребувати ще більшого часу, щоб стати детектованими.

Краще, час інкубації першої стадії експансії має значення в діапазоні від 4 днів до 10 днів.

Було показано, що для клітин периферичної крові час інкубації близько 7 днів є особливо корисним з погляду результату іншої (оїпег) експансії. Однак, як згадувалося вище, в залежності від зразка, експансія протягом усього лише 4 днів може бути достатньою, або, з іншого боку, приблизно 10 днів чи більше можуть бути потрібними. На підставі гарних результатів, одержаних для МНКПК у прикладах, час інкубації в діапазоні від 6 до 8 днів, зокрема, близько семі днів, є кращим.

Згідно з одним варіантом втілення винаходу, культуральне середовище першої стадії експансії включає принаймні один антиген для проведення експансії. Антиген для проведення експансії є відомим клінічно релевантним антигеном або його фрагментом, мутантом або варіантом. У використовуваному в даному документі значенні, "мутант" визначається як амінокислотна послідовність, що відрізняється від референсної послідовності інсерцією, делецією або заміщенням принаймні однієї амінокислоти. Антиген для проведення експансії, краще, вибраний з ТАА, РАА та аутоантигена.

Краще, спосіб згідно з винаходом включає численні копії антигена для проведення експансії.

Підвищене число копій антигена для проведення експансії приводить до підвищеної швидкості експансії клінічно релевантного лімфоцита, зокрема, Т-клітин.

В одному варіанті втілення винаходу, культуральне середовище першої стадії експансії включає численні антигени для проведення експансії. Краще, численні антигени для проведення експансії включають відомий клінічно релевантний антиген та один чи декілька мутантів клінічно релевантного антигена. Замість самого антигена, можуть бути мутовані також бо (молекула) МНС класу І/пептид, що презентує антиген, зокрема, пептид. Використання одного чи декількох дикого типу, варіантів або мутантів клінічно релевантного антигена або молекул

МНС класу І як антигенів для проведення експансії приводить до одержання набору різноманітних лімфоцитів, зокрема, Т-клітин, реактивних по відношенню до номінально клінічно релевантного антигена.

Згідно з кращим варіантом втілення способу згідно з другим аспектом, зразок з організму є пухлиною і при культивації не використовується жодного антигена для проведення експансії.

Пухлинну тканину, краще, промивають двічі перед виділенням клітин зі зразка пухлини.

В іншому кращому варіанті втілення винаходу, культуральне середовище першої стадії експансії включає численні антигени для проведення експансії. Завдяки наявності численних антигенів, Т-клітини продукту реагують на більш різноманітний репертуар Т-клітинних рецепторів, на що вказує використання (рецептора) МВ, асоційоване із застосуванням стимулюючого антигена (антигенів).

В іншому кращому варіанті втілення винаходу, культуральне середовище першої стадії експансії включає численні антигени для проведення експансії. Стимуляція Т-клітин з периферичної крові приводить до одержання Т-клітин, які розпізнають різноманітні епітопи, як було визначено (за допомогою аналізів) цитотоксичності (суїохісйу). Коли наївні Т-клітини брали з крові та стимулювали такими антигенами, це приводило до розпізнавання ними різноманітних епітопів антигена.

Це відрізняється від попередньо стимульованих Т-клітин або Т-клітин з пухлини, які мають схильність розпізнавати більш обмежене число або стандартне число епітопів.

Вибір антигена для проведення експансії залежить від хвороби, яку треба лікувати. Зокрема, якщок піддана експансії популяція клінічно релевантних лімфоцитів має використовуватися проти онкологічних хвороб, антигеном для проведення експансії, який додають на першій стадії експансії, краще, є ТАА. Альтернативно, якщо хвороба, яку треба лікувати, є інфекційною хворобою, антигеном для проведення експансії, який додають на на першій стадії експансії, є

РАА. Крім того, якщо популяція клінічно релевантних лімфоцитів має бути використана для лікування аутоімунної хвороби, антигеном для проведення експансії, краще, є аутоантиген.

Вважається, що антиген для проведення експансії на першій стадії експансії приводить до стимуляції клінічно релевантних лімфоцитів у суміші клітин вже на ранній стадії і таким чином

Зо разом із цитокіновим коктейлем підсилює експансію клінічно релевантних лімфоцитів. Така стимуляція також називається антигенною активацією або антигенним редагуванням.

За першою стадією експансії може йти друга стадія експансії, на якій клітини інкубують із живильними клітинами та/або антитілом проти СОЗ на додаток до принаймні двох типів цитокінів, вибраних з ЇЇ -2, ІІ -15 та ІІ -21. Експансія із живильними клітинами та антитілом проти

СОЗ була описана у відомому рівні техніки. Вважається, що живильні клітини приводять до поліпшення росту клітин. Живильні клітини є опроміненими клітинами, які не проліферують або проліферують лише в незначному ступені. Живильні клітини збільшують число клітинних контактів у культурі та додатково живлять клітинну культуру, яка проліферує та розмножузться.

Живильньі клітини, краще, є опроміненими МНКПК. Алогенні (клітини-)фідери походять з організму, відмінного від ссавця, якого будуть лікувати підданими експансії клінічно релевантними лімфоцитами. Аутологічні живильні клітини походять від ссавця, якого треба лікувати.

Антитіло проти СОЗ, краще, є антитілом, визначеним як ОКТ3. ОКТЗ є мишачим моноклональним антитілом, що належить до ізотипу імуноглобуліну Їд)2а. Мішень ОКТЗ, СОЗ, є мультимолекулярним комплексом, присутнім лише в зрілих Т-клітинах. Взаємодія між Т- клітинами, ОКТЗ та моноцитами спричинює іп міго активацію Т-клітин.

Краще, живильні клітини використовують в комбінації з СОЗ та цитокінами ІІ -2, ІІ -15 та І - 21. Відповідно до одного варіанта втілення способу згідно з другим аспектом, співвідношення живильних клітин до лімфоцитів має значення в діапазоні від 1:1 до 1:100. Краще, співвідношення (Пе гайоп) живильних клітин до лімфоцитів має значення в діапазоні від 1:2 до 1:50. Як показано у прикладах, дуже низькі співвідношення живильних клітин є достатніми для сильної експансії клінічно релевантних лімфоцитів, зокрема, клінічно релевантних Т-клітин.

У прикладах, співвідношення 1:10 є достатнім для підтримування росту та експансії лімфоцитів. Відповідно, вважається, що величина в діапазоні від 1:5 до 1:20 не буде приводити до відмінного результату. Низьке число живильних клітин має принаймні дві переваги. По- перше, зменшується кількість відволікаючих клітинних сигналів, що дозволяє одержати більш однорідні та надійні результати експансії. По-друге, менша кількість живильних клітин приводить до меншої кількості екзогенного матеріалу в продукті для імунотерапії, одержаному цим способом, тобто, в популяції клінічно релевантних лімфоцитів. 60 Друга стадія експансії, необов'язково, також включає антиген для проведення експансії в культуральному середовищі. Краще, ніякі клінічно релевантні антиген або фрагмент не додаються до середовища другої стадії експансії.

Згідно з кращим варіантом втілення другого аспекту винаходу, спосіб включає стадію перефокусування. Стадія перефокусування включає культивацію в культуральному середовищі, що містить клітини для проведення перефокусування. Клітини для проведення перефокусування є клітинами ссавця, від якого одержують зразок з організму, зокрема, людини.

Відповідно, клітини для проведення перефокусування є аутологічними клітинами, які буули оброблені принаймні одним антигеном для проведення перефокусування. Будь-який антиген для проведення експансії, як визначено в даному документі, може бути також використаний як антиген для проведення перефокусування. Краще, у способі один чи декілька антигенів для проведення перефокусування є ідентичними з одним чи декількома антигенами для проведення експансії.

Клітини для проведення перефокусування є клітинами, які були інкубовані з антигеном для проведення перефокусування протягом принаймні 30 хвилин чи більше, наприклад, принаймні однієї години, принаймні двох годин, принаймні п'яти годин, або принаймні дсяти годин. Після інкубації з (клітинами) для проведення перефокусування, клітини для проведення перефокусування опромінюють дозою принаймні 40 Гр. Краще, клітини опромінюють дозою принаймні 45 Гр чи більше, приклад, принаймні 50 Гр, особливо краще, з інтенсивністю 55 Гр.

Завдяки цій обробці, антиген-специфічні Т-клітини більш ефективно піддають експансії, розпізнають пухлину, патогени або аутоїмунні клітини і можуть забезпечувати захист проти ракових клітин або передпухлинних уражень.

Час стадії перефокусування має значення в діапазоні від 1 до 6 днів, краще, від 1 до З днів.

Хоча стадія перефокусування може бути досить короткою, вона приводить до значного поліпшення виходу підданих експансії клінічно релевантних лімфоцитів, зокрема, для клінічно релевантних лімфоцитів, підданих експансії з периферичної крові.

Також, число клітин для проведення перефокусування у порівнянні з числом лімфоцитів є досить низьким. Зокрема, співвідношення клітин для проведення перефокусування до лімфоцитів має значення в діапазоні від 1:1 до 1:100. Було знайдено, що найкращі результати досягаються, якщо стадію перефокусування проводять одразу після першої стадії експансії, та після неї проводять другу стадію експансії. Послідовність стадій культивації є, зокрема, корисною для генерування популяції клінічно релевантних лімфоцитів, зокрема, Т-клітин.

Згідно з одним варіантом втілення способу, перша стадія експансії включає додавання ЇЇ -2,

І--15 та 1-21 одночасно до клітинної культури. Для цього, можна приготувати суміш 1-2, 1-15 та І--21 та додати її до середовища клітинної культури, або ІІ --2, ІІ -15 та І--21 додають окремо, але одночасно, до середовища клітинної культури. Як показано у прикладах, одночасне додавання 1-2, ІЇ/-15 та 11-21 приводить до кращої композиції лімфоцитів у популяції лімфоцитів, підданих експансії.

Для зміни складу композиції підданої експансії популяції лімфоцитів можна у способі за винаходом додати спочатку тільки Ї/-21 до середовища клітинної культури на першій стадії експансії. Після додавання 1-21, 1-15 та 1/-2 можуть бути додані одночасно або послідовно.

Краще, 1-15 додають другим і 1-2 додають останнім. В альтернативному варіанті втілення, ІЇ-- 15 додають як перший цитокін, з подальшим одночасним додаванням 1-2 та 1-21 або послідовним додаванням 1//-2 та 1-21. Наприклад, І/-21 додають другим і І/-2 додають останнім.

Культуральне середовище першої та/або другої стадії експансії може включати принаймні один антиген для проведення експансії. Антиген для проведення експансії може, наприклад, бути фрагментом відомого ТАА. Можливими ТАА для використання як антигени для проведення експансії є, наприклад, ММ-ЕБО-1, пухлинний антиген тирозиназа, тирозиназа-асоційований білок (ТКР)-1, ТАР-2, МЕСЕВ-2, та член сімейства білків МАСЕ, теломераза, р53, НЕК2/пеи, мезотелін, карциноембріональний (антиген), сурвівін, ЕСЕЕМІИЇ, МЕСЕ, антиген САМРАТН 1,

СбОр22, СА-125, муцин-1, альфа-1-фетопротеїн (дефоргоїеіп), РОМА.

Фрагмент ТАА є, зокрема, пептидом. Такий пептид може бути, наприклад, пептидом, що містить принаймні вісім послідовних амінокислот амінокислотної послідовності, яка є принаймні на 80 95 ідентичною з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 6,

ЗЕО ІЮО МО: 7.

ЗЕБЕО ІО МО: 4 є амінокислотною послідовністю відомого пухлина-асоційованого антигена

МУ-Е5БО-1. 5ЕО ІЮО МО: 5 є амінокислотною послідовністю відомого пухлина-асоційованого антигена сурвівіну. 5ЕБЕО 10 МО: б є амінокислотною послідовністю відомого пухлина- асоційованого антигена мезотеліну. 5ЕО ІО МО: 7 є амінокислотною послідовністю пухлина- бо асоційованого антигена ЕСЕЕМІЇ.

Антиген для проведення експансії може, наприклад, бути фрагментом відомого РАА.

Можливими РАА для використання як антигени для проведення експансії є, наприклад,

СММУррб5 або ЕВМ (ЕВМА-3, ЕВМА-1), НРМУ-16/33 Еб, Е7 або 11. Фрагмент РАА є, зокрема, пептидом. Такий пептид може бути, наприклад, пептидом, що містить принаймні вісім послідовних амінокислот амінокислотної послідовності, яка є принаймні на 80 95 ідентичною з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9, 5ЕО ІЮО МО: 10, або 5ЕО ІЮ МО: 11, які є амінокислотними послідовнями відомих патоген-асоційованих антигенів СММррб5, ЕВМА-З,

ЕВМА-1 та НРУ-І1, відповідно.

Антиген для проведення експансії може, наприклад, бути фрагментом відомого РАА.

Можливими аутоантигенами для використання як антигени для проведення експансії є, наприклад, РКОМ2, ОСНІЗ, ІМО8ОЕ, 51 С12А6 та рілін (гееїїп). Фрагмент РАА є, зокрема, пептидом. Такий пептид може бути, наприклад, пептидом, що містить принаймні вісім послідовних амінокислот амінокислотної послідовності, яка є принаймні на 80 95 ідентичною амінокислотній послідовності зЗЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІЮО МО: 13, 5ЕО ІЮ МО: 14, або 5ЕО ІО МО: 15, які є амінокислотними послідовностями аутоантигенів РКОМ2, ІМО8ОЕ, СНІ З та ОМазевВ, відповідно.

Додаткові компоненти, такі як додаткові цитокіни, можуть бути додані під час стадії культивації, зокрема, на першій або другій стадіях експансії або стадії перефокусування.

Крім того, промоторна сполука може бути додана на стадії культивації, зокрема, на першій або другій стадіях експансії або на стадії перефокусування. Краще, промоторну сполуку додають на першій стадії експансії. Промоторна сполука, у використовуваному в даному документі значенні, є сполукою, яка в процесі експансії спричинює збільшення специфічної підгрупи лімфоцитів. Кращою промоторною сполукою є золедронова кислота. Золедронова кислота промотує експансію гамма-дельта Т-клітин. Додатковою кращою промоторною сполукою є (така, що) промотує експансію В-клітин.

Згідно з одним варіантом втілення, на стадії культивації, зокрема, на першій або другій стадіях експансії або на стадії перефокусування, додають ко-стимулюючу сполуку. Ко- стимулююча сполука є, наприклад, лігандом СО28, що медіює Т-клітинні сигнали. Приклади лігандів СЮО28, що медіюють Т-клітинні сигнали, є члени суперсімейства В7, зокрема В7-1

Зо (СсО80) та В7-2 (СО86).

Відповідно до одного варіанта втілення способу згідно з другим аспектом, тестування присутності клінічно релевантних лімфоцитів у підданому експансії зразку лімфоцитів включає використання антигенів для проведення оцінки.

Для тестування, популяцію лімфоцитів інкубують з антигенами для проведення оцінки.

Антиген для проведення оцінки може бути антигеном, який відповідає визначенню антигена для проведення експансії. Наприклад, відомий клінічно релевантний антиген або його фрагмент додають як антиген для проведення оцінки до культурального середовища популяції лімфоцитів для стимулювання лімфоцитів. Після періоду інкубації вимірюють параметр, , який показує активацію клінічно релевантних лімфоцитів.

Краще, антиген для проведення оцінки додають до лімфоцитів у формі, зв'язанів з комплексом МНС І. Наприклад, антигени для проведення оцінки можуть бути презентовані лімфоцитам зв'язаними з декстрамерами МНС. Декстрамери МНС є флуоресцентно міченими мультимерами МНС, зв'язаними з декстрозним основним ланцюгом.

Використання мультимерних стуктур МНС має ту перевагу, що численні копії антигена можуть бути презентовані одному лімфоциту, тим самим підвищуючи стимуляцію (5ітшиакоп) антигеном для проведення оцінки. Альтернативно, відомі клінічно релевантні антигени можуть бути презентовані культивованому зразку як антигени для проведення оцінки у формі клітин, що експресують клінічно релевантний антиген як трансген. Додатково, можна додавати принаймні частково генетично підібрані алогенні клітини, які презентують клінічно релевантні антигени на клітинній поверхні підданим експансії лімфоцитам.

Параметром, який показує присутність клінічно релевантних лімфоцитів, може бути, наприклад, продукування одного чи декількох цитокінів, зокрема, ІЕМ-у, або продукування ТМЕа.

Додатковими параметрами, що показують присутність клінічно релевантних лімфоцитів, є підвищена проліферація клітин, підвищена цитотоксичність, підвищена клітинна сигналізація та/або внутрішньоклітинне фосфорилювання. Визначення цих параметрів є відомим фахівцям та пояснюється у прикладах.

Краще, на додаток до використання антигенів для проведення оцінки, виділених з відомих клінічно релевантних антигенів, можна також проводити тестування на клінічно релевантні лімфоцити, специфічні для ссавця, якого треба лікувати. Для цього клітини, зокрема, пухлинні 60 клітини, одержані від того ж самого ссавця, що й піддані експансії лімфоцити, використовують для презентування антигенів для проведення оцінки. Використання таких аутологічних клітин для презентації антигенів при проведенні оцінки дозволяє перевірити присутність клінічно релевантних лімфоцитів, специфічних до клінічно релевантних антигенів, які не обов'язково є відомими клінічно релевантними антигенами.

В одному варіанті втілення згідно з другим аспектом винаходу, антигени для проведення оцінки, які проезентують культивованому зразку, мають форму, вибрану з клітин, зокрема, пухлинних клітин, одержаних від того ж самого ссавця, що й культивований зразок (аутологічні клітини), які принаймні частково генетично відповідають алогенним клітинам, зокрема, пухлинним клітинам, або клітинам, що експресують клінічно релевантні антигени як трансген.

Згідно з додатковим варіантом втілення, спосіб тестування присутності клінічно релевантних лімфоцитів включає введення в контакт лімфоцитів з принаймні одним антигеном для проведення оцінки та визначення зміни будь-чого одного з продукування цитокінів, зокрема,

ІРМ-у, або продукування ТМЕа, проліферації клітин, цитотоксичності, сигналізації та/або внутрішньоклітинного фосфорилювання.

Тестування цих параметрів може бути скомбіноване з протоковою цитометрією та сортуванням клітин. Відповідно, можна також виділити популяцію клінічно релевантних лімфоцитів, зокрема, популяцію пухлина-реактивних лімфоцитів з підданої експансії популяції лімфоцитів. Виділена популяція клінічно релевантних лімфоцитів може додатково культивуватися або бути безпосередньо використаною для імунотерапії.

Спосіб за другим аспектом винаходу приводить до утворення популяції лімфоцитів, яка включає популяцію клінічно релевантних лімфоцитів. Клінічно релевантні лімфоцити у складі підданої експансії популяції лімфоцитів можуть бути будь-яким типом лімфоцитів.

Лімфоцити включають В-клітини, природні клітини-вбивці та Т-клітини. Згідно з одним варіантом втілення, клінічно релевантний лімфоцит є В-клітиною. Згідно з одним варіантом втілення, клінічно релевантний лімфоцит є природною клітиною-вбивцею.

Згідно з третім аспектом, винахід передбачає клінічно релевантні лімфоцити, одержані способом згідно з другим аспектом, у якому клінічно релевантний лімфоцит є Т-клітиною, природною клітиною-вбивцею або В-клітиною.

Т-клітина, краще, вибрана з хелперної Т-клітини (Тн-клітини або СО4--Т-клітини), зокрема,

Зо Тні-клітини, цитотоксичної Т-клітини (То-клітини або СО8Т-клітини), зокрема, СО8-СХОСВЗ3-т- клітини, Т-клітини пам'яті, зокрема, Т-клітини центральної пам'яті (Тсм-клітини), Т-клітини пам'яті стовбурових клітин (Тесм-клітини) або клітини периферичної пам'яті (Трм-клітини), гамма-дельта

Т-клітини (уб-Т-клітини), природної Т-клітини-вбивці, інваріантної Т-клітини слизової оболонки (МАТ), подвійно негативної Т-клітини (СО3-504-208-Т-клітини).

Згідно з одним варіантом втілення, клінічно релевантний лімфоцит є лімфоцитом, який експресує молекули, що сприяють проникненню в тканини, зокрема, пухлину або інфіковану або запалену тканину (наприклад, СХСКЗ). Згідно з додатковим варіантом втілення, клінічно релевантний лімфоцит є лімфоцитом, який є збагаченим маркерами будь-якої довготермінової пам'яті, зокрема, СО117 та с-Кії та цитолітичних імунних клітинних відповідей, зокрема, СО107а.

Як було пояснено, піддана експансії популяція лімфоцитів не лише містить клінічно релевантні лімфоцити, але також і інші лімфоцити, які не розпізнають клінічно релевантні антигени.

Вважається, що клінічно релевантні та інші лімфоцити в культурі, одержаній способом згідно з другим аспектом, беруть участь в терапевтичному ефекті. Згідно з одним варіантом втілення третього аспекту, винахід стосується лімфоцита, одержаного способом згідно з другим аспектом, який експресує молекули та цитокіни, що промотують утворення комбінації лімфоцитів, придатної для медичного застосування, включаючи імунотерапію. Комбінація лімфоцитів, придатних для медичного застосування, краще, включає прекурсори Т-клітин, клітини Тсм, Тесм та/або Тем.

Згідно з одним варіантом втілення, лімфоцит, одержаний способом згідно з другим аспектом, експресує молекули та цитокіни, що промотують експансію клінічно релевантних лімфоцитів. Згідно з додатковим варіантом втілення, лімфоцит, одержаний способом згідно з другим аспектом, продукує цитокіни, вибрані з ІЄМ-у, ТМЕ-а, І--2, 11-17 та будь-якої їх комбінації.

Згідно з одним варіантом втілення, лімфоцит є СОЗ3-С04-С08-Т-клітиною.

Згідно з четвертим аспектом, даний винахід передбачає популяцію лімфоцитів, одержаних відповідно до другого аспекту винаходу, яка включає популяцію клінічно релевантних лімфоцитів.

Популяція лімфоцитів може складатися з популяції клінічно релевантних лімфоцитів.

Популяція клінічно релевантних лімфоцитів може бути моноклональною, олігоклональною або поліклональною. бо В одному варіанті втілення, популяція клінічно релевантних лімфоцитів є поліклональною та відповідає на численні антигени або на різні епітопи одного й того самого антигена. Краще, популяція клінічно релевантних лімфоцитів відповідає на різни антигени.

Лімфоцити, зокрема, Т-клітини, що відповідають на численні антигени, можуть запобігати ризику рецидиву передпухлинних клітин, пухлинних клітин та патогенів, тим самим знижуючи ризик ухиляння від імунної відповіді.

Популяція лімфоцитів згідно з четвертим аспектом складається з лімфоцитів різних фенотипів, зокрема, фенотипів Т-клітин, які є корисними для імунотерапії.

Популяція лімфоцитів має низький процентний вміст регуляторних Т-клітин. Регуляторні Т- клітини, як відомо, пригнічують терапевтичну функцію популяції лімфоцитів. Згідно 3 одним варіантом втілення четвертого аспекту, процентна частка Тео в популяції лімфоцитів, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає менше 5 95, краще, менше З 95.

Крім того, більшість Тн-клітин в популяції лімфоцитів має фенотип Тні. Згідно з одним варіантом втілення винаходу, процентна частка Тні клітин, обчислена від загальної кількості Тн клітин, складає принаймні 10 95, краще, принаймні 50 9о, ще краще, принаймні 70 Об.

В популяції лімфоцитів, процентн частка цитотоксичних СО8«ЖТ-клітин є підвищеною, про що свідчить підвищена процентна частка СХСКЗ- клітин. Згідно з одним варіантом втілення винаходу, процентна частка СХСКЗ- клітин, обчислена від загальної кількості СО8--Т-клітин, складає принаймні 10 95, принаймні 50 9о, ще краще, принаймні 70 95.

На додаток, популяція лімфоцитів може включати підвищену кількість Т-клітин, які недавно контактували зі своїм антигеном, наприклад, ідентифікованих за фенотипом 4-1ВВ. Згідно з одним варіантом втілення четвертого аспекту, процентна частка 4-188В Т-клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 195, краще, принаймні 295, ще краще, принаймні 2,595. Згідно з одним варіантом втілення, процентна частка СО107-- клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще, принаймні 2 95, ще краще, принаймні 2,595. СО117-Т-клітини були асоційовані з популяцією довготермінової пам'яті.

Фенотип СХОСКЗ-СО8-Т-клітин додатково асоційований з інвазивністю в тканини і, таким чином, можливо, зокрема, є корисним для імунотерапії раку. Додатково, популяція лімфоцитів може включати достатню процентну частку СО3-С04-С20О8- клітин. Ці подвійно негативні Т-

Зо клітини є високоспецифічними до антигена-мішені, оскільки вони є залежними від ко-рецептора срач або СОв8-- та продукують запальні цитокіни. Таким чином, вони є цитотоксичними.

Згідно з одним варіантом втілення, популяція лімфоцитів включає процентну частку

Со3-0204-С208- клітин, обчислену від загальної кількості Т-клітин, що складає принаймні 1 95, краще, принаймні З 95, ще краще, принаймні 5 95. Згідно з додатковим варіантом втілення, процентна частка гамма-дельта Т-клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, в популяції лімфоцитів складає принаймні 1 95, краще, принаймні З 96, ще краще, принаймні 5 95. Гамма- дельта Т-клітини забезпечують ефект розпізнавання піддані стресу клітини, трансформовані клітини, інфіковані клітини, наприклад, СММ- клітини-мішені. Гамма-дельта Т-клітини перехресно розпізнають також вірусно (мігаіІзу) та трансформовані клітини.

Згідно з одним варіантом втілення, популяція лімфоцитів має такі ознаки: - процентна частка Тед, обчислена від загальної кількості Т клітин, складає менше 5 95, краще, менше 3 965; - процентна частка Тні-клітин, обчислена від загальної кількості Тн-клітин, складає принаймні 50 9о, краще, принаймні 70 95, ще краще, принаймні 80 95, - процентна частка СХСРЗЖТ-клітин, обчислена від загальної кількості СО8-Т-клітин, складає принаймні 50 9о, краще, принаймні 70 95, ще краще, принаймні 80 95, - процентна частка 4-188--Т-клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще, принаймні 2 95, ще краще, принаймні 2,5 95, - процентна частка СО117Т-клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще, принаймні 2 95, ще краще, принаймні 2,5 95, - процентна частка СОЗ3-СО04-СО8- клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще, принаймні З 95, ще краще, принаймні 5 905; і - процентна частка убТ-клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 до, краще, принаймні З 95, ще краще, принаймні 5 95.

Згідно з одним варіантом втілення, в популяції лімфоцитів, процентна частка прекурсорів Т- клітин (СО45КАЖССК7 хх), обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще, принаймні 2 95, ще краще, принаймні З 95. Т-клітини центральної пам'яті, як вже було показано, пов'язані з успіхом терапії Т-клітинами.

Клітини центральної пам'яті продукують декілька цитокінів, корисних для терапії, 60 забезпечують гарну відповідь пам'яті. Однак, клітини центральної пам'яті нездатні добре інфільтровуватися в тканину. В одному варіанті втілення, процентна частка периферичних клітин пам'яті (СО45ВА-ССІ7-), обчислена від загальної кількості Т-клітини, складає принаймні 295, краще, принаймні 595, ще краще, принаймні 1095. Периферичні клітини пам'яті демонструють високе продукування цитокінів та гарно інфільтруються в тканину. Таким чином, ці клітини є, зокрема, корисними для імунотерапії раку.

Також термінально диференційовані Т-клітини (СО45КАн-ССК7-) є здатними заходоти в тканину. Крім того, ці клітини демонструють продукування терапевтично корисних цитокінів.

Згідно з одним варіантом втілення, процентна частка ефекторних Т-клітин (СО45КА-ССВІ-), обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще, принаймні З 95, ще краще, принаймні 5 95. Процентна частка прекурсорів Т-клітин (СО45КАНССЕ7), обчислена від загальної кількості Т-клітин, може становити принаймні 1 95. Краще, процентна частка складає принаймні 295, ще краще, принаймні З 95. Прекурсори Т-клітин демонструють лише продукування цитокінів і майже не заходять в тканину. Однак, ці клітини можуть бути перетворені на Т-клітини з пожиттєвим ефектом пам'яті.

Популяція лімфоцитів згідно з п'ятим аспектом може бути додатково охарактеризована внутрішньоклітинним продукуванням цитокінів після стимуляції антигеном для проведення оцінки, величина якого принаймні удвічі перевищує стандартний відхил (у досліді) без стимуляції антигеном для проведення оцінки. Крім того, стимуляція антигеном для проведення оцінки приводить до значення індукції СО107а, яке принаймні удвічі перевищує стандартний відхил (у досліді) без стимуляції антигеном для проведення оцінки.

Завдяки цим параметрам, популяція лімфоцитів та/або популяція клінічно релевантних лімфоцитів є корисними продуктами для імунотерапії для лікування раків, інфекційних хвороб та аутоїмунних хвороб.

Згідно з п'ятим аспектом, винахід передбачає імунотерапію для лікування або профілактики онкологічної хвороби, інфекційної хвороби або аутоімунної хвороби у ссавця, яка включає стадії генерування популяції клінічно релевантних лімфоцитів згідно з другим аспектом винаходу, у якому зразок з організму одержують від зазначеного ссавця, та введення популяції клінічно релевантних лімфоцитів зазначеному ссавцю. Інфекційна хвороба може бути будь-якою відомою інфекційною хворобою, пов'язаною з будь-яким відомим патогеном.

Ко) Онкологічна хвороба згідно з винаходом може бути будь-яким раком, включаючи будь-який з гострого лімфоцитарного раку, гострого мієлоїдного лейкозу, альвеолярної рабдоміосаркоми, раку кісток, раку головного мозку, раку молочної залози, раку анального отвору, анального каналу або аноректального раку, раку ока, раку внутрішньопечінкових жовчних протоків, раку суглобів, раку шиї, сечового міхура або плеври, раку носу, назальної порожнини або середнього вуха, раку вульви, хронічного лімфолейкозу, хронічного мієлоїдного раку, раку, шийки матки, гліоми, лімфоми Ходжкіна, раку гіпофаринксу, раку нирки, раку гортані, раку печінки, раку легені, злоякісної мезотеліоми, меланоми, множинної мієломи, раку носоглотки, неходжкінської лімфоми, раку яєчників, очеревини, сальника, раку брижі, раку підшлункової залози, раку глотки, раку простати, ректального раку, раку нирки, раку шкіри, раку м'якої тканини, раку яєчка, раку щитоподібної залози, раку сечоводу, раку сечового пухира та раку травного тракту, такого як, наприклад, езофагеальний рак, рак шлунку, рак підшлункової залози, рак шлунку, рак малої кишки, шлунково-кишкова карциноїдна пухлина, рак ротової порожнини, рак ободової кишки та гепатобіліаотний рак. Краще, раки є гліобластомою та раком підшлункової залози.

З метою уникнення імунних ефектів проти клінічно релевантних лімфоцитів, ракові пацієнти можуть бути "кондиціоновані" перед введенням Т-клітин. Кондиціонування має три мети. Перша полягає в забезпеченні більшого простору для популяції лімфоцитів, яку вводять інфузією, друга - у видаленні небажаних ефекторів, і третя - в збільшенні продукування факторів росту, які можуть сприяти швидкій експансії та виживанню Т-клітин, тобто, продукуванню аутологічних

І--7 та ІС-15.

Клінічно релевантні лімфоцити можуть бути змішані з фармацевтично прийнятним носієм для утворення фармацевтичної композиції, яка також входить до обсягу даного винаходу. В одному варіанті втілення, клінічно релевантні лімфоцити можуть бути аутологічними для суб'єкта, тобто, клінічно релевантні лімфоцити одержують від суб'єкта, що потребує лікування, і потім вводять тому ж самому суб'єкту.

Введення аутологічних клітин суб'єкту може приводити до зменшення відторгнення клітин хазяїна у порівнянні з введенням не-аутологічних клітин. Альтернативно, клітини хазяїна є алогенними клітинами, тобто, клітини одержують від першого суб'єкта та вводять другому суб'єкту, який відрізняється від першого суб'єкта, але належить до того ж виду. Наприклад, алогенні клінічно релевантні лімфоцити можуть бути одержані від донора-людини та введені 60 реципієнту-людині, відмінному від донора.

Для практичного здійснення способів, розкритих в даному документі, ефективна кількість клінічно релевантних лімфоцитів, описаних в даному документі, або їх композицій, може бути введена суб'єкту (наприклад, раковому пацієнту-людині, пацієнту з інфекційною хворобою, пацієнту з аутоїмунною хворобою), що потребує лікування, придатним шляхом, таким як, наприклад, внутрішньовенне введення. Клітини можуть бути введені шляхом ін'єкції, катетером тощо. Якщо бажано, додаткові лікарські засоби (наприклад, цитокіни) також можуть бути спільно або послідовно введені. Будь-які клітини або їх композиції можуть бути введені суб'єкту в ефективній кількості. У використовуваному в даному документі значенні, ефективна кількість стосується кількості відповідного агента (наприклад, клітин або їх композиції), яка при введенні створює бажаний терапевтичний ефект у суб'єкта. Визначення того, чи досягне кількість клітин або композицій, описаних в даному документі, бажаного терапевтичного ефекту, буде зрозумілим кваліфікованому фахівцю. Наприклад, див. посилання 2-5. Ефективні кількості змінюються, як зрозуміло кваліфікованим фахівцям, в залежності від конкретного стану, лікування якого проводиться, тяжкості стану, індивідуальних параметрів пацієнта, включаючи вік, фізичний стан, розміру, статі та ваги, тривалості лікування, характеру супутної терапії (якщо вона проводиться), конкретного шляху введення та інших факторів, відомих та доступних медичному працівнику. В деяких варіантах втілення, ефективна кількість полегщує, ослаблює, поліпшує, покращує, зменшує симптоми, або уповільнює прогресування бажаної хвороб або розладу у суб'єкта. "Введення" стосується фізичного введення суб'єкту композиції, що містить клітини або фармацевтичну композицію, описані в даному документі, з використанням будь-яких з різноманітних методів та систем доставки, відомих кваліфікованим фахівцям.

Введення популяції пухлина-реактивних лімфоцитів, краще, є введенням пацієнту або локально поблизу до пухлини або в пухлину. Альтернативно, популяцію пухлина-реактивних лімфоцитів вводять в кровотік. Інші клінічно релевантні лімфоцити, краще, вводять в кровотік.

Згідно з варіантом втілення даного винаходу, суб'єкту вводять дозу клінічно релевантних лімфоцитів, яка містить принаймні приблизно 4х105, 4,5х105, 5х106, 5,5х106, бх106, 6б,5х106, 7х106, 7,5х105, вх106, 8,5х105, 9х105, 9,5х106, 10х105, 12,5х105, 15х106, 20х106, 25х105, 30х106, 35х105, 40х105, 45х106, 50х106, 60х105, 70х105, 80х106, 90х105 клітин на кільграм ваги тіла. «будь ласка, поширте на інші діапазони значень, якщо треба)

Імунотерапія згідно з п'ятим аспектом популяції клінічно релевантних лімфоцитів - спричинює регресію ракових клітин у ссавця; - перещкоджає переходу від передпухлинного до злоякісного ураження; - спричинює швидке старіння пухлинних клітин або передпухлинних клітин; - викликає усунення аутоантиген-позитивних клітин; - спричинює загибель, зупинку росту або локалізацію патогенів; - чинить шкідливий вплив на ракові стовбурові клітини; та/або - індукує зупинку росту ракових клітин або клітин, що експресують аутоантигени.

Згідно з шостим аспектом, винахід передбачає композицію згідно з першим аспектом винаходу, призначену для використання в консервативному лікуванні, зокрема, для лікування та профілактики інфекційної хвороби, аутоімунної хвороби або онкологічної хвороби.

Згідно з одним варіантом втілення шостого аспекту, використання включає генерування популяції клінічно релевантних лімфоцитів з використанням способу згідно з другим аспектом винаходу.

Відповідно до одного варіанта втілення композиції згідно з шостим аспектом, використання включає імунотерапію згідно з п'ятим аспектом винаходу. Як було описано вище, конкретні цитокіни цитокінового коктейля не обов'язково мають використовуватися одночасно, і можуть бути додані в різні моменти часу.

Згідно із сьомим аспектом, винахід передбачає набір для використання в консервативному лікуванні, зокрема, для лікування або профілактики інфекційної хвороби, аутоїмунної хвороби або онкологічної хвороби, де набір включає ІІ -2, ІІ -15 та І--21. Набір, додатково, необов'язково включає принаймні один з компонентів, що стимулюють ТОК, зокрема, ОКТЗ, костимулюючі молекули, живильні клітини та пептид, що містить амінокислотну послідовність клінічно релевантного антигена. Краще, набір включає усі згадані компоненти.

Винахід додатково характеризується наступними прикладами.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1 - Протокол експансії лімфоцитів з використанням мононуклеарних клітин периферичної крові

А) Матеріали та обладнання 60 Її) Обладнання

24-пунковий планшет, (Весіоп, біскіпзоп (ВО), КЕЕ 353504)

Стерильний скальпель

Стерильний пінцет

Меадітаспіпе (машина для гомогенізації тканин), (ВО, Саг340588)

Меадісоп, 50 мкм, (ВО, Сас 340591)

Нісоп5, 200 мкм (ВО, Са 340613)

Витяжка з ламінарним потоком повітря (витяжка класу 2 біобезпеки)

Низькотемпературний морозильник, -80 7

Холодильник

Центрифуга і) Витратні матеріали

Рукавички (латексні)

Лабораторний халат

Стерильні центрифужні пробірки, 15 мл.

Наконечники для піпеток

Груша для піпеток (Ріреце аїа)

Контейнер для відходів ії) Реагенти

ВАРМІ 1640, (Сібсо, ВЕЕ 61870-044)

Сеїдго, (СеІСепіх, Саї:20801-0100)

Змішана людська АВ сироватка (Іппоаїїме Кезеагсі, ІРІ А-ЗегАВ-13458).

Сироватка плоду корови (бірсо, КЕР: 26140-079).

Антитіло проти СОЗ (ОКТЗ), (Віоїедепа, Сас317304).

Людський 1-2 (Ргозрес, Саї: СУТ-209-Б).

Людський 1-15 (Ргозрес, Сагсуї-230-Б).

Людський ІІ -21 (Ргозрес, Сагсуї-408-5)

РЕЗТ (антибіотики)

Амфотерицин

В) Процедура

Зо Проводять аферез для здорового донора, примованого МУ-ЕБО-1. Після розділення компонентів крові продукт, що містить лейкоцити, відокремлюють від решти. Клітини суспендують в СеїЇЇдго, що містить 5 956 змішаної людської АВ сироватки, 1000 МО/мл 1-2, 10 нг/мл 1-15 та 10 нг/мл І--21. Середовище на додаток містило 10 мкмоль пептиду МЖ-ЕБО-1 як антиген для проведення експансії. Концентрація клітин від. Експансія лімфоцитів з периферичної крові включала стадію стимуляції опромінених аутологічних МНКПК, оброблених антигеном, що представляє інтерес, в імпульсному режимі. Для цього, аутологічні МНКПК піддають імпульсній обробці протягом двох годин 10 мМ пептиду МУ-ЕБО-1 при кімнатній температурі (КТ), і потім опромінюють дозою 55 Гр. Оброблені в імпульсному режимі опромінені аутологічні МНКОК додають до культури лімфоцитів в день 7 та ресуспендують в свіжому культуральному середовищі з домішкою 5 96 змішаної людської АВ сироватки з цитокінами в концентраціях, визначених вище. В день 10 клітини піддають експансії з використанням СеїЇдго з домішкою 595 змішаної людської АВ сироватки та цитокінів. Антитіло ОКТЗ додають в концентрації 30 нг/мл в такому саме культуральному середовищі, як описано вище, плюс опромінені живильні клітини (55 Гр) у співвідношенні 1:10 (співвідношення фідерні клітини:Т- клітини), пептид та цитокіни. В дні 17-20 культивації клітини збирають для аналізу або перенесення пацієнту.

Приклад 2 - Протокол експансії лімфоцитів з використанням мононуклеарних клітин периферичної крові

Процедура Прикладу 2 є ідентичною з процедурою Прикладу 1, за винятком того, що донором був пацієнт, який отримав вакцинацію МУ-ЕБО-1.

Приклад З - Протокол експансії лімфоцитів з використанням мононуклеарних клітин периферичної крові

Приклад З є ідентичним Прикладу 1, за винятком того, що донором є пацієнт, пухлина якого вже експресує ТАА МУ-ЕБО-1.

Приклад 4 - Гамма-дельта Т-клітини можна збагачувати у підданих експансії лімфоцитах з цитокінами ІІ--2, 11-15 та І -21

Експансію проводять згідно з протоколом, описаним у Прикладі 1, з тією різницею, що додають до клітинної культури золедроновую кислоту в концентрації 5 мкмоль. Золедронова кислота, як відомо, промотує експансію ТОК гамма-дельта Т-клітин. Як показано на Фіг. 1, ця 60 експериментальна модель приводить до сильного зростання ТСК гамма-дельта Т-клітин як за частотою, так і за абсолютними величинами. На Фіг. 1 представлені зображення протокової цитометрії підданих експансії культур в різні моменти часу. Відповідно, в перший день експансії 3,68 96 клітин несуть ТОК гамма-дельта. Вже на другий день спостерігається невелике зростання. Разюче, після 7 днів експансії майже 50 95 Т-клітин належать до підгрупи уб.

Приклад 5 - Експансія лімфоцитів із цитокіновим коктейлем індукує подвійно негативні Т- клітини (СОЗ-С04-С08-).

Лімфоцити були одержані від пацієнта з нарколепсією. Експансія проводять, як описано у

Прикладі 1, але з пептидом РКОМаО2 як антигеном для проведення експансії та стимулювання.

Культивовані клітини тестують на фенотип Т-клітин в день 1 та день 18. Фіг. 2 зображує результати протокової цитометрії для цих зразків. В результатах, спочатку фільтрують лімфоцити і потім фільтрують СОЗ- лімфоцити. Ці клітини потім додатково аналізують на присутність СО4 та СО8. На панелях можна побачити, що після дня 1 тільки 13 95 клітин мають подвійно негативний стан. Більшість клітин є СО4-ж. Після 18 днів експансії із цитокіновим коктейлем 92 95 клітини є подвійно негативними (С03-204-208-) Т-клітинами.

Крім того, тестували індукцію продукування ІЕМ-у підданими експансії лімфоцитами при стимуляції пептидом РКОМ2. Як показано на Фіг. 3, в день 1 тільки 0,89 95 клітин продукують

ІЕМ-у при стимуляції РКОМ2. На відміну від цього, зразок з дня 18 демонструє значно збільшену популяцію цитокінів, що продукують РКОМ2-специфічні Т-клітини. Оскільки більшість Т-клітин є бор3-004-С208-, це свідчить про те, що протокол експансії приводить до утворення клінічно релевантних подвійно негативних Т-клітин.

Приклад 6 - Піддані сортуванню декстрамерні клітини продукують ІЕМ-у у відповідь на аутологічні ЕВМУ-І СІ. (клітини великоклітинної лімфоми, трансформовані вірусом Епштейна-

Барр), навантажені пептидом та білком антигенів

Протокол експансії згідно з Прикладом 1 проводять з кров'ю від двох різних пацієнтів з нарколепсією, також з РКОМО2 як пептидом для проведення експансії. В двох різних моделях для різних пацієнтів, додавали пептиди ЮОМАзеВ або РКОМ2 до цитокінового коктейля в культуральному середовищі. СОЗ3-С04-208-, і звичайні СО8-«Т-клітини, які були рестриктовані по антигенам головного комплексу гістосумісночті (МНС гезігісіеєд) та націлені на РЕОМ2 або

ОМА5зеВ, сортували методом протокової цитометрії та тестували на розпізнавання ними

Зо процесованих та презентованих в природних умовах епітопів. Т-клітини від тих самих пацієнтів обробляли в імпульсному режимі пептидами або рекомбінантними білками та вимірювали продукування ІЕМ-у. Результати експерименту зібрані у Таблиці 1:

Таблиця 1 71717171 |Сортовані Т клітиних декстрамери- . Аутологічні

РАМО2

СО03-ОМ- 10,7 | 12 1,0 23,0 0,05 0,27 9

ОМАзев ОМАзеВ

СО03-ОМ- 0,7 | 7,7 1,5 31 З 0,07 0,29 95

РАМО2

СО03-ОМ- 2,3 0,10

М 0,25 95

Норм ОМАзев к СО03-ОМ- 5,3 0,4 1,8 2,7

С 0,45 95 рмавев ОМАеВ Сов вв мов мав | мом

СІ те он (вів!) пи) ла 1516 - | РАОМ2 МАВ Сов

Е дах |гає|то| ме | по | т8 | бо

Вимірюваними значеннями є концентрація ІЕМ-у в пг/мл. Цей експеримент показує, що цитокіновий коктейль 1-2, ІЇ/-15 та 1/-21 в комбінації зі специфічним антигеном є здатним 5 забезпечувати експансію клінічно релевантних Т-клітин, зокрема, Т-клітин, специфічних до антигенів в периферичній крові. Т-клітини можуть, краще, належать до популяції так званих ОМ (подвійно негативних) СО3-С04-С08-Т-клітин, і ці Т-клітини є функціонально високоактивними, вони продукують ІЕМ-у та розпізнають біологічно та медично релевантні мішені.

Приклад 7 - Аналіз лімфоцитів, підданих експансії із цитокіновим коктейлем та пухлина- асоційованими антигенами

Процедуру експансії проводять, як описано у Прикладі 1 за винятком того, що використовують ІМОВОЕ та ОСНІ З замість МУ-Е5О-1 як антиген для проведення експансії.

Після 18 днів експансії, клітини стимулюють ІМО8ОЄ або ОСНІ З, (та) аналізують методом протокової цитометрії. Результати протокової цитометрії представлені на Фіг. 4 та 5. Фіг. 4АА зображує сигнал клітин, розділених з використанням бічного та прямого розсіювання.

Лімфоцити гейтують, як показано чорною еліптичною окружністю. Профільтровані лімфоцити потім знов фільтрують на присутність СОЗ3. СОЗ" клітини додатково аналізують шляхом розділення в залежності від присутності або неприсутності СО8 та СО4. В цьому експерименті, 41 95 клітин були СОвж, 29,6 95 СО4, і 26,5 95 - подвійно негативними. Подвійно негативні та

Сов потім тестували на продукування ІЄМ-у при стимуляції антигенами-мішенями ІМОВ8ОЕ та

ОСНІЗ. Відзначимо, що Т-клітини об'єктивно виміряють з використанням комплексів (молекула)

МНС класу 1/пептид. Згідно з результатами, зображеними на Фіг. 5А, 1,495 СО8: клітин продукують ІЕМ-у при стимуляції ІМО8ОЕ, але також 0,56 95 подвійно негативних Т-клітин продукують ІЕМ-у при стимуляції (див. Фіг. 58). Аналогічні результати одержані для активації

ОСНІЗ, як показано на Фіг. 5. 0,34 95 СОвж клітин продукують ІЕМ-у. Також 0,45 95 подвійно негативних клітин продукують ІЕМ-у (див. Фіг. 50).

Клітини, стимульовані ІМОВ8ОЕ, додатково аналізують на продукування цитокінів. Фіг. бА-6С також зображують гейтування СО8я-Т-клітин, що продукують ІБМ-у. Аналіз клітин, що продукують СО107а, СО127 (1-7К) та СО117, зображений на Фіг. 60-6Р. Сірі сигнали

Зо відповідають популяції СОЗ-СОВ8 Т-клітин в цілому (незалежно від антигенної специфічності), чорні сигнали - СОЗ3-СО8--Т-клітинам, які є антигенспецифічними. Аналіз показує, що ТАА- реактивні СО8-Т-клітини експресують СО107а, що є маркером, асоційованим з цитотоксичністю та СО127 (рецептор ІІ-7К, що медіює сигнали виживання), але не з СО117, який є маркером Т- клітин з властивостями, подібними до стовбурових клітин.

Приклад 8 - Експансія МНКПК із цитокіновим коктейлем та пептидом СММррб5

МНКПК були одержані від пацієнта з гліобластомою. та піддані експансії із цитокіновим коктейлем ІІ--2, ІІ -15 та І--21 згідно з Прикладом 1, але в комбінації з пептидом СММррб5. Цей експеримент показує, що стимуляція пептидом СММУррб5 у комбінації із цитокіновим коктейлем

І--2, 1-15 та ІС-21 приводить до сильної експансії високоафінних антигенспецифічних Т-клітин (аналіз тетрамерів). Результати представлені на Фіг. 7А-7О0. АРС-СММ або (рам.) РЕ-СММ та (опа) РІТО-СММ позначають ї) молекули, ідентичні МНС класу І-НІ А-0201, її) ідентичні пептиди.

Але молекула головного комплексу гістосумісності (МНС) є мутованою. Єдиною відмінністю є мутація в молекулі МНС - яка детектує Т-клітини з різними афінностями. Тетрамери СММ мають різні мутації. АРС-СММ (середня афінність, мутація в положенні 245; (займає положення) між

РЕ-СММ (висока афінність) та РІТСО-СММ (дикого типу, порівняно низька афінність). Дані показують, що мутантні тетрамери, які забезпечують утворення тільки високоафінних Т- клітинних рецепторів для зв'язування, детектують високоафінні Т-клітини (а також Т-клітини з низькою та проміжною афінністю). Високоафінні Т-клітини, як вважають, медіюють сильніші функції імунних ефекторів та краще видяляють пухлинні клітини та/або патогени.

Приклад 9 - Аналіз частоти пухлинореактивних Т-клітин після експансії лімфоцитів з периферичної крові із цитокіновим коктейлем та МУ-ЕБО-1

МНКПК були одержані від пацієнта з раком підшлункової залози. Експеримент проводять, як описано у Прикладі 1. фіг. 8 зображує аналіз методом протокової цитометрії зразків експансії в день 0 та день 18. Хоча в день 1 продукування ІЕМ-у після стимуляції МУ-Е5О-1 становить лише 1,85, ця концентрація різко зростає до 9,25 в день 18 (див. Фіг. 88 та 80). Таким чином, число МУ-ЕБО-1 специфічних Т-клітин різко збільшується під час експансії.

Приклад 10 - Експансія сурвівін-реактивних Т-клітин з периферичної крові від пацієнтів з раком

МНКПК були одержані від пацієнта з гліобластомою та піддані експансії із цитокіновим коктейлем 1-2, 1-15 та 1-21 згідно з Прикладом 1, але разом з відомим ТАА сурвівіном. Знов, клітини аналізували в день 1 та після 18 днів культивації методом протокової цитометрії. Перед аналізом, піддані експансії клітини стимулюють сурвівіном. Клітини групують на СО4-, СОв та подвійно негативні Т-клітини. В цих групах визначають концентрацію 1-2, ІЕМ-у та ТМЕ-а. Фіг.

Зо 9А зображує результати для клітин СО4 х, Фіг. 98 - результати для подвійно негативних, і Фіг. 9С - результати для клітин СО8вж. Результати можуть бути узагальнені таким чином: не спостерігається детектованих Т-клітинних відповідей, обумовленних продукуванням цитокінів, в момент часу 0 (Т0). На відміну від цього, після 18 днів експансії було виявлено сильне продукування цитокінів у відповідь на стимуляцію сурвівіном, що свідчить про присутність сурвівін-специфічних Т-клітин. У зв'язку з цим слід зазначити, що звичайно дуже важко індукувати Т-клітинні відповіді проти сурвівіну.

Приклад 11 - Аналіз фенотипу підданих експансії лімфоцитів

МНКПК були одержані від пацієнта з гліобластомою. Експансію проводять, як описано у

Прикладі 1. Зразки з дня 0 та дня 18 аналізували в залежності від присутності СО45КА та ССК7 методом протокової цитометрії. Результати зображені на Фіг. 10А та Фіг. 108. Для цього експерименту, клітини були розділені на такі групи. Позитивні сигнали СО45КА та ССК7 у верхній правій секції графіка позначають прекурсорні клітини. ССК7-СО45КА- внизу справа є клітинами центральної пам'яті. Позитивний сигнал СО45КА з ССК?7- зверху сліва - ефекторні клітини, і негативний сигнал в обох ділянках внизу зліва - периферичні клітини пам'яті. Як показує порівняння Фіг. 10А та Фіг. 108, видно, що число клітин центральної пам'яті при експансії з цитокіновим коктейлем сильно зростає, а саме, з 3,72 до 21,1. Число периферичних клітин пам'яті трохи збільшується, у той час як число ефекторних клітин сильно зменшується.

Число прекурсорних клітин лише незначно знижується з 65,4 до 57,4. Відповідно, експансія з комбінацією цитокінів згідно з винаходом збагачує Т-клітини центральної пам'яті.

Приклад 12 - Аналіз диференціації різних підгруп Т-клітин при експансії із цитокіновим коктейлем ІІ--2, ІІ -15 та ІС-21 разом з різними ТАА

МНКПК від пацієнтів з раком підшлункової залози обробляли згідно з Прикладом 1 різними антигенами: ОРІ, який є зв'язаною з клітинною поверхнею частиною мезотеліну, сурвівіном та

ММУ-Е5О-1. Результати узагальнені в Таблиці 2 нижче:

Таблиця 2

Центральної сто . пам'яті Прекурсорні Сфекторні т Периферичної

ОрлБНА: СОЛЗНАХОСНИ СраБВАССВТ (О045ВА-ССН: аСА7- - | Антиген Після Після Після Після

Популяція Момент Момент Момент Момент : для стиму- стиму- стиму- стиму-

Т-клітин, п - часу - | часу - | часу - | часу 2. стимуляції ляції ляції ляції ляції 24,30 24,20 48,70

Со МУ-ЕБО-1| 12,80 | 29,10) 44,50 | 1220 | 7,93 34,80 | 54,90

Пацієнт 15,50 78,40 х 50,90 25,50 16,,80

Сов ММ-ЕБО-1| 0,61 10,90 | 26,70 | 11,30 | 57,60 | 11,50 1 15,10 | 66,30 6.96 | 14,50 69,30 19,90 4040 - | 3540

СО4-СО8- ММ-ЕБО-1) 1,81 | 6,90 | 29,20 58,80 6880 | 10,20 | 18,90 57,80| - | 29,80

В першій колонці вказана підгрупа аналізованих Т-клітин: СО4-, СОв-., 004- та СОВ8-. В другій колонці вказаний антигенний стимул. В наступних колонках наведені процентні частки клітин центральної пам'яті, прекурсорних клітин, диференційованих ефекторних клітин та клітин периферичної пам'яті в день 0 та день 18 різних експериментів. Відповідно, деякі антигени, такі як мезотелін, особливо стимулюють експансію прекурсорних клітин, що характеризуються

Ср45КАССК7ч, та клітин центральної пам'яті, що характеризуються СО45КА-ССВ7 кю.

Приклад 13 - Збагачення прекурсорних Т-клітин та експресія з с-Кії

МНКПК від пацієнта з гліобластомою піддають експансії згідно з протоколом Прикладу 1 з пептидами антигенів (ЕСЕМІИІ, ММУ-ЕБО-1 або сурвівін). Клітини стимулюють цими самими пептидами, аналізують методом протокової цитометрії, і результати зібрані у Таблиці 3:

Таблиця З 77111117 Пацієнтїї | Пацієнт? | Пацієнєт3.Ї///:

Сур-/ Мо- Сур-/Мо- Сур- Мо-

ЕСЕВМ МУ- о мент| ЕСЕН!| МУ- о мент єсЕВУ Мм- Хо мент

ЕБО-1| У | часу У ЕБО-1| "У | часу ЕБО-1| | часу він 0 він 0 він 0 со3. | 76 546 |75,9| 46,4) 654 | 80,8 |60,9| 48,9) 57,7 | 63.8 66,5 535,9 скін | 224 | 552 |21,94 0,6 | 33,5 | 75,8 |71.3| 217 6.44 | 27,6 130,3 0,29

Со1і07а | 562 | 17,5 5321 0,98) 2,68 | 14,8 | 13 1,47| 2.56 | 8,5 1221 0,65 ше п Я Я ПНЯ ПОН ПОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ НО КОНЯ НК ст: ССВІ-, 2: СОН7-,

ОЗ: СОВА, 04: СоВТ-, скін | 40,6 33,4 |40,7| 066 23 | 90,8 191,9) 108 11,4 | 49,3 |32,7|0,078 сова;

со107ах ше п Я Я ПНЯ ПОН ПОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ НО КОНЯ НК ст: ССВІ-, 2: СОН7-,

ОЗ: СОВА, 04: СоВТ-, со107ах ше п Я Я ПНЯ ПОН ПОН КОНЯ КОНЯ КОНЯ НО КОНЯ НК ст: ССВІ-, 2: СОН7-,

О3: ССВА7 я, : 04: СоВТ-,

Числа показують процентний склад популяцій Т-клітин в батьківському СО4ж, СОвж, або подвійно негативному фенотипі для кожного з відповідних антигенів в момент часу 18 днів з порівнянням з моментом часу 0 (початок експансії). Було детектоване збагачення підгрупи прекурсорів Т-клітин, позначених СО45КАжССК7в, асоційоване з антигеном та сильною експресією с-КИ (СО117). С-КИ є маркером Т-клітин з ознаками, подібними до стовбурової клітини. СЮО117 «Т-клітини були асоційовані із забезпеченням популяції довготермінової пам'яті.

Також спостерігали сильну індукцію маркера цитотоксичності/дегрануляції СО107а у стимульованих Т-клітин.

Приклад 14 - Протокол експансії із цитокіновим коктейлем та пептидом ТАА приводить до 4- 188 та ТІМ-3 позитивних Т-клітин

МНКПК були одержані від пацієнтів з раком підшлункової залози та піддані експансії згідно з

Прикладом 1. Знов, пептиди ТАА були одержані з СРІ, МУ-Е5О-1 та сурвівіну. Присутність різних маркерів тестували за допомогою протокової цитометрії. Маркерами є: 4-188, СО25,

СО0127, СТІ А-4, І АСЗ, РО та ТІМ3. Результати зібрані у Таблиці 4:

Таблиця 4 10000001 АЯВВ |СбО25. |С0127-4 |СТІА-4 | АСЗ. РОЇ. | ТІМ3 1 1 Щ1то Ао |то |до |то ГАо /|то |до то |до то |до (то |до 37,00 36,80 26,10 мм 003 596647 25,80|66,70145,30 0,01 ооо|ол6 028822 25,70 32,10 37,50 25,80 23,90 0,061 39,20

Па- |сов/му- цієнт й ЕВО-1 оо4 ом |1,46 39,50 2340 214. оо 010085 04 7,43 44,60 й 37,0 39,70 сра|сРІ | 28,10 23,70| 0,06) - Мм- 12,0

Сов ЕФО-1 004 090,89 40.70 12,90) 2.06 |0,07|0,04 0,82 |омт 0 11,60 - 50,10 12,50 78,30 27,30 62,70

Сра му 1,80 4,26 |56,30|54,70119,2010,03 0,06 (0,45 (0,42 11771 |28,9010,00 10,25 щ ЕБЗО-1 (0) 75,10 27,50 61,90 55,30 47,60

Па- Ісов/му- 11,8 цієнт й ЕФО-1 бов 1,52|2и5 лодо 8,00) 6,07 |оло |з овг (тв! 0 30,80

В 56,40 44,10 сора|СРІ | 41,60 31,60 - Мм- 10,7 - 3210 29,50) -10,00

В Таблиці 4 ТО позначає концентрацію індивідуальних підгруп, вказаних у колонці 2, до експансії (ТО). Ад позначає 18 днів антигенної стимуляції та стимульовану цитокінами експансію. Значення 4-188 та значення ТІМЗ вказують на "навчені" антигенами Т-клітини. Було знайдено, що, зокрема, 4-1885-Т-клітини сильно підвищуються в деяких експериментах та клітинних підгрупах. Наприклад, стимуляція ММ-Е5О-1 в підгрупі СО4ж приводить до 200- кратного збільшення 4-1ВВ--Т-клітин (з 0,03 до 5,96).

Приклад 15 - Детальний аналіз клітинних маркерів у лімфоцитах, підданих експансії з периферичної крові пацієнтів з глобластомою

Експеримент проводять згідно з протоколом Прикладу 1 з ЕСМВМІШ, ММ-ЕБО-1 або сурвівіном, відповідно. Результати зібрані у Таблиці 5.

Таблиця 5 ре пеня | пек» | пек а| пен антигеном 1 17711111 птофаю |то ло |то |до то |до | до

ЕСЕВМТІ. |у сраю |МУ-Е5О-1 30,5 70 36,2 48,8 65,6

ЕСЕВУПІ соня 41885 | МУ-ЕБО-1 и Ов | 502 0,032 16,91 0,28 /3,4710,0831| 2,78

ЕсЕВМИ! |. 31,8 сргв. | МУ-ЕВО-1 || 66 | 643 4,01 10 4,73

СОТя ГМУЕВО- || 604 | 695 88,5 35,7 42 до МУЕВОЛ | 687 | 104 ол 64303 128

ІАбЗи МУ-ЕВО- | 208 | 125 4,05 зв (АБ) 221

РО-1 | МУ-ЕВО-1 7 37,8 14,8 3,99 4,64 тімз» |МУ-ЕБО-1 | 22 0,34 |БЕ-03| 0,36. 0,13 (0,52 | 0,044 |0,066 сов. |МУ-Е5О-1| 5 339 196 39,6 гом 9,55 0,96. алввх |МугЕвоя 1138 | 16 125 0,067|757| 017 сргви |МУ-ЕБО-1 || 43 | БВ 1,59 347 ТА Ге.

ОТ Ммусввос ват 62 67 425 37 | 526 соз/сОВ я й МУЕВОг | 358 | 216 1,87 ї2 таз

ГАСЗя 79 88,3 91,9 15,9 18,9

Ро |МмУБО-1 1752/2853 263 4,63 6,04 5,34 0,69

ТІМ3 0,061 |0,016| 011 |7Е-03| 0,27 | 012 03

Знов, лімфоцити розділяли в залежності від присутності СО4 або СОв8-. Числа у таблиці стосуються процентного вміста клітин, позитивних щодо індивідуальних маркерів, зазначених в другій колонці таблиці в момент часу ТО або після 18 днів експансії (Ад). Знов, для більшості пацієнтів спостерігали сильну індукцію 4-188--Т-клітин.

Приклад 16 - Аналіз лімфоцитів, підданих експансії, від пацієнта з раком підшлункової залози та від пацієнта з гліобластомою

МНКІК були одержані від пацієнта з раком підшлункової залози та від пацієнта з гліобластомою. Лімфоцити піддають експансії за протоколом згідно з Прикладом 1. Культуру лімфоцитів аналізують методом протокової цитометрії проти різноманітних маркерів.

Результати представлені у Таблиці 6:

Таблиця 6 11111110 Панкро/// | Гліобластома (ОВМ) ро тн (то тн со37777 17171717 64 111699 | 7 .|ДЮюКюВнвв рве 1312 | 64 | " тні 77777717 969 | 971 | 482 | 388 тнге 777777 | 023 | 0 | 064 | 02 ср тні? 77777717 05 | 0 | 102 | 052 срібла. | 04 | 024 | 08 | 439 11111335 | 645 | з03 | 7 сов 111 вив | 347 | 456 | 137 -

В першій колонці вказано, яку підгрупу лімфоцитів фільтрували. В другій колонці перелічені відповідні випробовані маркери. Якщо не указано жодного маркера, то в цьому рядку наведена процентна частка загального числа клітин з маркером фільтрації СОЗ- по відношенню до загального числа клітин та СО4ж, СО8-- або подвійно негативними. ТО знов позначає культуру до експансії і ТН - час збирання в день 18. Числа позначають процентну частку клітин, що несуть вибрані маркери у колонці 2 або колонці 1, відповідно. Слід відзначити, що більшість

Срах клітин після експансії є ТНІ1І позитивними. Для раку підшлункової залози число СО4 клітин зростає від 22,2 до 92,1 95. При гліобластомі результати є лише трохи менш вираженими - від 9,64 до 68,1 95 С04 клітин. Аналогічно, крім цього спостерігається сильна експресія СХСКЗ в

СО8--Т-клітинах після експансії - 96,895 в підшлунковій залозі та 85,5 95 в гліобластомі.

Відповідно, майже всі СЮО8-- клітини є СХСКЗ Кк. Крім того, був відзначений зсув від термінально диференційованих Т-клітин до підгруп прекурсорних Т-клітин або Т-клітин центральної пам'яті.

Фіг. 11 зображує графіки протокової цитометрії експерименту з визначення ТНІ17, ТНІ, ТНІ1" та ТНа2 у зразку пацієнта з раком підшлункової залози. Спочатку клітини гейтують на ССКЄ, і потім на ССКЗ та ССКА, відповідно.

Приклад 17 - Експансія Т-клітин пам'яті, специфічни до певних антигенів за відсутності стимуляції цими антигенами

МНКПК від пацієнтів з раком підшлункової залози піддають експансії згідно з Прикладом 1 з пухлина-асоційованим антигеном МУ-Е5О-1. Одержані клітини стимулюють протягом чотирьох годин з такими пухлина-асоційованими антигенами: СММ, ЕВМА-За, ІМО8ОЕ, мезотелін, МУ-

ЕБО-1, сурвівін та ОСНІ 3. Методом протокової цитометрії визначають процентну частку цитокін-продукуючих Т-клітин. Числові значення наведені в Таблиці 7 для різних підгруп Т- клітин: СОвя, СО4-- та подвійно негативні. Проводили тестування таких цитокінів: ІЕМ-у, І -2 та

ТМ. Цікаво, що не лише стимуляція МУ-Е5О-1 приводила до одержання цитокін-продукуючих

Т-клітин і, отже, пухлинореактивних Т-клітини, але також стимуляція іншими антигенами, які не використовували в процесі експансії. Також стимуляція антигенами вірусних мішеней (СММ та

ЕВМА-За) приводила до одержання Т-клітин, що продукують цитокіни, що демонструє присутність Т-клітин, специфічних по відношенню до цих мішеней.

Таблиця 7 псля 33111110 ПІСЛЯВИДАЛЕННЯСЕРЕДОВИЩАДГ-://-:С/:/М4ССЖ єм. 200031 0,97 | ї56 | 000 | оо | 024 | 007 | 03 сов. (са. | 3,84 | 006 | 002 | 000 | 004 | 003 | 004 006 єм. 71008000 | 000 | 000 | 000 | 000 | 000 | 000

Ссра. (са. |14959|022| 0,06 | 009 | 016 | 05 | оо | 093

МЕ. / 10291000 | 000 | 000 | 002 | 000 | 00 | 065 єм. 5,53 | 005 | 014 | 000 | 000 | 000 | 00 | 000

Ом -а2я 5,89 | 020 | 014 | 002 | 009 | 022 | 09 | 023

Приклад 18 - Цитотоксичність після НРУ І. 1-специфічної експансії

В цьому прикладі периферичну кров одержують від пацієнта з тяжкою хворобою НРУ (папіломавірус людини) (НРУЗЗ3 та НРМ56). Стимуляцію проводять пептидом 1/1 НРМ та цитокіновим коктейлем, що містить /Ї-2, ІЇ/-15 та 1/-21. Після 18 днів експансії, клітини стимулюють пептидом 11, та вимірюють методом протокової цитометрії. Результати представлені на Фіг. 12. Фіг. 120-12Е показують гейтування для лімфоцитів СОЗ- та СОвх,, відповідно. На Фіг. 12А, 12В та 12С прямокутник позначає ділянку з клітинами, що експресують цитокін СО107а, який є антиген-специфічним маркером дегрануляції/цитотоксичності. Фіг. 12А зображує результати, одержані для пептиду 11, Фіг. 128 - позитивний контроль, і Фіг. 120 - само лише середовище як негативний контроль. Відповідно, спостерігається збільшення з 0,77 до 2,23 процентної частки клітин, що продукують СО107а.

Приклад 19-Т-клітини, піддані експансії із цитокіновим коктейлем та пухлинними антигенами, розпізнають аутологічні пухлинні клітини

МНКПК від пацієнта з гліобластомою стимулюють пептидами МУ-Е5О-1 та пептидами сСММррб5. Периферичну кров від пацієнта з гліобластомою обробляють згідно з протоколом

Прикладу 4, в якому в двох моделях стимулюючим пептидом були МУ-Е5О-1 або СММррб5.

Після 18 днів продукування цитокінів також проводять аналіз з використанням різних антигенів для стимуляції або аутологічних пухлинних клітин. Було знайдено, що антиген-специфічна експансія Т-клітин з використанням пептидів та цитокінового коктейля приводить до експансії Т- клітин, спрямованих проти стимулюючої мішені, але також і проти власних аутологічних

Зо пухлинних клітин пацієнта. Ця реактивність була відсутньою до експансії Т-клітин з МУ-ЕБО-1 та цитокінами. Дані узагальнені у Таблиці 8. Числа позначають процентну частку Т-клітин, присутніх в популяції батьківських Т-клітин.

Таблиця 8 11111101 РМА | МУЕБО-1 | Сурвівн | СМУ | Пухлина |Середовище! еМм-у /16,35145,2010,0010,ж310,0010,ж01|000 0661000 023| 0,00 | 011 со4. Ше 150,58|6415|000 01510001 00510,0010,08 00510211 0,02 | 0,05 і-17 | 069 | 209 |00210,08|0,01|01|000 0,011 0,04 / 0,21 | 0,03 | 0,09

ТМЕ-а| 45,38 | 68,8410,001042|0,001|020|000 0 045| 00 0,28 | 1,68 | 0,42 єм-у| 13051 87161|0,0110,911|0,01| 1201004 2,53|0,00 0,82 | 0,00 | 0,64

Сова і-17 | 008 | 046 |0,0410,07|0,04|0и18|004 013|000 012 0,01 | 0,08 тМЕ-а| 14,28 | 63,9910,001 0,961 0,0010,451|000 1,131 0,00 015 | 202 | 0.41 єму вл | 63,771|0,0012,891|0,00| 5,20 | 025 7,73| 0,07 | 2,38 | 1,89 | 0,00 сра- Па 5602/4142 003|03210001|0,39|025|0101 0301040 | 013 | 04

Со8- Пі-17 | б22 | Олі олб|0021000|0л2|0и151|0,04| 032 |0151 0,06 | 0,04 /тмЕ-а| 28,78 | 48,801 0,001 1,881 0,17 | 215 | 016 1514 | 0,00 | 1,11 | 1,95 | 1,03

Приклад 20 - Порівняння експансії лімфоцитів з двома різними комбінаціями цитокінів та стимуляцією ТАА

Периферичну кров від пацієнтів з раком підшлункової залози одержують та обробляють згідно з протоколом Прикладу 4. В різних експериментальних моделях використовують МУ-ЕБО- 1 або сурвівін разом із цитокіновим коктейлем. На додаток, ці ж самі експерименти проводять без додавання цитокінів або з комбінацією 1Ї--7 та ІІ-2. Після 18 днів експансії, клітини тестують на продукування ними ІЕМ-у при стимуляції МУ-Е5О-1 або сумішшю пептиду сурвівіну.

Результати представлені на Фіг. 13. Фіг. 13 зображує сильно підвищене продукування ІЕМ-у і, таким чином, концентрацію антиген-специфічних лімфоцитів після експансії з ІІ -2, ІІ 15 та 1-21, у порівнянні з іншою композицією цитокіну, або без цитокінів.

Приклад 21 - Порівняння експансії лімфоцитів з двома різними комбінаціями цитокінів та стимуляцією ТАА

Експеримент згідно з Прикладом 20 повторюють з вірусними антигенами ЕВМА-1, ЕВМА-За та СММррб5. Результати узагальнені на Фіг. 14. Фіг. 14 зображує сильно підвищене продукування ІЕМ-у і, таким чином, концентрацію антиген-специфічних лімфоцитів після експансії з ІІ -2, 115 та І--21, у порівнянні з іншою композицією цитокіну, або без цитокінів.

Приклад 22 - Аналіз експансії Тгед із цитокіновим коктейлем

Т-клітини, одержані з МНКПК, культивують в присутності цитокінового коктейля ІІ -2, 1-15 та

І/-21 та Тгед (регуляторних Т-клітин) (та) ідентифікують до та після експансії Т-клітин методом протокової цитометрії. Результати зображені на Фіг. 15. На Фіг. 15, зліва направо: показано гейтування Т-клітин на СО4--Т-клітинах і потім на СО25підп, що позначає високу експресію рецептора 1-2 на активованих Т-клітинах. Потім клітини гейтували на 1ІІ-2К (високий СО125) клітинах та тестували на експресію рецептора І--7 (20127) та Еохр3 (внутрішньоклітинно).

Клітина Тгед визначається як СО4-С025підп, Бохр3ж та СО127-негативна. Початкове число

Тгед було низьким (0,07 95 в СО4--Т-клітинах), і н нижчим після експансії Т-клітин (0,01 95). Ці дані свідчать про те, що цитокіновий коктейль є кращим для експансії Т-клітин, оскільки відомо, що ІЇ--2 стимулює сильну експансію Тгед, вони також підкреслюють синергічні ефекти комбінації

І -2ЛІ-15/Л1І-21, що блокує експансію Тгед, в той же час дозволяючи експансію Т-клітин, спрямованих проти пухлини.

Приклад 23 - Аналіз розподілу сімейства МВ після експансії

Т-клітини піддають експансії з використанням цитокінової суміші ІС-2/ЛІ-15/І/-21 разом з антигенами МУ-ЕБО-1 протягом 21 дня. Аналіз методом протокової цитометрії проводять до (ТО - момент часу 0) та після експансії (ТН - час збирання). Т-клітини, стимульовані цитокінами, узяті окремо, слюжать контролем. Результати зібрані у Таблиці 9. Відзначимо сильну переважну експансію сімейства МВ7.2 в СО8вжТ-клітинах, підданих експансії, в колбі ОКех, а також сімейства МВ13.2 в СО8'«Т-клітинах (також підданих експансії в колбі СКех). Дані показують, що присутність антигена (МУ-Е5О-1) стимулює кращу експансію індивідуальних сімейств ТОВ МВ - і показують також різноманітність відповіді, викликуваної антигеном (не лише цитокінами).

Сфокусовані, але різноманітні сімейства ТОК МВ дозволяють припустити різноманітні відповіді

Т-клітин, спрямовані проти мішені.

Таблиця 9 17711117 1 сов. | 7 | 7711 соя | сов. 71 |т0| тн то| тн! | | то | тн| то | тн.

МВ 1,14 168 |МВ12 0,68 3,09

МВ2 6,74 3,54 / 5,06 |МВ131 742 1,96

МВЗ 3,84 19,00 | 10,70 /МВ13.2 4,56 14,70

МВА 1,68 4,53 3,92 |МВ13.6 0,85 0,71

МВ5.1 2,51 110 | 062 |Мр14 15,30 11,30 0.09

МВ5.2 0,37 08 | 017 /МВ16 0,53 0,33

МВ5.3 0,48 0,50 | 1,77 |МВ17 2,89 1,06

МВТ 547 096 |МВ18 0,81 0,29 090

МВ7.2 2,00 4,39. 462 |МВ20 0,95 0,74

Мв8 2,83 1,39 | 292 |МВ21,3 3,70 0,32 | 0.66

МВо 1,64 1,84 | 1,59 |Мр22 2,97 1,03

МВ11 0,45 1,09 | 410 |Мр23 0,20 0,34

ТН: Момент часу збирання, 21 день; с-Кех: колба 5-Кех, стимуляція МУ-ЕБО-1; Су: Один лише цитокін, без стимуляції; СЕ: система (ферментації) СЕ ул"аме, стимуляція МУ-ЕБЗО-1

Приклад 24 - Маркер РО1 в СОв- клітинах

Т-лімфоцити піддають експансії з використанням ІІ -2/І -15/І -21 та суміші пептидів МУ-ЕБО- 1. Верхня панель: до, нижня панель: після експансії з цитокіном/ТАА-Т-клітини культивують в присутності ІС-2/ЛІ/-15/Л1-21. Проводять аналіз методом протокової цитометрії до та після стимуляції Т-клітин. Зліва направо: ії) гейтування на лімфоцитах, ії) гейтування на СОЗ«нтТ- клітинах. ії) гейтування на СО4/С08. Вверху справа: експресія РОЇ на СОв-ж- активованих Т- клітинах (37 95 Т-клітин). Т-клітини, піддані експансії з цитокіном/ТАА, виявляють знижену експресію РОЇ на Сра4СОрваТ-клітинах. Дані показують, що Т-клітини, піддані експансії з цитокіном/пептидом, демонструють знижену частоту РОТ-Т-клітин на СОвяТ-клітинах - це свідчить про те, що ці піддані експансії Т-клітини можуть демонструвати більший час життя і, тому, вищу ефективність проти пухлинних клітин.

Приклад 25 - Численні антигени

Пептидний коктейль, що складається з 12 індивідуальних пептидів з білюка!1 з НРМ 33, разом з цитокіновим коктейлем, використовують для стимулювання Т-клітин від пацієнтів з

НРУ. ураженням. В день 21, Т-клітини тестують на цитотоксичність, спрямовану проти кожного

Зо індивідуального пептиду. В даному випадку, брали аутологічні ЕВМ-трансформовані В-клітини та обробляли в імпульсному режимі пептидами 1-12, з подальшим стандартним аналізом Стг51.

Цей аналіх вимірює здатність Т-клітин вбивати специфічні мішені. Результати представлені на

Фіг. 16.

Т-клітини від донора А сильно розпізнають пептиди 11 та 12. Т-клітини від донорпа (4) В сильно розпізнають пептиди 7-12, із сильною реактивністю проти пептиду 11. Ці дані показують, що експансія Т-клітин з цитокіновим коктейлем ІІ--2/І/-15/ЛІ/-21 та пептидами приводить до і) утворення цитотоксичних Т-клітин, та ії) того, що відповідь Т-клітини є різноманітною та сфокусованою на варіанті набору індивідуальних пептидів. Це свідчить про те, що Т-клітини, стимульовані пептидом/цитокіновим коктейлем, можуть бути переважно цитотоксичними і можуть також бути націленими на декілька епітопів - що робить їх більш різноманітними в розпізнаванні пухлинних клітин, або вірусно інфікованих клітин, які демонструють на своїй поверхні різні набори пептидів.

Приклад 26 - Експресія СО117 до та після експансії МНКПК, стимульованою цитокіном та

ММ-ЕЗО-1.

МНКПК піддають експансії з сумішшю 1ІС-2/І-15/І-21 в присутності пухлина-асоційованого антигена МУ-Е5О-1. Клітини аналізують методом протокової цитометрії до (Фіг. 18) та після експансії (Фіг. 19). Спочатку гейтують СОЗ-Т-клітини, потім СОЗЖТ-клітини гейтують на СО4-- та

СО8аТ-клітини. СЮО117ж клітини потім детектують на СОвкТ-клітинах (верхня) та на СО4тТ- клітинах (нижня панель, зліва). Середня панель: експресія СО45КА/ССК7 в СОвж та СО4т- клітини з високою популяцією на СО45КАЖССК7 «Т-клітинах, які є прекурсорними Т-клітинами (середня панель). Справа: СО117-Т-клітини (помічені синім кольором) є присутніми в ефекторних Т-клітинах в СОв8ЖТ-клітинах; СЮО117Т-клітини можуть бути присутніми в різних популяціях Т-клітин в підгрупі СО4 «Т-клітин. Дані свідчать про те, що експресія СО117/, який) є маркером подібності Т-клітин до стовбурових клітин (5їет-пе55), спостерігається в різних підгрупах Т-клітин. СЮО117«Т-клітини є кращими для забезпечення джерела довготермінової Т- клітинно пам'яті.

Спочатку гейтують СОЗ-Т-клітини, потім СОЗяТ-клітини гейтують на СО4- та СОрвет- клітини. (Спостерігається) дуже сильна експресія та висока частота СО117-- клітин на СОвУТ-

Зо клітинах (верхня) та на СО4-Т-клітинах (нижня панель, зліва). Середня панель: експресія сСрабБкА/ССК7 в СОвя та СО4Т-клітини з високою популяцією на СО45КАнССК7 «Т-клітинах, які є прекурсорними Т клітинами (середня панель). Справа: СО117--Т-клітини (помічені синім кольором) є присутніми в периферичних ефекторних Т-клітинах в СЮАБВА-ССВ7-Т-клітинах (ефектори). СО84 Т-клітини; СЮО117-Т-клітини можуть бути присутніми в популяції прекурсорів

Т-клітин СО45КАжССТ7ж. Дані свідчать про те, що експресія СО117(, який) є маркером подібності Т-клітин до стовбурових клітин (51ет-пе55), спостерігається в різних підгрупах Т- клітин. СЮО117ЖТ-клітини є кращими для забезпечення джерела довготермінової Т-клітинно пам'яті. Також видно, що цитокіновий коктейль спричинює сильну експансію СО117--Т-клітини, забезпечуючи довготермінову імунну клтинну пам'ять, а також що СО117Т-клітини є присутніми в прекурсорних Т-клітинах, забезпечуючи довготермінові імунні відповіді на пухлини.

Приклад 27 - Експансія культури ТІЇ. з гліобластоми

Цей приклад описує процедуру культивації ТІ з раук підшлункової залози для функціонального тесту та імунотерапії.

Опис матеріалів, обладнання та витратних матеріалів наведений в Прикладі 1.

Пухлинну тканину, одержану від пацієнта, поміщають в стерильний контейнер. Тканину разрізають на шматочки 1-2 мм3 стерильним скальпелем. Шматочки тканини поміщають в лунки 24-пункового планшета по 1 шматочку на лунку. Середовище клітинної культури готують з використанням Сеїдго з 10 95 людської АВ сироватки. В це середовище додають ІІ -2, ІІ -15 та

І/-21 до кінцевої концентрації 1000 мкг/мл (и/ті) для 1-2, 10 нг/мл для кожного з 1-15 та І -21.

Крім того, додають до середовища РЕ5Т та амфотерицин. 1 мл середовища додають в кожну лунку і клітинну культура інкубують протягом 7 днів при 37 "С. Паралельно, МНКПК від здорового донора культивують в СеїЇдго, що містить 10 96 людської АВ сироватки. Визначають концентрацію МНКПК та довордять до концентрації 105/мл. МНКПК потім опромінюють протягом 18 хвилин при 55 Гр. Після опромінювання додають ОКТЗ до кінцевої концентрації 10 нг/мл. Ця культура називається живильними клітинами з ОКТЗ. В день 10 культури ТІЇ, 100 мкл культури фідерних клітин з ОКТЗ додають до кожної лунки 24-лункового планшета. Відповідно, культуру в кожній лунці (доводять) до кінцевої концентрації 10 нг/мл ОКТЗ та загальної кількості 105 живильних клітин. Співвідношення ТІЇ. та живильних клітин становить приблизно 1:10.

Приклад 28 - Експансія культури ТІЇ. з раку підшлункової залози. бо Пухлинну тканину, одержану від пацієнта, поміщають в стерильний контейнер. Тканину розрізають на шматочки 1-2 мм3 стерильним скальпелем. Шматочки тканини поміщають в лунки 24-пункового планшета по 1 шматочку на лунку. Середовище клітинної культури готують з використанням СеїЇдго з 10 96 людської АВ сироватки. Додають до цього середовища ІІ--2, 1-15 та ІС-21 до кінцевої концентрації 1000 мкг/мл (ш/ті) для 1-2, 10 нг/мл для кожного з 1-15 та ІІ - 21. Крім того, додають до середовища РЕ5Т та амфотерицин. Додають в кожну лунку 1 мл середовища та клітинну культуру інкубують протягом 4 днів при 37 "С. Паралельно, МНКПК від здорового донора культивують в СеїЇЇдго, що містить 10 96 людської АВ сироватки. Визначають концентрацію МНКПК та доводять до концентрації 105/мл. МНКПК потім опромінюють протягом 18 хвилин при 55 Гр. Після опромінювання додають ОКТЗ до кінцевої концентрації 10 нг/мл. Цю культуру називають живильними клітинами з ОКТЗ. В день 10 культури ТІЇ додають 100 мкл фідерної клітинної культури з ОКТЗ до кожної лунки 24-лункового планшета. Відповідно, культура в кожній лунці містить кінцеву концентрацію 10 нг/мл ОКТЗ та загальну кількість 105 живильних клітин. Співвідношення ТІЇ. та живильних клітин становить приблизно 1:10.

Приклад 29 - Процедура генерування клітинної лінії пухлини з тканини

Пухлинну тканину підшлункової залози одержують безпосередньо після операції та поміщають в стерильний контейнер. Пухлинну тканину розрізають на шматочки 1-2 мм3 стерильним скальпелем. Кожен шматочек тканини переносять в лунку 24-лункового планшета.

Додають в кожну лунку 1 мл культурального середовища КРМІ 1640 з 10 95 сироватки плоду корови. Середовище заміняють в день 7 та день 14, що означає, що культуральне середовище видаляють та заміняють на свіже культуральне середовище такого самого виду. Коли пухлинні клітини досягають дуже високої щільності, культуру переносять на б-лунковий планшет.

Приклад 30 - Визначення точного моменту часу для додавання фідерних клітин

Було знайдено, що додавання живильних клітин не приводить до гарної експансії інфільтруючих пухлину лімфоцитів, якщо живильні клітини додають, коли концентрація лімфоцитів є дуже низькою. Фіг. 20 А зображує культуру лімфоцитів після одного тижня інкубації. Детектують певну кількість лімфоцитів, однак концентрація лімфоцитів є нижчою за базову лінію експансії. Фіг. 208 та Фіг. 20С показують цю ж саму культуру лімфоцитів після двох тижнів інкубації. Тепер число лімфоцитів, які можуть бути детектовані, зросло до рівня вище базової лінії експансії. Живильні клітини можуть бути додані на цій стадії. Фіг. 10, Е та Е

Зо показують культуру через чотири дні, один тиждень та два тижня після додавання живильних клітин. На фігурах можна побачити, що число лімфоцитів різко зростає від зображення на Фіг. Ю до зображення на Фіг. Р. На Фіг. Е можна побачити, що лімфоцити збираються та атакують пухлинні клітини в культурі.

Приклад 31 - Аналіз фенотипу та експресії маркера активації/виснаження лімфоцитів, підданих експансії з ТІЇ, одержаних з гліобластоми.

Пухлинну тканину одержують від 16 пацієнтів з глобластомоюю. ТІЇ піддають експансії з тканини із цитокіновим коктейлем ЇЇ -2, 1-15 та І -21, згідно з протоколом Прикладу 1.

А)

Піддані експансії клітини аналізують методом протокової цитометрії на їх СО4/СО08 фенотип з використанням антитіла, спрямованого проти СОЗ, СО4 та СОВ8.

Результати зібрані у Таблиці 10.

Таблиця 10

Стать . Клітинна сра- (М7Є) Діагноз лінія | СОЗ-- | СОв8-- |СО4- сов- сСра-сСов пухлини евМ-А| 69 М (СВМістадіяїм) |М 075,50 11,40|8520| 292| 047 евМм-в| 66 (М 0 |РХА (стадія П-МЙ) |М 073,00 9010Щ|8951| 1,07 | 050 евМм-с| 64 (м (сВМуістадіяїм) |М 094,60 1240|8540| 213 | 025 евМм-р| 65 Ж (ОВМістадіяїм) |М 073,50 2420|7120| 3,71 | 0,99 евМ-Е| 54 |М (|СВМістадіяїм) |М 9820 4,00 189,90) 263 | 353 евмМ-Е| 70 м |сВМістадіяїм) |М 99,60 3,58 |89,90| 615 | 098 евМм-а| 49 |М |сВМуістадіяїм) |М 94,30 0,52 |77,80|21,60| 008 евМм-н| 76 |м (|сВМуістадіяїм) |М 092,70 з38,50|52,60| 580 | зо евмМм- | 45 |Мм |сВМуістадіяїм) |М 98,50 4420|281|52,90| 008 евМм-к| 67 |м (сВМістадіяїм) |М 8520 33,ж30|4940|10,80| 650 евМм-м|! 79 |м (|сВМістадіяїм) |М 99,90 0,02 92,50 7,39 | оо евМм-о| 17 м |АЕсстадіяй) М 8250 0,59 |84,70|14,60| 02 пм-16 Бв(17-799л1миЖж| 77777777 змлоояю7 177 ЇЇ 7 Її

Дані показують, що ТІЇ. можуть бути піддані експансії з кожної з індивідуальних пухлин, які переважно складаються з СОЗ-Т-клітин. В залежності від пацієнта, більшість Т-клітин належить до одного з СО4-, СОвяж або ОМ. Однак, найчастіше більшість належала до СО4-. Таблиця також показує, що цитокіновий коктейль є здатним забезпечувати експансію Т-клітин з пухлин

ЦНе різних гістологій (див. колонку 4 "Діагноз").

В)

Піддані експансії клітини аналізують методом протокової цитометрії на їх специфічний фенотип - прекурсорні (СО45КАЖССК7 я), центральної пам'яті (СО45КА-ССК7х), периферичної пам'яті (СО45КА-ССІ7-), або диференційовані ефекторні (СО45КАССК7-) Т-клітини, та експресію маркерів активації/виснаження в базових фенотипах СОв-, СО4- та подвійно негативних Т-клітин.

Антитіла, використовувані для аналізу популяцій ТІЇ методом протокової цитометрії, вказані у Таблиці 11.

Таблиця 11

Імунофенотип Внутрішньоклітинне рпепосуїе цитокінів

Регор ср4 Коте Огапде 1388.2 ср4 200

Суб.5

МО1- ек 0 ЇРЕСУ7 1710402 | 77777 Ї11111111111111111ї1

Діамантовий 111111111111111111004 1 |котеОгапрде | 13882 активація

Діамантовий тев МВ 570 Набір репертуару

Діамантовий - ЕЕ 1 510

Діамантовий 421

РОЇ 7 ЇРЕ ЕЛ Г///Ї 1171Ї1111111111111111ї1

Результати узагальнені на фіг. 22А та В. Більшість СОв., СО4- або ОМ Т-клітин належать до підгрупи центральної пам'яті Т-клітин, яка виявилася критично важливою для ефективної протиракової відповіді та довготермінової імунної пам'яті. Результати показують в середньому сильну експансію ОМ-Т-клітин. Ця підгрупа є високоактивованою та несе афінні Т-клітинні рецептори. Також спостерігають сильну експансію підгрупи СО45КАССтК7- прекурсорних Т- клітин, які зпбезпечують довготермінову пам'ять Т-клітинної відповіді, бажаної для довготермінового імунного нагляду.

Спостережувана експресія 4-188, І АС-3 або ТІМ-3 в Т-клітинах (див. Фіг. ЗВ) вказує на Т- клітини, специфічні по відношенню до антигена/пухлини. Приклад показує, що цитокіновий коктейль забезпечує експансію ТІЇ, які належать переважно до підгрупи пам'яті (центральної пам'яті) Т-клітин, що була асоційована з корисними клінічними відповідями, і також показує, що піддані експансії ТІЇ. несуть маркери, асоційовані з антигеноспецифічністю.

Приклад 32 - Аналіз фенотипу та експресії маркера активація/виснаження лімфоцитів, підданих експансії з ТІ, одержаних з раку підшлункової залози

Пухлинну тканину одержують від 17 пацієнтів з раком підшлункової залози. В Таблиці 12 наведені вік та стать пацієнтів, тип зразка та гістологія.

Таблиця 12

Цитокінови коктейль забезпечує експансію ТІЇ. з раків підшлункової залози різної гістології

Пацієнти | Вік | Стать | Зразок | ///// Гістолобя//////-:/2Ф«"

Рапс!ї | 72 |М Біопсія |папілярнааденокарцинома./-://"/С:(/БН8Н

Рапс2 | 66 |М (Пухлина |протоковааденокарцинома./-/:/; ////С(И

Рапе3 | 68 |М (Пухлина |аденокарциномадванадцятипалоїкишки:Ч/

Рапс4 | 67 |М (Пухлина |протоковааденокарцинома./-/:/;/:ХУУЯ.:Г(МО/

Рапсб | 50 |М Біопсія |протоковааденокарцинома./-/:/;/ :ЗХ|К"К/:Г(КЛДЬ

Рапс7 | 68 |М Біопсія |протоковааденокарцинома./-/:/;/| ЗХггКРГуЖ (Рапе9 | 71 |М Пухлина |протоковааденокарцинома./-/:/;/ХЖ/Ж.:/Г/иКЖс((

Рапст0 | 60 |Ж (Пухлина (аденокарцинома./7/:///НС(Х::/// З

Рапст2 | 70 |М (Пухлина |протоковааденокарцинома./-/:/;//ЗН.:У/ ЖУч залозисто-плоскоклітинна карцинома

Рапс14 | 60 |Ж (Пухлина протоковааденокарцинома./-/:/ //;ДН)../СГС(ДсуК

Рапс15 | 72 |М (Пухлина |протоковааденокарцинома./-/://;/ /ХЖ../:"(ЕС (Рапс17 | 61 ЇМ Біопсія |протоковааденокарцинома./-/:/;; /:/| (ЕФ:

ТІС піддають експансії з тканини із цитокіновим коктейлем 1-2, 1/-15 та 1-21 згідно з протоколом Прикладу 28. Фенотип СО4/С608 (визначають) з використанням антитіл, спрямованих проти СОЗ, СО4 та СОВ8.

А)

Піддані експансії клітини аналізують методом протокової цитометрії на їх СО4/СО08 фенотип з використанням антитіл, спрямованих проти СОЗ, СО4 та СОВ8. Результати зібрані у Таблиці 13.

Таблиця 13

Аналіз фенотипу Т-клітин у ТІЇ раку підшлункової залози. Домінантні популяції СО8-ТІЇ.

Рапсї 7 | .99699. | 433 | 8953 | 2953 | 4

Рапс2 7/7 |71799699.. | 561 2 | 298 | 276 | З

Рапс4 7/7 |77117996 | 505 2 | з | 23 | 5

Рапс5 | 799,5 2 | 99 | 0073 | 051 | 059

Рапст0 | 17986 2 | 922 2 | 575 | 06 | 147

Рапст14 | 179999. | 066 | 957 | 03 | 355

Рапсіб,ї | 79993. | з | 544 | 86 | 286

Меап 7777777 717996 2 | з | 54 | 253 | 206

Піддані експансії клітини аналізують методом протокової цитометрії на їх специфічний фенотип - прекурсорні (СО45КАнССК7 ), центральної пам'яті (СО45КА-ССК7), периферичної пам'яті (СО45КА-ССВ7-), або диференційовані ефекторні (СО45КАССКТ-) Т-клітини в базових фенотипах СО8-- та СО4 к. Результати узагальнені на Фіг. 23 та 24.

Більшість Сов, СОр4- або ОМ Т-клітин належать до підгрупи центральної пам'яті Т-клітин, яка була визначена як критична для ефективної протиракової відповіді та довготермінової імунної пам'яті. Результати показують в середньому сильну експансію ЮМ-Т-клітин (дані не наведені). Ця підгрупа є високоактивованою та несе афінні Т-клітинні рецептори. Також спостерігається сильна експансія СО45КАжССтК. прекурсорної підгрупи Т-клітин, які забезпечують відповіді Т-клітин довготермінової пам'яті, бажані для довготермінового імунного нагляду.

Спостережувана експресія 4-188, І АС-3 або ТІМ-3 в Т-клітинах (див. Фіг. 24) вказують на специфічні по відношенню до антигена/пухлини Т-клітини. Приклад показує, що цитокіновий коктейль забезпечує експансію ТІЇ, які належать переважно до підгрупи пам'яті (центральної пам'яті) Т-клітин, що були асоційовані з корисними клінічними відповідями, і також показує, що піддані експансії ТІЇ. несуть маркери, асоційовані з антигеноспецифічністю.

Приклад 33 - Аналіз довжини ТСК Т-клітин, підданих експансії з пухлинної тканини пацієнтів з раком підшлункової залози

Пухлинну тканину одержують від 17 пацієнтів з раком підшлункової залози. ТІЇ. піддають експансії з тканини із цитокіновим коктейлем 1-2, ІЇ/-15 та 1-21 згідно з протоколом Прикладу 28. Довжину ТОК вимірюють з використанням підходу на основі ПЛР. "Нормальним" для сімейства ТСК є гаусівсьий розподіл по довжині Т-клітинних рецепторів. Одиночні піки дозволяють припустити моноклональність індивідуальних сімейств ТОК. Дані, представлені на

Фіг. 25, показують, що композиція ТІ є моноклональною або поліклональною, дозволяючи припустити її сфокусованість проти аутологічних пухлинних мішеней, причому цитокіновий коктейль допомагає експансії сфокусованого репертуара ТОК.

Приклад 34 - Аналіз продукування цитокінів у лімфоцитах, підданих експансії з ТІ, одержаних від пацієнтів з гліобластомою

Пухлинну тканину одержують від пацієнтів з гліобластомою. ТІЇ піддають експансії з пухлинної тканини із цитокіновим коктейлем ІІ--2, ІІ -15 та 1-21 згідно з протоколом Прикладу 1.

Піддані експансії лімфоцити стимулюють пептидами, одержаними з пухлина-асоційованих антигенів, а саме, ЕСЕМмІ, МУ-Е5О-1 або сурвівіном, і вимірюють процентну частку клітин, що продукують будь-який з цитокінів ІЕМУу та ТМЕа.

Результати зображені на Фіг. 268. Для порівняння, максимальну стимуляцію тестують з

РМАЛ/нономіцином як позитивним контролем і фоновий сигнал визначають в присутності самого лише середовища (негативний контроль). Результати демонструють, що піддані експансії Т- клітини розпізнають ці загальнопоширені пухлинні антигени. Відповідно, цитокіновий коктейль забезпечує експансію Т-клітин з гліобластоми, які є реактивними до пухлинних антигенів, що були описані як клінічно релевантні та асоційовані з клінічними відповідями.

Приклад 35 - Аналіз продукування цитокінів у лімфоцитах, підданих експансії з ТІЇ, одержаних від пацієнтів з раком підшлункової залози

Пухлинну тканину одержують від пацієнтів з раком підшлункової залози.

ТІС піддають експансії з пухлинної тканини із цитокіновим коктейлем 1-2, 1-15 та 1-21 згідно з протоколом Прикладу 27. Піддані експансії лімфоцити стимулюють пептидами, одержаними з пухлина-асоційованих антигенів, а саме, ЕСЕМмгІ, МУ-ЕБО-1 або сурвівіном, і вимірюють процентну частку клітин, що продукують будь-який з цитокінів ІЕМу та ТМЕа.

Зо Результати зображені на Фіг. 27А. Фіг. 27В показує зображення аналізу методом протокової цитометрії для ММУ-Е5О-1. Результати підтверджують, що піддані експансії Т-клітини розпізнають ці загальнопоширені пухлинні антигени. Відповідно, цитокіновий коктейль забезпечує експансію Т-клітин з пухлини підшлункової залози, які є реактивними по відношенню до пухлинних антигенів, що були описані як клінічно релевантні та асоційовані з клінічними відповідями.

Приклад 36 - Аналіз продукування цитокінів у лімфоцитах, підданих експансії з ТІЇ, одержаних від пацієнтів з гліобластомою, (з) аутологічною стимуляцією

Пухлинну тканину одержують від пацієнтів з гліобластомою. ТІЇ піддають експансії з пухлинної тканини із цитокіновим коктейлем І1І-2, 1-15 та 1-21 згідно з протоколом Прикладу 27. Піддані експансії лімфоцити стимулюють аутологічними пухлинними клітинами. Результати зображені на Фіг. 28А. Фіг. 288 показує зображення аналізу методом протокової цитометрії.

Результати підтверджують, що піддані експансії Т-клітини розпізнають аутологічні пухлинні клітини. Відповідно, цитокіновий коктейль забезпечує експансію Т-клітин з гліобластоми, що є реактивними по відношенню до аутологічних пухлинних клітин, відповідно, до власних мутацій пацієнта.

Приклад 37: Зв'язок використання ТОК при раку підшлункової залози з розпізнаванням аутологічних пухлинних клітин

Пухлинну тканину одержують від пацієнтів з гліобластомою. ТІЇ піддають експансії з пухлинної тканини із цитокіновим коктейлем 1-2, 1-15 та 1-21 згідно з протоколом Прикладу 27. Піддані експансії лімфоцити стимулюють аутологічними пухлинними клітинами. ТІЇ. спочатку гейтують на СОЗЖТ-клітини, потім на СО4-- та СО8--Т-клітини. Тестують частоту індивідуальних сімейств МВ з використанням панелі антитіл до ТОК МВ. Ця панель ТСК охоплює приблизно 7596 людського репертуара ТСК, отже, існує можливість того, що не всі сімейства ТОК Мр охоплені в достатньому ступені. Розподіл сімейств МВ ТОК складає приблизно 2-6 95 в кожному сімействі, за винятком ТС МВ 2, які можуть досягати значень більше 10 95. Таблиця 14 зображує кращу експансію сімейства Мр-2 в ТІЇ. від пацієнтів з глобластомою.

Таблиця 14

ЕЕ КВ М ЕМВ ММК КЕ: МА УК УВК ИНА УВА ЗИ МАЕ: КВУ МИ УК МН ЗИМ ВН БАХ ВА: МБ ВУ НВЕ смс | МКК збі оо о 19133. 22100801 025: 237 ОВ 035, ЗА М 290035, 006 МЖК о 103939 110273 со 074011 10361003 018 010023 011 1153 167 001 015 МО 326: 003: 019447 070 003: 008: ба Щі (ОБ 0.07 | де см | 35 М за, оо олово бяв та БЮ БІ МІРІ ЗіБ ЗБ ЗНО 135 0 М з соломі пл, сов) 074: 252929 : 004 076033 082 038086 325053 2171234 1121202 015 387 197 028 010292: 37: 000: 053 | 4070 само ск | 1491732 БАЗІ 00 ОМЯ 065 0ДО 2000119 АВ ЗМ ета 506 ІВ 65 МОВАМИ ОМ ООВІБО ЗІ С18300120 | 746 соа ММЖХ збо ЗХ 001 011 087 Ід 499032 123 014 обі 220 114 2295: 060 603 527 000 006439 854: 16300256) 746 смак біз Ж 133 оо5ооля 023005 007035 оз бЖ біз, ал оя бою МЖК ооо36 зем 1331 моно сраю| 012: 167 100: 007: 009: 223 008 180 680 123 100 од»: 0дб 208056 074 38 АЮ 125: 004 ЛВв бл 009 8 смс ао6 МОЖ бяг оо, яяя од ово ою, вломе о МВ ояоо5ез0озя? 227 оз оо об о4; 655008 ВоЮ, сов 025: 248 211 1003 011 1016 0.02 003003 025: 556 005: 1М 006: 010 005 1987 170 027: 003: 031 ЩО 002 0.02 | 6255 см ме 009 017 801103 006 ОБ 005 00603 МО 004 002: 003 0020 012 МЖК ооо оо 008 384095 005 | 6576,

Сов ЗЕ 0002009: 000: 000 000: 0.00: 000000 000: 000: 000: 000: 000: 870: 000 526: 000 000: 000: 000: 345: 0001 000 | 27 смс дк 000:054 000 000 000 0070 000 000 008005 бо: 00 МЖК ото 037 001 00000010 Я 001: 001 03 | вавІ, сраю| 000: 000 000: 000 000: 000 000 000 000 000: зяБ 000: 000 000: 357: 000 000: 000 ЗХ 000 204 000000 000. 5137 ма | МВ 1 083 Б ОО ОВ ОБ 000, КЛ 038 ВІ: АЗОВ 008032, 168 0211020 009. 352. 013: 046 542 | ЗОВ сов 006: 000: 000: 009: 000: 025: 0.00: 0.00: 000 Те 011 007: 000: 008: 027: 00 МУ 005 000: 000005 050: 995 019 | 9747 см жо ЖЖ ооо оо обо 001000 001 009 001 000 00710061 000 001000 001 001002 000000 001: 001 000 ГтоБої сраю| 000: 000 000: 000 ЗХ 000000 000000 065027 000: 000 000: 000: 000: 000: 000: 000: 009 043 000: 009 00. 9835 само сою обо: ож: ою: ооо ом 032 бю ою о об 000 0 бю о об ою 000 бою ою ци ММ. пло ою Пост свв рек ов: 005 Я 0039 043009 0211097 302002 029: 053 009 БИ Мб ЖК 159 006 0310506: 01138 | ЗВУ сов) 000: 003: 012: 000: 037 006 000 000004 265: 000: 004: 000: 006: 038: 015: 077: 006 003 009 045: 004: 0217 0.20) 5.76 мо | 113201 4461047 732 047391 119 МИ АВ Ме ЗІБ 1550: 32427372 529 28 ЗІ ДО 5 МЗ 1 аЯ6 8129, сов 1 2090 038: 0080167 СОБІ ДЯ 151592 235: 072 063: 034 052: 50 БА 1801417 194: 708132 Ж 109: 3.82 | 93,91 св рват іа М ох ов оі5 020655 вд 170 Ма 183 ПО Ж 106 18100097 083001 010023 0301 036 | 6БА7, сов 1721372: 3791 098 1 000 2 053 085 199293 2310: 355: 043: 5831 154: 195: 308 1870: 5.09 1,52: 000: 00022330: 000: ФЯБ | 10644 сма ж 027 М 133003 033 126 005 507 0 102 762 01018018 ОР 009 013 01040003 035 008: 001 оо | БобБ, сов ов: ом 002: 001045: 010 002 ЩО 000 007 007 010: 004 005: 027027 00004 006: 005: 001 006: 011 058 | 9342 де 137 2381341 00 0160027, 006005, 095, ДОЮ 031013 051315 018015 28023 006: 012 012. 0201022 0831557, совю| 370: 230: 309: 008: 026: 089: 013 025139 022 297 030 МО за 156 од ов 192 2180: 026115 106: 040 583676

Дані у Таблиці 14 показують, що індивідуальні ТОК МВ, краще, зазнають експансії в ТІ. Слід відзначити, що кклональність може бути визначена тільки шляхом секвенування. Слід відзначити, що цитокіновий коктейль забезпечує експансію різних сімейств ТСК МВ у індивідуальних пацієнтів. Цей ефект спостерігається у пацієнтів з гліобластомою, а також у пацієнтів з раком підшлункової залози. Слід також відзначити, що деякі ТІЇ складаються з одного або двох сімейств МВ, демонструючи експансію високосфокусованих ТС МВ, що дозволяє припустити процес антиген-стимульованої експансії Т-клітин. Деякі ТІЇ, які були визначені нами як такі, що переважно зазнають експансії, виявилися моноклональними. Таким чином, цитокіновий коктейль 1-2, ІІ -15 та І/-21 забезпечує експансію сфокусованої Т-клітинної відповіді, спрямованої проти власних пухлинних клітин пацієнта.

Приклад 38 - Зв'язок використання ТОК при раку підшлункової залози з розпізнаванням аутологічних пухлинних клітин

Пухлинну тканину одержують від пацієнтів з раком підшлункової залози. ТІЇ піддають експансії з пухлинної тканини із цитокіновим коктейлем 1-2, 1-15 та І--21 згідно з протоколом

Прикладу 28.

Клітини забарвлюють методом протокової цитометрії з використанням СОЗ, СО04 та СО8 в комбінації з антитілом ТОК МВ. (Використовують) панель, що охоплює до 7595 повного репертуара ТОК МВ. Якщо певні сімейства Т-клітин потрапили до 25 95, не охоплених цією панеллю, вони не захоплюються в цій панелі. Результати зібрані у Таблиці 15.

Таблиця 15 7 Рапсі Рапс2 Рапс З Рапс 4 Рапс 5 Рапс 6 о |с04 |Со8 |сС04 |Со8 |С04 |Со8 |Со4 |СО8 |с04 |СО8 |Ср4 |СО8

МВ1і | 28 |771| 32 | 23 | 34 08 | 02 | 21 | 15 | 02 | 07 мв2г | 80 | 06 | 98 / 26 | 48 / 02 | 85) 20 1 00 | 00 | 9,6 | 19,95

МВ3 | 2 | 02 | 48 1,9 |267 05 | 48 | 83 / 00 | бл | 42 | 03 мА | 04/00 | 00/00 |о01 00/00 |о00о00|о00 | ооо мв5.1 | 04 | 04 | 07 | 05 | 03 00 | о | 00100 | 03 | 90 | оз мв5.2 | 02 | 01 | 15100 | 15 00 | 0 | 02 | 02 | 00 | 02 | 15,7 мв5.3 | ол | ом | 16 | 04 | 19 00 | 00 | 00 100 | 00 | оз | ом мв7.1 | 02 | 03 | 07 | 21 | 09 34 | 02 | ол | ол | 00 | ом | о мв72 | 66 | 00 | 03 | 0 | 09 | 1,7 | 02 | ол | 00 | 00 | ли | ом мВ | 19/17 |з37|061|29 | о |04|04|427| 4 | 12 | о ме | 16 00108030 оо |о1 14050 17 | 00

МВ |051001051/02)1|7,500|о01 10703100 06 23

МВ12 |32 0919/0925 0 |07|78 00100 06 03

Візи | 24 | 03 | 46 | 104 150526 | 42 | 00 | ол 08 | 00 уВі32 | зл | 02 | 14 | 04 | 1,8 02 | 02 | 01 | 00 | 00 02 | 06 уві36 | 28 | 9 | 36 | 051 12 | ол | 02 | 01102 | о 02 | оо

Мв14 | 719 | 14 | 20 | 36 | 13 633) 04 | 07 | 00 | 00 10 | 53 віє |24 | 170 | 69/69 | 53 / 03 | 41 | 11 | 00 | ол 08 | 00

МВ17 |46|01 29/78/0800 |02|001|00 100 15 | 00 уві | 24 | 00210005 00 |о01|о00|04/|00 04 | 02

Мвго | 70 | 59 66 1381 46 | о | 37 | 01 | 00 | 04 | о | 02

Ув2і3 | 04 | 05 38 | 43 | 04 | ол | о | о 10032 | 62 | ол

Мв22 || ог | 33 | 717 | 28 02 | 62 | 18 | 01 | 00 5 | 2 мвгз | 3703104 |о011|08108)|09)|051|176)|05|ом | 46 11111117 рапс | Рапс8 | Рапс9 | Рапс!0 | Рапсл!ї / 1004 |с08 |ср4 |с04 |Со8 ср4 |с08 со8 |с04 (сОо8

МВ! | 03 | 01 | 75 | 44 | 71 11350) 05 12 | 06 | о

Маг | о | 07 | 74 | 41 | 398) 24 | 02 | 17 | 120 | 00

МВ3 | 5 | 287 | 24 | 37 | 13 | 00 | 00 7120 | 10 | 00

МВА | о | 00 | о | 60 | о 00 | 00 00 | 32 00

Ув51 | а | 62 | 93 | 108 | 1 06 | 07 00 | 36 | о

Мв5.2 | 24 | 02 | 03 | 13 | 94 | ол. | о 1 02 | 01 | о

Мв5.3 | 00 | 09 | 06 | 07 | 180) 02 | 00 / ол | 00 | 00

Мв7л1 | о | 02 | 5 | 051 715 0000 0306 00

Мв72 | 70 | 04 | 53 | 16 | ол 1 00 | 00 38 | 139 | 00

МВВ | 54 | 05 | 23 | 27 | 14 | 04 | 03 | 22 | 05 | о

Ме | 02 | 0 | 70 | 34 | ї2 | 05 | 02 | ол | 48 | 00

МВ | 40 | їо | 02 | 06 | 03 | ол. | 02 00 | 10 | ол

Мв12 | 00 | 00 | о | 16 | 05 00 | 00 / ол | 04 | 00 віз | вл | 7100 | 56 | 37 | 0 355) 01 165) 50 00 увІ32 | 03 | її | 03 | 62 | 07 | 02 | 00 / 00 | 05 / 992

Мві36 | 77 | 0 | 32 | 20 | 03 | 06 | 00 / 69 | 04 | 00

Мв14 | 32 | 28 | 06 | 36 | 08 | ол. | 00 / 14 | 04 | ол

МВ | о | 03 | о | о | 02 00 | 02 254 | 05 | 00

МВ17 | 70 | 329 | 1,3 | 75 | 03 | ол | 123 | ол | 124 00 ві | 70 | 02 | 36 | 05 | 02 | ол. | 02 00 | 04 | 00

Мвго | ол | 00 | 14 | 25 | 05 | ол | о 1 04 | 01 | оо

Мв2і3 | 24 | 00 | 06 | 24 | 01 1 09 | 00 / 03 | 05 00

Мв22 | 02 | 26 | 14 | 34 | 10 | 36 | 01 06 | 19 | 07 мвагз || о | о 1021451 07106 | о | 6 | ол | оо 1111111 Рапсї2 | Рапс!3 | Рапс!4 | Рапсі5 | Рапсіб / . |с04 со8 |с04 |Со8 )|сС04 |Со8 |с04 |Со8 |сС04 /|СО8

МВ! | 14 258 | ол | 03 | 09 | 162 | 06 | 28 | 03 | 04

Маг | 75 48 | 15 | 06 | 5 | 07 | 293 | 15 | 489 | 10

Мв3 | 17 1 88 | 00 | 00 | 133 | 20 | ли | 179 | 117 | 02

МВА | 22 04 | 48 | 00 | 09 | 01 | 83 | т2 | ол | о

Мв5.1 | 34 05 | 46 | 02 | 27 | 08 | 42 | 16 | 152 | 02

Мв5.2 | 03 / 18 | ол | ом | 04 | 0 | 23 | 08 | 712 | 0

Мв5.3 | 03 716 | 0 | 00 | о | 03 | 42 | 03 | 09 | 00

Мв7л1 | 16 28 | ол | 03 | 03 | 63 | 09 | 18 | 03 | 22

Мв72 | 04 | ол | 00 | 00 | 07 | 48 | 04 | 0 | 00 | 00 ме | 36 / 18 | 171 | 05 | 17 | 08 | 719 | 41 | 05 | 03

МВ1ї | 08 | 03 | 02 | 02 | 03 | 02 | 14 | 07 | 04 | 02

МВ12 03 | 10 | 03 | 00 | 1,5 | 59 | 03 | 02 | 03 | ом

МВ131 92 | 03 | 05 | 02 | 43 | 196 | 07 | 08 | 26 | и

МВ132 | 25 | 14 | 02 | 02 | 44 | 09 | 18 | 230 | 04 | 06

МВ136 | 15 02 | 05 | 02 | 03 | 19 | 06 | 09 | 03 | 04

МВ14 007 | 35 | 01 | 03 | 29 | 25 | 09 | 72 | 21 | 06

Мб 01 о 1 00 | 02 | 02 | 08 | 02 | 02 | ол | 00

МВ17 | 33 | 23 | 31 | 09 | 99 | 14 | 13 | 19 | 15 | 05

МВІ8 03 | 03 | 05 | 0 | 09 | зл | 33 | 36 | 04 | з3 мМв2го 14 | 02 | 00 | 00 | 07 | 03 | 05 | 06 | 00 | 08

Мв21.3 05 80 | 05 | 00 | Т2 | 05 | 04 | 04 | бе | 16

Мв22 | 52 | 20 | 26,0 | 659 | 36 | 08 | 07 | 29 | бе | 64

Продукування ІЕМу вимірюють через З дні після експозиції ТІЇ аутологічними пухлинними клітинами (суспензія окремих клітин). Високий рівень продукування ІЄМу спостерігається тільки після аутологічних пухлинних клітин (див. Фіг. 35) Продукування ІРМу повністю блокується антитілом проти М/6/32 (блокує СО8--ТІ). Як контроль, антитіло 243, що блокуе СО4-ТІЇ, є нездатним заблокувати реактивність, реактивні Т-клітини в підданих експансії клітинах лімфоцитів є усі СОв'ж. Дані показують, що цитокіновий коктейль забезпечує експансію ТІГ., які дуже сфокусовані та специфічно розпізнають аутологічні пухлинні клітини від пацієнтів з раком підшлункової залози. Моноклональні сімейства ТОК в ТІЇ. від пацієнтів з раком підшлункової залози: 1-2, 1-15 та ІІ-21 забезпечували експансію, переважно, індивідуальних сімейств ТС

МВ, так, переважна експансія сімейств Т-клітин асоційована з антигеноспецифічністю та сфокусованою протипухлинною реактивниіїстю. Деякі з цих сімейств МВ, що переважно зазнають експансії, містять моноклональні Т-клітини, що мають одноланцюговий ТОК МВ. Така експансія моноклональних ТСК вказує на сфокусовану протиракову відповідь. Аналізи функціональної відповіді показали, що моноклональні піддані експансії ТІЇ. розпізнають аутологічні пухлинні клітини.

Приклад 39 - Аналіз цитолітичної відповіді підданих експансії ТІЇ від пацієнтів з гліобластомою проти аутологічних пухлинних клітин

Пухлинну тканину одержують від пацієнтів з гліобластомою. ТІЇ піддають експансії з пухлинної тканини із цитокіновим коктейлем І1І-2, 1-15 та 1-21 згідно з протоколом Прикладу 28. Аутологічні пухлинні клітини генерують згідно з протоколом, наведеним у Прикладі 29.

Аутологічні пухлинні клітини мітять радіоактивністю та культивують з підданими експансії ТІЇ. протягом 4 год. Загибель пухлинних клітин приводить до вивільнення радіоактивності, яку потім вимірюють. Принципова схема способу зображена на фіг. 21. Результати, зображені на Фіг. 31, підтверджують цитотоксичний ефект, залежний від співвідношення ТІЇ до пухлинних клітин.

Дані показують, що цитокіновий коктейль забезпечує експансію ТІ, що є сильно цитотоксичними (суїохіс) проти аутологічних пухлинних клітин.

Альтернативно, піддані експансії моноклональні Т-клітини та/або, краще, піддані експансії

Зо ТІЇ тестують на їх цитотоксичність з використанням цього ж самого тесту. Результати зображені на Фіг. 32. Таблиця 16 показує, що ці імунні відповіді є специфічно спрямованими проти аутологічних пухлинних клітин. Дані показують, що цитокіновий коктейль забезпечує експансію

ТІЇ зі специфічною реактивністю, включаючи цитотоксичні відповіді, проти аутологічної пухлини.

В)

В паралельному експерименті, аутологічні пухлинні клітини інкубують протягом трьох днів з

ТІ, підданими експансії з гліобластоми із цитокіновим коктейлем 1-15, ІЇ/-21 та 1-2. Після інкубації вимірюють продукування ІЕМу (пг/мл) методом твердофазового імуноферментного аналізу (ЕГІЗА). Для визначення того, чи є СО4-- або СО8-- клітини відповідальними за пухлинні відповіді, використовують антитіла, що блокують відповіді антигену МНС класу | (М/6/32), впливаючи на СО8--Т-клітини або блокують НІ А-ОК (відповіді МНС класу Ії), впливаючи на брат -клітини. Результати зібрані у Таблиці 16.

Таблиця 16 . . Аутологічна Аутологічна Аутологічна оВМ(стадя!М) (ОВМ-АА | 1540 | -: 00017777 000 2

РХА(стадіяП-Ш) (ОВМ-АВ | 25119 | 109975 | 000 2 2щ(Мю оВМ(стадя!М) |0ВМ-С | 1332 | 30947 000 2 щ-- оВМ(стадія!М) (ОВМ-Е | 678996 | 252 1/7 000 2 оВМ(стадя!М) фо0вМ-Я | 000 | --.юЙо000 1777000 2 овВМ(стадя!М) (0вВМ-К | 8947 | - 00017777 000 2

АО (стадія!) (ВМ | 000 2 | щ- 000 17777000 овВМ(стадя!М) |0ВМ-М | 000 | --: 000777771777771000 2

О(стадія!) |0ВМ-М | 000 2 | щ- 00017777 000 2

АЕ(стадія!) |08МО | 000 | 000 2 щ | 000 / (Рецидив,некроз |0ВМ-Р. | 3626 | 021 24 | -( (И000

ТІС, що продемонстрували відсутність продукування ІЄМу, були сильно цитотоксичними, як було визначено стандартним аналізом вивільнення СК51. Дані показують, що ТІЇ специфічно продукують ІЄМгамма проти аутологічних пухлинних клітин.

Приклад 40 - Аналіз цитолітичної відповіді підданих експансії ТІЇ від пацієнтів з раком підшлункової залози проти аутологічних пухлинних клітин

Пухлинну тканину одержують від пацієнтів з раком підшлункової залози. ТІЇ. піддають експансії з пухлинної тканини із цитокіновим коктейлем 1-2, 1-15 та 1-21 згідно з протоколом

Прикладу 28. Аутологічні пухлинні клітини генерують згідно з протоколом, наведеним у Прикладі 29. Аутологічні пухлинні клітини мітять радіоактивністю та культивують з підданими експансії ТІЇ. протягом 4 год. Загибель пухлинних клітин приводить до вивільнення радіоактивності, яку потім вимірюють. Принципова схема способу зображена на Фіг. 7. Для порівняння та як контроль використовують систему аутологічна (пухлина) (меланома) - ТІЇ. Результати, зображені на фіг. 33, підтверджують цитотоксичний ефект. Дані показують, що цитокіновий коктейль також забезпечує експансію ТІЇ від пацієнтів з раком підшлункової залози. Ці ТІ є високосфокусованими - на основі використання ТСК - та демонструють специфічну реактивність, включаючи цитотоксичні відповіді, проти аутологічної пухлини.

Приклад 41 - Аналіз розподілу експресії СХСКЗ СА клітин

Пухлинну тканину одержують від пацієнтів з гліобластомою. ТІЇ піддають експансії з пухлинної тканини із цитокіновим коктейлем І1І-2, 1-15 та 1-21 згідно з протоколом Прикладу 27. Клітини аналізують методом протокової цитометрії на експресію маркера, що визначає Т- клітинну функцію та хомінг-ефект.

Результати аналізу зібрані у Таблиці 17. Клітини ТП1, а також СХСОКЗ становили менш ніж 10 95 до експансії. Дані показують, що цитокіновий коктейль приводить до продукту Т-клітин, в якому СО8- клітини складаються по суті з СХСКЗ-СОв8 Т-клітин. Цей фенотип є здатним проникати в пухлинну тканину. СО4-Т-клітини майже усі мають профіль Тні. Профіль Тні (продукування ІЕМгамма та ТМЕальфа) приводить до поліпшеної протипухлинної відповіді.

Також присутні СОЗ3-С04-208- (ОМ) Т-клітини, що є підгрупою Т-клітин, асоційованих із

Зо сильними аутоїмунною та пухлинною відповідями, яка також експресує маркер СХСОКЗ, який зобезпечує можливість кращого проникнення в пухлинну тканину.

Таблиця 17

Совх СОтотах

СХСВЗх

Пол Ко Я НО УДО 0,073

Сссвбя ссвбя

Сра ТНІ17 0,047 сснве- сснве-

На 000010 0,038.Ю сор107ая ще СОтотах

СХСВЗя

Приклад 42 - Розпізнавання ТІЇ загальнопоширених пухлинних антигенів від пацієнтів з раком підшлункової залози

ТАА у вигляді 15 перекривних пептидів інкубують протягом трьох днів з ТІЇ та вимірюють продукування ІЕМу (пг/мл) методом ЕГІЗА. На додаток, антигенні відповіді блокують або антитілом, що блокує антигенні відповіді МНС класу І (МУб/32), що впливає на СО8-«Т-клітини, або блокують НІ А-ОМК (відповіді МНС класу Ії, 1243), що впливає на СО4-Т-клітини.

Продукування ІРМу (пг/мл) в кожному із зразків наведено в Таблиці 18. Продукування ІЄМУ в ТІ, що є антигеноспецифічним, як показано блокуванням Т-клітин, спрямованих проти МНС класу І (блокування СО8яжТ-клітин) або проти МНС класу І (блокування СО4-ж). Результати підтверджують, що ТІЇ продукують ІЕМу проти загальнопоширених ракових антигенів, зокрема,

ММУ-Е5О-1 або мезотеліну від пацієнтів з раком підшлункової залози.

Таблиця 18

Мезо- М мУу- |МмУ-Е5О-| МУ-Е5О- | Сур- | Сурвівін | Сурвівін | Мезо- | телін тепін

ЕБЗО-1 | 14Уу6/32 1 243 вівін Му 6/32 чі 243 телін -1 243 -Му6/32

Рапс1| 697 | 0 2 71741 5 щ0 | 0 | о | о |26223|1596| 0 г420| 0 1. юЮюЮюД0 ЇЇ о0 1 0 | 0 |29127|15350| 0 51,02 | 31,96 33,74 77,99 49,24 36,72 | 44,46 | 34,34 | 27,21

Рапс р СТ НОСИ НОСА НАС НОВОСТИ НОСИ ЕЕ НОСИ НОСТ рЕаО сс СНИ НОСА ЗУ НОНОСТНННЯ НОСОВА СУЯ

Багато модифікацій та інших варіантів втілення винаходу, викладених в даному документі. будуть очевидними для кваліфікованих фахівців в галузі техніки, до якої належить винахід, що можуть користуватися наведеним вище описом та супровідними кресленнями. Таким чином, слід розуміти, що винахід не має обмежуватися конкретними розкритими варіантами втілення, і що модифікації та інші варіанти втілення мають бути включені до обсягу прикладеної формули винаходу. Хоча в даному документі застосовуються конкретні терміни, вони використовуються лише узагальнено та описово, а не з метою обмеження.

ПОСИЛАННЯ

1. Опп СР, Ой Гу, 5спгєірег ВО. Те іттипобріоіоду ої сапсег іттипозигмеїйапсе апа іттипоеайпа. Іттипйну. 2004:21(2):137-48. 2. Возепрегу 5А, Невійо МР, Мапд УС, Могдап ВА, ЮОшаїІєу МЕ. Адоріїме сеї! іапвгег: а сіїпіса! раї іо еПесіїме сапсег іттипоїпегару. Майте геміє5 Сапсег. 2008:8(4):299-308. 3. Возепрегу 5А, РасКага вВ5, АебегзоЇїй РМ, боіотоп 0, Тораїїап 5І, Тоу 5Т, єї аІ. Ове ої

Тмтог-іпіїйкайпо Іутрпосуїе5 апа іпіепеиКіп-2 іп Ше іттипоїйпегару ої райепіб м/йй теїавіаїййс теїапота. А ргєїїтіпагу герой. Пе Мем Епдіапа |ошитаї ої тедісіпе. 1988;319(25):1676-80. 4. ВобБріп5 РЕ, Си МС, ЕІ-Сатії М, Її МЕ, Сто55 С, Сапйпег .), еї аі. Міпіпд ехотіс зедоепсіпа даїа о ідепійу тшиїаїгей апіїдеп5 гесодпігей Бу адоріїмеїу ігапвівїтей їштог-геасіїме Т сеїІв. Маї

Меа. 2013;19(6):747-52. 5. Тап Е, ТитсоНе 5, Сго5 А, ВоБбріпо РЕ, и МС, ЮцаІеу МЕ, єї аїЇ. Сапсег іттипоїНегару разед опо тшайоп-зресіїс С0О4-1 сейбв іп а орайепі м/йй ерййеїйаІ сапсег. Зсієпсе. 2014;344(6184):641-5. б. 1 М, Ци 5, Негппапаеє? .), Мепсе І, Ну Р, Вадмапуї Ї. МАВТ-1-5ресіїїс теіапота Штог- іптійгасйпу І утрпосуїе5 таїіпіаіпіпд СО28 ехргезвіоп Паме ітргомеад зигміма! апа ехрапзіоп сараріїйу

Тоїом/іпоу апіїдепіс гевійтшацоп іп міго. дошигпаї ої іттипоіоду. 2010;184(1):452-65. 7. Уипе СН. Рітіпсіріеєз ої адоріїме Т сеїЇ сапсег Шегару. Тпе Чошгпаї! ої сіїпіса! іпмевіїдайоп. 2007;:117(5)1204-12. 8. Оцадієу МЕ, УУипаепісй У, Мівпітига МІ, Ми 0, Мапа УС, Тораїїап 5І,, еї а). Адоріїме їМапвтег ої сіопей теІапота-геасіїме Т Іутрпосуїев ог Пе еаїтепі ої райепів м/йй теїавіаййс теїіапота.

Уоитаї! ої іттипоїпегару. 2001;24(4):363-73. 9. ОцаІєу МЕ, УУипаеплісйи УВА, Зпепоп ТЕ, Емеп /), Нозепрего 5А. Сепегаїйоп ої Тштог-іптйгайпа

ІутрПпосуїє сийигебз їТог ибве іп адоріїме ігапеїєї Шегару їог теїапота раїйепіб. Уошцтаї! ої

Коо) іттипоїНегару. 2003;26(4):332-42. 10. Мебег У, Аїкіп5 М, Нуги Р, Вадмапуї І, 52по! М, Меєеє С, еї аї. М/піе рарег оп адоріїме сеї!

ІШегару їог сапсег м/йй Шштог-іпіїйгакпа Іутрпосуїев: а герогі ої Ше СТЕР зибсоттіЦеє оп адоріїме сеї! Шегару. Сіїпіса! сапсег гезеагсій: ап ойісіа! |оигпа! ої Ше Атегісап Авзосіайоп ог Сапсег

Везеагсі. 2011;17(7):1664-73. 11. Тгап КО, 2пои У, ЮОипйіїпдег КН, Гапдпап ММ, Зпепйоп ТЕ, Уипаепісй УВА, єї аї. Міпітайну сипигей їштог-іпіійгайпод Іутрпосуїез аі5ріау оріїтаї! сНагасіегівіісв5 Тог адоріїме сеї! Шегару. Чоигтпаї ої іттипоїШегару. 2008;31(8):742-51. 12. Мдиуєп ІТ, Меп РН, Міеє У, І іадів М, Спагагіап 0, АІ-Нареєб А, єї аї. Ехрапзіоп апа сПпагасієгігайоп о ої йитап о теіапота іштог-іпіїйгайпу Іутрпосуїєз (ТІ. 5). Ріоб5 опе. 2010;5(11):613940. 13. 2пои У, ЮОцаієу МЕ, ВКозепрега ЗА, Ноббріпе РЕ. 5еїІесіїме дгомлЛи, іп міо апа іп мімо, Е іпаїмідца! Т сеї! сіопе5 їот їштог-іпіійганйтд Іутрпосуїез обіаіїпейд їот раїйепів м/їй теїапота.

Уоитаї! ої іттипоїіоду. 2004:173(12):7622-9. 14. Нипдег ММ, УМаїйеп Н, Сао У, Непагпске ОМУ, Вейу 92, Водтуге В, єї аїЇ.Тгеаїтепі ої теїавіаїййс теіапота м/йй ашоіодои5 СО4-Т сеї адаіпвї ММ-ЕБО-1. Тне Мем Еподіапа іоштаї ої теадісіпе. 2008;358(25):2698-703. 15. Кадати Н, 5пи! 5. Ригітісайноп ої І -зеІесіїіп(Іом) сеї рготоїев Ше депегаїйоп ої піднпіу роїепі

Ср4 апійштог еПесіог Т Іутрпосуїев. Чошигпаї ої іттипоїіоду. 1998;160(7):3444-52. 16. Хіє У, АКріпаїїї А, Магіз С, Нірків5 ЕЇ, І апе М, Кмоп ЕК, вї аї. Маїме Штогзресіїс СрА(я) Т сеїв ашегепіаїва іп мімо егадісаїе езіабіїзней теІапота. Пе Уошгтпаї ої ехрегітепіа! теадісіпе. 2010:207(3):651-67. 17. МасКкепзеп А, Меїдепрацег М, Моді 5, Іаштег М, Вегодег .), Апагеезеп В. РНавзе І вішау ої адоріїме Т-сеїІ ІНегару изіпу апіїідеп-5ресіїс СО8--Т сеїЇв Тог Те ігєаїтепі ої райепів м/йй теїазіаїйс теїапота. доштпаї ої сіїпіса! опсоіоду: ойісіа! (оштпаї! ої Ше Атегісап 5осівїу ої Сіїпіса! Опсоіоду. 0 200624(31):5060-9. 18.дадег Е, Спайс 5, Мадаїа М, біосКеп Е, дадег 0, Катасн ., еї а!. Іпдисіоп ої ргітагу ММ-

ЕБЗО-1 іттипйпу: СО8-Т ІутрПосуїе апа апііроду гезропзез іп реріідемассіпаївейд раїепів м/йй МУ -

Е5ЗО-1 нсапсегв. Ргос Маї! Асай 5сі 0 5 А. 2000:97(22):12198-203. 19.Но МУ, Мдиуеп НМ, УМО М, Киваї! У, Стеепрега РО. Іп мйго теїподз гог депегаїіпд СО8--Т- 60 сеї сіопе5 ог іттипоШегару їот Ше паїме герепоїіге. дЧоцта! ої іттипоіодіса!І тейодв5.

2006;310(1-2):40-52. 20. Оцаієу МЕ, М/ипаепісн УВ, Роббіпо РЕ, Мапа УС, Нми Р, Ззспулагігепігибег 0, еї аі. Сапсег гедгтезвіоп апа ашоіттипійу іп раїйєпіх апйег сіопа! героршіайоп м/йй апшитог Іутрпосуїев.

Зсієпсе. 2002;298(5594):850-4. 21. Гога СМ, Маїагезе С, Ноуага УК, ВакКег ВУ), Вісот 5, І есНієг ВІ. І еріїп тоадшіаїез Ше Т- сеї іттипе теб5ропбе ап темегзе5 віагмайоп-іпдисей іттипозирргевзвзіоп. / Маїшге. 1998;394(6696):897-901. 22. ТапаКа М, 5идапаті Т, Кіт-Заїйо М, Тода С, Твицїї М, Осні К, єї аї. Воїє ої сепіна! Іеріїп відпаїїпу іп Ше 5іагу/айоп-іпдисей апегайоп ої В-сеїЇ аемеюртепі. Пе уЧошитаї ої пеигозсівепсе: Те оНісіа! їіоитаї ої Ше 5осівєїу тог Мешгозсіепсе. 2011;31(23):8373-80. 23. Ваміпагап В, Кнап М, МакКауа НІ, Гі 5, І оербегтапп У, Мадаиг МБ, еї а!. Массіпе асіїмайоп ої Ше пиШіепі 5епбогї С2СМ2 іп депагйіс сей еппапсеб5 апідеп ргезепіайоп. осієпсе. 2014;343(6168):313-7. 24. Реагзоп С, 5іма А, 5еддоп В. Еходепоиз атіпо асідв аге ез5зепіа! їог іпіепеикКіп-7 іпадисейд

СО8 Т сеї! дгоумй. |соттесіеді|. Ріо опе. 2012;7(4):633998. 25. Зспмапгепігирег БУ, Нот 55, ЮОадтаг: В, М/піе ОЕ, Маппеїїї УВА, 5ієїпрегу ЗМ, еї аї. п міїго ргєдісіог5 ої Тегарешііс гезропзе іп теіапота раїепів гесеїміпд Шштог-іпіійгайпод Іутрпосуїев5 апа іпіепеийкКіп-2. дошцттаї ої сіїпіса! опсоіоду: ойісіа! | бита! ої Ше Атеїгїсап Босієїу ої Сііпіса!

Опсоіоду. 1994712(7):1475-83. 26. Рійеї МУ, бреїзег ОЕ, МаїІтогі ОЮ, Сегоціпі УС, Вотего Р. Сиціпа едде: суюїуїйс енесюг

Типеїоп іп питап сігсціатпа СО8-- сеїІ5 сіозеїу соїтеїаїез м/ййпт СО56 зипасе ехргезвіоп. Усигпаї ої іттипоіоду. 2000;164(3):1148-52. 27. Зпеп Х, 7Нои У, Наїйсоск Ко, Воббіпз Р, Роуеї! БУ, Уг., Возепрегу 5А, евї аї. Регвівієпсе ої їштог іпійтайнптд Іутрпосуїез іп адоріїме іттипоїпегару соітеїаїе5 м/лій їєіотеге Іепдій. Усигпаї ої іттипоїНегару. 2007;30(1):123-9. 28. 7пои У, Зпеп Х, Ниапа у, Нодез ВУ, Возепрега ЗА, ВоБбБіпе РЕ. Теіотеге Іепдій ої їапотетей Іутрпосуїев согтеїа(ев5 м/йй іп мімо регзібієпсе апа їштог гедгебзвіоп іп теіапота раїепів гесеїміпа сеї! мапвіег ІТегару. Уоигпаї ої іттипоіоду. 2005;175(10):7046-52. 29. Іпогите Т, Напада К, У/апуд 0), Антадгаден М, УУипаепісн ОА, НКозепрегу 5А, еї аї.

Зо зЗеїІесіоп ої СО8-А-РО-1-4утрпосуїез іп їтезп питап теіапотавх епгіснев ог Штог-геасіїме Т сеїв.

Уоитаї! ої іттипоїПпегару. 2010;33(9):956-64. 30. 72епд В, 5роїз5кКі В, РіпКеївієїп ЗЕ, ОП 5, Комапеп РЕ, Ніпгісне С5, єї аІ. Зупегду ої І -21 апа 11-15 іп гедшайпуд СО8--Ї сеї! ехрапвіоп апа їипсійоп. Те уошгпаї ої ехрегітепіа! теаісіпе. 2005;201(1):139-48. 31. Ци 0, 5опа І, МУеї ), Сошйпеу АМ, Сао Х, Магіпома Е, єї аї. 1-15 ргоївсі5 МКТ сеїЇв їот іпйпірйіоп Бу їштог-аз5осіаївєд тасторпаде5 апа еппапсев апіітеїавіайс асіїмпу. Те Чошгпаї ої сіїпіса! іпмезіїдайоп. 20127122(6):2221-33. 32. Ії М, ВієаКІєу М, Меє С. ІІ -21 іпПнепсев Ше Гедиепсу, рпепоїуре, апа аніппу ої їйе апіїдеп- 5ресіїїс СОВ8 Т сеї! гезропзе. дошттаї ої іттипоіоду. 2005;175(4): 2261-9. 33. С(заціпопі Ї, У М, Вевійо МР. М/пі/реїа-саїепіп зідпаїйпу іп Т-сеїЇ іттипйу ап сапсег іттипоїНегару. Сіїіпіса! сапсег гезеагсі: ап онйісіа! |оигпа! ої Ше Атегісап Авзосіайоп їог Сапсег

Везеагсі. 2010;16(19):4695-701. 34. Саціпопі Її, 7йопдуд Х5, Раітетг ОС, Зі М, Ніпгісне С5, Ми 7, єї а). М/пі в5ідпаїїпу а!гтевів ейесіог Т сеїЇ айегепіайноп апа депегаїез СО8в--тетогу в5ієт сеїЇІв. Маї Меа. 2009;15(7):808-13. 35. Хі 95, би М, 7адас А). А мйаї гоїє ог іпіепешцйкКіп-21 іп Те сопіго! ої а спгопіс міга! іптесіоп.

Зсієпсе. 2009;324(5934):1572-6. 36. дадег 0, Катасні У, Рашіок С, 5еї І, Егєї С, Снеп МТ, єї а. Нитогаї апа сеїшаг іттипе гезропзев адаїпв5і Ше Бгєаві сапсег апідеп МУ-ВВ-1: дейпйоп ої їмо НІ АД2 гевзійсієй реріїде еріюревз. Сапсег іттипйу. 2005;5:11. 37. Чадег Е, Каїтасі .), Спіайс 5, дадег О, Маєицгег М, Аїтаса А, еї аї. Ідепійісайоп ої а пайшгайПу ргосеззєед МУ-Е5О-1 реріїде гесодпігед Бу СО8--Т сеї іп Те сопієхі ої НІ А-В51. Сапсег іттипйу. 2002:2:12. 38. Оі Тотавзо Т, Малглоіїєпі 5, УМуапуд Е, бомепа (Сї, Сіамеппа 0, Егапгіп А, єї аіттипобіоіодіса! снагасієгігайоп ої сапсег віт сеї ізоЇаієд їїот аїобіазюта раїепів. Сііпісаї сапсег гезеагсі: ап ойісіа! |оитпаї ої Ше Атеїгісап Авзосіайоп ог Сапсег Везеагсі. 2010;:16(3):800- 13. 39. Маївите А, У/аКабауавні Т, Твціітига К, Зпітай 5, по М, Киг2и5Ніта К, єї а. Те ОМА детвеїНуїаїйпд адепі 5-ага-2'-деохусуїаіпе асіїмаїез ММ-ЕБО-1 апііїдепісйу іп оппоїоріс питап діюта. Іпіегпайопаї |оигпаї ої сапсег уошитаї іпіетпайопаї ди сапсег. 20087122(11):2542-53. (510) 40. КопКапкі ММ, Кіт МУ, Коуа НАС, Е5Кіп А, Оат МА, Меїзоп 5, еї аї. Оесйпаріпе іттипозепзіййге5 питап аійотав ю МУ-Е5О-1 зресіїіс Т Іутрпосуїе їагаєїїпа їпгоцдіи їШйе Раз/Рав

Ідапа раїжмау. доштпаї ої їгапвіайопаї! теаісіпе. 2011:9:192. 41. Маєшгег М, Нонп Н, Савівїїї С, Занег ВО, МескКег А, Веїіснен Т, єї а. Апіїдеп гесодпіоп ру

Т сеїв: а 5ігопу зепз5е ої вігисіиге. Тгепавз іп іттипоіоду. 2001;22(11):599-601. 42. Маєштег МУ, Соп ЗМ, Мапіп 0, Змжапеу МУ, Вгуапі У, Савівїїї С, єї аї. Титог езсаре їот іттипе гесодпіоп: Іеїа! геситепі теІапота іп а раїепі аззосіаївй мйй домпгедшіайоп ої Те рерііде ігап5ропег ргоївіп ТАР-1 апа Іо55 ої ехргевв5іоп ої Ше іттиподотіпапі МАНТ-1/Меїап-А апіїдеп. Те уоишгпаї ої сіїіпіса! іпмевіїдайноп. 1996;98(7):1633-41. 43. Маєишгег МУ, МескКег А, ЗайНег ВО, Савівїїї С, Нонп Н, Каїбасн ., єї а!. Ітргомей адеїесійоп ої теїапота апіїдеп-зресіїс Т сеї ехргезвіпд ом ог Підп Іемеїє ої СО8 Бу НІ А-А2 іІенгатегв ргезепіїпа а Меіап-А/Мап-1 рерііде апаІодиве. Іпіегпаїйопаї |оигпаї ої сапсег дошгпаї іпіеєттайопаї ди сапсег. 2002:97(1):64-71. 44. МадаІНнаєз І, Мидани МК, Аптейа ВК, Кипітапп-Вегепгоп 5, Мдо У, Зігетоге ОН, еї а).

Нідн сопіепі сеПшШак іттипе ргоїййпу гемеаіє айшегтепсеб5 Беїмеєп пПези5 топКеу5 апа теп.

Іттипоіоду. 2010;131(1):128-40.

ЦЕВКЛІК ПЕК ОДНОСТЕВ

«3» Боаіувівсевї ЗЕ «іс83 ЕКСПаНЕХЯ ЛІКТЯ З БОМ КЕИЦІЄМ МиТОКІНУ дя КТ

КЛЕН ДеУНИТЕКаЦІї «133 жахи ах «із3іх шия «вах 35 «Ей» Басентій чегбісю 3.5 «ха 1 «ЕЕ 153 «ВА» не запівве

Кеж ТЕК втЕ Меї Бім ее ів бек Му Ті біз ів бве рве ві їв 1 В ІЗ 15

УВІ їВе ой Зав аа ре Те бе дек бек ТВ ру фу їве о бЕВ Кам

Ко а ЗИ

Бі Зішм сів Мі5 ем їен верх вв ем Іа Ве о Кае ів; джа йку БЖ

Я 45 де дав й Хже ін вв Вт бух же ТР овед Мей ве: Те фе вух Ре

Туг НЕ Бре бух бух йів так о дій їжч бух мів Бео Бай бух Цве ім 55 ТВ т ва

Щіч Біо іже фе Беєобев із іч МИХ без вай іє йіз бів Щек ув вх ча пк дяк Бе Віз і«в бю бе) ге й им ХЗе бе ой ів йзи ж С1ж

І 15 зів зх і ін вем же щЩУуж Зеге бім ве ге ввае Кеб Су бів Туг вав 115 їх 355 йхо пі ТО йія їме КЕе УБЬ фу Ме бен би й Те Ж3ів Тве бів в 135 ща їз щій Зак іє її8 йдете ЯН фев ТВ їа5 їз «ІІ З «М За «ДЗ. КН ВріяЕ

Меї й Дів бе іує Вте Ні фев ве ес (36 бак БХе Бій Суб Те 3 Ку їв 15 їв Суб мем сен ів) йхя Баг НІ ВВБ сек Те Фів да БЕ Хі нів

Уві рве Ків іез й3уУ Кух Вее бе» дів бір зво Бее уз тТае Б) їв 35 ча 5

Заа їкв Уві Ява Уві 336 Жев бак ів уз зе Ків бів йзев Зв Кіж

ЗВ ЗВ кВ біз бек Ме ні їіФ Абе іа ТР Оге)х Те Ве 63; бе бю Уві НІВ ща В Т5 ща уч: ет Суб вує зі ТВ бів еф См Бе їен бер Я Зх ДМ

Уві бів Бек бе: Бі; бег Бі» ар Віз хг Хі8 Ні без Тр оУуа) Ха ди ішн МіЄ фі5 163 Жіж був й» Зк озен о бе» Бе й БіУ вза Бі ївВР Бін Зег о Біх ух ге Бі Сех «Бі: еВ бів Бі за ве ще

ЗВ 835 КІ

МУ бін РОБ фе біз Бек ре Ужі Ні ща УВЕ За МОЖЕ Бе Хе да їв 35 Їж

Те ат «ах 3 «-5ї1х 155 «Щі» нове заріах те» З

Меж Зіч АкЖ Кі Уві тіж Єух ів Жек Уві 115 Вне їви біж Те фе

КЗ Ку їв 15 ча Мі ву Зек бек бе іп бік бів дб ваги Мі Меї їі ге Меї

Же Б щі век Бі ж Зв АЗИ ТфЄ Мі ббо чіп оба вуз вал їжи УББ Вже вар

ХО а ах ів Ма БКо біб бе зве бе іа Ре біз вве УВІ бій Те ба був

ЗЕ ЗЕ БИ

Щі їхв баб БЕ ба зате КУ» Бре Біб вуз біз бій Бео ж Бек Вів дае Її Бі йхп дай щію ев БІ Ті без Ві бек 18 Бу 15 кер їж йешж іт Бра бе заго їнк о йев бів іч дев Ат біз Є Мі дев зав ЗЕ ЩЕ іче Те Суб бо Зве сх вар оаеє Тек бін Бех Бу Во Бе Беж 53

Ві фен аю йежш КНе іт ве іже ев Бій ех Ме 18 Ні бій Ні

З58 БЕЗ АВ

Кеш Жет бен веж Те Ні бік бев Бім азв бве «сах я

«Щі БА «ах 8

Меї із віз біб Бім г сіу ЗВГ Об3іЖ Б1У бее Те БіУ ба» а Бр 3 5 те їх ці Бге Бі БіУ Бе Бім Хі Без Вхр Бі фе» Бі йіу вка із бі

З 85 За іш бке біх бі» віз бів бів Тк щіуУ Щіу Ав бів бго кв бЕу вів

Б ЗВ 5

Біх ія Аїв йед віз Бег сік Рг Бі б1у бі» аїв Вб ЯгРБ бір ро

Бе ах 58

Ні бів бЕш Віз йій пек аЕу ви Аа Піх Сех Суб Вев Сух Бах вів ве те та а акКЕ щік бте Б3ю Бек йРд іжу іжем б): Бе оТуК іжм Аз Я без вве ще З з

ЯІа Те Бе Мак пів мів бів їжи вів ВгЕ йги Бек зви Аба і йо

Від реа Бе іво Без Увї бе Му 85 іо ія ух ам Бір Те У із не

Ваг ау ва БіЖ і ївЕКк Хе агЕ іпо їне 83 йів бе ніх ве одія 138 335 ща іч іа ви бек Кіє Зак бек шеЗ і: Бівя 35 фев обегб фею Би Я

КВК І їх ЗК

ТР оЖія ТНК ій СЄж5 бе без Без Маї Ра зїеш від дів фта Бк ее

БЕ 198 5 бу вів Бвгя Ве ік

«383 5 «еіїх 345 «з12х РЕТ яхійВ Моє зарівие «а

Метк і» віз Ве ТВ везе бро Бке ВЕз фер бів бо Бе жи Бує дже ї 5 За З

НІ Аг Діє беє Те б'є Гу хм оТер Бра Ре ів біз бі» Сх Аа

СУ Те Же пон йме о Меї ді сін ха пі» бі ї1ів Мі Сех ВрРО Таж ї5 Б х сін дже Бім Бто йжр мес йів ія См Ре Рі бух Бе був бік і ек ще 55 ве бвіц Щі Те ші Ре ав АБ йо Веб Же діє БІ Я ух ух ів.

ЩЕ та 25 ке

Бек Шегх бік Су АХВ бле Бе Зате ЗВ) бух бек Зі Ба бін бі 135; їхКа за ЗЕ

Твеозфеш бір бів ббе ідо їж Без вв Аг біб вив АБ Бе дп іт

Це вія су зів БЕ АБяи жа бух Бере вуз Бі ме Б БЕ: Те дів

ТЕЖ муж УВІ АБЕ АгЕ АЛІ Зв біз БЕ жо» ія Аза ет Аза ка 135 в «ЖБіз ВЕ

ТЕХ ВАТ

«ТЕЗ» ЖНЖЕ зВВІеле

Які Мія цем о бтга ЇвВг о Аія ваг ВгО їев ев бік Зее Су БЕх ТвВгб Ве ї 5 зв 15 і 18 біу зее іа іо РЕ Кв іо БНе Бе ке щі те май ще

Вч; Бе Ве ЖМР ізнх вів бін Хе: те бім біс б; 18 ів бе вх

Ба «В ях

Кі біж Уві їжи йіз й» бе Без бев 1 Зам бек вве бее Бео ар йіпоіви Бе: бір Ре реа Суб дія біб ВЕ бе фу фам обее ТОЖ; їх та ТЕ ща

З жі гЖ ОбАш Без бів Уді Кіш фев вла Зі ін дей УВЕ Б щих

Бо Тк обі: Фів Меч Аге Су ів АЇЗ Ні Агро Бк: бее бін ее бга

З 95 і38

І аж бен йех аін сви Рез Б Абе що я і Ба івц Бод ве кі 328 ЗК

Аанойів Не Зег біж Бгто бій Айв Су ТМ Ат Кбе Ве бек дю Щі з їх ї85 їБе Ех МІЯ ап УБЕ йо) із БО Бе Аве сум із Вез вх ВР БІВ 55 З їжа еВ ве сен іє: бто Азз вів іжи да бух Тер оби Маі АбвобЕх ее ку

Ух З ря їв бег бін яра Ар Мі йед АфВ Без Б3У бі ех лів Сух вро іже зва ВВ їж

Вга щіу бе Ре уні йЗія Бію Зег Лів бів Мал зів іжз бує аРЕ ів

УФЕ Бек су Без Бім Бгто фізи дор ЗЕ йзю бі мін БЕ: йів 38 АВ

ЕВ аа ТВ дів аз фе щів бік Бі бі Ве Бе Ту БіФ ве ВР бее ТВРОтТеВ

Зх жа 5 КО

Зег Уві бат Зви ет дев піз ізо ге обіх Рец їем Бгє Уві бе бу щів ге Ті Жіе век беев Їів реа йів бі Тік маї дев віз Чер ке

Ба 25 ІВ

Фів АбЕ бе его дев вар ргш Бег оТтв ев бів РеХ К1ію ага ївВе Це жу а 85

Кеш йеш Рез ага бе вк ВбЕ ЗМ ЖНі Б3 веж Те овів Сую Юкка Ба

За я З віж іУ5 уз абз йеи Бі тів аа бі; беєб іже 3 Ве Тугв й уж бух

З зі зїх ЗАВ їв ів іви 53 вів бух Уві вер вій діз ів: іви Ба Те ан ех кн йед Ущі дах ія Вфе Бех не Те їж Бін Біб фаф йев ЖЕ Бех 398 За5 5

Кт» Ніх ких фаме дер із бе: оТуб бе піп Мі Туб реє Ба хев ща

З55 зва Зо тів ія нія іве Бі Ту Ба бне фе фра МЕ Хеб Бе бін о вщі ї1

ЯКЕ Му гроши Уві Те ет вв бів Тео Бею фу як Бе Бе ща зх Ж я ай чаї вай ін АЖ Ні ій Ме Зак бе» бів йіз Вт аев Зкж бр зви я ЗІ щх

Вко бів Уві 13 їВе Зец бів йзе ас ВНе БЕХ Був біу а бі Вів зе ЩЕ БЕ івч Ар вух й Твк Зв вжр Те оіве ТВк Ак Рве їв реа піж Те ів су БЕК оіже бек Бжо бів Біб ім Зег ев Ууді реа Вка вк Заг

ЗУ ЯВх Я

КЕ те дів Узі йее ре ій вав ів; й Те о сСеє бер Бех РЕ пів ее дя 5 «ва

Ме дез МВА Кей Те Бр їж їж РЕ бе: Віз ВМНе бів дже МеЖ вав «5 Я «95 ів бе бій Ту Бе УВЬ іу5 118 й3й Яеб РВБ б йіу бі ВІВ ех

Те 035 дер іо їу5 біз іє бек бій БЖ й жаі бе Мет де іви

ЖЕІБ їйе ВЕ ВЕК у ів вид Те аби із УЗ) їіез би фен ТВ щі дів бів Уві ів вже Кер; сем бік Вко НЕ МВ) бі бік ев Гу АХ заз БЕЯ Ка: ай «ін ців дея Ні дгд Бе Уві йед йо тер 16 Крем вгеЕ бів агЕ ОА

Бр; йже їжи й Те фе БУ Ме Бім фен бій бін бі За Рее ва

Піч тує фев Уві іеи БЕ Бен) Же Мек вів іш дів це бек бу тре ах ва ОК

Вт сих іез ве ЗК без БіжЖ Рез УВА іже Те ті ве ів іже Бех

БІВ 5 БІВ їез дів я Тїнг ке й18 - Ба «85 У «аз ЖІ «48 РЕТ «аії» ех завів

Ме вкЕ го ек Щіу ЗНе Аів біу дія Аз ев ви лів мем зец вів і 5 їв ї5 вів їез Се Бета дій бе все Ві Б біз 310 бу іуб Зі Су бів зве Те бак ойхи Куб і їНе бів вве Бі ке оБбе 53 хв Мія Ба

ЗВ 5

Мей же іеч бів ЯР бе те вх жа Ск бів Мек Мі Бе біу вп за 55 в їви Б) Кі Те оТуг й бів бе бай ук йер ее еє БВ Бей Бик

Я та 75 ве їн Ще бів жів 83 Кіа 51» Те Уві іез Хі Біз іх би ЖВе Уві

Я а БЕ бін ага Ті Бра кев бів йо Мен Бій 16 (16 Агш бау Ба МК Зук з їв5 ке

Теж Біб бжп бек Те із ін аз ВЕ ів ве йхй їУк йо дів дев

ТІ іже НК іже ТКгоБіЖ без фу БЕіВ ву фте Меї ве ой іже ім бе Хі Бе

МІЖ Віу ів Ма Абе Бе Бе й йеп о Вга Ен ев бує жа мах біз ї35 Ка я зва

Зе" (ів б)п ткр о Аги Зв Хе УВІ бег Бек дер бе ів Бег век меж іще уте 175

Как Веж бев Ре б3і5 ям Ніж ее БІК Бе Су БІЙ ря Сує ДЕ Вр

Бак Суе Бте ха Бу беб бух Тер обі вів ЗВУ Кім Ффім о Аа бр я їх Ве «а вуз ія ТИР іт Жів Іі сух АД» БІЛ ЗІЗ Сує Зає Щі» БРЕ бує г

ЕН КЕх зв щік іт5 бем фета Бек аб Су Сух Мі ва БІВ Суз дів 858 Зх Суз

ЖХве о іу Бго аеЕ біс: Заг йжр Сух ев Мі Са ВиК Буб пе дея Вер біМ ВІЖ їМж Себ вм Вей їМе Суж Бре Беф ів Ме би Тує ей Беа хай КУКЯ ІВ ївк ве тує боїв Меї дев мні Аха Бе бів БІЖ їж Тув Заг ВЕ б3у

КЕН 58 Ка віз пе Сує Кі ін Му5 Се Бо беж джи Тек Уві Жа1 Зк йхв Ні5 за 85 3 бі зег сух ві дк вія Су біх вія вв оЗегкоЖує Вів МУК бів Б15

ЗВ ЗЕ Мі Аев бух КУЗ вуз іх бух Біб: БІіХ бко бе йгшж іме УВІ

З55 ще 35 бух зп бі зів бБіжЖ Бі біж бли Рав уз ба Заг ів Бек Ті Вей

ВК Б ЗЕ вла їе ах їзв бух Мій БМе іух Бк Суб ТВг бек Їів бре 5БіюЖ Вр іе« Ні Тіе ія) бе Уві Віа Ре де бі» вер Бег Ре Твж Ні те

ЗВ ЗУ Ява

Речк Вка фев йорка іп Бі ер беж Ї3е Бен ма ТНК ОМаї Ве ЦЕ їі тек опію ВВЕ Бе: ія: 338 бій ів Тер ВО ів йей ЗгЕ ТНК Вр ах їх зі5 їше ніх йіа Бпж Бій йБлофез Щію Жів тів абЕ о бБЖ ее ТАБ ої ЩА

КЗ 45 БЖ

Ж б3н БІ Бе бег обме АБ УВІ Ук Бег ів дей іє ТВРО5ет Май

БЖ ще ях

Піт ім АеЕш его іже іме БО ТіЄ Жег ар 03у вер Уві Ї19 Ї38 бек

БК 5 ОЕ

Щі вка іух й і су Тук аів вза Те Зв яв о Кра ізя їж вв

Як ай БЕЗ «НЕ

Же бін ТВе Шев Бі ВЕБ КУБ ТР оїух ХМ Щ3Є бас йяю йек Біж

Б. ЗИ Ж ваз йиг Су ух вів Те БХу ЗВ Уж Сух М3я вів ев Суз Мак бух ів щу СеБ Те уж ко Бе Рг агЕ Ар КУБ ЕЕ его сСух ЕЕ ДБК іх 5 НЯ чі бег Аг у ЯкЕ Зі; Сув Маі Бр Бе жуя Авп їз Св; ім Біт аа 535 За він Річ ден КОЮ Річ Уж Бі вай Бее ів жує 118 Бів уз На Ме

Не й Ба 5е

Біб уз без Ре Бій АВ МеЄ дев ЩТіе ТВвобує Таб ові бе біЖ рев чо Зав І йер ов бух бів БЩіп Сех Абе Мі ТУує Зі вер бів ях Ні бух Ві іт їВк Є Рго дів біб Уві Жеї Бін іс бл ап ВВе іже аа Тер ї»5 Зїуе йіа йо йза бів Ніз Ма1 Сех НЕ йеб Суз Мі5 Ве ка Єу

Тег Тук біб Су ТНК о бЕе Рез бік ів БЕ щіУ бух Втга ївкЕ вза вію

БЕХ Ів ща5 ЯН вра зує Ї58 ВО бе Зв в3а ВКе іх Ме УВІ іж вій Баш ее Бе

--ї в я іт івз УВЕ Уві йіЗ їео бі Ті5 1 іа Ре БЖ ав Аг РЕ ВІВ

ЯМ КОХ ТИ іє ві ЯКЕ Муз ВГ ТР оіжю йРЕ ледве ів 3 бів Аг око фев

ОК БНО Ех

Уві біш Рез іш Те Бе бег 83 біз йіз Бгє аа дів віз Зв Бе

Ів ща тав

АКБ ЦК і-ї БЕ Те фо Бе зує БЖ Ме уч Зах Б ву бее

КУ тій Яу ТВ

Кі вів Ре Бі Тйе Узі Жук бує Щі іви Тер їі. бте йзб бу Бу т» ТЗ та їу5 ма ву Ті т; Уві Аїз Тіз іш 3 беи йгш о щію Віа же бах за 785 т5а

Веб вус й3а бл і Фіз Зде їз Аа бі: віз ТЇук УВІ Важ 5ід Яве

Та5 теЕВ те

УВА еп чи бго і У Сре вве о вж: Бер БЗУ бе Се Ге ївк бе їй жі щі зав БІж Те ФІЛ зем веж Кт фе БІВ Се іо ів) Я тя та ях ще

Тус МІ йРЕ У НІЖ 1ж5 бер Азе їіа ОКУ ев Фі Тег емо іх лей що пів кі5

Теж Ку ЧЕК ів Зі їв вих іж меж йхв тує і ою вер о йер ВК

Бкся ЩІ ІВ кМез Зі НІ ЯРБ вер їм ВІЗ дів йгш дея Ущі Звнобаї їує ТВе вв 835 хз що

Зм: іє УВА гує Лі» їйеб вер вве бі ів дів Був еф ве пк Ав ще що БО

Щів Фін бух Бін тує ж йіз БЕ єіу Бі зве УВІ ре тів іжх Те

Бе БК 5 еВ. не йїз ем Біб бек ГІ іеб Ві5 Ябв БЕв Тек тає із бій Бек 858 вх а Нео че їкроБег Ту щік ми Те Уві Тер офі фе беф Пе ВбЕ біж бе іуБ вра Туг дет бів Хі веж Вів бек Фів БХе ев зак 13 Кеш біде 585 о 5

Еж5 щіу Біч аРЖ сер БУ Кіа Бео бро іє сСух їВУ Хів 85 Маї Тує 3 5 зай

Маї Ще ес ча» Куб бух її веж Хе вер йіж Бер Заг йеЕ Во цих ча З ще же

БНе ав Бі: фей Зв Зі бів БНе бе бу Ваї дів Яке Я Бра а

БЕК З Ж

Яги бук фен Же ів біп іт йо бів АВ Меї Ніж бжб бує рек Бех

ЗЕ 5 ще

ТБе бр баг аа ббе їуб лгв Віа без МЕ Або» іх Вів бр кет кер «в ВаКі Жеі бер ЕВ ав Зі Луж ів біб еф бів Ха Біж вне

За ЗК аа ме Заг о 5ер рт Жак ТВе Жеб одед Те Бге фев іже Бак Яви ву вес: ха ща35

Заг Віз ТБ бек дея йхз бек Твк о Уі Аза Сех Хіє бхв дев вк іа вах за5а біу іже Ми Бек ська бе Ще зе Біб веж ее Ве Без зіва вер. ща зва зако

Тег Яае Бег ВБр бе Б єї Аа их Муб іч вро беб Ме ав ів 1875 звЕй вза Їбе Біе іре бтє Уві бо бів Труб їі» йха біз дек уді ре 1955 Зав зво

Яув АРЕ Бгто Ай біу Бех У и АБАа Рее УВІ Тує ОНЕ5 хе ее

Іа Уцк Ів

Речх ен вжи Бкй ія без Зеє дея бр обро нія Тук бів беб ре 1535 зе моз

Мія бек о жве віз Мі Бу ва бка Біз Зк бе дев Те Уві ЕВ з 533 КЕ

Бе Тне бух узі бай бек Те фе дев бек реа йЕв іх Укровій 185 ве ЗІБ

ЩІй бує Б3у бю НіЯ Бій ів Борг Бжв бар йхи Бу бр Туєк Бій 1158 чі55 В біз йєю РВЕ Ре Рею дух біц вів БУЗ Бе вже Вів Ж3е ВЕ бух їії18и 1185 ру ак Тв дія 03 й вів Бію Тук о їве йкЕ мві ойбіз бра 5

Щек ее бів ЖНЕ Х3е ту вів зах ВІБе «війх В «АЖі» ІВ «Ва ВКх «83 Ножо звріяпх саше 8

Мат Хн бегб лев біу Ав ге Суб фе Біч Ме Езе беє Заі гео біж ї в ів КЗ

Ре їі бет бі Мія ув) іо ух йІВ Уві З бак аеЕ бі Ахв о Тве жа ЖЕ 3

БЕХ жі ім Бе іх бів їне ак фев і Фі бве бі» Кв Кіз за ага ові Жее Бій Бе Зюк ів бе вер; оба) 5еб Бій Ту Те Бо вед я ха а еко Тве Ба Сух НЕ: ЯР сіж Або ва ів Бе Бій маї Бій Нє Те

Тук Рне Те шіу бег бів Уві біз дл Уві бек уві йха Уві Ні ви

ВЕ за ща

Бує тйг бі йгЖ бе ІЗ Сех Бере Яеб бін 03) бею мех Зже ів їке

В ще же

Уві тек вів фер бе ів веж МЕЖ (же ва 38 Рео ее Гіж йза УК 115 вже 5

Ні Мі Тут Бе беб бів віз пі вРЕ бує Бі Ат НІВ Веб; бе» Маї о М а

Ав ав йіз Уві бів Мі5 йів бек йБЖ Був Бін» Меї Ткр бій лів йгЕ їх ВВ Кя ії

Мар ТвВе Уві ек ші» зе вів тео опе я бів бій аа Бін Те Був їі855 зв 375

Щі Кто ак і ЗУЄ їк їБе Зеб віз Бе таї Бе реко ТТ бе вда ще 85 198

Ме) Віз їв аеЕ ніх Узі У) бух іх Між Бі ї5о УБІ бук Же БК

ФВ Ве а йон Те аб ія ТМгоїнх Меїх дів Уві Ті бі Б Біл Ту Уву ще аа КЗ

МУЖ УВІ Тутп зец Біб Беб Бе Сух зу Ахр о МЖі Бе Зее БУ Буя Бе)

Ух за «35 КО

Бне ме Мі жаї Мб ів» бі бе вв У БІ іє ев бе; тТвВе ВЕ а я жа

Тке дкрю Аз Ре) біт реє Біне Ме йгЕ Бе Мі бів» йеЕ й Щу ВВе т ЇВХ КЗ

ТввоУжі ке Кух Мо їж лем Ме їз Кі ба бе біу фе Б)ж За

Кк ЯН ща

НІЖ ЖБК іви вро жві 51В ВМе ЗМК о бже Ні бі: Ні Ве біж Бе 58 ЖЖ Ко ії Ста вко БФ Зак Ї55 врО Ві ре; ЗР 516 бек ді вза Бе їв 338. 315 за

МЕ вка Біу Вів біз КЗ БИж реп ЗВ Мяї 0ій Аза її бод обію тв 335 за З

У іч фев бере Щі тує во бра Мхі Віз ія зей бе бле вве бев

БК ех З її аб ів зви бен Зі веж Біу вк ів Туб Зег б3іц Ніж бро Ме

Бне їбр бек Бфи їг о йгу тів Бій БІ уз яв» бін Тук КЕ Мі Ме

ЗВ ЗІ за

Чек аби вгЕ Кі5 йбю біз Вік йіл діа Бій зу Яр Ач йен УВО Кб;

БЕЗ 398 355 БЕ

Таг яке ді ве вхр о бег о вв БМ о зіва Узі ЇВ їз Ш3ін вид мух

ЗЕ 18 ЖК

Те Белодек жі Бебі Б3У піт дій Меб аа пі бів Бак Те хек

ВІЙ 35 «35

Мі Бі АгЕ іїу5 аг іу5 Бек від Бек ет віз ТВе ДЬВ БУ ТР щає «їх 848 дах б3у Мві Меї З Аве Шіу йгдоіє їх вів Фі Хеє Тк Увх 81 жо

ЗУ а БЕ бо іх бін вБа їжБге аяр біс вжхр бек Аз ази Б3М Хе Між дя ке яка

Вк та Я «ща

Зал ве Те От» Бевз ре Тра пія віза БіуУ Кі зов іа вРЕ й ви 85 вх 485 жаі йто Мет чаї дія Таб зей Зі Бі Біб дз звемо Бу Тує за ща5 ча «иївх 5 «3» А «Я» ВТ тех а ЗКна хаМівк

Б ЗК

Как йхр іме бо йКЕ Бе ЗЕу те БТ Ат ее дев до вв бе 1 і 5 їв 5

Фів М: МА фак Че ТКе фее Уві ВІ сів бів Біб Мі бек дів у 2а 25 зв

Ав оїтв ів й уаї ів Кб дів Бе; Зве вх бек бек де 3 Веб ча ах

Бін іш БІМ Зм йіж Ма іди Бі Бго Аї5 ія і ПУХ Мб ух ку

Кт РЕ УЗ йер ніє бер щіз Сік бЕу баб йів Бке Ай Ве фею Мет

Ку КЗ 75 зв ів реа ре я го арія бе БіуУ веБ щі він ТЗ. Ве агЕ Ага не бе бен йо рей бе ЗВК сен і біл вів КТ бі бла 538 та

Твае ден Яіє йов Таж Агро іа Хі Ав бій Ве Ве біб жеє шій Же 335 ще 25

Хег ви Те дЬО мех Туг Лів МОЖ Тук із веж 835 ББе аг іп Ада ж ї35 їі їЇїв ака йеБ ла ЖК АРК йіа Бета вів Берг ЯКЕ йдете же СІВ А Зух 145 ке 355 ЗВ

Тер аг іо вія ТВг ів йіа віз бі тре Бе Меж бів жує іп" АХА

ІВ а

Тже Звае баг То МОЖ Те бак оїже Те йно ніх Біл їЯж ЗВк без їбе

ЗО Ія5 З

КМе УБЬ нів їси Біз біз їйгоївв бі Єе5 Тг о й3У БіУ йгж й су нів ща ТР Яна ще Мі ші їйе Бе вух БФ бе рю жу Ве беа

ЖАВ ке й

Бін кр агЕ щік тероічх тує узі бій 5ее ев узі біжу ваз тів жа) їх та 35 ке іл Уже Ск» бл овез все Те ее Ї1ів ББе Бе бер тує Ще дів ЩіЄ

НІ Аг бек їви Мб уз Зв Тер Бі Зі У ів Тве Уч йхв дів

РУ яв ща

Мер щі Зее Біне Ме си п іем обі» бе сем бів жев ТР й ее

Заг кує ТБ імя ве Бе жі ще йо зів і БУ Те ЕР ов їте щей Ка зве бій Те Бео Тео Щі. Бр ой а) Бе дек ЖВК бів Те Аза Зв Аза

Зо ЕКС хі: за

Їкр акя А1з Віу ТБ рею дев бак Абе від ту ХУ КТЖ яв їн ев за 35 ев оте вів ві Біб нів Узі Ба біб віз тн ВЕУ Бі те ев БИ; бів ес щі яти жає Зі» бют й біу ве дав Ба й5в Бей вето СуВ бів ді Зег тв важ бу ее суз заЗі су вки Без Ба Хів Бів тів

З БУ У За аРу йтЕ ем НЕ Дер фе зей же Меї бер Аза Бію фе дев ТВУ пів

БЗсжя БЕ ах Яа «ів біж куБ БМ У іже біб ів 8іЗ аг щік бет ЯМНК тре ку Ве ах А З15 ле АРК Риб Бе ма) РРО ух РРО бе Ре БЕ: ЖІ ВУ пай ве дев

Же Азв Те бе Бія Б3у Беб ДІЖ Бій Узі Кка Зв; бе БО їде

КІ БІ5 Зіец вів йіа бі) 535 Ве Аз Тує Бк зем ві Біб Б3" НЕ

Я в Яка пів бе Аза вез бує че Уві віз Пій дів Ра Без Же фе емо вечя ща я т СІ

Та Уві Заг Бто Бі» вер дій ів) рез Му Уві Бе Баг др віє ягЕ що Ой ах чі із Сжз вів бтео уві РКа бів фе віз бів ра ре омі вка ве

Та бів Бтс бек ібн їв вів вза йів Ве Бій віз Бче віх Кг маї

МЕ КУ Зах дев ро мів НІХ Ме бе Бі бі бе М35 без Уві бте бе і Аза

ЗІ ЗЕ ща івм бів агЕ Бе УЗЕ Теб РІХ Ку Вт УБЕ РЕ КР Біж Бе Ра ух

Ше ліз Меї бів Фі Бго біжЖ Біб ТБ Зеє біт Кі агЕ вт іш вия

КУ БУ ЗІ

Біп йее Же о йги бе вів Рез їброїйє Бго аж Ро РРО Аг бе Ре ща КСВ БО

Бе іп Беж бе мні ВгБш Вр ВгЕ ів віз БгЕ Зев вер віз БІВ Аза ща Ба 5 ів ря БЕ азів бек Узі біз У) Біт те бра ів рез Те 3 ще щх вяй

УБЕ Ме Вжо пів бів Без Же «Фін пів вго ів чні Без ЗЕ сіл

Бах гЗБк щЯЖ роя

ВЕЖ РЕВ Ра ші 8ія реа рве Ба ція Мі вів дяв Мі ж Яед дів бке Біж Уві Бра із МеБ ія без бів Ту Жче йзвобкм БР їше ХЕ

БЕК 5 ще пів бтз Ше ек щі б3у 38 Рез ха) Кіз Бей бен БР й1з ее НЕХ

ЖІ5 Ва БИ

ВЕУ Ре маі Бк буч Ма ФУ Вів Те ої й ія Тк Бе дар дів

БВ ЩО тав

Ртш же ТБе о біює Бго Кіш без Біл З3іУ дів Бек йів ія НО Бім (ек

Тая та ТЕ Яга

Бре Вів бій Бе меж Бін блю Бе яз мі бте 55; бі Тер Меб Яке 285 та 5

Рге щі АзіВ вів ве; Звт біб ек жа АгЕ то Біх хі Вів ія ет тав ЖЖ ща щіп тує бле а:рп їж ее фам ТК БІВ Без Тіз жи МОЄ ім Бі вка

Аза вів Мік Ба ів Ні іє Бгто Бте МОЖ бів бі Бе тей УВУ ВРХ хв ТУ УнЕ

Кіз А" їв меж ие ців бі із Вт ге зве Вів Біж гор же тах тах тах ща ті БІБ Ні щік іти хво вів фен ів те ПН ої НІ БРУ і йхи

БВ ЖК ща ніб вго муж ау ве чі Жек о жге дів Ух) ав жів Те ніх Бе ех щі Аза вів РЕ ІХУ зви Бека 165 дев ів вер оіє дев ПЗУ ЕВ Ощ Ж я ща ща ше йбр їж вт бі реч; Сує бно діжі аФроїво бек Жіє Ні БКу

Бк З ІЗ ек вге Куб ба бік Між Бе бі ТБ Бке Уві щі зе Шів БУ ДУ ща ЖЕ ЩЕ ще ців йхр іа Те бів Жах Бе Бр іш жже Жфе МІ Ж1У веБоРеО АгЕ дах аа ох

Бга бек ТВе оре Біб їгроБРо шкі бів пі» бЕв БУ Бі шал бе ні

Бее З ща

Тве ді бере БІ: ПБе ЯР ЗКш ча УЖЬ М) Зак АК Уфі Ох Мех ух пік й» де ців Бке бгех йяо зве біз бер Уч; реа вза ів дід «Зв «ії 3 «оз КЕ чщіїх Нева зарівнх за ЗВ ех же зв вів Бін бгє БШіу Тве о бБіж БР Оу Ба щік ме Фію БІ»

КЗ 5 Ки 15 ве ші бер о твйе бат і вк біз Біх Зее ші БЕУ ве бі ке щей

З тх5 зв

Атед зе ж 5І1У вжв о Яжя Ні щі Атв білу ака ту йеш БІ АВ Бу хо де 45 асо Щіу Зб Бі» БЕ бра бі діва р бі Щі Чер Бі бес ВЕЖ вро за ЗЕ Я йРЕ Мі акЕ Ар щіЖ УМ аАгЕ ВЕ Рез Б зує ВЕ РР Аве Ку КІВ

Ба жа ЕЕ а бі Жук Бе піУ Те 8іб бБіж бі їМе біу дія Біу за зЗкх дів Фу іт віз ЗК йів Бір Бі Азіа іх дів біж ба» БР 518 Бі дів у 168 155 за іх БІУ й3За БЕР ЩЕ йіз бік бі йів іх іх із БЕУ йіз Бі ОЇ 115 ще 25 ім БЕіє Бі» діа Біж б3іу ік йін бі БХуУ дів Бі» Б3у вів 1 Аза і БЕУ іч Кіз БУ Аів Зіх Б3Ж щі Ак біж У вів БІ Ам З3у іЯх ке 55 ще іх Біж іх сі бі вів Бім Біу біз Бі» хв іх Б3У бів дів Б1у

ВЕ Кс З:

Зта Бін 3 Б)Ж Віз щі Бі і Віу вла Бі біУ бу ліз БІК віх

ЗЕ 5 8

Аз іч Біт йів БІ ів Бію пів Бім йіз Бі ія піУ БЖ к1а БЖ іще еВ гне щіу 38 Зі бБік віз БЕ ді Бі щЩіу ХВ ВЕС ія ХЬУ їж БЖ дія «Уа Зо зав

Її Бі Аів Бі біт Аза Зам вів Бі Б1у За Яку лів ші Б)у Мія щіт вія бБіу 5іф (іа 535 Віз іє щу із Біт Бім віз щіу Аа щіж тах КУ. За

5іт іа іх Щ1у вів шБіж йіз Біж Щіх азів віх біж Азя іх 8ів Бі

ЗБЕ ах КЯ пік шіу 8іа бі щі ія бі а5а Бір іх ші Аз пін іх іа Ху тв ява «Во ів Бін іш яз Бі іх із «1у Аза Бі ік йіз ві щі ів Б1Х віз біу ці із біу Бі йіз бін йіз біу Бі бів віз ші Аза ВЕУ пу Аів 35 АіЗ БІК вік бів б3к АРЕ ЗІ еВ У БІ Же БТ Бу

Мед біу ав іх Бі ба" ія 1 АТЕ у ВЕ бі щу Беб сту БІХ жа ща ЗВ ага й Бі ве ів АеЕ ЗМ; Вт аа КЕ БЕХ ЯКУ Би ВЕ бе АД

ЗЕ За 5 йіз Ака бі аАгж бі вгЕ біб аг Біу ЩІ зуб АРК рео ад ошек рр -егодак бій его бак дет Бег б3ю Боб Без Р Вев ВК Бе Во Бра іх асЕ йеш бо БНе Бі Мія Хто Ма іх ВЕ» біб ав Зже Ре що ах ків ак

Тут Мі бів і: бік ш3іж Рез йер ШІЖ ів Вга вв яв фо ге БЕу ях ії Аз ді їі щі іп ожік те Аї3 хо овжр Бе Бім ім шІЖ г» зе їНе 835 жав жах 5ІЖ Рг йго БУ із Бі аз Бін БІ» йкЕ бгВ іме ух Вау Бію Тев ж БеЕЯ ще

Те ів мух МЕ йтв Кік бій бліх щіу Беж бей Вер овує Бба Ам й щеЕ5 Ята ЕІ НЕ їі вів 15 БІК Бевз й біз Бей ви віз дге Щек Віх УВЕ бів ве

ВЕ У ах

Тїае їне во Мів паж ТВе Тер Уві він біу Мат Бі Маї Зує віт іх в 5 ів ее фже Тбе беб фшб Тує йхи ви ге АгРЕ БІ ТВ біз мем АЗВ ЩЕ ща БЕ Ех

Без біа Сех акв вже ТК бує ви Хек ой Бе бут Бе дію МК АЇВ

В роя ща

Вга бір Бе БІ Вка щівз фбтге БУ бу бен йкЕОБНЕ Зак Кіа кі ув ех ЗИ ва ща тат ріж МЖ Ча3 Ріш ко бів Те Мі Ків бе із біб УБЕ Бек вух аз ія ЖІЄ (ух дев ви МВЕ меж Те фу ге Яр бе Яйк Се Ал її аеш Ма) Твк Узі КуЗ бек ре йо без шу Уві хв Бен Ва Ре

БЕ ав ва5

ТРИ Раш Бе Бее меж Уві ів Бів Аза віх дій Бан БЕ ваз й ВАК а ІВ ке

ВІВ ВЕ 35 Бак

ЖОВ ЗЕ

«пі бе завівих «емах 3 яеї жест бек тев цем бра бе» Біб йій тт мв3і тек іх вра га ві тує Аї ЕР 1ф5 МВІ МЕ ет їй АЕЮ БіЗ ту жі ат дер вве В8я

Т1Є Тут Три Ніз діз Бін Ти бегб Аид ісч ін ака ТЕ Бін ж Бере

Тує Бе жгЕ ВІ ву фу Ру вжи зи да СУБ 1315 кер уві Кік

Без 5Е ща

Уві Щек 1 іо бій тує вгре чаї бНе ав Ті Біб без Бка йщ» бра за ЕК ща дай фжх Рі фі ББЖ бко йБр їй зате Вп тує дело бге вар о тТве ія 85 зв вх

ЯРЕ фам Уві Те Д1іЗ бух УВК БЕК М) Фів За Оу АР БІ 638 РР; її 155 118 іт бію Маї ші бів бе Фів НІБ Річ іже феч вже фу Бе Ар л5р 133 еВ 345 їйе біз вжи йій бек їв Туб дів віз йхв ЗБ у УЗ) хв ка дей ї38 35 ї4а бік су Кі бек Мет ваш Хук іт Біло їне біз ев ожЖув фею ХВ у ї45 158 ще БВ

Кух ст Бгто га бі бі шів Ні їве Біх бух піу зе обра СУ5 Ве і55 за І

Зла Уві від чі вп бе; Зі Б сх вро бра ів іч їв Се ва

Ве 185 зав

Тве уаф Діє бів аз Ту вер Ме Уві азю Те Біу Ре біУ із ех 135 Зв ща

Зап іме Уне ТЗбк о бве Біл ід бяп ік Беєб Фів Узі Рео сви а5в бів щіВ -35 НКУ

КУБ ТАК Зак БЬе Кух Уже Бум Бех вер тує 31 Зоб Меж Уві бек БКЕ ля рев а

Бра тує ВІ; вва бак фе) Бере бі Тс ісп вер й бів Бій МЕЖ Був як ща 5

Уві АтЕ НІ ве Ве йха Вик дів Бім Віз Узі бі бЕв дка Уві) Ре

Бе Ех кс

ЗВ Аж іюи Ту ів бу 6іЗу ЖЕК бі ее Те діа Аз ів; діа ве на Кашу 235 чек ве Те Бе Бучі ЕБе обБко бег біу ес Щеж Мі їне шек вар яія ав зве ах щи Хі ве йо бух Бко Ту Твої б3я КЕ АК сіє У НАВ Вег ух ЕР З ще

Аж» віх ЇЗе Суз Гр; оБіу п ОМ; без же зі їме УЖІ Ме) дев Тве їве вед Бек ЯМеК ап ек же фей сух від діа Те бер їнк Зеб БИ зав зЗа5 за

Тве їВе Куб вух бзи ТР о аша Ббж вух бін Тує фев ВР НЕ БЖ Зе

Ж З За

Вій Тує бр бе; ій БНе ї3а РБе бій ія Кк ЗУБ ЇЇ ТЕР озфец Ве за ЗІ ЗИ дів вве мая Мет Те Те 116 нія бек вет деп Зако ЗвВи ЖЕ Бе БД зво ще ЗЕ чав дай тро йяа бе піє сво; дів ЗТ реа бе біб ім Те ої БО» вер щНх ІВ ЖЕ

Те Тук дек бе Меії ївВКобюе бів ЯЗ іє Аба бе іє уз НЕЖ ОБ «ха 435 38

Тгто Без Ліз бо іже БМ: йо бе йен Бе» іл Тут Тк Рі Тер бі 35 48 аа

Уві жи Вей б Бім іш РЕ ав вія вар іс бе іа Бім РР ідо ов ях яка

СЕ га У Бе ім іви бів Віз біб ібн бт5 бів же ка бух БНЕ «ка Ес ав дав їМмб" БОБ БУ бух АК Су дба Зйе Бе Те їбйк баб беє ТВ За Те

Б ве «5 їНе аж фу ев бух рух Ага бує їв 55 «ів: 35 «сії ЗР «Ей БЕХ «Ж ОБО звів х сах 5 яеї вза Бій оба Те Те бі» те Уві їв дів ве бл Ж бю ВІВ і 5 їв її щі Маї бке 21 НОЯ Уві) іже йеш о йіф бе БеРе вію Б) МЯї АгЕ їм

Він дн» биг АХ Шаї хв і ЗвБе дек Їе Щіу БІ Бродів ТВе Буря ах аа я

Вт. Жіж іже іже б3ю (т5 вуз Вме БХу Без обче ві Зв АБ Бе ув ух йгк бек Зі маі їж йелй бев Мзі Те ВЕЖ тТее бю УВА Тег Ту та т5 ща

Бтече би іш Щім Тр ОВет Сух Кі йер йо ЗвВе Ар бра ме Ву БУ

Ще ща Зк дей КО іез ге ТУуг Меії дек Тер вів Суя бек бЄзУ Сів сіє 3 Яхв їви Бе бго фе 035 КіБ ев йги йія Хе Тжб о Ту ж ТНК обед же тро тів АД РКО Сію ФМ бі із ев уві їгр отук ваза біУ 53 яв і38 335 За

Аж" ее вії Зфе афа аів віз біо зів Ббв Біб Агд біз ве Аза АР

Ма їв 355 зве оег Бжх бгд бек бев Ве бу Зег ев фу БАЖ вух 15 ЗУ ет БІ 355 ЗхВ ЕІ ім вжи бух АВ іфя Бі бе фу Щі Б)ів йжи ке пів Бшм бух ТВ

ЗЕ ї1щ5 ве

Бек хм Беа Вр бі Її За ві вжи Ме йеЕ йо бек ява біз ге ух 53) вва Бі Бім Був го Зег йфш щег діз зва БЕ Біл ве

Вів ТБе їжу бів біб ві А18 беє біб хе Ж8Ю Бо Бее б3я Бер аж зе Ка я зво

Тег пк йфж ве» діз Тео бів Рео бій ме 538 Вк бер біз ак Бе 85 хе 55

Ві: із 8б5а ЗББ Сух Бі МВА би Вр рев і бі пли БД бів жеВ БЕ р ще бів вів біз ахв щім бБію бін бБ3ш ін йке йов ядер АХр вові іем БХи: вро бів Бім Б1; бів бів йіж зве МОЖ Реве вже ФІН йей ек

Ку жо 388

ЧЕ. уз бін Без біс Зі вгв о Сез ар Бін іже Бго бів ажр о бжм їм

Ваї 8 ЗЕ З а ів Ко щу Те ТР бе Б/в Ба Тв фею бів Ахв Су Бек 3

ЗБЕ ТР Безу вія мес дя Хе Без агЕ Те ги без сви дів Би пу

ЕВ 345 же

Яр шві Ббе біз Те ОйВе Ме Бе Бко бує Біб Мі5 Ск біз вед о вфух

З55 за З55

Бе те ТВР в зів ВЕУ Гее фі вед Ні Мет Бі їів Ні ЖЕе йо

Тае Мах вв Мі Віз РО Буб бує фу тую брж біж Вуж із ББе щу

БО ха За ЗУ їбе щ3я Хке АБ аг Ка АбЕ НЕ: Віз тв о Вед НЕ ЗіБ йіфя Щі Бек ех че зії і-5 РЕ Кук ВО бак ПІВ Те зе БІВ бко Щее Бір йде ів ха й

ІВ 35 В «Ву Муз дів век щі БЕ) йхи Уві йїіа Бак фу Яви Ве бек бе гу г» Же іні Ку фу бук бує жу ЖІ МЕЖ бже ее БІЙ фу» Дів бак ява 455 за 5іВ аж Тйе Х36 вх бе Бек Маї УВІ БМ; З) йжв БіЖ віз Бі Був

БЕ За ат ча

ФМ ів МНіЗ Бгто Су Беж Туб бує Бу» зу Жах Ре ДУ Те НЕ ТВе я ач ак

Яха Мей Яги АгЕ Мі З йгд бер Уві Важ ВБР ВЕ нях Шен ів Бго

Уй зи зай бух бі я) йгЕ йгЕ Бж5 бі З)Ж і БІ ХВ БічУ щі ие реж Яка ів вів їж ів діз Те бБа бзв Уві Тут чаї Ввз Зве ТВе Б3в Без 538 БК ай оін Бій бів б3у КМУ йіж ве йев МаБ Був Кіж Мас Вер Кіж Бе Щее

ЗЕ ях з

Якп жів ек бів дей зви аБп Гук їує ї3в Ар оБЕж бух Хе бій Б

БЕЗ ЗВ УТ

Аж ви дя Твг ог Аа Сух аж М (ав пе Ме Бек хегб вда ве

Кс КБ ще

Віж аз іжи їж йіж Гів дя Су вв Це; Тйє бе УВА Ме Уві Би ща5 БАВ БАЗ

Ще ТВе бій дви 325 Кже ТО ЗВе щів УвЕ бгє Уві їне МОЗ Веб їм ів ії Ба фе фев ід фах вже Кк бек Пе дж беє БК Віз їж ЗУ йкЕ Агу жах Б БЖ аж

Таг дія вве Ва БгОо біз ши РРО іже біз зу із Бі Те о бхробБее вах ВО ва

Яр бччк Ме Уві го деє Сух еко ів о Зеє Я Беб ее Бе Щіж Оее

Тве Жве бір віз ща Бе Б ОМіз їУух ІБ фу ек уні Туб Ве Беж

Бек ух їев імз Бе зе За ів Те і Азробуж фев Те бке віж

Фі Ще Кег о Аїв уве біз Я3е АХ ву Ге Фів беч Мей бує маі ек то А лі5 ЕВ

За Бе ія Зек Меї іже фе Мі ЗвБе о Зеє Зжг о вгя Ве бух ге Ага ах Ка КА

Твт о Жек бБае фр Бко Зек о беє Бгто бі Ніж Беб оби дів зем лек Ер жкіКЕ зах Та

Реве щі Дб вро Се йяв БіЖж фу БЕ Аіа їв ївК о йхе ВІВ БІК ве

Кох ти ТВ

ТМк бек і фу БК бує Бен бі ев ніх Бек вер баг Рео діа тку ув ККЗ за

Бен ви Бе ху АРЕ йжр ів аг бів ЗМК БІ бек Ба вка Сук Ве

Лев ін Жук УЄ МОЇ беж ке ЗХ; Те Те АХ ее бек фа ВВе бек а ВХ 15

Бек уві се йди Зі БЕ Бе їшо ВВ Би ас Баг віб маї іш БІК їх 832 ОМ; БІ ЇМе щі БЕ Те Бре УА БИ Жкр жі зЗюк УБХ БЕК 835 вав вах ажр іш: бек Уві Мі фу5 їу5 Ні Су Заг Яр беє ЗЕ) БУ їу БВ; я ща ща

Не кує Бін ек НЕж Зав УЗ) бів ВгО Те о Сух боє із ті і їж щкх ВУ ЖУК КУ ги фу кеВ Тр ЖвВе Суб МЕЖ ва Бій 5 Уа Бе ев ях ІВ їг

Я С я дет і Кі бе ізо бе Уві Бій: й бро 538 хв БІ Те АВ ее

З ах ів

Буч бат Бто Пух Був зае іш ад Вів Біз Вге йжа Ре йхе вв пах щ ЗВ Кока

Бе щік ее біу Віе бро біз Кто ЗВе Щі ЗБЕ бег Тве без Во Уз5

З КК КУ

Су бро Збр зве то ів ве фіз ТВж Беа бек све дек ек ВЕК БІВ ів БОЇ РРО Б ішу Ї3в ВО ВК Абе Без бек ВР РРО ВР го Ск»

Кн ще ок

Вге бто УЗ ів; Те Ма) вів ТР бета бго Беє Бк ж; зе ру Тв

За Зк ще

ЧУВ го іже Меч» Лів бече бак еко бее із бе Без Мія бтба бух Ве

Щет Бра оіжу беєе дав віз вт о За Біб дев Бе бжа Рке КВ ев зв3в ІВ За

Ват рба їве ба) ббе Ре» бек бе баб обеа хів бе Бе Уві аа захв 385 рев іно меж бЖевм дів Віа Бек бе БЩ1У Вко о бга ТВ їжи бве бек хе їв5 зв шк же Бек зве ев бат бБег Бег Бег Бас БНД БЕК Бе щає Заг ке. ік зах

Шак бек о Жек ев рез Баг те обее Бра бе: Шев діа Ха Бек Хек

Кесвих ЕТ ав

Уа Уві ек хе Біу вхо доп ів» Бі) вія Беб Бяз бка Мвт її» ек вве вух бів фіз бі вим бі йев бів БМК Бех фу Бгто агу хе зі ї536 їз ів орг ій явге біз йія бЕо ЗЬб йо Маї Зв» ві бій БЕЗ за За 131

Тег Ре й ів жа Ре УК обу Аа БЕ Ку Баш бек Бех бНа за з 13148 іже екв о їі хх бр Бер Тео ув НІ5 мех жар Між нія АВ ЩІ зах КУ 55

ФМ ТР РР Бе ме Сух Бін ре Сухє УЩі ФМ Бер о Не і кеш й» зї85й Зх їКяв ух ТП дже» фен ее Бі Ні» АБ РНе ев івн НЯ дек Уяї у 355 ЗВ 3585 ден КВе фе хі Сук Бе" жа Су зжх Бе Щі» ве АЗв бів Бех

Суб Вев без Б Мів НКУ У йги ве вам НІЖ фе» о бер бує ЗХ ев їі5і68 3235

Уж їве ніх МІ5 бів Бе бі бек бу Те оїже аей о РРО БК йБИ

БЖ ТЯ 1238 бін ТЕ вав бе Шек бух ів нів Уві БА ніх Ме бай Жек Сем

ККЗ зо їх їчче блю др фе фа Б Те Бе бує Бін Ха БМ) обі фею й 155 ке т ха бює Хек ойіє бів іа Я» ТвВРотве 33 бух Хв меж АЇа як 255 їж ВТ

ЩЕ ДіЖ ух ЇВ Буж йде Бк» же Мі КЕ без ОЗ Бе йщи йІВ

ЗВ Ко За

НО Ту» без дае МЕ фе) Ре» ба ке Ріє фра Зук нія Мі дер;

Ба Вуо ек ць Ще ШЕУ в. тВК Віз Тве вав КВе б зве НЕ

Зі 1535 ЗЖа

Ва Бе бто біз тТве о БЯе ТВе о Тве ев гія агв був БК Бу« сух 33 3355

ФіЖ бух БУ УМ1 м» вза Ма бто бін Бех Нів їж Ніж же ефе ві Кух іш ж Віз ЗР вжВ ух ів АРЕ Тем Вб О вБге бе КУЄ

Вже бжтє озаі бр іш» ів їВе Узі ія бРа бу» дан ху ву

ЕК З Бава

УЗ) УЖЕ Ще; аж Аби БК ЩІ іхж5 Ам Аза Ре аг АгЕ Меї беж

Зах ха 35 ій Бе: бує вки фен дея Бе бек бі бін зе Зак о Буб МБТ Зав

ККУ 1405 кое

Бак йче 5 їн бух 16: Ват ів ев фу Бу зу баб бів їв заха 158 КЕск

УВІ СЕ ух із ЕВ ів: БІВ У ВжВ бує Бек іа зв бів Бе

За 145 їаща

Кіш дер ев ік бе віз сує БМ бе Зегобеє ів біж См Бев

КЕ іа зач

Тебе су й гри бів БНЧе ТВе о Те Се щу бек ба ав уж НІХ зава зак заа

Аіз дій Би бек Суб фх зж зх Ре іже бЗеє Бгто орг ів ух 1455 ЗВ за5 іт ушу ее між бе" Ба гу у бір б» Міб бее бег Ре» 318

Я МВ ЗБ бек Бе їух Вже Бак й ее йєй Ні йев йге де Те Аа ях вка 515 ар йів 3 ЗІ ех МЕЖ Оз Бае ВОК дій Те Ре бе БМ Бех і53 їїа» БЕ їВе Ав Азв кв обег Бе 3» бе їКе Бі Уві бво бе бр Баг за ї5В8 Есе ее Бай бе йдеш ек вує БІЙ ойай ВВ іт Бе вів ЯЗ бек Ма

ТЯ 55 Км із Бен імя ія ККОо Бек БЕР бе Бек Бей РЕ й Зак Бе» КР

ХЕ йеш МеЖ АЇЖ Бк 165 ТРК Ні5 УВК дів БІК фу бе Вро |у

Ко їЗ83 159 ій Уві піз іш ха ніх баг ія бій Хв бБеб Яек о їу5 ЖВе бе ев бе» фев Мік Маі Ра Жві БІ уує бак кує ві» МІ ів БК іків їй їдаВ

Бе ух Заг ТЖБе Оу із ек о кУ5 іш ден їйкК Аа Вед ожте яв яБІх 538 35

ЇМ ув ве АРЕ жів йгж баг Бі» Зі БУ Ві ВР ВР БЕР ВИ

КЕ іа зв

Щій іже ія Ав ав Аа ою о іжю ЗвК 03: Да ру оре Бах Ат» їб5е Бий БЕ пін бек Афа бе біз Ми Би рух йжо РОБ его Ту Зав зво) ЯгЕ

ЗБ З75 їБе6 їв віз Бек агж се Зек орга бе) він йіз Беа Бее о Бфе Тве Аг

За 5 1555

ВІЗ Тут КЕ гу Уві уз йін бко жів ів Аза бій Бе Біло іу

КаЕУ ВЕ вка

Бей: рве ВБе ух 616 19515 «ЯХ1іх УК «ехо» ВЕЖ яЖЯх НИ Зі ях 13 как біз і пів акад Тер офем без Бех іч ВІ хи Рез бів лі Те зе и Мис ім іже Біл іван бі ев оМі во век тер фе вух заї

Явні Ту ШІю Же й ко фін Се; іже Зав ВеЖ ові Фе дед пе

Уві ск віз УЖЕ Бе ех іо Ве РР) Щів ТВе 68 Бе» Туєе 3 БЕ ке й Те Ве Бім Б Бі їж Хі фу баг Бі Зх бій вер Уві

Тег бек сек Уз1 Тек ВКе ЯКЕ б бів Їве Жав Жак йеа АХа був ЩЕ

БЕся І З

Те жів біюж вх їі На Кіз Кіє віз дп й Брж Втр іже Меб Мів ва ща а ж Щ1ш бве ку Жак тйФ фже їж ух бе ви Ме бід Заг ЩЕ Бек що 188 325

ШЕ Бек Ре Щі біз Бе Аз йгш Тег во біз бе Тек вв АТа Ле 58 35 ка вВгж УЖ ТвВе ніз Біо Те бег вія Мія бів біж Біж Те щі вже вке тая ЕК 355 еВ ке КіЄ Вхр Вів іх Уві Ва кев Вів Бе Хе Аа рев за3 НІВ УВІ її5 І7В вен дво щі Мія ів Туб бів бе; дея бі вер обме ре бе Без КЬЖ Ой

ЗВ їі85 ха

Мія пік іє ТК Хек бар Бі) Те кезч їеу фе в5в аа Ме дів Уві

Суб ж фев Бе МЕ 3 БгРЕ Абу бе Ахр бін вже ВР бе ве ід

Хів віз івю бек вів ВО

«Зі а «жах ВЕУ «ЖІЗ Нове варі «авще а

Ме АБ БІК Ре Ай ер у МЕ Уа Яр ТУе ух бує бух Жук ЯРЕ і 5 їй 35 хв Бех іже ев ж Б бує Б івц ЗВ Був Бі Мія 53 бує Же з З5 за щіт він Земні: ву їх Ай Бій Як Бех Мем би Беж Маі баг йеЕ

Зк я Я ща ух Заг Ве бе фе Яви АРЕ Бей бе жі Тує 53 ба УВО й 53 ар Заг бве вхо бе йо йія ТМ Ада Хек бее Дер йжиа бек 515

Тае Бін біж Те ве вух ев бе йо їйе Бе аа бе (в АКЕ Кух 85 Зх 5 йгв бес брє Бу Бе бів бі біз бе ее бум бе ее іде бак Ме

ІВ тах їв

Без реко Баг ТВе Бію бе Бе ен бів віз Бе бі Мах Ре ек ве 135 128 15

Туг цез ее бек бен бів бер Зак дев тує Бра ру рве реє ем вер за ще ТЯ

Тює Бе Яка ша БИ бе бе ЗА бе бяеє Вко ев бгрЕ б; зу ге їй з 55 зв вів уж РЕ фев бе зем Ве вий є фев беж ех БЖ Ми Бе й уче дор се ев У БУ БЮ Бе ів Те Бе Без ЯЕх ЯРИ бі ве

ВА 5 КО шліж іа БІК УЗА ШІ ТБе о Те єв ЗВЕР обра іх чо бго Кеа Буз Бек

Ббз Рез беб ТНК ЕВ Бер оеє Зе чаї Ре Аж іа КЕ БО ее ха

Ка ЖІ ЯяИ

Аїз пі бак ів й ден Аїш Бех йо Зіу бур бр дае ем ад Ті

За 3 тх35 че

АеИ Це во БІ: «ах ЗК «шій РЕК «аІ13в Нове зі енпх «а» 35

Ме жа Бжу ве у беє йея йга ві бе бве вух ри Ку йед ої; ї Із їв і5 чаї в Ве же Мет маї вів бе: Уві йо Аа ТКе Мет аз зі Тве

І 5 ЗВ

ТвВе УВІ їйк вен бів йзя ТР й Бес Я йдеш бій те ра Ма бек ве др ЖІ УЩі ів й й Бір від яек бе Туб івю жа із від іви біз Тер тає бе бив др ве бо бай Тек тб 5 Так Бе ові ща Уа ТУ ща

Тйг бае Вій ІЗ їВК обо 533 бо Ре бтє ія 15 Біб дев Щ38 бе ще 5

Ту Зют Бу ів йо» 538 ев Бі» ак їйг о дге ТВе фа й бі ЯвВе

За 385 за ке: їйт Тук дів й узі бів бір его їж Біб Узі дероців бе вне

Зх 325 в2

ЗУ ух й ців бай ре віз Бі ТР ЗМР бін Ви Буре ази ні Узі а хе 4 их ЇУг фея Хі Бі; ТР кеш вав ім фев бек Тек Ужі Бін йо Бве їгр о йБа дев бек Мі іву Бі аїа йБо бек ів бі бік дев Аза Кв вже Ше ії" вед зЗі Аа йіа ЗІ їве біб Тег оаеЕ Те щік вза ді біж БіЖ Яеш в їх 58 хо бів ву: бік Біж Меб агв Ту Те біз бій йго аіз й) бів їте то зва з

ЕВ ін Вів йче Яги пер Біу Ту ен Тек о Жее бів У Ада Бе тів 38 35 ке

Туг вка ліз аби бів ев ї)ю без бек йіа Ма Маі Мав бе Ве бів ах я 35 ай зве бе" Айр жи Те бів йже бін вух Меі яв мат Тебе вве Твг іа вх Бі Тк» Тег Кіє йож Ту ні Ве БУ Те Бека ТМе біл вух аа -вх МВ

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Композиція для експансії лімфоцитів іп міо, яка містить інтерлейкін 2 (1-2), інтерлейкін 15 (І/-15) та інтерлейкін 21 (1-21), де композиція знаходиться в рідкій формі, концентрація 1-2 в рідкій композиції знаходиться в діапазоні від 500 до 2000 МО/мл, концентрація 1-15 знаходиться в діапазоні від 0,1 до 100 нг/мл, і де концентрація ІІ -21 знаходиться в діапазоні від 0,1 до 100 нг/мл.

2. Композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що концентрація ІЇ/-2 в рідкій композиції має значення в діапазоні від 800 до 1200 МО/мл.

3. Композиція за п. 2, яка відрізняється тим, що концентрація 1І/-15 має значення в діапазоні від 2 до 50 нг/мл, ще краще в діапазоні від 5 до 20 нг/мл.

4. Композиція за будь-яким з пп. 2 або 3, яка відрізняється тим, що концентрація 1-21 має значення в діапазоні від 2 до 50 нг/мл, краще в діапазоні від 5 до 20 нг/мл.

5. Спосіб одержання популяції клінічно релевантних лімфоцитів, який включає стадії: - забезпечення зразка, отриманого з організму ссавця, зокрема зразка тканини або зразка рідини організму, що містить принаймні один лімфоцит та, необов'язково, виділення клітин зі зразка з організму, - культивації зразка з організму іп мйго для експансії та/"або стимулювання лімфоцитів у зразку, причому культивація включає використання 1-2, ІІ -15 та/або 1-21 у композиції знаходиться в рідкій формі, де концентрація 1-2 в рідкій композиції знаходиться в діапазоні від 500 до 2000 МО/мл, концентрація 1-15 знаходиться в діапазоні від 0,1 до 100 нг/мл і де концентрація 1-21 знаходиться в діапазоні від 0,1 до 100 нг/мл, - та визначення присутності клінічно релевантного лімфоцита у культивованому зразку, де культивація іп міо включає першу стадію експансії, що включає інкубацію у культуральному середовищі, що містить 1-2, 11-15 та 1-21, доки лімфоцити не стануть детектованими, і де культивування іп мійго включає другу стадію експансії з інкубацією у культуральному середовищі, що містить живильні клітини та/або антитіло проти СОЗ на додаток до ІЇ--2, ІІ -15 та І -21.

6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що клінічно релевантні лімфоцити вибирають з пухлина-реактивних лімфоцитів, патоген-реактивних лімфоцитів та аутоїмунних реактивних лімфоцитів, краще пухлина-реактивних лімфоцитів.

7. Спосіб за п. 5 або 6, який відрізняється тим, що зразок з організму вибирають з групи, що складається з периферичної крові, пуповинної крові, кісткового мозку, лімфатичних вузлів печінки, плеврального випоту, грудної клітини, черевної порожнини, синовіальної рідини, очеревини, ретроперитонеального простору, вилочкової залози та пухлини.

8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що зразок з організму вибирають з периферичної крові.

9. Спосіб за будь-яким з пп. 5-7, який відрізняється тим, що ссавця, зокрема людину, вибирають із ссавця з онкологічною хворобою, ссавця з ризиком розвитку онкологічної хвороби, ссавця з інфекційною хворобою, ссавця з ризиком розвитку інфекційної хвороби, ссавця з аутоїмунною хворобою, ссавця з ризиком розвитку аутоїмунної хвороби.

10. Спосіб за будь-яким з пп. 5-9, який відрізняється тим, що час інкубації першої стадії експансії має значення в діапазоні від б годин до 180 днів, краще в діапазоні від 4 до 10, ще краще в діапазоні від 6 до 8 днів, найкраще приблизно 7 днів.

11. Спосіб за будь-яким з пп. 5-10, який відрізняється тим, що співвідношення живильних клітин до лімфоцитів має значення в діапазоні від 1:1 до 1:100, краще в діапазоні від 1:2 до 1:50, ще краще в діапазоні від 1:5 до 1:20, найкраще приблизно 1:10.

12. Спосіб за будь-яким з пп. 5-11, який відрізняється тим, що популяція клінічно релевантних лімфоцитів є моноклональною, олігоклональною або поліклональною.

13. Спосіб за будь-яким з пп. 5-12, який відрізняється тим, що культуральне середовище першої та/або другої стадії експансії включає принаймні один антиген для проведення експансії.

14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що антиген для проведення експансії є фрагментом ТАА, зокрема пептидом, що містить принаймні вісім послідовних амінокислот амінокислотної послідовності яка є принаймні на 80 95 ідентичною амінокислотним послідовностям ЗЕО ІЮ МО: 4, ЗЕО ІЮ МО: 5, ЗЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІО МО: 8, 5ЕО Коо) ІО МО: 9, ЗЕО ІЮ МО: 10, ЗЕО ІЮО МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 12, ЗЕО ІЮ МО: 13, або 5ЕО ІО МО: 14.

15. Спосіб за будь-яким з пп. 5-14, який відрізняється тим, що іп міо культивація додатково включає стадію перефокусування, яка включає інкубацію в культуральному середовищі, що містить клітини для проведення перефокусування.

16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що час стадії перефокусування має значення в діапазоні від 1 до 6 днів, краще від 1 до З днів.

17. Спосіб за п. 15 або 16, який відрізняється тим, що співвідношення клітин для проведення перефокусування до лімфоцитів має значення в діапазоні від 1:1 до 1:100, краще в діапазоні від 1:5 до 1:10.

18. Спосіб за будь-яким з пп. 5-17, який відрізняється тим, що культивація включає додавання промоторної сполуки для промотування експансії специфічної підгрупи лімфоцитів, зокрема гамма-дельта Т-клітин (уб-Т-клітин).

19. Спосіб за будь-яким з пп. 5-18, який відрізняється тим, що додатково включає виділення популяції клінічно релевантних лімфоцитів з підданої експансії клітинної культури.

20. Спосіб за будь-яким з пп. 5-19, який відрізняється тим, що тестування присутності клінічно релевантних лімфоцитів включає використання антигенів для проведення оцінки.

21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що антигени для проведення оцінки презентують культивованому зразку в формі, вибраній з клітин, зокрема пухлинних клітин, одержаних від того ж самого ссавця, що й культивований зразок (аутологічні клітини), принаймні частково генетично відповідних алогенних клітин, зокрема пухлинних клітин, або клітин, що експресують клінічно релевантні антигени як трансген.

22. Спосіб за п. 20 або 21, який відрізняється тим, що тестування присутності клінічно реактивних лімфоцитів включає введення в контакт лімфоцитів з принаймні одним клінічно релевантним антигеном та визначення зміни будь-чого з продукування цитокінів, зокрема продукування ІМЕУ, проліферації клітин, цитотоксичності, сигналізації та/або внутрішньоклітинного фосфорилювання.

23. Клінічно релевантний лімфоцит, одержаний у спосіб за будь-яким з пп. 5-22, який відрізняється тим, що клінічно релевантний лімфоцит вибирають з В-клітини, природної клітини-вбивці та Т-клітини, де Т-клітину вибирають з хелперної Т-клітини (Тн-клітини або СО4-5- Т-клітини), зокрема Тні-клітини, цитотоксичної Т-клітини (То-клітини або СО8:-Т-клітини), 60 зокрема СО8-СХОВЗ: Т-клітини, Т-клітини пам'яті, зокрема Т-клітини центральної пам'яті (Тсм-

клітини), Т-клітини пам'яті стовбурових клітин (Тесм) або клітини периферичної пам'яті (Трм- клітини), гамма-дельта Т-клітини (уб-Т-клітини), природної Т-клітини-вбивці, інваріантної Т- клітини слизової оболонки (МАТ), подвійно негативної Т-клітини (СО3-504-2508: Т-клітини).

25. Популяція лімфоцитів, одержана у спосіб за будь-яким з пп. 5-22, що включає популяцію клінічно релевантних лімфоцитів.

26. Популяція лімфоцитів за п. 25, яка характеризується однією чи декількома з таких ознак: - процентна частка Тгед, обчислена від загальної кількості Т-клітин, є нижчою 5 95, краще нижчою 3 905; - процентна частка Тні-клітин, обчислена від загальної кількості Тн-клітин, складає принаймні 50 Фо, краще принаймні 70 90, ще краще принаймні 80 90, - процентна частка СХСКЗ- Т-клітин, обчислена від загальної кількості СЮО8»" Т-клітин, складає принаймні 50 95, краще принаймні 70 95, ще краще принаймні 80 95, - процентна частка 4-188В-- Т-клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще принаймні 2 95, ще краще принаймні 2,5 95, - процентна частка СО117ж- Т-клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще принаймні 2 95, ще краще принаймні 2,5 95, - процентна частка СО3-С0АСОВ: клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще принаймні З 95, ще краще принаймні 5 95; і - процентна частка уб-Т-клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 Фо, краще принаймні З 9о, ще краще принаймні 5 90.

27. Популяція лімфоцитів за п. 25 або 26, яка характеризується однією чи декількома з таких ознак: - процентна частка прекурсорних Т-клітин (СО45КАЖССЕ7), обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 1 95, краще принаймні 2 95, ще краще принаймні З 905; - процентна частка Т-клітин центральної пам'яті (СО45КА-ССК7 ж), обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 2 95, краще принаймні 5 95, ще краще принаймні 10 905; - процентна частка Т-клітин периферичної пам'яті (СО45КА-ССВ7-), обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 2 95, краще принаймні 5 95, ще краще принаймні 10 905; і - процентна частка ефекторних Т-клітин (СО45КАжССКТ-), обчислена від загальної кількості Т- Зо клітин, складає принаймні 1 95, краще принаймні З 9о, ще краще принаймні 5 905.

28. Популяція лімфоцитів за будь-яким з пп. 25-27, яка характеризується однією чи декількома з таких ознак: - процентна частка клінічно релевантних Т-клітин, обчислена від загальної кількості Т-клітин, складає принаймні 0,1 95 при визначенні за мультимерними розчинними комплексами МНС - пептид або внутрішньоклітинним продукуванням цитокінів; - внутрішньоклітинне продукування цитокінів після антигенної стимуляції має значення, яке принаймні в 2 рази перевищує стандартний відхил без антигенної стимуляції; і - індукція СО107а після антигенної стимуляції має значення, яке принаймні в 2 рази перевищує стандартний відхил без антигенної стимуляції. дечь Девь 2 Дявь 7 Бі СВ | КАН і и нн В | що бах 22020224 | ооо і арія вя ння ОО Я нн щи ан НЕ й ши ШЕ ни в ТСВгакмвіденьти ФГ

Лечо м і Данк е 16 ля Ще ії вки Дачь 16 після спиляканції й їх» Ї шин ення пе Р : самок я що ІК их ії. розм ШІ З км 0 В ех мі - Зо Ї во Не її ВІВ : Ще ше р ИН КХ : ЗНОВ рив В ЗК УК ок МВ 11 ВВ. ій Ї ні йо: ПІКИ Я и: У ве Са ї І ЕНН КОКО ШЕ не о КУ ЩЕ ОБ ОЗ одн ОО Я пу ОО ВШ. Е ід ЗК я Н ХЕ 1-х М - «ІВ Я я з ї ДОН іє То ВС ЩЕ БНШНВАЙ » М кової ВВ. р МК, хе о 5 ЩІ п ник НЕ ОО БОБЕ В с ї5' МН: ен оре ОВО З В сн : Ех сво НУ с її Ман сен їх ВЕ Ко ок ВВ 5 ро дня кос КУН п ОО А ж ОВ ши ВН : с ши а 3 ЕЕ їс ОНИ у. : г 1 Вк о мо Й св КІВ го зі дах і Маю ро р фр БІВ 1: ій 14 | ще 1 фаі лк т: і дк телеттеерт кн і. реч Й шо ; тд : Не ЕК ї- 2 з 5 а вв тертю дн жов ох не «ее р Це й ЖО Меннннннтнннннн ТМ й ТВ конк ; з я т фор вьОИ х Ен СЕКС ке Ку С Зако ка НЕ КОМІ дев ке ЗДА, МО М МІВ г. У Дяньі ех-рмо З День 18 ліля стиму лації 1 я 3 : «в поза і Н Й ї Її Н хе вх ще 4 ї ! дея 105 5 щ- ШИ і Км: НІ Й ї з шо Н : е і сиди м ! х : і Ж 8 Дю я і ! з ОАЕ, г 1 І Н жк ОО. Н Е є | Е ! й її ОО і | | і і 5 ХО КАС В в і і сна ИН Н і «4 и Ї І Я оо, У Н п. ШК ех ї «4 пс ! Се а не їх їх ООН Я ж: з 1-- ККОНОВВВЯ ЕМВ Н Е - ВМО Н З щу Й ОКО КК ЗВВНй ж ї ВО ї ЩО Н СЕМКИНИ Н Е КВ к 3 З Н х ї УВС п я ОК ! ЧІ ВО ах 5 ! "жк В о под Е- І Н ОК 3 | о і Кунжут ! ,"ТИИ у» ї сну свй ЛЕВКО ОН Х : фер рен пом о ке ОБ о зо жк І ШИ пєснтеннні звсй з ко меж о ее жа мук ЗВ

ФГ. ен пря ; поковок сковонт, ак І о щі ще т; Я А ой явне З поле КЗ ї КУ й КІ ВИН Ж : соку Ко й ДПК ККУ ВМ Ще ве я і ПЕ ка КЕ Бета с оо Й : КО З «У зей МОМ 5 а я Е ооо ОДій ВК МОМ ОХ ВК ЗКУ КОФВННЯ Ст ВІ у КО ов хз ї Б о кон» і: КК о ВАН ї ЕК Те сх вв ї йо СЕ: ММ В З СС ней ШЕ Е в НА ЗБ йно 1-1 х МОН, Н сс НН НН З кн І Кос о їж ЕМ т КВН Й -і ВК снеки з ле Не т у І хи зеціежоти| ї "ПОМ що пШ БУ Н і ну и БО Яна і ее : зі ма НИ веж Б ще й зі окт 5 о Во Яй 5 шко Кк ОКО 8 ме вжо ВЖК з фаз щи й че ВК ВК зв ДЕ ДИ Кк Я х Кен та Ми

ФГ. ЗА р й Ї

ФГ. ФГ. Яс

Ям » ту шмат ; В - СОНЕ За їоь ВЛ ши ооо ооо ооо: ж: НИШН ще : че з и З ос хз МИ ЦО ПИВА З сш ШАХ Е я Мен р же «ква Код Ен я в ОК я ох ЗК НК Бах Ов я КЕ ЕК ; Ве КК КОН -й З «КОМ ВХ в: і и ОК КЕ В : ОКО у ОК, ї і ХУНОК и и - ах ся хх ев нним Х щ во ОО ШИ ше ік "Зоо У еВ І со. КК В й КВК ППО 4 М ОО со в КН в м ОВ ; ВЕН КО КОКО ОПН ! Бо г КОНКУ у у КК З «их ОО Н Щек ЗВО Денненех чу феод со х Ж ех я ООН ЕНН що Су жк Зк о з еко За КЗ ще оо я ж зеж яр з "

і й. зах ша 5 мазь СОВЕ пень Ме му М м Кум юю КАКАКАКАнК ооо кни Мк шЙ щаї КК ЯМИ ОО оофевдноенке й ШЕ: й Же» Ж поко ще: я ее п КИ НО НН ше КН НЕ ОК В в Ж ЗУ і В: ОО С х АК А Ку як Я «МОМ Я Кт ШЕ о в В Б о : нн ня Ж фон я : зи ни в В ОХ Я ПИ 73 Боско зей 30000 0 НВ НН й Мосс і У -Е М есоккння ЗННННИННННЯ я 2 Вк: заби ов жаую жах й Вк з3К о їяше Ух зб вас ях ; Фо Кк 2 о щ- ш й щі я БО, | ! у Ух ї ОВО Я: ях х ; ТЕ ВО х .ї Бан ж ЕТ На і т, БОНН У Кт ще ШЕЯ - й СЕ ВВ їі Се і дну я : ЕК їй К х ЩЇ ре я х З А с в: БО Ех пня і св Б щщщц ее з вне я КОПОПИНННННИИ КО о ВН З 5 Я я 5 - ТОШМННШИИИИЙ ї ІЗ ШДЛИТИПТКИЙ У з К й тт І МО ШЕ 5 - у ання : Вон ; | ВН і ПОН | Н доптптодаееіоооеоочооотнносду пеееееттетттнотттнеттнтосестютння зе опи оно їчне роосіювання бра тейтування ма СВІ бБиме рогова них Н з о

ФІ. бА «г. вв ФІГ. во яр Шк ово, | ; І розхсвву лини ДН | і Ї сіре дакструмею ж ії і жа Ко ей ! сві» х « КЕ 15 о і ви г КЕ щ іч т - Я опе -Е щих м: Ї БІ знання ВІЙ Я з : : Ба їй ха ро З Е ія і (5 -з р Я Бічне розсювання у -

г. Ва ЯНГ. ЕЕ ФО ст мк

ЯНГ. ТА фу. їв Фіг. її Дано мн нова тин Гонмнвннннн о вна птн рдллт , іл | : аж | ! «мк ПЕ ув ше нн нн нн нн п -ео е 1 С Н ние : ї Н до Н : Н БУ; Н А : р ЕН : ще і : : Н Н біля В ше о ши ет щої са їі дб ка : «р рано : ОО НЯ Н т - си ВТМ: Н і ! 4 і Не і беж ен: нн ни пишна х теж юки яти еМижюА тля 7 джек й Й пика юю У Збиданкя У-кптям - День 18 нини минав: НН нн оо по ИН я уюу ть ЕЕ НИ В и ши нан о ші ши нишЕсшш «і 1-3 ій т Р ЗННЕ НН мое ни МИ ЗВ ИН НН ек ЖИМ Аж: іч «3 Й : сл а: : нн ЧА МИС Н боса іш Б ай 8: ко с Н По я й у : Кк В ВАШ Н « | : Її ; ЩІ Я Ї ежетттякетюяяи З невтяттктювутнняи овепеетясотоустю тижня 7 жа ка юним ком 07 сов перхедня захаУсть звозка водить мазка афінність СУ лечлннкнлалч ча кА АКА НАККАККАККАК НААН КАК КАКАААК КАК АНА АААААКККАНК ВАННА Вееесе оо»

Фіг. то ФОТЕ ЯН ТЕ ск М МИ, | З кН ' й ті І І у Н Н шк

ФГ. ВА ко Й Н Об: ко т ер 8 5 : КОВЕТ т тоа Ще і РН ОВ у ВВ і - В їх кадежнОвх ! « В ' в. ка Н Збкряння Т-КАТин - Двнаі ТВ. ппплялладянннанв А АААААнАнАА Алана вола его нн и нан

ВЕ. ВС НІ З | | : о ІВдя ! | ФІ в С Я ! ! їй Я ИНА ! Ге ' гоже ї Її: з 1 і : ЗНУ Ка : З хм | І щі! та, і Феї «КЕ ! г ше шини ЯН поту з і в. : : у : ї- : оо Н Еш : Мн и г : ре ох Н : й шині ї : КОРЖ ; І рУвдме вик ки Кен -З т е Гбхціюєня З ЕП Тідрехт З Ем чітиме ге ; Гівдет З Ся Хаітюни Подих метати пізня 25 к5 , С -е 3-3 Кй яко і. Рой як тя й як ПЕ х я же Ух я я се ТЕХ 84 Ж з5ї ще Мой их х Ко дня я НН сн зви СУД Єравві сур клею те тн то те Вктмгоем для стиму нти ка стул ФА «НГ, Ва Піакіемт З СА Тудтктики Е я М: «і а щ КУ ее Кі Ж т, яке Ех чи лу КІ є 2 лм кнтлжжккто юс ол суряжик сСхреівн то т Анти ди сим Кик ФО День й Деме 8 зфакодя пракурооюр ула, «7 Ї - | х Е сок севу вва | «7 шия є в ми ї зо осо их в у » сок І; т ЩІ Кс Ви ит З с, К п о БОНН Я й В. й і 4 ОМОМ- ж МУ Я Н їх 1 АВК Ку ї АК КК КЕКВ Н Я - 3 ВО. | Ф СЕ еВ Н 52 КА ДИС МАК Ти КОДОК Ох ов У Й не: в Н ШЕ ОК со ЦВИЙ ІЗ Н щої ТУ і жк З. Я об ах | 5.4 ВМ і! х Ха туга Н з Е В су Я і т. Я я | В РА Н - ; - В : Хореумюрарсоертт тету теплою Оу кокон : ев - Ес ие -я ка ех «Е помюохсяк ню: ВОК? песо жено соМу пока а и периферичні центрагуьні сив . ОСКО КЕН заожуте проникати пухлину ФО ло ВІг.ОоВ р о, ах со дея чего гонВ Я 0 Жан дено ЗИ пПоиродні умови рт Е День а ж «лк роз ще Доржщттт пхриех 5 Ж НУ Й і в пк А ни ке їх Мін ній

Як. Ой Не | НАШИ тов Кто читетви 1 ах вки ЗНИНННН ССО -к МОЗМ З БУ ки: ж ШшН ох Й як 0 ки де я я НЕ І У шкі БЕ тт х КА у С: повний : м Я у й : Й у ов о "ж пу пит у я еф СОЯ ШО сн нач чні У -- і-ї С СО кю сь ем І ння ЗО ССЗ 5 -о рот родЕтутитти от ші, В 1О7а Ж і бо бюР СЕ Не п ОК пише | пвоціной дер, НИК: ша і дввиюнюння ЩЕ М ги ри и 1 до пухлини и щи пк ЗОЇ ие М Вшнй ЕВ: МНЕ З М. і ту ін нкнтічянй : пжчвкюю ст х я ож кн ді схсваХ аг. А ;

і Р. За Пепчия НРУ РМАЛОопо Шон тр Середовище р: по зоб: І пт Н В й йде сь Доля ле М, КЕ Й Рон: МОВ Мо жи ск: зіВнвнвнння Сх КК чи : шой ж з ше й іш ВО о я | МК ку, і БВ в АЙ Аа А ш-- ВО і ВО Її еВ са ШИ ж: ВО БОМ х ШЕ ву 5 Ух: ОБОХ КВН Ви і ООННННеме Я во: ВОВК і МО і ДОЗ ї : : ОО І ВО і ВЕОМБО і В І: БОКОМ і ОН с; і шення Н : НК Е Ве І ОКО і Оман Її ВО Се | ОК й ! і НН Не ОО не В Що ти В Ей ВВ ОУН Н В, МО о поджва ї о Б Я КУН Ге : г: НЕО МОН НИ С й : е»и Теж І: т оо ЕК ВВ СКС. й Н Гвитува на лю : о В ее: ЯНВ сх 1 батьківськи ; КК ся нн: я і тка вдарюврам і и Є ! п В сс | до СОВ'япіми сх ще дттння те Я сесесввея длюжіккнкй: бо Жсткексхю «го - Фе Янг аЕ я я бжай шк ЗЖККУ ер ривок Ша дис у яко ; НІ ї Н їх х їх якою 7 : 5 зо їх х й кт Зк бою цртокіну Х Ум ЕЗ рн -йна З й поса жк Ч з. х зшУльа : 3; п зак Ше х Е їх вені от» ; щ-щ- ЕЕ з шко г є ій Б ї НОЯ

Х. Га й ії я я й й г Би ї Б яко Ж і Є З і х тях ї і х ши КЕ з ЩЕонкоов оси «і див Щі Би Ти и ша овес

Зі. НО й й мая мука рі фран а - бурвмівім пехтидма сумі Я 1 зо пенні КК оллянялянлняя ння паттсееттеено вк ететоссссо ї песо ник ан дддлдрлалк алла МЕН ЩІ ЗНИК когось дотик що 5 ХЕ ЕЕ ей І Мак іх 1 Ду 2 оди З зюб о МЕ ШКО М : Ж с: Ю. ЕК 2 Н жи НО КУ ВИЗ - І ЖАХ КІ Я х зво ЩЕ Зкв Не АК. пк дня Ж зах Шк в ії йо НЕ на а щ Ж: М ії Її У в МУ У БУ У БУ М зіінжх М ек: БОНКю ії о ї Н ж МЕ ме: її У м НИК АХ ВХ г і. Р КИ ЧИ ЇВ шт і хв Оз ие е и КУ ЕЕ ле г й НЕ й о і Ко ої ГЕ КЗ ох -х НО я пе БД зх 4 «В І и ОТ я ї КУ я. не М У сотня В МИ жо ої Мер ак в свяссей я на НН ОК зе нюху ШКО М вВМА-і ЕВНА-За саму врах бнз цетонму Веуусні внтани ї вк я лин ля и-яї ця ай.

«ФВ. 34 К й г ї : ії Ї і | Емо ООН оїй Її воже |: Ко КЕ |. сійних її : : да СБ: і Ох Я в! ! Коня ШЕ ши ши УНН Кия Я й ОН Я їі Косован Я ВІТ 7 ; ШЕ созвасповнце | ; ЩІ З зва | вх ЕІ дЯНННКУ, х КОЗУ яз Е: Н І: МІ яру у Но б-ки фот Н Копопоуокия І ; КН: З | Но Після ак Я ШЕ : хх. (ОХ Я Е КК і а і НО З РЕ і и ох ; їі 3 ЗИ Е зе, . ; й | і г Еічне роасновання со127 ЯНГ, ТВ

До еєопвкої созеоранова- і ша Пт АдТІ ее і ех ко ХЕ ЗМУ ї ПОВ ово м Н Косі Божим а, я: : ша ЗВ кове ВИШ ковим зу і , ММ ії Я 0001: ВОНО ЗВ о . ВОМ їі БО її: ЗОН 0: БОНН і НЕ ши 5 ящ я ан ие її ши Шо ай кс Б Ши ПОН НЕ Квас я НН МНН ВОНИ І ум 1 т її Ве і Н і ї ком Й : ІН ; Н : ПК НИК : Н Н : 022 ван 1 5 11 а ї Вис 0 З БО ок: ВО Рі диау ! і ВН. і КОХ ! Н ! зна Ко се шенні В но ще і ! і: ВОНО. ЕВ ВЕ І: ! і В поп ШЕ о НВ Е ї Й І п Я іа І й МЧНЕ х і р нн у пен жтттютттюттетчетноо р як олова їм Гномля екопанеї як А Оу дент АХА КУА ААУ Анни тт ц | І! ем нн М Е « шк щі С я ДонорА і ж х с ВХ ек ши Я Й . КУ М Б ЩЕ ІЧ з КЗ й 5 в 7 5 КІ зи 3: х РЕУмер паитидх ФО х повтор дитини роту ттн 1 ВАХ ВВ Я Н па | с : п ! ШЕ ! і Вин , мав яко : : і М КЕ І : . Я щи Ше ші ! Я У х | : т і і да як НИ и : 85 : З 00000 Бе:

ЕЕ. 1-3 щі р : тах. 4 й КУ я І : уееннтннтнтітрттттт руш : пттттттрттттяттттяу прттнттттттттттожя - КГ аБатьківгько грума : ї мок " фробаннну учня НЯ ми пе НИ НИ с УНН Я -- що З і --о- в! На Н Ес: НИ С НУ Ме а Н Ед і «МИМО ПМААААДАМ чи АН А АААнт АНА ЧАНАААА нн г. тв

! 0 Її а ! і: Ока І КВ вк Н : Ве. : в; і От в ХО : ОВ: : ВО; 83 МОВО ОБ с: ВО Я ння Еш ши ше й КК ! Її І і їм у пхі А А дріт ПДК дадд Ве ств кої стат: : й " ' Н ху Н й я ши ие С НН НА ОГО Н сіна: ! БК М сою | | ве: -«- ши сов Фе і і шо сей : і ОКО Н : МОНО : щі в. І «От клітини: шк кН М її совно ша пе Б пе Е , ЕК : аа ван ЗШ юн во. | с и п: з и патентні пет тонке чттчнтбр ВО СОЯБНА Фа й п

Кліщ Мрейтерна Мамо КЛІТИН Зо ОВ дисц і ож «Ж й о ща и ДБ зернівка ОО щу Е розвонаєї Погуна махбрани вх чухолідний ія) -- ; Е КИЙ ул, Пережеосник ФУ мит дент пеппнтттттнннння ПЕКО адмютють сх хипернатанта на ВИМИ Зпунноюня плвню: ву ВОК. Стовд веляатняях -- МЕМ зихи тя Фохуаіанів - Ше У ОН ВО хи Ворептіх : -- ВО знаю ЗЕриввюють, споувуютьт ї ОКО ня УЕДпахуують 8 Гікнному ТО КО поз суперниївнтя, /-УКНВККЕВКОМУ Дело 7 й 7 адемістить СС МЕЖ ща Са в - - - І ! ! і і ті 2 ні Н Н і х - Б і ні Н НЯ Х як Н ж я їі: айкох її, ж : пис и роя Фо - ж.

ї . Кі 1 я еко я т Н ж е НК : а че її шення Ше , т ві х ко міх мо 1 й Ї лася - . Ї ілет ня НУ я же тут Ех г Н МІК сеннтетестятнн о вно фа фмлллАААМАААААХААВАААААКАЇДИАХ ДлАДУД лляликутляахилянляляя ВВ я ЖЕО Же що В. З Я Те» ляже я ОщЖ ЩІ водо» бал гбІВА. СМЦИЮ» сок ПЯБДа. ФЗНУКа. ФФХЛЮй; СОКОІАЄ СПАЛАХ. ЗМОВА. СИМ ві ре сов сов тів в , Що і я я і ! тп х з «і . і Бо ! Н Н : Н і НУ : « і" ж її, о. ; НКУ я Я НІ Я . ж « ' М КУ І Н ви и Н Н т и Е НУ Й « д « НИ - Мо снидня - Я . РО яння 2 ! ГА «ох Ро еф ях Н ПОН осо со пижма щита з тн пак тах Св ге ГЕННІ ев че ЯН сх

Ге я гА ОВУ Те м й « з Ся з м Н "х ве В за «е г і я? пеня і стра тк ч - КО к Зк ще а Бл : : ЕЕ во Е ей . в Ж г х

5 . В І а з КУ М Бі т КУ 5 з. т м як х 4 фе і з Я ну зх ги « їх Чи і ї З з У прокумютм ох їх їхж проку Ку їв Те о. о що. й й - й - " :

за. м ше же су за же зер сра що. й т к г ї. . ра тА ІЧНЯ ці шко, - У Н 7 а: ННЯ пи ИНА Я ИМЯ зб. з « -ли 2 щі х «о й ; . І В, «8 т . чех й з - кри г р : а и шк Й я В пе й Це г х М Ко зма - х х У з - Пт од

ВРХ. ей Я пот тн аю. У я Й Й чо. - и "

-. - т тя, - - ла аули Гч ха. й т з ом х Що

45. х КО я- Зй» : ко 2. : боки з х с -е є У олсю 2 І они м ОО

3. айленя ля Кк КВ. ав Сюеує «дз стіна вма.а Бо УЖжУ

; 1 1 ! в Пропюзовзана область 33 пло. ОНА : Н ки спина плжальнииин латин кВ теж есе і удав, о я ХААКМАКМААМАКНАК КАК НК і 1 В С і . ; З З ї КЕ: у ; 1 3 ж Як г: Ж й Х Ж Е Ж Х : з їк і УБУ й. З я Є 5 і В В Н ПОБУ У ЗМК ВЕЛО ОК, ВНМУ : в с р п оз З ВН ЗМК у одн Нас Е 8. ;. |: З і ІК | я В Кі З ! щі: і овуроккоут чу вих РМ Бека КО) Пане чиУТВ КБ ду й з ме 1 ХК 8 ЩЕ: Я Е: СМ ААУ і їх й ж ЗМ М УК я 5 МУ таке й ЩЕ шш ши о хна г І ; ; с репсів ту тУкотЕ УВІ Раку Бас: Фіг яв ен - п «

БІ . : рах : тхН, г ЕК - їх ср Гб шк: НИ Ще Кк Ю5'АА і ох; М -к- Й Й ! фікісколося ККД сісти Сі СІВ Ні ї є 2 з ше ше а пе ш І Еш В 5. 2 І МОУ «Е Н В 5аВ « ще о й ж сов Я е ЩІ Я е БИ -і 25 е «0 ше І. Ж ві, : Ком Н Ж мк: а» 5 з : Н Н сабо «ах Р: РН . і ей --- диді уиИ. ни що (1: а . ; ха, ! Е в ї ж 1, - я зом ж х в Н ї я 3 5. х т ГУ шій ка» Ко З зх и ло 23 в м 55 25 52 дея р 4 58. арсккрю ве Ку Ко о ак ЗЕ ЕЕ ех В о «А - ж 5 5 574 5 5 З Я З ШК Х СЯ ВО 5 хи й хх ХМ шо в її і увів Е х : 5 Е Ек і З 1 ра п Ншишк з їх Зах вже УК о серхик Мч ке мех

НГ. се ся ков я зу м я 824 к Не як М : дах Ме г і є к сх ов їм . . ФВ соня ува ши й хе » ок

ЖХ. Я очю ху ї- се стук - й я ж» Кк і пі сркнй, х сеоякуувля :. з : . мона

В. Т до ОМА й | « | чі х ї. Її пор А | і -Енх зал Ї КЗ » Кв --ї

5. В Зв, - і | | оо тки З и | Той Е Ї, енаннннкккннкккнн 12 7 ми и ; Стикумнця МУ ВО

З. М . х ч г ї ре У з СУ мо т. ще щи і є. КЕ ще З є й - хх ши ше ши ши ше ши ФігшТ Соя сов ом ря Ще | з Т.к ре У як е Я ще Ех тва в | соа| ше. ї Ши Й 5 | е 5 о й шк з нас вій . пе ТМ 5 ; | се А З ху Ма ж шк с: ВИЙ ши 5 Сов Ж... Ме ! е Бл Га це Ф НІ є т Ек Я це Фе Кк: « ї зу ; м А -и шу й ще « зеовофбіфеюсся . а | т, ще ше в сонні себя фін ну отче ж 5