UA119140C2 - Мутеїн інтерлейкіну-2, що стимулює регуляторні t-клітини - Google Patents

Abstract

Винахід стосується мутеїну інтерлейкіну-2 людини (ІЛ-2), що має амінокислотну заміну V91K, та стимулює регуляторні Т-клітини. Винахід також стосується Fc- злитого білка, виділеної нуклеїнової кислоти, вектора експресії, клітини-хазяїна, способу отримання мутеїну ІЛ-2, способу збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин до кількості нерегуляторних Т-клітин у популяції Т-клітин або у периферичній крові суб’єкта, способу збільшення кількості регуляторних клітин до кількості природних клітин-кілерів у периферичній крові суб’єкта, способу лікування суб’єкта, що має запальне або аутоімунне захворювання та способу контрою відповіді суб’єкта на лікування мутеїном ІЛ-2.

Description

ПЕРЕХРЕСНІ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ

Ця заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США Мо61/784669, поданою 14 березня 2013 р. Вказана вище заявка включена в цю заявку шляхом посилання.

ПОСИЛАННЯ НА ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

Ця заявка подається разом з переліком послідовностей, що представлений в електронній формі за допомогою системи ЕЕ5-УМебр. Перелік послідовностей представлений у вигляді файлу в текстовому форматі з назвою А-1826-МО-РСТ 5Т25.МХІ, який був створений 25 лютого 2014 р. і має розмір 40849 байтів. Інформація, що міститься у переліку послідовностей, що представлений в електронній формі, повністю включена в цю заявку шляхом посилання.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

Інтерлейкін-2 (ІЛ-2) зв'язується з трьома трансмембранними субодиницями рецептора: ІЛ- 28 й ІЛ-2Ку, які сумісно активують передачу сигналів усередині клітин після зв'язування з ІЛ-2, і білюм СО25 (ІЛ-2Ка), який стабілізує взаємодію між ІЛ-2 й ІЛ-2Ву. Передача сигналів за допомогою ІЛ-2КВу задіяна у шляхах передачі сигналів за участю РіЗ-кінази, Кабз-МАР-кінази й

ЗТАТЬ.

Для того, щоб відповідати на низькі концентрації ІЛ-2, які зазвичай присутні в тканинах, Т- клітинам необхідна експресія СО25. Підгрупа Т-клітин, що експресують СО25, включає БохР3З-- регуляторні Т-клітини (Тре-клітини), які необхідні для пригнічення аутоїмунного запалення, і

ЕохРЗ- Т-клітини, які піддавали активації для експресії СО25. ГохР3-СО025-- ефекторні Т-клітини (Теф) можуть належати до типу СО4-- кітин або СОвж клітин, при цьому обидва типи можуть сприяти развитку запалення, аутоіїмуних захворювань, відторгнення трансплантата органу або реакції "трансплантат проти хазяїна". Передача сигналів за участю 5ТАТ»5, стимульованої ІЛ-2, має вирішальне значення для нормального росту й виживання Тре-клітин і для досягнення високого рівня експресії ЕохР3.

У заявці МО 2010/085495 тих же заявників ми описуємо застосування мутеїнів ІЛ-2 для переважної експансії або стимуляції Тре-клітин. Вплив описаних мутеїнів на Тре-клітини можна використовувати для лікування запальних і аутоїмунних захворювань при введенні суб'єкту таких мутеїнів. Незважаючи на те, що мутеїни ІЛ-2, описані в цій заявці, можна застосувати для переважної експансії Трег порівняно з Тер-клітинами в умовах іп мімо, бажаним було створення

Зо мутеїнів ІЛ-2, які б мали оптимальні характеристики для терапевтичного застосування у людини.

СУТЬ ВИНАХОДУ

У цій заявці описані мутеїни ІЛ-2, які можуть бути отримані з високим виходом і мають оптимізовану фармакологічну активність. Під час досліджень, спрямованих на отримання зразка

З5 терапевтичного засобу на основі мутеїну ІЛ-2 для застосування у людини, було зроблено декілька неочікуваних і непередбачуваних спостережень. Мутеїни ІЛ-2, описані в цій заявці, були отримані в результаті вказаних досліджень.

Мутеїни ІЛ-2, описані в цій заявці, мають мінімальну кількість змін ІЛ-2, що зменшує ймовірність виникнення імунної відповіді проти мутеїну ІЛ-2 і/або ендогенного ІЛ-2, при цьому зберігається здатність указаних мутеїнів стимулювати переважну експансію й активацію Трег- клітин. Окрім того, в деяких варіантах реалізації мутеїн ІЛ-2 гібридизований з молекулою, наприклад, фрагментом Ес антитіла, яка збільшує період напіввиведення з сироватки крові при введенні суб'єкту. Мутеїни ІЛ-2 мають короткий період напіввиведення з сироватки крові (від З до 5 годин при підшкірній ін'єкції). Приклади гібридних білків, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент

Ес, описані в цій заявці, мають період напіввиведення у людини, що становить щонайменше 1 день, щонайменше З дні, щонайменше 5 днів, щонайменше 10 днів, щонайменше 15 днів, щонайменше 20 днів або щонайменше 25 днів. Детальний вплив на фармакокінетику мутеїнів

ІЇЛ-2 дає змогу зменшити або знизити частоту введення терапевтичного засобу на основі мутеїну ІЛ-2.

Також при створенні великої молекули для фармацевтичного застосування особлива увага повинна бути приділена можливості отримання вказаної молекули в значних кількостях при одночасному зниженні до мінімуму агрегації і підвищенні до максимуму стабільності молекули.

Гібридна молекула, що містить мутеїн ІЛ-2 й фрагмент Ес, має такі характеристики.

Окрім того, в деяких варіантах реалізації цього винаходу гібридний білок, що містить мутеїн

ІЛ-2 й фрагмент Ес, містить фрагмент Ес з Ідсе1. Було показано, що в тих випадках, коли бажаним є усунення ефекторних функцій ІдсС1 (наприклад, АЮСсС-індукуючої активності), мутаційна заміна аспарагіну в позиції 297 гліцином (М2970; згідно з системою нумерації ЄС) забезпечує суттєве підвищення ефективності очищення й біофизичних властивостей порівняно з іншими мутаціями, які призводять до відсутності глікозилування фрагмента Ес ІдС1. У бо переважних варіантах реалізації цього винаходу залишки цистеїну вводять у фрагмент Ес, щоб забезпечити формування дисульфідних зв'язків, які збільшують стабільність молекули, що містить неглікозилований фрагмент Ес. Корисні властивості неглікозилованого фрагмента Ес знаходяться за рамками обговорення гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 й фрагмент Ес.

Таким чином, у цьому винаході запропоновані Ес-вмісні молекули, Ес-гібридні білки й антитіла, що містять заміну М29705 і, можливо, заміну одного або більше додаткових залишків цистеїном.

У іншому аспекті цей винахід стосується глікозилованих пептидних лінкерів. Переважні лінкерні пептиди, які придатні для модифікації шляхом М-глікозилування, включають ЗОМОТ (ЗЕО ІО МО: 6) або УОМОТ (5ЕО ІО МО: 7).

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований мутеїн інтерлейкіну-2 (ІЛ-2) людини, що містить заміну МУ91К і має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична амінокислотній послідовності, наведеній у ЗЕО ІЮО МО: 1, при цьому вказаний мутеїн

ІЛ-2 переважно стимулює регуляторні Т-клітини. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 людини містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності, наведеній у 5ЕО ІО МО: 1. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу вказаний мутеїн містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗБЕО ІЮ МО: 1. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу амінокислота в позиції 125 являє собою аланін. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу амінокислота в позиції 125 являє собою цистеїн.

Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу запропонований Ес-гібридний білок, що містить фрагмент Ес і мутеїн ІЛ-2 людини. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес являє собою фрагмент Ес ІдО1 людини. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес Ідс1 людини містить одну або більше мутацій, що змінюють ефекторну функцію вказаного фрагмента Ес. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу Ідс1 людини містить заміну в позиції М297. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу заміна в позиції М297 являє собою М2976. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу

Ес-гібридній білок містить заміну або делецію С-кінцевого лізину вказаного фрагмента Ес ІдО людини. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу у вказаному фрагменті Ес ІдО людини видалений С-кінцевий лізин. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес і мутеїн ІЛ-2 людини у вказаному білку з'єднані лінкером. Згідно з іншим варіантом

Зо реалізації цього винаходу вказаний лінкер являє собою О(005, ОМОТ або МОМОТ. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу вказаний лінкер являє собою со(05. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 додатково містить вставки, заміни або делеції амінокислот, які призводять до зміни характеру глікозилування вказаного Ес-гібридного білка при експресії у клітинах ссавців. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн

ІЛ-2 містить заміну 13. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 містить заміну ТЗМ або ТЗА. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 містить заміну ТЗМ. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 додатково містить мутацію 55. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 додатково містить мутацію 55Т. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу Ес-гібридний білок містить димер Ес. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу вказаний Ес-гібридний білок містить два мутеїни ІЛ-2. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу вказаний Ес- гібридний білок містить один мутеїн ІЛ-2.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонована виділена нуклеїнова кислота, що кодує мутеїн ІЛ-2 людини або частину Ес антитіла і мутеїни ІЛ-2 людини. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу вказана частина Ес антитіла і мутеїн ІЛ-2 людини кодуються у межах однієї відкритої рамки зчитування. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент с являє собою фрагмент Ес ІдсСї людини. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес ІдС1 людини містить одну або більше мутацій, що змінили ефекторну функцію вказаного фрагмента Ес. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу ІдДС1 людини містить заміну в позиції М297. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу заміна в позиції М297 являє собою М2970. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес ІДС! людини містить заміну або делецію С-кінцевого лізину. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу у вказаному фрагменті Ес Їд людини видалений С- кінцевий лізин. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу нуклеїнова кислота додатково кодує лінкер, що з'єднує частину Ес антитіла й мутеїн ІЛ-2 людини. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу вказаний лінкер являє собою 00055, СОМОТ або ХОМОТ.

Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу вказаний лінкер являє собою (0005.

Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 додатково містить вставки, заміни або делеції амінокислотних залишків, що змінюють характер глікозилування білка, що бо містить указаний мутеїн ІЛ-2, при експресії в клітинах ссавців. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 містить заміну Т3. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 містить заміну ТЗ3М або ТЗА. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 містить заміну ТЗ3М. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 додатково містить мутацію 55. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 додатково містить мутацію 557.

Згідно з іншим аспектом цього винаходу запропонований вектор експресії, що містить виділену нуклеїнову кислоту, описану вище, функціонально зв'язану з промотором.

Згідно з іншим аспектом цього винаходу запропонована клітина-хазяїн, що ключає виділену нуклеїнову кислоту, описану вище. В одному варіанті реалізації цього винаходу виділена нуклеїнова кислота функціонально зв'язана з промотором. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу вказана клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну клітину. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу клітина-хазяїн являє собою клітину Е.соїї. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу вказана клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину.

Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу клітина-хазяїн являє собою клітину ссавця.

Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу клітина-хазяїн являє собою лінію клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО).

Згідно з іншим аспектом цього винаходу запропонований спосіб виготовлення мутеїну ІЛ-2 людини, що включає культивування клітини-хазяїна, описаної вище, за умов, що забезпечують експресію вказаного промотору, і отримання мутеїну ІЛ-2 людини з цієї культури. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу спосіб включає культування клітини-хазяїна, описаної вище, за умов, що забезпечує експресію вказаного промотору, й отримання Ес-гібридного білка з цієї культури.

Згідно з іншим аспектом цього винаходу запропонований спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у популяції Т-клітин, що включає приведення популяції Т-клітин у контакт з ефективною кількістю мутеїну ІЛ-2 людини, описаного вище. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості СОЗ-ЕРохРЗ- клітин до кількості СОЗ-БохР3- клітин збільшується. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості СОЗ-РохР3-- клітин до кількості

СОЗаРохРЗ- клітин збільшується щонайменше на 50 95.

Зо Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у популяції Т-клітин, що включає приведення популяції Т-клітин у контакт з ефективною кількістю

Ес-гібридного білка, описаного вище. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості СОЗ-РохРЗ- клітин до кількості СОЗ-РохР3- клітин збільшується.

Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості СОЗЖЕохРаЗ клітин до кількості СОЗ-ЕохР3- клітин збільшується щонайменше на 50 95.

Згідно 3 іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у периферичній крові суб'єкта, що включає введення ефективної кількості мутеїну ІЛ-2 людини, описаного вище. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості

СО3-РохР3- клітин до кількості СОЗяРохР3- клітин збільшується. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу співвідношення СОЗРохР3 клітин до кількості СОЗ-ЕБохР3- клітин збільшується щонайменше на 50 95.

Згідно 3 іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у периферичній крові суб'єкта, що включає введення ефективної кількості Ес-гібридного білка, описаного вище. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості

СО3-РохР3- клітин до кількості СЮОЗя-РохР3З- клітин збільшується. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості СЮОЗя-ЕРохР3З я клітин до кількості СОЗяЕохР3- клітин збільшується щонайменше на 50 95.

Згідно 3 іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості природних клітин-кілерів (МК- клітин) у периферичній крові суб'єкта, що включає введення ефективної кількості мутеїну ІЛ-2 людини, описаного вище. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості СОЗ-РохР3 клітин до кількості СО3-СО19- лімфоцитів, що експресують СО56 і/або

СО16, збільшується. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості СОЗУРохРЗ3: клітин до кількості СО3-СО19- лімфоцитів, що експресують СО56 і/або

СО16, збільшується щонайменше на 50 95.

Згідно 3 іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб збільшення бо співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості природних клітин-кілерів (МК-

клітин) у периферичній крові суб'єкта, що включає введення ефективної кількості Ес-гібридного білка, описаного вище. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості СОЗ-РохР3 клітин до кількості СО3-СО019- лімфоцитів, що експресують СО56 і/або

СО16, збільшується. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості СОЗА-РохР3 клітин до кількості СО3-СО019- лімфоцитів, що експресують СО56 і/або

СО16, збільшується щонайменше на 50 95.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб лікування суб'єкта, що має запальне або аутоїмунне захворювання, що включає введення вказаному суб'єкту терапевтично ефективної кількості мутеїну ІЛ-2, описаного вище.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб лікування суб'єкта, що має запальне або аутоїмунне захворювання, що включає введення вказаному суб'єкту терапевтично ефективної кількості Ес-гібридного білка, описаного вище. В одному варіанті реалізації цього винаходу введення викликає зменшення щонайменше одного симптому вказаного захворювання. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у периферичній крові суб'єкта збільшується після введення. Згідно 3 іншим варіантом реалізації цього винаходу співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у периферичній крові суб'єкта залишається по суті незмінним після введення. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу запальне або аутоїмунне захворювання являє собою вовчак, реакцію "трансплантат проти хазяїна", гепатит С-індукований васкуліт, цукровий діабет І типу, розсіяний склероз, спонтанну втрату вагітності, атопічні захворювання або запальні захворювання кишечнику.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований фрагмент Ес антитіла Ідс1 людини, при цьому вказаний фрагмент Ес містить мутацію М29705, й амінокислотна послідовність указаного фрагмента Ес ІдСї людини щонайменше на 90595 ідентична амінокислотній послідовності, наведеній у ЗЕО ІЮО МО: 3. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу амінокислотна послідовність фрагмента Ес ЇД01 людини щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності, наведеній у 5ЕО ІО МО: 3. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес людського ЇдДс1 містить амінокислотну послідовність,

Зо наведену в 5ЕО ІЮО МО: 3. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес люського ЇДОС1 додатково містить одну або більше мутацій для стабілізації поліпептиду. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу одна або більше амінокислот, наведених у ЗЕО ІЮ

МО: 3, заміщені цистеїном. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу залишки М259,

А287, 292, М302, І 306, У323 або 1332 амінокислотної послідовності, наведеної в 5ХЕО ІЮО МО: 3, заміщені цистеїном. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес містить заміну А287С і 1 306С у межах амінокислотної послідовності, наведеної в зЕО ІЮО МО: 3. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес містить заміну М259С і 1 306С у межах амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 3. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес містить заміну К292С і М302С у межах амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮО МО: 3. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес містить заміну М323С і І332С у межах амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІЮО МО: 3.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропоноване антитіло, що містить фрагмент Ес, описаний вище.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований Ес-гібридний білок, що містить фрагмент Ес, описаний вище.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований поліпептид, що містить лінкер, що являє собой СООМСОТ або УОМСТ. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу лінкер містить М-глікозилування. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаход лінкер вставлений або заміщує петлю в поліпептидній структурі.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб створення молекули, що містить неглікозилований фрагмент Ес ІдДС!1, що включає експресію нуклеїнової кислоти, кодуючий поліпептид, описаний вище, в культурі клітин ссавців і отримання молекули, що містить неглікозилований фрагмент Ес Ідс1, з цієї культури.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб створення молекули, що містить неглікозилований фрагмент Ес ІдС1, за експресії в клітинах ссавців, що включає етап мутаційної заміни кодону М297 у фрагменті Ес кодоном, який кодує гліцин.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований Ес-гібридний білок, що містить послідовність ЗЕО ІЮО МО: 18 або 5ЕО ІЮ МО: 20. Згідно з одним варіантом реалізації цього 60 винаходу запропонована нуклеїнова кислота, що кодує Ес-гібридний білок. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу запропонована клітина, що включає вказану нуклеїнову кислоту. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу запропонований спосіб отримання

Ес-гібридного білка, що включає інкубування клітини за умов, що забезпечують експресію вказаного Ес-гібридного білка. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу запропонований спосіб лікування запального або аутоїмунного захворювання у суб'єкта, що включає введення ефективної кількості Ес-гібридного білка вказаному суб'єкту. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу вказане запальне або аутоїмунне захворювання являє собою реакцію "трансплантат проти хазяїна".

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропонований спосіб контролю відповіді суб'єкта на лікування з використанням мутеїну інтерлейкіну-2 (ІЛ-2) людини, описаного вище, або Ро-гібридного білка, описаного вище, що включає детектування визначеної зміни у вказаного суб'єкта, причому визначена зміна являє собою підвищення температури тіла, підвищення концентрації С-реактивного білка (СРБ) в периферичній крові вказаного суб'єкта, зменшення кількості тромбоцитів у периферичній крові вказаного суб'єкта, зменшення кількості нейтрофілів у периферичній крові вказаного суб'єкта або зменшення концентрації альбуміну в периферичній крові вказаного суб'єкта, при цьому в випадку детектування такої зміни лікування припиняють, призупиняють, зменшують частоту дозування або зменшують кількість препарату, що вводять. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу визначена зміна включає підвищення температури тіла щонайменше на 0,5 "С, збільшення концентрації С-реактивного білка в периферичній крові вказаного суб'єкта щонайменше на 0,2 мг/мл, зменшення кількості тромбоцитів у периферичній крові вказаного суб'єкта щонайменше в 0,8 разу, зменшення кількості нейтрофілів у периферичній крові вказаного суб'єкта щонайменше в 0,8 разу або зниження концентрації альбуміну в периферичній крові вказаного суб'єкта щонайменше в 0,4 разу.

КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ

ФІГ. 1. Гетеродимеризація шляхом гібридизації з С-кінцем фрагмента Ес ІдС не змінює активність мутеїнів ІЛ-2, що мають знижену ефективність і високу афінність відносно СО25, згідно з результатами короткочасного дослідження з використанням стимуляції.

ФІГ. 2А і ФІГ. 28. Мутеїни ІЛ-2, що містять вказані мутації й гібридизовані з С-кінцем однієї сторони Ес-гетеродимеру, досліджували для визначення їхньої здатності стимулювати фосфорилування 5ТАТ?»5 в Т-клітинах. Ці мутеїни також містили три мутації, що надають високу афінність відносно СО25 (Мб9А, М718, О74Р). їхню активність порівнювали з активністю трьох форм ІЛ-2, не гібридизованих з фрагментом Ес (відкриті символи): М/Т 1-2, Нам/7" (висока афінність відносно СО25) (М295, УЗ1ТН, КЗ5К, Т37А, К48Е, Мб9А, МЕ, О74Р) і Наб (висока афінність відносно СО25 і знижена активність при передачі сигналів) (М295, УЗ1Н, КЗ5Е, Т37А,

КАВЕ, Мб69А, М7ТК, 074Р, М880). Відповіді фосфо-5ТАТ»5 наведені для популяції ЕохРЗ3-Ср4ч. і

ЕохРєРЗ3-С04- Т-клітин за інтенсивності сигналу вище від порогового значення.

ФІГ. 3. Проліферація підгрупи Т-клітин у відповідь на титрування доз мутеїнів ІЛ-2, гіоридизованих з Ес-гетеродимером. Активність гібридних білків порівнювали з такою для трьох форм ІЛ-2, не гібридизованих з фрагментом Ес (відкриті символи): УМТ 1-2, Намум/т (висока афінність відносно СО25) (М295, УЗ1ТН, КЗ5К, Т37А, К48Е, Мб9А, МЕ, О74Р) і Наб (висока афінність відносно СО25 і знижена активність при передачі сигналів) (М295, УЗ1Н, КЗ5ЕК, Т37А,

КА8Е, Мб9А, М7Т1В, 074Р, М880).

ФІГ. 4. Проліферація МК-клітин у відповідь на титрування доз мутеїнів ІЛ-2, гібридизованих з

Ес-гетеродимером. Активність гібридних білков порівнювали з такою для трьох форм ІЛ-2, не гібридизованих з фрагментом Ес (відкриті символи): УМТ 1-2, Наум (висока афінність відносно

СО25) (М295, УЗН, КЗ5К, Т37А, К48Е, Мб9А, М71К, О74Р) ї Наб (висока афінність відносно

СО25 і знижена активність при передачі сигналів) (М295, УЗ1ТН, КЗ5К, Т37А, КА8Е, Мб9А, М71К,

О74Р, М880).

ФІГ. 5. Проліферація підгрупи Т-клітин у відповідь на титрування доз мутеїнів ІЛ-2, гібридизованих з Ес-гетеродимером М2970. Активність мутеїнів, гібридизованих з фрагментом

Ес, порівнювали з такою для ІЛ-2 дикого типу (відкриті кола) і Ес дикого типу (забарвлені кола).

Мутації, які зумовлюють високу афінність відносно СО25 (Намий), включали М69А і 074Р.

ФІГ. 6. Проліферація МК-клітин у відповідь на титрування доз мутеїнів ІЛ-2, гібридизованих з

Ес-гетеродимером М2970. Активність мутеїнів, що містили фрагмент Ес, порівнювали з такою для ІЛ-2 дикого типу (відкриті кола) і Ес дикого типу (забарвлені кола).

ФІГ. 7А і ФІГ. 7В. Мутеїни ІЛ-2.Ес, які не містять мутацій, що зумовлюють високу афінність відносно СО25, стимулюють експансію Тре--клітин і активацію РохР3З у гуманізованих мишей.

ФІГ. 8. Низькі щотижневі дози (0,5 мкг на тварину) мутеїнів ІЛ-2.ес стимулюють експансію бо Тре-кКклітин і активацію ГохР3З у гуманізованих мишей, при цьому для Ес.М91К спостерігали вищу активність порівняно з такою для Ес.М880 і Ес.М/Т.

ФІГ. 9А. Ес.МО1К і ЕРс.М880 зберігаються на поверхні активованих Т-клітин за рахунок зв'язку з СО25.

ФІГ. 98. Підтримання процесу передачі сигналів за участю ІЛ-2К при введенні Ес.МУ1Кк і

Ес.М880 порівняно з Ес.М/Т.

ФІГ. 10А і В. Порівняння інтервалів між періодами дозування Ес.Ме91кК, які становлять два тижні і чотири тижні, у яванських макак, і порівняння ефективності внутрішньовенного (в/в) і підшкірного (п/ш) шляхів введення.

ФІГ. 11А-Р. Кінетичні параметри клітинних відповідей, температура тіла й концентрація С- реактивного білка (СРБ) у сироватці крові у яванських макак, що отримували пролейкін?,

Ес.МО1К і Ес.М880 відповідно до різних схем дозування.

ФІГ. 12А. Вплив збільшення дозування пролейкіну?, Ес.М91К або ЕРс.М880 на рівні Трег- клітин, МК-клітин, СО4-РохРЗ: Т-клітин і СО8-РохРЗ- Т-клітин у яванських макак. Кожна точка являє собою середні максимальні відповіді від чотирьох тварин.

ФІГ. 128. Вплив збільшення дозування пролейкіну?, Ес.у91К або Ес.М880 на рівні Тре--клітин і еозинофілів у яванських макак. Кожна точка являє собою середні максимальні відповіді від чотирьох тварин.

ФІГ. 120. Вплив збільшення дозування пролейкіну?, Ес.М91К або Ес.М880 на рівні Трег- клітин, концентрацію СРБ і температуру тіла у яванських макак. Кожна точка являє собою середні максимальні відповіді від чотирьох тварин.

ФІГ. 120. Вплив збільшення дозування пролейкіну?, Ес.М91К або Ес.М880 на кількість Трег- клітин, тромбоцитів, нейтрофілів і концентрацію альбуміну у яванських макак. Кожна точка являє собою середні максимальні відповіді від чотирьох тварин. Праві осі ОМ перевернуті, щоб відобразити відносне зниження кількості тромбоцитів, нейтрофілів або концентрації альбуміну порівняно зі зразками, отриманими до початку дозування.

ФІГ. 13. Кінетика вироблення антитіл до лікарського препарату (АБА) у яванських макак, що отримували Ес.Мме1К.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ПЕРЕВАЖНИХ ВАРІАНТІВ РЕАЛІЗАЦІЇ ВИНАХОДУ

Заголовки розділів, що використовуються у цій заявці, призначені виключно для

Зо структурування тексту опису і не повинні бути витлумачені як такі, що обмежують предмет цього винаходу. Усі літературні джерела, що наведені в цьому описі, очевидним чином повністю включені в цю заявку шляхом посилання.

Стандартні методики можуть бути використані для отримання рекомбінантних ДНК, синтезу олігонуклеотидів, культивування й трансформації тканин, очищення білків і т.п. Ферментативні реакції й методики очищення можуть бути виконані згідно з технічними умовами виробника або згідно зі стандартним способом реалізації, відомим з цього рівня техніки або як описано в цій заявці. Перераховані далі процедури й методики можуть бути, як правило, виконані згідно зі стандартними способами, добре відомими в цій галузі техніки, і як описано у різних загальних і більш конкретних посиланнях, які цитуються й обговорюються в цьому описі. Див., наприклад, керівництво Затргоок еї аї!., 2001, МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиеї, 3 ей., Соід Зргіпд

Нагбог І арогафогу Ргез55, Соїй Зргіпд Нагбог, М.У., яке включено в цю заявку шляхом посилання для будь-яких цілей. У тому випадку, якщо не передбачені конкретні визначення, використовувана номенклатура, лабораторні процедури й методики, що стосуються рівня аналітичної хімії, органічної хімії, медичної і фармацевтичної хімії, описані в цій заявці, є добре відомими й зазвичай використовуються в цій галузі техніки. Для проведення хімічного синтезу, хімічних досліджень, приготування і доставки фармацевтичного препарату й лікування пацієнтів можуть бути використані стандартні методики.

ІЛ-2

Мутеїни ІЛ-2, що описані в цій заявці, являють собою варіанти людського ІЛ-2 дикого типу. У цій заявці термін "людський ІЛ-2 дикого типу", "ІЛ-2 дикого типу" або "МТ ІЛ-2" означає поліпептид, що має таку амінокислотну послідовність:

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНОГГ ОЇ ОМІМСИММУКкМРКІТАМІ ТЕКЕММРККАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЕЇ КРІ Е

ЕМІ МІ АОЗКМЕНІ АРАОГ ІЗМІММ ІМ ЕЇ КаАЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕХОБІІЗТІ Т

В якій Х являє собою С, 5, М або А (5ЕО ІО МО: 2).

Варіанти можуть містити одну або більше замін, делецій або вставок у межах амінокислотної послідовності ІЛ-2 дикого типу. У цій заявці залишки амінокислот позначені однолітерним кодом, після якого зазначена позиція амінокислоти в ІЛ-2, наприклад, КЗ5 являє собою залишок лізину в позиції 35 у послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2. У цій заявці заміни амінокислот позначені однолітерним кодом, після якого зазначена позиція амінокислоти в ІЛ-2, за яким 60 слідує однолітерний код замінної амінокислоти, наприклад, КЗ5А являє собою заміну залишку лізину в позиції 35 у послідовності 5Е0 ІЮО МО: 2 залишком аланіну.

Мутеїни ІЛ-2

У цьому винаході запропоновані мутеїни ІЛ-2 людини, які переважно стимулюють регуляторні Т-клітини (Трег). У цій заявці термін "переважно стимулює регуляторні Т-клітини" означає, що мутеїн підсилює проліферацію, виживання, активацію і/або функцію СОЗАЕРохР З

Т-клітин у більшій мірі, ніж СОЗя-РохР3- Т-клітин. Здатність переважно стимулювати Трег-клітини може бути виміряна за допомогою методу проточної цитометрії лейкоцитів периферичної крові, в якій спостерігають збільшення відсоткої частки ГохР3-СО4- Т-клітин в загальній популяції сра4- Т-клітин, збільшення відсоткої частки гохР3-СО8-- Т-клітин у загальній популяції Сов Т- клітин, збільшення відсоткої частки ГохР3- Т-клітин відносно МК-клітин, і/або більш виражене збільшення рівня експресії СО25 на поверхні БохРЗ- Т-клітин відносно збільшення рівня експресії СО25 на поверхні інших типів Т-клітин. Переважну експансію Тре-клітин також можна детектувати як збільшення представлення деметильованої ДНК промотору ГохР3 (тобто Трег- специфічної деметильованої області або Т5ОК) відносно деметильованих генів СОЗ в загальній

ДНК, екстрагованій з цільної крові, згідно з результатами секвенування продуктів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), отриманих з геномної ДНК, обробленої бісульфітом (9. бепоції, єї аї. 2011. Ерідепеїйсв5 6:2, 236-246).

Мутеїни ІЛ-2, які переважно стимулюють Тре-клітини, збільшують співвідношення кількості

СО3-РохР3- Т-клітин до кількості СОЗяРохР3- Т-клітин у суб'єкта або в зразку периферичної крові щонайменше на 30 96, щонайменше на 40 9о, щонайменше на 50 956, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 100 95, щонайменше на 150 95, щонайменше на 200 95, щонайменше на 300 95, щонайменше на 400 95, щонайменше на 500 95, щонайменше на 600 95, щонайменше на 700 95, щонайменше на 800 95, щонайменше на 900 95 або щонайменше на 1000 95.

Переважні мутеїни ІЛ-2 включають, але не обмежуються ними, мутеїни ІЛ-2, що містять заміну М91К або М880 в амінокислотній послідовності, наведеній у 5ЕО ІЮ МО: 2. Приклад мутеїну ІЛ-2 наведений у 5ЕО ІЮО МО: 1. Особливо переважною є амінокислотна послідовність, наведена в ЗЕО ІО МО: 1, що містить заміну СТ25А. Незважаючи на те, що зменшення числа додаткових мутацій і послідовності ІЛ-2 дикого типу може забезпечувати переваги, в рівень

Зо цього винаходу включені мутеїни ІЛ-2, що мають укорочення або додаткові вставки, делеції або заміни, окрім заміни М9ЇК або М880, за умови, що вказані мутеїни зберігають активність, спрямовану на переважну стимуляцію Тре-клітин. Таким чином, варіанти реалізації цього винаходу включають мутеїни 1Л-2, які переважно стимулюють Тре-клітини і містять амінокислотну послідовність, що містить заміну МУ1К або М880, яка щонайменше на 90 95, щонайменше на 91 95, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 95, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 98 95 або щонайменше на 99 95 ідентична амінокислотній послідовності, наведеній у 5ЕО ІЮ МО: 2. В особливо переважних варіантах реалізації такі мутеїни 1/Л-2 містять амінокислотну послідовність яка щонайменше на 9095, щонайменше на 9195, щонайменше на 92 965, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 9795, щонайменше на 98595 або щонайменше на 99595 ідентична амінокислотній послідовності, наведеній у 5ЕО ІО МО. 2.

Стосовно амінокислотних послідовностей ідентичність і/або схожість послідовностей визначають з використанням стандартних методик, відомих у цій галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись ними, алгоритм локальної ідентичності послідовностей, описаний у роботі

Зтій апа М/аїептап, 1981, Адм. Аррі. Майн. 2:482, алгоритм вирівнювання для визначення ідентичності послідовностей, описаний у роботі Меедієтап апа УМипбсй, 1970, У. Мої. Віо). 48:443, метод визначення схожості послідовностей, описаний у роботі Реагхоп апа Гіртап, 1988, Ргос. Маї. Асад. 5сі. О.5.А. 85:2444, комп'ютеризований варіант реалізації цих алгоритмів (САР, ВЕБ5ТРІТ, РАБТА і ТЕРА5ТА в пакеті програмного забезпечення УМізсопвіп Сепеїісв5,

Сепеїїсв Сотриїег (гор, 575 Зсіепсе Огіме, Медісон, Вісконсин, США), програму для визначення ідентичності послідовностей Вебві Рії, описану в роботі Юемегеих еї аї!., 1984, Мисі.

Асій Вев5. 12:387-395, переважно з використанням налаштувань за замовчуванням або візуальної перевірки. Переважно відсоток ідентичності обраховується за допомогою системи баз даних РазіОВ на основі наступних параметрів: штраф за невідповідність 1; штраф за пропуск 1; штраф за розмір пропуску 0,33 і штраф за приєднання 30, "Сигтепі Меїпоаз іп

Зедиепсе Сотрагізоп апа Апаїувзі5, » Масготоїесціє Зедпиепсіпд апа Зупіпеві5, ЗеІесівєд Меїпоаз апа Арріісайопв5, рр 127-149 (1988), Агап НВ. І і55, Іпс.

Одним з прикладів придатного алгоритму є РІГЕОР. РІГЕОР здійснює множинне бо вирівнювання послідовностей з групи споріднених послідовностей з використанням прогресуючого парного вирівнювання. Він також будує дерево, що показує взаємозв'язок між кластерами, що викоритовується для побудови вирівнювання. У РІГЕОР використовується спрощення способу прогресуючого вирівнювання Репо 8. Оооїїше, 1987, у). Мої. Емої. 35:351-360; використовуваний спосіб аналогічний способу, описаному Ніддіп5 апа Зпагр, 1989, САВІО5З 5:151-153. Придатні параметри РІГСЕОР включають штраф за делецію за замовчуванням 3,00, штраф за продовження делеції за замовчуванням 0,10 і аналізовані кінцеві делеції.

Іншим прикладом придатного алгоритму є алгоритм ВІ А5Т, описаний в: Ай5епиЇ еї аї., 1990,

У. Мої. Віої. 215:403-410; Аве! еї а!., 1997, Мисієїс Асіаз Не5. 25:3389-3402; і Кагіп еї а!., 1993,

Ргос. Маї). Асад. сі. 0.5.А. 90:5873-5787. Особливо придатною програмою ВІ А5ЗТ є програма

М/О-ВІ А5Т-2, яка була отримана з АЇїбвБсепПиЇ еї аї!., 1996, Меїподв» іп Епгутоїоду 266:460-480. У

МО-ВІАБЗТ-2 використовується декілька параметрів пошуку, більшість з яких установлені як значення за замовчуванням. Для змінних параметрів установлюють наступні значення: область перекривання - 1, частка перекривання - 0,125, поріг для слова (Т) - ІІ. Параметри Н5Р 5 і НІР 52 являють собою динамічні значення й встановлюються програмою самостійно, залежно від структури конкретної послідовності і структури конкретної бази даних, в якій проводять пошук цільової послідовності. Проте значення можна коректувати для підвищення чутливості.

Прикладом додаткового придатного алгоритму є ЗАРРЕО ВІ А5Т, описаний в Айв5епиї еї аї., 1993, Мис. Асійб5 Нев5. 25:3389-3402. САРРЕЮО ВІАБТ використовує матрицю вагових оцінок замін ВГОЗИОМ-62; значення порогу Т установлено рівним 9; двохпіковий спосіб для ініціації нерозривних продовжень оцінює довжину делеції К як 10ж-К; Хи установлено рівним 16 і Ху установлено рівним 40 для етапу пошуку за базою даних і 67 для вихідної стадії алгоритмів.

Вирівнювання послідовностей, що містять делеції, ініціюється оцінкою, що відповідає близько 22 бітам.

Незважаючи на те, що сайт або область для введення варіацій амінокислотної послідовності можуть бути визначені заздалегідь, мутація сама собою не обов'язково повинна бути визначена заздалегідь. Наприклад, для того, щоб оптимізувати ефективність мутації в якому-небудь сайті, цільовий кодон або область можуть піддаватися випадковому мутагенезу, потім експресований мутеїн ІЛ-2 піддають скринінгу для виявлення оптимальної комбінації бажаних видів активності. Методики введення мутаційних замін у заздалегідь визначені сайти молекули ДНК, що має відому послідовність, добре відомі, наприклад, мутагенез з використанням праймера М13 і ПЛР-мутагенез. Скринінг мутеїнів може бути виконаний за допомогою кількісних досліджень, описаних у цій заявці, наприклад.

Заміни амінокислот, як правило, являють собою заміни окремих залишків; вставки зазвичай містять від близько одного (1) до двадцяти (20) амінокислотних залишків, хоча допустимі вставки значно більших розмірів. Делеції можуть становити від близько одного (1) до близько двадцяти (20) амінокислотних залишків, хоча в деяких випадках делеції можуть бути значно більших розмірів.

Заміни, делеції і вставки амінокислотних залишків або будь-яку їхню комбінацію можна використовувати для отримання кінцевого похідного або варіанта. Як правило, ці зміни стосуються декількох амінокислот, щоб мінімізувати зміни молекули, зокрема, імуногенність і специфічність антигензв'язувального білка. Проте за визначених умов можуть бути допустимі більш суттєві зміни. Консервативні заміни, як правило, вводять відповідно за наступною схемою, наведеною в Таблиці 1.

Таблиця 1

Ше 11111111 Певма,////11111111111111111111111

Суттєві зміни функції або імуногенної ідентичності здійснюють шляхом вибору замін, які є менш консервативними, ніж ті, які показані в Таблиці 1. Наприклад, можуть бути введені заміни, які більш суттєво впливають на: структуру головного поліпептидного ланцюга в області зміни, наприклад, альфа-спіральну або бета-складчасту структуру; заряд або гідрофобність молекули в сайті-мішені або об'єм бічного ланцюга. Заміни, які, як очікується, в цілому викликають суттєві зміни властивостей поліпептиду, включаючи те, в яких (а) гідрофільній залишок, наприклад, серил або треоніл, заміщений (або змінений) гідрофобним залишком, наприклад, лейцилом, ізолейцилом, фенілаланілом, валілом або аланілом; (б) цистеїн або пролін заміщений (або змінений) будь-яким іншим залишком; (с) залишок, що має електропозитивний бічний ланцюг, наприклад, лізил, аргініл або гістидил, заміщений (або змінений) електронегативним залишком, наприклад, глутамілом або аспартилом; або (4) залишок, що має об'ємний бічний ланцюг, наприклад, фенілаланін, заміщений (або змінений) залишком, що не має бічного ланцюга, наприклад, гліцином.

Варіанти зазвичай проявляють аналогічну якісну біологічну активність і викликають аналогічну імунну реакцію, що і природний аналог, у той же час за мірою необхідності проводять відбір варіантів для зміни характеристик мутеїну ІЛ-2. Альтернативно, варіант може бути сконструйований так, щоб змінити біологічну активність мутеїну ІЛ-2. Наприклад, сайти глікозилування можуть бути змінені або видалені, як описано в цій заявці.

Мутеїни ІЛ-2, що мають збільшений період напіввиведення з сироватки крові

Оскільки мутеїни ІЛ-2, що запропоновані в цій заявці, переважно стимулюють експансію Трег- клітин порівняно, наприклад, з Теф» або МК-клітинами, очікується, що при введенні пацієнту їхній профіль безпеки буде відрізнятися від такого для ІЛ-2 дикого типу або пролейкіну? (алдеслейкін;

Момагпіх, Базель, Швейцарія). Побічні ефекти, пов'язані з введенням ІЛ-2 дикого типу або пролейкіну?, включають грипоподібні симптоми, мерзлякуватість/озноб, біль у суглобах, лихоманку, висип, свербіж, реакції в місці ін'єкції, артеріальну гіпотензію, діарею, нудоту, занепокоєння, сплутаність свідомості і депресію. Мутеїни ІЛ-2, запропоновані в цій заявці, можуть бути змінені для включення або гібридизації з молекулами, які збільшують період напіввиведення мутеїну із сироватки крові без підвищення ризику того, що таке збільшення

Зо періоду напіввиведення збільшить імовірність виникнення або вираженість побічного ефекту, або небажаного явища у пацієнта. Підшкірне введення такого мутеїну, що має збільшений період напіввиведення з сироватки крові, може забезпечити більш тривалий вплив на мішень з більш низьким системним максимальним впливом (Стах). Збільшений період напіввиведення із сироватки крові може забезпечити введення мутеїну за нижчого дозування або з меншою частотою дозування.

Період напіввиведення із сироватки крові мутеїнів ІЛ-2, запропонованих у цій заявці, може бути збільшений по суті будь-яким способом, відомим у цій галузі техніки. Такі способи включають зміну послідовності мутеїну ІЛ-2 для включення пептиду, який зв'язується з неонатальним рецептором су або зв'язується з білком, який має збільшений період напіввиведення із сироватки крові, наприклад, (95 або сироватковим альбуміном людини.

Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 гібридизований з поліпептидом, який забезпечує збільшення періоду напіввиведення гібридної молекули. Такі поліпептиди включають фрагмент Ес до або інші поліпептиди, які зв'язуються з неонатальним рецептором

Есу, сироватковим альбуміном людини, або поліпептиди, які зв'язуються з білком, що має збільшений період напіввиведення із сироватки крові. У переважних варіантах реалізації мутеїн

ІЛ-2 гібридизований з молекулою Ес Ід.

Мутеїн ІЛ-2 може бути гібридизований з М-кінцем або С-кінцем фрагмента Ес дО. Як показано в прикладах, гібридизація з С-кінцем фрагмента Ес до зберігає активність мутеїну ІЛ- 2 у більшій мірі, ніж гібридизація з М-кінцем фрагмента Ес Ідс.

Один варіант реалізації цього винаходу стосується димеру, що містить два Ес-гібридних поліпептиди, отриманих шляхом гібридизації мутеїну ІЛ-2 і фрагмента Ес антитіла. Димер може бути отриманий, наприклад, шляхом введення гібридного гена, що кодує гібридний білок, у відповідний вектор експресії який експресує гібридний ген у клітинах-хазяїнах, трансформованих рекомбінантним вектором експресії тим самим забезпечуючи збирання експресованого гібридного білка з формуванням структури, яка близька до такої для молекул антитіл, після утворення міжланцюгових зв'язків між фрагментами Ес для отримання димеру.

У цій заявці термін "Рс-поліпептид" або "фрагмент Ес" включає природні і мутовані форми поліпептидів, отриманих з фрагмента Ес антитіла. Укорочені форми таких поліпептидів, що містять шарнірну область, яка сприяє димеризації, також включені в галузь цього винаходу. У деяких варіантах реалізації фрагмент Ес містить ділянки СН2 і СНЗ антитіла. Поряд зі збільшеним періодом напіввиведення із сироватки крові однією з переваг гібридних білків, що містять фрагменти Ес (і утворені з них олігомери), є легше очищення способом афінної хроматографії на колонках з такими сорбентами, як білок А або білок 5. Переважні фрагменти

Ес отримують з людського дО, який включає Ідс1, Ідс2, ІдоЗ і Ідс4. При цьому конкретні залишки всередині Ес позначені з використанням номерів положень. Всі позиції Ес пронумеровані відповідно до системи ЄС.

Одна з функцій фрагмента Ес антитіла полягає у взаємодії з імунною системою, коли антитіло зв'язується зі своєю мішенню. Така функція розглядається як "ефекторна функція".

Взаємодія антитіло-мішень призводить до антитіло-залежної клітинної цитотоксичності (АОСС), антитіло-залежного клітинного фагоцитозу (АОСР) і/або комплемент-залежної цитотоксичності (СОС). АОС ї АОСР ініціюються при зв'язуванні фрагмента Ес з рецепторами Ес на поверхні клітин імунної системи. СОС ініціюються при зв'язуванні фрагмента Ес з білками системи комплементу, наприклад, С1а4.

Підкласи ІдСо розрізняються за їхньою здатністю виступати в ролі посередників ефекторних функцій. Наприклад, Ідс1 значно перевершує 1Ідоса2 і Ідс4 відносно здатності ініціювати АОСС і

СОС. Таким чином, у тих варіантах реалізації в яких ефекторна функція є небажаною, фрагмент Ес Ідс2 буде переважним. Проте відомо, що молекули, що містять Ес Ід2, складніше отримати, і вони мають менш привабливі біофізичні властивості, такі як коротший період напіввиведення, порівняно з молекулами, що містять Ес Ід51.

Ефекторна функція антитіла може бути збільшена або зменшена шляхом введення однієї або більше мутацій у фрагмент Ес. Варіанти реалізації цього винаходу включають гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, в яких фрагмент Ес модифікований для збільшення ефекторної функції (0.5. 7317091 ії 5іоНІ, Сцт. Оріп. Віоїесп., 20:685-691, 2009; які повністю

Зо включені в цю заявку шляхом посилання). Приклади молекул Ес ІдДО1, що мають підвищену ефекторну функцію, включають ті, які містять такі заміни: з2гз9рлазагє з2г39р/АЗ305/332Е з2г39р/АЗЗзОІ /ЗЗ2Е з2ЗВА/ЮЗЗЗА/КЗ34А

Р2АЛ/АЗЗ390

Р2А7/АЗ390 ревон/кг905 ревон/кг905/52980 ревон/кг905/5298М

Е2431І /ЛН292Р/УЗО0І.

Е2431І /ЯН292Р/УЗО01 /Р 3961.

Е2431І /Я292Р/УЗО00І //3051/Р 3961. сезбА/з2390/332Е

КЗ2б6А/ЕЗЗЗА

КЗ26М/ЕЗЗ335

К29ОЕ/52980/Т1299А к2г9оМм/5298,1/1299А

К29ОЕ/52980/1299А/К326Е к2г9о0м/5298,1/1299А/К326Е

Інший спосіб підвищення ефекторних функції білків, що містять Ес до, включає зменшення ступеня іфукозилування фрагмента Ес. Видалення корової фукози 3 2-антенарних олігосахаридів, приєднаних до фрагмента Ес, значно підсилювало АЮСС-ефекторну функцію без зміни антигензв'язувальних функції або СОС-ефекторної функції. Відомо декілька способів зменшення або усунення іфукозилування Ес-вмісних молекул, наприклад, антитіл. Ці способи включають рекомбінантну експресію в певних лініях клітин ссавців, включаючи лінію клітин з блокованим геном РИТ8, варіант лінії клітин СНО І ес13, лінію клітин гібридоми щура ХВ2/0, клітинну лінію, яка містить малі інтерферуючі РНК, специфічні відносно гена БИТВ, і клітинну лінію, що спільно експресує В-1,4-М-ацетилглюкозамінилтрансферазу ПШ ї фермент апарату бо Гольджі а-манозидазу ІІ. В іншому варіанті Ес-вмісні молекули можна експресувати в клітині з виду, що не стосується ссавців, такій як рослинна, дріжджова або прокаріотична клітина, наприклад, клітина Е. соїї.

У переважних варіантах реалізації цього винаходу гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, містять фрагмент Ес, який модифікований для зменшення ефекторних функції.

Приклади молекул Ес, що мають зменшену ефекторну функцію, включають ті, які містять такі заміни:

М297А або М2970О (1901)

І 234А/ 235А (Ідс1)

М234А/с237А (ІдИа2)

І 235А/4237А/ЕЗ18А (ІдИ4)

Н2г680/УЗО9І /АЗ305/АЗ3315 (2) б2205/02265/02295/Р2385 (41) б2265/02295/Е2ЗЗР/Л 234М/ 235А (ІДСИ1)

Г234Р/ 235Е/РЗ315 (41)

З267Е/І 328Е (Іда1)

Відомо, що ІдДО1 людини має сайт глікозилування в позиції М297 (система нумерації ЄС), і глікозилування сприяє реалізації ефекторної функції антитіл (91. Приклад послідовності Ідс1 наведений в 5ЕО ІЮ МО: 3. У ряді дослідницьких груп були зроблені спроби ввести мутацію в позицію М297, щоб отримати неглікозиловані антитіла. Мутагенез був направлений переважно на заміщення М297 амінокислотами, які схожі з аспарагіном за фізико-хімічною природою, такими як глутамін (М2979) або аланін (М297А), який імітує аспарагін без полярних груп.

У цій заявці термін "неглікозиловане антитіло" або "неглікозилований фрагмент Ес" стосується статусу глікозилування залишку в позиції 297 фрагмента Ес. Антитіло або інша молекула може бути глікозилована в одному або більше інших сайтів, але все ще може розглядатися як неглікозиловане антитіло або неглікозилований Ес-гібридний білок.

У ході дослідницьких робіт з метою отримання фрагмента Ес Ідс1, позбавленого ефекторних функції, було виявлено, що мутаційна заміна амінокислоти в позиції М297 людського ЇДО1 залишком гліцину, тобто М2970, забезпечує набагато вищу ефективність очищення і поліпшені біофізичні властивості порівняно з іншими амінокислотними замінами в

Зо цьому залишку. Див. Приклад 8. Таким чином, у переважних варіантах реалізації гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, містить фрагмент Ес людського ЇдсС1, що містить заміну М2970. Фрагмент Ес із заміною М2975 можна застосовувати відповідно з будь-яким варіантом реалізації в якому молекула містить фрагмент Ес людського ІдДС1, при цьому її застосування не обмежується включенням до складу гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес. У деяких варіантах реалізації антитіло містить фрагмент Ес, який містить заміну

Мм297а.

Фрагмент Ес, що являє собою фрагмент Ес ІдДО1 людини з мутацією в позиції М2970, також може містити додаткові вставки, делеції і заміни. У деяких варіантах реалізації цього винаходу фрагмент Ес ІдсС!1 людини містить заміну М29705 і щонайменше на 9095 ідентичний, щонайменше на 91 95 ідентичний, щонайменше на 92 95 ідентичний, щонайменше на 93 95 ідентичний, щонайменше на 94 95 ідентичний, щонайменше на 95 95 ідентичний, щонайменше на 96 95 ідентичний, щонайменше на 97 95 ідентичний, щонайменше на 98 95 ідентичний або щонайменше на 99 95 ідентичний амінокислотній послідовності, наведеній у 5ЕО ІЮ МО: 3. В особливо переважному варіанті реалізації С-кінцевий залишок лізину заміщений або видалений. Амінокислотна послідовність людського ІдДО1, що містить заміну М2975 і делецію С- кінцевого лізину, наведена в ЗЕО ІЮО МО: 4.

Було показано, що молекули, що містять неглікозилований фрагмент Ес ІДС1, менш стабільні, ніж молекули, що містять глікозилований фрагмент Ес Ідс1. Фрагмент Ес може бути додатково модифікований, щоб підвищити стабільність неглікозилованої молекули. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу одна або більше амінокислот заміщені цистеїном так, щоб сформувати дисульфідні зв'язки в димерному стані. Залишки М259, А287, К292, М302,

Ї306, М323 або 1332 амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІЮ МО: 3, можуть бути заміщені цистеїном. У переважних варіантах реалізації цього винаходу конкретні пари залишків заміщені так, що вони переважно формують дисульфідний зв'язок один з одним, тим самим обмежуючи або запобігаючи випадковому формуванню дисульфідних зв'язків. Переважні пари включають, але не обмежуються ними, А287С і 1 306С, М259С і 1306, К292С і М302С і М323С і

ІЗЗ2О.

У цьому винаході запропоновані Ес-вмісні молекули, в яких один або більше залишків 259,

А287, К292, М302, 1306, М323 або І332 заміщені цистеїном. Переважні Ес-вмісні молекули 60 включають ті, які містять заміни А287С і 1306, М259С і1306С, К292С і М302С або М323С і

ІЗЗ2О.

Додаткові мутації, які можуть бути введені у фрагмент Ес ІдДС1, включають ті, які полегшують формування гетеродимеру з Ес-вмісних поліпептидів. У деяких варіантах реалізації фрагмент

Ес модифікований для створення "виступів" і "западин", які полегшують формування гетеродимеру з двох різних Ес-вмісних поліпептидних ланцюгів при спільній експресії в клітині.

Патент США 7695963. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу фрагмент Ес змінений для використання ефекту електростатичної взаємодії, щоб стимулювати формування гетеродимеру, перешкоджаючи утворенню гомодимеру з двох різних Ес-вмісних поліпептидних ланцюгів при спільній експресії в клітині. Заявка УЛО 09/089004, яка повністю включена в цю заявку шляхом посилання. Переважні гетеродимерні фрагменти Ес включають ті, в яких один ланцюг Ес містить заміни 0399К ії ЕЗ56К, й інший Ес ланцюг містить заміни К4090 і К3920. В інших варіантах реалізації один ланцюг Ес містить заміни ЮОЗ99К, ЕЗ56К і ЕЗ57К, й інший ланцюг Ес містить заміни К4090, К3920 і К3700.

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу мономерна форма гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, тобто, що містить тільки одну молекулу мутеїну ІЛ-2, може забезпечувати певні переваги. У таких варіантах реалізації фрагмент Ес гібридного білка може містити одну або більше мутацій, які полегшують формування гетеродимеру. Гібридний білок експресується спільно з фрагментом Ес, що містить мутації, зворотні відносно тих, які присутні в гібридному поліпептиді, що містить мутеїн ІЛ-2 і Ес, але без мутеїну ІЛ-2. При утворенні гетеродимеру з двох Ес-вмісних поліпептидів кінцевий білок містить тільки один мутеїн ІЛ-2.

Інший спосіб створення мономерного гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, включає гібридизацію мутеїну ІЛ-2 з мономерним фрагментом Ес, тобто фрагментом Ес, який не піддається димеризації. Стабільні мономерні фрагменти Ес містять мутації, які перешкоджають димеризації і стабілізують молекулу в мономерній формі. Переважні мономерні фрагменти Ес розкриті в ММО 2011/063348, яка повністю включена в цю заявку шляхом посилання. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент

Ес, містять фрагмент Ес з негативно зарядженими амінокислотами в позиціях 392 і 409 спільно із заміною амінокислот у позиціях У349, 1351, 1368, М397, 1398, Р405 або 407 залишком треоніну.

Зо Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу гібридний білок, що містить мутеїн

ІЛ-2 ії фрагмент Ес, містить лінкер між Ес і мутеїном ІЛ-2. У цій галузі техніки відомо багато різних поліпептидних лінкерів, які можна використовувати для конструювання гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і Ес. У переважних варіантах реалізації гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і Ес, містить одну або більше копій пептиду, що складається з (0005 (ЗЕО ІЮ МО: 5), ООМОТ (ЗЕО ІЮО МО: 6) або УОМОТ (ЗЕО ІО МО: 7), між Ес і мутеїном ІЛ-2. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу область поліпептиду між фрагментом Ес і областю мутеїну ІЛ-2 містить одну копію (0005 (ЗЕО ІЮ МО: 5), СОМОТ (ЗЕО ІЮО МО: 6) або МОМОТ (ЗЕО ІО МО: 7). У цій заявці розкрито, що лінкери ССОМОТ (5ЕО ІЮО МО: 6) або МОМОТ (5ЕО ІО

МО: 7) піддаються глікозилуванню при експресії у відповідних клітинах і що таке глікозилування може полегшити стабілізацію білка в розчині і/або при введенні в умовах іп мімо. Таким чином, згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу, гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-г2, містить глікозилований лінкер між фрагментом Ес і областю мутеїну ІЛ-2.

У цьому винаході передбачено, що глікозилований лінкер можна використовувати для конструювання поліпептиду. У цьому винаході запропоновані поліпептиди, що містять ЗОМОТ (ЗЕБЕО ІО МО: 6) або МОМОТ (ЗЕБО ІЮО МО: 7), що введені в амінокислотну послідовність поліпептиду або заміщають одну або більше амінокислот у амінокислотної послідовності поліпептиду. У переважних варіантах реалізації цього винаходу ООМОТ (ЗЕО ІО МО: 6) або

МОМОТ (5ЕО ІО МО: 7) введені в петлю третинної структури поліпептидів. В інших варіантах реалізації одна або більше амінокислот в петлі заміщені ЗОМОТ (ЗЕО ІЮО МО: 6) або УОМОТ (ЗЕО ІО МО: 7).

С-кінцева ділянка фрагмента Ес і/або М-кінцева ділянка мутеїну ІЛ-2 може містити одну або більше мутацій, які змінюють профіль глікозилування гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, при експресії в клітинах ссавців. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 додатково містить заміну Т3, наприклад, ТЗМ або ТЗА. Мутеїн ІЛ-2 може додатково містити заміну 55, наприклад, 55Т.

Ковалентні модифікації мутеїну ІЛ-2 і гібридних білків, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, включені в обсяг цього винаходу, і, як правило, але не завжди, здійснюються після трансляції.

Наприклад, кілька типів ковалентних модифікацій мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, вводять в молекулу за допомогою взаємодії конкретних бо амінокислотних залишків мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент

Ес, з органічним агентом, що використовується для отримання похідних, який здатний реагувати з вибраними бічними ланцюгами або залишками М- або С-кінцевих аміногруп.

Залишки цистеїнілу найчастіше вступають у реакцію з с-галоацетатами (і відповідними амінами), такими як хлороцтова кислота або хлорацетамід, з формуванням карбоксиметильних або карбоксіамідометильних похідних. Залишки цистеїнілу також утворюють похідні при взаємодії з бромтрифторацетоном, са-бром-В- (5-імідозоїл) пропіонової кислоти, хлорацетилфосфатом, М-алкілмалеїмідами, З-нітро-2-піридилдисульфідом, метил-2- піридилдисульфідом, п-хлормеркурібензоатом, 2- хлормеркурі-4-нітрофенолом або хлор-7- нітробензо-2-окса-1,3-діазолом.

Залишки гістидилу утворюють похідні при взаємодії з діетилпірокарбонатом при рН - 5,5-7,0, оскільки цей агент є відносно специфічним стосовно бічного ланцюга гістидилу. Також можна застосовувати пара-бромфенацилбромід; реакцію проводять переважно в 0,1 М какодилаті натрію при рН 6,0.

Залишки лізинілу і кінцевих амінокислот піддають взаємодії з бурштиновим ангідридом або ангідридами інших карбонових кислот. Отримання похідних при використанні цих агентів змінює заряд залишків лізинілу. Інші придатні реагенти для отримання похідних являють собою а- аміновмісні залишки, включаючи імідоефіри, такі як метилпіколінимідат; піридоксаль фосфат; піридоксаль; хлорборгідрид; тринітробензолсульфонову кислоту; О-метилізосечовину; 2,4- пентандіон; і реакцію з гліоксилатом, що каталізується трансаміназою.

Залишки аргінілу модифікують шляхом взаємодії з одним або декількома стандартними реагентами, включаючи фенілгліоксаль, 2,3-бутандіон, 1,2-циклогександіон і нінгідрин. Для отримання похідних залишків аргініну необхідно, щоб реакція проходила в лужних умовах у зв'язку з високим значенням рКа функціональної групи гуанідину. Окрім того, ці реагенти можуть взаємодіяти з групами лізину, а також епсилон- аміногрупою аргініну.

Може бути проведена специфічна модифікація залишків тирозину, при цьому особливий інтерес викликає введення спектральних міток у залишки тирозину за допомогою реакції з ароматичними сполуками діазонію або тетранітрометаном. Найчастіше для утворення О- ацетилпохідних тирозилу і З-нітропохідних використовують М-ацетилімідазол і тетранітрометан, відповідно. Залишки тирозилу піддають йодуванню з використанням 1!25 або 1"!, щоб отримати мічені білки для застосування в радіоїмунологічних способах досліджень, також можна використовувати спосіб на основі хлораміну Т, описаний вище.

Карбоксильні бічні групи (аспартилу або глутамілу) селективно модифікують шляхом взаємодії з карбодіїімідами (Б-М-С-М-К), де К і КЕ" являють собою необов'язково різні алкільні групи, такі як 1-циклогексил-3-(2-морфолініл-4-етил) карбодіїмід або 1-етил-3- (4-азон-4,4- диметилпентил) карбодіїмідів. Окрім того, залишки аспартилу і глутамілу перетворюють на залишки аспарагіну і глутаміну шляхом взаємодії з іонами амонію.

Отримання похідних із застосуванням біфункціональних агентів можна використовувати для зшивання антигензв'язувальних білків з нерозчинним у воді носієм або поверхнею для використання в різних способах досліджень. Зазвичай, зшиваючі агенти, що використовуються, включають, наприклад, 1,1-біс(дізоацетил)-2-фенілетан, глутаровий альдегід, складні ефіри М- гідроксисукциніміду, наприклад, складні ефіри 4-азидосаліцилової кислоти, гомобіфункціональні імідоефіри, включаючи складні ефіри дисукцинімідилу, такі як 3, 3'-дитіобіс (сукцинімідилпропіонат), і біфункціональні малеїіміди, такі як біс-М-малеїмідо-1,8-октан. Агенти для одержання похідних, такі як метил-3-(п-азидофеніл)дитіо| пропіонімідат, дають змогу отримувати фотоактивуючі проміжні сполуки, які здатні утворювати поперечні зшивання за присутності світла. В іншому варіанті для іммобілізації білків використовують реакційноздатні нерозчинні у воді носії, такі як вуглеводи, активовані ціаноген-бромідом, і реакційноздатні субстрати, описані в патентах США МоМе3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 і 4330440.

Залишки глутамінілу і аспарагінілу зазвичай деамідують з отриманням відповідних залишків глутамілу і аспартилу, відповідно. В іншому варіанті ці залишки деамідують в слабокислому середовищі. Будь-яка форма цих залишків включена в обсяг цього винаходу.

Інші модифікації включають гідроксилювання проліну і лізину, фосфорилування гідроксильних груп залишків серилу або треонілу, метилювання а-аміногруп бічних ланцюгів лізину, аргініну і гістидину (Т. Е. Стеідпіоп, Ргоїеіп5: Зігисіиге апа МоїІесшаг Ргорегпіє5, УМ. Н.

Егеетап 4 Со., Зап Егапсізсо, 1983, рр. 79-86), адцетилювання М-кінцевого аміну й амідування будь-якої С-кінцевої карбоксильної групи.

Інший тип ковалентної модифікації мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, який включений в обсяг цього винаходу, являє собою зміну характеру бо глікозилування зазначеного білка. Як відомо в цій галузі техніки, характер глікозилування може залежати як від послідовності білка (наприклад, наявності або відсутності конкретних амінокислотних залишків, що піддаються глікозилування, як обговорюється нижче), так і від типу клітини-хазяїна або організму, в якому виробляється білок. Конкретні системи експресії обговорюються нижче.

Глікозилування поліпептидів, як правило, є М-зв'язаним або О-зв'язаним. М-зв'язане глікозилування стосується приєднання вуглеводного фрагмента до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Х-треонін, де Х позначає будь-яку амінокислоту, крім проліну, є послідовностями впізнавання для ферментативного приєднання вуглеводного фрагмента до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, присутність будь-якої з цих трипептидних послідовностей в поліпептиді створює можливий сайт глікозилування. О-зв'язане глікозилування стосується приєднання одного фрагмента таких цукрів як М-ацетилгалактозамін, галактоза або ксилоза до гідроксіамінокислоти, найчастіше до серину або треоніну, хоча 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин також можуть бути використані.

Додавання сайтів глікозилування до мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, який містить мутеїн

ІЛ-2 ії фрагмент Ес, може бути легко здійснено шляхом зміни амінокислотної послідовності так, щоб вона включала одну або більше з описаних вище трипептидних послідовностей (для М- зв'язаного глікозилування). Зміна також може бути здійснена шляхом додавання або заміни одного чи більше залишків серину або треоніну в початковій послідовності (для О-зв'язаного глікозилування). Для зручності амінокислотну послідовність мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, переважно модифікують шляхом змін на рівні ДНК, зокрема, шляхом мутування ДНК, що кодує поліпептид-мішень, у попередньо вибраних оновах з отриманням кодонів, які при трансляції забезпечують бажані амінокислоти.

Іншим способом збільшення числа вуглеводних фрагментів на мутеїні ІЛ-2 або гібридному білку, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, є хімічне або ферментативне зв'язування глікозидів з білююом. Перевага цих способів полягає в тому, що вони не вимагають вироблення білка в клітині-хазяїні, яка має молекулярний апарат, придатний для М- і О-зв'язаного глікозилування.

Залежно від використовуваного способу зв'язування цукор(у) може бути прикріплений до (а) аргініну і гістидину, (б) вільних карбоксильних груп, (с) вільних сульфгідрильних груп, наприклад, цистеїну, (4) вільних гідроксильних груп, наприклад, серину, треоніну або гідроксипроліну, (е)

Зо ароматичних залишків, наприклад, фенілаланіну, тирозину або триптофану, або (ї) амідної групи глутаміну. Такі способи описані в міжнародній патентній заявці 87/05330, опублікованій 11 вересня 1987 р., і в роботі Аріїп апа Уугівіоп, 1981, САС Ст. Веу. Віоснет., рр. 259-306.

Видалення вуглеводних фрагментів, присутніх на вихідному мутеїні ІЛ-2 або гібридному білку, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, може бути здійснено хімічними або ферментативними способами. Для хімічного деглікозилування необхідним є вплив на білок такої сполуки, як трифторметансульфонова кислота, або еквівалентної сполуки. Така обробка призводить до відщеплення більшості або всіх цукрів, за винятком зв'язувального цукру (М- ацетилглюкозамін або М-ацетилгалактозамін), при цьому поліпептид залишається інтактним.

Хімічне деглікозилування описано в роботах НаКітидаїйп еї аї!., 1987, Агсп. Віоспет. Віорнув. 259:52 і Едде еї аї., 1981, Апаї. Віоспет. 118:131. Ферментативне відщеплення вуглеводних фрагментів на поліпептидах може бути здійснено за допомогою різних ендо- і екзоглікозидаз, описаних у роботі Тпоїакига єї аї!., 1987, Меїй. Епгутої. 138:350. Глікозилування в потенційних сайтах глікозилування може бути попереднє шляхом використання такої сполуки, як тунікаміцин, описаної в ЮОи5Кіп єї аї.,, 1982, 9. Віої. Спет. 257:3105. Тунікаміцин блокує формування зв'язків білок-М-глікозид.

Інший тип ковалентної модифікації мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, включає зв'язування мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, з різними небілюовими полімерами, включаючи, але не обмежуючись ними, різні поліоли, такі як поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь або поліоксіалкілени, за допомогою способу, описаного в патентах США МоМе4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 або 4179337. Окрім цього, заміни амінокислот можуть бути введені в різних позиціях в межах мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, щоб полегшити додавання полімерів, таких як ПЕГ. Відповідно, варіанти реалізації цього винаходу включають пегильовані мутеїни ІЛ-2 і пегильовані гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес. Такі пегильовані білки можуть мати збільшений період напіввиведення і/або знижену імуногенність порівняно з непегильованими білками.

Полінуклеотиди, кодуючі мутеїни ІЛ-2 і гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес

У галузь цього винаходу включені нуклеїнові кислоти, що кодують мутеїни ІЛ-2 і гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес. Аспекти цього винаходу включають полінуклеотидні 60 варіанти (наприклад, внаслідок вирожденості), які кодують амінокислотні послідовності, описані в цій заявці. У переважних варіантах реалізації цього винаходу поліпептид, який кодується виділеною нуклеїновою кислотою, є компонентом гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і Ес.

Нуклеотидні послідовності, що відповідають амінокислотним послідовностям, описаним в цій заявці, які призначені для використання як зондів або праймерів для виділення нуклеїнових кислот або як послідовностей для запиту під час пошуку в базах даних, можуть бути отримані за допомогою "зворотньої трансляції" з амінокислотних послідовностей. Добре відома методика полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) може бути використана для виділення і ампліфікації послідовності ДНК, що кодує мутеїни ІЛ-2 і гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент

Ес. Олігонуклеотиди, які визначають бажані кінці комбінації фрагментів ДНК, використовують як 5- і З-праймери. Олігонуклеотиди можуть додатково містити сайти розпізнавання рестрикційними ендонуклеазами, щоб полегшити введення ампліфікованої комбінації фрагментів ДНК у вектор експресії. Методики ПЛР описані в заїкі еї аІ., зсіепсе 239:487 (1988);

Весотбріпапі ОМА МеїШодоіоду, У/и сеї аї!., єд5., Асадетіс Ргев5, Іпс., Зап Оієдо (1989), рр. 189- 196; і РСК Ргоїосо!5: А сціде о Меїпоаз апа Арріїсайіоп5, Іппів еї. а!., еа5., Асадетіс Ргезв5, Іпс. (1990).

Молекули нуклеїнових кислот згідно з цим винаходом включають ДНК і РНК в одноланцюговій і дволанцюговій формі, а також відповідні комплементарні послідовності. "Виділена нуклеїнова кислота" являє собою нуклеїнову кислоту, яка була відокремлена від суміжних генетичних послідовностей, присутніх у геномі організму, з якого була виділена нуклеїнова кислота, у випадку нуклеїнових кислот, виділених з природних джерел. У випадку нуклеїнових кислот, синтезованих ферментативними способами на основі матриці або хімічними способами, наприклад, ПЛР-продукти, молекули кДНК або олігонуклеотиди, наприклад, варто розуміти, що нуклеїнові кислоти, отримані за допомогою таких способів, являють собою виділені нуклеїнові кислоти. Виділена молекула нуклеїнової кислоти стосується молекули нуклеїнової кислоти у вигляді окремого фрагмента або у вигляді компонента більшої конструкції нуклеїнової кислоти. В одному переважному варіанті реалізації нуклеїнові кислоти по суті не містять забруднюючого ендогенного матеріалу. Молекула нуклеїнової кислоти переважно отримана з ДНК або РНК, виділеної щонайменше один раз, по суті, в чистій формі і в кількості або концентрації, що забезпечує ідентифікацію, перетворення і відновлення її складових нуклеотидних послідовностей за допомогою стандартних біохімічних методів (наприклад, методів, які описані в затьгоок еї аї., МоІесшаг СіІопіпд: А ІГарогаїгу Мапиаї, 2па еа., Со ргіпд Нагрог Гарогайогу, Соїа Зргіпд Нагбог, МУ (1989)). Такі послідовності переважно забезпечені і/або сконструйовані у формі відкритої рамки зчитування, яка перервана внутрішніми нетранслюючими послідовностями, або інтронами, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетранслюючої ДНК можуть знаходитися в напрямку 5'- або 3-кінця відносно відкритої рамки зчитування, в ділянках, в яких нетранслюючі області ДНК не будуть перешкоджати перетворенню або експресії кодуючої області.

Варіанти згідно з цим винаходом зазвичай отримують за допомогою сайт-направленого мутагенезу нуклеотидів в ДНК, що кодує мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і Ес, використовуючи метод касетного мутагенезу або ПЛР-мутагенезу й інші методики, добре відомі в цій галузі техніки, щоб отримати ДНК, що кодує такий варіант, з подальшою експресією рекомбінантної ДНК у клітинній культурі, як описано в цій заявці. Проте мутеїни ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і Ес, можуть бути отримані за допомогою синтезу в умовах іп міго, використовуючи загальноприйняті методики. Варіанти зазвичай проявляють якісну біологічну активність, яка аналогічна такій для природного аналога, наприклад, експансія

Тре-клітин, проте можуть бути відібрані варіанти, які мають модифіковані характеристики, які будуть більш детально описані нижче.

Фахівці в цій галузі техніки зрозуміють, що у зв'язку з вирожденністю генетичного коду може бути отримана надзвичайно велика кількість нуклеїнових кислот, всі з яких кодують мутеїни ІЛ-2 і гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і Ес, відповідно до цього винаходу. Таким чином, після визначення конкретної амінокислотної послідовності, фахівці в цій галузі техніки зможуть виготовити будь-яку кількість різних нуклеїнових кислот шляхом простої зміни послідовності одного або більше кодонів так, що амінокислотна послідовність кодованого білка залишиться незмінною.

У цьому винаході також запропоновані системи експресії та конструкції у формі плазмід, векторів експресії, касет транскрипції або експресії, які містять щонайменше один полінуклеотид, описаний вище. Також у цьому винаході запропоновані клітини-хазяїни, що містять такі системи експресії або конструкції.

Як правило, вектори експресії, що використовуються в будь-якій з клітин-хазяїнів, будуть 60 містити послідовності для підтримки плазміди і для клонування та експресії екзогенних нуклеотидних послідовностей. Такі послідовності, що сукупно називаються "фланкуючими послідовностями", у деяких варіантах реалізації, як правило, будуть містити одну або більше з наступних нуклеотидних послідовностей: промотор, один або більше енхансерів, сайт ініціації реплікації, послідовність термінації транскрипції, повну інтронну послідовність, що містить донорний і акцепторний сайт сплайсингу, послідовність, що кодує лідерну послідовність для секреції поліпептиду, сайт зв'язування рибосом, послідовність поліаденілювання, полілінкерну область для вставки нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який експресують, і селективний маркерний елемент. Кожна з цих послідовностей обговорюється нижче.

Вектор необов'язково може містити послідовність, що кодує "мітку", тобто молекулу олігонуклеотиду, розташовану на 5'- або 3'-кінці кодує послідовності мутеїнів ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес; олігонуклеотидна послідовність кодує полігістидинову мітку (наприклад, пеханіх (5ЕО ІЮО МО: 21)) або іншу "мітку", таку як ЕГАС, НА (гемаглютинін вірусу грипу) або тус, для яких існують комерційно доступні антитіла. Така мітка, як правило, гібридизована з поліпептидом при експресії цього поліпептиду і може слугувати як засіб для афінного очищення або детектування мутеїну ІЛ-2 в клітині-хазяїні. Афінне очищення можна здійснювати, наприклад, за допомогою колонкової хроматографії з використанням антитіл проти мітки як афінного носія. Мітка необов'язково може бути згодом видалена з очищених мутеїнів ІЛ-2 і гібридних білків, що містять мутеїн ІЛ-2 і Ес, за допомогою різних способів, таких як використання певних пептидаз для розщеплення.

Фланкуючі послідовності можуть бути гомологічними (тобто отриманими з одного і того ж виду і/або штаму, що і клітина-хазяїн), гетерологічними (тобто отриманими з виду, відмінного від виду клітини-хазяїна або штаму), гібридними (тобто являють собою комбінацію фланкуюючих послідовностей, отриманих більш ніж з одного джерела), синтетичними або нативними. Таким чином, джерелом фланкуючої послідовності може бути будь-який прокаріотичний або еукаріотичний організм, будь-який хребетний і безхребетних організм або будь-яка рослина, за умови, що фланкуюча послідовність є функціональною і може бути активована молекулярними системами клітини-хазяїна.

Фланкуючі послідовності, які можна використовувати у векторах згідно з цим винаходом, можуть бути отримані за будь-яким з декількох способів, добре відомих в цій галузі техніки. Як

Зо правило, фланкуючі послідовності, які можна використовувати в цій заявці, будуть заздалегідь виявлені за допомогою картування та/або шляхом розщеплення рестрикційною ендонуклеазою і таким чином, можуть бути виділені з належного тканинного джерела з використанням відповідних рестрикційних ендонуклеаз. У деяких випадках може бути відома повна нуклеотидна послідовність фланкуючої послідовності. У цій заявці фланкуючі послідовності можуть бути синтезовані за допомогою способів синтезу нуклеїнових кислот або клонування, описаних у цій заявці.

Незалежно від того, відома вся або тільки частина фланкуючої послідовності, така послідовність може бути отримана за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та/або шляхом скринінгу геномної бібліотеки з використанням відповідного зонда, такого як олігонуклеотид талабо фрагмент фланкуючої послідовності з цього ж або іншого виду. Якщо фланкуюча послідовність не відома, то фрагмент ДНК, що містить фланкуючу послідовність, може бути виділений з більшого фрагмента ДНК, який може містити, наприклад, послідовність, що кодує або навіть інший ген або гени. Виділення може бути здійснено шляхом розщеплення рестрикційною ендонуклеазою з отриманням правильного фрагмента ДНК з подальшим виділенням за допомогою очищення в агарозному гелі, колонкової хроматографії на основі систем ОіадепФ (Чатсворт, Каліфорнія, США) або іншими способами, щ відомі фахівцям у цій галузі техніки. Параметри вибору відповідних ферментів для здійснення цієї мети будуть очевидні для будь-якого фахівця зі стандартною кваліфікацією в цій галузі техніки.

Сайт ініціації реплікації, як правило, є частиною комерційно доступних прокаріотичних векторів експресії і полегшує ампліфікацію вектора в клітині-хазяїні. Якщо вибраний вектор не містить сайту ініціації реплікації, то такий сайт може бути хімічно синтезований на основі відомої послідовності і лігований у вектор. Наприклад, сайт ініціації реплікації з плазміди рРВК322 (Мем/

Епаїапа Віоіабз, Беверлі, Массачусетс, США) придатний для більшості грамнегативних бактерій, і різні сайти ініціації реплікації вірусного походження (наприклад, 5М40, поліоми, аденовірусу, вірусу везикулярного стоматиту (М5МУ) або папіломи, такі як НРМ або ВРУ) придатні для клонування векторів у клітинах ссавців. Як правило, сайт ініціації реплікації не є необхідним компонентом для векторів експресії в клітинах ссавців (наприклад, сайт ініціації реплікації 5М40 зазвичай використовується тільки тому, що він додатково містить промотор ранніх генів вірусу).

Послідовність термінації транскрипції, як правило, розташована на 3'-кінці області, що кодує бо поліпептид, і слугує для термінації транскрипції. Зазвичай послідовність термінації транскрипції в прокаріотичних клітинах являє собою фрагмент, збагачений парами СС, за яким розташована політимінова послідовність. У той час як послідовність може бути легко клонована з бібліотеки або навіть отримана комерційно як частина вектора, вона також може бути легко синтезована за допомогою способів синтезу нуклеїнових кислот, таких як ті, які описані в цій заявці.

Селективний маркерний ген кодує білок, необхідний для виживання і розмноження клітини- хазяїна, що вирощують у селективному культуральному середовищі. Звичайні селективні маркерні гени кодують білки, які (а) надають прокаріотичним клітин-хазяїнам стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад ампіциліну, тетрацикліну або канаміцину; (Б) доповнюють різні види ауксотрофної недостатності клітини; або (с) постачають необхідними поживними речовинами, недоступними зі складних середовищ або середовищ з певним складом. Конкретні селективні маркерні гени включають ген стійкості до канаміцину, ген стійкості до ампіциліну і ген стійкості до тетрацикліну. Переважно ген стійкості до неоміцину також може бути використаний для відбору в прокаріотичних і еукаріотичних клітинах-хазяїнах.

Інші селективні гени можуть бути використані для ампліфікації гена, який буде експресованим. Ампліфікація являє собою процес, при якому гени, необхідні для вироблення білка, важливого для розмноження або виживання клітин, повторюються в тандемі в хромосомах наступних поколінь рекомбінантних клітин. Приклади відповідних селективних маркерів для клітин ссавців включають ген дигідрофолатредуктази (ОНЕБК) і ген тимідинкінази, що не містить промотору. Трансформовані клітини ссавців піддають тиску відбору, в результаті цього розмножуються тільки трансформовані клітини, унікальним чином пристосовані до виживання завдяки наявності селективного гена, присутнього у векторі. Тиск відбору створюють шляхом культивування трансформованих клітин в умовах, в яких концентрація селективного агента в середовищі послідовно збільшується, що призводить до ампліфікації як селективного гена, так і ДНК, що кодує інший ген, такий як мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн

ІЛ -2 і фрагмент Ес. Як наслідок цього на основі ампліфікованої ДНК синтезується підвищена кількість поліпептиду, такого як мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес.

Сайт зв'язування рибосом зазвичай необхідний для ініціації трансляції мРНК і містить послідовність Шайна-Дальгарно (прокаріоти) або послідовність Козака (еукаріоти). Цей елемент

Зо зазвичай розташований в напрямку 3'-кінця відносно промотору і 5'-кінця відносно кодуючої послідовності поліпептиду, який експресують. У деяких варіантах реалізації одна або більше кодуючих областей можуть бути функціонально зв'язані з внутрішнім сайтом посадки рибосоми (ІКЕ5), що забезпечує трансляцію двох відкритих рамок зчитування з одного РНК-транскрипту.

У деяких випадках, наприклад, коли глікозилування є бажаним у системі експресії на основі еукаріотів-хазяїнів, різні перед- або пропослідовності можуть бути модифіковані з метою поліпшення характеру глікозилування або виходу продукту. Наприклад, сайт розщеплення пептидаз конкретного сигнального пептиду може бути змінений або можуть бути додані пропослідовностії, які також можуть впливати на глікозилування. Кінцевий білковий продукт може мати в позиції -1 (відносно першої амінокислоти зрілого білка) одну або більше додаткових амінокислот, що є придатними для експресії, які могли бути не повністю видалені.

Наприклад, кінцевий білковий продукт може містити один або два амінокислотних залишки в сайті розщеплення пептидазою, прикріпленому до аміно-кінця. У іншому варіанті використання деяких сайтів ферментативного розщеплення може призвести до утворення незначно укороченої форми бажаного поліпептиду, якщо фермент здійснює розщеплення в такій області в межах послідовності зрілого поліпептиду.

Вектори експресії і клонування відповідно до цього винаходу, як правило, будуть містити промотор, який розпізнається організмом-хазяїном і функціонально зв'язаний з молекулою, що кодує мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес. Промотори являють собою нетранскрибуючі послідовності, розташовані перед (тобто в напрямку 5'-кінця) стартовим кодоном структурного гена (зазвичай в межах близько від 100 до 1000 п.о.), які контролюють транскрипцію структурного гена. Промотори зазвичай стосуються одного з двох класів: індукуючі промотори і конститутивні промотори. Індукуючі промотори ініціюють підвищення рівня транскрипції з послідовності ДНК, що знаходиться під їхнім контролем, у відповідь на деяку зміну умов культивування, таку як наявність або відсутність поживної речовини або зміну температури. Конститутивні промотори, з іншого боку, забезпечують постійну транскрипцію гена, з яким вони функціонально зв'язані, тобто, практично не керують експресією гена. Велика кількість промоторів, які розпізнаються різними потенційними клітинами-хазяїнами, добре відомі в цій галузі техніки.

Промотори, які придатні для використання в дріжджових хазяїнах, також добре відомі в цій бо галузі техніки. Енхансери дріжджових генів переважно використовують з промоторами дріжджових генів. Промотори, які придатні для використання в клітинах-хазяїнах ссавців, добре відомі і включають, але не обмежуються ними, промотори, отримані з геномів вірусів, таких як вірус поліоми, вірус пташиної віспи, аденовірус (такий як аденовірус 2), вірус папіломи великої рогатої худоби, вірус саркоми птахів, цитомегаловірус, ретровіруси, вірус гепатиту В і найбільш переважно вірус мавп 40 (5М40). Інші придатні промотори ссавців включають гетерологічні промотори ссавців, наприклад, промотори білків теплового шоку і промотор актину.

Додаткові промотори, які можуть представляти інтерес, включають, але не обмежуються ними: ранній промотор 5М40 (Вепоїзі апа Спатбоп, 1981, Маїште 290:304-310); промотор СММ (Тнотпзеп вї а!., 1984, Ргос. Май. Асад. Ш.5.А. 81:659-663); промотор, що міститься в довгому 3'- кінцевому повторі вірусу саркоми Рауса (Уататоїо єї аї., 1980, СеїІ 22:787-797); промотор тимідинкінази вірусу герпесу (Уу/адпег єї аї!., 1981, Ргос. Маї. Асай. 5сі. О.5.А. 78:1444-1445); промотор і регуляторні послідовності з гена металотіонеїну (Ргіпеіег єї аї., 1982, Машге 296:39- 42); і прокаріотичні промотори, такі як промотор бета-лактамази (мМійа-Катагоїй еї а!., 1978, Ргос.

Майї. Асад. сі. 0.5.А. 75:3727-3731); або промотор їас (ОеВоег вї а!., 1983, Ргос. Маї). Асад. 5сі.

И.5Б.А. 80:21-253. Також певний інтерес представляють наступні області, контролюючі транскрипцію у тварин, які проявляють тканинну специфічність і були використані у трансгенних тварин: контрольна ділянку гена еластази І, яка активна в ацинарних клітинах підшлункової залози (ЗМ еї а!., 1984, Сеї! 38:639-646; Отії» єї а!., 1986, Сода 5ргіпд Натог бутр. Оцапі. Віо|. 50:399-409; Масропаїй, 1987, Нератюіоду 7:425-515); контрольну ділянку гена інсуліну, який активний в бета-клітинах підшлункової залози (Напапйап, 1985, Маїште 315: 115-122); контрольний ділянку гена імуноглобуліну, який активний в лімфоїдних клітинах (Сго5з5спеаі еї аІ.,, 1984, Сеї! 38:647-658; Адатез еї а!., 1985, Маїшге 318:533-538; АіІехапаеєг еї а!., 1987, Мо).

СеїІ. Віої. 7:1436-1444); контрольну ділянку гена вірусу раку молочної залози миші, який активний у клітинах яєчок, молочної залози, лімфоїдних і тучних клітинах (І едег єї аї., 1986, СеїЇ 45:485-495); контрольну ділянку гена альбуміну, яка активна в печінці (Ріпкег!і еї а!., 1987, Сепев5 апа Оеємеї. 1:268-276); контрольну ділянку гена альфа-фетопротеїну, який активний у печінці (Ктитіаці еї аї., 1985, Мої. СеїІ. Віої. 5:1639-1648; Наттег еї аї., 1987, Зсіепсе 253:53-58); контрольну ділянку гена альфа-1-антитрипсину, який активний у печінці (Кеї5еу еї аї., 1987,

Сепез апа Оємеї. 1:161-171); контрольну ділянку гена бета-глобіну, який активний у мієлоїдних клітинах (Модгат 6ї аї!., 1985, Маїиге 315:338-340; Коїаз єї а!., 1986, СеїІ 46:89-94); контрольну ділянку гена основного білка мієліну, який активний в олігодендроцитах мозку (Кеаапеавд е6ї аї., 1987, Сеї! 48:703-712); контрольну ділянку гена легкого ланцюга міозину-2, який активний у скелетних м'язах (Запі, 1985, Маїште 314:283-286); і контрольну ділянку гена гонадотропін- вивільняючого гормону, який активний у гіпоталамусі (Мазоп еї аї!., 1986, Зсієпсе 234:1372- 1378).

Послідовність енхансера може бути вставлена у вектор для підвищення ефективності транскрипції у вищих еукаріотів. Енхансери являють собою цис-діючі елементи ДНК, зазвичай містять приблизно 10-300 п.о., які діють на промотор, щоб підвищити ефективність транскрипції.

Енхансери відносно незалежні від орієнтації і позиції, оскільки їх виявляли в позиціях, які розташовані в напрямку як 5'-кінця, так ї 3'-кінця відносно транскрипційної одиниці. Відомо декілька послідовностей енхансерів, доступних з генів ссавців (наприклад, глобіну, еластази, альбуміну, альфа-фетопротеїну та інсуліну). Тим не менше, зазвичай застосовують який-небудь вірусний енхансер. Приклади енхансерних елементів для активації промоторів в еукаріот включають енхансер 5М40, енхансер промотору ранніх генів цитомегаловірусу, енхансер поліоми і енхансери аденовірусів, відомі в цій галузі техніки. Незважаючи на те, що енхансер може бути розташований у векторі в напрямку або 5'-кінця, або 3-кінця відносно відносно кодуючої послідовності, як правило, він розташований в ділянці послідовності в напрямку 5'- кінця відносно промотору. Послідовність, що кодує відповідну нативну або гетерологічну сигнальну послідовність (лідерну послідовність або сигнальний пептид), може бути включена у вектор експресії для посилення позаклітинної секреції мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес. Вибір сигнального пептиду або лідерної послідовності залежить від типу клітин-хазяїнів, в яких повинен вироблятися білок, причому гетерологічна сигнальна послідовність може заміщати нативну сигнальну послідовність. Приклади сигнальних пептидів, які є функціональними в клітинах-хазяїнах ссавців, включають: сигнальну послідовність для інтерлейкіну-/ (ІЛ-7), описану в патенті США Мо4965195; сигнальну послідовність для рецептора інтерлейкіну-2, описану в роботі Соб5тап єї а1!.,1984, Машгє 312:768; сигнальний пептид для рецептора інтерлейкіну-4, описаний в патенті ЕР Мг0367566; сигнальний пептид для рецептора інтерлейкіну-1 типу І. описаний в патенті США Ме4968607; сигнальний пептид для рецептора інтерлейкіну-1 типу ІїЇ, описаний в патенті ЕР Ме0460846. бо Вектор може містити один або більше елементів, які полегшують експресію, коли вектор інтегрований в геном клітини-хазяїна. Приклади включають елемент ЕАЗЕ (Аіагісп еї аІ. 2003

Віотесппо! Ргод. 19:1433-38) і ділянку прикріплення до ядерного матриксу (МАК). Ділянки МАК виступають посередниками при структурній організації хроматину і можуть захистити інтегрований вектор від ефекту "позиція". Отже, ділянки МАК є особливо придатними в тих випадках, коли вектор використовується для створення стабільних трансфектантів. Ряд природних і синтетичних МАК-вмісних нуклеїнових кислот відомі в цій галузі техніки, наприклад, патенти США МоМоб239328; 7326567; 6177612; 6388066; 6245974; 7259010; 6037525; 7422874; 7129062.

Вектори експресії згідно з цим винаходом можуть бути сконструйовані з вихідного вектора, такого як комерційно доступний вектор. Такі вектори можуть містити всі бажані фланкуючі послідовності або можуть не містити їх. У тих випадках, коли одна або більше з фланкуючих послідовностей, описаних у цій заявці, не присутні спочатку у векторі, вони можуть бути отримані окремо і ліговані вектор. Способи, що використовуються для отримання кожної з фланкуючих послідовностей, добре відомі фахівцеві в цій галузі техніки.

Після отримання вектора і введення молекули нуклеїнової кислоти, що кодує мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, у належний сайт вектора, готовий вектор може бути введений в придатну клітину-хазяїна для ампліфікації та/або експресії поліпептиду.

Трансформацію вектора експресії в вибрану клітину-хазяїна можна здійснювати за допомогою добре відомих способів, включаючи трансфекцію, інфекцію, спільне осадження фосфатом кальцію, електропорацію, мікроін'єкцію, ліпофекцію, трансфекцію з використанням ОЕАЕ- декстрану або іншими відомими способами. Вибраний спосіб буде частково залежати від типу клітини-хазяїна, яка буде використана. Перераховані способи та інші відповідні способи добре відомі фахівцеві в цій галузі техніки і викладені, наприклад, в керівництві Затрьгоок еї аї., 2001, вище.

Клітина-хазяїн при культивуванні у відповідних умовах синтезує мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, які згодом можуть бути відірані з культурального середовища (якщо клітина-хазяїн секретує білок у середовище) або безпосередньо з клітини- хазяїна, яка продукує білок (якщо білок не секретується). Вибір придатної клітини-хазяїна буде залежати від різних факторів, таких як бажаний рівень експресії, поліпептидні модифікації, які є

Ко) бажаними чи необхідними для забезпечення активності (наприклад, глікозилування або фосфорилування) і легкості згортання в біологічно активну молекулу. Клітка-хазяїн може являти собою прокаріотичну або еукаріотичну клітину.

Лінії клітин ссавців, доступні як хазяїни для експресії, добре відомі в цій галузі техніки і включають, але не обмежуються ними, іморталізовані клітинні лінії, доступні з Американської колекції типових культур (АТСС), і будь-які клітинні лінії що використовуються в системі експресії, відомої в цій галузі техніки, можуть бути використані для отримання рекомбінантних поліпептидів згідно з цим винаходом. У цілому, клітини-хазяїни трансформують рекомбінантним вектором експресії, який містить ДНК, що кодує бажаний мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес. Клітини-хазяїни, які можна використовувати, включають прокаріотичні, дріжджові або клітини вищих еукаріотів. Прокаріоти включають грамнегативні або грампозитивні організми, наприклад, Е. соїї або бацили. Клітини вищих еукаріотів включають клітини комах і встановлені клітинні лінії ссавців. Приклади придатних ліній клітин-хазяїнів ссавців включають лінію клітин нирки мавп СО5-7 (АТСС СЕ 1651) (СіІйтап еї аї., 1981, Сеї 23:175), І-клітини, клітини 293, клітини С127, клітини ЗТЗ3 (АТСС СС 163), клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) або їхні похідні, такі як Меддіе СНО і споріднені клітинні лінії, які вирощують у безсироватковому середовищі (Кахтивх5еп еї аї., 1998, СуюїесппоЇоду 28: 31), клітини Нега, клітинні лінії ВНК (АТС СК. 10) і клітини лінії СМ/ЕВМА, отримані з лінії клітин нирки африканської зеленої мавпи СМІ (АТСС СС 70), описаної в роботі МеМайап еї аї., 1991,

ЕМВО У. 10: 2821, лінії клітин мезонефроса людини, такі як 293, 293 ЕВМА або М5К 293, клітини епідермісу людини А431, клітини людини Со/о205, інші трансформовані клітинні лінії приматів, нормальні диплоїдні клітини, клітинні штами, отримані з культивованої в умовах іп мйго первинної тканини, первинні експланти, НІ-60, 0937, клітини ліній НакК або дижаї. За необхідності, клітинні лінії ссавців, такі як Нерс2/3В, КВ, МІН-3ТЗ3 або 549, наприклад, можуть бути використані для експресії поліпептиду, коли бажаним є використання поліпептиду в різних шляхах передачі сигналів або кількісних дослідженнях з використанням репортерного гена.

В іншому варіанті поліпептид може бути отриманий в клітинах нижчих еукаріотів, таких як дріжджі, або в клітинах прокаріотів, таких як бактерії. Відповідні штами дріжджів включають

Засспаготусев сегемізіае, Зспігозасспаготусе5 ротбре, Кісумеготусев5 в5ігаіп5, Сапаїда або будь-який інший штам дріжджів, який здатний експресувати гетерологічні поліпептиди. Придатні 60 штами бактерій включають Езспегіспіа соїї, Васійи5 5и,иБій5, ЗаїІтопейїа їурпітигішт або будь-

який інший штам бактерій, який здатний експресувати гетерологічні поліпептиди. У випадку якщо поліпептид виробляється клітинами дріжджів або бактерій, то бажаною може бути модифікація поліпептиду, отриманого в таких системах, наприклад, шляхом фосфорилування або глікозилування відповідних сайтів, щоб отримати функціональний поліпептид. Ковалентне приєднання таких фрагментів можна здійснювати з використанням відомих хімічних або ферментативних способів.

Поліпептид також може бути отриманий за допомогою функціонального зв'язування виділеної нуклеїнової кислоти згідно з цим винаходом з придатною керуючою послідовністю в одному або більше векторів експресії в клітинах комах, а також використовуючи систему експресії в клітинах комах. Матеріали і способи, що стосуються систем експресії на основі бакуловірусів/клітин комах, доступні комерційно у вигляді набору, наприклад, від Іпмігодеп, Сан-

Дієго, Каліфорнія, США (набір МахВас?"), такі способи також добре відомі в цій галузі техніки і описані в ЗБиттег5 апа тії, Теха5 Адгісийига! Ехрегітепі 5іайоп ВиПеїйп Мо. 1555 (1987), і

ГисКожм апа З!итітегв, Віо/ТесппоЇоду 6:47 (1988). Безклітинні системи трансляції також можна використовувати для отримання поліпептидів за допомогою РНК, отриманих з конструкцій нуклеїнових кислот, розкритих у цій заявці. Відповідні вектори клонування та експресії для використання в бактеріальних, грибкових, дріжджових клітинах-хазяїнах і клітинах-хазяїнах ссавців описані в Роцугеї5 еї аї. (Сіопіпд Месіоге: А І арогагу Мапиаї, ЕІбвеміег, Мем МогК, 1985).

Клітина-хазяїн, яка містить виділену нуклеїнову кислоту згідно з цим винаходом, переважно, функціонально зв'язана щонайменше з однією послідовністю, яка керує експресією, являє собою "рекомбінантну клітину-хазяїна".

У деяких аспектах цей винахід включає виділену нуклеїнову кислоту, що кодує мутеїн ІЛ-2 людини, яка переважно стимулює регуляторні Т-клітини і амінокислотна послідовність якого містить заміну МТК і щонайменше на 90 9о, щонайменше на 91 956, щонайменше на 92 95, щонайменше на 93 95, щонайменше на 94 956, щонайменше на 95 95, щонайменше на 96 95, щонайменше на 97 95, щонайменше на 9895, щонайменше на 9995 або 100 95 ідентична амінокислотної послідовності, наведеній у 5ЕО ІЮ МО: 1. Виділена нуклеїнова кислота може кодувати будь-який з типових мутеїнів ІЛ-2, запропонованих у цій заявці.

У галузь цього винаходу також включені виділені нуклеїнові кислоти, що кодують будь-який з

Зо типових гібридних білків, що містять мутеїн ІЛ-2 і Ес, описаних у цій заявці. У переважних варіантах реалізації частина Ес антитіла і мутеїн ІЛ-2 людини кодуються в межах однієї відкритої рамки зчитування, можливо, містить лінкер, кодуюча послідовність якого знаходиться між фрагментом Ес і мутеїном ІЛ-2.

Згідно з іншим аспектом в цьому винаході запропоновані вектори експресії, що містять нуклеїнові кислоти, що кодують описані вище мутеїни ІЛ-2 або гібридні білки, що містять мутеїн

ІЛ-2 і фрагмент Ес, які функціонально зв'язані з промотором.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропоновані клітини-хазяїни, що містять виділені нуклеїнові кислоти, що кодують описані вище мутеїни ІЛ-2 або гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес. Клітина-хазяїн може являти собою прокаріотичну клітину, таку як Е.соїї, або еукаріотичну клітину, таку як клітину ссавця. У деяких варіантах реалізації цього винаходу клітина-хазін являє собою лінію клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО).

Згідно з іншим аспектом в цьому винаході запропоновані способи отримання мутеїну ІЛ-2 людини. Зазначені способи включають культивування клітини-хазяїна в умовах, що забезпечують експресію промотору, функціонально зв'язаного з мутеїном ІЛ-2 людини. Далі із зазначеної культури отримують мутеїн ІЛ-2 людини. Мутеїн ІЛ-2 може бути отриманий з культурального середовища та/або лізатів клітин-хазяїнів.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропоновані способи отримання гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 людини і фрагмент Ес. Зазначені способи включають культивування клітини-хазяїна в умовах, що забезпечують експресію промотору, функціонально зв'язаного з гібридним білком, що містить мутеїн ІЛ-2 людини і фрагмент Ес. Далі із зазначеної культури отримують гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 людини і фрагмент Ес. Гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 людини і фрагмент Ес, може бути отриманий з культурального середовища та/або лізатів клітин-хазяїнів.

Фармацевтичні композиції

У деяких варіантах реалізації цього винаходу запропонована фармацевтична композиція, що містить терапевтично ефективну кількість мутеїну ІЛ-2 разом з фармацевтично ефективними розчинниками, носієм, солюбілізатором, емульгатором, консервантом та/або ад'ювантом. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 стосується гібридного білку, який містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес. Фармацевтичні композиції згідно з цим 60 винаходом включають, але не обмежуючись ними, рідкі, заморожені і ліофілізовані композиції.

Переважно матеріали для виготовлення композицій є нетоксичними для реципієнтів у використовуваних дозах і концентраціях. У конкретних варіантах реалізації запропоновані фармацевтичні композиції, що містять терапевтично ефективну кількість терапевтичної молекули, що містить мутеїн ІЛ-2, наприклад, гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу фармацевтична композиція може містити матеріали для виготовлення композицій, призначені для модифікації, підтримки чи збереження, наприклад, значення рН, осмолярності, в'язкості, прозорості, кольору, ізотонічності, запаху, стерильності, стабільності, швидкості розчинення або вивільнення, всмоктування або проникнення композиції. У таких варіантах реалізації придатні матеріали для виготовлення композицій включають, але не обмежуються ними, амінокислоти (наприклад, гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін, пролін або лізин); антимікробні препарати; антиоксиданти (такі як аскорбінова кислота, сульфіт натрію або гідросульфіт натрію); буфери (такі як борат, бікарбонат, Тріс-НСЇ, цитрати, фосфати або інші органічні кислоти); наповнювачі (такі як маніт або гліцин); хелатуючі агенти (такі як етилендіамінтетраоцтова кислоти (ЕДТА)); комплексоутворюючі агенти (такі як кофеїн, полівінілліролідон, бета-циклодекстрин або гідроксипропіл-бета-циклодекстрин); наповнювачі; моносахариди; дисахариди; та інші вуглеводи (такі як глюкоза, маноза або декстрини); білки (наприклад, сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни); барвники, ароматизатори та розчиники; емульгатори; гідрофільні полімери (такі як полівінілпіролідон); низькомолекулярні поліпептиди; солеутворюючі протиїіони (такі як натрій); консерванти (такі як хлорид бензалконію, бензойна кислота, саліцилова кислота, тимеросал, фенетиловий спирт, метилпарабен, пропіллпарабен, хлоргексидин, сорбінова кислота або перекис водню); розчинники (такі як гліцерин, пропіленгліколь або поліетиленгліколь); цукрові спирти (такі як маніт або сорбіт); суспендуючі агенти; поверхнево-активні речовини або змочувальні агенти (наприклад, плюронові кислоти, ПЕГ, складні ефіри сорбітану, полісорбати, такі як полісорбат 20, полісорбат, тритон, трометамін, лецитин, холестерин, тилоксапол); агенти, що підвищують стабільність (такі як сахароза або сорбіт); агенти, що підвищують тонічність (такі як галогеніди лужних металів, переважно хлорид натрію або калію, маніт, сорбіт); носії для доставки; розчинники; допоміжні речовини та/або фармацевтичні ад'юванти. Див. Кептіпдоп'є

РІНаптасеціїса! бсієпсев, 18" Еайоп, (А. А. Сепгто, єд.), 1990, Маск Рибріїзпіпд Сотрапу.

У деяких варіантах реалізації цього винаходу оптимальна фармацевтична композиція буде визначена фахівцем у цій галузі техніки залежно від, наприклад, передбачуваного шляху введення, способу доставки та бажаної дози. Див., наприклад, Кетіпдіоп'є РПпагтасеціїсаї! зсіепсе5, вище. У деяких варіантах реалізації цього винаходу такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стабільність, швидкість вивільнення в умовах іп мімо та швидкість кліренсу антигензв'язувальних білків відповідно до цього винаходу в умовах іп мімо. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу основний наповнювач або носій у фармацевтичній композиції може бути водним або неводним. Наприклад, придатний наповнювач або носій може являти собою воду для ін'єкцій, фізіологічний сольовий розчин або штучну спинномозкову рідину, можливо, з додаванням інших матеріалів, які є стандартними для композицій для парентерального введення. Інші приклади наповнювачів включають нейтральний фізіологічний розчин або фізіологічний розчин, змішаний з сироватковим альбуміном. У конкретних варіантах реалізації цього винаходу фармацевтичні композиції містять Тріс-буфер з показником рн близько 7,0-8,5 або ацетатний буфер з показником рН близько 4,0-5,5, і можуть додатково містити сорбіт або його відповідний аналог. У деяких варіантах реалізації цього винаходу композиції, що містять мутеїн ІЛ-2, можуть бути отримані для зберігання у формі ліофілізованої таблетки або водного розчину шляхом змішування вибраної композиції, що має бажаний ступінь чистоти, з необов'язковими агентами для виготовлення композицій (Кептіпдіоп'є РпагтасеціїсаїЇ зсіепсе5, вище). Також у деяких варіантах реалізації цього винаходу продукт, що містить мутеїн

ІЛ-2, може бути приготовленим у вигляді ліофілізату з використанням відповідних допоміжних речовин, таких як сахароза.

Фармацевтичні композиції згідно з цим винаходом можуть бути вибрані для парентеральної доставки. В іншому варіанті композиції можуть бути вибрані для введення шляхом інгаляції або для доставки через травний тракт, наприклад, перорально. Виготовлення таких фармацевтично прийнятних композицій знаходиться в межах кваліфікації фахівця в цій галузі техніки.

Компоненти композицій присутні переважно в концентраціях, які прийнятні для місця введення.

Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу буфери використовуються для підтримки показника рН композиції в межах фізіологічних значень рН або трохи нижчих значень рнН, як правило, в діапазоні значень рН від близько 5 до близько 8. 60 У тому випадку, якщо передбачається використання парентерального шляху введення,

терапевтичні композиції для застосування відповідно до цього винаходом можуть бути забезпечені у вигляді апірогенного водного розчину, придатного для парентерального введення, який містить бажану композицію мутеїну ІЛ-2 у фармацевтично прийнятному носії.

Особливо придатним носієм для парентеральної ін'єкції є стерильна дистильована вода, на основі якої композиція, що містить мутеїн ІЛ-2, виготовляється у вигляді стерильного ізотонічного розчину з належною концентрацією консервантів. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу продукт може містити композицію, що містить бажану молекулу спільно з агентом, таким як ін'єковані мікросфери, біодеградабельні частинки, полімерні сполуки (такі як полімолочна кислота або полігліколева кислота), гранули або ліпосоми, які можуть забезпечити контрольоване або пролонговане вивільнення зазначеного продукту, який може бути доставлений за допомогою ін'єкції з уповільненим всмоктуванням компонентів. У деяких варіантах реалізації цього винаходу може бути використана гіалуронова кислота, яка сприяє збільшенню періоду циркуляції. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу імплантовані пристрої для доставки лікарського засобу можуть бути використані для введення композиції, що містить мутеїн ІЛ-2.

Додаткові фармацевтичні композиції будуть очевидні для фахівців у цій галузі техніки, включаючи композиції з пролонгованим або контрольованим вивільненням композиції, що містить мутеїн ІЛ-2. Методики виготовлення багатьох інших систем, що забезпечують пролонговану або контрольовану доставку, таких як ліпосомні носії, біодеградабельні мікрочастинки або пористі гранули та ін'єкції з уповільненим вивільненням компонентів, також відомі фахівцям у цій галузі техніки. Див., наприклад, міжнародну патентну заявку

РСТ/О593/00829, яка включена в цю заявку шляхом посилання і в якій описано контрольоване вивільнення пористих полімерних мікрочастинок для доставки фармацевтичних композицій.

Препарати з пролонгованим вивільненням можуть включати напівпроникні полімерні носії у вигляді формованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул. Носії, що забезпечують пролонговане вивільнення, можуть включати складні поліефіри, гідрогелі, полілактиди (розкриті в патенті США Ме3773919 і в Європейській патентній заявці ЕР 058481, які включені в цю заявку шляхом посилання), співполімери І -глутамінової кислоти і гамма-етил-їЇ -глутамату (Зічтап еї а!., 1983, Віороїтутег5 2:547-556), полі-2-гідроксіетилметакрилату (І апдег еї аї., 1981, 9. Віотеа.

Зо Маїег. Нев. 15:167-277 і І апдег, 1982, Спет. Тесп. 12:98-105), співполімер етилену і вінілацетату (Іапдег еї а!І., 1981, вище) або полі-ОД(-)-3З-гідроксимасляну кислоту (публікація Європейської патентної заявки ЕР 133988). Композиції з пролонгованим вивільненням можуть також включати ліпосоми, які можуть бути отримані будь-яким з декількох способів, відомих у цій галузі техніки.

Див., наприклад, Еррзієїп еї аїЇ., 1985, Ргос. МаїЇ. Асайд. сі. Ш.5.А. 82:3688-3692; публікації

Європейських патентних заявок ЕРОЗ6676; ЕРО88046 і ЕР143949, які включені в цю заявку шляхом посилання.

Фармацевтичні композиції, що використовуютьсяїі для введення в умовах іп мімо, як правило, забезпечуються у вигляді стерильних препаратів. Стерилізація може бути досягнута шляхом фільтрації через стерильні фільтраційні мембрани. Якщо композиція є ліофілізованою, то стерилізація з використанням цього способу може бути проведена або перед, або після ліофілізації і відновлення. Композиції для парентерального введення можуть зберігатися в ліофілізованій формі або у вигляді розчину. Композиції для парентерального введення, як правило, поміщають у контейнер, що має стерильний вхідний отвір, наприклад, пакет для внутрішньовенного розчину або флакон, що має пробку, що проколюється голкою для підшкірних ін'єкцій.

У деяких аспектах цей винахід включає композиції, що містять мутеїн ІЛ-2, які мають буферну здатність, придатні для використання у вигляді фармацевтичних композицій, як описано в міжнародній патентній заявці 06138181А2 (РСТ/.О52006/022599), яка повністю включена в цю заявку шляхом посилання.

Як обговорювалося вище, у деяких варіантах реалізації запропоновані композиції, що містять мутеїн ІЛ-2, зокрема, фармацевтичні гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент

Ес, які містять, крім композиції, що містить мутеїн ІЛ-2, одну або більше допоміжних речовин, таких як ті, які наведені як приклад в цьому розділі і в інших місцях цієї заявки. Стосовно зазначених композицій допоміжні речовини можуть бути використані в цьому винаході для найрізноманітніших цілей, таких як регулювання фізичних, хімічних чи біологічних властивостей композицій, наприклад, регулювання в'язкості, та/або відповідно зі способами згідно з цим винаходом для поліпшення ефективності та/або стабілізації таких композицій, і відповідно зі способами захисту від розкладання і псування, внаслідок, наприклад, впливів, що виникають у процесі виробництва, перевезення, зберігання, передпродажної підготовки, введення і протягом бо наступних етапів.

Існують різні методичні вказівки, що описують способи стабілізації білка і матеріали для виготовлення композицій, а також способи, які є придатними для цих цілей, наприклад, див. роботи АгакКауча еї аї., "Зоїмепі іпіегасійоп5 іп рпаптасеціїса! тогтиїанопв" Рпагт Кев. 8(3): 285-91 (1991); Кепагіск еї аї., "Рпувіса! 5їабріййг2аноп ої ргоївїп5 іп адоеои5 зоЇшіоп, » в: КАТІОМАЇ.

РЕБІСМ ОБ 5ТАВІ Е РАЕОТЕІМ РГОВМИШЇ АТІОМ5: ТНЕОВНМ АМО РААСТІСЕ, Сагрепієї апа

Маппіпа, єд5. Рпаптасешііса! Віоїесппоіоду. 13: 61-84 (2002), і Капао!рп еї а!., "Зитасіапі-ргоїєїп іп'егасіоп5, » Рпагт Віоїтесппої. 13: 159-75 (2002), кожна з яких повністю включена в цю заявку шляхом посилання, зокрема, в розділи, що стосуються допоміжних речовин і вищевказаних способів для білкових композицій, що мають буферну здатність, згідно з цим винаходом, особливо відносно білюювих фармацевтичних продуктів і способів, що є придатними для використання у медичних цілях у тварин і/або людини.

Згідно з деяких варіантами реалізації цього винаходу солі можуть бути використані, наприклад, для регулювання іонної сили та/або ізотонічності композиції, та/"або для поліпшення розчинності та/або фізичної стабільності білка або іншого інгредієнта композиції згідно з цим винаходом.

Добре відомо, що іони можуть стабілізувати нативний стан білків за рахунок зв'язування з зарядженими залишками на поверхні білка, екранування заряджених і полярних груп в білку і зменшення міцності їх електростатичних взаємодій, тобто притягування і відштовхування. Іони також можуть стабілізувати денатурований стан білка, зокрема, за рахунок зв'язування з денатурованими пептидними зв'язками (-СОМН) білка. Також іонна взаємодія із зарядженими і полярними групами в білюу може зменшити міжмолекулярні електростатичні взаємодії і тим самим запобігати або зменшувати агрегації білка і його нерозчинності.

Різні види іонів значно відрізняються за своїм впливом на білки. Було розроблено кілька якісних класифікацій іонів та їхній вплив на білки, які можуть бути використані при виготовленні фармацевтичних композицій згідно з цим винаходом. Одним із прикладів є серія Гофмейстера, в якій іонні і полярні неіонні розчинені речовини класифікуються згідно з їхнім впливом на конформаційну стабільність білків у розчині. Стабілізуючі розчинені речовини називаються "космотропними". Дестабілізуючі розчинені речовини називаються "хаотропними". Космотропні речовини зазвичай використовуються у високих концентраціях (наприклад, 21 М сульфат

Зо амонію) для осадження білків з розчину ("висолювання"). Хаотропні речовини зазвичай використовуються для денатурування та/або солюбілізації білків ("всолювання"). Відносна ефективність іонів відносно процесів "висолювання" і "всолювання" визначає їхню позицію у серії Гормейстера.

Згідно з різними варіантами реалізації цього винаходу вільні амінокислоти можуть бути використані в композиціях, що містять мутеїн ІЛ-2, як наповнювачі, стабілізатори і антиоксиданти, а також згідно з іншими стандартними способами застосування. Лізин, пролін, серин і аланін можна використовувати для стабілізації білків у складі. Гліцин можна використовувати при ліофілізації щоб забезпечити правильну структуру і властивості ліофілізованої таблетки. Аргінін можна використовувати для інгібування агрегації білка в рідких і ліофілізованих композиціях. Метіонін можна використовувати як антиоксидант.

Поліоли включають цукри, такі як маніт і сахароза, сорбіт і багатоатомні спирти, такі як, наприклад, гліцерин і пропіленгліколь, і, згідно з цим описом, полієтиленгліколь (ПЕГ)., і споріднені речовини. Поліоли є космотропними сполуками. Їх можна використовувати як стабілізуючі агенти в рідких і ліофілізованих композиціях для захисту білків від процесів фізичного та хімічного руйнування. Поліоли також можна використовувати для регулювання тонічності композицій.

Поліоли, які можна використовувати в деяких варіантах реалізації цього винаходу, включають маніт, який зазвичай застосовують, щоб забезпечити структурну стабільність таблетки в ліофілізованих композиціях. Маніт забезпечує структурну стабільність ліофілізованої таблетки. Як правило, він використовується спільно з ліопротектором, наприклад, сахарозою.

Сорбіт і сахароза є одними з бажаних агентів для регулювання тонічності, а також стабілізаторами, що захищають від впливів під час циклів заморожування-розтавання при транспортуванні або отриманні нерозфасованого продукту в процесі виробництва. Відновні цукри (які містять вільні альдегідні або кетонові групи), такі як глюкоза і лактоза, можуть глікувати поверхневі залишки лізину і аргініну. Відповідно, вони, як правило, не входять до числа переважних поліолів для застосування згідно з цим винаходом. Крім цього, цукри, які утворюють такі активні форми, наприклад, сахароза, яка при гідролізі в кислих умовах розпадається на фруктозу і глюкозу і, отже, призводить до глікування, з цієї причини також не входять до переважних поліолів згідно з цим винаходом. ПЕГ можна використовувати для бо стабілізації білків і як кріопротектори, і завдяки цим якостям він може бути використаний у цьому винаході.

Варіанти композицій, що містять мутеїн ІЛ-2, додатково містять поверхнево-активні речовини. Білкові молекули можуть всмоктуватися на поверхнях і денатурувати з подальшою агрегацією на поверхні розділу фаз повітря-рідина, тверде тіло-рідина і рідина-рідина. Як правило, ймовірність виникнення таких явищ зворотно пропорційна концентрації білка.

Інтенсивність таких шкідливих взаємодій зазвичай обернено пропорційна концентрації білка і, як правило, посилюється при фізичному струшуванні, наприклад, такому, яке створюється під час доставки і завантаження продукту.

Поверхнево-активні речовини зазвичай використовують для запобігання, зведення до мінімуму або зниження поверхневого всмоктування. Поверхнево-активні речовини, які придатні для використання в цьому винаході для цих цілей, включають полісорбат 20, полісорбат 80, інші жирнокислотні складні ефіри полієтоксилатів сорбіту і полоксамер 188.

Поверхнево-активні речовини також зазвичай використовують для контролю конформаційної стабільності білка. Використання поверхнево-активних речовин для цієї мети залежить від конкретного білка, оскільки будь-яка конкретна поверхнево-активна речовина, як правило, буде стабілізувати одні білки й дестабілізувати інші.

Полісорбати піддаються окиснювальному розкладу і часто надходять з вмістом достатньої кількості пероксидів, щоб викликати окиснення бічних ланцюгів амінокислотних залишків білка, особливо метіоніну. Отже, слід з обережністю використовувати полісорбати і, у випадку їхнього використання, вони повинні бути присутніми в найнижчій ефективній концентрації. У зв'язку з цим полісорбати ілюструють загальне правило, що допоміжні речовини повинні бути використані в мінімальних ефективних концентраціях.

Варіанти композицій, що містять мутеїн ІЛ-2, додатково містять один або більше антиоксидантів. Шкідливому окисненню білків у фармацевтичних композиціях у деякій мірі можна запобігти шляхом підтримання належного зовнішнього рівня кисню і температури, а також уникаючи впливу світла. Антиоксидантні допоміжні речовини також можуть бути використані, щоб запобігти окиснювальному руйнування білків. Антиоксиданти, які Є належними для цієї мети, включають відновні агенти, пастки активних форм кисню/вільних радикалів і хелатуючі агенти. Антиоксиданти для терапевтичного використання у білкових композиціях

Зо згідно з цим винаходом переважно є водорозчинними і зберігають свою активність протягом усього терміну придатності продукту. ЕДТА є переважним антиоксидантом для цієї мети згідно з цим винаходом.

Антиоксиданти можуть пошкодити білки. Наприклад, відновні агенти, такі як глутатіон, зокрема, можуть порушувати внутрішньомолекулярні дисульфідні зв'язки. Таким чином, антиоксиданти, які є придатними для використання в цьому винаході, вибирають так, щоб, окрім іншого, усунути або значно зменшити можливість пошкодження білків у композиції.

Композиції згідно з цим винаходом можуть включати іони металів, які є кофакторами білків і необхідні для утворення координаційних комплексів білків, такі як цинк, який необхідний для утворення деяких суспензій інсуліну. (они металів також можуть інгібувати деякі процеси, які викликають руйнування білків. Проте іони металів також каталізують фізичні та хімічні процеси, які руйнують білки.

Іони магнію (10-120 мМ) можуть бути використані для інгібування ізомеризації аспарагінової кислоти в ізо-аспарагінову кислоту. ни Са (аж до 100 мМ) можуть підвищувати стійкість дезоксирибонуклеази людини. Проте іони Мад"-, Мпи»2 ії 7пя2 можуть викликати дестабілізацію рлДНази. Аналогічним чином Са": і Зі"? можуть стабілізувати фактор МІ, у той час як іони Мод,

Мп»2 ії 2пя2, бу та Ре-2 можуть призвести до його дестабілізації, а іони Аз можуть підсилити агрегацію цього чинника.

Варіанти композицій, що містять мутеїн ІЛ-2, додатково містять один або більше консервантів. Консерванти необхідні при розробці багатодозових композицій для парентерального введення, в яких передбачено більше одного відбору препарату з одного і того ж контейнера. Їхня основна функція полягає в інгібуванні росту мікроорганізмів і в забезпеченні стерильності продукту протягом усього терміну придатності або терміну використання лікарського препарату. Зазвичай, використовувані консерванти включають бензиловий спирт, фенол і м-крезол. Незважаючи на те, що консерванти довгий час використовуються разом з низькомолекулярними сполуками для парентерального введення, розробка білкових композицій, які містять консерванти, може бути складним завданням.

Консерванти майже завжди чинять дестабілізуючу дію на білки (викликають агрегацію), і це стало основним чинником, що обмежує їхнє використання в багатодозових білкових композиціях. Сьогодні більшість білкових лікарських препаратів виготовлено тільки для 60 одноразового використання. Проте у тих випадках, коли можливе використання багатодозових композицій, вони забезпечують додаткову перевагу відносно зручності для пацієнта і підвищену конкурентоспроможність. Хорошим прикладом є гормон росту людини (ПОН), стосовно якого розробка, що містить консерванти композицій, призвела до промислового випуску зручніших шприців-ручок для багаторазового використання. Нині у продажу доступні щонайменше чотири різновиди пристроїв шприців-ручок, що містять композиції на основі гормону росту людини з додаванням консервантів. Нордитропін (рідина, Момо Могаї5К), нутропін АО (рідина, Сепепіесі) і генотропін (ліофілізована форма, картридж з двома відділеннями, РПпагтасіахОріопп) містять фенол, тоді як соматроп (Еїї (Шу) виготовлений з додаванням м-крезолу.

Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, такий як, наприклад, Ес.ІЇ-2(М91К) або Ес.ІІ-2(М8850), виготовлені в концентрації 10 мг/мл у розчині 10 мМ І -глутамінової кислоти, 3,0 95 (мас./об.) І - проліну, при рН-5,2. Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, такий як, наприклад, Ес.ІЇ.-2(МО91К) або

Ес. -2(М880), виготовлений у розчині 10 мМ КРІ, 161 мМ Г--аргініну, при рН - 7,6.

У ході виготовлення і розробки дозованих форм з додаванням консервантів слід враховувати ряд аспектів. Ефективна концентрація консерванта в лікарському продукті повинна бути оптимізована. Це потребує проведення випробувань цього консерванта у складі лікарської форми в діапазоні концентрацій, які забезпечують антимікробну ефективність без шкоди для стабільності білка.

Згідно з іншим аспектом у цьому винаході запропоновані мутеїни ІЛ-2 або гібридні білки, що містять мутеїни ІЛ-2 і фрагмент Ес, що знаходяться у формі ліофілізованих композицій.

Сублімовані продукти можуть бути ліофілізовані без консерванта і відновлені розчинником, що містить консервант, під час використання. Це скорочує час, протягом якого консервант перебуває в контакті з білком, значно зменшуючи ризики, пов'язані зі стабільністю. При використанні рідких складів ефективність і стабільність консерванта повинні підтримуватися протягом усього терміну придатності продукту (приблизно від 18 до 24 місяців). Важливо відзначити, що ефективність консерванта має бути продемонстрована в кінцевій композиції, що містить активну лікарську речовину і всі допоміжні компоненти.

Композиції, що містять мутеїн ІЛ-2, як правило, призначені для конкретних шляхів і способів

Зо введення, конкретних дозувань і частоти введення, конкретних видів лікування конкретних захворювань, і мають певний діапазон біодоступності і стійкості, окрім іншого. Композиції, таким чином, можуть бути розроблені згідно з цим винаходом для доставки будь-яким відповідним шляхом, включаючи, але не обмежуючись ними, пероральний, внутрішньовушний, офтальмологічний, ректальний, вагінальний і парентеральний шляхи введення, включаючи внутрішньовенну і внутрішньоартеріальну ін'єкцію, внутрішньом'язову ін'єкцію ії підшкірну ін'єкцію.

Після виготовлення фармацевтичної композиції її можна зберігати в стерильних флаконах у вигляді розчину, суспензії, гелю, емульсії, твердої речовини, кристалу або у вигляді зневодненого або ліофілізованого порошку. Такі композиції можна зберігати в готовій до використання формі або у формі (наприклад, ліофілізованій), яку відновлюють перед введенням. У цьому винаході також запропоновані набори для отримання стандартної лікарської форми для одноразового введення. Кожен набір за винаходом може включати перший контейнер, що містить висушений білок, і другий контейнер, що містить водну композицію. У деяких варіантах реалізації цього винаходу запропоновані набори, що містять одно- і багатокамерні попередньо заповнені шприци (наприклад, шприци, містять рідкі композиції, і шприци з ліофілізованою композицією).

Терапевтично ефективна кількість фармацевтичної композиції, що містить мутеїн ІЛ-г2, призначеної для застосування, буде залежати, наприклад, від терапевтичних показань і цілей.

Фахівець у цій галузі техніки зрозуміє, що відповідні рівні доз для лікування будуть варіювати, зокрема, залежно від доставленої молекули, показання, згідно з яким використовують мутеїн ІЛ- 2, шляхи введення, розміру (маса тіла, площа поверхні тіла або розмір органу) та/або стану (вік і загальний стан здоров'я) пацієнта. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу лікар може титрувати дозу і змінювати шлях введення для отримання оптимального терапевтичного ефекту. Звичайна доза може варіюватися від близько 0,1 мкг/кг до близько до 1 мг/кг або більше, залежно від зазначених вище факторів. У конкретних варіантах реалізації доза може варіюватися від 0,5 мкг/кг до близько 100 мк /кг, можливо, від 2,5 мкг/кг до близько 50 мкг/кг.

Терапевтично ефективна кількість мутеїну ІЛ-2 переважно викликає зменшення ступеня тяжкості симптомів захворювання, збільшення частоти і тривалості безсимптомних періодів захворювання або запобігає виникненню порушень або інвалідності завдяки пригніченню (516) захворювання.

Фармацевтичні композиції можуть бути введені за допомогою медичного пристрою.

Приклади медичних пристроїв для введення фармацевтичних композицій описані в патентах

США МоМо4475196; 4439196; 4447224; 4447233; 4486194; 4487603; 4596556; 4790824; 4941880; 5064413; 5312335; 5312335; 5383851 і 5399163, які всі включені в цю заявку шляхом посилання.

Способи лікування аутоїмунних або запальних захворювань

У деяких варіантах реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 згідно з цим винаходом використовують для лікування аутоїмунного або запального захворювання. У переважних варіантах реалізації цього винаходу використовують гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес.

Захворювання, які особливо піддаються лікуванню з використанням мутеїну ІЛ-2, розкритого в цій заявці, включають, але не обмежуються ними, запалення, аутоїмунне захворювання, атопічні захворювання, паранеопластичні аутоїмунні захворювання, запалення хряща, артрит, ревматоїдний артрит, ювенільний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, олігоартикулярний ювенільний ревматоїдний артрит, поліартикулярний ювенільний ревматоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит з системним початком, ювенільний анкілозивний спондиліт, ювенільний ентеропатичний артрит, ювенільний реактивний артрит, ювенільний синдром

Рейтера, ЗЕА-синдром (синдром серонегативної ентезопатії і артропатії), ювенільний дерматоміозит, ювенільний псоріатичний артрит, ювенільну склеродермію, ювенільний системний червоний вовчак, ювенільний васкуліт, олігоартикулярний ревматоїдний артрит, поліартикулярний ревматоїдний артрит, ревматоїдний артрит з системним початком, анкілозивний спондиліт, ентеропатичний артрит, реактивний артрит, синдром Рейтера, ЗЕА- синдром (синдром серонегативної ентезопатії і артропатії), дерматоміозит, псоріатичний артрит, склеродермію, васкуліт, міозит, поліміозит, дерматоміозит, вузликовий поліартериїт, гранулематоз Вегенера, артериїт, ревматичну поліміалгію, саркоїдоз, склероз, первинний біліарний склероз, склерозивний холангіт, синдром Шегрена, псоріаз, бляшковий псоріаз, краплевидний псоріаз, псоріаз складок, пустульозний псоріаз, еритродермічний псоріаз, дерматит, атопічний дерматит, атеросклероз, вовчак, хвороба Стілла, системний червоний вовчак (СЧВ), міастенію, запальне захворювання кишечнику (З3ЗК), хвороба Крона, виразковий коліт, целіакію, розсіяний склероз (РС), астму, ХОЗЛ, риносинусит, риносинусит з поліпами,

Зо еозинофільний езофагіт, еозинофільний бронхіт, хвороба Гійєна-Барре, цукровий діабет І типу, тиреоїдит (наприклад, базедову хвороба), хворобу Аддісона, синдром Рейно, аутоімунний гепатит, ТПХ, відторгнення трансплантата, пошкодження нирок, гепатит С-індукований васкуліт, спонтанну втрату вагітності тощо.

У переважних варіантах реалізації аутоїімунне або запальне захворювання являє собою вовчак, реакцію "трансплантат проти хазяїна", гепатит С-індукований васкуліт, цукровий діабет І типу, розсіяний склероз, спонтанну втрату вагітності, атопічні захворювання та запальні захворювання кишечнику.

Згідно з іншим варіантом реалізації цього винаходу пацієнт, що страждає на аутоїмунне або запальне захворюванням або схильний до ризику розвитку такого захворювання, отримує мутеїн ІЛ-2 (наприклад, мутеїн ІЛ-2, описаний у цій заявці, такий як гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, описаний у цій заявці, або інший мутеїн ІЛ-2, відомий у цій галузі техніки, або ІЛ-2 дикого типу, можливо, як частини Ес-гібридної молекули, що належить до типу, описаного в цій заявці), з подальшим контролем відповіді пацієнта на лікування. Контрольована відповідь пацієнта може являти собою будь детектовану або відповідь пацієнта на лікування, що піддається оцінці, або будь-яку комбінацію таких видів відповідей. Наприклад, відповідь може являти собою зміну фізіологічного стану пацієнта, такого як температура тіла або лихоманка, апетит, пітливість, головний біль, нудота, втома, голод, спрага, розумова активність або т.п. В іншому варіанті відповідь може являти собою зміну кількості клітин певного типу або продукту гена (наприклад, білка, пептиду або нуклеїнової кислоти), наприклад, у зразку периферичної крові, взятої у пацієнта. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу схема лікування пацієнта змінюється, якщо пацієнт має детектовану або відповідь на лікування, що піддається оцінюванню, або якщо така відповідь перевищує конкретний поріг. Зміна схеми лікування може являти собою зменшення або збільшення частоти дозування, або зменшення або збільшення кількості мутеїну ІЛ-2, що вводиться у вигляді одноразової дози, або припинення прийому препарату (тобто тимчасове припинення лікування або припинення на вказаний період часу, або доти, поки лікуючий лікар не визначить, що лікування повинно бути продовженим, або доти, поки контрольована відповідь пацієнта не буде свідчити про те, що лікування повинно або може бути відновленим) або припинення лікування. Згідно з одним варіантом реалізації цього винаходу відповідь являє собою зміну температури тіла або бо концентрації С-реактивного білка у пацієнта. Наприклад, відповідь може являти собою підвищення температури тіла пацієнта або збільшення концентрації СРБ у зразку периферичної крові, або обидві зміни одночасно. В одному конкретному варіанті реалізації винаходу лікування пацієнта обмежують, припиняють або припиняють, якщо температура тіла пацієнта під час лікування збільшується щонайменше на 0,17, 0,27, 0,37, 0,47, 0,57, 0,77, 17, 1,57, 27 або 2,576. В іншому конкретному варіанті реалізації винаходу лікування пацієнта обмежують, припиняють або припиняють, якщо під час лікування концентрація СРБ у зразку периферичної крові пацієнта збільшується щонайменше на 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,7, 1, 1,5 або 2 мг/мл. Інші види відповідей пацієнта, які можуть контролюватися і використовуватися при прийнятті рішення про зміну, обмеження, призупинення або припинення лікування, включають виникнення або погіршення синдрому капілярного витоку (гіпотензія і серцево-судинна нестійкість), порушення функції нейтрофілів (наприклад, у результаті інфекції або при виникненні або загостренні інфекції), тромбоцитопенію, тромботичну ангіопатію, реакції в місці ін'єкції, васкуліт (наприклад, гепатит

С-індукований васкуліт) або запальні симптоми, або захворювання. Інші види відповідей пацієнта, які можна контролювати і використовувати при прийнятті рішення про зміну, обмеження, посилення, призупинення або припинення лікування, включають збільшення кількості МК-клітин, Тре-клітин, ЕохР3СО4 Т-клітин, ЕохР3-СО4 Т-клітин, ЕохР3-СО8 Т-клітин або еозинофілів. Збільшення кількості клітин цих типів можна детектувати, наприклад, як збільшення кількості таких клітин на одиницю об'єму периферичної крові (наприклад, виражене як збільшення кількості клітин на мілілітр крові) або як збільшення частки такого типу клітин, наприклад, порівняно з іншим типом клітин або кількістю клітин у зразку крові. Інший тип відповіді пацієнта, який можна контролювати, являє собою збільшення кількості мутеїну ІЛ-г, зв'язаного на поверхні СО25- клітин у зразку периферичної крові пацієнта.

Способи експансії Тре--Клітин

Мутеїн ІЛ-2 або гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, можна використовувати для експансії Тре-клітин у суб'єкта або у зразку. У цьому винаході запропоновані способи збільшення відношення кількості Тре-клітин до кількості нерегуляторних Т-клітин. Спосіб включає приведення популяції Т-клітин у контакт з ефективною кількістю людського ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес. Величина співвідношення може бути виміряна шляхом визначення співвідношення кількості СОЗ-ЕБохРЗ- клітин до кількості

Зо СОЗаРохРЗ- клітин у популяції Т-клітин. Як правило, Тре-клітини в крові людини складають 5- 1095 від загальної кількості СО4-СО3ж- Т-клітин, проте при захворюваннях, перерахованих вище, ця частка може бути вищою або нижчою. У переважних варіантах реалізації цього винаходу частка Тре-клітин збільшується щонайменше на 1095, щонайменше на 20 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 95, щонайменше на 80 95, щонайменше на 90 95, щонайменше на 100 95, щонайменше на 200 95, щонайменше на 300 95, щонайменше на 400 95, щонайменше на 500 95, щонайменше на 600 95, щонайменше на 700 9о, щонайменше на 800 95, щонайменше на 900 95 або щонайменше на 1000 95. Максимальна величина відносного збільшення частки Трег- клітин може варіювати для конкретних захворювань. Проте максимальна частота Тре-клітин, яка може бути отримана за допомогою лікування мутеїном ІЛ-2, становить 50 95 або 60 95 від загальної кількості СЮО4-С03-- Т-клітин. Згідно з деякими варіантами реалізації цього винаходу мутеїн ІЛ-2 або гібридний білок, що містить мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес, вводять суб'єкту, при цьому в периферичнії крові суб'єкта збільшується співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин.

Оскільки мутеїн ІЛ-2 і гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ-2 і Ес, переважно стимулюють експансію Тре-клітин порівняно з іншими типами клітин, вони також можуть бути використані, щоб збільшити відношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості природних клітин- кілерів (МК) у периферичній крові суб'єкта. Величина співвідношення може бути виміряна шляхом визначення співвідношення кількості СОЗ-БохР3- клітин до кількості СО16б- та/або

СО56- лімфоцитів, які стосуються типу СО19- ії СОЗ-.

У цьому винаході також передбачено, що мутеїни ІЛ-2 або гібридні білки, що містять мутеїн

ІЛ-2 ії фрагмент Ес, можуть надавати терапевтичну дію відносно захворювання або розладу у пацієнта без істотного збільшення співвідношення кількості Тре-клітин до кількості нерегуляторних Т-клітин або МК-клітин у периферичній крові пацієнта. Терапевтична дія може бути обумовлено локалізованою активністю мутеїну ІЛ-2 або гібридного білка, що містить мутеїн

ІЛ-2 і фрагмент Ес, у вогнищі запалення або аутоімунного захворювання.

ПРИКЛАДИ

Описані надалі приклади, включаючи конкретні приклади і приклади можливого використання, наведені з метою ілюстрування конкретних варіантів реалізації або ознак 60 винаходу і не призначені для обмеження його обсягу.

Приклад 1. Зниження числа мутацій, які надають високу афінність відносно СО25

Мутеїни ІЛ-2 з підвищеною афінністю відносно СО25 і зменшеною активністю передачі сигналів за участю ІЛ-2КВу переважно стимулюють експансію і функцію Тре-клітин. Щоб зменшити потенційну імуногенність було проведено пошук мінімального числа мутацій, необхідних для досягнення високої афінності відносно СО25. Кристалічна структура ІЛ-2 в комплексі з трьома його рецепторами (код РОВ-2В5І) показує, що заміни Мб9А і 074Р розташовані в спіральній структурі, яка взаємодіє з СО25. Цей факт може пояснити, чому заміни

М69А і 074Р часто виділяли в двох незалежних скринінгових дослідженнях, спрямованих на пошук мутацій ІЛ-2, що забезпечують високу афінність зв'язування з СО25 (Као еї аї. 2005;

Тпапоз еї а. 2006). Мета дослідження, описаного в цьому прикладі, полягала у визначенні того, які з інших мутацій в мутеїні ІЛ-2 "2-4", виявлених у скринінговому дослідженні, проведеному

Као єї аїІ., є найважливішими для підвищення афінності до величини, що перевищує ту, яку спостерігали для Мб9А і 074Р окремо. Наступні білки піддавали скринінгу за допомогою проточної цитометрії для оцінювання зв'язування з СО25 на поверхні активованих Т-клітин. Всі конструкції також включали С-кінцеву мітку ЕГДС і полігістидинову мітку для очищення і детектування. Конкретні мутації наведені в дужках.

Намино (М69А, О74Р, М880, С125А) (ЗЕО ІО МО:8)

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНСГ 0 ОМІСМатммМУикМРєКІТАМІТЕКЕУМРККАТЕЇ КН ОСІ ЕЕЕЇГ КРІ ЕЕА

ГМГАРБКМЕНІ АРАОГІЗОІММІМІ ЕІ КаЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Намшер (МЗО5, М69А, О74Р, М880, С125А) (ЗЕО ІО МО:9)

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНОГГ ОЇ ОМІ МИ МЗУКМРКІ ТАМ ТЕКЕУМРККАТЕЇ КН ОСІ ЕЕЕЇГ КРІ ЕЕА

ГМГАРБКМЕНІ АРАОГІЗОІММІМІ Є. КаЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МЕАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Намизор (КЗ5А, М69А, О74Р, М880, С125А) (ЗЕО ІО МО:10)

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНСГ 0 ОМІСМСИїММУКкМРАСТАМІ ТЕКЕММРККАТЕЇ КН ОСІ ЕЕЕЇ КРІ ЕЕА

ГМГАРБКМЕНІ АРАОГІЗОІММІМІ ЕІ КаЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Намшар (ТЗ37А, М69А, О74Р, м880, С125А) (ЗЕО ІО МО:11)

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНСГ ОЇ ОМІСМСИММУКУРКІАВМІ ТЕКЕММРККАТЕЇ КН ОСІ ЕЕЕЇ КРІ ЕЕА

ГМГАРБКМЕНІ АРАОГІЗОІММІМІ ЕІ КаЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Намши5о (КаВЕ, М69А, О74Р, Мм880, С125А) (5ЕО ІО МО-12)

Коо) АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНСГ 0 ОМІСМСИїММУкМРКІСТАМІ ТЕКЕУМРЕКАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЕЇ КРІ ЕЕА

ГМГАРБКМЕНІ АРАОГІЗОІММІМІ ЕІ КаЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Намш6бо (Е68О, М69А, О74Р, М880, С125А) (ЗЕО ІО МО:13)

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНСГ 0 ОМІСМСИаттмМмМУкМРКСТАМІТЕКЕММРККАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЕЇ КР ЕВА

ГМГАРБКМЕНІ АРАВОГІЗОІММІМІ ЕІ КаЗЕТТЕМСЕМАОВЕТАТІМЕР МАУ ТЕАОБІЗТІ Т

Намш7ор (МТВ, М69А, О74Р, М880, С125А) (ЗЕО ІО МО :14)

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНСГ ОЇ ОМІСМСИїММУкМРКІСТАМІ ТЕКЕММРККАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЄБЕЇ КР ЕЕА

ГАГАРБКМЕНІ АРАОГІЗОІММІМІ ЕІ КаЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Намш8о (КЗ5А, КАаВЕ, Е680, Мм880, С125А) (5ЕО ІО МО:15)

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНСГ ОЇ ОМІСМСИаїмММУкМРАТАМІ ТЕКЕММРЕКАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЕЇ КРІ ЕОМ

ГМГАОЗКМЕНІ АРАОІ ІЗОІММІМІ ЕІ КаЗЕТТЕМСЕМАРЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Конструкція НаМми17О зв'язувалася з СО25 з афінністю, величина якої була аналогічна такій для вихідного ізоляту "2-4" (ї- 200 пМ), це вказує на те, що мутація М71К була здатна значно збільшувати афінність до величини, що перевищує ту, яку спостерігали для М69А, 074Р окремо (Намш10О, -2 нМ). Афінність інших конструкцій була аналогічна або незначно вища, ніж афінність Нами, за винятком Намши(80, величина афінності якої була лише трохи вища, ніж у

ІЛ-2 дикого типу.

Приклад 2. Мутеїни ІЛ-2, гібридизовані з фрагментом Ес ІдС1 для покращення періоду напіввиведення

Щоб зменшити частоту дозування, необхідну для збагачення популяції Тре--клітинами при використанні мутеїну ІЛ-2, проводили оцінювання різних гібридних білків між ІЛ-2 і фрагментами

Ес Ідс1. Фрагменти Ес містили точкові мутації, щоб усунути ефекторні функції, опосередковані

ІДО1, такі як лізис клітини-мішені. Мутації фрагмента Ес для усунення ефекторних функції включали АЗ270), Аа Аїа (І234АхІ 235А) або М2970. Оскільки мутеїни ІЛ-2, селективні відносно

Тре-клітин, мають частково знижену активність ІЛ-2, залишалось важливим гібридизувати ІЛ-2 з фрагментом Ес таким способом, який не проявляє суттєвого впливу на передачу сигналів за участю ІЛ-2К. Таким чином, мутеїни ІЛ-2 досліджували, щоб оцінити їхню здатність активувати

ІЛ-2Е після гібридизації з фрагментом Ес або в негібридизованому стані.

Щоб визначити, чи призведе димеризація ІЛ-2 при гібридизації з фрагментом Ес до збільшення інтенсивності передачі сигналів за участю ІЛ-2К внаслідок підвищеної авідності бо відносно ІЛ-2ЕЕ, слабший мутеїн ІЛ-2 (паб5) (0520110274650) гібридизували з аміно-кінцем фрагмента Ес, відокремленого лінкерною послідовністю (0505 (5Б6О ІЮ МО: 5). Цей мутеїн містив З мутації, що впливають на передачу сигналів за участю ІЛ-2А (Е150, НІбМ, М880), 8 мутацій, що надають високу афінність відносно СО25 (М295, УЗ1Н, КЗ5К, Т37А, К48Е, М69А,

МТА, О74Р) (Као еї аї. 2005), ії С1255, щоб запобігти помилковому спаровуванню цистеїну і агрегації. Гібридизація з фрагментом Ес таким чином повністю усунула біологічну активність пар», у той час як його високоафінне зв'язування з поверхневим СО25 посилилося, ймовірно, внаслідок підвищення авідності в результаті димеризації.

Мутеїни ІЛ-2 також гібридизували з М- або С-кінцем гетеродимеру Ес так, що тільки один ланцюг димеру Ес ніс домен ІЛ-2. Гетеродимерне спаровування між двома асиметричними ланцюгами Ес посилювалося за рахунок електростатичних взаємодій між введеними залишками лізину на одному ланцюзі Ес і введеними залишками аспарагінової кислоти на іншому ланцюзі

Ес. Мутеїн ІЛ-2, паб гібридизували з М-кінцем одного ланцюга Ес або іншого ланцюга, в тому випадку, якщо одна конфігурація була переважнішою, дві отримані білкові конструкції позначили пабб.гсро ії паОб.гскКК. Мутеїн паМмш7О також гібридизували з С-кінцем гетеродимеру Ес з використанням одного або двох лінкерів 0005 (5ЕО ІЮ МО: 5) (ЕСКК (545) памМш7О, гсКкКк (с45) 2пами70). Гібридизація мутеїну ІЛ-2, паЮрб, з М-кінцем гетеродимеру Ес призвела до часткової втрати активності порівняно з вільним мутеїном паб в експериментах відносно дослідження фосфорилування ротТАТ5 і проліферації Т-клітин. Навпаки, гібридизація паМми7О з

С-кінцем гетеродимеру Ес з використанням одного або двох лінкерів (30005 (5ЕО ІЮ МО: 5) не змінювала активність паМмиї70.

Також було вивчено вплив гібридизації мутеїну ІЛ-2 з С-кінцем гомодимеру Ес. Загальний пул мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) при густині З00 мільйонів клітин на 100 мл активували в колбах Т75 для вирощування тканинних культур з використанням 100 нг/мл антитіла до СОЗ (ОКТЗ). На третій день культивування клітини промивали З рази і залишали в стані спокою у свіжому середовищі протягом З днів. Потім клітини стимулювали з використанням варіантів ІЛ-2 в 10-кратному діапазоні доз для титрування від 1 пМ до 10 нМ у кінцевому об'ємі 50 мкл. Рівень фосфорилування 5ТАТ5 вимірювали за допомогою набору буферів ВО РіпозПом/ "м. Загалом, 1 мл лізуючого/фіксуючого буфера ВО РіпозПом/"М додавали, щоб зупинити стимуляцію. Клітини фіксували протягом 20 хв при 37 "С і пермеабілізували х1

Зо буфером для пермеабілізаці ВО РпозПом/"м Регт на льоду перед проведенням фарбування бра, СОр25, ЕГохРЗ і р3ТАТЬ.

Як видно з ФІГ. 1, біологічна активність мутеїнів памииО і памМш7О не змінювалася в результаті гібридизації з С-кінцем гомодимеру Ес. Таким чином, гібридизація між М-кінцем ІЛ-2 і

С-кінцем Ес не погіршує агоністичну активність мутеїнів ІЛ-2, навіть стосовно гомодимеру Ес.ІЛ- 2. У цих конструкціях мутацію С125А використовували замість С1255 для поліпшення виробничого процесу.

Приклад 3. Регулювання активності мутеїну ІЛ-2 для забезпечення переважної експансії Трег- клітин

Вихідна панель мутеїнів ІЛ-2 містила М880 окремо або в комбінації з 1 або 2 додатковими мутаціями, що впливають на передачу сигналів за участю ІЛ-2К. Для того, щоб виявити мутеїни, що мають аналогічну або незначно вищу агоністичну активність, порівняно з серією М880, була розроблена друга панель мутеїнів, які всі містили поодинокі точкові мутації. Панель, що включає 24 сигнальні мутації, була виявлена на основі передбачуваних амінокислот, що взаємодіють з ІЛ-2В (кристалічна структура, код РОВ-2В5І). Конкретні заміни вибирали на підставі прогнозованого зниження вільної енергії зв'язування між мутеїном та ІЛ-2КД. Величину вільної енергії зв'язування розраховували з використанням обчислювального алгоритму ЕСАЮ (лабораторія Генделя, Каліфорнійський університет в Сан-Дієго, США). Величину вільної енергії зв'язування мутованого варіанта визначають як АЛОтл ї М (ДОти - ДОм). Де Мн (- 01, як правило) позначає коефіцієнт похибки, що використовували для нормування прогнозованих змін афінності зв'язування, щоб отримати нахил кривої 1, при порівнянні з експериментальними величинами енергії (РоКаїа апа Напаеєеї 2005). Вільну енергію дисоціації (ДО) визначали як різницю величин енергії між пов'язаним станом (ДОрошпа) і вільним станом (ДОгеге). Величину енергії дисоціації АСти розраховували для кожної заміни.

Панель мутеїнів ІЛ-2, що містять наступні заміни (НІЄЕ, НІ6О, 119К, 020, р2оК, О2ОН, ргом, мегзн, р84кК, рван, 587, М880, М88К, М881І, М88Н, Мав, М91М, МОїК, МОН, Мет, 1ІЗ2Н,

Е95К, Е95К або Е95І), експресували у вигляді С-кінцевих гібридних білків з гетеродимером Ес.

Ці конструкції також містили мутації паМш7, для додання високої афінності зв'язування з СО25 (Мб9А, М7ТЕК, О74Р) і С125А, щоб забезпечити ефективний фолдинг білкового ланцюга.

Панель піддавали скринінгу для визначення активності за допомогою кількісного бо дослідження рівня фосфорилування 5ТАТ5 у Т-клітинах, описаного в Прикладі 2, при цьому було виявлено, що активність НІЄЕ, Ю84К, М91М, МО1К ї МО1Е була нижчою, ніж активність ІЛ-2 дикого типу, і вищою, ніж активність М880 (ФІГ. 2).

НІбЄЕ, 084К, М91М, МО91К ії М91К мали активність, яка була нижчою, ніж активність ІЛ-2 дикого типу, і вищою, ніж активність М880.

Відібрані мутеїни також досліджували в кількісних дослідженнях проліферації Т-клітин і МК- клітин.

Для проведення досліджень проліферації Т-клітин загальний пул МКПК при густині З млн. клітин/мл активували 100 нг ОКТЗ. На 2-й день клітини промивали З рази і залишали в стані спокою у свіжому середовищі протягом 5 діб. Потім клітини позначали з використанням сукцинімідилового ефіру карбоксифлуоресцеїну (СЕЗЕ) та додатково культивували в 24- ямковому планшеті при густині 0,5 млн./ямку в середовищі, що містить ІЛ-2, протягом 7 діб перед проведенням дослідження способом проточної цитометрії (ГАС5). Проліферація підгрупи

Т-клітин проілюстрована на ФІГ. З як розведення СЕЗЕ (медіана інтенсивності флуоресценції

СЕБЕ).

Для дослідження проліферації МК-клітин підгрупу СО16-МК-клітин, відібраних за допомогою магніто-активованого клітинного сортингу, культивували в середовищі, що містить ІЛ-г2, протягом З днів при густині 0,1 млн./ямку в 9б6-ямкових планшетах. За 0,5 мкКи НЗ-тимідину вносили в кожну ямку протягом останніх 18 годин інкубації. Результати дослідження проілюстровані на ФІГ. 4.

Мутовані варіанти НІбЕ, Ю84К, МО91М, МО1К їі М91К були здатні стимулювати експансію Трег- клітин, аналогічно тому, як це спостерігали для ІЛ-2 дикого типу, проте були в близько 10 разів менш активні відносно інших Т-клітин (ФІГ. 3) і в близько 100 разів менш активні відносно МК- клітин (ФІГ. 4).

Була сконструйована окрема панель гібридних білків Ес.ІЛ-2, в яких відстань між гетеродимером Ес і мутеїном памМиї7 (Мб9А, МТК, 074Р, С125А) зменшили шляхом скорочення амінокислотної послідовності на кілька залишків.

Ес.памши Ес... ТОКБІ БІ ЗРОКОСОС5АРТЗЗЗТККТОГ ОЇ ЕН ГІ ОЇ ОМІСМ... пами (ЗЕО І

МО: 22)

Тгипс1 Ес... ТОКБІ 5І 55З5ТККТОГ ОЇ ЕН ГІ ОСІ ОМІ-М... памиї7 (ЗЕО І МО: 23)

Коо) Тгипс2 Ес... ТОК5БІ 5І 5-5ТККТОГОЇ ЕН ГГ ОГОМІСМ... пами (ЗЕО ІЮ МО: 24)

ТгипсоЗ Ес... ТОК5БІ 5І 5--ТККТОГ ОГЕНГ С ОГОМІ-М.... пами (5ЕО ІЮО МО: 25)

Тгипс4 Ес... ТОК5БІ 5І 5--ККТОГОГЕНІ ГП ОГОМІ-М... пами (5ЕО ІЮ МО: 26)

Тгипо5 Ес... ТОК5БІ 5І 5--КТОГ ОЇ ЕНІ С ОЇ ОМІМ... нами (ЗЕО ІЮ МО: 27)

Тгипеб Ес... ТОК5БІ 5І 5---ТОГ ОГ ЕН ОГОМІМ... нами (ЗЕО ІЮ МО: 28)

Тгипс7 Ес... ТОК5БІ 5І 5---О1Г ОГ ЕН І ОГОМІ-М...памш (ЗЕО ІЮ МО: 29)

Тгипс8 Ес... ТОК5БІ 5І ----ОГ ОГ ЕН С.Г ОГОМІМ... памиї7 (ЗЕО ІЮ МО: 30)

Активність варіантів Тгипс1-Тгипс4 була аналогічна такій для повнорозмірної вихідної конструкції Ес.памиї7, згідно з результатами вимірювання рівня фосфорилування 5ТАТ?5 і проліферації Т-клітин і МК-клітин, як описано для ФІГ. 2, З і 4. Варіанти Тгипс5 і Тгипсб стимулювали слабші відповіді, інтенсивність яких, однак, була сильнішою, ніж інтенсивність відповідей, стимульованих мутацією М880 (паб і памш70р), і була практично аналогічна інтенсивності відповідей, стимульованих МУ91К. Активність варіанта Тгипс7 була слабшою, ніж активність мутеїнів, що містять М880, Тгипс8 мав дуже низьку активність. Але при випробуванні на МК-клітинах Тгипсе5 і Тгипсб проявили себе як сильніші агоністи, ніж МО1К, це свідчить про те, що селективності відносно Тре-клітин легше досягнути при використанні мутацій, що впливають на шляхи передачі сигналів, ніж при створенні стеричних перешкод за допомогою проксимального фрагмента Ес.

Приклад 4. Мутації, що забезпечують високу афінність відносно СО25, стосовно гомодимеру

Ес

Мутації, які надавали високу афінність зв'язування з СО25, вважалися переважними, оскільки вони підвищували тропізм відносно Т-клітин, що експресують високі рівні СО25, сприяли утворенню стійкого зв'язку мутеїн ІЛ-2:2025 і забезпечували тривалішу передачу сигналів. Проте зменшення кількості мутацій може знизити можливу імуногенність. Мутеїни, що містять М880 або МО1К, з і без мутацій пами! Мб65А і 3074Р, що забезпечують високу афінність, експресували у вигляді С-кінцевих гібридів гомодимеру Ес і порівнювали їхню біологічну активність. У дослідженні рівня фосфорилування реТАТ»5 гомодимеризація не чинила впливу на інтенсивність сигналу порівняно з мономірним мутеїном. Реверсія мутацій Мб9А ії 074Р, що забезпечують високу афінність, також не впливала на передачу сигналів за участю роТАТ5. У дослідженнях проліферації Т-клітин мутації, що забезпечують високу афінність, зменшували бо активність звичайних СО4 Т-клітин і СО8 Т-клітин, але не регуляторних Т-клітин (ФІГ. 5). Мутації,

Зо що забезпечують високу афінність, також не змінювали проліферативні відповіді МК-клітин (ФІГ. б).

Щоб визначити, чи впливають мутації, що забезпечують високу афінність, на відповіді Т- клітин в умовах іп мімо, гуманізованим мишам (МОЮО.5СІЮО.П2ггд-нульові миші, імунну функцію яких відновлювали людськими СО34- гемопоетичними стовбуровими клітинами) вводили гібридні білки, що містять мутеїн ІЛ -2 і Ес, і контролювали експансію Трег-клітин.

МОЮ.5СІЮ.ІЛ2гд-нульових (М5О) мишей у віці 7-і тижнів (Часкзоп І арх, Бар-Харбор, Мен, США) опромінювали (180 рад) і відновлювали імунну функцію шляхом введення 94000 ембріональних

СбО34: гемопоетичних стовбурових клітин печінки людини. Через 21 тиждень мишей розподіляли на б груп на підставі рівномірного розподілу частки химеризму (згідно з результатами проточної цитометрії лімфоцитів периферичної крові) і вводили 1 мкг зазначених гібридних білків, що містять мутеїн ІЛ-2 і фрагмент Ес або фосфатно-сольовий буфер (ФСБ) шляхом підшкірних ін'єкцій на О-у і 7-у добу. На 11-у добу кількість Т-клітин визначеної підгрупи в крові визначали за допомогою проточної цитометрії. При низькій дозі 1 мкг на тварину мутації, що забезпечують високу афінність, не покращували експансію Тре-клітин понад те, що спостерігали для мутацій М880 або М91К окремо (ФІГ. 7).

Експансія Трег була селективною в тому, що частка ЕохР3 бра» Т-клітин не збільшувалася відносно загальної кількості лейкоцитів периферичної крові (ЛІК), що представляють собою суміш В- їі Т-клітин людини, і мієлоїдних клітин миші. Крім того, при вищих дозах мутації, що забезпечують високу афінність, сприяли збільшенню кількості СО25РохРЗ: Т-клітин, таким чином зменшуючи селективність відносно Тре-клітин. Так, стосовно гомодимеру Ес мутації, що забезпечують високу афінність, не розглядали як необхідні для стимулювання переважної експансії Тре--КЛітин.

Ес. щдатесе(мМмго7са авеіюу:с45:пи І -2(С125А) (ЗЕО ІЮ МО 16)

ОКТНТСРРОРАРЕЇ ЇЇ ФОаРБЗУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕМИМ УМО МЕМ

НМАКТКРАЕЕЄЕОМОаЗТУВУМУМІ ТМІ НОМУ МОКЕМКОСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРАВЕРОМУУТІ.

РРЗОВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКОЕМРЗОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ О5ОСОЗЕРІ МК ТУОКАМУ

ООСММЕЗСЗУММНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОСИ

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНОГГ ОЇ ОМІМСИММУКкМРКІТАМІ ТЕКЕММРККАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЕЇ КРІ Е

Коо) ЕМІ МІ АОЗКМЕНІ АРАОГ ІЗМІММ ІМ ЕЇ КаАЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Ес.пнамин мат К дат Ес(М297с аеік):с45:пи -2(М69А, 074Р, МО1К, С125А) (5ЕО І МО:17)

ОКТНТСРРОРАРЕЇ ЇЇ ФОаРБЗУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕМИМ УМО МЕМ

НМАКТКРАЕЕЄЕОМОаЗТУВУМУМІ ТМІ НОМУ МОКЕМКОСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРАВЕРОМУУТІ.

РРОВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКОЕМРЗОІАМЕМ ЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О5БраЗЕРІ УК ТУОКАМ

ООСММЕЗСЗУММНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОСИ

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНОГГ ОЇ ОМІМСИММУКкМРКІТАМІ ТЕКЕММРККАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЕЇ КРІ Е

ЕАЇ МІ АР5КМЕНІ АРВАВОГІЗМІМКІМІ ЕІ КаЗЕТТЕМСЕМАВЕТАТІМЕРІ МАУ ТЕАОБІІЗТІ Т

Ес.МО1К (або Ес. -2(М91К)) дат Ес(М2972: аєеік):а45:пи -2(М91К, С125А) (ЗЕО І МО:18)

ОКТНТСРРОРАРЕЇ ЇЇ ФаРБЗУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕМУ МУрамЕМ

НМАКТКРАЕЕЄЕОМОаЗТУВУМУМІ ТМІ НОМУ МОКЕМКОСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРАВЕРОМУУТІ.

РРОВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКОЕМРЗОІАМЕМ ЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О5БраЗЕРІ УК ТУОКАМ

ООСММЕЗСЗУММНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОСИ

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНОГ 0 ОМІСМСИїММУкМРКІТАМІ ТЕКЕММРККАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЕЇ КРІ Є

ЕМІ МІ АОЗКМЕНІ АРАОГ ІЗМІМКІМІ ЕІ КаАЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Ес.памин М880 дат Ес(М2972: аєік):с45:пи -2(У69А, 074Р, М880, С125А) (5ЕО ІЮ МО:19)

ОКТНТСРРОРАРЕЇ ЇЇ ФОаРБЗУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕМИМ УМО МЕМ

НМАКТКРАЕЄЕОМОаЗТУВМУМУМІ ТМІ НОМУ МОКЕМКОСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРАЕЕРОММТІ

РРОВЕЕМТКМОМ5І ТОЇ УКОЕМРЗОІАМЕМ ЕЗМСОРЕММУКТТРРМІ О5БраЗЕРІ УК ТУОКАМ

ООСММЕЗСЗУММНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОСИ

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНОГГ ОЇ ОМІМСИММУКкМРКІТАМІ ТЕКЕММРККАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЕЇ КРІ Е

ЕАЇ МІ АР5КМЕНІ АРАВОГІЗОІММІМІ ЕІ. КаЗЕТТЕМСЕМАВЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Ес.м880 (або Ес. -2(М880)) ІДЕ Ес(М2972 аеік):с45:пи -2(М880, С125А) (ЗЕО ІЮ МО:20)

ОКТНТСРРОРАРЕЇ ЇЇ ФОаРБЗУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕМИМ УМО МЕМ

НМАКТКРАЕЕЄЕОМОаЗТУВУМУМІ ТМІ НОМУ МОКЕМКОСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСОРАВЕРОМУУТІ.

РРОВЕЕМТКМОМУ5І ТОЇ УКОЕМРЗОІАМЕМ ЕЗЄМСОРЕММУКТТРРМІ О5БОСОЗЕБРІ ЗК ТУЮКОАМ

ООСММЕЗСЗУММНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОСИ

АРТБЗБЗОЗТККТОЇ ОГЕНОГГ ОЇ ОМІМСИММУКкМРКІТАМІ ТЕКЕММРККАТЕЇ КНІ ОСІ ЕЕЕЇ КРІ Е

ЕМІ М АОЗКМЕНІ АРАОГІЗОІММІМІ ЕЇ КаАЗЕТТЕМСЕМАОЕТАТІМЕРІ МАУМІТЕАОБІІЗТІ Т

Приклад 5. Триваліший зв'язок мутеїнів ІЛ-2.Ес з СОЮ25 на поверхні клітин 60 У ході досліджень на гуманізованих мишах був отриманий несподіваний результат, який свідчить про те, що, незважаючи на свою знижену здатність передавати сигнали, мутеїни індукували стійкіше збагачення популяції Тре-клітинами порівняно з Ес.ІЛ-2 дикого типу.

Значніше збагачення Тре-клітинами і активацію РохР3З порівняно з тими, які спостерігали при використанні Ес.М/Т, виявляли при дозі 1 мкг/миша (ФІГ.7) і при нижчій дозі 0,5 мкг/миша (ФІГ. 8). Таке збільшення активності в умовах іп мімо, можливо, було зумовлено зниженням поглинання Т-клітинами, що призвело до збільшення кількості гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2.Ес, доступного для тривалішої передачі сигналів.

Проте в ході досліджень фармакокінетики в умовах іп міїго і іп мімо не було отримано доказів істотного збільшення тривалості збереження Ес.М91К або Ес.М880 порівняно з Ес М/ у супернатантах, отриманих з культур активованих Т-клітин, або в сироватці мишей, що отримували досліджувані сполуки. Оскільки Ес-гібридні білки несли два домени мутеїну ІЛ-2, то підвищене рециклювання в ендосомах може призвести до тривалішого зв'язку з клітинною поверхнею внаслідок збільшення авідності відносно СО25. Так, було виявлено, що Ес.МмОм1кК і

Ес.М880 ефективніше ніж Ес.М/! зберігаються на поверхні раніше активованих Т-клітин після короткочасного впливу гібридних білків (ФІГ. 9А і В).

Первинні МКПК попередньо стимулювали протягом двох днів, використовуючи 100 нг/мл

ОКТЗ. Клітини збирали, промивали чотири рази і залишали в стані спокою протягом ночі в культуральному середовищі. Потім клітини стимулювали 400 пМ Ес.ІЛ-2 протягом 30 хв при 37 "С. Після стимуляції клітини збирали для визначення в ТО після одного промивання або промивали ще три рази в 12 мл теплого середовища і культивували протягом чотирьох годин.

Для детектування, пов'язаного з клітинами Ес.ІЛ-2, клітини фарбували РІТС-кон'югованими антитілами до людського Їдс (Часкбоп ІттипоКезеагсі, Вест Грув, Пенсильванія, США) і кон'югованими з алофікоціаніном антитілами до СО25 (ФІГ. 9А).

Збільшення тривалості передачі сигналів за участю ІЛ-2К при використанні Ес.МО1Кк і

Ес.М880О0, порівняно з Бс.УМТ, спостерігали за допомогою внутрішньоклітинного імунного детектування фосфо-5ТАТ5 в аналогічних часових точках. Середні величини інтенсивності флуоресценції фосфо-5ТАТ5 в ГохР3-Сраі- Т-клітинах наведені на ФІГ. 98.

Приклад 6. Оптимізація гібридної послідовності

У доклінічних дослідженнях на мишах було показано, що величини впливу гібридних білків,

Зо що містять мутеїни ІЛ-2 і Ес, були різними, коли концентрації інтактної молекули в сироватці крові порівнювали з такими для фрагмента Ес людини окремо, що вказує на циркуляцію катаболіту Ес людини. Для оптимізації стабільності та фармакокінетики гібридних білків, що містять мутеїни ІЛ-2 і Ес, в умовах іп мімо проводили дослідження модифікацій гібридної послідовності, щоб визначити їхній вплив на протеолітичне розщеплення гібридних білків, що містять мутеїни ІЛ-2 і фрагмент Ес, в системному кровотоці та під час повторної переробки в ретикулоендотеліальній системі. Перераховані надалі конструкції оцінювали відносно їхнього впливу на протеолітичну деградацію в умовах іп міїго і іп мімо. (АІа АІа) 545... ТОКБІ 5БІЗРОКСОСсСОЗАРТОЗОТККТОГО... па7/М880 (5ЕО І МО: 31) (м29765 аеІК) с45...ТОК5ІБІБРОа СОС аБЗАРТОЗЗТККТОГО... патїме91К (ЗЕО ІЮ МО: 32) (М29765 КІбА) ААРТ...ТОКБІ 5І РА АРТ5ОЗ5ТККТОГО... па1тїме1К (ЗЕО ІО МО: 33) (М29765 КІбА) ААРА ... ТОКБІ 5І РА АРАБЗЗТККТО ОО... па1їме1К (5ЕО І МО: 34)

Стабільність вимірювали за допомогою кількісних імунологічних досліджень шляхом порівняння концентрації загального пулу Ес людини і концентрації інтактного гібридного білка, що містить Ес і мутеїн ІЛ-2, у різних часових точках. Протеоліз гібридного білка, що містить мутеїни ІЛ-2 і Ес, підтверджували за допомогою вестерн-блоттингу, використовуючи антитіла до

ІЛ-2 і антитіла до Ес людини, з подальшим зв'язуванням катаболітів імунологічними способами і дослідженням способом мас-спектрометрії. При проведенні мас-спектрометричних досліджень катаболітів (Аа Аа) (545 із зразків, отриманих в умовах іп міго і іп мімо, С-кінцевий Гу фрагмента Ес був визначений як сайт протеолітичного розщеплення. Делеція або мутація С- кінцевого лізину у фрагменті Ес ((М29705 аеіК) 45 і (М2975 КІіоА) ААРТ) забезпечила тривалішу стабільність в мишачії сироватці при 37 "С в умовах іп міїго порівняно з конструкціями

Ес, що містять С-кінцевий лізин ((Аіа Аа) (345). Подібна триваліша стабільність у сироватці крові в умовах іп міго призвела до більшої величини впливу у мишей, згідно з результатами вимірювання області під кривою концентрація-час (АОС) у сироватці крові для гібридного білка, що містить мутеїн ІЛ-2 і Ес. Тривалішу стабільність гібридних білків, що містять мутеїн ІЛ-2 і позбавлений С-кінцевого лізину фрагмент Ес, також спостерігали в сироватці крові яванських макак і людини в умовах іп міго. Мутація Тпг-3 на Аа (М2970 КібА) ААРА) в ІЛ-2 призвела до зниження стабільності в умовах іп міго при 37 "С (порівняно з (М2975 КІОА) ААРТ) у сироватці крові мишей і в окремих експериментах, що включали інкубацію з рекомбінантним катепсином Ю бо і | людини. Подібна знижена стабільність у сироватці крові в умовах іп міго призвела до зменшення впливу (АОС) у мишей в умовах іп мімо для (М2970 КІОА) ААРА порівняно з (М2975 Код) ААРТ. Мас-спектрометричні дослідження катаболітів (М2975 КІОА) ААРА із зразків, отриманих в умовах іп міїго і іп мімо, виявило, що залишки ГІ уз 8 і Гуз 9 мутеїну ІЛ-2 сприйнятливі до протеолізу, який не був виявлений для еквівалентних зразків (М29765 КіоА) ААРТ. Зниження стабільності при 37 "С (М29705 КІоА) ААРА до величини характерної для (М2970 КІОА) ААРТ також спостерігали в сироватці крові яванських макак і людини в умовах іп міїго.

Зважаючи на важливість глікозилування в цій області і для того, щоб потенційно поліпшити виробничу технологічність гібридного білка, гібридні послідовності змінювали, як описано надалі, щоб посилити М-пов'язане, але не О-пов'язане гликозилювання:

Вихідна конструкція

Іст Ес(М2970: аск): 45: ши -2(М91К, С125А) ТОКБбБІБЗІ БХРОСОаДсОаБАРТЗЗЗТККТОГО (ЗЕО ІО МО: 32)

Змінена конструкція

Іст Ес(М2972: аєік):с4: пи -2(ТЗМ, МУК, С125А)

ТОКБІ 5І БРОСІаСавАРМОЗЗТККТОЇ О (ЗЕО ІО МО: 35)

Іст Ес(М2972: аєік): 45: ни -2(ТЗМ, 55Т, МУК, С125А)

ТОКБІ 5І БРОСІаСавАРМОТОТККТОЇ О (ЗЕО ІЮ МО: 36)

Іза Ес(М297А: аекю)у:самат: ни -2(ТЗА, МУК, С125А)

ТОКБІ 5І 5РОСИОМОаТАРАБЗЗТККТОЇГО п(ЗЕО І МО: 37)

Іза Ес(М2972: авію): мама ти -2(ТЗА, МІК, С125А)

ТОКБІ 5І БРОМаМаИтАРАБЗБЗОТККТОЇ О (5ЕО ІО МО: 38)

Приклад 7. Визначення фармакокінетики та фармакодинаміки у яванських макак

При використанні стандартних способів лікування, спрямованих на стимуляцію імунної системи під дією ІЛ-2, необхідні перерви між циклами введення лікарських препаратів (відсутність впливу), щоб уникнути небажаних побічних ефектів. На відміну від цього, способи лікування, спрямовані на стимулювання або експансію Тре-клітин, можуть потребувати тривалого впливу зі стійкими залишковими рівнями лікарських препаратів (Стіп у сироватці крові), достатніми для стимуляції Тре-клітин, але з максимальними величинами впливу (Стах У

Зо сироватці крові), які нижчі рівня лікарського препарату, який призводить до активації імунної системи. Цей приклад описує стратегії дозування мутеїнів, що мають збільшений період напіввиведення, у яванських макак для досягнення тривалішого впливу на мішень (Стіп у сироватці крові), при збереженні максимальних величин впливу (Стах У сироватці крові) нижче рівня лікарського препарату, який, як очікується, буде необхідний для запальної активації імунної системи.

У чотирьох групах (А-ОЮ) яванських макак вводили Ес.М91К (ІдС1Ес(М2975 аеІк):545:пи - 2(М91К, С125А), причому в трьох групах (А-С) введення здійснювали підшкірним шляхом і в одній групі (0) шляхом внутрішньовенних ін'єкцій. У кожній з груп чотирьом біологічно інтактним самцям яванських макак вводили досліджувані сполуки з використанням стратегії дозування, описаної нижче. Підшкірне введення мутеїнів зі збільшеним періодом напіввиведення може забезпечити інтенсивніше всмоктування в лімфатичній системі, що призводить до отримання нижчих величин впливу (Стах у сироватці крові) та/або надійнішій фармакологічному відповіді (експансія Трег). Стратегія дозування для групи А складається з введення трьох послідовних доз 10 мкг/кг на 0, 2, 4-у добу в циклі 1, і 10 мкг/кг на 14-ту добу, що забезпечує триваліший вплив на мішень, аналогічний тому, який спостерігають при вищій початковій дозі 50 мкг/кг, при збереженні низької максимальної величини впливу (Стах). Стратегія дозування для групи В включає введення доз 50 мкг/кг на 0-ву і 14-ту добу для порівняння з групою А. Стратегія дозування для групи С включає введення дози 50 мкг/кг на О-ву і 28-му добу. Зазначені дозування дозволяють визначити, чи проявляють залишкові концентрації досліджуваних препаратів вплив на мішень, який є достатнім для підтримки переважної експансії Тре--клітин, а також чи забезпечує перерва між циклами введення препарату будь-яку перевагу. Стратегія дозування для групи О з внутрішньовенним введенням включає введення дози 50 мкг/кг на 0-ву добу, що дозволяє порівняти максимальні величини впливу (Стах) та різниці у ступені збагачення Тре-клітинами з цими показниками при підшкірному введенні.

Фармакокінетичні параметри (кількісне імунологічне дослідження інтактної молекули і загального рівня Ес людини), рівні антитіл до лікарського препарату, рівні відщепленої розчинної форми СО25 і цитокінів у сироватці крові (ІЛ-1Д, ФНП-са, ІФН-у, ІЛ-10, ІЛ 5, ІЛ-4 та ІЛ- 13) вимірювали в наступних часових точках для кожної зазначеної дозової групи:

Група А: перед введенням дози (перший цикл; доза 1), 48 (перший цикл перед введенням 60 дози; доза 2), 96 (перший цикл перед введенням дози; доза 3), 100, 104, 120, 168, 216, 264, 336

(другий цикл перед введенням дози), 340, 344, 360, 408, 456, 504, 576, 672, 744, 840 ї 1008 годин.

Група В: перед введенням дози (перший цикл), 4, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 336 (другий цикл перед введенням дози), 340, 344, 360, 408, 456, 504, 576, 672, 744, 840 і 1008 годин.

Група С: перед введенням дози (перший цикл), 4, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 336, 408, 504, 672 (другий цикл перед введенням дози), 676, 680, 696, 744, 792, 840, 912, 1008, 1080 і 1176 годин.

Група 0: перед введенням дози (перший цикл), 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 336, 408, 504 і 672 годин.

Фармакодинамічні параметри (імунологічне фенотипування і підрахунок Тре-клітин, нерегуляторних СО4 і СО8 Т-клітин і МК клітин в периферичній крові) вимірюють у таких часових точках для кожної зазначеної дозової групи:

Група А: перед введенням дози (перший цикл; доза 1), 96 (перший цикл перед введенням дози; доза 3), 168, 336 (другий цикл перед введенням дози), 456 і 576 годин.

Група В: перед введенням дози (перший цикл), 120, 240, 336 (другий цикл перед введенням дози), 456 і 576 годин.

Група С: перед введенням дози (перший цикл), 120, 240, 672 (другий цикл перед введенням дози), 792 і 912 годин.

Група 0: перед введенням дози (перший цикл), 120 і 240 годин.

Показники загального і біохімічного аналізу крові оцінюють у всіх тварин і у всіх дозових групах перед введенням дози і через 24 години після введення початкової дози в кожній дозовой групі. Оцінюють наступні параметри.

Гематологічні показники: о Кількість лейкоцитів (загальний і абсолютний вміст лейкоцитів) о Кількість еритроцитів о Гемоглобін о Гематокрит о Середня еритроцитарна концентрація гемоглобіну, середній об'єм еритроцитів, середня еритроцитарна концентрація гемоглобіну (розрахункова) о Абсолютна кількість ретикулоцитів

Зо о Кількість тромбоцитів о Морфологія клітин крові о Ширина розподілу еритроцитів за об'ємом о Середній об'єм тромбоцитів

Показник біохічного аналізу крові: о Лужна фосфатаза о Загальний білірубін (прямий білірубін, якщо загальний білірубін перевищує 1 мг/дл) о Аспартатамінотрансфераза о Аланінамінотрансфераза о Гамма-глутамілтрансфераза о Азот сечовини о Креатинін о Загальний білок о Альбумін о Глобулін і співвідношення А/Г (альбумін/глобулін) (розрахункове) о Глюкоза о Загальний холестерин о Тригліцериди о електроліти (натрій, калій, хлорид) о Кальцій о Фосфор

Приклад 8. Неглікозилований фрагмент Ес ІдО1

Природні антитіла до містять сайт глікозилування в константній області 2 важкого ланцюга (СН2). Наприклад, людські антитіла ІдсС1 містять сайт глікозилування в позиції А5п297 (нумерація згідно з системою ЄС). Сьогодні стратегії створення неглікозилованих антитіл включають заміну залишку Азп амінокислотою, фізико-хімічні властивості якої аналогічні таким

Азп (наприклад, Сіп), або залишком Аа, який імітує бічний ланцюг Азхп без полярних груп. У цьому прикладі описані переваги заміни Азп гліцином (М2975). Фрагменти Ес із заміною М2975 являють собою неглікозиловані молекули з поліпшеними біофізичними властивостями і параметрами, що стосуються виробничої технологічності (наприклад, відновлення в процесі бо очищення).

Вивчення кількох відомих кристалічних структур фрагментів Ес і антитіл | виявило значну конформаційну гнучкість навколо глікозилованого петлевого сегмента, особливо в позиції залишку А5п297, який є глікозилованим. У багатьох відомих кристалічних структурах залишок

А5п297 набував конформації з позитивним значенням торсійних кутів основного ланцюга. Су має високу схильність набувати конформації з позитивним значенням торсійного кута основного ланцюга у зв'язку з відсутністю атомів бічного ланцюга. Таким чином, на підставі цієї конформації і структурного фактора Сіу може являти собою переважнішу заміну для Авп, ніж

М2970 або М297А.

Мутаційний обмін А5п297 на СіІу призводить до отримання неглікозилованих молекул з істотно поліпшеною здатністю до відновлення (або ефективністю) у процесі очищення і поліпшеними біофизичними властивостями. Наприклад, відсоток відновлення (кінцевий вихід) з пулу, сорбованого на білку А, становив 82,6 95 для мутації М297С порівняно з 45,6 95 для М2970 і 39,6 96 для М297А. Дослідження з використанням колонки, що містить гідролізовані пептидні фрагменти соєвого білка з пов'язаними фосфоліпідами, показало, що нижчий відсоток відновлення для мутованих варіантів М297О і М297А був пов'язаний з подовженням спадаючої частини піку, яка вказує на присутність високомолекулярних агрегатів та/або фрагментів з неправильним упакуванням ланцюгів. Цей результат був повторно підтверджений у великомасштабній серії експериментів з реакційним об'ємом, що дорівнює 2 л.

У біофармацевтичній промисловості молекули, які потенційно можна використовувати у великомасштабному виробничому процесі, наприклад, потенційно придатні для випуску на ринок як лікарські засоби, оцінюють за рядом характеристик, щоб знизити ризик того, що молекула непридатна для великомасштабного виробництва й очищення. При оцінюванні виробничої технологічності заміна М2975 проявила стійкість до змін рН. При випробуванні

М2970 відсутні проблеми, пов'язані з агрегацією; в той час як заміни М2970 і М297А викликали 2095 і 1095 збільшення агрегації, відповідно. Незважаючи на те, що заміна М29705 демонструвала кращі характеристики виробничої технологічності, її показники були аналогічні таким для М2970 і М297А у всіх функціональних дослідженнях, в яких вона була досліджена.

Наприклад, у дослідженнях АЮСС-індукуючої здатності було показано, що М29705 не має цитотоксичності, аналогічно М2970 і М297А.

Зо Приклад 9. Стабілізований глікозилований фрагмент Ес Ідс1

Цей приклад описує спосіб покращення стабільності каркаса антитіл |0 шляхом введення сконструйованого дисульфідного(их) зв'язку(ів). Природні антитіла Ідс є стабільними молекулами. Проте для деяких видів терапевтичного застосування може знадобитися введення мутацій або створення неглікозилованих молекул. Наприклад, неглікозиловані молекули ІдС можуть бути використані для терапевтичних показань, при яких необхідно уникати АОСС і зв'язування з рецепторами Есу. Тим не менше, неглікозиловані молекули ЇДО1 мають значно нижчу температуру плавлення (температура плавлення домену СН2 зменшується на приблизно 107С; з 70"С до 60 "С), ніж глікозиловані молекули ІдДс51. Виявлена нижча температура плавлення негативно впливає на різні біофізичні властивості неглікозилованого Ідс1.

Наприклад, неглікозиловані 91 більш схильні до утворення агрегатів при низькому значенні рН порівняно з глікозилованим Ідсес1.

Для конструювання дисульфідних зв'язків спочатку використовували метод, оснований на структурних даних, що включає розрахунок відстані між С-альфа атомами, щоб виявити 54 пари залишків у фрагменті Ес, придатних для мутаційної заміни залишком Суб. Ці 54 сайти далі скоротили до 4 пар залишків (М259С-І306С, Н2920-М3020, А2870-І306С і М323С-І3325).

Використовувані критерії включали (ї) позиції в межах області СНІ, (ії) позиції, віддалені від петель, вигинів ланцюга і вуглеводних фрагментів, (іїї) позиції, віддалені від рецептора Есу і сайтів взаємодії з ЕсКп, (ім) позиції, доступні для розчинника (переважно заглиблені позиції) і т.д.

Парні заміни цистеїном створювали для використання в послідовності неглікозилованого фрагмента Ес М2970. Пептидне картування в невідновних умовах показало, що три з чотирьох сконструйованих сайтів формували дисульфідні зв'язки, згідно з прогнозом і передбачуваним дизайном зазначеного фрагмента. Мутація М259С2-І1306С не формувала дисульфідні зв'язки і призвела до неправильного спаровування з нативним дисульфідом, вже присутнім в області

СНІ. Інші три пари мутацій: К2920-У3020, А2870-1 306С і М323С-І332С формували дисульфідні зв'язки належним чином, згідно з прогнозом і передбачуваним дизайном. Додавання дисульфідного зв'язку до мутації М297 призвело до поліпшення термостабільності приблизно на 15"С порівняно з мутацією М2970 окремо. З таких варіантів потенційних дисульфідних зв'язків як К2920-М3020, А2870-1306С і М323С-І332С, мутації К2920-У302С і А287С-І 3060 бо мали хороші фармакокінетичні параметри при введенні щурам (Т:/»2 становив одинадцять діб і дев'ять діб, відповідно). Ці результати відрізнялися від опублікованого раніше фармакокінетичного профілю, що спостерігали у щурів, для дисульфідного зв'язку в області

СНеІ (Сопо в! аї., у. Віої. Снет. 2009 284: 14203-14210), згідно з яким Ті/2 становив п'ять діб.

Конструювання дисульфідного зв'язку в області СН2 покращує стабільність неглікозилованої молекули до величини, характерної для глікозилованих молекул Ід01 (покращення температури плавлення на 10 70-15", згідно з результатами диференціальної скануючої калориметрії).

Сконструйовані сайти, описані в цій заявці, не призводять до невпорядкованого формуванню дисульфідних зв'язків, і дисульфідні зв'язки формуються згідно з прогнозом приблизно в 100 95 популяції. Ще важливішим є той факт, що на відміну від сайту дисульфідного зв'язку в області

СН2, описаного в опублікованих літературних джерелах, дисульфідні зв'язки, описані в цій заявці, не впливають на параметри фармакокінетики у щурів.

Приклад 10

Вплив мутацій МО1К їі М880 на відповіді в Т-клітинах і МК-клітинах яванських макак і людини порівнювали в умовах іп мйго. За присутності СО25 (популяція СО4-0025: Т-клітин, інтенсивність сигналу яких вище порогового значення, при реєстрації відповідей реТАТ5 у зразку цільної крові) вплив мутації МУ1К на передачу сигналів за участю ІЛ-2К у яванських макак був незначним порівняно зі зниженням активності передачі сигналів за участю ІЛ-28 людини. Тим не менше, за відсутності СО25 (у популяції СО25:- Т-клітин, інтенсивність сигналу яких вище порогового значення, при реєстрації відповідей реТАТУЬ в цільній крові і в дослідженні проліферації МК-клітин) мутація МУ1К викликала більш виражене зменшення передачі сигналів за участю ІЛ -2К у яванських макак. Навпаки, Ес.М880 викликала зменшення передачі сигналів в С025: Т-клітинах цільної крові яванських макак, яке було більш схожим з впливом мутації

Ес.МО1К на передачу сигналів в Т-клітинах цільної крові людини. Дані в Таблиці 2, отримані в умовах іп міго, показують, що терапевтичне вікно, що спостерігали для слабшого агоніста

Ес.мМ880 у яванських макак, дозволить передбачити вплив мутації Ес.М91К у людини.

Таблиця 2

Узагальнені дані відносно впливу мутацій МУ1К або М880 на відповіді в клітинах людини і яванських макак в умовах іп міго жи Бевтяни ню клітин шо | 8 01717700 макак і і

МеїКулюдини.їд//-/-: (777771 Її ше Го 12 62 Ор ро макак 1 М М мввоулюдини.ї//: | -: щШ 79477777 7777ї17111111щЩщ1

Приклад 11

Два дослідження в умовах іп мімо були проведені на яванських макаках. Перше дослідження

Зо на яванських макаках було розроблено для порівняння інтервалів між введенням Ес.М91К, що становило два тижні і чотири тижні, щоб визначити, чи змінює повний або частковий фармакокінетичний (ФК) і фармакодинамічний (ФД) спад терапевтичної активності величину відповіді на другу дозу (ФІГ. 10А і В). У дослідженнях використовували першу дозу, яка згідно з прогнозами, забезпечує потужну відповідь Трег-клітин (50 мкг/кг), і другу дозу, щоб вивчити нижні межі терапевтичного вікна (10 мкг/кг). Оскільки не було відомо, чи була доза 10 мкг/кг занадто низькою, дози вводили на 1, З і 5-у добу, щоб збільшити ймовірність відповіді. Ця схема дозування забезпечила отримання величини впливу після 5-ї доби, яка була аналогічна величині, що досягнули при введенні одноразової дози 50 мкг/кг підшкірно (п/ш), але з більш низьким значенням Стах. Група, що отримувала дозу 50 мкг/кг внутрішньовенно (в/в), також була включена для вивчення потенційних відмінностей параметрів ФД залежно від вищої величини впливу препарату в лімфатичній системі порівняно з кровоносною системою. Результати цього дослідження показали, що кожен з рівнів доз індукував активну експансію Тре-клітин, яке не супроводжувалося небажаними явищами (НЯ) або експансією Теф або МК-клітин, і що величини відповідей на другу дозу, яку вводили на 14-ту або 28-му добу, були еквівалентними.

Таблиця З

Дизайн першого дослідження на яванських макаках

Друге дослідження на яванських макаках було розроблено, щоб вивчити межі терапевтичного вікна для Ес.МО1К у дозах, що дорівнюють 1, 3, 100, 200 мкг/кг (п /ш), і порівняти їх з показниками для слабкого агоніста Ес.М880 у дозах 3, 10, 100, 200 мкг/кг (п/ш) і пролейкінуєФ в дозах 3, 10, 30, 100 мкг/кг (п/ш, 1 р./добу протягом 5 діб). Дози пролейкіну?Ж вибирали на підставі опублікованих даних досліджень з участю людей і на приматах, за винятком людини (Напетанпт ес! а/!., 2013, І апсеї Оіабеїєз Епадостіп 1:295-305; Заадоишп сеї аї., 2011, МЕОМ 365:2067- 77; Аоуата ев! а!., 2012, Ат У Ттапзріапіайноп 12:2532-37), і вводили 1 р./добу протягом 5 діб, щоб імітувати клінічні дослідження з використанням низьких доз ІЛ-2 для лікування ВГОС-індукованого васкуліту та цукрового діабету 1 типу (ЦДІ).

Таблиця 4

Дизайн другого дослідження на яванських макаках 1-й цикл лікування | 2-й цикл лікування

К-сть . - дози: доза (п/ш) дози: доза (п/ш) мкг/кг мкг/кг 77776 | 4 смб8О ////////// |ДобабїОмкукг |Доба 14: 200 мкг/кг)

На Фігурах 11А-Е проілюстровані зміни кінетики клітинних відповідей, температури тіла і концентрації СРБ у сироватці крові. Часова шкала на осі абсцис починається з 0-ї доби, а не 1-ї доби, як доби введення першої дози.

У сукупності результати двох досліджень на яванських макаках показали, що мутеїни ІЛ-2 ініціювали більш значуще збагачення популяції Тре-клітинами з ширшим терапевтичним вікном, ніж при використанні пролейкіну? (ФІГ. 12А і В). При використанні пролейкіну? збагачення Трег- клітинами здійснювалося одночасно з експансією МК-клітин і еозинофілів. Безвідносно до будь- якої конкретної теорії автори вважають, що експансія еозинофілів є відомою відповіддю на лікування з використанням 1Л-2 і, швидше за все, викликаною ІЛ-2-індукованим вивільненням ІЛ- 53 2025 вроджених лімфоїдних клітин. Експансія СО4 і СОВ8 Теф-клітин мала місце при дозах, які викликали збільшення кількості Тре-клітин на 25-35 95 від загальної популяції СО4 Т-клітин.

На відміну від цього Ес.МУ1К і Рс.М880 з більшою селективністю індукували експансію Трег- клітин порівняно з МК-клітинами і еозинофілами, і дози, які стимулювали експансію Теф-клітин, були вищі за ті, які викликали збагачення Тре-клітинами до 240 95 від загальній популяції СО4 Т- клітин.

Згідно з даними з клінічних досліджень з використанням низьких доз ІЛ-2, описаних у

Зо літературних джерелах, небажані явища (НЯ), що виникали першими, включали грипоподібні симптоми і лихоманку. Таким чином, додатково з порівнянням терапевтичних вікон, мета цього дослідження полягала у виявленні біомаркерів, які передували лихоманці. Як показано на ФІГ. 12С, було виявлено, що при використанні двох високих доз пролейкіну? рівень СРБ корелював з температурою тіла. При найвищій дозі Ес.МО1К було виявлено помірне підвищення температури тіла, і при введенні наступної нижчої дози спостерігали невелике збільшення СРБ. Таким чином, рівень СРБ може бути використаний для контролю відповіді суб'єкта на лікування з використанням молекули згідно з цим винаходом та/або для визначення верхньої межі підвищення дози у пацієнта.

У тварин, які отримували пролейкін", також спостерігали деякі види токсичності, які були або менш вираженим, або були відсутні у тварин, які отримували Ес.М91К або Ес.Мм880 (ФІГ. 120).

Було встановлено, що рівні тромбоцитів, нейтрофілів і альбуміну знижувалися в результаті лікування пролейкіноме, тоді як дози Ес.М91К або Ес.мМ880, які викликали аналогічне або більш виражене збагачення популяції Тре-клітинами, незначно знижували ці параметри або не чинили на них впливу. У сукупності ці дані показують, що терапевтичне вікно для лікування пацієнтів з використанням Ес.М91К або Ес.мМ880, як очікується, буде значно більшим, ніж при використанні пролейкіну?.

Приклад 12

В окремих часових точках у зразках сироватки, отриманих з першого дослідження на яванських макаках, описаного в прикладі 11, визначали присутність антитіл до лікарського препарату (АбБА) (ФІГ. 13). Наведено дані про співвідношення сигнал/шум для АБбА в зразках, в яких специфічність Ес.М91К підтверджували за допомогою конкурентного дослідження. Часові точки, в яких проводили випробування АБВА, показані вертикальними лініями вище осі ОХ. У групі 1 в однієї тварини АБА вироблялися щонайменше через п'ятнадцять діб після введення останньої дози, у групі 2 жодна тварина не мала позитивних результатів визначення АбБА, їв групі 3 АБА послідовно з'явилися у трьох тварин через п'ятнадцять або більше діб після введення першої дози. Після повторного введення препарату в групах 1 і 2 в дозі 50 мкг/кг на 162-у добу жодна інша тварина не мала позитивного результату визначення АБА через чотири тижні (190-а доба). У двох тварин у групі 3, у яких були отримані найсильніші сигнали АБбА (210, 212), знизилися показники фармакодинаміки, що відповідало зменшенню величини Стах, ЩО спостерігається у цих тварин після введення другої дози. Жодна з тварин у четвертій групі (50 мкг/кг, в/в) не мала позитивного результату визначення АБА. АБА були специфічні відносно як

ІЛ-2, так і фрагмента Ес, що можна було б очікувати через розходження за вісьмома амінокислотним залишкам між послідовністю ІЛ-2 яванських макак і ІЛ-2 людини (МУ91К, С125А).

Нейтралізуючу активність АВА не досліджували.

Перелік послідовностей

Коо) -1105 АМОЕМ ІМО. «120» МУТЕЇНИ ІНТЕРЛЕЙКІНУ-2 ДЛЯ ЕКСПАНСІЇ РЕГУЛЯТОРНИХ Т-КЛІТИН -130» А-1826-МО-РСТ «140» «1415» -150» 61/784,669 -1515» 2013-03-14 -160» 38 «170» Раїепіп версія 3.5 «21051 «2115 133 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «220» «2215 МОЮ ВЕ5 «222» (125)..(125) «223» Сув, Зег, Ма! чи Аа (510)

«4005» 1

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Стп Геи Сп еи Спи Нів 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г еи Авп ау Пе Авп Авп Тут Гув 20 25 Зо

Авп Рго Гуз І ви Тит Агу Меї І еи Тпг Ре Гуз Рне Туг Меї Рго ГГ уз 35 40 45

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Суб Геи Спи См СП Гей Гув 50 55 бо

Рго І єи Сім Спи Маї І еи Авп ГГ еи Аїа Сп ЗБег Гу Авп РнНе Ніз І ви 65 70 75 80

Аг Рго Агу Азр І єи Пе 5ег Авп ІІе Авп Гуз ЇІе Маї І єи Спи І еи 85 90 95

Гуз Спу бег Спи Тиг ТАг РНе Меї Суз Сім Туг Аіа Азр Сти ТНг Аа 100 105 110

ТА Пе Маї Спи Рпє І єи Авп Аго Тр Пе Тнг Рне Хаа Сп 5ег Пе 115 120 125

Пе Бег Тиг Гей ТНг 130 «-21052 «2115 133 «2125 БІЛОК «213» Ното зарієп5 «220» «2215 МОЮ ВЕ5 «реа» (125)..0125) «223» Сув, Зег, Ма! чи Аа «40052

Аа Рго Тиг бег Зег Зег ТП Гуз Гуз ТАг Сп ГГ еи Стпп Гей Си Нів 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г еи Авп ау Пе Авп Авп Тут Гув 20 25 0)

Авп Рго Гуз І єи ТНг Агу Меї І еи Тпг Рпе Гуз Рпе Туг Меї Рго ГГ ув 35 40 45 60

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Суб Геи Спи См СП Гей Гув 50 55 60

Рго І єи Сім Спи Маї І еи Авп ГГ еи Аїа Сп ЗБег Гу Авп РнНе Ніз І ви 65 70 75 80

Агу Рго Аг Авр Геи Іе Зег Авп Пе Авп Ма! Пе Маї Геи Сім І еи 85 90 95

Гуз Спу бег Спи Тиг ТАг РНе Меї Суз Сім Туг Аіа Азр Сти ТНг Аа 100 105 110

Тит Пе Маї Сіи Рне І єи Азп Ага Тр Іе ТАг Рне Хаа сСіп 5ег Пе 115 120 125

Пе Бег Тиг Гей ТНг 130 «2105 З «2115 227 «212» БІЛОК «213» Ното зарієп5

Зо «4005» З

Ар Гуз ТНг Ні Тнг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Спи І ей Гей Спу 1 5 10 15

З5

Стпу Рго Зег Маї Рнє І єи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І ви Меї 20 25 0) 40 Пе Бег Агу Тниг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Нів

Сі Авр Рго Сііи Ма! Гуз Рне Авзп Тгр Туг Маї Азр Су Маї Сіи Маї 45 50 55 бо

Нів Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Спи СПми стіп Туг Авп 5ег ТАг Туг 65 70 75 80

Ага Маї Ма! 5ег Ма! І и Тнг Ма! Геи Ні Сіп Авр Тр Гей Авп Спу 85 90 95

Гуз Спи Туг Гуз Суз І уз Ма! бЗег Авп І уз Аа І еи Рго Аа Рго Ме 100 105 110 60 Спи Сув ТТН Пе Зег Гуз Аа Гуз СПу Спп Рго Агу Сім Рго Сіп Маї

115 120 125

Туг Тиг ГГ еи Рго Рго Зег Агу Сіи Спи Меї Тниг Гуз Авп ап Маї Зег 130 135 140

Ї еи Тиг Суз І еи Ма! Гуз Спу Рпе Туг Рго 5ег Ар Іе Аа Маї Сі 145 150 155 160

Тр Спи Бег Авп ау Сп Рго СІм Авп Авп Туг Гуз Тит Тнг Рго Рго 165 170 175 маї Геи Авр 5Зег Авр Су 5ег Рпе РНе Геи Туг Зег Гуз Геи ТНг Маї 180 185 190

Авр Гуз 5ег Агу Тгр Сп Сп Спу Авп Маї Ре 5Зег Сув 5ег Ма! Меї 195 200 205

Ніз Сі Аїйа І єм Нів Авп Нів Туг Тнг Сп Г ув 5егіІ еи 5ег І єи 5ег 210 215 220

Рго сту Гув 225

Зо «2105 4 «2115 226 «212» БІЛОК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 4

Азр Гуз Тниг Ні Тнг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сім Геи І еи Спу 1 5 10 15

Спу Рго Зег Маї Рнє І єи Рне Рго Рго І уз Рго Гуз Авр ТНг І єи Меї 20 25 0)

Пе Бег Агу Тниг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Нів 35 40 45

Сі Авр Рго Сііи Ма! Гуз Рне Азп Тгр Туг Маї Азр Су Маї Спи Маї 50 55 60

Нів Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Сім СП сій Туг Спу Зег Тег Туг 65 70 75 80 60

Ага Маї Ма! 5Зег Ма! І еи Тнг Маї! І єи Ніз Сіп Авр Тгр Гей Азп СпІу 85 90 95

Гуз Си Туг Гуз Суз І уз Ма! Бег Авзп І уз Аа І єи Рго Аа Рго Пе 100 105 110 сій Суз ТАг Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Сп Рго Агу Спи Рго Сп Маї 115 120 125

Туг Тиг ГГ еи Рго Рго Зег Агу Сіи Спи Меї Тниг Гуз Авп ап Маї Зег 130 135 140

Ї еи Тиг Суз І еи Маї Гуз Спу Ре Туг Рго 5ег Авр Пе Аїа Ма! Спи 145 150 155 160

Тр Спи Бег Авп ау Сп Рго СІм Авп Авп Туг Гуз Тит Тнг Рго Рго 165 170 175 ма! І еи Авр бЗег Авр Сіпу бег Ріє РнНе ГГ еи Туг Зег Гуз І еи Тнг Маї 180 185 190

Азр Гуз 5ег Агу Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Ре 5Зег Сув 5ег Ма! Меї

Ко) 195 200 205

Ні5 Спи Айа ГІ єм Ні Авп Ні Туг ТНг Сп Гуз Зег І єи 5ег Геи Зег 210 215 220

Рго Слу 225 «21055 «-21155 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005» 5 сту Су Спу Спу Зег 1 5 «2105 6 «-21155 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» 60 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид

«4005» 6

Сіу Спу Азп Су ТНг 1 5 -2105 7 «-21155 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 7

Туг сапу Авп Су ТНг 1 5 2105» 8 «2115 133 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 8

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Стп Геи Сп еи Спи Нів

Коо) 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г еи Авп ау Пе Авп Авп Тут Гув 20 25 Зо

З5

Авп Рго Гуз І ви ТНг Агу Меї І еи Тпг Рпе Гуз Рпе Туг Меї Рго ГГ ув 40

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Суб Геи Спи См СП Гей Гув бо 45 РгоГеи Сім Си Аа І єи Авп І єи Аа Рго 5ег Гуз Авп РнНе Ніз І ви 65 70 75 80

Аг Рго Агу Азр ГІ єи Іе 5ег Авр Іе Азп Маї ІПе Ма! Геи Спи Гей 50 85 90 95

Гуз Спу бег Спи Тиг ТАг РНе Меї Суз Сім Туг Аіа Азр Сти ТНг Аа 100 105 110 55

Тит Пе Маї Сіи Рне І єи Азп Ага Ттр Іе ТАг Рне Аїа Сип 5ег Пе 115 120 125 60

Пе Бег Тиг Гей ТНг «2105 9 «2115 133 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 9

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз ТАг Сп І еи Сп ГГ еи См Ніб 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г еи Авп Су Пе Авп 5ег Туг Гув зо 20

Авп Рго Гуз І ви ТНг Агу Меї ГГ еи Тпг Рпе Гуз Рпе Туг Меї Рго ГГ ув 35 40 45 25

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Суб Геи Спи См СП Гей Гув 50 55 бо

РгоГеи Сім Си Аїйа І єм Авп Г єи Аа Рго 5ег Гуз Авп РнНе Ніз І ви 65 70 75 80

Аг Рго Агу Азр ГІ єи Іе 5ег Авр Іе Азп Маї ІПе Ма! Геи Спи Гей 85 90 95

Гуз Спу Зег СПи Тиг ТАг РНе Меї Суз Сім Туг АІа Азр Сти ТНг Аа 100 105 110

Тит Пе Маї Сіи Рне І єи Азп Ага Ттр Іе ТАг Рне Аїа Сип 5ег Пе 115 120 125

Пе Бег Тиг Гей ТНг 130 «210510 «2115 133 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 10

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Стп Геи Сп еи Спи Нів бо 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г еи Авп ау Пе Авп Авп Тут Гув 20 25 Зо

Авп Рго Ага І єи Тпг Агу Меї І еи Тнг Ре Гуз Рне Туг Меї Рго ГГ уз 35 40 45

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Суб Геи Спи См СП Гей Гув 50 55 бо

РгоГеи Сім СПи Аа І єи Авп І єи Аа Рго 5ег Гуз Авп РнНе Ніз І ви 65 70 75 80

Аг Рго Агу Азр ГІ єи Іе 5ег Авр Іе Азп Маї ІПе Ма! Геи Спи Гей 85 90 95

Гуз Спу бег Спи ТНг ТАг Ре Меї Суз Сім Туг Аіа Азр Спи ТАг Аа 100 105 110

Тит Пе Маї Сіи Рне І єи Азп Ага Ттр Іе ТАг Рне Аїа Сип 5ег Пе 115 120 125

Зо

Пе Бег Тиг Гей ТНг 130 -2105 11 «2115 133 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 11

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Стп Геи Сп еи Спи Нів 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г еи Авп ау Пе Авп Авп Тут Гув 20 25 Зо

Авп Рго Гуз І ви Аа Ага Меї І еи Тпг РНе Гуз Рпе Туг Меї Рго ГГ ув 35 40 45

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Суб Геи Спи См СП Гей Гув 50 55 бо 60 Ро єи Спи Си Аа Ге Авп Гей Айа Рго З5ег Гуз Авзп РНе Нів ГІ еи

65 70 75 80

Аг Рго Агу Азр ГІ єи Іе 5ег Авр Іе Азп Маї ІПе Ма! Геи Спи Гей 85 90 95

Гуз Спу бег Спи Тиг ТАг РНе Меї Суз Сім Туг Аіа Азр Сти ТНг Аа 100 105 110

Тит Пе Маї Сіи Рне І єи Азп Ага Ттр Іе ТАг Рне Аїа Сип 5ег Пе 115 120 125

Пе Бег Тиг Гей ТНг 130 «-2105 12 «2115 133 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 12

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Стп Геи Сп еи Спи Нів 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г єеи Авп Су Пе Авп Авп Туг Гуз 20 25 Зо

З5

Авп Рго Гуз І єи ТАг Агу Меї Геи ТАг РНе Гуз Рне Туг Меї Рго Сіи 40

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Сув Гей Сім Стіи Си Гей Гув бо 45 РгоГеи Сім Си Аа І єи Авп І єи Аа Рго 5ег Гуз Авп РнНе Ніз І ви 65 70 75 80

Аг Рго Агу Азр І єи Пе 5ег Авр Пе Авп Ма! Пе Маї Геи Си І еи 50 85 90 95

Гуз Спу бег Спи Тиг ТАг РНе Меї Суз Сім Туг Аіа Азр Сти ТНг Аа 100 105 110 55

Тит Пе Маї Сіи Рне І єи Авп Ага Ттр Іе ТАг Рне Аїа Сп 5ег Пе 115 120 125 60

Пе Бег Тиг Гей ТНг «210513 «2115 133 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 13

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Стп Геи Сп еи Спи Нів 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г еи Авп ау Пе Авп Авп Тут Гув зо 20

Авп Рго Гуз І ви ТНг Агу Меї І еи Тпг Рпе Гуз Рпе Туг Меї Рго ГГ ув 25

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Суб Геи Спи См СП Гей Гув бо

Коо) Рго І єи Сім Авр Аа І єм Авп І єи Аа Рго зег Гуз Авп РНе Нів І єи 65 70 75 80

Аг Рго Агу Азр ГІ єи Іе 5ег Авр Іе Азп Маї ІПе Ма! Геи Спи Гей 35 85 90 95

Гуз Спу бег Спи Тиг ТАг РНе Меї Суз Сім Туг Аіа Азр Сти ТНг Аа 100 105 110 40

Тит Пе Маї Сіи Рне І єи Азп Ага Ттр Іе ТАг Рне Аїа Сип 5ег Пе 115 120 125 45

Пе Бег Тиг Гей ТНг 130 50 «2105 14 «2115 133 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність 55 «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 14

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гув Тиг Сп Гей Сп Г еи См Нів (510) 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г еи Авп ау Пе Авп Авп Тут Гув 20 25 Зо

Авп Рго Гуз І єи ТНг Агу Меї І еи Тпг Рпе Гуз Рпе Туг Меї Рго ГГ ув 35 40 45

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Суб Геи Спи См СП Гей Гув 50 55 бо

Рго І єи Сім Спи Аа ГІ еи Аго Гей Аїйа Рго 5ег Гуз Авзп Ре Нів І еи 65 70 75 80

Аг Рго Агу Азр ГІ єи Іе 5ег Авр Іе Азп Маї ІПе Ма! Геи Спи Гей 85 90 95

Гуз Спу бег Спи Тиг ТАг РНе Меї Суз Сім Туг Аіа Азр Сти ТНг Аа 100 105 110

Тит Пе Маї Сіи Рне І єи Азп Ага Ттр Іе ТАг Рне Аїа Сип 5ег Пе 115 120 125

Зо

Пе Бег Тиг Гей ТНг 130 0 «210515 «2115 133 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 15

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Стп Геи Сп еи Спи Нів 1 5 10 15

Ї ен Геи Геи Авр І єи Сп Ме! Пе Г еи Авп ау Пе Авп Авп Тут Гув 20 25 Зо

Азп Рго Аго І єи ТАг Агу Меї Геи Тйг Рпє Гуз Рне Туг Меї Рго Спи 35 40 45

Гуз Аа ТАг Спи І єи Гуз Нів Геи Сп Суб Геи Спи См СП Гей Гув 50 55 бо (510) Рго І єи Сім Авр Маї І єм Авп І єи Аа Сп Зег Г ув Авзп РнНе Нів І еи

65 70 75 80

Аг Рго Агу Азр ГІ єи Іе 5ег Авр Іе Азп Маї ІПе Ма! Геи Спи Гей 85 90 95

Гуз Спу бег Спи Тиг ТАг РНе Меї Суз Сім Туг АІа Ар Сім ТНг Аа 100 105 110

Тит Пе Маї Сіи Рне І єи Азп Ага Ттр Іе ТАг Рне Аїа Сип 5ег Пе 115 120 125

Пе Бег Тиг Гей ТНг 130 «210516 «2115 364 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 16

Ар Гуз ТНг Ні Тнг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Спи І ей Гей Спу

Ко) 1 5 10 15

Стпу Рго Зег Маї Рнє І єи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І єи Меї 20 25 зо

Пе Бег Агу Тниг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Нів 35 40 45

Сі Авр Рго Сііи Ма! Гуз Рне Авзп Тгр Туг Маї Азр Су Маї Сіи Маї 50 55 бо

Нів Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Сім СП сій Туг Спу Зег Тег Туг 65 70 75 80

Ага Маї Ма! 5ег Ма! І и Тнг Ма! Геи Ні Сіп Авр Тр Гей Авп Спу 85 90 95

Гуз Спи Туг Гуз Суз І уз Ма! бЗег Авп І уз Аа І еи Рго Аа Рго Ме 100 105 110 сій Суз ТАг Пе Зег Гуз Ага Гуз Спу Сп Рго Агу Сім Рго Сіп Маї 115 120 125 (516)

Туг Тиг ГГ еи Рго Рго Зег Агу Сіи Спи Меї Тниг Гуз Авп ап Маї Зег 130 135 140

Ї єи Тиг Суз І єи Ма! Гуз Сіу РНе Туг Рго 5ег Авр Іе Аа Маї СІ 145 150 155 160

Тр Спи Бег Авп ау Сп Рго СІм Авп Авп Туг Гуз Тит Тнг Рго Рго 165 170 175 маї Геи Авр 5Зег Авр Су 5ег Рпе РНе Геи Туг Зег Гуз Геи ТНг Маї 180 185 190

Азр Гуз 5ег Агу Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Ре 5Зег Сув 5ег Ма! Меї 195 200 205

Ніз Сі Аїйа І єм Нів Авп Нів Туг Тнг Сп Г ув 5егіІ еи 5ег І єи 5ег 210 215 220

Рго Спу Спу Спу Су Спу Зег Аа Рго Тнг Зег Зег Зег ТНг Гуз Гув 225 230 235 240

ТАг ай Гей Сп Ї ви Спи Ніз Гей ей Гей Авр І єи Сп Меї Пе І єи

Ко) 245 250 255

Азп сту Пе Авп Авп Туг Гуз Авп Рго Гуз Геи ТАг Агу Меї І еи Тиг 260 265 270

З5

Рпє Гуз РНе Туг Меї Рго Гуз Гуз Аа Тнг Сии І єи Гуз Нів І ви Сп 275 280 285

Суз І єи Спи Сім Спи І и Гуз Рго І єи Спи Спи Маї І єи Авп І єи Аа 290 295 00

Сп Зег Гуз Азп РпНе Ніз І єи Агу Рго Агу Азр І єи Іе Зег Авп ЇІе 305 з10 315 з20

Азп Ма! Пе Ма! І еи Сім І єи Гуз Спіу Зег Спи ТНг ТНе Рне Меї Су 325 330 335

Сім Туг АІа Авр Сііи ТНг Аа Тнг Пе Маї Спи Ре І єи Авп Аго Ттр 340 345 350

Пе Тиг Ре Аїа Сп 5ег Пе Пе Зег ТНг Геи ТНг 355 360 60

«2115» 364 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 17

Авр Гуз ТНг Ні Тнг Сув Рго Рго Суз Рго Аїа Рго Сім І єи І ви Спу 1 5 10 15

Стпу Рго Зег Маї Рнє І єи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І єи Меї 0)

Пе Бег Агу Тниг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Нів 35 40 45 20

Сі Авр Рго Сііи Ма! Гуз Рне Авзп Тгр Туг Маї Азр Су Маї Сіи Маї 50 55 60 25

Нів Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Спи СПи (п Туг Сіу Зег Тег Туг 65 70 75 80

Аго Маї Ма! Зег Ма! Геи Тнг Маї Гей Нів Сип Авр Тр І ви Авзп Стпу 85 90 95

Гуз Спи Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Авп І уз Аа І еи Рго Аа Рго Пе 100 105 110 сій Суз ТАг Пе Зег Гуз Ага Гуз Спу Сп Рго Агу Сім Рго Сіп Маї 115 120 125

Туг Тиг ГГ еи Рго Рго Зег Агу Сім Спи Меї Тниг Гуз Авп Сп Маї Зег 130 135 140

Ї еи Тиг Суз І еи Ма! Гуз Спу Рпе Туг Рго 5ег Ар Іе Аа Маї Сі 145 150 155 160

Ттраїш зег Авп Сіу Сп Рго Спи Авп Авп Туг Гуз ТНиг ТНг Рго Рго 165 170 175 маї Геи Авр 5Зег Авр Су 5ег Рпе РНе Геи Туг Зег Гуз Геи ТНг Маї 180 185 190

Азр Гуз 5ег Агу Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Ре 5Зег Сув 5ег Ма! Меї 195 200 205 60

Ні5 Спи Айа ГІ єм Ні Авп Ні Туг ТНг Сп Гуз Зег І єи 5ег Геи Зег 210 215 220

Рго Спу Спу Спу Су Спу Зег Аа Рго Тнг Зег Зег Зег ТНиг Гуз Гув 225 230 235 240

ТАг ап Гей Сіп І еи Сім Ніз І еи Гей І єеи Авр Гей Сп Меї Пе Гей 245 250 255

Азп сту Пе Авп Авп Туг Гуз Авп Рго Гуз Геи ТАг Агу Меї І еи Тиг 260 265 270

Рпє Гуз РНе Туг Меї Рго Гуз Гуз Аа Тнг Сии І єи Гуз Нів І ви Сп 275 280 285

Суз І єи Спи СпПш Спи І и Гуз Рго І єи Спи Сім Аа І єи Авп І ей Аа 290 295 100)

Рго Зег Гуз Авп РНе Нів І ви Агу Рго Ага Азр І єи Пе 5ег Авп ЇІе 305 З10 315 320

Авп Гуз Пе Маї І єи Спи Геи Гуз Сіу Зег Спи ТАг ТНг Ре Меї Суз 325 330 335

Сім Туг АІа Авр Сііи ТНг Аа Тнг Пе Маї Спи Ре І єи Авп Аго Ттр 340 345 350

Пе Тиг Ре Аїа Сп бег Пе Пе Зег ТНг Геи ТНг 355 360 «2105 18 «2115 364 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 18

Ар Гуз ТНг Ні Тнг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Спи І ей Гей Спу 1 5 10 15

Стпу Рго Зег Маї Рнє І єи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І єи Меї 20 25 Зо

Пе Бег Агу Тниг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Нів бо 35 40 45

Сі Авр Рго Сііи Ма! Гуз Рне Авзп Тгр Туг Маї Азр Су Маї Сіи Маї 50 55 60

Нів Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Сім СП сій Туг Спу Зег Тег Туг 65 70 75 80

Ага Маї Ма! 5ег Ма! І и Тнг Ма! Геи Ні Сіп Авр Тр Гей Авп Спу 85 90 95

Гуз Спи Туг Гуз Суз І уз Ма! бЗег Авп І уз Аа І еи Рго Аа Рго Ме 100 105 110 сій Суз ТАг Пе Зег Гуз Ага Гуз Спу Сп Рго Агу Сім Рго Сіп Маї 115 120 125

Туг Тиг ГГ еи Рго Рго Зег Агу Сіи Спи Меї Тниг Гуз Авп ап Маї Зег 130 135 140

Ї еи Тиг Суз І еи Ма! Гуз Спу Рпе Туг Рго 5ег Ар Іе Аа Маї Сі 145 150 155 160

Зо

Тр Спи Бег Авп ау Сп Рго СІм Авп Авп Туг Гуз Тит Тнг Рго Рго 165 170 175

Ма еи Авр бег Азр Сіпу бег Рнє РнНе ГГ еи Туг Зег Гуз І еи Тнг Маї 180 185 190

Азр Гуз 5ег Агу Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Ре 5Зег Сув 5ег Ма! Меї 195 200 205

Ні5 Спи Айа ГІ єм Ні Авп Ні Туг Тиг Сіп Гуз Зегі єи 5ег Гей Бег 210 215 220

Рго Спу Спу Спу Су Спу Зег Аа Рго Тнг Зег Зег Зег ТНиг Гуз Гув 225 230 235 240

ТАиг ай Гей Сп Ї ви Спи Ніз Гей ей Гей Авр І и Сіп Ме! Пе І ей 245 250 255

Азп сту Пе Авп Авп Туг Гуз Авп Рго Гуз Геи ТАг Агу Меї І еи Тиг 260 265 270

Рпє Гуз РНе Туг Меї Рго Гуз Гуз Аа Тнг Стпи ГГ еи Гуз Нів І еи Сп бо 275 280 285

Суз І єи Спи СпПш Спи І и Гуз Рго І єи Спи СП Маї І и Авп І ей Аа 290 295 100)

Сіп Зег Гуз Авп РНе Нів І еи Агу Рго Ага Азр І єи Пе Зег Авп ЇІе 305 з10 315 з20

Авзп Гуз Пе Ма! Геи Спи Геи Гуз СПу Зег Спи ТАиг ТНг Рпєе Меї Сувз 325 330 335 ам Туг Аіа Азр Си ТНг Аа Тнг Те Маї Спи Ре Гей Авп Ага Ттр 340 345 350

Пе Тиг Ре Аїа Сп бег Пе Пе Зег ТНг Геи ТНг 355 360 «2105 19 «2115» 364 25. «2125» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид

Зо «4005» 19

Ар Гуз ТНг Ні Тнг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Спи І ей Гей Спу 1 5 10 15

З5

Сіу Рго 5ег Маї Рпе Геи РНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І еи Меї 20 25 0) 40 Пе Бег Агу Тниг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Нів

Сі Авр Рго Сііи Ма! Гуз РНе Азп Тгр Туг Маї Азр Су Маї Спи Маї 45 50 55 бо

Нів Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Сім СП сій Туг Спу Зег Тег Туг 65 70 75 80

Аг Маї Маї Зег Ма! І єи Тиг Маї Геи Нів Сп Авр Тр Геи Авп Спу 85 90 95

Гуз Спи Туг Гуз Суз І уз Ма! бЗег Авп І уз Аа І еи Рго Аа Рго Ме 100 105 110 60 Спи Сув ТТ Пе Зег Гуз Аа Гуз СПу Сп Рго Агу Сім Рго Сп Маї

115 120 125

Туг Тиг ГГ еи Рго Рго Зег Агу Сіи Спи Меї Тниг Гуз Авп ап Маї Зег 130 135 140

Ї еи Тиг Суз Геи Ма! Гуз Спу Ре Туг Рго 5ег Ар Іе Аа Ма! Сі 145 150 155 160

Тр Спи Бег Авп ау Сп Рго СІм Авп Авп Туг Гуз Тит Тнг Рго Рго 165 170 175 маї Геи Авр 5Зег Авр Су 5ег Рпе РНе Геи Туг Зег Гуз Геи ТНг Маї 180 185 190

Авр Гуз 5ег Агу Тгр Сп Сп Спу Авп Маї Ре 5Зег Сув 5ег Ма! Меї 195 200 205

Ні5 Спи Айа ГІ єм Ні Авп Ні Туг ТНг Сп Гуз Зег І єи 5ег Геи Зег 210 215 220

Рго Спу Спу Спу Су Спу Зег Аа Рго Тнг Зег Зег Зег ТНиг Гуз Гув 225 230 235 240

Зо

ТАг ай Гей Сп Ї ви Спи Ніз Гей ей Гей Авр І єи Сп Меї Пе І єи 245 250 255

З5

Азп сту Пе Авп Авп Туг Гуз Авп Рго Гуз Геи ТАг Агу Меї І еи Тиг 260 265 270

Рне Гуз Рне Туг Меї Рго І уз І уз АІа Тнг Сі І єи Гуз Нів І еи Сп 275 280 285

Суз І єи Спи СпПш Спи І и Гуз Рго І єи Спи Сім Аа І єи Авп І ей Аа 290 295 зо00

Рго 5ег І уз Авп РнНє Нівз І єи Агу Рго Агу Азвр І єи Пе бег Авр Іе 305 310 315 з20

Азп Ма! Пе Ма! І еи Сім І єи Гуз Спу Зег СП Тк ТАг Ре Меї Суз 325 з30 335

Сім Туг АІа Авр Сііи ТНг Аа Тнг Пе Маї Спи Ре І єи Авп Аго Ттр 340 345 350 (510) Пе Тиг Ре Аїа Сп бег Пе Пе Зег ТНг Геи ТНг

355 360 «2105» 20 00о«2115 364 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 20

Ар Гуз ТНг Ні Тнг Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго Спи І ей Гей Спу 1 5 10 15

Стпу Рго Зег Маї Рнє І єи Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр ТНг І єи Меї 0) 20

Пе Бег Агу Тниг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Маї 5ег Нів 35 40 45 25 Сім Авр Рго Сім Маї Гуз Рне Авп Тр Туг Ма! Авр Сіу Маї Спи Маї 50 55 бо

Нів Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Ага Сім СП сій Туг Спу Зег Тег Туг 65 70 75 80

Ага Маї Ма! 5ег Ма! І и Тнг Ма! Геи Ні Сіп Авр Тр Гей Авп Спу 85 90 95

З5

Гуз Спи Туг Гуз Суз І уз Ма! бЗег Авп І уз Аа І еи Рго Аа Рго Ме 100 105 110 сій Суз ТАг Пе Зег Гуз Ага Гуз Спу Сп Рго Агу Сім Рго Сіп Маї 115 120 125

Ту Тип еи Рго Рго 5ег Агу Сім Спи Меї Тниг Гуз Авп Сп Маї Зег 130 135 140

Ї еи Тиг Суз І еи Ма! Гуз Спу Рпе Туг Рго 5ег Ар Іе Аа Маї Сі 145 150 155 160

Тр Спи Бег Авп ау Сп Рго СІм Авп Авп Туг Гуз Тит Тнг Рго Рго 165 170 175 маї Геи Авр 5Зег Авр Су 5ег Рпе РНе Геи Туг Зег Гуз Геи ТНг Маї 180 185 190 60

Азр Гуз 5ег Агу Тгтр Сп Сп Спу Авп Маї Ре 5Зег Сув 5ег Ма! Меї 195 200 205

Ні Спи Айва Г єи Ні Авп Ні Туг ТНг Сп Гуз Зег І єи 5ег ГГ еи Зег 210 215 220

Рго Спу Спу Спу Су Спу Зег Аа Рго Тнг Зег Зег Зег ТНг Гуз Гув 10225 230 235 240

ТАг ай Гей Сп Ї ви Спи Ніз Гей ей Гей Авр І єи Сп Меї Пе І єи 245 250 255

Азп сту Пе Авп Авп Туг Гуз Авп Рго Гуз Геи ТАг Агу Меї І еи Тиг 260 265 270

Рпє Гуз РНе Туг Меї Рго Гуз Гуз Аа Тнг Сии І єи Гуз Нів І ви Сп 275 280 285 бузі єи Спи СМ Спи Ї ей Гуз Ро І єи СП Спи Ма! Гей Авп І єи Аїа 290 295 100)

Сіп Зег Гуз Авп РНе Нів І еи Агу Рго Агу Авр ГГ еи Пе Зег Азр Пе 305 310 315 з20

Азп Ма! Пе Ма! І еи Сім І єи Гуз Спіу Зег Спи ТНг ТНе Рне Меї Су 325 330 335

Сім Туг АІа Авр Сііи ТНг Аа Тнг Пе Маї Спи Ре І єи Авп Аго Ттр 340 345 350

Пе Тиг Ре Аїа Сп 5ег Пе Пе Зег ТНг Геи ТНг 355 360 «2105 21 «-211556 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетична мітка бхНів «4005» 21

Ні Ні Ні Ні Ні Ніб 1 5 «2105 22 «2115 42 60 0 «212» БІЛОК

213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 22

ТАг ай Гуз бегіІ ви Бег І ви бег Рго Сіу Гуз Сіу Спу Спу Спу Бег 1 5 10 15

Аа Рго Тиг Зег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Стп Геи Сп еи Спи Нів 20 25 30

І ен еи Гей Авр І еи Сп Ме! Пе І еи Авп 35 40 «210» 23 «2115» 30 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 23

ТАг ай Гуз б5егіІ ви Бег І ви бег Зег бег ТНг Гуз Гуз Тнг Сп І єи 1 5 10 15

Сіп Гей Си Нів І єи І єи І єи Авр І ви Сп Меї Пе І єи Авп 20 25 30 «-210» 24 «2115 29 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 24

ТАигаїп Гуз ЗегіІ єи 5ег І ви Бег Зег ТНг Гуз Гув Тит Сіп Геи Сп 1 5 10 15

Ї еи Спи Ніз І є І еи І єи Авр І ви Сп Меї Ге І єи Авп 20 25 «210» 25 «2115 28 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид 60

«400» 25

ТАг ай Гуз б5егіІ ви Зег І ви бег ТНг Гуз Гуз ТНг Сп І ви Сп ЇЇ ви 1 5 10 15

Сім Ніз! еп ей І еи Авр І єи Сп Меї Іе І еи Авп 20 25 «210» 26 «2115 27 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 26

ТАг ай Гуз бегіІ ви Бег І ви 5ег І уз Гуз ТНг Сп І єи Сп Ї ви Си 1 5 10 15

НізГ ей Гей Гей Авр І ви Сіп Ме! Пе І ей Авп 20 25 «-2105 27 «2115 26 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «400» 27

Тиг ап Гуз ЗегІ єи Зег Геи Зег Гуз ТАг Сп І ви Сіпп ГГ еи Си Нів 1 5 10 15

І ен еи Гей Авр І еи Сп Ме! Пе І еи Авп 20 25 «210» 28 «2115 25 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 28

Тиг ап Гуз Зег І еи Зег Геи Зег ТНг Сп ГГ еи Стій Гей Спи Нів І еи 1 5 10 15

Ї еи І єи Авр І еи Сіп Ме! Пе Гей Авп 20 25 60

«-210» 29 «2115 24 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 29

Тиг ай Гуз б5егіІ ви Бег І єи бег Сп І ви Сп І єи Спи Ніб Гей Ї єи 1 5 10 15

Ї еи Авр І еи Сп Ме! Пе Гей Авп «210» 30 «2115 23 20 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 30

Тиг ап Гуз Зег І и Зег І еи Сп І ви Сп Гей Спи Ні Г еи Гей Ї є 1 5 10 15

Азр Геи Сп Меї Пе І еи Авп 20 «210» 31 «2115 29 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 31

ТАг ай Гуз бегіІ ви Бег І ви бег Рго Сіу Гуз Сіу Спу Спу Спу Бег 1 5 10 15

Аа Рго Тнг Зег бег Зег ТНг Гуз Гуз ТНг Сп Гей Сп 20 25 «-2105 32 «2115 28 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид бо «400» 32 бо

ТАг ай Гуз бегІ и Зег І ви бег Рго Сіу Спіу Спу Сіу Спіу Зег Аа 1 5 10 15

Рго Тнг Зег Зег Зег ТНиг Гуз Гуз Тиг Сп Гей Сп 20 25 «2105» 33 «2115 24 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 33

Тиг ап Гуз Зег І ви Зег Геи Зег Рго Сіу Ага Аа Рго ТНиг 5ег 5ег 1 5 10 15 зЗег ТП Гуз Гуз ТАг Сп Ї еи Сп 20 «210» 34 «2115 24 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 34

ТАгаїп Гуз БегіІ єи 5ег І ви Зег Рго Спу Аа Айа Рго Аїа 5ег 5ег 1 5 10 15 зЗег Тпг Гуз Гуз ТАг Сіп ГГ еи Сп 20 «2105» 35 «2115 28 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 35

ТАг ай Гуз бегІ и Зег І ви бег Рго Сіу Спіу Спу Сіу Спіу Зег Аа 1 5 10 15

Рго Авп 5ег Зег Зег ТП Гуз Гуз Тниг ап І еи Сп 20 25 60 «210» 36

«2115 28 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005» 36

ТАг ай Гуз бегІ и Зег І ви бег Рго Сіу Спіу Спу Сіу Спіу Зег Аа 1 5 10 15

Рго Авп 5ег Тниг Зег Тпиг Гуз Гув Тиг Сп Гей Сп 20 25 «-2105» 37 «2115 28 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 37

ТАг ай Гуз бегІ ви Бег І ви бег Рго Сіу Спу Спу Авп Спу Тег Аа 1 5 10 15

Коо) Рго Аа 5ег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Сп Гей Сп 20 25 -2105» 38 «2115 28 «212» БІЛОК 213» Штучна послідовність «020» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «400» 38

ТАг ай Гуз бегіІ ви Зег І ви 5ег Рго Спу Туг Спу Азп Спу ТНг Аа 1 5 10 15

Рго Аа бег 5ег Зег ТНг Гуз Гуз Тиг Сп Гей Сп

Claims (1)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Мутеїн інтерлейкіну-2 людини (ІЛ-2), що містить заміну М91К ї амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична амінокислотній послідовності, наведеній у БЕО ІЮО МО: 1, при цьому зазначений мутеїн ІЛ-2 переважно стимулює регуляторні Т-клітини порівняно з іншими клітинами.

2. Мутеїн ІЛ-2 людини за п. 1, який відрізняється тим, що вказаний мутеїн містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності, наведеній у ЗЕО ІЮО МО: 1.

3. Мутеїн ІЛ-2 людини за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що вказаний мутеїн містить 60 амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 1.

4. Мутеїн ІЛ-2 людини за пп. 1, 2 або 3, який відрізняється тим, що амінокислота в позиції 125 є або аланіном, або цистеїном.

5. Ес-злитий білок, що містить фрагмент Ес і мутеїн ІЛ-2 людини за будь-яким з пп. 1-4.

б. Ес-злитий білок за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений фрагмент Ес являє собою фрагмент Ес ІдДС1 людини.

7. Ес-злитий білок за п. 6, який відрізняється тим, що зазначений фрагмент Ес ЇДсО1 людини містить одну або більше мутацій, що змінюють ефекторну функцію зазначеного фрагмента Ес.

8. Ес-злитий білок за п. 7, який відрізняється тим, що зазначений Ідс1 людини містить заміну в позиції М297.

9. Ес-злитий білок за п. 8, який відрізняється тим, що зазначена заміна в позиції М297 являє собою М29706.

10. Ес-злитий білок за будь-яким з пп. 6-9, що містить заміну або делецію С-кінцевого лізину в зазначеному фрагменті Ес ЇдДО людини.

11. БРсо-злитий білок за п. 10, який відрізняється тим, що зазначений С-кінцевий лізин зазначеного фрагмента Ес дО людини видалений.

12. Рс-злитий білок за будь-яким з пп. 5-11, який відрізняється тим, що фрагмент Ес і мутеїн ІЛ-2 людини з'єднані в зазначеному білку за допомогою лінкеру.

13. Рс-злитий білок за п. 12, який відрізняється тим, що зазначений лінкер являє собою СОбО5 (5ЕО І МО: 5), ООМОТ (5ЕО ІО МО: 6) або МОМОТ (5ЕО ІО МО: 7).

14. Ес-злитий білок за будь-яким з пп. 5-13, який відрізняється тим, що зазначений мутеїн ІЛ-2 додатково містить вставки, заміни або делеції амінокислотних залишків, що змінюють характер глікозилювання зазначеного Ес-злитого білка при його експресії в клітинах ссавців.

15. Ес-злитий білок за п. 14, який відрізняється тим, що зазначений мутеїн ІЛ-2 містить заміну

ТЗ.

16. Ес-злитий білок за п. 15, який відрізняється тим, що зазначений мутеїн ІЛ-2 містить заміну ТЗМ або ТЗА.

17. Ес-злитий білок за п. 16, який відрізняється тим, що зазначений мутеїн ІЛ-2 містить заміну

ТЗ.

18. Ро-злитий білок за п. 17, який відрізняється тим, що зазначений мутеїн ІЛ-2 додатково Зо містить мутацію 55.

19. Ро-злитий білок за п. 18, який відрізняється тим, що зазначений мутеїн ІЛ-2 додатково містить мутацію 5517.

20. Рс-злитий білок за будь-яким з пп. 5-19, який відрізняється тим, що зазначений Ес-злитий білок містить димер Ес.

21. Ес-злитий білок за п. 20, який відрізняється тим, що зазначений Ес-злитий білок містить два мутеїни ІЛ-2.

22. Ес-злитий білок за п. 20, який відрізняється тим, що зазначений Ес-злитий білок містить один мутеїн ІЛ-2.

23. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує мутеїн ІЛ-2 людини за будь-яким з пп. 1-4.

24. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує Ес-злитий білок за будь-яким з пп. 5-22.

25. Вектор експресії, що містить виділену нуклеїнову кислоту за пп. 23 або 24, функціонально зв'язану з промотором.

26. Клітина-хазяїн, що містить виділену нуклеїнову кислоту за будь-яким з пп. 23-25.

27. Клітина-хазяїн за п. 26, в якій виділена нуклеїнова кислота функціонально зв'язана з промотором.

28. Клітина-хазяїн за п. 26 або 27, де зазначена клітина-хазяїн являє собою прокаріотичну клітину.

29. Клітина-хазяїн за п. 28, де зазначена клітина-хазяїн являє собою клітину БЕ. со).

30. Клітина-хазяїн за п. 26 або 27, де зазначена клітина-хазяїн являє собою еукаріотичну клітину.

31. Клітина-хазяїн за п. 30, де зазначена клітина-хазяїн являє собою клітину ссавця.

32. Клітина-хазяїн за п. 31, де зазначена клітина-хазяїн являє собою лінію клітин яєчника китайського хом'ячка (СНО).

33. Спосіб отримання мутеїну ІЛ-2 людини, що включає культивування клітини-хазяїна за будь- яким з пп. 26-32 в умовах, що забезпечують експресію зазначеного промотору, і відбирання мутеїну ІЛ-2 людини із зазначеної культури.

34. Спосіб отримання Ес-злитого білка, що включає культивування клітини-хазяїна за будь-яким з пп. 26-32 в умовах, що забезпечують експресію зазначеного промотору, і відбирання Ес- злитого білка із зазначеної культури.

35. Спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у популяції Т-клітин, що включає приведення популяції Т-клітин в контакт з ефективною кількістю мутеїну ІЛ-2 людини за будь-яким з пп. 1-4.

36. Спосіб за п. 35, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СЮОЗ3- ГохР3-- клітин до кількості СОЗ-- ГохР3- клітин збільшується.

37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СОЗ3- ГохР3З- клітин до кількості СЮОЗ-- ГохР3- клітин збільшується щонайменше на 50 95.

38. Спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у популяції Т-клітин, що включає приведення популяції Т-клітин в контакт з ефективною кількістю Ес-злитого білка за будь-яким з пп. 5-22.

39. Спосіб за п. 38, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СОЗяРохР3-- клітин до кількості СЮОЗ-- РохР3- клітин збільшується.

40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що співвідношення СОЮЗ ГохР3-- клітин до кількості СОЗ ГохРЗ-клітин збільшується щонайменше на 50 95.

41. Спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у периферичній крові суб'єкта, що включає введення ефективної кількості мутеїну ІЛ-2 людини за будь-яким з пп. 1-4.

42. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СЮОЗ-- ГохР 3 клітин до кількості СЮОЗ-- РохР3- клітин збільшується.

43. Спосіб за п. 42, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СЮОЗ-- ГохР 3 клітин до кількості СЮОЗ3-- ГохР3- збільшується щонайменше на 50 95.

44. Спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у периферичній крові суб'єкта що включає введення ефективної кількості Ес-злитого білка за будь-яким з пп. 5-22.

45. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СЮОЗ-- ГохР 3 клітин до кількості СЮОЗ-- ГохР3- збільшується.

46. Спосіб за п. 45, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СЮОЗ-- ГохР 3 клітин до кількості СЮОЗ-- ГохР3- клітин збільшується щонайменше на 50 95.

47. Спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості Зо природних клітин-кілерів (МК-клітин) у периферичній крові суб'єкта, що включає введення ефективної кількості мутеїну ІЛ-2 людини за будь-яким з пп. 1-4.

48. Спосіб за п. 47, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СЮОЗ-- ГохР 3 клітин до кількості СО3-С019- лімфоцитів, що експресують СО56 і/або СО16, збільшується.

49. Спосіб за п. 48, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СЮОЗ-- ГохР 3 клітин до кількості СО3-С019- лімфоцитів, що експресують СО56 і/або СО16, збільшується щонайменше на 50 95.

50. Спосіб збільшення співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості природних клітин-кілерів (МК) у периферичній крові суб'єкта, що включає введення ефективної кількості Ес-злитого білка за будь-яким з пп. 5-22.

51. Спосіб за п. 50, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СОЗ3- ГохР3З- клітин до кількості СО3-СО019- лімфоцитів, що експресують СО56 і/або СО 16, збільшується.

52. Спосіб за п. 51, який відрізняється тим, що співвідношення кількості СЮОЗ3- ГохР3-- клітин до кількості СО3-С019- лімфоцитів, що експресують СО56 і/або СО16, збільшується щонайменше на 50 95.

53. Спосіб лікування суб'єкта, що має запальне або аутоїмунне захворювання, що включає введення зазначеному суб'єкту терапевтично ефективної кількості мутеїну ІЛ-2 за будь-яким з пп. 1-4.

54. Спосіб лікування суб'єкта, що має запальне або аутоїмунне захворювання, що включає введення зазначеному суб'єкту терапевтично ефективної кількості Ес-злитого білка за будь- яким з пп. 5-22.

55. Спосіб лікування суб'єкта, що має запальне або аутоїмунне захворювання за п. 53 або 54, який відрізняється тим, що введення викликає зменшення щонайменше одного симптому зазначеного захворювання.

56. Спосіб за п. 55, який відрізняється тим, що співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у периферичній крові суб'єкта збільшується після введення.

57. Спосіб за п. 55, який відрізняється тим, що співвідношення кількості регуляторних Т-клітин (Трег) до кількості нерегуляторних Т-клітин у периферичній крові суб'єкта залишається, по суті, незмінним після введення.

58. Спосіб за будь-яким з пп. 53-57, який відрізняється тим, що зазначене запальне або аутоїмунне захворювання являє собою вовчак, реакцію "трансплантат проти хазяїна", васкуліт, індукований гепатитом С, цукровий діабет | типу, розсіяний склероз, спонтанний викидень, атонічне захворювання або запальні захворювання кишечнику.

59. Спосіб контролю відповіді суб'єкта на лікування мутеїном інтерлейкіну-2 (ІЛ-2) людини за п. 1, що включає детектування у зазначеного суб'єкта зміни, причому зазначена зміна являє собою: а) підвищення температури тіла, р) збільшення концентрації С-реактивного білка в периферичній крові зазначеного суб'єкта, с) зниження кількості тромбоцитів у периферичній крові зазначеного суб'єкта, а) зниження кількості нейтрофілів у периферичній крові зазначеного суб'єкта або е) зменшення концентрації альбуміну в периферичній крові зазначеного суб'єкта, при цьому після детектування зазначеної зміни зазначене лікування припиняють, призупиняють, зменшують частоту дозування або знижують кількість введеного препарату.

60. Спосіб за п. 59, який відрізняється тим, що зазначена зміна включає: а) підвищення температури тіла щонайменше на 0,5 "С, р) збільшення концентрації СРБ у периферичній крові зазначеного суб'єкта щонайменше на 0,2 мг/мл, с) зниження кількості тромбоцитів у периферичній крові зазначеного суб'єкта щонайменше в 0,8 разів, а) зниження кількості нейтрофілів у периферичній крові зазначеного суб'єкта щонайменше в 0,8 разу або е) зменшення концентрації альбуміну в периферичній крові зазначеного суб'єкта щонайменше в 0,4 разу. . чі а янв 350 де ар велаМато ! Е і 00 м, | з всваМиУ Фосфо-СТАТВ зв. Р : ре вовзмню (Сі1Ф . : п шк; ) юю до -ендт З - ру пам 150 5 Ем х пнєсовар во й Ск свнней : ! Б а а А м ї м СО

ФІГ. 1

ФІГ. 2А по ЕОХРИ СОВИ св ГОХРУ СА дет нижжиьЕижиЕаажнжАаовтнчтТчТчТчлтичиннншнинниї м дх чоснимддмнлжжнжажннжлжнЕачанннни нити : ко : код му во що 5 о ре : зи ве : ра ! ж 5 В он же о | н в5ю луки. вк аж бр даю. СУ НИ 9, вт і 800000 орно Во су З З Б Раш 5 І в и дн В Ди яка: ї а ! в за ї ке Ка Ка: Ко 2 : ї й денна Ото ик пиктмх що: КМ ж і Ї 4 "У рр Я з аа и МИ Й за і Шедея дес ой сосни в онко лю зоблоюю а 4л0 ле нюрнхюю Канц. ІЛ-2 (ям) Кани: 1-2 (Му зни ЦІ е НаМг ня наб МЕ НІВЕ НІВ ей ІК зе ПОВ ее ВОК ав -В2ОН ЕОХРА СО 00 ВОХрРУ:СОг яз ЗБК: Же Мк щю: Не ' во о-дйю я Б Ко баю. ЖЕК, БА Ка Р ав 5 : г д і в. гу прах Во. Ееу Ба и В ЯК ат о де РК і Ж Я Р, а гм : ще «є дя | 8 зя, й й «ден бно «тоні | в он хе, м ж ЕЙ шт рост Н «а рей зем М с дю. меню нена

Фоз. 0 мю об нюбо оо ае зооюзоюрі конц. ІЛ-2 (ПМ) Ковц. 1-2 (ВМ) -ДТ зона еде на ее ОО наве МОЗА се ДВК ей ОВЯН Осн 57 «ве МВВК чг.2в й ЕОХРІ СО с ЕОХРІ СО ЗУ пет сю р Ї г ; К цу нор ше шко ри в дити оо не, Ж в о зви и НИ дин, ! МД - ! й аю жи і ще ІК ши вс о я ЕЕ з : п г шеья г. : п ри рих і Во Я о /й Ж вв. зи жи ії Я ки Я в : С г Як мо у ек я ! 8 ' ї «Ж п як і К-Я : -е не «хи ! ши ши ДИ ная бю: в. ЗВ ні Шо хх Й ! вся ов оо не ою здоб Зою а 0530 зл зоро Зою Кониу а (ПМ Кону. 1-2 (М) міс ДТ пяуєенацмт ее Нар з жу НН ак кн ния ве нн ЕН Ве по -- ОКР що -- ОКИС Маю: ; р. Бошю по «ї Н и й ІН «- КУ я Кі Ма; Я й в Н ве і й за. миши и Я Я Б ба ї Та хи і г ж г Яршжй ве Е КІ и мит ! Я Е Зі А б ЩЕ. жи і ЕЛ й : 9: а | бе у Ж : бо Я ! а сот о ї С ВК Я і 5 Н Щи ОГО я Б р я ж ї МО Я Ж й У і хо БИ Я - о і ож 100 МО зо юю 800090 0003000) Кон ІЛ-2АМ Кониу. Щ-2 (вм) -- ДТ сере на ет: наб - УВІ оно и ЕК ші кита: БІ Ина й З же МВВ

9 ОВОХРІІ Бай р ой й кою сра й Р | «оенащт жк : НВ х Н Я здо: ой м рота най в й шу: я я ЇЇ «ав Еснесвамун-нівЕ о зо ! де | те ЕсНеї ваміцту- ОК ті Е зо шо Се -ЕСНеї пами? Мао в Ж Й Ії рек «фе ЕСНнЕ Вами 1 УМ с шк: ЖИ рон всневнаматт УТІК ї- А. З З х а Е: З я ж а Ж о У шов У до о У З пива о пива о ПАТ о 0000 яОхКРХх : сов ди е З та 4 ог зар й Що і ж с содг ; | У ШИ оч й 8 3060 В я здоб Ж вд ра ВЕ у ай в Ж А000 ай и що Н пари Я вхо ТАК ою. І ж, Бк й ей Ж ж «евов Е У ух во Ї с --к Ж с-ай - : А а М ож Я а ж охо КЗ и У СИС с-й ко Ку Ей с СИ я н- Ф т

ФГ. З Бл а ДЕ нн нн нн зов ; Мк су, я | нт Й : нею у Я аб Нац ШО Я й УЧ г : Її я! Котов ї-ї- це х х ї Е - у шо 20000 2 і й Гоян всНеє пами НІБВЕ "- : Її за І! ! Дію / а ШИ 000 -жетснемвамшєовак Ї х ІЗ І 5 : КГ: є ч х І я зе-Еснепаїмиє?-МЗВО мезги з ка ; с - ; ; З м іх К : я ЕснеспамМц-УЗІМ ши Же ЕК АНІ пк во ОВУ а ТО ян-вснеєвамиєт ува о БМ 0000000 сжетснеєвамит вія А МИ НЕ НИ НН А ИН к5 СЕ ВО ОК

ФІГ. 4 бо тт ; - «006 ЕОХРЗ С4 зе. сей І: Я ". Зоо | і лу зни ДІ ДА в» 3009 | , | нар Бе Ж ГЕ зн / / Гоняевомох ОО зо йе щі ша І и т Ре Намині У9ІК ЩО вою і НЕ юю -е-БеМаВО

98 . пи, ша -ж Бе Нами МеВо б В из НЯ здоа Ї 3 нн | псхе Фередовище 8 Олям о лом о іїйом о З000М о їнмо Збнм б З хо СД уплдтувор вн чання 2 | й З г ВЕ о КОХРЯЗСОД свя г | . о Б зві ри б : ях боозюо ВЕ о

З Я. ; Ж гу і Й я

Ж 5. й р ж | / НК 8 вою | Й ож х и ЦЯ ; х ж НИ йони НЕО сани ПОКОАМИВОнн бОлам оїаМм о биМ о зЗОбам їмо лом

ФІГ. 5 збою попа зво ІК ту о: / «нн дннж, з В | й | сін ДТ 2 прое шу фонем 5 во. , Е ЙО --я УВІ ою: й й й як 5 зб: /л | -ж Ренаматьучік зво: у х | -е-рРоМаВО щоб ще й | -Жж венами мо д | засних з Ве с вин з ЗК А СИ і В и ВИНО АНЯ С А А НИ НН у г) но «й я і що с яУ

ФІГ. 6

ЕОХРУ від'єсТ СОКСЮЗ Т-клітин Експресія РОХРЗ а РОХРІ» регуляторних Т- кпітинах (Трой 5 б «Середня інтенсивність Фпуореоценції) -? т ж У Зо

40 . ч є . КА са ов Ж зо я Я во в ї і а У ДУч чобовя я й по 5 2 З ж я Фе ів - "В чкож 9 ж кожи Ф ждав. В и. Ба г ; 184 є ово і Й щі е кі солоне 5 -- їй в Гак! я жк Ек) ж СЯ г) 2 а 93 ті т - 0 є а В - - у Я во. 0 Ф Ф а Я ща Фо Ф Іа ж ши ся ж ж ж ож 5 в ощж Е х З 2 - г с с Р «о І ри я - ж « щ ш ФІГ ТД о ОХ СПА СОЮЗ від загальної к-сті ж ОХРІСОА СО" від загальної к-сті 8 лейкоцитів периферичної крові лейкоцитів периферичної крові

4

В. їх Фе з Ф й Ж о а ;з бо жк 2. : їЯ я Й й ж Ж заважати шій чи ие КЕ а й г. З Ше ше: о а я ної ж Ба - 8 «де . " є б й кол пи вав 8 нн п Ме) мо м цов- ш ве ох м ве ОО хх в ке що Фо оф г "в о Ф Ф се п в ж а 2 ов т з нин но ш З ж ш я 5 й - І рез 23. - - 5 З Із 8 т ж - Ку в та не КУ т

ФІГ. тв

ФР. 8 з РОХРУ від кості СОВА СО Т-клітин Експресія РОХРЗ в ЕОХРІ» регуляторних Т- клітинах (Тов) зо «ооо (Середня інтененаність флуорасценц ш ж к 15 ай «ке ік. : Вк ж й г ши а кя же « п: я і6 Кк , Ба и Ж , ее ес і ши ше М «о є я ж "я а . б ак о ; сяк й и че глй х «и «У БОХРУ'СОЖ СОЮЗ від загальної к-сті Я ЕОХРУ СОУ СО від загальної кості лейкоцитів периферичної крові дпенкоцитів периферичної крові 8 на -й ще 755 - за- т г ж е в Шк Ен Кт х Б и ? кА з вай ж щи «І- ї Е вс іо че ак З Кк «за а Кк Уж ак ж -к - ж й ж і й вот ФА некстнннернннннтреніннтт є а З «2 Ж ху - СЯ «т М и « «У цу чех

ФІГ. ЗА Селекція СОЮЗ» СОде то 4агодини «уз Я ОДУ еетттееве ту У еш г че ши ? тс, Не шся Й ше В ше Й Н Ес м ї Й її Ес По? наспиийний поверхні ' ї Бе. 17.2 на кпітмнній поверхні з 3. в «Ж я ї в Б ї | ее зує й їх ї їх й: Е ЩЕ : ії: з Якої лу юю : | Ен я о 1 нн о е ко я а КО Кео дж Се КОМЕЮи . п В Й Ї ви Цю їй Б п 4 кое їх я я сх х Й ІЗ ме з Кк повне ково вовка ник; подана ка до с х :ЯЙ З і М тк перо т - сер сет ї В Н Я: З ДК й у чий з 3 МЕ їб 1 й ЕН щу 553 я за Я Щ и сіння плнннтю т йе й й спон се г: ї ие . 2 !

ке. мя ї Бо І-й мажкпітинній поверхні о б. МТ на клітинній поверхні і КЕ ; й. ; : ще аж Її ві 205 ті «БЕ ше й й хЕ пак ен 1 БІК АВ А ЕЕ ША у М вик, ої з ЕК кн я оо т і ЕЕ (г у Б й їх п і п - ДБ й ей фени зай пи ЖЕК Н оо че пз їв ож я ї' я і її - оп: що. не 5 нн що сяяли ВК ОД . се дин . ИН ре. УчК І. тр. ьо наклптинній повархні З Е Ре Ша накптинній поверкні з ЗТ 1 тож і т Ж : т ї ї : НО : 5 - : її -- с пес Ж х х и ток: ва з сля : я. росло КБ й ї . ща ше ще сен п. г а ИН и ен З АИИИНННЕ ша 00000 Б й Й ше 00 Що тя Ше 1 1 а я ВИХ я щі . і Я що «Джі жн нене нання ро «фон З іорнну нена уереантнсяченння фАнтитто які -е че що с м за! м во пи щи нн НН их над

ФІГ. 98 450 тиШШ2Ш225ВА о шо ЩО,

Що. м па ЕС.М88О | ! 350 п З явЕсМВКО в зоб ! М ! : : Я ! і го а шк піп СОгод. обтод. Я4Ягод. бгод.о ПОН.

ФІГ. 10А рн ! Вр гетніюнт по ол вия о ВН Е ща 10 нки ті теекеої нене Ж: Дня і ваги я сно зво кОм Ж п. ще ВЕ і те . пи Ба До ем Ж Моска В. шу ОДАтояю і Ж Бик ув ве З Як хо ви о причи ше пошее ох С кт Ї 5 вх де соч ше Щ я СКУ е і 7 ш- ше кор не 4 ї Ко шк ння З нн ВІ і Го оо тиж: ідо ння кожне, Ве, Ї фероуютичувю ї і ання 5 є я: ШК МИРНУ ТК Е уя В пт т тджиакт

КЕ. Б м пу УУеКг - Ж. й ЖЕ і Е | Ще: ШЕ Ше Я. опр хв : : Н ще ЛЕ з п МИ МОМ КЕ НИ і ж І Ом ля са 3 Що у : це т. ЩО ГА ; Не: в їх те ітд дкиххідитьтій вженнм ТОЇ НЯ пд у вклю п пре ДЖ дини Й В ї т Е - рен В Я пн НН В є Ат пи ши ки нах пк щих Ще Ж ! я ї Ї в НОТИ ще ще 5 : ло І Боно ЯК ОВ ще пит уж ж туї ї Ух піччю ж хенмІй уж піт йАТ ЦІ мі Кує Ї Те Ех : ї- Я ЗМ отсемжо ж МОВ ! т оч ія : Кофти ан кох Я че о сани ще ек м же пеммтчюх Он ес чек: іч Шах Ск : ї Е Сінево КВ НЯ и жк ї ! фону чинити ше пЕОЙЖ ох Кот : пен ин Е от тв ням хво : й ч Ку «5 я ТТ хх ккд Ж т, ! ї Ба 53 ТЕ її гу 5 Какую пуер дотик дк укіхнть 7 Малік їх т ї й 5 : І Доба Щ й й і за Доба і їв і во КР М. сеухтюуьної хнтекттів, БАН в до В Р униснавниєствнки вою і ЛЕК жи щи жк нн пи Мк : Бо) миріжети шик ше Н а их КЕ жк УВА нене ТОДІ фо моло нання Тож Я. ох Н нн ія у ше ша. ие сви ще і То зов, шк: КО АЩЕ т кажі доб МИ ш ин и Озон 5 шо тан бони і ессо й і ще 7 пет жрия фей щ ще їй Хх Ж їчй ТИ де отв В і в То сб 45 Ж в а и З Н роса ; и ЖКТх тт их куютя. нк с я щі тих кудмн ока ем 5 й 7 Іа ях А ге що я Е Я . тен тет Ай потен ДКВУ Й че п А роя Дав ЗО МН Л.Н ІВ Б: жоя й Св рю па ен я ин їй рожі як нуля пам трятя пи і 8 В дей МИ Я нин г Б кою по, ср НК з КАХ їі нен куй о, НИ З ння іони р ДЕ МУ З і няння ТЕН ОО ве ме і а 0 ьХ в ї гдодкоціхї І Мк со клин ОА фо иЯмі і Е ОК лк йо ей З ї І ж г ох І 5 ФЖ пюекуноте За Тит ЕЕ: ши и й В і і лину скін нені нт вух Е й імя кон пи у рю я ван Ж дош ЖК ОЛЕНИ, Ну ЖОВ Яке МІН меру ї іон я ех ния НИЗ Др темат умі рим кіля скуче кучня дм уми, - й і М ЕС й Ї її зе БО ланежгв в. пулньііня лей МЕ В ях З зх фу же пана нн С а ЖЖ няжуююяхння ше інн о ЕВ сел рено, КАЖАНИ ше о а Й тА: ЗЕ пня ше ие Бо ьо: ие; "ж шини гне ум НО зон Я Бе вони що і ман ник ; о і ї доня Тина Го ання ння не і ФУ пелена АК жі Я КД нин ЕЕ: ї З з ММК ун Н ту вем: жи вн дк Доба пов Доба '

рент Н ігвнейєти ШКО 0000000 з ото і ЕТнсндити я ПМК! з ї- 10 рн фд пнинтнннту а а а: ши -ї і кит ві дя Же і х ЖОМУ : Доречі Пил: ; їх в шо ЦІ ень Я Ши нен в фену іти Ж дея зт о; ; ун гешейва х певне кати з ід ит. мк Я або ТТ а в от я яЛИТИТТЯ ко речи АТ ЗЛ Їє мой возом ТІ, В зу ше ТЕ я шо ПАК ЛИДує тет ЕЕ ше ко омажт «ЕМВ 5 5 я УК ще ЯЗ и Н рову тк інн Жоододннннннння х ан ЩО ЩІ » 1 ЗІ Е: ТОСВ ми лах, пн ння В ї пні мо м в З я 1 ЩЕ : ко ї інн ЩЮ 5 з тс В 35 г й з из Ї ко ою ШИ о З ЕВ ення шви оф пови ек У ня По Є нм о ан Пн 8ово тво ТД, - Т7нидуєтьти Б і якою й 84. З З В і еп ані 5 іш вия в 1 нин ших Нанея во фенічнтнк денне ил ЩЕ 5. у шие ї рн «Коня ! ОХ ів яви поенчененнся 8. І яд нн 5 : ій їй п стю ЩЕ ІВ, х ШЕ ях го ЖЕ сет ре Щ о я во Н шк Е ке фіналі.

Я й х селждткі р дотннвєкнж ет зкклгити з вони інт А ' кни ж ИЙ очЯ ; й пр увищи КК 5 : Мовою в іклдлеттяятттяни і форт Наш Мо З рутья яте ЕЗ вт м пстонтврнтсттвн нотний з і пет, с можна, соя |В В тмовожожоя в ! Жде дух іт Я енитентяя нови шен ре Що 7 1 ОА 2000 ї Ме ша плярвніхій їх МТ» : ї ї кни Гой, щі ше Хжилотилл Щ ї ндввнновнниск а птн збив, ПОТЕЕлУ Шошжхиутя пола. і т теня мая Я 4 і ТВ рн ванн ни | Ялти ке Лв Н 7 Й ша яз житя санки Ки шоскфекни ТУ е х ; дання туя ! но Сн реа й з нини вання. і у ух а з й ЖЕ За Я у Доба ноой в вх Дт пеня й 5 Інн Монтеня ст ди доба шо з нд сенс пднлтеттня - п НН ИН 2 ОТ М С ОО Доба

ФІГ. НА

Її. чек МЕ М фо сжеєіню усю В се каву : ОБ ожину. ща і Заяві: ЗАККАЕ: ЗБ кое Н яке: ЗО МКВЙЮ Зк Я Ї зняв й ек, ех Я Б г Пропейкін в оспоков.овбу оком : Є ДС : ву їн : ОК о я і хар; ге То из Феї ж й место дя Кі мі Ми Бе Ж мери її ке : і і Бо т фени тот тя г кутттутт у тюукетеутт З м ї г з 15 х М : їУ Н мож ол т т- ен мн о А Треки В Я Зіка Ку Н а НЯ: же ї Е.ОЖА Ді як жан Ж. Н

Ге. Неон тмежр Вони Н Зежженті ВАЖКЕ лих вхо Ку, : ще того НЕ: НЕ ВИН ї х Н Б | СОофожтнккі й і ТК БО км ї х і ї. пе й Н Н Ач 1 мк НУ що зх. ше а гу і: шо ! у Я : АК ї : в Ян реч ни й НЕ рт. ЦЕ: п и в м А в Кп В и ОА б еко х х БУ хі Ж Якої м х 22 КЯ 4 Я АЕН х ї Наше і Ж ни х обся хі ня - З ВЕК АК МЕ ве Коврфне хв ЛО МКгме ОО че : не її те МІ : а : г У КОТ : я ї пе НН и в о нн в ж НН, т и ре Ох тт ме лом Й : що ВКА Н І ці у З УК їі зи НЕ НИ вк пак В, СК в рн! Я: й і; ія Деко гу о Км з (ВЕН сода й Б кт кв и пи і ДВ п КК ото коошА ОВ он КОКО лЯ одро сдй пупннтттт тА кттст і Конт АЖ ект Клін, Знані тіні тн Ат чні В у спі уетткіні пні нти ШОК фол омкюту т пехме хумк ую кути ЦЕ смт ит уих кутку Аж Микити Б ВИ ше Ком фа тні їшілу СВАЯКОЖЕ ЗИ МЕИКО БО фуздв і ІАКя, пап ОЇ о фенету я беж х Н пор пон ні мером дитя у ИжНя, ВНК ОЗ ен ННЯ ще Пропейкін ї Гак От НЕ й З й и. Е ІЗ Ше» В : Кк Боя ее ще ст їі Ї ях : Н З о ї ж НЕ ЯК ве І роя 3 ви СА : йк их Уся ТЕ з Ме ин ІРО ше й І г | Бен ше. СН Мзаашй І й КЗ ку Гохкаккюлвчнк інеті жен нажеачнининй ОТ фета ужелянувувсия йякимянк В ектинмююжанмні вій ШЕ : ВИШ Я С во шо їн Мов У ЕК доро нин м но в оса ми оно онен о рив ЗО вдчетку, З гоп Де. дИФмиК : й п Яе явля ТК НВ Мо жов М фр могу а ї ши КК ОА Н у ху: МКК : І т оф - Я п НЕ Заіка НМУ ї їх ї - ісянейис її чи ії услкнечкі 4 Ек ІЗ 5 пали! Ганні і пе НЕ знане : х НИ ту А Ох Н х Е Н 7 м з где Н Ї х я Н КЗ - г Н о -Е : х у : Ше и шІишШШ Ш Е з кокон Шаккй тка яки ок п : ем (й сором В 5 З, фекекцан кн авккннне вуз. ДМ Жила тлекьтр с ення Гой М ШЕУ т мово ог з м п ві й Ж вп іо ри мирно метро ОВ вкрив Кун дж юну З лях я ї ОК тай теж ТЕ : 5 ПМ Ах Ге бо СЕ мкг ї г ; й мк : З М т сикглкі НК ся й Тане Тк ше З Не НЕ: рей поли ЗМО Бош З уюжуют В може 1 й а ж сиве ше и нн ШЕ ВОД ШИ корт Со юдюві В БСИУТ Яд БО ЕИТЕМОВ ля Не Кн еВ ЯМ З Ш Н Ж їх і . НІ - НШ Ж ЕН же и с. ПКУ М ж, я Ек ї :Х со і о нн НОЯ в т Н Баш со Н : а Джек ужити рук ДТ п ннчктуючиккни па Го немен ченко Кк нн крнєхкнякя Е Н хх що Ж 7 ТЕ їй КУ ХА 12 М, Її п т лі У пднкоєдеттетнт ее інтеттютттовевеектстю нтееорінятеттяе тет ТЕ ее тет НКТ т Нет ноттоеек вон

ПЕТ рн й пит певну Н іван деталі я дай М дО ку 7 хе я Се ія фОСТЖУК че ши ропейкін я Сак ях КЕ ето р ї 7 ев И яву Н ЕН ня КЗ Н со й їх ти м. ї ї зві плоске чні Кт Ж.

Ж. хів р Мир о цито Пожкаї їх Не : з їх а Че ї УНН їх Н ле Ії ше еВ БИ В ? і їт-ї Н 2 х Н ня г й 4 : В ї ав тел. йо: і Б М о ї ї пхвр бере кину Зомей срок шен й КО Е е 5 Діву сно м пи ОКО че ке ее я ї і КАнння ЩІ що є щ Пет 1 ї я. но в У: же з «х вен 3 с мегко ви Ж Е сс мнньний Ж В сс Пн : г ев соми тутекжк нн ОС ще НЕ шо дуття ЖЕК ще чи " : м Тед? щих вен я т. МЕМ, 7 ро ; ННЯ МНН ем Ве ах Н дити с не 7 о маю З ве я КЕШ ож я фе и сосках І Хо чех паху єю Ж їв кі сф Бош шо пеутрдентятя лю Мюррей я і ї ду КУН ї ще й пес Сена р ох МУ ї " й й : К 7 я Сх й Боно : жк І У Ї Ба ж ЩИ не ж : х | ЧК о- АЙ. 2-52 тях; | се З однини і ж пи ро «Вр З яєнляенюний, іразяиті оо оленя шт я в. о т ткітекух х я ш піна ки я А 7 Во їх ц уроку 2 і і :жМшши Сех є і ї зехужетеув тя ЕК З со : Ка ще їх ; путі ух нях й. і зи с й ї Ж нку шою яка: скгіже і. 1 дкхнкА ЇЯ з ї М Я Мини клани, - М леж між Кб нет СУ З я слккжнию «Ж кеусех ; Мих Кожна : шия СН. смуток " х в не их ах поліг З : хз КАК хрвуєух Її Кир: ких реву т СБК) че ? Баш уєітутенї МДЕ ІМИВ Коен 5 БЕ ї С яенкнев Я ох : - Я ВЗН | півні : А : ї би ИН й 5 Її ваш ЯТх о гене 7 дистленкх ще на ж ак сеніетнтя зма. ОК рана кН з шк ЦЕ х « зош хх М Н Я я Щай їх г р ко с МИША Ке БК ж ! . і не вет Е и : -- жк каш КОХ 023 кл п Кк 5 : МиФ Ки: хи о І с ІК - У мазі З Мо ї отак КОМ че вх кх Є і дошки д вужча й баню їх" пай мч г У-а Н

-. З В й хмліомінкий І Ї З : як я кох т ї й - щ 7 ул очея ї і Мука посли М; дитини В с їх. х, щепи й Я щі Кн же Е вея унаннн Най МЕ Їли у МК міміхе Н я-- й ме : послав - кон ссвкнтнннй Її Ж ролей пряжки вк Зиеще З Птн їв ки їй я пененіннннн ї шк СК т-б 022 ПОРТ НЕ р ше че Фо КО: режне : « й є КН Горіх» Ще охо пекан : й боти і лих жо пи віко пені нииВю 7 рових п, ТЕЖ ; дове ВИЙ й я іє «ож ЩЕ киян і Її вет УА в Еш ЩЕ ши 5 ? НИ шк й ли НЕ Що о : В, о кет Я; Й МУРНЕВВ ! Мх : Е Як х Е підете Е сени п, ї ї пет ! ІМ мя уми юввоюй Кне 1 5 шення ке пИоишн й я ж Е ШК в г ПУТ й й п Ку 1 пе 1х меси 7 КЯ т лин Ще тей ин: ПОМ я шк т Н по : теор ІКУ С ТИМ ПОЗ МИКе РО тет й їй теки Е КУ 4 ТИЛ ї що Ол й : ПІЦОТЬКВ пінетки и й й в у ; Я а Пік інтен котлет що й і лиж жо роя мое нення - 15 я я піти Н ря в матйю о Зс т - ання з : ля і Ву --к збо меске г й і сот кдикх. х Ех Н Я: пен й Й ї де БУЛИ і Я сх і 53 дк ект. СИ тв і ї піл 5 ; ше денім 5 ижнср ще пох, ШЕ і о ше пеня сш знанннн я Ася в Ярі Пе тимния ше: т Кв дане й ТЕ жннмі В : ях КН Ки КЕ б шк Кия сх а У печення шк ІЖ і щ З Нд. ; ан нен е ве пікету 7 : в т Заехлів. о ие Ша Тут : КОЖ: ПМ КО пам і Колот ме моді МІ: ПТО ОТ і І ва Афонін Що - і і; 1 Кк ня і свнййннкя В і НАаНви удо я т 5 Криму . ї і Комі г Топ мне ї «1 нен ме Е : ; В хОБзчтнюя : іх до що ї й і дв : я зве ж А ешнюетн : т Кт ї дин нік ях ен ку КЕ мкс текжєтетнн ті І-ї «жит, яз й ни ідетдаон ЇВ о У У ЕН з не ее пихи Ж турки ее т ТЗН Кк -п У СМ Іден писку Кок Юма ; аоо ОНИ - р Проплейкнх 5 хлє М й тА : пан сни - - ї ке ой фор Горова виді ТЕ пиниуяняніх - Н Щі їе о |. Тов НО ИН: є ї : т їж ц НН ях т й Ї я пох ви В : Ка В Нас Же х ваз : в кри З Ооойж Бо й Іі ЕК ї х за, йони, ї і Я У С че З ЩЕ икидо Ки її : Еу ге юю КО; ІЗ ї 4 і 9 Докечктювнктсті ке У вед : ТА гі зх ій А укижкк датовані їй ; чи Кернел й я. є щ

. тов сонній : і Хуст НИ во К- Ж туди ни та сеяняеннн 2 1 стик їй о НЯ онко в НИ хх Кз рн ноннанння і Бк зі 5 ше иа нання ! З щі Кржяжнт хо таж М ше Ши Що 7 це кчначиракнккьчня З ой о лЛедуц т золи ї пе й е зх Нй Ж сама п ї ; це Н | Сн у нннненкяня ше са ж сем ши я Я: ринв ї пня МИ тя ее і й т. Ж х Н ря Кі З мкРке н нс В 5 дент шо з х. Ї тут Вих ка ЗМ НМ ї НМ і соку; НЕ часних ну Е : ЩЕ жо щої сн р-н ик, ке ; гу іш шик о Бас ізн Аз с код й, их Те Е ї «і и ді живи : ай я чо ВЕК Я о ! х з ежемаунункя ї кт Уж і пт Є Кот Н ; дою : й дзсемй ск Канн дж У ЕК УУМем и щк Фе маш Ганни : нн шк в 5 рн ЩО прот ук учАчтАХ нях їх с пібвнтнтссовяені З ще В ІІ за стелю пише и чн і; р я В й каієт . туя щи дченнеюиной ДЕ Їсе щІЗ т те тки Її УМХ 7 т ім Ге я сич Ве . Е іплухх ща 1 ск | ї : ОН МЕИття що Би хг 4 ов і: рок А чи м пиття ї Гая чиї пп дачні Н Н й ен и доб куг : Ї іо буденна лоту і Кк ! Ос і зга : Пажнтттеннн Код ще їх : : т Й пк нене : що кі ї нон иок й тня я : рентні 7 у. нн пає а Я хх КУ ос 1 ком Її є : у ст і - пити с ща т ! ПЗ дент ку Пн У сн сніжки і Ж д ДН : с ісіе новин З їз з зай і Е п ово как, Зб тир Я вул т зх Н ще іже ни БО би КВ Е уро . і щ ролей МАМІ ща БО ЛИН НІ ін --- М севле кунжут куютття чн. ОЙ М НН Кох. ВКМ їх ман зи Н 5 Я оон шк ї Ей ж ож т ДО ЖКВя ж т і 5 па Тло, нан ОЛКЖЖЕ т. і Я їх і фливо: тем я Ме А вас, я я че З й Древо вк ск : і Сешк ї і бах шк МТМеК Ку хі ! ге й ПИВО зом но жа. НЕ : Ей я; іх ій у ан їй що поло - годе і КЗ Дол Щі ї ще она ньки З і нн сс с я. и Н -к ня їх : КО ву рик я й і. ЕЗ ек ен х їв КУТУ ся й й у х рек у питних Бо -ї МУКУ ск зу і о бшяжедц песисхк ворони св В поета І їз ОК У мейоітнтхжте у й цї й ск ук пліви І щі Те ж 7 Ук. Я А У : піка же. -- Бе у Гжикя НЯ по ження ї й те Й м їх 7 5 ЯК ж ца сам Я пи ще ОТ платне інно тя , Я х. Бо фр СК ванн

1х . ! ши ан мит о М: ККУ - БулятневІй 1 вон ЗЕ х Ол ТИХ МЕ ї Яга В й хх я ; ; - у хо - в гель УТ и от Ди І їх Ка ін Н Ко 1. Думки ока тах Мами ї й р ш чн році - сееичж і іт, дини по 4 мах вож ик п її х а У пи доня лежно не ї є А

. ! ; є : щ- паж Як. 5 В орипенишгя ! ї: жовч 8 Ей соків стих пра І 8 Еш миняехві Є пи свнютя ее Я ще і Та к пити лит й лк З пімйоливиь Бо з за ОН Мія му щі я соня Крах БО гор рр вв: Змиглт Не р | 7 їх екв феод Де . 1сбмисл ї теиопЕнеЕНИ щи м. -. 5 ЗМОВ 2 нн З мок ОБ дор ння їж З 5 Кк х гра . ей я р що : ї п ей опуЖКоКЕ ще - х- ! ; ше зопченія і ! Й Тож : У й ше а ТІВ : Н Н а салс кни ТО си ож Ж, і; ІЗ шо лі Ж - і я еклери о я І т ТУ Кк: що РЕ нак "дл буйна ке То жу ї НЯ зеипненннннх ЗХ Бинесснтту тк: СУК і їй їх я Дню септктнкит ЗАЙ тк А см Н Бу да ; понти Й о Я тенет В Ме шк е

Ж ря річн й п - дод ї- як ЗМК нен А ша коса дк шо щу пе Зомай і Й Ол Пролейкі сих в ДЦ і в ШИН ні зе и ші : ща клон ЩО У - ШИ я! - їй : 3 Ул Не А ох ме т " з ші ї 2 ЗА Михелтнв: о ї ль Гуз вві З | Її а ї ж ен З ВИЗ й КН Х : око К. | й ля : й тн Т, - 5. її ї я : г, м й 1 г й сно ДШмданяння Ще ж | л З 15 й лева єтю еваво й ни у , ух | ій : : те І КЕ . З аи ях Ї - зи З т Ще и ха й й Б й й Чл я 7 дис Б й вч; п Її й вх Ух гренненисвй а, ка с 1 г дина нини й 4 й иа пон З нн ІВ : / / | і г ж ЗТ кий пт зт ш Ф пре РАХ віття хе тоб якої щ : в Н 1 ще З спжетжя КЕ і М : нших Е і й Ж ЛУК бик і "й дже Я З Ж дю і и Е - ; : їй Н ї Годни мя! ЩІ ТЕ скін КІ -х ї Я : х 5 її це вм! З ме і | ! я рт зво Мке 200 ї ! З ше і Годин у но З Н : ! хі : я І шия , й га н й і р я Ії : ще й ху. і прхдйня НИ ще : й Еш ГА) дсх не кіенувя тан сей КО, -е щи чі з яю учня : | лк І КІ ; М сеееенняснй ї ; с - - кл, З п З й : давня - : ех, з! фін ши! менти че їй й Б 7 їй і; сно кій датю калюж мкс те й б 7 й ЖІШЕ. зклеклєжсяркінняя, 2 й Й г ГЕТЕ ре Й ЖИ У мий І 50 дхутх й і ТИ АТ ся БОЛТ пл мя 42 і екон й й й не СН ек ню вкл ОКО. ШИ : і Е: ї Кох і ж тн Е ши їй ї ї ша ов шк Яб'мкпкк ОП маг ої ВО миле о в ! зарети о и, 1 їв І. Й є 1 КО сонне зу тв Е | ся пошани ще - флак кутя з. ох ; я ПИ « ши.

Фіг. 11 пи Еш син - АД й " : - Е Б НЯ й пе я вер с ин ее шк ех х пня ОБ 5 : Не ЗЕЛЕЖОЖВО п : п БОЖА не ТЕ, ПЕК» зе Я то Ол Ї Те сірі х жу зни ОО Е НЯ Ку я . ропейкн,: що я сн ШОЗЖЕИ ре НИ та ж пит їх р роза шн ЗТяХ шо ШИ йо Се Й й. : зчишид п но 8; за пів т й щи рем : ще пн решт, пл якої Жов, - Й ми ДЯ ; є сення ' нд жу уж Я йо в ї 5 ж ях ян я ! що щ. пи Бе пн юс вябв віх у

А. о й ОВ : НК я й як гра Па ро ; ше я ми ши Я з и ТЕН де ЩЕ 5 евбянея Я в і НН ї іп М ТЛ А й Яд "Як оокх Е дю зе бло й їз т шк Бе вику я ово й іовасвя ! ш дим помах а зо са ї Е фетр ее, МЕТАЖ НВ ви ЗК в Коен я сля КН ТЕН ЕШЖВ Хо х оч й я | С ПИТ духу бежева Я вх «Конні Кох ої 1 що : шо тя ках Бдж я пе шт ! Н я пи рі пак я пох й Ще клин: Б й ких ЕНН ИН ще КМ шо с Бо Я кнфеін Пій лйеняя ша І74 х дув ху Її віх. їх Н ха ПИТИ ї: вони тех ї рак ОВ ЗУвкла НИ сер НЕ пен бан цюютх 5 їКі Я ж и кан а а ш ще ща ши собаки о й й веб «в ви коле: ВИ : ри Н Ж шк ПЛИТ ТЯ век щи : - т, ! в я їв : І що а в Ге У ух в "ді : ві Я гр Б вд ЕВ йон :ї ! ше БЕН птн о и й що, й довші ЧЕК я «ост д С пил ! ік ПОЛЕ ще о ій ї шини Уамізііжаю ЖЕ в бендиютяя ші Ен я оті жіакую В ІВІШОИ Мфшеутштр ки й й й де Ба ее І - вв ІВІЖ: Ек ЗЕ їн Ще СО сдкодню ис шок ЗЕ ! : чктня з же ння ЕК: ап ї Не гий оз хто Не І Я ре НІ денно ї ОСИ о ее 7 по. де хі ке ІМЯ ВЕВ ї пеки. рих й РО СРЛИМ пер наНт ться нн ик ДМЯВО спав КАН не ше с ШИ М

1. У НА їх х, ВО в щ М х ИДТИТиХ пен Е ! Аг во ЗМ шок 5 в. | Щ і 4 Оки я мя ще ші бу сних не і ; вер» вда Я аж ЩІ їй : ваше МО од НЕ і вени ШІ й с їй шк й . : ОО МО ОК, т. жк ІЇ ! к кі 5 Ж щи А бив 108 не Ши ше шЕши ще БИ і пе НН Ба шо нене нт : не шо : Пре ікімциЕ ОЛОВО. НАІЩІ они : ший о Біжи й СТЕКТНКЕ КІ, Р днттнтутттчннннтн тин ртутні нні днтттятьк т п тн кінтжж іти нні киликижнн днкнкня орати т па й - КТК мові ян ї ие: інно вівтьт

Фіг 7 - нано! Ж прп третя юними сюттттянннннту СВК ото теле теля кед тет меру я їожев ди ові, Я : ! ша й свід ренннюю, х У г ек ння 5 ровно мк щи МІЖ Ж ежнс-ВОкЕ Ре ії Е ЕАЖ іс є їх і Пролейкін я души шин нии як . же Її Бе і сс В р ч ши І з СД м айснунх дав, КО ЕВ ож ення ес: насе жи й стелу теж х А є: (сон вертей НИ Тени Я ік їй і Зник зо о ші ЗО мкг з і икун ді щи ба юки ше ШЕ: хо М рим р м а і Я оц пд тт тт тити тт ОЙ окдолІЦодтИ тт ит титани і шив пре, ЕВ нн Кк. : -- ід інн Вів орди : ї є ее 5 1 ВН 1 ях Е ЕХ Дня ВИ, 1 Яябд маш сю зняв і З Е Зйжо люто З мюке ХО Я суне ввї і Я 1 ОЕ овасамеюр КО я 1 в ті ши пі и шу (5 сряттрнН т Мет зро Ок ВЕ ово занн НН: НИШНН Пенн нин се ШО 44 І 5 Ж ій Ка її а НЕ БУ т за У т ЧЕН зуп тут иттннтнктнтттннтнтнттвнеетння НКУ, руси чт ктенненмнететнненнх задав ря ЕККр ж. А СЛОб'яеккг. ад Я ши . з ване вк Й оожек лен, і ше живі Я ро ие дяді я і ї БІЖ о флалтекоі ку Я, ТО лоб дияхікєван 4 х БеподмаВО) лина ша з х У Е; 7 у ї КУ За й Е з де Б й Ли й Пе іх г ши гли дж дк х - АТО о Ху 4 да мое зас а -еї кА ук шля У -ї Я ї Вр жу ія не х т з : ШО В уп нний боже «оо ЗО иКоКК Ж.О лОбоаюкт Ка у ди ване НН МН 2 я ЗМИВ МИМВННИ нан,

ад. ат Не Е чи т ь-Я ха «у 5 ж я. ТЕ дя я ЗМкскттини Я СО РОХРЗ-Т- кпїтини ей СОдь БОХИЗ їх клітизи у Пролейкін гад В ЕсПАДМОТКІ З до ЕеНАМВВІ й щ ТЕ в топлене | т жк 5 Ж в о у Е о (вда | я Й є 8 Е е ї о й 5 ва " БВ ! 5 ї- рЕгк о - Е. З й Ж : хе па сів» г 9 па "о З Бо 5" Б ло з Б ж в : а їх а є і - 5 ж о - - в і в ш ; же Ся Ю в іч ре нан шен заз; пивна ная т Френе я Е Е й Е й : Бі я 150 РЕД! за 160 оз зо 10 д Мене м ТДХГ г сі Мк х йкі. -к щи ; пк й й й як ко Провенкін з фе келії Кк) ков Бе гМВЯОЇ о Ж щ Тв, ді) ох ЖОЖ о Км о зо ОО в ЖЕ ща ек 8 Е Е вв рі хо Б. В за Бо зо Е З м бик вах че Е Ка З дю ЕЯ й 28 гЯ мл й т зв Ї в І Зо ! з Е з и Е я я і й ї Її є Що я є зни Ех Ж оощо Е сш г: еЕ її 5 5 шо ли: са се вв в се клина Я 1 16 чо з зо 3во кі 16 о Мкгінг г Мікгже ж Мікоку

Фіг. 12с ехо вннн ЯКЕ Збільшення СР (А мг/мл) «фе Збільшення темперетури піди А с вище ЗАС -х ех те Пропейкін кофе Вс АННОЮ 28 В дв ЕсЛЬ-ТІ МОВО за 5 Я (трів, 5дю) Я 0, во. гя В х ю ; ж шо 5 З Е ай Е 28 в Е 328 Б зо 55 «в 5 З ю 5 е ; ее ки ми 155 до» птд з Ед 5 о ше зв3 о ча З л- ща ш Ж шо Зб 8 зе Б Б 555 55 5 хх є ; БЖ ж з ; вх ж 5 8 я ; я як за г ов нн я у НН с зв : вої во Ко ї0а поз 36 Що ЕН 38 тов ї З Мкикг Е- влкіткг ше Мкее - й ч Зниження кисті промбоцитв

ФІГ. 120 «дм Зниження каст найтрофідів:

«р. Зниженнх конц. альбуміну че Пропейкін яй оч Еслі-з(МаТ Кк) вв як Бе. П.А НОВОЇ во ж и р/д, 5діЄ) а с до 2 хо Хі х 2 ЕЕ т Ж ш ЖЕ щ 5 а г в б щі " во В Ес к аб ор з ба ж З З жо Зо: в - З ге їз є каш е Я ш Ка) з Я би а хм ва що же ГУ Е я Ж ж ЖЕ Еш Ей І Кая р Їх Її ю та є ле й жі" З їв і 7 Ка і 4 - т 5 я 38 й в З ча шо 4 8 і я що шк з 100 і чо що Ве олюиїКг ш Мигіке Ж Маг Група 1 Група? Група З Зо мкгукг я. БО мкг/кг п, БО мклкт пл. Ага, і Бвоначення ДЮА лі: ДЕ ВО паю ВИСТУ а ТОБ АПАХТ як ММ ЕОДОВ ТТ фбнаначення ДОА: З З БТ Я З АСДх аю ПОВ їгеЗ «ке ЗА ААХ че Я теВ зе ТЕСТ зак ПЗ лк я А те з ПОВ ТУ са ДЕ ТтВИ пад ОБ шк: ві в Бо в я о т- с у хі к 2 ж В ж ков ев хі А ва в Дж ше те веб, ЛЬ вовк: Гм ою ва КК ет й вва - КЕ ко їй Тож о Ж Е 35 мя АД, ; 8 Е - : я Ї шкі 5 Е ві 5 я Н ще че т с. Ж ОО бен 5 ше тих З ав рову ж в з і ше; че ши ши ше шик ще, и 1 КЕ 8 Я й. ні Якшо Я я жах й ге ї М ча Ж ши тя жо жк го пишна і і. є і. 1-5 а ле: НК 9 б ж що жо бос 485 юю З б щщ Зо 5 здв Бо в ж м З а ок в ТО ле | КО лова | З мк Повторна зунізація