TWI837517B - 抗claudin 18.2和cd3的雙特異性抗體以及其用途 - Google Patents
抗claudin 18.2和cd3的雙特異性抗體以及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本發明係關於特異性結合Claudin18.2和CD3的新型雙特異性抗體和抗體片段以及含有該雙特異性抗體或抗體片段的組成物。此外，本發明係關於編碼該抗體或其抗體片段的核酸及包含其的宿主細胞，以及相關用途。此外，本發明係關於這些雙特異性抗體和抗體片段的治療和診斷用途。
Description
本發明係關於特異性結合Claudin18.2和CD3的雙特異性抗體以及含有該抗體的組成物。此外，本發明係關於編碼該抗體的核酸及包含其的宿主細胞，以及相關用途。本發明還關於這些抗體和抗體片段的治療和診斷用途。
Claudins是一個蛋白質家族，是構成細胞緊密連接的重要組成部分。它們建立了控制細胞間分子流動的細胞間屏障，可控制細胞之間分子的流動。Claudins家族蛋白具有四次跨膜結構域，其N端和C端均包括在細胞質中。不同的Claudins蛋白在不同的組織上表達，其功能的改變與各個組織的癌症形成有關，比如Claudin-1表達在結腸癌中並且具有預後價值，Claudin-18在胃癌、胰腺癌高表達，Claudin-10表達在肝細胞癌中高表達。Claudins作為細胞膜表面蛋白，是各種治療策略的有用靶標。
Claudin-18的同種型2(Claudin 18.2或CLDN18.2)是高度選擇性的細胞譜系標記物，其在正常組織中的表達嚴格限於胃黏膜分化的上皮細胞，但不表達於胃幹細胞區。CLDN18.2在相當一部分原發性胃癌中表達，並且在胃轉移的癌組織中保留了其表達水平。除胃癌以外，在胰腺癌中也發現有CLDN18.2的
表達，是治療這些癌症的理想的靶標分子(Singh,P.,Toom,S.& Huang,Y.Anti-CLDN18.2 antibody as new targeted therapy for advanced gastric cancer.J Hematol Oncol 10,105(2017).https：//doi.org/10.1186/s13045-017-0473-4)。
關於胃癌，2014年，全國胃癌新發病例約41萬和死亡病例約29萬例，幾乎占全球發病人數和死亡人數的一半，且仍呈增長趨勢。但是存在大量的未被滿足的臨床腫瘤治療的需求，因此開發靶向Claudin18.2的藥物十分必要。
CD3是與T細胞受體複合物(TCR)結合的在T細胞上表達的同型二聚體或異二聚體抗原，並且是T細胞活化所需要的。功能性CD3由以下四種不同鏈中的兩種的二聚締合形成：ε、ζ、δ和γ。CD3二聚體排列包含γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。已顯示針對CD3的抗體在T細胞上聚集CD3，從而以類似於藉由肽負載的MHC分子參與TCR的方式引起T細胞活化。因此，已提出抗CD3抗體用於涉及T細胞活化的治療目的。此外，已提出能夠結合CD3和靶向腫瘤表面抗原的雙特異性抗體能夠將腫瘤細胞和T細胞銜接，從而直接活化T細胞，釋放顆粒酶、穿孔素及細胞因子殺傷腫瘤，從而達到抑制腫瘤的治療目的。CLDN18.2在胃癌、胰腺癌、胃食管交界癌等高表達，因此可以藉由開發同時結合CD3和Claudin18.2的雙特異性抗體來實現治療目的。
在一些方面，本發明提供了雙特異性抗體，其中該抗體包含兩個結合結構域，其中該第一結合結構域特異性結合CLDN18.2，且該第二結合結構域特異性結合CD3。
在較佳的實施方案中，本發明的特異性結合CLDN18.2的第一結合結構域是全人源的，和/或第二結合結構域是人源化的。
在一些方面，本發明的雙特異性抗體是IgG樣結構的雙特異性抗體。
在一方面，本發明涉及以下實施方案：
1、雙特異性抗體，其包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域，其中第一抗原結合結構域特異性結合CLDN18.2，第二抗原結合結構域特異性結合CD3，其中第一抗原結合結構域包含如SEQ ID NO：4所示的A1-VH中所含的三個互補決定區域A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3，和如SEQ ID NO：9所示的VL中所含的三個互補決定區域A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3；第二抗原結合結構域包含如SEQ ID NO：30、22或32所示的A2-VH中所含的三個互補決定區域A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3，和如SEQ ID NO：27所示的A2-VL中所含的三個互補決定區域A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。
2、實施方案1的雙特異性抗體，其中
第一抗原結合結構域包含分別如以下胺基酸序列所示的A1-HCDR1、A1-HCDR2、A1-HCDR3：SEQ ID NO：1、2和3，以及分別如以下胺基酸序列所示的A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3：SEQ ID NO：6、7和8；以及
第二抗原結合結構域包含
(i)分別如以下胺基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO：19、20和29，以及分別如以下胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO：24、25和26；或
(ii)分別如以下胺基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO：19、20和21，以及分別如以下胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO：24、25和26；或
(iii)分別如以下胺基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO：19、31和21，以及分別如以下胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO：24、25和26。
3、實施方案1或2的抗體，其中第一抗原結合結構域包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區
(i)包含與選自SEQ ID NO：4的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含選自SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：4的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中；和/或
輕鏈可變區
(i)包含與選自SEQ ID NO：9的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含選自SEQ ID NO：9的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：9的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
4.實施方案1-3中任一項的抗體，其中第二抗原結合結構域包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區
(i)包含與選自SEQ ID NO：30、22或32的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含選自SEQ ID NO：30、22或32的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：30、22或32的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中；
和/或
輕鏈可變區
(i)包含與選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
5、實施方案1-4中任一項的抗體，其還包含重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。
6、實施方案1-5中任一項的抗體，其為IgG樣結構的雙特異性抗體。
7、實施方案1-6中任一項的抗體，其中該抗體的重鏈恆定區來自IgG1或IgG2或IgG3或IgG4，較佳的IgG1。
8、實施方案1-6中任一項的抗體，其包含2個重鏈恆定區，其中一個重鏈恆定區A1-HC與第一抗原結構域的重鏈可變區A1-VH相連構成與CDLN18.2結合部分的重鏈，且另一個重鏈恆定區A2-HC與第二抗原結合結構域的重鏈可變區A2-VH相連構成與CD3結合部分的重鏈，且包含2個輕鏈恆定區，其中一個輕鏈恆定區A1-LC與第一抗原結構域的輕鏈可變區A1-VL相連構成與CLDN18.8結合部分的輕鏈，且另一個輕鏈恆定區A2-LC與第二抗原結合結構域的輕鏈可變區A2-VL相連構成與CD3結合部分的輕鏈。
9、實施方案8的抗體，其中A1-HC可以與A2-HC相同或不同，和/或A1-LC與A2-LC相同或不同。
10、實施方案8的抗體，其中與CLDN18.2結合部分的A1-VH和A1-VL是全人源的，且與CD3結合部分的A2-VH和A2-VL是人源化的。
11、實施方案8的抗體，其中與CLDN18.2結合部分的重鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；和/或
與CLDN18.2結合部分的輕鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO：38的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：38的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：38的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
12.實施方案8或11的抗體，其中
與CD3結合部分的重鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO：41、39或42的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：41、39或42的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：41、39或42的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；和/或
與CD3結合部分的輕鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：40的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
13、分離的核酸，其編碼實施方案1至12中任一項的抗體的輕鏈可變區或重鏈可變區，或輕鏈或重鏈。
14、包含實施方案13的核酸的載體，較佳地該載體是表達載體。
15、包含實施方案13的核酸或實施方案14的載體的宿主細胞，較佳地，該宿主細胞是原核的或真核的，更佳的選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如293細胞或CHO細胞，例如CHO-S細胞或HEK293細胞)或適用於製備抗體或其抗原結合片段的其它細胞。
16、製備結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括在適於表達編碼實施方案1至12中任一項的抗體的核酸的條件下培養實施方案15的宿主細胞，視需要地分離該抗體或其抗原結合片段，視需要地該方法還包括從該宿主細胞回收該抗體。
17、醫藥組成物，其包含實施方案1至12中任一項的結合CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段，以及視需要地一種或多種其它治療劑，例如化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫檢查點抑制劑或激動劑)，以及視需要地藥用輔料。
18、藥物組合，其包含實施方案1至12中任一項的抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種其它治療劑，例如化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫檢查點抑制劑或激動劑)。
19、預防或治療受試者中腫瘤的方法，該方法包括向該受試者施用有效量的實施方案1至12中任一項的抗體或其抗原結合片段、或實施方案17的醫藥組成物、或實施方案18的藥物組合。
20、實施方案19的方法，其中該腫瘤為癌症，較佳的，該癌症具有升高水平的(例如核酸或蛋白質水平的)CLDN18.2，例如該癌症為胰腺癌或胃癌或胃食管交界癌。
21、實施方案19-20中任一項的方法，其中該方法還包括向患者施用一種或多種療法，例如治療方式和/或其它治療劑，較佳地，治療方式包括放射療法或手術，或者治療劑包括化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫檢查點抑制劑或激動劑)。
圖1顯示了HB37A6抗體特異性結合細胞表面的CLDN18.2。
圖2顯示了HB37A6抗體不結合細胞表面的CLDN18.1。
圖3顯示了HB37A6抗體與胃癌細胞系NUGC-4、胃癌細胞系KATO III-hCLDN18.2和胰腺癌細胞系DAN-G-hCLDN18.2的結合。
圖4顯示了HB37A6抗體在胰腺癌小鼠模型的抗腫瘤效果。
圖5顯示了HB37A6抗體在胃癌小鼠模型的抗腫瘤效果。
圖6顯示了CD3單抗Hzsp34.24，Hzsp34.87和Hzsp34.97在細胞水平上的結合親和力。
圖7顯示了CD3抗體Hzsp34.24、Hzsp34.87和Hzsp34.97的T細胞激活能力。
圖8顯示了顯示了實施例中使用的雙特異性抗體結構示意圖。
圖9顯示了本發明的雙特異性抗體特異性殺傷CLDN18.2陽性的胃癌細胞NUGC-4。
圖10顯示了雙特異性抗體特異性殺傷CLDN18.2陽性的胰腺癌細胞DAN-GCLDN18.2。
圖11顯示了雙特異性抗體對CLDN18.2表達陰性的細胞沒有非特異性的殺傷。
圖12顯示了在NUGC-4中雙特異性抗體依賴的T細胞介導的細胞因子釋放。
圖13顯示了在DAN-G-CLDN18.2中雙特異性抗體依賴的T細胞介導的細胞因子釋放。
圖14顯示了CLDN18.2表達依賴的雙特異性抗體介導的T細胞激活。
圖15顯示了雙特異性抗體在NUGC-4胃癌人源化模型的體內藥效結果。
圖16顯示了雙特異性抗體在DAN-G-CLDN18.2胰腺癌人源化模型的體內藥效結果。
圖17顯示了雙特異性抗體在小鼠中的PK。
發明詳述
I. 定義
在下文詳細描述本發明前，應理解本發明不限於本文中描述的特定方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解本文中使用的術語僅為了描述具體實施方案，而並不意圖限制本發明的範圍，其僅會由所附申請專利範圍限制。除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者通常的理解具有相同的含義。
為了解釋本說明書，將使用以下定義，並且只要適當，以單數形式使用的術語也可以包括複數，並且反之亦然。要理解，本文所用的術語僅是為了描述具體的實施方案，並且不意欲是限制性的。
術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。
如本文所用，術語“和/或”意指可選項中的任一項或可選項的兩項或多項。
如本文所用，術語“包含”或“包括”意指包括該要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由該及的要素、整數或步驟組合的情形。例如，
當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
本文所用的術語“CLAUDIN”或“CLDN”是決定細胞間緊密連接結構的最重要的骨架蛋白，其參與黏附連接，並且在腫瘤細胞的轉移和侵襲中起到重要作用。Claudin蛋白廣泛存在於哺乳動物上皮和內皮細胞中，其分佈主要是上皮細胞側面以及基底細胞質膜上。不同的Claudin蛋白在不同組織中具有各自特異性表達，其中Claudin18(CLDN18)基因定位於3q22.3，分子量24kDa，包含261個胺基酸殘基，屬Claudins超家族成員，其蛋白結構包含2個細胞外環和4個穿膜區。人CLDN18或Claudin18蛋白的兩個亞型分別是Claudin18.1或CLDN18.1(UniProt ID：P56856-1)，和Claudin18.2或CLDN18.2(UniProt ID：P56856-2)，在二者蛋白的一級結構序列中，僅N端信號肽至細胞外環1(Loop1)結構的某些位置的胺基酸殘基上有所區別，尤其是在細胞外環1上，CLDN18.1和CLDN18.2僅8個胺基酸不同。CLDN18的兩種亞型蛋白的種屬間序列同源性也非常高。其中CLDN18.2的細胞外環1在人、小鼠、獼猴等不同物種上序列完全一致，而人與小鼠的CLDN18.2蛋白同源性達到84%，表明CLDN18.2蛋白序列極端保守性(O.Tureci.等人.，Gene 481：83-92,2011)。CLDN18.2或其任何變體和同種型可以從天然表達它們的細胞或組織中分離，或者使用本領域熟知的技術和/或本文所述的那些技術重組產生。在一個實施方案中，本文所述的CLDN18.2是人CLDN18.2。
本文所用的術語“抗CLDN18.2抗體”、“抗CLDN18.2”、“CLDN18.2抗體”或“結合CLDN18.2的抗體”是指這樣的抗體，該抗體能夠以足夠的親和力結合(人)CLDN18.2以致該抗體可以用作靶向(人)CLDN18.2的治療
劑。在一個實施方案中，該(人)CLDN18.2抗體在體外或體內以高親和力結合(人)CLDN18.2。在一個實施方案中，該(人)CLDN18.2抗體不結合CLDN18.1。在一個實施方案中，該(人)CLDN18.2抗體與表達CLDN18.2的細胞結合而不結合表達CLDN18.1的細胞。在一些實施方案中，該結合例如藉由放射性免疫測定(RIA)、生物膜薄層干涉測定法(BLI)、MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)或流式細胞術測量的。
本文所使用的術語“CD3”指表達在T細胞上作為多分子T細胞受體(TCR)的部分的抗原，且其是由下列四條受體鏈中的二條鏈所形成的同源二聚體或異源二聚體所組成：CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ。人類CD3-ε n(hCD3 ε)包含UniProtKB/Swiss-Prot：P07766.2中所述的胺基酸序列。人類CD3-δ(hCD3 δ)包含UniProtKB/Swiss-Prot：P04234.1中所述的胺基酸序列。在一些實施方案中，本發明所述的CD3是指來自人或食蟹猴的CD3。
本文所使用的術語“結合CD3的抗體”或“抗CD3抗體”包含特異性識別單一CD3亞單元(例如ε、δ、γ或ζ)或與其結合的抗體和其抗原結合片段，以及特異性識別兩個CD3亞單元的二聚複合物(例如，γ/ε、δ/ε和ζ/ζ CD3二聚體)以及與其連結的抗體和其抗原結合片段。本發明的抗體和抗原結合片段可與可溶性CD3、結合CD3和/或細胞表面表達的CD3結合。可溶性CD3包含天然的CD3蛋白以及重組的CD3蛋白變異體，例如，缺乏跨膜區或另外不與細胞膜結合的單體和二聚體CD3結構。本發明提供以較低或不可檢測的結合親和力結合人類和食蟹猴CD3從而能夠激活人類和食蟹猴的T細胞的抗體。在一些實施方案中，該結合例如藉由放射性免疫測定(RIA)、生物膜薄層干涉測定法(BLI)、MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)或流式細胞術測量的。
“細胞表面表達的CD3”一詞，指一個或多個CD3蛋白，其在活體內或活體外表達在細胞表面，使得至少一部分的CD3蛋白暴露於細胞膜的胞外側且易接近抗體的抗原結合部分。“細胞表面表達的CD3”包含包括在細胞膜中的功能性T細胞受體環境內的CD3蛋白。“細胞表面表達的CD3”一詞包含表達作為細胞表面上的同源二聚體或異源二聚體(例如，δ/ε、γ/ε和ζ/ζ CD3二聚體)部分的CD3蛋白。
效應細胞包含效應T細胞(T淋巴細胞)，例如CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、Th1、Th2和調節T細胞(Tregs)。效應細胞還可以包含天然的殺手細胞、巨噬細胞、粒細胞、漿細胞或B細胞(淋巴細胞)。
術語“多特異性抗體”是指至少是雙特異性的抗體，即該抗體包含至少第一結合結構域和第二結合結構域，其中該第一結合結構域結合一種靶標或抗原且該第二結合結構域結合另一抗原或靶標。因此，根據本發明的抗體包含對於至少兩種不同的抗原或靶標的特異性。根據本發明的抗體也涵蓋包含多個結合結構域/結合位點的多特異性抗體，諸如三特異性抗體，其中該抗體包含三個結合結構域。
雙特異性抗體形式包含IgG樣和非IgG樣抗體(Fan等人(2015)Journal of Hematology & Oncology.8：130)。最常見的IgG樣抗體類型包含兩個Fab區域和一個Fc區域，每個Fab的重鏈和輕鏈可以來自單獨的單株抗體。非IgG樣雙特異性抗體缺乏Fc區域，其每一個抗原或靶標結合結構域可以是Fab，也可以是單鏈可變片段(scFv)，還可以是模擬兩種抗體的可變結構域的融合蛋白，不同的結合結構域藉由肽接頭、化學偶聯、非共價鍵連接或者其他方式連接到一起。這些形式包含雙特異性T-細胞銜接子(BiTE)。
可以使用任何雙特異性抗體形式或技術來製備本發明的雙特異性抗體。例如，具有第一抗原結合特異性的抗體或其片段可以與如具有第二抗原結合特異性的另一種抗體或抗體片段等一種或多種其它分子實體功能性連結(例如，藉由化學偶聯、遺傳融合、非共價締合或以其它方式)，以產生雙特異性抗體。可以在本發明的背景下使用的具體示例性雙特異性形式包含但不限於以下：基於scFv的或雙抗體雙特異性形式、IgG-scFv融合、雙可變域(DVD)-Ig、四融合瘤(Quadroma)、杵臼(knobs-into-holes)、普通輕鏈(例如，具有旋鈕入孔的普通輕鏈等)、CrossMab、CrossFab，(SEED)body、Duobody、IgG1/IgG2、雙作用Fab(DAF)-IgG以及Mab2雙特異性形式。
如本文所用的術語“接頭”是指使得能夠直接連接雙特異性抗體的不同部分的任何分子。在不同抗體部分之間建立共價連接的接頭的實例包括肽接頭和非蛋白質聚合物，包括但不限於聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇、聚丙二醇的共聚物。
根據本發明的術語“肽接頭”是指胺基酸的序列，其中該序列將抗體的第一部分的胺基酸序列連接至抗體的第二部分。例如，肽接頭可以將抗體的第一(可變和/或結合)結構域連接至第二可變和/或結合)結構域。例如，肽接頭也可以將抗體的一部分連接至抗體的另一部分，諸如將抗原結合結構域連接至Fc結構域或其片段。較佳地，該肽接頭具有這樣的長度，其足以連接兩個實體，其方式使得它們維持它們相對於彼此的構象，使得不妨礙期望的活性。
肽接頭可以主要包括或可以不主要包括以下胺基酸殘基：Gly、Ser、Ala或Thr。有用的接頭包括甘胺酸-絲胺酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)nG，其中n是至少1(且較佳2、3、
4、5、6、7、8、9、10)的整數。有用的接頭還包括甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物和其他柔性接頭。
根據本發明的術語“價”表示在抗體分子中存在指定數目的結合位點。因此，術語二價、三價、四價分別表示在抗體構建物中存在兩個、三個或四個結合位點。根據本發明的雙特異性抗體是至少二價的並且可以是多價的，例如二價、三價、四價或六價的。
如本文所用的術語“結合結構域”是指雙特異性抗體的結合特定靶標或抗原的任何部分。結合結構域是抗原結合位點。結合結構域可以是例如抗體或免疫球蛋白本身或抗體片段。這種結合結構域可以具有或可以不具有獨立於BsAB的剩餘部分的三級結構，並且可以作為單獨實體結合或不結合其靶標。
在本發明的某些示例性實施例中，雙特異性抗體的每個抗原結合域包括重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL。在包括第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域域的雙特異性抗體中，第一抗原結合結構域的VH、VL或CDR可以用前綴“A1”表示，並且第二抗原結合結構域的VH、VL或CDR可以用前綴“A2”表示。例如，第一抗原結合結構域的重鏈CDR(HCDR)在本文中可以稱為A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3；並且第二抗原結合結構域的重鏈CDR在本文中可以稱為A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。類似的，第一抗原結合結構域的重鏈可變區VH在本文中稱為A1-VH，第二抗原結合結構域的重鏈可變區VH在本文中稱為A2-VH。第一抗原結合結構域的輕鏈CDR(HCDR)在本文中可以稱為A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3；並且第二抗原結合結構域的輕鏈CDR在本文中可以稱為A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。類
似的，第一抗原結合結構域的輕鏈可變區VL在本文中稱為A1-VL，第二抗原結合結構域的輕鏈可變區VL在本文中稱為A2-VL。
術語“抗體片段”包括完整抗體的一部分。在較佳的實施方案中，抗體片段為抗原結合片段。
“抗原結合片段”指與完整抗體不同的分子，其包含完整抗體的一部分且結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段的例子包括但不限於Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2；dAb(domain antibody)；線性抗體；單鏈抗體(例如scFv)；單結構域抗體例如VHH；雙價抗體或其片段；或駱駝科抗體。
術語“抗原”是指引發免疫應答的分子。這種免疫應答可能涉及抗體產生或特異性免疫細胞的活化，或兩者兼有。所屬技術領域具有通常知識者將理解，任何大分子，包括基本上所有的蛋白質或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組DNA。如本文所用，術語“表位”指抗原(例如，CLDN18.2)中與抗體分子特異性相互作用的部分。
與參照抗體“結合相同或重疊表位的抗體”是指這樣的抗體，其在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該參照抗體與其抗原的結合，反言之，參照抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。
與參照抗體競爭結合其抗原的抗體是指這樣的抗體，其在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體在競爭測定中阻斷50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗
體是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定。
抑制(例如競爭性抑制)參照抗體與其抗原的結合的抗體是指這樣的抗體，其抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該參照抗體與其抗原的結合。反言之，參照抗體抑制50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的該抗體與其抗原的結合。抗體與其抗原的結合可以親和力(例如平衡解離常數)衡量。測定親和力的方法是本領域已知的。
與參照抗體顯示相同或相似的結合親和力和/或特異性的抗體是指這樣的抗體，其能夠具有參照抗體的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%以上的結合親和力和/或特異性。這可以藉由本領域已知的任何測定結合親和力和/或特異性的方法進行測定。
“互補決定區”或“CDR區”或“CDR”是抗體可變結構域中在序列上高變並且形成在結構上確定的環(“超變環”)和/或含有抗原接觸殘基(“抗原接觸點”)的區域。CDR主要負責與抗原表位結合。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。位於抗體重鏈可變結構域內的CDR被稱作HCDR1、HCDR2和HCDR3，而位於抗體輕鏈可變結構域內的CDR被稱作LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一個給定的輕鏈可變區或重鏈可變區胺基酸序列中，各CDR的精確胺基酸序列邊界可以使用許多公知的抗體CDR指派系統的任一種或其組合確定，該指派系統包括例如：基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883，Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))，基於抗體序列可變性的Kabat
(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(在萬維網上imgt.cines.fr/上)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。
例如，根據不同的CDR確定方案，每一個CDR的殘基如下所述。
CDR也可以基於與參考CDR序列(例如本發明示例性CDR之任一)具有相同的Kabat編號位置而確定。
除非另有說明，否則在本發明中，術語“CDR”或“CDR序列”涵蓋以上述任一種方式確定的CDR序列。
除非另有說明，否則在本發明中，當提及抗體可變區中的殘基位置(包括重鏈可變區殘基和輕鏈可變區殘基)時，是指根據Kabat編號系統(Kabat
等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))的編號位置。
在一個實施方案中，本發明抗體的重鏈可變區CDR按照如下規則確定：
VH CDR1按照AbM規則確定；並且VH CDR2和3均按照Kabat規則確定。
在一個實施方案中，本發明抗體的輕鏈可變區CDR按照Kabat規則確定。
在一個實施方案中，本發明抗體的重鏈可變區CDR按照如下規則確定：VH CDR1按照AbM規則確定；並且VH CDR2和3均按照Kabat規則確定；且輕鏈可變區CDR按照Kabat規則確定。
應該注意，基於不同的指派系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含該具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統規則或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。
具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR(在同一指派系統下)。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子
部分。正如所屬技術領域具有通常知識者明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。
術語“Fc區”在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈的CH2和CH3的恆定區域，該術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。天然Fc區域能夠和免疫細胞表面的不同的Fc受體結合，從而能夠引起CDC\ADCC\ADCP效應功能。此類效應器功能一般要求Fc區與結合結構域(例如抗體可變域)聯合。在一些實施方案中，Fc區被突變以增強其CDC\ADCC\ADCP效應功能。在一些實施方案中，Fc區被突變以削弱或刪除其CDC\ADCC\ADCP效應功能。
“IgG形式的抗體”是指抗體的重鏈恆定區所屬的IgG形式。所有同一型的抗體的重鏈恆定區都是相同的，不同型的抗體之間的重鏈恆定區不同。例如，IgG4形式的抗體是指其重鏈恆定區來自IgG4，或者IgG1形式的抗體是指其重鏈恆定區來自IgG1。
“人源化”抗體是指包含來自非人CDR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基的抗體。在一些實施方案中，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的CDR(例如，CDR)對應於非人抗體的那些，並且所有或基本上所有的FR對應於人抗體的那些。人源化抗體視需要可以包含至少一部分的來源於人抗體的抗體恆定區。抗體(例如非人抗體)的“人源化形式”是指已經進行了人源化的抗體。
“人抗體”或“全人抗體”或“全人源抗體”可以互換使用，其指具有這樣的胺基酸序列的抗體，該胺基酸序列對應於下述抗體的胺基酸序列，該抗體
由人或人細胞生成或來源於非人來源，其利用人抗體庫或其它人抗體編碼序列。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。
如本文所用，術語“結合”或“特異性結合”意指結合作用對抗原是選擇性的並且可以與不想要的或非特異的相互作用區別。抗原結合位點與特定抗原結合的能力可以藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或本領域已知的常規結合測定法如藉由放射性免疫測定(RIA)或生物膜薄層干涉測定法或MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)測定。
本文所述的術語“治療劑”涵蓋在預防或治療腫瘤，例如癌症中有效的任何物質，包括化療劑、細胞因子、血管生成抑制劑、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫抑制劑)。
術語“細胞毒性劑”用在本發明中指抑制或防止細胞功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。
“化療劑”包括在治療癌症或免疫系統疾病中有用的化學化合物。
術語“小分子藥物”是指低分子量的能夠調節生物過程的有機化合物。“小分子”被定義為分子量小於10kD、通常小於2kD和較佳小於1kD的分子。小分子包括但不限於無機分子、有機分子、含無機組分的有機分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模擬物和抗體模擬物。作為治療劑，小分子可以比大分子更能透過細胞、對降解更不易感和更不易於引發免疫應答。
本文使用的術語“免疫調節劑”指抑制或調節免疫應答的天然或合成活性劑或者藥物。免疫應答可以是體液應答或細胞應答。免疫調節劑包含免疫抑制劑。在一些實施方案中，本發明的免疫調節劑包括免疫檢查點抑制劑或免疫檢查點激動劑。
術語“有效量”指本發明的抗體或片段或組成物或組合的這樣的量或劑量，其以單一或多次劑量施用患者後，在需要治療或預防的患者中產生預期效果。
“治療有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需治療結果的量。治療有效量也是這樣的一個量，其中抗體或抗體片段或組成物或組合的任何有毒或有害作用不及治療有益作用。相對於未治療的對象，“治療有效量”較佳地抑制可度量參數(例如腫瘤體積)至少約40%、甚至更佳地至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%甚至100%。
“預防有效量”指以需要的劑量並持續需要的時間段，有效實現所需預防結果的量。通常，由於預防性劑量在對象中在疾病較早階段之前或在疾病較早階段使用，故預防有效量將小於治療有效量。
術語“宿主細胞”、“宿主細胞系”和“宿主細胞培養物”可交換地使用且是指其中引入外源核酸的細胞，包括這種細胞的後代。宿主細胞包括“轉化體”和“轉化的細胞”，其包括初級轉化的細胞和來源於其的後代，而不考慮傳代的數目。後代在核酸內容上可能與親本細胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括在最初轉化的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物學活性的突變體後代。
本文所使用的術語“標記”是指被直接或間接綴合或融合至試劑(諸如多核苷酸探針或抗體)並且促進其所綴合或融合的試劑的檢測的化合物或組成物。標記本身可以是可檢測的(例如，放射性同位素標記或螢光標記)或在酶促標記的情況下可以催化可檢測的受質化合物或組成物的化學改變。術語旨在
涵蓋藉由將可檢測物質偶聯(即，物理連接)至探針或抗體來直接標記探針或抗體以及藉由與直接標記的另一種試劑反應來間接標記探針或抗體。
“個體”或“受試者”包括哺乳動物。哺乳動物包括但不限於，家養動物(例如，牛，羊，貓，狗和馬)，靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)，兔，以及齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在一些實施方案中，個體或受試者是人。
“分離的”抗體是這樣的抗體，其已經與其天然環境的組分分離。在一些實施方案中，將抗體純化至超過95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE，等電聚焦(IEF)，毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)確定的。
“分離的編碼抗CLDN18.2xCD3雙特異抗體或其片段的核酸”是指一個或多個核酸分子，其編碼抗體重鏈或輕鏈(或其片段，例如重鏈可變區或輕鏈可變區)，包括在單一載體或分開的載體中的這樣的核酸分子，以及存在於宿主細胞中的一個或多個位置處的這樣的核酸分子。
如下進行序列之間序列同一性的計算。
為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分數，將該序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為了最佳比對而在第一和第二胺基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。在一個較佳實施方案中，為比較目的，所比對的參考序列的長度是至少30%、較佳地至少40%、更佳地至少50%、60%和甚至更佳地至少70%、80%、90%、100%的參考序列長度。隨後比較在對應胺基酸位置或核苷酸位置處的胺基酸殘基或核
苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則該分子在這個位置處是相同的。
可以利用數學算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。在一個較佳實施方案中，使用已經集成至GCG軟體包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個胺基酸序列之間的同一性百分數。在又一個較佳的實施方案中，使用GCG軟體包中的GAP程序(在http：//www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別佳的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum 62評分矩陣。還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12，空位罰分4)，利用已經併入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法((1989)CABIOS,4：11-17)確定兩個胺基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。額外地或備選地，可以進一步使用本文所述的核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共數據庫執行檢索，以例如鑑定其他家族成員序列或相關序列。
如本文所用，術語“在嚴格條件下(例如在低嚴格性、中等嚴格性、高嚴格性或極高嚴格性條件下)雜交”描述了雜交和洗滌條件。進行雜交反應的指導可以在藉由引用方式併入的Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。參考文獻中描述了含水方法和非含水方法並且可以使用任一方法。本文中提及的較佳的雜交條件如下：1)低嚴格性雜交
條件是在約45℃於6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，隨後至少在50℃(對於低嚴格性條件，可以增加洗滌的溫度至55℃)於0.2X SSC，0.1% SDS中洗滌兩次；2)中等嚴格性雜交條件是在約45℃於6 X SSC中、隨後在60℃在0.2 X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次；3)高嚴格性雜交條件是在約45℃在6 X SSC中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次；並且較佳地4)極高嚴格性雜交條件是在65℃於0.5M磷酸鈉、7%SDS中、隨後在65℃於0.2X SSC、0.1% SDS中洗滌一次或多次。極高嚴格性條件(4)是較佳的條件和除非另外說明，否則應當使用的一個條件。
術語“抗腫瘤作用”指可以藉由多種手段展示的生物學效果，包括但不限於例如，腫瘤體積減少、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活減少。
術語“腫瘤”和“癌症”在本文中互換地使用，涵蓋實體瘤和血液腫瘤。
術語“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳動物中特徵通常為細胞生長不受調節的生理疾患。在某些實施方案中，適合於藉由本發明的抗體來治療的癌症包括胃癌、胰腺癌或胃食管交界癌，包括那些癌症的轉移性形式。
術語“腫瘤”指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”、“癌性”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。
術語“藥用輔料”指與活性物質一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全的))、賦形劑、載體或穩定劑等。
術語“醫藥組成物”指這樣的組成物，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用該組成物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。
術語“藥物組合”是指非固定組合產品或固定組合產品，包括但不限於藥盒、醫藥組成物。術語“非固定組合”意指活性成分(例如，(i)本發明的抗CLDN18.2xCD3雙特異性抗體或其片段、以及(ii)其他治療劑)以分開的實體被同時、無特定時間限制或以相同或不同的時間間隔、依次地施用於患者，其中這類施用在患者體內提供預防或治療有效水平的兩種或更多種活性劑。在一些實施方案中，藥物組合中使用的本發明的抗CLDN18.2xCD3雙特異性抗體或其片段和其他治療劑以不超過它們單獨使用時的水平施用。術語“固定組合”意指兩種或更多種活性劑以單個實體的形式被同時施用於患者。較佳對兩種或更多種活性劑的劑量和/或時間間隔進行選擇，從而使各部分的聯合使用能夠在治療疾病或病症時產生大於單獨使用任何一種成分所能達到的效果。各成分可以各自呈單獨的製劑形式，其製劑形式可以相同也可以不同。
術語“組合療法”是指施用兩種或更多種治療劑或治療方式(例如放射療法或手術)以治療本文所述疾病。這種施用包括以基本上同時的方式共同施用這些治療劑，例如以具有固定比例的活性成分的單一膠囊。或者，這種施用包括對於各個活性成分在多種或在分開的容器(例如片劑、膠囊、粉末和液體)中的共同施用。粉末和/或液體可以在施用前重構或稀釋至所需劑量。此外，這種施用還包括以大致相同的時間或在不同的時間以順序的方式使用每種類型的治療劑。在任一情況下，治療方案將提供藥物組合在治療本文所述的病症或病狀中的有益作用。
用於本文時，“治療”指減緩、中斷、阻滯、緩解、停止、降低、或逆轉已存在的症狀、病症、病況或疾病的進展或嚴重性。
用於本文時，“預防”包括對疾病或病症或特定疾病或病症的症狀的發生或發展的抑制。在一些實施方式中，具有癌症家族病史的受試者是預防性方案的候選。通常，在癌症的背景中，術語“預防”是指在癌症的病徵或症狀發生前，特別是在具有癌症風險的受試者中發生前的藥物施用。
術語“載體”當在本文中使用時是指能夠增殖與其相連的另一個核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構的載體以及結合到已經引入其的宿主細胞的基因組中的載體。一些載體能夠指導與其可操作相連的核酸的表達。這樣的載體在本文中被稱為“表達載體”。
“受試者/患者/個體樣品”指從患者或受試者得到的細胞或流體的集合。組織或細胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發育任何時間的細胞。組織樣品可能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩衝劑、固定劑、營養物、抗生素等等。
II. 抗體
在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2xCD3雙特異性抗體以高親和力結合CLDN18.2(例如人CLDN18.2)。在一些實施方案中，本發明的抗體特異性結合CLDN18.2(例如人CLDN18.2)，而不結合CLDN18.1(例如人CLDN18.1)。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段與人CLDN18.2的結合親和力高於已知的CLDN18.2抗體，例如Zolbetuximab(簡稱Zmab)抗體。在一些
實施方案中，本發明的抗CLDN18.2 x CD3雙特異性抗體以所需的親和力(例如較低)結合CD3(例如人CD3或食蟹猴CD3)。在一些實施方案中，本發明的抗體能夠既結合人CD3，又結合食蟹猴CD3。在一些實施方案中，藉由生物膜薄層干涉測定技術或表面電漿共振法測定抗體的親和力。
在一些實施方案中，本發明的抗CLDN18.2xCD3雙特異性抗體能夠結合腫瘤細胞表面的CLDN18.2，以及效應細胞表面的CD3。在一些實施方案中，利用流式細胞術檢測該結合。
在一些實施方案中，本發明的抗體能夠特異性殺傷腫瘤細胞，例如表達CLDN18.2的腫瘤細胞。在一些實施方案中，本發明的抗體能夠介導細胞因子，例如IL-2、TNF α和/或IFNgamma的釋放。在一些實施方案中，本發明的抗體能夠激活效應細胞，例如T細胞。
在一些實施方案中，效應細胞為T細胞，例如T淋巴細胞，例如CD4+T細胞或CD8+T細胞。
在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段能夠用於治療癌症。在一些實施方案中，本發明的抗體或其抗原結合片段，能夠有效抑制腫瘤生長，腫瘤抑制率大於或等於約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，甚至100%。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域，其中第一抗原結合結構域特異性結合CLDN18.2，第二抗原結合結構域特異性結合CD3。
在本發明較佳的實施方案中，第一抗原結合結構域包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(A1-HCDR)，A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3。
在本發明較佳的實施方案中，第一抗原結合結構域包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(A1-LCDR)，A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3。
在一些實施方案中，第一抗原結合結構域包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(A1-HCDR)和3個來自輕鏈可變區的互補決定區(A1-LCDR)。
在一些方面中，第一抗原結合結構域包含重鏈可變區(A1-VH)。在一些方面中，第一抗原結合結構域包含輕鏈可變區(A1-VL)。在一些方面中，第一抗原結合結構域包含重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施方案中，該重鏈可變區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(A1-HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中，該輕鏈可變區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(A1-LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，A1-VH
(i)包含與選自SEQ ID NO：4的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含選自SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：4的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，A1-VL
(i)包含與選自SEQ ID NO：9的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含選自SEQ ID NO：9的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：9的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明的3個來自A1-VH的互補決定區(A1-HCDR)，A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3為
(i)如SEQ ID NO：4所示的VH中所含的三個互補決定區域A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3，或者
(ii)相對於(i)的序列，在該三個A1-HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中，本發明的3個來自A1-VL的互補決定區(A1-LCDR)，A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3為
(i)如SEQ ID NO：9所示的VL中所含的三個互補決定區域A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3，
(ii)相對於(i)的序列，在該三個A1-LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中，A1-HCDR1包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A1-HCDR1包含與SEQ ID NO：1的胺基酸序
列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A1-HCDR2包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A1-HCDR2包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A1-HCDR3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A1-HCDR3包含與SEQ ID NO：3的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A1-LCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A1-LCDR1包含與SEQ ID NO：6的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A1-LCDR2包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A1-LCDR2包含與SEQ ID NO：7的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A1-LCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A1-LCDR3包含與SEQ ID NO：8的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在本發明較佳的實施方案中，第二抗原結合結構域包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(A2-HCDR)，A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3。
在本發明較佳的實施方案中，第二抗原結合結構域包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(A2-LCDR)，A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。
在一些實施方案中，第二抗原結合結構域包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(A2-HCDR)和3個來自輕鏈可變區的互補決定區(A2-LCDR)。
在一些方面中，第二抗原結合結構域包含重鏈可變區(A2-VH)。在一些方面中，第二抗原結合結構域包含輕鏈可變區(A2-VL)。在一些方面中，第二抗原結合結構域包含重鏈可變區和輕鏈可變區。在一些實施方案中，該重鏈可變區包含3個來自重鏈可變區的互補決定區(A2-HCDR)，HCDR1、HCDR2和HCDR3。在一些實施方案中，該輕鏈可變區包含3個來自輕鏈可變區的互補決定區(A2-LCDR)，LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，A2-VH
(i)包含與選自SEQ ID NO：22、30或32的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含選自SEQ ID NO：22、30或32的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：22、30或32的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，A2-VL
(i)包含與選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(ii)包含選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列由該胺基酸序列組成，較佳地，該胺基酸改變不發生在CDR區中。
在一些實施方案中，本發明的3個來自A2-VH的互補決定區(A2-HCDR)，A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3為
(i)如SEQ ID NO：22、30或32所示的VH中所含的三個互補決定區域A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3，或者
(ii)相對於(i)的序列，在該三個A2-HCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中，本發明的3個來自A2-VL的互補決定區(A2-LCDR)，A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3為
(i)如SEQ ID NO：27所示的A2-VL中所含的三個互補決定區域A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3，
(ii)相對於(i)的序列，在該三個A2-LCDR區上共包含至少一個且不超過5、4、3、2或1個胺基酸改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的序列。
在一些實施方案中，A2-HCDR1包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A2-HCDR1包含與SEQ ID NO：19的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A2-HCDR2包含SEQ ID NO：20或31的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A2-HCDR2包含與SEQ ID NO：20或31的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A2-HCDR3包含SEQ ID NO：21或29的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A2-HCDR3包含與SEQ ID NO：21或29的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A2-LCDR1包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A2-LCDR1包含與SEQ ID NO：24的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A2-LCDR2包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A2-LCDR2包含與SEQ ID NO：25的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，A2-LCDR3包含SEQ ID NO：26的胺基酸序列，或由該胺基酸序列組成，或者A2-LCDR3包含與SEQ ID NO：26的胺基酸序列相比具有一個、兩個或三個改變(較佳胺基酸置換，較佳保守置換)的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體還包含重鏈恆定區。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體還包含輕鏈恆定區。在一些實施方案
中，本發明的雙特異性抗體還包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含2個重鏈恆定區，其中一個重鏈恆定區A1-HC與第一抗原結構域的重鏈可變區A1-VH相連構成與CDLN18.2結合部分的重鏈，且另一個重鏈恆定區A2-HC與第二抗原結合結構域的重鏈可變區A2-VH相連構成與CD3結合部分的重鏈。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含2個輕鏈恆定區，其中一個輕鏈恆定區A1-LC與第一抗原結構域的輕鏈可變區A1-VL相連構成與CLDN18.2結合部分的輕鏈，且另一個輕鏈恆定區A2-LC與第二抗原結合結構域的輕鏈可變區A2-VL相連構成與CD3結合部分的輕鏈。在一個實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含A1-HC、A1-LC、A2-HC和A2-LC。在一些實施方案中，A1-HC可以與A2-HC相同或不同。在一些實施方案中，A1-LC可以與A2-LC相同或不同。在一些實施方案中，A1-HC與A2-HC不同，且A1-LC與A2-LC不同。
在一些實施方案中，本發明的重鏈恆定區HC為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區，較佳的IgG1的重鏈恆定區，例如野生型IgG1重鏈恆定區或突變的IgG1重鏈恆定區(例如IgG1LALA)。在一些實施方案中，本發明的抗體輕鏈恆定區LC為lambda或Kappa輕鏈恆定區。
在一些較佳的實施方案中，本發明的重鏈恆定區HC
(i)包含與選自SEQ ID NO：5或23的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：5或23的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：5或23的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些較佳的實施方案中，本發明的重鏈恆定區HC
(i)包含與選自SEQ ID NO：33或34的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：33或34的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：33或34的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施方案中，本發明的抗體輕鏈恆定區LC
(i)包含與選自SEQ ID NO：10或28的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：10或28的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：10或28的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更較佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更較佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域，其中
第一抗原結合結構域特異性結合CLDN18.2，第二抗原結合結構域特異性結合CD3，其中第一抗原結合結構域包含如SEQ ID NO：4所示的A1-VH中所含的三個互補決定區域A1-HCDR1、A1-HCDR2和A1-HCDR3，和如SEQ ID NO：9所示的VL中所含的三個互補決定區域A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3；
第二抗原結合結構域包含如SEQ ID NO：22、30或32所示的A2-VH中所含的三個互補決定區域A2-HCDR1、A2-HCDR2和A2-HCDR3，和如SEQ ID NO：27所示的A2-VL中所含的三個互補決定區域A2-LCDR1、A2-LCDR2和A2-LCDR3。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域，其中第一抗原結合結構域特異性結合CLDN18.2，第二抗原結合結構域特異性結合CD3，其中
第一抗原結合結構域包含分別如以下胺基酸序列所示的A1-HCDR1、A1-HCDR2、A1-HCDR3：SEQ ID NO：1、2和3，以及分別如以下胺基酸序列所示的A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3：SEQ ID NO：6、7和8；以及
第二抗原結合結構域包含
(i)分別如以下胺基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO：19、20和21，以及分別如以下胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO：24、25和26；或
(ii)分別如以下胺基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO：19、20和29，以及分別如以下胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO：24、25和26；或
(iii)分別如以下胺基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO：19、31和21，以及分別如以下胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO：24、25和26。
在本發明的一些具體實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域，其中第一抗原結合結構域特異性結合CLDN18.2，第二抗原結合結構域特異性結合CD3，其中
第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的A1-VH，和包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的A1-VL；
第二抗原結合結構域包含SEQ ID NO：22、30或32所示的胺基酸序列或與其具有至少90%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的A2-VH，和包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成的A2-VL。
在本發明的一些具體的實施方案中，本發明的雙特異性抗體是IgG-樣結構的雙特異性抗體，即其包含與CLDN18.2結合部分的重鏈和輕鏈，以及與CD3結合部分的重鏈和輕鏈。在一些實施方案中，在兩條重鏈的CH3區具有Knob-into-Hole的序列(Shane Atwell等，Journal of Molecular Biology,1997；A.Margaret Merchant等，Nature Biotechnology，1998)，因此形成杵臼結構。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體的結構參見圖8。
在一些實施方案中，與CLDN18.2結合部分的重鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施方案中，與CLDN18.2結合部分的輕鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO：38的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：38的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：38的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施方案中，與CD3結合部分的重鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO：39、41或42的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：39、41或42的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：39、41或42的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在一些實施方案中，與CD3結合部分的輕鏈
(i)包含與選自SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；
(ii)包含選自SEQ ID NO：40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者
(iii)包含與選自SEQ ID NO：40的胺基酸序列相比具有1個或多個(較佳不超過20個或10個，更佳不超過5、4、3、2、1個)的胺基酸改變(較佳胺基酸置換，更佳胺基酸保守置換)的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
在本發明的一個實施方案中，本文所述的胺基酸改變包括胺基酸的置換、插入或缺失。較佳的，本文所述的胺基酸改變為胺基酸置換，較佳地保守置換。
在較佳的實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在CDR外的區域(例如在FR中)。更佳地，本發明所述的胺基酸改變發生在重鏈可變區外和/或輕鏈可變區外的區域。在一些實施方案中，本發明所述的胺基酸改變發生在抗體重鏈恆定區的Fc區上，在較佳的實施方案中，該Fc區上的胺基酸改變削弱或刪除了抗體的ADCC和/或CDC作用。
在一些實施方案中，置換為保守性置換。保守置換是指一個胺基酸經相同類別內的另一胺基酸置換，例如一個酸性胺基酸經另一酸性胺基酸置
換，一個鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸置換，或一個中性胺基酸經另一中性胺基酸置換。示例性的置換如下表所示：
在某些實施方案中，置換發生在抗體的CDR區。通常，獲得的變體相對於親本抗體在某些生物學特性方面(例如，增加的親和力)具有修飾(例如，
改善)和/或將具有親本抗體的基本上保留的某些生物學特性。示例性置換變體是親和力成熟抗體。
在某些實施方案中，可在本文中所提供抗體的Fc區中引入一個或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體，以改變抗體的一種或多種功能特性，例如血清半衰期、補體結合、補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合和/或抗體依賴性細胞毒性。Fc區變體可包括在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸改變(例如置換)的人Fc區序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。
在某些實施方案中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代MAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。
在某些實施方案中，本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體中，與CLDN18.2特異性結合的第一抗原結合結構域，或重鏈和輕鏈組合是全人源的，且與CD3結合的第二抗原結合結構域或重鏈和輕鏈組合是人源化的。
III. 本發明的核酸以及包含其的宿主細胞
在一方面，本發明提供了編碼以上任何雙特異抗體的可變區或重鏈或輕鏈的核酸。在一個實施方案中，提供包含該核酸的載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如pcDNA3.1。在一個實施方案中，提供包含該核酸或該載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞(例如CHO細胞(例如CHO-S)或293細胞(例如293F或HEK293細胞))或適用於製備抗體或其片段的其它細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是原核的。
在一方面，本發明的核酸可以包含編碼抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區的胺基酸序列的核酸，或包含編碼抗體的輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列的核酸。
例如，本發明的核酸包含編碼選自SEQ ID NO：4、9、22、27、30、32、37-42中任一項所示胺基酸序列的核酸，或編碼與選自SEQ ID NO：4、9、22、27、30、32、37-42中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸。
本發明還涵蓋與下述核酸在嚴格性條件下雜交的核酸或與下述核酸具有一個或多個置換(例如保守性置換)、缺失或插入的核酸：包含編碼選自SEQ ID NO：4、9、22、27、30、32、37-42中任一項所示胺基酸序列的核酸序列的核酸；或包含編碼與選自SEQ ID NO：4、9、22、27、30、32、37-42中任一項所示的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的胺基酸序列的核酸序列的核酸。
在一個實施方案中，提供包含該核酸的一個或多個載體。在一個實施方案中，載體是表達載體，例如真核表達載體。載體包括但不限於病毒、質
粒、黏粒、λ噬菌體或酵母人工染色體(YAC)。在一個實施方案中，載體是pcDNA3.1。
在一個實施方案中，提供包含該載體的宿主細胞。用於選殖或表達編碼抗體的載體的適當宿主細胞包括本文描述的原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別當不需要糖基化和Fc效應子功能時。在表達後，抗體可以從可溶級分中的細菌細胞糊狀物分離，並且可以進一步純化。
在一個實施方案中，宿主細胞是真核的。在另一個實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳動物細胞或適用於製備抗體或其片段的其它細胞。例如，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是關於編碼抗體的載體的合適選殖或表達宿主。例如，糖基化途徑已經進行“人源化”的真菌和酵母菌株導致產生具有部分或完全人糖基化模式的抗體。適於表達糖基化抗體的宿主細胞也衍生自多細胞生物體(無脊椎動物和脊椎動物)。也可以將脊椎動物細胞用作宿主。例如，可以使用被改造以適合於懸浮生長的哺乳動物細胞系。有用的哺乳動物宿主細胞系的其它實例是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(HEK293、293F或293T細胞)等。其它有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞、CHO-S細胞、ExpiCHO等；以及骨髓瘤細胞系如Y0，NS0和Sp2/0。本領域已知適合產生抗體的哺乳動物宿主細胞系。
IV. 本發明的抗體分子的生產和純化
在一個實施方案中，提供了製備本發明抗體分子的方法，其中該方法包括，在適合抗體表達的條件下，培養包含編碼該抗體(例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸或包含該核酸的表達載體的宿主細胞，如上文所提供的，和視需要地從該宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收該抗體。
為了重組產生本發明抗體分子，分離編碼抗體(例如上文所描述的抗體，例如任意一條多肽鏈和/或多條多肽鏈)的核酸，並將其插入一個或多個載體，用於在宿主細胞中進一步選殖和/或表達。此類核酸易於使用常規規程分離和測序(例如藉由使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針進行)。
如本文所述製備的抗體分子可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對所屬技術領域具有通常知識者是顯而易見的。可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，該熟知分析方法包括尺寸排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。
V. 測定法
可以藉由本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗體鑑定，篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。一方面，對本發明的抗體測試其抗原結合活性，例如藉由已知的方法諸如ELISA，Western印跡，等來進行。可使用本領域已知方法來測定對CLDN18.2和/或CD3的結合，本文中公開了例示性方法。在一些實施方案中，使用放射性免疫測定(RIA)或生物膜薄層干涉測定法或MSD測定法或表面電漿共振法(SPR)或流式細胞術測量。
另一方面，可使用競爭測定法來鑑定與本文中公開的任何雙特異性抗體競爭對CLDN18.2和/或CD3的結合的抗體。在某些實施方案中，此類競爭性抗體結合與本文中公開的雙特異性抗體所結合表位相同或重疊的表位(例如線性或構象表位)。
本發明還提供了用於鑑定具有生物學活性的抗體的測定法。生物學活性可以包括例如結合CLDN18.2和/或CD3(例如結合人CLDN18.2和/或CD3)，對表達CLDN18.2和/或CD3的細胞的結合，對T細胞的激活作用、對細胞因子的分泌刺激作用、對腫瘤細胞的抑制和殺傷作用等。還提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。
在某些實施方案中，對本發明的抗體測試此類生物學活性。
供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表達CLDN18.2和/或CD3或經改造而表達或過表達CLDN18.2和/或CD3細胞系。此類細胞還包括表達CLDN18.2和/或CD3和並非正常情況下表達CLDN18.2和/或CD3的編碼DNA轉染的細胞系。在一些實施方案中，這類細胞是胃癌細胞或胰腺癌細胞。在一些實施方案中，這些細胞是表達CLDN18.2的CHO細胞。在一些實施方案中，這些細胞是細胞系NUGC-4、KATO III和DAN-G細胞系，例如過表達CLDN18.2的KATO III和DAN-G細胞系。在一些實施方案中，這類細胞是T細胞，例如人T淋巴細胞，例如Jurkat細胞。
可以理解的是，能夠使用本發明的抗體和別的活性劑的組合來進行任何上述測定法。
VI. 醫藥組成物
在一些實施方案中，本發明提供包含本文所述的任何抗體或其組成物，較佳地組成物為醫藥組成物。在一個實施方案中，該組成物還包含藥用輔料。在一個實施方案中，組成物，例如，醫藥組成物，包含本發明的抗體或其片段，以及一種或多種其它治療劑的組合。
本發明還包括包含本發明的雙特異性抗體或其組成物(包括醫藥組成物)。這些組成物還可以包含合適的藥用輔料，如本領域中已知的藥用載體、藥用賦形劑，包括緩衝劑。
如本文所用，“藥用載體”包括生理上相容的任何和全部溶劑、分散介質、等滲劑和吸收延遲劑等。
對於藥用輔料的使用及其用途，亦參見“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第八版，R.C.Rowe,P.J.Seskey和S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。
本發明的組成物可以處於多種形式。這些形式例如包括液體、半固體和固體劑型，如液態溶液劑(例如，可注射用溶液劑和可輸注溶液劑)、散劑或混懸劑、脂質體劑和栓劑。較佳的形式取決於預期的施用模式和治療用途。
可以藉由將具有所需純度的本發明的抗體與一種或多種視需要的藥用輔料混合來製備包含本文所述的抗體的藥物，較佳地以凍乾製劑或水溶液的形式。
本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含超過一種活性成分，該活性成分是被治療的特定適應證所需的，較佳具有不會不利地彼此影響的互補活性的那些活性成分。例如，理想的是還提供其它治療劑，包括化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫檢查點抑制劑或激動劑)等。該活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水聚合物的半滲透基質，該基質呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
VII. 藥物組合和藥盒
在一些實施方案中，本發明還提供了藥物組合或藥物組合產品，其包含本發明的抗體，以及一種或多種其它治療劑(例如治療劑，包括化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫檢查點抑制劑或激動劑)等)。
本發明的另一個目的是提供一種成套藥盒，其包含本發明的藥物組合，較佳地該藥盒為藥物劑量單元形式。由此可以依據給藥方案或藥物施用間隔提供劑量單元。
在一個實施方案中，本發明的成套藥盒在同一包裝內包含：
- 含有包含本發明的雙特異性抗體的醫藥組成物的第一容器；
- 含有包含其它治療劑的醫藥組成物的第二容器。
VIII. 用途和方法
本發明一方面提供了在受試者中預防或治療腫瘤(例如癌症)的方法，包括向受試者施用有效量的本發明的抗CLDN18.2 x CD3的雙特異性抗體或其片段(較佳的抗原結合片段)、醫藥組成物、藥物組合或藥盒。
在一些實施方案中，該腫瘤(例如癌症)患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白質水平的)CLDN18.2。
在一些實施方案中，該腫瘤例如癌症包括實體腫瘤和血液腫瘤以及轉移性病灶。在一個實施方案中，實體瘤的例子包括惡性腫瘤。癌症可以處於早期、中期或晚期或是轉移性癌。
在一些實施方案中，該腫瘤治療將受益於抑制核酸或蛋白質水平的CLDN18.2。
在一個具體的實施方案中，本發明的抗體能夠殺傷腫瘤細胞，和/或抑制腫瘤細胞增殖，例如表達CLDN18.2的腫瘤細胞，例如胃癌細胞或胰腺癌細胞。
在另一個具體的實施方案中，本發明的抗CLDN18.2 x CD3雙特異性抗體能夠激活T細胞。
因此，本發明的抗體適用於預防或治療其中需要細胞毒性T細胞的效應器機制的任何腫瘤或癌症，或需要T細胞募集的任何腫瘤或癌症。
在一些實施方案中，腫瘤是腫瘤免疫逃逸。
在一些實施方案中，該腫瘤是癌症，例如胃癌或胰腺癌，受試者可以是哺乳動物，例如，靈長類，較佳地，高級靈長類，例如，人類(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的風險的個體)。在一個實施方案中，受試者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的風險。在某些實施方案中，受試者接受或已經接受過其它治療，例如化療治療和/或放射療法。在一些實施方案中，受試者之前已經接受過或正在接受免疫療法。
在其他方面，本發明提供抗體分子或醫藥組成物或藥物組合或藥盒在生產或製備藥物中的用途，該藥物用於本文所述的用途，例如用於預防或治療本文提及的相關疾病或病症。
在一些實施方案中，本發明的抗體分子或醫藥組成物或藥物組合或藥盒會延遲病症和/或與病症相關的症狀的發作。
在一些實施方案中，本發明的抗體分子或醫藥組成物還能與一種或多種其它療法例如治療方式和/或其它治療劑組合施用，用於本文所述的用途，例如用於預防和/或治療本文提及的相關疾病或病症。
在一些實施方案中，治療方式包括外科手術；放射療法、局部照射或聚焦照射等。
在一些實施方案中，治療劑選自化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑(例如免疫檢查點抑制劑或激動劑)。
示例性的免疫調節劑包括免疫抑制劑或抗炎劑。在一些實施方案中，免疫調節劑還包括免疫檢查點抑制劑或激動劑。示例性的其他抗體包括特異性結合免疫檢查點的抗體。
在一些實施方案中，本文中描述的抗體組合可以分別施用，例如，作為單獨的抗體分別施用。
此類組合療法涵蓋組合施用(例如兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中)，和分開施用，在該情況中，可以在施用別的治療劑和/或藥劑之前，同時，和/或之後發生本發明的抗體的施用。
醫藥組成物的施用途徑是根據已知方法，例如，經口、藉由靜脈內注射、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門脈內或病灶內途徑；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置。在某些實施方案中，組成物可藉由彈丸注射或藉由連續輸注或藉由植入裝置施用。
組成物還可經由植入膜、海綿或其上吸收或膠囊包封所需分子的另一種適當的材料被局部施用。在某些實施方案中，當使用植入裝置時，該裝置可被植入到任何合適的組織或器官中，並且可經由擴散、定時釋放的大丸劑、或連續施用遞送所需分子。
IX. 用於診斷和檢測的方法和組成物
在某些實施方案中，本文中提供的任何抗體可以用於檢測CLDN18.2在生物樣品中的存在。術語“檢測”用於本文中時，包括定量或定性檢測，示例性的檢測方法可以涉及免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術(例如，FACS)、抗體分子複合的磁珠、ELISA測定法、PCR-技術(例如，RT-PCR)。在某些實施方案中，生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方案中，生物樣品包含細胞或組織。在一些實施方案中，生物樣品來自過度增生性或癌性病灶相關病灶。
在一個實施方案中，提供用於診斷或檢測方法的雙特異性抗體。在另一個方面中，提供檢測CLDN18.2在生物樣品中的存在的方法。在某些實施方案中，方法包含檢測CLDN18.2蛋白在生物樣品中的存在。在某些實施方案中，CLDN18.2是人CLDN18.2。在某些實施方案中，CD3是人CD3。在某些實施方案中，該方法包括將生物樣品與如本文所述的抗體在允許其與CLDN18.2結合的條件下接觸，並檢測在該抗體和CLDN18.2之間是否形成複合物。複合物的形成表示存在CLDN18.2。該方法可以是體外或體內方法。在一個實施方案中，本發明的抗體用於選擇適合利用本發明的雙特異性抗體治療的受試者，例如其中CLDN18.2是用於選擇該受試者的生物標記物。
在一個實施方案中，可以使用本發明抗體診斷腫瘤，例如癌症，例如評價(例如，監測)個體中本文所述疾病的治療或進展、其診斷和/或分期。在某些實施方案中，提供標記的雙特異性抗體。標記包括但不限於，被直接檢測的標記或部分(如螢光標記、發色團標記、電子緻密標記、化學發光標記和放射性標記)，以及被間接檢測的部分，如酶或配體，例如，藉由酶促反應或分子相互作用。
在本文中提供的一些實施方案中，樣品是在用本發明的抗體治療之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法之前獲得的。在一些實施方案中，樣品是在用其他療法治療過程中，或者用其他療法治療後獲得的。
在一些實施方案中，樣品是福爾馬林固定、石蠟包膜(FFPE)的。在一些實施方案中，樣品是活檢(例如芯活檢)，手術標本(例如來自手術切除的標本)，或細針吸出物。
在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測CLDN18.2。
在一些實施方案中，提供了一種治療本發明疾病的方法，該方法包括：對受試者(例如，樣品)(例如，受試者樣品)檢驗CLDN18.2的存在，因而確定CLDN18.2值，將CLDN18.2值與對照值比較，並且如果CLDN18.2值大於對照值，則向受試者施用治療有效量的視需要與一種或多種其他療法組合的本發明所述的雙特異性抗體，因而治療該疾病。
本發明的這些以及其它方面和實施方案在圖式(圖式簡述緊隨其後)和以下的發明詳述中得到描述並且示例於以下實施例中。上文以及整個本申請中所論述的任何或所有特徵可以在本發明的各種實施方案中組合。以下實施例進一步說明本發明，然而，應理解實施例以說明而非限定的方式來描述，並且所屬技術領域具有通常知識者可以進行多種修改。
[實施例]
實施例1、穩定表達細胞株的構建
人源CLDN18.2的過表達細胞株的製備
根據製造商的說明書，使用Freedom® CHO-S®試劑盒(Invitrogen,A1369601)構建穩定表達人源Claudin18.2(簡稱CLDN18.2，以下同)的細胞系。首先將人源CLDN18.2(UniProt ID：P56856-2)的全長基因構建到載體pCHO1.0中，形成質粒，採用化學轉染法和電轉染法將構建好的質粒分別轉入CHO-S細胞(Invitrogen,A1369601)和HEK293細胞(Invitrogen,A14527)中，轉染後的細胞經過兩輪加壓篩選得到分別表達CLDN18.2的細胞池(pool)。然後利用流式細胞分選儀(MoFlo XDP，Beckman Coulter)將高表達CLDN18.2的細胞分選出來，藉由稀釋法獲得穩定表達CLDN18.2的單純株細胞系CHO-hCLDN18.2和HEK293-hCLDN18.2。
人源CLDN18.1的過表達細胞株的製備
根據製造商的說明書，使用Freedom® CHO-S®試劑盒(Invitrogen,A1369601)構建穩定表達人源Claudin18.1(簡稱CLDN18.1，以下同)的細胞系。首先將人源CLDN18.1(UniProt ID：P56856-1)全長基因構建到載體pCHO1.0(Invitrogen,A1369601)中，形成質粒，採用化學轉染法將構建好的質粒轉入CHO-S細胞(Invitrogen,A1369601)中，轉染後的細胞經過兩輪加壓篩選得到分別表達CLDN18.1的細胞池(pool)。然後利用流式細胞分選儀(MoFlo XDP,Beckman Coulter)將高表達CLDN18.1的細胞分選出來，藉由稀釋法獲得穩定表達CLDN18.1的單純株細胞系CHO-hCLDN18.1。
過表達CLDN18.2的腫瘤細胞系的構建
將人源CLDN18.2(UniProt ID：P56856-2)的全長基因構建到載體pWPT-GFP(Addgene,12255)中，替換其中的GFP序列，與慢病毒的包裝載體psPAX2(Addgene,12260)和pMD2.G(Addgene,12259)共同轉染到HEK293T(ATCC,CRL-3216)細胞中，進行病毒的包裝。分別收集培養了48小時和72小時後的培養上
清，使用PEG8000進行慢病毒的濃縮。用濃縮後的病毒轉染胰腺癌DAN-G細胞和胃癌KATO III細胞，然後利用流式細胞分選儀(MoFlo XDP,Beckman Coulter)將表達CLDN18.2的細胞分選出來，獲得穩定轉染CLDN18.2的腫瘤細胞系DAN-G-hCLDN18.2和KATO III-hCLDN18.2。
實施例2、CLDN18.2單純株的產生
本發明採用融合瘤技術，藉由實施例1獲得的細胞(CHO-hCLDN18.2)免疫小鼠H2L2全人源抗體轉基因小鼠(購自Harbour BioMed)。然後獲取小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞進行電融合。之後收集上清液藉由流式細胞儀(FACS)篩選出特異性表達抗CLDN18.2抗體的融合瘤細胞，且分泌的抗體不與CLDN18.1結合。將實施例1獲得的待檢測細胞(HEK293-hCLDN18.2)計數，並稀釋至1×106個細胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g 5min，離心，去除細胞培養基。將融合瘤96孔板培養上清加入U型板並重新懸浮細胞，每孔加100μl，冰上靜置30min。500g 5min去除上清，PBS洗細胞1遍。每孔加入100μl抗鼠Fab的FITC標記的二抗(1：500稀釋於PBS中)，陽性對照抗體加入100μl抗人Fab的FITC標記的二抗。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗細胞1遍。用50μl 1×PBS重新懸浮細胞，FACS上機檢測。將陽性純株，再用上述同樣方法進行CHO-hCLDN18.1的複篩。經過兩輪篩選，獲得了全人源抗體純株HB37A6。
實施例3、重組CLDN18.2單株抗體的製備
將抗CLDN18.2單株抗體H337A6(參見CN202010570517.X)以及對照抗體zolbetuximab(簡稱Zmab，序列來源於INN117)以全長單株抗體的形式表達在HEK293細胞(Invitrogen,A14527)中。
首先構建表達載體，分別將HB37A6和對照抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區(參見序列信息)放置在人源IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：5)和輕鏈kappa恆定區(SEQ ID NO：10)的N端。之後構建到帶有N端信號肽的pcDNA3.1表達載體中，獲得輕重鏈表達載體。將所獲得的輕、重鏈表達載體藉由PEI(Polysciences Inc,23966)共轉染到HEK293細胞中，培養7天後收集培養基上清。上清藉由Protein A管柱(Hitrap Mabselect Sure，GE 11-0034-95)進行純化，之後超濾並換液到PBS(Gibco，70011-044)中，採用A280法檢測濃度並用SEC-HPLC法測定純度，獲得純度大於95%的抗體溶液，得到重組CLDN18.2單株抗體HB37A6。
具體轉染和純化過程如下：
根據所需轉染體積傳代Expi293細胞(Invitrogen,A14527)，轉染前一天將細胞密度調整至1.5×106個細胞/ml。轉染當天細胞密度約為3×106個細胞/ml。取終體積1/10的Opti-MEM培養基(Gibco，31985-070)作為轉染緩衝液，按1.0μg/ml轉染細胞加入適當的質粒，混勻。加合適的聚乙烯亞胺(PEI)(Polysciences，23966)到質粒中(質粒與PEI的比例在293F細胞中為1：3)，混勻後室溫孵育20min，獲得DNA/PEI混合物。將DNA/PEI混合物緩慢加入細胞中，邊加邊輕輕晃動搖瓶，然後置於36.5℃，8%的CO2培養箱中培養，七天後獲得細胞料液，收集細胞上清進行純化。
將純化使用的Protein A管柱(Hitrap Mabselect Sure，GE，11-0034-95)使用0.1M NaOH處理2h，玻璃瓶等用蒸餾水洗淨後在180℃乾烤4h。純化前將收集的細胞料液4500rpm離心30min，將上清使用0.22μm的濾器過濾。使用10個管柱體積的結合緩衝液(磷酸鈉20mM.NaCl 150mM,PH7.0)平衡
Protein A管柱。將過濾後的上清加入純化管柱後使用10個管柱體積的結合緩衝液平衡。加5ml沖提緩衝液(檸檬酸+檸檬酸鈉0.1M,pH3.5)，收集沖提液，每1ml的沖提液加入80μl濃度為2M Tris-HCl。將收集的抗體超濾濃縮交換到PBS(Gibco，70011-044)中，並檢測濃度。
實施例4、SPR法測定CLDN18.2抗體親和力
採用表面電漿共振法(Surface plasmon resonance,SPR)測定HB37A6結合人CLDN18.2的平衡解離常數(KD)。根據製造商的說明，使用胺基偶聯試劑盒(GE Healthcare，BR-1006-33)，將人Claudin 18.2(GenScrip，P50251802)偶聯在CM5芯片(GE Healthcare，29-1496-03)表面，偶聯後注入1M乙醇胺，對剩餘的活化位點進行封閉。根據製造商的說明，藉由Biacore(GE Healthcare，T200)檢測芯片表面抗原與流動相中的抗體之間的結合與解離獲得親和力及動力學常數。將梯度稀釋後的抗體(0-100nM)，由低濃度到高濃度的順序流過芯片表面，結合時間180s，解離時間600s。最後使用10mM Glycine pH 1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)對芯片進行再生。數據結果使用Biacore T200分析軟體，以1：1結合模型進行動力學的分析。如表1所示：HB37A6親和力均優於對照抗體Zmab。
表1. SPR法檢測CLDN18.2抗體的親和力常數(平衡解離常數)
實施例5、CLDN18.2抗體與CLDN18細胞的結合特異性
藉由流式細胞術(FACS)測定上述抗CLDN18.2單株抗體HB37A6以及對照抗體Zmab分別與實施例1獲得的穩定轉染了人源CLDN18.2和人源CLDN18.1的CHO-S細胞系(即如實施例1該製備的CHO-hCLDN18.2和CHO-hCLDN18.1)的結合。
具體而言，將實施例1獲得的待檢測細胞(CHO-hCLDN18.2和CHO-hCLDN18.1)計數，並稀釋至1×106個細胞/ml，向U型底96孔板中加入100μl/孔。500g 5min，離心，去除細胞培養基。將抗CLDN18.2單株抗體HB37A6以及對照抗體Zmab加入U型板並重新懸浮細胞，每孔加100μl，抗體的起始濃度為900nM，然後依次3倍稀釋，共10個濃度點。冰上靜置30min。500g 5min去除上清，PBS洗細胞1遍。每孔加入100μl山羊抗人Fc的PE標記的二抗(SouthernBiotech,J2815-5H87B)。冰上避光孵育30min。500g 5min去除上清，PBS洗細胞1遍。用50μl 1×PBS重新懸浮細胞，FACS上機檢測。使用GraphPad Prism軟體分析實驗數據，得到圖1和圖2。如圖1和圖2所示，該抗體均特異地結合人CLDN18.2，而不與人CLDN18.1結合。
實施例6、CLDN18.2抗體與腫瘤細胞系的結合
參照實施例5，藉由FACS測定HB37A6與胃癌細胞系NUGC-4(JCRB細胞庫，JCRB0834)、胃癌細胞系KATO III-hCLDN18.2和胰腺癌細胞系DAN-G-hCLDN18.2的結合。圖3顯示全人源抗體HB37A6均具有較好的腫瘤細胞特異性結合，優於對照抗體Zmab。
實施例7、CLDN18.2抗體的體內抗腫瘤效果
1、抗體對DAN-G-CLDN18.2荷瘤小鼠模型的活性
應用HB37A6抗體測試其在帶有人胰腺癌的NOD-SCID小鼠(雌性NOD-SCID小鼠(15-18g)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，數量60隻)內的抗腫瘤效果。將實施例1構建的人胰腺癌細胞DAN-G-hCLDN18.2進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞，以PBS(1×)分散DAN-G-hCLDN18.2，獲得細胞密度為12×10^5個/ml的懸液。將細胞懸液與matrigel膠1：1混合製備成細胞濃度為6×10^5個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOD-SCID小鼠右側腹部區域中來建立DAN-G-CLDN18.2荷瘤小鼠模型。
腫瘤細胞接種5天後檢測各隻小鼠瘤體積，挑選出瘤體積在43.36mm3~89.47mm3範圍內的小鼠按瘤體積大小蛇形分組(每組8隻小鼠)分組。
對每隻小鼠施用hIgG(Equitech-Bio，批號160308-02)和HB37A6及對照抗體Zmab，給藥劑量為每次10mg/kg，分別在接種後第5、9、12、16天給藥，每週2-3次監測小鼠瘤體積。腫瘤體積測定：採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W2/2。採用電子天平測定體重。
2、抗體對NUCG-4荷瘤小鼠模型的活性
選取HB37A6抗體測試其在帶有人胃癌的NOG小鼠(雌性NOG小鼠(15-18g)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，數量100隻)內的抗腫瘤效果。將PBMC細胞(Allcells)復蘇，離心收集細胞，以PBS(1×)分散PBMC細胞，細胞密度為2.5×10^6個/ml細胞懸液，在第0天取0.2ml細胞懸液用於NOG小鼠眼靜脈注射，建立NOG人源化小鼠模型。
將NUGC-4細胞進行常規復蘇傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞，以PBS(1×)分散NUGC-4細胞，細胞密度為12×10^6個/ml與matrigel膠1：1混合製備成細胞濃度為6×10^6個/ml細胞懸液。在第5天取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOG人源化小鼠右側腹部區域中來建立NUCG-4荷瘤小鼠模型。
腫瘤細胞接種後第1天隨機分組，每組7隻，對每隻小鼠施用hIgG(Equitech-Bio，批號160308-02)和HB37A6及對照抗體Zmab，給藥劑量為每次10mg/kg，分別在接種後第1、5、8、12天給藥，每週2-3次監測小鼠瘤體積與體重。腫瘤體積測定：採用遊標卡尺測定腫瘤的最大長軸(L)和最大寬軸(W)，腫瘤體積按如下公式計算：V=L×W2/2。採用電子天平測定體重。在接種第26天計算相對腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：
TGI%=100%*(對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。
3、結果
結果如圖4所示，HB37A6及對照抗體Zmab在人胰腺癌DAN-G-CLDN18.2小鼠模型上都能抑制腫瘤生長，HB37A6的TGI為28%，Zmab的TGI為24%。如圖5所示，HB37A6在人胃癌NUGC-4小鼠模型上比對照抗體Zmab展示出更佳的抗腫瘤效果，HB37A6的TGI為31%，Zmab的TGI為0%。
實施例8 抗CD3單株抗體的製備
將鼠源CD3抗體sp34(U.S.Pat.No.8,236,308；J.Immunol.Methods.,1994,178：195)和sp34經過人源化和親和力優化的抗CD3單株抗體HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97和以全長單株抗體的形式在HEK293細胞(Invitrogen,A14527)中表達。
將HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97、sp34的重鏈可變區重鏈可變區和輕鏈可變區(參見序列信息)放置在IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：23)和輕鏈lambda恆定區(SEQ ID NO：28)的N端。之後構建到帶有N端信號肽的pcDNA3.1表達載體中，獲得輕重鏈表達載體。將所獲得的輕、重鏈表達載體藉由PEI(Polysciences Inc,23966)共轉染到HEK293細胞中，培養7天後收集培養基上清。上清藉由Protein A管柱(Hitrap Mabselect Sure，GE 11-0034-95)進行純化，之後超濾並換液到PBS(Gibco，70011-044)中，採用A280法檢測濃度並用SEC-HPLC法測定純度，獲得純度大於95%的抗體溶液，得到重組抗CD3單株抗體HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97和鼠源CD3抗體sp34。具體轉染和純化過程參見實施例3。
實施例9. 抗CD3單株抗體與人CD3的結合
Jurkat細胞是永生化的人T淋巴細胞，其表達人的CD3複合物，利用該細胞系檢測本發明的抗體與該細胞的結合情況。
詳細操作為：將Jurkat細胞(Promega,J1621)接種於U型96孔板中，每孔2×105個，將所要檢測的抗體(抗CD3單株抗體HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97和鼠源CD3抗體sp34)按照一系列的濃度梯度(抗體分子起始濃度為500nM,3倍梯度進行稀釋)，加入到對應的細胞孔中，置於4℃孵育30分鐘，然
後使用PBS清洗未結合的部分，加入羊抗人Fc的PE螢光二抗(SouthernBiotech,J2815-5H87B)，4℃孵育15分鐘後，使用流式細胞儀(FACSCELESTA,BD)上機檢測。
結果：
如圖6顯示，人源化CD3抗體HzSP34.24與鼠源抗體sp34在細胞水平上表現出了相當的親和力，而Hzsp34.87和Hzsp34.97與CD3在細胞水平的親和力出現了不同程度的弱化。
實施例10. CD3抗體的T細胞激活功能檢測
本發明使用Jurkat NFAT(Nuclear Factor of Activated T)報告細胞(Promega,J1621)檢測抗CD3單株抗體HzSP34.24、HzSP34.87、HzSP34.97和鼠源CD3抗體sp34的T細胞激活功能，該細胞是工程化改造的Jurkat T細胞，當該細胞藉由TCR-CD3通路被激活後，藉由下游信號NFAT向實驗體系中釋放螢光素酶受質，從而可以檢測T細胞的激活程度。
本實施例的詳細操作為：使用白色96孔平底板，每孔將Jurkat NFAT細胞4×104個與對應濃度的各個抗體分子(抗體分子起始濃度為500nM,3倍梯度進行稀釋)混合，置於37℃培養箱孵育6-8小時，然後每孔加入100微升Bio-Glo(Promega,G7940)，使用酶標儀(Spectra,Molecular Devices)進行波長檢測。結果如圖7所示，鼠源CD3抗體sp34，人源化CD3抗體HzSP34.24，Hzsp34.87和Hzsp34.97均具有T細胞激活能力。
實施例11.雙特異性抗體的構建與製備
按表2組合，將抗CLDN18.2單株抗體HB37A6與3個不同抗人CD3單株抗體HzSP34.24、HzSP34.87和HzSP34.97的抗原結合區的序列分別構建靶向
CLDN18.2×CD3的“1+1”形式的雙特異性抗體030、032和033，其抗體結構示意圖參見圖8。具體而言，特異性靶向CLDN18.2的抗原結合結構域的重鏈可變區序列為SEQ ID NO：4，輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：9；特異性靶向CD3的抗原結合結構域的重鏈可變區序列為：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32，輕鏈可變區序列為SEQ ID NO：27。抗體的Fc段選取杵臼結構的IgG1LALA序列(A.Margaret Merchant等，Nature Biotechnology，1998)。因此，雙特異性抗體CLDN18.2端部分的重鏈為SEQ ID NO：37，輕鏈為SEQ ID NO：38。雙特異性抗體CD3端部分的重鏈分別為SEQ ID NO：39、41和42，輕鏈為SEQ ID NO：40。
雙特異性抗體的質粒構建過程為：分別將CLDN18.2的重鏈序列(SEQ ID NO：37)、CLDN18.2的輕鏈序列(SEQ ID NO：38)，CD3的重鏈序列(SEQ ID NO：39、41和42)、CD3的輕鏈序列(SEQ ID NO：40)插入到載體pcDNA3.1(Invitrogen,V790-20)中，分別得到CLDN18.2端的重鏈質粒、輕鏈質粒，CD3端的重鏈質粒、輕鏈質粒。然後利用PEI(Polysciences，23966)分別將CLDN18.2端的重鏈質粒、輕鏈質粒和CD3端的重鏈質粒和輕鏈質粒瞬時轉染到Expi293細胞(Invitrogen,A14527)中，表達CLDN18.2端的和CD3端的3個抗體分子。7天後獲得細胞發酵液，將其過濾澄清，分別用HitrapMabselect Sure的Protein A管柱(GE Healthcare，11-0034-95)進行捕獲，得到CLDN18.2端和CD3端的抗體。採用A280法檢測濃度之後，兩端的抗體按莫耳比例1：1混合。加入適量還原劑GSH，室溫反應過夜。超濾去除還原劑，終止反應。之後採用MonoS陽離子交換層析(GE Healthcare,17-5168-01)進行精細純化，A液為20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.6)，B液為含有1M氯化鈉的20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.6)，沖提梯度為0-
50%(30管柱體積)。將沖提得到的蛋白溶液超濾並換液到PBS(Gibco，70011-044)中，用質譜進行分子量的測定，並用SEC-HPLC進行純度鑑定。獲得的030、032和033雙特異性抗體用於以下實施例。
表2. CD3/CLDN18.2雙特異性抗體列表
實施例12.雙特異性抗體親和力測定
採用生物膜薄層干涉測定技術(BLI)測定本發明雙特異性抗體結合人CD3蛋白的平衡解離常數(KD)。BLI法親和力測定按照現有的方法(Estep,P等人，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2)：第270-8頁)進行。
實驗開始前半個小時，根據樣品數量，取合適數量的AHC(18-5060,Fortebio)傳感器浸泡於SD緩衝液(1x PBS，BSA 0.1%，Tween-20 0.05%)中。取100μl的SD緩衝液、各雙特異性抗體、人CD3蛋白(CT026H0323H，北京義翹神州)，分別加入到96孔黑色聚苯乙烯半量微孔板(Greiner，675076)中。使用Fortebio Octet Red96進行檢測，根據樣品位置布板，選擇傳感器位置。儀器設置參數如下：運行步驟：Baseline、Loading ~1nm、Baseline、Association和Dissociation；各個步驟運行時間取決於樣品結合和解離速度，轉速為1000rpm，溫度為30℃。使用ForteBio Octet分析軟體分析KD值。
雙特異性抗體的親和力如表3所示。其中，030分子CD3端親和力最高，為7.4nM。032和033分子CD3端親和力依次降低，分別為89nM和440nM。
表3. 雙特異性抗體CD3端親和力
採用表面電漿共振法(Surface plasmon resonance,SPR)測定結合人CLDN18.2的平衡解離常數(KD)。根據製造商的說明，使用胺基偶聯試劑盒(GE Healthcare，BR-1006-33)，將抗原人Claudin18.2(GenScrip，P50251802)偶聯在CM5芯片(GE Healthcare，29-1496-03)表面，偶聯後注入1M乙醇胺，對剩餘的活化位點進行封閉。根據製造商的說明，藉由Biacore(GE Healthcare，T200)檢測芯片表面抗原與流動相中的各個雙特異性抗體之間的結合與解離獲得親和力及動力學常數。將梯度稀釋後的抗體(0-100nM，2倍稀釋)，由低濃度到高濃度的順序流過芯片表面，結合時間180s，解離時間600s。最後使用10mM Glycine pH 1.5(GE Healthcare，BR-1003-54)對芯片進行再生。數據結果使用Biacore T200分析軟體，以1：1結合模型進行動力學的分析。結果如表4所示，030、032和033雙特異性抗體在CLDN18.2端採用的是同一個純株HB37A6，CLDN18.2端的親和力一致，具有非常強的親和力，為0.57nM。
表4. 雙特異性抗體CLDN18.2端親和力
實施例13. 體外T細胞殺傷實驗
將實施例11獲得的030、032和033雙特異性抗體進行體外T細胞殺傷實驗。用完全培養基RPMI-1640(Hyclone,SH30809.01)+10%胎牛血清(FBS,Hyclone,SH30084.03)重新懸浮人外周血單個核細胞(PBMC,Allcells or Saily)，將PBMC調整為2×106個/ml。
將NUGC-4或過表達Claudin18.2的DAN-G腫瘤靶細胞DAN-G-hCLDN18.2，非靶細胞L363(DSMZ，ACC49)用Far-Red(Invitrogen)標記10min，洗滌兩次後重新懸浮在完全培養基中，細胞濃度調整為2×105個/ml。
將PBMC與雙特異性抗體030、032和033分別混合(其中030、032使用的初始濃度為1nM，033使用的初始濃度為400nM，所有抗體均5倍稀釋，共10個濃度點)，37℃孵育30min，然後按照10：1的效靶比，將50μl腫瘤靶細胞(1×104個)加入到50μl PBMC效應細胞中。37℃孵育24小時，離心，用終濃度為10μg/ml的碘化丙啶(propidium iodide,PI,Invitrogen)重新懸浮細胞，用流式細胞儀(BD，FACSCELESTA)檢測Far-Red和PI雙陽的細胞。藉由FACSDiva software(BD,Celestsa)計算腫瘤靶細胞殺傷比例。
從圖9結果顯示，030和032分子在胃癌細胞NUGC-4上具有非常強的殺傷活性，EC50值均小於1pM。而從圖10結果顯示，在CLDN18.2高表
達的胰腺癌細胞DAN-G-hCLDN18.2上，兩者EC50值甚至小於0.1pM。而033分子在兩個腫瘤細胞系上的殺傷活性較弱，弱於030和032，約低1000倍，但是仍能達到最大殺傷(接近100%裂解細胞)。但在CLDN18.2表達陰性的情況下，030、032和033分子均未沒有非特異性的殺傷(圖11)。這說明030、032和033分子均展示了依賴CLDN18.2表達的腫瘤細胞特異性殺傷。而且，本發明的雙特異性抗體的殺傷效果與CLDN18.2在細胞表面的豐度有關，在一定的表達豐度範圍內，細胞表面的CLDN18.2表達量越高，則殺傷效果越好。
實施例14. 體外細胞因子釋放實驗
用完全培養基RPMI-1640(Hyclone,SH30809.01)+10%胎牛血清(FBS,Hyclone,SH30084.03)重新懸浮人外周血單個核細胞(PBMC,Allcells or Saily)，將PBMC調整為2×106個/ml。將NUGC-4或過表達Claudin18.2的DAN-G腫瘤靶細胞DAN-G-hCLDN18.2濃度調整為2×105個/ml。
將PBMC與雙特異性抗體030、032和033分別混合，37℃孵育30min，然後按照10：1的效靶比，將50μl腫瘤靶細胞(1×104個)加入到50μl PBMC效應細胞中。37℃孵育24小時，離心，取細胞上清。用Human Th1/Th2/Th17 Kit試劑盒(BD，貨號560484)檢測細胞因子，室溫孵育3小時，用流式細胞儀(BD，FACSCELESTA)檢測，藉由FCAP Array software(BD)分析上清中細胞因子的釋放。
從圖12和圖13的結果顯示，030，032和033分子在胃癌細胞NUGC-4和胰腺癌細胞DAN-G-hCLDN18.2上均能夠介導IL-2、TNF α和IFNgamma細胞因子的大量釋放，並且與CD3端的親和力呈正相關。
實施例15. 體外T細胞激活實驗
用完全培養基RPMI-1640(Hyclone,SH30809.01)+10%胎牛血清(FBS,Hyclone,SH30084.03)重新懸浮人外周血單個核細胞(PBMC,Allcells or Saily)，將PBMC調整為2×106個/ml。
將NUGC-4或過表達Claudin18.2的DAN-G腫瘤靶細胞DAN-G-CLDN18.2濃度調整為2×105個/ml。將PBMC與雙特異性抗體030、032和033分別混合，37℃孵育30min，然後按照10：1的效靶比，將50μl腫瘤靶細胞(1×104個)加入到50μl PBMC效應細胞中。37℃孵育24小時，離心，去掉上清，將細胞用BV421抗人CD3(Biolegend,317344)、PerCP/Cy5.5小鼠抗人CD4(BD,552838)、APC/Cy7抗人CD8a(Biolegend,300926)、PE抗人CD25(Biolegend,302606)、FITC抗人CD69(Biolegend,310904)4℃孵育一小時，然後用1×PBS洗滌三次，用流式細胞儀(BD，FACSCELESTA)分別檢測CD4+和CD8+T細胞中CD25和CD69雙陽的細胞比例，藉由FACSDiva software(BD,Celestsa)計算CD4+和CD8+T細胞中CD25和CD69雙陽的細胞比例，即為CD4和CD8+ T細胞激活的比例。
根據圖14所示，30，032和033分子在胃癌細胞NUGC-4共培養的情況下能夠特異性激活T細胞，並且激活能力與CD3端的親和力呈正相關。
實施例16. 體內藥效實驗-胃癌模型
本實驗研究在NOG雌性小鼠上雙特異性抗體對NUGC-4荷瘤的抗腫瘤作用。選取49隻NOG雌性小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。
將PBMC細胞(Allcells)復蘇，離心細胞，以PBS(1×)分散PBMC細胞，獲得細胞密度為2×107/ml的細胞懸液。取200μl細胞懸液對小鼠進行眼眶靜脈注射PBMC細胞，4×106/隻。
將NUGC-4細胞進行常規復蘇傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞，以PBS(1×)分散NUGC-4細胞，細胞密度為6×107個/ml與matrigel膠1：1混合製備成細胞濃度為3×107個/ml細胞懸液。在第3天取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOG人源化小鼠右側腹部區域中來建立NUCG-4荷瘤小鼠模型。
細胞接種後第7天用遊標卡尺測量小鼠腫瘤的最大寬軸和最大長軸，計算瘤體積，挑選出瘤體積在53.35mm3~168.07mm3內的小鼠，根據小鼠瘤體積進行蛇形分組(每組6隻小鼠)。對每隻小鼠靜脈注射本發明的雙特異性抗體030、032和033，以及陰性對照h-IgG(Equitech-Bio，批號160308-02)，給藥劑量為0.3mg/kg和1mg/kg，每週給藥一次，一共給藥4次，測量小鼠腫瘤體積頻率為一週兩次。同時計算腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：
TGI%=100% * (對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。
根據圖15所示，在人胃癌NUCG-4荷瘤小鼠模型上，030和032在0.3mg/kg的低劑量能達到TGI 100%，而在高劑量1mg/kg下更是達到50% CR(complete remission，完全緩解)(6隻小鼠中有3隻達到腫瘤完全消失)。而033分子在低劑量下幾乎沒有藥效，在1mg/kg劑量下，TGI能達到20%。整個實驗過程，實驗組和對照組小鼠體重沒有下降。
實施例17. 體內藥效實驗-胰腺癌模型
本實驗研究在NOG雌性小鼠上雙特異性抗體對DAN-G-Claudin18.2荷瘤的抗腫瘤作用。將49隻NOG小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)進行眼眶靜脈注射PBMC細胞，4×106/隻，接種體積200ul/隻(如實施例18所示)。此時記為第0天。
將實施例1構建的人胰腺癌細胞DAN-G-CLDN18.2進行常規傳代培養用於後續體內實驗。離心收集細胞，以PBS(1×)分散DAN-G-CLDN18.2，獲得細胞密度為10×106個/ml的懸液。將細胞懸液與matrigel膠1：1混合製備成細胞濃度為5×106個/ml細胞懸液。在第0天取0.2ml細胞懸液皮下接種至NOD-SCID小鼠右側腹部區域中來建立CLDN18.2過表達的DNA-G胰腺癌人源化模型。
腫瘤細胞接種7天後用遊標卡尺測量小鼠腫瘤的最大寬軸和最大長軸，計算瘤體積，根據小鼠瘤體積進行蛇形分組，將瘤體積在46.42mm3~120.64mm3範圍內的小鼠按瘤體積大小蛇形分組(每組6隻小鼠)分組。
對每隻小鼠靜脈注射本發明的雙特異性抗體030、032和033，以及陰性對照h-IgG(Equitech-Bio，批號160308-02)，腹腔給藥劑量為0.3mg/kg和1mg/kg，每週給藥一次，一共給藥4次，測量小鼠腫瘤體積頻率為一週兩次。同時計算腫瘤抑制率(TGI%)，計算公式如下：
TGI%=100% * (對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/(對照組腫瘤體積-對照組給藥前腫瘤體積)。如圖16所示，在CLDN18.2過表達的DNA-G胰腺癌人源化模型中，030和032分子在兩個劑量下均能達到TGI 100%。而033分子也分別達到TGI 42%(0.3mg/kg)和TGI 76%(1mg/kg)，這可能與DAN-G-CLDN18.2胰腺癌細胞表達CLDN18.2表達量高有關。整個實驗過程，實驗組和對照組的小鼠體重沒有下降。
實施例18. 小鼠PK實驗
本研究利用尾靜脈給藥的方法，向雌性Balb/C小鼠(維通利華)注射10mg/kg的030、032和033，從而研究其在小鼠體內的藥物代謝動力學性質。小鼠給藥
後分別在0.086hr、0.5hr、2hr、6hr、24hr、48hr、4day、7day、14day和21day時間點時經眼球取血，血液於4℃ 3000rpm離心10min，收集血清。利用ELISA測定血清中抗體含量，計算獲得030、032和033在小鼠體內的半衰期。
實驗結果如圖17所示，030、032和033在小鼠體內的半衰期均達到了與正常單抗類似的PK。進而說明本發明構建的雙特異性抗體沒有影響抗體的半衰期。
序列信息：
<110> 大陸商信達生物製藥(蘇州)有限公司(INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO.,LTD.)
<120> 抗Claudin18.2和CD3的雙特異性抗體以及其用途
<130> PF 210767PCT
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Claims (29)
- 一種雙特異性抗體，其包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域，其中第一抗原結合結構域特異性結合CLDN18.2，第二抗原結合結構域特異性結合CD3，其中第一抗原結合結構域包含分別如以下胺基酸序列所示的A1-HCDR1、A1-HCDR2、A1-HCDR3：SEQ ID NO：1、2和3，以及分別如以下胺基酸序列所示的A1-LCDR1、A1-LCDR2和A1-LCDR3：SEQ ID NO：6、7和8；以及第二抗原結合結構域包含(i)分別如以下胺基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO：19、20和29，以及分別如以下胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO：24、25和26；或(ii)分別如以下胺基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO：19、20和21，以及分別如以下胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO：24、25和26；或(iii)分別如以下胺基酸序列所示的A2-HCDR1、A2-HCDR2、A2-HCDR3：SEQ ID NO：19、31和21，以及分別如以下胺基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3：SEQ ID NO：24、25和26。
- 如請求項1所述的抗體，其中第一抗原結合結構域包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區(i)包含與選自SEQ ID NO：4的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者 (ii)包含選自SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且輕鏈可變區(i)包含與選自SEQ ID NO：9的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：9的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1所述的抗體，其中第二抗原結合結構域包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區(i)包含與選自SEQ ID NO：30、22或32的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：30、22或32的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且輕鏈可變區(i)包含與選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項2所述的抗體，其中第二抗原結合結構域包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中重鏈可變區 (i)包含與選自SEQ ID NO：30、22或32的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：30、22或32的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且輕鏈可變區(i)包含與選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1所述的抗體，其中第一抗原結合結構域包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：4的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：9的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且其中第二抗原結合結構域包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含選自SEQ ID NO：30、22或32的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且輕鏈可變區包含選自SEQ ID NO：27的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項1至4中任一項所述的抗體，其還包含重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。
- 如請求項1至4中任一項所述的抗體，其為IgG樣結構的雙特異性抗體。
- 如請求項1至4中任一項所述的抗體，其中該抗體的重鏈恆定區來自IgG1或IgG2或IgG3或IgG4。
- 如請求項1至4中任一項所述的抗體，其包含2個重鏈恆定區，其中一個重鏈恆定區A1-HC與第一抗原結構域的重鏈可變區A1-VH相連構成與CDLN18.2結合部分的重鏈，且另一個重鏈恆定區A2-HC與第二抗原結合結構域的重鏈可變區A2-VH相連構成與CD3結合部分的重鏈，且包含2個輕鏈恆定區，其中一個輕鏈恆定區A1-LC與第一抗原結構域的輕鏈可變區A1-VL相連構成與CLDN18.2結合部分的輕鏈，且另一個輕鏈恆定區A2-LC與第二抗原結合結構域的輕鏈可變區A2-VL相連構成與CD3結合部分的輕鏈。
- 如請求項9所述的抗體，其中A1-HC可以與A2-HC相同或不同，和/或A1-LC與A2-LC相同或不同。
- 如請求項9所述的抗體，其中與CLDN18.2結合部分的A1-VH和A1-VL是全人源的，且與CD3結合部分的A2-VH和A2-VL是人源化的。
- 如請求項9所述的抗體，其中與CLDN18.2結合部分的重鏈(i)包含與選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且與CLDN18.2結合部分的輕鏈(i)包含與選自SEQ ID NO：38的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者 (ii)包含選自SEQ ID NO：38的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項9所述的抗體，其中與CD3結合部分的重鏈(i)包含與選自SEQ ID NO：41、39或42的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：41、39或42的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；和與CD3結合部分的輕鏈(i)包含與選自SEQ ID NO：40的胺基酸序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；或者(ii)包含選自SEQ ID NO：40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 如請求項9所述的抗體，其中與CLDN18.2結合部分的重鏈包含選自SEQ ID NO：37的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且與CLDN18.2結合部分的輕鏈包含選自SEQ ID NO：38的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；與CD3結合部分的重鏈包含選自SEQ ID NO：41、39或42的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成；且與CD3結合部分的輕鏈包含選自SEQ ID NO：40的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
- 一種分離的核酸，其編碼如請求項1至14中任一項所述的抗體。
- 一種包含如請求項15所述的核酸的表達載體。
- 一種包含如請求項15所述的核酸或如請求項16所述的表達載體的宿主細胞。
- 如請求項17所述的宿主細胞，其中該宿主細胞是293細胞或CHO細胞。
- 一種製備抗體的方法，該方法包括在適於表達編碼如請求項1至14中任一項所述的抗體的核酸的條件下培養如請求項17或18所述的宿主細胞。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至14中任一項所述的抗體，以及藥用輔料。
- 一種藥物組合，其包含如請求項1至14中任一項所述的抗體，以及一種或多種其它治療劑。
- 如請求項21所述的藥物組合，其中該其它治療劑選自化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑。
- 一種如請求項1至14中任一項所述的抗體、或請求項20所述的醫藥組成物、或如請求項21或22所述的藥物組合在製備藥物中的用途，該藥物用於預防或治療受試者的腫瘤。
- 如請求項23所述的用途，其中該腫瘤為癌症。
- 如請求項24所述的用途，其中該癌症具有升高的核酸或蛋白質水平的CLDN18.2。
- 如請求項24所述的用途，其中該癌症為胰腺癌或胃癌或胃食管交界癌。
- 如請求項23至26中任一項所述的用途，其中該用途還包括向受試者施用一種或多種療法。
- 如請求項27所述的用途，其中該療法為治療方式和/或其它治療劑。
- 如請求項28所述的用途，其中該治療方式包括放射療法或手術，或者治療劑包括化療劑、血管生成抑制劑、細胞因子、細胞毒性劑、其它抗體、小分子藥物或免疫調節劑。
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