TWI819203B - 經修飾腺病毒及含有其之醫藥 - Google Patents
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Abstract
本發明之目的在於提供一種具有針對標的細胞之殺細胞活性且安全性較高之經修飾腺病毒。
本發明係關於一種經修飾腺病毒、及含有其等之醫藥，該經修飾腺病毒係具備E1A基因、具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列、及導入至自身之增殖所必需之病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置之AU富集元件的經修飾腺病毒；或具備E1A基因及具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列，且無法表現正常之E4orf6蛋白質的經修飾腺病毒；且E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離為1500 bp～4500 bp。
Description
本發明係關於一種具有針對包含AU富集元件之mRNA之穩定化亢進之細胞之特異性殺細胞活性的、組入有編碼AU富集元件之基因之經修飾腺病毒及含有其之醫藥。
於癌症治療中，如今同時確保攻擊癌細胞之有效性、及不攻擊正常之細胞或不會對患者帶來較重副作用之安全性為重要之課題。針對該課題，提倡使用對癌細胞顯示特異性殺細胞效果之所謂腫瘤溶解病毒的癌症治療法，推進實用化。
腫瘤溶解病毒之代表例係被稱為Onyx-015之缺失了編碼E1B55K之基因之腺病毒(非專利文獻1)。該腺病毒係無法表現由E1B基因所編碼之55 kDa之蛋白質(E1B55K)的病毒，對腫瘤抑制基因p53未正常發揮功能(包含表現變異p53之情形)之腫瘤細胞、或病毒後期基因之mRNA運輸至核外之腫瘤細胞顯示殺細胞效果。然而，指出有如下問題：p53未正常發揮功能之腫瘤細胞為癌症種類整體之約50%，而Onyx-015之應用範圍限於該等癌症種類。
本發明者以擴大可應用之腫瘤之範圍為主要目的，著眼於在腫瘤細胞中，包含AU富集元件(AU-Rich Element，亦被稱為AU富集序列，以下表示為ARE)之mRNA之穩定化亢進，提出在自身之複製所必需之病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置導入有ARE的經修飾病毒、及具有經修飾E4orf6(Early region 4 open reading frame 6，早期區域4開放閱讀框6)基因之經修飾腺病毒(專利文獻1)。
ARE係存在於mRNA之3'末端非轉譯區中之富含腺嘌呤(A)及尿嘧啶(U)之區域，高頻度地存在於由癌基因或細胞激素基因等增殖相關基因所轉錄之mRNA之3'非轉譯區。已知包含ARE之mRNA(以下，表示為ARE-mRNA)藉由Tristetraprolin(TTP)、Zfp36L1、Zfp36L2、AUF1、KSRP等識別ARE進行結合而快速分解。另一方面，在HuR蛋白質結合於ARE而受到各種應激之細胞內，ARE-mRNA藉由HuR向核外運輸，從而穩定化。
由於HuR於腫瘤細胞或炎症相關細胞等特定細胞內穩定地局部存在於細胞質，故而期待導入有ARE之經修飾病毒發揮於因HuR而使ARE-mRNA恆常地穩定化之該等細胞中選擇性地增殖，於正常細胞中不增殖之有效性及安全性。有效性及安全性、特別是安全性之確保於腫瘤溶解病毒中為最為重要之課題之一。
先前技術文獻
非專利文獻
非專利文獻1：Bischoff et al., Science, 1996, Vol.274, pp.373-376
專利文獻
專利文獻1：日本專利特開2016-160249號公報
[發明所欲解決之問題]
本發明之目的在於提供一種具有針對標的細胞之殺細胞活性，且安全性較高之經修飾腺病毒。
[解決問題之技術手段]
本發明者等人發現，於專利文獻1所記載之導入有ARE之經修飾腺病毒中，藉由調節E1A(Early region 1A，早期區域1A)基因與增強其表現之增強子序列之距離，可維持殺腫瘤細胞活性且提高安全性，從而完成下述之各發明。
(1)一種經修飾腺病毒，其係具備E1A基因、具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列、及導入至自身之增殖所必需之病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置之AU富集元件者，且E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離為1500 bp～4500 bp。
(2)如(1)記載之經修飾腺病毒，其中自身之增殖所必需之病毒基因係E1A基因。
(3)一種經修飾腺病毒，其係具備E1A基因及具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列，且無法表現正常之E4orf6蛋白質者，且E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離為1500 bp～4500 bp。
(4)如(3)記載之經修飾腺病毒，其中經修飾腺病毒係以於腫瘤結構域(oncodomain)內不表現具有α螺旋結構之E4orf6蛋白質之方式經修飾之腺病毒。
(5)如(4)記載之經修飾腺病毒，其具有包含序列編號1所示之鹼基序列或編碼與其所編碼之胺基酸序列相同之胺基酸序列之鹼基序列的經修飾E4orf6基因。
(6)如(4)記載之經修飾腺病毒，其具有編碼序列編號2所示之胺基酸序列之經修飾E4orf6基因。
(7)如(4)記載之經修飾腺病毒，其係缺失了E4orf6之腺病毒。
(8)如(3)至(7)中任一項記載之經修飾腺病毒，其具有導入至自身之增殖所必需之病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置的ARE。
(9)如(8)記載之經修飾腺病毒，其中自身之增殖所必需之病毒基因係E1A基因。
(10)一種醫藥，其包含如(1)至(9)中任一項記載之經修飾腺病毒，用於治療包含AU富集元件之mRNA之穩定化亢進之細胞參與的疾病。
(11)如(10)記載之醫藥，其中包含AU富集元件之mRNA之穩定化亢進之細胞參與的疾病為惡性腫瘤或風濕。
[發明之效果]
根據本發明，可提供一種具有針對標的細胞之殺細胞活性，且安全性較高之經修飾腺病毒，又，含有其之醫藥可成為除了對癌症有效以外亦對風濕有效之治療藥。
本發明之第1態樣係關於一種經修飾腺病毒，其係具備E1A基因、具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列、及導入至自身之增殖所必需之病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置之ARE者，且E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離為1500 bp～4500 bp。
本發明之經修飾腺病毒具備E1A基因及具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列。
於腺病毒中存在51種血清型，於本發明中，可利用所有血清型之腺病毒，但較佳為利用作為病毒載體得到較多利用之5型腺病毒。
E1A基因係於腺病毒基因之中首先被誘導表現的、編碼使腺病毒基因之轉錄活化之E1A蛋白質之基因。E1A蛋白質具有誘導腺病毒之初始基因E4、E1B、E3、E2之各基因以及所有後期基因之表現之功能。
增強子序列(以下，亦簡稱為增強子)係具有於真核生物之DNA中與控制基因表現之啟動子協同增強基因表現的功能之鹼基序列。於本發明中，增強子只要具有增強E1A基因之表現之功能，則無限制，可為存在於腺病毒之E1A基因上游中之固有之增強子(E1A增強子)，亦可為以於哺乳動物細胞內發揮功能之方式組入之異種增強子、例如源自巨細胞病毒(CMV)之增強子或源自疱疹病毒之增強子等。於本發明中，特佳之增強子係存在於5型腺病毒基因組DNA之E1A基因上游-192 bp～-343 bp之E1A增強子(序列編號5)。
於本發明之經修飾腺病毒中，增強子只要以可增強E1A基因之表現之方式配置，則可配置於E1A基因之上游下游之任一者，又，增強子之鹼基序列之朝向可為與E1A基因之轉錄方向相同或相反之任一者。關於E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離，其下限為1500 bp，較佳為2500 bp，更佳為2900 bp，其上限為4500 bp，較佳為3500 bp，更佳為3200 bp。E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離例如為1500 bp～4500 bp、2500 bp～3500 bp、2900 bp～3200 bp。此處，E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離係不論E1A基因及增強子之配置及朝向，均意指E1A基因5'末端之鹼基與增強子之接近E1A基因之末端之鹼基之間的鹼基數。又，於E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之鹼基序列中可存在其他基因，亦可存在非轉錄序列或非轉譯序列等，但無特別限制。
第1態樣之經修飾腺病毒具有導入至自身之增殖所必需之病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置的ARE。
ARE只要為於與Tristetraprolin(TTP)、Zfp36L1、Zfp36L2、AUF1、KSRP等促進ARE-mRNA之分解之蛋白質或HuR等使ARE-mRNA穩定化之蛋白質之關係中具有控制細胞內之ARE-mRNA之穩定性之功能者即可。已知ARE存在於c-fos基因、c-myc基因、TNF-α基因、cox-2基因等參與動物細胞之增殖、分化誘導或免疫應答之各種基因之3'非轉譯區，報告有多種鹼基序列。於本發明中，只要為此種ARE，則皆可利用，但特佳為利用人類基因中存在之ARE。又，導入之ARE可為一個，亦可為複數個，可為一種，亦可為複數種。於本發明中，較佳之ARE之例係人類TNF-α基因中所含之ARE(序列編號3)或人類c-fos基因中所含之ARE(序列編號6)。
又，本發明中之ARE除了RNA分子中之富含A及U之鹼基序列以外，亦包含DNA分子中之相當於ARE之富含A及T(胸腺嘧啶)之鹼基序列。因此，「具有ARE」「包含ARE」係除了RNA分子中包含ARE以外，亦用於DNA分子中包含相當於ARE之富含A及T之鹼基序列之情形。又，「導入ARE」意指以作為轉錄產物之mRNA分子中包含ARE之方式，於編碼基因之基因組或DNA分子中組入相當於ARE之富含A及T之鹼基序列。
作為導入ARE之自身之增殖所必需之病毒基因之例，可列舉：E1A基因、E1B基因、E4orf6基因、E4orf3基因等，較佳為使用E1A基因。於使用E1A基因作為導入ARE之病毒基因之情形時，第1態樣之經修飾腺病毒表示為如下經修飾腺病毒，即，其係具備具有導入至3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置之ARE的E1A基因、及具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列者，且E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離為1500 bp～4500 bp。
ARE導入至上述病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置。特佳為ARE導入至自病毒基因之ORF之終止密碼子之後起至多聚A序列開始為止之位置。又，病毒基因之與3'末端非轉譯區鄰接之位置意指當藉由RNA聚合酶自病毒基因轉錄mRNA時，藉由RNA聚合酶之通讀(read through)而於mRNA之3'末端包含ARE的位置。
如上文說明，ARE具有與TTP等一起促進包含其之mRNA之快速分解之功能。因此，藉由將ARE導入至自身之增殖所必需之病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置，可使自該病毒基因轉錄之mRNA不穩定化。本發明之第1態樣之經修飾病毒於ARE-mRNA快速分解之通常之細胞中，ARE-mRNA所編碼之增殖所必需之蛋白質不表現，故而無法增殖，但於ARE-mRNA之穩定化亢進之細胞中，上述蛋白質穩定地表現，故而可增殖，但不限於上述推斷。
第1態樣之經修飾腺病毒可使用業者所知之各種基因工程方法而製作。例如，可藉由如下方式構建經修飾腺病毒DNA，即，將包含在3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置導入有ARE之自身之增殖所必需之病毒基因及E1A基因的核酸片段、或於使用E1A基因作為自身之增殖所必需之病毒基因之情形時將包含在3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置導入有ARE之E1A基因的核酸片段，以E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離成為1500 bp～4500 bp之方式，組入至包含具備具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子的腺病毒基因組DNA之黏接質體載體pAxcwit或pAxcwit2。
又，於以不具有增強子之腺病毒DNA作為基礎之情形時，例如，可藉由在該腺病毒DNA中組入如下核酸片段而構建經修飾之腺病毒DNA：該核酸片段包含在3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置導入有ARE之自身之增殖所必需之病毒基因、E1A基因及增強子；或於使用E1A基因作為自身之增殖所必需之病毒基因之情形時包含在3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置導入有ARE之E1A基因及增強子；且E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離為1500 bp～4500 bp。
其次藉由將所構建之經修飾腺病毒DNA轉染至HEK293細胞或HEK293T細胞等包裝細胞，可經由病毒結構蛋白質之轉譯、病毒基因組之包裝而將第1態樣之經修飾腺病毒作為病毒粒子進行回收。
第1態樣之經修飾腺病毒只要具有E1A基因、增強子及導入至自身之增殖所必需之病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置的ARE，且於標的細胞中可增殖，則可包含其他基因，又，亦可缺失病毒之增殖所不必需之基因。例如，以上所例示之黏接質體載體pAxcwit及pAxcwit2缺失野生型腺病毒所具有之E1A基因、E1B基因及E3基因。於以pAxcwit或pAxcwit2作為基礎構建本發明之經修飾腺病毒之情形時，需要組入E1A基因。另一方面，由於E1B基因及E3基因於ARE-mRNA之穩定化亢進之細胞中對病毒之增殖沒有E1A重要，故而經修飾腺病毒無需包含該等基因。
又，第1態樣之經修飾腺病毒只要具有E1A基因、增強子及導入至自身之增殖所必需之病毒基因之3'非轉譯區內或與該3'非轉譯區鄰接之位置的ARE，且於標的細胞中可增殖，則亦可基因組上之基因之位置或朝向與野生型腺病毒不同。
第1態樣之經修飾腺病毒之較佳之例係如下經修飾腺病毒：E1A TATA框、E1A編碼區、E1B啟動子及E1B編碼區之部分序列、具體而言自E1B mRNA起點開始包含約1627 bp之鹼基序列之核酸片段以該順序與E1A增強子之鹼基序列之朝向相反地組入至E1A增強子之鹼基序列之正下方，進而於E1A基因之3'非轉譯區內組入有ARE。
利用本發明之經修飾腺病毒所得之針對腫瘤細胞之殺細胞活性之強化如下所示進行推測。若經修飾腺病毒感染腫瘤細胞，則藉由由增強子所得之適度之轉錄增強作用而轉錄適當量之E1Α-ARE mRNA。經轉錄之E1Α-ARE mRNA經核外運輸，穩定地合成E1A蛋白質，從而腺病毒增殖，腫瘤細胞溶解。又，認為於上述本發明之較佳之經修飾腺病毒之另一例中，由於不具有完整之E1B基因，故而亦可能具有與上述Onyx-015等同等之性質。
本發明之另一態樣係關於一種經修飾腺病毒，其係具備E1A基因及具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列，且無法表現正常之E4orf6蛋白質者，且E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離為1500 bp～4500 bp。
E4orf6蛋白質係作為腺病毒之初始基因之一的E4orf6之基因產物，已知：於位於其C末端側之腫瘤結構域(於5型腺病毒之情形時，相當於E4orf6胺基酸序列之204位至294位)中與pp32蛋白質相互作用；存在於腫瘤結構域中之α螺旋結構參與上述相互作用；及經由該相互作用，E4orf6蛋白質與pp32經由直接結合於ARE之HuR蛋白質與3'非轉譯區包含ARE之mRNA結合，不依賴於CRM1地強制、恆常地將包含ARE之mRNA運輸至核外且穩定化(Higashino et al, J. Cell Biol., 2005, Vol.170, pp15-20)。本發明中之「無法表現正常之E4orf6蛋白質」係指無法表現具有與野生型E4orf6蛋白質同等之功能之E4orf6蛋白質，典型而言，係指藉由編碼E4orf6蛋白質之腫瘤結構域之鹼基序列之全部或一部分缺失，或藉由於該鹼基序列發生1個或複數個變異，而無法表現保持腫瘤結構域內之α螺旋結構之E4orf6蛋白質。
上述態樣之較佳之經修飾腺病毒係如下經修飾腺病毒：其具備E1A基因及具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列，且具有包含序列編號1所示之鹼基序列或編碼與其所編碼之胺基酸序列相同之胺基酸序列之鹼基序列的經修飾E4orf6基因；具備E1A基因及具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列，且具有編碼序列編號2所示之胺基酸序列之經修飾E4orf6基因；或具備E1A基因、具有使E1A基因之表現增強之功能之增強子序列，且缺失了E4orf6；並且E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離為1500 bp～4500 bp。
具有包含序列編號1所示之鹼基序列之經修飾E4orf6基因之經修飾腺病毒之例係Halbert et al, J. Virology, 1985, Vol. 56, 250-257所記載之被稱為dl355之腺病毒。又，缺失了E4orf6之腺病毒之例係上述Halbert et al所記載之被稱為dl366之腺病毒。本發明之經修飾腺病毒可藉由以dl355或dl366為基礎，以E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離成為1500 bp～4500 bp之方式進行重組而製作。此處，增強子、E1A基因與增強子之間之距離、E1A基因與增強子之位置關係如上述第1態樣中所說明。再者，具有因所謂密碼子退化而包含與序列編號1所示之鹼基序列不同之鹼基序列，但依然編碼序列編號1所示之鹼基序列所編碼之胺基酸序列之經修飾E4orf6基因的經修飾腺病毒亦構成本發明之一個態樣。
由於本發明之經修飾腺病毒於ARE-mRNA之穩定化亢進之細胞中顯示較高之增殖能力及殺細胞活性，故而可用作用於治療此種細胞參與之疾病之醫藥。因此，本發明提供一種包含上述經修飾病毒之用於治療ARE-mRNA之穩定化亢進之細胞參與之疾病的包含腺病毒之醫藥作為另一態樣。
於本發明中，「ARE-mRNA之穩定化亢進」並非意指因各種應激而暫時使ARE-mRNA穩定化之狀態，而意指例如如腫瘤細胞般無需如上所述之刺激便可使ARE-mRNA於細胞內恆常性地穩定化之狀態。
ARE-mRNA之穩定化亢進之宿主細胞之例為腫瘤細胞(Lopez et al, Oncogene, 2003, 22: 7146-7154)。因此，包含本發明之經修飾腺病毒之醫藥可用作抗腫瘤藥。
ARE-mRNA之穩定化亢進之宿主細胞之另一例係風濕患者之末梢單核細胞及滑膜細胞(Thiele, et al., Exp. Cell Res., 2006, Vol. 312. No. 12)。已知於風濕患者之末梢單核細胞中，促進ARE-mRNA之分解之TTP之表現與健全人相比大為降低，另一方面，自ARE-mRNA轉譯之TNF-α之表現異常亢進，推測ARE-mRNA之穩定化亢進。因此，期待藉由使末梢單核細胞及滑膜細胞感染本發明之經修飾腺病毒而使該末梢單核細胞選擇性地死滅，抑制TNF-α之表現以及由炎症所導致之破骨細胞之誘導，進而抑制成為炎症之標的之滑膜細胞之增殖，藉此可抑制風濕之發展或惡化。如此，包含本發明之經修飾腺病毒之醫藥可用作用於治療風濕之醫藥。
本說明書中所使用之用語「治療」包含以疾病之治癒或暫時緩解為目的之醫學上所容許之所有類型之治療介入。即，包含ARE之mRNA之穩定化亢進之細胞參與的疾病之治療包括包含該疾病之發展之延緩或停止、病變之消退或消失等在內之各種目的之醫學上所容許之介入。
本發明提供一種包含上述各態樣之經修飾腺病毒之醫藥。醫藥可為除了經修飾腺病毒以外，包含任意其他病毒、治療上有效之藥劑、藥學上所容許之載體、緩衝劑、賦形劑、佐劑、防腐藥、填充劑、穩定劑、增黏劑及/或製劑所通常使用之任意成分的醫藥組合物之形態。
藥學上所容許之成分為業者所周知，業者可於通常之實施能力之範圍內，例如自第17修訂版之日本藥典等規格書所記載之成分根據製劑之形態適當選擇使用。又，較佳為利用包含病毒之製劑所利用之各種成分。
本發明之醫藥可為適於投予之任意形態，例如溶液、冷凍乾燥粉末、乳液、懸濁液、錠劑、丸劑、膠囊等固體形、半固體形或液體形，但不限定於該等。於特定之實施形態中，醫藥係以注射劑、點滴劑等非經口製劑之形態使用。作為可用於非經口製劑之載體，例如可列舉：生理鹽水、或包含葡萄糖、D-山梨糖醇等之等張液等製劑中所通常使用之水性載體。
上述形態之醫藥例如可藉由製造包含上述非專利文獻1(Bischoff et al., Science, 1996, Vol.274, pp.373-376)所記載之腫瘤溶解病毒等病毒載體的先前之醫藥之方法或由業者之通常之能力對其等進行改良之方法而製造。
本發明之醫藥以犬、貓等寵物、牛、豬等家畜動物及人類等靈長類、特別是人類作為對象進行投予。向對象投予醫藥例如可仿照包含上述非專利文獻1所記載之腫瘤溶解病毒等病毒載體的先前之醫藥而進行。作為投予路徑，由業者考慮到製劑之形態、疾病、疾病部位及其他投予藥劑時要考慮之各種因素而決定。
本發明之醫藥之較佳之投予路徑係例如血管內投予(較佳為靜脈內投予)、腹腔內投予、腸道內投予、腫瘤內或向其附近之局部投予等非經口投予。於較佳之實施形態之一中，本發明之醫藥藉由靜脈內投予或腫瘤內或向其附近之局部投予而向對象投予。投予可單次投予，亦可反覆投予。
本發明之醫藥係投予根據用法、對象之年齡、疾病之狀態等條件而適當決定的對疾病之治療有效之量。於對對象、特別是對人類投予本發明之醫藥之情形時，其用量範圍可為例如每1位人類對象為1×103
～1×1014
、較佳為1×105
～1×1012
、更佳為1×106
～1×1011
、最佳為1×107
～1×1010
之空斑形成單位(p.f.u.)，可將其1天1次或分複數次、或間歇性地進行投予。
本發明又提供一種包括對需要之對象投予有效量之上述各態樣之經修飾腺病毒的治療ARE-mRNA之穩定化亢進之細胞參與之疾病之方法作為另一態樣。
使用本發明之醫藥之疾病治療即便單獨使用亦有效，但亦可併用任意其他治療，例如將以往之治療與使用本發明之醫藥之治療併用。例如，於癌症治療之情形時，亦可併用使用其他抗癌劑之化學療法、癌症免疫療法或放射線治療等。
以下，藉由非限定性實施例進一步詳細地說明本發明。於實施例中，使用市售之套組之操作係根據套組製造者之操作說明進行。再者，業者容易理解，本發明並不限定於本說明書所記載之特定之方法論、操作說明、細胞株、動物種及屬、構建物以及試劑，該等可適當變更。
實施例
實施例 1 1) E1A 基因之 3' 非轉譯區中導入有 ARE 之經修飾腺病毒之製備
藉由限制酶HpaI使由普林斯頓大學T.Shenk博士提供之在大腸桿菌載體pBR322中插入有5型腺病毒之包含E1A基因及E1B基因之E1區的質體pXhoIC(Logan et al, Cancer Cells 2, 527-532, 1984)開環。於其中組入包含相當於人類TNF-α基因中所含之ARE(5'-gtgattattt attatttatt tattatttat ttatttacag-3'、序列編號3)之鹼基序列及其互補鏈之合成雙鏈DNA片段，構建包含在E1A基因之3'非轉譯區中導入有上述ARE之E1區之質體pXhoIC-ARETNF。
將pXhoIC-ARETNF作為模板，使用兩端包含15個鹼基對之黏接質體側之序列之引子組進行PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)，製備導入有ARE之E1區之擴增片段。藉由融合(In fusion)法將該擴增片段組入至包含缺少了E1A基因及E1B基因之腺病毒基因組之pAxcwit2(塔卡拉生物公司)之Smi I限制部位，構建pAx-ARETNF及pAx-ARETNF-R作為包含在E1A基因之3'非轉譯區中導入有ARE之腺病毒基因組之質體。
將兩質體中所含之插入片段之鹼基序列示於序列編號4。pAx-ARETNF於與pAxcwit2中所含之E1A增強子相同朝向上具有該插入片段，pAx-ARETNF-R於與pAxcwit2中所含之E1A增強子相反朝向上具有該插入片段。於序列編號4所示之鹼基序列中，第1～1217號鹼基相當於E1A基因，第1～43號鹼基為包含TATA框之E1A上游區域，第105～1090號鹼基(一部分包含內含子)為E1A之編碼區，第1091～1217號鹼基為E1A基因之3'非轉譯區，其中之第1120～1159號鹼基為導入之源自人類TNF-α基因之ARE。又，第1218～2913號鹼基相當於E1B基因之一部分(至E1B55k之編碼區之中途)。又，pAx-ARETNF中之E1A mRNA起點與增強子序列末端之間之距離為203 bp，pAx-ARETNF-R中之E1A mRNA起點與增強子序列末端之間之距離為3029 bp。
使用Hilymax(同仁化學研究所公司)使藉由限制酶pacI切斷pAx-ARETNF及pAx-ARETNF-R所得之鏈狀DNA感染293細胞，藉此製備重組腺病毒之母液(stock)，進而使用Fast-Trap腺病毒純化套組(Fast-Trap adenovirus purification kit)(EMD Millpore公司)製備純化病毒(9.0×109
病毒粒子數/mL)。之後，將該病毒表示為AdARET及AdARET-R。
又，使作為野生型5型腺病毒之wt300(自T Shenk博士獲得)、作為缺損了E1B55k之5型腺病毒之dl1520(自加利福尼亞大學A.Berk博士分讓)以與上述相同之方式感染293細胞，從而製備純化病毒。
2) 經修飾病毒中之 E1A 表現量之評價
將1×105
個源自人類肺泡基底上皮腺癌之A549細胞株(自ATCC購買)接種於包含2 ml之DMEM(10%FBS)之6孔培養皿，於37℃下進行培養。去除培養基，重新添加2 ml之包含10%FBS之DMEM，進而以MOI＝1000之方式添加上述1)所製備之AdARET-R，以MOI＝10之方式添加wt300或dl1520，於37℃下將wt300、dl1520溫育24小時，將AdARET-R溫育48小時。自培養液回收病毒，萃取蛋白質後，藉由使用M58抗體之西方法檢測E1A。其結果確認到，與其他病毒相比，AdARET-R之E1A表現量較少(圖1)。
3) 殺細胞活性之評價
將3×103
個作為人類正常細胞之源自包皮皮膚纖維母細胞之BJ細胞及源自人類宮頸癌之HeLa細胞分別接種於包含100 μL之DMEM(10%FBS)之96孔培養皿，於37℃下進行培養。去除培養基，重新添加100 μL之包含10%FBS之DMEM，進而以MOI＝10000之方式添加上述1)所製備之AdARET-R，於37℃下進行溫育。自培養開始起1、5、7天後，使用細胞增殖套組II(Cell Proliferation kit II)(XTT)(Roche公司)進行XTT分析，測定細胞存活率。將添加有同體積培養基代替腺病毒之孔作為對照(mock)，算出相對於mock之相對細胞存活率。其結果確認到，AdARET-R對HeLa細胞顯示殺細胞活性，另一方面，對作為正常細胞之BJ細胞幾乎不顯示殺細胞活性(圖2)。
4) 殺細胞活性之評價
藉由與上述3)相同之方法將AdARET-R或AdARET以MOI＝0.01、0.1或1之方式添加至HeLa細胞及A549細胞進行溫育，藉由自培養開始起7天後之XTT分析測定細胞存活率。其結果確認到，AdARET-R及AdARET皆顯示針對癌細胞之殺細胞活性，針對HeLa細胞，AdARET-R比AdARET顯示更強之殺細胞活性，針對A549細胞，AdARET比AdARET-R顯示更強之殺細胞活性(圖3)。
5) 針對正常細胞之殺細胞活性之比較
藉由與上述3)相同之方法將AdARET-R或AdARET以MOI＝0.01、0.1或1之方式添加至BJ細胞進行溫育，藉由自培養開始起20天後之XTT分析測定細胞存活率。其結果確認到，AdARET-R感染細胞之存活率比AdARET感染細胞之存活率高(圖4)，針對正常細胞，AdARET-R之殺細胞活性比AdARET之殺細胞活性低。
實施例 2
1)E1A基因之3'非轉譯區導入有源自c-fos之ARE的經修飾腺病毒之製備
藉由限制酶HpaI使pXhoIC開環，組入包含相當於人類c-fos基因中所含之ARE(5'- tttt attgtgtttt taatttattt attaagatgg attctcagat atttatattt ttattttatt ttttt -3'、序列編號6)之鹼基序列及其互補鏈之合成雙鏈DNA片段，構建包含在E1A基因之3'非轉譯區中導入有上述ARE之E1區之質體pXhoIC-AREFOS。
將pXhoIC-AREFOS作為模板，使用兩端包含15個鹼基對之黏接質體側之序列之引子組進行PCR，製備導入有ARE之E1區之擴增片段。藉由融合法將該擴增片段組入至pAxcwit2之Smi I限制部位，構建pAx-AREFOS及pAx-AREFOS-R作為包含在E1A基因之3'非轉譯區中導入有ARE之腺病毒基因組之質體。
將兩質體中所含之插入片段之鹼基序列示於序列編號7。pAx-AREFOS於與pAxcwit2中所含之E1A增強子相同朝向上具有該插入片段，pAx-AREFOS-R於與pAxcwit2中所含之E1A增強子相反朝向上具有該插入片段。於序列編號7所示之鹼基序列中，第1～1246號鹼基相當於E1A基因，第1～43號鹼基為包含TATA框之E1A上游區域，第105～1090號鹼基(一部分包含內含子)為E1A之編碼區，第1091～1246號鹼基為E1A基因之3'非轉譯區，其中之第1120～1188號鹼基為導入之源自人類c-fos基因之ARE。又，第1247～2942號鹼基相當於E1B基因之一部分(至E1B55k之編碼區之中途)。又，pAx-AREFOS中之E1A mRNA起點與增強子序列末端之間之距離為203 bp，pAx-AREFOS-R中之E1A mRNA起點與增強子序列末端之間之距離為3058 bp。
使用Hilymax使藉由限制酶pacI切斷pAx-AREFOS及pAx-AREFOS-R所得之鏈狀DNA感染293細胞，藉此製備重組腺病毒之母液，進而使用Fast-Trap腺病毒純化套組製備純化病毒。之後，將該病毒表示為AdAREF及AdAREF-R。
2) 經修飾病毒中之 E1A 表現量之評價
將1×105
個A549細胞株接種於包含2 ml之DMEM(10%FBS)之6孔培養皿，於37℃下進行培養。去除培養基，重新添加2 ml之包含10%FBS之DMEM，進而以MOI＝10之方式添加上述1)所製備之AdAREF或AdAREF-R，於37℃下溫育72小時。自培養液回收mRNA，藉由使用E1A引子(Fw：5'-GAACCACCTACCCTTCACG-3'(序列編號8)、Rev 5'-CCGCCAACATTACAGAGTCG-3(序列編號9))之定量性實時RT-PCR法，進行E1A mRNA之定量。其結果確認到，與AdAREF相比，AdAREF-R之E1A mRNA表現量較少(圖5)。
3) 癌細胞及正常細胞中之經修飾病毒之增殖能力之評價
將5×104
個HeLa細胞株、A549細胞株及BJ細胞株接種於包含2 ml之DMEM(10%FBS)之6孔培養皿，於37℃下進行培養。去除培養基，重新添加2 ml之包含10%FBS之DMEM，進而以MOI＝10之方式添加上述1)所製備之AdAREF或AdAREF-R，於37℃下溫育72小時。溫育後自培養基回收病毒，藉由Adeno-X(註冊商標)快速滴定套組(Rapid Titer Kit)(Clontech)使用293細胞對病毒外殼構成蛋白質之Hexon進行染色，藉此測定病毒量。其結果確認到，與AdAREF相比，AdAREF-R於正常細胞中之增殖能力較低(圖6)。
實施例 3
移植有HeLa S3細胞之荷癌小鼠中之經修飾病毒之抗腫瘤效果
於5週齡之裸小鼠(BALB/c nu/nu；雌、n＝5)之皮下移植源自人類宮頸癌之HeLa S3細胞(1×106
個)，形成腫瘤。將確認到腫瘤之直徑變為9-10 mm之日設為第0天，將缺失了E1A基因之腺病毒dl312、實施例1之AdARET-R及實施例2之AdAREF-R(1×109
vp；100 μl)直接投予至各腫瘤共計2次(第1天及第4天)，經時測定腫瘤之體積(mm3
、藉由長徑×短徑2
×0.5而算出)。腫瘤體積之測定係自第0天開始每5天進行。其結果，於投予了AdAREF-R、AdARET-R之群中，皆抑制腫瘤之增大，確認到兩病毒於體內之效果(圖7)。
序列表非關鍵文字
序列編號1 經修飾E4orf6基因之鹼基序列
序列編號2 經修飾E4orf6蛋白質之胺基酸序列
序列編號3 人類TNF-α基因之ARE之鹼基序列
序列編號4 pAx-ARETNF及pAx-ARETNF-R之插入片段之鹼基序列
序列編號5 5型腺病毒E1A基因之增強子之鹼基序列
序列編號6 人類c-fos基因之ARE之鹼基序列
序列編號7 pAx-AREFOS及pAx-AREFOS-R之插入片段之鹼基序列
序列編號8 用於擴增5型腺病毒E1A基因之正向引子
序列編號9用於擴增5型腺病毒E1A基因之反向引子
圖1係表示藉由西方墨點法對使經修飾腺病毒AdARET-R、野生型腺病毒wt300或E1B55k缺損腺病毒dl1520感染源自人類肺泡基底上皮腺癌之A549細胞時之E1A蛋白質之表現量進行解析所得之結果的圖。
圖2係表示經修飾腺病毒AdARET-R針對作為正常細胞之BJ細胞或源自人類宮頸癌之HeLa細胞之殺細胞活性的曲線圖。
圖3A.、B.係將經修飾腺病毒AdARET-R針對HeLa細胞或A549細胞之殺細胞活性與對照之腺病毒AdARET進行比較顯示之曲線圖。
圖4係將經修飾腺病毒AdARET-R針對BJ細胞之殺細胞活性與對照之腺病毒AdARET進行比較顯示之曲線圖。
圖5係將經修飾腺病毒AdAREF-R於A549細胞中之E1A表現量與對照之腺病毒AdAREF進行比較顯示之曲線圖。
圖6係將經修飾腺病毒AdAREF-R於HeLa細胞、A549細胞及BJ細胞中之增殖能力(病毒生產)與對照之腺病毒AdAREF進行比較顯示之曲線圖。
圖7係將移植有HeLa S3細胞之荷癌小鼠中之經修飾腺病毒AdAREF-R及AdARET-R之抗腫瘤效果與對照之腺病毒dl312進行比較顯示之曲線圖。
<110> 國立大學法人北海道大學(NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY)
<120> 經修飾腺病毒及含有其之醫藥
<130> P17HU08WO
<140> 109109287
<141> 2020-03-19
<150> JP2019-053895
<151> 2019-03-20
<160> 9
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 871
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾e4or f6基因
<400> 1
<210> 2
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾e4or f6多肽
<400> 2
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
<211> 2913
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAx-ARETNF及pAx-ARETNF-R中之插入序列
<400> 4
<210> 5
<211> 152
<212> DNA
<213> 5型腺病毒
<400> 5
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
<210> 7
<211> 2942
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAx-AREFOS及pAx-AREFOS-R中之插入序列
<400> 7
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸，E1A正向引子
<400> 8
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸，E1A反向引子
<400> 9
Claims (9)
- 一種經修飾腺病毒，其係具備E1A基因、E1A增強子序列、及E1A基因之3'非轉譯區內之AU富集元件者，上述E1A基因係以其轉錄方向與上述增強子之鹼基序列之朝向相反地組入，且E1A基因5'末端與增強子序列末端之間之距離為2900bp~3200bp。
- 如請求項1之經修飾腺病毒，其中上述E1A增強子序列係配置於E1A基因之下游。
- 如請求項1之經修飾腺病毒，其中上述E1A增強子序列包含序列編號5所示之鹼基序列。
- 如請求項2之經修飾腺病毒，其中上述E1A增強子序列包含序列編號5所示之鹼基序列。
- 如請求項1至4中任一項之經修飾腺病毒，其中E1B啟動子及E1B編碼區之5'末端側片段係進而於與E1A基因之3'非轉譯區鄰接之位置，以其轉錄方向與上述增強子之鹼基序列之朝向相反地組入，上述E1B編碼區之5'末端側片段係包含至E1B55k編碼區之中途。
- 如請求項1至4中任一項之經修飾腺病毒，其中序列編號4或序列編號7所示之鹼基序列係以與上述增強子之鹼基序列之朝向相反地組入。
- 如請求項5之經修飾腺病毒，其中序列編號4或序列編號7所示之鹼基序列係以與上述增強子之鹼基序列之朝向相反地組入。
- 一種醫藥，其包含如請求項1至7中任一項之經修飾腺病毒，用於治療包含AU富集元件之mRNA之穩定化亢進之細胞參與的疾病。
- 如請求項8之醫藥，其中包含AU富集元件之mRNA之穩定化亢進之細胞參與的疾病為惡性腫瘤或風濕。
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