TWI862583B

TWI862583B - 用於玻璃體內遞送之變異體aav蛋白殼

Info

Publication number: TWI862583B
Application number: TW109113631A
Authority: TW
Inventors: 安納錫塔凱拉維拉; 黛安娜瑟佩達; 美帝賈斯敏
Original assignee: 美商愛德維仁生物科技公司
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2024-11-21
Also published as: CN113766934A; WO2020219933A1; AU2020262948A1; ZA202105975B; MX2021012311A; KR20220004114A; BR112021020957A2; US20200338146A1; JP7623703B2; US11510950B2; IL287438A; JP2022529775A; SG11202108928XA; CN113766934B; TW202106699A; EP3958911A1; CA3130217A1

Abstract

本發明提供變異體腺相關病毒(adeno-associated virus；AAV)蛋白殼蛋白及具有一或多種變異體AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子。本發明亦提供使用重組AAV病毒粒子以便諸如治療或預防疾病或病症之組合物及方法。

Description

用於玻璃體內遞送之變異體AAV蛋白殼

本發明係關於用於玻璃體內遞送之變異體AAV蛋白殼。

治療及預防遺傳性疾病及病症以及其他疾病及病症之有前景的方法為遞送具有基因療法載體(諸如病毒粒子)之治療基因產物。適用於基因療法之病毒粒子之說明性實例包括(但不限於)反轉錄病毒病毒粒子、慢病毒病毒粒子、腺病毒病毒粒子、疱疹病毒病毒粒子、α病毒病毒粒子及腺相關病毒(AAV)病毒粒子。AAV為4.7 kb單股DNA病毒。基於AAV之重組病毒粒子(rAAV病毒粒子)與極佳臨床安全性相關，因為野生型AAV為非病原性的且不具有與任何已知疾病之病因相關性。另外，AAV提供高效基因遞送及在大量組織(包括眼睛、肌肉、肺及腦)中持續轉基因表現之能力。

在關於設計用於基因療法中之病毒粒子方面仍然存在之某些挑戰包括最佳化病毒細胞向性，且特定言之在眼睛之基因療法方面，最佳化對視網膜之遞送。因此，需要用於在所選哺乳動物細胞中表現基因之最佳化病毒粒子。本發明藉由提供有利於將重組AAV病毒粒子遞送至所需細胞及組織之經修飾之AAV蛋白殼蛋白來解決此需要。

本文提供重組腺相關病毒(AAV)病毒粒子，其包含：(a)包含經修飾序列之變異體AAV蛋白殼蛋白，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579內包含一或多個胺基酸取代，其中該經修飾序列包含HKFKSGD (SEQ ID NO: 1)，且其中胺基酸殘基編號對應於AAV5 VP1蛋白殼蛋白；及(b)編碼治療基因產物之聚核苷酸序列。

在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV5蛋白殼蛋白或AAV5與AAV2雜交蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白。

在一些實施例中，經修飾序列包含LAHKFKSGDA (SEQ ID NO: 3)。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列具有至少85%同源性之蛋白殼序列。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中所示之蛋白殼序列。

在一些實施例中，rAAV病毒粒子為變異體AAV5或變異體AAV2與AAV5雜交病毒粒子。在一些實施例中，rAAV病毒粒子為變異體AAV2.5T病毒粒子。

在一些實施例中，重組AAV病毒粒子能夠在玻璃體內注射至哺乳動物中時轉導視網膜細胞。在一些實施例中，重組AAV病毒粒子能夠在玻璃體內注射至哺乳動物中時轉導以下中之一或多者：感光體、視網膜神經節細胞、繆勒氏細胞(Müller cell)、雙極細胞、無軸突神經細胞、水平細胞及視網膜色素上皮細胞。在一些實施例中，重組AAV病毒粒子能夠在玻璃體內注射至哺乳動物中時轉導視網膜色素上皮細胞。

在一些實施例中，治療基因產物為siRNA、miRNA或蛋白質。在一些實施例中，治療基因產物為抗血管內皮生長因子(anti-vascular endothelial growth factor；抗VEGF)基因產物。在一些實施例中，治療基因產物為視蛋白(opsin)。

在一些實施例中，編碼治療基因產物之聚核苷酸側接一或多個AAV ITR。在一些實施例中，一或多個AAV ITR為AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR或其變異體。在一些實施例中，一或多個AAV ITR為AAV2 ITR或AAV5 ITR。

在一些實施例中，重組AAV病毒粒子與AAV2.5T相比具有經改變之細胞向性。

在一些實施例中，本文所揭示之重組AAV病毒粒子適用於治療有需要之個體之視網膜疾病或病症的方法中，其中該方法包含藉由玻璃體內注射向該個體投與包含重組AAV病毒粒子之醫藥組合物。在一些實施例中，本文所揭示之重組AAV病毒粒子用於製備用於治療個體之視網膜疾病或病症用之藥劑。在一些實施例中，疾病或病症為年齡相關之黃斑變性(AMD)、濕性AMD、乾性AMD、視網膜新血管生成、脈絡膜新生血管、糖尿病性視網膜病變、增生性糖尿病性視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、視網膜中央靜脈阻塞、視網膜分枝靜脈阻塞、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變或糖尿病性視網膜水腫。

本文亦提供包含本文所揭示之重組AAV病毒粒子之醫藥組合物。

本文亦提供產生rAAV病毒粒子之方法，其包含：(a)在產生rAAV病毒粒子之條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含：(i)編碼包含經修飾序列之變異體AAV蛋白殼蛋白之聚核苷酸，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579內包含一或多個胺基酸取代，其中該經修飾序列包含HKFKSGD (SEQ ID NO: 1)；(ii)編碼rep蛋白之聚核苷酸；(iii)側接至少一個AAV ITR之聚核苷酸卡匣，該卡匣包含編碼治療基因產物之序列；(iv) AAV輔助功能；以及(b)回收由宿主細胞產生之rAAV病毒粒子。

本文亦提供向個體之視網膜提供治療基因產物之方法，其包含藉由玻璃體內注射向該個體投與本文所揭示之重組AAV病毒粒子或本文所揭示之醫藥組合物。

在一些實施例中，個體已診斷患有或疑似具有選自由以下組成之群的一或多個病狀：急性黃斑視神經視網膜病變、白塞氏病(Behcet's disease)、脈絡膜新生血管、糖尿病性葡萄膜炎(diabetic uveitis)、組織漿菌病(histoplasmosis)、黃斑變性、水腫、多灶性脈絡膜炎(multifocal choroiditis)、影響後眼部部位或位置之眼部損傷、眼部腫瘤、視網膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion)、糖尿病性視網膜病變、增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy；PVR)、視網膜動脈阻塞性疾病(retinal arterial occlusive disease)、視網膜脫落(retinal detachment)、葡萄膜炎性視網膜病(uveitic retinal disease)、交感神經性眼炎(sympathetic ophthalmia)、沃格特小柳-原田(Vogt Koyanagi-Harada；VKH)氏症候群、葡萄膜擴散、因眼部雷射治療引起或受眼部雷射治療影響之後眼部病狀、因光動力學療法引起或受光動力學療法影響之後眼部病狀、光凝(photocoagulation)、放射性視網膜病(radiation retinopathy)、視網膜前膜病症、視網膜分枝靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion)、前部缺血性視神經病變(anterior ischemic optic neuropathy)、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變、非視網膜病變糖尿病性視網膜功能障礙(non-retinopathy diabetic retinal dysfunction)、視網膜裂損症(retinoschisis)、色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa)、青光眼(glaucoma)、尤塞氏症候群(Usher syndrome)、視錐-視桿細胞營養不良、斯特格氏病(Stargardt disease)、遺傳性黃斑變性、視網膜脈絡膜變性、雷伯氏先天性黑矇(Leber congenital amaurosis)、先天性靜止性夜盲(congenital stationary night blindness)、無脈絡脈畸型(choroideremia)、巴-比二氏症候群(Bardet-Biedl syndrome)、黃斑毛細管擴張、雷伯氏遺傳性視神經病變(Leber's hereditary optic neuropathy)、早產兒視網膜病(retinopathy of prematurity)及色覺病症。

本文亦提供治療有需要之個體之視網膜疾病或病症之方法，其包含藉由玻璃體內注射向該個體投與本文所揭示之重組AAV病毒粒子或本文所揭示之醫藥組合物。

在一些實施例中，疾病或病症為急性黃斑視神經視網膜病變、白塞氏病、脈絡膜新生血管、糖尿病性葡萄膜炎、組織漿菌病、黃斑變性、水腫、多灶性脈絡膜炎、影響後眼部部位或位置之眼部損傷、眼部腫瘤、視網膜中央靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病變、增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、視網膜動脈阻塞性疾病、視網膜脫落、葡萄膜炎性視網膜病、交感神經性眼炎、沃格特小柳-原田(VKH)氏症候群、葡萄膜擴散、因眼部雷射治療引起或受眼部雷射治療影響之後眼部病狀、因光動力學療法引起或受光動力學療法影響之後眼部病狀、光凝、放射性視網膜病、視網膜前膜病症、視網膜分枝靜脈阻塞、前部缺血性視神經病變、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變、非視網膜病變糖尿病性視網膜功能障礙、視網膜裂損症、色素性視網膜炎、青光眼、尤塞氏症候群、視錐-視桿細胞營養不良、斯特格氏病、遺傳性黃斑變性、視網膜脈絡膜變性、雷伯氏先天性黑矇、先天性靜止性夜盲、無脈絡脈畸型、巴-比二氏症候群、黃斑毛細管擴張、雷伯氏遺傳性視神經病變、早產兒視網膜病或色覺病症。

本文亦提供變異體AAV蛋白殼蛋白，其包含經修飾序列，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579內包含一或多個胺基酸取代，其中該經修飾序列包含HKFKSGD (SEQ ID NO: 1)，且其中胺基酸殘基編號對應於AAV5 VP1蛋白殼蛋白。

在一些實施例中，經修飾之AAV蛋白殼蛋白在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579處包含LAHKFKSGDA (SEQ ID NO: 3)。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列具有至少85%同源性之蛋白殼序列。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中所示之蛋白殼序列。

本文亦提供包含編碼本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白之核酸序列的核酸。

本文亦提供包含本文所揭示之核酸之表現載體，其中編碼變異體AAV蛋白殼蛋白之核酸序列可操作地連接至啟動子序列。在一些實施例中，表現載體進一步包含編碼rep蛋白之核酸。

本文亦提供包含本文所揭示之表現載體的細胞。在一些實施例中，細胞進一步包含編碼治療基因產物之核酸。在一些實施例中，治療基因產物為siRNA、miRNA或蛋白質。在一些實施例中，治療基因產物為抗血管內皮生長因子(抗VEGF)基因產物。在一些實施例中，治療劑為視蛋白。

本文所引用之所有參考文獻(包括專利申請案及公開案)以全文引用之方式併入本文中。

相關申請之交叉參考

本申請案主張2019年4月26日申請之美國臨時申請案62/839,548及2019年10月21日申請之美國臨時申請案62/923,924之權益，該等臨時申請案中之每一者之內容特此以全文引用之方式併入。

本發明提供變異體AAV蛋白殼蛋白及具有一或多種變異體AAV蛋白殼蛋白之重組腺相關病毒(AAV)病毒粒子。在一些實施例中，重組AAV病毒粒子展現以下特徵中之一或多者：1)視網膜細胞之感染性增加；2)經改變之向性；3)與肝素及/或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖及/或內限界膜(inner limiting membrane；ILM)之結合增加；及4)在玻璃體內投與時，相比於包含其天然野生型及/或親本蛋白殼蛋白而非本文所揭示之經修飾之蛋白殼蛋白的病毒載體，感染及/或遞送治療基因產物跨越ILM之能力增加。亦提供醫藥組合物及方法，該等方法用於使用本文所揭示之組合物中之任一者促進個體之細胞(例如視網膜細胞)中之治療基因產物之表現，例如用於治療或預防疾病或病症。I. 定義

除非另外定義，否則本文所用之所有技術術語均具有與一般熟習此項技術者通常理解相同之含義。

本文所用之術語僅出於描述特定實例之目的且並不意欲為限制性的。如本文所用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該」意欲亦包括複數形式。此外，就實施方式及/或申請專利範圍中所用之術語「包括(including/includes)」、「具有(having/has/with)」或其變異體之程度而言，此類術語意欲以類似於術語「包含」之方式為包括性的。如本文所用之術語「包含」與「包括」或「含有」同義，且為包括性或開放性的。

除非另外陳述，否則本文中對「或」之任何參考皆意欲涵蓋「及/或」。

本文中對「約」一個值或參數之提及包括(及描述)針對該值或參數本身之變化形式。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。

在本發明之一些實施例中，「個體(individual/subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該個體(individual/subject)為人類。

如本文所用之術語「治療(treat/treating/treatment)」、「減輕(ameliorate/ameliorating)」及其他文法等效術語係指緩解、緩和或減輕眼部疾病或病症或眼部疾病或病症之症狀、預防眼部疾病或病症之其他症狀、減輕症狀之潛在代謝原因、抑制眼部疾病或病症，例如遏制眼部疾病或病症之發展、緩解眼部疾病或病症、引起眼部疾病或病症消退或終止眼部疾病或病症之症狀。該等術語進一步包括實現治療效益。術語「治療效益」係指根除或減輕所治療之眼部疾病或病症。此外，藉由根除或減輕與眼部疾病或病症相關之一或多種生理學症狀實現治療效益，使得在患者、個體(subject/individual)中觀測到改善，儘管在一些實施例中，患者、個體(subject/individual)仍罹患眼部疾病或病症。

在一些實施例中，本發明之方法提供預防效益；舉例而言，將醫藥組合物投與處於罹患眼部疾病或病症之風險下的患者、個體(subject/individual)，或投與報導眼部疾病或病症之一或多種生理學症狀的患者、個體(subject/individual)，即使尚未診斷疾病或病症。

如本文所用，術語「投與(administer/administering/administration)」及其類似術語可指用於使得能夠將療法或醫藥組合物遞送至生物作用所需部位之方法。此等方法包括玻璃體內或視網膜下注射至眼睛。

如本文所用之術語「有效量」、「治療有效量」或「醫藥學上有效量」可指足夠量之至少一種所投與之醫藥組合物或化合物，其將在一定程度上緩解所治療之眼部疾病或病症之一或多種症狀。醫藥組合物之「有效量」、「治療有效量」或「醫藥學有效量」可以單位劑量向對其有需要之個體投與(如本文中他處所詳細描述)。

如本文所用之術語「醫藥學上可接受」可指不會消除本文所揭示之化合物之生物活性或特性且相對無毒之材料，諸如載劑或稀釋劑(亦即將該材料投與個體時不會導致不合需要之生物效應或不會以有害方式與其所含之組合物之組分中之任一者相互作用)。

如本文所用之術語「醫藥組合物」可指視情況與至少一種醫藥學上可接受之化學組分混合的生物活性化合物，諸如(但不限於)載劑、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑、賦形劑及其類似物。

如本文所用之「AAV載體」或「rAAV載體」係指腺相關病毒(AAV)載體或重組AAV (rAAV)載體，該重組AAV (rAAV)載體包含不屬於AAV來源之聚核苷酸序列(例如與AAV異源之聚核苷酸，諸如編碼治療性轉基因(例如阿柏西普(aflibercept))之核酸序列)以轉導至目標細胞中或轉導至目標組織。一般而言，異源聚核苷酸側接至少一個及通常兩個AAV反向末端重複序列(inverted terminal repeat sequence；ITR)。術語rAAV載體涵蓋rAAV載體粒子及rAAV載體質體兩者。rAAV載體可為單股的(ssAAV)或自補的(scAAV)。

「AAV病毒」或「AAV病毒粒子」或「rAAV載體粒子」或「rAAV粒子」或「重組AAV病毒粒子」係指包含至少一個AAV蛋白殼蛋白及聚核苷酸rAAV載體之病毒粒子。若粒子包含異源聚核苷酸(例如除野生型AAV基因組，諸如待遞送至目標細胞或目標組織之轉基因以外的聚核苷酸)，則其通常稱為「rAAV載體粒子」或「rAAV載體」。

如本文所用之術語「封裝」可指一系列可導致rAAV粒子之組裝及蛋白殼化之胞內事件。

AAV「rep」及「cap」基因係指編碼腺相關病毒之複製及蛋白殼化蛋白的聚核苷酸序列。AAV rep及cap在本文中稱為AAV「封裝基因」。

術語「多肽」或「蛋白質」在本文中可互換使用，係指任何長度之胺基酸之聚合物。聚合物可為直鏈或分支鏈的，其可包含經修飾之胺基酸，且其可間雜有非胺基酸。術語亦涵蓋已天然或藉由干預修飾之胺基酸聚合物；干預例如雙硫鍵形成、糖基化、脂質化、乙醯化、磷酸化，或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分或毒素結合。定義內亦包括例如含有胺基酸之一或多種類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。

術語「聚核苷酸」係指任何長度之核苷酸(包括去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)之聚合形式或其類似物。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及核苷酸類似物，且可間雜有非核苷酸組分。若存在，可在聚合物組裝之前或之後賦予對於核苷酸結構之修飾。如本文所用，術語聚核苷酸可指雙股分子及單股分子。

如本文所用，「重組」可指生物分子，例如基因或蛋白質，該生物分子(1)已自天然存在之環境中移除；(2)不與自然界中所發現之基因之聚核苷酸之全部或一部分締合；(3)以操作方式連接至自然界中不連接之聚核苷酸；或(4)不存在於自然界中。術語「重組」可參考經選殖之DNA分離物、化學合成之聚核苷酸類似物或藉由異源系統生物合成之聚核苷酸類似物以及由此類核酸編碼之蛋白質及/或mRNA使用。因此，舉例而言，由微生物合成之蛋白質為重組的，例如若其由細胞中所存在之重組基因合成之mRNA合成。

術語「抗VEGF基因產物」包括任何治療劑，包括蛋白質、多肽、肽、融合蛋白、多聚蛋白、抗體、人類單株抗體、抗體片段、適體、激酶抑制劑、受體或受體片段或核酸分子，其可減少、干擾、破壞、阻斷及/或抑制活體內內源性VEGF及/或內源性VEGF受體(VEGFR)或VEGF-VEGFR相互作用或路徑之活性或功能。抗VEGF基因產物可為已知治療基因產物中之任一者，該等治療基因產物可在遞送至活體內細胞、組織或個體中時減少新血管生長或形成及/或水腫或腫脹，例如雷珠單抗(ranibizumab)、溴珠單抗(brolucizumab)或貝伐珠單抗(bevacizumab)。在一些實施例中，抗VEGF基因產物可為天然存在、非天然存在或合成的。在一些實施例中，抗VEGF基因產物可來源於天然存在之分子，該天然存在之分子隨後經修飾或突變以賦予抗VEGF活性。在一些實施例中，抗VEGF基因產物為融合或嵌合蛋白。在此類蛋白質中，功能結構域或多肽人工地融合至一個部分或多肽以製備可在活體內螯合VEGF或充當VEGFR誘餌之融合或嵌合蛋白質。在一些實施例中，抗VEGF基因產物為阻斷內源性VEGFR與其配位體相互作用之融合或嵌合蛋白。

如本文所用，除非另外要求，否則「VEGF」可指任何VEGF或VEGF家族成員之同功異型物，包括(但不限於)VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、胎盤生長因子(placenta growth factor；PGF)或其任何組合，或其任何功能片段或變異體。如本文所用，「VEGF受體」或「VEGFR」或「VEGF-R」可用於指VEGF之受體中之任一者，包括(但不限於)VEGFR-1 (或Flt-1)、VEGFR-2 (或Flk-1/KDR)及VEGFR-3 (或Flt-4)。VEGFR可為膜結合或可溶形式，或受體之功能片段或截短。

如本文所用，除非另外明確說明，否則「sFlt-1蛋白」係指與天然存在之人類sFLT-1序列具有至少90%或更高同源性之多肽序列或其功能片段，以使得sFlt-1蛋白或多肽結合至VEGF及/或VEGF受體。同源性係指兩個序列之間的比對殘基之保留%。天然存在之人類sFLT-1蛋白可包括sFLT-1之任何適合的變異體，包括(但不限於)功能片段、序列，該等功能片段、序列包含插入、缺失、取代、假片段、假基因、剪接變異體或人工地最佳化之序列。

「以操作方式連接」或「可操作地連接」或「偶合」可指遺傳要素之並接，其中該等要素呈准許其以預期方式操作之關係。舉例而言，若啟動子有助於引發編碼序列之轉錄，則啟動子可以操作方式連接至編碼區。在啟動子與編碼區之間可存在中間殘基，只要維持此功能關係即可。

如本文所用之「表現載體」涵蓋例如如上文所論述或如此項技術中已知之質體、小環、病毒載體、脂質體及其類似物之載體，其包含編碼所關注基因產物之聚核苷酸，且用於實現基因產物在預期目標細胞中之表現。表現載體亦可包含可操作地連接至編碼區以促進基因產物在目標中之表現的控制要素。控制要素(例如啟動子、強化子、UTR、miRNA靶向序列等)與其可操作地連接以用於表現之一或多個基因的組合有時稱為「表現卡匣」。許多此等控制要素在此項技術中為吾人所知且可用的，或可易於自在此項技術中可用之組分構築。

「基因產物」為由特定基因之表現產生之分子基因產物包括例如多肽、適體、干擾RNA、mRNA及其類似物。在特定實施例中，「基因產物」為多肽、肽、蛋白質或干擾RNA，該干擾RNA包括短干擾RNA (siRNA)、miRNA或小髮夾RNA (shRNA)。在特定實施例中，基因產物為治療基因產物，例如治療蛋白。

術語「異源」可指基因型不同於其所比較之實體之其餘部分之實體。舉例而言，藉由基因工程改造技術引入至衍生自不同物種之質體或載體中的聚核苷酸可為異源聚核苷酸。自其天然編碼序列移除且以操作方式連接至天然地發現不與其連接之編碼序列的啟動子可為異源啟動子。

除非另外指示，否則本文所描述之方法、組合物及套組可採用分子生物學(包括重組技術)、細胞生物學、生物化學、免疫化學及眼科技術之習知技術及描述，該等習知技術及描述在此項技術中實踐之彼等技術及描述之技能內。此類習知技術包括用於觀測及分析個體之視網膜或視力、重組病毒之選殖及繁殖、醫藥組合物之調配及生物化學純化及免疫化學之方法。可參考本文中之實例來獲得適合技術之特定說明。然而，當然亦可使用等效習知程序。此類習知技術及描述可見於標準實驗室手冊中，諸如Green等人編, Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999)；Weiner等人編, Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007)；Dieffenbach, Dveksler編, PCR Primer: A Laboratory Manual (2003)；Bowtell及Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003)；Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004)；Sambrook及Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006)；以及Sambrook及Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) (全部均來自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer, L., Biochemistry (第4版) W.H. Freeman, N.Y. (1995)；Gait, 「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」 IRL Press, London (1984)；Nelson及Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 第3版, W.H. Freeman Pub., New York (2000)；以及Berg等人, Biochemistry, 第5版, W.H. Freeman Pub., New York (2002)，該等手冊中之所有皆以全文引用之方式併入本文中。

如本文所用之「變異體AAV蛋白殼蛋白」係指AAV蛋白殼蛋白，其中AAV蛋白殼蛋白相對於對應親本AAV蛋白殼蛋白包含至少一個胺基酸差異(例如，胺基酸取代、胺基酸插入、胺基酸缺失)，其中AAV蛋白殼蛋白並不對應於天然存在之AAV蛋白殼蛋白中所存在之胺基酸序列。在一些實施例中，相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之AAV病毒粒子之結合，變異體AAV蛋白殼蛋白賦予與肝素及/或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖之增加之結合。在某些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白賦予：a)與藉由包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之AAV病毒粒子對視網膜細胞之感染性相比，視網膜細胞之感染性增加；b)相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之AAV病毒粒子之向性，經改變之細胞向性；及/或c)相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之AAV病毒粒子，增加之結合及/或跨越ILM之能力。

如本文所用之「經修飾序列」係指與親本AAV或親本AAV蛋白殼蛋白之對應序列相比，包含一或多個取代、插入及/或缺失之序列。

AAV之「輔助病毒」係指允許AAV (例如，野生型AAV)複製且藉由哺乳動物細胞封裝之病毒。AAV之多種此類輔助病毒為此項技術中已知的，包括腺病毒、疱疹病毒及痘病毒(諸如牛痘)。腺病毒涵蓋多個不同子組，但子組C之5型腺病毒最常用。已知人類、非人類哺乳動物及禽類來源之多種腺病毒且可購自貯藏所(諸如ATCC)。疱疹科病毒包括例如疱疹單純型病毒(herpes simplex virus；HSV)及埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus；EBV)，以及細胞巨大病毒(cytomegalovirus；CMV)及假性狂犬病病毒(pseudorabies virus；PRV)；該等病毒亦可購自貯藏所(諸如ATCC)。

「一或多種輔助功能」係指在允許AAV複製及封裝(結合本文所描述之複製及封裝之其他需求)之輔助病毒基因組中編碼之一或多種功能。如本文所描述，可以多種方式提供「輔助功能」，包括藉由提供輔助病毒或向呈反式之生產細胞提供例如編碼一或多種必需功能之聚核苷酸序列。舉例而言，質體或包含編碼一或多種腺病毒蛋白質之核苷酸序列之其他表現載體與rAAV載體一起轉染至生產細胞中。

「感染性」病毒粒子(virion/viral particle)為如下病毒粒子(virion/viral particle)：包含勝任組裝之病毒蛋白殼且能夠將聚核苷酸組分遞送至病毒物種對其具向性之細胞中。該術語未必暗示病毒粒子之任何複製能力。用於計數感染性病毒粒子之分析描述於在本發明及此項技術中之他處。病毒感染性可表示為感染性病毒粒子與總病毒粒子之比率。測定感染性病毒粒子與總病毒粒子之比率的方法為此項技術中已知的。參見例如Grainger等人(2005) Mol. Ther. 11:S337 (描述TCID50感染性力價分析)；及Zolotukhin等人(1999) Gene Ther. 6:973。II. 變異體 AAV 蛋白殼蛋白

本文提供變異體腺相關病毒(AAV)蛋白殼蛋白。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含經修飾序列，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579內包含一或多個胺基酸取代，其中該經修飾序列包含HKFKSGD (SEQ ID NO: 1)，且其中該胺基酸殘基編號對應於AAV5 VP1蛋白殼蛋白。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含經修飾序列，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579內包含一或多個胺基酸取代，其中該經修飾序列包含X₁ X₂ HKFKSGDX₃ (SEQ ID NO: 2)，且其中該胺基酸殘基編號對應於AAV5 VP1蛋白殼蛋白，其中X_1-3 可獨立地為任何胺基酸。在一些實施例中，X_1-3 中之每一者獨立地選自A、L、G、S及T。在一些實施例中，X_1-3 中之每一者獨立地選自A、L、G、S及T。在一些實施例中，X₁ 為L。在一些實施例中，X₂ 為A。在一些實施例中，X₃ 為A。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含經修飾序列，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579內包含一或多個胺基酸取代，其中該經修飾序列包含LAHKFKSGDA (SEQ ID NO: 3)，與SEQ ID NO: 3具有至少80%或至少90%同源性；與SEQ ID NO: 3具有至少80%或至少90%序列一致性；或具有四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個或九個或更多個SEQ ID NO: 3內之連續胺基酸之序列，且其中胺基酸殘基編號對應於AAV5 VP1蛋白殼蛋白。在一些實施例中，經修飾序列包含LAHKFKSGDA (SEQ ID NO: 3)。

儘管本文中提及使用對應於AAV5 VP1蛋白殼蛋白之胺基酸編號的蛋白殼蛋白之胺基酸修飾(包括特定胺基酸取代及插入)，但應理解，亦可在其他血清型AAV之蛋白殼蛋白中，例如在對應於AAV5 VP1之彼等蛋白殼蛋白位置處引入此等胺基酸修飾中之任一者。AAV蛋白序列具有顯著同源性及類似胺基酸編號，且熟習此項技術者可容易確定對應於本文針對AAV5 VP1所特定描述之彼等AAV血清型的其他AAV血清型中之胺基酸殘基。

在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為野生型AAV蛋白殼蛋白，例如1型AAV (AAV1)、2型AAV (AAV2)、3型AAV (AAV3)、4型AAV (AAV4)、5型AAV (AAV5)、6型AAV (AAV6)、7型AAV (AAV7)、8型AAV (AAV8)、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV或綿羊AAV蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV5蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為VP1、VP2或VP3蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV5 VP1蛋白殼蛋白。

在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為變異體AAV蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV或綿羊AAV蛋白殼蛋白之變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV5 VP1蛋白殼蛋白之變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為與SEQ ID NO: 4具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之AAV5 VP1蛋白殼蛋白之變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為與SEQ ID NO: 4具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之AAV5 VP1蛋白殼蛋白之變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為雜交蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2蛋白殼蛋白與AAV5蛋白殼蛋白之雜交。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T蛋白殼蛋白或與AAV2.5T蛋白殼蛋白具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之其變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T蛋白殼蛋白或與AAV2.5T蛋白殼蛋白具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為VP1、VP2或VP3蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白或與AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白(SEQ ID NO: 5)具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之其變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白或與AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白(SEQ ID NO: 5)具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其變異體。

在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列具有至少85%同源性之蛋白殼序列。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列具有至少85%序列一致性之蛋白殼序列。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%同源性之蛋白殼序列。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列具有至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%序列一致性之蛋白殼序列。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白包含SEQ ID NO: 7。

在特定實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白在存在於重組AAV病毒粒子中時，相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子對視網膜細胞之感染性，賦予視網膜細胞之感染性增加。在特定實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白在存在於重組AAV病毒粒子中時，相比於在藉由玻璃體內注射投與包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子對視網膜細胞之感染性，在藉由玻璃體內注射投與時，賦予視網膜細胞之感染性增加。在一些實施例中，視網膜細胞為感光細胞(例如，視桿細胞；視錐細胞)、視網膜神經節細胞(RGC)、視網膜色素上皮(RPE)細胞、繆勒氏細胞、無軸突神經細胞、雙極細胞及水平細胞中之一或多者。在特定實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白在存在於重組AAV病毒粒子中時，相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子之向性，賦予重組AAV病毒粒子之經改變之向性。在特定實施例中，變異體AAV蛋白殼蛋白在存在於重組AAV病毒粒子中時，相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子，在玻璃體內注射之後賦予與肝素及/或硫酸乙醯肝素之增加之結合，及/或結合及跨越內限界膜(ILM)之增加之能力。III. 聚核苷酸及細胞

本文亦提供編碼本文所描述之一或多種變異體AAV蛋白殼蛋白之聚核苷酸。在特定實施例中，聚核苷酸為表現載體。在一些實施例中，表現載體包含編碼本文所描述之經修飾之蛋白殼蛋白之聚核苷酸序列，該經修飾之蛋白殼蛋白可操作地連接至啟動子序列，例如驅使聚核苷酸在細胞中之表現的啟動子序列。在某些實施例中，細胞為宿主細胞。宿主細胞可用於產生包含經修飾之蛋白殼蛋白之病毒粒子。例示性宿主細胞包括哺乳動物細胞(例如HEK293細胞)、昆蟲細胞(例如SF9細胞)、微生物及酵母。在一些實施例中，細胞包含AAV rep基因，諸如編碼AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV或綿羊AAV rep蛋白或其變異體之AAV rep基因。在一些實施例中，AAV rep基因穩定維持於細胞中。

本文亦提供包含編碼本文所描述之經修飾之蛋白殼蛋白的聚核苷酸或載體的細胞。在特定實施例中，聚核苷酸為表現載體，且表現載體包含編碼本文所描述之變異體蛋白殼的聚核苷酸序列，該變異體蛋白殼可操作地連接至啟動子序列，例如驅使聚核苷酸在細胞中之表現的啟動子序列。在一些實施例中，聚核苷酸或載體穩定維持於細胞中。在一些實施例中，細胞進一步包含AAV rep基因。在一些實施例中，AAV rep基因穩定維持於細胞中。在某些實施例中，聚核苷酸或載體進一步包含編碼rep蛋白之序列，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV或綿羊AAV rep蛋白或其變異體。

在一些實施例中，細胞進一步包含聚核苷酸卡匣，該聚核苷酸卡匣包含編碼基因產物(例如治療基因產物，諸如本文所描述之治療基因產物)之序列。在某些實施例中，聚核苷酸卡匣側接一或多個AAV反向末端重複序列(ITR)。在某些實施例中，聚核苷酸卡匣側接於AAV ITR之5'及3'末端上。在一些實施例中，一或多個ITR為AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR或其變異體。在一些實施例中，一或多個ITR為AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR。在一些實施例中，一或多個ITR為包含一或多個核苷酸插入、缺失及/或取代之AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR。IV. 病毒粒子及產生其之方法

本文亦提供包含本文所描述之變異體AAV蛋白殼蛋白之病毒粒子，例如重組AAV病毒粒子。

在一些實施例中，重組AAV病毒粒子進一步包含聚核苷酸卡匣，該聚核苷酸卡匣包含編碼基因產物(例如治療基因產物，諸如本文所描述之治療基因產物)之序列。在某些實施例中，聚核苷酸卡匣側接一或多個AAV反向末端重複序列(ITR)，諸如AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR或其變異體。在某些實施例中，聚核苷酸卡匣側接於AAV ITR之5'及3'末端上。在一些實施例中，一或多個ITR為AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR或其變異體。在一些實施例中，一或多個ITR為包含一或多個核苷酸插入、缺失及/或取代之AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR。在一些實施例中，一或多個ITR為AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR。

在某些實施例中，基因產物抑制個體視網膜中新血管生成，例如脈絡膜新生血管(CNV)。已發現許多細胞因子在CNV產生之調節中起重要作用，其中可包括(但不限於)血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(VEGFR)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor；PDGF)、低氧誘導因子(hypoxia inducible factor；HIF)、血管生成素(Ang)及其他細胞介素、有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase；MAPK)。在一些實施例中，基因產物為VEGF、VEGFR、PDGF、HIF、Ang及MAPK中之一或多者之抑制劑。

在某些實施例中，基因產物抑制個體視網膜中新血管生成，例如脈絡膜新生血管(CNV)。已發現許多細胞因子在CNV產生之調節中起重要作用，其中可包括(但不限於)血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(VEGFR)、血小板衍生生長因子(PDGF)、低氧誘導因子(HIF)、血管生成素(Ang)及其他細胞介素及有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。在一些實施例中，基因產物為VEGF、VEGFR、PDGF、HIF、Ang及MAPK中之一或多者之抑制劑。

在一些實施例中，基因產物為干擾RNA、適體或蛋白質。在一些實施例中，治療基因產物為干擾RNA、適體或蛋白質。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為siRNA、miRNA或蛋白質。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為提供基因功能之位點特異性阻斷之位點特異性核酸酶。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為干擾RNA。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為siRNA或miRNA。

在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為抗VEGF基因產物。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為抗VEGF干擾RNA。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為抗VEGF siRNA或miRNA。

在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為適體。例示性所關注適體包括針對抗血管內皮生長因子(VEGF)之適體。參見例如Ng等人(2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5:123；Lee等人(2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:18902。亦適合使用的為PDGF特異性適體，例如E10030；參見例如Ni及Hui (2009) Ophthalmologica 223:401；及Akiyama等人(2006) J. Cell Physiol. 207:407)。

在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為蛋白質。蛋白質通常為增強視網膜細胞功能之蛋白質，例如視桿或視錐感光細胞、視網膜神經節細胞、繆勒氏細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞、水平細胞或視網膜著色上皮細胞之功能。例示性蛋白質包括神經保護性多肽(例如GDNF、CNTF、NT4、NGF及NTN)；抗血管生成多肽(例如可溶性血管內皮生長因子(VEGF)受體；VEGF結合抗體；VEGF結合抗體片段(例如單鏈抗VEGF抗體)；內皮抑制素；腫瘤抑制素；血管抑制素；可溶性Flt蛋白(Lai等人(2005) Mol. Ther. 12:659)；包含可溶性Flt蛋白之Fc融合蛋白(參見例如Pechan等人(2009) Gene Ther. 16:10)；色素上皮衍生因子(PEDF)；可溶性Tie-2受體；等)；金屬蛋白酶之組織抑制劑-3(TIMP-3)；視蛋白，例如視紫質；抗細胞凋亡多肽(例如Bc1-2、Bc1-X1)；及其類似物。適合的多肽包括(但不限於)神經膠衍生之神經滋養因子(glial derived neurotrophic factor；GDNF)；纖維母細胞生長因子2；神經營養因子(NTN)；睫狀神經滋養因子(CNTF)；神經生長因子(NGF)；神經營養因子4(NT4)；腦衍生之神經滋養因子(BDNF)；表皮生長因子；視紫質；X-連鎖細胞凋亡之抑制劑；及音蝟因子(Sonic hedgehog)。

適合的視蛋白包括例如如美國專利公開案第2007/0261127號(例如ChR2；Chop2)；美國專利公開案第2001/0086421號；美國專利公開案第2010/0015095號；及Diester等人(2011) Nat. Neurosci. 14:387中所描述之光反應性視蛋白。

適合的蛋白質亦包括視網膜裂損蛋白。適合的多肽包括例如色素性視網膜炎GTP酶調節因子(RGPR)-相互作用蛋白1(參見例如GenBank寄存編號Q96KN7、Q9EPQ2及Q9GLM3)；外周蛋白2(Prph2) (參見例如GenBank寄存編號NP_000313；及Travis等人(1991) Genomics 10:733)；外周蛋白；視網膜色素上皮特異性蛋白(RPE65) (參見例如GenBan AAC39660；及Morimura等人(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3088)；及其類似物。

適合的蛋白質亦包括：CHM(無脈絡脈畸型(Rab護航蛋白1))，一種多肽，其在有缺陷或缺失時引起無脈絡脈畸型(參見例如Donnelly等人(1994) Hum. Mol. Genet. 3:1017；及van Bokhoven等人(1994) Hum. Mol. Genet. 3:1041)；及屑同源物1(CRB 1)，一種多肽，其在有缺陷或缺失時引起雷伯氏先天性黑矇及色素性視網膜炎(參見例如den Hollander等人(1999) Nat. Genet. 23:217；及GenBank寄存編號CAM23328)。

適合的蛋白質亦包括在有缺陷或缺失時引起全色盲之蛋白質，其中此類多肽包括例如視錐感光體cGMP-門控通路次單元α (CNGA3) (參見例如GenBank寄存編號NP_001289；及Booij等人(2011) Ophthalmology 118:160-167)；視錐感光體cGMP-門控陽離子通路β-次單元(CNGB3) (參見例如Kohl等人(2005) Eur J Hum Genet. 13(3):302)；鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)；α轉導活性多肽2 (GNAT2) (ACHM4)；及ACHM5；及在有缺陷或缺乏時引起各種形式之色彩失明之多肽(例如L-視蛋白、M-視蛋白及S-視蛋白)。參見Mancuso等人(2009) Nature 461(7265):784-787。

在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為抗VEGF蛋白。在一些實施例中，抗VEGF蛋白為sFlt-1蛋白或其片段或抗VEGF抗體或其片段。在一些實施例中，抗VEGF蛋白為抗VEGF抗體或其片段，諸如阿柏西普、雷珠單抗及貝伐珠單抗或其片段。在一些實施例中，抗VEGF蛋白為sFlt-1蛋白。

VEGF受體FLT-1、sFLT-1之可溶性截短形式為唯一已知之VEGF之內源性特異性抑制劑。在本質上，其藉由替代性mRNA剪接產生且缺乏膜近端免疫球蛋白樣結構域、跨膜跨越區及胞內酪胺酸激酶結構域。在結構上，FLT-1及sFLT-1蛋白可皆包含多個功能結構域。在一些變異體中，FLT及sFLT蛋白通常共用6個互連結構域；3個參與蛋白質之二聚化的結構域及3個參與配位體(諸如VEGF)之結合的結構域。sFLT-1並不受限於細胞膜。未結合之sFLT-1可在胞外空間或溶液中自由擴散。

sFLT-1與VEGF受體之間之相互作用為特異性的且可與100倍過量未標記之VEGF競爭掉。在一些情況下，sFLT-1之血管抑制性活性可由兩個機制抑制VEGF產生：i)將其以高親和力結合至VEGF之螯合，及ii)用VEGF受體FLTt-1及FLK-1/KDR之跨膜同功異型物形成非活性異二聚體。如此項技術中已知，活體外結合分析已指示，sFLT-1以高親和力結合VEGF且亦可抑制VEGF驅使之人類臍靜脈內皮細胞之增殖。在癌症之動物模型中，sFLT-1抑制腫瘤生長。在一些情況下，sFLT-1可以次化學計量或顯性負方式起作用，因為可預防胞外空間中之過量VEGF結合且隨後活化VEGF受體。sFLT-1之此等特性已描述於Kendall及Thomas, 1993；Proc Natl Acad Sci. 90: 10705-10709中，其以全文引用之方式併入本文中。可使用sFLT-1之功能片段代替全長蛋白。更特定言之，VEGF結合結構域(結構域2)或替代地，sFLT-1之結構域2加來自sFLT1、KDR或另一家族成員之結構域3可用於結合及不活化VEGF。此類功能片段描述於Wiesmann等人, 1997; Cell, 91: 695-704中，其以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，sFlt-1蛋白為如美國專利案第5,861,484號中所描述之天然存在之蛋白質sFlt-1及藉由於US2013/0323302中之SEQ ID NO: 109所揭示之序列。例示性sFlt-1胺基酸序列在本文中揭示為SEQ ID NO: 13。其亦包括(但不限於)其功能片段，包括sFlt-1結構域2或美國專利申請公開案第2013/0323302號之SEQ ID NO: 121中所示之彼等序列，以及相關構築體，諸如美國專利第7,635,474號中所揭示之VEGF結合融合蛋白。例示性sFlt-1功能片段在本文中揭示為SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，sFLT-1蛋白與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%同源。在一些實施例中，sFLT-1蛋白與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%序列一致性。抗VEGF蛋白亦可包括美國專利申請公開案第2013/0323302號中所描述之sFLT-1蛋白、其變異體或片段中之任一者。

在一些實施例中，sFLT-1蛋白與天然存在之人類sFLT-1蛋白序列至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%同源。在一些實施例中，sFLT-1蛋白與天然存在之人類sFLT-1蛋白序列至多約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%同源。在一些實施例中，sFLT-1蛋白與天然存在之人類sFLT-1蛋白序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%序列一致性。在一些實施例中，sFLT-1蛋白與天然存在之人類sFLT-1蛋白序列具有至多約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%序列一致性。在一些實施例中，sFLT-1蛋白與天然存在之人類sFLT-1蛋白構形至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%在空間上同源。在一些情況下，sFLT-1蛋白與天然存在之人類sFLT-1蛋白構形至多約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%或100%在空間上同源。

在一些實施例中，抗VEGF蛋白為抗VEGF抗體。在一些實施例中，抗VEGF蛋白為雷珠單抗(可在商標Lucentis® (Genentech, San Francisco, CA)下購得，參見針對雷珠單抗之重鏈及輕鏈可變區序列之美國專利第7,060,269號之圖1)；貝伐珠單抗(可在商標Avastin® (Genentech, San Francisco, CA)下購得，參見針對貝伐珠單抗之重鏈及輕鏈可變區序列之美國專利第No. 6,054,297號之圖1)；阿柏西普(可在商標Eylea^® (Regeneron, Tarrytown, NY)下購得)；或溴珠單抗，參見美國專利第10,035,850號。在某些實施例中，貝伐珠單抗包括以下重鏈及輕鏈可變結構域序列，分別為：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL (SEQ ID NO: 8)；及DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (SEQ ID NO: 9)。在某些實施例中，雷珠單抗包括以下重鏈及輕鏈可變結構域序列，分別為：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL (SEQ ID NO: 10)；及DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV (SEQ ID NO: 11)。在某些實施例中，阿柏西普包括以下胺基酸序列：MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 12)。在某些實施例中，阿柏西普包括以下胺基酸序列：EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 15)。

此等序列可由使用遺傳密碼編碼此類序列之DNA表現，該遺傳密碼為熟習此項技術者所理解之標準技術。如熟習此項技術者可瞭解，由於遺傳密碼之簡併，抗VEGF蛋白序列可容易地由多個不同DNA序列表現。

在一些情況下，基因產物(或治療基因產物)為提供基因功能之位點特異性阻斷之位點特異性核酸內切酶，例如其中核酸內切酶基因剔除與視網膜疾病相關之對偶基因。舉例而言，在主要對偶基因編碼基因之缺陷複本之情況下，在野生型時，該基因之缺陷複本為視網膜結構蛋白及/或提供正常視網膜功能，位點特異性核酸內切酶可靶向缺陷型對偶基因且基因剔除缺陷型對偶基因。

除基因剔除缺陷型對偶基因外，位點特異性核酸酶亦可用於刺激與編碼缺陷型對偶基因所編碼之蛋白質之功能複本的供體DNA之同源重組。因此，例如病毒載體可用於遞送基因剔除缺陷型對偶基因之位點特異性核酸內切酶且可用於遞送缺陷型對偶基因之功能複本兩者，使得修復缺陷型對偶基因，由此提供產生功能性視網膜蛋白(例如功能性視網膜裂損蛋白、功能性RPE65、功能性外周蛋白等)。參見例如Li等人(2011) Nature 475:217。在一些實施例中，病毒載體包含編碼位點特異性核酸內切酶之異源核苷酸序列；及編碼缺陷型對偶基因之功能複本之異源核苷酸序列，其中該功能複本編碼功能性視網膜蛋白。功能性視網膜蛋白包括例如視網膜裂損蛋白、RPE65、色素性視網膜炎GTP酶調節因子(RGPR)-相互作用蛋白質1、外周蛋白、周邊蛋白2及其類似物。

適於使用之位點特異性核酸內切酶包括例如鋅指核酸酶(ZFN)；及轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease；TALEN)，其中此類位點特異性核酸內切酶為非天然存在的且經修飾以靶向特定基因。此類位點特異性核酸酶可經工程改造以切割基因組內之特定位置，且非同源末端連接可隨後修復斷裂，同時插入或缺失若干核苷酸。此類插入或缺失(亦稱為「INDEL」)隨後將蛋白質投擲出框且有效地基因剔除基因。參見例如美國專利公開案第2011/0301073號。

在一些實施例中，編碼基因產物之序列可操作地連接至啟動子。在一些實施例中，編碼基因產物之序列可操作地連接至組成啟動子。在其他實施例中，編碼所關注基因產物之核苷酸序列可操作地連接至可誘導啟動子。在一些情況下，編碼基因產物之序列可操作地連接至組織特異性或細胞特異性調節要素。舉例而言，在一些情況下，編碼基因產物之序列可操作地連接至感光體特異性調節要素(例如，感光體特異性啟動子)，例如，賦予可操作地連接之基因在感光體細胞中之選擇性表現的調節要素。適合的感光體特異性調節要素包括例如視紫質啟動子；視紫質激酶啟動子(Young等人(2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076)；β磷酸二酯酶基因啟動子(Nicoud等人(2007) J. Gene Med. 9:1015)；色素性視網膜炎基因啟動子(Nicoud等人(2007) supra)；感光體間類視黃素結合蛋白(IRBP)基因強化子(Nicoud等人(2007) supra)；IRBP基因啟動子(Yokoyama等人(1992) Exp Eye Res. 55:225)。

在特定實施例中，重組AAV病毒粒子能夠結合至肝素及/或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)，例如相比於包含相應親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子，具有親和力為至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在特定實施例中，重組AAV病毒粒子能夠結合至肝素及/或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)，例如相比於AAV5病毒粒子，具有親和力為至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在特定實施例中，重組AAV病毒粒子能夠結合至肝素及/或硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)，例如相比於AAV2.5T病毒粒子，具有親和力為至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。

在特定實施例中，重組AAV病毒粒子能夠結合至內限界膜(ILM)，例如相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子，具有親和力為至少至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在特定實施例中，重組AAV病毒粒子能夠結合至內限界膜(ILM)，例如相比於AAV5病毒粒子，具有親和力為至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在特定實施例中，重組AAV病毒粒子能夠結合至內限界膜(ILM)，例如相比於AAV2.5T病毒粒子，具有親和力為至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。

在特定實施例中，相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子對視網膜細胞之感染性，重組AAV病毒粒子具有增加之視網膜細胞感染性。在特定實施例中，重組AAV病毒粒子能夠跨越ILM。在特定實施例中，相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子對視網膜細胞之感染性，重組AAV病毒粒子具有增加之視網膜細胞感染性且能夠跨越ILM。在特定實施例中，相比於AAV5病毒粒子對視網膜細胞之感染性，重組AAV病毒粒子具有增加之視網膜細胞感染性。在特定實施例中，相比於AAV2.5T病毒粒子對視網膜細胞之感染性，重組AAV病毒粒子具有增加之視網膜細胞感染性。在特定實施例中，重組AAV病毒粒子能夠在玻璃體內注射至哺乳動物中時轉導視網膜細胞。在特定實施例中，重組AAV病毒粒子能夠跨越ILM。在特定實施例中，相比於在藉由玻璃體內注射投與時包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子對視網膜細胞之感染性，在藉由玻璃體內注射投與時，重組AAV病毒粒子具有增加之視網膜細胞感染性。在特定實施例中，相比於在藉由玻璃體內注射投與時AAV5病毒粒子視網膜細胞之感染性，在藉由玻璃體內注射投與時，重組AAV病毒粒子具有增加之視網膜細胞感染性。在特定實施例中，相比於在藉由玻璃體內注射投與時AAV2.5T病毒粒子對視網膜細胞之感染性，在藉由玻璃體內注射投與時，重組AAV病毒粒子具有增加之視網膜細胞感染性。在一些實施例中，一或多種視網膜細胞為感光細胞(例如，視桿細胞；視錐細胞)、視網膜神經節細胞(RGC)、視網膜色素上皮(RPE)細胞、繆勒氏細胞、無軸突神經細胞、雙極細胞及水平細胞中之一或多者。在一些實施例中，視網膜細胞為繆勒氏細胞、視錐細胞、視桿細胞、雙極細胞及/或RPE細胞。在一些實施例中，視網膜細胞為繆勒氏細胞。在一些實施例中，視網膜細胞為視錐細胞。在一些實施例中，視網膜細胞為雙極細胞。在一些實施例中，視網膜細胞為RPE細胞。

在特定實施例中，包含本文所描述之變異體AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子能夠在經由玻璃體內注射遞送時將基因產物(諸如治療基因產物)遞送至視網膜，例如其中相比於包含對應親本AAV蛋白殼蛋白之對應重組AAV病毒粒子，所得表現大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在特定實施例中，包含本文所描述之變異體AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子能夠在經由玻璃體內注射遞送時將基因產物遞送至視網膜，例如其中相比於AAV5及/或AAV2.5T載體，所得表現大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。

此項技術中已知多種用於產生重組AAV病毒粒子之方法，包括轉染、穩定細胞株產生及感染性雜交病毒產生系統，其包括腺病毒-AAV雜交、疱疹病毒-AAV雜交(Conway, JE等人, (1997)J. Virology 71(11):8780-8789)及桿狀病毒-AAV雜交。用於產生rAAV病毒粒子之rAAV產生培養物全部需要；1)適合的宿主細胞；2)適合的輔助病毒功能；3) AAV rep及cap基因；4)側接至少一個AAV ITR序列(例如，過大rAAV載體基因組)之核酸(諸如編碼基因產物之序列)；以及5)適合的培養基及培養基組分以支持rAAV產生。在一些實施例中，適合的宿主細胞為靈長類動物宿主細胞。在一些實施例中，適合的宿主細胞為人類衍生之細胞株，諸如HeLa、A549、293或Perc.6細胞。

在一些實施例中，適合的輔助功能藉由野生型或突變型腺病毒(諸如溫度敏感性腺病毒)、疱疹病毒(HSV)、桿狀病毒或提供輔助功能之質體構築體提供。在一些實施例中，AAV輔助功能藉由腺病毒或HSV提供。在一些實施例中，AAV輔助功能藉由桿狀病毒提供且宿主細胞為昆蟲細胞(例如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda ) (Sf9)細胞)。

在一些實施例中，本文所描述之AAV病毒粒子係產生於昆蟲細胞中。在一些實施例中，本文所描述之AAV病毒粒子係產生於草地黏蟲(Sf9)細胞中。在一些實施例中，本文所描述之AAV病毒粒子係產生於人類衍生之細胞株中。在一些實施例中，本文所描述之AAV病毒粒子係產生於HeLa、A549、293或Perc.6細胞中。在一些實施例中，本文所描述之AAV病毒粒子係產生於HEK-293細胞中。

在一些實施例中，AAV rep基因可來自任何AAV血清型。一般而言，但並非必然的，AAV rep基因具有與rAAV載體基因組之ITR相同的血清型，只要藉由rep基因編碼之rep蛋白可用以複製及封裝rAAV基因組即可。

此項技術中已知之適合的培養基可用於產生rAAV載體。此等培養基包括(但不限於)藉由Hyclone實驗室及JRH生產之培養基，包括經修飾之伊格爾培養基(Modified Eagle Medium；MEM)、杜爾貝科氏經修飾之伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium；DMEM)，定製調配物諸如美國專利第6,566,118號中所描述之彼等調配物且Sf-900 II SFM培養基如美國專利第6,723,551號中所描述，該等專利中之每一者以全文引用之方式併入本文中，尤其關於用於產生重組AAV載體之定製培養基調配物。

一種用於產生rAAV病毒粒子之方法為三重轉染方法。簡言之，含有rep基因及蛋白殼基因(諸如編碼本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白之聚核苷酸)之質體連同輔助腺病毒質體可經轉染(例如使用磷酸鈣方法)至細胞株(例如HEK-293細胞)中，且病毒粒子可經收集且視情況純化。因此，在一些實施例中，rAAV病毒粒子藉由將載體基因組、編碼AAV rep及cap之核酸(諸如編碼本文所揭示之變異體蛋白殼蛋白之聚核苷酸)及編碼AAV輔助功能之核酸三重轉染至宿主細胞中產生，其中將核酸轉染至宿主細胞產生能夠產生rAAV病毒粒子之宿主細胞。

在一些實施例中，rAAV病毒粒子可藉由生產細胞株方法產生，諸如Martin等人, (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269；美國公開案第US2004/0224411；及Liu, X.L.等人(1999) Gene Ther. 6:293-299中所描述之例示性生產細胞株方法。簡言之，細胞株(例如HeLa、293、A549或Perc.6細胞株)可用含有rep基因、蛋白殼基因(諸如編碼本文所揭示之變異體蛋白殼蛋白之聚核苷酸)及載體基因組之質體穩定轉染。可篩檢細胞株以選擇用於rAAV產生之先導殖株，其隨後可擴展至生產用生物反應器且感染輔助病毒(例如腺病毒或HSV)以引發rAAV產生。可隨後收集病毒粒子，可使腺病毒不活化(例如藉由加熱)及/或移除，且可純化rAAV病毒粒子。因此，在一些實施例中，rAAV病毒粒子係藉由包含編碼rAAV基因組之核酸、編碼AAV rep之核酸、編碼本文所揭示之變異體蛋白殼蛋白之聚核苷酸及編碼AAV輔助功能之核酸中之一或多者的生產細胞株產生。

在一些實施例中，編碼AAV rep基因、AAV cap基因及/或rAAV基因組之核酸穩定維持於生產細胞株中。在一些實施例中，在一或多個質體上將編碼AAV rep基因、AAV cap基因及/或rAAV基因組之核酸引入至細胞株中以產生生產細胞株。在一些實施例中，將AAV rep基因、AAV cap基因及rAAV基因組引入至同一質體上之細胞中。在其他實施例中，將AAV rep、AAV cap及rAAV基因組引入至兩個或更多個不同質體上之細胞中。在一些實施例中，經質體穩定轉染之細胞株維持質體用於細胞株之多個通道(例如，細胞株之5、10、20、30、40、50個或超過50個通道)。舉例而言，一或多個質體可複製為細胞複製物，或一或多個質體可整合至細胞基因組中。已鑑別出多種使得質體能夠在細胞(例如，人類細胞)中自主複製之序列(參見例如，Krysan, P.J.等人(1989) Mol. Cell Biol. 9:1026-1033)。在一些實施例中，一或多個質體可含有允許選擇維持質體之細胞的可選標記(例如抗生素抗性標記)。常用於哺乳動物細胞中之可選標記包括(但不限於)殺稻瘟菌素(blasticidin)、G418、潮黴素B (hygromycin B)、吉歐黴素(zeocin)、嘌呤黴素(puromycin)及其衍生物。將核酸引入至細胞中之方法為此項技術中已知的且包括(但不限於)病毒轉導、陽離子轉染(例如，使用諸如DEAE-聚葡萄糖之陽離子聚合物或諸如脂染胺之陽離子脂質)、磷酸鈣轉染、顯微注射、粒子轟擊、電穿孔及奈米粒子轉染(更多細節，參見例如Kim, T.K.及Eberwine, J.H. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 397:3173-3178)。

在一些實施例中，編碼AAV rep基因、AAV cap基因及/或rAAV基因組之核酸穩定整合於生產細胞株之基因組中。在一些實施例中，將一或多個質粒上之編碼AAV rep基因、AAV cap基因及/或rAAV基因組之核酸引入至細胞株以產生生產細胞株。在一些實施例中，將AAV rep基因、AAV cap基因及rAAV基因組引入至同一質體上之細胞中。在其他實施例中，將AAV rep基因、AAV cap基因及rAAV基因組引入至兩個或更多個不同質體上之細胞中。在一些實施例中，一或多個質體可含有允許選擇維持質體之細胞的可選標記(例如抗生素抗性標記)。用於將核酸穩定整合至多種宿主細胞株中之方法為已知的。舉例而言，重複選擇(例如經由使用可選標記)可用於選擇已整合含有可選標記(及AAV cap基因、AAV rep基因及/或rAAV基因組)之核酸的細胞。在其他實施例中，核酸可以位點特異性方式整合至細胞株中以產生生產細胞株。若干位點特異性再組合系統在此項技術中已知，諸如FLP/FRT (參見例如，O'Gorman, S.等人(1991) Science 251:1351-1355)、Cre/loxP (參見例如，Sauer, B.及Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5166-5170)及phi C31-att (參見例如，Groth, A.C.等人(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5995-6000)。

在一些實施例中，產生細胞株來源於靈長類動物細胞株(例如非人類靈長類動物細胞株，諸如Vero或FRhL-2細胞株)。在一些實施例中，細胞株來源於人類細胞株。在一些實施例中，生產細胞株來源於HeLa、293、A549或PERC.6^® (Crucell)細胞。舉例而言，在將編碼AAV rep基因、AAV cap基因及/或rAAV基因組之核酸引入及/或穩定維持/整合至細胞株中以產生生產細胞株之前，細胞株為HeLa、293、A549或PERC.6^® (Crucell)細胞株或其衍生物。

在一些實施例中，生產細胞株適用於在懸浮液中生長。如所已知，固著依賴性細胞通常不能夠在無底物(諸如微載體珠粒)之情況下在懸浮液中生長。使細胞株在懸浮液中生長可包括例如在具有攪拌槳之旋轉培養中生長細胞株；使用缺乏鈣及鎂離子之培養基以預防結塊(及視情況選用之消泡劑)；使用塗佈有滲矽化合物之培養容器；及在各通道處選擇培養物(而非在大塊中或在容器側上)中之細胞。關於進一步描述，參見例如ATCC常見問題文件(可在www[dot]atcc[dot]org/Global/FAQs/9/1/Adapting%20a%20monolayer%20cell%20line%20to%20suspension-40[dot]aspx獲得)及其中所引用之參考文獻。

在一些態樣中，提供一種用於產生如本文中所揭示之rAAV病毒粒子之方法，其包含(a)在產生rAAV病毒粒子之條件下培養宿主細胞，其中宿主細胞包含(i)編碼本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白之聚核苷酸；(ii)編碼rep蛋白之聚核苷酸；(iii)包含編碼基因產物(例如側接至少一個AAV ITR之治療基因產物)之序列的聚核苷酸卡匣；及(iv)AAV輔助功能；以及(b)回收由宿主細胞產生之rAAV病毒粒子。在一些實施例中，該至少一個AAV ITR係選自由以下組成之群：AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV血清型ITR或其類似物。在一些實施例中，方法進一步包含純化rAAV病毒粒子。

本發明之適合的rAAV產生培養基可補充有0.5%-20% (v/v或w/v)之含量的血清或血清衍生之重組蛋白。可替代地，如此項技術中已知，rAAV病毒粒子可在無血清條件下產生，其亦可稱為無動物衍生之產物的培養基。一般熟習此項技術者可瞭解，經設計以支持rAAV病毒粒子產生之市售或定製培養基亦可補充有此項技術中已知之一或多種細胞培養組分，包括(但不限於)葡萄糖、維生素、胺基酸及/或生長因子，以便增加rAAV於產生培養物中之力價。

rAAV產生培養物可在適合於所用之特定宿主細胞的多種條件(在寬溫度範圍內、持續不同時間長度及其類似者)下生長。如此項技術中已知，rAAV產生培養物包括附著依賴性培養物，其可在適合的附著依賴性容器，諸如滾瓶、中空纖維過濾器、微載體及填充床或流體化床生物反應器中培養。rAAV產生培養物亦可包括懸浮適應宿主細胞，諸如HeLa、293及SF-9細胞，其可以多種方法培養，包括例如旋轉燒瓶、攪拌槽生物反應器，及拋棄式系統，諸如Wave袋系統。V. 組合物

本文亦提供包含本文所揭示之重組AAV病毒粒子之組合物，該重組AAV病毒粒子包含本文所描述之變異體AAV蛋白殼蛋白。在一些實施例中，組合物為包含本文所揭示之重組AAV病毒粒子及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑之醫藥組合物。

重組AAV病毒粒子可與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及試劑組合，該等載劑、稀釋劑及試劑適用於製備通常安全、無毒且合乎需要且包括靈長類動物使用可接受之賦形劑的調配物。此類賦形劑可為固體、液體、半固體，或在霧劑組合物情況下為氣態。此類載體或稀釋劑之實例包括(但不限於)水、鹽水、林格氏(Ringer's)溶液、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。補充活性化合物亦可併入至調配物中。用於調配物之溶液或懸浮液可包括無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌化合物，諸如苄醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑化合物，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；清潔劑，諸如Tween 20以預防聚集；及用於調節張力之化合物，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼，諸如鹽酸或氫氧化鈉調節pH。在特定實施例中，醫藥組合物為無菌的。對於活體內接觸眼部細胞之情況，重組AAV病毒粒子可視為適合於遞送至眼睛。

醫藥組合物可進一步包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌散劑。對於靜脈內投與，適合的載劑包括(但不限於)生理鹽水、抑菌水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在一些情況下，組合物為無菌的且流動性應達到存在易於注射能力之程度。在某些實施例中，醫藥組合物在製造及儲存條件下為穩定的，且針對微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用加以保存。載劑可為例如含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、藉由維持所需粒度(在分散液之情況下)及藉由使用界面活性劑來維持。微生物作用之預防可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)及氯化鈉。在一些實施例中，醫藥組合物包含延遲吸收之藥劑，例如單硬脂酸鋁及明膠。

無菌溶液可藉由如下方法製備：將所需量之重組AAV病毒粒子與上文所列舉之成分中之一者或組合一起併入適當溶劑中，視需要隨後進行過濾滅菌。一般而言，分散液藉由將活性化合物併入含有鹼性分散介質及來自以上所列舉之彼等成分的所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，製備方法包括(但不限於)真空乾燥及冷凍乾燥，其利用先前無菌過濾溶液產生活性成分加上任何額外所需成分的粉末。

在一些實施例中，用保護病毒載體免於自身體快速消除之載劑來製備醫藥組合物，該載劑諸如控制釋放調配物，包括植入物及微膠囊化遞送系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。脂質體懸浮液(包括靶向具有針對病毒抗原之單株抗體之經感染細胞的脂質體)亦可用作醫藥學上可接受之載劑，例如如美國專利第4,522,811號中所描述。

為易於投與及劑量均一性而以單位劑型來調配經口、經眼或非經腸組合物可為有利的。如本文所用之單位劑型可指適合作為單一劑量用於待治療之個體的物理離散單位；各單位含有經計算以產生所需治療效果之預定量之活性化合物。

可製備適於有效轉導哺乳動物細胞之任何濃度之重組AAV病毒粒子。舉例而言，重組AAV病毒粒子可調配為約10⁸ 個載體基因組/mL或更大之濃度，例如約5×10⁸ 個載體基因組/mL；約10⁹ 個載體基因組/mL; 約5×10⁹ 個載體基因組/mL；約10¹⁰ 個載體基因組/mL；約5×10¹⁰ 個載體基因組/mL；約10¹¹ 個載體基因組/mL；約5×10¹¹ 個載體基因組/mL；約10¹² 個載體基因組/mL；約5×10¹² 個載體基因組/mL；約10¹³ 個載體基因組/mL；約1.5×10¹³ 個載體基因組/mL；約3×10¹³ 個載體基因組/mL；約5×10¹³ 個載體基因組/mL；約7.5×10¹³ 個載體基因組/mL；約9×10¹³ 個載體基因組/mL；約1 ×10¹⁴ 個載體基因組/mL或約5 ×10¹⁴ 個載體基因組/mL；或更大。在一些實施例中，病毒粒子可調配為不超過約1×10¹⁵ 個載體基因組/mL之濃度。

重組AAV病毒粒子可調配成任何適合的單位劑量，包括(但不限於)約1×10⁸ 個載體基因組或更大，1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 或約1×10¹³ 個載體基因組或更大，或在某些情況下，約1×10¹⁴ 個載體基因組。在一些實施例中，重組AAV病毒粒子可調配成任何適合的不超過約4×10¹⁵ 個載體基因組之單位劑量。在一些情況下，單位劑量為至多約5×10¹⁵ 個載體基因組，例如約1×10¹⁴ 個載體基因組或更小，例如約1×10¹³ 、約1×10¹² 、約1×10¹¹ 、約1×10¹⁰ 或約1×10⁹ 個載體基因組或更小，或在某些情況下為約1×10⁸ 個載體基因組或更小。在一些實施例中，重組AAV病毒粒子可調配成任何適合的不小於約1×10⁸ 個載體基因組之單位劑量。在一些情況下，單位劑量為約1×10¹⁰ 至約1×10¹¹ 個載體基因組。在一些情況下，單位劑量為約1×10¹⁰ 至約3×10¹² 個載體基因組。在一些情況下，單位劑量為約1×10⁹ 至約3×10¹³ 個載體基因組。在一些情況下，單位劑量為約1×10⁸ 至約3×10¹⁴ 個載體基因組。

在一些情況下，醫藥組合物之單位劑量可使用感染倍率(MOI)來量測。MOI意謂病毒基因組與核酸可遞送之細胞的比率或倍數。在一些情況下，MOI可為約1×10⁶ 。在一些情況下，MOI可為約1×10⁵ 至約1×10⁷ 。在一些情況下，MOI可為約1×10⁴ 至約1×10⁸ 。在一些情況下，本發明之重組病毒粒子為至少在約1×10¹ 、1×10² 、1×10³ 、1×10⁴ 、1×10⁵ 、1×10⁶ 、1×10⁷ 、1×10⁸ 、1×10⁹ 、1×10¹⁰ 、1×10¹¹ 、1×10¹² 、1×10¹³ 、1×10¹⁴ 、1×10¹⁵ 、1×10¹⁶ 、1×10¹⁷ 及1×10¹⁸ MOI中之任一者下。在一些情況下，本發明之重組AAV病毒粒子在約1×10⁸ 至約3×10¹⁴ MOI下。在一些情況下，本發明之重組AAV病毒粒子至多為在約1×10¹ 、1×10² 、1×10³ 、1×10⁴ 、1×10⁵ 、1×10⁶ 、1×10⁷ 、1×10⁸ 、1×10⁹ 、1×10¹⁰ 、1×10¹¹ 、1×10¹² 、1×10¹³ 、1×10¹⁴ 、1×10¹⁵ 、1×10¹⁶ 、1×10¹⁷ 及1×10¹⁸ MOI中之任一者下。

在一些態樣中，醫藥組合物之量包含約1×10⁸ 至約1×10¹⁵ 個重組AAV病毒粒子、約1×10⁹ 至約1×10¹⁴ 個重組AAV病毒粒子、約1×10¹⁰ 至約1×10¹³ 個重組AAV病毒粒子或約1×10¹¹ 至約3×10¹² 個重組AAV病毒粒子。

醫藥組合物可與投與說明書一起包括於容器、包裝或分配器(例如注射器，例如預填充注射器)中。

在一些實施例中，醫藥組合物包含醫藥學上可接受之鹽。多種醫藥上可接受鹽為此項技術中已知的且例如描述於「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 第17版, Alfonso R. Gennaro (編), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (及其最新版本)中；描述於「Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology」, 第3版, James Swarbrick (編), Informa Healthcare USA (公司), NY, USA, 2007中；及描述於J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977)中。此外，關於適合的鹽之綜述，參見Stahl及Wermuth之Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Wiley-VCH, 2002)。

醫藥學上可接受之鹼加成鹽由金屬或胺形成，諸如鹼金屬及鹼土金屬或有機胺。用作陽離子之金屬包含鈉、鉀、鎂、鈣及類似金屬。胺包含N-N'-二苄基乙二胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、二環己胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺及普魯卡因(參見例如Berge等人, 「Pharmaceutical Salts」, J. Pharma Sci., 1977, 66, 119)。該等酸性化合物之鹼加成鹽係藉由使游離酸形式與足夠量之所需鹼接觸以按習知方式產生鹽來製備。游離酸形式可藉由使鹽形式與酸接觸且以習知方式分離游離酸來再生。游離酸形式在某些物理特性(諸如在極性溶劑中之溶解度)方面在某種程度上不同於其各別鹽形式，但出於本發明之目的，在其他情況下，鹽等效於其各別游離酸。

醫藥組合物可經調配以用於投與哺乳動物，諸如靈長類動物，諸如人類。在一些實施例中，醫藥組合物包含水性載劑，諸如無毒、惰性、醫藥學上可接受之水性載劑。在一些實施例中，水性載劑之pH為約3至約8。在一些實施例中，水性載劑之pH為約6至約8。

在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含治療有效量之本文所揭示的重組AAV病毒粒子與醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑(例如鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、磷酸鹽及胺基酸)、聚合物、多元醇、糖、緩衝液、防腐劑及其他蛋白質之混合。例示性胺基酸、聚合物及糖及其類似物為辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、聚乙二醇單硬脂酸酯化合物、聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖、果糖、右旋糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖醇、聚葡萄糖、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、木糖醇、乳糖、海藻糖、牛或人類血清白蛋白、檸檬酸酯、乙酸酯、林格氏及漢克氏溶液、半胱胺酸、精胺酸、肉鹼、丙胺酸、甘胺酸、離胺酸、纈胺酸、白胺酸、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯及乙二醇。在一些實施例中，醫藥組合物在約4℃下穩定至少六個月。

在一些實施例中，本文所提供之醫藥組合物包含緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或磷酸鈉/硫酸鈉、tris緩衝液、甘胺酸緩衝液、無菌水，及一般熟習此項技術者已知之其他緩衝液，諸如Good等人(1966) Biochemistry 5:467所描述之彼等緩衝液。

本文亦提供包含本文所揭示之重組AAV病毒粒子之組合物，該重組AAV病毒粒子包含用於本文所描述之方法中之本文所描述之變異體AAV蛋白殼蛋白。在一些實施例中，組合物為包含本文所揭示之重組AAV病毒粒子及一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑之醫藥組合物。

本文亦提供包含本文所描述之編碼本文所描述之變異體AAV蛋白殼蛋白之聚核苷酸的組合物。在一些實施例中，組合物用於本文所揭示之方法中，諸如製備包含變異體AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子的方法。VI. 方法及用途

如隨附實例中所揭示，本文所描述之經修飾之蛋白殼蛋白可賦予包含變異體AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子經增強或經改變之細胞向性。舉例而言，本文所描述之某些變異體AAV蛋白殼蛋白與增加之視網膜感染性或視網膜中之基因產物之增加之表現量、增加之與ILM之結合、玻璃體內注射之後增加之視網膜感染性及/或玻璃體內注射之後視網膜中之基因產物之增加之表現相關。

可藉由本文所描述之病毒粒子轉染之視網膜細胞組分之實例可包括(但不限於)星形膠質細胞、繆勒氏細胞、RGC、RGC軸突、感光體、雙極細胞、無軸突神經細胞、水平細胞及其組合。在一些情況下，使用細胞標記量測編碼基因產物之核酸至視網膜細胞組分之轉導。細胞標記可包括(但不限於) GFAP、波形蛋白(Vimentin)、Fox、β-微管蛋白、視紫質、PKCa、小清蛋白(parvalbumin)、鈣結合蛋白(calbindin)及其組合。下表 1 描繪例示性細胞標記及相應視網膜細胞組分。表 1 ：細胞標記及細胞類型之概述

標記	細胞類型
GFAP	星形膠質細胞
波形蛋白	繆勒氏細胞
Fox	RGC
β-微管蛋白	RGC軸突
視紫質(Rho)	視桿細胞感光體
PKCa	雙極細胞
小清蛋白	無軸突神經細胞
鈣結合蛋白	水平細胞

在一些情況下，rAAV病毒粒子轉導基因產物之能力可藉由報告蛋白之表現來量測。在一些實施例中，報告蛋白可包括GFP、YFP、紅色螢光蛋白、β-半乳糖苷酶或此項技術中已知之其他報告蛋白。

在一些情況下，報告蛋白隨時間推移之表現可經由在不同時間點眼睛之影像之捕捉來測定。舉例而言，GFP之表現可與螢光增加相關。在給定時間點處之螢光量可用於定量基因產物之表現。

在一些實施例中，免疫螢光法可用於確定經轉導基因在本文所描述之視網膜細胞區室中之定位。視網膜細胞區室可藉由使用對本文所揭示之細胞標記具有特異性之抗體標記。在一些情況下，將抗體偶合至螢光團。在一些情況下，二級抗體可用於偵測第一抗體之結合。可在與針對所關注細胞標記之抗體一起培育之前對經轉導之視網膜進行冷凍切片，藉此使得經結合之抗體成像。隨後可使用抗體標記冷凍切片以偵測轉基因之轉導、所關注細胞標記之存在及兩者之間的重疊區域。

因此，本文提供增強或改變重組AAV病毒粒子之向性的方法，該方法包含將本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白併入至重組AAV病毒粒子中。本文亦提供增強或改變重組AAV病毒粒子之向性的方法，該方法包含用包含HKFKSGD (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列取代親本AAV蛋白殼之胺基酸殘基570至579以產生變異體AAV蛋白殼蛋白，且將變異體AAV蛋白殼蛋白併入至重組AAV病毒粒子中，其中胺基酸殘基編號對應於AAV5 VP1蛋白殼蛋白。在一些實施例中，該方法包含用包含X₁ X₂ HKFKSGDX₃ (SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列取代胺基酸殘基570至579，其中X_1-3 可獨立地為任何胺基酸。在一些實施例中，X_1-3 中之每一者獨立地選自A、L、G、S及T。在一些實施例中，X₁ 為L。在一些實施例中，X₂ 為A。在一些實施例中，X₃ 為A。在一些實施例中，該方法包含用包含LAHKFKSGDA (SEQ ID NO: 3)之胺基酸序列取代胺基酸殘基570至579；與SEQ ID NO: 3具有至少80%或至少90%同源性；與SEQ ID NO: 3具有至少80%或至少90%序列一致性；或具有四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、或九個或更多個SEQ ID NO: 3內之連續胺基酸。在一些實施例中，胺基酸序列包含LAHKFKSGDA (SEQ ID NO: 3)。

在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為野生型AAV蛋白殼蛋白，例如1型AAV (AAV1)、2型AAV (AAV2)、3型AAV (AAV3)、4型AAV (AAV4)、5型AAV (AAV5)、6型AAV (AAV6)、7型AAV (AAV7)、8型AAV (AAV8)、9型AAV (AAV9)、10型AAV (AAV10)、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV或綿羊AAV蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV5蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為VP1、VP2或VP3蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV5 VP1蛋白殼蛋白。

在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為變異體AAV蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、禽類AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、靈長類動物AAV、非靈長類動物AAV或綿羊AAV蛋白殼蛋白之變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV5 VP1蛋白殼蛋白之變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為與SEQ ID NO: 4具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之AAV5 VP1蛋白殼蛋白之變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為與SEQ ID NO: 4具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之AAV5 VP1蛋白殼蛋白之變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為雜交的。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2與AAV5之雜交。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T或與AAV2.5T蛋白殼蛋白具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之其變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T或與AAV2.5T蛋白殼蛋白具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為VP1、VP2或VP3蛋白殼蛋白。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白或與AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白(SEQ ID NO: 5)具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性之其變異體。在一些實施例中，親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白或與AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白(SEQ ID NO: 5)具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之其變異體。

本文所描述之包含本文所描述之變異體AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子可用於將基因產物遞送至細胞(例如動物之細胞)中。舉例而言，其可用於研究，例如以確定基因產物對細胞生存力及/或功能具有之作用。作為另一實例，其可用於藥物中，例如藉由將治療基因產物遞送至細胞或組織來治療病症。因此，在一些實施例中，本文提供在細胞中表現基因產物之方法，該方法包含使細胞與包含重組AAV病毒粒子之組合物接觸，該重組AAV病毒粒子包含本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白及包含編碼基因產物之序列的聚核苷酸卡匣。在一些實施例中，接觸發生於活體外。在一些實施例中，接觸發生於活體內，亦即將向組合物投與至個體。在特定實施例中，組合物為非經腸投與，例如靜脈內、經口或藉由注射。在某些實施例中，藉由注射將組合物至眼睛，例如投與至視網膜、視網膜下或玻璃體。在某些實施例中，藉由視網膜注射、視網膜下注射或玻璃體內注射投與組合物。在某些實施例中，藉由玻璃體內注射投與組合物。

在哺乳動物細胞將活體外與包含本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子接觸之特定實施例中，該細胞可來自任何哺乳動物物種，例如嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、松鼠)、家兔、貓、犬、山羊、綿羊、豬、馬、牛、靈長類動物、人類。細胞可來自所確立之細胞株，例如WERI細胞、661W細胞，或細胞可為初級細胞。

在某些實施例中，為促進基因產物之表現，使細胞與重組AAV病毒粒子接觸約30分鐘至約24小時或更長時間，例如約1小時、1.5小時、2小時、2.5小時、3小時、3.5小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、12小時、16小時、18小時、20小時或24小時等中之任一者。細胞可與重組AAV病毒粒子接觸一或多次，例如一次、兩次、三次或超過三次，且在各接觸事件之後使得細胞與重組AAV病毒粒子一起培育一定時間量，例如約16-24小時。接觸細胞可在任何培養基中且在促進細胞存活之任何培養條件下發生。舉例而言，細胞可懸浮於適宜之任何適當營養培養基中，諸如伊斯科夫氏經修飾之DMEM(Iscove's modified DMEM)或RPMI 1640，補充有胎牛血清或熱滅活山羊血清(約5-10%)、L-麩醯胺酸、硫醇(特定言之2-巰基乙醇)及抗生素(例如青黴素及鏈黴素)。培養物可含有細胞對其有反應性之生長因子。如本文所定義，生長因子為能夠經由對跨膜受體之特異性作用促進細胞在培養物中或在完整組織中之存活、生長及/或分化的分子。生長因子包括多肽及非多肽因子。

在某些實施例中，提供有效量之包含變異體AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子以在細胞中產生基因產物之表現。在特定實施例中，可憑經驗確定有效量，例如藉由偵測基因產物之存在或含量，藉由偵測對細胞之生存力或功能之作用等。在某些實施例中，與相同量之參考病毒載體，諸如包含親本AAV蛋白殼蛋白之重組AAV病毒粒子相比，有效量之重組AAV病毒粒子促進細胞中之基因產物之相等或更大表現。在某些實施例中，相對於來自參考病毒載體之表現，表現增強約2倍或更多倍；例如約3倍、4倍或5倍或更多倍中之任一者，在一些情況下約10倍、20倍或50倍或更多倍中之任一者，例如100倍。在某些實施例中，經增強之表現發生於特定細胞類型中，例如本文所描述之眼部細胞中之任一者。

對於細胞活體內與包含具有本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白及包含編碼基因產物之序列的聚核苷酸卡匣的重組AAV病毒粒子之組合物接觸的情況，個體可為任何哺乳動物，例如嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、沙鼠)、家兔、貓、犬、山羊、綿羊、豬、馬、牛或靈長類動物(例如人類或非人類靈長類動物)。本發明之方法及組合物用於治療可至少部分地藉由細胞之基因療法解決之任何病狀。因此，本發明之組合物及方法用於治療需要細胞療法之個體。細胞包括(但不限於)血液、眼睛、肝、腎臟、心臟、肌肉、胃、腸、胰臟及皮膚。

本文亦提供將基因產物遞送至視網膜之方法，其包含藉由玻璃體內注射來投與包含本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白及包含編碼基因產物之序列的聚核苷酸卡匣之重組AAV病毒粒子。在一些實施例中，本文提供跨越ILM遞送基因產物之方法，其包含藉由玻璃體內注射來投與包含本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白及包含編碼基因產物之序列的聚核苷酸卡匣之重組AAV病毒粒子。在某些實施例中，本發明提供一種向個體之視網膜提供基因產物之方法，其包含藉由玻璃體內注射向個體投與包含本文所描述之重組AAV病毒粒子之醫藥組合物，其中重組AAV病毒粒子包含本文所提供或所揭示之變異體AAV蛋白殼及編碼基因產物之聚核苷酸序列。

在特定實施例中，個體已診斷患有或疑似具有選自由以下組成之群的一或多個疾病或病症：急性黃斑視神經視網膜病變；白塞氏病；脈絡膜新生血管；糖尿病性葡萄膜炎；組織漿菌病；黃斑變性，諸如急性黃斑變性、非滲出性年齡之相關黃斑變性及滲出性年齡相關之黃斑變性；水腫，諸如黃斑水腫、囊樣黃斑水腫及糖尿病性黃斑水腫；多灶性脈絡膜炎；影響後眼部部位或位置之眼部損傷；眼部腫瘤；視網膜病症，諸如視網膜中央靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病變(包括增生性糖尿病性視網膜病變)、增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、視網膜動脈阻塞性疾病、視網膜脫落、葡萄膜炎性視網膜病；交感神經性眼炎；沃格特小柳-原田(VKH)氏症候群；葡萄膜擴散；因眼部雷射治療引起或受眼部雷射治療影響之後眼部病狀；因光動力學療法引起或受光動力學療法影響之後眼部病狀；光凝；放射性視網膜病；視網膜前膜病症；視網膜分枝靜脈阻塞；前部缺血性視神經病變；糖尿病性視網膜缺血；缺血性視網膜病變；非視網膜病變糖尿病性視網膜功能障礙；視網膜裂損症；色素性視網膜炎；青光眼；尤塞氏症候群；視錐-視桿細胞營養不良；斯特格氏病(眼底黃色斑點症)；遺傳性黃斑變性；視網膜脈絡膜變性；雷伯氏先天性黑矇；先天性靜止性夜盲；無脈絡脈畸型；巴-比二氏症候群；黃斑毛細管擴張；雷伯氏遺傳性視神經病變；早產兒視網膜病；及色覺病症，包括全色盲、紅色盲、綠色盲及黃藍色盲。

在特定實施例中，個體處於產生選自由以下組成之群的一或多個疾病或病症之風險下：急性黃斑視神經視網膜病變；白塞氏病；脈絡膜新生血管；糖尿病性葡萄膜炎；組織漿菌病；黃斑變性，諸如急性黃斑變性、非滲出性年齡之相關黃斑變性及滲出性年齡相關之黃斑變性；水腫，諸如黃斑水腫、囊樣黃斑水腫及糖尿病性黃斑水腫；多灶性脈絡膜炎；影響後眼部部位或位置之眼部損傷；眼部腫瘤；視網膜病症，諸如視網膜中央靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病變(包括增生性糖尿病性視網膜病變)、增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、視網膜動脈阻塞性疾病、視網膜脫落、葡萄膜炎性視網膜病；交感神經性眼炎；沃格特小柳-原田(VKH)氏症候群；葡萄膜擴散；因眼部雷射治療引起或受眼部雷射治療影響之後眼部病狀；因光動力學療法引起或受光動力學療法影響之後眼部病狀；光凝；放射性視網膜病；視網膜前膜病症；視網膜分枝靜脈阻塞；前部缺血性視神經病變；糖尿病性視網膜缺血；缺血性視網膜病變；非視網膜病變糖尿病性視網膜功能障礙；視網膜裂損症；色素性視網膜炎；青光眼；尤塞氏症候群；視錐-視桿細胞營養不良；斯特格氏病(眼底黃色斑點症)；遺傳性黃斑變性；視網膜脈絡膜變性；雷伯氏先天性黑矇；先天性靜止性夜盲；無脈絡脈畸型；巴-比二氏症候群；黃斑毛細管擴張；雷伯氏遺傳性視神經病變；早產兒視網膜病；及色覺病症，包括全色盲、紅色盲、綠色盲及黃藍色盲。

本文亦提供治療有需要之個體之視網膜疾病或病症之方法，其包含藉由玻璃體內注射來投與包含本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白及包含編碼治療基因產物之序列的聚核苷酸卡匣之重組AAV病毒粒子。本文亦提供預防性治療有需要之個體之視網膜疾病或病症之方法，其包含藉由玻璃體內注射來投與包含本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白及包含編碼治療基因產物之序列的聚核苷酸卡匣之重組AAV病毒粒子。本文亦提供治療有需要之個體之視網膜之已確立或診斷之疾病或病症的方法，其包含藉由玻璃體內注射來投與包含本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白及包含編碼治療基因產物之序列的聚核苷酸卡匣之重組AAV病毒粒子。在一些實施例中，方法包含投與包含重組AAV病毒粒子之醫藥組合物，該病毒粒子包含本文所揭示之變異體AAV蛋白殼蛋白及包含編碼治療基因產物之序列的聚核苷酸卡匣。

在一些實施例中，疾病或病症係選自由以下組成之群：急性黃斑視神經視網膜病變；白塞氏病；脈絡膜新生血管；糖尿病性葡萄膜炎；組織漿菌病；黃斑變性，諸如急性黃斑變性、非滲出性年齡之相關黃斑變性及滲出性年齡相關之黃斑變性；水腫，諸如黃斑水腫、囊樣黃斑水腫及糖尿病性黃斑水腫；多灶性脈絡膜炎；影響後眼部部位或位置之眼部損傷；眼部腫瘤；視網膜病症，諸如視網膜中央靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病變(包括增生性糖尿病性視網膜病變)、增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、視網膜動脈阻塞性疾病、視網膜脫落、葡萄膜炎性視網膜病；交感神經性眼炎；沃格特小柳-原田(VKH)氏症候群；葡萄膜擴散；因眼部雷射治療引起或受眼部雷射治療影響之後眼部病狀；因光動力學療法引起或受光動力學療法影響之後眼部病狀；光凝；放射性視網膜病；視網膜前膜病症；視網膜分枝靜脈阻塞；前部缺血性視神經病變；糖尿病性視網膜缺血；缺血性視網膜病變；非視網膜病變糖尿病性視網膜功能障礙；視網膜裂損症；色素性視網膜炎；青光眼；尤塞氏症候群；視錐-視桿細胞營養不良；斯特格氏病(眼底黃色斑點症)；遺傳性黃斑變性；視網膜脈絡膜變性；雷伯氏先天性黑矇；先天性靜止性夜盲；無脈絡脈畸型；巴-比二氏症候群；黃斑毛細管擴張；雷伯氏遺傳性視神經病變；早產兒視網膜病；及色覺病症，包括全色盲、紅色盲、綠色盲及黃藍色盲。

在某些實施例中，基因產物抑制個體之視網膜中之新血管生成，例如脈絡膜新生血管(CNV)。已發現許多細胞因子在CNV產生之調節中起重要作用，其中可包括(但不限於)血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF受體(VEGFR)、血小板衍生生長因子(PDGF)、低氧誘導因子(HIF)、血管生成素(Ang)及其他細胞介素及有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)。在一些實施例中，基因產物為VEGF、VEGFR、PDGF、HIF、Ang及MAPK中之一或多者之抑制劑。

在一些實施例中，基因產物為本文所揭示之基因產物或治療基因產物。在一些實施例中，基因產物為干擾RNA、適體或蛋白質。在一些實施例中，治療基因產物為干擾RNA、適體或蛋白質。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為siRNA、miRNA或蛋白質。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為提供基因功能之位點特異性阻斷之位點特異性核酸酶。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為干擾RNA。在一些實施例中，基因產物(或治療基因產物)為siRNA或miRNA。

在一些實施例中，該方法產生治療效益，例如預防疾病或病症之產生、阻止疾病或病症之進展、逆轉疾病或病症之進展等。在一些實施例中，該方法包含偵測已達成之治療效益之步驟。

在一些情況下，可在投與之後兩個月或少於兩個月，例如在投與之後約4、3或2週或少於2週，例如在投與本發明組合物之後1週觀測到基因產物之表現，例如如藉由量測基因產物之含量、藉由量測治療功效等來偵測。亦預期基因產物之表現隨時間保持。因此，在一些情況下，可在投與本發明組合物之後2個月或多於2個月，例如約4、6、8或10個月或多於10個月，在一些情況下約1年或多於1年，例如2、3、4或5年，在某些情況下超過5年觀測到基因產物之表現，例如如藉由量測基因產物之含量、藉由量測治療功效等來偵測。

在特定實施例中，向一隻眼睛或向兩隻眼睛中之每一者投與約1×10⁸ 個載體基因組或更多，在一些情況下約1×10⁹ 、1×10¹⁰ 、1×10¹¹ 、1×10¹² 或1×10¹³ 個載體基因組或更多中之任一者，在某些情況下約1×10¹⁴ 個載體基因組或更多。在一些情況下，經遞送之載體基因組之量為至多約1×10¹⁵ 個載體基因組，例如1×10¹⁴ 個載體基因組或更少，例如約1×10¹³ 、1×10¹² 、1×10¹¹ 、1×10¹⁰ 或1×10⁹ 個載體基因組或更少中之任一者，在某些情況下1×10⁸ 個載體基因組，且有時不少於1×10⁸ 個載體基因組。在一些情況下，經遞送之載體基因組之量為約1×10¹⁰ 至約1×10¹¹ 個載體基因組。在一些情況下，經遞送之載體基因組之量為約1×10¹⁰ 至約3×10¹² 個載體基因組。在一些情況下，經遞送之載體基因組之量為約1×10⁹ 至約3×10¹³ 個載體基因組。在一些情況下，經遞送之載體基因組之量為約1×10⁸ 至約3×10¹⁴ 個載體基因組。

在一些情況下，待投與之醫藥組合物之量可使用感染倍率(MOI)來量測。在一些情況下，MOI可指載體或病毒基因組與核酸可遞送之細胞的比率或倍數。在一些情況下，MOI可為約1×10⁶ 。在一些情況下，MOI可為約1×10⁵ 至約1×10⁷ 。在一些情況下，MOI可為約1×10⁴ 至約1×10⁸ 。在一些情況下，本發明之重組病毒粒子為至少約1×10¹ 、1×10² 、1×10³ 、1×10⁴ 、1×10⁵ 、1×10⁶ 、1×10⁷ 、1×10⁸ 、1×10⁹ 、1×10¹⁰ 、1×10¹¹ 、1×10¹² 、1×10¹³ 、1×10¹⁴ 、1×10¹⁵ 、1×10¹⁶ 、1×10¹⁷ 或1×10¹⁸ MOI中之任一者。在一些情況下，本發明之重組AAV病毒粒子在約1×10⁸ 至約3×10¹⁴ MOI下。在一些情況下，本發明之重組AAV病毒粒子至多為在約1×10¹ 、1×10² 、1×10³ 、1×10⁴ 、1×10⁵ 、1×10⁶ 、1×10⁷ 、1×10⁸ 、1×10⁹ 、1×10¹⁰ 、1×10¹¹ 、1×10¹² 、1×10¹³ 、1×10¹⁴ 、1×10¹⁵ 、1×10¹⁶ 、1×10¹⁷ 或1×10¹⁸ MOI中之任一者下。

在一些實施例中，可採用多於一次投與(例如兩次、三次、四次或更多次投與)來達成在各種時間間隔時段(例如每天、每週、每月、每年等)內所需基因表現量。

在一些態樣中，在投與該醫藥組合物之後約7、約14、約21或約30天在人類個體之淚液、血液、唾液或尿液樣本中未偵測到重組AAV病毒粒子。在一些態樣中，藉由qPCR或ELBA偵測重組AAV病毒粒子之存在或不存在。

在一些態樣中，在本文所描述之治療方法之後，個體之最佳矯正視力(best corrected visual acuity；BCVA)提高約1、2、3、4、5或更多行。

在一些態樣中，在投與步驟之後，如藉由螢光素血管攝影術(Fluorescein Angiography；FA)評估新血管生成之降低。

在一些情況下，可量測視網膜厚度以檢查治療效果。在一些情況下，在用本發明之醫藥組合物治療之後約12個月內，人類個體之視網膜中央厚度增加不超過約50微米、約100微米或約250微米。在一些情況下，在用本發明之醫藥組合物治療之後約3個月、約6個月、約9個月或約12個月內，人類個體之視網膜中央厚度降低至少約50微米、約100微米、約200微米、約250微米、約300微米、約400微米、約500微米或約600微米。可將一或多個時間點處之視網膜中央厚度與在投與本發明之醫藥組合物之約1、3、7或10天時或在投與本發明之醫藥組合物之約1、3、7或10天內獲取之基線量測值進行比較，來量測人類個體之視網膜中央厚度之降低。

根據以上內容應瞭解，雖然已出於說明之目的在本文中描述本發明之特定實施例，但可在不偏離本發明之精神及範疇之情況下進行各種修改。因此，本發明不受除隨附申請專利範圍以外的限制。VII. 例示性實施例

在所提供之實施例當中有： 1. 一種重組腺相關病毒(AAV)病毒粒子，其包含： (a)變異體AAV蛋白殼蛋白，其包含經修飾序列，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579內包含一或多個胺基酸取代，其中該經修飾序列包含HKFKSGD (SEQ ID NO: 1)，且其中該胺基酸殘基編號對應於AAV5 VP1蛋白殼蛋白；以及 (b)編碼治療基因產物之聚核苷酸序列。 2. 如實施例1之重組AAV病毒粒子，其中該親本AAV蛋白殼蛋白為AAV5蛋白殼蛋白或AAV5與AAV2雜交蛋白殼蛋白。 3. 如實施例1或2之重組AAV病毒粒子，其中該親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T蛋白殼蛋白。 4. 如實施例1至3中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白。 5. 如實施例1至4中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該經修飾序列包含LAHKFKSGDA (SEQ ID NO: 3)。 6. 如實施例1至5中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該變異體AAV蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列具有至少85%同源性之蛋白殼序列。 7. 如實施例1至6中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該變異體AAV蛋白殼蛋白包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中所示之蛋白殼序列。 8. 如實施例1至7中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子為變異體AAV5或變異體AAV2與AAV5雜交病毒粒子。 9. 如實施例1至8中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子為變異體AAV2.5T病毒粒子。 10. 如實施例1至9中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該重組AAV病毒粒子能夠在玻璃體內注射至哺乳動物中時轉導視網膜細胞。 11. 如實施例10之重組AAV病毒粒子，其中該重組AAV病毒粒子能夠在玻璃體內注射至哺乳動物中時轉導以下中之一或多者：感光體、視網膜神經節細胞、繆勒氏細胞、雙極細胞、無軸突神經細胞、水平細胞及視網膜色素上皮細胞。 12. 如實施例10或11之重組AAV病毒粒子，其中該重組AAV病毒粒子能夠在玻璃體內注射至哺乳動物中時轉導視網膜色素上皮細胞。 13. 如實施例1至12中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該治療基因產物為siRNA、miRNA或蛋白質。 14. 如實施例1至13中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該治療基因產物為抗血管內皮生長因子(抗VEGF)基因產物。 15. 如實施例1至13中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該治療基因產物為視蛋白。 16. 如實施例1至15中任一項之重組AAV病毒粒子，其中編碼該治療基因產物之該聚核苷酸側接一或多個AAV ITR。 17. 如實施例16之重組AAV病毒粒子，其中該一或多個AAV ITR為AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR或其變異體。 18. 如實施例16或17之重組AAV病毒粒子，其中該一或多個AAV ITR為AAV2 ITR或AAV5 ITR。 19. 如實施例1至18中任一項之重組AAV病毒粒子，其中該重組AAV病毒粒子相比於AAV2.5T具有經改變之細胞向性。 20. 一種醫藥組合物，其包含如實施例1至19中任一項之重組AAV病毒粒子。 21. 一種產生rAAV病毒粒子之方法，其包含： (a)在產生rAAV病毒粒子之條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含： (i)編碼包含經修飾序列之變異體AAV蛋白殼蛋白之聚核苷酸，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579內包含一或多個胺基酸取代，其中該經修飾序列包含HKFKSGD (SEQ ID NO: 1)； (ii)編碼rep蛋白之聚核苷酸； (iii)側接至少一個AAV ITR之聚核苷酸卡匣，該卡匣包含編碼治療基因產物之序列；及 (iv) AAV輔助功能；以及 (b)回收由宿主細胞產生之rAAV病毒粒子。 22. 一種向個體之視網膜提供治療基因產物之方法，其包含藉由玻璃體內注射向該個體投與如實施例1至19中任一項之重組AAV病毒粒子或如實施例20之醫藥組合物。 23. 如實施例22之方法，其中該個體已診斷患有或疑似具有選自由以下組成之群的一或多個病狀：急性黃斑視神經視網膜病變、白塞氏病、脈絡膜新生血管、糖尿病性葡萄膜炎、組織漿菌病、黃斑變性、水腫、多灶性脈絡膜炎、影響後眼部部位或位置之眼部損傷、眼部腫瘤、視網膜中央靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病變、增殖性玻璃體視網膜病變(PVR)、視網膜動脈阻塞性疾病、視網膜脫落、葡萄膜炎性視網膜病、交感神經性眼炎、沃格特小柳-原田(VKH)氏症候群、葡萄膜擴散、因眼部雷射治療引起或受眼部雷射治療影響之後眼部病狀、因光動力療法引起或受光動力學療法影響之後眼部病狀、光凝、放射性視網膜病、視網膜前膜病症、視網膜分枝靜脈阻塞、前部缺血性視神經病變、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變、非視網膜病變糖尿病性視網膜功能障礙、視網膜裂損症、色素性視網膜炎、青光眼、尤塞氏症候群、視錐-視桿細胞營養不良、斯特格氏病、遺傳性黃斑變性、視網膜脈絡膜變性、雷伯氏先天性黑矇、先天性靜止性夜盲、無脈絡脈畸型、巴-比二氏症候群、黃斑毛細管擴張、雷伯氏遺傳性視神經病變、早產兒視網膜病及色覺病症。 24. 一種治療有需要之個體之視網膜疾病或病症的方法，其包含藉由玻璃體內注射向該個體投與如實施例1至19中任一項之重組AAV病毒粒子或如實施例20之醫藥組合物。 25. 如實施例24之方法，其中該疾病或病症為急性黃斑視神經視網膜病變、白塞氏病、脈絡膜新生血管、糖尿病性葡萄膜炎、組織漿菌病、黃斑變性、水腫、多灶性脈絡膜炎、影響後眼部部位或位置之眼部損傷、眼部腫瘤、視網膜中央靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病變、增殖性玻璃體視網膜病變(PVR)、視網膜動脈阻塞性疾病、視網膜脫落、葡萄膜炎性視網膜病、交感神經性眼炎、沃格特小柳-原田(VKH)氏症候群、葡萄膜擴散、因眼部雷射治療引起或受眼部雷射治療影響之後眼部病狀、因光動力學療法引起或受光動力學療法影響之後眼部病狀、光凝、放射性視網膜病、視網膜前膜病症、視網膜分枝靜脈阻塞、前部缺血性視神經病變、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變、非視網膜病變糖尿病性視網膜功能障礙、視網膜裂損症、色素性視網膜炎、青光眼、尤塞氏症候群、視錐-視桿細胞營養不良、斯特格氏病、遺傳性黃斑變性、視網膜脈絡膜變性、雷伯氏先天性黑矇、先天性靜止性夜盲、無脈絡脈畸型、巴-比二氏症候群、黃斑毛細管擴張、雷伯氏遺傳性視神經病變、早產兒視網膜病或色覺病症。 26. 如實施例1至19中任一項之重組AAV病毒粒子，其用於治療有需要之個體之視網膜疾病或病症的方法中，其中該方法包含藉由玻璃體內注射向該個體投與包含重組AAV病毒粒子之醫藥組合物。 27. 如實施例1至19中之任一項之重組AAV病毒粒子，其用於製備用於治療個體之視網膜疾病或病症之藥劑。 28. 如實施例26或27之重組AAV病毒粒子，其中該疾病或病症為年齡相關之黃斑變性(AMD)、濕性AMD、乾性AMD、視網膜新血管生成、脈絡膜新生血管、糖尿病性視網膜病變、增生性糖尿病性視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、視網膜中央靜脈阻塞、視網膜分枝靜脈阻塞、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變或糖尿病性視網膜水腫。 29. 一種變異體AAV蛋白殼蛋白，其包含經修飾序列，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579內包含一或多個胺基酸取代，其中該經修飾序列包含HKFKSGD (SEQ ID NO: 1)，且其中該胺基酸殘基編號對應於AAV5 VP1蛋白殼蛋白。 30. 如實施例29之變異體AAV蛋白殼蛋白，其中該親本AAV蛋白殼蛋白為AAV5蛋白殼蛋白或AAV5與AAV2雜交蛋白殼蛋白。 31. 如實施例29或30之變異體AAV蛋白殼蛋白，其中該親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T蛋白殼蛋白。 32. 如實施例29至31中任一項之變異體AAV蛋白殼蛋白，其中該親本AAV蛋白殼蛋白為AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白。 33. 如實施例29至32中任一項之變異體AAV蛋白殼蛋白，其中該經修飾之AAV蛋白殼蛋白在相對於該親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基570至579處包含LAHKFKSGDA (SEQ ID NO: 3)。 34. 如實施例29至33中任一項之變異體AAV蛋白殼蛋白，其包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所示之胺基酸序列具有至少85%同源性之蛋白殼序列。 35. 如實施例29至34中任一項之變異體AAV蛋白殼蛋白，其包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 7中所示之蛋白殼序列。 36. 一種核酸，其包含編碼如實施例29至35中任一項之變異體AAV蛋白殼蛋白之核酸序列。 37. 一種包含如實施例36之核酸的表現載體，其中編碼該變異體AAV蛋白殼蛋白之核酸序列可操作地連接至啟動子序列。 38. 如實施例37之表現載體，其進一步包含編碼rep蛋白之核酸。 39. 一種細胞，其包含如實施例37或38之表現載體。 40. 如實施例39之細胞，其進一步包含編碼治療基因產物之核酸。 41. 如實施例40之細胞，其中該治療基因產物為siRNA、miRNA或蛋白質。 42. 如實施例40或41之細胞，其中該治療基因產物為抗血管內皮生長因子(抗VEGF)基因產物。 43. 如實施例40或41之細胞，其中治療劑為視蛋白。 44. 如實施例40至43中任一項之細胞，其中編碼該治療基因產物之聚核苷酸側接一或多個AAV ITR。 45. 如實施例44之細胞，其中該一或多個AAV ITR為AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR或其變異體。 46. 如實施例44或45之細胞，其中該一或多個AAV ITR為AAV2 ITR或AAV5 ITR。實例實例1：AAV2.5T突變庫之構築

AAV2.5T為含有來自AAV2及AAV5之區域的雜交蛋白殼，描述於美國專利第9,441,244號中，該專利之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。AAV2.5T能夠在視網膜下遞送時轉導視網膜，但不能夠在玻璃體內注射時轉導視網膜。AAV2.5T轉導可藉由富含硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)之內限界膜(ILM)阻斷。

除了AAV2.5T之aa582 (AAV5之aa581)中之A至T之單一取代(出現於哺乳動物細胞中增加感染性而不影響AAV5之典型唾液酸受體結合之突變)，AAV2.5T之表面暴露域與AAV5之表面暴露域相同。AAV5及AAV2.5T具有可忽略的硫酸乙醯肝素結合，而AAV2對硫酸乙醯肝素具有高親和力。

為在藉由玻璃體內注射遞送後產生具有跨越ILM及轉導視網膜細胞之增強的能力的新穎AAV變異體，在類似於AAV2之HSPG結合區之區域中由AAV2.5T蛋白殼產生具有環取代及插入之AAV突變庫，如藉由胺基酸比對所測定。

藉由合成具有7個胺基酸環之DNA片段來產生兩個突變庫。由於7個胺基酸位置中之每一者存在20個可能胺基酸，故此等片段庫之理論多樣性為約1×10⁹ 個獨特變異體。此等突變環側接於5'末端之胺基酸LA及3'末端之A。

使用此等片段庫，藉由在受體結合區中在AAV2.5T蛋白殼序列之位置577處插入10個胺基酸環，來產生環插入庫(LIL)。

藉由用胺基酸571與580 (自VP1之第一胺基酸編號)之間的環變異體序列取代蛋白殼之表面暴露區中之序列來產生第二庫。此庫被稱為環取代庫(LSL)。

將此等AAV變異體蛋白殼選殖至質體中以製備個別病毒封裝細胞庫(藉由以1:50比率(質體:phiC31)短暫轉染phiC31整合酶，如WO2017112868A1中所描述)。所得封裝細胞庫產生由載體基因組構成之突變AAV病毒粒子，該載體基因組含有封裝於藉由彼基因組編碼之蛋白殼蛋白內之突變Cap基因，具有低水準之交叉封裝。為確定細胞庫之多樣性，自各庫分離gDNA且進行NGS。該多樣性為在LIL中大致約725,000個獨特變異體及在LSL中約558,000個獨特變異體。實例2：NHP眼睛中之AAV庫篩檢

為研究突變AAV蛋白殼跨越ILM之能力，活體內篩檢變異體AAV病毒粒子之庫中穿過內限界膜(ILM)且感染非人類靈長類動物(NHP)眼睛中之視網膜細胞的能力。

將LIL及LSL突變AAV蛋白殼庫各自以6×10⁹ 與9×10⁹ vg/眼睛之間之劑量玻璃體內注射至3隻非洲綠猴(綠猴(Chlorocebus sabaeus))之眼睛中。注射後四至六週，將動物處死且分離來自各動物之視網膜組織外植體。分離具有脈絡膜皮下組織之玻璃體及視網膜且沿著角膜緣切割眼球且丟棄眼睛之前部。隨後移除玻璃體，同時保留附著至洗眼杯(eyecup)之視網膜。將洗眼杯轉移至CO₂ 非依賴性培養基中。切割視網膜及RPE/脈絡膜以製備視網膜平坦片。將整個平坦片(感光體層向下)置放於10 cm Trans-well培養盤之聚碳酸酯插入膜上，該培養盤含有10 mL之CO₂ 非依賴性培養基。當視網膜平緩沈降至插入物上時，移除培養基以使得視網膜暴露於大氣。

藉由在組織頂部添加Ad5溶液2小時，用1000感染倍率(MOI)之人類Ad5病毒(在無抗生素或抗黴菌素之Neurobasal-A培養基中稀釋)轉導視網膜。與Ad5病毒之共感染用於增加來自存在於視網膜組織中之突變AAV病毒粒子的Cap RNA之表現，藉此增加經感染細胞中之突變蛋白殼RNA之量以用於後續偵測。

在初始培育之後，將Neurobasal-A+ (B27補充劑，1×GlutaMAX，1×抗生素-抗黴菌素)介質添加至孔底部以使得其與插入物底部接觸但並不覆蓋組織(約10 ml)，且在37℃下將組織外植體與CO₂ 一起培育2天。在培育之後，將插入物自培養盤移除，置放於乾淨平坦表面上，且如圖 1A 中所示製得三個穿孔。簡言之，自黃斑獲取具有RPE/脈絡膜之神經視網膜之5 mm穿孔。隨後使用10 mm穿孔製備第二同心穿孔以分離在血弧內之黃斑周圍之視網膜及RPE/脈絡膜區域，其稱為側凹。隨後收集剩餘周邊視網膜及RPE/脈絡膜。

RNA隨後自組織穿孔中之每一者提取且藉由RT-PCR隨後一輪PCR轉化成cDNA。隨後將所得PCR產物選殖回至質體中且測序以確定能夠成功地跨越ILM且感染猴眼睛中之視網膜細胞的突變AAV蛋白殼之序列。

對於第二輪及第三輪篩檢，混合自個別視網膜位置(穿孔)中之每一者提取的LIL及LSL變異體以產生對於各位置之一個變異體庫。隨後使用此等庫集區來產生細胞及AAV蛋白殼庫，該等庫分開地注射至非洲綠猴(AGM)眼睛中且使用與上文相同的視網膜穿孔策略收集。另外，在一種情況下，分離視網膜色素上皮且自彼組織回收變異體。

使用NGS分析，鑑別AAV2.5T.LSV1。AAV2.5T.LSV1為源自LSL庫之環取代變異體，該LSL庫具有以下胺基酸環序列：LAHKFKSGDA (SEQ ID NO: 3)。AAV2.5T.LSV1為來自篩檢第2輪中之黃斑區域之第48最豐富變異體。在篩檢第3輪中，AAV2.5T.LSV1為發現於側凹中之第二最豐富變異體及發現於RPE區域中之最豐富變體。在各篩檢輪次時之前部變異體之相對豐度展示於圖 1B 至圖 1E 中。實例3：在HEK293細胞中產生AAV2.5T.LSV1

使用三重轉染方法在HEK293細胞中製造AAV2.5T.LSV1以用於進一步表徵。所得AAV2.5T.LSV1力價大於1×10¹³ vg/ml，表明AAV2.5T.LSV1具有良好封裝能力。實例4：AAV2.5T.LSV1之肝素結合親和力

AAV2.5T.LSV1結合HSPG之能力係藉由使用預裝填GE肝素管柱進行肝素結合分析來評估。將AAV2.5T.LSV1之乙醯肝素結合與AAV2.5T及在上文所描述之篩檢中產生之兩種其他變異體進行比較。將載體裝載於管柱上，隨後洗滌管柱，且最終用增加濃度之NaCl (100 mM-1 M)溶離。收集裝載、流過、洗滌及溶離之溶離份且藉由使用B1抗體之點漬墨法分析。

如圖 2 中所示，AAV2.5T不結合至肝素。相比之下，AAV2.5T.LSV1具有結合肝素之能力。實例5：豬視網膜外植體中之表現及向性

將體外豬視網膜外植體維持於如PCT/US2017/030636中所描述之反向孔上，其揭示內容以全文併入之方式併入，且用GFP報告基因轉導以2×10¹⁰ vg或4×10¹⁰ vg封裝至AAV2.5T.LSV1蛋白殼中。在轉導後之一及兩週捕捉實況螢光影像。圖 3 展示豬視網膜外植體之實況成像。此等影像表明AAV2.5T.LSV1能夠有效轉導培養物中之豬視網膜之至少一些細胞。實例6：玻璃體內投與至非人類靈長類動物視網膜之後的表現

在非洲綠猴(綠猴)中進行活體內研究，在廣泛啟動子之控制下，以5×10¹¹ vg/眼睛將非洲綠猴玻璃體內注射攜載GFP表現卡匣之AAV2.5T.LSV1。眼睛中之表現藉由眼底螢光及Heidelberg Spectralis成像每週監測且展示於圖 4A 至圖 4E 中。AAV2.5T.LSV1-GFP之玻璃體內遞送引起黃斑及血弧內之GFP表現。視網膜之血弧區具有最厚ILM，認為其在玻璃體內注射時藉由大多數AAV阻斷視網膜細胞轉導。實例7：在玻璃體內投藥之後表現之評估

在IVT注射之後，在非人類靈長類動物中評估AAV2.5T.LSV1之視網膜向性。

在廣泛啟動子之控制下，以5×10¹¹ vg/眼睛將非洲綠猴(綠猴)玻璃體內(IVT)注射攜載GFP表現卡匣之AAV2.5T.LSV1以便評估AAV2.5T.LSV1之向性。

在IVT注射後第35天將猴處死且將眼睛摘出。在摘出術後將眼睛固定在4%多聚甲醛中24小時，隨後用30%蔗糖/索倫森磷酸鹽緩衝液(Sorenson's phosphate buffer)低溫保護隔夜。將眼睛切割成象限，且自鞏膜移除包括RPE及脈絡膜之視網膜。將視網膜象限平坦安放在載片上且覆蓋在30%蔗糖/索倫森磷酸鹽緩衝液下滑動。使用Zeiss Axio.Z1獲得5倍天然GFP之平鋪掃描，且使用Zeiss Zen Blue軟體拼接。AAV2.5T.LSV1-GFP之所得實況螢光影像展示於圖 5A 至圖 5D 中。

自圖 5C 至圖 5D 中所示之平坦安放視網膜之部分之5倍掃描獲得GFP強度特徵曲線。自最接近視神經之黃斑邊緣至睫狀體獲取量測值。跨越黃斑至睫狀體之距離繪製長度總計20 mm之約20,000個量測點(圖 5E )。

將視網膜平坦片包埋於OCT封固劑中且經由異戊烷冷凍。經由視窩、視網膜赤道部及周邊以10 µm厚度收集冷凍切片且將載片染色以用於免疫螢光標記(IFL)。RPE之平面影像係藉由在平坦安放之視網膜切片中將脈絡膜剝離RPE且翻轉切片以使得RPE面向下置放於載片上，隨後染色以用於IFL。在0.1% Triton-x滲透30分鐘之後進行IFL，接著用於索倫森磷酸鹽緩衝液中之5%正常驢血清/6%牛血清白蛋白阻斷血清蛋白質1小時。使用表 2 中所示之染色及抗體在4℃下進行IFL隔夜。表 2 ：染色及抗體

標記類型	初級抗體或染色	初級抗體或染色之供應商	初級抗體或染色之濃度	二級抗體	二級抗體之供應商	二級抗體之濃度
基因產物表現	GFP	Abcam目錄號ab13970	1:1000	驢-抗雞488	Jackson Immuno Research目錄號703-545-155	5 µg/ml
視桿感光細胞	視紫質	Millipore sigma目錄號MABN15	1:2500	驢抗小鼠Alexa Flour 555	Thermo Scientific目錄號A-31570	5 µg/ml
繆勒氏細胞	麩胺合成酶	Sigma目錄號G2781	1:20000	驢抗家兔Alexa Flour 647	Thermo Scientific目錄號A-31573	5 µg/ml
雙極細胞	PKC-α	Invitrogen目錄號MA1-157	1:50	驢抗小鼠Alexa Flour 555	Thermo Scientific目錄號A-31570	5 µg/ml
視網膜神經節細胞體	γ突觸核蛋白	Abcam目錄號	1:100	驢抗家兔Alexa Flour 647	Thermo Scientific目錄號A-31573	5 µg/ml
視錐感光細胞	視錐抑制蛋白	Millipore Sigma目錄號AB15282	1:500	驢抗家兔Alexa Flour 647	Thermo Scientific目錄號A-31573	5 µg/ml
視網膜神經節軸突末端路徑	抗β III微管蛋白 (Tuj-1)	Abcam目錄號ab7751	1:500	驢抗小鼠Alexa Flour 555	Thermo Scientific目錄號A-31570	5 µg/ml
視網膜著色上皮(RPE)	RPE-65	Abcam目錄號ab78036	1:200	驢抗小鼠Alexa Flour 555	Thermo Scientific目錄號A-31570	5 µg/ml
細胞核	DAPI	Invitrogen目錄號D21490	5 µg/ml

使組織切片成像且所得影像展示於圖 6A 至圖 25E 中。表明細胞類型AAV2.5T.LSV1病毒粒子之向性之概述展示於表 3 中。表 3 ： 病毒粒子之向性

	視窩	視網膜
繆勒氏細胞	是	是
感光體	視錐細胞	視錐細胞＞視桿細胞
雙極細胞	是	是
內網狀層內之軸突末端	雙極細胞	雙極細胞
視網膜著色上皮		是

GFP陽性細胞之百分比係藉由細胞特異性標記共定位之人工細胞計數來定量。視網膜中之各種區域中之GFP陽性雙極細胞、視錐細胞及RPE細胞之數目分別展示於圖 26A 至圖 26C 中且概述於表 4 中。GFP陽性細胞之數目因視網膜中之位置而變化。表 4 ： GFP 陽性細胞之百分比

細胞類型( 位置)	總%
視錐細胞(視窩)	14-16%
感光體(中間及周邊視網膜)	25-55%
雙極細胞(中間及周邊視網膜)	25-50%
RPE細胞(中間及周邊視網膜)	2.5-4%

實例8：中和抗體特徵曲線之確定

藉由活體外分析確定AAV2.5T.LSV1及AAV2.5T病毒之中和抗體(Neutralizing antibody；nAB)特徵曲線。簡言之，將經混合之人類IgG抗體(Gammaguard IVIG)之連續稀釋液與表現GFP之AAV2.5T.LSV1或AAV2.5T載體組合，且用於轉導293T細胞。隨後量測GFP表現且GFP表現之抑制用於計算IC₅₀ 。實例 9 ： AAV2.5T.LSV1 及 AAV2 之中和抗體特徵曲線之對比

藉由活體外分析確定AAV2.5T.LSV1及AAV2病毒之中和抗體(nAB)特徵曲線。簡言之，製備3倍稀釋系列之經混合之人類IgG抗體(Gammagard IVIG)且與表現GFP之AAV2.5T.LSV1或AAV2載體(分別為AAV2.5T.LSV1-CMV-GFP或AAV2-CMV-GFP)組合。混合物隨後用於轉導293T細胞。將細胞培育3天，且隨後量測GFP表現。GFP表現之抑制用於計算IC₅₀ 。IC₅₀ 據報導為GFP表現降低50%之經混合之人類IgG抗體樣本的稀釋度倒數(舉例而言，IC₅₀ 為100指示1:100稀釋之IVIG使GFP表現降低50%)。更大IC₅₀ 值指示藉由經混合之人類IgG抗體中所存在之抗體對AAV轉導之抑制增加。

AAV2.5T.LSV1及AAV2之抑制曲線展示於圖 27A 至圖 27B 中。AAV2經計算具有IC₅₀ 為103.8，且AAV2.5T.LSV1經計算具有IC₅₀ 為9.3。序列

#	序列	附註
1	HKFKSGD	LSV1插入1
2	X₁ X₂ HKFKSGDX₃	LSV1插入2
3	LAHKFKSGDA	LSV1插入3
4	MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL	AAV5 VP1
5	MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPTTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL	AAV2.5T VP1
6	MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMLAHKFKSGDAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL	AAV5.LSV1 VP1
7	MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMLAHKFKSGDAPTTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL	AAV2.5T.LSV1 VP1
8	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTL	貝伐珠單抗重鏈可變結構域
9	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV	貝伐珠單抗輕鏈可變結構域
10	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTL	雷珠單抗重鏈可變結構域
11	DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTV	雷珠單抗輕鏈可變結構域
12	MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	阿柏西普
13	MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSKLKDPELSLKGTQHIAGQTLHLQCRGEAAMQHKWSLPEMVSKESERLSITKSACGRNGKQFCSTLTLNTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPRPVKLLRGHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRASVRRRIDQSNSHANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKAFITVKHRKQQVLETVAGKRSYRLSMKVKAFPSPEVVWLKDGLPATEKSARYLTRGYSLIIKDVTEEDAGNYTILLSIKQSNVFKNLTATLIVNVKPQIYEKAVSSFPDPALYPLGSRQ	sFlt-1
14	IYIFISDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTI	sFlt-1片段
15	EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSS	溴珠單抗
16	TAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMLAHKFKSGDAPTTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL	AAV5.LSV1 VP2
17	MSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMLAHKFKSGDAPTTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL*	AAV5.LSV1 VP3

圖 1A 展示視網膜及同心樣本穿孔位置之示意性表示。穿孔1含有黃斑(較小圓形壓痕)；穿孔2含有側凹；剩餘組織含有周邊視網膜，包括血弧。

圖 1B 至圖 1E 展示在選擇方法之不同階段處之蛋白殼變異體的相對豐度。圖 1B 展示前100種變異體於原始庫中之之百分比；圖 1C 展示在來自第二篩檢輪之側凹、黃斑或周邊視網膜區域中鑑別之前100種變異體之百分比。圖 1D 展示前50種經進化之變異體之百分比，該等變異體成功轉導來自源自側凹之第2輪庫中之側凹及RPE細胞。圖 1E 展示前50種經進化之變異體之百分比，該等變異體成功轉導來自源自側凹之第2輪庫中之黃斑+周邊細胞。

圖 2 展示來自AAV2.5T及變異體蛋白殼AAV2.5T.LSV1之肝素管柱溶離份之點漬墨法結果。溶離液E1至E10具有增加之NaCl濃度：0.1M (E1)、0.2M (E2)、0.3M (E3)、0.4M (E4)、0.5M (E5)、0.6M (E6)、0.7M (E7)、0.8M (E8)、0.9M (E9)及1.0M (E10)。

圖 3 展示在用編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之2 E+10 vg (亦即2E10 vg)或4 E+10 vg (亦即4E10 vg)感染後第7天或第14天時在6 mm豬視網膜外植體中之GFP表現之實時影像。

圖 4A 至圖 4C 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後第14天(圖 4A )，第21天(圖 4B )及第28天(圖 4C )之非洲綠猴之視網膜之OTC自體螢光影像，展示在視窩及血弧內之GFP表現。

圖 4D 至圖 4E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後第28天非洲綠猴之左(圖 4D )及右(圖 4E )視網膜之Heidelberg Spectralis影像，展示在視窩及血弧內之GFP表現。

圖 5A 至圖 5B 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴的平坦安放之視網膜之螢光影像。

圖 5C 至圖 5D 提供在對於左眼(圖 5C )及對於右眼(圖 5D )玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴的平坦安放之視網膜之螢光影像。

圖 5E 提供針對圖 5C 至圖 5D 中所示之眼睛，跨越自黃斑至睫狀體之距離繪製的GFP強度特徵曲線。自相對於視窩中心之平均距離計算視網膜區域位置。

圖 6A 至圖 6C 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視窩至睫狀體之螢光影像。圖 6A 展示GFP表現。圖 6B 展示細胞核之DAPI染色。圖 6C 為圖 6A 與圖 6B 之複合影像。

圖 7 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後在非洲綠猴眼睛之視窩中表現的GFP的螢光影像。

圖 8 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後在非洲綠猴眼睛之視窩中表現的GFP的螢光影像。

圖9A 至圖 9D 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視窩的螢光影像。圖 9A 展示圖 9B 至圖 9D 之複合影像。圖 9B 展示細胞核之DAPI染色。圖 9C 展示GFP表現。圖 9D 展示視桿感光細胞之視紫質抗體標記。

圖 10A 至圖 10D 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視窩的螢光影像。圖 10A 展示圖10B 至圖 10D 之複合影像。圖 10B 展示細胞核之DAPI染色。圖 10C 展示GFP表現。圖 10D 展示繆勒氏細胞之麩胺合成酶抗體標記。

圖 11 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後在非洲綠猴眼睛之視網膜中表現的GFP的螢光影像。

圖 12A 至圖 12C 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜的螢光影像。圖 12A 為圖 12B 與圖 12C 之複合影像。圖 12B 展示細胞核之DAPI染色。圖 12C 展示GFP表現。

圖 13A 至圖 13D 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜的螢光影像。圖 13A 展示圖 13B 至圖 13D 之複合影像。圖 13B 展示細胞核之DAPI染色。圖 13C 展示GFP表現。圖 13D 展示繆勒氏細胞之麩胺合成酶抗體標記。

圖 14A 至圖 14D 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜的螢光影像。圖 14A 展示圖 14B 至圖 14D 之複合影像。圖 14B 展示細胞核之DAPI染色。圖 14C 展示GFP表現。圖 14D 展示繆勒氏細胞之麩胺合成酶抗體標記。

圖 15A 至圖 15D 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜的螢光影像。圖 15A 展示圖 15B 至圖 15D 之複合影像。圖 15B 展示細胞核之DAPI染色。圖 15C 展示GFP表現。圖 15D 展示繆勒氏細胞之麩胺合成酶抗體標記。

圖 16A 至圖 16E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜的螢光影像。圖 16A 展示圖 16B 至圖 16E 之複合影像。圖 16B 展示細胞核之DAPI染色。圖 16C 展示GFP表現。圖 16D 展示雙極細胞之PCK-α抗體標記。圖 16E 展示視網膜神經節軸突末端路徑之TUJ-1抗體標記。

圖 17A 至圖 17D 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜的螢光影像。圖 17A 展示圖 17B 至圖 17D 之複合影像。圖 17B 展示細胞核之DAPI染色。圖 17C 展示GFP表現。圖 17D 展示雙極細胞之PCK-α抗體標記。

圖 18A 至圖 18E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜的螢光影像。圖 18A 展示圖 18B 至圖 18E 之複合影像。圖 18B 展示細胞核之DAPI染色。圖 18C 展示GFP表現。圖 18D 展示視錐感光細胞之視錐抑制蛋白抗體標記。圖 18E 展示視桿感光細胞之視紫質抗體標記。

圖 19A 至圖 19E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜的螢光影像。圖 19A 展示圖 19B 至圖 19E 之複合影像。圖 19B 展示細胞核之DAPI染色。圖 19C 展示GFP表現。圖 19D 展示視錐感光細胞之視錐抑制蛋白抗體標記。圖 19E 展示視桿感光細胞之視紫質抗體標記。

圖 20A 至圖 20E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜的螢光影像。圖 20A 展示圖 20B 至圖 20E 之複合影像。圖 20B 展示細胞核之DAPI染色。圖 20C 展示GFP表現。圖 20D 展示視錐感光細胞之視錐抑制蛋白抗體標記。圖 20E 展示視桿細胞感光細胞之視紫質抗體標記。

圖 21A 至圖 21E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜著色上皮(retinal pigmented epithelium；RPE)之螢光影像。圖 21A 展示圖 21B 至圖 21E 之複合影像。圖 21B 展示細胞核之DAPI染色。圖 21C 展示在無抗體標記之情況下之天然GFP表現。圖 21D 展示視錐感光細胞之RPE 65抗體標記。圖 21E 展示647 nm下之GFP表現。

圖 22A 至圖 22E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜著色上皮(RPE)之螢光影像。圖 22A 展示圖 22B 至圖 22E 之複合影像。圖 22B 展示細胞核之DAPI染色。圖 22C 展示在無抗體標記之情況下之天然GFP表現。圖 22D 展示視錐感光細胞之RPE 65抗體標記。圖 22E 展示647 nm下之GFP表現。

圖 23A 至圖 23E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜著色上皮(RPE)之平面螢光影像。圖 23A 展示圖 23B 至圖 23E 之複合影像。圖 23B 展示細胞核之DAPI染色。圖 23C 展示在無抗體標記之情況下之天然GFP表現。圖 23D 展示視錐感光細胞之RPE 65抗體標記。圖 23E 展示647 nm下之GFP表現。

圖 24A 至圖 24E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜著色上皮(RPE)之平面螢光影像。圖 24A 展示圖 24B 至圖 24E 之複合影像。圖 24B 展示細胞核之DAPI染色。圖 24C 展示在無抗體標記之情況下之天然GFP表現。圖 24D 展示視錐感光細胞之RPE 65抗體標記。圖 24E 展示647 nm下之GFP表現。

圖 25A 至圖 25E 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛的視網膜著色上皮(RPE)之平面螢光影像。圖 25A 展示圖 25B 至圖 25E 之複合影像。圖 25B 展示細胞核之DAPI染色。圖 25C 展示在無抗體標記之情況下之天然GFP表現。圖 25D 展示視錐感光細胞之RPE 65抗體標記。圖 25E 展示647 nm下之GFP表現。

圖 26A 至圖 26C 提供在玻璃體內投與編碼GFP之AAV2.5T.LSV1病毒粒子之後非洲綠猴之眼睛中之視網膜中的不同區域中之GFP陽性雙極細胞(圖 26A )、視錐細胞(圖 26B )及RPE細胞(圖 26C )之平均百分比。

圖 27A 至圖 27B 提供針對AAV2.5T.LSV1及AAV2之中和抗體(neutralizing antibody；nAB)特徵曲線。經混合之人類IgG抗體(Gammagard IVIG)與AAV2.5T.LSV1-CMV-GFP或AAV2-CMV-GFP組合。將293T細胞用混合物轉導且培育3天，隨後量測GFP表現。圖 27A 展示IVIG針對AAV2.5T.LSV1-CMV-GFP之中和抗體特徵曲線(對於各稀釋液，N=3)。圖 27B 展示IVIG針對AAV2-CMV-GFP之中和抗體特徵曲線(對於各稀釋液，N=2或3)。

<110> 美商愛德維仁生物科技公司(ADVERUM BIOTECHNOLOGIES,INC)

<120> 用於玻璃體內遞送之變異體AAV蛋白殼

<130> 62700-20011.00

<140> TW109113631

<141> 2020-04-23

<150> US 62/923,924

<151> 2019-10-21

<150> US 62/839,548

<151> 2019-04-26

<160> 17

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 1

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> VARIANT

<222> 1,2,10

<223> Xaa=任何胺基酸

<400> 2

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 3

<210> 4

<211> 724

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 4

<210> 5

<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 5

<210> 6

<211> 724

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 6

<210> 7

<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 7

<210> 8

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 8

<210> 9

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 9

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序

<220>

<223> 合成構築體

<400> 10

<210> 11

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 11

<210> 12

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 12

<210> 13

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 13

<210> 14

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 14

<210> 15

<211> 251

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 15

<210> 16

<211> 588

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 16

<210> 17

<211> 532

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 17

Claims

一種重組腺相關病毒(adeno-associated virus；AAV)病毒粒子，其包含：(a)包含經修飾序列之變異體AAV蛋白殼蛋白，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基571至580處經取代，其中該經修飾序列包含LAHKFKSGDA(SEQ ID NO：3)，其中該親本AAV蛋白殼蛋白為包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白；以及(b)包含編碼治療性基因產物之序列之聚核苷酸。
如請求項1之重組AAV病毒粒子，其中該變異體AAV蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO：7中所示之胺基酸序列具有至少85%序列一致性之VP1蛋白殼序列。
如請求項1之重組AAV病毒粒子，其中當該重組AAV病毒粒子以玻璃體內注射至哺乳動物中時能夠轉導視網膜細胞。
如請求項3之重組AAV病毒粒子，其中當該重組AAV病毒粒子以玻璃體內注射至哺乳動物中時能夠轉導以下：感光體、視網膜神經節細胞、繆勒氏細胞(Müller cell)、雙極細胞、無軸突神經細胞、水平細胞及/或視網膜色素上皮細胞中之一或多者。
如請求項4之重組AAV病毒粒子，其中當該重組AAV病毒粒子以玻璃體內注射至哺乳動物中時能夠轉導視網膜色素上皮細胞。
如請求項1之重組AAV病毒粒子，其中該治療性基因產物為siRNA、miRNA或蛋白質。
如請求項1之重組AAV病毒粒子，其中該治療性基因產物為抗血管內皮生長因子(anti-vascular endothelial growth factor；抗VEGF)基因產物或視蛋白(opsin)。
如請求項1之重組AAV病毒粒子，其中編碼該治療性基因產物之聚核苷酸側接一或多個AAV ITR。
如請求項8之重組AAV病毒粒子，其中該一或多個AAV ITR為AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR，或其等之變異體。
如請求項9之重組AAV病毒粒子，其中該一或多個AAV ITR為AAV2 ITR或AAV5 ITR。
如請求項1之重組AAV病毒粒子，其中該重組AAV病毒粒子相較於AAV2.5T具有經改變之細胞向性。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至11中任一項之重組AAV病毒粒子。
一種產生重組AAV(rAAV)病毒粒子之方法，其包含：(a)在產生rAAV病毒粒子之條件下培養宿主細胞，其中該宿主細胞包含：(i)編碼包含經修飾序列之變異體AAV蛋白殼蛋白之聚核苷酸，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基571至580處經取代，其中該經修飾序列包含LAHKFKSGDA(SEQ ID NO：3)，其中該親本AAV蛋白殼蛋白為包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白；(ii)編碼rep蛋白之聚核苷酸；(iii)側接至少一個AAV ITR的聚核苷酸卡匣，該卡匣包含編碼治療性基因產物之序列；及(iv)AAV輔助功能；以及(b)回收由該宿主細胞產生之該rAAV病毒粒子。
一種如請求項1至11中任一項之重組AAV病毒粒子或如請求項12之醫藥組合物之用途，其係用以製備用於向個體視網膜提供治療性基因產物之醫藥品，其中該醫藥品係用於藉由玻璃體內注射投與至該個體。
如請求項14之用途，其中該個體已診斷患有或疑似具有選自由以下組成之群之一或多個病狀：急性黃斑視神經視網膜病變、白塞氏病(Behcet's disease)、脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization)、糖尿病性葡萄膜炎(diabetic uveitis)、組織漿菌病(histoplasmosis)、黃斑變性、水腫、多灶性脈絡膜炎(multifocal choroiditis)、影響後眼部部位或位置之眼部損傷、眼部腫瘤、視網膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion)、糖尿病性視網膜病變、增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy；PVR)、視網膜動脈阻塞性疾病(retinal arterial occlusive disease)、視網膜脫落(retinal detachment)、葡萄膜炎性視網膜病(uveitic retinal disease)、交感神經性眼炎(sympathetic ophthalmia)、沃格特小柳-原田(Vogt Koyanagi-Harada；VKH)氏症候群、葡萄膜擴散、因眼部雷射治療引起或受眼部雷射治療影響之後眼部病狀、因光動力學療法引起或受光動力學療法影響之後眼部病狀、光凝(photocoagulation)、放射性視網膜病(radiation retinopathy)、視網膜前膜病症、視網膜分枝靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion)、前部缺血性視神經病變(anterior ischemic optic neuropathy)、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變、非視網膜病變糖尿病性視網膜功能障礙(non-retinopathy diabetic retinal dysfunction)、視網膜裂損症(retinoschisis)、色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa)、青光眼(glaucoma)、尤塞氏症候群(Usher syndrome)、視錐-視桿細胞營養不良、斯特格氏病(Stargardt disease)、遺傳性黃斑變性、視網膜脈絡膜變性、雷伯氏先天性黑矇(Leber congenital amaurosis)、先天性靜止性夜盲(congenital stationary night blindness)、無脈絡脈畸型(choroideremia)、巴-比二氏症候群(Bardet-Biedl syndrome)、黃斑毛細管擴張、雷伯氏遺傳性視神經病變 (Leber's hereditary optic neuropathy)、早產兒視網膜病(retinopathy of prematurity)及色覺病症。
一種如請求項1至11中任一項之重組AAV病毒粒子或如請求項12之醫藥組合物之用途，其係用以製備在有需要之個體治療視網膜疾病或病症的醫藥品，其中該醫藥品係藉由玻璃體內注射投與至該個體。
如請求項16之用途，其中該疾病或病症為急性黃斑視神經視網膜病變、白塞氏病、脈絡膜新生血管、糖尿病性葡萄膜炎、組織漿菌病、黃斑變性、水腫、多灶性脈絡膜炎、影響後眼部部位或位置之眼部損傷、眼部腫瘤、視網膜中央靜脈阻塞、糖尿病性視網膜病變、增生性玻璃體視網膜病變(PVR)、視網膜動脈阻塞性疾病、視網膜脫落、葡萄膜炎性視網膜病、交感神經性眼炎、沃格特小柳-原田(VKH)氏症候群、葡萄膜擴散、因眼部雷射治療引起或受眼部雷射治療影響之後眼部病狀、因光動力學療法引起或受光動力學療法影響之後眼部病狀、光凝、放射性視網膜病、視網膜前膜病症、視網膜分枝靜脈阻塞、前部缺血性視神經病變、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變、非視網膜病變糖尿病性視網膜功能障礙、視網膜裂損症、色素性視網膜炎、青光眼、尤塞氏症候群、視錐-視桿細胞營養不良、斯特格氏病、遺傳性黃斑變性、視網膜脈絡膜變性、雷伯氏先天性黑矇、先天性靜止性夜盲、無脈絡脈畸型、巴-比二氏症候群、黃斑毛細管擴張、雷伯氏遺傳性視神經病變、早產兒視網膜病或色覺病症。
一種如請求項1至11中任一項之重組AAV病毒粒子之用途，其係用以製備治療個體之視網膜疾病或病症之醫藥品。
如請求項18之用途，其中該疾病或病症為年齡相關之黃斑變性(AMD)、濕性AMD、乾性AMD、視網膜新血管生成、脈絡膜新生血管、糖尿病性視網膜病變、增生性糖尿病性視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、視網膜中央靜脈阻塞、視網膜分枝靜脈阻塞、糖尿病性黃斑水腫、糖尿病性視網膜缺血、缺血性視網膜病變或糖尿病性視網膜水腫。
一種包含經修飾序列之變異體AAV蛋白殼蛋白，該經修飾序列在相對於親本AAV蛋白殼蛋白之胺基酸殘基571至580處經取代，其中該經修飾序列包含LAHKFKSGDA(SEQ ID NO：3)，其中該親本AAV蛋白殼蛋白為包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之AAV2.5T VP1蛋白殼蛋白。
如請求項20之變異體AAV蛋白殼蛋白，其包含與SEQ ID NO：7中所示之胺基酸序列具有至少85%序列一致性之VP1蛋白殼序列。
一種核酸，其包含編碼如請求項20或21之變異體AAV蛋白殼蛋白之核酸序列。
一種包含如請求項22之核酸的表現載體，其中編碼該變異體AAV蛋白殼蛋白之核酸序列可操作地連接至啟動子序列。
如請求項23之表現載體，其進一步包含編碼rep蛋白之核酸。
一種細胞，其包含如請求項23或24之表現載體。
如請求項25之細胞，其進一步包含編碼治療性基因產物之核酸。
如請求項26之細胞，其中該治療性基因產物為siRNA、miRNA或蛋白質。
如請求項26之細胞，其中該治療性基因產物為抗血管內皮生長因子(抗VEGF)基因產物或視蛋白。
如請求項26之細胞，其中編碼該治療性基因產物之核酸側接一或多個AAV ITR。
如請求項29之細胞，其中該一或多個AAV ITR為AAV1 ITR、AAV2 ITR、AAV3 ITR、AAV4 ITR、AAV5 ITR、AAV6 ITR、AAV7 ITR、AAV8 ITR、AAV9 ITR、AAV10 ITR、禽類AAV ITR、牛AAV ITR、犬AAV ITR、馬AAV ITR、靈長類動物AAV ITR、非靈長類動物AAV ITR或綿羊AAV ITR，或其等之變異體。
如請求項30之細胞，其中該一或多個AAV ITR為AAV2 ITR或AAV5 ITR。