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TWI856078B - 抗體–吡咯并苯二氮呯衍生物結合物、其製造方法及其用途 - Google Patents

抗體–吡咯并苯二氮呯衍生物結合物、其製造方法及其用途 Download PDF

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TWI856078B
TWI856078B TW109109845A TW109109845A TWI856078B TW I856078 B TWI856078 B TW I856078B TW 109109845 A TW109109845 A TW 109109845A TW 109109845 A TW109109845 A TW 109109845A TW I856078 B TWI856078 B TW I856078B
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太田悠介
土居史尚
目黑正規
早川市郎
蘆田真二
益田剛
中田隆
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日商第一三共股份有限公司
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Abstract

一種新穎的抗體-吡咯并苯二氮呯(PBD)衍生物結合物、使用該抗體-藥物結合物之具有對腫瘤的治療效果的醫藥品、及使用該抗體-藥物結合物或醫藥品的腫瘤之治療方法。

Description

抗體-吡咯并苯二氮呯衍生物結合物、其製造方法及其用途
本發明係關於一種作為抗腫瘤藥而有用的抗體-藥物結合物，其係透過連接子結構部分而使能以腫瘤細胞作為標的之抗體與吡咯并苯二氮呯衍生物結合而成。
抗體-藥物結合物(Antibody-Drug Conjugate；ADC)已用於癌症治療等，例如，係使抗體與具有細胞毒殺活性的藥物結合而成者，該抗體與於癌細胞表面表現的抗原結合並藉由該結合而可使抗原內化於細胞內。ADC由於可將藥物有效率地送達至癌細胞，而可期待使藥物蓄積於癌細胞內，且使癌細胞死亡。
於作為用於ADC的藥物而有用之一者，可列舉吡咯并苯二氮呯(PBD)。PBD藉由與DNA小凹槽的PuGPu序列等結合而顯示細胞毒性。為源自天然的PBD的安曲黴素(anthramycin)係於1965年首次被發現，之後已發現各式各樣源自天然的PBD、又其類似物的PBD(非專利文獻1~4)。
PBD之一般的結構式係以下式表示。
Figure 109109845-A0305-02-0002-34
已知PBD係於A、C環部中於取代基之數目、種類、部位各自不同，又B、C環部之不飽和度各自不同者。 已知PBD係藉由形成二聚體結構，而細胞毒性飛躍性地提升(非專利文獻5、6)，亦已報告多種將二聚體PBD作成ADC化者(專利文獻1～15)。然而，於C2位具有螺環的PBD或其ADC體並未知悉。 人類CLDN6(密連蛋白-6(Claudin-6)，以下標記為hCLDN6)為密連蛋白(CLDN)家族蛋白質之一種，為包含220個胺基酸殘基的4次穿膜型之膜蛋白質。以前，有報告暗示hCLDN6於一部分的癌中過度表現，且為有吸引力的癌症治療標的(非專利文獻7～9)。又，亦已報告CLDN家族蛋白質藉由胞吞作用而被攝入至細胞內，為周轉(turnover)時間短的家族蛋白質(非專利文獻10)，因而被認為適合為抗體藥物複合體(ADC)之標的。 迄今為止，已由此種暗示與癌症的關連性的資訊，發現特異性辨識hCLDN6的單株抗體(專利文獻16、17)；已有報告使CLDN6特異性的單株抗體與微管蛋白(tubulin)聚合抑制藥的單甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)或美登素(maytansinoid，DM1)結合的ADC(非專利文獻11)。 另一方面，亦已揭示辨識複數個CLDN家族的抗體有擴大治療的適應範圍的可能性，而使辨識CLDN6及CLDN9的抗體(專利文獻18)與具有強力殺細胞效果的吡咯并苯二氮呯(PBD)結合的ADC(專利文獻19)。 然而，彼等之活性強度仍不足，存有將hCLDN6作為治療標的之未充足醫療需求。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2013/173496號 [專利文獻2]國際公開第2014/130879號 [專利文獻3]國際公開第2017/004330號 [專利文獻4]國際公開第2017/004025號 [專利文獻5]國際公開第2017/020972號 [專利文獻6]國際公開第2016/036804號 [專利文獻7]國際公開第2015/095124號 [專利文獻8]國際公開第2015/052322號 [專利文獻9]國際公開第2015/052534號 [專利文獻10]國際公開第2016/115191號 [專利文獻11]國際公開第2015/052321號 [專利文獻12]國際公開第2015/031693號 [專利文獻13]國際公開第2011/130613號 [專利文獻14]國際公開第2005/040170號 [專利文獻15]國際公開第2017/137556號 [專利文獻16]國際公開第2009/087978號 [專利文獻17]國際公開第2011/057788號 [專利文獻18]國際公開第2015/069794號 [專利文獻19]國際公開第2017/096163號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]Julia Mantaj,et al.,Angewandte Chemie Internationl Edition 2016,55,2-29 [非專利文獻2]Dyeison Antonow.et al., Chemical Reviews 2010,111, 2815-2864 [非專利文獻3]In Antibiotics III. Springer Verlag, New York, pp.3-11 [非專利文獻4]Accounts of Chemical Research 1986, 19, 230 [非專利文獻5]Journal of the American Chemical Society 1992,114, 4939 [非專利文獻6]Journal of Organic Chemistry 1996, 61, 8141 [非專利文獻7]BMC Cancer, 2006, 6, 186. [非專利文獻8]Histopatholody, 2012, 61, 1043-1056. [非專利文獻9]Int J Cancer, 2014, 135, 2206-2214. [非專利文獻10]J Membrane Biol, 2004, 199, 29-38. [非專利文獻11]14th Annu Meet Cancer Immunother (CIMT)(May 10-12, Mainz) 2016, Abst 185
[發明欲解決之課題]
本發明係提供新穎的抗體-吡咯并苯二氮呯(PBD)衍生物結合物及新穎的吡咯并苯二氮呯(PBD)衍生物。 又，本發明係提供含有具有抗腫瘤活性的前述抗體-PBD衍生物結合物的醫藥組成物。 再者，本發明提供使用了前述抗體-PBD衍生物結合物的癌症之治療方法。 [用以解決課題之手段]
本發明人等專心研討的結果發現新穎的抗體-吡咯并苯二氮呯(PBD)衍生物結合物具有強的抗腫瘤活性。又，發現前述結合物中的吡咯并二氮呯衍生物之11’位的羥基的絕對構型為Ｓ配置。本發明係基於前述知識見解而完成。 即本案發明係關於以下。
[1]一種下式所示的抗體-藥物結合物，
(式中，m1 表示1或2之整數， D係選自以下之群組的任一者：
式中，星號＊表示與L結合， L係將與Ab之Asn297結合的糖鏈(N297糖鏈)結合的糖鏈及D加以連結的連接子， N297糖鏈可被重塑(remodeling)， Ab表示抗體或該抗體之功能性片段)。
[2]如[1]記載之抗體-藥物結合物，其中L為以 -Lb-La-Lp-NH-B-CH2 -O(C=O)-＊表示， 其中，式中，星號＊表示與D結合， B為1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基或2,5-噻吩基， Lp表示選自以下之群組的任一者： -GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、及-GGPL-， La表示選自以下之群組的任一者： -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-、-C(=O)-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-、 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-、 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 -C(=O)-、 -C(=O)-CH2 CH2 -NH-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -CH2 CH2 -C(=O)-、-CH2 -OC(=O)-、及-OC(=O)-，以及 Lb為下式所示者：
、或
此處，於上述所示的Lb之結構式中，星號＊表示與La結合，波浪線表示與N297糖鏈或經重塑的N297糖鏈結合。
[3]如[1]或[2]記載之抗體-藥物結合物，其中L表示選自以下之群組的任一者： -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGPI-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVK-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGPL-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -NH-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -CH2 CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z2 -OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、及 -Z3 -CH2 -OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2 -OC(=O)-， 此處，B表示1,4-苯基， Z1 表示以下之結構式：
Z2 表示以下之結構式： Z3 表示以下之結構式：
此處，於Z1 、Z2 及Z3 之結構式中，星號＊表示與鄰接的C(=O)、OC(=O)或CH2 結合，波浪線表示與N297糖鏈或經重塑的N297糖鏈結合。
[4]如請求項3記載之抗體-藥物結合物，其中L表示選自以下之群組的任一者： -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、及 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -NH-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -CH2 CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-， 此處，B為1,4-苯基， Z1 表示以下之結構式：
此處，於上述Z1 之結構式中，星號＊表示與鄰接Z1 的C(=O)結合，波浪線表示與N297糖鏈或經重塑的N297糖鏈結合。
[5]如[1]～[4]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中N297糖鏈為經重塑的糖鏈。
[6]如[1]～[5]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中N297糖鏈表示具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG之任一者；
上述式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合， N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2 CH2 -O)n5 -CH2 CH2 -NH-， 此處，n5 表示2～5之整數，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與L中的Z1 之三唑環上的1位或3位的氮原子結合。
[7]如[6]記載之抗體-藥物結合物，其中n5 為3。 [8]一種下式所示之抗體-藥物結合物，
(於上述所示的各自之結構式中，m1 表示1或2之整數， Ab為抗體或該抗體之功能性片段， N297糖鏈為具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG，
式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合， N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2 CH2 -O)3 -CH2 CH2 -NH-， 此處，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與上述結構式中之三唑環上的1位或3位的氮原子結合)。
[9]一種下式所示的抗體藥物結合物，
(於上述所示的各自之結構式中，m1 表示1或2之整數， Ab為抗體或該抗體之功能性片段， N297糖鏈為具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG，
式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合， N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2 CH2 -O)3 -CH2 CH2 -NH-， 此處，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與上述結構式中之三唑環上的1位或3位的氮原子結合)。
[10]一種下式所示的抗體藥物結合物，
(於上述所示的各自之結構式中，m1 表示1或2之整數， Ab為抗體或該抗體之功能性片段， N297糖鏈為具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG，
式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合， N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2 CH2 -O)3 -CH2 CH2 -NH-， 此處，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與上述結構式中之三唑環上的1位或3位的氮原子結合)。
[11]一種下式所示的抗體藥物結合物，
(於上述所示的各自之結構式中，m1 表示1或2之整數， Ab為抗體或該抗體之功能性片段， N297糖鏈為具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG，
式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合， N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2 CH2 -O)3 -CH2 CH2 -NH-， 此處，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與前述式中之三唑環上的1位或3位的氮原子結合)。
[12]如[1]～[11]中任一項記載之抗體ー藥物結合物，其特徵為包含具有內化活性的抗體。
[13]如[1]～[12]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體具有與於腫瘤細胞表現的抗原結合且被攝入至腫瘤細胞內而內化的性質。
[14]如[1]～[13]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其特徵為抗體具有抗腫瘤效果。
[15]如[1]～[14]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體為抗CLDN6抗體、抗CLDN9抗體、抗CLDN6/CLDN9抗體、抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗DLL3抗體、抗FAP抗體、抗CDH11抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD25抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD37抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗B7-H3抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗FGFR2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗GPNMB抗體、抗整合素(Integrin)抗體、抗PSMA抗體、抗肌腱蛋白-C(Tenascin-C)抗體、抗SLC44A4抗體、抗間皮素(Mesothelin)抗體、抗EGFR抗體、抗5T4抗體、抗LRRC15抗體、抗DR5抗體、抗CDH3抗體、抗PDPN抗體、或抗CD123抗體。
[16]如[1]～[15]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其特徵為抗體與CLDN6及/或CLDN9特異性結合。
[17]如[16]記載之抗體-藥物結合物，其中抗體包含以下之(a)或(b)記載之包含CDRH1、CDRH2及CDRH3的重鏈、以及包含CDRL1、CDRL2及CDRL3的輕鏈： (a)由序列識別號9記載之胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號10記載之胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號11記載之胺基酸序列而成的CDRH3，以及，由序列識別號5記載之胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號6記載之胺基酸序列而成的CDRL2、及由序列識別號7記載之胺基酸序列或該胺基酸序列中1或2個之胺基酸被取代的胺基酸序列而成的CDRL3；或 (b)由序列識別號15記載之胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號16記載之胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號17記載之胺基酸序列而成的CDRH3，以及，由序列識別號12記載之胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列而成的CDRL2、及由序列識別號14記載之胺基酸序列而成的CDRL3。
[18]如[17]記載之抗體-藥物結合物，其中抗體包含以下之(a)或(b)記載之包含CDRH1、CDRH2及CDRH3的重鏈、以及包含CDRL1、CDRL2及CDRL3的輕鏈， (a)由序列識別號9記載之胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號10記載之胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號11記載之胺基酸序列而成的CDRH3，及，由序列識別號5記載之胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號6記載之胺基酸序列而成的CDRL2、及由序列識別號7記載之胺基酸序列或序列識別號8記載之胺基酸序列而成的CDRL3，或 (b)由序列識別號15記載之胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號16記載之胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號17記載之胺基酸序列而成的CDRH3，及，由序列識別號12記載之胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列而成的CDRL2、及由序列識別號14記載之胺基酸序列而成的CDRL3。
[19]如[16]～[18]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體包含以下之(a)或(b)記載之重鏈可變區、及輕鏈可變區： (a)抗體為由序列識別號21記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區、及由序列識別號19記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區，或 (b)抗體為由序列識別號25記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區、及由序列識別號23記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區。
[20]如[16]～[19]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其包含選自包含以下之(a)～(e)的群組的胺基酸序列而成的重鏈可變區、及選自包含以下(f)～(k)的群組的胺基酸序列而成的輕鏈可變區； (a)序列識別號54記載之胺基酸序列、 (b)序列識別號58記載之胺基酸序列、 (c)序列識別號62記載之胺基酸序列、 (d)對於(a)～(c)之序列中各CDR序列以外的框架區之序列具有至少95%以上之相同性的胺基酸序列、 (e)於(a)～(c)之序列中各CDR序列以外的框架區之序列中有1或數個胺基酸缺失、被取代或被附加的胺基酸序列、 (f)序列識別號38記載之胺基酸序列、 (g)序列識別號42記載之胺基酸序列、 (h)序列識別號46記載之胺基酸序列、 (i)序列識別號50記載之胺基酸序列、 (j)對於(f)～(i)之序列中各CDR序列以外的框架區之序列具有至少95%以上之序列相同性的胺基酸序列、及 (k)於(f)～(i)之序列中各CDR序列以外的框架區之序列中有1或數個胺基酸缺失、被取代或被附加的胺基酸序列。
[21]如[20]記載之抗體-藥物結合物，其中抗體包含選自包含以下之(a)～(e)的群組的重鏈可變區及輕鏈可變區： (a)由序列識別號54記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號38記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區、 (b)由序列識別號58記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號42記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區、 (c)由序列識別號54記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號46記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區、 (d)由序列識別號58記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號50記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區、及 (e)由序列識別號62記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號46記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區。
[22]如[16]～[21]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體為嵌合抗體。
[23]如[16]～[21]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體為人類化抗體。
[24]如[16]～[23]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體包含人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4之重鏈恆定區。
[25]如[23]或[24]記載之抗體-藥物結合物，其包含選自包含以下之(a)～(e)的群組的重鏈及輕鏈； (a)由序列識別號52之胺基酸編號20～471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號36之胺基酸編號21～234記載之胺基酸序列而成的輕鏈、 (b)由序列識別號56之胺基酸編號20～471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號40之胺基酸編號21～234記載之胺基酸序列而成的輕鏈、 (c)由序列識別號52之胺基酸編號20～471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號44之胺基酸編號21～234記載之胺基酸序列而成的輕鏈、 (d)由序列識別號56之胺基酸編號20～471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號48之胺基酸編號21～234記載之胺基酸序列而成的輕鏈、及 (e)由序列識別號60之胺基酸編號20～471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號44之胺基酸編號21～234記載之胺基酸序列而成的輕鏈。
[26]如[16]記載之抗體-藥物結合物，其中抗體與如[17]～[21]及[25]中任一項記載之抗體，於對CLDN6及/或CLDN9的結合中進行競爭，或與如[17]～[21]及[25]中任一項記載之抗體所辨識的CLDN6及/或CLDN9上的部位結合。
[27]如[1]～[15]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體與HER2特異性結合。
[28]如[27]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性。
[29]如[27]記載之抗體-藥物結合物，其中抗體之重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，包含引起ADCC及/或CDC活性降低的變異。
[30]如[29]記載之抗體-藥物結合物，其中抗體之重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，於該重鏈恆定區中由EU Index所示的234位及235位之白胺酸被取代為丙胺酸。
[31]如[27]或[28]記載之抗體-藥物結合物，其為包含由序列識別號65記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號64記載之胺基酸序列而成的輕鏈的人類化單株抗體。
[32]如[27]、[29]及[30]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其為包含由序列識別號75之胺基酸編號20～139記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號73之胺基酸編號21～127記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區的抗體。
[33]如[27]、[29]、[30]及[32]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其為包含由序列識別號75之胺基酸編號20～469記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號73之胺基酸編號21～234記載之胺基酸序列而成的輕鏈的人類化單株抗體。
[34]如[16]～[33]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體包含選自包含N-鍵結型糖鏈附加、O-鍵結型糖鏈附加、N末端的加工、C末端的加工、去醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、於N末端甲硫胺酸殘基的附加、脯胺酸殘基的醯胺化、及重鏈之羧基末端中的1個或2個胺基酸殘基的缺失之群組的1或2種以上之修飾。
[35]如[34]記載之抗體-藥物結合物，其於抗體之重鏈之羧基末端中有1個或數個之胺基酸殘基缺失。
[36]如[34]或[35]記載之抗體-藥物結合物，其於抗體之2條重鏈的雙方的羧基末端中有1個之胺基酸殘基缺失。
[37]如[34]～[36]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中重鏈之羧基末端之脯胺酸殘基進一步經醯胺化。
[38]如[1]～[37]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體係特徵為藉由以下之步驟而獲得的糖鏈重塑抗體： i)培養包含編碼如[12]～[37]中任一項記載之抗體的多核苷酸的宿主細胞，自獲得的培養物採取目的之抗體的步驟， ii)將步驟i)所獲得的抗體以水解酵素處理，而製造(Fucα1,6)GlcNAc-抗體的步驟，及 iii)於糖轉移酵素存在下，使(Fucα1,6)GlcNAc-抗體與糖鏈供予體分子反應的步驟，該糖鏈供予體分子係於MSG(9)或SG(10)之唾液酸之2位的羧酸的羰基導入具有疊氮基的PEG連接子並將還原末端進行唑啉化而得。
[39]如[38]記載之抗體-藥物結合物，其進一步包含：將步驟ii)之反應液，藉由利用羥磷灰石管柱的純化而將(Fucα1,6)GlcNAc-抗體進行純化的步驟。
[40]一種下式所示的任一者之化合物、其鹽、或彼等之水合物：
。
[41]一種如[1]～[39]中任一項記載之抗體-藥物結合物之製造方法，其包含使如[38]或[39]記載之糖鏈重塑抗體與如[40]記載之化合物、其鹽、或彼等之水合物反應的步驟。
[42]一種抗體-藥物結合物，其特徵為其係以如[41]記載之製造方法而獲得。
[43]如[1]～[39]及[42]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1。
[44]如[1]～[39]、[42]及[43]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中m1 為1之整數。
[45]如[1]～[39]及[42]～[44]中任一項記載之抗體-藥物結合物，其中抗體-藥物結合物中的抗體每1分子的平均藥物結合數為1～3或3～5。
[46]一種醫藥組成物，其特徵為包含如[1]～[39]及[42]～[45]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。
[47]如[46]記載之醫藥組成物，其特徵為抗腫瘤藥。
[48]一種腫瘤之治療方法，其特徵為將如[1]～[39]及[42]～[45]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物投予至個體。
[49]一種醫藥組成物，其特徵為將包含如[1]～[39]及[42]～[45]中任一項記載之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物的醫藥組成物、及至少一種抗腫瘤藥，同時地、分別地或連續地投予至個體。 [發明之效果]
本發明提供之新穎抗體-吡咯并苯二氮呯(PBD)衍生物結合物因具有優異的抗腫瘤活性及安全性，故作為抗腫瘤劑是有用的。又，本發明之PBD衍生物具有抗腫瘤活性，且作為該結合物之藥物是有用的。再者，本發明之抗體辨識於腫瘤細胞表現的抗原或與該抗原結合，因而作為該結合物之抗體是有用的。
[用以實施發明的形態]
〔抗體-藥物結合物〕 本發明之抗體-藥物結合物係使可辨識於腫瘤細胞表現的抗原或與該抗原結合的抗體，透過連接子結構部分而與抗腫瘤性化合物結合的抗腫瘤性藥物。
本發明之抗體-藥物結合物為下式所示者：
m1 為1或2之整數(較佳為1)，D表示藥物，L表示將N297糖鏈與D連結的連接子，Ab表示抗體或該抗體之功能性片段，N297糖鏈表示與前述抗體之Asn297之側鏈結合的糖鏈。N297糖鏈可為經重塑的糖鏈。
＜藥物＞ 本發明之藥物D較佳為抗腫瘤性化合物。本抗腫瘤性化合物係於腫瘤細胞內本發明之抗體-藥物結合物之連接子之一部分或全部被切斷的抗腫瘤性化合物部分所游離出而抗腫瘤效果被表現。 本發明之抗體-藥物結合物中的藥物，即PBD衍生物，例如為選自以下之群組的任一者。
其中，式中，星號＊表示與L結合。 本發明之PBD衍生物係11’位之羥基的絕對構型為S配置。
＜連接子結構＞ 本發明之連接子L係將N297糖鏈與D連結的連接子。 該連接子L為下式所示者： -Lb-La-Lp-NH-B-CH2 -O(C=O)-＊ 星號＊表示與藥物D之N10’位的氮原子結合者，Lb表示將La與N297糖鏈或經重塑的N297糖鏈結合的間隔子。
B表示苯基或雜芳基，較佳為1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基、2,5-噻吩基，更佳為1,4-苯基。
Lp表示於活體內或標的細胞中可切斷的由胺基酸序列而成的連接子。Lp可藉由例如酯酶或肽酶等之酵素的作用而被切斷。 Lp為由2至7個(較佳為2至4個)之胺基酸所構成的胜肽殘基。即，由2至7個之胺基酸藉由胜肽鍵結的寡肽之殘基而構成。 Lp於N末端中與Lb-La-之La的羰基結合，於C末端中與連接子之-NH-B-CH2 -O(C=O)-部分之胺基(-NH-)形成醯胺鍵。藉由前述酯酶等之酵素，Lp之C末端與-NH-間之結合被切斷。
構成Lp的胺基酸並未特別限定，例如，為L-或D-胺基酸，較佳為L-胺基酸。又，除α-胺基酸之外，可為β-丙胺酸、ε-胺基己酸、γ-胺基丁酸等之結構之胺基酸，再者例如亦可為經N-甲基化的胺基酸等之非天然型之胺基酸。
Lp之胺基酸序列並未特別限定，但就構成的胺基酸而言，可列舉甘胺酸(Gly；G)、纈胺酸(Val；V)、丙胺酸(Ala；A)、苯丙胺酸(Phe；F)、麩胺酸(Glu；E)、異白胺酸(Ile；I)、脯胺酸(Pro；P)、瓜胺酸(Cit)、白胺酸(Leu；L)、絲胺酸(Ser；S)、離胺酸(Lys；K)及天冬胺酸(Asp；D)等。此等之中較佳為甘胺酸(Gly；G)、纈胺酸(Val；V)、丙胺酸(Ala；A)、瓜胺酸(Cit)。 此等之胺基酸可為重複，可具有包含任意選擇的胺基酸的胺基酸序列。又，依胺基酸之種類而可控制藥物游離的樣式。
就連接子Lp之具體例而言，可列舉： -GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-、-EGGVA、-PI-、-GGF-、-DGGF-、(D-)D-GGF-、-EGGF-、-SGGF-、-KGGF-、-DGGFG-、-GGFGG-、-DDGGFG-、-KDGGFG-、-GGFGGGF-。 此處，上述之『(D-)V』意指D-纈胺酸，『(D-)P』意指D-脯胺酸，『(D-)D』意指D-天冬胺酸。
連接子Lp較佳為以下。 -GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-。
連接子Lp更佳為以下。 -GGVA-、-GGVCit-、-VA-。
La表示選自以下之群組的任一者。 -C(=O)-(CH2 CH2 )n2 -C(=O)-、-C(=O)-(CH2 CH2 )n2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 )n3 -C(=O)-、-C(=O)-(CH2 CH2 )n2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)n3 -CH2 -C(=O)-、 -C(=O)-(CH2 CH2 )n2 -NH-C(=O)-(CH2 CH2 O)n3 -CH2 CH2 -C(=O)-、-(CH2 )n4 -O-C(=O)-， 其中，式中，n2 表示1～3之整數(較佳為1或2)，n3 表示1～5之整數(較佳為2～4之整數、更佳為2或4)，n4 表示0～2之整數(較佳為0或1)。
La較佳為表示選自以下之群組的任一者： -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-、-C(=O)-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-、 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 )2 -C(=O)- -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 -C(=O)-、 -C(=O)-CH2 CH2 -NH-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -CH2 CH2 -C(=O)-、 -CH2 -OC(=O)-、及-OC(=O)-， La更佳為-C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-、或、-C(=O)-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-。
Lb之間隔子並未特別限定，可列舉例如，下式所示的間隔子。
於上述所示的Lb之各自的結構式，星號(＊)表示與La之左端的-(C=O)、或-(CH2 )n4 結合，波浪線表示與Ab之N297糖鏈或經重塑的N297糖鏈結合。 上述所示的Lb(Lb-1、Lb-2或Lb-3)之各自的結構式，疊氮基與DBCO之點擊反應(click reaction)所形成的三唑環環部位具有幾何異構性結構，1個之Lb係呈此等2種類之結構之任一者存在、或呈彼等之混合物而存在。於本發明之抗體-藥物結合物1分子中，有2或4個(m1 為1或2)之『-L-D』存在，2或4個各自之『-L-D』中的L中之各自的Lb(Lb-1、Lb-2或Lb-3)係呈此等2種類之結構之任一者，或此兩者混合存在。
L較佳為以-Lb-La-Lp-NH-B-CH2 -O(C=O)-＊表示， B為1,4-苯基， Lp表示選自以下之群組的任一者： -GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-。 La表示選自以下之群組的任一者： -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-、-C(=O)-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-、 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-、 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 -C(=O)-、 -C(=O)-CH2 CH2 -NH-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -CH2 CH2 -C(=O)-、-CH2 -OC(=O)-、-OC(=O)-。 Lb表示上述所示的Lb之任一者之結構式。
L更佳為選自以下之群組的任一者。 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGPI-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVK-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGPL-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -NH-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -CH2 CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z2 -OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、-Z3 -CH2 -OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2 -OC(=O)-。 此處，Z1 表示上述Lb之以下所示的結構式：
Z2 表示上述Lb之以下所示的結構式：
Z3 表示上述Lb之以下所示的結構式：
B為1,4-苯基。
L最佳為以下之任一者。 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2 -OC(=O)-、-Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 )2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)2 -CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-、及 -Z1 -C(=O)-CH2 CH2 -NH-C(=O)-(CH2 CH2 O)4 -CH2 CH2 -C(=O)-VA-NH-B-CH2 -OC(=O)-。 此處，B為1,4-苯基，
Z1 表示上述Lb之以下所示的結構式：
＜游離藥物＞ 本發明之抗體-藥物結合物之游離藥物係選自以下之群組之一。
本發明之游離藥物係於本發明之抗體-藥物結合物移行至腫瘤細胞內後，抗體-藥物結合物中的連接子L部分被切斷而生成。該游離藥物係有確認腫瘤細胞效果。
＜抗體＞ 於本發明，「癌」與「腫瘤」係以相同意義使用。 於本發明，「基因」係意指編碼蛋白質之胺基酸的核苷酸序列所包含的核苷酸或核苷酸序列、或其互補鏈，例如，為編碼蛋白質之胺基酸的核苷酸序列所包含的核苷酸序列或其互補鏈的多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、RNA等係包含於「基因」之意義中。就發明之「CLDN6基因」而言，可列舉例如，編碼CLDN6蛋白質之胺基酸序列的核苷酸序列所包含的DNA、mRNA、cDNA、cRNA等。 於本發明，「核苷酸」、「多核苷酸」或「核苷酸序列」與「核酸」同意義，例如，DNA、RNA、探針、寡核苷酸、多核苷酸、引子等亦包含於「核苷酸」或「核苷酸序列」之意義。 於本發明，「多肽」、「胜肽」、「蛋白質」係未區別地使用。 於本發明，「CLDN6」係以與CLDN6蛋白質相同意義使用。
於本發明，「細胞」亦包含動物個體內之細胞、培養細胞。 於本發明，「細胞毒殺活性」係指以某種形式於細胞引起病理性的變化，不僅限於直接的外傷，而且亦指引起DNA的切斷或鹼基之二聚體形成、染色體的切斷、細胞分裂裝置的損傷、各種酵素活性的降低等各種的細胞結構或功能上的損傷。
於本發明，「抗體之功能性片段」亦稱為「抗體之抗原結合片段」，意指具有與抗原之結合活性的抗體之部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、雙功能抗體(diabody)、線狀抗體及由抗體片段所形成的多特異性抗體等。又，將F(ab’)2於還原條件下處理過的抗體之可變區之一價片段的Fab’亦包含於抗體之抗原結合片段。然而，只要具有與抗原的結合能力即可，並未限定於此等之分子。又，於此等之抗原結合片段，不僅包含將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理者，亦包含使用基因工程上改變的抗體基因而於適當宿主細胞中產生的蛋白質。 本發明之功能性片段包含保持受到於IgG重鏈之Fc區域中良好保存的N結合型糖鏈所致的修飾的天門冬醯胺(Asn297)及其周邊的胺基酸，且具有與抗原的結合能力的功能性片段。
於本發明，「抗原決定位」意指特定之抗體(例如，抗CLDN6抗體)所結合的抗原之部分胜肽或部分立體結構(例如，CLDN6之部分胜肽或部分立體結構)。為前述之部分胜肽(例如，CLDN6之部分胜肽)的抗原決定位可藉由免疫試驗法等本技術領域中具有通常知識者所熟知的方法而決定。
本發明中的「CDR」係意指互補性決定區域(CDR：Complementarity determining region)。於抗體分子之重鏈及輕鏈各自有3處所之CDR為已知。CDR亦稱為高度變異區(hypervariable region)，位於抗體之重鏈及輕鏈的可變區內，為一級結構之變異性特高的部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈之一級結構上，各自分離於3處所。本說明書中，於抗體之CDR，將重鏈之CDR自重鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈之CDR自輕鏈胺基酸序列之胺基末端側標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位係於立體結構上相互靠近，而決定了對結合的抗原的特異性。
於本發明，「於嚴格條件下雜交」係指於市售的雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司)中，於68℃下雜交；或在如下條件或與其同等之條件下進行雜交：在使用固定DNA的過濾器而於0.7-1.0M之NaCl存在下、於68℃進行雜交後，使用0.1-2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度SSC係包含150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)，於68℃下洗淨，藉此可鑑定。 於本發明，「1～數個」意指1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個或1～2個。
於本發明，有時將辨識或結合CLDN6或CLDN6及CLDN9的抗體各自標記為「抗CLDN6抗體」、「抗CLDN6/CLDN9抗體」。於該抗體，包含嵌合化抗體、人類化抗體、人類抗體等。有時將辨識或結合CLDN6及CLDN9的抗體標記為「抗CLDN6抗體」。
本發明之抗體-藥物結合物所使用的抗體意指免疫球蛋白，為含有與抗原免疫特異性結合的抗原結合部位。就本發明之抗體而言，可為IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY之任一群別，較佳為IgG。又，就亞群而言，可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2之任一者，但較佳為IgG1、IgG2、IgG4。使用IgG1或IgG4的情形，可藉由取代恆定區之胺基酸殘基之一部分，調整效應子功能(參照WO88/07089、WO94/28027、WO94/29351)。
又，使用IgG1作為本發明之抗體的同型的情形，可藉由取代恆定區之胺基酸殘基之一部份，而調整效應子功能。就使效應子功能減少或減弱的IgG1之突變體而言，可列舉IgG1 LALA(IgG1-L234A、L235A)、IgG1 LAGA(IgG1-L235A、G237A)等，較佳為IgG1 LALA。又，前述L234A、L235A係表示由EU index(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., Vol. 63, No.1 (1969年5月15日), pp.78-85)所特定的234位、235位之白胺酸取代為丙胺酸，G237A表示由EU index特定的237位之甘胺酸取代為丙胺酸。
本發明之抗體可來自任一物種，但較佳可例示人類、大鼠、小鼠及兔。來自人類以外之物種的情形，較佳為使用周知之技術而嵌合化或人類化。本發明之抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體，但較佳為單株抗體。於單株抗體，包含有大鼠抗體、小鼠抗體、兔抗體等之源自非人類動物的單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、彼等之功能性片段、或彼等之修飾體。
本發明之抗體較佳為能以腫瘤細胞為標的的抗體，即，與於腫瘤細胞表面表現的抗原結合的抗體。 本發明之抗體-藥物結合物因使與發揮抗腫瘤效果的化合物結合，故抗體本身具有抗腫瘤效果雖較佳，但非必須。由使抗腫瘤性化合物之細胞毒殺性於腫瘤細胞中特異性・選擇性發揮的目的而言，具有抗體內化而移行至腫瘤細胞內的性質為重要且較佳。抗體之內化之際，抗體-藥物結合物亦可移行至細胞內。由抗腫瘤效果的點來看，具有抗體或抗體-藥物結合物內化而移行至腫瘤細胞內的性質係藉由藥物而對腫瘤細胞賦予特異性・選擇性傷害的點為重要且較佳。抗體之抗腫瘤活性係指對腫瘤細胞的細胞毒殺活性、抗細胞效果。使用周知之活體外或活體內之評價系統，可確認抗腫瘤活性。抗體之內化能力可藉由周知之評價系統而測定。 作為此種抗體，可列舉抗腫瘤關連抗原的抗體，可例示抗CLDN6抗體、抗CLDN9抗體、抗CLDN6/CLDN9抗體、抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗DLL3(δ樣蛋白3(Delta like protein3))抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD25抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD37抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗B7-H3(CD276)抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗FGFR2抗體(WO201315206等)、抗G250抗體、抗MUC1抗體(WO2011012309等)、抗GPNMB抗體、抗整合素抗體、抗PSMA抗體、抗肌腱蛋白-C抗體、抗SLC44A4抗體、抗間皮素抗體、抗EGFR抗體、抗5T4(癌胚抗原(oncofetal antigen) 5T4; 又TPBG及滋胚層醣蛋白(trophoblast glycoprotein))抗體、抗LRRC15(含富白氨酸重複的蛋白質15(Leucine-rich repeat-containing protein 15))抗體、抗DR5抗體、抗CDH3(黏附蛋白3(cadherin 3))抗體、抗PDPN(平足蛋白(podoplanin))抗體、或抗CD123抗體，但未限於此。 作為本發明之抗體，較佳為抗CLDN6抗體、抗CLDN6/CLDN9抗體、抗HER2抗體、抗CD98抗體、抗TROP2抗體，進一步較佳為抗CLDN6抗體、抗HER2抗體(例如，曲妥珠單抗、曲妥珠單抗突變體)。
於以下，針對本發明所使用的抗CLDN6抗體進行說明。
1.CLDN6及CLDN9 CLDN6為屬於密連蛋白家族之由220個胺基酸所組成的4次穿膜型之蛋白質，於細胞內具有N末端及C末端。 人類CLDN6之胺基酸序列及DNA序列已公開於公眾資料庫上，例如可由NP_067018(序列識別號1)、NM_021195(序列識別號2(與NCBI)等之登錄號參照。 於人類CLDN6蛋白質之胺基酸序列(以下，「CLDN6胺基酸序列」)，細胞外區域係以由序列表之序列識別號1之胺基酸編號29～81所組成的細胞外域(EC1)、由胺基酸編號138～160所組成的細胞外域(EC2)而構成。 CLDN9為屬於密連蛋白家族之由217個胺基酸所組成的4次穿膜型之蛋白質，於細胞內具有N末端及C末端。CLDN9具有與CLDN6高的相同性。 人類CLDN9之胺基酸序列及DNA序列已公開於公眾的資料庫上，例如可由NP_066192(序列識別號3)、NM_020982(序列識別號4)(同時NCBI)等之登錄號參照。
2.抗CLDN6抗體 作為本發明之抗CLDN6抗體之一例，可列舉辨識包含自序列表之序列識別號1所示的CLDN6之N末端第29至81號之胺基酸序列、及自第138至160號之胺基酸序列之2個細胞外區域的高階結構，且具有內化活性的抗CLDN6抗體。 本發明之抗CLDN6抗體為能以腫瘤細胞為標的的抗體，即具備可辨識腫瘤細胞的特性、可與腫瘤細胞結合的特性、而且可被攝入至腫瘤細胞內而內化的特性等。因此，可使本發明之抗CLDN6抗體與具有抗腫瘤活性的化合物，透過連接子而結合而作成抗體-藥物結合物。 本發明之抗CLDN6抗體可具有抗腫瘤活性。
(1)本發明之抗CLDN6抗體具有以下(a)及(b)之特性： (a)辨識或結合CLDN家族。 本發明之抗體辨識CLDN家族。換言之，本發明之抗體與CLDN家族結合。本發明之抗體較佳為與CLDN6結合，更佳為與CLDN6特異性結合。再者，本發明之抗體可辨識CLDN9或與CLDN9結合。 於本發明，「特異的辨識」，即「特異的結合」係意指不是非特異的吸附的結合。就結合是否為特異的判定基準而言，可列舉例如，解離常數(Dissociation Constant：以下，稱為「KD」)。本發明之適合的抗體之對CLDN6及/或CLDN9的KD值為1×10-5 M以下、5×10-6 M以下、2×10-6 M以下或1×10-6 M以下，更適合地為5×10-7 M以下、2×10-7 M以下或1×10-7 M以下。 本發明中的抗原與抗體之結合係可藉由ELISA法、RIA法、表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance)(以下，稱為「SPR」)解析法等而測定或判定。於細胞表面上表現的抗原與抗體之結合可藉由流動式細胞測量術法等而測定。 (b)具有藉由與CLDN6及/或CLDN9結合，而內化於CLDN6及/或CLDN9表現細胞的活性。 (2)CLDN6及/或CLDN9為人類CLDN6及/或人類CLDN9的上述(1)記載之抗體。
本發明之抗CLDN6單株抗體可以使用融合瘤的法等而獲得。就抗CLDN6單株抗體之例而言，可列舉小鼠抗CLDN6抗體B1及C7。又，於本發明中，亦有時將該「B1」標記為「B1抗體」，將該「C7」標記為「C7抗體」。 B1抗體之重鏈可變區之鹼基序列記載於序列表之序列識別號20，胺基酸序列記載於序列識別號21。又，B1抗體之輕鏈可變區之鹼基序列記載於序列表之序列識別號18，胺基酸序列記載於序列識別號19。 B1抗體之CDRH1之胺基酸序列記載於序列識別號9，CDRH2之胺基酸序列記載於序列識別號10，CDRH3之胺基酸序列記載於序列識別號11，CDRL1之胺基酸序列記載於序列識別號5，CDRL2之胺基酸序列記載於序列識別號6，CDRL3之胺基酸序列記載於序列識別號7。 C7抗體之重鏈可變區之鹼基序列記載於序列表之序列識別號24，胺基酸序列記載於序列識別號25。又，C7抗體之輕鏈可變區之鹼基序列記載於序列表之序列識別號22，胺基酸序列記載於序列識別號23。 C7抗體之CDRH1之胺基酸序列記載於序列識別號15，CDRH2之胺基酸序列記載於序列識別號16，CDRH3之胺基酸序列記載於序列識別號17，CDRL1之胺基酸序列記載於序列識別號12，CDRL2之胺基酸序列記載於序列識別號13，CDRL3之胺基酸序列記載於序列識別號14。
作為本發明之抗CLDN6抗體，可列舉與B1抗體或C7抗體結合於相同之抗原決定位的抗體。該抗體若與B1抗體或C7抗體之結合的部分胜肽或部分立體結構結合，可判定該抗體結合於與B1抗體或C7抗體相同的抗原決定位。又，藉由確認對於B1抗體或C7抗體之對CLDN6的結合，該抗體為競爭(即，該抗體妨礙B1抗體或C7抗體與CLDN6的結合)，即使具體的抗原決定位之序列或結構未被決定，亦可判定該抗體與抗CLDN6抗體相同的抗原決定位結合。確認抗原決定位為相同的情形，強烈期待該抗體具有與B1抗體或C7抗體同等之抗原結合能力、生物活性及/或內化活性。
於本發明之抗體，除了抗上述CLDN6的單株抗體之外，亦包含以使對人類的異種抗原性降低等為目的而人為地改變的基因重組型抗體，例如，嵌合(Chimeric)抗體、人類化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等之抗體可使用已知之方法而製造。
(1)嵌合抗體 就嵌合抗體而言，可列舉抗體的可變區與恆定區互為異種之抗體，例如將源自小鼠或大鼠的抗體之可變區與源自人類之恆定區加以接合的嵌合抗體。 作為本發明之嵌合抗體所例示的源自小鼠抗人類CLDN6抗體B1抗體之嵌合抗體為包含含有序列識別號21所示的胺基酸序列而成的重鏈可變區的重鏈及含有序列識別號19所示的輕鏈可變區的輕鏈之抗體，可具有任意之源自人類的恆定區。 作為源自小鼠抗人類CLDN6抗體B1抗體的嵌合抗體之具體例，可列舉源自小鼠抗人類CLDN6抗體B1抗體之嵌合抗體chB1抗體(以下，亦記載為「chB1」)。可列舉chB1抗體之胺基酸序列包含具有由序列表之序列識別號32之第20～471號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列的重鏈及具有由序列表之序列識別號28之21～234號而成的胺基酸序列的輕鏈的抗體。 又，於序列表之序列識別號32所示的重鏈序列中，由第1～19號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列為訊息序列，由第20～141號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列為重鏈可變區，由第142～471號之殘基而成的胺基酸序列為重鏈恆定區。又，於序列表之序列識別號28所示的輕鏈序列中，由第1～20號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列為訊息序列，由第21～127號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列為輕鏈可變區，由第128～234號之胺基酸殘基而成的胺基酸序列為輕鏈恆定區。 chB1抗體之重鏈及輕鏈之可變區之胺基酸序列記載於序列表之序列識別號34、序列識別號30。 chB1抗體之重鏈胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號33所示的核苷酸序列而編碼。由序列表之序列識別號33所示的核苷酸序列之第1～57號之核苷酸而成的核苷酸序列編碼chB1抗體重鏈之訊息序列，由序列表之序列識別號33所示的核苷酸序列之第58～423號之核苷酸而成的核苷酸序列編碼chB1抗體之重鏈可變區，由序列表之序列識別號33所示的核苷酸序列之第424～1413號之核苷酸而成的核苷酸序列編碼chB1抗體之重鏈恆定區。 chB1抗體之重鏈可變區之鹼基序列記載於序列表之序列識別號35。 chB1抗體之輕鏈胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號29所示的核苷酸序列而編碼。由序列表之序列識別號29所示的核苷酸序列之第26～85號之核苷酸而成的核苷酸序列編碼chB1抗體輕鏈之訊息序列，由序列表之序列識別號29所示的核苷酸序列之第86～406號之核苷酸而成的核苷酸序列編碼chB1抗體之輕鏈可變區，由序列表之序列識別號29所示的核苷酸序列之第407～727號之核苷酸而成的核苷酸序列編碼chB1抗體之輕鏈恆定區。 chB1抗體之輕鏈可變區之鹼基序列記載於序列表之序列識別號31。
(2)人類化抗體 就人類化抗體而言，可列舉：僅將互補性決定區域(CDR;complementarity determining region)組入源自人類的抗體的抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)；藉由CDR移植法，將CDR之序列外及一部份框架之胺基酸殘基都移植於人類抗體的抗體(WO90/07861號)；進而，維持對抗原的結合能力，同時改變一部份CDR之胺基酸序列的抗體(WO2012/075581、WO2011/084496、US2018/0501692)。CDR之胺基酸序列可依據Kabat之定義、Chothia之定義、Abm之定義、IMGT等周知之方法而決定，但本發明中的CDR可為藉由任一方法所定義者。。 惟，就源自B1抗體或C1抗體之人類化抗體而言，只要保持B1抗體或C1抗體之6種全部的CDR序列，且具有CLDN6結合活性即可，並未限定於特定之人類化抗體，進而改變1～數個(較佳為1～2個、更佳為1個)之CDR之胺基酸序列的人類化抗體突變體亦只要辨識CLDN6蛋白質或具有該抗體之CLDN6蛋白質結合活性即可，並未限定於特定之人類化抗體。 就本發明之抗CLDN6人類化抗體或其功能性片段而言，可列舉例如，辨識本發明之CLDN6蛋白質或保持該抗體之CLDN6蛋白質結合活性的抗體或該抗體之功能性片段等，其包含下列重鏈及輕鏈： 具有可變區之重鏈，該可變區包含： 序列表之序列識別號9所示的胺基酸序列或該胺基酸序列之1～數個(較佳為1～2個)之胺基酸被取代的胺基酸序列而成的CDRH1、 序列表之序列識別號10所示的胺基酸序列或該胺基酸序列之1～數個(較佳為1～2個)之胺基酸被取代的胺基酸序列而成的CDRH2、及 序列表之序列識別號11所示的胺基酸序列或該胺基酸序列之1～數個(較佳為1～2個)之胺基酸被取代的胺基酸序列而成的CDRH3；以及 具有可變區之輕鏈，該可變區包含： 序列表之序列識別號5所示的胺基酸序列或該胺基酸序列之1～數個(較佳為1～2個)之胺基酸被取代的胺基酸序列而成的CDRL1、 序列表之序列識別號6所示的胺基酸序列或該胺基酸序列之1～數個(較佳為1～2個)之胺基酸被取代的胺基酸序列而成的CDRL2、及 序列表之序列識別號7所示的胺基酸序列或該胺基酸序列之1～數個(較佳為1～2個)之胺基酸被取代的胺基酸序列而成的CDRL3。 就上述抗CLDN6人類化抗體或其功能性片段中的CDR之胺基酸取代之例而言，較佳可列舉上述CDRL3之1～數個(較佳為1～2個)之胺基酸取代，可例示將序列表之序列識別號7之胺基酸編號4及5之胺基酸加以取代的序列表之序列識別號8所示的CDRL3。
作為具有上述CDRH的人類化抗體之重鏈可變區，可例示序列表之序列識別號54所示的胺基酸序列、序列表之序列識別號58所示的胺基酸序列、及序列表之序列識別號62所示的胺基酸序列，作為具有上述CDRL的人類化抗體之輕鏈可變區，可例示序列表之序列識別號38所示的胺基酸序列、序列表之序列識別號42所示的胺基酸序列、序列表之序列識別號46所示的胺基酸序列、及序列表之序列識別號50所示的胺基酸序列。
上述，作為包含重鏈可變區及輕鏈可變區之組合的人類化抗體，可適當地例示： 包含由序列表之序列識別號54所示的胺基酸序列而成的重鏈可變區、及由序列表之序列識別號38所示的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的人類化抗體、 包含由序列表之序列識別號58所示的胺基酸序列而成的重鏈可變區、及由序列表之序列識別號42所示的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的人類化抗體、 包含由序列表之序列識別號54所示的胺基酸序列而成的重鏈可變區、及由序列表之序列識別號46所示的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的人類化抗體、 包含由序列表之序列識別號58所示的胺基酸序列而成的重鏈可變區、及由序列表之序列識別號50所示的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的人類化抗體、 包含由序列表之序列識別號62所示的胺基酸序列而成的重鏈可變區、及由序列表之序列識別號46所示的胺基酸序列而成的輕鏈可變區的人類化抗體。
作為包含上述重鏈可變區及輕鏈可變區之組合的人類化抗體之全長序列，可例示： 包含由序列表之序列識別號52之胺基酸編號20～471所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號36之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H1L1)、 包含由序列表之序列識別號56之胺基酸編號20～471所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號40之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H2L2)、 包含由序列表之序列識別號52之胺基酸編號20～471所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號44之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H1L3)、 包含由序列表之序列識別號56之胺基酸編號20～471所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號48之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H2L4)、或 包含由序列表之序列識別號60之胺基酸編號20～471所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號44之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H3L3)。 又，序列表之序列識別號52、56、或60所示的重鏈胺基酸序列中，由第1～19號之胺基酸殘基所組成的胺基酸序列為訊息序列，由第20～141號之胺基酸殘基所組成的胺基酸序列為重鏈可變區，由第142～471號之胺基酸殘基所組成的胺基酸序列為重鏈恆定區。 又，序列表之序列識別號36、40、44或48所示的輕鏈胺基酸序列中，由第1～20號之胺基酸殘基所組成的胺基酸序列為訊息序列，由第21～127號之胺基酸殘基所組成的胺基酸序列為輕鏈可變區，由第128～234號之胺基酸殘基所組成的胺基酸序列為輕鏈恆定區。
上述人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3之重鏈之羧基末端係如後述，可有1或2個胺基酸缺失，該缺欠體亦包含於本發明。 就缺失體之重鏈而言，可列舉包含序列表之序列識別號52、56、60之胺基酸編號20～470號記載之胺基酸序列的重鏈。 就該缺失體而言，可例示： 包含由序列表之序列識別號52之胺基酸編號20～470所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號36之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H1L1)、 包含由序列表之序列識別號56之胺基酸編號20～470所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號40之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H2L2)、 包含由序列表之序列識別號52之胺基酸編號20～470所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號44之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H1L3)、 包含由序列表之序列識別號56之胺基酸編號20～470所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號48之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H2L4)、或 包含由序列表之序列識別號60之胺基酸編號20～470所示的胺基酸序列而成的重鏈、及由序列表之序列識別號44之胺基酸編號21～234所示的胺基酸序列而成的輕鏈的人類化抗體(H3L3)。
編碼上述人類化抗體H1L1之重鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號53，編碼輕鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號37、 編碼人類化抗體H2L2之重鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號57，編碼輕鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號41、 編碼人類化抗體H1L3之重鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號53，編碼輕鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號45、 編碼人類化抗體H2L4之重鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號57，編碼輕鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號49、 編碼人類化抗體H3L3之重鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號61，編碼輕鏈胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號45所示的多核苷酸。 編碼上述人類化抗體H1L1之重鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號55，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號39、 編碼人類化抗體H2L2之重鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號59，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號43、 編碼人類化抗體H1L3之重鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號55，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號47、 編碼人類化抗體H2L4之重鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號59，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號51、 編碼人類化抗體H3L3之重鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號63，編碼輕鏈可變區之胺基酸序列的鹼基序列為序列識別號47所示的多核苷酸。 又，由序列表之序列識別號53、57、61所示的各核苷酸序列之第1～57號之核苷酸所組成的核苷酸序列編碼該人類化抗體重鏈之訊息序列，由第58～423號之核苷酸所組成的核苷酸序列編碼該人類化抗體重鏈可變區之胺基酸序列，由第424～1413號之鹼基序列之核苷酸所組成的核苷酸序列編碼該抗體重鏈恆定區。 又，由序列表之序列識別號37、41、45、49所示的各核苷酸序列之第1～60號之核苷酸所組成的核苷酸序列編碼該人類化抗體輕鏈之訊息序列，由第61～381號之核苷酸所組成的核苷酸序列編碼該人類化抗體輕鏈可變區之胺基酸序列，由第382～702號之核苷酸所組成的核苷酸序列編碼該抗體輕鏈恆定區。
與包含上述重鏈可變區及輕鏈可變區之組合的抗體、或包含上述重鏈及輕鏈之組合的抗體之胺基酸序列的同一性或相同性為80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進一步較佳為97%以上、最佳為99%以上的抗體，亦只要具有對CLDN6的結合活性，則包含於本發明之抗體中。 又，與包含上述重鏈可變區及輕鏈可變區之組合的抗體、或具有由與包含上述重鏈及輕鏈之組合的抗體之CDR相同之胺基酸序列而成的CDR，且除去該抗體之CDR之胺基酸序列後的胺基酸序列之同一性或相同性為80%以上、較佳為90%以上、更佳為95%以上、進一步較佳為97%以上、最佳為99%以上的抗體，亦只要具有對CLDN6的結合活性，則包含於本發明之抗體中。 再者，藉由組合於重鏈或輕鏈之胺基酸序列有1～數個之胺基酸殘基取代、缺失或附加的胺基酸序列，亦可選擇具有與上述之各抗體同等的生物活性的抗體。又，就本說明書中的胺基酸之取代而言，較佳為保守的胺基酸取代(WO2013154206)。 保守的胺基酸取代係指於與胺基酸側鏈有關連的胺基酸群組內發生的取代。該胺基酸取代較佳為於不使具有原有之胺基酸序列的物質的特性降低的範圍內進行。 二種類之胺基酸序列間的相同性可藉由使用Blast 演算法第2.2.2版(Altschul, Stephen F., Thomas L.Madden, Alejandro A.Schaaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J.Lipman(1997), 「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res.25:3389-3402)之系統內定參數(default parameter)來決定。Blast 演算法亦可藉由以網際網路存取來使用www.ncbi.nlm.nih.gov/blast。 (3)人類抗體 就本發明之抗體而言，進一步可列舉與CLDN6及/或CLDN9結合的人類抗體。抗CLDN6及/或CLDN9人類抗體係意指僅具有源自人類染色體的抗體之基因序列的人類抗體。亦已知抗CLDN6人類抗體可藉由周知之方法而獲得(Nature Genetics(1997)16,p.133-143、Nucl.Acids Res.(1998)26, p.3447-3448、Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects, vol.10, p.69-73、Kluwer Academic Publishers, 1999.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000) 97, p.722-727、Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002)43(7), p.2301-2308、Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002), 1(2), p.189-203、Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12, p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9), p.1105-1116)。
以下，針對於本發明使用的抗HER2抗體進行說明。 本發明之抗HER2抗體具有以下之特性： (1)一種抗HER2抗體，其特徵為具有以下之特性： (a)與HER2特異性結合； (b)具有藉由與HER2而於HER2表現細胞內化的活性。 (2)上述(1)記載之抗體，其與HER2之細胞外域(domain)結合。 (3)上述(1)或(2)記載之抗體，其中前述抗體為單株抗體。 (4)上述(1)～(3)中任一項記載之抗體，其具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性。 (5)上述(1)～(4)中任一項記載之抗體，其為小鼠單株抗體、嵌合單株抗體或人類化單株抗體。 (6)上述(1)～(3)及(5)中任一項記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，包含引起ADCC及/或CDC活性的降低的變異。 (7)上述(6)記載之抗體，其中重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，由EU Index所示的234位及235位之白胺酸被取代為丙胺酸。 (8)上述(1)～(5)中任一項記載之抗體，其係包含由序列識別號65記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號64記載之胺基酸序列而成的輕鏈的抗體。 (9)上述(1)～(3)及(5)～(7)中任一項記載之抗體，其為包含由序列識別號75之胺基酸編號20～139記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號73之胺基酸編號21～127記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區的抗體。 (10)上述(1)～(3)、(5)～(7)及(9)中任一項記載之抗體，其係包含由序列識別號75之胺基酸編號20～469記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號73之胺基酸編號21～234記載之胺基酸序列而成的輕鏈的抗體。 (11)上述(1)～(10)中任一項記載之抗體，其於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸缺失。 (12)上述(1)～(5)、(8)及(11)中任一項記載之抗體，其包含由序列識別號65之胺基酸編號1～449記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號64之胺基酸編號1～214記載之胺基酸序列而成的輕鏈。 (13)上述(1)～(3)、(5)～(7)、及(9)～(11)中任一項記載之抗體，其係包含由序列識別號75之胺基酸編號20～468記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號73之胺基酸編號21～234記載之胺基酸序列而成的輕鏈。 (14)一種藉由下列抗體之製造方法而獲得的抗體，其包含培養藉由含有編碼上述(1)～(13)中任一項記載之抗體的多核苷酸的表現載體而轉形的宿主細胞的步驟及自該步驟獲得的培養物採取目的之抗體的步驟。 又，於本案中，將曲妥珠單抗之重鏈恆定區(序列識別號65)之由EU Index所示的234位及235位之白胺酸被取代為丙胺酸的抗體稱為曲妥珠單抗突變體。 再者，就本發明之抗HER2抗體而言，可列舉曲妥珠單抗突變體2。曲妥珠單抗突變體2之重鏈胺基酸序列記載於序列識別號77，輕鏈胺基酸序列記載於序列識別號76。
本發明之抗體中亦包含抗體之修飾體。該修飾體意指對本發明之抗體施予化學或生物學的修飾者。化學的修飾體中包含對胺基酸骨架之化學部分的鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈的化學修飾體等。生物學的修飾體中包含經轉譯後修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結的糖鏈附加、N末端或C末端的加工、去醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化)、藉由使用原核生物宿主細胞而使表現而於N末端附加甲硫胺酸殘基等。又，為了能夠進行本發明之抗體或抗原的檢出或單離而被標識者，例如，酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含於該修飾體的意義中。此種本發明之抗體之修飾體有用於抗體之安定性及血中滯留性的改善、抗原性的減少、抗體或抗原的檢出或單離等。 又，能夠藉由調節與本發明之抗體結合之糖鏈修飾(糖苷化(glycosylation)、脫岩藻糖(fucose)化等)，而增強抗體依賴性細胞毒殺活性。就抗體之糖鏈修飾的調節技術而言，已知有WO1999/54342、WO2000/61739、WO2002/31140、WO2007133855、WO2013120066等，但未限定於此等。於本發明之抗體亦包含該糖鏈修飾經調節的抗體。 該修飾可施加於抗體或其功能性片段中的任意之位置、亦可施加於冀望的位置，可於1或2個以上之位置施予相同或2種以上之不同的修飾。 於本發明「抗體片段之修飾體」於其含意中亦包含「抗體之修飾體的片段」。
於暫時單離抗體基因後導入適當的宿主而製作抗體之情形，可使用適當的宿主與表現載體之組合。就抗體基因之具體例而言，可列舉組合編碼本說明書記載之抗體之重鏈序列的基因、及編碼輕鏈序列的基因者。於轉形宿主細胞之際，重鏈序列基因等與輕鏈序列基因等能夠被插入相同的表現載體，又亦可被插入不同的表現載體。 使用真核細胞作為宿主的情形，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。尤其就動物細胞而言，可列舉哺乳類細胞，例如，為猴之細胞的COS細胞(Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (1980)77、p.4126-4220)、FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)。 使用原核細胞的情形，可列舉例如，大腸菌、枯草菌。 藉由轉形而對此等之細胞導入為目的的抗體基因，於活體外培養經轉形的細胞而獲得抗體。於該培養，有依抗體的序列而產量不同的情形，能夠從具有同等的結合活性之抗體中以產量為指標來篩選作為醫藥之生產為容易者。據此，於本發明之抗體中亦包含藉由該抗體之製造方法而獲得的抗體，該製造方法之特徵為包含培養上述經轉形的宿主細胞的步驟、及自該步驟獲得的培養物採取目的之抗體或該抗體之功能性片段的步驟。
上述抗體基因較佳為包含以下之(a)～(e)中任一項記載之多核苷酸的多核苷酸。 (a)編碼B1或C7抗體、chB1抗體、人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3、曲妥珠單抗及其突變體之任一者之抗體之重鏈胺基酸序列的多核苷酸與編碼輕鏈胺基酸序列的多核苷酸之組合； (b)編碼包含B1或C7抗體、chB1抗體、及人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3、曲妥珠單抗及其突變體之任一者之抗體之包含CDRH1～CDRH3的重鏈胺基酸序列的多核苷酸與編碼包含CDRL1～CDRL3的輕鏈胺基酸序列的多核苷酸之組合； (c)編碼包含B1或C7抗體、chB1抗體、及人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、H3L3、曲妥珠單抗及其突變體之任一者之抗體之重鏈可變區之胺基酸序列的重鏈胺基酸序列的多核苷酸與編碼包含輕鏈可變區之胺基酸序列的輕鏈胺基酸序列的多核苷酸之組合； (d)於嚴格條件下與包含與(a)～(c)中任一項記載之多核苷酸互補的多核苷酸的核苷酸進行雜交，且編碼與CDLN6或HER2結合的抗體之胺基酸序列的多核苷酸；及 (e)編碼於(a)～(c)中任一項記載之多核苷酸中1～50個、1～45個、1～40個、1～35個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～8個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1或2個、或1個之胺基酸取代、缺失、附加或插入而成的多肽之胺基酸序列，且編碼與CLDN6或HER2結合的抗體之胺基酸序列的多核苷酸。 本發明包含編碼本發明之抗體或其功能性片段或其修飾體的核苷酸、有插入該基因的重組載體、有導入該基因或該載體的細胞。 又，本發明亦包含抗體或其功能性片段或其修飾體之製造方法，其包含培養前述細胞的步驟、及自該培養物回收抗體或其功能性片段或其修飾體的步驟。
又，已知以哺乳類培養細胞所生產的抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基缺失(Journal of Chromatography A, 705:129-134(1995))，又，已知相同於重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2胺基酸殘基缺失，且新位於羧基末端的脯胺酸殘基經醯胺化(Analytical Biochemistry、360:75-83(2007))。然而，此等之重鏈序列之缺失及修飾，對於抗體之抗原結合能力及效應子功能(補體之活性化或抗體依賴性細胞毒殺作用等)無影響。因此，本發明之抗體中，亦包含受到該修飾的抗體及該抗體之功能性片段，亦包含於重鏈羧基末端有1或2個之胺基酸缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。惟，只要保有抗原結合能力及效應子功能，本發明之抗體之重鏈的羧基末端的缺失體並未限定於上述之種類。構成本發明之抗體的2條重鏈可為選自包含完全長度及上述缺失體之群組的重鏈之任意一種，亦可為組合了任意二種者。各缺失體的量比可能受到產生本發明之抗體的哺乳類培養細胞的種類及培養條件影響，但就本發明之抗體的主成分而言，可列舉於2條重鏈之雙方有羧基末端的1個之胺基酸殘基缺失的情形。
所得到的抗體可純化至均一為止。抗體之分離、純化只要使用通常之蛋白質所使用的分離、純化方法即可。若適宜選擇、組合例如管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、調製用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等，即可分離、純化抗體(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996);Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但未限定於此等。
＜N297糖鏈＞ 近年來，已報告將不均一的抗體之糖蛋白質藉由酵素反應等而重塑，而均一地導入具有官能基的糖鏈的方法(ACS Chemical Biology 2012, 7, 110、ACS Medicinal Chemistry Letters 2016, 7, 1005、Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233、Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367、US2016361436)。
本發明之糖鏈的重塑，首先利用水解酵素，將附加於蛋白質(抗體等)的不均一糖鏈僅殘留末端的GlcNAc而進行切除，調製附加了GlcNAc的均一蛋白質部分(以下，稱為「接受體」)。接著，準備另外調製的任意之糖鏈(以下，稱為「供予體」)，將此接受體與供予體使用糖轉移酵素而連結。藉此，可合成具有任意之糖鏈結構的均一的糖蛋白質。
於本發明，「糖鏈」意指2個以上的單醣藉由醣苷鍵結被結合的結構單元。有時會將具體的單醣或糖鏈標記為例如「GlcNAc-」「MSG-」之類的縮寫。在結構式中以此等之縮寫記載之情形，在還原末端歸屬於與別的結構單元之醣苷鍵結的氧原子或氮原子，除了有特別的定義之情形，係作為不包含在表示該糖鏈之縮寫中者而表示。
於本發明，成為糖鏈之基本單元的單醣之記載，除了有另外規定之情形，方便上，將於其環結構中與構成環之氧原子結合，且與羥基(或歸屬於醣苷鍵結的氧原子)直接結合之碳原子，標記為1位(僅於唾液酸為2位)。實施例化合物的名稱係以化學結構整體來命名者，此規則並不一定適用。
於本發明，以記號(例如，GLY、SG、MSG、GlcNAc等)記載糖鏈之情形，除了有另外定義之情形，係使至還原末端的碳為止為該記號中所包含者，而使歸屬於N-或O-醣苷鍵結的N或O為該記號中不包含者。
於本發明，只要未特別記載，於胺基酸之側鏈中與糖鏈連結之情形的部分結構，係將側鏈部分以括弧來表示，例如使其標記為如「(SG-)Asn」。
本發明之抗體-藥物結合物係以下式表示：
抗體Ab或其功能性片段係自N297糖鏈或經重塑的N297糖鏈與L結合，較佳為自Ab之經重塑的N297糖鏈與L結合。
本發明中的Ab之糖鏈為N結合型糖鏈或O結合型糖鏈，較佳為N結合型糖鏈。 N結合型糖鏈係藉由N醣苷鍵結，O結合型糖鏈係藉由O醣苷鍵結，而與抗體之胺基酸側鏈結合。
IgG於其重鏈的Fc區域中之第297號之天門冬醯胺殘基(以下，稱為「Asn297或N297」)具有被良好地保存的N結合型糖鏈，已知對抗體分子的活性或動態等有貢獻(Biotechnol.Prog., 2012,28, 608-622, Anal.Chem., 2013,85,715-736)。
IgG之恆定區中的胺基酸序列高度保守，於Edelman et al.,(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., Vol.63, No.1 (May 15,1969),p.78-85)，各個胺基酸以Eu編號(EU index)特定。例如，於Fc區域中N結合型糖鏈附加之Asn297係相當於Eu編號中297位者，即使是因分子的片段化或區域缺失而實際的胺基酸位置有變動之情形，亦藉由以Eu編號表示而胺基酸被無歧義地特定。
於本發明之抗體-藥物結合物，較佳為抗體或其功能性片段自與其Asn297之側鏈結合的糖鏈(以下，稱為「N297糖鏈」)與L結合，更佳為抗體或其功能性片段係自前述N297糖鏈與L結合，該N297糖鏈為經重塑的糖鏈。
SGP為唾液酸醣肽(Sialyl GlycoPeptide)的簡稱，為N結合型複合糖鏈之代表性者。從雞卵的卵黃，SGP可按照例如WO2011/0278681中記載的方法而單離、純化。又，有市售(東京化成(股)、伏見製藥所(股))且可購入SGP的純化品。有市售於SG的糖鏈部分中只由還原末端的GlcNAc缺失了一個之糖鏈(以下，「SG(10)」)所構成的二唾液酸八糖(Disialyloctasaccharide)(東京化成(股))等。
於本發明，僅於SG(10)之β-Man的支鏈之任一者，將非還原末端之唾液酸缺失的糖鏈結構稱為MSG(9)，各自將僅於支鏈之1-3糖鏈具有唾液酸者標記為MSG1，將僅於支鏈之1-6糖鏈具有唾液酸者標記為MSG2。
本發明之經重塑的N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)MSG1與N297-(Fuc)MSG2之混合物，或N297-(Fuc)SG，較佳為N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG，更佳為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2。
N297-(Fuc)MSG1係以下列之結構式或序列式表示。
上述式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合， L(PEG)表示＊-(CH2 CH2 -O)n5 -CH2 CH2 -NH-，右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側的非還原末端之唾液酸的2位羧酸透過醯胺鍵而結合，左端之星號＊表示與前述連接子L中的Lb之1,2,3-三唑環上之1位或3位之氮原子結合，n5 為2～10之整數，較佳為2～5之整數。
N297-(Fuc)MSG2以下列之結構式或序列式表示：
上述式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合， L(PEG)表示＊-(CH2 CH2 -O)n5 -CH2 CH2 -NH-，右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-6鏈側之非還原末端的唾液酸的2位之羧酸透過醯胺鍵而結合，左端之星號＊表示與前述連接子L中的Lb之1,2,3-三唑環上之1位或3位之氮原子結合，n5 為2～10之整數，較佳為2～5之整數。
N297-(Fuc)SG以下列之結構式或序列式表示：
上述式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合， L(PEG)表示＊-(CH2 CH2 -O)n5 -CH2 CH2 -NH-，右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側及1-6鏈側的兩者之非還原末端之唾液酸之2位的羧酸透過醯胺鍵而結合，左端之星號＊表示與前述連接子L中的Lb之1,2,3-三唑環上之1位或3位之氮原子結合，n5 為2～10之整數，較佳為2～5之整數。
本發明之抗體-藥物結合物中的抗體之N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物的情形，因抗體為二聚體，抗體-藥物結合物成為2個藥物連接子(-L-D)所結合的分子(上述m1 =1)(參照圖1)。 例如，實施例27：ADC5係N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1的情形。
本發明之抗體-藥物結合物中的抗體之N297糖鏈為N297-(Fuc)SG的情形，因抗體為二聚體，抗體-藥物結合物成為4個藥物連接子(-L-D)所結合的分子(上述m1 =2)。
N297糖鏈較佳為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG，更佳為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2，最佳為N297-(Fuc)MSG1。 本發明之抗體-藥物結合物中的抗體之N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG的情形，可取得均一品質之ADC。
本發明提供包含以下i)～iii)之步驟的糖鏈重塑抗體或該抗體之功能性片段之製造方法。 i)培養上述之宿主細胞(例如，動物細胞(CHO細胞等))，自獲得的培養物採取目的之抗體的步驟； ii)將步驟i)所獲得的抗體以水解酵素處理，製造N297糖鏈為(Fucα1,6)GlcNAc的抗體((Fucα1,6)GlcNAc-抗體)的步驟(圖3A)， 較佳為進一步將該反應液藉由包含利用羥磷灰石管柱的純化的步驟而純化(Fucα1,6)GlcNAc-抗體的步驟；及 iii)於糖轉移酵素存在下，使(Fucα1,6)GlcNAc-抗體與糖鏈供予體分子反應，合成於唾液酸導入有疊氮基的糖鏈重塑抗體的步驟，該糖鏈供予體分子係於MSG(9)或SG(10)之唾液酸的2位之羧酸的羰基導入具有疊氮基的PEG連接子-(N3 -L(PEG))，且將還原末端唑啉化而得。 又，由該製造方法獲得的糖鏈重塑抗體或其功能性片段、或彼等之修飾體亦包含於本發明。
前述本抗體-藥物結合物之製造中間體具有DBCO(二苯并環辛炔)等之與疊氮基反應的炔結構(參照實施例2-1、化合物3-14)。因此，藉由使該製造中間體，與前述i)～iii)之步驟所獲得的糖鏈之唾液酸中導入具有疊氮基的PEG連接子的MSG1型、MSG2型或SG型糖鏈重塑抗體或該抗體之功能性片段反應，可製造本發明之抗體-藥物結合物。
於本發明之N297糖鏈，還原末端之岩藻醣附加的GlcNAc-(Fucα1,6)GlcNAc)係源自於動物細胞所產生的抗體，相較於此，非還原末端側之糖鏈係較佳為重塑成與上述的MSG(MSG1、MSG2)或SG同樣之糖鏈結構者。任一者皆利用與其非還原末端的唾液酸2位結合的羧酸，而與L(PEG)結合。 此種具有MSG(MSG1、MSG2)或SG型N297糖鏈的糖鏈重塑抗體，可依據例如例如WO2013/120066等記載之方法，以如圖3所示的方法製造。依據周知之方法而使用動物細胞作為宿主，使產生抗體作為基因重組蛋白質的情形(上述步驟i)，N297糖鏈雖具有岩藻醣附加的N結合型糖鏈結構作為基本結構，但可呈具有於非還原末端之結構或構成糖中具有各式各樣的修飾而成的結構的糖鏈之抗體或其片段之混合物而獲得(圖3A之IV)。以此種動物細胞所產生的抗體，藉由以EndoS等之水解酵素處理，還原末端之幾丁二糖(chitobiose)結構的GlcNAcβ1-4GlcNAc之間的醣苷鍵結被水解，獲得具有僅具有(Fucα1,6)GlcNAc作為N297糖鏈的單一糖鏈結構的抗體分子(稱為「(Fucα1,6)GlcNAc-抗體」，參照圖2之A)(圖3A)(上述步驟ii))。
就於N297糖鏈之水解反應所使用的酵素而言，可使用Endo S或保持其水解活性的變異酵素等。
將由上述之水解反應獲得的(Fucα1,6)GlcNAc-抗體作為糖鏈接受體分子，使用如EndoS D233Q或EndoS D233Q/Q303L突變體的糖轉移酵素(WO2017010559等)，藉由使與MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈供予體分子反應，可獲得具有包含上述之結構的MSG(MSG1、MSG2)或SG型N297糖鏈的抗體(參照圖2之B)(圖3B)(上述步驟iii)-1、iii)-2)。
抗體-藥物結合物中的抗體每1分子之藥物結合數m1 為1的情形，採用具有MSG(MSG1、MSG2)作為糖鏈的糖鏈供予體分子。此種糖鏈亦可採用將市售之monosialo-Asn free(1S2G/1G2S-10NC-Asn、糖鏈工學研究所(股)，以下，稱為「(MSG-)Asn」)為原料而依據實施例3記載之方法將(MSG-)Asn1或(MSG2-)Asn分離，亦可不分離而作為混合物而採用。
抗體-藥物結合物中的抗體每1分子之藥物結合數m1 為2的情形，於此糖轉移反應使用具有SG(10)作為糖鏈的糖鏈供予體分子。此種SG(10)糖鏈，例如可使用自SGP藉由水解等而取得者，亦可使用市售之如二唾液酸八糖(東京化成工業(股))的SG(10)糖鏈。
供予體分子所含的MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈係於其唾液酸之2位具有包含疊氮基的PEG連接子(N3 -L(PEG))。
供予體分子所含的MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈之還原末端的GlcNAc，係較佳使用以藉由例如2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓-氯化物處理的唑啉化之類的形式被活性化者(J.Org.Chem.,2009,74(5),2210-2212)。
就糖轉移反應所使用的酵素(糖轉移酵素)而言，若為具有使複合型糖鏈轉移至N297糖鏈的活性者即可，可採用各式各樣者，但較佳為將EndoS的第233號之Asp取代為Gln而抑制水解反應的變異體EndoS D233Q。關於使用EndoS D233Q的糖轉移反應，已記載於WO2013/120066等。又，亦可利用對於EndoS D233Q，進一步施加了變異的EndoS D233Q/Q303L之類的變異體酵素(WO2017010559)。
抗體之糖鏈重塑(糖水解、及糖鏈轉移反應)後之抗體之純化操作係以反應所使用的低分子化合物及酵素的分離為目的，於此種純化中，通常，使用膠體過濾層析、離子交換層析、親和性層析等，亦可進而進行藉由羥磷灰石管柱的追加純化。即，本發明提供一種抗體-藥物結合物之製造方法，其於自抗體之糖水解後的反應液的中間體之純化步驟，進一步包含利用羥磷灰石管柱的純化步驟。已清楚若依據糖鏈重塑報告例(JACS. 2012, 134,12308-12318.、Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367)，僅將抗體以水解酵素處理的反應液以蛋白質A管柱(親和性層析管柱)純化，但於此純化方法不能完全去除水解酵素(EndoS等)，殘留酵素會影響，而對接下來的糖轉移反應有影響。此處，研討純化法的結果，藉由將抗體以水解酵素處理的反應液以蛋白質A管柱、羥磷灰石管柱(CHT管柱、Bio-Rad Laboratories, Inc.)之順序進行純化，無殘留酵素的影響，且接下來的糖鏈轉移反應之反應效率提升。
本發明之抗體-藥物結合物最佳為選自下列群組的1個之抗體-藥物結合物。
於上述所示的各自之結構式中，m1 表示1或2之整數(較佳m1 為1之整數)， 抗體Ab為抗CLDN6抗體、抗CLDN9抗體、抗CLDN6/CLDN9抗體、抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗DLL3抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD25抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD37抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗B7-H3抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗FGFR2抗體(WO201315206等)、抗G250抗體、抗MUC1抗體(WO2011012309等)、抗GPNMB抗體、抗整合素抗體、抗PSMA抗體、抗肌腱蛋白-C抗體、抗SLC44A4抗體、抗間皮素抗體、抗EGFR抗體、抗5T4抗體、抗LRRC15抗體、抗DR5抗體、抗CDH3抗體、抗PDPN抗體、或抗CD123抗體(較佳為前述抗CLDN6抗體或抗HER2抗體， N297糖鏈表示N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物或N297-(Fuc)SG(較佳為N297-(Fuc)MSG1)之任一者， L(PEG)表示＊-(CH2 CH2 -O)3 -CH2 CH2 -NH-，右端之胺基與N297糖鏈之β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側(較佳為1-3鏈側)之非還原末端的唾液酸的2位之羧酸通過醯胺鍵而結合，左端之星號表示與前述結構式中之三唑環上的1位或3位的氮原子結合。 方便上，就上述最佳抗體-藥物結合物而言，記載有於結合物1分子中具有2或4個(m2 =1或2)「N297糖鏈與L中之Lb的三唑環上之1位氮原子結合的『-(N297糖鏈)-L-D』(『(N297糖鏈)-(N1Lb)L-D』)」的結構、或具有2或4個(m2 =1或2)「與3位之氮原子結合的『-(N297糖鏈)-L-D』(『(N297糖鏈)-(N3Lb)L-D』)」的結構，但亦包含於結合物1分子中具有『(N297糖鏈)-(N1Lb)L-D』(m2 =1的情形，1個；m2 =2的情形，1、2、3個)及『(N297糖鏈)-(N3Lb)L-D』(m2 =1的情形，1個；m2 =2的情形，3、2、1個)之兩者的抗體-藥物結合物。即，於結合物1分子中僅有『(N297糖鏈)-(N1Lb)L-D』或『(N297糖鏈)-(N3Lb)L-D』之任一者，或有該兩者混合存在。
於本發明之抗體-藥物結合物、其游離藥物或其製造中間體，亦有存在立體異構物或源自不對稱碳原子的光學異構物、幾何異構物、互變異構物或d體、l體、構型異構物等之光學異構物，但此等之異構物、光學異構物及此等之混合物之任一者亦包含於本發明中。
本發明之抗體-藥物結合物因顯示強腫瘤活性(活體內抗腫瘤活性、活體外抗細胞活性)、良好的體內動態及物性，且安全性高，而作為醫藥品是有用的。
於本發明之抗體-藥物結合物，藥物對抗體1分子的結合數為影響其有效性、安全性的重要因子。抗體-藥物結合物之製造雖規定使反應的原料・試藥的使用量等之反應條件而使藥物之結合數成為一定的數目來實施，與低分子化合物之化學反應不同，通常獲得為不同數量的藥物所結合的混合物。藥物對抗體1分子的結合數為平均值，即，可特定為平均藥物結合數(DAR:Drug to Antibody Ratio)。吡咯并苯二氮呯衍生物對抗體分子的結合數為能控制，就每1抗體之平均藥物結合數(DAR)而言，可使結合1至10之範圍的吡咯并苯二氮呯衍生物，但較佳為1至8個，更佳為1至5個。 於本發明之抗體-藥物結合物，抗體為自抗體之經重塑的糖鏈與L結合的情形，抗體-藥物結合物中的抗體每1分子的藥物結合數m2 為1或2之整數。該糖鏈為N297糖鏈，糖鏈為N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)MSG1與N297-(Fuc)MSG2之混合物的情形，m2 為1，DAR為1～3之範圍(較佳為1.0～2.5之範圍，更佳為1.2～2.2或1.6～2.2之範圍)。N297糖鏈為N297-(Fuc)SG的情形，m2 為2，DAR為3～5之範圍(較佳為3.2～4.8之範圍，更佳為3.5～4.2之範圍)。 又，若為本技術領域中具有通常知識者，則由本案之實施例之記載可設計出使結合對於抗體為必要數量的藥物的反應，且可取得控制吡咯并苯二氮呯衍生物之結合數的抗體。
又，本發明之抗體-藥物結合物、游離藥物或製造中間體有藉由放置於大氣中、或進行再結晶而吸收水分、吸附水附著、成為水合物的情形，該種包含水的化合物及鹽亦包含於本發明。
本發明之抗體-藥物結合物、游離藥物或製造中間體具有胺基等之鹼性基的情形，可根據期望而作成醫藥上可容許的鹽。就該種鹽而言，可列舉例如鹽酸鹽、氫碘酸鹽等之氫鹵酸鹽；硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等之無機酸鹽；甲烷磺酸鹽、三氟甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽等之低級烷烴磺酸鹽；苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等之芳基磺酸鹽；甲酸、乙酸、蘋果酸、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等之有機酸鹽；及鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽等之胺基酸鹽。
本發明之抗體-藥物結合物、游離藥物或製造中間體具有羧基等之酸性基的情形，一般而言可形成鹼性加成鹽。就醫藥上可容許的鹽而言，可列舉例如，鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽等之鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等之鹼土金屬鹽；銨鹽等之無機鹽；二苄基胺鹽、啉鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基還原葡糖胺(N-methylglucamine)鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、環己基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N’-二苄基乙二胺鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺鹽、哌鹽、四甲基銨鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷鹽等之有機胺鹽等。
本發明之抗體-藥物結合物、游離藥物或製造中間體亦有藉由吸收空氣中的水分等而呈水合物存在的情形。就本發明之溶劑合物而言，若為醫藥上可容許者，則未特別限定，但具體而言，較佳為水合物、乙醇合物、2-丙醇合物等。又，本發明之抗體-藥物結合物、游離藥物或製造中間體中有氮原子存在的情形，亦可形成N-氧化物體，此等溶劑合物及N-氧化物體亦包含於本發明之範圍。
又，於本發明亦包含以各種之放射性或非放射性同位素標識的化合物。構成本發明之抗體-藥物結合物、游離藥物或製造中間體的原子之1以上，亦可含有原子同位素之非天然比率。就原子同位素而言，可列舉例如，氘(2 H)、氚(3 H)、碘-125(125 I)或碳-14(14 C)等。又，本發明化合物可經例如，氚(3 H)、碘-125(125 I)或碳-14(14 C)之類的放射性同位素進行放射性標識。經放射性標識的化合物有用於作為治療或預防劑、研究試藥，例如，試驗試藥、及診斷劑，例如，活體內影像診斷劑。本發明之抗體-藥物結合物之全部的同位素變異種不論是否為放射性，皆包含於本發明之範圍。 [製造方法]
R法：抗體之調製 糖鏈重塑抗體，可依據例如WO2013/120066等記載之方法，以如圖3所示的方法製造。
R-1步驟     還原末端之幾丁二糖結構的GlcNAcβ1-4GlcNAc間之醣苷鍵結的水解 本步驟係對於目的之抗體，使用周知之酵素反應而切斷與抗體的胺基酸序列第297號之天門冬醯胺結合之N結合型糖鏈(N297結合糖鏈)，調製糖鏈切斷抗體之步驟。 將目的之抗體(20mg/ml)於緩衝溶液(50mM磷酸緩衝溶液等)中，於0℃至40℃為止，使用EndoS酶等水解酵素而實施還原末端之幾丁二糖結構之GlcNAcβ1與4GlcNAc之間的醣苷鍵結的水解反應。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為1小時至6小時。野生型EndoS酶係相對於抗體100mg使用0.1至10mg，較佳為使用0.1至3mg。可在反應結束後，實施後述之親和性層析純化及/或羥磷灰石管柱純化，以製造GlcNAcβ1與4GlcNAc之間的糖鏈被水解的(Fucα1,6)GlcNAc-抗體。
R-2步驟     糖鏈轉移反應 本步驟係對於上述之(Fucα1,6)GlcNAc-抗體，使用酵素反應而使具有含疊氮基的PEG連接子的MSG(MSG1、MSG2)或SG型糖鏈唑啉體(以下，「疊氮化糖鏈唑啉體」)結合，製造糖鏈重塑抗體的步驟。 藉由使上述之糖鏈切斷抗體於緩衝溶液(磷酸緩衝溶液等)中，於0℃至40℃為止，於觸媒量之EndoS(D233Q/Q303L)等之糖轉移酵素存在下，與疊氮化糖鏈唑啉體反應，而實施糖鏈轉移反應。反應時間為10分鐘至72小時，較佳為1小時至6小時。EndoS酶(D233Q/Q303L)係相對於抗體100mg使用1至10mg，較佳為使用1至3mg，疊氮化糖鏈唑啉體使用2至過剩當量，較佳為使用2至20當量。 反應結束後，可藉由實施親和性層析純化與羥磷灰石管柱純化而獲得純化的糖鏈重塑抗體。 疊氮化糖鏈唑啉體係可按照實施例3～5記載之方法而調製。於MSG(MSG1、MSG2)或二唾液酸八糖(東京化成工業(股))，利用有機合成科學領域中周知之反應(縮合反應等)，導入為含有疊氮基的PEG連接子(N3 -L(PEG))的N3 -(CH2 CH2 -O)n5 -CH2 CH2 -NH2 。即，向唾液酸2位之羧酸與N3 -(CH2 CH2 -O)n5 -CH2 CH2 -NH2 之右末端的胺基藉由周知之縮合反應而形成醯胺鍵。 又，MSG、MSG1或MSG2可藉由將前述(MSG-)Asn或分離純化的(MSG1-)Asn或(MSG2-)Asn(實施例56)，以EndoM等之水解酵素進行水解而獲得。
於上述之糖鏈重塑抗體之調製，抗體水溶液的濃縮、濃度測定、緩衝液交換可按照以下之共通操作A至C來進行。 (共通操作A：抗體水溶液之濃縮) 於Amicon Ultra(30,000至50,000MWCO,Millipore Co.)之容器內置入抗體或抗體-藥物結合物溶液，以使用離心機(Allegra X-15R,Beckman Coulter,Inc.)的離心操作(以2000G至4000G離心5至20分鐘)，濃縮抗體及後述的抗體-藥物結合物溶液。 (共通操作B：抗體之濃度測定) 使用UV測定器(Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.)，按照製造商規定的方法，進行抗體濃度之測定。於該時，對各抗體使用不同的280nm吸光係數(1.3mLmg-1 cm-1 至1.8mLmg-1 cm-1 )。 (共通操作C：抗體之緩衝液交換) 抗體水溶液係添加緩衝溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)、磷酸緩衝液(pH6.0)等)並使用共通操作A而濃縮。進行數次此操作後，使用共通操作B而進行抗體濃度之測定，使用緩衝溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)、磷酸緩衝液(pH6.0)等)而調整抗體濃度為10mg/mL。
S法：結合(conjugation) 本製造法係藉由SPAAC反應(strain-promoted alkyne azide cycloaddition: JACS. 2004, 126,15046-15047)使上述之糖鏈重塑抗體與製造中間體(2)結合，而製造抗體-藥物結合物的方法。
式中Ab表示糖鏈重塑抗體， La’、Lp’、B’係與La、Lp、B同意義， J表示以下所示的任一者之結構式， 式中，星號表示與La’結合。
J-La’-Lp’-NH-B’-CH2 -O(C=O)-PBD可藉由實施例2-1～2-6記載之方法等而合成。
藉由使抗體Ab之緩衝溶液(乙酸鈉溶液、磷酸鈉、硼酸鈉溶液等或彼等之混合物)、與化合物(2)溶解於適當溶媒(二甲基亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、N-甲基-2-吡啶酮(NMP)、丙二醇(PG)等或彼等之混合物)的溶液混合，SPAAC反應進行。 相對於抗體1莫耳，化合物(2)為2莫耳至過量莫耳，較佳為1莫耳至30莫耳，有機溶媒之比率較佳為相對於抗體之緩衝液為1至200%v/v。反應溫度為0℃至37℃，較佳為10℃至25℃，反應時間為1至150小時，較佳為6小時至100小時。反應時之pH較佳為5至9。
抗體-藥物結合物可藉由前述之共通操作A至C及後述之共通操作D至F進行緩衝液交換、純化、抗體濃度、及抗體每一分子的藥物平均結合數的測定，並進行抗體-藥物結合物(ADC)之鑑定。
共通操作D：抗體-藥物結合物之純化 以市售之含有山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10mM，pH5.5；於本說明書中稱為ABS)使NAP-25管柱平衡化。於此NAP-25管柱中裝入抗體-藥物結合物反應水溶液(約1.5～2.5mL)，藉由以製造商規定的量之緩衝液使溶出，分取抗體劃份。再次將此分取劃份置於NAP-25管柱，藉由重複共計2至3次以緩衝液使溶出的凝膠過濾純化操作，獲得去除未結合之藥物連接子或二甲基亞碸、丙二醇的抗體-藥物結合物。因應需要，藉由共通操作A及C而調製抗體-藥物結合物溶液之濃度。 共通操作E：抗體-藥物結合物的抗體濃度之測定 抗體-藥物結合物中的結合藥物濃度可使用下述所示的朗伯-比爾定律(Lambert-Beer law)而算出。 以下呈示使用了朗伯-比爾定律的式(I)。
此處，A280表示抗體-藥物結合物水溶液之280nm中的吸光度，ε280表示抗體-藥物結合物之280nm中的莫耳吸光係數，C(mol･L-1 )表示抗體-藥物結合物的莫耳濃度。 由上述式(I)，抗體-藥物結合物的莫耳濃度C(mol･L-1 )係以下列式(II)求得。
可進而於兩邊乘上抗體-藥物結合物的莫耳質量MW(g･mol-1 )，以求出抗體-藥物結合物的重量濃度C’(mg･mL-1 )(式(III))。
於以下，記載有關用於上述式而適用本實施例的各值。 吸光度A280係使用了抗體-藥物結合物水溶液之280nm中的UV吸光度的實測值。莫耳質量MW(g･mol-1 )係使用由抗體的胺基酸序列所求得之抗體分子量的計算推定值作為抗體-藥物結合物之莫耳質量的近似值。光徑長度l(cm)係以1cm進行測定。 抗體藥物結合物之莫耳吸光係數ε280可藉由以下之式(IV)而求得。
此處，εAb ， 280 表示280nm中的抗體之莫耳吸光係數，εDL ， 280 表示280nm中的藥物之莫耳吸光係數。 εAb ， 280 係可從抗體的胺基酸序列藉由已知的計算方法(Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423)而推定。於實施例，曲妥珠單抗之莫耳吸光係數使用εAb ， 280 =215400(計算推定值)。CLDN6抗體之莫耳吸光係數使用εAb ， 280 =221340(計算推定值)，TROP2抗體之莫耳吸光係數使用εAb ， 280 =226400(計算推定值)，CD98抗體之莫耳吸光係數使用εAb ， 280 =240400(計算推定值)，LPS抗體之莫耳吸光係數使用εAb ， 280 =230300(計算推定值)，曲妥珠單抗突變體之莫耳吸光係數使用εAb ， 280 =215057(計算推定值)。 εDL ， 280 使用了自每次以UV測定所得之實測值所算出者。即，使用：測定結合物前驅體(藥物)溶解為某莫耳濃度的溶液之吸光度，而應用朗伯-比爾定律、式(I)而獲得的值。
(共通操作F：抗體-藥物結合物中的抗體每一分子的藥物平均結合數之測定) 抗體-藥物結合物中的抗體每一分子之藥物平均結合數可藉由使用以下之方法的高速液體層析(HPLC)分析而求得。 [F-1.HPLC分析用樣品之調製(抗體-藥物結合物之還原)] 將抗體-藥物結合物溶液(約1mg/mL、60μL)與二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100mM、15μL)混合。藉由將混合物於37℃溫育30分鐘而切斷抗體-藥物結合物之L鏈及H鏈間的雙硫鍵的樣品，用於HPLC分析。
[F-2.HPLC分析] 以下述之測定條件進行HPLC分析。 HPLC系統：Agilent 1290  HPLC系統(Agilent Technologies) 檢測器：紫外吸光度計(測定波長：280nm、329nm) 管柱：BEH Phenyl(2.1×50mm、1.7μm、Waters Acquity) 管柱溫度：75℃ 移動相A：0.1%三氟乙酸(TFA)，15%異丙醇水溶液 移動相B：0.075%TFA、15%異丙醇乙腈溶液 梯度程式：14%-36%(0分鐘-15分鐘)、36%-80%(15-17分鐘)、80%-14%(17分鐘-17.1分鐘)、14%-14%(17.1分鐘-23分鐘) 樣品注入量：5μL
[F-3.資料解析] 〔F-3-1〕相對於未結合藥物的抗體之H鏈(H0 )，有結合藥物的H鏈(有一個藥物結合的H鏈：H1 、有二個藥物結合的H鏈：H2 )由於隨所結合之藥物之數目而疏水性比例增加，而滯留時間變大，因此以L0 、H0 、H1 、H2 的順序被溶出。可藉由L0 及H0 的滯留時間比較而將檢測波峰分配為L0 、H0 、H1 、H2 之任一者。又藥物之結合，於藥物之特徵的329nm的波長吸收亦可確認。 〔F-3-2〕因於藥物連接子會有UV吸收，所以因應藥物連接子的結合數，而使用L鏈、H鏈及藥物連接子之莫耳吸光係數，按照下式而進行波峰面積值的校正。
此處，各抗體中的L鏈及H鏈之莫耳吸光係數(280nm)可使用藉由已知計算方法(Protein Science, 1995, vol.4, 2411-2423)而自各抗體之L鏈及H鏈之胺基酸序列所推定的值。曲妥珠單抗的情形，按照其胺基酸序列，作為H鏈的莫耳吸光係數，使用81290作為推定值。同樣地，CLDN6抗體的情形，作為H鏈的莫耳吸光係數，使用77280，TROP2抗體的情形，作為H鏈的莫耳吸光係數，使用68990，CD98抗體的情形，作為H鏈的莫耳吸光係數，使用78500，LPS抗體的情形，作為H鏈的莫耳吸光係數，使用77470，曲妥珠單抗突變體的情形，作為H鏈的莫耳吸光係數，使用81488，藥物連接子之莫耳吸光係數(280nm)係使用為結合物前驅物的化合物(1)之實測的莫耳吸光係數(280nm)。 〔F-3-3〕按照下式計算相對於波峰面積校正值合計的各鏈波峰面積比(%)。
〔F-3-4〕按照下式計算抗體-藥物結合物中抗體每一分子的藥物平均結合數。
藥物平均結合數=(H0 波峰面積比×0+H1 波峰面積比×1+H2 波峰面積比×2)/100×2
＜醫藥＞ 本發明之抗體-藥物結合物因對癌細胞顯示細胞毒殺活性，而可使用作為醫藥，尤其可使用作為對癌症的治療劑及/或預防劑。
就本發明之抗CLDN6抗體-藥物結合物所適用的癌症種類而言，可列舉肺癌(非小細胞肺癌、小細胞肺癌等)、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌(表層上皮性腫瘤、間質性腫瘤、生殖細胞腫瘤等)、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、子宮體癌、睪丸癌(精原細胞瘤、非精原細胞瘤)、子宮頸癌、胎盤絨毛癌、腦腫瘤、頭頸部癌及彼等之轉移性形態等，就抗HER2抗體-藥物結合物所適用的癌症種類而言，可列舉肺癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、膀胱癌、胃癌、胃腸間質腫瘤、子宮頸癌、食道癌、扁平上皮癌、腹膜癌、肝臟癌、肝細胞癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、子宮癌、唾液腺癌、腎臟癌、外陰部癌、甲狀腺癌、或陰莖癌及彼等之轉移性形態等，但若為於成為治療對象的癌細胞中表現抗體-藥物結合物中的抗體可辨識的蛋白質的癌細胞，則未限定於此等。
本發明之抗體-藥物結合物可適合對哺乳動物投予，更佳為人類。
就於包含了本發明之抗體-藥物結合物的醫藥組成物中所使用的物質而言，於投予量或投予濃度，可自於此領域通常使用的其它製劑添加物而適當選擇應用。
本發明之抗體-藥物結合物，可作為含有1種以上之藥學上適合性的成分的藥學的組成物而被投予。例如，上述藥學的組成物係代表性地包含1種以上之藥學的載劑(例如，已滅菌的液體(例如，水及油(包含石油、動物、植物、或合成起源之油(例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等)))。於上述藥學的組成物被靜脈內投予的情形，水為更代表性的載劑。食鹽水溶液、以及右旋糖水溶液及甘油水溶液亦可作為液體載劑，尤其可被使用於注射用溶液。適當的藥學的賦形劑為於該領域周知。又，若需要，上述組成物可包含微量之濕潤劑或乳化劑、或pH緩衝化劑。適當的藥學的載劑之例記載於E.W.Martin的「Remington’s Pharmaceutical Sciences」。其處方對應於投予的態樣。
多種送達系統為周知，可使用於用以投予本發明之抗體-藥物結合物。就導入方法而言，可列舉皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、及皮下的路徑，但未限定於此等。投予，可為藉由例如，注入或團式注射(bolus injection)。於特定之較佳實施形態，上述配位體藥物結合體之投予為藉由注入者。非經口的投予為較佳的投予路徑。
於代表性實施形態中，上述藥學的組成物係作為適合於對人類的靜脈內投予之藥學的組成物，而按照慣用順序被調配。代表性地，用於靜脈內投予的組成物為滅菌之等張性的水性緩衝液中之溶液。必要的情形，上述又可包含助溶劑及用以緩和注射部位的疼痛的局部麻醉劑(例如，利卡多因(lignocaine))。一般而言，上述成分係(例如作為密封於顯示活性劑之量的安瓿或小袋(sachet)等而經封口之容器中的乾燥冷凍乾燥粉末或無水的濃縮物，而以各別地、或在單位劑型中一起混合的任一者而供給。上述醫藥預定藉由注入來投予之情形，其係例如可以包含滅菌之製藥等級的水或食鹽水的注入瓶而投藥。上述醫藥藉由注射被投予之情形，注射用滅菌水或食鹽水的安瓿，例如可以上述成分可在投予前被混合的方式提供。
本發明之醫藥組成物可為僅含本發明之抗體-藥物結合物的醫藥組成物，亦可為包含抗體-藥物結合物及至少一種其以外之癌症治療劑的醫藥組成物。本發明之抗體-藥物結合物亦可與其它之癌症治療劑一起投予，可藉此而增強抗癌效果。以此種目的所使用的其它抗癌劑，可與抗體-藥物結合物同時地、分別地、或者連續地對個體投予，亦可改變各自之投予間隔而投予。作為此種癌症治療劑，可列舉亞伯杉(abraxane)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、愛伊立替康(irinotecan)(CPT-11)、紫杉醇(paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、索拉非尼(sorafenib)、長春花鹼(vinblastin)或WO2003/038043號小冊記載之藥劑，又可列舉LH-RH類似物(亮丙瑞林(leuprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)等)、雌莫司汀磷酸鹽(Estramustine Phosphate )、雌激素拮抗藥(泰莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)等)、芳香酶阻礙劑(阿那曲唑(anastrozole)、利妥唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)等)等，但若為具有抗腫瘤活性的藥劑，則未被限定。
此種醫藥組成物，作為具有所選擇的組成及必要純度的製劑，只要製劑化為冷凍乾燥製劑或液狀製劑即可。於製劑化為冷凍乾燥製劑之際，可為包含此領域使用的適當製劑添加物的製劑。又於液劑亦同樣地，可製劑化為包含此領域使用的各種之製劑添加物的液狀製劑。
醫藥組成物之組成及濃度亦依投予方法而變化，但本發明之醫藥組成物中所含的抗體-藥物結合物，於抗體-藥物結合物之對抗原的親和性，即，對抗原的解離常數(Kd值)之點，親和性越高(Kd值低)，越可即使以少量的投予量亦可藥效發揮。據此，於抗體-藥物結合物之投予量的決定時，亦可基於抗體-藥物結合物與抗原的親和性的狀況而設定投予量。於對人類投予本發明之抗體-藥物結合物之際，例如，只要將約0.001～100mg/kg以1次或於1～180日間1次的間隔複數次投予即可。
又，本發明之抗體或該抗體之功能性片段亦可使用作為醫藥。此情形，關於上述之＜醫藥＞的「抗體-藥物結合物」的記載，可適當地替換成關於「抗體或該抗體之功能性片段」的記載的描述。
再者，本發明之游離藥物(新穎PBD衍生物化合物)、其鹽、或彼等之水合物亦可使用作為醫藥。此情形，關於上述之＜醫藥＞的「抗體-藥物結合物」的記載，可適當地替換成關於「游離藥物(新穎PBD衍生物化合物)、其鹽、或彼等之水合物」的記載的描述。 [實施例]
藉由以下所示的實施例而具體地說明本發明，但本發明並未限定於此等例。又，此等於任何意義上皆非被限定地解釋。又，於本說明書，未特別記載的試藥、溶媒及起始材料為可自市售之供給源容易取得。
參考例1：曲妥珠單抗Tesirine 步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於曲妥珠單抗(參考例3)之5mM四乙酸乙二胺-磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.5)溶液(9.91mg/mL, 0.70mL)中，於20℃添加磷酸二鉀水溶液(1.0M, 0.0112mL)、參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽水溶液(10mM， 0.0086mL)，並於20℃60分鐘、於室溫30分鐘使反應。於反應溶液中添加參考文獻(Med.Chem.Lett.2016，7，983-987)而合成的Tesirine (0.36mg)之二甲基乙醯胺溶液(0.0415mL)，並使於室溫反應1小時。於反應溶液中添加N-乙醯基半胱胺酸水溶液(100mM、0.0024mL)，使反應30分鐘而停止反應。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液3.5mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.40mg/mL，抗體產量：4.90mg(71%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：2.0
參考例2：抗CLDN6(H1L1)抗體Tesirine 步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於抗CLDN6(H1L1)抗體之5mM四乙酸乙二胺-磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.5)溶液(9.87mg/mL，0.45mL)中，於20℃添加磷酸二鉀水溶液(1.0M, 0.0072mL)、參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽水溶液(10mM, 0.0041mL)，於20℃使反應90分鐘。於反應溶液中添加參考文獻(Med.Chem. Lett.2016,7,983-987)而合成的Tesirine(0.15mg)之N、N-二甲基乙醯胺溶液(0.0277mL)，於20度使反應1小時。於反應溶液中添加N-乙醯基半胱胺酸水溶液(100mM、 0.001mL)，使反應30分鐘而停止反應。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液3.5mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.56mg/mL，抗體產量：3.90mg(88%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：2.1
參考例3：抗HER2抗體曲妥珠單抗 抗HER2抗體係參考US5821337而製作。將曲妥珠單抗之輕鏈及重鏈之胺基酸序列示於序列識別號64及序列識別號65。
參考例4：抗LPS抗體h＃1G5-H1L1 抗LPS抗體係參照WO2015/046505而製作。將h＃1G5-H1L1之輕鏈及重鏈之胺基酸序列示於序列識別號66及序列識別號67。
參考例5：抗TROP2抗體hRS7 抗TROP2抗體係參照WO2003/074566、WO2015/098099(參考例1)而製作。將hRS7之輕鏈及重鏈之胺基酸序列示於序列識別號68及序列識別號69。
參考例6：抗CD98抗體hM23-H1L1 抗CD98抗體係參照WO2015/146132而製作。將hM23-H1L1之輕鏈及重鏈之胺基酸序列示於序列識別號70及序列識別號71。
〔製造中間體(藥物連接子)之合成〕 實施例1 [實施例1-1：中間體1]
步驟1：(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸苄酯(1-2) 於5-苄基6-甲基(6S)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5,6-二甲酸酯(1-1)(104mmol，WO2012087596)之四氫呋喃(500mL)溶液中，於0℃一點一點地添加硼氫化鋰(4.30g，178mmol)。於0℃攪拌30分鐘後，於室溫攪拌2小時。於0℃添加水(180mL)、2N鹽酸(186mL)，進行減壓餾除。獲得的殘渣以乙酸乙酯萃取4次，有機層以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉乾燥。進行減壓餾除，將獲得的殘渣(1-2)(27.9g，90%)直接用於下一反應。
步驟2：(6S)-6-({[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5-甲酸苄酯(1-3) 於上述步驟1所獲得的化合物(1-2)(27.9g，107mmol)與咪唑(14.5g，214mmol)之二氯甲烷(300mL)溶液中，於室溫添加三級丁基二甲基氯矽烷(24.2g，160mmol)，於室溫攪拌18小時。將反應溶液以飽和檸檬酸水溶液、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥後，進行減壓餾除。將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)～50：50(v/v)]純化，獲得目的物(1-3)(32.5g，81%)。 1H-NMR(CDCl3)δ:7.39-7.34(5H,m),5.23-5.11 (2H,m),4.10-3.48(4H,m), 3.16-3.14(1H,m),2.15-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m), 0.91-0.88(9H,m),0.65-0.55(4H,m),0.08-0.01(6H,m). MS (APCI)m/z:376(M+H)+
步驟3：(6S)-6-({[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚烷(1-4) 於上述步驟2所獲得的化合物(1-3)(32.5g，86.5mmol)之乙醇(400mL)溶液中，於室溫添加7.5%鈀碳觸媒(54%水分、5.00g)，並於室溫、氫氣環境下攪拌6小時。將反應溶液進行矽藻土過濾，減壓餾除濾液，獲得目的物(1-4)(21.3g，定量的)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:3.79-3.77(1H,m),3.71-3.69(1H,m), 3.65-3.60(1H,m),3.01-2.98(2H,m),1.81-1.71(2H,m),0.90 (9H,s),0.65-0.57(4H,m),0.08(3H,s),0.07(3H,s). MS(APCI、ESI)m/z:242(M+H)+
步驟4：[(6S)-6-({[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基](5-甲氧基-2-硝基-4-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}苯基)甲酮(1-5) 於5-甲氧基-2-硝基-4-{三(丙烷-2-基)矽基]氧基}苯甲酸(52.2g，141mmol，US20150283262)與1-羥基苯并三唑一水合物(23.8g，155mmol)之二氯甲烷(500mL)溶液中，於冰冷卻下添加N,N’-二環己碳二亞胺(35.0g，170mmol)。於室溫攪拌反應混合物。羧酸消失後，於-60℃緩緩滴加於上述步驟3所獲得的化合物(1-4)(34.1g，141mmol)與三乙基胺(29.4mL，212mmol)之二氯甲烷(100mL)溶液。將反應溶液於室溫攪拌一晚後，於反應混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液，將反應混合物以氯仿萃取。將有機層以水及飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鎂乾燥。於減壓餾除而獲得的殘渣中添加乙酸乙酯與二乙基醚，藉由過濾移除固體成分，減壓餾除濾液，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)～25：75(v/v)]純化，獲得目的物(1-5)(55.0g，66%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.72-7.66(1H,m),6.80-6.73(1H,m), 4.53-4.49(1H,m),4.04-3.95(1H,m),3.91-3.88(3H,m),3.59-3.54(1H,m),3.36-3.25(0.5H,m),3.01-2.96(1.5H,m),2.24-2.20(0.3H,m),2.09-2.05(0.7H,m),2.00-1.97(0.7H,m), 1.69-1.67(0.3H,m),1.32-1.24(3H,m),1.12-1.05(18H,m), 0.93-0.91(6H,m),0.79-0.77(3H,m),0.71-0.62(2H,m),0.57-0.40(2H,m),0.12-0.10(4H,m),0.11-0.15(2H,m). MS(APCI、ESI)m/z:593(M+H)+
步驟5：(2-胺基-5-甲氧基-4-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}苯基)[(6S)-6-({[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基]甲酮(1-6) 於上述步驟4所獲得的化合物(1-5)(55.0g，92.8mmol)之乙醇(300mL)溶液中，於氮氣環境下，添加7.5%鈀碳(10.0g)。立即將氮氣球更換為氫氣球，氫氣環境下，於室溫激烈攪拌反應混合物。原料消失後，過濾反應混合物，減壓餾除濾液，將獲得之目的物(1-6)(52.2g，100%)直接用於下一反應。 1H-NMR(CDCl3 )δ:6.71(1H,s),6.25(1H,s),4.55-4.28 (2H,m),3.97(1H,m),3.75-3.62(3H,m),3.70(3H,s),3.09-3.07(1H,m),2.24-2.19(1H,m),1.81-1.68(1H,m),1.27-1.22 (3H,m),1.09-1.05(18H,m),0.90(9H,s),0.65-0.46(4H,m), 0.07-0.03(6H,m). MS(APCI、ESI)m/z:563(M+H)+
步驟6：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(1-7) 於上述步驟5所獲得的化合物(1-6)(18.6g，33.0mmol)及三乙基胺(6.26mL，45.2mmol)之THF(300mL)溶液中，於乙醇-冰浴上，緩緩添加三光氣(4.22g，14.2mmol)。添加後，對經冰冷的反應混合物，緩緩滴加N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(11.4g，30.2mmol，WO2011130598)與三乙基胺(6.26mL，45.2mmol)之四氫呋喃(100mL)、N,N-二甲基甲醯胺(30mL)混合溶液。滴加後，移開冰浴，於氮氣體環境下，於40℃攪拌反應混合物。原料消失後，於反應混合物中添加水，將反應混合物以乙酸乙酯萃取。有機層以飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。過濾後，將進行減壓餾除而獲得的殘渣，以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)～40：60(v/v)]純化，獲得目的物(1-7)(23.5g，74%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:8.99(1H,m),8.58(1H,s),7.80 (1H,s),7.55-7.53(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.77-6.75 (2H,m),5.94-5.87(1H,m),5.40-5.38(1H,m),5.33-5.29 (1H,m),5.23-5.21(1H,m),5.13(1H,m),5.10(2H,m),4.69-4.64(1H,m),4.62-4.52(2H,m),4.06-4.03(1H,m),3.98 (1H,m),3.76-3.65(6H,m),3.04(1H,m),2.28-2.26 (1H,m),2.18-2.13(1H,m),1.46(3H,m),1.32-1.25(3H,m), 1.11-1.09(18H,m),0.99-0.84(15H,m),0.65-0.40(4H,m), 0.08-0.00(6H,m). MS(APCI、ESI)m/z:966(M+H)+
步驟7：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(1-8) 於上述步驟6所獲得的化合物(1-7)(23.5g，24.3mmol)之四氫呋喃(50mL)、甲醇(50mL)、水(44mL)溶液中，室溫下添加乙酸(200mL)。於室溫攪拌反應混合物。原料消失後，將反應混合物以乙酸乙酯萃取。將有機層以水及飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。過濾後，將進行減壓餾除而獲得的殘渣，以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)～0：100(v/v)]純化，獲得目的物(1-8)(18.0g，87%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:8.64-8.62(1H,m),8.50(1H,m),7.69 (1H,m),7.55-7.53(2H,m),7.34-7.32(2H,m),6.79-6.75(3H,m),5.91-5.89(1H,m),5.39(1H,m),5.32-5.29(1H,m),5.23-5.21(1H,m),4.68-4.54(4H,m),4.31 (1H,m),4.06-4.04(1H,m),3.81-3.79(3H,m),3.76(3H,s), 3.63-3.61(1H,m),3.13-3.11(1H,m),2.16-2.13(1H,m),1.87-1.81(2H,m),1.46-1.43(3H,m),1.30-1.24(3H,m),1.12-1.08(18H,m),0.98-0.91(6H,m),0.63-0.45(4H,m). MS(APCI、ESI)m/z:852(M+H)+
步驟8：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-5’-側氧基-8’-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(1-9) 於二甲基亞碸(3.75mL，52.8mmol)之二氯甲烷(300mL)溶液中，氮氣環境下，於-78℃，緩緩滴加草醯氯(2.17mL，25.3mmol)。滴加後，於-78℃攪拌反應混合物。於反應混合物中，緩緩滴加上述步驟7所獲得的化合物(1-8)(18.0g，21.1mmol)之二氯甲烷(50.0mL)溶液。於反應溶液中，於-78℃，添加三乙基胺(14.6mL，105mmol)。添加後，移開冷媒浴，緩緩地升溫至室溫為止。原料消失後，於反應混合物中添加水，反應混合物以氯仿(200mL)萃取。將有機層以水及飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鎂乾燥。過濾後，將進行減壓餾除而獲得的殘渣，以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)～0：60(v/v)]純化，獲得目的物(1-9)(16.5g，92%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:8.51-8.36(1H,m),7.54-7.38 (2H,m),7.22-7.07(3H,m),6.73-6.64(1H,m),5.94-5.87 (2H,m),5.33-5.22(3H,m),5.09(1H,m),4.97(1H,m),4.64-4.58(4H,m),4.02-4.00(1H,m),3.86-3.83(3H,m),3.75-3.70(1H,m),3.61-3.54(2H,m),3.38-3.29(1H,m),2.40 (1H,m),2.16-2.14(1H,m),1.74-1.71(1H,m),1.44(3H,m), 1.18-1.16(3H,m),1.05-1.00(18H,m),0.97-0.92(6H,m), 0.72-0.60(4H,m). MS(APCI、ESI)m/z:850(M+H)+
步驟9：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-7’-甲氧基-5’-側氧基-8’-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(1-10) 於上述步驟8所獲得的化合物(1-9)(12.0g，14.1mmol)及2,6-二甲吡啶(6.58mL，56.5mmol)之二氯甲烷(200mL)溶液中，氮氣環境下，於0℃，緩緩滴加三氟甲基磺酸三級丁基二甲基矽烷(9.73mL，42.3mmol)。冰冷卻下，攪拌10分鐘後，移開冰浴，於室溫攪拌。原料消失後，於反應混合物中添加水，將反應混合物以氯仿萃取，以水及飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。過濾後，將進行減壓餾除而獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)～25：75(v/v)]純化，獲得目的物(1-10)(8.12g，60%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:8.67-8.45(1H,m),7.50-7.44(2H,m), 7.19(1H,s),7.13(2H,m),6.95(2H,m),6.62-6.57(2H,m), 6.01(1H,m),5.95-5.86(1H,m),5.33-5.13(3H,m), 4.82(1H,m),4.65-4.54(3H,m),4.03-4.01(1H,m),3.84-3.82(3H,m),3.73-3.66(1H,m),3.50-3.48(1H,m),3.27 (1H,m),2.37-2.33(1H,m),2.19-2.13(1H,m),1.54-1.43(3H,m),1.22-1.13(3H,m),1.10-1.00(18H,m),0.97-0.91(6H,m),0.81(9H,s),0.76-0.59(4H,m),0.19-0.09(6H,m). MS(APCI、ESI)m/z:964(M+H)+
步驟10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-8’-羥基-7’-甲氧基-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(1-11) 於上述步驟9所獲得的化合物(1-10)(8.12g，8.42mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(90mL)、水(2mL)溶液中，添加乙酸鋰(0.611g，9.26mmol)，並於室溫下攪拌。原料消失後，於反應混合物中添加水，將反應混合物以乙酸乙酯萃取。將有機層以水及飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。過濾後，將進行減壓餾除而獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)～0：100(v/v)]純化，獲得目的物(1-11)(5.48g，81%)。1 H-NMR(400MHz,CDCl3, 20.9℃)δ:8.76-8.60(1H,m), 7.45-7.44(2H,m),7.21(1H,s),7.10-7.09(2H,m),6.81-6.74(1H,m),6.65(1H,s),6.23(1H,s),6.01-5.99(1H,m),5.95-5.84(1H,m),5.41-5.20(2H,m),5.16(1H,m),4.84 (1H,m),4.67-4.54(4H,m),4.05-4.03(1H,m),3.87(3H,s), 3.71(1H,m),3.55-3.51(1H,m),3.26(1H,m),2.35(1H,m), 2.18-2.12(1H,m),1.55-1.42(4H,m),0.97-0.92(6H,m), 0.81(9H,s),0.76-0.61(4H,m),0.20-0.06(6H,m) MS(APCI、ESI)m/z:808(M+H)+
1 H-NMR(500MHz,CDCl3, 27℃)δ:8.76(1H,s), 7.43(2H,brd),7.20(1H,s),7.08(2H,d,J=8.3Hz),7.00(1H,br),6.66(1H,s),6.44(1H,s),6.00(1H,H-11’,d,J11’,11’a= 9.2Hz),5.89(1H,m),5.53(1H,brd),5.30(1H,d,J=17.2Hz),5.20(1H,d,J=10.3Hz),5.15(1H,d,JABq=12.5Hz),4.85(1H,d,JABq=12.5Hz),4.66(1H,m),4.60-4.52(2H,m),4.07(1H,m), 3.84(3H,s),3.71(1H,H-3’β,d,Jgem=11.7Hz),3.53(1H,H-11’a,m),3.26(1H,H-3’α,d,Jgem=11.7Hz),2.35(1H,H-1’β,dd,J1’β,11’a=8.30Hz,Jgem=13.1Hz),2.14(1H,m),1.54(1H,H-1’α,d,Jgem=13.1Hz),1.41(3H,d,J=6.90Hz),0.95 (3H,d,J=6.80Hz),0.92(3H,d,J=6.80Hz),0.81(9H,s),0.80-0.70 (1H,m),0.70-0.59(3H,m),0.2-0.06(6H,m)
對於化合物(1-11)，由選擇性 1D ROESY光譜所獲得的關聯(下圖)，進行11’位的絕對構型之解析。1’α-H與11’-H、 3’α-H與11’-H、及1’β-H與3’ β-H間被認為有關連，因而得知11’位之絕對構型為S配置。
因此，得知化合物(1-11)、具有與其相同的絕對立體配置的化合物(1-9)及化合物(1-10)、使用化合物(1-11)而合成的化合物(3-11)、化合物(3-12)、化合物(3-13)及藥物連接子1(化合物(3-14))、化合物(4-9)、化合物(4-10)、化合物(4-11)及藥物連接子2(化合物(4-12))、以及化合物(6-10)、化合物(6-11)、化合物(6-12)及藥物連接子4(化合物(6-13))中的11’位的絕對立體配置為S配置。又，決定以同樣的合成手法所獲得的化合物(5-9)、化合物(5-10)及藥物連接子3(化合物(5-11))之11’位之絕對立體配置為S配置。
[實施例1-2：中間體2]
步驟1：N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯甘胺酸(2-2) 於甘胺醯甘胺酸(0.328g，2.49mmol)、N,N-二異丙基乙基胺(0.433mL，2.49mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(20mL)溶液中，於室溫添加1-{[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(2-1)(1.00g，2.49mmol，Click Chemistry Tools)、水(10mL)，於相同溫度下攪拌一晩。進行減壓餾除，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[氯仿～氯仿：甲醇：水=7：3：1(v/v/v)之分配有機層]純化，獲得目的物(0.930g，89%)。 1H-NMR(DMSO-D6)δ:12.58(1H,s),8.14-8.12(1H,m), 8.08-8.07(1H,m),7.69-7.68(1H,m),7.62-7.61(1H,m),7.53 -7.45(3H,m),7.40-7.29(3H,m),5.05-5.01(1H,m),3.73-3.72 (2H,m),3.66-3.60(3H,m),2.66-2.60(1H,m),2.33-2.24 (1H,m),2.08-2.04(1H,m),1.81-1.77(1H,m). MS(APCI、ESI)m/z:420[(M+H)+].
實施例2 [實施例2-1：藥物連接子1]
步驟1：(2R,11aS)-2-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-8-羥基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(3-2) 於(2R,11aS)-8-(苄基氧基)-2-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(3-1)(25.5g，41.6mmol，WO2016149546)之四氫呋喃(150mL)、乙醇(150mL)溶液中，氮氣環境下，添加5%鈀碳(54%水分、10.0g)後，將反應溶液於氫氣環境下，於室溫攪拌三日。於反應溶液中添加氯仿，進行矽藻土過濾後，減壓餾除濾液。將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0(v/v)～50：50(v/v)]純化，獲得目的物(3-2)(19.4g，89%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),6.01(1H,s), 5.45-5.43(1H,m),4.69-4.67(1H,m),4.60-4.55(1H,m),4.23-4.21(1H,m),3.96(3H,s),3.76-3.68(2H,m),3.63-3.61 (1H,m),3.56-3.53(1H,m),2.88-2.83(1H,m),2.03-2.00 (1H,m),1.00-0.98(2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.02 (9H,s). MS(APCI、ESI)m/z:523(M+H)+
步驟2：(2R,11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-2-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基} -2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11 (10H,11aH)-二酮(3-3) 於上述步驟1所獲得的化合物(3-2)(10.8g，20.7mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(30mL)溶液中，於室溫添加1,5-二溴戊烷(23.8g，103mmol)、碳酸鉀(3.43g，24.8mmol)。於室溫攪拌3小時後，於反應溶液中添加水，以乙酸乙酯萃取。將獲得的有機層以飽和食鹽水洗淨，以硫酸鈉乾燥後，進行減壓餾除。將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)～50：50(v/v)]純化，獲得目的物(3-3)(14.5g，定量的)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.34(1H,s),7.21(1H,s),5.52-5.49 (1H,m),4.63-4.62(1H,m),4.58-4.55(1H,m),4.24-4.22 (1H,m),4.07-4.04(2H,m),3.92(3H,s),3.82-3.64(3H,m), 3.56-3.53(1H,m),3.45-3.43(2H,m),2.86-2.84(1H,m),2.04-2.00(1H,m),1.97-1.87(4H,m),1.66-1.62(2H,m),1.01-0.98 (2H,m),0.87(9H,s),0.10(6H,s),0.04(9H,s) MS(APCI、ESI)m/z:673[81Br,(M+H)+],671[79Br, (M+H)+].
步驟3：(2R,11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-2-羥基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(3-4) 於上述步驟2所獲得的化合物(3-3)(21.5mmol)之四氫呋喃(40mL)溶液中，於0℃添加1mol/L之四丁基氟化銨 四氫呋喃溶液(28.0mL，28.0mmol)。於室溫攪拌30分鐘後，於反應溶液中添加水，以乙酸乙酯萃取，獲得的有機層以飽和食鹽水洗淨。以硫酸鈉乾燥後，進行減壓餾除。將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[氯仿：甲醇=97.5：2.5(v/v)～92.5：7.5(v/v)]純化，獲得目的物(3-4)(11.3g，94%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.34(1H,s),7.21(1H,s),5.53-5.50 (1H,m),4.69-4.64(2H,m),4.32-4.30(1H,m),4.10-4.00 (2H,m),3.91(3H,s),3.88-3.75(2H,m),3.73-3.64(2H,m), 3.45-3.44(2H,m),2.99-2.96(1H,m),2.15-2.09(1H,m),1.99-1.85(5H,m),1.68-1.62(2H,m),1.01-0.95(2H,m),0.04(9H,s). MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br, (M+H)+].
步驟4：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2,5,11(3H,10H,11aH)-三酮(3-5) 使於上述步驟3所獲得的化合物(3-4)(11.3g，20.2mmol)、四丁基溴化銨(0.325g，1.01mmol)、溴化鉀(0.240g，2.02mmol，)溶解於飽和碳酸氫鈉水溶液(60mL)、二氯甲烷(60mL)，於0℃添加nor-AZADO(0.0279g，0.202mmol)、次氯酸鈉五水合物(2.03g，27.2mmol)，並於0℃攪拌30分鐘。因有原料殘存，故於0℃加入次氯酸鈉五水合物(1.00g、13.4mmol)，於0℃攪拌15分鐘。進一步於0℃添加次氯酸鈉五水合物(0.300g、4.03mmol)，於0℃攪拌15分鐘，以TLC確認原料的消失。於反應溶液中加入硫代硫酸鈉水溶液，以氯仿萃取，獲得的有機層以硫酸鈉乾燥。進行減壓餾除，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=75：25(v/v)～40：60(v/v)]純化，獲得目的物(3-5)(9.74g，87%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.33(1H,s),7.24(1H,s),5.56-5.53 (1H,m),4.71-4.69(1H,m),4.66-4.63(1H,m),4.27-4.22 (1H,m),4.12-4.02(2H,m),3.93-3.88(4H,m),3.82-3.75 (1H,m),3.69-3.67(1H,m),3.61-3.56(1H,m),3.46-3.44 (2H,m),2.82-2.77(1H,m),1.97-1.89(4H,m),1.68-1.64 (2H,m),1.05-0.93(2H,m),0.04(9H,s). MS(APCI、ESI)m/z:557[81Br,(M+H)+],555[79Br, (M+H)+].
步驟5：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2-基 三氟甲烷磺酸酯(3-6) 於上述步驟4所獲得的化合物(3-5)(9.74g，17.5mmol)之二氯甲烷(160mL)溶液中，於-40℃添加2,6-二甲吡啶(8.17mL，70.1mmol)，並於-40℃攪拌10分鐘。於反應溶液中，於-40℃添加無水三氟甲烷磺酸(8.85mL，52.6mmol)，於-40℃攪拌30分鐘。於反應溶液中添加10%檸檬酸水溶液，以氯仿萃取，將獲得的有機層以硫酸鈉乾燥。進行真空蒸餾，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=95：5→70：35]純化後，以NH2矽膠層析[己烷：乙酸乙酯=95：5(v/v)～65：35(v/v)]純化，獲得目的物(3-6)(7.10g，59%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.32(1H,s),7.24(1H,s),7.15-7.14 (1H,m),5.56-5.53(1H,m),4.70-4.68(1H,m),4.66-4.63 (1H,m),4.11-4.01(2H,m),3.94-3.90(4H,m),3.84-3.75 (1H,m),3.73-3.68(1H,m),3.46-3.44(2H,m),3.18-3.14 (1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.69-1.61(2H,m),1.02-0.92 (2H,m),0.04(9H,s). MS(APCI、ESI)m/z:689[81Br,(M+H)+],687[79Br, (M+H)+].
步驟6：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(3-7) 於上述步驟5所獲得的化合物(3-6)(2.00g，2.91mmol)、4-甲氧基苯基硼酸(0.884g，5.82mmol)、肆(三苯基膦)鈀(0)(0.336g，0.291mmol)、碳酸鈉(1.23g，11.6mmol)之混合物中，於室溫添加甲苯(20mL)、乙醇(10mL)、水(10mL)。於室溫攪拌反應溶液30分鐘後，將反應溶液以乙酸乙酯萃取，以水、飽和食鹽水洗淨。將有機層以硫酸鈉乾燥後，進行減壓餾除。將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)～50：50(v/v)]純化，獲得目的物(3-7)(1.71g，91%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.38-7.37(3H,m),7.33(1H,s),7.25 (1H,s),6.89-6.88(2H,m),5.56-5.54(1H,m),4.71-4.68 (1H,m),4.65-4.62(1H,m),4.09-4.04(2H,m),3.96-3.91 (4H,m),3.85-3.66(5H,m),3.46-3.45(2H,m),3.16-3.12 (1H,m),1.99-1.94(4H,m),1.69-1.64(2H,m),1.00-0.98(2H,m),0.04(9H,s). MS(APCI、ESI)m/z:647[81Br,(M+H)+],645[79Br, (M+H)+].
步驟7：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,11a-二氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮(3-8) 將於上述步驟6所獲得的化合物(3-7)(0.789g，1.22mmol)溶解於乙醇(10mL)、四氫呋喃(10mL)，於0℃添加2.0M之硼氫化鋰四氫呋喃溶液(6.11mL，12.2mmol)，於0℃攪拌3小時。於反應溶液中添加水，以氯仿萃取，將獲得的有機層以硫酸鈉乾燥。進行減壓餾除，將獲得的殘渣溶解於二氯甲烷(10mL)、乙醇(20mL)、水(10mL)，於室溫添加矽膠(4g)，於室溫攪拌4日。藉由過濾移除矽膠，添加水，以氯仿萃取，將獲得的有機層以硫酸鈉乾燥。進行減壓餾除，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=60：40(v/v)～25：75(v/v)]純化，獲得目的物(3-8)(0.496g，81%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.90-7.89(1H,m),7.53(1H,s),7.40-7.40(1H,m),7.35-7.34(2H,m),6.92-6.90(2H,m),6.83-6.81 (1H,m),4.43-4.40(1H,m),4.13-4.06(2H,m),3.96(3H,s), 3.84(3H,s),3.61-3.57(1H,m),3.47-3.36(3H,m),2.00-1.92 (4H,m),1.67-1.63(2H,m). MS(APCI、ESI)m/z:501[81Br,(M+H)+],499[79Br, (M+H)+].
步驟8：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,10,11,11a-四氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮(3-9) 於上述步驟7所獲得的化合物(3-8)(0.496g，0.992mmol)之二氯甲烷(20mL)溶液中，於0℃添加三乙醯氧基硼氫化鈉(0.421g，1.99mmol)。於室溫攪拌2小時後，添加飽和碳酸氫鈉水溶液，並以氯仿萃取。將有機層以硫酸鈉乾燥，進行減壓餾除後，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=60：40(v/v)～25：75(v/v)]純化，獲得目的物(3-9)(0.426g，86%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.53-7.53(2H,m),7.32-7.30(2H,m), 6.89-6.87(2H,m),6.05(1H,s),4.33-4.27(2H,m),4.00-3.98 (2H,m),3.86(3H,s),3.82(3H,s),3.57-3.55(2H,m),3.42-3.38 (3H,m),2.76-2.72(1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.65-1.62 (2H,m). MS(APCI、ESI)m/z:503[81Br,(M+H)+],501[79Br, (M+H)+].
步驟9： (11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-甲酸丙-2-烯-1-基酯(3-10) 於上述步驟8所獲得的化合物(3-9)(0.426g，0.849mmol)之二氯甲烷(30mL)溶液中，於0℃添加吡啶(0.102mL1.27mmol)、氯甲酸烯丙酯(0.374mL，3.54mmol)，於0℃攪拌15分鐘。於反應溶液中添加10%檸檬酸水溶液，以氯仿萃取，將獲得的有機層以飽和碳酸氫鈉水溶液洗淨後，以硫酸鈉乾燥。進行減壓餾除，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=90：10(v/v)～50：50(v/v)]純化，獲得目的物(3-10)(0.465g，94%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.38(1H,s),7.31-7.29(2H,m),7.26-7.25(1H,m),6.89-6.87(2H,m),6.71(1H,s),5.80-5.78 (1H,m),5.14-5.11(2H,m),4.65-4.62(1H,m),4.39-4.26 (3H,m),4.03-4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.82(3H,s),3.66-3.64 (1H,m),3.46-3.44(2H,m),3.30-3.27(1H,m),2.72-2.68 (1H,m),1.96-1.88(4H,m),1.68-1.60(2H,m). MS(APCI、ESI)m/z:587[81Br,(M+H)+],585[79Br, (M+H)+].
步驟10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-7’-甲氧基-8’-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)戊基]氧基}-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(3-11) 於實施例1-1步驟10所獲得的化合物(1-11)(0.130g，0.161mmol)與上述步驟9所獲得的化合物(3-10)(0.104g，0.177mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(3mL)溶液中，於室溫添加碳酸鉀(0.0266g，0.193mmol)，並於室溫攪拌一晚。將反應溶液以乙酸乙酯稀釋，以水、飽和食鹽水洗淨後，以硫酸鈉乾燥。進行減壓餾除後，將獲得的殘渣以NH2 -矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=70：30(v/v)～0：100(v/v)]純化，獲得目的物(3-11)(0.184g，87%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:8.76(1H,s),7.58-7.56(2H,m),7.39 (1H,s),7.32-7.30(2H,m),7.26-7.24(2H,m),7.19-7.17 (3H,m),6.90-6.88(2H,m),6.78(1H,s),6.68-6.66(1H,m), 6.37(1H,s),5.99-5.93(3H,m),5.34-5.20(6H,m),4.66-4.01 (11H,m),3.90(3H,s),3.89(3H,s),3.78-3.54(9H,m),3.31-3.28(2H,m),2.73-2.69(1H,m),2.38-2.35(1H,m),2.19-2.13 (1H,m),1.82-1.80(2H,m),1.46-1.29(6H,m),0.98-0.90 (6H,m),0.83(9H,s),0.69-0.63(4H,m),0.19-0.16(6H,m). MS(APCI、ESI)m/z:1312(M+H)+
步驟11：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)戊基]氧基}-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(3-12) 於上述步驟10所獲得的化合物(3-11)(0.1837g，0.140mmol)與乙酸(0.048mL，0.840mmol)之四氫呋喃(5.00mL)溶液中，於室溫添加1mol/L之四丁基氟化銨 四氫呋喃溶液(0.700mL，0.700mmol)，並於室溫攪拌3小時。將反應溶液以乙酸乙酯稀釋，將有機層以飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和食鹽水洗淨後，以硫酸鈉乾燥。進行減壓餾除後，將獲得的殘渣以矽膠層析[氯仿：甲醇=99.5：0.5(v/v)～95：5(v/v)]純化，獲得目的物(3-12)(0.178g、定量的)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:8.86(1H,s),7.60-7.59(2H,m), 7.39(1H,s),7.32-7.20(7H,m),6.90-6.88(2H,m),6.78 (1H,s),6.68(1H,s),6.38(1H,s),5.90-5.87(3H,m),5.39-5.22 (6H,m),4.72-4.02(11H,m),3.90(3H,s),3.88(3H,s), 3.83(3H,s),3.70-3.63(6H,m),3.32-3.29(3H,m),2.73-2.69 (1H,m),2.43-2.40(1H,m),2.12-2.06(1H,m),1.77-1.74 (2H,m),1.39-1.25(6H,m),0.96-0.89(6H,m),0.73-0.66 (4H,m). MS(APCI、ESI)m/z:1198(M+H)+
步驟12：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(3-13) 於上述步驟11所獲得的化合物(3-12)(0.140mmol)之二氯甲烷(2mL)溶液中，於室溫添加吡咯啶(0.0579mL, 0.700mmol)、肆(三苯基膦)鈀(0)(0.0162g, 0.0140mmol)，並於室溫攪拌15分鐘。進行減壓餾除後，將獲得的殘渣以矽膠層析[氯仿：甲醇=99.5：0.5(v/v)～92.5：7.5(v/v)]純化，獲得目的物(3-13)(0.143g, 99%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:9.12(1H,s),7.94-7.92(1H,m),7.57-7.53(4H,m),7.33-7.31(2H,m),7.20-7.18(3H,m),6.90-6.88(2H,m),6.36(1H,s),6.07(1H,s),5.91-5.88(1H,m),5.47-5.44(1H,m),5.21-5.13(1H,m),4.66-4.58(3H,m),4.32 (1H,s),4.03-3.49(17H,m),3.38-3.29(4H,m),3.15-3.14 (1H,m),2.77-2.73(1H,m),2.57(2H,s),2.43-2.40(1H,m), 2.32-2.27(1H,m),1.81-1.39(8H,m),0.98-0.96(3H,m),0.85-0.83(3H,m),0.75-0.62(4H,m). MS(APCI、ESI)m/z:1030(M+H)+
步驟13：N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(3-14) 於實施例1-2步驟1所獲得的化合物(2-2)(0.0640g, 0.153mmol)、N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(0.0446g, 0.180mmol)之混合物中，於室溫添加二氯甲烷(2mL)，並於室溫攪拌15分鐘。於反應溶液中添加上述步驟12所獲得的化合物(3-13)(0.143g, 0.139mmol)之二氯甲烷(2mL)溶液，於室溫攪拌五小時後，進行減壓餾除。將獲得的殘渣以矽膠層析[氯仿：甲醇=99.5：0.5(v/v)～92.5：7.5(v/v)]純化，獲得目的物(3-14)(0.103g, 52%)。 1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.93(1H,s),8.21-8.16 (2H,m),8.07-8.04(1H,m),7.83-7.64(2H,m),7.60-7.55 (3H,m),7.51-7.28(10H,m),7.19-7.16(2H,m),7.10-7.04(1H,m),6.92-6.90(2H,m),6.76-6.70(1H,m),6.39 (1H,s),5.77-5.75(1H,m),5.21-5.18(1H,m),5.03-4.99 (1H,m),4.82-4.79(1H,m),4.37-4.35(1H,m),4.21-4.20 (2H,m),4.02-3.24(26H,m),3.16-3.13(1H,m),2.79-2.59 (2H,m),2.39-2.28(2H,m),2.05-1.97(2H,m),1.91-1.77(4H,m),1.57-1.54(3H,m),1.28-1.23(3H,m),0.85-0.80 (6H,m),0.67-0.61(4H,m). MS(APCI、ESI)m/z:1431(M+H)+
[實施例2-2：藥物連接子2]
步驟1：(2R,11aS)-8-(3-溴丙氧基)-2-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(4-1) 將實施例2-1步驟1所獲得的化合物(3-2)(5.06g，9.67mmol)與1,3-二溴丙烷(4.93mL，48.4mmol)與實施例2-1步驟2同樣地進行反應，獲得目的物(4-1)(4.85g，78%)。 MS(APCI、ESI)m/z:645[81Br,(M+H)+],643[79Br, (M+H)+].
步驟2：(2R,11aS)-8-(3-溴丙氧基)-2-羥基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(4-2) 將於上述步驟1所獲得的化合物(4-1)(4.85g，7.54mmol)與實施例2-1步驟3同樣地進行反應，獲得目的物(4-2)(4.05g，定量的)。 MS(APCI、ESI)m/z:531[81Br,(M+H)+],529[79Br, (M+H)+].
步驟3：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2,5,11(3H,10H,11aH)-三酮(4-3) 將於上述步驟2所獲得的化合物(4-2)(7.54mmol)與實施例2-1步驟4同樣地進行反應，獲得目的物(4-3)(3.73g，93%)。 1H-NMR(CDCl3)δ:7.34(1H,s),7.29(1H,s),5.56-5.53 (1H,m),4.72-4.69(1H,m),4.67-4.61(1H,m),4.23-4.17 (3H,m),3.97-3.88(4H,m),3.82-3.75(1H,m),3.74-3.56 (4H,m),2.82-2.77(1H,m),2.43-2.38(2H,m),1.06-0.94 (2H,m),0.08-0.00(9H,m).
步驟4：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二側氧基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-2-基 三氟甲烷磺酸酯(4-4) 將於上述步驟3所獲得的化合物(4-3)(3.73g，7.08mmol)與實施例2-1步驟5同樣地進行反應，獲得目的物(4-4) (3.27g，70%)。 MS(APCI、ESI)m/z:661[81Br,(M+H)+],659[79Br, (M+H)+].
步驟5：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基-10-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5,11(10H,11aH)-二酮(4-5) 將於上述步驟4所獲得的化合物(4-4)(3.27g，4.96mmol)與實施例2-1步驟6同樣地進行反應，獲得目的物(4-5)(2.49g，81%)。 MS(APCI、ESI)m/z:619[81Br,(M+H)+],617[79Br, (M+H)+].
步驟6：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,11a-二氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮(4-6) 將於上述步驟5所獲得的化合物(4-5)(2.49g，4.04mmol)與實施例2-1步驟7同樣地進行反應，獲得目的物(4-6)(1.59g，84%)。 MS(APCI、ESI)m/z：473[81Br，(M＋H)＋]，471[79Br，(M＋H)＋].
步驟7：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,10,11,11a-四氫-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-5-酮(4-7) 將於上述步驟6所獲得的化合物(4-6)(1.59g，3.38mmol)與實施例2-1步驟8同樣地進行反應，獲得目的物(4-7) (1.39g，87%)。 MS(APCI、ESI)m/z:475[81Br,(M+H)+],473[79Br, (M+H)+].
步驟8： (11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-11,11a-二氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-10(5H)-甲酸丙-2-烯-1-基 酯(4-8) 將於上述步驟7所獲得的化合物(4-7)(1.40g，2.95mmol)與實施例2-1步驟9同樣地進行反應，獲得目的物(4-8)(0.885g，54%)。 MS(APCI、ESI)m/z:559[81Br,(M+H)+],557[79Br, (M+H)+].
步驟9：N-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-L-纈胺醯基-N-[4-({[(11’S,11’aS)-11’-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-7’-甲氧基-8’-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5’-側氧基-11’,11’a-二氫-1’H,3’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(4-9) 將於上述步驟8所獲得的化合物(4-8)(0.0381g，0.0683mmol)與實施例1-1步驟10所獲得的化合物(1-11)(0.0552g、0.0683mmol)與實施例2-1步驟10同樣地進行反應，獲得目的物(4-9)(0.0712g，81%)。 MS(APCI、ESI)m/z：1284(M＋H)＋.
步驟10：N-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-L-纈胺醯基-N-[4-({[(11’S,11’aS)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5’-側氧基-11’,11’a-二氫-1’H,3’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(4-10) 將上述步驟9所獲得的化合物(4-9)(0.0712g，0.0554mmol)與實施例2-1步驟11同樣地進行反應，獲得目的物(4-10)(0.0671g，定量的)。 MS(APCI、ESI)m/z：1170(M＋H)＋.
步驟11：L-纈胺醯基-N-[4-({[(11’S,11’aS)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5’-側氧基-11’,11’a-二氫-1’H,3’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(4-11) 將上述步驟10所獲得的化合物(4-10)(0.0571mmol)與實施例2-1步驟12同樣地進行反應，獲得目的物(4-11)(0.0574g，99%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:9.16(1H,s),7.93-7.91(1H,m),7.55-7.52(1H,m),7.50-7.47(3H,m),7.35-7.32(2H,m),7.21 (1H,s),7.13-7.11(2H,m),6.90-6.87(2H,m),6.40(1H,s),6.08 (1H,s),5.90-5.87(1H,m),5.37-5.34(1H,m),4.73-4.53 (3H,m),4.23-4.08(5H,m),3.89(3H,s),3.82(3H,s),3.78-3.72 (5H,m),3.57-3.51(3H,m),3.38-3.30(3H,m),2.76-2.71 (1H,m),2.36-2.24(4H,m),1.78-1.42(6H,m),1.00-0.98 (3H,m),0.87-0.84(3H,m),0.74-0.62(4H,m). MS(APCI、ESI)m/z:1002(M+H)+.
步驟12：N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-[4-({[(11’S,11’aS)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}丙氧基)-5’-側氧基-11’,11’a-二氫-1’H,3’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(4-12) 將上述步驟11所獲得的化合物(4-11)(0.189g，0.189mmol)及實施例1-2步驟1所獲得的化合物(2-2)(0.087g、0.207mmol)與實施例2-1步驟13同樣地進行反應，獲得目的物(4-12)(0.169g，64%)。 MS(APCI、ESI)m/z：1402(M＋H)＋.
[實施例2-3：藥物連接子3]
步驟1：二甲基(6S,6’S)-5,5’-{1,5-戊烷二基雙[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)羰基]}雙(5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-甲酸酯)(5-2) 於4,4’-[1,5-戊烷二基雙(氧基)]雙(5-甲氧基-2-硝基苯甲酸)(5-1)(5.41g，10.9mmol，Journal of Medicinal Chemistry 2004,47，1161)之二氯甲烷(50mL)溶液中，於0℃添加草醯氯(5.63mL，65.7mmol)，滴加N,N-二甲基甲醯胺(0.0844mL，1.09mmol)。將反應溶液升溫至室溫為止，攪拌2小時。將減壓餾除而獲得的殘渣溶解於二氯甲烷(100mL)，氮氣環境下，於-40℃滴加至(6S)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-甲酸甲酯鹽酸鹽(4.28g，24.1mmol，Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847)與三乙基胺(6.07mL，43.8mmol)之二氯甲烷溶液(100mL)中。將反應溶液升溫至0℃而攪拌2小時。於反應混合物中添加1N鹽酸(100mL)，將有機層以水、飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。進行減壓餾除，獲得目的物(5-2)(8.40g、定量的)。 MS(APCI、ESI)m/z:769(M+H)+.
步驟2：{1,5-戊烷二基雙[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)]}雙{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基]甲酮}(5-3) 於上述步驟1所獲得的化合物(5-2)(8.40g，10.9mmol)之四氫呋喃(100mL)溶液中，添加硼氫化鋰(714mg，32.8mmol)，於0℃攪拌30分鐘，升溫至室溫而攪拌1小時。於0℃添加1N鹽酸後，以乙酸乙酯萃取，以飽和食鹽水洗淨後，以無水硫酸鈉使乾燥。減壓下餾除溶媒，獲得目的物(5-3)(7.70g，99%)。 MS(APCI、ESI)m/z:713(M+H)+.
步驟3：戊烷-1,5-二基雙[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)羰基(6S)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5,6-二基甲烷二基]二乙酸酯(5-4) 將於上述步驟2所獲得的化合物(5-3)(7.70g、10.8mmol)溶解於吡啶(20mL)及乙酸酐(10mL，105.9mmol)，於室溫攪拌。減壓餾除而獲得目的物(5-4)(8.38g，97%)。 MS(APCI、ESI)m/z:797(M+H)+.
步驟4：1,5-戊烷二基雙[氧基(2-胺基-5-甲氧基苯-4,1-二基)羰基(6S)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-5,6-二基甲烷二基]二乙酸酯(5-5) 於上述步驟3所獲得的化合物(5-4)(8.28g，10.4mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(100mL)溶液中，添加5%鈀碳(54%水分、1.00g)後，將反應溶液於氫氣環境下、於室溫激烈攪拌6小時。進行矽藻土過濾後，將濾液進行減壓餾除而將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[氯仿：甲醇=100：0(v/v)～90：10(v/v)]純化，獲得目的物(5-5)(5.05g，66%)。 MS(APCI、ESI)m/z:737(M+H)+.
步驟5:{(6S)-5-[4-({5-[4-({(6S)-6-[(乙醯氧基)甲基]-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基}羰基)-5-胺基-2-甲氧基苯氧基]戊基}氧基)-5-甲氧基-2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]胺基}苯甲醯基]-5-氮雜螺[2.4]庚-6-基}甲基乙酸酯(單烯丙氧基羰基體)(5-6) 於上述步驟4所獲得的化合物(5-5)(5.05g，6.85mmol)之二氯甲烷(100mL)溶液中，添加吡啶(1.10mL，13.7mmol)，氮氣環境下，於-78℃添加氯甲酸烯丙酯(0.725mL，6.85mmol)，攪拌2小時。將進行減壓餾除而獲得的殘渣以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=70：30(v/v)～100：0(v/v)、氯仿：甲醇=100：0(v/v)～90：10(v/v)]純化，獲得為目的物的單烯丙氧基羰基體(5-6)(2.63g，47%)。 MS(APCI、ESI)m/z:821(M+H)+.
步驟6：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[2-({(6S)-6-[(乙醯氧基)甲基]-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基}羰基)-5-({5-[4-({(6S)-6-[(乙醯氧基)甲基]-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基}羰基)-2-甲氧基-5-{[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]胺基}苯氧基]戊基}氧基)-4-甲氧基苯基]胺甲醯基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(5-7) 將上述步驟5所獲得的單烯丙氧基羰基體(5-6)(2.00g，2.44mmol)及N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-(羥基甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(1.10g，2.92mmol，WO2011130598)，與實施例1-1步驟6同樣地進行反應，獲得目的物(5-7)(2.64g，89%)。 MS(APCI、ESI)m/z:1224(M+H)+.
步驟7：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基]羰基}-5-{[5-(4-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基]羰基}-2-甲氧基-5-{[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]胺基}苯氧基)戊基]氧基}-4-甲氧基苯基)胺甲醯基]氧基}甲基)苯基]-L-丙胺醯胺(5-8) 於上述步驟6所獲得的化合物(5-7)(2.64g，2.16mmol)之甲醇(10mL)溶液中，添加碳酸鉀(1.49g，10.8mmol)，於室溫攪拌3小時。於反應混合物中添加飽和氯化銨水溶液(100mL)，以乙酸乙酯萃取。有機層以無水硫酸鈉使乾燥。減壓餾除，而獲得目的物(5-8)(2.21g，90%)。 MS(APCI、ESI)m/z:1140(M+H)+.
步驟8：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-8’-{[5-({(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-5’-側氧基-10’-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-5’,10’,11’,11a’-四氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8’-基}氧基)戊基]氧基}-7’-甲氧基-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(5-9) 於上述步驟7所獲得的化合物(5-8)(2.03g，1.78mmol)之二氯甲烷(50mL)溶液中，添加戴斯-馬丁氧化劑(Dess-Martin Periodinane)(1.59g，3.74mmol)，並於室溫攪拌一晚。於反應混合物中添加飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)，並以氯仿萃取。有機層以無水硫酸鈉使乾燥。將進行減壓餾除而獲得的殘渣以矽膠管柱層析[氯仿：甲醇=100：0(v/v)～90：10(v/v)]純化，獲得目的物(5-9)(2.05g，定量的)。 MS(APCI、ESI)m/z:1136(M+H)+.
步驟9：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧基-5’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(5-10) 將於上述步驟8所獲得的化合物(5-9)(2.05g，1.80mmol)與實施例2-1步驟12同樣地進行反應，獲得目的物(5-10)(1.02g，60%)。 MS(APCI、ESI)m/z:950(M+H)+.
步驟10：N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧基-5’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(5-11) 將上述步驟9所獲得的化合物(5-10)(0.710g，0.747mmol)及實施例1-2步驟1所獲得的化合物(2-2)(0.313g、0.747mmol)溶解於二氯甲烷(1.5mL)及甲醇(0.1mL)之混合溶媒。添加4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三-2-基)-4-甲基啉鎓氯化物(0.264g，0.897mmol)，並於室溫攪拌1小時。將進行減壓餾除而獲得的殘渣，以矽膠管柱層析[氯仿：甲醇=100：0(v/v)～80：20(v/v)]純化，而獲得目的物(5-11)(0.671g，66%)。 1H-NMR(DMSO-D6)δ:9.91(1H,s),8.32(1H,s),8.23-7.91(3H,m),7.81-7.19(14H,m),7.04(1H,m),6.80-6.62 (3H,m),5.77-5.75(1H,m),5.20(1H,m),5.01(1H,m), 4.79(1H,m),4.46-4.35(1H,m),4.04(4H,m),3.86-3.38 (18H,m),3.22-3.15(2H,m),2.67-2.63(1H,m),2.46-2.23 (3H,m),2.09-1.91(2H,m),1.80-1.78(5H,m),1.57(3H,m), 1.27(3H,s),1.11-1.04(1H,m),0.87-0.79(6H,m),0.63-0.55 (6H,m). MS(APCI、ESI)m/z:1351(M+H)+.
[實施例2-4：藥物連接子4]
步驟1：(6S)-5-[4-(苄基氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲醯基]-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-甲酸甲酯(6-2) 於4-(苄基氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(6-1)(6.07g，20.0mmol，Tetrahedron 1995,51,5617)、N,N-二甲基甲醯胺(1.08mL，13.9mmol)之二氯甲烷(100mL)溶液中，於冰冷卻下歷經5分鐘滴加草醯氯(3.43mL，40.0mmol)。於室溫攪拌反應溶液5小時後，進行減壓餾除，使獲得的殘渣溶解於二氯甲烷(20mL)，進行減壓餾除。重複三次此操作後，使殘渣懸浮於二氯甲烷(5mL)，於其中添加過剩之二乙基醚與己烷，過濾、減壓下使乾燥而獲得粗醯氯。使獲得的醯氯溶解於二氯甲烷，冷卻至-40℃(乾冰-乙腈浴)，緩緩添加(6S)-5-氮雜螺[2.4]庚烷-6-甲酸甲酯鹽酸鹽(4.22g，22.0mmol，Tetrahedron Letters 2012.53.3847)、三乙基胺(3.36mL，24.2mmol)。將反應混合物歷經一晩升溫至室溫為止。於反應混合物中添加1N鹽酸，反應混合物以二氯甲烷萃取。將有機層以水、飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。將進行減壓餾除而獲得的殘渣，以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0～50：50]純化，獲得目的物(6-2)(6.55g，80%)。 MS(APCI、ESI)m/z:441(M+H)+
步驟2：(11a’S)-8’-(苄基氧基)-7’-甲氧基-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5’,11’(10’H,11a’H)-二酮(6-3) 於上述步驟1所獲得的化合物(6-2)(6.55g，16.0mmol)之乙醇(150mL)，四氫呋喃(150mL)溶液中，氮氣環境下，添加雷氏鎳(7.00g)。於反應混合物中添加肼一水合物(7mL)，緩緩升溫至50℃為止。於50℃攪拌2小時後，添加雷氏鎳(3.00g)、肼一水合物(3mL)，並攪拌1小時。於反應混合物中添加THF(100mL)，進行矽藻土過濾。將進行減壓餾除而獲得的殘渣，以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0～25：75]純化，獲得目的物(6-3)(4.42g，73%)。 MS(APCI、ESI)m/z:379(M+H)+
步驟3：(11a’S)-8’-(苄基氧基)-7’-甲氧基-10’-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5’,11’(10’H,11a’H)-二酮(6-4) 於上述步驟2所獲得的化合物(6-3)(10.0g，26.4mmol)之四氫呋喃(150mL)溶液中，於-40℃，緩緩滴加2.6mol/L之正丁基鋰正己烷溶液(12.0mL，31.8mmol)。將反應溶液於-40℃攪拌15分鐘後，緩緩滴加2-(氯甲氧基)乙基三甲基矽烷(5.57mL，31.7mmol)。於室溫攪拌反應溶液3小時後，添加水並以乙酸乙酯萃取。將有機層以水及飽和食鹽水洗淨，以無水硫酸鈉乾燥。將進行減壓餾除而獲得的殘渣，以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0～30：70]純化，獲得目的物(6-4)(11.8g，88%)。 MS(APCI、ESI)m/z:509(M+H)+
步驟4：(11a’S)-8’-羥基-7’-甲氧基-10’-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5’,11’(10’H,11a’H)-二酮(6-5) 於上述步驟3所獲得的化合物(6-4)(18.7g，36.8mmol)之四氫呋喃(50mL)、乙醇(100mL)溶液中，於氮氣環境下添加5%之鈀碳觸媒(5.00g)。立即將氮氣球替換為氫氣球，將反應混合物於氫氣環境下攪拌6小時。於反應混合物中添加氯仿而稀釋，進行矽藻土過濾後，將濾液進行減壓餾除而獲得的殘渣，以矽膠管柱層析[己烷：乙酸乙酯=100：0～25：75]純化，獲得目的物(6-5)(15.1g，98%)。 MS(APCI、ESI)m/z：419(M＋H)＋
步驟5：(11a’S)-8’-[(5-溴戊基)氧基]-7’-甲氧基-10’-{[2-(三甲基矽基)乙氧基]甲基}-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5’,11’(10’H,11a’H)-二酮(6-6) 將上述步驟4所獲得的化合物(6-5)(2.77g，6.62mmol)與實施例2-1步驟2同樣地進行反應，獲得目的物(6-6)(3.31g，88%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.36(1H,s),7.25(1H,s),5.55 (1H,m),4.65(1H,m),4.24-4.23(1H,m),4.11-4.03(2H,m), 3.93(3H,s),3.85-3.78(1H,m),3.72-3.69(2H,m),3.46-3.39 (3H,m),2.47-2.44(1H,m),2.25-2.22(1H,m),1.95-1.91 (4H,m),1.67-1.59(1H,m),1.03-0.95(2H,m),0.90-0.85 (1H,m),0.70-0.66(4H,m),0.05(9H,s).
步驟6：(11a’S)-8’-[(5-溴戊基)氧基]-7’-甲氧基-1’,11a’-二氫-5’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5’-酮(6-7) 將上述步驟5所獲得的化合物(6-6)(3.31g，5.83mmol)與實施例2-1步驟7同樣地進行反應，獲得目的物(6-7)(1.11g，45%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.81(1H,m),7.53(1H,s),6.82 (1H,s),4.13-4.06(2H,m),3.97(3H,s),3.88-3.83(1H,m), 3.69(1H,m),3.52-3.39(3H,m),2.55-2.52(1H,m),2.06-1.89 (5H,m),1.67-1.63(2H,m),0.76-0.72(4H,m).
步驟7：(11a’S)-8’-[(5-溴戊基)氧基]-7’-甲氧基-1’,10’,11’,11a’-四氫-5’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5’-酮(6-8) 將上述步驟6所獲得的化合物(6-7)(2.56g，6.08mmol)與實施例2-1步驟8同樣地進行反應，獲得目的物(6-8)(1.15g，45%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:7.60(1H,s),6.07(1H,s),4.11-4.04 (1H,m),3.99(2H,m),3.87-3.84(1H,m),3.85(3H,s),3.73 (1H,m),3.58-3.53(2H,m),3.47-3.42(3H,m),2.03-1.78 (6H,m),1.65-1.63(2H,m),0.77-0.56(4H,m).
步驟8：(11a’S)-8’-[(5-溴戊基)氧基]-7’-甲氧基-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-甲酸 丙-2-烯-1-基酯(6-9) 將上述步驟7所獲得的化合物(6-8)(1.15g，2.72mmol)與實施例2-1步驟9同樣地進行反應，獲得目的物(6-9)(1.14g，82%)。 1H-NMR(CDCl3)δ:7.23(1H,s),6.69(1H,s),5.79 (1H,s),5.13-5.10(2H,m),4.68-4.66(1H,m),4.48-4.45 (2H,m),4.01(2H,m),3.92(3H,s),3.76(1H,m),3.54-3.37 (3H,m),2.39(1H,m),1.95-1.90(4H,m),1.68-1.61 (3H,m),1.44(1H,m),0.75-0.66(4H,m).
步驟9：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-7’-甲氧基-8’-{[5-({(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧基-10’-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5’,10’,11’,11a’-四氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8’-基}氧基)戊基]氧基}-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(6-10) 將上述步驟8所獲得的化合物(6-9)(0.374g，0.737mmol)及實施例1-1步驟10所獲得的化合物(1-11)(0.452g、0.56mmol)與實施例2-1步驟10同樣地進行反應，獲得目的物(6-10)(0.589g，65%)。 MS(APCI、ESI)m/z：1234(M＋H)＋
步驟10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-{[5-({(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧基-10’-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5’,10’,11’,11a’-四氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8’-基}氧基)戊基]氧基}-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(6-11) 將上述步驟9所獲得的化合物(6-10)(0.589g，0.477mmol)與實施例2-1步驟11同樣地進行反應，獲得目的物(6-11)(0.382g，71%)。 1H-NMR(CDCl3 )δ:8.90(1H,s),7.55(2H,m),7.25-7.21 (2H,m),6.74(2H,m),6.38(1H,s),5.90-5.87(5H,m),5.33-5.09(8H,m),4.66-4.60(8H,m),3.98-3.91(10H,m),3.77-3.30 (12H,m),2.42-2.36(2H,m),1.77-1.39(6H,m),0.91-0.70 (14H,m).
步驟11：L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧基-5’,10’,11’,11a’-四氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(6-12) 將上述步驟10所獲得的化合物(6-11)(0.382g，0.341mmol)與實施例2-1步驟12同樣地進行反應，獲得目的物(6-12)(0.200g，62%)。 MS(APCI、ESI)m/z：952(M＋H)＋
步驟12：N-[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]甘胺醯基甘胺醯基-L-纈胺醯基-N-{4-[({[(11’S,11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11a’S)-7’-甲氧基-5’-側氧基-5’,10’,11’,11a’-四氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-8’-基]氧基}戊基)氧基]-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙胺醯胺(6-13) 將上述步驟11所獲得的化合物(6-12)(0.0560g，0.0588mmol)及實施例1-2步驟1所獲得的化合物(2-2)(0.022g、0.053mmol)與實施例2-1步驟13同樣地進行反應，獲得目的物(6-13)(0.0500g，63%)。 MS(APCI、ESI)m/z：1354(M＋H)＋
〔糖鏈供予體之合成〕 實施例3：[N3 -PEG(3)]-MSG1-Ox
步驟1：(MSG1-)Asn 將為市售品的monosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn、糖鏈工學研究所(股)製)(稱為「(MSG-)Asn」) (500mg)，以下列之條件進行逆相HPLC分離純化，分離出呈第一主峰被溶出的(MSG1-)Asn(滯留時間 15～19分鐘附近)及呈第二主峰被溶出的(MSG2-)Asn(滯留時間 21～26分鐘附近)。使用0.1%甲酸水溶液作為溶析液，裝置使用ELS-PDA trigger分取系統(JASCO Corporation製)，管柱使用Inertsil ODS-3(10um、30Φx250mm、GL SCIENCES公司製)，流速設為30mL/min。溶出中分取出經UV檢測(210nm)的最初波峰，冷凍乾燥，而獲得目的物(238mg)。
步驟2：MSG1 使上述步驟1所獲得的化合物(229mg)溶解於200mM磷酸緩衝溶液(pH6.25)(1145μL)，添加EndoM(東京化成工業(股)製、1U/mL))水溶液(100μL)，於35℃溫育6日。反應結束後，將反應液使用VIVASPIN 15R(Hydrosart膜、30K，6,000xG)進行超過濾，將獲得的通過液進行逆相HPLC分離純化。使用0.1%三氟乙酸水溶液作為溶析液，裝置使用ELS-PDA trigger分取系統(JASCO Corporation製)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL SCIENCES公司製)。分取溶出中經UV檢測(210nm)的目的物之波峰，冷凍乾燥，而獲得目的物(117mg)。
步驟3：[N3 -PEG(3)]-MSG1 於5ml取樣管(INA･OPTIKA CO.,LTD)中，添加11-疊氮基-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(0.108mL，0.541mmol)及上述步驟2所獲得的MSG1(117mg，0.068mmol)之水溶液(1.2mL)，攪拌1小時後，冷凍乾燥。於冷凍乾燥後之5ml取樣管中，添加O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(103mg，0.27mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(1.2mL)及二異丙基乙基胺(0.046mL，0.27mmol)，並於37℃攪拌3小時。反應結束後，將反應液移到事先添加二乙基醚(20ml)的離心管(50ml)中。利用小型離心機(日立工機、CF16RX)，使固形物沉澱，去除上清液。進一步添加二乙基醚(10ml)，離心分離操作後，進行傾析。接著，添加乙腈(10mL)，離心分離後，重複二次傾析的操作後，減壓下乾燥，獲得粗生成物。將獲得的固形物以與上述步驟2同樣的條件而進行逆相HPLC純化，獲得目的物(94.2mg)。
步驟4：[N3 -PEG(3)]-MSG1-Ox 於5mL取樣管(INA･OPTIKA CO.,LTD製)中，添加上述步驟3所合成的化合物(100mg)、2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓-氯化物(伏見製藥所製、56mg，0.257mmol)之水溶液(520μl)。於冰冷卻後之反應液中添加磷酸三鉀(165mg，0.78mmol)之水溶液(520μl)，冰冷卻下攪拌3小時。將獲得的反應液，使用Amicon Ultra(Ultracel 30K，Merck Millipore製)進行超過濾，去除固形物。將該通過液以膠體過濾層析純化。裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製)，管柱使用HiPrep 26/10 Desalting(GE HEALTHCARE製)，於移動相使用0.03%-NH3 水溶液，將流速設為10mL/min，將分級容量設為10mL。收集於溶出中經UV檢測(220nm)出的包含目的物的劃份成為一個，添加1N氫氧化鈉水溶液(104μl，0.104mmol)進行冷凍乾燥，獲得目的物(84mg)。
實施例4：[N3 -PEG(3)]-MSG-Ox
步驟1：(MSG-)Asn之調製 使為市售品的1S2G/1G2S-10NC-Asn-Fmoc((股)糖鏈工學研究所製)(稱為「Fmoc-(MSG-)Asn」)(1000mg)溶解於乙醇/水(1/1)(10mL)，添加1N之氫氧化鈉水溶液(1.75mL，4當量)，並於室溫攪拌3小時。反應結束後，反應液使用Amicon Ultra(30K、Millipore公司製)進行超過濾，去除固形物，於獲得的通過液中添加1N鹽酸(832μl，1.9當量)。使用高速濃縮裝置V-10(Biotage公司製)，去除溶媒。添加乙腈，使用高速濃縮裝置V-10(Biotage公司製)，去除溶媒後，進行逆相HPLC分離純化。將0.1%三氟乙酸水溶液及0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液，裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製)，管柱使用Inertsil ODS-3(GL SCIENCES製)。收集於溶出中經UV檢測(220nm)出的包含目的物的劃份成為一個，冷凍乾燥。再次，使溶解於純水時，以pH試驗紙確認為酸性，而添加18%氨水(150μl)，以pH試驗紙確認成為鹼性，再次冷凍乾燥。將獲得的目的物(840mg)直接用於下一反應。
步驟2：MSG之合成 使步驟1所獲得的化合物(840mg)溶解於200mM磷酸緩衝溶液(pH6.25)(6000μL)，添加EndoM(東京化成工業(股)製、1U/mL))水溶液(200μL)，於28℃溫育26小時。因反應未結束，而添加EndoM(東京化成工業(股)製、1U/mL))水溶液(50μL)，於28℃溫育2小時後，於室溫放置至反應結束為止。反應結束後，使用Amicon Ultra(30K、Millipore公司製)將反應液進行超過濾。於獲得的通過液中添加三氟乙酸(80μl)，進行逆相HPLC分離純化。將0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液，裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製)，於管柱係使用Inertsil ODS-3(GL SCIENCES製)。收集於溶出中經UV檢測(220nm)出的包含目的物的劃份成為一個，冷凍乾燥。於去除殘留三氟乙酸的目的，再次使溶解於純水，獲得呈無色固體之目的化合物(618mg)。 ESI-MS: C66 H110 N4 O49 : [M+H]+ 計算值1743.62, 實測值1743.63
步驟3：[N3 -PEG(3)]-MSG之合成 使用於上述步驟2所獲得的化合物(120mg)，按照與實施例3步驟3同樣之手法，獲得目的物(88.6mg)。 ESI-MS: C73 H124 N8 O51 :[M+2H]2+ 計算值965.37, 實測值965.37
步驟4[N3 -PEG(3)]-MSG-Ox之合成 使用於上述步驟3所獲得的合成的化合物(100mg)，按照與實施例3步驟4同樣之手法，獲得目的物(88mg)。
實施例5：[N3 -PEG(3)]2 -SG(10)-Ox
步驟1：[N3 -PEG(3)]2 -SG(10) 於5ml取樣管(INA･OPTIKA CO.,LTD)中，添加11-疊氮基-3,6,9-三氧雜十一烷-1-胺(0.096mL，0.485mmol)、二唾液酸八糖(50mg，0.24mmol)之水溶液(0.5mL)，攪拌1小時後，冷凍乾燥。於冷凍乾燥後之5ml取樣管中，添加O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽(92mg，0.24mmol)之N,N-二甲基甲醯胺溶液(0.6mL)及二異丙基乙基胺(0.042mL，0.24mmol)，並於37℃攪拌4小時。反應結束後，將反應液移到事先添加二乙基醚(20ml)的離心管(50ml)中。利用小型離心機(日立工機、CF16RX)，使固形物沉澱，去除上清液。添加二乙基醚(20ml)，進行傾析。接著，添加乙腈(20mL)，傾析後，減壓下乾燥，獲得粗生成物。使獲得的固形物溶解於適量之0.2%三氟乙酸水溶液，並進行逆相HPLC分離純化。將0.1%三氟乙酸水溶液及0.1%三氟乙酸乙腈溶液作為溶析液，裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製)，於管柱係使用Inertsil ODS-3(GL SCIENCES製)。收集於溶出中經UV檢測(220nm)出的包含目的物的劃份成為一個，冷凍乾燥而獲得目的物(42mg)。
步驟2：[N3 -PEG(3)]2 -SG(10)-Ox 於5mL取樣管(INA･OPTIKA CO.,LTD製)中，添加上述步驟1所合成的化合物(40mg)、2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓-氯化物(伏見製藥所製、17.9mg，0.083mmol)之水溶液(200μl)。於冰冷卻後之反應液中添加磷酸三鉀(52.6mg，0.25mmol)之水溶液(200μl)，於冰冷卻下攪拌2小時。將獲得的反應液，使用Amicon Ultra(Ultracel 30K、 Merck Millipore製)進行超過濾，去除固形物。將該通過液以膠體過濾層析純化。裝置使用Purif-Rp2(SHOKO SCIENTIFIC製)，管柱使用HiPrep 26/10 Desalting(GE HEALTHCARE製)，於移動相使用0.03% NH3水溶液，將流速設為10mL/min，將分級容量設為10mL。收集於溶出中經UV檢測(220nm)出的包含目的物的劃份成為一個，添加1N氫氧化鈉水溶液(33μl，0.033mmol)進行冷凍乾燥，獲得目的物(34mg)。
實施例6：小鼠抗CLDN6抗體B1產生融合瘤(218B1)及小鼠抗CLDN6抗體C7產生融合瘤(218C7) 6-1.小鼠之免疫與融合瘤之取得 1-1)於小鼠免疫所使用的細胞之準備 將2×106 個或5×106 個之NOR-P1細胞(人類胰臟癌細胞株、RIKEN RCB-2139)，在RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute-1640)10%FBS(胎牛血清)(＋)培養基(10ml或20ml)培養5日後回收，以PBS(磷酸緩衝生理食鹽水)洗淨2次，再懸浮於PBS(300μl)中。
1-2)對小鼠之免疫 對BALB/c小鼠(12週齡)，第1～5次之免疫係以約1週之間隔，將NOR-P1細胞(2×106 個)向腹腔內進行免疫。由第5次的免疫後約2週後，將NOR-P1細胞(5×106 個)向腹腔內免疫。第6次之免疫後約3週後將NOR-P1細胞(2×106 個)向腹腔內進行免疫。第8～10次係以約2週間隔將2×106 個之NOR-P1細胞向腹腔內進行免疫。第10次之約3週後(第11次)及之後3日後(第12次、最終免疫)係將5×106 個之NOR-P1細胞向腹腔內進行免疫。自最終免疫後3日後摘出脾臟細胞。
1-3)經免疫的小鼠之脾臟細胞之準備 摘出已免疫的小鼠的脾臟，磨碎而懸浮於RPMI1640 10%FBS(＋)培養基。將細胞懸浮液通過細胞過濾器(Cell strainer)(70μm、BD Falcon公司)後，以1500rpm於室溫離心5分鐘，丟棄上清液。添加Tris-NH4 Cl溶液(20mM Tris-HCl pH7.2、77.6mM NH4 Cl；20mL)，於室溫處理5分鐘。添加PBS(20mL)，以1500rpm於室溫離心5分鐘。丟棄上清液後，添加RPMI1640 FBS(＋)培養基(10ml)。
1-4)骨髓瘤細胞之準備 將P3U1細胞(小鼠骨髓瘤細胞株)在RPMI1640 FBS(＋)培養基培養5日後回收，再懸浮於RPMI1640 FBS(＋)培養基(20ml)。
1-5)細胞融合 使脾臟細胞與骨髓瘤細胞混合成5：1，以1500rpm於室溫離心5分鐘。以RPMI1640 FBS(-)培養基(10ml)洗淨2次後，離心分離(1500rpm、5分鐘)。充分鬆開獲得的沉澱劃份之細胞群後，一邊攪拌一邊歷經約1分鐘緩緩地添加聚乙二醇-1500(PEG-1500；1ml)。攪拌3分30秒後，於室溫靜置30秒。之後，對該細胞液歷經1分鐘添加RPMI培養基 10%Low IgG FBS(＋)(10ml)。將該細胞懸浮液離心分離(1500rpm、5分鐘)，緩慢地鬆開獲得的沉澱劃份之細胞後，緩慢地懸浮於HAT培養基(含10%Low IgG FBS、HAT Media Supplement、5%BriClone的RPMI1640培養基；200ml)中。將該懸浮液各分注200μl/孔於96孔培養用盤，於37℃、5% CO2 之培養箱中培養6日。
1-6)融合瘤之篩選・探針之準備 製作用於測定抗體之內化及免疫毒素活性之重組複合蛋白質DT3C。此DT3C係使白喉毒素(DT)之觸媒區域與鏈球菌蛋白質G之抗體結合區域進行基因工程地融合的蛋白質。DT3C係與抗體之Fc部分特異性結合，被攝入至細胞內時，藉由蛋白質合成阻礙而誘導細胞死亡。藉由使用此系統，可同時觀察抗體之內化及免疫毒素所致的殺細胞效果(Yamaguchi， M. et al.， Biochemical and Biophysical Research Communications 454(2014)600-603)。
1-7)利用DT3C的融合瘤之篩選 於96孔盤中添加4μg/ml之DT3C(25μl)，進一步添加步驟1-5所取得的融合瘤之培養上清液(25μl)，並於室溫溫育30分鐘。接種2×105 個/ml(RPMI培養基 10%Low IgG FBS(＋))之NOR-P1細胞(50μl)，於37℃ CO2 培養箱中培養3日。藉由培養後之顯微鏡觀察，使用陰性對照抗體之際的附著細胞數，將表示約25%以下之附著細胞數的孔判定為陽性。篩選出的殖株進行1～2次次選殖(subcloning)，建立單株的融合瘤細胞株8株。
6-2：融合瘤之產生的抗體之結合的抗原的鑑定 對於實施例6-1所調製的融合瘤之產生的抗體之中2個殖株218B1及218C7，進行抗原之鑑定。 2-1)使用經生物素標示的細胞表面蛋白質之218B1抗體及218C7抗體的免疫沉澱 去除2×106 個之NTERA-2細胞(人類睪丸癌細胞株、ATCC CRL-1973)之培養上清液，以PBS洗淨2次。將EZ-Link Sulfo-NHS-生物素(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)以0.1mg/ml之濃度懸浮於PBS。去除PBS後，添加生物素/PBS溶液，於振盪器上溫育30分鐘後，以100mM甘胺酸/PBS溶液(25ml)洗淨2次，之後，以PBS(10ml)洗淨1次。將洗淨後之細胞再懸浮於200μl之溶解緩衝液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH7.4、1%DDM、蛋白酶抑制劑、Complete EDTA free(Roche公司)1粒/50ml)中，於4℃處理30分鐘。離心分離(13000rpm、20分鐘、4℃)而調製細胞溶解液。將Protein G Sepharose(Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare公司))之緩衝液置換為溶解緩衝液，而將獲得的Protein G Sepharose/溶解緩衝液(50%漿液；30μl)添加於細胞溶解液中，於4℃旋轉30分鐘後，於4℃離心1分鐘，回收上清液。於此上清液中添加218 B1抗體或218C7抗體(約3μg)，並於4℃旋轉30分鐘後，添加Protein G Sepharose/溶解緩衝液(50%漿液；60μl)，於4℃旋轉1小時。以溶解緩衝液(1ml)將Protein G Sepharose洗淨6次後，再懸浮於1×SDS樣品緩衝液(BioRad公司)。於100℃處理懸浮液5分鐘後，回收溶液，作為SDS-PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)用之樣品。
2-2)SDS-PAGE及西方印漬術 將2-1)所調製的SDS-PAGE樣品，使用SuperSep Ace 5-20%(Wako公司)，在50mV堆疊30分鐘後，在200mV泳動1小時後，在12mV由膠體向膜印漬47分鐘。將膜以PBS-T(PBS(-)-0.02% Tween 20)洗淨後，進行1小時封阻。膜以PBS-T5分鐘洗淨3次後，使與鏈黴親和素-辣根過氧化物酶結合物(Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate)(GE Healthcare公司；以PBS-T稀釋2000倍而使用)反應1小時。將膜以PBS-T 5分鐘洗淨2次後，使用增強化學螢光(enhanced chemiluminecscence(ECL))法檢測目的之條帶。於使用了218B1抗體及218C7抗體任一者的情形，無論是否添加DTT，均檢測到分子量為18kDa的條帶。
2-3)細胞蛋白質之使用218B1抗體及218C7抗體的免疫沉澱產物之質量分析 回收2×107 個之NTERA-2細胞，以PBS洗淨2次。使用細胞刮刀將細胞回收，於1500rpm離心5分鐘。去除上清液後，再懸浮於2ml之溶解緩衝液中，於4℃處理30分鐘。離心分離(13000rpm、20分鐘、4℃)而調製細胞溶解液。將Protein G Sepharose/溶解緩衝液(50%漿液；180μl)加到細胞溶解液中，於4℃旋轉30分鐘後，於4℃離心1分鐘，回收上清液。於此上清液中添加218B1抗體(約9μg)，於4℃旋轉30分鐘後添加Protein G Sepharose/溶解緩衝液(50%漿液；180μl)，並於4℃旋轉1小時。以溶解緩衝液(1ml)將Protein G Sepharose洗淨6次後，再懸浮於1×SDS樣品緩衝液。於100℃處理懸浮液5分鐘後，回收溶液，作為用於SDS-PAGE的樣品。以與2-2)同樣之方法，進行SDS-PAGE，將泳動膠體進行CBB染色。自泳動膠體切出相當於18kDa的部分，供給於質量分析。質量分析的結果，清楚得知該膠體片包含密連蛋白-6。
2-4)FACS解析 由質量分析可預測218B1抗體及218C7抗體之抗原為密連蛋白-6，因而進行利用cDNA之基因導入的強制表現解析。FACS解析之結果，因於人類密連蛋白-6表現CHO-K1細胞，218B1抗體及218C7抗體顯示強陽性反應，顯示218B1抗體及218C7抗體之抗原為密連蛋白-6。 2-5)自融合瘤培養上清液之抗體之純化 將小鼠抗CLDN6抗體B1產生融合瘤(218B1)及小鼠抗CLDN6抗體C7產生融合瘤(218C7)，以含10%之胎牛血清、Ultra-Low IgG(Thermo Fisher Scientific)的Hybridoma-SFM(Thermo Fisher Scientific)培養。藉由離心將培養上清液回收，以0.45μm之過濾器(Corning公司製)過濾。於rProtein A親和性層析(4～6℃下)1階段步驟，自培養上清液純化抗體。rProtein A親和性層析純化後之緩衝液取代步驟係於4～6℃下實施。最初，將培養上清液施用於填充有以PBS平衡化的MabSelectSuRe(GE Healthcare Bioscience公司製)的管柱。培養液全部置入管柱後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。接著，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，收集抗體所含的劃份。將該劃份藉由透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行向PBS(-)的液體取代。最後，以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (分級分子量UF10K，Sartorius公司，4℃下)濃縮，將IgG濃度調製為1mg/mL以上。以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
實施例7：小鼠抗CLDN6抗體B1及C7之活體外評價 7-1：利用流動式細胞測量術的小鼠抗CLDN6抗體之結合能力評價 將實施例6所製作的小鼠抗CLDN6抗體之人類CLDN6及家族分子CLDN3、CLDN4、CLDN9結合性藉由流動式細胞測量術法而評價。將購自Origene公司的人類CLDN3/pCMV6-Entry、人類CLDN4/pCMV6-Entry、人類CLDN6/pCMV-Entry、人類CLDN9/pCMV6-Entry、或pCMV6-Entry，使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific)而暫時性導入293T細胞(Thermo Fisher Scientific HCL4517)中，於37℃、5%CO2 之條件下培養一晚後，調製細胞懸浮液。將經基因導入的293T細胞懸浮液離心，去除上清液後，以終濃度30μg/mL、10μg/mL、3.3μg/mL、1.1μg/mL添加小鼠抗CLDN6抗體(株編號為B1、C7)、或小鼠IgG1對照抗體(R&D Systems)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含5%胎牛血清(Hyclone)的杜氏磷酸鹽缓衝液(Dulbecco’s phosphate buffered saline) (Sigma-Aldrich)(以下，含有5%FBS的PBS)洗淨2次後，添加以含有5%FBS的PBS稀釋500倍的FLUORESCEIN-CONJUGATED GOAT IGG FRACTION TO MOUSE IGG(全分子)(MP BIOMEDICALS)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5%FBS的PBS洗淨2次後，以流式細胞儀(FC500；Beckman Coulter)進行檢測。資料解析係以FlowJo(TreeStar)進行。又，各基因導入之確認係將細胞以含有0.25%Tween20的PBS進行透過處理後使用小鼠抗FLAG抗體(Sigma-Aldrich)而進行。將結果示於圖40。於圖40之圖表中，縱軸為表示抗體結合量的FITC之螢光強度，橫軸表示抗體濃度。製作的小鼠抗CLDN6抗體係與人類CLDN6及人類CLDN9同程度地結合，與人類CLDN3、人類CLDN4則未結合。小鼠對照IgG1亦未與任一細胞結合。
7-2：抗體內化活性 小鼠抗CLDN6抗體B1及C7之內化活性係使用使結合了抑制蛋白質合成的毒素(皂草素)的抗小鼠IgG試藥Mab-ZAP(ADVANCED TARGETING SYSTEMS)而評價。於此評價，取決於小鼠抗CLDN6抗體之內化活性而Mab-ZAP被攝入細胞內，抑制蛋白質合成的皂草素被釋放至細胞內，而細胞增殖被抑制。 將人類CLDN6陽性細胞之為人類絨毛癌株的JEG-3(ATCC HTB-36)、人類CLDN6陽性細胞之為人類卵巢癌株的NIH：OVCAR-3 (ATCC HTB-161)、或人類CLDN6陰性細胞之為人類胰臟癌株的BxPC-3(ATCC CRL-1687)，以2x103 細胞/孔，接種於96孔細胞培養用微量盤，而於37℃、5% CO2 之條件下培養一晚。次日，將小鼠抗CLDN6抗體、或小鼠IgG1抗體(R＆D Systems)，以成為終濃度1nM的方式，添加與Mab-ZAP(終濃度：0.5nM)、或未結合毒素的AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch) (終濃度：0.5 nM)混合的混合溶液，於37℃、5% CO2之條件下培養5日。生存細胞數係以使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)的ATP活性之定量而測定。抗CLDN6抗體添加所致的細胞增殖抑制作用係以將未添加混合溶液孔之值設為100%的相對生存率而求得。將結果示於圖41。確認到小鼠抗CLDN6抗體(B1、C7)對人類CLDN6陽性細胞株JEG-3及NIH：OVCAR-3有細胞增殖抑制效果。另一方面，對於人類CLDN6陰性細胞株BxPC-3，未確認到細胞增殖抑制效果。又，小鼠IgG1抗體對任一細胞株皆未確認到細胞增殖抑制效果。此結果，茲認為製作的抗CLDN6抗體(B1、C7)具有內化活性，適合作為抗體-藥物結合物用之抗體。
實施例8：編碼小鼠抗CLDN6抗體B1及C7之可變區的cDNA之核苷酸序列之決定 8-1：編碼B1抗體之可變區的cDNA之核苷酸序列之決定 8-1-1：B1抗體產生融合瘤之總RNA之調製 為了增幅編碼B1抗體之可變區的cDNA，由B1抗體產生融合瘤，使用TRIzol Reagent(Ambion公司)而調製總RNA。 8-1-2：利用5’-RACE PCR的編碼B1抗體之輕鏈可變區的cDNA之增幅及序列之決定 編碼輕鏈可變區的cDNA之增幅係使用以實施例8-1-1調製的總RNA之約1μg與SMARTer RACE 5’/3’ 套組(Clontech公司)而實施。作為用於以PCR增幅編碼B1抗體之輕鏈基因之可變區的cDNA之引子，使用UPM(附屬於Universal Primer A Mix:SMARTer RACE 5’/3’套組)、及由周知之小鼠輕鏈之恆定區之序列所設計的引子。 將以5’-RACE PCR增幅的編碼輕鏈之可變區的cDNA，選殖至質體，接著實施編碼輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列之定序解析。 將經決定的編碼B1抗體之輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號18，將胺基酸序列示於序列識別號19。 8-1-3：利用5’-RACE PCR的編碼B1抗體之重鏈可變區的cDNA之增幅及序列之決定 編碼重鏈可變區的cDNA之增幅係使用實施例8-1-1所調製的總RNA之約1μg與SMARTer RACE 5’/3’ 套組(Clontech公司)而實施。使用UPM(附屬於Universal Primer A Mix：SMARTer RACE 5’/3’ 套組)、及自周知之小鼠重鏈之恆定區的序列所設計的引子，作為用於以PCR增幅編碼LB1抗體之重鏈基因之可變區的cDNA的引子。 將以5’-RACE PCR增幅的編碼重鏈之可變區的cDNA選殖於質體，接著實施編碼重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列之定序解析。 將經決定的編碼B1抗體重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號20，將胺基酸序列示於序列識別號21。
8-2：編碼C7抗體之可變區的cDNA之核苷酸序列之決定 以與實施例8-1同樣之方法實施。將經決定的編碼C7抗體輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號22，將胺基酸序列示於序列識別號23。將編碼重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列示於序列識別號24，將胺基酸序列示於序列識別號25。
實施例9：嵌合化抗CLDN6抗體chB1之製作 9-1：嵌合化抗CLDN6抗體chB1之表現載體之構築 9-1-1：嵌合化及人類化輕鏈表現載體pCMA-LK之構築 將質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)以限制酶XbaI及PmeI消化所獲得的約5.4kb之片段、與序列識別號26所示的包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA序列的DNA片段，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)進行結合，而製作pcDNA3.3/LK。藉由自pcDNA3.3/LK去除新黴素(neomycin)表現單元而構築pCMA-LK。 9-1-2：嵌合化及人類化IgG1LALA型重鏈表現載體pCMA-G1LALA之構築 將pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而移除輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA片段、及序列識別號27所示的包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1LALA恆定區的DNA序列的DNA片段，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)進行結合，而構築pCMA-G1LALA。 9-1-3：嵌合化chB1重鏈表現載體之構築 合成序列識別號33所示的chB1重鏈之核苷酸序列之核苷酸編號36至440所示的DNA片段(GENEART公司)。藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，於pCMA-G1LALA以限制酶BlpI切斷處插入合成的DNA片段而構築chB1重鏈表現載體。將chB1重鏈之胺基酸序列示於序列識別號32。 9-1-4：嵌合化chB1輕鏈表現載體之構築 合成序列識別號29所示的包含編碼chB1輕鏈的DNA序列的DNA片段(GENEART公司)。藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，將合成的DNA片段、與pCMA-LK以XbaI及PmeI消化而移除輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA片段結合，而構築chB1輕鏈表現載體。將chB1輕鏈之胺基酸序列示於序列識別號28。
9-2：嵌合化抗CLDN6抗體chB1之生產及純化 9-2-1：嵌合化抗體chB1之生產 FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係按照手冊進行繼代、培養。將對數增殖期之1.2×109 個FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING公司)，以 FreeStyle293 expression 培養基(Invitrogen公司)稀釋而調製2.0×106 個細胞/mL。於40mL之Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中添加0.24mg之重鏈表現載體與0.36mg之輕鏈表現載體及1.8mg之聚伸乙亞胺(Polyscience ＃24765)，並輕輕地攪拌，進一步放置5分鐘後，添加FreeStyle 293F細胞。於37℃、8%CO2 培養箱中以90rpm震盪培養4小時後，添加600mL之EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司)、18mL之GlutaMAX I(GIBCO公司)、及30mL之Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO公司)，於37℃、8%CO2 培養箱中，以90rpm震盪培養7日，將獲得的培養上清液以拋棄式膠囊過濾器(Disposable Capsule Filter)(Advantec ＃CCS-045-E1H)過濾。將取得的嵌合化抗CLDN6抗體命名為「chB1」。 9-2-2：嵌合化抗體chB1之純化 自實施例9-2-1所獲得的培養上清液，將抗體以rProtein A親和性層析之1階段步驟純化。將培養上清液施用於填充有以PBS平衡化的MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。接著，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)溶出，收集抗體所含的劃份。將該劃份藉由透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)進行向PBS(-)的緩衝液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF10K,Sartorius公司)將抗體濃縮，將IgG濃度調製為1mg/mL以上。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
實施例10：人類化抗CLDN6抗體之製作 10-1：抗CLDN6抗體之人類化體設計 10-1-1：嵌合化抗體chB1之可變區之分子模擬 chB1之可變區之分子模擬係利用作為同源性模擬之周知方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))。將登錄於對chB1之重鏈與輕鏈之可變區具有高序列同一性的蛋白質資料庫(Nuc.Acid Res.35,D301-D303(2007))的結構(PDB ID:1XIW)作為模板，使用市售之蛋白質立體結構解析程式BioLuminate(Schrodinger公司製)而進行。 10-1-2：人類化胺基酸序列之設計 chB1係藉由CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))而人類化。於Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))所規定的人類之gamma鏈亞群1及kappa鏈亞群1之共通序列(consensus sequence)係對於chB1之框架區域具有高同一性，因而各自選擇作為重鏈與輕鏈之接受體。應移入接受體上的供予體殘基係藉由參考Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))給予的基準等，分析三維模型而選擇。又，因CDRL3富含疏水性胺基酸，亦設計了於CDRL3導入變異的人類化輕鏈。
10-2：chB1重鏈之人類化 將所設計的3種之重鏈命名為hH1、hH2及hH3。將hH1之重鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號52。將編碼序列識別號52之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號53。將hH2之重鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號56。將編碼序列識別號56之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號57。將hH3之重鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號60。將編碼序列識別號60之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號61。
10-3：chB1輕鏈之人類化 將所設計的4種之輕鏈命名為hL1、hL2、hL3及hL4。將hL1之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號36。將編碼序列識別號36之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號37。將hL2之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號40。將編碼序列識別號40之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號41。將hL3之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號44。將編碼序列識別號44之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號45。將hL4之輕鏈全長胺基酸序列記載於序列識別號48。將編碼序列識別號48之胺基酸序列的核苷酸序列記載於序列識別號49。
10-4：藉由重鏈及輕鏈之組合的人類化抗體之設計 將包含hH1及hL1的抗體稱為「H1L1抗體」或「H1L1」。將包含hH2及hL2的抗體稱為「H2L2抗體」或「H2L2」。將包含hH1及hL3的抗體稱為「H1L3抗體」或「H1L3」。將包含hH2及hL4的抗體稱為「H2L4抗體」或「H2L4」。將包含hH3及hL3的抗體稱為「H3L3抗體」或「H3L3」。
10-5：人類化抗CLDN6抗體之製作 10-5-1：人類化重鏈表現載體之構築 10-5-1-1：hH1表現載體之構築 合成序列識別號53所示的hH1之核苷酸序列之核苷酸編號36至440所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例9-1-3同樣之方法，構築hH1表現載體。 10-5-1-2：hH2表現載體之構築 合成序列識別號57所示的hH2之核苷酸序列之核苷酸編號36至440所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例9-1-3同樣之方法，構築hH2表現載體。 10-5-1-3：hH3表現載體之構築 合成序列識別號61所示的hH2之核苷酸序列之核苷酸編號36至440所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例9-1-3同樣之方法，構築hH3表現載體。 10-5-2：人類化輕鏈表現載體之構築 10-5-2-1：hL1表現載體之構築 合成序列識別號37所示的hL1之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的DNA片段(GENEART公司)。藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，於pCMA-LK以限制酶BsiWI切斷處插入合成的DNA片段，而構築hL1表現載體。 10-5-2-2：hL2表現載體之構築 合成序列識別號41所示的hL2之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例10-5-2-1同樣之方法，構築hL2表現載體。 10-5-2-3：hL3表現載體之構築 合成序列識別號45所示的hL3之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例10-5-2-1同樣之方法，構築hL3表現載體。 10-5-2-4：hL4表現載體之構築 合成序列識別號49所示的hL4之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例10-5-2-1同樣之方法，構築hL4表現載體。 10-5-3：人類化抗體之調製 10-5-3-1：人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3之生產 以與實施例9-2-1同樣之方法生產。藉由對應實施例10-4所示的重鏈與輕鏈之組合的重鏈表現載體與輕鏈表現載體之組合，生產H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3。 10-5-3-2：人類化抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3之2步驟純化 將實施例10-5-3-1所獲得的培養上清液以rProtein A親和性層析與陶瓷羥磷灰石之2階段步驟進行純化。將培養上清液施用於填充有以PBS平衡化的MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量2倍以上之PBS將管柱洗淨。接著，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)將抗體溶出。抗體所含的劃份藉由透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)而進行向PBS的緩衝液取代，以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0之緩衝液稀釋5倍後，施用於以5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0之緩衝液平衡化的陶瓷羥磷灰石管柱(日本Bio-Rad、Bio-Scale CHT Type-1 Hydroxyapatite Column)。實施利用氯化鈉的線性濃度梯度溶出，收集抗體所含的劃份。將該劃份藉由透析(Thermo Scientific公司、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，進行向HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇、pH6.0)之緩衝液取代。以Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分級分子量UF10K，Sartorius公司)將抗體濃縮，將IgG濃度調製為50mg/mL。最後，以Minisart-Plus filter(Sartorius公司)過濾，作為純化樣品。
實施例11：利用流動式細胞測量術的人類化抗CLDN6抗體之結合能力評價 利用流動式細胞測量術法評價實施例10所製作的人類化抗CLDN6抗體之人類CLDN6及家族分子CLDN3、CLDN4、CLDN9結合性。以與實施例7-1同樣之手法，使用暫時性基因導入的293T細胞。於導入了人類CLDN6或人類CLDN9基因的細胞，以終濃度100nM、20nM、4nM、0.8nM添加人類化抗CLDN6抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3、或人類IgG1對照抗體(CALBIOCHEM)而懸浮，於4℃靜置30分鐘。於導入人類CLDN3、人類CLDN4基因、或空的載體的細胞，以終濃度100 nM添加人類化抗CLDN6抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3而懸浮，於4℃靜置30分鐘。以含有5%之胎牛血清(Hyclone)的杜氏磷酸鹽缓衝液 (Sigma-Aldrich)(以下，含有5%FBS的PBS)洗淨後，添加以含有5%FBS的PBS稀釋150倍的FITC AffiniPureF(ab’)2 Fragment Goat Anti-Human IgG(H＋L)(Jackson ImmunoResearch)而懸浮，於4℃靜置30分鐘。以含有5%FBS的PBS洗淨後，以流式細胞儀 (FC500；Beckman Coulter)進行檢測。資料解析係以FlowJo(TreeStar)進行，算出表示抗體之結合量的FITC之平均螢光強度(MFI)。將結果示於圖42。於圖42之圖表中，橫軸表示抗體濃度，縱軸表示MFI。製作的人類化抗CLDN6抗體係與人類CLDN6及人類CLDN9同程度地結合，與人類CLDN3、人類CLDN4並未結合。人類對照IgG1亦未與任一細胞結合。
實施例12：曲妥珠單抗突變體之製作 12-1：曲妥珠單抗-LALA之重鏈表現載體之構築 合成序列識別號74所示的曲妥珠單抗-LALA之重鏈之核苷酸序列之核苷酸編號36至434所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例9-1-3同樣之方法，構築表現載體。將曲妥珠單抗-LALA之重鏈之胺基酸序列示於序列識別號75。
12-2：曲妥珠單抗-LALA之輕鏈表現載體之構築 合成序列識別號72所示的曲妥珠單抗-LALA之輕鏈之核苷酸序列之核苷酸編號37至402所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例10-5-2-1同樣之方法，構築表現載體。將曲妥珠單抗-LALA之輕鏈之胺基酸序列示於序列識別號73。
12-3：曲妥珠單抗突變體之生產 以與實施例9-2-1同樣之方法生產。
12-4：曲妥珠單抗突變體之純化 自實施例12-3所獲得的培養上清液，以與實施例9-2-2同樣之方法，純化曲妥珠單抗-LALA。惟，不使用PBS(-)，而進行對50mM磷酸緩衝溶液(pH6.0)的緩衝液取代。
〔糖鏈重塑抗體之調製〕 實施例13：糖鏈變換1(T-SG)
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗之調製 使用共通操作C，將參考例3所調製的曲妥珠單抗溶液22mg/mL之(25mM組胺酸溶液(pH6.0)、5%山梨糖醇溶液)(45.5mL)，分二次進行對50mM磷酸緩衝液(pH6.0)的緩衝液交換。於獲得的28.1mg/mL之曲妥珠單抗溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0)(18mL)與28.0mg/mL之相同溶液(18mL)中，各自添加1.26mL、1.27mL之2.0mg/mL野生型EndoS溶液(PBS)，並於37℃溫育4小時。使用Experion電泳工作站(BIO-RAD製)確認反應的進度。反應結束後，按照以下之方法，進行利用親和性層析的純化及利用羥磷灰石管柱的純化。 (1)利用親和性層析的純化 純化裝置：AKTA pure150(GE Healthcare製) 管柱：HiTrap rProtein A FF(5mL)(GE Healthcare製) 流速：5mL/min(進料時為1.25mL/min) 將上述所獲得的反應液分複數次進行純化。管柱為2連結，對管柱的結合時係將反應液添加至管柱上部，並將結合緩衝液(20mM磷酸緩衝液(pH6.0))以1.25mL/min以2CV流入，再以5mL/min以5CV流入。中間洗淨時，流入15CV洗淨溶液(20mM磷酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 氯化鈉溶液)。溶出時，流入6CV溶出緩衝液(ImmunoPure IgG Eution buffer、PIERCE製)。溶出液立即以1M Tris緩衝液(pH9.0)中和。溶出中，對於經UV檢測(280nm)的劃份，使用微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及Experion電泳工作站(BIO-RAD製)而確認。使用共通操作C，將含目的物的劃份，進行向5mM磷酸緩衝液50mM2-啉基乙烷磺酸(MES)溶液(pH6.8)的緩衝液交換。
(2)利用羥磷灰石層析的純化 純化裝置：AKTA avant25(GE Healthcare製) 管柱：Bio-Scale Mini CHT Type I匣筒(5mL)(BIO-RAD製) 流速：5mL/min(進料時為1.25mL/min) 將2個管柱連結，將上述(1)所獲得的溶液分複數次進行純化。將溶液添加至管柱之上部，以1.25mL/min 2CV流入A液(5mM磷酸緩衝液50mM-啉基乙烷磺酸(MES)溶液(pH6.8))，進一步以5mL/min 3CV流入。之後，使用A液與B液(5mM磷酸緩衝液50mM-啉基乙烷磺酸(MES)溶液(pH6.8)、2M氯化鈉溶液)，進行溶出。溶出條件係A液：B液=100：0～0：100(15CV)。進一步，5CV流入洗淨溶液(500mM磷酸緩衝液(pH6.5))。 使用共通操作C，將包含目的物的劃份，進行緩衝液交換，獲得25.5mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(35mL)。
步驟2：曲妥珠單抗[SG-(N3 )2 ]2 之調製 於上述步驟1所獲得的23.9mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(3.37mL)中，添加實施例5步驟2所合成的化合物(12.9mg)之50mM磷酸緩衝液(pH6.0)溶液(0.258mL)、4.90mg/mL之EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(0.328mL)，並於30℃溫育4.5小時。進行2批以上之操作。使用Experion電泳工作站(BIO-RAD製)確認反應之進度。反應結束後，與上述步驟1同樣地進行利用親和性層析的純化及利用羥磷灰石層析的純化後，使用共通操作C，將包含目的物的劃份，向磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)進行緩衝液交換，獲得10.0mg/mL之曲妥珠單抗[SG-(N3 )2 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0))(15.5mL)。
實施例14：糖鏈變換2(T-MSG)
步驟1：曲妥珠單抗[MSG-N3 ]2 進行5批以下之操作。使用實施例13步驟1所獲得的化合物(20mg/mL，15.0mL)，使用實施例4步驟4所獲得的化合物(25.5mg)作為糖鏈供予體，於30℃溫育3小時，進行與實施例13步驟2同樣之操作。合併5批，獲得14.4mg/mL曲妥珠單抗[MSG-N3 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0))(93.5mL)。
實施例15：糖鏈變換3(T-MSG1)
步驟1：曲妥珠單抗[MSG1-N3 ]2 進行2批以下之操作。使用實施例13步驟1所獲得的化合物(25.5mL，7.8mL)，使用實施例3步驟4所獲得的化合物(25.5mg)作為糖鏈供予體，於30℃溫育3小時，進行與實施例13步驟2同樣之操作。合併2批，獲得10.6mg/mL曲妥珠單抗[MSG1-N3 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0))(31mL)。
實施例16：糖鏈變換4(CLDN6-MSG1(H1L1))
步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H1L1) 使用實施例10所調製的抗CLDN6抗體(H1L1)溶液ca.37.7mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH6.0)、5%山梨糖醇溶液)(2.5mL)，進行與實施例13步驟1同樣之操作，獲得19.2mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H1L1)溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(4.8mL)。
步驟2：抗CLDN6抗體(H1L1)-[MSG1-N3 ]2 使用上述步驟1所獲得的19.2mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6(H1L1)抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(4.8mL)，藉由進行與實施例15步驟1同樣之操作，獲得10.2mg/mL抗CLDN6抗體(H1L1)-[MSG1-N3 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0))(7.2mL)。
實施例17：糖鏈變換5(CLDN6-MSG1(H2L2)) 步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H2L2) 使用實施例10所調製的抗CLDN6抗體(H2L2)溶液ca.20mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH6.0)、5%山梨糖醇溶液)(6mL)，進行與實施例13步驟1同樣之操作，獲得21.84mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H2L2)溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(5.7mL)。
步驟2：抗CLDN6抗體(H2L2)-[MSG1-N3 ]2 使用上述步驟1所獲得的21.8mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6(H2L2)抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(5.7mL)，藉由進行與實施例15步驟1同樣之操作，獲得10.2mg/mL抗CLDN6抗體(H2L2)-[MSG1-N3 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0))(11.1mL)。
實施例18：糖鏈變換6(CLDN6-MSG1(H1L3)) 步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H1L3) 使用實施例10所調製的抗CLDN6抗體(H1L3)溶液ca.39.4mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH6.0)、5%山梨糖醇溶液)(3mL)，進行與實施例13步驟1同樣之操作，獲得39.2mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6抗體(H1L3)溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(4.5mL)。
步驟2：抗CLDN6抗體(H1L3)-[MSG1-N3 ]2 使用上述步驟1所獲得的39.2mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗CLDN6(H1L3)抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0)) (4.5mL)，藉由進行與實施例15步驟1同樣之操作，獲得9.83mg/mL抗CLDN6抗體(H1L3)-[MSG1-N3 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0))(7.2mL)。
實施例19：糖鏈變換7(CD98-MSG1) 步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗CD98抗體 使用參考例6所調製的抗CD98抗體溶液ca.20mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH6.0)、5%山梨糖醇溶液)(6mL)，進行與實施例13步驟1同樣之操作，獲得21.7mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗CD98抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(4.7mL)。
步驟2：抗CD98抗體-[MSG1-N3 ]2 使用上述步驟1所獲得的21.7mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗CD98抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(4.7mL)，藉由進行與實施例15步驟1同樣之操作，獲得10.1mg/mL之抗CD98抗體-[MSG1-N3 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0))(7.6mL)。
實施例20：糖鏈變換8(TROP2-MSG1) 步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗Trop2抗體 使用參考例5所調製的抗Trop2抗體溶液ca.20mg/mL(25mM組胺酸溶液(pH6.0)、5%山梨糖醇溶液)(6mL)，進行與實施例13步驟1同樣之操作，獲得21.69mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗Trop2抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(3.3mL)。
步驟2：抗Trop2抗體-[MSG1-N3 ]2 使用上述步驟1所獲得的21.69mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗Trop2抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(3.35mL)，藉由進行與實施例15步驟1同樣之操作，獲得10.3mg/mL之抗Trop2抗體-[MSG1-N3 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0))(6.4mL)。
實施例21：糖鏈變換9(LPS-MSG1) 步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗LPS抗體 使用參考例4所調製的抗LPS抗體溶液ca.17mg/mL (25mM組胺酸溶液(pH6.0)、5%山梨糖醇溶液)(6.6mL)，進行與實施例13步驟1同樣之操作，獲得21.03mg/mL之(Fucα1,6)GlcNAc-抗LPS抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(5.4mL)。
步驟2：抗LPS抗體-[MSG1-N3 ]2 使用上述步驟1所獲得的21.03mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-抗LPS抗體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(5.4mL)，藉由進行與實施例15步驟1同樣之操作，獲得9.89mg/mL之抗LPS抗體-[MSG1-N3 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)) (7.9mL)。
實施例22：糖鏈變換10(曲妥珠單抗突變體-MSG1) 步驟1：(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗突變體 使用實施例12所調整的曲妥珠單抗突變體溶液ca.22.3mg/ml(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(2.7ml)，進行與實施例13步驟1同樣之操作，獲得6.1mg/ml之(Fucα1,6) GlcNAc-曲妥珠單抗突變體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(6.1mL)。
步驟2：曲妥珠單抗突變體-[MSG1-N3 ]2 使用上述步驟1所獲得的6.1mg/ml(Fucα1,6)GlcNAc-曲妥珠單抗突變體溶液(50mM磷酸緩衝液(pH6.0))(6.1ml)，藉由進行與實施例15步驟1同樣之操作，獲得10.2mg/ml曲妥珠單抗突變體-[MSG1-N3 ]2 溶液(磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0))(3.7ml)。
〔ADC之合成〕 實施例23、24、52記載之ADC1、2、5係如下述之反應式所示，藉由將實施例14之步驟1所獲得的抗體與藥物連接子結合(conjugation)而合成。式中，R係依各實施例所使用的藥物連接子而不同。
實施例23：ADC1
(實施例23步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例14步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、包含實施例2-4步驟12所獲得的化合物(6-13)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應2日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.0mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.33mg/mL，抗體產量：7.97mg(80%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例24：ADC2
(實施例24步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例14步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(9.88mg/mL，0.500mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.459mL)、包含實施例2-3步驟10所獲得的化合物(5-11)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0408mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應1日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.00mL。使用共通操作A，將此溶液濃縮，獲得具有目的之化合物的溶液0.420mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：7.27mg/mL，抗體產量：3.54mg(72%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例25、26記載之ADC3、4係如下述之反應式所示，藉由將實施例13步驟2所獲得的抗體與藥物連接子結合而合成。式中，R係依各實施例所使用的藥物連接子而不同。
實施例25：ADC3
(實施例25步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例13步驟2所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.835mL)、含實施例2-2步驟12所獲得的化合物(4-12)10mM的二甲基亞碸溶液(0.165mL；相對於抗體1分子為24當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應48小時。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液4.50mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.66mg/mL，抗體產量：7.48mg(75%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.8
實施例26：ADC4
(實施例26步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例13步驟2所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.835mL)、含實施例2-4步驟12所獲得的化合物(6-13)10mM的二甲基亞碸溶液(0.165mL；相對於抗體1分子為24當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應2日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液10.5mL。 特性評價：使用共通操作E、F，獲得下述之特性值。 抗體濃度：0.73mg/mL，抗體產量：7.70mg(77%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：3.8
實施例27、28、29、53～56記載之ADC5～7、16～19係如下述之反應式所示，藉由將實施例15步驟1所獲得的抗體與藥物連接子結合而合成。式中，R基係依各實施例所使用的藥物連接子而不同。
實施例27：ADC5
(實施例27步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。) 步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例15步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含實施例2-4步驟12所獲得的化合物(6-13) 10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應2日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.0mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.46mg/mL，抗體產量：8.76mg(88%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例28：ADC6 (實施例28步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例15步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，5.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(4.59mL)、含實施例2-2步驟12所獲得的化合物(4-12)10mM的二甲基亞碸溶液(0.413mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應48小時。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液30.0mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.30mg/mL，抗體產量：38.9mg(78%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例29：ADC7
(實施例29步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。) 步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例15步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含實施例2-1步驟13所獲得的化合物(3-14)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應2日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.00mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.41mg/mL，抗體產量：8.45mg(85%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例30：ADC8
(實施例30步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例16步驟2所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.2mg/mL，2.50mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(2.29mL)、含實施例2-1步驟13所獲得的化合物(3-14)10mM的二甲基亞碸溶液(0.206mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應48小時。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液14.5mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.54mg/mL，抗體產量：22.3mg(89%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例31：ADC9
(實施例31步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例17步驟2所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(9.96mg/mL，2.50mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(2.29mL)、含實施例2-1步驟13所獲得的化合物(3-14) 10mM的二甲基亞碸溶液(0.206mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應48小時。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液14.5mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.52mg/mL，抗體產量：22.0mg(88%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例32：ADC10
(實施例32步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例18步驟2所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(9.83mg/mL，2.50mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(2.29mL)、含實施例2-1步驟13所獲得的化合物(3-14)10mM的二甲基亞碸溶液(0.206mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應48小時。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液14.5mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.45mg/mL，抗體產量：21.0mg(84%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例33：ADC11
(實施例33步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例20步驟2所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含實施例2-1步驟13所獲得的化合物(3-14)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應2日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.00mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.47mg/mL，抗體產量：8.8mg(88%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例34：ADC12
(實施例34步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例19步驟2所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.2mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含實施例2-1步驟13所獲得的化合物(3-14)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應2日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.00mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.36mg/mL，抗體產量：8.19mg(82%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例35：ADC13
(實施例35步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例21步驟2所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(9.89mg/mL，0.40mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.367mL)、含實施例2-1步驟13所獲得的化合物(3-14)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0328mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應2日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液2.50mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.16mg/mL，抗體產量：2.89mg(72%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例36：ADC14
(實施例36步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。) 步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例22步驟2所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.2mg/mL，0.40mL)中，於室溫添加磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(0.40mL)1,2-丙二醇(0.767mL)、二甲基甲醯胺(0.20mL)、含實施例2-1步驟13所獲得的化合物(3-14)10mM的二甲基甲醯胺溶液(0.033mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應48小時。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液7.00mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：0.39mg/mL，抗體產量：1.38mg(35%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例37：抗體-藥物結合物之細胞增殖抑制評價(1) 將為HER2抗原陽性細胞之人類胃癌株的NCI-N87(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)；ATCC CRL-5822)，以含10%之胎牛血清(Hyclone)的RPMI1640 培養基(Thermo Fisher Scientific；以下，RPMI培養基)培養。HER2抗原陰性細胞之MDA-MB-468(ATCC HTB-132)係以含10%之胎牛血清(Hyclone)的Leibovitz’s L-15 培養基(Thermo Fisher Scientific；以下，Leibovitz’s培養基)培養。各自將NCI-N87以RPMI培養基、MDA-MB-468細胞以Leibovitz’s培養基調製成2.5×104 個細胞/mL，各添加80μL至 96孔細胞培養用微量盤。添加細胞後，NCI-N87係於37℃、5%CO2 下培養一晩，MDA-MB-468係設定於37℃、CO2 濃度下培養一晚。 次日，將以RPMI培養基或Leibovitz’s培養基稀釋為100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM的抗HER2抗體-藥物結合物各添加20μL於微量盤。於未添加抗體‐藥物結合物的孔中各添加20μL之RPMI培養基或Leibovitz’s培養基。NCI-N87係設定於37℃、5%CO2 下培養6日、MDA-MB-468係設定於37℃、CO2 濃度設定下培養6日。培養後，將微量盤自培養箱取出而於室溫靜置30分鐘。添加與培養液等量之CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)而以平盤混合器攪拌。於室溫靜置10分鐘後，以平盤讀數器(PerkinElmer)計測發光量。 活細胞率係以下式算出。 活細胞率(%)=a÷b×100 a：被驗物質添加孔之發光量的平均值 b：培養基添加孔之發光量的平均值 IC50 值係以下式算出。 IC50 (nM) =antilog((50-d)×(LOG10 (b)-LOG10 (a))÷(d-c)+LOG10 (b)) a：被驗物質之濃度a b：被驗物質之濃度b c：添加濃度a之被驗物質時之活細胞率 d：添加濃度b之被驗物質時之活細胞率 a、b係包夾活細胞率50%的2點而a＞b。 對於NCI-N87細胞，抗體-藥物結合物ADC5、ADC4、ADC16顯示IC50 ＜0.001(nM)之抗細胞效果。抗體-藥物結合物ADC2、ADC15、ADC3、ADC6、ADC17、ADC18係顯示0.001≦IC50 ＜0.1 (nM)之抗細胞效果。又，任一者之抗體-藥物結合物皆對於MDA-MB-468細胞未顯示抗細胞效果(IC50 ＞0.1(nM))。
實施例38：抗體-藥物結合物之細胞增殖抑制評價(2) 為HER2抗原陽性細胞之人類胃癌株的NCI-N87(ATCC CRL-5822)係以含10%之胎牛血清(Hyclone)的RPMI1640 培養基(Thermo Fisher Scientific；以下，RPMI培養基)培養。為HER2抗原陽性細胞之人類乳癌株的JIMT-1(德國微生物和細胞培養物收藏有限公司；DSMZ ACC 589)係以含10%之胎牛血清(Hyclone)的杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(Thermo Fisher Scientific；以下，DMEM培養基)培養。將NCI-N87以RPMI培養基調製成5.0×104 個細胞/mL，將JIMT-1細胞以DMEM培養基調製成1.3×104 個細胞/mL，各添加80μL於 96孔細胞培養用微量盤，於37℃、5%CO2 下培養一晚。 次日，將以RPMI培養基或以DMEM培養基稀釋成400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0.13nM、0.026nM、0.0051nM、0.0010 nM的抗HER2抗體-藥物結合物ADC7、或抗LPS抗體-藥物結合ADC13各添加20μL至微量盤。於未添加抗體‐藥物結合物的孔中各添加20μL之RPMI培養基或DMEM培養基。於37℃、5%CO2 下培養6日。培養後，將微量盤自培養箱取出而於室溫靜置30分鐘。添加與培養液等量之CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)而以平盤混合器攪拌。於室溫靜置10分鐘後以平盤讀數器 (PerkinElmer)計測發光量。使用與實施例37相同的式子，算出活細胞率。 對於NCI-N87、JIMT-1兩細胞，抗HER2抗體-藥物結合物ADC7係顯示0.001＜IC50＜0.1(nM)之抗細胞效果。另一方面，抗LPS抗體-藥物結合物ADC13係對任一者之細胞皆未顯示抗細胞效果 (IC50 ＞0.1(nM))。
實施例39：抗體-藥物結合物之細胞增殖抑制評價(3) 為CLDN6抗原陽性細胞之人類卵巢癌株的OV-90 (ATCC CRL-11732)係以含15%之胎牛血清(Hyclone)的培養基199(Thermo Fisher Scientific)及MCDB 105 培養基(Sigma-Aldrich)之1對1混合培養基(以下，培養基)進行培養。將OV-90細胞以培養基調製成1.9×104 個細胞/mL，添加80μL於96孔細胞培養用微量盤，並於37℃、5%CO2 下培養一晚。 次日，將以培養基稀釋為50nM、10nM、2.0nM、400pM、80pM、16pM、3.2pM、0.64pM、0.13pM的抗CLDN6抗體-藥物結合物ADC8、ADC9、ADC10各添加20μL於微量盤。於未添加抗體‐藥物結合物的孔中各添加20μL之培養基。於37℃、5%CO2 下培養6日。培養後，將微量盤自培養箱取出而於室溫靜置30分鐘。添加與培養液等量之CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)而以平盤混合器攪拌。於室溫靜置10分鐘後，以平盤讀數器(PerkinElmer)計測發光量。使用與實施例37相同的式子，算出活細胞率。 對於OV-90細胞，抗CLDN6抗體-藥物結合物ADC8、ADC9、ADC10係顯示0.001＜IC50 ＜0.1(nM)之抗細胞效果。
實施例40：抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(1) 小鼠：實驗使用前於SPF條件下馴化4-5週齡之雌BALB/c裸鼠(日本CHARLES RIVER) 4-7日。於小鼠餵飼經滅菌的固體飼料(FR-2， Funabashi Farms Co., Ltd)，給予經滅菌的自來水(添加5-15 ppm次氯酸鈉溶液而調製)。 測定・計算式：於全部的研究中，腫瘤之長徑及短徑以電子式數位卡尺(CD-15CX， Mitutoyo Corp.)於一週間測定2-3次，計算腫瘤體積(mm3 )。計算式係如以下所示。 腫瘤體積(mm3 )=長徑(mm) × [短徑(mm)]2 × 1/2 抗體-藥物結合物及抗體係全部以10 mM-乙酸鹽緩衝液(Acetate Buffer)， 5% 山梨糖醇， pH5.5(Nacalai Tesque股份有限公司；ABS緩衝液)稀釋，尾靜脈內投予10mL/kg之液量。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將NCI-N87細胞(ATCC CRL-5822)懸浮於生理食鹽水(大塚製藥工場股份有限公司)，將1×107 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第7日實施隨機分組。於第7日以0.3mg/kg之用量將抗HER2抗體-藥物結合物ADC2進行尾靜脈內投予，於第7日以1mg/kg之用量將ADC1進行尾靜脈內投予。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖4。抗HER2抗體-藥物結合物ADC2、ADC1係觀察到伴隨腫瘤退縮的強抗腫瘤效果。於投予任一者之抗HER2抗體-藥物結合物的小鼠皆未觀察到體重減少。 於與以下之抗腫瘤試驗有關的評價例，未特別記載的情形，以本評價例所使用的手法實施試驗。
實施例41：抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(2) 將NCI-N87細胞(ATCC CRL-5822)懸浮於杜氏磷酸鹽缓衝液(Sigma-Aldrich)，將1×107 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第4日實施隨機分組。將抗HER2抗體-藥物結合物ADC7、抗HER2抗體曲妥珠單抗(參考例3)、或抗LPS抗體-藥物結合物ADC13，於第4日全部以0.33mg/kg之用量進行尾靜脈內投予。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖5。抗HER2抗體-藥物結合物ADC7係觀察到伴隨腫瘤之退縮的強抗腫瘤效果。另一方面，於抗HER2抗體曲妥珠單抗、抗LPS抗體-藥物結合物ADC13，未抑制腫瘤之增殖。又，未觀察到抗體-藥物結合物ADC7、ADC13、或抗HER2抗體投予所致的小鼠之體重減少。
實施例42：抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(3) 將KPL-4細胞(川崎醫科大學・紅林淳一、British Journal of Cancer,(1999)79(5/6). 707-717)懸浮於杜氏磷酸鹽缓衝液(Sigma-Aldrich)，將1.5×107 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第14日實施隨機分組。將抗HER2抗體-藥物結合物ADC7、抗LPS抗體-藥物結合物ADC13、或曲妥珠單抗tesirine(參考例1)，於第14日以0.4mg/kg之用量進行尾靜脈內投予。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖6。抗HER2抗體-藥物結合物ADC7觀察到伴隨腫瘤之退縮的強抗腫瘤效果。另一方面，ADC13、曲妥珠單抗 tesirine未觀察到腫瘤之退縮。又，未觀察到ADC7、曲妥珠單抗 tesirine投予所致的小鼠體重減少。
實施例43：抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(4) 將JIMT-1細胞(DSMZ ACC 589)懸浮於生理食鹽水(大塚製藥工場股份有限公司)，將5×106 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第10日實施隨機分組。於第10日以0.4mg/kg之用量尾靜脈內投予抗HER2抗體-藥物結合物ADC7、或曲妥珠單抗tesirine(參考例1)。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖7。抗HER2抗體-藥物結合物ADC7觀察到伴隨腫瘤之退縮的強抗腫瘤效果。另一方面，曲妥珠單抗tesirine雖觀察到抗腫瘤效果，但未觀察到腫瘤的退縮。又，未觀察到ADC7、曲妥珠單抗tesirine投予所致的小鼠體重減少。
實施例44：抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(5) 將OV-90細胞(ATCC CRL-11732)懸浮於基質膠(matrigel)(CORNING)，將2.5×106 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第15日實施隨機分組。於第15日以0.33mg/kg之用量尾靜脈內投予抗CLDN6抗體-藥物結合物ADC8、或抗CLDN6抗體(H1L1)tesirine。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖8。抗CLDN6抗體-藥物結合物ADC8觀察到伴隨腫瘤之退縮的強抗腫瘤效果。另一方面，於抗CLDN6抗體(H1L1)tesirine，未觀察到腫瘤的退縮。又，未觀察到ADC8、H1L1 tesirine投予所致的小鼠之體重減少。
實施例45：抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(6) 將NIH：OVCAR-3細胞(ATCC HTB-161)懸浮於基質膠(CORNING)，將1×107 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第25日實施隨機分組。於第25日以0.33mg/kg之用量尾靜脈內投予抗CLDN6抗體-藥物結合物ADC8、或抗CLDN6抗體(H1L1)- tesirine。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖9。抗CLDN6抗體-藥物結合物ADC8觀察到伴隨腫瘤之退縮的強抗腫瘤效果。另一方面，於H1L1- tesirine，雖觀察到抗腫瘤效果，但未觀察到腫瘤之退縮。又，未觀察到ADC8、H1L1- tesirine投予所致的小鼠之體重減少。
實施例46：抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(7) 將FaDu細胞(ATCC HTB-43)懸浮於生理食鹽水(大塚製藥工場股份有限公司)，將3×106 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第10日實施隨機分組。於第10日以0.4mg/kg之用量尾靜脈內投予抗TROP2抗體-藥物結合物ADC11、或抗LPS抗體-藥物結合物ADC13。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖10。抗TROP2抗體-藥物結合物ADC11係觀察到伴隨腫瘤之退縮的強抗腫瘤效果。另一方面，抗LPS抗體-藥物結合物ADC13未抑制腫瘤之增殖。又，未觀察到ADC11、ADC13投予所致的小鼠之體重減少。
實施例47：抗HER2抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(8) 使用與實施例40同樣之實驗動物及手法，測定抗HER2抗體-藥物結合物之抗腫瘤的抗腫瘤效果。 將KPL-4細胞(川崎醫科大學・紅林淳一)懸浮於杜氏磷酸鹽缓衝液(Sigma-Aldrich)，將1.5×107 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第14日實施隨機分組。於第14日以0.33mg/kg之用量尾靜脈內投予抗HER2抗體-藥物結合物ADC7、或抗HER2抗體-藥物結合物ADC14。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖47。ADC7與ADC14係任一者皆以0.33mg/kg投予，顯示同等之抗腫瘤活性。又，未觀察到ADC7、ADC14投予所致的小鼠之體重減少。
實施例48：抗HER2抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(9) 將JIMT-1細胞(DSMZ ACC 589)懸浮於生理食鹽水(大塚製藥工場股份有限公司)，將5×106 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第11日實施隨機分組。於第11日以0.4mg/kg或0.2mg/kg之用量尾靜脈內投予ADC14。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖48。ADC14觀察到於0.4mg/kg投予時伴隨腫瘤之退縮的強抗腫瘤效果。又，於任一者之投予用量，皆未觀察到ADC14投予所致的小鼠之體重減少。
實施例49：抗HER2抗體-藥物結合物之抗腫瘤試驗(3) 將CFPAC-1細胞(ATCC CRL-1918)懸浮於生理食鹽水(大塚製藥工場股份有限公司)，將5×106 個細胞皮下移植至雌裸鼠之右體側部(第0日)，於第10日實施隨機分組。於第10日以0.4mg/kg之用量尾靜脈內投予抗HER2抗體-藥物結合物ADC7、ADC14或抗LPS抗體-藥物結合物ADC13。又，作為對照組(媒劑組)，同樣地投予ABS緩衝液。 將結果示於圖49。於投予ADC7與ADC14任一者的小鼠，觀察到伴隨腫瘤之退縮的強抗腫瘤效果。又，未觀察到ADC7與ADC14、或ADC13投予所致的小鼠之體重減少。
〔藥物D之合成〕 實施例50：藥物1 按照下述之流程圖而合成自ADC7～ADC1之游離藥物(藥物1)。
步驟1：(2-{[(6S)-6-({[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}苯基)胺甲酸 丙-2-烯-1-基酯 (7-1) 將實施例1-1步驟5所獲得的化合物(1-6)(4.59g，8.15mmol)與實施例2-1步驟9同樣地進行反應，獲得目的物(7-1)(4.86g，92%)。 MS(APCI、ESI)m/z:647(M+H)+
步驟2： (2-{[(6S)-6-(羥基甲基)-5-氮雜螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}苯基)胺甲酸丙-2-烯-1-基酯 (7-2) 將上述步驟1所獲得的化合物(7-1)(4.86g，7.51mmol)與實施例1-1步驟7同樣地進行反應，獲得目的物(7-2)(3.42g，86%)。 MS(APCI、ESI)m/z:533(M+H)+
步驟3： (11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-5’-側氧基-8’-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-甲酸 丙-2-烯-1-基酯(7-3) 將上述步驟2所獲得的化合物(7-2)(6.68g，12.5mmol)與實施例1-1步驟8同樣地進行反應，獲得目的物(7-3)(6.44g，97%)。 MS(APCI、ESI)m/z:531(M+H)+
步驟4： (11a’S)-11’-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-7’-甲氧基-5’-側氧基-8’-{[三(丙烷-2-基)矽基]氧基}-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-甲酸 丙-2-烯-1-基酯(7-4) 將於上述步驟3所獲得的化合物(7-3)(3.24g，6.10mmol)與實施例1-1步驟9同樣地進行反應，獲得目的物(7-4)(3.86g，98%)。 MS(APCI、ESI)m/z:645(M+H)+
步驟5： (11a’S)-11’-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-8’-羥基-7’-甲氧基-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-甲酸 丙-2-烯-1-基酯(7-5) 將上述步驟4所獲得的化合物(7-4)(4.49g，6.96mmol)與實施例1-1步驟10同樣地進行反應，獲得目的物(7-5)(3.24g，95%)。 MS(APCI、ESI)m/z:489(M+H)+
步驟6： (11a’S)-11’-{[三級丁基(二甲基)矽基]氧基}-7’-甲氧基-8’-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)戊基]氧基}-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-甲酸 丙-2-烯-1-基酯(7-6) 將上述步驟5所獲得的化合物(7-5)(0.080g，0.164mmol)與實施例2-1步驟10同樣地進行反應，獲得目的物(7-6)(0.160g，98%)。 MS(APCI、ESI)m/z:993(M+H)+
步驟7： (11a’S)-11’-羥基-7’-甲氧基-8’-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基}氧基)戊基]氧基}-5’-側氧基-11’,11a’-二氫-1’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-10’(5’H)-甲酸 丙-2-烯-1-基酯(7-7) 將上述步驟6所獲得的化合物(7-6)(160mg，0.161mmol)與實施例2-1步驟11同樣地進行反應，獲得目的物(7-7)(141mg，定量的)。 MS(APCI、ESI)m/z:879(M+H)+
步驟8：(11a’S)-7’-甲氧基-8’-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-側氧基-5,10,11,11a-四氫-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯-8-基]氧基}戊基)氧基]-1’,11a’-二氫-5’H-螺[環丙烷-1,2’-吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮呯]-5’-酮(7-8) 將上述步驟7所獲得的化合物(7-7)(141mg，0.161mmol)與實施例2-1步驟12同樣地進行反應，獲得目的物(7-8：藥物1)(109.8mg，99%)。1 H-NMR(DMSO-D6 )δ:7.92-7.91(1H,m),7.45 (1H,s),7.39-7.37(2H,m),7.33(1H,s),7.29(1H,s),6.92-6.89(2H,m),6.85(1H,s),6.56-6.54(1H,m),6.31(1H,s),4.19-4.12(2H,m),4.05-3.99(1H,m),3.95-3.93(2H,m),3.82-3.79 (4H,m),3.76(3H,s),3.66(3H,s),3.52-3.46(3H,m),3.30-3.21 (2H,m),2.78-2.74(1H,m),2.45-2.42(1H,m),2.06-2.05 (1H,m),1.89-1.82(4H,m),1.60-1.58(2H,m),0.80-0.63 (4H,m). MS(APCI、ESI)m/z:693(M+H)+
實施例51：藥物1之細胞增殖抑制評價(4) 將為人類乳癌株的KPL-4細胞(川崎醫科大學・紅林淳一、British Journal of Cancer, (1999)79(5/6). 707-717)，以含10%之胎牛血清(Hyclone)的RPMI1640 培養基 (Thermo Fisher Scientific;以下，RPMI培養基)調製成6.25×103 個細胞/mL，各添加80μＬ於96孔細胞培養用微量盤。添加細胞後，於37℃、5%CO2 下培養一晚。 次日，各添加20μＬ以RPMI培養基稀釋為100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM、6.4pM、1.3pM、0.26pM的藥物1於微量盤。於未添加抗體‐藥物結合物的孔中各添加20μＬ之RPMI培養基。KPL-4於37℃、5%CO2 下培養6日。培養後，將微量盤自培養箱取出而於室溫靜置30分鐘。添加與培養液等量之CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)而以平盤混合器攪拌。於室溫靜置10分鐘後，以平盤讀數器 (PerkinElmer)計測發光量。使用與實施例37相同的式子，算出活細胞率。 對於KPL-4細胞，藥物1顯示0.01＜IC50 ＜0.02 (nM)之抗細胞效果。
實施例52-1：藥物連接子5
步驟1：化合物(8-1) 將實施例2-3步驟9所獲得的化合物(5-10)(0.100g，0.105mmol)與氮二苯并環辛炔酸(azadibenzocyclooctyne acid)(0.0351g，0.105mmol)，與實施例2-3步驟10同樣地進行反應，獲得目的物(8-1)(0.0702g，53%)。 MS(APCI、ESI)m/z:1265(M+H)+ .
實施例52-2：ADC15
(實施例52-2步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例14步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(9.88mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含實施例52-1步驟1所獲得的化合物(8-1)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應1日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液10.5mL。使用共通操作A將此溶液濃縮，而獲得具有目的化合物的溶液0.850mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：8.90mg/mL，抗體產量：7.56mg(77%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例53-1：藥物連接子6
步驟1：化合物(9-1) 將5-胺基吉草酸(0.436g，3.72mmol)溶解於N,N-二甲基甲醯胺(10mL)，於室溫添加1-{[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(1.36g，3.38mmol)、三乙基胺(0.937mL，6.76mmol)，於室溫攪拌1.5小時。於反應溶液中添加1N鹽酸，以氯仿萃取，獲得的有機層以水、飽和食鹽水洗淨後，以硫酸鎂乾燥。進行減壓餾除，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[氯仿～氯仿：甲醇：水=7：3：1(v/v/v)之分配有機層]純化，獲得呈固體之目的物(9-1)之N,N-二甲基甲醯胺加成物(0.730g，45%)。 MS(APCI、ESI)m/z:405(M+H)+
步驟2：化合物(9-2) 將於上述步驟1所獲得的化合物(9-1)(0.0176g，0.0368mmol)與實施例2-1步驟13同樣地進行反應，獲得目的物(9-2)(0.00880g，18%)。 MS(APCI、ESI)m/z：1339(M＋H)
實施例53-2：ADC16
(實施例53-2步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例15步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含實施例53-1步驟2所獲得的化合物(9-2)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應2日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.0mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.53mg/mL，抗體產量：9.17mg(92%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例54-1：藥物連接子7
步驟1：化合物(10-2) 於起始物質(10-1)(3.00g，7.78mmol，東京化成工業股份有限公司)之N,N-二甲基甲醯胺(10mL)溶液中，於室溫添加1,8-二氮雙環[5.4.0]-7-十一烯(1.16mL，7.78mL)，於室溫攪拌2小時後，於室溫添加1-{[4-(11,12-二脫氫二苯并[b,f]吖-5(6H)-基)-4-側氧基丁醯基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮(1.10g，2.72mmol)、三乙基胺(1.94mL，14.0mmol)。將反應溶液進行減壓餾除後，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[氯仿：甲醇=100：0(v/v)～氯仿：甲醇=90：10(v/v)]純化，獲得目的物(10-2)(0.410g，12%)。 MS(APCI、ESI)m/z:451(M+H)+
步驟2：化合物(10-3) 將上述步驟1所獲得的化合物(10-2)(0.050g，0.0499mmol)與實施例2-1步驟13同樣地進行反應，獲得目的物(10-3)(0.0590g，82%)。 MS(APCI、ESI)m/z:1434(M+H)+
實施例54-2：ADC17
(實施例54-2步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例15步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含實施例54-1步驟2所獲得的化合物(10-3)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應48小時。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.0mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.63mg/mL，抗體產量：9.80mg(98%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.8
實施例55-1：藥物連接子8
步驟1：化合物(11-2) 將實施例2-2步驟11所獲得的化合物(4-11)(0.0500g，0.0499mmol)、起始物質(11-1)(0.050g，0.0499mmol，由Alfa Aesar販售)、三乙基胺(0.00830mL，0.0599mmol)之二氯甲烷(3mL)溶液於室溫攪拌一晚。進行減壓餾除後，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[氯仿：甲醇=100：0(v/v)～氯仿：甲醇=90：10(v/v)]純化，獲得目的物(11-2)(0.0490g，64%)。 MS(APCI、ESI)m/z：1536(M＋H)＋
實施例55-2：ADC18
(實施例55-2步驟1所獲得的化合物係如上述式所示，具有三唑環之幾何異構物，獲得的ADC係將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例15步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含實施例55-1步驟1所獲得的化合物(11-2)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，於室溫使反應48小時。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.0mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.72mg/mL，抗體產量：10.3mg(定量的)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.9
實施例56-1：藥物連接子9
步驟1：化合物(12-2) 於11,12-二去氫-5,6-二氫二苯并[a,e][8]輪烯-5-基4-硝基苯基 胺甲酸酯(12-1)(0.437g,1.14mmol)，N,N-二異丙基乙基胺(0.198mL,1.14mmol)之N,N-二甲基甲醯胺(6mL)溶液中，於室溫添加甘胺醯甘胺酸(0.150g,1.14mmol)、水(3mL)，並於室溫攪拌一晚。進行減壓餾除，將獲得的殘渣以矽膠管柱層析[氯仿：CMW=100:0(v/v)～0:100(v/v)]純化，獲得目的物(12-2)(0.324g，75%)。 MS(APCI、ESI)m/z:378(M+H)+
步驟2：化合物(8-3) 將上述步驟1所獲得的化合物(12-2)(0.0306g, 0.0305mmol)與實施例2-2步驟11所獲得的化合物(4-11)，與實施例2-1步驟13同樣地進行反應，獲得目的物(12-3)(0.0361g, 87%)。 MS(APCI、ESI)m/z:1362(M+H)+
實施例56-2：ADC19
(於實施例56-2步驟1所獲得的化合物，如上述式所示具有三唑環之幾何異構性結構，將上述R所示的包含2種類之結構的藥物連接子混合而保持。)
步驟1：抗體與藥物連接子之結合 於實施例15步驟1所獲得的抗體之磷酸緩衝生理食鹽水(pH6.0)溶液(10.0mg/mL，1.00mL)中，於室溫添加1,2-丙二醇(0.917mL)、含實施例56-1步驟2所獲得的化合物(12-3)10mM的二甲基亞碸溶液(0.0825mL；相對於抗體1分子為12當量)，使用試管旋轉器(MTR-103，AS ONE股份有限公司)，使於室溫反應3日。 純化操作：使用共通操作D將上述溶液進行純化，獲得具有目的之化合物的溶液6.00mL。 特性評價：使用共通操作E、F而獲得下述之特性值。 抗體濃度：1.06mg/mL，抗體產量：6.35mg(63%)，抗體每一分子之藥物平均結合數(n)：1.2 [產業上利用之可能性]
藉由使用本發明之抗體-藥物結合物、抗體及/或PBD衍生物等，各種癌之治療或預防成為可能。
[序列表非關鍵詞文字] 序列識別號1：人類CLDN6之胺基酸序列 序列識別號2：編碼人類CLDN6之胺基酸序列的cDNA之核苷酸序列 序列識別號3：人類CLDN9之胺基酸序列 序列識別號4：編碼人類CLDN9之胺基酸序列的cDNA之核苷酸序列 序列識別號5：B1抗體輕鏈之CDRL1之胺基酸序列 序列識別號6：B1抗體輕鏈之CDRL2之胺基酸序列 序列識別號7：B1抗體輕鏈之CDRL3之胺基酸序列 序列識別號8：人類化B1抗體輕鏈L4之CDRL3之胺基酸序列 序列識別號9：B1抗體重鏈之CDRH1之胺基酸序列 序列識別號10：B1抗體重鏈之CDRH2之胺基酸序列 序列識別號11：B1抗體重鏈之CDRH3之胺基酸序列 序列識別號12：C7抗體輕鏈之CDRL1之胺基酸序列 序列識別號13：C7抗體輕鏈之CDRL2之胺基酸序列 序列識別號14：C7抗體輕鏈之CDRL3之胺基酸序列 序列識別號15：C7抗體重鏈之CDRH1之胺基酸序列 序列識別號16：C7抗體重鏈之CDRH2之胺基酸序列 序列識別號17：C7抗體重鏈之CDRH3之胺基酸序列 序列識別號18：編碼B1抗體輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號19：B1抗體輕鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號20：編碼B1抗體重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號21：B1抗體重鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號22：編碼C7抗體輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號23：C7抗體輕鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號24：編碼C7抗體重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列 序列識別號25：C7抗體重鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號26：包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恆定區的DNA序列的DNA片段 序列識別號27：包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1LALA恆定區的DNA序列的DNA片段 序列識別號28：chB1輕鏈之胺基酸序列 序列識別號29：包含編碼chB1輕鏈之胺基酸序列的DNA序列的DNA片段 序列識別號30：chB1輕鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號31：編碼chB1輕鏈可變區的核苷酸序列 序列識別號32：chB1重鏈之胺基酸序列 序列識別號33：編碼chB1重鏈之核苷酸序列 序列識別號34：chB1重鏈之可變區之胺基酸序列 序列識別號35：編碼chB1重鏈之可變區之核苷酸序列 序列識別號36：人類化抗體輕鏈hL1之胺基酸序列 序列識別號37：編碼人類化抗體輕鏈hL1之核苷酸序列 序列識別號38：人類化抗體輕鏈hL1之可變區之胺基酸序列 序列識別號39：編碼人類化抗體輕鏈hL1之可變區之核苷酸序列 序列識別號40：人類化抗體輕鏈hL2之胺基酸序列 序列識別號41：編碼人類化抗體輕鏈hL2之核苷酸序列 序列識別號42：人類化抗體輕鏈hL2之可變區之胺基酸序列 序列識別號43：編碼人類化抗體輕鏈hL2之可變區之核苷酸序列 序列識別號44：人類化抗體輕鏈hL3之胺基酸序列 序列識別號45：編碼人類化抗體輕鏈hL3之核苷酸序列 序列識別號46：人類化抗體輕鏈hL3之可變區之胺基酸序列 序列識別號47：編碼人類化抗體輕鏈hL3之可變區之核苷酸序列 序列識別號48：人類化抗體輕鏈hL4之胺基酸序列 序列識別號49：編碼人類化抗體輕鏈hL4之核苷酸序列 序列識別號50：人類化抗體輕鏈hL4之可變區之胺基酸序列 序列識別號51：編碼人類化抗體輕鏈hL4之可變區之核苷酸序列 序列識別號52：人類化抗體重鏈hH1之胺基酸序列 序列識別號53：編碼人類化抗體重鏈hH1之核苷酸序列 序列識別號54：人類化抗體重鏈hH1之可變區之胺基酸序列 序列識別號55：編碼人類化抗體重鏈hH1之可變區之核苷酸序列 序列識別號56：人類化抗體重鏈hH2之胺基酸序列 序列識別號57：編碼人類化抗體重鏈hH2之核苷酸序列 序列識別號58：人類化抗體重鏈hH2之可變區之胺基酸序列 序列識別號59：編碼人類化抗體重鏈hH2之可變區之核苷酸序列 序列識別號60：人類化抗體重鏈hH3之胺基酸序列 序列識別號61：編碼人類化抗體重鏈hH3之核苷酸序列 序列識別號62：人類化抗體重鏈hH3之可變區之胺基酸序列 序列識別號63：編碼人類化抗體重鏈hH3之可變區之核苷酸序列 序列識別號64：曲妥珠單抗輕鏈之胺基酸序列 序列識別號65：曲妥珠單抗重鏈之胺基酸序列 序列識別號66：抗LPS抗體(h#1G5-H1L1)輕鏈之胺基酸序列 序列識別號67：抗LPS抗體(h#1G5-H1L1)重鏈之胺基酸序列 序列識別號68：抗TROP2抗體(hRS7)輕鏈之胺基酸序列 序列識別號69：抗TROP2抗體(hRS7)重鏈之胺基酸序列 序列識別號70：抗CD98抗體(hM23-H1L1)輕鏈之胺基酸序列 序列識別號71：抗CD98抗體(hM23-H1L1)重鏈之胺基酸序列 序列識別號72：編碼曲妥珠單抗突變體輕鏈之核苷酸序列 序列識別號73：曲妥珠單抗突變體輕鏈之胺基酸序列 序列識別號74：編碼曲妥珠單抗突變體重鏈之核苷酸序列 序列識別號75：曲妥珠單抗突變體重鏈之胺基酸序列 序列識別號76：曲妥珠單抗突變體2輕鏈之胺基酸序列 序列識別號77：曲妥珠單抗突變體2重鏈之胺基酸序列
(a):藥物D (b):連接子L (c):N3 -L(PEG)- (d):N297糖鏈 (e):僅由在Fuc之1位及6位中α醣苷鍵結的GlcNAc所構成的N297糖鏈 (f):供給於末端與連接子L之結合的疊氮基
圖1示意性表示本發明之抗體-藥物結合物((I)之分子)。各自為(a)表示藥物D，(b)表示連接子L，(c)表示N3 -L(PEG)-，(d)表示N297糖鏈(此處，白色橢圓表示NeuAc(Sia)，白色六角形表示Man，實心六角形表示GlcNAc、白色菱形表示Gal，及白色倒三角形表示Fuc)。(b)及(c)係(c)之疊氮基(黑色之淚珠型)與(b)之間隔子(白色之半圓形)中的炔結構反應，形成三唑環而結合。Y字型表示抗體Ab。又，於本示意圖中，於方便上將N297糖鏈表示為N297-(Fuc)MSG，且表示僅於N297糖鏈各自之一支鏈具有與具有疊氮基的PEG連接子(N3 -L(PEG)-)所結合的唾液酸，於另一支鏈之非還原末端不具有唾液酸的態樣，但亦可藉由採用N297-(Fuc)SG，於兩方之支鏈之非還原末端具有與具有疊氮基的PEG連接子所結合的唾液酸的態樣。此種表示方法只要未特別提及，就適用於本說明書之全體。 圖2係呈示為本發明之抗體-藥物結合物之製造中間體之(Fucα1,6)GlcNAc-抗體(圖2A之(II)之分子)、及MSG型糖鏈重塑抗體(圖2B之(III)之分子)之結構的示意圖。於兩者之圖中，Y字型與圖1同樣地表式抗體Ab。於圖2A中，(e)表示僅由在Fuc之1位及6位中α醣苷鍵結的GlcNAc所構成的N297糖鏈。於圖2B，(d)表示與圖1相同之N297糖鏈，(f)為具有疊氮基的PEG連接子部分之結構，表示供給於末端與連接子L之結合的疊氮基。具有疊氮基的PEG連接子之結合樣式係與圖1之說明相同 圖3為自動物細胞所產生的抗體製造MSG型糖鏈重塑抗體的步驟之示意圖。圖中之分子(II)、(III)係與圖2同樣地，各自表示(Fucα1,6)GlcNAc-抗體及MSG型糖鏈重塑抗體。(IV)之分子為動物細胞所產生的抗體，為N297糖鏈不均勻分子的混合物。圖3A呈示藉由將(IV)之不均勻的N297糖鏈以如EndoS的水解酵素處理，而有均一的(Fucα1,6)GlcNAc-抗體(II)被製作的步驟。圖3B係呈示對抗體(II)之N297糖鏈之GlcNAc，使用如EndoS D233Q/Q303L突變體的糖轉移酵素，藉由使MSG型糖鏈供予體分子之糖鏈進行糖鏈轉移，而有(III)之MSG型糖鏈重塑抗體被製作的步驟。此處所使用的MSG型糖鏈供予體分子為MSG之非還原末端之唾液酸以具有疊氮基的PEG連接子修飾者，於製作的MSG型N297糖鏈重塑抗體中，如圖2B所說明，成為非還原末端之唾液酸接受相同修飾者。於圖3B，於方便上，將MSG表示為供予體分子，但藉由將SG(10)作為糖鏈供予體，(III)之糖鏈重塑抗體為於N297糖鏈之兩者的非還原末端有具有疊氮基的連接子分子結合的糖鏈重塑抗體被合成。 圖4呈示抗HER2抗體-藥物結合物ADC2、ADC1對經皮下移植的為人類胃癌株的NCI-N87細胞的效果。 圖5呈示抗HER2抗體-藥物結合物ADC7、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、抗LPS抗體-藥物結合物ADC13對經皮下移植的為人類胃癌株的NCI-N87細胞的效果。 圖6呈示抗HER2抗體-藥物結合物ADC7、抗LPS抗體-藥物結合物ADC13或曲妥珠單抗-Tesirine(參考例1)對經皮下移植的為人類乳癌株的KPL-4細胞之效果。 圖7呈示抗HER2抗體-藥物結合物ADC7、或曲妥珠單抗-Tesirine對經皮下移植的為人類乳癌株的JIMT-1細胞之效果。 圖8呈示抗CLDN6抗體-藥物結合物ADC8、或抗CLDN6抗體(H1L1)-Tesirine對經皮下移植的為人類卵巢癌株的OV-90細胞之效果。 圖9呈示抗CLDN6抗體-藥物結合物ADC8、或抗CLDN6抗體(H1L1)-Tesirine對經皮下移植的為人類卵巢癌株的NIH：OVCAR-3細胞之效果。 圖10呈示抗體-藥物結合物抗TROP2抗體-藥物結合物ADC11、或抗LPS抗體-藥物結合物ADC13對經皮下移植的為人類頭頸部癌細胞株的FaDu細胞之效果。 圖11呈示人類CLDN6之全長胺基酸序列(序列識別號1)及全長cDNA之鹼基序列(序列識別號2)。 圖12呈示人類CLDN9之全長胺基酸序列(序列識別號3)及全長cDNA之鹼基序列(序列識別號4)。 圖13呈示B1抗體輕鏈之CDRL1～3之胺基酸序列(序列識別號5～7)。 圖14呈示人類化B1抗體輕鏈L4之CDRL3之胺基酸序列(序列識別號8)。 圖15呈示B1抗體重鏈之CDRH1～3之胺基酸序列(序列識別號9～11)。 圖16呈示C7抗體輕鏈之CDRL1～3之胺基酸序列(序列識別號12～14)。 圖17呈示C7抗體重鏈之CDRH1～3之胺基酸序列(序列識別號15～17)。 圖18呈示編碼B1抗體輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列(序列識別號18)及B1抗體輕鏈之可變區之胺基酸序列(序列識別號19)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖19呈示編碼B1抗體重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列(序列識別號20)及B1抗體重鏈之可變區之胺基酸序列(序列識別號21)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖20呈示編碼C7抗體輕鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列(序列識別號22)及C7抗體輕鏈之可變區之胺基酸序列(序列識別號23)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖21呈示編碼C7抗體重鏈之可變區的cDNA之核苷酸序列(序列識別號24)及C7抗體重鏈之可變區之胺基酸序列(序列識別號25)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖22呈示chB1輕鏈之胺基酸序列(序列識別號28)及包含編碼chB1輕鏈之胺基酸序列的DNA序列的DNA片段(序列識別號29)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖23呈示chB1輕鏈之可變區之胺基酸序列(序列識別號30)及編碼chB1輕鏈可變區的核苷酸序列(序列識別號31)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖24呈示chB1重鏈之胺基酸序列(序列識別號32)及編碼chB1重鏈的核苷酸序列(序列識別號33)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖25呈示chB1重鏈之可變區之胺基酸序列(序列識別號34)及編碼chB1重鏈之可變區的核苷酸序列(序列識別號35)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖26呈示人類化抗體輕鏈hL1之胺基酸序列(序列識別號36)及編碼人類化抗體輕鏈hL1的核苷酸序列(序列識別號37)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖27呈示人類化抗體輕鏈hL1之可變區之胺基酸序列(序列識別號38)及編碼人類化抗體輕鏈hL1之可變區的核苷酸序列(序列識別號39)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖28呈示人類化抗體輕鏈hL2之胺基酸序列(序列識別號40)及編碼人類化抗體輕鏈hL2的核苷酸序列(序列識別號41)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖29呈示編碼人類化抗體輕鏈hL2之可變區之胺基酸序列(序列識別號42)及人類化抗體輕鏈hL2之可變區的核苷酸序列(序列識別號43)。 圖30呈示人類化抗體輕鏈hL3之胺基酸序列(序列識別號44)及編碼人類化抗體輕鏈hL3的核苷酸序列(序列識別號45)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖31呈示人類化抗體輕鏈hL3之可變區之胺基酸序列(序列識別號46)及編碼人類化抗體輕鏈hL3之可變區的核苷酸序列(序列識別號47)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖32呈示人類化抗體輕鏈hL4之胺基酸序列(序列識別號48)及編碼人類化抗體輕鏈hL4的核苷酸序列(序列識別號49)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖33呈示人類化抗體輕鏈hL4之可變區之胺基酸序列(序列識別號50)及編碼人類化抗體輕鏈hL4之可變區的核苷酸序列(序列識別號51)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖34呈示人類化抗體重鏈hH1之胺基酸序列(序列識別號52)及編碼人類化抗體重鏈hH1的核苷酸序列(序列識別號53)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖35呈示人類化抗體重鏈hH1之可變區之胺基酸序列(序列識別號54)及編碼人類化抗體重鏈hH1之可變區的核苷酸序列(序列識別號55)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖36呈示人類化抗體重鏈hH2之胺基酸序列(序列識別號56)及編碼人類化抗體重鏈hH2的核苷酸序列(序列識別號57)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖37呈示人類化抗體重鏈hH2之可變區之胺基酸序列(序列識別號58)及編碼人類化抗體重鏈hH2之可變區的核苷酸序列(序列識別號59)。 圖38呈示人類化抗體重鏈hH3之胺基酸序列(序列識別號60)及編碼人類化抗體重鏈hH3的核苷酸序列(序列識別號61)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖39呈示人類化抗體重鏈hH3之可變區之胺基酸序列(序列識別號62)及編碼人類化抗體重鏈hH3之可變區的核苷酸序列(序列識別號63)。胺基酸序列中的下線表示CDR序列。 圖40呈示B1抗體及C7抗體之利用流動式細胞測量術而得的相對於人類CLDN6及家族分子CLDN3、CLDN4、CLDN9的結合能力。 圖41呈示B1抗體及C7抗體之利用Mab-ZAP而得的抗體內化活性能力。 圖42呈示人類化抗CLDN6抗體H1L1、H2L2、H1L3、H2L4、及H3L3之利用流動式細胞測量術而得的相對於CLDN6及家族分子的結合能力。 圖43呈示曲妥珠單抗輕鏈之胺基酸序列(序列識別號64)及重鏈之胺基酸序列(序列識別號65)。 圖44呈示曲妥珠單抗突變體之輕鏈之胺基酸序列(序列識別號73)及重鏈之胺基酸序列(序列識別號75)。 圖45呈示為人類嵌合化抗CLDN6抗體chB1之重鏈的chB1＿H、為人類化抗體重鏈的hH1、hH2及hH3之胺基酸序列之比較的圖。「・」表示與chB1＿H相同之胺基酸殘基，記載胺基酸殘基處表示經取代的胺基酸殘基。 圖46呈示為人類嵌合化抗CLDN6抗體chB1之輕鏈的chB1＿L、為人類化抗體輕鏈的hL1、hL2、hL3及hL4之胺基酸序列之比較的圖。「・」表示與chB1＿L相同之胺基酸殘基，記載胺基酸殘基處表示經取代的胺基酸殘基。 圖47呈示抗HER2抗體-藥物結合物ADC7及ADC14對經皮下移植之為人類乳癌株的KPL-4細胞的效果。 圖48呈示抗HER2抗體-藥物結合物ADC14對經皮下移植之為人類乳癌株的JIMT-1細胞的效果。 圖49呈示抗HER2抗體-藥物結合物ADC7及ADC14、抗LPS抗體-藥物結合物ADC13對經皮下移植之為人類胰臟癌株的CFPAC-1細胞的效果。
<110> 第一三共股份有限公司(DAIICHI SANKYO COMPANY,LIMITED)
<120> 抗體-吡咯并苯二氮呯衍生物結合物、其製造方法及其用途
<130> SAP-859-PCT
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<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_特徵
<223> 人類CLDN6之胺基酸序列
<400> 1
Figure 109109845-A0305-02-0230-2
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
(a):藥物D
(b):連接子L
(c):N3-L(PEG)-
(d):N297糖鏈

Claims (53)

  1. 一種下式所示的抗體-藥物結合物，
    Figure 109109845-A0305-02-0314-3
     (式中，m1表示1或2之整數，D係選自以下之群組的任一者：
    Figure 109109845-A0305-02-0314-35
     式中，星號＊表示與L結合，L係將與Ab之Asn297結合的糖鏈(N297糖鏈)及D加以連結的連接子，N297糖鏈可被重塑，Ab表示抗體或該抗體之功能性片段)。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中L為以-Lb-La-Lp-NH-B-CH2-O(C=O)-＊表示，其中，式中，星號＊表示與D結合，B為1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基或2,5-噻吩基，Lp表示選自以下之群組的任一者：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、及-GGPL-，La表示選自以下之群組的任一者：-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-、 -C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-、-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-、-CH2-OC(=O)-、及-OC(=O)-，以及Lb為下式所示者：
    Figure 109109845-A0305-02-0315-6
    或
    Figure 109109845-A0305-02-0315-49
    Figure 109109845-A0305-02-0315-8
    或
    Figure 109109845-A0305-02-0315-9
    、或
    Figure 109109845-A0305-02-0315-10
    或
    Figure 109109845-A0305-02-0315-11
    此處，於上述所示的Lb之結構式中，星號＊表示與La結合，波浪線表示與N297糖鏈或經重塑的N297糖鏈結合。
  3. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中L表示選自以下之群組的任一者：-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GG-(D-)VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、 -Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPI-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVK-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGPL-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-Z3-CH2-OC(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-，此處，B表示1,4-苯基，Z1表示以下之結構式：
    Figure 109109845-A0305-02-0317-12
     Z2表示以下之結構式：
    Figure 109109845-A0305-02-0317-13
     Z3表示以下之結構式：
    Figure 109109845-A0305-02-0317-15
     此處，Z1、Z2及Z3之結構式中，星號＊表示與鄰接的C(=O)、OC(=O)或CH2結合，波浪線表示與N297糖鏈或經重塑的N297糖鏈結合。
  4. 如請求項3之抗體-藥物結合物，其中L表示選自以下之群組的任一者：-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGVCit-NH-B-CH2-OC(=O)-、 -Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2)2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、-Z1-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-(CH2CH2O)2-CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-、及-Z1-C(=O)-CH2CH2-NH-C(=O)-(CH2CH2O)4-CH2CH2-C(=O)-VA-NH-B-CH2-OC(=O)-，此處，B為1,4-苯基，Z1表示以下之結構式：
    Figure 109109845-A0305-02-0318-16
     此處，上述Z1之結構式中，星號＊表示與鄰接Z1的C(=O)結合，波浪線表示與N297糖鏈或經重塑的N297糖鏈結合。
  5. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中N297糖鏈為經重塑的糖鏈。
  6. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中N297糖鏈表示具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG之任一者：
    Figure 109109845-A0305-02-0318-37
    Figure 109109845-A0305-02-0319-19
     上述式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合，N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2CH2-O)n5-CH2CH2-NH-，此處，n5表示2~5之整數，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與L中的Z1之三唑環上的1位或3位的氮原子結合。
  7. 如請求項6之抗體-藥物結合物，其中n5為3。
  8. 一種下式所示之抗體-藥物結合物，
    Figure 109109845-A0305-02-0319-46
     (於上述所示的各自之結構式中，m1表示1或2之整數，Ab為抗體或該抗體之功能性片段，N297糖鏈為具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG，
    Figure 109109845-A0305-02-0320-22
     式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合，N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-，此處，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與上述結構式中之三唑環上的1位或3位的氮原子結合)。
  9. 一種下式所示的抗體藥物結合物，
    Figure 109109845-A0305-02-0321-45
     (於上述所示的各自之結構式中，m1表示1或2之整數，Ab為抗體或該抗體之功能性片段，N297糖鏈為具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG，
    Figure 109109845-A0305-02-0321-24
     式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合，N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-， 此處，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與上述結構式中之三唑環上的1位或3位的氮原子結合)。
  10. 一種下式所示的抗體藥物結合物，
    Figure 109109845-A0305-02-0322-47
     (於上述所示的各自之結構式中，m1表示1或2之整數，Ab為抗體或該抗體之功能性片段，N297糖鏈為具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG，
    Figure 109109845-A0305-02-0322-26
    Figure 109109845-A0305-02-0323-27
     式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合，N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-，此處，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與上述結構式中之三唑環上的1位或3位的氮原子結合)。
  11. 一種下式所示的抗體藥物結合物，
    Figure 109109845-A0305-02-0323-28
     (於上述所示的各自之結構式中，m1表示1或2之整數， Ab為抗體或該抗體之功能性片段，N297糖鏈為具有下式所示的結構的N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或彼等之混合物、或N297-(Fuc)SG，
    Figure 109109845-A0305-02-0324-31
     式中，波浪線表示與抗體之Asn297結合，N297糖鏈中之L(PEG)表示＊-(CH2CH2-O)3-CH2CH2-NH-，此處，右端之胺基透過醯胺鍵而與N297糖鏈的β-Man之支鏈的1-3鏈側或/及1-6鏈側的非還原末端的唾液酸之2位的羧酸結合，左端之星號＊表示與前述結構式中之三唑環上的1位或3位的氮原子結合)。
  12. 如請求項1、2及8至11中任一項之抗體-藥物結合物，其包含具有內化活性的抗體。
  13. 如請求項1、2及8至11中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體具有與於腫瘤細胞表現的抗原結合且被攝入至腫瘤細胞內而內化的性質。
  14. 如請求項1、2及8至11中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體具有抗腫瘤效果。
  15. 如請求項1、2及8至11中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體為抗CLDN6抗體、抗CLDN9抗體、抗CLDN6/CLDN9抗體、抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗DLL3抗體、抗FAP抗體、抗CDH11抗體、抗A33抗體、抗CanAg抗體、抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD22抗體、抗CD25抗體、抗CD30抗體、抗CD33抗體、抗CD37抗體、抗CD56抗體、抗CD70抗體、抗CD98抗體、抗B7-H3抗體、抗TROP2抗體、抗CEA抗體、抗Cripto抗體、抗EphA2抗體、抗FGFR2抗體、抗G250抗體、抗MUC1抗體、抗GPNMB抗體、抗整合素(Integrin)抗體、抗PSMA抗體、抗肌腱蛋白-C(Tenascin-C)抗體、抗SLC44A4抗體、抗間皮素(Mesothelin)抗體、抗EGFR抗體、抗5T4抗體、抗LRRC15抗體、抗DR5抗體、抗CDH3抗體、抗PDPN抗體、或抗CD123抗體。
  16. 如請求項1、2及8至11中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體與CLDN6及/或CLDN9特異性結合。
  17. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其中抗體包含以下之(a)或(b)記載之包含CDRH1、CDRH2及CDRH3的重鏈、以及包含CDRL1、CDRL2及CDRL3的輕鏈；(a)由序列識別號9記載之胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號10記載之胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號11記載之胺基酸序列而成的CDRH3，以及，由序列識別號5記載之胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號6記載之 胺基酸序列而成的CDRL2、及由序列識別號7記載之胺基酸序列或該胺基酸序列中1或2個之胺基酸被取代的胺基酸序列而成的CDRL3，或(b)由序列識別號15記載之胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號16記載之胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號17記載之胺基酸序列而成的CDRH3，以及，由序列識別號12記載之胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列而成的CDRL2、及由序列識別號14記載之胺基酸序列而成的CDRL3。
  18. 如請求項17之抗體-藥物結合物，其中抗體包含以下之(a)或(b)記載之包含CDRH1、CDRH2及CDRH3的重鏈、以及包含CDRL1、CDRL2及CDRL3的輕鏈；(a)由序列識別號9記載之胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號10記載之胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號11記載之胺基酸序列而成的CDRH3，及，由序列識別號5記載之胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號6記載之胺基酸序列而成的CDRL2、及由序列識別號7記載之胺基酸序列或序列識別號8記載之胺基酸序列而成的CDRL3，或(b)由序列識別號15記載之胺基酸序列而成的CDRH1、由序列識別號16記載之胺基酸序列而成的CDRH2、及由序列識別號17記載之胺基酸序列而成的CDRH3，及，由序列識別號12記載之胺基酸序列而成的CDRL1、由序列識別號13記載之胺基酸序列而成的CDRL2、及由序列識別號14記載之胺基酸序列而成的CDRL3。
  19. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其中抗體包含 以下之(a)或(b)記載之重鏈可變區、及輕鏈可變區：(a)抗體為由序列識別號21記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區、及由序列識別號19記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區，或(b)抗體為由序列識別號25記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區、及由序列識別號23記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區。
  20. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其包含選自包含以下之(a)~(e)的群組的胺基酸序列而成的重鏈可變區、及選自包含以下(f)~(k)的群組的胺基酸序列而成的輕鏈可變區：(a)序列識別號54記載之胺基酸序列、(b)序列識別號58記載之胺基酸序列、(c)序列識別號62記載之胺基酸序列、(d)對於(a)~(c)之序列中各CDR序列以外的框架區之序列具有至少95%以上之相同性的胺基酸序列、(e)於(a)~(c)之序列中各CDR序列以外的框架區之序列中有1或數個胺基酸缺失、被取代或被附加的胺基酸序列、(f)序列識別號38記載之胺基酸序列、(g)序列識別號42記載之胺基酸序列、(h)序列識別號46記載之胺基酸序列、(i)序列識別號50記載之胺基酸序列、(j)對於(f)~(i)之序列中各CDR序列以外的框架區之序列具有至少95%以上之序列相同性的胺基酸序列、及(k)於(f)~(i)之序列中各CDR序列以外的框架區之序列中有1或數個胺基酸缺失、被取代或被附加的胺基酸序列。
  21. 如請求項20之抗體-藥物結合物，其中抗體包含選自包含以下之(a)~(e)的群組的重鏈可變區及輕鏈可變區：(a)由序列識別號54記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號38記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區、(b)由序列識別號58記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號42記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區、(c)由序列識別號54記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號46記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區、(d)由序列識別號58記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號50記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區、及(e)由序列識別號62記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號46記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區。
  22. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其中抗體為嵌合抗體。
  23. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其中抗體為人類化抗體。
  24. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其中抗體包含人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4之重鏈恆定區。
  25. 如請求項23之抗體-藥物結合物，其包含選自包含以下之(a)~(e)的群組的重鏈及輕鏈：(a)由序列識別號52之胺基酸編號20~471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號36之胺基酸編號21~234記載之胺基酸序列而成的輕鏈、(b)由序列識別號56之胺基酸編號20~471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號40之胺基酸編號21~234記載 之胺基酸序列而成的輕鏈、(c)由序列識別號52之胺基酸編號20~471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號44之胺基酸編號21~234記載之胺基酸序列而成的輕鏈、(d)由序列識別號56之胺基酸編號20~471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號48之胺基酸編號21~234記載之胺基酸序列而成的輕鏈、及(e)由序列識別號60之胺基酸編號20~471記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號44之胺基酸編號21~234記載之胺基酸序列而成的輕鏈。
  26. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其中抗體與如請求項17至21及25中任一項之抗體-藥物結合物中的抗體，於對CLDN6及/或CLDN9的結合中進行競爭，或與如請求項17至21及25中任一項之抗體-藥物結合物中的抗體所辨識的CLDN6及/或CLDN9上的部位結合。
  27. 如請求項1、2及8至11中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體與HER2特異性結合。
  28. 如請求項27之抗體-藥物結合物，其具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性及/或補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性。
  29. 如請求項27之抗體-藥物結合物，其中抗體之重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，包含引起ADCC及/或CDC活性降低的變異。
  30. 如請求項29之抗體-藥物結合物，其中抗體之重鏈恆定區為人類IgG1之重鏈恆定區，於該重鏈恆定區中由EU Index所示的234位及235位之白胺酸被取代為丙胺酸。
  31. 如請求項27之抗體-藥物結合物，其中抗體為包含由序列識別號65記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號64記載之胺基酸序列而成的輕鏈的抗體。
  32. 如請求項27之抗體-藥物結合物，其中抗體為包含由序列識別號75之胺基酸編號20~139記載之胺基酸序列而成的重鏈可變區及由序列識別號73之胺基酸編號21~127記載之胺基酸序列而成的輕鏈可變區的抗體。
  33. 如請求項27之抗體-藥物結合物，其中抗體為包含由序列識別號75之胺基酸編號20~469記載之胺基酸序列而成的重鏈及由序列識別號73之胺基酸編號21~234記載之胺基酸序列而成的輕鏈的抗體。
  34. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其中抗體包含選自包含N-鍵結型糖鏈附加、O-鍵結型糖鏈附加、N末端的加工、C末端的加工、去醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、於N末端甲硫胺酸殘基的附加、脯胺酸殘基的醯胺化、及重鏈之羧基末端中的1個或2個胺基酸殘基的缺失之群組的1或2種以上之修飾。
  35. 如請求項34之抗體-藥物結合物，其於抗體之重鏈之羧基末端中有1個或數個之胺基酸殘基缺失。
  36. 如請求項34之抗體-藥物結合物，其於抗體之2條重鏈的雙方的羧基末端中有1個之胺基酸殘基缺失。
  37. 如請求項34之抗體-藥物結合物，其中抗體之重鏈之羧基末端之脯胺酸殘基進一步經醯胺化。
  38. 如請求項27之抗體-藥物結合物，其中抗體包含 選自包含N-鍵結型糖鏈附加、O-鍵結型糖鏈附加、N末端的加工、C末端的加工、去醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、於N末端甲硫胺酸殘基的附加、脯胺酸殘基的醯胺化、及重鏈之羧基末端中的1個或2個胺基酸殘基的缺失之群組的1或2種以上之修飾。
  39. 如請求項38之抗體-藥物結合物，其於抗體之重鏈之羧基末端中有1個或數個之胺基酸殘基缺失。
  40. 如請求項38之抗體-藥物結合物，其於抗體之2條重鏈的雙方的羧基末端中有1個之胺基酸殘基缺失。
  41. 如請求項38之抗體-藥物結合物，其中抗體之重鏈之羧基末端之脯胺酸殘基進一步經醯胺化。
  42. 如請求項1、2及8至11中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體係特徵為藉由以下之步驟所獲得的糖鏈重塑抗體：i)培養包含編碼如請求項12至41中任一項之抗體-藥物結合物中的抗體的多核苷酸的宿主細胞，並自獲得的培養物採取目的之抗體的步驟，ii)將步驟i)所獲得的抗體以水解酵素處理，而製造(Fucα1,6)GlcNAc-抗體的步驟，及iii)於糖轉移酵素存在下，使(Fucα1,6)GlcNAc-抗體與糖鏈供予體分子反應的步驟，該糖鏈供予體分子係於MSG(9)或SG(10)之唾液酸之2位的羧酸的羰基導入具有疊氮基的PEG連接子並將還原末端進行
    Figure 109109845-A0305-02-0331-48
    唑啉化而得。
  43. 如請求項42之抗體-藥物結合物，其進一步包含：將步驟ii)之反應液，藉由利用羥磷灰石管柱的純化而將 (Fucα1,6)GlcNAc-抗體進行純化的步驟。
  44. 一種下式所示的任一者之化合物、其鹽、或彼等之水合物，
    Figure 109109845-A0305-02-0332-33
  45. 一種如請求項1至43中任一項之抗體-藥物結合物之製造方法，其包含：使如請求項42或43之抗體-藥物結合物中的糖鏈重塑抗體與如請求項44之化合物、其鹽、或彼等之水合物反應的步驟。
  46. 一種抗體-藥物結合物，其特徵為其係以如請求項45之製造方法而獲得。
  47. 如請求項1、2、8至11及46中任一項之抗體-藥物結合物，其中N297糖鏈為N297-(Fuc)MSG1。
  48. 如請求項1、2、8至11及46中任一項之抗體-藥物結合物，其中m1為1之整數。
  49. 如請求項1、2、8至11及46中任一項之抗體-藥物結合物，其中抗體-藥物結合物中的抗體每1分子的平均藥物結合數為1至3或3至5。
  50. 一種醫藥組成物，其特徵為包含如請求項1至43 及46至49中任一項之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物。
  51. 如請求項50之醫藥組成物，其為抗腫瘤藥。
  52. 一種如請求項1至43及46至49中任一項之抗體-藥物結合物、其鹽、或彼等之水合物的用途，其用以製造治療腫瘤之醫藥組成物。
  53. 如請求項52之用途，其中該醫藥組成物係與至少一種抗腫瘤藥，同時地、分別地或連續地投予至個體。
TW109109845A 2019-03-25 2020-03-24 抗體–吡咯并苯二氮呯衍生物結合物、其製造方法及其用途 TWI856078B (zh)

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