TWI765311B

TWI765311B - 包含抗pd-1/her2雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途

Info

Publication number: TWI765311B
Application number: TW109126706A
Authority: TW
Inventors: 劉洋涵; 馬一冬; 汪音爵; 周凱松
Original assignee: 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司; 大陸商北京韓美藥品有限公司
Priority date: 2019-08-07
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2022-05-21
Also published as: JP2022543422A; EP4011390A4; CN114206382B; BR112022001775A2; KR20220044286A; US20220281972A1; CN114206382A; TW202114639A; CA3146138A1; EP4011390A1; AU2020325415A1; WO2021023267A1

Abstract

本發明涉及包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體的製劑，尤其涉及包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體、緩衝劑、穩定劑和表面活性劑的藥物製劑。此外，本發明還涉及這些製劑的疾病治療或預防用途。

Description

包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途

本發明涉及抗體製劑領域。更具體而言，本發明涉及包含重組的抗程序性死亡受體1(PD-1)和抗人表皮生長因子受體2(HER2)雙特異性抗體(也稱為抗PD-1/HER2雙特異性抗體)的藥物製劑，尤其是穩定的液體製劑，以及用於製備該藥物製劑的方法，以及該藥物製劑的治療和/或預防用途。

人表皮生長因子受體2(HER2)(也稱為NEU、ERBB-2、CD340或p185)的過量表達與多種癌症相關聯，這些癌症包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮癌、黑色素瘤以及膽管癌等。例如，在侵襲性、轉移性乳腺癌中、在具有高復發率和/或患者預後不良的乳腺癌中，均觀察到了HER2過量表達。

治療HER2過量表達癌症的一種方法是使用抑制HER2信號傳導的抗HER2抗體。例如，曲妥珠單抗(trastuzumab)是阻斷由HER2介導的細胞內信號傳導的一種治療性抗HER2抗體，並且被廣泛用來治療HER2過表達腫瘤。遺憾的是，其在臨床應用中的抗腫瘤效果往往沒有臨床前實驗那麼好。在現有技術中，通常將抗HER2抗體與化療藥等聯合用藥(Slamon DJ等人，N Engl J Med,344：783-792,2001)。

近年來，隨著對免疫檢查點(immune checkpoint)分子的研究，發現免疫檢查點的抑制性信號通路活化導致T淋巴細胞不能有效發揮對腫瘤的殺傷效應(Yao S,Zhu Y和Chen L.，Advances in targeting cell surface signaling molecules for immune modulation.Nat Rev Drug Discov,2013,12(2)：130-146)，這從一個方面導致了僅靶向腫瘤細胞上的靶點的藥物(例如曲妥珠單抗)的抗腫瘤效果不佳。

程序性死亡蛋白-1(PD-1)是一種重要的免疫檢查點蛋白，為55kDa I型跨膜蛋白，主要誘導性表達於活化的T細胞表面，也表達於B細胞、NK細胞、單核細胞、DC細胞等細胞上。已鑒定到PD-1的兩種細胞表面糖蛋白配體，分別為程序性死亡蛋白配體1(PD-L1)和程序性死亡蛋白配體2(PD-L2)。PD-1的配體在許多癌細胞上高表達。PD-1與PD-1的配體結合後可導致T細胞凋亡、免疫無應答、T細胞“耗竭”和分泌IL-10等，因此，阻斷PD1途徑能在癌症患者中恢復T細胞功能(Sheridan,Nature Biotechnology 30(2012),729-730)。針對PD-1的單株抗體已有記載，例如，百時美施貴寶(BMS)公司的納武單抗(Nivolumab)和默克(Merck)公司的派姆單抗(Pembrolizumab)。納武單抗(商品名OPDIVO^®)為完全人源化的IgG4抗體分子，派姆單抗(商品名KEYTRUDA^®)為人源化IgG4抗體分子。該抗PD-1單株抗體與T淋巴細胞上的PD-1結合後能夠抑制PD-1與其配體PD-L1和PD-L2的結合，由此促進T淋巴細胞活化、增殖和產生免疫活化型細胞因子如IL-2，並解除PD-1對具有抗腫瘤活性的T淋巴細胞免疫監視的抑制。

鑒於免疫檢查點分子PD-1在調節免疫應答中的重要性，本發明人藉由銳意研究，已獲得了一種靶向PD-1且靶向HER2的抗PD-1/HER2雙特異性抗體，它能夠同時靶向腫瘤細胞上的HER2且活化T淋巴細胞，具有在增強抗腫瘤作用的同時減少副作用的優勢。該抗PD-1/HER2雙特異性抗體的專利申請號是PCT/CN2018/075851(申請日：2018年2月8日)，其中構建並表達了由抗PD-1半抗體和抗HER2半抗體組成的抗PD-1/HER2雙特異性抗體。對使用HCC1954人乳腺癌細胞接種免疫缺陷NCG小鼠產生的荷瘤小鼠施用抗PD-1/HER2雙特異性抗體，結果表明，與施用抗HER2單株抗體或抗PD-1單株抗體相比較，抗PD-1/HER2雙特異性抗體具有顯著提高的抗腫瘤活性，能夠顯著縮小腫瘤體積。

本領域需要能夠用來治療、預防或延緩各種與HER2信號傳導通路和PD-1信號傳導通路相關的疾病的抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑，且該製劑的穩定性好，當在液體中調配時，液體溶液中的抗PD-1/HER2雙特異性抗體不易分解、聚集或發生不希望的化學修飾等。

發明概述

本發明藉由提供含有特異結合PD-1和HER2的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的藥物製劑來滿足上述需求。本發明的抗體製劑除了能夠使抗體以適於施用給受試者的方式調配之外，還能在儲存以及後續使用期間維持其穩定性。

在一個方面，本發明提供了一種液體抗體製劑，其包含(i)抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑。

本發明抗體製劑中的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合PD-1的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合HER2的第二VH/VL單元。在一些實施方案中，該抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與T淋巴細胞表面的PD-1結合，由此阻斷PD-1與其配體的結合，促進T淋巴細胞活化、增殖和產生免疫活化型細胞因子如IL-2；並以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與腫瘤細胞表面的HER2結合，由此阻斷由HER2介導的細胞內信號傳導並發揮抗腫瘤作用。

在一個實施方案中，該抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白為PCT申請號PCT/CN2018/075851(申請日：2018年2月8日)中公開的重組抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白。為了本申請的目的，該PCT申請的全部內容特此併入本文作為參考。在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合PD-1的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合HER2的第二VH/VL單元，其中所該第一VH/VL單元包含SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：10的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中所含的全部重鏈CDR與輕鏈CDR，並且其中該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：2的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中所含的全部重鏈CDR與輕鏈CDR。

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合PD-1的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合HER2的第二VH/VL單元，其中所該第一 VH/VL單元包含SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：10的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列，並且其中該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：2的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含從N至C方向的SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和從N至C方向的SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：4的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列，並且其中第二半抗體包含從N至C方向的SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和從N至C方向的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列。

在一個實施方案中，該抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白是在HEK293細胞或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E細胞；CHO細胞或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr^-、CHO/DG44、ExpiCHO中重組表達的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的濃度為約1-150mg/ml。在另一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的濃度為約10-100mg/mL。在其他實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的濃度為約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約5-50mM。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約10-30mM，例如，約10、15、20、25、30mM。

在一個實施方案中，該緩衝劑選自組胺酸、鹽酸組胺酸和它們的組合。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約50-500mM。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的穩定劑的濃度為約100-400mM，例如，約100、150、200、250、300、350、400mM。

在一個實施方案中，該穩定劑選自多元醇(例如，山梨醇)、糖類(例如，蔗糖、海藻糖)和它們的任意組合。

在又一個實施方案中，該穩定劑選自多元醇(例如，山梨醇)、糖類(例如，蔗糖、海藻糖)和它們的任意組合與抗氧化劑的組合。在一個實施方案中，該液體抗體製劑中穩定劑的總濃度為約50-500mM，較佳地總濃度為約100-400mM，例如，約100、150、200、250、300、350、400mM，其中抗氧化劑的濃度為約1-50mM，較佳地約5-40mM，例如約5、10、20、30、40mM。在一個實施方案中，該抗氧化劑是甲硫胺酸。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的表面活性劑的濃度為約0.1-1mg/ml。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的表面活性劑的濃度為約0.2-0.8mg/ml，例如約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/ml。

在一個實施方案中，該表面活性劑是非離子型表面活性劑。在一個實施方案中，該表面活性劑選自聚山梨酯類表面活性劑。在一個具體實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的表面活性劑是聚山梨酯-80。

在一個實施方案中，該液體製劑的pH值為約5.0-6.5。在一些實施方案中，該液體製劑的pH值為約5.0-6.5中的任意值，例如約5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4。

在一個實施方案中，該液體製劑為藥物製劑，較佳為注射劑，更佳為皮下注射劑或靜脈內注射劑。在一個實施方案中，該液體製劑為靜脈輸注劑。

在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

(i)約1-150mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；

(ii)約5-50mM的組胺酸和/或鹽酸組胺酸；

(iii)約50-500mM的山梨醇、蔗糖、海藻糖和它們的任意組合；或者

總濃度為約50-500mM的山梨醇、蔗糖、海藻糖和它們的任意組合與甲硫胺酸的組合，其中甲硫胺酸的濃度為約1-50mM，和

(iv)約0.1-1mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約5.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含：

(i)約10-100mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；

(ii)約10-30mM的組胺酸和/或鹽酸組胺酸；

(iii)約100-400mM的山梨醇、蔗糖、和/或海藻糖；或者

總濃度為約100-400mM的山梨醇、蔗糖、和/或海藻糖與甲硫胺酸的組合，其中甲硫胺酸的濃度為約5-40mM，和

(iv)約0.2-0.8mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約5.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)約20mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；

(ii)約10mM組胺酸；

(iii)約50mg/ml山梨醇，和

(iv)約0.3mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約5.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)約50mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；

(ii)約20mM組胺酸；

(iii)約50mg/ml山梨醇，和

(iv)約0.2mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約5.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)約50mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；

(ii)約20mM組胺酸；

(iii)約80mg/ml蔗糖，和

(iv)約0.2mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約5.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)約50mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；

(ii)約20mM組胺酸；

(iii)約80mg/ml海藻糖，和

(iv)約0.2mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約5.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)約50mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；

(ii)約20mM組胺酸；

(iii)約80mg/ml蔗糖和約1.49mg/ml甲硫胺酸，和

(iv)約0.2mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約5.5。

在一個較佳的實施方案中，本發明的液體抗體製劑包含

(i)約42mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；

(ii)約0.85mg/ml組胺酸和約3.17mg/ml鹽酸組胺酸；

(iii)約80mg/ml蔗糖，和

(iv)約0.2mg/ml聚山梨醇酯80；

其中該液體製劑的pH為約5.0-6.5，較佳地約5.5。

另一方面，本發明提供了一種固體抗體製劑，其是通過將本發明的液體抗體製劑經固化處理而獲得的。該固化處理是藉由例如結晶法、噴霧乾燥法、冷凍乾燥法實施的。在一個較佳的實施方案中，該固體抗體製劑例如是凍乾粉針劑形式。固體抗體製劑可在使用前，藉由重構於適當的溶媒中，形成本發明的重構製劑。該重構製劑也是一種本發明的液體抗體製劑。在一個實施方案中，該適當的溶媒選自注射用水、注射用有機溶劑，包括但不限於注射用油、乙醇、丙二醇等，或其組合。

本發明的液體製劑可以長期穩定儲存，例如至少24個月或更長時間。在一個實施方案中，本發明的液體製劑可以在約-80℃至約45℃，例如-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約5℃、約25℃、約35℃、約38℃、約40℃、約42℃或約45℃的條件下，儲存至少10天、至少20天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月，至少36個月，或更長時間，且是穩定的。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑可以穩定儲存至少24個月。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在至少40℃是穩定的。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在約2℃-8℃保持穩定至少3個月，較佳至少12個月，更佳至少24個月。在一個實施方案中，本發明的液體製劑在室溫或例如約25℃保持穩定至少2個月，較佳至少3個月，更佳至少6個月。在再一實施方案中，本發明的液體製劑在約40℃保持穩定至少2週、較佳至少1個月。

在一個實施方案中，可以藉由檢測製劑的外觀、可見異物、蛋白含量、濁度、純度、和/或電荷變異體的變化，來指示儲存後製劑的穩定性。在一個實施方案中，可以在高溫脅迫的強制實驗中，例如在40℃±2℃儲存至少1週、2週或較佳地1個月後，或在加速實驗中，例如在25℃±2℃儲存至少1個月或2個月後，或在長期實驗中，例如在5℃±3℃儲存至少2個月或3個月後，檢測本發明液體製劑的穩定性。

在一個實施方案中，在儲存後，藉由目視檢查本發明液體製劑的穩定性，其中本發明液體製劑在外觀上保持為澄明至微乳光，為無色至淡黃色液體，且無異物。在一個實施方案中，在澄明度檢測儀下目視檢查，製劑中無可見異物存在。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定蛋白含量變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中例如藉由紫外分光光度(UV)法，相對於儲存第0天的初始值，蛋白含量變化率不超過20%，較佳不超過10%，例如7-8%，更佳不超過5%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的濁度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中例如藉由OD_350mm法檢測，相對於儲存第0天的初始值，變化值不超過0.06，較佳地不超過0.05，更佳地不超過0.04。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的純度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中藉由尺寸排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)，相對於儲存第0天的初始值，單體純度的變化值不超過10%，例如不超過5%、4%、3%、例如變化值不超過1-2%，較佳不超過1%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由測定本發明液體製劑的純度變化，檢查本發明液體製劑的穩定性，其中藉由非還原型和/或還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)法，單體純度的變化值下降不超過10%，例如不超過5%、4%、3%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)檢測本發明液體製劑的穩定性，其中相對於儲存第0天的初始值，抗體的電荷變異體(主成分、酸性組分和鹼性組分)的變化值總和不超過50%，例如不超過40%、30%、20%、10%、5%。在一個實施方案中，在儲存後，藉由陽離子交換高效液相色譜法(CEX-HPLC法)檢測本發明液體製劑的穩定性，其中相對於儲存第0天的初始值，抗體的電荷變異體(主成分、酸性組分和鹼性組分)的變化值總和不超過40%，例如不超過38%、36%、34%、32%、30%。

在一個實施方案中，製劑在儲存後，例如在2-8℃儲存至少24個月後，或在室溫儲存至少3個月後，或在40℃±2℃儲存1個月後，是穩定的，較佳地具有如下特徵之一或多項：

(i)藉由SEC-HPLC法測量，製劑具有大於90%的純度，較佳大於95%、96%、97%、98%、99%的純度；

(ii)藉由還原型或非還原型CE-SDS法測量，製劑具有大於90%的純度，較佳大於92%、94%、96%、98%的純度；

(iii)藉由iCIEF法測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的各組分(主成分、酸性組分和鹼性組分)的變化值總和不超過50%，例如不超過40%、30%、20%、10%、5%；

(iv)藉由ELISA法測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的相對結合活性為70%-130%，例如，為70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%。

在一個方面，本發明提供了一種遞送裝置，其包含本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑。在一個實施方案中，本發明的遞送裝置以包含本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的預填裝注射器形式提供，例如用於靜脈內、皮下、皮內或者肌內注射、靜脈內輸注。

在又一方面，本發明提供向受試者，例如哺乳動物遞送抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的方法，包括給予該受試者本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的步驟，該遞送是例如藉由使用預填裝注射器的遞送裝置實施的。

在又一方面，本發明提供本發明的液體抗體製劑或固體抗體製劑的用途，用於製備在受試者中治療、預防或延緩與HER2信號傳導通路和PD-1信號傳導通路相關的病症的遞送裝置(如，預填裝注射器)或藥物，該病症例如各種血液病和實體瘤，包括但不限於白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黑色素瘤。

本發明的其它實施方案將藉由參閱此後的詳細說明而清楚明瞭。

結合以下圖式一起閱讀時，將更好地理解以下詳細描述的本發明的較佳實施方案。出於說明本發明的目的，圖中顯示了目前較佳的實施方案。然而，應當理解本發明不限於圖中所示實施方案的精確安排和手段。

圖1例示了一種抗PD-1/HER2雙特異性抗體的結構，包含抗PD-1半抗體分子和抗HER2半抗體分子。

圖2顯示了抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑在pH 5.0、5.5、6.0、6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由OD_350nm法測定的各樣品濁度變化趨勢圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1W表示1週；2W表示2週；1M表示1個月。

圖3顯示了抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑在pH 5.0、5.5、6.0、6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由SEC-HPLC法測定的各樣品中蛋白純度變化趨勢圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1W表示1週；2W表示2週；1M表示1個月。

圖4顯示了抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑在pH 5.0、5.5、6.0、6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由非還原型CE-SDS法測定的各樣品中蛋白純度變化趨勢圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1W表示1週；2W表示2週；1M表示1個月。

圖5顯示了抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑在pH 5.0、5.5、6.0、6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由還原型CE-SDS法測定的各樣品中蛋白純度變化趨勢圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1W表示1週；2W表示2週；1M表示1個月。

圖6顯示了抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑在pH 5.0、5.5、6.0、6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由iCIEF法測定的各樣品中電荷變異體主成分的變化趨勢圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1W表示1週；2W表示2週；1M表示1個月。

圖7顯示了將具有不同穩定劑的抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑(處方1-4)置於約40℃儲存0天、1週、2週和4週後，藉由iCIEF法測定的電荷變異體主成分隨時間的變化圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1W表示1週；2W表示2週；4W表示4週；F1表示處方1，F2表示處方2，F3表示處方3，F4表示處方4。

圖8顯示了將具有不同穩定劑的抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑(處方1-4)置於25℃±2℃儲存0天、1週、2週和4週後，藉由iCIEF法測定的電荷變異體主成分隨時間的變化圖。圖中橫坐標上的T0表示0天；1M表示1個月；2M表示2個月；F1表示處方1，F2表示處方2，F3表示處方3，F4表示處方4。

發明詳述

在詳細描述本發明之前，應瞭解，本發明不受限於本說明書中的特定方法及實驗條件，因為該方法以及條件是可以改變的。另外，本文所用術語僅是供說明特定實施方案之用，而不意欲為限制性的。

定義

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本發明的目的，下文定義了以下術語。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值。

術語“和/或”當用於連接兩個或多個可選項時，應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或多項。

如本文中所用，術語“包含”或“包括”意指包括該的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本文中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由該及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。

在本文中，術語“抗體”以最廣意義使用，指包含抗原結合位點的蛋白質，涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體，包括但不限於完整抗體和抗體的抗原結合片段。

術語“全抗體”、“全長抗體”、“完全抗體”和“完整抗體”在本文中可互換地用來指包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH區和VL區可以進一步再劃分為超變區(為互補決定區(CDR)，其間插有較保守的區域(為構架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和4個FR組成，從胺基端到羧基端以如下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是顯示出多種效應子功能。

術語“人源化”抗體指包含來自非人類HVR的胺基酸殘基和來自人FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在一些實施方案中，人源化抗體包含全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)與非人抗體的那些HVR對應並且全部或基本上全部的FR區與人抗體的那些FR對應。人源化抗體視需要地可以包含從人抗體衍生的抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人抗體)的“人源化形式”指已經歷過人源化的抗體。

術語“半抗體”或“半聚物”指單價抗原結合多肽。在一些實施方案中，半抗體或半聚物包含VH/VL單元和視需要地免疫球蛋白恆定結構域的至少一部分。在一些實施方案中，半抗體或半聚物包含與一條免疫球蛋白輕鏈締合的一條免疫球蛋白重鏈，或其抗原結合片段。在一些實施方案中，半抗體或半聚物是單特異的，即，與單個抗原或表位結合。在一些具體的實施方案中，半抗體與HER2結合並且不與PD-1結合。在一些具體的實施方案中，半抗體與PD-1結合並且不與HER2結合。本領域技術人員將會輕易地理解，半抗體可以具有由單一可變結構域組成(例如，源自駱駝屬(Camelidae))的抗原結合結構域。

術語“VH/VL單元”指抗體中包含至少一個VH CDR和至少一個VL CDR的抗原結合區。在一些實施方案中，VH/VL單元包含至少一個、至少兩個或全部三個VH CDR和至少一個、至少兩個或全部三個VL CDR。在某些實施方案中，VH/VL單元還包含構架區(FR)的至少一部分。在一些實施方案中，VH/VL單元包含三個VH CDR和三個VL CDR。在一些實施方案中，VH/VL單元包含至少一個、至少兩個、至少三個或全部四個VH FR和至少一個、至少兩個、至少三個或全部四個VL FR。

在本文中，術語“雙特異性抗體”包含與兩種不同生物分子上的表位特異性結合的抗原結合結構域。除非另外說明，否則列出的雙特異性抗體名稱中雙特異性抗體結合的抗原的順序是任意的。即，在一些實施方案中，術語“抗PD-1/HER2雙特異性抗體”和“抗HER2/PD-1雙特異性抗體”可以互換使用。在一些實施方案中，雙特異性抗體包含兩個半抗體，其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和視需要地重鏈恆定區的至少一部分以及單個輕鏈可變區和視需要地輕鏈恆定區的至少一部分。在一些實施方案中，雙特異性抗體包含兩個半抗體，其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和單個輕鏈可變區並且不包含多於一個單個重鏈可變區且不包含多於一個單個輕鏈可變區。在一些實施方案中，雙特異性抗體包含兩個半抗體，其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和單個輕鏈可變區，並且其中第一半抗體與第一抗原結合且不與第二抗原結合並且第二半抗體與第二抗原結合且不與第一抗原結合。

術語“抗體製劑”指一種製備物，該製備物處於允許作為活性成分的抗體的生物活性可以有效發揮的形式，並且不含有對於待施用該製劑的受試者而言具有不可接受毒性的其它組分。這類抗體製劑通常是無菌的。通常，抗體製劑中包含可藥用賦形劑。“可藥用”賦形劑是可以合理地施用至受試哺乳動物以便製劑中所用活性成分的有效劑量可以遞送至受試者的試劑。賦形劑的濃度與施用模式相適應，例如可以是注射可接受的。

術語“抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑”在本文中也簡稱為“本發明的抗體製劑”，意指包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白作為活性成分並包含可藥用賦形劑的製備物。將抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白與可藥用賦形劑組合後，作為活性成分的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白適於治療性或預防性施與人類或非人類動物。本發明的抗體製劑可以例如製備成水性形式的液體製劑，例如，即用式預填裝注射器，或者製備成凍乾製劑，在即將使用前藉由溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中進行重構(即，複溶)。在一些實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白製劑是液體製劑形式。

“穩定的”抗體製劑是製劑中的抗體在儲存於特定條件下之後保有可接受程度的物理穩定性和/或化學穩定性。儘管抗體製劑中所含的抗體在儲存特定時間之後可能不會100%維持其化學結構，但通常在儲存特定時間之後維持約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%的抗體結構或功能，則認為抗體製劑是“穩定的”。在一些具體的實施方案中，本發明的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白製劑在製造、製備、運輸和長期儲存過程中表現出低至檢測不到的抗體聚集或降解或化學修飾，從而極少或甚至是沒有抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的生物活性損失，表現出高度穩定性。在一些實施方案中，本發明的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白製劑在儲存後，基本上保留其物理和化學穩定性。較佳地，本發明液體製劑可以在室溫或在40℃穩定至少2週，和/或在25℃穩定至少2個月，和/或在2-8℃穩定至少24個月。

本領域已知多種分析技術可以用於測定蛋白質的穩定性，參見例如Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs(1991)and Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。可以在選定的溫度和選定的儲存時間測量穩定性。例如，可以基於預期的製劑貨架期來選擇儲存時間。備選地，可以使用加速穩定性試驗。在一些實施方案中，藉由對抗體製劑進行各種脅迫測試來進行穩定性測試。這些測試可以代表調配的抗體製劑在製造、儲存或運輸期間可能遭遇到的極端條件，也可以代表在非製造、儲存或運輸期間可能使抗體製劑中的抗體的不穩定性加速的條件。例如，可以將經調配的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白製劑充填至玻璃小瓶中以檢驗在高溫脅迫下的抗體穩定性。

經一段儲存時間後，製劑不顯示聚集、沉澱、混濁和/或變性；或顯示非常少的聚集、沉澱、混濁和/或變性，則可以認為抗體在製劑中“保持其物理穩定性”。由於製劑中抗體的聚集可以潛在地導致患者增加的免疫反應，從而導致安全性問題。因此，需要使在製劑中的抗體聚集最小化或防止聚集。光散射法可以用於測定製劑中的可見聚集物。SEC可以用於測定製劑中的可溶性聚集物。此外，可以藉由目視檢查製劑的外觀、顏色和/或澄清度、或者藉由OD_350nm法檢測製劑的濁度、或者藉由非還原型CE-SDS法測定製劑的純度，來指示製劑的穩定性。在一個實施方案中，藉由測定在特定溫度下儲存特定時間之後製劑中的抗體單體的百分比來測量製劑的穩定性，其中製劑中的抗體單體的百分比越高，則製劑的穩定性越高。

“可接受程度的”物理穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後，在製劑中檢測到至少約92%的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白單體。在一些實施方案中，在特定溫度儲存至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久後，可接受程度的物理穩定性表示至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白單體。當評估物理穩定性時，藥物製劑儲存的特定溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約4℃-8℃、約5℃、約25℃、約35℃、約37℃、約40℃、約42℃或約45℃。例如，若儲存於約40℃±2℃ 1個月或4週之後，檢測到至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白單體，則藥物製劑視為是穩定的。若儲存於約25℃ 2個月之後，檢測到至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白單體，則藥物製劑視為是穩定的。若儲存於約5℃ 9個月之後，檢測到至少約88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白單體，則藥物製劑視為是穩定的。

經一段儲存時間後，如果製劑中的抗體不顯示顯著的化學改變，則可以認為抗體在製劑中“保持其化學穩定性”。大多數化學不穩定性源自於形成了抗體的共價修飾形式(例如，抗體的電荷變異體)。例如由天冬胺酸異構化、N和C末端修飾，可以形成鹼性變異體；由脫醯胺化、唾液酸化和糖化，可以產生酸性變異體。化學穩定性可以藉由檢測和/或定量抗體的化學改變形式來評估。例如，可以藉由陽離子交換色譜(CEX)或成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)檢測製劑中抗體的電荷變異體。在一個實施方案中，藉由測定在特定溫度下儲存特定時間之後製劑中抗體的電荷變異體百分比變化值來測量製劑的穩定性，其中該變化值越小，則製劑的穩定性越高。

“可接受程度”的化學穩定性可以表示於特定溫度下儲存特定時間之後製劑中電荷變異體(例如主成分或酸性組分或鹼性組分)的百分比變化值不超過50%，例如不超過30%、不超過20%。在一些實施方案中，在特定溫度儲存至少2週、至少28天、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少12個月、至少18個月、至少24個月或更久後，可接受程度的化學穩定性可以表現為主成分電荷變異體的百分比變化值不超過約50%、40%、30%、20%、15%。當評估化學穩定性時，儲存藥物製劑的溫度可為約-80℃至約45℃的任一溫度，例如儲存於約-80℃、約-30℃、約-20℃、約0℃、約4℃-8℃、約5℃、約25℃或約45℃。例如，若在儲存於5℃ 24個月之後，主成分電荷變異體的百分比變化值少於約25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑可被視為是穩定的。若在儲存於25℃ 2個月後，主成分電荷變異體的百分比變化值少於約20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、 2%、1%、0.5%或0.1%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。若在儲存於40℃ 1個月之後，主成分電荷變異體的百分比變化值少於約50%、40%、30%、20%、10%、5%或4%，則藥物製劑亦可被視為是穩定的。

術語“凍幹製劑”是指藉由液體製劑的冷凍乾燥處理得到或能夠得到的組合物。較佳地，其為具有少於5%、較佳少於3%水含量的固體組合物。

術語“重構製劑”是指將固體製劑(例如凍乾製劑)溶解和/或懸浮於生理可接受的溶液中得到的液體製劑。

文中使用的術語“室溫”是指15℃至30℃、較佳20℃至27℃、更佳25℃的溫度。

“脅迫條件”是指在化學和/或物理上不利於抗體蛋白的環境，該環境可以導致不可接受的抗體蛋白失穩定。“高溫脅迫”是指，將抗體製劑置於室溫或甚至於更高溫度(例如40℃±2℃)儲存一段時間。藉由高溫脅迫加速試驗，可以檢查抗體製劑的穩定性。

如本文所使用，術語“腸胃外施用”意指腸內和局部給藥以外的給藥方式，通常藉由注射或輸注方式，並且包括但不限於，靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下(subcuticular)、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射以及輸注。在一些實施方案中，本發明的穩定抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白製劑腸胃外施用於受試者。在一個實施方案中，本發明的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白製劑以皮下、皮內、肌內或靜脈內注射方式施用於受試者。

I.抗體製劑

本發明提供穩定的液體抗體製劑，其包含(i)抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白，(ii)緩衝劑，(iii)穩定劑，和(iv)表面活性劑，該抗體製劑的pH為約5.0-6.5。在一個較佳方案中，本發明的液體抗體製劑是注射製劑形式。

(i)抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白

本發明抗體製劑中的“抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白”包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合PD-1的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合HER2的第二VH/VL單元。在一些實施方案中，該抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與T淋巴細胞表面的PD-1結合，且能夠以至少約10⁷M^-1、較佳地約10⁸M^-1和更佳地約10⁹M^-1或更強的親和力常數與腫瘤細胞表面的HER2結合，以致該抗體可以用作雙特異性靶向PD-1分子和HER2分子的治療劑和/或預防劑。

對於該特異性結合PD-1或HER2的VH/VL單元，其包含衍生自任何現有技術中報導的抗PD-1抗體和將來研發出的抗PD-1抗體VH/VL單元的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列；或者包含衍生自任何現有技術中報導的抗HER2抗體和將來研發出的抗HER2抗體VH/VL單元的6個CDR或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的特異性結合PD-1的第一VH/VL單元包含衍生自抗PD-1半抗體的SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：10的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中所含的全部6個重鏈CDR與輕鏈CDR，或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的特異性結合HER2的第二VH/VL單元包含衍生自抗HER2半抗體的SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：2的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列中所含的全部6個重鏈CDR與輕鏈CDR，或與該6個CDR中的一個或多個CDR具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個胺基酸變化(例如，胺基酸置換或缺失)的序列。

術語“CDR”或“互補決定區”或“CDR區”(在本文中與超變區“HVR”可以互換使用)，是抗體可變區中主要負責與抗原表位結合的胺基酸區域。重鏈和輕鏈的CDR通常被稱作CDR1、CDR2和CDR3，從N-端開始順序編號。本領域公知多種用於在一個給定的VH或VL或VHH胺基酸序列中確定其CDR序列的方案。例如，Kabat互補決定區(CDR)是基於序列變異性確定的並且是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。而Chothia指的是結構環的位置(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR是Kabat HVR和Chothia結構環之間的折中，並且由Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體使用。“接觸性”(Contact)HVR基於對可獲得的複雜晶體結構的分析。

該胺基酸變化，例如，胺基酸置換較佳地是保守胺基酸取代。“保守胺基酸取代”是指導致某個胺基酸置換為化學上相似的胺基酸的胺基酸改變。提供功能上相似胺基酸的保守性置換表是本領域熟知的。在本發明任一實施方案中，在一個較佳的方面，保守取代殘基來自以下的保守替代表A，較佳地為表A中所示較佳置換殘基。

表A

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合PD-1的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合HER2的第二VH/VL單元，其中該第一VH/VL單元包含SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：10的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列，並且其中該第二VH/VL單元包含SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：2的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，或與該成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列同一性的序列。

不特別地限制抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白中第一半抗體和第二半抗體的重鏈恆定區的類型，較佳地是IgG1、IgG2或IgG4免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。更佳地，該重鏈恆定區是人IgG1免疫球蛋白的重鏈恆定區，或與之基本上同一(例如，至少80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或更多同一)的序列。

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含IgG1(例如，人IgG1)中使用的重鏈恆定區。在又一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含用於IgG4(例如，人IgG4)的重鏈恆定區。例如，抗PD-1/HER2雙特異性抗體的兩條重鏈的Fc結構域中分別包含具有“CPPC”胺基酸殘基的鉸鏈區，和/或分別包含Y349C和S354C(根據Kabat的“EU編號”)，由此，抗PD-1半抗體和抗HER2半抗體在Fc區形成鏈間二硫鍵，由此，穩定抗PD-1半抗體和抗HER2半抗體的正確配對。

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的抗PD-1半抗體和/或抗HER2半抗體在Fc結構域中包含影響抗體效應子功能的胺基酸突變。在一個具體實施方案中，該效應子功能是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性(ADCC)。在一個實施方案中，該胺基酸突變存在於Fc區的CH2結構域，例如，該抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含在抗PD-1半抗體和/或抗HER2半抗體Fc區第234和235位置(EU編號)處的胺基酸置換。在一個具體實施方案中，該胺基酸置換是L234A和L235A(也稱為“LALA突變”)。

在又一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的輕鏈包含κ輕鏈恆定區或者λ輕鏈恆定區，例如，人κ輕鏈恆定區或者人λ輕鏈恆定區。

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的兩條重鏈各自的Fc結構域中分別包含凸起(“結(knob)”)或空穴(“扣(hole)”)，並且一條重鏈Fc結構域中的該凸起或空穴可分別置於另一條重鏈Fc結構域中的該空穴或凸起中，由此該兩條重鏈彼此形成“結入扣(knob-in-hole)”的穩定締合。在一個實施方案中，在該兩條重鏈之一條鏈中包含胺基酸置換T366W，並且在該兩條重鏈之另一條鏈中包含胺基酸置換T366S、L368A和Y407V(EU編號)。由此一條鏈中的凸起能夠置於另一條鏈中的空穴中，促進抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的兩條重鏈的正確配對。

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的各半抗體中的重鏈和輕鏈的免疫球蛋白CH1結構域和CL結構域中分別包含凸起或空穴，並且CH1結構域中的該凸起或空穴可分別置於CL結構域中的該空穴或凸起中，從而各半抗體中的重鏈和輕鏈彼此也形成“結入扣”的穩定締合。

在一個實施方案中，抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含從N至C方向的SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和從N至C方向的SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：4的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列，並且其中第二半抗體包含從N至C方向的SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的重鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的重鏈序列，和從N至C方向的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的輕鏈序列或與之具有至少90%、95%、98%或99%同一性的輕鏈序列。

在本文中，“序列同一性”是指在比較窗中以逐個核苷酸或逐個胺基酸為基礎的序列相同的程度。可以藉由以下方式計算“序列同一性百分比”：將兩條最佳比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同一性百分比。為了確定序列同一性百分數而進行的最佳比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。

本發明抗體製劑中的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白能夠同時與PD-1和HER2蛋白結合，且維持了各親本抗體的親和力常數，由此，能夠阻斷HER2信號傳導通路和阻斷PD-1信號傳導通路，從而用於治療、預防或延緩各種與HER2信號傳導通路和/或與PD-1信號傳導通路相關的疾病或病症。

在一個較佳的實施方案中，本發明的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白是PCT申請號PCT/CN2018/075851(申請日：2018年2月8日)中公開的重組抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白，其包含全人源抗PD-1半抗體和人源化抗HER2半抗體，其中全人源抗PD-1半抗體的重鏈序列從N至C方向為SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14，輕鏈序列從N至C方向為SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：4，並且其中人源化抗HER2半抗體的重鏈序列從N至C方向為SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8，輕鏈序列從N至C方向為SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4。

在一個實施方案中，該抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白由HEK293細胞或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E細胞；CHO細胞或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr^-、CHO/DG44、ExpiCHO重組表達產生並經純化。較佳地，在本發明液體製劑中的該抗體表現出顯著的抗腫瘤活性。對使用HCC1954人乳腺癌細胞接種免疫缺陷NCG小鼠產生的荷瘤小鼠施用抗PD-1/HER2雙特異性抗體，結果表明，與施用抗PD-1單株抗體或抗HER2單株抗體相比較，施用抗PD-1/HER2雙特異性抗體具有顯著提高的抗腫瘤活性，可以導致腫瘤體積的顯著縮小。

本發明的抗體製劑中所包含的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的量可隨著製劑的特定目的特性、特定環境、和使用製劑的特定目的而改變。在一些實施方案中，抗體製劑為液體製劑，其可含有約1-150mg/ml，較佳地為約10-100mg/mL，例如約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白。

(ii)緩衝劑

緩衝劑是可以將溶液的pH維持在可接受範圍的試劑。在一些實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑可以將本發明製劑的pH控制在大約5.0-6.5的pH範圍，例如約5.5的pH。在一些具體的實施方案中，本發明的抗體製劑具有約5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4的pH。

在一些實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑選自組胺酸、鹽酸組胺酸和它們的組合。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約5-50mM。在一個實施方案中，本發明的液體抗體製劑中的緩衝劑的濃度為約10-30mM，例如，約10、15、20、25、30mM。

在一個實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑是約10mM組胺酸。在另一個實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑是約20mM組胺酸。

又在一個實施方案中，用於本發明製劑中的緩衝劑是約5.5mM組胺酸和約15mM鹽酸組胺酸的組合。

(iii)穩定劑

用於本發明的合適的穩定劑可以選自糖類、多元醇及其組合。進一步地，本發明的穩定劑還可以包含抗氧化劑。

作為穩定劑的糖類可以是二糖、三糖和多糖，而且糖類可以選自但不限於：蔗糖、右旋糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、環糊精、麥芽糖糊精和葡聚糖。在一個實施方案中，作為穩定劑的糖類是蔗糖和/或海藻糖。

作為穩定劑的多元醇可以選自但不限於：甘露醇、山梨醇和木糖醇。在一個實施方案中，作為穩定劑的多元醇是山梨醇。

在一些實施方案中，作為穩定劑的糖類和/或多元醇在本發明的液體製劑中以約50-500mM，較佳地約100-400mM，例如，約100、150、200、250、300、350、400mM的濃度存在。

本發明的穩定劑中還可以包含的抗氧化劑選自但不限於：同型半胱胺酸、半胱胺酸、胱硫醚、甲硫胺酸、谷胱甘肽、以及包含同型半胱胺酸、半胱胺酸、胱硫醚、甲硫胺酸和谷胱甘肽中任意一種的肽。在包含抗氧化劑的情形下，穩定劑的總濃度為約50-500mM，較佳地總濃度為約100-400mM，例如，約100、150、200、250、300、350、400mM，其中抗氧化劑的濃度為約1-50mM，較佳地約5-40mM，例如約5、10、20、30、40mM。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含山梨醇作為穩定劑。山梨醇在本發明液體製劑中的量可以是約50-400mM，例如，約50、100、150、200、250、300、350、400mM。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含蔗糖作為穩定劑。蔗糖在本發明液體製劑中的量可以是約50-300mM，例如，約50、100、150、200、250、300mM。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含海藻糖作為穩定劑。海藻糖在本發明液體製劑中的量可以是約50-300mM，例如，約50、100、150、200、250、300mM。

在一個實施方案中，本發明液體製劑包含蔗糖和甲硫胺酸的組合作為穩定劑。該組合中，穩定劑的總濃度為約50-500mM，較佳地總濃度為約100-400mM，例如，約100、150、200、250、300、350、400mM，其中甲硫胺酸的濃度為約1-50mM，較佳地約5-40mM，例如約5、10、20、30、40mM。

(iv)表面活性劑

如本文所使用的，術語“表面活性劑”是指具有兩親結構的有機物質；即，它們由相反的溶解性傾向的基團所組成，通常是油溶性的烴鏈和水溶性的離子基團。

在一個實施方案中，本發明的液體製劑中的表面活性劑是非離子型表面活性劑，例如，烷基聚(環氧乙烯)。可包括在本發明製劑中的特定非離子型表面活性劑包括，例如聚山梨酯，諸如聚山梨酯-20、聚山梨酯-80、聚山梨酯-60、或聚山梨酯-40；普洛尼克等。在一個較佳實施方案中，本發明的液體製劑中包含聚山梨酯-80作為表面活性劑。

本發明抗體製劑中所含的表面活性劑的量可隨製劑的特定目的特性、特定環境、和使用製劑的特定目的而改變。在較佳的一些實施方案中，製劑可含有約0.1-1mg/ml，較佳地約0.2-0.8mg/ml，例如約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/ml的聚山梨酯類表面活性劑(例如，聚山梨酯-80)。

(v)其它賦形劑

本發明的抗體液體製劑中可以包含或不包含其它賦形劑。例如，本發明的抗體液體製劑還包含張力調節劑。張力調節劑可以選自下組：醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣。

這些和另外已知的藥物賦形劑和/或適用於本發明製劑的添加劑是本領域公知的，例如，列出於“The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等人編，American Pharmaceuticals Association(2003)；和Remington：the Science and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro編，Lippincott Williams & Wilkins(2005)”。

II.製劑的製備

本發明提供了包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的穩定製劑。在本發明製劑中使用的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白可以使用本領域已知的用於生產抗體的技術進行製備。例如，可以重組製備抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白。在一個較佳的實施方案中，本發明的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白藉由在HEK293細胞或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E細胞；CHO細胞或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr^-、CHO/DG44、ExpiCHO中重組表達而製備，例如，如PCT申請號PCT/CN2018/075851中所述，重組製備抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白。

抗體作為藥物的活性成分的應用現在已經很廣泛。用於將治療性抗體純化至藥用級的技術是本領域公知的。例如，Tugcu等(Maximizing productivity of chromatography steps for purification of monoclonal antibodies,Biotechnology and Bioengineering 99(2008)599-613)描述了在蛋白A捕獲步驟後使用離子交換色譜(陰離子IEX和/或陽離子CEX色譜)的抗體三管柱純化方法。 Kelley等(Weak partitioning chromatography for anion exchange purification of monoclonal antibodies,Biotechnology and Bioengineering 101(2008)553-566)描述了兩管柱純化法，其中在蛋白A親和色譜後使用弱分配陰離子交換樹脂。

一般地，重組產生的抗體可以利用常規的純化方法純化，以提供具有足夠的可重複性和適度純度的藥物物質用於抗體製劑的配製。例如，在抗體從重組表達細胞分泌至培養基中後，可以使用商業可得的蛋白濃縮過濾器例如Amicon的超濾裝置，濃縮來自該表達系統的上清液。之後，可以使用例如色譜、透析和親和純化等方式進行抗體的純化。蛋白A適應於作為親和配體用於純化IgG1、IgG2和IgG4型抗體。也可以使用其它抗體純化方法，例如離子交換色譜。在獲得足夠純度的抗體後，可以按照本領域已知的方法，製備包含抗體的製劑。

例如，可以採用如下步驟進行製備：(1)在發酵結束後將發酵液離心澄清去除細胞等雜質以獲得上清；(2)使用親和層析(例如對IgG1、IgG2和IgG4型抗體具有特異親和力的蛋白A管柱)捕獲抗體；(3)進行病毒滅活；(4)精製純化(一般可以採用CEX陽離子交換層析)，以去除蛋白中的雜質；(4)病毒過濾(使病毒滴度降低例如4 log10以上)；(5)超濾/滲濾(可以用於將蛋白置換於利於其穩定的製劑緩衝液中並濃縮至合適的濃度供注射用)。參見例如，B.Minow,P.Rogge,K.Thompson,BioProcess International,Vol.10,No.6,2012,pp.48-57。

III．製劑的分析方法

在抗體製劑的儲存過程中，抗體可能會發生聚集、降解或化學修飾，導致抗體異質性(包括大小異質性和電荷異質性)以及聚集物和片段等，從而影響抗體製劑的質量。因此，有必要進行抗體製劑穩定性的監測。

在本領域中已知多種方法可以用於檢測抗體製劑的穩定性。例如，可以藉由還原型CE-SDS、非還原型CE-SDS和SEC-HPLC等方法，分析抗體製劑的純度和評估抗體的聚集水平；可以藉由毛細管等電聚焦電泳(cIEF)、成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)和離子交換色譜(IEX)等，分析抗體製劑中的電荷變異體。此外，可以藉由目視檢測製劑外觀，快速地判斷製劑的穩定性。也可以使用OD_350nm法檢測製劑的濁度改變，該方法可以給出有關可溶性和不溶性聚集物量的信息。此外，可以使用紫外分光光度法(UV法)檢測製劑中的蛋白質含量變化。

非還原型CE-SDS法是一種以毛細管為分離通道進行的抗體純度測定方法。在CE-SDS中，蛋白遷移由SDS結合引起的表面電荷來驅動，而該表面電荷與蛋白質的分子量成正比。由於所有的SDS-蛋白質複合物都具有相似的質量-電荷比，故可以在毛細管的分子篩凝膠基質中，實現基於分子的大小或流體動力學半徑的電泳分離。該方法已經被廣泛地用於監測變性的完整抗體的純度。一般，在非還原型CE-SDS法中，供試樣品與SDS樣品緩衝液和碘乙醯胺混合。之後，混合物可以於68-72℃孵育約10-15分鐘，冷卻至室溫後離心的上清液用於分析。採用紫外檢測器檢測蛋白的遷移，獲得電泳譜圖。抗體製劑純度可以計算為IgG主峰的峰面積占所有峰面積之和的百分比。關於CE-SDS法的進一步描述，可以參見例如Richard R.等，Application of CE SDS gel in development of biopharmaceutical antibody-based products,Electrophoresis,2008,29,3612-3620。

尺寸排阻高效液相色譜法，即SEC-HPLC法，是用於抗體標準和質控的另一重要方法。該方法主要依據分子的尺寸大小或流體動力學半徑差異來進行分子的分離。藉由SEC-HPLC，抗體可以分離出三種主要形式：高分子量形式(HMMS)、主峰(主要是抗體單體)、和低分子量形式(LMMS)。抗體純度可以計算為色譜圖上主峰面積占所有峰面積之和的百分比。藉由SEC-HPLC法，可以測量製劑產品中抗體單體的百分數，給出可溶性聚集物和剪切物的含量信息。關於SEC-HPLC法的進一步描述，可以參見例如，J.Pharm.Scien.,83：1645-1650,(1994)；Pharm.Res.,11：485(1994)；J.Pharm.Bio.Anal.,15：1928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.,14：1133-1140(1986)。此外，也可以參見例如，R.Yang等，High resolution separation of recombinant monoclonal antibodies by size exclusion ultra-high performance liquid chromatography(SE-UHPLC),Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2015),http：//dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2015.02.032；和Alexandre Goyon等，Protocols for the analytical characterization of therapeutic monoclonal antibodies.I-Non-denaturing chromatographic techniques,Journal of Chromatography，http：//dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2017.05.010。

成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF)可以用於分析抗體的電荷異質性。該方法可以提供電荷變異體的定量分佈情況。iCIEF基於分子在pH梯度中的電荷差異(表觀pI值)來實現分子分離的目的。在iCIEF中，分離管柱通常是短毛細管(例如，5cm長，100μm內徑的二氧化矽毛細管)，蛋白質在高電壓下在毛細管管柱中聚焦，並藉由在280nM操作的全管柱成像檢測系統對聚焦進行實時在線監測。該技術的一個優點是，可以藉由該全管柱檢測系統同時記錄抗體樣品的各種電荷變異體。一般而言，在icIEF中，將樣品與尿素和icIEF緩衝液混合，其中該緩衝液含有甲基纖維素、pI分子量標準和兩性電解質。然後，可以在iCIEF分析儀例如iCE280分析儀(Protein Simple,Santa Clara,CA)上，使用iCIEF管柱例如ProtionSimple組裝的iCIEF管柱，在樣品聚焦一定時間後，測定280nm的吸光度，獲得聚焦抗體電荷變異體的譜圖。在iCEIF譜圖中，在主峰(即主成分)之前洗脫的蛋白相關峰被分類為酸性組分；相對地，在主峰之後洗脫的蛋白相關峰被分類為鹼性組分。主成分、酸性組分和鹼性組分的相對量可以表示為占總峰面積的百分數。關於iCIEF的進一步描述，可以參見例如，Salas-Solano O等，Robustness of iCIEF methodology for the analysis of monoclonal antibodies：an interlaboratory study,J Sep Sci.2012 Nov；35(22)：3124-9.doi：10.1002/jssc.201200633.Epub 2012 Oct 15；和Dada OO等，Characterization of acidic and basic variants of IgG1 therapeutic monoclonal antibodies based on non-denaturing IEF fractionation,Electrophoresis.2015 Nov；36(21-22)：2695-2702.doi：10.1002/elps.201500219.Epub 2015 Sep 18.

也可以藉由陽離子交換高效液相色譜法(CEX-HPLC)測定抗體製劑中抗體的電荷變異體。在該測定法中，以比主峰的保留時間更早從CEX-HPLC管柱洗脫出的峰被標記為“酸性峰”，而那些以比主峰的保留時間更晚從CEX-HPLC管柱洗脫出的峰被標記為“鹼性峰”。

加速穩定性研究可以用於檢查產品的穩定性性質，有利於篩選穩定藥物製劑形式。例如，可以將製劑樣品放置於升高的溫度，例如約40℃±2℃、25℃±2℃條件下進行加速穩定性研究。檢測指標可以包括外觀、可見異物、蛋白含量、濁度、純度(SEC-HPLC法、非還原型CE-SDS法)和電荷變異體(iCIEF法、CEX-HPLC法)。

此外，可以檢測抗體的功效或生物活性。例如，可以檢測製劑中抗體與其抗原分子(HER2分子和PD-1分子)的結合能力。本領域技術人員已知多種方法可以用於定量抗體與抗原的特異性結合，例如免疫測定試驗，ELISA等。

本發明的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白製劑是穩定的。在一個實施方案中，於約5℃、25℃、37℃、40℃、或45℃儲存至少1個月、2個月或3個月後，例如，在5℃±3℃儲存3個月後，本發明的抗體製劑中的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白純度是至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上，如藉由尺寸排阻色譜法或藉由非還原型CS-SDS所測定。在一個實施方案中，於約5℃、25℃、37℃、40℃、或45℃儲存至少1個月、2個月或3個月後，例如，在5℃±3℃儲存3個月後，本發明的抗體製劑中抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的至少60%，較佳至少65%是非鹼性及非酸性形式(亦即，主峰或主要電荷形式)，如藉由iCIEF法所測定。

IV．製劑的用途

本發明的包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的本發明的抗體製劑可以用於治療、預防或延緩各種與HER2信號傳導通路和/或與PD-1信號傳導通路相關的疾病或病症。“與HER2信號傳導通路相關的疾病或病症”和/或“與PD-1信號傳導通路相關的疾病或病症”在本文中指可以用本發明抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白製劑進行治療(例如改善)或預防的疾病或病症。任何可以得益於本發明抗體製劑治療的疾病或病症都適用於本發明。

包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的本發明製劑能夠用於預防或治療受試者的各種血液病和實體瘤，包括但不限於白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黑色素瘤。

本發明也提供本發明的製劑在製備藥物中的用途，其中該藥物用於向哺乳動物遞送抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白，或用於治療、預防或改善上述疾病和病症中的一種或多種。較佳地，哺乳動物是人。

可以以多種途徑將本發明的抗體製劑施用於受試者或患者。例如，施用可以藉由輸注或藉由注射器進行。因此，在一個方面，本發明提供了一種遞送裝置(例如注射器)，其包含本發明的抗體製劑(例如，預填裝注射器)。患者將接受有效量的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白作為主要活性成分，即足以治療、改善或預防目的疾病或病症的量。

治療效果可包括減少生理症狀。用於任何特定受試者的抗體的最佳有效量和濃度將取決於多種因素，包括患者的年齡、體重、健康狀況和/或性別、疾病的性質和程度、特定抗體的活性，身體對其清除率，並且也包括與該抗體製劑組合施用的任何可能的其它治療。對於具體的情況，所遞送的有效量可以在臨床醫師的判斷範圍內來確定。取決於待治療的適應症，有效劑量可為約0.005mg/kg體重至約50mg/kg體重，或約0.1mg/kg體重至約20mg/kg體重。在這方面，已知的基於抗體的藥物的應用可以提供一定的指導。劑量可以是單劑量方案或多劑量方案。

描述以下實施例以輔助對本發明的理解。不意在且不應當以任何方式將實施例解釋成限制本發明的保護範圍。

縮略詞描述

CE-SDS：十二烷基硫酸鈉毛細管凝膠電泳

ELISA：酶聯免疫吸附測定法

iCIEF：成像毛細管等電聚焦電泳

SEC-HPLC：尺寸排阻高效液相色譜法

實施例

為了開發出重組抗程序性死亡受體1(PD-1)和抗人表皮生長因子受體2(HER2)雙特異性抗體注射液長期穩定儲存的製劑處方，確保產品在有效期內(至少24個月)的質量可控，設計了處方篩選試驗，考察了不同輔料對於抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑穩定性的影響。試驗所用材料和方法如下：

材料和方法

1.1.本發明的製劑研究中使用的材料

1.2.本發明的製劑研究中使用的儀器設備

1.3．製劑穩定性的檢測項目和檢測方法

對抗體製劑檢測了以下項目：(1)檢測外觀以及是否存在可見異物；(2)藉由紫外法(UV法)測定製劑中的蛋白質含量；(3)藉由檢測在350nm處的吸光度，測定濁度；(4)藉由尺寸排阻色譜法，例如，尺寸排阻高效液相色譜法(size-exclusion chromatography-HPLC；SEC-HPLC)測定抗體製劑的純度，表示為單體的面積占所有峰面積之和的百分數；(5)藉由還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(還原型CE-SDS)和/或非還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(非還原型CE-SDS)測定抗體製劑的純度，表示為單體的面積占所有峰面積之和的百分數；(6) 藉由成像毛細管等電聚焦電泳法(iCIEF法)測定抗體製劑中電荷變異體，表示為主成分、酸性組分和鹼性組分的百分數；(7)藉由免疫測定法，例如，直接ELISA法測定抗體製劑中抗PD-1/HER2雙特異性抗體對PD-1抗原和HER2抗原的相對結合活性。

可見異物檢測

按照國家藥典委員會，中華人民共和國藥典(2015年版，四部通則0904“可見異物檢查法”，北京：中國醫藥科技出版社.2015)中所記載的方法，採用澄明度檢測儀(天津天大天發生產，型號YB-2)，檢查樣品中的可見異物。

蛋白含量測定

使用紫外分光光度計(日本島津生產，型號UV-1800)測定樣品中的蛋白質含量。

濁度測定

使用紫外分光光度計(日本島津生產，型號UV-1800)，測定樣品在350nm的吸光度，確定樣品濁度。

純度(SEC-HPLC法)

使用體積排阻色譜管柱分離，流動相為磷酸鹽緩衝液(稱取3.12g二水合磷酸二氫鈉，8.77g氯化鈉和34.84g精胺酸，超純水溶解後用鹽酸調節pH至6.8並定容至1000ml)，色譜管柱保護液為0.05%(w/v)NaN₃，進樣量50μl，流速0.5ml/分鐘，採集時間30分鐘，管柱溫25℃，檢測波長280nm。取待測樣品用超純水稀釋至2mg/ml，作為供試品溶液。取製劑緩衝液用上述相同處理方式稀釋後做為空白溶液。取空白溶液、供試品溶液各50μl注入液相色譜儀，開始檢測。

純度(還原型CE-SDS法)

採用毛細管凝膠電泳法檢測。毛細管為無塗層毛細管，內徑50μm，總長30.2cm，有效長度20.2cm。電泳前分別使用0.1mol/L氫氧化鈉、0.1mol/L鹽酸、超純水、電泳膠70psi沖洗毛細管管柱。將待測樣品用適量超純水稀釋至2.0mg/ml，取以上稀釋後的樣品50μl於1.5ml離心管中，分別向其中加入45μl pH 6.5的樣品緩衝液(稱取一水檸檬酸0.32g，十二水合磷酸氫二鈉2.45g，溶於45ml超純水中，定容至50ml，制得檸檬酸-磷酸鹽緩衝液，精密量取該緩衝液200μl，加10%(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液80μl，加水至1ml，混勻，即得)、1μl內標(10kDa蛋白質，5mg/mL)(Beckman Coulter，貨號：390953)和5μl β-巰基乙醇，充分混勻後70±2℃加熱10±2分鐘，冷卻至室溫後轉移至樣品瓶作為供試品溶液。取與供試品相同體積的製劑緩衝液，按上述方法同樣操作，制得空白溶液。樣品進樣條件：-5kV 20秒；分離電壓：-15kV 35分鐘。毛細管管柱溫控制在25℃，檢測波長為220nm。

純度(非還原型CE-SDS法)

採用毛細管凝膠電泳法檢測。毛細管為無塗層毛細管，內徑50μm，總長30.2cm，有效長度20.2cm。電泳前分別使用0.1mol/L氫氧化鈉、0.1mol/L鹽酸、超純水、電泳膠70psi沖洗毛細管管柱。將待測樣品用適量超純水稀釋至2.0mg/ml，取以上稀釋後的樣品50μl於1.5ml離心管中，分別向其中加入45μl pH 6.5的樣品緩衝液(稱取一水檸檬酸0.32g，十二水合磷酸氫二鈉2.45g，溶於45ml超純水中，定容至50ml，制得檸檬酸-磷酸鹽緩衝液，精密量取該緩衝液200μl，加10%(w/v)十二烷基硫酸鈉溶液80μl，加水至1ml，混勻，即得)、1μl內標(10kDa蛋白質，5mg/mL)(Beckman Coulter，貨號：390953)和 5μl 250mmol/L NEM溶液(稱取N-乙基順丁稀二醯亞胺62mg，溶於2ml超純水中)，充分混勻後70±2℃加熱10±2分鐘，冷卻至室溫後轉移至樣品瓶作為供試品溶液。取與供試品相同體積的製劑緩衝液，按上述方法同樣操作，制得空白溶液。樣品進樣條件：-5kV 20秒；分離電壓：-15kV 35分鐘。毛細管管柱溫控制在25℃，檢測波長為220nm。

電荷變異體(iCIEF法)

採用成像毛細管等電聚焦電泳(iCIEF法)檢測。毛細管內徑100μm，總長5cm。樣品電泳前需分別使用0.5%甲基纖維素溶液(下文中也縮寫為MC溶液)、超純水沖洗毛細管管柱。採用真空進樣方式，預聚焦電壓及時間為1.5kV 1分鐘，聚焦電壓及時間為3kV 8分鐘，進樣時間55秒，樣品盤溫度為10℃，檢測波長為280nm。陰極穩定劑(Cathodic Stabilizer)為500mmol/L精胺酸溶液，0.5% MC溶液降低蛋白與毛細管之間的粘附。將供試品用水稀釋至1.0mg/ml，取稀釋後的供試品溶液20μl，向其中加入78μl預混液(預混液配比如下：70μl pI 0.5% MC溶液，4μl兩性電解質(pH 3-10)，2μl陰極穩定劑，1μl pI 5.85標誌物，1μl pI 9.99標誌物)，充分混勻制得待測樣品溶液。進樣分析，根據面積歸一化法，計算主成分、酸性組分及鹼性組分含量。

相對結合活性(直接ELISA法)

用CBS稀釋抗原(檢測抗PD-1/HER2雙特異性抗體的抗PD-1端對PD-1的相對結合活性時，使用購自Sinobiological的重組人PD-1，貨號：10377-H08H；檢測抗PD-1/HER2雙特異性抗體的抗HER2端對HER2的相對結合活性時，使用購自Sinobiological的Human HER2/ErbB2 Protein(His Tag)，貨號：10004-H08H-100)至0.5μg/ml，100μl/孔，4℃過夜包被於96孔酶標板上。洗板後加封閉液(2% BSA-PBST，300μl/孔)37℃封閉2h。以2% BSA-PBST稀釋抗PD-1/HER2雙特異性抗體至3μg/ml，3倍梯度稀釋至第11個濃度(0.05~3000ng/ml)。將梯度稀釋的供試品以100μl/孔加入到棄去封閉液的酶標板中，設置陰性對照每孔只加100μl稀釋液(2% BSA-PBST)，37℃恆溫培養箱中孵育60min。洗板後加入以2% BSA-PBST稀釋的HRP綴合山羊抗人IgG-Fc片段(美國BETHYL，貨號A80-104P)作為二抗(100000倍稀釋，100μl/孔)，37℃反應30min。洗板後每孔加入100μl TMB顯色液，顯色10min後，每孔加入100μl的1mol/L H₂SO₄終止反應。以620nm為參比波長，測450nm處的OD值。以各濃度梯度樣品的濃度值作為橫坐標，各梯度樣品的OD450nm-OD620nm值為縱坐標，應用Prism四參數擬合計算EC₅₀反映抗體與各抗原的結合活性。

實施例1.製備和純化抗PD-1/HER2雙特異性抗體

根據PCT申請號PCT/CN2018/075851所述，製備和純化抗PD-1/HER2雙特異性抗體。

具體而言，分別構建含抗人PD-1的抗體重鏈和輕鏈的X0GC表達載體(X0GC表達載體的構建參見中國專利申請號200780038403.3)，其中輕鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示；輕鏈恆定區核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：12所示；重鏈恆定區核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

分別構建含抗人HER2的抗體重鏈和輕鏈的X0GC表達載體，其中輕鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示；輕鏈恆定區核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示；重鏈可變區核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示；重鏈恆定區核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

分別將該含抗人PD-1抗體的重鏈和輕鏈的表達載體轉染293F細胞(FreeStyle^TM 293-F Cells，貨號R79007,invitrogen)，表達、純化和藉由還原過程，得到含有一條重鏈和一條輕鏈的抗人PD-1半抗體分子。

類似地，分別將該含抗人HER2抗體的重鏈和輕鏈的表達載體轉染293F細胞(FreeStyle^TM 293-F Cells，貨號R79007,invitrogen)，表達、純化和藉由還原過程，得到含有一條重鏈和一條輕鏈的抗人HER2半抗體分子。

將還原的抗PD-1半抗體分子以及還原的抗HER2半抗體分子以等莫耳比例混合，在4℃條件下進行重組反應24小時，獲得了含有抗PD-1半抗體分子以及抗HER2半抗體分子的異源二聚體的雙特異性抗體的溶液。對該溶液藉由超濾濃縮管超濾濃縮後，採用AKTA explorer 100型蛋白純化系統(GE Healthcare)以及離子色譜管柱Source 15S(16mm I.D.，17ml，GE Healthcare)於4℃純化，獲得了純度為99.96%的抗PD-1/HER2雙特異性抗體。

實施例2. pH對製劑的穩定性影響試驗之一

本實施例考察了包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體的製劑在pH 5.0至6.5的穩定性。共設計了4個pH值，分別為5.0、5.5、6.0和6.5。

2.1 實驗步驟

配製10mM組胺酸，5%(w/v)山梨醇緩衝液，用稀鹽酸將pH分別調節為5.0、5.5、6.0和6.5，將實施例1的經純化的抗PD-1/HER2雙特異性抗體超濾置換到該不同pH值的溶液中。置換完成後，調節樣品中的雙特異性抗體蛋白含量至約20mg/ml；然後加入聚山梨酯80，使聚山梨酯80的終濃度為0.30mg/ml；過濾分裝至西林瓶中，加塞、軋蓋。將各樣品於40℃±2℃條件下進行穩定性考察，具體實驗方案見表1。

表1.實驗方案

2.2 判斷標準

根據對產品的認識以及儀器和方法的精密度，設定了樣品檢測指標數值與初始值相比質量未發生變化的判定標準，用以判斷樣品是否發生了變化，具體見表2。

表2.質量未發生變化的判斷標準

2.3 處方篩選試驗之一的實驗結果

(1)外觀和可見異物

在40℃±2℃條件下放置一個月後，pH 5.0、pH 5.5、pH 6.0和pH 6.5樣品外觀和可見異物均合格。

(2)蛋白含量

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，各樣品的蛋白含量檢測結果見表3。結果表明，在40℃±2℃條件下放置1個月，各pH值樣品均未發生顯著變化。

表3.在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，各樣品的蛋白含量(UV法，mg/ml)

(3)濁度

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，各樣品的濁度檢測結果見表4，其變化趨勢見圖2。結果表明，在40℃±2℃條件下放置1個月，各pH值樣品的濁度均升高，且pH越高，濁度變化速率越快。

表4.在各pH下於40℃±2℃放置不同時間後，各樣品的濁度結果(OD_350nm法)

(4)純度

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由SEC-HPLC法測定各樣品的蛋白純度。結果見表5，其變化趨勢見圖3。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，不同pH值的樣品純度均未發生明顯變化。

表5.藉由SEC-HPLC法對各樣品測定的蛋白純度(%)

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由非還原型CE-SDS法分別測定各樣品的蛋白純度。結果見表6，其變化趨勢見圖4。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，各pH值樣品純度均下降，與0天的樣品純度比較分別下降了2.6%、2.5%、2.5%和3.2%。

表6.藉由非還原型CE-SDS法對各樣品測定的蛋白純度(%)

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由還原型CE-SDS法分別測定各樣品的蛋白純度。結果見表7，其變化趨勢見圖5。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，各pH值樣品純度與0天的樣品純度比較分別下降了0.4%、0.7%、0.6%和1.4%。

表7.藉由還原型CE-SDS法對各樣品測定的蛋白純度(%)

(5)電荷變異體

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由iCIEF法測定各樣品的電荷變異體。結果見表8，其變化趨勢見圖6。結果表明，在40℃±2℃條件下考察1個月，各pH值樣品主成分和酸鹼各組分均發生明顯變化。pH值越高，樣品的主成分下降越快，酸性組分上升越快。

表8.藉由iCIEF法測定的各樣品的電荷變異體(%)

(6)相對結合活性

在pH 5.0、5.5、6.0和6.5於40℃±2℃放置不同時間後，藉由直接ELISA法測定各樣品的相對結合活性。結果見表9。結果表明，在40℃±2℃條件下考察2週時，各樣品結合PD-1抗原和HER2抗原的相對結合活性均高於70%；pH 6.0和pH 6.5的樣品抗HER2端相對結合活性有明顯下降，均低於70%；在40℃±2℃條件下考察1個月時，各樣品結合PD-1抗原的相對結合活性仍高於 70%，僅pH 6.0和pH 6.5的樣品結合HER2抗原的相對結合活性低於70%，但仍高於50%。

表9.藉由直接ELISA法測定的樣品的相對結合活性(%)

以上進行的pH對製劑的穩定性影響試驗結果表明，抗PD-1/HER2雙特異性抗體在pH 5.0-6.5於40℃±2℃放置2週，樣品外觀和可見異物均合格，蛋白含量未發生顯著變化，且對HER2抗原和PD-1抗原的相對結合活性也未發生明顯變化；另外，抗PD-1/HER2雙特異性抗體在pH 5.0-6.5於40℃±2℃放置一個月，樣品外觀和可見異物均合格，蛋白含量未發生顯著變化，且對PD-1抗原的相對結合活性也未發生明顯變化，抗PD-1/HER2雙特異性抗體僅在pH 6.0和pH 6.5的情形下，結合HER2抗原的相對結合活性下降，但仍高於50%。在隨後的實施例中，從pH 5.0-6.5中選擇pH 5.5進行實驗。

實施例3.處方篩選試驗

3.1 穩定劑篩選試驗

考察了不同穩定劑：作為多元醇的山梨醇；作為糖類的蔗糖、海藻糖；作為抗氧化劑的甲硫胺酸等對包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體製劑穩定性的影響。

3.1.1 穩定劑篩選試驗步驟

共設計了4個處方，詳細處方信息見表10。按照表10配製各個處方的緩衝液，將抗PD-1/HER2雙特異性抗體超濾置換至各自的處方溶液中。置換完成後，調節各處方的蛋白含量至約50.0mg/ml；加入聚山梨酯80，使聚山梨酯80的終濃度為0.20mg/ml；過濾分裝至西林瓶，加塞、軋蓋。將各樣品於40℃、25℃、5℃條件下進行穩定性考察，具體方案見表11。檢測指標為外觀、可見異物、蛋白含量、純度(SEC-HPLC法和CE-SDS法)和電荷變異體(iCIEF法)。

表10.穩定劑篩選試驗備選處方信息表

表11.穩定性考察方案

3.1.2 判定標準

判定標準具體參見實施例2中的表2。

3.1.3 穩定劑篩選試驗

(1)外觀、可見異物

在40℃條件下觀察至1個月，25℃±2℃條件下觀察至2個月，5℃±3℃條件下觀察至3個月，結果表明：各處方樣品外觀、可見異物均合格。

(2)蛋白含量

在40℃條件下觀察至1個月，25℃±2℃條件下觀察至2個月，5℃±3℃條件下觀察至3個月，各處方樣品的蛋白含量測定結果見表12。結果表明，在40℃、25℃±2℃和5℃±3℃這三個不同溫度條件下，四個處方中的蛋白含量均未發生變化。

表12.穩定劑篩選試驗蛋白含量結果(UV法，mg/ml)

(3)純度

純度(SEC-HPLC法)：結果見表13。結果表明，在40℃條件下考察4週，各處方樣品純度均未發生顯著變化；在25℃±2℃條件下2個月，各處方樣品純度均未發生明顯變化；在5℃±3℃條件下3個月，各處方樣品純度也未發生明顯變化。

表13.穩定劑篩選試驗的純度結果(SEC-HPLC法，%)

純度(非還原型CE-SDS法)：結果見表14。結果表明，在40℃條件下考察4週，各處方樣品純度均未發生顯著變化；在25℃±2℃條件下2個月，各處方樣品純度均未發生明顯變化；在5℃±3℃條件下3個月，各處方樣品純度均未發生顯著變化。

表14.穩定劑篩選試驗的純度結果(非還原型CE-SDS法，%)

純度(還原型CE-SDS法)：結果見表15。結果表明，在40℃條件下考察4週，各處方樣品純度均未發生顯著變化；在25℃±2℃條件下2個月，各處方樣品純度均未發生明顯變化；在5℃±3℃條件下3個月，各處方樣品純度也均未發生顯著變化。

表15.穩定劑篩選試驗的純度結果(還原型CE-SDS法，%)

(4)電荷變異體(iCIEF法)

電荷變異體(iCIEF法)：結果見表16。40℃和25℃±2℃時，各處方電荷變異體主成分的變化趨勢分別見圖7和圖8。

結果表明，40℃條件下考察4週，各處方電荷變異體主成分及酸鹼組分均發生明顯變化，主成分下降，酸性組分上升，其變化趨勢基本一致，處方1-4之間無明顯差異。25℃±2℃條件下加速2個月，各處方電荷變異體主成分及酸鹼組分均發生明顯變化，主成分下降，酸性組分上升，其變化趨勢基本一致，處方1-4之間無明顯差異。5℃±3℃條件下考察3個月，各處方電荷變異體主成分及酸鹼組分均無明顯變化。

表16.穩定劑篩選試驗的電荷變異體結果(iCIEF法，%)

處方確定實驗結果表明，處方1-4之間有比較一致的變化趨勢，它們之間無明顯差異。從處方簡單性方面考慮，處方1、處方2和處方3中使用單一穩定劑對蛋白的保護無明顯差異，考慮到後期凍幹製劑的開發，選用處方2。從後期生產安全性考慮，將處方2的緩衝體系由濃鹽酸調節pH調整為組胺酸和鹽酸組胺酸。為確保調整後的製劑處方的穩定性，進一步實施以下實驗。

實施例4：處方確認實驗

4.1 處方設計和實驗方案

設計了處方5，處方5的詳細信息見表17。

表17.處方信息表

處方確認實驗方案見表18。

表18.處方確認實驗方案

4.2 實驗結果

40℃強制實驗結果見表19。在40℃條件下放置4週，外觀、可見異物和生物學活性均合格，蛋白含量、純度(SEC-HPLC法和CE-SDS法)均未發生顯著變化，僅電荷變異體(iCIEF法)主成分下降16.0%，酸性組分上升14.0%，鹼性組分上升2.0%。

表19.穩定性實驗結果

結果表明，42.0mg/ml本發明的重組全人源抗程序性死亡受體1(PD-1)和人源化抗人表皮生長因子受體2(HER2)雙特異性抗體在處方5(0.85mg/ml組胺酸、3.17mg/ml鹽酸組胺酸、80.00mg/ml蔗糖、0.2mg/ml聚山梨酯80，pH 5.5)中與實施例3中的處方2有比較一致的變化趨勢。

由此，確定最佳的製劑方案為：約42.0mg/ml重組全人源抗程序性死亡受體1(PD-1)和人源化抗人表皮生長因子受體2(HER2)雙特異性抗體、0.85mg/ml組胺酸、3.17mg/ml鹽酸組胺酸、80.00mg/ml蔗糖、0.2mg/ml聚山梨酯80，pH 5.5。

以上描述了本發明的示例性實施方案，本領域技術人員應當理解的是，這些公開內容僅是示例性的，在本發明的範圍內可以進行各種其它替換、適應和修改。因此，本發明不限於文中列舉的具體實施方案。

<110> 大陸商信達生物製藥(蘇州)有限公司；大陸商北京韓美藥品有限公司(INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO.,LTD.；BEIJING HANMI PHRMACEUTICL CO.,LTD.)

<120> 包含抗PD-1/HER2雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途

<130>

<150> CN 201910726334.X

<151> 2019-08-07

<160> 14

<170> PatentIn版本3.3

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人HER2抗體輕鏈可變區

<400> 1

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人HER2抗體輕鏈可變區

<400> 2

<210> 3

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人HER2抗體輕鏈恆定區

<400> 3

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人HER2抗體輕鏈恆定區

<400> 4

<210> 5

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人HER2抗體重鏈可變區

<400> 5

<210> 6

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人HER2抗體重鏈可變區

<400> 6

<210> 7

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人HER2抗體重鏈恆定區

<400> 7

<210> 8

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人HER2抗體重鏈恆定區

<400> 8

<210> 9

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人PD-1抗體輕鏈可變區

<400> 9

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人PD-1抗體輕鏈可變區

<400> 10

<210> 11

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人PD-1抗體重鏈可變區

<400> 11

<210> 12

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人PD-1抗體重鏈可變區

<400> 12

<210> 13

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人PD-1抗體重鏈恆定區

<400> 13

<210> 14

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗人PD-1抗體重鏈恆定區

<400> 14

Claims

一種液體抗體製劑，其包含(i)抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；(ii)緩衝劑，該緩衝劑係組胺酸，或組胺酸與鹽酸組胺酸之組合；(iii)穩定劑，該穩定劑係選自山梨醇、蔗糖、海藻糖及其組合、以及與甲硫胺酸之組合；和(iv)表面活性劑，該表面活性劑係聚山梨醇酯80；其中該抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白包含第一半抗體和第二半抗體，其中第一半抗體包含特異性結合PD-1的第一VH/VL單元並且第二半抗體包含特異性結合HER2的第二VH/VL單元，其中該第一VH/VL單元為SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：10的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列，並且其中該第二VH/VL單元為SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：2的成對重鏈可變區序列/輕鏈可變區序列；該液體抗體製劑的pH為5.0-5.5。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中該液體抗體製劑中的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的濃度為10-100mg/mL。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中該緩衝劑的濃度為5-50mM。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中該穩定劑的總濃度為100-400mM。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中該甲硫胺酸的濃度為5-40mM。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中該表面活性劑的濃度為0.2-0.8mg/ml。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中該抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白中第一半抗體包含從N至C方向的SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14的重鏈序列，和從N至C方向的SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：4的輕鏈序列，並且第二半抗體包含從N至C方向的SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的重鏈序列，和從N至C方向的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的輕鏈序列。
如請求項1所述的液體抗體製劑，其中該抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白在HEK293細胞或以HEK293細胞為基礎改造而得到的HEK293T、HEK293F、HEK293E細胞；CHO細胞或以CHO細胞為基礎改造而得到的CHO-S、CHO-dhfr^-、CHO/DG44、ExpiCHO中重組表達。
如請求項1至8中任一項所述的液體抗體製劑，其中該液體製劑為注射劑或者為輸注劑。
如請求項1至8中任一項所述的液體抗體製劑，其包含：(i)10-100mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；(ii)10-30mM的組胺酸、或10-30mM的組胺酸和鹽酸組胺酸的組合；(iii)100-400mM的山梨醇、蔗糖、和/或海藻糖；或者總濃度為100-400mM的山梨醇、蔗糖、和/或海藻糖與甲硫胺酸的組合，其中甲硫胺酸的濃度為5-40mM，和(iv)0.2-0.8mg/ml聚山梨醇酯80；其中該液體抗體製劑的pH為5.0-5.5。
如請求項10所述的液體抗體製劑，其包含： (i)20mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；(ii)10mM組胺酸；(iii)50mg/ml山梨醇，和(iv)0.3mg/ml聚山梨醇酯80；其中該液體抗體製劑的pH為約5.0-5.5；或者，該液體抗體製劑包含(i)50mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；(ii)20mM組胺酸；(iii)50mg/ml山梨醇，和(iv)0.2mg/ml聚山梨醇酯80；其中該液體抗體製劑的pH為約5.0-5.5；或者，該液體抗體製劑包含(i)50mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；(ii)20mM組胺酸；(iii)80mg/ml蔗糖，和(iv)0.2mg/ml聚山梨醇酯80；其中該液體抗體製劑的pH為約5.0-5.5；或者，該液體抗體製劑包含(i)50mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；(ii)20mM組胺酸；(iii)80mg/ml海藻糖，和(iv)0.2mg/ml聚山梨醇酯80；其中該液體抗體製劑的pH為約5.0-5.5；或者，該液體抗體製劑包含(i)50mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；(ii)20mM組胺酸；(iii)80mg/ml蔗糖和1.49mg/ml甲硫胺酸，和(iv)0.2mg/ml聚山梨醇酯80；其中該液體抗體製劑的pH為5.0-5.5；或者，該液體抗體製劑包含(i)42mg/ml的抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白；(ii)0.85mg/ml組胺酸和3.17mg/ml鹽酸組胺酸；(iii)80mg/ml蔗糖，和(iv)0.2mg/ml聚山梨醇酯80；其中該液體抗製劑的pH為5.0-5.5。
如請求項11所述的液體抗體製劑，其中，該製劑在2-8℃儲存至少24個月後，或在室溫儲存至少3個月後，或在40℃±2℃儲存1個月後，是穩定的，並且具有以下特徵之一者或多者：(i)藉由SEC-HPLC法測量，製劑具有大於90%的純度；(ii)藉由還原型或非還原型CE-SDS法測量，製劑具有大於90%的純度；(iii)藉由iCIEF法測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的主成分、酸性組分和鹼性組分的變化值總和不超過50%；(iv)藉由ELISA法測量，相對於儲存第0天的初始值，製劑中抗PD-1/HER2雙特異性抗體蛋白的相對結合活性為70%-130%。
一種固體抗體製劑，其藉由固化如請求項1至12中任何一項所述的液體抗體製劑而獲得。
如請求項13所述的固體抗體製劑，其係凍乾粉針劑形式。
一種預填裝注射器，其包含如請求項1至12中任何一項的液體抗體製劑或如請求項13的固體抗體製劑，用於靜脈內注射或者肌內注射。
一種如請求項1至12中任何一項的液體抗體製劑或如請求項13的固體抗體製劑的用途，用於製備治療或延緩與HER2信號傳導通路和PD-1信號傳導通路相關的病症的藥物，該病症係選自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、腦腫瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽囊癌、膽管癌、肝癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、子宮肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌、黑色素瘤。